CN103276053A - 以LINE1基因为测定对象的ctDNA含量和完整性测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以LINE1基因为测定对象的ctDNA含量和完整性测定方法，其步骤如下：取5名健康人外周静脉血各2ml，置于EDTA-K2抗凝管中，2000g离心5分钟，取上层血浆500μl，将5人血浆混匀后，加入DNAse，充分混匀，95℃5-10分钟，16000g离心10分钟，取上清液分装作为血浆ctDNA直接定量检测的标准品，分装后-20℃保存备用。本发明所产生的有益效果为：1.不经过DNA提取步骤，可以去除DNA提取试剂盒和操作人员差异造成的DNA提取误差。2.筛选了特定的高度重复序列LINE1基因的PCR引物序列组装ctDNA定量测定试剂盒，使结果的稳定性、重复性和高灵敏度方面有显著改善，并能很好地用于ctDNA完整性评价。
Description
技术领域
本发明涉及血液循环DNA测定技术领域，具体是一种以LINE1基因为测定对象的ctDNA含量和完整性测定方法。
背景技术
血液循环DNA(Circulating DNA，ctDNA)，又称游离DNA或无细胞DNA(Cell-free DNA)，主要来源于细胞的凋亡和死亡。可作为肿瘤、自身免疫病及胎儿遗传学检测的依据。目前的检测方法均需要先从血清或血浆中提取DNA，然后扩增基因组中某个基因的方式，计算ctDNA的浓度或基因组拷贝数。由于个体间、不同病理状态间ctDNA含量及片段完整程度存在较大差异，即便不考虑操作者的因素，所用提取方法和试剂的不同就会造成提取效率存在巨大差别。在此基础上的ctDNA测定结果误差会更大。但直接用血浆或血清扩增，血清或血浆中含有的蛋白质等会严重干扰PCR，使标本间的扩增效率不一致。此外测定对象也是影响检测重复性和敏感性的重要因素。文献报道多以b-actin等管家基因为检测对象，由于是单拷贝基因，检测灵敏度低。LINE1基因是一个高度重复序列，在基因组中的拷贝数高达520000个，以其为检测对象，可显著提高检测敏感性。
发明内容
为了克服以上技术缺陷，本发明提供一种以LINE1基因为测定对象的ctDNA含量和完整性测定方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案为，一种以LINE1基因为测定对象的ctDNA含量和完整性测定方法，其步骤如下：
1、取5名健康人外周静脉血各2ml，置于EDTA-K2抗凝管中，2000g离心5分钟，取上层血浆500μl，将5人血浆混匀后，加入DNAse，终浓度10U/ml，37℃20分钟消化ctDNA，95℃5-10分钟灭活DNAse，制备不含DNA的血浆基质；加入等体积的溶解在缓冲液中的外源性DNA，使终浓度为100ng/ml，充分混匀，95℃5-10分钟，16000g离心10分钟，取上清液分装作为血浆ctDNA直接定量检测的标准品，分装后-20℃保存备用。
2、取10ul标准品，加入90ul的0.5×缓冲液稀释10倍，再取10ul稀释后的血浆DNA，加入90ul的0.5×缓冲液再稀释10倍，依次稀释下去，制备出不同稀释倍数的标准品。
3、使用以下LINE1引物序列：LINE1-F：AGGAGATGTGCTGGAGAAAGAG，LINE1-R1：CTCCACTGATAGGAAGAAAAGAAT(扩增子61bp)，LINE1-R2：CAAATGAGTTTTCTGTGTAGTTTCA(扩增子169bp)，LINE1-R3：CAAGTTGCTAGTGGTGAGCTTC(扩增子292bp)。
4、分别取2ul不同稀释倍数的标准品血浆直接进行定量PCR扩增，PCR体系共20ul，包括快速复活热启动DNA聚合酶1ul、SuperGreen染料1ul、2x混合物10ul、终浓度为300nM的引物4ul以及H2O4ul；95℃5分钟；95℃5秒，60℃20秒，72℃20秒，重复40个循环。
5、绘制各引物对扩增的标准曲线，计算待测血浆中ctDNA含量。按以下公式计算DNA完整性指数(DII)：DII＝较大片段检测的ctDNA含量/较小片段检测的ctDNA含量。
进一步，所述2x混合物包括2x反应缓冲液、终浓度为3mM的氯化镁、三磷酸脱氧核苷。
进一步，所述三磷酸脱氧核苷包括终浓度均为0.4mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
进一步，所述不同稀释倍数的标准品的稀释倍数为1∶1、1∶10或者1∶100。
进一步，进行定量PCR扩增使用ROCHE LightCycler480定量PCR仪。
本发明所产生的有益效果为：1.不经过DNA提取步骤，可以去除DNA提取试剂盒和操作人员差异造成的DNA提取误差。2.筛选了特定的高度重复序列LINE1基因的PCR引物序列组装ctDNA定量测定试剂盒，使结果的稳定性、重复性和高灵敏度方面有显著改善，并能很好地用于ctDNA完整性评价。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式进行详细说明
图1为以LINE1为测定对象进行标准量ctDNA的PCR扩增后的荧光信号分析图
具体实施方式
下面结合实例，对本发明进一步说明。
1.大肠癌患者48例，其中男27例，女21例，中位年龄54岁。健康查体30例，其中男19例，女11例，中位年龄45岁。
2.取以上人员的外周静脉血1～2ml，置于EDTA抗凝管中，10℃-20℃静置4小时，2000g离心5分钟，取上层血浆100ul-200ul，加入相同体积的试剂A，充分混匀，95℃5-10分钟，16000g离心10分钟，取上清液为模板直接用于PCR检测。
3.结果：图1为以LINE1为测定对象进行标准量ctDNA的PCR扩增后的荧光信号分析图；
48例大肠癌患者和30例健康人用3对LINE1引物测得的ctDNA见下表：
ctDNA的完整性指数(DII)＝较大片段的测定值/较小片段的测定值。
Claims (5)
1.一种以LINE1基因为测定对象的ctDNA含量和完整性测定方法，其特征在于，其步骤如下：
(1)取5名健康人外周静脉血各2ml，置于EDTA-K2抗凝管中，2000g离心5分钟，取上层血浆500μl，将5人血浆混匀后，加入DNAse，终浓度10U/ml，37℃20分钟消化ctDNA，95℃5-10分钟灭活DNAse，制备不含DNA的血浆基质；加入等体积的溶解在缓冲液中的外源性DNA，使终浓度为100ng/ml，充分混匀，95℃5-10分钟，16000g离心10分钟，取上清液分装作为血浆ctDNA直接定量检测的标准品，分装后-20℃保存备用；
(2)取10ul标准品，加入90ul的0.5×缓冲液稀释10倍，再取10ul稀释后的血浆DNA，加入90ul的0.5×缓冲液再稀释10倍，依次稀释下去，制备出不同稀释倍数的标准品；
(3)使用以下LINE1引物序列：LINE1-F：AGGAGATGTGCTGGAGAAAGAG，LINE1-R1：CTCCACTGATAGGAAGAAAAGAAT扩增子为61bp，LINE1-R2：CAAATGAGTTTTCTGTGTAGTTTCA扩增子为169bp，LINE1-R3：CAAGTTGCTAGTGGTGAGCTTC扩增子为292bp；
(4)分别取2ul不同稀释倍数的标准品血浆直接进行定量PCR扩增，PCR体系共20ul，包括快速复活热启动DNA聚合酶1ul、SuperGreen染料1ul、2x混合物10ul、终浓度为300nM的引物4ul以及H2O4ul；95℃5分钟；95℃5秒，60℃20秒，72℃20秒，重复40个循环；
(5)绘制各引物对扩增的标准曲线，计算待测血浆中ctDNA含量；按以下公式计算DNA完整性指数DII：DII＝较大片段检测的ctDNA含量/较小片段检测的ctDNA含量。
2.根据权利要求1所述的以LINE1基因为测定对象的ctDNA含量和完整性测定方法，其特征在于，所述2x混合物包括2x反应缓冲液、终浓度为3mM的氯化镁、三磷酸脱氧核苷。
3.根据权利要求1所述的以LINE1基因为测定对象的ctDNA含量和完整性测定方法，其特征在于，所述三磷酸脱氧核苷包括终浓度均为0.4mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
4.根据权利要求1所述的以LINE1基因为测定对象的ctDNA含量和完整性测定方法，其特征在于，所述不同稀释倍数的标准品的稀释倍数为1∶1、1∶10或者1∶100。
5.根据权利要求1所述的以LINE1基因为测定对象的ctDNA含量和完整性测定方法，其特征在于，进行定量PCR扩增使用ROCHE LightCycler480定量PCR仪。
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