CN108315393A

CN108315393A - 定量检测游离dna的方法、应用及检测游离dna的试剂盒

Info

Publication number: CN108315393A
Application number: CN201810076733.1A
Authority: CN
Inventors: 贺欣; 刘强; 樊赛军; 董辉; 郝建秀
Original assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Current assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Priority date: 2018-01-26
Filing date: 2018-01-26
Publication date: 2018-07-24

Abstract

本申请涉及DNA检测技术领域，尤其涉及一种定量检测血浆或血清中游离DNA的方法、应用及检测游离DNA的试剂盒。所述方法包括以下步骤：步骤一：制备PCR扩增反应模板：取待测外周血，离心后取上层血清，经再次离心处理后取上层血清与孵育液混合，经孵育、变性后于低温下离心，取上清液作为模板；步骤二：PCR扩增反应：以步骤一模板进行荧光定量PCR扩增反应，检测扩增产物，计算游离DNA的含量。

Description

定量检测游离DNA的方法、应用及检测游离DNA的试剂盒

技术领域

本申请涉及DNA检测技术领域，尤其涉及一种定量检测血浆或血清中游离DNA的方法、应用及检测游离DNA的试剂盒。

背景技术

循环游离DNA(circulating cell free DNA，cfDNA)是指循环血中游离于细胞之外的DNA，目前cfDNA在医学领域主要应用于以下三个方面：产前诊断、免疫性疾病的病情分析与疗效观察和肿瘤相关分析。

血清或血浆cfDNA的大小在166bp左右，其释放入血的生物机制尚未被完全揭示，目前认为主要来自细胞凋亡，其他来源包括坏死肿瘤细胞的溶解、白细胞的分解、新合成核酸的自主释放、细菌病毒等病原体的分解等。cfDNA在血液与蛋白质或膜结合颗粒形成天然复合物，能抵抗核酸酶的降解。正常健康人群的cfDNA水平较低，一般在0～100ng/mL，但在某些病理情况下会显著升高，比如恶性肿瘤、手术和创伤、中风、心衰、自身免疫性疾病、胰腺炎、重症监护相关状况、运动员大量训练后等。癌症患者与健康个体相比有较高的cfDNA水平。这些升高的cfDNA主要来自癌细胞。近年来，随着DNA提取、检测、测序等分子生物学技术发展，使得cfDNA的研究取得了长足进步，与疾病之间的关系逐渐被揭示出来。cfDNA作为生物标志物，在疾病筛查、诊断、治疗监控、预后、疾病复发等方面具有广泛应用。

但cfDNA的浓度及组成始终是一个动态过程，cfDNA是蛋白质结合DNA，其半衰期较短，半衰期从几分钟到2h不等，检测的可靠性是其后续应用的基本保障，关系到其作为生物标志物的应用前景，然而目前cfDNA的检测仍然存在诸多问题，从采用血清还是血浆标本的争议，到标本采集流程、检测方法、结果判读、正常值等均缺乏统一标准，各实验室之间的结果没有可比性。对cfDNA检测的规范和标准化，是cfDNA走向实际应用的必然要求。目前cfDNA检测的常用方法有实时荧光定量PCR(qPCR)法、荧光染料法、bDNA技术等。检测目标大概可分为cfDNA总浓度的检测和其中一部分DNA的检测。

在选择检测标本方面，血浆或血清均可作为cfDNA提取及检测的样本，但两者的cfDNA浓度和成分存在差异。目前认为，由于凝血过程中白细胞溶解，释放DNA入血，因此血清cfDNA总浓度高于血浆。从避免白细胞基因组DNA混入待测标本的角度考虑，采用血浆标本研究更加合理，也被采用较多。血液存放时间也会对cfDNA浓度产生影响。有研究显示，血浆cfDNA在8h内没有变化，但血清cfDNA浓度在4h时增加，并随时间延长持续增加。因此血浆分离前，抗凝全血在4℃的最大存放时间是8h，而血清应立刻分离以避免基因组DNA的污染。EDTA抗凝全血在加入细胞膜稳定剂的情况下，室温放置0、3、6d后离心取血浆，cfDNA浓度未见明显变化。细胞膜稳定剂的加入可以有效抑制血细胞溶解，释放DNA入血。血液存放的时间对cfDNA水平确实产生影响。因此，在条件允许的情况下，采血后最好立刻分离血浆或血清，避免外源DNA的混入及浓度波动，最大程度地反映cfDNA的原貌。

多数qPCR的定量研究面临的第一个问题通常为提取cfDNA，然后进行qPCR定量。这样会造成cfDNA的损失，不仅在cfDNA总量上的损失不易被测量，而且，cfDNA片段的大小分布也会由于提取步骤的操作难以完全一致和物理材料吸附性质不同而造成很大偏差。目前，血浆或血清cfDNA的提取普遍采用商业化试剂盒。由于cfDNA浓度极低，提取困难，不同方法提取效率差异明显。

比较常用的试剂盒为吸附柱式和磁珠式DNA纯化试剂盒，例如申请公布号为CN201610206263.7的发明专利公开了一种基于磁珠法提取游离DNA的试剂盒及其使用方法，试剂盒包括有分别独立分装的DNA固定结合液、第一磁珠悬浮液，清洗液、基因组DNA去除液、第二磁珠悬浮液和洗脱液。本案可以实现直接从全血样本中提取游离DNA；将提取纯化游离DNA的对象由血清或者血浆扩大到全血样本，将提取游离DNA的步骤向前延伸到血液的前期处理，大大减少了血液原先提取游离DNA的步骤；另外，该试剂盒同样也可以兼容从血浆或血清样本中提取纯化游离DNA。但该发明试剂盒主要用于从血细胞提取高度完整性的基因组DNA，而不是用于高度碎片化的cfDNA，因此提取效率较低，有研究表明，磁珠式提取效率高于吸附柱式，对质粒DNA的提取效率也仅为69.2％，其余几种方法提取率均未超过50％，并且，以上两种方法提取游离DNA所需要的时间在1小时左右。

为了解决上述技术问题，本领域技术人员尝试不需DNA纯化直接定量cfDNA：进行qPCR之前，血浆或血清用备好的缓冲液和蛋白酶K处理，以去掉蛋白质，通过扩增两种长度的Alu序列对cfDNA定量。现有技术中通常在在反应混合物中加入一种用于困难模板扩增的特殊聚合酶(velocitypolymerase)，该酶每10s可延伸1kb碱基，血浆1：40稀释后，不需其他处理，直接加入反应体系进行qPCR测定血浆cfDNA浓度。结果显示，未经提纯的血浆中cfDNA的浓度是吸附柱式试剂盒洗脱液中cfDNA的2.79倍，在弃掉的流出液中，发现了cfDNA总量的36.7％。可见，直接qPCR法操作更加简便，避免了cfDNA的损失，但其可靠性仍无法完全满足在疾病筛查、诊断、治疗监控、预后、疾病复发等方面的使用。

发明内容

本申请为了解决上述技术问题，提供一种定量检测血浆或血清中游离DNA的方法、应用及检测游离DNA的试剂盒。

一种定量检测血浆或血清中游离DNA的方法，包括以下步骤：

步骤一：制备PCR扩增反应模板：取待测外周血，离心后取上层血清，经再次离心处理后取上层血清与孵育液混合，继续加入蛋白酶K，使所述蛋白酶K的浓度为0.04～4mg/ml，经孵育、高温变性后于骤冷并在低温下离心，取上清液作为模板。

步骤二：PCR扩增反应：以步骤一模板进行荧光定量PCR扩增反应，检测扩增产物，基于扩增产物的荧光值计算待测血浆或血清中游离DNA的含量。

作为优选，步骤一：制备PCR扩增反应模板：取待测外周血，1600g离心5分钟后取上层血清，经再次16000g离心5分钟离心处理后取上层血清按照体积比为按照3：1～1：1与孵育液混合，所述孵育液包括十二烷基硫酸钠、三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸，继续加入蛋白酶K，使所述蛋白酶K的浓度为0.04～4mg/ml，50～60℃孵育10分钟，95℃变性5分钟，4℃骤冷，于4℃16000g离心5分钟，取上清液0.01～2μl作为模板；

步骤二：PCR扩增反应：根据检测目的DNA设计引物，以步骤一模板进行荧光定量PCR扩增反应，检测扩增产物，基于扩增产物的荧光值计算待测血浆或血清中游离DNA的含量。

作为优选，经再次离心处理后得到的上清液与所述孵育液的体积比为3：1，可最大程度降低试剂对血样本的稀释作用。

作为优选，所述待测外周血内添加有乙二胺四乙酸二钾。

作为优选，所述荧光定量PCR扩增反应过程依次包括恒温段、循环段和溶解段，所述恒温段为50℃反应2分钟后95℃反应10分钟；所述循环段为95℃反应15秒、60℃反应60秒后读取荧光值，40个循环；所述溶解段为95℃反应15秒、60℃反应60秒、95℃反应15秒后读取荧光值。

作为优选，所述荧光定量PCR扩增反应体系包括：0.05～1U浓度为5U/μl的DNA聚合酶、荧光染料、0.1～0.5mmol/L的PCR级dNTPs、50mmol/L且pH值为8.3的Tris/HCl缓冲液、10mmol/L的氯化钾、5mmol/L的硫酸铵盐、1.5～4mmol/L的氯化镁溶液、0.2～1mmol/L上游引物、0.2～1mmol/L的下游引物、0.06～2μl的所述模板；所述荧光定量PCR扩增反应体系的总体积为20μl。

作为优选，所述孵育液包括质量浓度为8％的十二烷基硫酸钠、80mmol/L的三羟甲基氨基甲烷和2mmol/L的乙二胺四乙酸。

作为优选，所述孵育液包括体积浓度为5％的吐温20、80mmol/L的三羟甲基氨基甲烷和2mmol/L的乙二胺四乙酸。

一种上述定量检测血浆或血清中游离DNA的方法在检测孕妇外周血游离胎儿DNA中的应用。

作为优选，用于识别SRY基因和RhD基因。

作为优选，所述的定量检测血浆或血清中游离DNA的方法在检测孕妇外周血游离胎儿DNA中的应用中，PCR扩增引物的上游引物为序列表SEQ ID NO.1所示引物，下游引物为序列表SEQ ID NO.2所示引物。

一种上述定量检测血浆或血清中游离DNA的方法在检测外周血肿瘤标志物DNA中的应用。

作为优选，用于定量检测人外周血中Alu基因和L1PA2基因。

作为优选，定量检测血浆或血清中游离DNA的方法在检测外周血肿瘤标志物DNA中的应用中，基因ALU247-F的引物为序列表SEQ ID NO.3所示引物；基因ALU247-R的引物为序列表SEQ ID NO.4所示引物；基因ALU115-F的引物为序列表SEQ ID NO.5所示引物；基因ALU115-R的引物为序列表SEQ IDNO.6所示引物；基因L1PA2-F的引物为序列表SEQ ID NO.7所示引物；基因LIPA2 90-R的引物为序列表SEQ ID NO.8所示引物；基因LIPA2 222-R的引物为序列表SEQ ID NO.9所示引物。

一种上述定量检测血浆或血清中游离DNA的方法在检测基因数量和完整度中的应用。

作为优选，所述的基因包括Alu基因和L1PA2基因。

一种检测游离DNA的试剂盒，包括采用上述定量检测血浆或血清中游离DNA的方法的步骤制备得到。

本申请实现的有益效果如下：本发明提供的定量检测血浆或血清中游离DNA的方法，合理设计各步骤及参数条件，与传统的提取法相比，能够将制备待检样品的时间节省了0.5小时，同时避免了提取过程带来的游离DNA绝对数量的损失和相对完整度的变化；该方法较之于现有的非提取处理方法，降低了检测成本，且将检测下限从0.1μl减少到0.01μl，大大提高的检测的检测限及检测精度。

附图说明

图1为本发明实施例一所示为孕妇外周血游离DNA SRY基因检测结果阳性对照GAPDH基因扩增曲线；

图2为本发明实施例一所示孕妇外周血游离DNA SRY基因检测结果阳性对照SRY基因扩增曲线；

图3为本发明实施例一所示孕妇外周血游离DNA SRY基因检测结果阳性对照的SRY基因和内参基因GAPDH的标准曲线；

图4为本发明实施例一至实施例三所示游离DNA PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

图5为本发明实施例二所示Alu 115扩增曲线；

图6为本发明实施例二所示Alu 247扩增曲线；

图7为本发明实施例二所示L1PA290扩增曲线；

图8为本发明实施例二所示L1PA2 222扩增曲线；

图9为本发明实施例二所示Alu基因标准曲线；

图10为本发明实施例二所示L1PA2基因标准曲线；

图11为本发明实施例二所示Alu 115实测浓度直观图；

图12为本发明实施例二所示Alu 247实测浓度直观图；

图13为本发明实施例二所示Alu 115和Alu 247的实测浓度平均值C和稀释倍数N之间的线性回归图；

图14为本发明实施例二所示L1PA2 90实测浓度直观图；

图15为本发明实施例二所示L1PA2 222实测浓度直观图；

图16为本发明实施例二所示L1PA2 90和L1PA2 222的实测浓度平均值C和稀释倍数N之间的线性回归图；

图17为本发明实施例二所示不同浓度的Alu115和Alu247实测浓度累积柱状图；图18为本发明实施例二所示不同浓度的L1PA2 90和L1PA2 222实测浓度累积柱状图；

图19为本发明实施例二所示Alu基因(Alu 247/Alu 115)完整度和L1PA2(L1PA2222/L1PA2 90)基因完整度柱状图；

图20为本发明实施例一至三所示定量检测血浆或血清中游离DNA的不同方法所需时间比较图；

图21为本发明实施例三所示20Gy gamma射线暴露导致的血浆Alu完整度和L1PA2完整度直观图；

图22为本发明实施例三所示20Gy gamma射线暴露导致的Alu完整度随时间变化图；

图23为本发明实施例三所示20Gy gamma射线暴露导致的L1PA2完整度随时间变化图；

图24为本发明实施例三所示外周血样本在20Gy gamma射线暴露后35分钟内Alu基因完整度和L1PA2基因完整度随时间变化的3D模型图；

图25为本发明实施例三所示外周血样本在0～20Gy gamma射线暴露后1小时的Alu基因完整度和L1PA2基因完整度热图。

具体实施方式

下面结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

一种定量检测血浆或血清中游离DNA的方法，包括以下步骤：

步骤一：制备PCR扩增反应模板：取待测外周血，离心后取上层血清，经再次离心处理后取上层血清与孵育液混合，继续加入蛋白酶K，使所述蛋白酶K的浓度为0.04～4mg/ml，经孵育、变性后于低温下离心，取上清液作为模板；

需要具体说明的是，所述蛋白酶K的浓度以0.4mg/ml为普遍采用浓度，可以根据样品所含蛋白的量进行调整。

在一可选实施例中，步骤一：制备PCR扩增反应模板：取待测外周血，1600g离心5分钟后取上层血清，经再次16000g离心5分钟离心处理后取上层血清按照体积比为按照3：1与孵育液混合，所述孵育液包括十二烷基硫酸钠、三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸，继续加入蛋白酶K，使所述蛋白酶K的浓度为0.04～4mg/ml，50～60℃孵育10分钟，95℃变性5分钟，4℃骤冷，于4℃16000g离心5分钟，取上清液0.01～2μl作为模板；

需要具体说明的是，本发明孵育液与血浆比例为1:3～1:1，其中1:3最大程度降低了试剂对血浆带来的稀释作用，保证检测限及检测精度。同时高温变性后骤冷并低温离心步骤，保证了蛋白质得到最大程度的清除。

在一可选实施例中，经再次离心处理后得到的上清液与所述孵育液的体积比为3：1。

在一可选实施例中，所述待测外周血内添加有乙二胺四乙酸二钾。所述取外周血的过程，可以采用EDTA-2K抗凝，也可以不加抗凝剂，前者得到的上清是血浆，后者得到的上清是血清。

在一可选实施例中，所述荧光定量PCR扩增反应过程依次包括恒温段、循环段和溶解段，所述恒温段为50℃反应2分钟后95℃反应10分钟；所述循环段为95℃反应15秒、60℃反应60秒后读取荧光值，40个循环；所述溶解段为95℃反应15秒、60℃反应60秒、95℃反应15秒后读取荧光值。

在一可选实施例中，所述荧光定量PCR扩增反应体系包括：0.05～1U浓度为5U/μl的DNA聚合酶、荧光染料、0.1～0.5mmol/L的PCR级dNTPs、50mmol/L且pH值为8.3的Tris/HCl缓冲液、10mmol/L的氯化钾、5mmol/L的硫酸铵盐、1.5～4mmol/L的氯化镁溶液、0.2～1mmol/L上游引物、0.2～1mmol/L的下游引物、0.06～2μl的所述模板；上述反应体系以总体积为20μl为例，其他体积体系以此配方等比配制。

在一可选实施例中，所述孵育液包括质量浓度为8％的十二烷基硫酸钠、80mmol/L的三羟甲基氨基甲烷和2mmol/L的乙二胺四乙酸。

在一可选实施例中，所述孵育液包括体积浓度5％的吐温20、80mmol/L的三羟甲基氨基甲烷和2mmol/L的乙二胺四乙酸。

需要进一步说明的是，可以用于无创DNA产前筛查，检测孕妇外周血游离DNA中男性性别决定基因SRY基因的含量，从而判断胎儿性别。在孕早期至分娩后30分钟内，从母体血浆中就可以检测出胎儿DNA，其来源目前有两种解释：(1)来源于母体损伤及凋亡的胎盘滋养层细胞；(2)胎儿细胞在自身造血系统中凋亡后释放入母血，虽然来源尚待进一步证实，但是，应用方面已较成熟，现有技术可早在妊娠8周检测孕妇血浆中游离的胎源DNA，识别男性性别决定基因SRY，或者RhD基因型，以达到产前诊断胎儿性别或基因型的目的。

在一可选实施例中，所述的定量检测血浆或血清中游离DNA的方法在检测孕妇外周血游离胎儿DNA中的应用中，PCR扩增引物的上游引物为序列表SEQ ID NO.1所示引物，下游引物为序列表SEQ ID NO.2所示引物。

在一可选实施例中，用于定量检测人外周血中Alu基因和L1PA2基因；基因ALU247-F的引物为序列表SEQ ID NO.3所示引物；基因ALU247-R的引物为序列表SEQ ID NO.4所示引物；基因ALU115-F的引物为序列表SEQID NO.5所示引物；基因ALU115-R的引物为序列表SEQ ID NO.6所示引物；基因L1PA2-F的引物为序列表SEQ ID NO.7所示引物；基因LIPA290-R的引物为序列表SEQ ID NO.8所示引物；基因LIPA2 222-R的引物为序列表SEQ IDNO.9所示引物。

需要进一步说明的是，该应用主要适用于定量检测血浆或血清中游离DNA特定基因的含量，从而提示疾病预后或者治疗效果评估。具体地可以用于检测人外周血中Alu和L1PA2基因，用于评估外周血细胞辐射照射后基因组损伤程度。Alu序列属于DNA非编码区中的是短散置元(short interspersedelements,SINEs)，Alu家族是哺乳动物包括人基因组中含量最丰富的一种中度重复序列家族，在单倍体人基因组中重复达30万-50万次。Alu序列分散在整个人体或其他哺乳动物基因组中，平均每5kb DNA就有一个Alu序列。在人类基因组中Alu序列的拷贝数为50万-100万，是拷贝数最丰富的序列，大约占整个人类基因组的5-6％。L1PA2序列属于长散置元(long interspersed elements,LINEs)家族之L1系列成员，它散布在整个人类基因组中。外周血游离DNA中Alu和L1PA2的绝对数量和完整度可以密切反应细胞凋亡和基因组损伤情况。基因完整度的计算方法，举例说明如下，已有的研究选用Alu115和Alu247两个基因片段作完整性的研究(Alu115的115bp的短片段即包含在Alu247的247bp的长片段内，两者有很好的相关性)，检测得到的长片段与短片段拷贝数的比值，即Alu基因完整度＝Alu247/Alu115。

进一步的，所述的基因包括Alu基因和L1PA2基因。

在一可选实施例中，定量检测血浆或血清中游离DNA的方法在检测外周血肿瘤标志物DNA中的应用中，基因ALU247-F的引物为序列表SEQ ID NO.3所示引物；基因ALU247-R的引物为序列表SEQ ID NO.4所示引物；基因ALU115-F的引物为序列表SEQ ID NO.5所示引物；基因ALU115-R的引物为序列表SEQ ID NO.6所示引物；基因L1PA2-F的引物为序列表SEQID NO.7所示引物；基因LIPA2 90-R的引物为序列表SEQ ID NO.8所示引物；基因LIPA2222-R的引物为序列表SEQ ID NO.9所示引物。

实施例一：识别血浆或血清中SRY基因和RhD基因：

选取孕12-26周孕妇40例，取肘前静脉血2ml，EDTA-2K抗凝管收纳，按如下步骤制备：

步骤一：制备PCR扩增反应模板：取待测外周血，离心后取上层血清，经再次离心处理后取上层血清与孵育液混合，所述孵育液包括十二烷基硫酸钠、三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸，继续加入蛋白酶K，使所述蛋白酶K的浓度为0.04～4mg/ml，经孵育、变性后于低温下离心，取上清液作为模板；按表1体系配制溶液，每个样本3个平行孔；

步骤二：确定扩增引物：确定扩增引物，SRY基因上游引物序列(5'-3')为：CCCAGAATGCGAAACTCAGA，其下游引物序列(5'-3')为：CAAACTGCAATTCTTCGGCA，(5)内参基因GAPDH上游引物序列(5'-3')为：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT，其下游引物序列(5'-3')为：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG；

步骤三：PCR扩增反应：进行荧光定量PCR扩增反应；以步骤一模板进行荧光定量PCR扩增反应，电泳检测扩增产物，基于扩增产物的荧光值计算待测血浆或血清中游离DNA的含量；采用Bio-Rad iQ5实时荧光定量PCR仪，程序依此包括恒温段、循环段和溶解段，所述恒温段为50℃反应2分钟后95℃反应10分钟；所述循环段为95℃反应15秒、60℃反应60秒后读取荧光值，40个循环；所述溶解段为95℃反应15秒、60℃反应60秒、95℃反应15秒后读取荧光值。

采用无孕产史的健康女性基因组DNA作为阴性对照。采用健康男性基因组DNA作为阳性对照，DNA浓度从0.8～8000ng/ml(DNA浓度换算成PCR体系的实测浓度，说明书其他位置出现的log模板浓度全部如此)，10倍梯度稀释，共5个浓度，每个浓度设置8个平行孔，以log(模板浓度)为x轴，8个平行孔的平均Ct值做y轴，制作标准曲线，并采用线性拟合。孵育液配方为：8％SDS(w/v)，40mM Tris，2mM EDTA。蛋白酶K终浓度在0.04～4mg/ml范围内均可。

表1PCR反应体系

如图1、图2和图3所示，其中图1和图2分别是阳性对照的GAPDH和SRY基因扩增曲线，图3是GAPDH和SRY基因的线性标准拟合曲线，按照PCR扩增效率＝-1+10-1/斜率，GAPDH和SRY基因的回归方程和扩增效率见表2。

表2GAPDH和SRY基因标准曲线回归

基因	回归方程	扩增效率	R2
				GAPDH	y＝-3.6336x+19.72	0.88	0.9995
SRY	y＝-3.5063x+22.623	0.93	0.9992

将孕妇血浆检测Ct值(3个平行孔的平均值)按照表2方程计算，得到SRY基因定性定量结果，与临床结局吻合情况见表3。

表3 40例孕妇外周血游离DNA基因检测结果汇总表

实施例二：定量检测人外周血中Alu基因和L1PA2基因：

选取健康志愿者(女性)一名，取肘前静脉血2ml，EDTA-2K抗凝管收纳，按如下步骤制备：

步骤一：制备PCR扩增反应模板：取待测外周血，离心后取上层血清，经再次离心处理后取上层血清与孵育液混合，所述孵育液包括十二烷基硫酸钠、三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸，继续加入蛋白酶K，使所述蛋白酶K的浓度为0.04～4mg/ml，经孵育、变性后于低温下离心，取上清液作为模板；由去离子水进行2倍梯度稀释，共采用6个浓度，浓度从低到高依次分组为1-6组，每个浓度8个平行孔，最低上样量相当于0.012μl血浆；

步骤二：制作表准曲线：取步骤一获取的基因组DNA做模板，DNA浓度从2.08*10-3～2.08*103ng/ml，10倍梯度稀释，共7个浓度，每个浓度5个平行孔，以log(模板浓度)为x轴，5个平行孔的Ct平均值做y轴，制作标准曲线，并采用线性回归；

步骤三：PCR扩增反应：采用表4引物，其中L1PA2 90和L1PA2 222的上游引物相同(L1PA2-F)，PCR体系同表1；进行荧光定量PCR扩增反应；以步骤一模板进行荧光定量PCR扩增反应，(6)电泳确认扩增产物，根据扩增Ct值计算待测DNA的量，进而计算Alu 247/Alu115，L1PA2222/L1PA2 90计算基因完整度。取同一名志愿者的血样，重复该实验5次。

表4Alu和L1PA2扩增引物

基因	引物序列(5'-3')
		ALU 247-F	GTGGCTCACGCCTGTAATC
ALU 247-R	CAGGCTGGAGTGCAGTGG
		ALU 115-F	CCTGAGGTCAGGAGTTCGAG
ALU 115-R	CCCGAGTAGCTGGGATTACA
		L1PA2-F	TGCCGCAATAAACATACGTG
LIPA2 90-R	GACCCAGCCATCCCATTAC
		LIPA2 222-R	AACAACAGGTGCTGGAGAGG

用1.8％琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物，如图4所示，由左至右依此为泳道1～8，其中，泳道1：DNA ladder，泳道2-5：Alu 115，Alu 247，L1PA2 90，L1PA2 222，泳道6：SRY基因扩增产物(186bp)，泳道7：GAPDH扩增产物(194bp)，泳道8：DNA ladder；)。扩增和拟合曲线如图5～10所示，其中图5、图6、图7和图8是Alu 115，Alu 247，L1PA2 90，L1PA2 222的扩增曲线，图9是Alu115和Alu 247的线性拟合标准曲线，图10是L1PA2 90和L1PA2 222的线性拟合标准曲线，PCR扩增效率＝-1+10-1/斜率，Alu 115，Alu 247，L1PA2 90，L1PA2 222的回归方程和扩增效率见表5。

表5Alu和L1PA2扩增标准曲线回归

将血浆制备好后，取0.5μl作为最高模板浓度，依次2倍梯度稀释，浓度从低到高依次分组为1-6组，检测得到的Ct值代入表5所列回归方程，计算得到实测浓度C(pg/ml)，实测浓度C和稀释倍数N的关系如图11～16所示。图11和图12分别是Alu 115和Alu 247重复5次实验的实测浓度和分组之间的直观图，图13是两个片段的实测浓度C和稀释倍数N之间的线性回归图，其中R2值分别在0.9986和0.9988，图14和图15分别是L1PA290和L1PA2 222重复5次实验的实测浓度和分组之间的直观图，图16是两个片段的实测浓度C和稀释倍数N之间的线性回归图，其中R2值分别在0.9991和0.9716。图11～16表明，用直接法制备样本用来检测Alu和L1PA2基因的重复性良好，实测值与稀释倍数之间存在良好的线性关系，说明实测值能够较忠实地反应样本中待检基因的数量。

对不同浓度组间DNA完整度进行了比较，如图17、18和19所示，采用组间非参数检验Kruskal-Wallis检验，p＝0.416，0.416，无显著差异。说明：用该方法制备样本，DNA完整度基本不受稀释倍数和基因浓度的影响，检测结果接近真实值，克服了提取步骤中物理吸附造成的DNA完整度损失和绝对数量的损失。本方法的另一优势在于，缩短了模板制备时间，三种制备方法所需时间的比较见图20所示。

实施例三：检测Alu和L1PA2基因数量和完整度

选取13名健康志愿者，将新鲜采集的外周血，用EDTA抗凝处理，按实施例一步骤制备模板并完成PCR定量检测，模板上样量采用0.5μl，每个模板6个平行孔，检测Alu 115，Alu247，L1PA2 90和L1PA2 222，取Ct平均值计算基因浓度，并计算Alu完整度，L1PA2完整度，结果见表6。

表6 13名健康志愿者外周血Alu和L1PA2基因检测明细

进一步地，再次采集13名志愿者外周血，采集后立即将全血暴露在20Gy137Csgamma射线下作为照射组(剂量率0.8Gy/min)，在暴露后5min，15min，25min，35min，1h，2h六个时间点制备模板，同时，每个时间点的对照组为取血后未照射也未分离的全血(自然状态下，外周血离体后8小时内被认为cfDNA成分没有变化)。将照射组和对应的对照组的全血按照实施例一的步骤处理，制备模板，采用0.5μl上样量，6个平行孔/样品，检测Alu 115，Alu247，L1PA2 90和L1PA2 222，取Ct平均值计算基因浓度，并计算Alu完整度，L1PA2完整度。我们发现，照射后35分钟，以Alu完整度和L1PA2完整度分别为横坐标和纵坐标，照射组和未照射组的分布有显著差异，如图21所示；照射后35分钟内Alu 247和L1PA2 222释放增加，在基因完整度上表现为，Alu完整度和L1PA2完整度随着时间的进展呈现线性正相关，拟合优度r²分别为0.8984和0.7807件，如图22和23所示。在35分钟之后，Alu完整度和L1PA2完整度变化较小(数据未显示)。照射后Alu完整度和L1PA2完整度随时间变化的3D模型，如图24所示。

Alu完整度和L1PA2完整度与电离辐射损伤程度的关系检测实验如下：选取13名健康志愿者，将新鲜采集的外周血，用EDTA抗凝处理后立即暴露在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20Gy gamma ¹³⁷Cs gamma射线下(剂量率0.8Gy/min)，在暴露后1h制备模板，检测Alu115，Alu 247，L1PA2 90和L1PA2 222，取Ct平均值计算基因浓度，并计算Alu完整度，L1PA2完整度。分别比较每一个样本的Alu完整度和L1PA2完整度在0～20Gy内的变化，绘制热图，如图25所示。可见，Alu完整度和L1PA2完整度随着辐射剂量的增加而增加，同方向的趋势变化。综合图21～25，可以推测，Alu完整度和L1PA2完整度与辐射损伤程度和损伤时间存在相关，高拷贝数的散在重复序列可以作为辐射损伤程度的标志物，基因完整度具有成为衡量辐射损伤的指标的潜力。

实验例：

磁珠法、离心柱型提取试剂盒与本方法实施例一所制备的样本检测下限和精确度比较实验：

实验方法：采取市售TIANGEN公司生产的磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒，商品目录号DP709，和该公司生产的离心柱型提取试剂盒，商品目录号DP339，分别提取同一批血液样本(n＝4)，同时用实施例一所述方法用同样的血液样本制备模板。将三种方法制备的模板分别采用10倍梯度稀释，每个浓度8个平行孔，用qPCR定量检测Alu115基因的数量，将检测到的Cq_test值与不加模板对照的组Cq_contr值进行t-test统计检验，采纳p<0.05为显著性置信区间，每一种方法都可以找到两个临界组，即差异显著组10ⁿ倍稀释，差异不显著组10ⁿ⁺¹倍稀释，将10ⁿ倍稀释浓度组认定为检测下限，将10ⁿ倍稀释浓度换算为原始血浆浓度，即为血浆最低检测下限。

实验结果：三种方法的详细情况比较见表7。本发明实施例一所提供的直接法制备样本，能够将检测下限从现有的磁珠法的0.1μl降低到0.01μl，这是由于本案制备方式基本不损失DNA的数量，而磁珠法和离心柱法由于物理原因，不可避免要损失DNA的总数量，尤其是小片段DNA的数量损失尤甚。

表7实施例一与市售商品化试剂盒制备样本的检测下限比较

	磁珠法	离心柱法	直接法
				最低需要血浆体积(μl)	400	100	10
产物总体积(μl)	30	20	6.7
				最低检测下限(μl)	0.1	0.5	0.01

尽管已描述了本申请的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本申请范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本申请进行各种改动和变型而不脱离本申请的精神和范围。这样，倘若本申请的这些修改和变型属于本申请权利要求及其等同技术的范围之内，则本申请也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 中国医学科学院放射医学研究所

<120> 定量检测游离DNA的方法、应用及检测游离DNA的试剂盒

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

cccagaatgc gaaactcaga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

caaactgcaa ttcttcggca 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gtggctcacg cctgtaatc 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

caggctggag tgcagtgg 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

cctgaggtca ggagttcgag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

cccgagtagc tgggattaca 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

tgccgcaata aacatacgtg 20

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gacccagcca tcccattac 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

aacaacaggt gctggagagg 20

Claims

1.一种定量检测血浆或血清中游离DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：制备PCR扩增反应模板：取待测外周血，离心后取上层血清，经再次离心处理后取上层血清与孵育液混合，继续加入蛋白酶K，使所述蛋白酶K的浓度为0.04～4mg/ml，经孵育、高温变性后于骤冷并在低温下离心，取上清液作为模板；

2.根据权利要求1所述的定量检测血浆或血清中游离DNA的方法，其特征在于，经再次离心处理后得到的上清液与所述孵育液的体积比为3：1～1：1。

3.根据权利要求1所述的定量检测血浆或血清中游离DNA的方法，其特征在于，所述孵育液包括质量浓度为8％的十二烷基硫酸钠、80mmol/L的三羟甲基氨基甲烷和2mmol/L的乙二胺四乙酸。

4.根据权利要求1所述的定量检测血浆或血清中游离DNA的方法，其特征在于，所述孵育液包括体积浓度5％的吐温20、80mmol/L的三羟甲基氨基甲烷和2mmol/L的乙二胺四乙酸。

5.一种权利要求1～4任一项所述的定量检测血浆或血清中游离DNA的方法在检测孕妇外周血游离胎儿DNA中的应用。

6.根据权利要求5所述的定量检测血浆或血清中游离DNA的方法在检测孕妇外周血游离胎儿DNA中的应用，其特征在于，用于识别SRY基因和RhD基因；所述的定量检测血浆或血清中游离DNA的方法中，PCR扩增引物的上游引物为序列表SEQ ID NO.1所示引物，下游引物为序列表SEQ ID NO.2所示引物。

7.一种权利要求1～4任一项所述的定量检测血浆或血清中游离DNA的方法在检测外周血肿瘤标志物DNA中的应用。

8.根据权利要求7所述的定量检测血浆或血清中游离DNA的方法在检测外周血肿瘤标志物DNA中的应用，其特征在于，用于定量检测人外周血中Alu基因和L1PA2基因；基因ALU247-F的引物为序列表SEQ ID NO.3所示引物；基因ALU247-R的引物为序列表SEQ IDNO.4所示引物；基因ALU115-F的引物为序列表SEQ ID NO.5所示引物；基因ALU115-R的引物为序列表SEQ ID NO.6所示引物；基因L1PA2-F的引物为序列表SEQ ID NO.7所示引物；基因LIPA2 90-R的引物为序列表SEQ ID NO.8所示引物；基因LIPA2 222-R的引物为序列表SEQID NO.9所示引物。

9.一种权利要求1～4所述的定量检测血浆或血清中游离DNA的方法在检测基因数量和完整度中的应用。

10.一种检测游离DNA的试剂盒，其特征在于，包括采用权利要求1～4任一项所述的定量检测血浆或血清中游离DNA的方法的步骤制备得到。