CN110283914A

CN110283914A - 一种膀胱癌的新型基因诊断试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN110283914A
Application number: CN201910691537.XA
Authority: CN
Inventors: 董文华
Original assignee: Shanghai Tellgen Diagnosis Science Co Ltd; Shanghai Tou Jing Life Science Limited-Liability Co
Current assignee: Shanghai Tellgen Diagnosis Science Co Ltd; Shanghai Tou Jing Life Science Limited-Liability Co
Priority date: 2019-07-29
Filing date: 2019-07-29
Publication date: 2019-09-27

Abstract

本发明提供了一种膀胱癌的新型基因诊断试剂盒及其应用。具体地，本发明提供了一种检测试剂组合的用途，其特征在于，用于制备一试剂盒，所述试剂盒用于诊断膀胱癌；其中，所述检测试剂组合包括：a)特异性检测人POU4F2基因的DNA甲基化水平的检测试剂；和b)特异性检测人TWIST1基因的DNA甲基化水平的检测试剂；并且，所述试剂盒的使用对象是亚洲人群。本发明所提供的技术方案中，所需样本为被检者尿液，具有快速、灵敏、无创检测的优点。

Description

一种膀胱癌的新型基因诊断试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于基因诊断领域，更具体地，本发明涉及一种膀胱癌的新型基因诊断试剂盒及其应用。

背景技术

膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位，组织学分类可分为移行细胞癌(90％)、鳞状细胞癌(5％)和腺癌(1％-2％)三种。移行细胞癌又分为非肌肉侵入型膀胱癌(NMIBC)(70％)(pTa、pTis、pT1)和肌肉侵入型膀胱癌(MIBC)(30％)(pT2、pT3、pT4)。根据癌细胞分化程度不同，又将移行细胞癌分为Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级(GradeⅠ、Ⅱ、Ⅲ)。膀胱癌可发生于任何年龄，甚至于儿童。其发病率随年龄增长而增加，高发年龄50-70岁。男性膀胱癌发病率为女性的3-4倍。膀胱癌患者约有80％的患者会出现无痛血尿。在到访泌尿科门诊的血尿病人中，有3％-28％的患者被诊断为膀胱癌。

目前对膀胱癌的检查主要采用细胞学检测和膀胱镜检查。两种方法对于检测低级别的肿瘤(Ta、T1、Grade1)，灵敏度都较低，而且膀胱镜检查是一种侵入性而且不舒服的过程。乳头状非侵入性膀胱癌(pTa和pT1)中，有高达50％-70％的患者术后会复发，并且这其中有10％-20％患者会发展成侵入性膀胱癌。目前，监测方案为，前2年中，每3-6个月进行一次膀胱镜检查，在之后每年进行两次的膀胱镜检查。从诊断到死亡，频繁的经尿道切除术和随访膀胱镜检查使膀胱癌成为世界上最昂贵的癌症，发展膀胱癌的无创诊断成为一种迫切的需要。

DNA甲基化作为一种新型分子标志，在肿瘤诊断中的重要性日益受到重视。在脊椎动物CpG岛会发生胞嘧啶5'位的甲基化，在人类肿瘤中CpG岛异常的甲基化已经显示会引起肿瘤抑制基因的转录沉默。

在临床样本中，检测低拷贝的甲基化DNA是非常具有挑战性的，甲基化特异的定量PCR(qMSP)能够在亚硫酸氢盐修饰后的大量非甲基化序列中特异性地扩增甲基化的DNA靶序列。膀胱组织脱落的肿瘤细胞会进入到尿液中，用定量qMSP的方法在尿液样本中检测脱落细胞的DNA甲基化成为膀胱癌早期诊断的可能方法。

然而，现有的通过检测DNA甲基化来诊断膀胱癌的技术中，准确率仍然较低，存在大量的假阳性或假阴性，以致膀胱癌误诊甚至会耽误膀胱癌患者的即时治疗。

因此，本领域迫切需要开发一种准确率高、易操作、灵敏度高的膀胱癌的诊断技术。

发明内容

本发明的目的就是提供一种准确率高、易操作、灵敏度高的膀胱癌的诊断技术。

在本发明的第一方面，提供了一种检测试剂组合的用途，用于制备一试剂盒，所述试剂盒用于诊断膀胱癌；

其中，所述检测试剂组合由以下DNA甲基化水平检测试剂组成：

a)特异性检测人POU4F2基因的DNA甲基化水平的检测试剂；和

b)特异性检测人TWIST1基因的DNA甲基化水平的检测试剂；

并且，所述试剂盒的使用对象是亚洲人群。

在另一优选例中，所述试剂盒的使用对象是中国人群。

在另一优选例中，所述试剂盒的使用对象是汉族人群。

在另一优选例中，所述试剂盒的使用对象不包括白种人群和黑种人群

在另一优选例中，所述膀胱癌包括：移行细胞癌、膀胱鳞状细胞癌和腺癌。

在另一优选例中，所述移行细胞癌包括：非肌肉侵入型膀胱癌(NMIBC)(pTa、pTIS、pT1)和肌肉侵入型膀胱癌(MIBC)(pT2、pT3、pT4)。

在另一优选例中，所述膀胱癌为移行细胞癌。

在一个优选例中，所述的DNA甲基化序列含有CpG二核苷酸结构，并且CpG二核苷酸结构的C碱基带有甲基基团。

在另一优选例中，所述特异性检测人POU4F2基因的DNA甲基化水平的检测试剂包括：针对人POU4F2基因的引物对和探针。

在另一优选例中，所述针对人POU4F2基因的引物对和探针是针对修饰后的人POU4F2基因序列的引物对和探针。

在另一优选例中，所述修饰包括：亚硫酸氢盐修饰、重亚硫酸氢盐修饰、肼盐修饰，或其组合。

在另一优选例中，所述修饰为亚硫酸氢盐修饰。

在另一优选例中，所述修饰后的人POU4F2基因序列如SEQ ID NO:2所示。

在另一优选例中，所述针对人POU4F2基因的引物对为序列如SEQ ID NO:13和14所示的引物对。

在另一优选例中，所述针对人POU4F2基因的探针序列包括如SEQ ID NO:15所示的序列。

在另一优选例中，所述针对人POU4F2基因的探针还包括可检测标记。

在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：荧光基团、放射性元素、酶、化学发光剂胶体金，或其组合。

在另一优选例中，所述可检测标记包括位于所述探针的5'端的荧光基团，所述荧光基团包括：FAM、HEX、CY5、CY3、VIC、JOE、TET、5-TAMRA、ROX、Texas Red-X，或其组合。

在另一优选例中，所述可检测标记还包括位于所述探针的3'端的猝灭基团，所述荧光基团包括：BHQ、TAMRA、DABCYL、DDQ，或其组合。

在另一优选例中，所述针对人POU4F2基因的探针包括位于其5'端的荧光基团和位于其3'端的猝灭基团。

在另一优选例中，所述荧光基团为FAM，并且所述猝灭基团为BHQ1。

在另一优选例中，所述特异性检测人TWIST1基因的DNA甲基化水平的检测试剂包括：针对人TWIST1基因的引物对和探针。

在另一优选例中，所述针对人TWIST1基因的引物对和探针是针对修饰后的人TWIST1基因序列的引物对和探针。

在另一优选例中，所述修饰后的人TWIST1基因序列如SEQ ID NO:4所示。

在另一优选例中，所述针对人TWIST1基因的引物对为序列如SEQ ID NO:19和20所示的引物对。

在另一优选例中，所述针对人TWIST1基因的探针序列包括如SEQ ID NO:21所示的序列。

在另一优选例中，所述针对人TWIST1基因的探针还包括可检测标记。

在另一优选例中，所述针对人TWIST1基因的探针包括位于其5'端的荧光基团和位于其3'端的猝灭基团。

在另一优选例中，所述荧光基团为VIC，并且所述猝灭基团为BHQ1。

在另一优选例中，所述针对人POU4F2基因的探针所包括的荧光基团和针对人TWIST1基因的探针所包括的荧光基团是不同的荧光基团。

在本发明的第二方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：用于诊断膀胱癌的检测试剂组合，所述检测试剂组合由以下DNA甲基化水平检测试剂组成：

a)特异性检测人POU4F2基因的DNA甲基化水平的检测试剂；和

b)特异性检测人TWIST1基因的DNA甲基化水平的检测试剂；

并且，所述试剂盒包括：

(i)第一容器，以及位于第一容器中的所述特异性检测人POU4F2基因的DNA甲基化水平的检测试剂；和

(ii)第二容器，以及位于第二容器中的所述特异性检测人TWIST1基因的DNA甲基化水平的检测试剂。

在另一优选例中，所述试剂盒的第一容器和/或第二容器中，还包括：

特异性检测内参基因的检测试剂。

在另一优选例中，所述的内参基因用于指示DNA提取和修饰的质量。

在另一优选例中，所述内参基因为：β-actin基因。

在另一优选例中，所述特异性检测内参基因的检测试剂包括：针对β-actin基因的引物对和探针。

在另一优选例中，所述针对β-actin基因的引物对和探针是针对修饰后的β-actin基因序列的引物对和探针。

在另一优选例中，所述修饰后的β-actin基因序列如SEQ ID NO:6所示。

在另一优选例中，所述针对β-actin基因的引物对为序列如SEQ ID NO:28和29所示的引物对。

在另一优选例中，所述针对β-actin基因的探针序列包括如SEQ ID NO:30所示的序列。

在另一优选例中，所述针对内参基因的探针还包括可检测标记。

在另一优选例中，所述针对内参基因的探针包括位于其5'端的荧光基团和位于其3'端的猝灭基团。

在另一优选例中，所述荧光基团为CY5，并且所述猝灭基团为BHQ2。

在另一优选例中，所述针对人POU4F2基因的探针所包括的荧光基团、针对人TWIST1基因的探针所包括的荧光基团，以及针对内参基因的探针所包括的荧光基团两两之间均为不同的荧光基团。

在另一优选例中，所述针对人POU4F2基因的探针所包括的荧光基团为FAM，针对人TWIST1基因的探针所包括的荧光基团为VIC，并且针对内参基因的探针所包括的荧光基团为CY5。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括针对人POU4F2基因的探针，针对人TWIST1基因的探针和针对内参基因的探针；

并且所述针对人POU4F2基因的探针包括荧光基团FAM，针对人TWIST1基因的探针包括荧光基团VIC，并且针对内参基因的探针包括荧光基团CY5。

在另一优选例中，所述针对人POU4F2基因的引物对的浓度为50nM-500nM，较佳地为100nM-400nM，更佳地为200nM。

在另一优选例中，所述针对人POU4F2基因的探针的浓度为60nM-400nM，较佳地为100nM-200nM，更佳地为150nM。

在另一优选例中，所述针对人TWIST1基因的引物对的浓度为50nM-500nM，较佳地为100nM-400nM，更佳地为200nM。

在另一优选例中，所述针对人TWIST1基因的探针的浓度为60nM-400nM，较佳地为100nM-200nM，更佳地为150nM。

在另一优选例中，所述针对内参基因的引物对的浓度为50nM-500nM，较佳地为100nM-400nM，更佳地为200nM。

在另一优选例中，所述针对内参基因的探针的浓度为60-400nM，较佳地为100nM-200nM，更佳地为150nM。

在另一优选例中，所述针对人POU4F2基因的引物对和探针的摩尔浓度比为0.2:(0.4-0.06)，较佳地0.2:0.15。

在另一优选例中，所述针对人TWIST1基因的引物对和探针的摩尔浓度比为0.2:(0.4-0.06)，较佳地0.2:0.15。

在另一优选例中，所述针对内参基因的引物对和探针的摩尔浓度比为0.2:(0.4-0.06)，较佳地0.2:0.15。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括：

(iii)第三容器，以及位于第三容器中的用于修饰基因的反应体系。

在另一优选例中，所述的用于修饰基因的反应体系中，包括：亚硫酸氢盐、重亚硫酸氢盐、肼盐，或其组合。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括：

(iv)第四容器，以及位于第四容器中的PCR反应体系。

在另一优选例中，所述PCR反应体系包括：DNA聚合酶、dNTPs、Mg²⁺离子，或其组合。

在另一优选例中，所述PCR反应体系中，所述Mg²⁺离子的浓度为1.75mM-4.5mM，较佳地为3mM-3.5mM，更佳地为3.25mM。

在另一优选例中，所述PCR反应体系中，所述dNTPs的浓度为0.1mM-0.35mM，较佳地为0.2mM-0.3mM，更佳地为0.25mM。

在另一优选例中，所述DNA聚合酶为0.4U-2U，较佳地为1-1.8U，更佳地为1.5U。

在另一优选例中，所述第一容器、第二容器、第三容器和/或第四容器是相同的或不同的容器。

在另一优选例中，所述的第一容器或第二容器可各自独立地与第三容器和/或第四容器是相同的或不同的容器。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括标签或说明书，所述标签或说明书中注明所述试剂盒用于检测膀胱癌。

在另一优选例中，所述标签或说明书中包括以下内容：

对于情况(1)和情况(2)：

情况(1)：检测对象POU4F2基因的定量PCR检测结果Ct<35，更佳地，POU4F2基因的Ct<35且Ct_(FAM)-Ct_(CY5)<7；

情况(2)：检测对象TWIST1基因的定量PCR检测结果Ct<35，更佳地，TWIST1基因的Ct<35且Ct_(VIC)-Ct_(CY5)<10；

其中，针对人POU4F2基因的探针标记有FAM荧光基团，针对TWIST1基因的探针标记有VIC荧光基团，且Ct_(FAM)、Ct_(VIC)和Ct_(CY5)分别为荧光检测中所检测到的FAM、VIC和CY5三个荧光通道的Ct值；

若情况(1)和情况(2)同时存在或仅有一个存在，则认为检测对象为膀胱癌患者；若情况(1)和情况(2)均不存在，则认为检测对象为非膀胱癌患者。

在本发明的第三方面，提供了一种诊断膀胱癌的方法，包括步骤：

(i)从受试对象中获得一样品；

(ii)使用如本发明第二方面所述的试剂盒对所述样品进行检测。

在另一优选例中，所述样品为尿液样品或组织样本。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了人POU4F2基因和人TWIST1基因甲基化DNA检测灵敏度(CY5信号)，图中数字表示DNA拷贝数。

图2显示了人POU4F2基因和人TWIST1基因甲基化DNA检测灵敏度(FAM信号)，图中数字表示DNA拷贝数。

图3显示了人POU4F2基因和人TWIST1基因甲基化DNA检测灵敏度(VIC信号)，图中数字表示DNA拷贝数。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一种通过协同检测两种膀胱癌标志物的甲基化DNA来提高膀胱癌检出率的方法，所述的膀胱癌标志物是人POU4F2基因和人TWIST1基因。实验证明，在对膀胱癌的检测中，TWIST1指标和POU4F2指标之间具有互补的作用。选择POU4F2/TWIST1双指标进行检测，检出率不仅显著提高到84.6％，而且特异性非常高(约92.3％)。与其他双指标(如VIM+TWIST1、GDF15+TCF21等)或多指标相比，POU4F2/TWIST1双指标具有高灵敏度和高特异性的综合优势。并且，经过本发明人对各引物探针及反应体系各组分的大量优化和筛选，开发了一套优化的检测体系，使得本发明反应体系的检测灵敏度可达到稳定检出10拷贝/反应。在此基础上完成了本发明。

如本文所用，“待测样本”、“待测样品”或“待测核酸(如DNA)样品”是指待检测的核酸样本，其中含有一种核酸或多种核酸，需要了解其中是否存在目标核酸。本发明中，所述的待测样本可以是：尿液或取自病变部位的组织。

如本文所用，“目标核酸”是指感兴趣的核酸片段，其是人POU4F2基因和人TWIST1基因甲基化DNA特异性片段。

如本文所用，“探针”是指一种具有已知核苷酸序列的单链核酸，其具有与目标核酸基本上互补的核苷酸序列结构，可以与“目标核酸”形成双链。所述的“探针”可以携带标记物。例如，标记物可以连接在探针的5'末端或3'末端。

本发明的相关基因

人POU4F2(POU class 4homeobox 2)基因是POU-结构域转录因子家族的一员，其核苷酸序列可以与NCBI基因数据库：ID:18997序列相同。其编码的蛋白是一个转录因子,是一个能与癌症相关基因如BRCA1和TP53相互作用的多功能蛋白，据报道，POU4F2的缺失赋予了细胞对细胞凋亡的抗性。在本发明中，所针对的POU4F2基因序列如SEQ ID NO:1所示，其被亚硫酸(氢)盐修饰后的序列如SEQ ID NO:2所示。

人TWIST1基因(twist family bHLH transcription factor 1)编码基本的螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子，其核苷酸序列可以与NCBI基因数据库：ID:7291序列相同。其编码的TWIST1蛋白是一种抗细胞凋亡和促转移的碱性螺旋-β环-螺旋转录因子，与细胞谱系决定和分化有关。在乳腺癌，肺癌，宫颈癌和胃癌中，已有报道发现TWIST1启动子的过甲基化。在本发明中，所针对的TWIST1基因序列如SEQ ID NO:3所示，其被亚硫酸(氢)盐修饰后的序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明人发现，在临床膀胱癌患者中，POU4F2基因启动子异常甲基化，而部分POU4F2甲基化阴性的患者中，TWIST1基因启动子异常甲基化，联合检测人POU4F2基因和人TWIST1基因的甲基化情况，可提高膀胱癌患者的检出率。在正常人的尿液样本中，POU4F2基因和TWIST1基因的甲基化检测为阴性。

本发明试剂盒

本发明提供了一种试剂盒。

具体地，本发明提供了一类特别适合于人POU4F2基因和人TWIST1基因甲基化DNA特异性片段检测的引物和探针。基因甲基化位点的选择直接与临床检测灵敏度相关，经过实验，本发明人选取了人POU4F2基因和人TWIST1基因特定的甲基化区域，如对应于人POU4F2基因的SEQ ID NO:1序列，或对应于TWIST1基因的SEQ ID NO:3序列。在此基础上，本发明人还设计了高度特异的引物来扩增出不同的目的片段，并用高度特异的探针来识别。

作为本发明的优选方式，本发明的方法或试剂盒中，还应用内参来指示DNA提取和修饰的质量。所述的内参较佳地为β-actin，并且具有如SEQ ID NO:5所示的基因序列，并且其被亚硫酸(氢)盐修饰后的序列如SEQ ID NO:6所示。

根据临床检测的需要，利用实时荧光PCR技术进行人POU4F2基因和人TWIST1基因甲基化DNA特异性片段检测是较为优选的。当应用实时荧光PCR进行检测时，所述的探针连接有适合于甄别不同基因甲基化DNA片段的荧光基团。探针的前端标记有荧光基团，另一端标记有淬灭基团，其中淬灭基团可淬灭荧光基团发出的荧光。当PCR扩增反应进行时，利用聚合酶的5'外切酶活性将带有荧光基团的碱基切离，游离后的荧光基团不再受淬灭基团的影响，在激发光的作用下可发射一定波长的荧光信号。随着PCR产物的不断积累，荧光信号不断地增强，从而可以检测到特异甲基化DNA的存在。

作为本发明的优选方式，为方便临床使用，在进行检测时，采用在同一个反应管中加入三种不同荧光基团标记的三种特定的探针(对应于人POU4F2基因、人TWIST1基因和β-actin基因)，在一个反应管内同时指示3种目的DNA片段的存在情况。

作为本发明的优选方式，为方便临床使用，检测探针标记的荧光基团可以是VIC、ROX、FAM、CY5、HEX、TET、JOE、NED等；淬灭基团可以是TAMRA、BHQ、MGB、Dabcyl。以适用于目前临床检测常用的多通道PCR检测系统，实现在一个反应管中进行多色荧光检测。

在本发明的一些优选实施方式中，本发明人还对PCR扩增反应中的各组分：包括酶的用量、dNTPs的用量、Mg²⁺离子的浓度以及引物探针的浓度，进行了滴定实验，保证PCR过程各组分含量充足，使扩增效果更为理想。

本发明的检测试剂被置于试剂盒中，从而便于人们应用。除了引物和探针试剂，试剂盒中还可包括：亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐、PCR反应液、Taq聚合酶、质控品、阴性对照和/或使用说明书。

本发明的方法和试剂盒特别适合于膀胱癌辅助诊断和早期诊断，具有高灵敏度、高特异性、操作简便、检测周期短等特点。可有效提高检测准确率，并减少结果的假阴性。

本发明的方法

本发明还提供了一种诊断膀胱癌的方法，所述方法包括：

(1)将待测样品进行亚硫酸盐或重亚硫酸氢盐或肼盐处理，获得经修饰的待测样品；

(2)利用前面所述的用于检测膀胱癌的试剂盒对步骤(1)的经修饰的待测样品进行检测，获得人POU4F2基因的DNA甲基化情况和人TWIST1基因的DNA甲基化情况。

在一个优选实施方式中，若人POU4F2基因DNA甲基化阳性和/或人TWIST1基因的DNA甲基化阳性，则表明待测样品的提供者为膀胱癌高危或膀胱癌患者。

在另一个优选实施方式中，在一个反应管内进行多个核酸片段检测；并同时在一个反应管内进行多个波段荧光信号检测，通过不同的荧光信号区别不同的DNA片段。或者，可以在不同的反应管内进行不同核酸片段检测；并同时在一个反应管内进行单个波段荧光信号检测，通过荧光信号区别不同的DNA片段。

在另一优选例中，所述的核酸样本来源于：含有细胞的样本提取的核酸，如尿液。

本发明的主要优点包括：

1)采用两个标记物联合检测，在两个标志物的特异性都比较高的前提下，使用两个标志物联用的方式，提高了检测的灵敏度。

2)在判断标准中，加入delta Ct值的判断标准，排除了血尿患者中血液对尿液样本的干扰情况，减少了假阳性的出现。

3)实时荧光定量PCR技术利用经亚硫酸氢钠处理后的DNA序列为模板，通过优化的反应体系和高特异Taq酶的使用，在实时荧光PCR平台上实现对样品中甲基化DNA的快速和高特异性检测。

4)相比现有的在临床上使用的生物标记物，本发明的甲基化生物标记物组合具有高灵敏和高特异性的特点。与其他双指标(如VIM+TWIST1、GDF15+TCF21等)或多指标相比，本发明的POU4F2/TWIST1双指标具有高灵敏度和高特异性的综合优势。

5)尿液样本的检测，对患者无创，实现了对膀胱癌患者的快速、定量检测。

6)与采用6种或7种或更多标志物的现有技术相比，本发明的基于POU4F2/TWIST1双指标的方法具有成本低，检验时间短等优势。

7)本发明的基于POU4F2/TWIST1双指标特别适合中国人群。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验指南(第四版)(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,2017)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1：检测靶基因的选择

甲基化DNA作为检测靶标具有明显的优点，相比蛋白质类标志物，DNA是可以扩增的，并且很容易检测到；与突变类标志物相比，甲基化DNA都位于基因的特定部位，一般在启动子区，使检测变得更容易和方便。为了完成本发明，发明人查阅了大量文献，在报道的与膀胱癌相关的基因中，选择有代表性的NID2、VIM、POU4F2、GDF15、TWIST1、TCF21、HOXA9作为候选的检测基因，研究各个基因甲基化位点分布情况，设计检测的引物探针分别用于检测。

各基因检测引物探针如下：

NID2的检测引物和探针为：

NID2引物F：GCGGTTTTTAAGGAGTTTTATTTTC(SEQ ID NO:7)

NID2引物R：CGCTACGAAATTCCCTTTACG(SEQ ID NO:8)

NID2探针：FAM-CCGCTACCCCAAACCTTACGAACC-BHQ1(SEQ ID NO:9)

VIM的检测引物和探针为：

VIM引物F：TTCGGGAGTTAGTTCGCGTT(SEQ ID NO:10)

VIM引物R：ACCGCCGAACATCCTACGA(SEQ ID NO:11)

VIM探针：

FAM-CACGAACCTAATAAACATAACTACGAAAAATAACGATAA-BHQ1(SEQ ID NO:12)

POU4F2的检测引物和探针为：

POU4F2引物F：GGGTTGTGCGAAGTTGAGTTTAT(SEQ ID NO:13)

POU4F2引物R：ACATCCGTTCAAACTAACAACAAAA(SEQ ID NO:14)

POU4F2探针：FAM-CGGATTTTGTACGTTTGATTTCGGTTAC-BHQ1(SEQ ID NO:15)

GDF15的检测引物和探针为：

GDF15引物F：TCGGCGGTTATTTGTATTTGC(SEQ ID NO:16)

GDF15引物R：CGTCGAAAACAACCGAAACA(SEQ ID NO:17)

GDF15探针：FAM-CGAAAAACCTCGAAAAACCCCTCGA-BHQ1(SEQ ID NO:18)

TWIST1的检测引物和探针为：

TWIST1引物F：GTTAGGGTTCGGGGGCGTTGTT(SEQ ID NO:19)

TWIST1引物R：CCGTCGCCTTCCTCCGACGAA(SEQ ID NO:20)

TWIST1探针：FAM-CGGCGGGGAAGGAAATCGTTTC-BHQ1(SEQ ID NO:21)

TCF21的检测引物和探针为：

TCF21引物F：GGTAAGAGGAGGAAGGCGTTTAT(SEQ ID NO:22)

TCF21引物R：CCTTACTCAACACTCGCATACGA(SEQ ID NO:23)

TCF21探针：FAM-CGCGCGTTAACGACGTTACGCTAA-BHQ1(SEQ ID NO:24)

HOXA9的检测引物和探针为：

HOXA9引物F：GTGGTTATTATCGTGTTTAGCGTTT(SEQ ID NO:25)

HOXA9引物R：CCCGATACCACCAAATTATTACATA(SEQ ID NO:26)

HOXA9探针：FAM-TCATAATTTCCGTAAATCGAACCGAACG-BHQ1(SEQ ID NO:27)

内参质控亚硫酸盐修饰过程和DNA质量，其检测引物探针如下：

β-actin的检测引物和探针为：

ACTB引物F：TAGGGAGTATATAGGTTGGGGAAGTT(SEQ ID NO:28)

ACTB引物R：AACACACAATAACAAACACAAATTCAC(SEQ ID NO:29)

ACTB探针：CY5-GTGGGGTGGTGATGGAGGAGGTTTAG-BHQ2(SEQ ID NO:30)

实验过程：

1、提取DNA

收集确诊膀胱癌患者的标本和非肿瘤患者标本，分离细胞，以天根生化科技(北京)有限公司的微量样品基因组DNA提取试剂盒为例，提取DNA。

2、DNA修饰

以ZYMO RESEARCH生物公司试剂盒EZ DNA Methylation-Direct^TM Kit(D5021)说明进行亚硫酸盐修饰。

3、扩增与检测

如下配制反应体系(20ul)：

表1

组分	浓度	一人份加入量(ul)
			10*buffer	-	2
dNTPs	2.5mM	2
			Mg<sup>2+</sup>	25mM	2.6
指标F	10uM	0.4
			指标R	10uM	0.4
指标P	10uM	0.3
			内参F	10uM	0.4
内参R	10uM	0.4
			内参P	10uM	0.3
Taq酶	5U/ul	0.3
			模板	-	5
H<sub>2</sub>0	-	5.9

PCR扩增程序如下：

第一阶段：95℃，10min，1个循环；

第二阶段：95℃，15sec，60℃，1min，45个循环；

信号收集：第二阶段60℃时进行荧光信号采集。

4、检测结果

结果判读：

(1)设置基线3-15个循环，设置阈值10000。

(2)质控品：阳性质控品反应管FAM和CY5均应有信号，阴性质控品应无FAM、CY5扩增信号。

(3)样本判读：

(a)CY5有信号，并且CY5信号Ct值<35，则样本实验结果可信；

(b)若无CY5信号，提示加入的DNA含有PCR抑制剂或DNA处理失败，需要重新提取DNA并进行亚硫酸氢盐处理；

(c)FAM荧光信号的扩增曲线为光滑的'S'形，且Ct值<35，提示人基因甲基化阳性；

(d)Ct值≥35，提示人基因甲基化阴性或甲基化程度低于最低检限；

根据各个扩增情况，检测结果如下表2。

表2

注：“+”为甲基化DNA检测阳性，“-”为甲基化DNA检测阴性。

表3

注：合格标准为：特异性≥80％且灵敏度≥80％。

从其上结果可以看出：

对于四指标组合而言，NID2、GDF15、TCF21、HOXA9四个指标在非肿瘤样本中的特异性差，非肿瘤标本在判定上会导致假阳性，其他4指标组合如POU4F2+NID2+TCF21+GDF15的组合，其特异性仅15.4％；POU4F2+TWIST+VIM+HOXA9的组合，其特异性为53.8％。这提示，指标组合并不一定是越多越好。

对于两指标组合而言，而NID2+POU4F2的组合，虽然灵敏度达到92.3％，但其特异性仅61.5％，因此不合格。此外，VIM+TWIST1的组合，虽然特异性达到92.3％，但其灵敏度为69.2％，因此不合格。GDF15+TCF21的组合，虽然灵敏度达到92.3％，但其特异性仅为15.4％出乎意料的是，VIM和TWIST1均对POU4F2阳性样本有一定互补作用，POU4F2+VIM，灵敏度达到84.6％，特异性84.6％；而POU4F2+TWIST1组合，灵敏度为84.6％，特异性为92.3％。

综合结合考虑到非肿瘤标本的特异性，因此，选择POU4F2/TWIST1双指标进行检测，该组合的检测灵敏度高(84.6％)，并保障了高特异性(92.3％)。

上述结果表明，在中国人群中，POU4F2+TWIST1的双指标组合具有高灵敏度和高特异性的优点。

实施例2：检测体系优化研究

目的：确保PCR反应体系中各成分的用量最适

1、POU4F2引物探针浓度滴定实验

POU4F2引物浓度滴定范围：在50nM，100nM，150nM，200nM，250nM，300nM，350nM，400nM，450nM，500nM的区间进行滴定，以T24细胞系修饰后的DNA为模板，进行定量PCR检测。

结论：随着体系中引物浓度的增加，Ct值先变小后稳定，表明体系中引物的浓度已经达到饱和，引物浓度过高，Ct值反而变大，说明引物浓度过高后反而对PCR反应造成了抑制，在100nM～400nM范围内，POU4F2的Ct值均比较稳定，最佳的，POU4F2引物浓度确定为200nM。

POU4F2探针浓度滴定范围：在60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM的区间进行滴定，以T24细胞系修饰后的DNA为模板，进行定量PCR检测。

结论：随着体系中引物浓度的增加，FAM通道的荧光信号高度逐渐增加，在150nM时已经到达了6.000e+005的荧光水平，所以POU4F2探针浓度确定为150nM。

2、TWIST1引物探针浓度滴定实验

TWIST1引物浓度滴定范围：在50nM，100nM，150nM，200nM，250nM，300nM，350nM，400nM，450nM，500nM的区间进行滴定，以T24细胞系修饰后的DNA为模板，进行定量PCR检测。

结论：随着体系中引物浓度的增加，Ct值先变小后稳定，说明体系中引物的浓度已经达到饱和，在200nM～500nM的范围内，TWIST1的Ct值均比较稳定，更佳地，TWIST1引物浓度确定为200nM。

TWIST1探针浓度滴定范围：在60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM的区间进行滴定，以T24细胞系修饰后的DNA为模板，进行定量PCR检测。

结论：随着体系中探针浓度的增加，VIC通道的荧光信号高度逐渐增减，在150nM时已经到达了4.000e+005的荧光水平，所以TWIST1探针浓度确定为150nM。

3、ACTB引物探针浓度滴定实验

ACTB引物浓度滴定范围：在50nM，100nM，150nM，200nM，250nM，300nM，350nM，400nM，450nM，500nM的区间进行滴定，以T24细胞系修饰后的DNA为模板，进行定量PCR检测。

结论：在50nM～500nM的范围内，ACTB的Ct值均比较稳定，说明体系中引物的浓度已经达到饱和，更佳地，ACTB引物浓度确定为200nM。

ACTB探针浓度滴定范围：在60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM的区间进行滴定，以T24细胞系修饰后的DNA为模板，进行定量PCR检测。

结论：随着体系中探针浓度的增加，CY5通道的荧光信号高度逐渐增减，在150nM时已经到达了3.500e+005的荧光水平，所以ACTB探针浓度确定为150nM。

4、dNTPs浓度滴定实验

dNTPs浓度滴定范围：在100uM，150uM，200uM，250uM，300uM，350uM的区间进行滴定，以T24细胞系修饰后的DNA为模板，进行定量PCR检测。

结论：实验结果发现，dNTPs的浓度在100uM～250uM的范围内，Ct值均保持稳定，dNTPs浓度过高，反而会对PCR反应造成抑制，所以dNTPs浓度确定为250uM。

5、Taq酶浓度滴定实验

Taq酶浓度滴定范围：在0.4U，0.8U，1U，1.25U，1.5U，1.75U，2U的区间进行滴定，以T24细胞系修饰后的DNA为模板，进行定量PCR检测。

结论：体系中1.5U的Taq酶量已经足够保证PCR反应的进行。

6、Mg²⁺浓度滴定实验

Mg²⁺浓度滴定：在1.75mM，2mM，2.5mM，3mM，3.25mM，3.5mM，3.75mM，4mM，4.5mM区间内进行滴定，以T24细胞系修饰后的DNA为模板，进行定量PCR检测。

结论：实验结果发现，Mg²⁺浓度在3mM～4.5mM的范围内，Ct值均保持稳定，更佳地，Mg²⁺浓度确定为3.25mM。

实施例3：分析灵敏度实验

对膀胱癌T24细胞系DNA进行亚硫酸盐修饰，以2500拷贝、250拷贝、25拷贝、10拷贝修饰后T24BisDNA为模板，进行体系灵敏度检测。

检测结果如图1(CY5信号——ACTB)、图2(FAM信号——POU4F2)、图3(VIC信号——TWIST1)所示，10拷贝的T24BisDNA，三重复的CV分别为1.73％(CY5)、1.02％(FAM)、1.98％(VIC)，表明本发明反应体系的检测灵敏度可达到稳定检出10拷贝/test。

实施例4：正常人血液样本检测(膀胱癌阳性样本的判断标准的建立)

收集某医院的正常人体检血液样本共计43份。DNA抽提、亚硫酸氢盐修饰、并进行定量检测。

检测结果如下表4。

表4

为排除膀胱癌患者中血尿样本的干扰，我们收集正常人血液样本，以修正血尿带来的检测偏差，更真实、准确地保障检测结果的准确性。上表为部分正常人数据显示，根据正常人的结果统计，发现在正常人血液样本中，POU4F2指标的delta Ct>7，TWIST1的deltaCt>10。

因此，膀胱癌阳性样本的进一步判断标准为：POU4F4：Ct<35且Ct_(FAM)-Ct_(CY5)<7或TWIST1：Ct<35且Ct_(VIC)-Ct_(CY5)<10。

实施例5：临床样本检测

基于实施例1-4的结果，在本实施例中，进一步验证本发明POU4F2+TWIST1的双指标的检测性能。方法如下：收集某肿瘤医院临床确诊膀胱癌和非膀胱癌患者(包括其他癌症，膀胱炎症，结石等良性疾病，既往膀胱癌且无复发患者，健康人)的尿液样本共计40份。离心收集细胞，并用PBS洗细胞两次。DNA提取、亚硫酸盐修饰、并进行定量检测。

结果判读：

(1)设置基线3-15个循环，设置阈值10000。

(2)质控品：阳性质控品反应管FAM、VIC和CY5均应有信号，阴性质控品应无FAM、VIC及CY5扩增信号。

(3)样本判读：

(a)CY5有信号，并且CY5信号Ct值<35，则样本实验结果可信；若无CY5信号，提示加入的DNA含有PCR抑制剂或DNA处理失败，需要重新提取DNA并亚硫酸氢盐处理；

(c)FAM荧光信号的扩增曲线为光滑的'S'形，Ct值<35且Ct_(FAM)-Ct_(CY5)<7，提示人基因甲基化阳性；Ct值≥35或Ct_(FAM)-Ct_(CY5)≥7，提示甲基化程度低于最低检出限或人基因甲基化阴性；

(e)VIC荧光信号的扩增曲线为光滑的'S'形，Ct值<35且Ct_(VIC)-Ct_(CY5)<10，提示人基因甲基化阳性；Ct值≥35或Ct_(VIC)-Ct_(CY5)≥10，提示甲基化程度低于最低检出限或人基因甲基化阴性；

检测结果如下表5。

表5

样本判断方法如表6。

表6

表4结果表明，21例膀胱癌患者和48例非膀胱癌患者(包括其他癌症，膀胱炎症等良性疾病，膀胱癌患者复查且无复发患者，正常人)的尿液样本，POU4F2/TWSIT1双指标在21例膀胱癌患者中，检测出了18例，灵敏度为85.7％，特别是，有2例POU4F2指标为阴性的膀胱癌患者，TWIST1指标阳性，说明TWIST1指标能够对POU4F2指标起到补充作用。在48例非膀胱癌样本中，检出了4例阳性样本(两例为膀胱癌未复发患者，1例为输尿管尿路上皮癌，1例为膀胱结石)，特异性为91.7％。特别是对15号和26号样本，在加入delta Ct判定之前为阳性，而在加入delta Ct值后，变为阴性，使特异性由87.5％变为91.7％，说明delta Ct的加入能够提高检测指标的特异性。而且，19例正常体检样本中，无一例阳性，特异性达到了100％。

综上说明，POU4F2/TWSIT1双指标可以高灵敏和高特异地用于对膀胱癌患者进行早期诊断和筛查。

实施例6：检测膀胱癌的试剂盒

提供试剂盒，其中包括：

PCR反应液：1x PCR buffer；0.2uM POU4F2基因的扩增引物对(SEQ ID NO:13，SEQID NO:14)，0.15uM POU4F2的检测探针(SEQ ID NO:15)，0.2uM TWIST1基因的扩增引物对(SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20)，0.15uM TWSIT1的检测探针(SEQ ID NO:21)，以及0.2uMβ-actin基因的扩增引物对(SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:29)和0.15uMβ-actin基因的检测探针(SEQ ID NO:30)；3.25mM MgCl₂、0.25mM dNTPs。

聚合酶：50U Taqman聚合酶

阳性质控品(1000拷贝/ul标准品质粒，在5000拷贝/ulβ-actin质粒背景下)

阴性对照：DEPC H₂O

DNA修饰液：3M亚硫酸氢钠(PH5.0)

讨论

在本发明中，提供了一种利用由POU4F2基因和TWIST1基因这两种基因的甲基化检测试剂的组合，来检测膀胱癌的技术手段。

在已知的肿瘤标志物中，有多种基因可被用来诊断膀胱癌。本发明是从大量的已知标志物中，筛选出了两种基因，其甲基化的水平可以互相协同并互补地作为膀胱癌诊断依据。

在本领域中，出现过将多种基因的检测结果共同作为膀胱癌诊断依据的技术方案。然而，这类检测方案由于标志物过多，不仅检测成本高，假阳性率也高。此外，由于中国人群与白人等人群不同，因此检测灵敏度和特异性也有所不同。

相比于上述多标志物组合或其他双标志物的组合，本发明所提供的技术方案中，仅检测POU4F2和TWIST1两种基因的甲基化水平，具有出乎意料的高检出灵敏度(高达85.7％)，并且具有极高的特异性(在实施例5中对21例膀胱癌患者和48例非膀胱癌患者验证实验中，检出特异性为91.7％，对正常患者的检测正确率为100％)。

此外，由于本发明所提供的技术方案中，检测的标志物数量的减少，大量地缩减了检测成本和检测时间，因此在生物技术和医疗领域中具有极大的应用前景。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海透景生命科技股份有限公司

上海透景诊断科技有限公司

<120> 一种膀胱癌的新型基因诊断方法

<130> P2019-0434

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1106

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

caagacctgc tgaatactta agagagagag aggggaaaat tggttggagg tgtggggtga 60

tttgctgtgc agacatgaaa aaaacatcaa gcagataaag ggggctgtca aaatgtgcct 120

ttaagcggtg attatgcaga aatacgcacc ggtggggttg gaagacaggc tctccgcata 180

gcctccgagc ccccgccgcc gctgctgcca ctgctgctgg agctgctgct tcggcctccg 240

ccgccgccgc cgccgccgcc gccgccgccg ccaccaccag cgttgctcga gctgctgggg 300

gagctggccg agggcgcgat gggagccgag gagcccggcg aggtgctgtg cagtgccgag 360

tacttgggct ccacgtgcag gctgccgccg tgcggcatgc taaacgcctg cttgctgttc 420

agggacatca tcatcatctt cccgcccgcc ggggcgctgg tccgtagagg cactcactgg 480

tcccggctgc cgggaccctc cgagaagtgc cgggccagcc ggggctggag ctgggaaggg 540

ctgtgcgaag ttgagctcac ccgccgccgc ctccggactc tgtacgcctg atctcggcta 600

cgcgctcctt cgccgcctct gctgtcagtc tgaacggatg cctgactccg cttgccgcta 660

gctgcagacc tcggcacccg aaactgcccc cgctcctcgc ggccggcgag ttatactccc 720

ctctccccgc gcctaccccc gcgccccccg ccctccctct ctccctctct cccgcgcgcc 780

tccgccctcc cttgccagga aacgccggct cctgttcggt ttctcgcgtt gccccttctt 840

cctctctact cccctcaggc ttgagtcctt tctgctctct cagcactcgc ctcgcgctcc 900

cccaccgcgc cctccgccgc ctcttttctg cccccgcccg tgctctgttg ccgccgcccc 960

ttcgcagcgt cccgcggctg ctactcacaa tcgcgccccc actcaacccc acccaaatgg 1020

ccaggtccgc gctccagtcg ccgggcagtg cctacctaag gaccagcctc cagcccctcc 1080

cgcttcttct gccgggtctc tgtctc 1106

<210> 2

<211> 1106

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taagatttgt tgaatattta agagagagag aggggaaaat tggttggagg tgtggggtga 60

tttgttgtgt agatatgaaa aaaatattaa gtagataaag ggggttgtta aaatgtgttt 120

ttaagcggtg attatgtaga aatacgtatc ggtggggttg gaagataggt ttttcgtata 180

gttttcgagt tttcgtcgtc gttgttgtta ttgttgttgg agttgttgtt tcggttttcg 240

tcgtcgtcgt cgtcgtcgtc gtcgtcgtcg ttattattag cgttgttcga gttgttgggg 300

gagttggtcg agggcgcgat gggagtcgag gagttcggcg aggtgttgtg tagtgtcgag 360

tatttgggtt ttacgtgtag gttgtcgtcg tgcggtatgt taaacgtttg tttgttgttt 420

agggatatta ttattatttt ttcgttcgtc ggggcgttgg ttcgtagagg tatttattgg 480

tttcggttgt cgggattttt cgagaagtgt cgggttagtc ggggttggag ttgggaaggg 540

ttgtgcgaag ttgagtttat tcgtcgtcgt tttcggattt tgtacgtttg atttcggtta 600

cgcgtttttt cgtcgttttt gttgttagtt tgaacggatg tttgatttcg tttgtcgtta 660

gttgtagatt tcggtattcg aaattgtttt cgtttttcgc ggtcggcgag ttatattttt 720

tttttttcgc gtttattttc gcgtttttcg tttttttttt tttttttttt ttcgcgcgtt 780

ttcgtttttt tttgttagga aacgtcggtt tttgttcggt ttttcgcgtt gttttttttt 840

tttttttatt ttttttaggt ttgagttttt tttgtttttt tagtattcgt ttcgcgtttt 900

tttatcgcgt ttttcgtcgt tttttttttg ttttcgttcg tgttttgttg tcgtcgtttt 960

ttcgtagcgt ttcgcggttg ttatttataa tcgcgttttt atttaatttt atttaaatgg 1020

ttaggttcgc gttttagtcg tcgggtagtg tttatttaag gattagtttt tagttttttt 1080

cgtttttttt gtcgggtttt tgtttt 1106

<210> 3

<211> 1297

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

ccgcgccaca ccaccccccc agccccagca atcccaaatc ggccccacgg acctagaggg 60

ctcttgggcg agatgagaca tcacccactg tgtagaagct gttgccattg ctgctgtcac 120

agccactccg gatggggctg ccaccgcggc caggacagtc tcctccgacc gcttcctggg 180

ctgcgctagg gttcgggggc gctgcccgca cgctccggcg gggaaggaaa tcgccccgcg 240

cccgccggag gaaggcgacg gggagggaag ggggagggcg gctaggaggc gggtggaggg 300

gccggccgcc cgggccaggt cgtttttgaa tggtttggga ggacgaattg ttagaccccg 360

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gctctgcagc accggcaccg tttccaggag gcctggcggg gtgtgcgtcc agccgttggg 600

cgctttcttt ttggacctcg gggccatcca caccgtcccc tccccctccc gcctccctcc 660

ccgcctcccc cgcgcgccct ccccgcggag gtccctcccg tccgtcctcc tgctctctcc 720

tccgcgggcc gcatcgcccg ggccggcgcc gcgcgcgggg gaagctggcg ggctgaggcg 780

ccccgctctt ctcctctgcc ccgggcccgc gaggccacgc gtcgccgctc gagagatgat 840

gcaggacgtg tccagctcgc cagtctcgcc ggccgacgac agcctgagca acagcgagga 900

agagccagac cggcagcagc cgccgagcgg caagcgcggg ggacgcaagc ggcgcagcag 960

caggcgcagc gcgggcggcg gcgcggggcc cggcggagcc gcgggtgggg gcgtcggagg 1020

cggcgacgag ccgggcagcc cggcccaggg caagcgcggc aagaagtctg cgggctgtgg 1080

cggcggcggc ggcgcgggcg gcggcggcgg cagcagcagc ggcggcggga gtccgcagtc 1140

ttacgaggag ctgcagacgc agcgggtcat ggccaacgtg cgggagcgcc agcgcaccca 1200

gtcgctgaac gaggcgttcg ccgcgctgcg gaagatcatc cccacgctgc cctcggacaa 1260

gctgagcaag attcagaccc tcaagctggc ggccagg 1297

<210> 4

<211> 1297

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcgcgttata ttattttttt agttttagta attttaaatc ggttttacgg atttagaggg 60

tttttgggcg agatgagata ttatttattg tgtagaagtt gttgttattg ttgttgttat 120

agttatttcg gatggggttg ttatcgcggt taggatagtt tttttcgatc gttttttggg 180

ttgcgttagg gttcgggggc gttgttcgta cgtttcggcg gggaaggaaa tcgtttcgcg 240

ttcgtcggag gaaggcgacg gggagggaag ggggagggcg gttaggaggc gggtggaggg 300

gtcggtcgtt cgggttaggt cgtttttgaa tggtttggga ggacgaattg ttagatttcg 360

aggaagggag gtgggacggg ggagggggat tggaaagcgg aaattttttt ataaaatttc 420

gaaaagtttt ttttttttac gttaggttaa tgatattgtt gtttttaaat ttttcgtttg 480

tacggaggta taagagtttt taagtttgta gttttcgttt aatttttaga tatttcgcgg 540

gttttgtagt atcggtatcg tttttaggag gtttggcggg gtgtgcgttt agtcgttggg 600

cgtttttttt ttggatttcg gggttattta tatcgttttt tttttttttc gttttttttt 660

tcgttttttt cgcgcgtttt tttcgcggag gtttttttcg ttcgtttttt tgtttttttt 720

ttcgcgggtc gtatcgttcg ggtcggcgtc gcgcgcgggg gaagttggcg ggttgaggcg 780

tttcgttttt tttttttgtt tcgggttcgc gaggttacgc gtcgtcgttc gagagatgat 840

gtaggacgtg tttagttcgt tagtttcgtc ggtcgacgat agtttgagta atagcgagga 900

agagttagat cggtagtagt cgtcgagcgg taagcgcggg ggacgtaagc ggcgtagtag 960

taggcgtagc gcgggcggcg gcgcggggtt cggcggagtc gcgggtgggg gcgtcggagg 1020

cggcgacgag tcgggtagtt cggtttaggg taagcgcggt aagaagtttg cgggttgtgg 1080

cggcggcggc ggcgcgggcg gcggcggcgg tagtagtagc ggcggcggga gttcgtagtt 1140

ttacgaggag ttgtagacgt agcgggttat ggttaacgtg cgggagcgtt agcgtattta 1200

gtcgttgaac gaggcgttcg tcgcgttgcg gaagattatt tttacgttgt tttcggataa 1260

gttgagtaag atttagattt ttaagttggc ggttagg 1297

<210> 5

<211> 491

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

caccccaccc ccccagcact ccacccagtt caacgttcca cgaaccccca gaaccagccc 60

tcatcaacag gcagcaagaa gggccccccg cccatcgccc cacaacgcca gccgggtgaa 120

cgttggcagg tcctgaggca gctggcaaga cgcctgcagc tgaaagatac aaggccaggg 180

acaggacagt cccatcccca ggaggcaggg agtatacagg ctggggaagt ttgcccttgc 240

gtggggtggt gatggaggag gctcagcaag tcttctggac tgtgaacctg tgtctgccac 300

tgtgtgctgg gtggtggtca tctttcccac caggctgtgg cctctgcaac cttcaaggga 360

ggagcaggtc ccattggctg agcacagcct tgtaccgtga actggaacaa gcagcctcct 420

tcctggccac aggttccatg tccttatatg gactcatctt tgcctattgc gacacacact 480

cagtgaacac c 491

<210> 6

<211> 491

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tattttattt ttttagtatt ttatttagtt taacgtttta cgaattttta gaattagttt 60

ttattaatag gtagtaagaa gggtttttcg tttatcgttt tataacgtta gtcgggtgaa 120

cgttggtagg ttttgaggta gttggtaaga cgtttgtagt tgaaagatat aaggttaggg 180

ataggatagt tttattttta ggaggtaggg agtatatagg ttggggaagt ttgtttttgc 240

gtggggtggt gatggaggag gtttagtaag ttttttggat tgtgaatttg tgtttgttat 300

tgtgtgttgg gtggtggtta ttttttttat taggttgtgg tttttgtaat ttttaaggga 360

ggagtaggtt ttattggttg agtatagttt tgtatcgtga attggaataa gtagtttttt 420

ttttggttat aggttttatg tttttatatg gatttatttt tgtttattgc gatatatatt 480

tagtgaatat t 491

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcggttttta aggagtttta ttttc 25

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgctacgaaa ttccctttac g 21

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccgctacccc aaaccttacg aacc 24

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttcgggagtt agttcgcgtt 20

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

accgccgaac atcctacga 19

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cacgaaccta ataaacataa ctacgaaaaa taacgataa 39

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gggttgtgcg aagttgagtt tat 23

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acatccgttc aaactaacaa caaaa 25

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cggattttgt acgtttgatt tcggttac 28

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tcggcggtta tttgtatttg c 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cgtcgaaaac aaccgaaaca 20

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cgaaaaacct cgaaaaaccc ctcga 25

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gttagggttc gggggcgttg tt 22

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ccgtcgcctt cctccgacga a 21

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cggcggggaa ggaaatcgtt tc 22

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggtaagagga ggaaggcgtt tat 23

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ccttactcaa cactcgcata cga 23

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cgcgcgttaa cgacgttacg ctaa 24

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gtggttatta tcgtgtttag cgttt 25

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cccgatacca ccaaattatt acata 25

<210> 27

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tcataatttc cgtaaatcga accgaacg 28

<210> 28

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tagggagtat ataggttggg gaagtt 26

<210> 29

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

aacacacaat aacaaacaca aattcac 27

<210> 30

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gtggggtggt gatggaggag gtttag 26

Claims

1.一种检测试剂组合的用途，其特征在于，用于制备一试剂盒，所述试剂盒用于诊断膀胱癌；

a)特异性检测人POU4F2基因的DNA甲基化水平的检测试剂；和

b)特异性检测人TWIST1基因的DNA甲基化水平的检测试剂；

并且，所述试剂盒的使用对象是亚洲人群。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述特异性检测人POU4F2基因的DNA甲基化水平的检测试剂包括：针对人POU4F2基因的引物对和探针。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述针对人POU4F2基因的引物对为序列如SEQ ID NO:13和14所示的引物对。

4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述针对人POU4F2基因的探针序列包括如SEQ ID NO:15所示的序列。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述特异性检测人TWIST1基因的DNA甲基化水平的检测试剂包括：针对人TWIST1基因的引物对和探针。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述针对人TWIST1基因的引物对为序列如SEQ ID NO:19和20所示的引物对。

7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述针对人TWIST1基因的探针序列包括如SEQ ID NO:21所示的序列。

8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于诊断膀胱癌的检测试剂组合，所述检测试剂组合由以下DNA甲基化水平检测试剂组成：

a)特异性检测人POU4F2基因的DNA甲基化水平的检测试剂；和

b)特异性检测人TWIST1基因的DNA甲基化水平的检测试剂；

并且，所述试剂盒包括：(i)第一容器，以及位于第一容器中的所述特异性检测人POU4F2基因的DNA甲基化水平的检测试剂；和

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的第一容器和/或第二容器中，还包括：

特异性检测内参基因的的检测试剂。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述内参基因为β-actin基因。

11.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括针对人POU4F2基因的探针，针对人TWIST1基因的探针和针对内参基因的探针；