CN111575377B - 用于line-1的检测引物组及其应用 - Google Patents
用于line-1的检测引物组及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111575377B CN111575377B CN202010425155.5A CN202010425155A CN111575377B CN 111575377 B CN111575377 B CN 111575377B CN 202010425155 A CN202010425155 A CN 202010425155A CN 111575377 B CN111575377 B CN 111575377B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ine1
- cancer
- tumor
- concentration
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 28
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 56
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 13
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 5
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 4
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 claims description 3
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 claims description 3
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 claims 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 7
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 101710159080 Aconitate hydratase A Proteins 0.000 description 1
- 101710159078 Aconitate hydratase B Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 101000666833 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 20.8 kDa protein in FGF-VUBI intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000977023 Azospirillum brasilense Uncharacterized 17.8 kDa protein in nodG 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000977027 Azospirillum brasilense Uncharacterized protein in nodG 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000962005 Bacillus thuringiensis Uncharacterized 23.6 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000961984 Bacillus thuringiensis Uncharacterized 30.3 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101000644901 Drosophila melanogaster Putative 115 kDa protein in type-1 retrotransposable element R1DM Proteins 0.000 description 1
- 101000785191 Drosophila melanogaster Uncharacterized 50 kDa protein in type I retrotransposable element R1DM Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000747704 Enterobacteria phage N4 Uncharacterized protein Gp1 Proteins 0.000 description 1
- 101000747702 Enterobacteria phage N4 Uncharacterized protein Gp2 Proteins 0.000 description 1
- 101000861206 Enterococcus faecalis (strain ATCC 700802 / V583) Uncharacterized protein EF_A0048 Proteins 0.000 description 1
- 101000769180 Escherichia coli Uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000758599 Escherichia coli Uncharacterized 14.7 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101000768930 Lactococcus lactis subsp. cremoris Uncharacterized protein in pepC 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000976301 Leptospira interrogans Uncharacterized 35 kDa protein in sph 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000976302 Leptospira interrogans Uncharacterized protein in sph 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000778886 Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae serovar Lai (strain 56601) Uncharacterized protein LA_2151 Proteins 0.000 description 1
- 208000007433 Lymphatic Metastasis Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 101000658690 Neisseria meningitidis serogroup B Transposase for insertion sequence element IS1106 Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 101000748660 Pseudomonas savastanoi Uncharacterized 21 kDa protein in iaaL 5'region Proteins 0.000 description 1
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710105008 RNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 101000584469 Rice tungro bacilliform virus (isolate Philippines) Protein P1 Proteins 0.000 description 1
- 101001121571 Rice tungro bacilliform virus (isolate Philippines) Protein P2 Proteins 0.000 description 1
- 101000818096 Spirochaeta aurantia Uncharacterized 15.5 kDa protein in trpE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000818098 Spirochaeta aurantia Uncharacterized protein in trpE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000766081 Streptomyces ambofaciens Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in unstable DNA locus Proteins 0.000 description 1
- 101001026590 Streptomyces cinnamonensis Putative polyketide beta-ketoacyl synthase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000804403 Synechococcus elongatus (strain PCC 7942 / FACHB-805) Uncharacterized HIT-like protein Synpcc7942_1390 Proteins 0.000 description 1
- 101000750910 Synechococcus elongatus (strain PCC 7942 / FACHB-805) Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator Synpcc7942_2319 Proteins 0.000 description 1
- 101000750896 Synechococcus elongatus (strain PCC 7942 / FACHB-805) Uncharacterized protein Synpcc7942_2318 Proteins 0.000 description 1
- 101000644897 Synechococcus sp. (strain ATCC 27264 / PCC 7002 / PR-6) Uncharacterized protein SYNPCC7002_B0001 Proteins 0.000 description 1
- 101000916321 Xenopus laevis Transposon TX1 uncharacterized 149 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000916336 Xenopus laevis Transposon TX1 uncharacterized 82 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001000760 Zea mays Putative Pol polyprotein from transposon element Bs1 Proteins 0.000 description 1
- 101000760088 Zymomonas mobilis subsp. mobilis (strain ATCC 10988 / DSM 424 / LMG 404 / NCIMB 8938 / NRRL B-806 / ZM1) 20.9 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000678262 Zymomonas mobilis subsp. mobilis (strain ATCC 10988 / DSM 424 / LMG 404 / NCIMB 8938 / NRRL B-806 / ZM1) 65 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150102487 ine gene Proteins 0.000 description 1
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000007427 paired t-test Methods 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 230000018412 transposition, RNA-mediated Effects 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了用于LINE‑1的检测引物组及其应用，引物组包括如SEQ ID NO.1、2、7和8所述的引物。本发明一些实例的引物组，具有很好的特异性及极佳的扩增效率。可以用于多种肿瘤的早期筛查、复发诊断、治疗监测，具有简便、快捷、准确的优势。
Description
技术领域
本发明涉及基因领域，特别涉及用于LINE-1的检测引物组及其应用。
背景技术
癌症是困扰人类的一大疾病，根据统计数据，2018年全球新增约1810万癌症病例，另有970癌症患者死亡。癌症的早期筛查、诊断能有效的降低癌症死亡率。治疗效果、复发的有效监测能为癌症病人的精准治疗提供可靠参考。目前癌症诊断的金标准是影像学检测。但是影像学检测存在一些局限性：很难在早期发现肿瘤发生，且部分影像学检测存在适应性差〔如肠镜〕、成本较高等缺点。
Cell-free DNA(cfDNA)即游离DNA，是存在于血清、血浆和其它体液(即尿、腹水等)且高度降解的细胞外DNA。主要来源于细胞的凋亡和死亡。当细胞发生癌变时，会释放特异的DNA进入血液，通过检测肿瘤特也cfDNA，可以监测癌症的发生与发展。随着技术的发展循环肿瘤DNA(ctDNA)在肿瘤检测中便捷、快速、无创等优点，表现出很强的优势。
然而目前以ctDNA为标志物的检测方法大多需要检测多个基因，且只能监测一种癌症，导致检测成本居高不下，很难广泛推广，且检测特异性和灵敏度较低。
长散布元件(LINE-1， long interspersed nucleotid element 1，L1)属于中度重复序列，是人类基因组中最丰富的能自主转座的非末端重复序列反转录转座子，约有850000个拷贝，占基因组的17％。典型的L1元件全长为6500kb，包括5’UTR，两个读码框(ORF1和ORF2)，和3’UTR。两个读码框分别编码两种蛋白，具有分子伴侣活性的非特异RNA结合蛋白(40kDa)及具有反转录酶(RT)和核酸内切酶(EN)的活性150kDa的蛋白质，是反转座作用所必须的。LINE-1过表达可以促进细胞增殖，对肿瘤的预后及转移产生影响。LINE-1反转录转座和甲基化状态在临床诊断、预后、疾病监测以及治疗等方面有着潜在的应用价值。
LINE-1与多种肿瘤相关，通过检测LINE-1的表达情况下，可以对多种肿瘤进行筛查。然而LINE-1在人类基因组中虽然存在很多份拷贝，但是由于 95%以上的 LINE-1 5′端存在缺失，其中有 10 % LINE-1 还存在重排，因此具有序列全长及转座活性的 LINE-1 非常少见，具体LINE-1上哪些片段可作为肿瘤筛查的检测靶点，需要对LINE-1相关研究做广泛调研，并需要较为大量样品的验证。且单一引物检测效果可能并不具备足够的特异性和灵敏度，两对甚至多对引物结合可能有更好的效果，如何筛选出合适的引物组合是一个难点所在。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种用于LINE-1的检测引物组及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
一种用于游离LINE-1检测的引物组，包括以下至少一对引物：
LINE1-S-A引物对，其正向序列为：TGGCACATATACACCATGGAA，反向序列为：TGAGAATGATGGTTTCCAATTTC；
LINE1-L-A引物对，其正向序列为：ACACCTATTCCAAAATTGACCAC，反向序列为：TTCCCTCTACACACTGCTTTGA。
在一些实例中，所述引物组同时包括LINE1-S-A引物对和LINE1-L-A引物对。
本发明的第二个方面，提供：
一种用于游离LINE-1检测的试剂盒，其包括本发明第一个方面的用于游离LINE-1检测的引物组。
在一些实例中，所述试剂盒的引物组同时包括LINE1-S-A引物对和LINE1-L-A引物对。
在一些实例中，所述试剂盒还包括游离DNA提取试剂。
在一些实例中，所述试剂盒为定量PCR试剂盒。
本发明的第三个方面，提供：
本发明第一个方面的用于游离LINE-1检测的引物组在制备肿瘤筛查、诊断或监测试剂中的应用。
在一些实例中，所述引物组同时包括LINE1-S-A引物对和LINE1-L-A引物对。
在一些实例中，所述肿瘤选自结直肠癌、淋巴癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、胃癌。
在一些实例中，基于LINE1-S-A引物对和LINE1-L-A引物对对样品的绝对定量PCR结果，计算负荷指数，确定肿瘤的情况。
在一些实例中，所述负荷指数的计算方法为：
y=22.457+8.507*x1+1.59*x2-0.314*x1*x2
式中，x1为通过引物LINE1-S-A Ct值计算出的浓度取log2，x2为通过引物LINE1-L-A Ct值计算出的浓度取log2，y为负荷指数，浓度单位为ng/μL。
肿瘤的情况包括但不限于肿瘤发生的风险、预后、复发风险、治疗进展或响应、转移风险、特别是淋巴转移风险。
本发明的第四个方面，提供：
本发明第二个方面的用于游离LINE-1检测的试剂盒在制备肿瘤筛查、诊断或监测试剂中的应用。
在一些实例中，所述试剂盒的引物组同时包括LINE1-S-A引物对和LINE1-L-A引物对。
在一些实例中，所述肿瘤选自结直肠癌、淋巴癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、胃癌。
在一些实例中，基于LINE1-S-A引物对和LINE1-L-A引物对对样品的绝对定量PCR结果，计算负荷指数，确定肿瘤的情况。
在一些实例中，所述负荷指数的计算方法为：
y=22.457+8.507*x1+1.59*x2-0.314*x1*x2
式中，x1为通过引物LINE1-S-A Ct值计算出的浓度取log2，x2为通过引物LINE1-L-A Ct值计算出的浓度取log2，y为负荷指数，浓度单位为ng/μL。
本发明的第五个方面，提供：
一种用于肿瘤筛查、诊断或监测的系统，包括：
游离LINE-1基因提取装置；
游离LINE-1基因定量装置，其使用的引物组如本发明第一个方面所述；
数据处理装置，基于游离LINE-1基因定量的结果，计算负荷指数，确定肿瘤的情况。
在一些实例中，所述引物组同时包括LINE1-S-A引物对和LINE1-L-A引物对。
在一些实例中，所述肿瘤选自结直肠癌、淋巴癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、胃癌。
在一些实例中，基于LINE1-S-A引物对和LINE1-L-A引物对对样品的绝对定量PCR结果，计算负荷指数，确定肿瘤的情况。
在一些实例中，所述负荷指数的计算方法为：
y=22.457+8.507*x1+1.59*x2-0.314*x1*x2
式中，x1为通过引物LINE1-S-A Ct值计算出的浓度取log2，x2为通过引物LINE1-L-A Ct值计算出的浓度取log2，y为负荷指数，浓度单位为ng/μL。
实例中负荷指数越高，肿瘤发生风险越高，或进展越严重。在同一肿瘤患者对比中，肿瘤负荷指数升高，说明肿瘤发展出现恶化。
本发明的有益效果是：
本发明一些实例的引物组，可以有效扩增出能有效反应肿瘤情况的游离LINE-1基因片段，同时具有很好反应的特异性及极佳的扩增效率。特别的，结合于LINE1-S-A引物对和LINE1-L-A引物对的绝对定量PCR结果，可以通过计算负荷指数反应肿瘤情况，可以用于多种肿瘤的早期筛查、复发诊断、治疗监测，具有简便、快捷、准确的优势。
本发明一些实例的试剂盒，具有很好的特异性及极佳的扩增效率。可以用于多种肿瘤的早期筛查、复发诊断、治疗监测，具有简便、快捷、准确的优势。
附图说明
图1、三对短片段引物LINE1-S-A、LINE1-S-B、LINE1-S-C溶解曲线；
图2、三对长片段引物LINE1-L-A、LINE1-L-B、LINE1-L-C溶解曲线；
图3、三对短片段引物LINE1-S-A、LINE1-S-B、LINE1-S-C在相同模板浓度下扩增曲线；
图4、三对长片段引物LINE1-L-A、LINE1-L-B、LINE1-L-C在相同模板浓度下扩增曲线；
图5、LINE1-S-A灵敏度检测结果；
图6、LINE1-L-A灵敏度检测结果；
图7、肿瘤患者与健康人LINE1负荷指数；
图8、健康人、肿瘤患者LINE-A检测浓度的ROC曲线；
图9、健康人、肿瘤患者LINE-B检测浓度的ROC曲线；
图10、健康人、肿瘤患者肿瘤负荷指数的ROC曲线；
图11、肿瘤患者手术前和手术后一个月肿瘤负荷指数比对。
具体实施方式
下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。
特异性比较：
基于公开的LINE1序列，设计了2对长片段扩增引物、2对短片段扩增引物，并选则以往文献中报道过的一长一短2对引物（表1）作为比较，发现LINE1-S-A、LINE1-L-A两对引物具有最好的扩增效率和特异性，因此后续检测实验均用LINE1-S-A、LINE1-L-A。
表1：设计引物与文献中引物序列
注：“*”处所注文献为：宋现让. 以LINE1基因为测定对象的ctDNA含量和完整性测定方法。引物序列的SEQ ID NO.编号由上到下依次为1～12。
用标准品对表2中引物灵敏度和特异性进行QPCR检测。利用实时荧光定量PCR中溶解曲线的原理，通过分别测试LINE1-S-A和LINE1-L-A两对引物的特异性，发现LINE1-S-A和LINE1-L-A的溶解曲线具有单一的峰（图1和图2），表明该方法中的LINE1-S-A和LINE1-L-A两对引物具有较高的特异性，能够特异地检测到LINE基因。并且从PCR扩增曲线看出LINE1-S-A和LINE1-L-A具有比其他引物更好的扩增能力（图3和图4）。因此挑选LINE1-S-A和LINE1-L-A作为检测引物。
扩增灵敏度实验：
利用梯度稀释，将标准品DNA稀释到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6ng/μL 5个浓度梯度，分别对LINE1-S-A和LINE1-L-A两对引物灵敏度进行检测。发现LINE1-S-A和LINE1-L-A引物灵敏度均可达到10-6ng/μL（图5和图6）。
实际样品的检测：
血液采集：用EDTA采血管或游离DNA采血管采集血液样品，在4℃条件下1600×g离心10min，离心后取上清（血浆），再4℃条件下以12000×g离心10min去除残余细胞，上清所需的血浆，标记后-20℃保存。
cfDNA提取：取分离得到的上清200μL，用QIAGEN QIAamp Blood Mini kitDNA提取试剂盒提取cfDNA，测定DNA浓度。
QPCR检测：采用绝对定量PCR的方法。其中标准品为Themo公司的TaqMan ControlGenomic DNA (human)，货号为4312660。将标准品稀释至以下浓度：10-3、10-2、10-1、0.5、1、2ng/μL。标准品各浓度和样品用LINE1-S-A、LINE1-L-A两对引物进行QPCR检测。每个样品做3个重复。
结果分析：根据标准品浓度与Ct值拟合标准曲线，得出计算浓度公式，将样品Ct值带入公式，计算得到样品中目的基因浓度。将浓度带入以下公式，得到负荷指数。
y=22.457+8.507*x1+1.59*x2-0.314*x1*x2
其中x1为通过引物LINE1-S-A Ct值计算出的浓度取log2，log2DNA97，x2为通过引物LINE1-L-A Ct值计算出的浓度取log2，y为负荷指数。
肿瘤患者LINE1负荷指数均比健康人高
首先我们收集了健康人样品，肠癌、淋巴瘤、肺癌、肝癌、宫颈癌、胃癌患者样品。检测结果如图7所示，肿瘤患者LINE1负荷指数均比健康对照组高。
肿瘤负荷指数更能区分肿瘤患者和健康人
我们分别以LINE-A检测浓度，LINE-B检测浓度、肿瘤负荷指数作为区分指标，做ROC曲线，ROC曲线下的面积（AUC）分别为0.934、0.916、0.976（图8～10）。说明用肿瘤负荷指数作为区分指标，更能分辨出肿瘤患者和健康人。
LINE1负荷指数检测结果在手术前后对比结果
其次我们收集了癌症患者手术前，或者手术过程中的血液样品，以及手术1个月后的血液样品进行检测。所有患者在手术1个月后临床表现比术前好转。手术前与手术后一个月对比，通过配对t检验，p值为1.206 × 10-6。结果如图11。可以清楚地看出，手术前后的LINE1负荷指数具有显著区别。
SEQUENCE LISTING
<110> 邹畅
<120> 用于LINE-1的检测引物组及其应用
<130> LINE-1
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tggcacatat acaccatgga a 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgagaatgat ggtttccaat ttc 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aacaacaggt gctggagagg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgaggaatcg ccacactgac 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aggagatgtg ctggagaaag ag 22
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctccactgat aggaagaaaa gaat 24
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
acacctattc caaaattgac cac 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ttccctctac acactgcttt ga 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cccaatacag gagcacccag 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ataggtgtgg tgtggtgctg 20
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
aggagatgtg ctggagaaag ag 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
caagttgcta gtggtgagct tc 22
Claims (1)
1.一种用于肿瘤筛查、诊断或监测的系统，包括：
游离LINE-1基因提取装置；
游离LINE-1基因定量装置，其使用的引物组为：
LINE1-S-A引物对，其正向序列为：TGGCACATATACACCATGGAA，反向序列为：TGAGAATGATGGTTTCCAATTTC；
LINE1-L-A引物对，其正向序列为：ACACCTATTCCAAAATTGACCAC，反向序列为：TTCCCTCTACACACTGCTTTGA；
数据处理装置，基于游离LINE-1基因定量的结果，计算负荷指数，确定肿瘤的情况；
所述负荷指数的计算方法为：y=22.457+8.507*x1+1.59*x2-0.314*x1*x2；
式中，x1为通过所述LINE1-S-A引物对定量样品得到的Ct值计算出的浓度取log2，x2为通过所述LINE1-L-A引物对定量样品得到的Ct值计算出的浓度取log2，y为负荷指数，浓度单位为ng/μL；负荷指数越高，肿瘤发生风险越高，或进展越严重；
其中，根据Ct值计算出的浓度是将样品Ct值代入以标准品浓度与Ct值拟合标准曲线得出的计算浓度公式中获得的；
所述肿瘤选自结直肠癌、淋巴癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、胃癌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010425155.5A CN111575377B (zh) | 2020-05-19 | 2020-05-19 | 用于line-1的检测引物组及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010425155.5A CN111575377B (zh) | 2020-05-19 | 2020-05-19 | 用于line-1的检测引物组及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111575377A CN111575377A (zh) | 2020-08-25 |
| CN111575377B true CN111575377B (zh) | 2024-02-23 |
Family
ID=72113772
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010425155.5A Active CN111575377B (zh) | 2020-05-19 | 2020-05-19 | 用于line-1的检测引物组及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111575377B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103276053A (zh) * | 2013-03-07 | 2013-09-04 | 宋现让 | 以LINE1基因为测定对象的ctDNA含量和完整性测定方法 |
| CN106384001A (zh) * | 2016-09-14 | 2017-02-08 | 北京起因科技有限公司 | 人体肿瘤负荷的量化表达方法及系统 |
| CN106778073A (zh) * | 2017-01-19 | 2017-05-31 | 北京吉因加科技有限公司 | 一种评估肿瘤负荷变化的方法和系统 |
| CN108893538A (zh) * | 2018-08-01 | 2018-11-27 | 邹畅 | 用于监测游离肿瘤dna的引物组合、试剂盒以及应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8229200B2 (en) * | 2005-03-14 | 2012-07-24 | General Electric Company | Methods and systems for monitoring tumor burden |
| US20100041048A1 (en) * | 2008-07-31 | 2010-02-18 | The Johns Hopkins University | Circulating Mutant DNA to Assess Tumor Dynamics |
-
2020
- 2020-05-19 CN CN202010425155.5A patent/CN111575377B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103276053A (zh) * | 2013-03-07 | 2013-09-04 | 宋现让 | 以LINE1基因为测定对象的ctDNA含量和完整性测定方法 |
| CN106384001A (zh) * | 2016-09-14 | 2017-02-08 | 北京起因科技有限公司 | 人体肿瘤负荷的量化表达方法及系统 |
| CN106778073A (zh) * | 2017-01-19 | 2017-05-31 | 北京吉因加科技有限公司 | 一种评估肿瘤负荷变化的方法和系统 |
| CN108893538A (zh) * | 2018-08-01 | 2018-11-27 | 邹畅 | 用于监测游离肿瘤dna的引物组合、试剂盒以及应用 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| "Circulating cell-free DNA in plasma of colorectal cancer patients - A potential biomarker for tumor burden;Jagdeep Singh Bhangu 等;《Surgical Oncology》;第1-28页 * |
| A quantitative analysis of the potential biomarkers of non-small cell lung cancer by circulating cell-free DNA;Lirong Wei 等;《Oncol Lett》;20180724;第16卷(第4期);摘要、第4354页左栏第1段-第4359页左栏最后1段 * |
| Circulating cell-free DNA in plasma of colorectal cancer patients - A potential biomarker for tumor burden;Jagdeep Singh Bhangu 等;《Surg Oncol》;20170807;第26卷(第4期);摘要、第2页左栏最后1段-第8页左栏最后1段 * |
| Lirong Wei 等.A quantitative analysis of the potential biomarkers of non-small cell lung cancer by circulating cell-free DNA.《Oncol Lett》.2018,第16卷(第4期), * |
| 逆转录转座子LINE-1的活性调控及其在癌症中的作用;朱绮霞 等;《广西科学》;20180331;第25卷(第3期);全文 * |
| 非小细胞肺癌患者血液循环DNA含量及完整性的研究;周娜;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 (医药卫生科技辑)》(第3期);第E072-360页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111575377A (zh) | 2020-08-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114736968B (zh) | 血浆游离dna甲基化标志物在肺癌早筛中的用途以及肺癌早筛装置 | |
| CN108103195A (zh) | 一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针、试剂盒及其应用 | |
| WO2017124854A1 (zh) | 一组用于肠癌早期诊断的ndrg4基因甲基化检测引物和探针及其试剂盒 | |
| CN110387421A (zh) | 用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法 | |
| EP2210942B1 (en) | Gene associated with liver cancer, and method for determination of the risk of acquiring liver cancer | |
| CN107475388B (zh) | 鼻咽癌相关的miRNA作为生物标志物的应用及鼻咽癌检测试剂盒 | |
| CN113355415B (zh) | 用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂及试剂盒 | |
| WO2017202185A1 (zh) | 甄别肺部微小结节良恶性的外周血基因标志物及其用途 | |
| CN113604563A (zh) | 一种肝癌诊断或辅助诊断的核酸组合、检测试剂盒及其应用 | |
| CN107630093B (zh) | 用于诊断肝癌的试剂、试剂盒、检测方法及用途 | |
| CN114277143B (zh) | 外泌体arpc5、cda等在肺癌诊断中的应用 | |
| US20240254569A1 (en) | Biomarker combination for colorectal cancer early diagnosis and use thereof | |
| CN113699242A (zh) | 检测kras基因突变、adamts1与bnc1甲基化的引物探针，试剂盒与方法 | |
| CN107641649B (zh) | 检测微卫星nr27位点稳定性的引物对、试剂盒及方法 | |
| CN112280867A (zh) | 肝癌早期的预警方法、及预警用检测试剂盒、检测方法 | |
| CN111575377B (zh) | 用于line-1的检测引物组及其应用 | |
| CN113667757B (zh) | 用于前列腺癌早期筛查的生物标志物组合、试剂盒及应用 | |
| CN115927614A (zh) | 基于Alu重复原件的肠癌早期筛查检测引物、检测方法和试剂盒 | |
| CN113999914A (zh) | 一种新型多靶点肝细胞癌早期检测的组合标志物及其应用 | |
| CN107326092A (zh) | 大肠癌相关的miRNA作为生物标志物的应用及大肠癌检测试剂盒 | |
| CN112322743A (zh) | 检测人sept9基因甲基化的试剂盒及其使用方法、应用 | |
| CN114150065B (zh) | 一种结直肠癌或癌前病变的标记物及其应用 | |
| CN116068193B (zh) | 结核病分子标志物组合及其用途 | |
| CN114277136B (zh) | 一种基于ecDNA上的肺癌基因标志物及其应用 | |
| CN111088358B (zh) | 结直肠癌分子标志物组合、其用途及引物组和检测试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |