CN115927610A - 检测foxo6基因中目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用 - Google Patents
检测foxo6基因中目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种检测FOXO6基因中目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用；所述目标区域包括如下定义的区域1或其部分区域：以GRCh38.p14为参考，区域1为Chr1:41382214‑41382419。相对于传统技术，本发明具备如下有益效果：本发明将检测FOXO6基因位于目标区域的甲基化水平的检测试剂制备成试剂盒，采用该试剂盒能够高灵敏度地检出膀胱癌，且其检测健康人样本的特异性高，为膀胱癌的筛查和诊断提供新的技术方案。特别是，该试剂盒能够实现非侵入性的膀胱癌的诊断，性能优越，有望为膀胱癌高风险人群及患者带来福音。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种检测FOXO6基因中目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用。
背景技术
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在我国呈逐年增加的趋势。根据组织来源，膀胱癌可以分为膀胱尿路上皮癌、膀胱鳞癌、膀胱腺癌、膀胱肉瘤等，其中膀胱尿路上皮癌是最常见的病理类型，约占所有膀胱癌发病率的90％以上。根据治疗模式及疾病预后的不同，膀胱癌又可分为非肌肉浸润性疾病(NMIBC)和肌肉浸润性疾病(MIBC)。膀胱癌的5年生存率与确诊时的疾病分期有关，原位癌的5年生存率高达95.8％，而转移性膀胱癌的5年生存率低至4.6％。虽然早期膀胱癌治愈率较高，但是多数患者经尿道电切术后有复发的风险，因此需要在术后进行膀胱癌的监测。膀胱癌的早期筛查、早期治疗和复发监测对于提高患者的生存率至关重要。
目前膀胱癌的诊断和术后监测的主要方法为膀胱镜检查以及病理活检。虽然此方法是诊断膀胱癌的金标准，但是膀胱镜检查时会给患者带来巨大的痛苦，且存在尿道穿孔、出血或感染的可能性。一些无创的检测方法，如尿液脱落细胞学检测和染色体荧光原位杂交等，其诊断膀胱癌尤其是早期肿瘤的灵敏度较低，不能满足临床需求，因此急需一种高灵敏度的诊断膀胱癌的方法。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
基于此，本发明的目的包括提供检测FOXO6基因中目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用，本发明实施例用FOXO6基因中目标区域的甲基化水平的检测试剂制备膀胱癌诊断试剂盒，采用该试剂盒能够高灵敏度地检出膀胱癌，为膀胱癌的筛查和诊断提供新的技术方案。
在本发明的第一方面，检测FOXO6基因中目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用；
所述目标区域包括如下定义的区域1或其部分区域：
以GRCh38.p14为参考，区域1为Chr1:41382214-41382419。
在本发明的一些实施方式中，所述区域1的部分区域选自如下定义的区域2、区域3、区域4、区域5、区域6、区域7、区域8和区域9中的一个或者多个：
区域2为Chr1:41382215-41382419正链，
区域3为Chr1:41382389-41382214负链，
区域4为Chr1:41382253-41382390正链，
区域5为Chr1:41382247-41382365正链，
区域6为Chr1:41382286-41382390正链，
区域7为Chr1:41382334-41382235负链，
区域8为Chr1:41382366-41382288负链，以及
区域9为Chr1:41382316-41382217负链。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述目标区域的甲基化水平的检测：甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂包括检测所述目标区域的甲基化水平的引物对，或者还包括检测所述目标区域的检测探针。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂包括具备如下技术特征中的一个或者多个的检测所述目标区域的甲基化水平的甲基化引物对和非甲基化引物对：
检测所述区域2的甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，
检测所述区域2的非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，
检测所述区域3的甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，以及，
检测所述区域3的非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂包括具备如下技术特征中的一个或者多个的检测所述目标区域的甲基化水平的检测引物对和所述检测引物对对应的检测探针：
检测所述区域4的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，
检测所述区域5的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，
检测所述区域6的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，
检测所述区域7的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示，
检测所述区域8的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示，以及
检测所述区域9的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂还包含检测内参基因的检测引物对和所述检测引物对对应的检测探针；可选地，所述内参基因包含ACTB基因，所述ACTB基因对应SEQID NO.33和SEQ ID NO.34所示的检测引物对和SEQ ID NO.35所示的检测探针。
在本发明的一些实施方式中，检测的样本包括细胞样本、组织样本或者尿液样本。
在本发明第二方面，提供一种膀胱癌诊断试剂盒，包括第一方面所定义的试剂。
在本发明的一些实施方式中，所述诊断试剂盒还包含测序试剂、扩增试剂、将未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂和DNA提取试剂中的一种或者多种；可选地，所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或者多种。
相对于传统技术，本发明具备如下有益效果：
本发明将检测FOXO6基因中目标区域的甲基化水平的检测试剂制备成试剂盒，采用该试剂盒能够高灵敏度地检出膀胱癌，且其检测健康人样本的特异性高，为膀胱癌的筛查和诊断提供新的技术方案。特别是，该试剂盒能够实现非侵入性的膀胱癌的诊断，性能优越，有望为膀胱癌高风险人群及患者带来福音。
具体实施方式
下面结合实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。
本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。
本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本发明中，膀胱癌指发生于膀胱粘膜上的癌症，根据其组织类型可分为尿路上皮(移行)细胞癌、鳞状细胞癌、腺细胞癌以及一些少见的小细胞癌、混合型、癌肉瘤或者转移癌等。其中尿路上皮癌占膀胱癌的90％以上。
本发明中，诊断包括辅助诊断、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。
本发明中，基因是指编码产生氨基酸多肽链的DNA区段，它包括参与基因转录/翻译和转录/翻译调控的位于编码区和非编码区的序列。
本发明中，术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选多于三个，并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素，而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
本发明中，甲基化，为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
本发明中，甲基化水平，指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代笔定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。
本发明中，引物，是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。在本公开内容中，术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。
本发明中，Taqman探针，是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。
本发明中，桑格尔测序，即一代测序，其反应系统包含：目标片段、四种脱氧核糖核苷酸(dNTP)、DNA聚合酶，引物等，还需要加入不同荧光基团标记的4种双脱氧核糖核苷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，通过光激发将四种光波长信号转化为电脑可识别的电信号，根据反应管中最后掺入的ddNTP的荧光信号判断目的DNA序列。
DNA甲基化是调节基因表达的一种常见方式，抑癌基因CpG二核苷酸中胞嘧啶的异常高甲基化可能会造成基因的转录沉默以及癌症的发生。目前抑癌基因的高甲基化已经被认为是膀胱癌发生的早期事件，因此DNA甲基化模式的改变可以作为一种有潜力的癌症筛查、诊断和监测手段。由于尿液中存在脱落的肿瘤细胞以及肿瘤细胞释放的游离的DNA，因此本发明认为可以通过检测尿液中某些生物标志物甲基化水平的改变来进行膀胱癌的早期诊断或监测。
本发明的第一方面
本发明实施例提供一种检测FOXO6基因中目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用；
所述目标区域包括如下定义的区域1或其部分区域：
以GRCh38.p14为参考，区域1为Chr1:41382214-41382419。
FOXO6(forkhead box O6)基因，即叉头框O6基因，gene ID:100132074，以GRCh38.p14为参考，其物理位置为：Chr1:41361434-41383590。预测该基因能够与DNA结合，具有转录因子活性。
在本发明的一些示例中，所述区域1的部分区域选自如下定义的区域2、区域3、区域4、区域5、区域6、区域7、区域8和区域9中的一个或者多个：
区域2为Chr1:41382215-41382419正链，
区域3为Chr1:41382389-41382214负链，
区域4为Chr1:41382253-41382390正链，
区域5为Chr1:41382247-41382365正链，
区域6为Chr1:41382286-41382390正链，
区域7为Chr1:41382334-41382235负链，
区域8为Chr1:41382366-41382288负链，以及
区域9为Chr1:41382316-41382217负链。
例如，所述区域1的部分区域选自区域2至区域9中的任意一个，或者其中的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个。
进一步地，所述区域1的部分区域为区域6、区域7或者区域8。更进一步地，所述区域1的部分区域为区域7。
可以理解理解是，本发明对甲基化水平的检测的方法不做特别限定，所述试剂可以通过但不限于采用如下方法中的一种或多种实现对所述目标区域的甲基化水平的检测：甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。
在本发明的一些示例中，所述试剂包括检测所述目标区域的甲基化水平的引物对，或者还包括检测所述目标区域的检测探针。
在本发明的一些示例中，所述试剂包括具备如下技术特征中的一个或者多个的检测所述目标区域的甲基化水平的甲基化引物对和非甲基化引物对：
检测所述区域2的甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，
检测所述区域2的非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，
检测所述区域3的甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，以及，
检测所述区域3的非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。
在本发明的一些示例中，所述试剂包括具备如下技术特征中的一个或者多个的检测所述目标区域的甲基化水平的检测引物对和所述检测引物对对应的检测探针：
检测所述区域4的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，
检测所述区域5的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，
检测所述区域6的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，
检测所述区域7的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示，
检测所述区域8的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示，以及
检测所述区域9的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示。
在本发明的一些示例中，所述试剂还包含检测内参基因的检测引物对和所述检测引物对对应的检测探针；可选地，所述内参基因包含ACTB基因，所述ACTB基因对应SEQ IDNO.33和SEQ ID NO.34所示的检测引物对和SEQ ID NO.35所示的检测探针。
其中一个示例中，所述检测探针标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。所述荧光报告基团例如FAM、HEX、VIC、CY5、ROX、Texsa Red、JOE、Quasar 705等。所述荧光淬灭基团例如MGB、BHQ1、BHQ2及BHQ3等。
可以理解的是，本发明对进行甲基化水平检测的样本种类不做特别限定，可以选自但不限于细胞样本、组织样本或者尿液样本。
本发明第二方面
本发明实施例提供一种膀胱癌诊断试剂盒，包括第一方面所定义的试剂。
在本发明的一些示例中，所述诊断试剂盒还包含测序试剂、扩增试剂、将未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂和DNA提取试剂中的一种或者多种。
可选地，所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或者多种。
本发明的第三方面
本发明实施例提供一种膀胱癌的诊断方法，所述诊断方法包括如下步骤：
采用第二方面所述的诊断试剂盒对受试者的样本的甲基化水平进行检测，并根据检测结果确定受试者是否患有膀胱癌。
相对于传统技术，本发明具备如下有益效果：
本发明将检测FOXO6基因位于目标区域的甲基化水平的检测试剂制备成试剂盒，采用该试剂盒能够高灵敏度地检出膀胱癌，且其检测健康人样本的特异性高，为膀胱癌的筛查和诊断提供新的技术方案。特别是，该试剂盒能够实现非侵入性的膀胱癌的诊断，性能优越，有望为膀胱癌高风险人群及患者带来福音。
具体实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1
通过亚硫酸氢盐测序的方法分析样本中Chr1:41382214-41382419区域(区域1)的DNA的甲基化水平可以有效区分膀胱癌组织和癌旁正常组织，具体的测试过程如下。
1.样本收集
共收集了96例经病理检测确诊为膀胱癌患者的癌组织样本和对应的癌旁正常组织样本96例，所有的组织样本均为福尔马林浸泡、石蜡包埋的组织样本。其中，非肌肉浸润性癌(NMIBC)组织样本共42例，肌肉浸润性癌(MIBC)组织样本54例。所有组织样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有组织样本均采用匿名化处理。
2.样本DNA提取
使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Cat:56404)提取组织样本的DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。
3.样本DNA转化和纯化
样本DNA的转化和纯化所用试剂盒均为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)，具体操作步骤见试剂盒说明书。
4.PCR扩增及测序
DNA分子经亚硫酸氢盐转化后，未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，在随后PCR扩增的过程中，尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶。由此可知，在经历亚硫酸氢盐转化后，双链DNA分子的一条单链中未甲基化的胞嘧啶由于转化为胸腺嘧啶而不再与其原反向互补链中的鸟嘌呤互补，即转化后DNA分子的原正义链和原负义链不再完全互补配对，那么可以理解的是，对转化后的DNA分子的正义链和负义链进行PCR扩增时，所用的扩增引物对是不同的。考虑到引物结合的特异性，针对Chr1:41382214-41382419区域的DNA分子的正义链和负义链都设计了引物对，并进行了甲基化水平的检测。
分别以完全甲基化的且经亚硫酸氢盐转化后的序列片段和完全未甲基化的且经亚硫酸氢盐转化后的序列片段为模板，设计甲基化的引物对和非甲基化的引物对，扩增相应的正、负链区域(扩增子的序列如表1所示)，并筛选最佳的甲基化引物对和非甲基化引物对的配比，以保证在一个PCR反应体系中同时加入甲基化引物对和非甲基化引物对时，当模板中存在大于等于1％的甲基化序列时，即可扩增得到甲基化的产物，仅当模板为非甲基化序列片段时，扩增产物为非甲基化产物。
表1、Chr1:41382214-41382419区域的DNA序列
以转化后的组织样本DNA为模板，分别以表2中SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.10、SEQID NO.11-SEQ ID NO.14为引物对，进行PCR反应来扩增Chr1:41382214-41382419区域DNA的正、负链。PCR反应的配置体系如表3所示，体系中用到的DNA聚合酶为PrimeSTAR HS DNAPolymerase(Takara,Cat:R010A)。PCR扩增程序同表4，在PCR扩增结束后，使用混合引物(包含甲基化引物对和非甲基化引物对)对扩增产物进行桑格尔测序(送测序公司)，同时从5’端和3’端测序。
表2、甲基化引物对和非甲基化引物对
表3、PCR反应体系
| 组分 | 用量(μL) |
| <![CDATA[10×buffer(Mg<sup>2+</sup>Free)]]> | 5 |
| <![CDATA[25mM Mg<sup>2+</sup>]]> | 4 |
| dNTP Mix(10mM each) | 1 |
| 甲基化上游引物(10μM) | 1 |
| 甲基化下游引物(10μM) | 1 |
| 非甲基化上游引物(10μM) | 0.5 |
| 非甲基化下游引物(10μM) | 0.5 |
| DNA聚合酶 | 0.5 |
| 模板DNA | 10 |
| 超纯水 | 补至50 |
表4、PCR反应程序
6.结果分析
根据测序峰图对每个样本各个扩增子中的CpG位点的甲基化情况进行分析。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果为胸腺嘧啶，则其为非甲基化的；若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果仍然为胞嘧啶，则其为完全甲基化的；若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果既有胞嘧啶也有胸腺嘧啶(双峰)，则其为部分甲基化的。
如果一个扩增子中95％以上的CpG二核苷酸中胞嘧啶是甲基化的(包括完全甲基化和部分甲基化)，则认为此样本在该扩增区域是甲基化阳性的；否则认为此样本在该扩增区域为甲基化阴性。分别计算各类组织样本在Chr1:41382214-41382419区域正义链、负义链中的甲基化阳性数目和甲基化阴性数目；并计算其检测的灵敏度和特异性，灵敏度为病理结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例，特异性为病理结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。
利用亚硫酸氢盐测序的方法，通过检测Chr1:41382214-41382419区域DNA分子的甲基化水平诊断膀胱癌癌组织样本、癌旁组织样本的灵敏度和特异性如表5所示。
表5、基于亚硫酸氢盐测序法检测组织样本的灵敏度和特异性
由表5可以看出，通过亚硫酸氢盐测序的方法分析Chr1:41382214-41382419区域DNA分子的甲基化水平，可以有效地区分膀胱癌组织样本和癌旁正常组织样本，而且对Chr1:41382214-41382419区域DNA分子的正链进行甲基化水平分析来诊断膀胱癌的性能与负链相差无几，可见此区域十分适合作为诊断膀胱癌的甲基化分子标志物。具体来看，Chr1:41382214-41382419区域诊断非肌肉浸润性膀胱癌组织样本的灵敏度为73.81％-76.19％，其诊断肌肉浸润性膀胱癌的灵敏度为90.74％-92.59％，其在癌旁组织中的特异性高于88％。
实施例2
为了提升试剂盒在临床应用中的价值，本实施例提供了基于荧光定量甲基化特异性PCR(qMSP)的方法检测Chr1:41382214-41382419区域DNA分子甲基化水平，可以根据Ct值来判断样本的甲基化状态，进而判断样本是否为癌症样本，该方法简单、便捷、易于操作、可以在半个工作日内出示检测报告。本实施例提供了利用qMSP的方法检测Chr1:41382214-41382419区域的甲基化水平进而判断组织样本是否为膀胱癌样本的实验流程及检测效果。
1.样本的收集、样本DNA的提取、转化和纯化步骤同实施例1.
2.qMSP反应
分别以完全甲基化的且经亚硫酸氢盐转化后的序列片段SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.5为模板，设计了6对不同的检测引物对和探针，进行甲基化荧光定量PCR反应。引物对和检测探针的核苷酸序列如表6所示，其检测的各个目的区域的序列如表7所示，引物对和检测探针可检测的甲基化的胞嘧啶位点如表8所示。
表6、引物对和检测探针的核苷酸序列
表7、各引物对和检测探针检测的目的区域的核苷酸序列
表8、引物对和检测探针可检测的甲基化的胞嘧啶位点
将经亚硫酸氢盐转化并纯化的模板DNA进行qMSP反应以检测各个待测样本在Chr1:41382214-41382419区域的甲基化状态，用表8中的6种检测引物对和检测探针分别扩增每一个待测样本。进行PCR反应的过程中，在一个PCR管中，首先需加入反应缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、模板等必须的成分；然后加入检测引物对和检测探针(6种引物对和探针组合中的一种)，此外，还需加入内参基因ACTB的检测引物对和检测探针(SEQ ID NO.33-SEQ IDNO.35)。这里用到的检测探针为Taqman探针，目标区域的检测探针5’端的报告基团为FAM，3’端淬灭基团为MGB，ACTB基因的检测探针其5’端的报告基团为VIC，3’端淬灭基团为BHQ1。采用Invitrogen Platinum II Taq热启动DNA聚合酶(Invitrogen,Cat:14966005)进行PCR扩增，PCR反应液配置体系如表9所示，按照表10展示的扩增程序进行PCR扩增。
表9、qMSP反应体系
| 组分 | 规格 | 体积(μL) |
| Platinum II PCR缓冲液 | 5× | 5 |
| dNTPs | 各2.5mM | 3 |
| 目标区域上游引物 | 10μM | 0.5 |
| 目标区域下游引物 | 10μM | 0.5 |
| 目标区域检测探针 | 10μM | 0.5 |
| ACTB上游引物 | 10μM | 0.5 |
| ACTB下游引物 | 10μM | 0.5 |
| ACTB检测探针 | 10μM | 0.5 |
| Taq酶 | / | 0.5 |
| 待测样本DNA | / | 5 |
| 纯化水 | / | 补至25 |
表10、PCR反应程序
阴性对照和阳性对照：在用6种不同的检测引物对和探针分别进行检测时，阴性对照和阳性对照应同步进行检测。阴性对照为TE缓冲液。阳性对照的制备方法为：将ACTB的扩增区域对应的经亚硫酸氢盐完全转化后的序列进行人工合成，并克隆至载体上，形成人工合成质粒。将编号为3至8的引物对和检测探针所检测的目标区域(SEQ ID NO.37、39、41、43、45、47)进行人工合成，并分别克隆至载体，形成人工合成质粒。阳性对照管的模板DNA为：103拷贝/微升的ACTB人工合成质粒和103拷贝/微升的含目标区域(SEQ ID NO.37、39、41、43、45、47)之一的人工合成质粒1:1混合而成，如使用引物对和探针3进行扩增反应时的阳性对照为103拷贝/微升的ACTB人工合成质粒和103拷贝/微升的含SEQ ID NO.37序列的人工合成质粒1:1混合而成。
3.PCR结果分析：
1)Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1-2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。
2)质量控制：阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，且阳性对照的Ct值应在26-30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤35，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
3)结果分析和判读方法：对于组织样本，若待测样本在某一检测区域的Ct值≤38时，即认为该样本在此区域为甲基化阳性，若待测样本在某一检测区域的Ct值>38，则认为该样本在此区域为甲基化阴性。
利用荧光定量甲基化特异性PCR检测的方法，通过检测Chr1:41382214-41382419区域DNA分子的甲基化水平诊断膀胱癌癌组织样本、癌旁组织样本的灵敏度和特异性如表11所示。
表11、基于qMSP法检测组织样本的灵敏度和特异性
由表11可以看出，利用荧光定量甲基化特异性PCR的方法来检测Chr1:41382214-41382419区域DNA分子的甲基化水平，进而区分膀胱癌癌组织样本、癌旁组织样本的效果不比亚硫酸氢盐测序的方法差，而且针对该区域设计的不同的引物对和探针对癌和癌旁样本都有较好的区分效果。具体地，qMSP法检测非肌肉浸润性膀胱癌组织样本的灵敏度都在71.43％以上，可高达78.57％，其检测肌肉浸润性膀胱癌组织样本灵敏度都高于90％，其检测癌旁组织的特异性都高于86％。
实施例3
本实施例提供了利用qMSP法检测Chr1:41382214-41382419区域DNA分子的甲基化水平，来区分膀胱癌患者、健康人、泌尿系统良性疾病患者的尿液样本的性能。
1.样本收集
共收集156例经病理检测确诊的膀胱癌患者及178例进行常规体检的健康人的尿液样本，其中，非肌肉浸润性癌患者的样本共74例，肌肉浸润性癌患者的样本共82例。此外，还收集了常见的泌尿系统良性疾病(包括腺性膀胱炎、泌尿道感染、前列腺增生、肾结石、肾积水等)患者的尿液样本72例。所有收集到的每份尿液样本的体积大于10mL。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。
2.样本DNA提取
利用武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试剂盒(鄂汉械备20210740号)进行尿液样本DNA的提取，具体步骤见试剂盒说明书。
3.样本DNA转化、纯化同实施例1。
4.qMSP检测方法同实施例2。
5.qMSP结果分析
Ct值的读取、质量控制等同实施例2。
qMSP结果分析和判读方法：对于尿液样本，若待测样本在某一检测区域的Ct值≤45时，即认为该样本在此区域为甲基化阳性，若待测样本在某一检测区域的Ct值>45，则认为该样本在此区域为甲基化阴性。利用qMSP检测的方法，通过检测Chr1:41382214-41382419区域DNA分子的甲基化水平诊断膀胱癌患者、健康人和泌尿系统良性疾病患者的尿液样本的灵敏度和特异性如表12所示。
表12、基于qMSP法检测尿液样本的灵敏度和特异性
由表12可以看出，利用荧光定量甲基化特异性PCR的方法来检测Chr1:41382214-41382419区域DNA分子的甲基化水平，进而区分膀胱癌患者、健康人、良性泌尿系统疾病患者尿液样本的性能良好，与检测组织样本的效果趋势相同，针对该区域设计的不同的引物对和检测探针对膀胱癌患者和非癌患者的尿液样本都有较好的区分效果。qMSP法检测非肌肉浸润性膀胱癌患者尿液样本的灵敏度都高于70％；其检测肌肉浸润性膀胱癌患者尿液样本的灵敏度都高于89％；其检测膀胱癌的总灵敏度不低于80％，最高可达85.9％；其检测健康人尿液样本的特异性都高于92％；且其检测良性泌尿系统疾病患者尿液样本的特异性都高于87％。另外，可以看出，引物对和检测探针6检测性能最佳，其对膀胱癌尿液样本的检测总灵敏度高达85.9％。综上，检测Chr1:41382214-41382419区域DNA分子的甲基化水平可以有效提高早期膀胱癌的检出率，进而提高膀胱癌患者的生活质量和生命周期。
整体上，为解决目前尚无高灵敏度、高特异性的膀胱癌筛查或诊断的方法，本发明实施例提供了基于尿液样本、组织样本进行膀胱癌诊断或辅助诊断的检测试剂和试剂盒。通过亚硫酸氢盐测序或荧光定量甲基化特异性PCR的方法，来检测受试者样本中FOXO6基因的甲基化水平，若受试者样本中FOXO6基因的甲基化水平显著高于健康人的样本，则认为受试者患有膀胱癌。具体地，通过检测尿液样本中FOXO6基因位于Chr1:41382214-41382419区域DNA分子的甲基化水平，进而来区分患者是否患有膀胱癌，该方法诊断非肌肉浸润性膀胱癌的灵敏度最高可达75.68％，其诊断肌肉浸润性膀胱癌的灵敏度最高可达95.12％，其检测健康人尿液样本的特异性可达96.07％。该方法检测性能优越，且具有无创伤性，有望为膀胱癌高风险人群及患者带来福音。
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.检测FOXO6基因中目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用；
所述目标区域包括如下定义的区域1或其部分区域：
以GRCh38.p14为参考，区域1为Chr1:41382214-41382419。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述区域1的部分区域选自如下定义的区域2、区域3、区域4、区域5、区域6、区域7、区域8和区域9中的一个或者多个：
区域2为Chr1:41382215-41382419正链，
区域3为Chr1:41382389-41382214负链，
区域4为Chr1:41382253-41382390正链，
区域5为Chr1:41382247-41382365正链，
区域6为Chr1:41382286-41382390正链，
区域7为Chr1:41382334-41382235负链，
区域8为Chr1:41382366-41382288负链，以及
区域9为Chr1:41382316-41382217负链。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述目标区域的甲基化水平的检测：甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。
4.根据权利要求2或者3所述的应用，其特征在于，所述试剂包括检测所述目标区域的甲基化水平的引物对，或者还包括检测所述目标区域的检测探针。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂包括具备如下技术特征中的一个或者多个的检测所述目标区域的甲基化水平的甲基化引物对和非甲基化引物对：
检测所述区域2的甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，
检测所述区域2的非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，
检测所述区域3的甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，以及，
检测所述区域3的非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂包括具备如下技术特征中的一个或者多个的检测所述目标区域的甲基化水平的检测引物对和所述检测引物对对应的检测探针：
检测所述区域4的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；
检测所述区域5的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；
检测所述区域6的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；
检测所述区域7的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示；
检测所述区域8的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示；以及
检测所述区域9的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂还包含检测内参基因的检测引物对和所述检测引物对对应的检测探针；可选地，所述内参基因包含ACTB基因，所述ACTB基因对应SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34所示的检测引物对和SEQ ID NO.35所示的检测探针。
8.根据权利要求1至3和5至7中任一项所述的应用，其特征在于，检测的样本包括细胞样本、组织样本或者尿液样本。
9.一种膀胱癌诊断试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至8任一项所定义的试剂。
10.根据权利要求9所述的膀胱癌诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包括测序试剂、扩增试剂、将未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂和DNA提取试剂中的一种或者多种；可选地，所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或者多种。
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|---|---|
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102459636A (zh) * | 2009-05-07 | 2012-05-16 | 威拉赛特公司 | 用于诊断甲状腺病症的方法和组合物 |
| WO2012116019A1 (en) * | 2011-02-22 | 2012-08-30 | Brown University | Compositions and methods for detecting bladder cancer |
| CN110198711A (zh) * | 2016-11-22 | 2019-09-03 | 第一基因股份有限公司 | 癌症检测方法 |
| CN110283914A (zh) * | 2019-07-29 | 2019-09-27 | 上海透景生命科技股份有限公司 | 一种膀胱癌的新型基因诊断试剂盒及其应用 |
-
2022
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102459636A (zh) * | 2009-05-07 | 2012-05-16 | 威拉赛特公司 | 用于诊断甲状腺病症的方法和组合物 |
| WO2012116019A1 (en) * | 2011-02-22 | 2012-08-30 | Brown University | Compositions and methods for detecting bladder cancer |
| CN110198711A (zh) * | 2016-11-22 | 2019-09-03 | 第一基因股份有限公司 | 癌症检测方法 |
| CN110283914A (zh) * | 2019-07-29 | 2019-09-27 | 上海透景生命科技股份有限公司 | 一种膀胱癌的新型基因诊断试剂盒及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| FRANÇOIS LALLEMAND等: "Involvement of the FOXO6 transcriptional factor in breast carcinogenesis", 《ONCOTARGET.》, vol. 9, no. 7, 30 December 2017 (2017-12-30), pages 7464 - 7475 * |
| 朱理等: "DNA甲基化与膀胱癌关系的研究进展", 《西南军医》, vol. 22, no. 05, 15 September 2020 (2020-09-15), pages 424 - 428 * |
| 陶燕等: "基于生物信息学数据库探讨FOXO3基因在膀胱癌中的表达及临床意义", 《癌变·畸变·突变》, vol. 32, no. 05, 30 September 2020 (2020-09-30), pages 374 - 379 * |
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