CN107541561B - 提高母体外周血中胎儿游离dna浓度的试剂盒、装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了提高母体外周血中胎儿游离DNA浓度的试剂盒、装置及方法。发明人通过大量的研究，发现通过富集母体外周血中的<160bp的某一点或者任一区段长度的游离DNA进行测序和数据分析，可以出人意料地富集母体外周血中胎儿的游离DNA，从而将胎儿游离DNA浓度(百分比)提高至原来的1.5～4倍。孕妇外周血中胎儿游离DNA的浓度均值为13％，本发明的装置和方法可将胎儿游离DNA浓度均值提高至20％～40％，效果显著。通过有效提高胎儿游离DNA浓度，可以大幅减少高通量测序的数据处理量，有利于进一步降低高通量测序的成本。

Description

提高母体外周血中胎儿游离DNA浓度的试剂盒、装置及方法

技术领域

本发明涉及一种含有游离DNA样本的前处理试剂盒、装置及方法，特别涉及一种提高母体外周血中胎儿游离DNA浓度的试剂盒、装置及方法。

背景技术

胎儿染色体异常(包括染色体非整倍体异常以及微缺失微重复异常)导致的出生缺陷发生率约1％，染色体异常主要指染色体数目和结构异常，包括21-三体综合征(T21)、18-三体综合征(T18)、13-三体综合征(T13)、XO综合征、XXX综合征、XYY综合征和XXY综合征以及各种染色体微缺失微重复综合征。患儿多表现为智力障碍、发育迟缓、多发畸形或成年后生育障碍等。

单基因遗传病是指受一对等位基因控制的遗传病，据人类在线孟德尔遗传数据库统计，目前有6000多种单基因遗传病，对致病机理及分子机制研究清楚的大致有3700多种。常见的单基因遗传病有G6PD缺乏症(蚕豆病)，地中海贫血症，假肥大性肌营养不良(DMD)，耳聋、白内障等。

对胎儿基因组异常的产前诊断是降低出生缺陷、提高出生人口素质的重要手段。传统的羊膜腔穿刺、绒毛活检、脐静脉穿刺等方法准确性高，但均为侵入性的，伴随0.2％～0.5％的流产和感染风险[1]。同时，这些侵入性的检测方法对操作者的经验要求较高，会在母体上留下创口，对母体的形态有一定的影响，随着技术的发展，使用率已经大幅降低。

1997年，lo等人[2]发现在母体外周血中存在胎儿的游离DNA，为通过母体外周血进行无创胎儿基因组异常奠定理论基础。2008年，Lo[3]和Stephen quake[4]宣布通过高通量测序检测母体外周血的游离DNA可筛查胎儿染色体非整倍体异常，开创了无创胎儿染色体非整倍体基因检测(NIPT)的新方法。

CN102108409A基于其发现母体血浆中的胚胎DNA大部分为100bp到250bp的片段，且各个染色体占总DNA的比例与各个染色体占母体血浆中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA的比例是一致的，通过测定100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA的每段DNA来自几号染色体，并计算在同一样本内100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有DNA中来自待测染色体与来自参考染色体的DNA片段数的比值，并计算各个样本间所述比值的变异，根据变异的数值确定待测染色体的拷贝数。这一方法只是基于阳性样本不同长度bins的游离DNA ratio值存在差异进行染色体非整倍体检测，并不能提高胎儿游离DNA的浓度，其准确性依然受到血浆中胎儿游离DNA实际浓度的限制。

据2015年统计，NIPT对T21、T18和T13的综合检出率为99％，假阳性率低于0.5％，准确性接近有创产前诊断水平。NIPT由于检测通量大、灵敏度和特异性很高，目前已被广泛应用于临床的胎儿染色体非整倍体筛查[5]。随后，母体外周血游离DNA还被证实可用于检测胎儿的微缺失和微重复综合征[6]以及胎儿单基因病[7]。但是，无创胎儿微缺失微重复综合症的准确性远远低于NIPT，灵敏性只有70％～90％，其检出的准确性受胎儿游离DNA浓度、微缺失微重复区域的长度以及测序数据量的影响。

母体外周血中的胎儿游离DNA浓度一般在3％～30％以内，均值约为13％。研究表明，母体外周血中胎儿游离DNA的浓度和阳性样本的检出值呈现正相关关系，胎儿游离DNA浓度越高，则无创胎儿基因组病检测的准确性越高[6，8]。对NIPT而言，胎儿游离DNA浓度过低会提高阳性样本漏检的风险。NIPT的检测极限为3％～4％，但由于孕妇个体差异、样本质量以及实验误差等影响，现有技术中，当胎儿游离DNA浓度低于5％时其NIPT检测结果则可能出现假阴性。此外，无创胎儿微缺失微重复基因检测和无创胎儿单基因病的检测分辨率更高，对胎儿游离DNA的浓度要求更高，一般要求胎儿游离DNA浓度超过10％方可进行检测。因此，提高母体外周血中胎儿游离DNA的浓度至关重要，可进一步提高NIPT对于低胎儿浓度样本的检出水平，降低假阴性率，同时也是无创胎儿微缺失微重复基因检测和无创胎儿单基因病检测得以进行的先决条件。

参考文献：

1.Nanal,R.,P.Kyle,and P.W.Soothill,A classification of pregnancylosses after invasive prenatal diagnostic procedures:an approach to allowcomparison of units with a different case mix.Prenat Diagn,2003.23(6):p.488-92.

2.Lo,Y.M.,et al.,Presence of fetal DNA in maternal plasma andserum.Lancet,1997.350(9076):p.485-7.

3.Chiu,R.W.,et al.,Noninvasive prenatal diagnosis of fetalchromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA inmaternal plasma.Proc Natl Acad Sci U S A,2008.105(51):p.20458-63.

4.Fan,H.C.,et al.,Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy byshotgun sequencing DNA from maternal blood.Proc Natl Acad Sci U S A,2008.105(42):p.16266-71.

5.Hu,H.,et al.,Clinical Experience of Non-Invasive PrenatalChromosomal Aneuploidy Testing in190,277Patient Samples.Curr Mol Med,2016.16(8):p.759-766.

6.Yin,A.H.,et al.,Noninvasive detection of fetal subchromosomalabnormalities by semiconductor sequencing of maternal plasma DNA.Proc NatlAcad Sci U S A,2015.112(47):p.14670-5.

7.Lv,W.,et al.,Noninvasive prenatal testing for Wilson disease by useof circulating single-molecule amplification and resequencing technology(cSMART).Clin Chem,2015.61(1):p.172-81.

8.Liao,C.,et al.,Noninvasive prenatal diagnosis of commonaneuploidies by semiconductor sequencing.Proc Natl Acad Sci U S A,2014.111(20):p.7415-20。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高母体外周血中胎儿游离DNA浓度的试剂盒、装置及方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种从母体外周血中获得高浓度胎儿游离DNA的方法，包括如下操作：

1)从母体外周血中分离血浆并提取其中的游离DNA；

2)对游离DNA进行扩增；

3)及在游离DNA扩增前或扩增后进行的游离DNA纯化操作；

其中，纯化操作用于富集游离DNA中片段长度不超过160bp的任意一点或者任一区段的游离DNA片段。

特别的，纯化操作用于富集游离DNA中100bp～160bp的任意一点或者任一区段的游离DNA片段。

优选的，上述方法中，纯化操作选自固相可逆固定化磁珠富集、电泳。磁珠包括纯化类磁珠和筛选类磁珠，其中纯化类磁珠包括但不限于Beckman的Agencourt AMPure XP磁珠，TransGen的Magnetic DNA Beads、Magen的MagPure A3XP、AxyPrep Mag PCR Clean-Upbeads、康为的CM Pure DNA产物纯化试剂盒等纯化磁珠。筛选类磁珠，包括但不限于Beckman的DNAsize seleticon beads、AxyMag DNASelection Kit磁珠。电泳特别包括琼脂糖凝胶电泳等DNA分离常用的电泳方式。

优选的，上述方法中，通过构建文库对游离DNA进行扩增。文库的构建方案可以按现有方法进行，也可以按本发明记载的方法构建得到。

游离DNA纯化操作既可以在游离DNA扩增前进行，也可以在扩增后进行。在扩增前进行游离DNA纯化操作可以有效减少扩增时的工作量；扩增后再进行纯化，可以保证提取得到游离DNA都被有效扩增。

作为一种提高母体外周血中胎儿游离DNA浓度的试剂盒，包括血浆游离DNA提取试剂、DNA扩增试剂和游离DNA富集试剂，游离DNA富集试剂可富集母体外周血游离DNA中片段长度不超过160bp的任意一点或者任一区段的游离DNA片段。

作为上述试剂盒的进一步改进，游离DNA富集试剂选自固相可逆固定化磁珠。

作为上述试剂盒的进一步改进，游离DNA富集试剂富集游离DNA中100bp～160bp的任意一点或者任一区段的游离DNA片段。

一种从母体外周血中获得高浓度胎儿游离DNA的系统，包括：

外周血游离DNA分离装置；

游离DNA扩增装置；及

游离DNA富集装置，用于富集母体外周血游离DNA中片段长度不超过160bp的任意一点或者任一区段的游离DNA片段。

游离DNA富集装置为物理方法分离短片断游离DNA的装置，包括但不限于电泳槽、凝胶、DNA ladder、电泳平台和操作系统。

上述片段长度不超过160bp的任意一点或者任一区段的游离DNA片段，特别指100bp～160bp的任意一点或者任一区段的游离DNA片段，100bp～160bp的任意一点或者任一区段选自120bp～130bp、110bp～140bp、100bp～150bp、≤150bp、≤160bp。

本发明的有益效果是：

发明人通过大量的研究，发现通过富集母体外周血中的<160bp的某一点或者任一区段长度的游离DNA进行测序和数据分析，可以出人意料地富集母体外周血中胎儿的游离DNA，从而将胎儿游离DNA浓度(百分比)提高至原来的1.5～4倍。孕妇外周血中胎儿游离DNA的浓度均值为13％，本发明的装置和方法可将胎儿游离DNA浓度均值提高至20％～40％，效果显著。通过有效提高胎儿游离DNA浓度，可以大幅减少高通量测序的数据处理量，有利于进一步降低高通量测序的成本。

通过有效提高胎儿游离DNA浓度，将带来如下优势：

1)将提高在无创产前基因将检测时间提前至孕10周进行检测的实施可能性，使得无创产前基因检测普及面更广，提前发现异常，及早进干预，减少社会经济负担；

2)提高胎儿检测深度和无创产前胎儿基因非整倍体检测的准确率，可显著降低由于胎儿游离DNA浓度过低所导致的假阴性率和提高嵌合体异常胎儿的检出百分比；

3)提高现有无创产前基因检测的检测灵敏度，减少对测序数量的要求，提高检测通量，缩短测序时长，降低无创产前检测的检测成本和人力成本，利于全面推广，促进将无创产前检测纳入社保的政策支持，降低出生缺陷率；

4)提高无创胎儿染色体微缺失微重复检测的分辨率和准确性，给研制覆盖胎儿所有染色体非整倍体及染色体微缺失微重复基因检测试剂盒和方法打下稳定基础；

5)拓展无创产前胎儿基因检测的领域，提高无创胎儿单基因病异常的可行性和准确性。

总而言之，本发明技术方案提高胎儿游离DNA浓度的效益，对于拓展无创产前胎儿检测领域，完善国内现有的产前筛查流程，减少基因组病患儿出生，减轻社会负担，提高社会人口素质和降低社会经济负担具有重要意义。

附图说明

图1是不同reads长度Bins对应的胎儿DNA浓度提高倍数；

图2是实施例1片段筛选和空白对照的DNA大小的分布图；

图3是实施例2片段筛选和空白对照的DNA大小的分布图；

图4是实施例3片段筛选和空白对照的DNA大小的分布图；

图5是微缺失/微重复样本片段筛选前后CNV区域检出值对比图。

具体实施方式

发明人根据母体外周血中源于胎儿的游离DNA比源于母体的游离DNA偏短这一现象，认为有可能通过提取短片断的游离DNA可以达到富集胎儿DNA的目的。为了确认不同长度的外周血游离DNA对应的胎儿DNA浓度的变化情况，将已有的男胎样本的序列长度(readslength)划分bins进行分析。

选取来自北京博奥医学检验所的10000例临床样本，这10000个样本均为携带男胎的样本，并且经临床随访结果证实胎儿的核型正常。

将测序得到的序列(reads)比对到人类参考基因组，并去除低质量的比对结果以及重复序列，进而计算22对染色体以及性染色体的序列数(reads number)和序列比例(reads ratio)。根据用核型正常的样本建立的参考数据库(Reference)，可以计算每条染色体的Z-score：Z-score＝(序列比例-Reference平均值)/Reference标准差。由于男胎的胎儿DNA浓度和Y染色体的Z-score是呈现正相关关系的，因此根据男胎Y染色体的Z-score可以推测胎儿游离DNA浓度。

由于胎儿的游离DNA长度偏短，因此在实际的数据分析过程中，可以将截取<160bp的短片段游离DNA进行独立分析，可以达到将胎儿DNA浓度提高的效果。每个混合样本，根据DNA的长度将测序得到的序列读段(reads)分入10个不同的长度bins，包括[95，105)，[105，115)，[115，125)，[125，135)，[135，145)，[145，155)，[155，165)，[165，175)，[175，185)，[185，195)。每个读长的bins单独计算chrY染色体的Zscore并与原始的Zscore进行比较，从而得到胎儿浓度提高的倍数。如图1所示，DNA长度在<160bp的5个bin中都是富集了胎儿游离DNA的，其中[95，105)，[105，115)，[115，125)，[125，135)，[135，145)，[145，155)，[155，165)分别提高至原来的1.99、2.61、2.85、2.78、2.21和1.53倍。因此，这一数据充分说明，通过实验或者数据分析的手段富集<160bp以内某一点或者某一区段的DNA可以富集胎儿DNA，从而提高胎儿DNA浓度。

表1：不同reads长度区间对应的胎儿DNA浓度提高倍数

基于该发现，发明人提出了一种可将母体外周血中胎儿游离DNA提高至原来的1.5～4倍的试剂盒、装置和方法。

下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。

以下实验中：

DNA测序文库测序：

利用Ion Proton^TM测序平台对上述构建好的DNA文库在同一张芯片进行高通量测序Ion Proton^TM测序平台采取的为单端测序法，测序最大读长为300bp，因此可以将母体外周血的游离DNA测通，获得DNA片段的长度信息。

测序数据分析：

将测序得到的序列(reads)比对到人类参考基因组，并去除低质量的比对结果以及重复序列，进而计算22对染色体以及性染色体的序列数(reads number)和序列比例(reads ratio)。根据用核型正常的样本建立的参考数据库(Reference)，可以计算每条染色体的Z-score：Z-score＝(序列比例-Reference平均值)/Reference标准差。由于男胎的胎儿DNA浓度和Y染色体的Z-score是呈现正相关关系的[5]，因此根据男胎Y染色体的Z-score可以推测胎儿游离DNA浓度。

实施例1：一种提高母体外周血中胎儿游离DNA浓度的试剂盒

试剂盒由游离DNA提取试剂、文库建库试剂和游离DNA富集试剂组成，其中，游离DNA富集试剂可富集游离DNA中片段长度不超过160bp的任意一点或者任一区段的游离DNA片段。

具体的，游离DNA提取试剂为磁珠提取试剂，包括蛋白酶K、裂解缓冲液、清洗液1、清洗液2、洗脱液。

文库建库试剂为胎儿染色体非整倍体的建库试剂，包括：末端修复缓冲液、末端修复酶、DNA连接酶、DNA连接酶、PCR扩增试剂、PCR引物、TE溶液、P1接头、标签序列1-32；也可以使用Ion Plus Fragment Library Ki(Life Technology)或New England Biolabs，以及Enzymatics的相关文库构建试剂。本实施例中使用胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒(博奥生物集团)里面的建库试剂。

游离DNA富集试剂：包括纯化类磁珠和筛选类磁珠，其中纯化类磁珠包括但不限于Beckman的Agencourt AMPure XP磁珠，TransGen的Magnetic DNABeads、Magen的MagPureA3XP、AxyPrep Mag PCR Clean-Up beads、康为的CM Pure DNA产物纯化试剂盒等纯化磁珠。本实施案例使用Beckman的Agencourt AMPure XP纯化类磁珠。筛选类磁珠，包括但不限于Beckman的DNA size seleticon beads、AxyMag DNA Selection Kit磁珠。本实施案例使用AxyMag DNA Selection Kit筛选类磁珠。

样本及其处理：样本来自北京博奥医学检验所的4例临床样本，样本编号分别为“RD13120026”、“RD13120027”、“RD13120035”和“RD13120036”。这四个样本均为携带男胎的样本，并且经临床随访结果证实胎儿的核型正常。采集母体的10ml外周血，血样经过两步离心法获得去除血细胞的血浆，该血浆可用于后续实验或-80℃冻存备用。

提取血浆游离DNA：选用博奥木华公司生产的血清/血浆游离DNA磁珠提取试剂盒(产品号为S10020)进行DNA提取。

也可以采用硅胶膜柱离心提取、磁珠提取等方法提取血浆游离DNA。例如使用TIANGEN公司生产的TIANamp Micro DNAkit(产品号为DP316)、Magnetic Serum/PlasmaCirculating DNA Kit(DP340)提取血浆中的DNA，或美基生物公司生产的磁珠法游离核酸DNA提取试剂盒(产品号为12918)等。

测序文库的制备：

A.末端修复：将上一步提取获得的游离DNA分别按照下面的表格配置反应体系；

组分	反应体积(μL)
		DNA	使用无核酸酶水补至39.5
末端修复缓冲液	10
		末端修复酶	0.5
反应体系总量	50

将此反应体系置于室温孵育20min。使用AMPure XP磁珠进行纯化，25μL TE溶液溶解洗脱。

B.接头连接：将上述片段集中的DNA溶液分别按照下面的表格配置反应体系：

接头为由如下两个正反序列组成的P1 Adapter：

5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3'(SEQ ID NO：1)，

3'-T*T*GGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA-5'(SEQ ID NO：2)

特异标签序列是由如下正反两个序列组成的Barcode Primer X组成：

5'-CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT-3'(SEQ ID NO：3)

3'-CGCACAGAGGCTGAGTCNNNNNNNNNNCTA-5'(SEQ ID NO：4)

其中“N”代表A、T、C、G任意一个碱基；*代表核苷酸进行了硫代修饰，防止被核酸酶降解。

将此反应体系置于室温孵育30min。使用AMPure XP磁珠进行纯化，18.2μL TE溶液溶解洗脱。

C.PCR扩增：将上步所得的连接接头的DNA按照下面的表格配置反应体系

组分	反应体积(μL)
		上步所得的连接接头的DNA	18
PCR扩增试剂	50
		PCR引物	2
反应体系总量	70

PCR扩增引物序列为：

Primer 1：5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTC-3'(SEQ ID NO：5)

Primer 2：5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG-3'(SEQ ID NO：6)

PCR反应条件：72℃，10min，95℃，5min；(95℃，15s；62℃，15s；70℃，1min)12cycles；70℃，5min；4℃，holding。

PCR结束后，用AMPure XP磁珠进行纯化，30μL TE溶液溶解洗脱。

文库片段筛选

为明确评估片段筛选对于提高胎儿DNA的效果，将以上制备好的文库DNA等分成三等份：第一份DNA作为对照组，不进行片段筛选使用纯化。

第二份DNA：使用磁珠进行短片断游离DNA筛选，包括如下操作：

1)将进行筛选的文库DNA加入1.5倍体积的筛选磁珠，充分混合后静置5分钟，置于磁力架上直至澄清；

2)将上清吸取至1.5倍体积的筛选磁珠中，将上清和磁珠充分混合后静置5分钟，置于磁力架上直至澄清；

3)吸走上清，使用75％～80％乙醇洗涤2次后，使用20μL TE溶液溶解洗脱，得到筛选后的DNA文库。

该筛选后的DNA文库的编号+”1”，以便与对照组文库区别。

第三份DNA：使用筛选磁珠进行短片断游离DNA筛选，包括如下操作：

1)将进行筛选的文库DNA加入1倍体积的筛选磁珠，充分混合后静置5分钟，置于磁力架上直至澄清；

2)将上清吸取至1.5倍体积的筛选磁珠中，充分混合后静置5分钟，置于磁力架上直至澄清；

3)吸走上清，使用75％～80％乙醇洗涤2次后，使用20μL TE溶液溶解洗脱，得到筛选后的DNA文库。

该筛选后的DNA文库的编号+”2”，以便与对照组文库区别。

文库质检

该文库质检可选用Qubit及其试剂进行检测，本方法中选择QPCR检测扩增产物的浓度，浓度如下表所示：

从上表中的数据可知，本发明的筛选试剂盒所构建的文库浓度适当，远远高于IonProton^TM测序平台上机浓度(26pM)和博奥生物集团的BioelectronSeq 4000基因测序仪上机浓度(20pM)，该发明的试剂组合溶液和文库构建方法可适用于Ion ProtonTM测序平台和BioelectronSeq4000基因测序仪。

不同处理方法对胎儿DNA浓度的影响

为了比较片段筛选与否两种实验方案对胎儿DNA浓度的影响，首先需要根据测序读长确定是否成功富集到了<160bp的短片断游离DNA；其次需要根据chrY的Z-score来判断胎儿DNA浓度提高的倍数；最后，需要根据chr13，chr18，chr21的Zscore来判断样本是否存在染色体非整倍体异常以及阳性样本的检出值是否等比例上升。

图2是根据上述方法得到的片段筛选和空白对照的DNA大小的分布图，从图中可以看到，进行片段筛选后，<160bp的短片断游离DNA的比例明显提高。

表2列出了样本“RD13120026”、“RD13120027”、“RD13120035”和“RD13120036”进行磁珠法片段筛选前后短片断游离DNA(<160bp)的比例、chrY的Zscore以及胎儿DNA浓度。

表2、不同处理对胎儿DNA浓度的影响

以样本RD13120026为例，采用纯化磁珠筛选和筛选片段筛选后：<160bp的短片断游离DNA的比例提高分别提高至78.33％和75.35％；胎儿浓度提高至2.25倍和2.10倍；chr13、chr18、chr21的Z-score均在正常范围[-3,3]以内，显示胎儿不存在染色体非整倍体异常。因充分证明通过富集<160bp的母体外周血短片断游离DNA，可以将母体外周血中的胎儿浓度提高至原来的1.5～4倍。

实施例2：一种提高母体外周血中胎儿游离DNA浓度的试剂盒

试剂盒的组成同实施例1。

样本及其处理：样本来自北京博奥医学检验所的10ml母体静脉血样本，编号为“RD13120110”、“RD13120111”、“RD13120112”和“RD13120113”。这些样本均为怀有男胎的孕妇外周血取样所得，其中RD13120112为T21阳性样本，其余三个样本经临床随访证实为正常胎儿。血样经过两步离心法获得去除血细胞的血浆，该血浆可用于后续实验或-80℃冻存备用。

提取血浆游离DNA：选用博奥木华公司生产的血清/血浆游离DNA磁珠提取试剂盒(产品号为S10020)进行DNA提取，每例样本提取三份DNA，来源同一个编号的DNA混合在一起，备用。

也可以采用硅胶膜柱离心提取、磁珠提取等方法提取血浆游离DNA。例如使用TIANGEN公司生产的TIANamp Micro DNA kit(产品号为DP316)、Magnetic Serum/PlasmaCirculating DNA Kit(DP340)提取血浆中的DNA，或美基生物公司生产的磁珠法游离核酸DNA提取试剂盒(产品号为12918)等。

文库的制备和片段筛选：

为明确评估片段筛选对于提高胎儿DNA的效果，将以上提取完毕的DNA等分成三等份，第一份DNA样本：作为对照组，不进行片段筛选；第二份DNA样本：在建库前使用纯化磁珠进行短片断游离DNA筛选；第三份DNA样本：按进行末端修复后，使用筛选磁珠进行短片断游离DNA筛选。

第一份DNA样本：

按实施例1所示，进行末端修复、接头连接和PCR扩增实验。

第二份DNA样本：

1)将进行筛选的文库DNA加入1.5倍体积的筛选磁珠，充分混合后静置5分钟，置于磁力架上直至澄清；

2)将上清吸取至1.5倍体积的筛选磁珠中，将上清和磁珠充分混合后静置5分钟，置于磁力架上直至澄清；

3)吸走上清，使用75％～80％乙醇洗涤2次后，使用40μL TE溶液溶解洗脱，得到筛选后的DNA。

将上步所得的DNA，按实施例1中末端修复、接头连接和PCR扩增的步骤进行实验。该构建好的DNA文库的编号+”1”,以便与对照组文库区别。

第三份DNA样本：

1)将该份DNA按进行末端修复反应后，往末端修复体系和DNA液体的混合反应液中加入1.5倍体积的筛选磁珠，充分混合后静置5分钟，置于磁力架上直至澄清；

2)将上清吸取至1.5倍体积的筛选磁珠中，将上清和磁珠充分混合后静置5分钟，置于磁力架上直至澄清；

3)吸走上清，使用75％～80％乙醇洗涤2次后，使用40μL TE溶液溶解洗脱，得到筛选后平末端修复后DNA。

将上步所的DNA按实施例1中接头连接和PCR扩增的步骤进行实验。该构建好的DNA文库的编号+”2”,以便与对照组文库区别。

文库质检：

该文库质检可选用Qubit及其试剂进行检测，本方法中选择QPCR检测扩增产物的浓度，浓度如下表所示：

从上表中的数据可知，本发明的筛选试剂盒所构建的文库浓度适当，远远高于IonProton^TM测序平台上机浓度(26pM)和博奥生物集团的BioelectronSeq 4000基因测序仪上机浓度(20pM)，该发明的试剂组合溶液和文库构建方法可适用各种测序平台测序，包括但不限于Ion ProtonTM测序平台和BioelectronSeq 4000基因测序仪。

不同处理方法对胎儿DNA浓度的影响

为了比较片段筛选与否两种实验方案对胎儿DNA浓度的影响，首先需要根据测序读长确定是否成功富集到了<160bp的短片断游离DNA；其次需要根据chrY的Z-score来判断胎儿DNA浓度提高的倍数；最后，需要根据chr13，chr18，chr21的Zscore来判断样本是否存在染色体非整倍体异常以及阳性样本的检出值是否等比例上升。

图3是根据上述方法得到的片段筛选和空白对照的DNA大小的分布图，从图中可以看到，进行片段筛选后，<160bp的短片断游离DNA的比例明显提高。

表3列出了样本“RD13120110”、“RD13120111”、“RD13120112”和“RD13120113”不做片段筛选、末端修复前筛选、末端修复后筛选等三种实验条件下短片断游离DNA(<160bp)的比例、chrY的Zscore以及胎儿DNA浓度。

表3、不同处理对胎儿DNA浓度的影响

以样本“RD13120112”为例，末端修复前筛选、末端修复后筛选后<160bp的短片断游离DNA的比例提高至79.12％和83.10％；胎儿浓度提高至2.47倍和2.68倍；chr21的Z-score由3.373提高至7.823和8.867，检出值大大提高。充分证明通过富集<160bp的母体外周血短片断游离DNA，可以将母体外周血中的胎儿浓度提高至原来的1.5～4倍，有利于阳性样本的检出。

实施例3：一种提高母体外周血中胎儿游离DNA浓度的装置

通过物理方法获得母体外周血中<160bp某一区段或者某一点的短片断游离DNA，物理方法分离短片断游离DNA的装置为凝胶电泳、预制凝胶电泳等，包含电泳槽、凝胶、DNAladder、电泳平台和操作系统。

装置包括外周血游离DNA分离装置、游离DNA文库构建装置、文库纯化装置及用于富集游离DNA中片段长度不超过160bp的任意一点或者任一区段的游离DNA片段的游离DNA富集装置。其中：

外周血游离DNA分离装置为磁珠提取试剂盒，包括：蛋白酶K、裂解缓冲液、清洗液1、清洗液2、洗脱液；

游离DNA扩增装置为文库构建装置，本实施例中使用胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒(博奥生物集团)里面的建库试剂，包括末端修复缓冲液、末端修复酶、DNA连接酶、DNA连接酶、PCR扩增试剂、PCR引物、TE溶液、P1接头、标签序列1-32。也可使用Ion Plus Fragment Library Ki(Life Technology)或New England Biolabs，以及Enzymatics的相关文库构建试剂；

文库纯化装置为纯化磁珠，包括但不限于Beckman的Agencourt AMPure XP磁珠、TransGen的Magnetic DNA Beads、Magen的MagPure A3XP、Axygen的AxyPrep Mag PCRClean-Up beads、康为的CM Pure DNA产物纯化试剂盒等纯化磁珠。本实施例中使用Beckman的Agencourt AMPure XP磁珠。

游离DNA富集装置可以是E-iBase^TM预制琼脂糖凝胶电泳系统(LifeTechnologies)、Pippin Pre全自动电泳和核酸片段回收系统(sage science)、BluePippin仪全自动电泳和核酸片段回收系统(sage science)。本实施例中使用Blue Pippin仪全自动电泳和核酸片段回收系统。

样本及其处理：

选取4例来自北京博奥医学检验所的10ml母体静脉血样本，编号为“RD150038”、“RD150039”、“RD150040”和“RD150041”，其中样本RD150039经羊水穿刺确认为T21男胎样本。血样经过两步离心法获得去除血细胞的血浆，该血浆可用于后续实验或-80℃冻存备用。

提取血浆游离DNA：

选用博奥木华公司生产的血清/血浆游离DNA磁珠提取试剂盒(产品号为S10020)进行DNA提取。

也可以采用硅胶膜柱离心提取、磁珠提取等方法提取血浆游离DNA。例如使用TIANGEN公司生产的TIANamp Micro DNA kit(产品号为DP316)、Magnetic Serum/PlasmaCirculating DNA Kit(DP340)提取血浆中的DNA，或美基生物公司生产的磁珠法游离核酸DNA提取试剂盒(产品号为12918)等。

双端测序文库的制备：

A.末端修复：参见实施例1的操作方法。

B.接头连接:参见实施例1的操作方法。

特异标签序列是由如下正反两个序列组成的Barcode Primer X组成：

5'-CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT-3'(SEQ ID NO：3)

3'-CGCACAGAGGCTGAGTCNNNNNNNNNNCTA-5'(SEQ ID NO：4)

其中”N”代表A、T、C、G任意一个碱基。

C.PCR扩增:参见实施例1的操作方法。

文库片段筛选：

为明确片段筛选对于提高胎儿DNA的效果，将以上制备好的文库等分成四等份DNA样本：

第一份DNA作为对照组，不进行片段筛选；

第二份DNA样本采用切胶仪截取短片断游离DNA文库，目标DNA长度为90-155bp；

第三份DNA样本采用切胶仪截取短片断游离DNA文库，目标DNA长度为120-150bp；

第四份DNA样本采用切胶仪截取短片断游离DNA文库，目标DNA长度为110-140bp。

使用Blue Pippin仪全自动电泳和核酸片段回收仪进行切胶。

文库质检：

该文库质检可选用Qubit及其试剂进行检测，本方法中选择QPCR检测扩增产物的浓度，浓度如下表所示：

从上表中的数据可知，本发明的筛选试剂盒所构建的文库浓度适当，远远高于IonProton^TM测序平台上机浓度(26pM)和博奥生物集团的BioelectronSeq 4000基因测序仪上机浓度(20pM)，该发明的试剂组合溶液和文库构建方法可适用于Ion Proton^TM测序平台和BioelectronSeq4000基因测序仪。

不同处理方法对胎儿DNA浓度的影响

为了比较片段筛选与否两种实验方案对胎儿DNA浓度的影响，首先需要根据测序读长确定是否成功富集到了<160bp的短片断游离DNA；其次需要根据chrY的Z-score来判断胎儿DNA浓度提高的倍数；最后，需要根据chr13，chr18，chr21的Zscore来判断样本是否存在染色体非整倍体异常以及阳性样本的检出值是否等比例上升。

图4是根据上述方法得到的片段筛选和空白对照的DNA大小的分布图，从图中可以看到，进行片段筛选后，<160bp的短片断游离DNA的比例明显提高。

表4列出了样本“RD150038”、“RD150039”、“RD150040”和“RD150041”不做片段筛选和切胶片段筛选下短片断游离DNA(<160bp)的比例、chrY的Zscore以及胎儿DNA浓度。

表4、不同处理方法对胎儿DNA浓度的影响

以T21阳性样本“RD150039”为例：采用切胶法筛选DNA的目标长度分别为90-155bp、120-150bp和110-140bp后，<160bp的短片断游离DNA的比例提高至97.20％、99.44％和100％，胎儿浓度由3.47％提高至7.81％、7.87％和9.51％；chr21的Z-score从，显示胎儿存在chr21三体异常，同时chr21的Z-score随着胎儿浓度的提高由3.274提高至6.891、8.142和9.523。充分证明通过富集<160bp的母体外周血短片断游离DNA，可以将母体外周血中的胎儿浓度提高至原来的1.5～4倍。

实施例4：提高母体外周血中胎儿游离DNA可提高无创微缺失/微重复样本的检出率试剂盒的组成同实施例1。

样本及其处理：样本来自广东省妇幼保健院的5ml母体静脉血样本，编号为“A0248”、“A0644”、“A0652”和“A0786”。这些样本均为B超发现胎儿存在B超异常，经arraycCGH检测胎儿羊水细胞确胎儿存在染色体微缺失/微重复异常，具体的异常如下表所示：

血样经过两步离心法获得去除血细胞的血浆，该血浆可用于后续实验或-80℃冻存备用。

提取血浆游离DNA：选用博奥木华公司生产的血清/血浆游离DNA磁珠提取试剂盒(产品号为S10020)进行DNA提取，每例样本提取三份DNA，来源同一个编号的DNA混合在一起，备用。

也可以采用硅胶膜柱离心提取、磁珠提取等方法提取血浆游离DNA。例如使用TIANGEN公司生产的TIANamp Micro DNA kit(产品号为DP316)、Magnetic Serum/PlasmaCirculating DNA Kit(DP340)提取血浆中的DNA，或美基生物公司生产的磁珠法游离核酸DNA提取试剂盒(产品号为12918)等。

文库的制备和片段筛选：

为明确评估片段筛选对于提高胎儿DNA的效果，将以上提取完毕的DNA等分成两等份，第一份DNA样本：作为对照组，不进行片段筛选；第二份DNA样本：参照实施例1所示，进行末端修复前或者末端修复后，使用筛选磁珠进行短片断游离DNA筛选。

文库质检

该文库质检可选用Qubit及其试剂进行检测，本方法中选择QPCR检测扩增产物的浓度，浓度如下表所示：

从上表中的数据可知，本发明的筛选试剂盒所构建的文库浓度适当，远远高于IonProton^TM测序平台上机浓度(26pM)和博奥生物集团的BioelectronSeq 4000基因测序仪上机浓度(20pM)，该发明的试剂组合溶液和文库构建方法可适用各种测序平台测序，包括但不限于Ion ProtonTM测序平台和BioelectronSeq 4000基因测序仪。

不同处理方法对胎儿DNA浓度的影响

为了比较片段筛选与否两种实验方案对胎儿DNA浓度的影响，首先需要根据测序读长确定是否成功富集到了<160bp的短片断游离DNA；其次需要根据chrY的Z-score来判断胎儿DNA浓度提高的倍数；最后，需要根据微缺失/微重复样本的CNV所在区域的Zscore来判断片段筛选方法是否能提高微缺失/微重复样本的检出值。

表5列出了样本“A0248”、“A0644”、“A0652”和“A0786”不做片段筛选、末端修复前/后进行片段筛选的实验条件下短片断游离DNA(<160bp)的比例、chrY的Zscore以及胎儿DNA浓度。

表5、不同处理方法对胎儿DNA浓度的影响

从表中可以看出，采用片段筛选方法可提高胎儿游离DNA的浓度，增加信噪比，微缺失微重复区域所在的染色体的Zscore的绝对值等比例提高，微缺失微重复区域的信号增强；而拷贝数正常的染色体的Zscore均在正常范围内。

表6详细列出了每个样本的CNV区域的信息以及片段筛选前后Zscore检出值的变化：

表6、样本信息以及片段筛选前后Zscore检出值的变化

从表中可以看出，所有样本的CNV区域的Zscore的绝对值均随着胎儿DNA浓度的提高而上升，显著性水平上升，CNV区域全部检出。如图5所示，未使用片段筛选方法，CNV的检出率只有50％，使用片段筛选方法后，检出率提高到100％。

可见，通过富集母体外周血中的<160bp的某一点或者任一区段长度的游离DNA进行测序和数据分析，可以出人意料地富集母体外周血中胎儿的游离DNA，从而将胎儿游离DNA浓度(百分比)提高至原来的1.5～4倍。孕妇外周血中胎儿游离DNA的浓度均值为13％，本发明的装置和方法可将胎儿游离DNA浓度均值提高至20％～40％，效果显著。通过有效提高胎儿游离DNA浓度，可以大幅减少高通量测序的数据处理量，有利于进一步降低高通量测序的成本。

SEQUENCE LISTING

<110> 东莞博奥木华基因科技有限公司

<120> 提高母体外周血中胎儿游离DNA浓度的试剂盒、装置及方法

<130> cfDNA

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 1

ccactacgcc tccgctttcc tctctatggg cagtcggtga t 41

<210> 2

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工引物

<220>

<221> 硫代修饰

<222> (42)..(43)

<400> 2

atcaccgact gcccatagag aggaaagcgg aggcgtagtg gtt 43

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工引物

<220>

<221> 硫代修饰

<222> (13)..(14)

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(40)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag nnnnnnnnnn gat 43

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(13)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

atcnnnnnnn nnnctgagtc ggagacacgc 30

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 5

ccatctcatc cctgcgtgtc 20

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 6

ccactacgcc tccgctttcc tctctatg 28

Claims (1)

1.一种从母体外周血中获得高浓度胎儿游离DNA的方法，包括如下操作：

1)从母体外周血中分离血浆并提取其中的游离DNA；

2)通过构建文库对游离DNA进行扩增，具体操作为：

末端修复：将上一步提取获得的游离DNA 分别按照下面的表格配置反应体系；

将此反应体系置于室温孵育20min；使用AMPure XP磁珠进行纯化，25μL TE溶液溶解洗脱；

接头连接：将上步所得的平末端DNA分别按照下面的表格配置反应体系：

所述P1接头为由如下两个正反序列组成的P1 Adapter：

5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3'，

3'-T*T*GGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA-5'

所述标签序列X是由如下正反两个序列组成的Barcode Primer X组成：

5'-CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT-3'

3'-CGCACAGAGGCTGAGTCNNNNNNNNNNCTA-5'

其中“N”代表A、T、C、G任意一个碱基； *代表核苷酸进行了硫代修饰，防止被核酸酶降解；

将此反应体系置于室温孵育30min；使用AMPure XP磁珠进行纯化，18.2μL TE溶液溶解洗脱；

PCR扩增：将上步所得的连接接头的DNA按照下面的表格配置反应体系

所述PCR引物序列为：

Primer 1：5 ' -CCATCTCATCCCTGCGTGTC- 3 '

Primer 2：5 ' -CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG -3'

PCR 反应条件： 72℃， 10min， 95℃， 5min；然后 95℃， 15s， 62℃， 15s， 70℃，1min， 12 个循环； 70℃， 5min； 4℃， holding；

PCR结束后，用AMPure XP磁珠进行纯化，30μL TE溶液溶解洗脱；

3)及文库片段筛选，具体包括：

a)将进行筛选的文库DNA 加入1.5倍体积的筛选磁珠，充分混合后静置5分钟，置于磁力架上直至澄清；

b)将上清吸取至1.5倍体积的筛选磁珠中，将上清和磁珠充分混合后静置5分钟，置于磁力架上直至澄清；

c)吸走上清，使用75%～80%乙醇洗涤2次后，使用20μL TE溶液溶解洗脱，得到筛选后的DNA文库；

或

a)将进行筛选的文库DNA 加入1倍体积的筛选磁珠，充分混合后静置5分钟，置于磁力架上直至澄清；

b)将上清吸取至1.5倍体积的筛选磁珠中，充分混合后静置5分钟，置于磁力架上直至澄清；

c)吸走上清，使用75%～80%乙醇洗涤2次后，使用20μL TE溶液溶解洗脱，得到筛选后的DNA文库；

其中，所述文库片段筛选用于富集游离DNA中片段长度区段为 [115-125)、[105-125)、[115-135)或[105-135)的游离DNA片段。