CN104640997B - 通过使用靶向大规模并行测序的等位基因比率分析进行的胎儿三体性的非侵入性产前诊断 - Google Patents

通过使用靶向大规模并行测序的等位基因比率分析进行的胎儿三体性的非侵入性产前诊断 Download PDF

Info

Publication number
CN104640997B
CN104640997B CN201380029904.0A CN201380029904A CN104640997B CN 104640997 B CN104640997 B CN 104640997B CN 201380029904 A CN201380029904 A CN 201380029904A CN 104640997 B CN104640997 B CN 104640997B
Authority
CN
China
Prior art keywords
locus
allele
ratio
maternal
amount
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201380029904.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104640997A (zh
Inventor
赵慧君
廖嘉炜
陈君赐
卢煜明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chinese University of Hong Kong CUHK
Original Assignee
Chinese University of Hong Kong CUHK
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chinese University of Hong Kong CUHK filed Critical Chinese University of Hong Kong CUHK
Priority to CN201711164143.6A priority Critical patent/CN107841543B/zh
Publication of CN104640997A publication Critical patent/CN104640997A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104640997B publication Critical patent/CN104640997B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/40—Population genetics; Linkage disequilibrium
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G16B30/10—Sequence alignment; Homology search
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Abstract

使用在具有母体DNA和胎儿DNA的混合物的母体样品中检测到的等位基因的比率，来检测胎儿是否具有与第一染色体相关的非整倍性。针对与多态性基因座相关的靶标区域富集来自样品的DNA，然后进行测序。确定第一染色体以及一个或多个参照染色体上具有胎儿特异性等位基因的靶标区域中的多态性基因座(例如单核苷酸多态性)。确定第一染色体上的基因座处的胎儿特异性等位基因与共有的等位基因之间的第一比率。确定参照染色体上的基因座处的胎儿特异性等位基因与共有的等位基因之间的第二比率。可将所述第一比率与第二比率之间的第三比率与阈值比较以确定是否存在非整倍性，以及该非整倍性是母本来源的还是父本来源的。

Description

通过使用靶向大规模并行测序的等位基因比率分析进行的胎 儿三体性的非侵入性产前诊断
相关申请的交叉引用
本申请为非临时申请，并要求2012年4月6日递交的标题为“通过使用靶向大规模并行测序的等位基因比率分析进行的胎儿三体性的非侵入性产前诊断(NONINVASIVEPRENATAL DIAGNOSIS OF FETAL TRISOMY BY ALLELIC RATIO ANALYSIS USING TARGETEDMASSIVELY PARALLEL SEQUENCING)”的美国临时专利申请第61/621,454号的权益，其通过引用整体并入本文，用于所有目的。
发明背景
胎儿非整倍性如21三体(T21)的产前筛查和诊断为现代产科护理的既定部分。常规的产前筛查以诸如母体年龄、声像图和生化标记的参数为基础[1]。因为这些参数主要是基于基本上作为与核心分子病理学相关的副现象的表型特征，它们的诊断性能通常是不理想的。通过上述筛查方法分级为高风险的怀孕需要进一步研究通过侵入性方案如绒毛膜取样(CVS)和羊膜穿刺术获得的胎儿遗传物质。后面的这些方案具有小的但确定的流产风险[2]。1997年证明了母体血浆中存在胎儿DNA，这开辟了非侵入性产前诊断(NIPD)的可能[3]。
母体血浆DNA含有片段化的母体和胎儿基因组DNA的混合物[4]。大量的母体DNA背景代表了对探测胎儿染色体状态的挑战。早期对T21的NIPD的研究为基于多态性的，需要测量等位基因比率并将其与预期的正常值比较[5-7]。这些早期的方法是基于胎儿特异性分子标签如DNA甲基化标记[5]和RNA标记[6]，或者需要人们例如使用母体血浆的甲醛处理来将分数形式的胎儿DNA浓度增加至足够高的水平[7]。然而，对于后一方法，对甲醛处理的有效性存在争议，因为该方法不能被不同的小组一致地重现[8-10]。因此，该方法的临床适用性仍不清楚。
因此，需要提供使用等位基因比率的非侵入性产前诊断的新技术。
发明概述
实施方案提供了用于非侵入性地确定胎儿是否具有与第一染色体相关的非整倍性的方法、装置和系统，其通过分析含有无细胞的胎儿DNA和母体DNA的混合物的生物样品。例如，可确定第一染色体的第一等位基因比率，并可确定一个或多个参照染色体的第二等位基因比率。为了确定该比率，可针对与多态性基因座相关的靶标区域富集DNA，然后进行测序。确定第一染色体和一个或多个参照染色体上具有胎儿特异性等位基因的靶标区域中的基因座。这些基因座可用于确定各个等位基因比率。可将第一等位基因比率与第二等位基因比率之间的第三比率与阈值比较以确定是否存在针对第一染色体的非整倍性，以及非整倍性是母本来源的还是父本来源的。
其他实施方案涉及与本文所述方法相关的系统、便携式用户装置和计算机可读介质。
参照以下详细描述和附图可获得对本发明实施方案的性质和优势的更好的理解。
附图说明
图1A显示了母体和整倍性胎儿的基因座处的等位基因的图100，以及根据本发明实施方案的计算实例。图1B显示了母体和父本来源的非整倍性胎儿的基因座处的等位基因的图120，以及根据本发明实施方案的计算实例。图1C显示了母体和母本来源的非整倍性胎儿的基因座处的等位基因的图140，以及根据本发明实施方案的计算实例。
图2是说明分析来自怀有胎儿的女性个体的生物样品以确定胎儿是否具有非整倍性的方法200的流程图。
图3显示了根据本发明实施方案的14名孕妇的测序结果表。
图4显示了通过非靶向与靶向测序数据的F-S比进行的T21检测。计算了值以将非靶向(A)和靶向(B)测序数据中来自整倍性胎儿的父本和母本来源的T21区分开来。(Ma-T21：母本来源的T21。Pa-T21：父本来源的T21。)
图5A和5B显示了根据本发明实施方案的分数形式的胎儿DNA浓度为5％(图5B)和15％(图5A)的T21检测的计算机模拟图。
图6显示了研究用于T21检测的特征性(informative)等位基因计数的最小数目的计算机模拟的图600。
图7显示了可用于根据本发明实施方案的系统和方法的计算机系统实例700的方框图。
定义
如本文所用的术语“生物样品”是指采集自个体(例如，人，如孕妇)且含有一个或多个目标核酸分子的任何样品。实例包括血浆、唾液、胸膜液、汗液(sweath)、腹水、胆汁、尿液、血清、胰液、粪便和宫颈刮片样品。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其单链或双链形式的聚合物。除非有明确的限定，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物与参照核酸具有类似的结合特性并通过与天然存在的核苷酸类似的方式代谢。除非另有所指，具体的核酸序列除明确指定的序列之外还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子替换)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列。具体而言，可通过产生其中一个或多个选定的(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基替换的序列来实现简并密码子替换(Batzer MAet al.,Nucleic Acid Res 1991；19:5081；Ohtsuka Eet al.,J Biol Chem 1985；260:2605-2608；和Rossolini GM et al.,Mol CellProbes 1994；8:91-98)。术语核酸可与基因，基因或基因座编码的cDNA、mRNA、非编码小RNA、微小RNA(miRNA)、Piwi相互作用RNA和短发卡RNA(shRNA)互换使用。
术语“基因”是指参与产生多肽链的DNA片段。其可包括编码区之前和之后的区域(前导序列(leader)和尾随序列(trailer))以及单独的编码片段(外显子)之间的间隔序列(内含子)。
如本文所用，术语“基因座(locus)”或其复数形式“基因座(loci)”为在基因组间具有变异的任何长度的核苷酸(或碱基对)的位置或地址。如果SNP在母体中为纯合的(例如，基因型AA)且在胎儿中为杂合的(例如，基因型AB)，则其为特征性的。
术语“测序标签”(也称为序列阅读结果)是指从核酸分子如DNA片段的全部或部分获得的序列。在一实施方案中，仅片段的一个末端被测序，例如，约30bp。然后，可将测序标签与参照基因组比对。可选地，可对片段的两端进行测序以生成两个测序标签，其可提供比对中的更大精确性，并且还提供片段的长度。在又一实施方案中，可例如通过连接将线性DNA片段环化，并可对跨越连接基因座的部分进行测序。
术语“通用测序”是指其中将连接物(adapter)添加至片段的末端并将用于测序的引物与连接物结合的测序。因此，可使用相同的引物对任何片段进行测序，因此测序可为任意的。
术语分数形式的胎儿DNA浓度可与术语胎儿DNA比例和胎儿DNA分数可互换使用，并且指母体血浆或血清样品中存在的来源于胎儿的DNA分子的比例(Lo YMD et al.Am JHum Genet 1998；62:768-775；Lun FMF et al.Clin Chem 2008；54:1664-1672)。
如本文所用的术语“过量表达的(overrepresented)核酸序列”是指生物样品中的两个目的序列(例如，临床相关的序列和背景序列)中比另一个序列更丰富的核酸序列。例如，母体基因(共有的等位基因)在特征性基因座为过量表达的。
如本文所用的术语“参数”是指定征定量数据集的数值和/或定量数据集之间的数值关系。例如，第一核酸序列的第一量与第二核酸序列的第二量之间的比率(或比率的函数)为参数。
如本文所用的术语“阈值”是指其值被用于判断生物样品的分类的两种或更多种状态(例如，患病的和非患病的)的数值。例如，如果参数大于阈值，则进行定量数据的第一类分类(例如，患病状态)；或者如果参数小于阈值，则进行定量数据的不同分类(例如，非患病的状态)。
如本文所用的术语“染色体非整倍性”是指染色体的定量与二倍性基因组的定量的差异。该差异可为获得或缺失。其可包括一个染色体的整体或染色体区域。
非标准的缩写为：NIPD，非侵入性产前诊断；MPS，大规模并行测序；chr21，染色体21；chrRef，参照染色体；T21，21三体；SNP，单核苷酸多态性；FSR，F-S比，胎儿特异性等位基因与共有的等位基因之间的比率；FC，胎儿特异性等位基因计数；和SC，共有的等位基因计数。
发明详述
获自孕妇的血浆DNA含有无细胞的母体DNA和无细胞的胎儿DNA的混合物。根据使用整倍性怀孕中的不同染色体间的多态性遗传标记测定的，母体血浆中的胎儿DNA比例是相对恒定的。例如，第一基因座处的第一胎儿特异性等位基因计数的比例与任何其他基因座处的第二胎儿特异性等位基因计数的比例相对一致。母体样品之间的胎儿DNA比例可能不同，但针对不同多态性遗传标记(相同的染色体或不同的染色体上的)的胎儿DNA比例在样品中是相对恒定的。
对于非整倍性怀孕，使用非整倍性染色体的多态性遗传标记测量而观察到的胎儿DNA比例将发生扰动。实施方案使用胎儿特异性等位基因的多态性(例如，单核苷酸多态性)来检测怀有非整倍性胎儿(例如，21三体胎儿)的母体中的此类扰动。尽管胎儿DNA的百分比通常小于母体DNA的百分比，但胎儿DNA百分比通常足够高而能确定该扰动。但是，样品间的胎儿DNA比例可能不同，从而给鉴定该复杂性增加了一些复杂性。
为了处理该复杂性，实施方案能够使用来自非整倍性染色体的多态性遗传标记的第一胎儿DNA比例和不涉及非整倍性的参照染色体的第二胎儿DNA比例来确定比率。参照染色体上的多态性遗传标记的胎儿DNA比例不会受到非整倍性的扰动。使用此类从参照染色体上的遗传标记确定的第二比率可提供鉴定非整倍性的精确参数(例如，两个比例的比率)，特别是在针对已知的多态性基因座将基因组的特定部分富集时。通过相对于未用于确定参数的其他DNA分子而增加对应于可用的多态性标记的分析的DNA分子的数目，此类富集可提供较高效率。
I.引言
非整倍性(如T21)的NIPD方法为测量母体血浆样品中染色体21(chr21)来源的DNA分子的比例。如果母体怀有T21胎儿，来自胎儿的chr21的额外拷贝将会向母体血浆样品提供额外量的chr21DNA分子，导致chr21序列[11]的比例增加。大规模并行测序(MPS)增加了DNA定量的精确度，并使得能够检测异常量的源自非整倍性染色体的胎儿DNA[11-14]。
实施方案通过使用MPS，利用了用于非整倍性(如T21)的NIPD的等位基因比率方法。由于根据人的dbSNP Build 135(www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)，单核苷酸多态性(SNP)仅占人基因组的约1.6％，常规的非靶向MPS仅包括序列阅读结果的小比例的SNP等位基因。因此，实施方案可使用靶向MPS来优先对生物样品(例如，母体血浆)中选定的SNP基因座进行测序，以用于胎儿非整倍性检测。在先前的出版物中，通过使用基于杂交的靶向MPS平台，发明人展示了富集靶标区域中的DNA分子，以及在靶标富集后母体血浆中靶标SNP的等位基因比率保持[15]。
如果SNP(或其他多态性)在母体中是纯合的(例如，基因型AA)且在胎儿中是杂合的(例如，基因型AB)，则其为特征性的。在该情形下，B等位基因为胎儿特异性等位基因，而A等位基因为母体和胎儿共有的等位基因。可从测序血浆DNA获得特征性SNP的胎儿特异性等位基因计数和共有的等位基因计数，并用于计算胎儿特异性等位基因计数与共有的等位基因计数之间的比率。该比率的实例标示为FSR。
在目标染色体为染色体21的一个实施方案中，比率可表示为chr21(表示为FSR21)和参照染色体(表示为FSRRef)的F-S比。如果母体怀有整倍性胎儿，FSR21与FSRRef之间的比率(表示为)应当等于1(图1A)。如果母体怀有具有来自父本的额外chr21的T21胎儿(在本文中称为父本来源的T21)，chr21上的胎儿基因型将为ABB。胎儿特异性等位基因的额外拷贝会将增加至2(图1B)。如果chr21的额外拷贝来自母本(在本文中称为母本来源的T21)，chr21上的胎儿基因型将为AAB。共有的等位基因的额外拷贝会将减小至小于1(图1)。
A.整倍性
图1A显示了母体和整倍性胎儿的基因座处的等位基因的图100，以及根据本发明实施方案的计算实例。基因座103为参照染色体的，且基因座106为染色体21的(但其可为任何目标染色体)。母体基因组在每个基因座处是纯合的，且胎儿在每个基因座处是杂合的。如同所描述的，尽管两个基因座的实际序列会不同，母本等位基因在每个基因座处被标示为A。因此，A和B仅为强调相同基因座处的两个不同的等位基因(即，来自两个不同的染色体拷贝的等位基因)的标记，并且在该情况下为胎儿基因组中的两个等位基因的标记。
父本等位基因B由胎儿从父本遗传，从而使得胎儿在两个基因座处为杂合的。可在参照染色体和目标染色体上找到其他类似坐落的基因座(特征性基因座)。因此，基因座103实际上可以是多个基因座103，且基因座106可以是多个基因座106。还可有多于一个参照染色体。
对于整倍性情形，胎儿在基因座103和基因座106处具有一个等位基因A和一个等位基因B。在胎儿DNA百分比为50％(即，相同的母体DNA部分和胎儿DNA部分)的实例中，在基因座103处会检测到25％的父本等位基因B比例，且在基因座106处会检测到25％的父本等位基因B比例。因此，两个比例的比率(即，25％除以25％)将为1。类似地，对于基因座103和106，B等位基因与A等位基因的比率为1/3，且1/3除以1/3将为1。当然，由于检测的等位基因的样本集的统计属性，该比率可能不会精确地为1。因此，基因座103处的父本等位基因B的比例(例如，等位基因计数的任何比率)应当与父本等位基因B的比例相同。
图1A提供了不同的分数形式的胎儿DNA浓度f的较通用的公式。如同所显示的，在每个基因座103处，胎儿将提供占基因座103处检测到的所有等位基因的f/2的比例的等位基因B。如上文所提及的，如果f为0.5，则该比例将为0.25或25％。类似地，胎儿将提供f/2的等位基因A。分数形式的胎儿DNA浓度越高，等位基因B的比例将越高。这里，f被定义为胎儿的两种基因型中的任一种的DNA，因此为二者的系数。
对于母体，每个拷贝的染色体提供相同的比例(1-f)/2。当f为0.5时，比例为0.25(25％)，如上文所述。在极限值0％胎儿DNA下，每个等位基因A提供50％，且仅检测到A序列，因为母体为纯合的。
每个基因座103和106处检测到的B等位基因相对于A等位基因的比率给出为f/(2-f)。例如，如果f为0.5，则该比率为1/3，因为对于各个A等位基因仅存在一个B等位基因。可使用其他比率，例如，针对所有基因座103检测到的父本等位基因B的百分比，给出为B/(A+B)或2B/(A+B)，其中这里的A和B为对应的等位基因的计数。所显示的比率标示为FSR，其为胎儿特异性(父本)等位基因计数与共有的(母本)等位基因计数的比率。
B.父本来源的非整倍性
图1B显示了母体和父本来源的非整倍性胎儿的基因座处的等位基因的图120，以及根据本发明实施方案的计算实例。基因座123为参照染色体的，且基因座126为染色体21的。与图1A相同，母体基因组在每个基因座处为纯合的，且胎儿在每个基因座处为杂合的。
对于该非整倍性情况，胎儿在基因座123处具有一个等位基因A和一个等位基因B，但在基因座126处具有一个等位基因A和两个等位基因B，因为存在来自父本的染色体21的额外拷贝。在胎儿DNA百分比为50％(即，相同的母体DNA部分和胎儿DNA部分)的实例中，基因座123的B等位基因与A等位基因的比率将为1/3，但对于基因座126将为2/3，因为有两个B等位基因。
对于通式，每个拷贝的染色体可被认为提供f/2，因为胎儿浓度是针对参照染色体测定的。因此，等位基因B的总计数提供了f/2+f/2＝f。等位基因A的总计数提供了f/2+1-f。这些的比率提供了2f/(2-f)，如同所示的。参照染色体的比率FSRRef仍然与图1A的相同，因为该染色体仍然为整倍性的。
比率FSR21与FSRRef的比率为2。当然，由于所检测的等位基因的样本集的统计特征，该比率可能不会精确地为2。父本来源的非整倍性比如下所述的母本来源的非整倍性较容易检测。
C.母本来源的非整倍性
图1C显示了母体和母本来源的非整倍性胎儿的基因座的等位基因的图140，以及根据本发明实施方案的计算实例。基因座143为参照染色体的，且基因座146为染色体21的。与图1A相同，母体基因组在每个基因座处为纯合的，且胎儿在每个基因座处为杂合的。
对于该非整倍性情形，胎儿在基因座143处具有一个等位基因A和一个等位基因B，但在基因座146处具有两个等位基因A和一个等位基因B，因为存在来自母本的染色体21的额外拷贝。在胎儿DNA百分比为50％(即，相同的母体DNA部分和胎儿DNA部分)的实例中，基因座143的B等位基因与A等位基因的比率将为1/3，但对于基因座146将为1/4，因为对于每1个等位基因A仅存在一个等位基因B。
对于通式，每个拷贝的染色体可被认为提供f/2，因为胎儿浓度是针对参照染色体测定的。因此，等位基因B的总计数提供f/2。等位基因A的总计数提供1-f+f/2+f/2，其简单地给出1。这些的比率提供f/2，如同所示的。参照染色体的比率FSRRef仍然与图1A的相同，因为该染色体仍然为整倍性的。比率FSR21与FSRRef的比率为1-f/2。当然，由于所检测的等位基因的样本集的统计特征，该比率可能不会精确地为1-f/2。
为了确定样品对应于这些分类中的哪一种，可将最终定量与阈值比较。例如，1-2某处的阈值可区分整倍性情况与父本来源的非整倍性情况。可使用多于一个1-2的阈值，从而提供测定的不同置信度水平。整倍性与母本来源的非整倍性之间的阈值较难，因为两个值间的间隔较小且依赖于胎儿部分的浓度f。可从f的单独测量确定阈值，以确定胎儿处于母本来源的非整倍性时的预期值。再例如，可能需要f的最小值，然后可以使用适于该最小胎儿浓度的相同的阈值。
因此，对于T21的实例，假定chrRef中分数形式的胎儿DNA浓度为f，chrRef上的F-S比将为f/(2-f)，这与胎儿的非整倍性状态无关。另一方面，如果母体怀有整倍性胎儿，chr21上的F-S比将为f/(2-f)；如果母体怀有父本来源的T21胎儿，则为2f/(2-f)；并且如果母体怀有母本来源的T21胎儿，则为f/2。因此，如果母体怀有整倍性胎儿，将为1；如果母体怀有父本来源的T21胎儿，则将为2；并且如果母体怀有母本来源的T21胎儿，则将为(1-f/2)。
II.方法
图2是说明分析来自怀有胎儿的女性个体的生物样品以确定胎儿是否具有非整倍性的方法200的流程图。所述生物样品含有来自所述胎儿和所述女性个体的DNA分子的混合物。可通过计算机系统实施方法200的一部分。
在方框210中，针对来自多个靶标区域的DNA分子富集生物样品。可通过杂交技术或扩增技术或二者的组合来进行富集。靶标区域可为已知具有多态性基因座的基因组区域。此类区域可包括基因组范围的人SNP阵列6.0(Genome-Wide Human SNP Array 6.0,Affymetrix)的那些。
在方框220中，对来自生物样品的DNA分子进行测序以获得多个序列阅读结果。可以各种方式进行测序。例如，通用的测序可使用与分子末端连接的相同连接物(adapter)，以对任何DNA分子进行测序。一个实施方案使用大规模并行DNA测序，例如但不限于如下进行的那些：Illumina基因组分析仪平台(Bentley DR et al.Nature 2008；456:53-59)、Roche 454平台(Margulies M et al.Nature 2005；437:376-380)、ABI SOLiD平台(McKernan KJ et al.Genome Res 2009；19:1527-1541)、Helicos单分子测序平台(HarrisTD et al.Science 2008；320:106-109)、使用单一聚合酶分子的实时测序(Science 2009；323:133-138)和纳米孔测序(Clarke J et al.Nat Nanotechnol.2009；4:265-70)。在一个实施方案中，测序为双末端测序，其提供测序的每个DNA分子的成对的阅读结果。
在方框230中，分析了多个序列阅读结果。分析序列阅读结果可包括通过将序列阅读结果与参照基因组比对以鉴定序列阅读结果在参照基因组中的位置，以及确定所述序列阅读结果各自的等位基因。所述各自的等位基因从阅读的序列确定而来。对于杂合的基因座，序列阅读结果可告知哪个等位基因对应于所述序列阅读结果。参照基因组可包括已知存在多态性且允许比对每个等位基因的位置。
在方框240中，鉴定了第一染色体上的多个第一基因座，其中所述多个第一基因座对应于部分的靶标区域。所述第一基因座的特征在于在该基因座处母体是纯合的，且胎儿是杂合的。当阅读结果具有两个不同的等位基因与参照基因组的相同的位置对齐且其中一个等位基因占绝大多数时，可从测序阅读结果中确定这些基因座。因为胎儿浓度预期为5％-20％，特征性基因座可能预期具有较少的等位基因，出现为约2.5％-10％。这些百分比为示例性的，并且可使用其他的百分比。可鉴定位于靶标区域(即，被富集的区域)中的此类第一基因座以用于进一步分析。
在方框250中，鉴定了一个或多个参照染色体上的多个第二基因座，其中所述多个第二基因座对应于部分的靶标区域。孕妇在所述第一基因座和第二基因座中的每个基因座处针对各个母本等位基因为纯合的，且胎儿在所述第一基因座和第二基因座中的每个基因座处针对各个母本等位基因和各个父本等位基因为杂合的。父本等位基因为胎儿特异性等位基因，因此所述各个父本等位基因与所述各个母本等位基因不同。
在方框260中，计算了第一母本量与第一父本量的第一比率。第一母本量为多个第一基因座处的各个母本等位基因的量。例如，可对每个第一基因座处计数的母本等位基因的数目进行计数。第一父本量为多个第一基因座处的各个父本等位基因的量。如上文所论述的，比率可为所述两个量的严格相除(分母可为任一个)，但也可为其他的比率，例如，其中分母包括两个值的总和。
在方框270中，计算了第二母本量与第二父本量的第二比率。第二母本量为多个第二基因座处的各个母本等位基因的量。第二父本量为多个第二基因座处的各个父本等位基因的量。所述第二比率应当与所述第一比率具有相同的形式，并且用于确定该比率的公式应当相同。例如，总的等位基因B除以总的等位基因A。
在方框280中，计算了所述第一比率与所述第二比率的第三比率。所述第三比率也可为所述第一比率或所述第二比率作为分母的简单的比率。该比率也可包括分母或分子中的总和，还可为所述第一比率和第二比率的函数比率，其仍然能够表示所述第一比率与第二比率之间的相对值。
在方框290中，将所述第三比率与一个或多个阈值比较以确定胎儿是否具有与第一染色体相关的非整倍性。可使用多于一个阈值，例如，以区分整倍性、母本来源的非整倍性和父本来源的非整倍性。可以各种方式推导阈值。例如，可将结果已知的测试样品之间的分布用于确定第三比率(例如，)针对每种情形的统计分布，并且可以选择阈值来精确地区分将落入已知的分布中的新的情形。也可使用理论值，例如，基于预期的分布。
可按图1A-1C中所概述地确定阈值。例如，阈值可区分第三比率约为2的情形，并因此可确定非整倍性为父本来源的。可通过第三比率大于旨在区分值1和值2的阈值来进行约为2的确定。再例如，阈值可区分第三比率约为1-f/2的情形，并因此确定非整倍性为母本来源的，其中f为混合物中分数形式的胎儿DNA浓度。可从第二父本量和第二母本量确定分数形式的胎儿DNA浓度f。例如，可使用下式：分数形式的胎儿DNA浓度＝第二父本量×2/(第二父本量+第二母本量)×100％。可将阈值置于1至1-f/2的合适的值，以区分这两种情形。
III.富集
可通过在测序前从DNA样品选择性扩增和/或捕获靶标区域来进行富集。所述富集受到设计为与基因组中的特定位置杂交的探针和/或引物的影响。这些探针/引物中的许多可用于靶向基因组的多个区域。可靶向目标染色体上的各个区域，并且可靶向一个参照染色体上的或多个参照染色体间的各个区域。
在一实施方案中，靶标区域包括已知具有多态性的区域。以这种方式，人们不需要提前知道胎儿的具体多态性。但是，由于靶标区域对应于群体中通常发现的多态性，很可能父本将那些多态性中的一种传至胎儿。如本文中所述，也可对母本和父本进行基因型分型，从而允许具体了解胎儿的多态性基因座。
A.捕获
捕获(例如，使用阵列)的基本原理是将DNA文库与固定的探针杂交。例如，所述探针对应于靶标区域，并且来自那些靶标区域的DNA分子与固定的探针杂交。因此，靶标DNA是固定的，而非靶标DNA未固定。
可通过洗涤去除非靶标DNA片段，并且可通过洗脱收获靶标片段。可能需要文库中DNA的量(每个样品20g)远超过探针的量，以确保完全杂交。实例技术包括阵列上捕获(20)和溶液中捕获(21)。在一些实施方案中，可针对已知在群体中显示高多态率的SNP基因座设计探针。仅将显示为特征性的SNP基因座用于计算。该方法通常比需要针对每个怀孕自定义选择探针的方法较易于在临床环境中实施，例如，当已知针对胎儿特异性等位基因的特异性基因座时，这可通过鉴定其中母本和父本针对不同等位基因同型的基因座来了解。
捕获可能并非完美的，因为可能残留有来自非靶标区域的一些DNA分子，来自靶标区域的DNA分子的百分比相对于富集前的百分比增加。以这种方式，存在序列阅读结果对应于靶标区域的更高的可能性。因此，需要进行较少的测序来获得针对各个基因座的相同数目的等位基因计数。
B.扩增
对于扩增，设计了引物来扩增基因组的靶标区域。虽然捕获技术去除来自非靶标区域的DNA，扩增技术优先增加来自靶标区域的DNA分子的数目。以这种方式，再次存在序列阅读结果对应于靶标区域的较高的可能性。
扩增可提供来自靶标区域的DNA的许多拷贝用于测序，但总精确度仍然与原始样品的统计精确度有关。即，如果原始样品相对较小(并由此由于样品大小而对统计误差敏感)，扩增将不能克服这类问题，即使现在存在DNA的较多拷贝。
在一实施方案中，可组合两种技术。例如，人们可针对靶标区域捕获DNA分子，并去除非靶标DNA。残留的DNA具有来自靶标区域的增加的百分比。然后人们可以扩增残留的DNA分子以将靶标百分比增加至更高，并获得来自靶标区域的DNA的更多拷贝。
IV.识别基因座
如上所述，实施方案使用其中母体为纯合的且胎儿为杂合的特征性基因座。可以各种方式鉴定这些基因座。例如，可根据母体和胎儿基因型分型信息鉴定特征性基因座(例如，SNP)。然而，此类方法将涉及获得胎儿细胞，例如，通过侵入性技术。例如，可对侵入性获得的母体血细胞和胎儿组织样品进行基因型分型。其他实施方案可通过非侵入性技术鉴定特征性基因座。但是，该基因型分型可用作比较非侵入性方法的有效性的金标准(goldstandard)。对于以下的非靶向测序结果，读取深度不足以仅基于测序来鉴定许多特征性基因座，并因此使用了关于特征性基因座的现有基因型分型信息。
对于靶向测序实施方案，在人们可以鉴定存在两个等位基因但一个等位基因量较低的多个SNP基因座处有足够的深度，并且这些SNP基因座是可能的特征性基因座。例如，对于基因座，人们可以计算对应于第一等位基因的序列阅读结果的第一数目并计算对应于第二等位基因的序列阅读结果的第二数目。过量表达的序列(等位基因)将对应于共有的等位基因，而表达不足的(underrepresented)等位基因将对应于胎儿特异性等位基因。可通过舍弃两个等位基因的比率约为1处的基因座来区别母体为杂合(即，两个等位基因约50-50)处的基因座。由于胎儿浓度预期为5％-20％，特征性基因座可能预期具有较少的等位基因，显现为占与基因座对齐的所有序列阅读结果的约2.5％-10％。这些百分比为示例性的，并且可使用其他的百分比。
在一实施方案中，可确定对应于第一基因座处的第一等位基因的序列阅读结果的第一数目。可确定对应于第一基因座处的第二等位基因的序列阅读结果的第二数目。可以各种方式(例如，作为关于第一等位基因的阅读结果的百分比)计算第一数目与第二数目的等位基因比率。如果等位基因比率大于第一阈值且小于第二阈值，则可将第一基因座确定为特征性基因座。例如，第二阈值可用于仅确保基因座在母体中不为杂合的，且第一阈值可为0(或一些其他的值来仅确保序列阅读结果无错误)。
V.结果
从采集自怀有单个胎儿的14名孕妇的血浆样品提取DNA。使用基于杂交的靶向测序来富集chr7、chr13、chr18和chr21上的2,906个单核苷酸多态性基因座。通过大规模并行测序分析进行和未进行靶标富集的血浆DNA文库。通过单核苷酸多态性微阵列分析对每例的母体和胎儿的基因组DNA样品进行基因型分型。
图3显示了根据本发明实施方案的14名孕妇的测序结果的表300。表300显示了染色体21为目标染色体的数据。从基因型分型数据确定了胎儿状态。从测序结果确定了其余数据。
对于靶标区域，富集的样品的平均测序深度为未富集样品的测序深度的225倍。测序深度可定义为特定区域中的每个碱基被测序的平均次数。平均而言，将未富集和富集样品中的三百万个双末端阅读结果针对参照人基因组(Hg18)独特地制图。在滤除重复的双末端阅读结果后，可通过将靶标区域中测序碱基的总数目除以靶标区域的长度来计算靶标区域的测序深度。对于未富集的样品，平均测序深度为0.12次，并且对于富集的样品为27次，表明了225倍的平均富集。该发现与我们先前的公布[15]一致。
通过使用来自除chr21外的所有常染色体的特征性SNP，根据方程式：分数形式的胎儿DNA浓度＝胎儿特异性等位基因计数×2/(胎儿特异性等位基因计数+共有的等位基因计数)×100％，来计算未富集样品中分数形式的胎儿DNA浓度(也称为胎儿DNA百分比)。该研究中分析的14例分数形式的胎儿DNA浓度的中值为15.5％(范围为9.1％-19.7％)。分数形式的胎儿DNA浓度可用于确定方法200的第三比率(例如，)从针对母本来源的非整倍性的值1的预期减小(图1C)。如本文所提及，可基于分数形式的胎儿DNA浓度确定阈值。可选地，可基于样品中存在最小的分数形式的胎儿DNA浓度这一假定或测量来选择阈值。
A.使用非靶向测序数据的F-S比计算
图4A显示了从根据本发明实施方案的非靶向测序数据计算值，以将父本和母本来源的T21与整倍性胎儿区分开。基于母体和胎儿基因型分型信息，鉴定了chr21(样品范围：1,044-1775SNP)和chrRef(其包括除chr21外的所有常染色体，样品范围：99,581-106,950SNP)上的特征性SNP。在上述特征性SNP中，确定了chr21(FC21＝2-19,SC21＝87-213)和chrRef(FCRef＝390-1,622,SCRef＝6,880-18,892)的胎儿特异性等位基因计数(表示为FC)和共有的等位基因计数(表示为SC)。图3显示了计算的FSR21、FSRRef和的结果。
如图4A中所示，可将父本来源的T21事例与整倍性组(均值0.91，中值0.96，范围0.70-1.10)区分开。在另一方面，母本来源的T21事例(均值1.10，中值1.30，范围0.33-1.57)与整倍性事例重叠(曼-惠特尼秩和检验，p＝0.366)。
B.使用靶向测序数据的F-S比计算
图4B显示了从根据本发明实施方案的非靶向测序数据计算值，以将父本和母本来源的T21与整倍性胎儿区分开。在chr21上的1,437个靶向SNP基因座和chrRef(包括chr7、chr13和chr18)上的1,469个SNP基因座中，鉴定了每个事例的特征性SNP(chr21＝151-273 SNP,chrRef＝145-182 SNP)。确定了chr21(FC21＝197-761,SC21＝3610-7,740)和chrRef(FCRef＝154-473,SCRef＝2,786-5,557)的关于胎儿特异性等位基因和共有的等位基因的测序阅读结果的数目，如表300中所示。
如图4B中所示，可将父本来源的T21事例与整倍性组(均值1.06，中值1.06，范围0.95-1.29)区分开。尽管母本来源的T21组具有较小的值(均值0.94，中值0.93，范围0.78-1.17)(曼-惠特尼秩和检验，p＝0.051)，仍然与整倍性组存在重叠。然而，重叠减少了。重叠的存在表明应当增加基因座数目和/或提高测序深度水平。
C.比较
在非靶向和靶向测序数据中均成功检测到父本来源的T21事例。对于母本来源的T21事例，该方法变得不太有效。尽管母本来源的T21事例的均值较小，整倍性和母本来源的T21事例间的值存在大量重叠。父本和母本来源的T21检测间的性能差异主要是由于变化的程度，对于父本来源的T21，增加到2倍，而对于母本来源的T21，降低f/2(图1B和1C)。因此，相比母本继承的非整倍性，可以较低的测序深度非侵入性地区分父本继承的非整倍性。
由于胎儿DNA代表了母体血浆中的较小群体，较低的分数形式的胎儿DNA浓度将减小母本来源的T21的变化的程度。例如，假定分数形式的胎儿DNA浓度为5％，母本来源的T21的将成为0.975，这与整倍性事例的非常接近。
VI.计算机模拟
计算机模拟被用于研究用于T21检测的F-S比分析的精确度。统计模型是基于根据父本和母本来源的T21模型中分数形式的胎儿DNA浓度，胎儿特异性等位基因计数和共有的等位基因计数的数目应当遵循二项分布这一假设。例如，假定参照染色体(chrRef)中分数形式的胎儿DNA浓度为f，检测chrRef上特征性SNP的胎儿特异性等位基因的可能性将为f/2，而与胎儿的非整倍性状态无关。另一方面，如果母体怀有整倍性胎儿，检测chr21上胎儿特异性等位基因的可能性将为f/2，如果母体怀有父本来源的T21胎儿，可能性将为2f/(2+f)，并且如果母体怀有母本来源的T21胎儿，可能性将为f/(2+f)(图1A-1C)。
为了说明目的，我们假定从chr21和chrRef获得相等量的特征性等位基因计数(胎儿特异性的和共有的等位基因计数的总和)。基于上述假设，每次针对不同的分数形式的胎儿DNA浓度模拟1,000名整倍性和1,000名T21事例，以研究父本和母本来源的T21模型中的检测精确度。
图5A和5B显示了根据本发明实施方案的5％(图5B)和15％(图5A)的分数形式的胎儿DNA浓度的T21检测的计算机模拟图。我们使用计算机模拟以确定将进一步改善用于T21检测的等位基因比率方法精确度的参数。计算机模拟揭示了胎儿DNA比例、特征性等位基因数目和测序深度之间的联系。
为了获得大于99％的特异性，选择T21差异的阈值为大于和小于整倍性组的平均F-S比3个标准差。针对15％的分数形式的胎儿DNA浓度，分别针对chr21和chrRef上的特征性等位基因计数的不同数目研究了父本和母本来源的T21检测的灵敏度(A)。针对5％的分数形式的胎儿DNA浓度进行了类似的分析(B)。(Ma-T21：母本来源的T21。Pa-T21：父本来源的T21。Sen＝灵敏度。Fe％＝分数形式的胎儿DNA浓度。Info AC＝每个chr21和chrRef上的特征性等位基因计数。Info SNP＝每个chr21和chrRef上的特征性SNP。Seq深度＝测序深度。Info AC＝Info SNP×Seq深度)。
为了得到图5A的图示，将分数形式的胎儿DNA浓度固定在15％，并逐渐增加chr21和chrRef上特征性等位基因计数的数目，以研究胎儿T21的检测精确度。额外的特征性等位基因计数将改善父本和母本来源的T21模型的检测精确度。为了获得精确的检测(灵敏度>99％，特异性>99％)，母本来源的T21检测(特征性等位基因计数＝130,000)比父本来源的T21检测(特征性等位基因计数＝1,100)需要更多的特征性等位基因计数(图5A)。如果分数形式的胎儿DNA浓度减小至5％，对于检测母本来源的T21，对应的特征性等位基因计数将需要增加至3,600,000；对于检测父本来源的T21，需要增加至3,500(图5B)。
图6显示了研究用于T21检测的特征性等位基因计数的最小数目的计算机模拟的图600。实线代表每个chr21和chrRef上需要的特征性等位基因计数的最小数目(Y轴)，以根据给定的分数形式的胎儿DNA浓度(X轴)实现母本来源的T21的可靠检测(灵敏度>99％，特异性>99％)。虚线代表父本来源的T21模型。
当母体血浆中的分数形式的胎儿DNA浓度从40％逐渐降低至1％时，将需要增加父本和母本来源的T21情形中的特征性等位基因计数的最小数目，以维持高检测率(灵敏度>99％，特异性>99％)，但母本来源的T21情形的计数增加更为显著。选择用于该分析的灵敏度和特异性被挑选用于再现最近报导的非多态性标签计数法的性能[12-14]。
VII.增加的精确度
如上所述，存在众多可以改善检测精确度的方式。一种方法为增加分数形式的胎儿DNA浓度，其可增加母本来源的T21中变化的程度。尽管早期研究尝试通过母体血浆的甲醛处理来富集胎儿DNA比例[7]，该方法还未准备好用于应用，因为其未被不同的小组一致地重现[8-10]。可选地，可通过增加特征性等位基因计数的数目来改善检测母本来源的T21的精确度。根据我们的模拟分析，额外的特征性等位基因计数将会在一定程度上补偿分数形式的胎儿DNA浓度降低所引起的检测精确度损失(图6)。两种方法可用于增加特征性等位基因计数的数目，即，募集更多的特征性SNP并对每个基因座进行更深度的测序。在一实施方案中，使用了两种方法。
A.确定特征性基因座
特征性SNP的数目通常取决于两个因素：检测的目标染色体上SNP的总数目和特征性SNP的频率。后者为一组分析的SNP中可检测的特征性SNP的百分比。为了研究，通过基于微阵列的绒毛膜绒毛DNA分析确定的胎儿基因型信息被用于最大化特征性SNP的频率，其在本研究的所有14例中的均值为约12％。然而，对于实际的NIPD，胎儿基因组物质在事先是不可用的。因此，需要间接推导特征性SNP，例如，通过选择其中亲本均为纯合的但具有不同的等位基因的SNP(例如，母本为AA且父本为BB)。在该情形下，特征性SNP的平均频率将从12％降至6％，因为该方法将排除其中父本为杂合的任何SNP。
在SNP募集情形下，可使用基于杂交的富集系统。在上述实例中，我们仅采用了相对较小数目的探针来捕获靶标染色体上的2,906个SNP基因座。然而，增加分析的SNP基因座的数目是可能的。例如，如果我们设计探针来覆盖基因组范围的人SNP阵列6.0(Affymetrix)上所有的chr21SNP基因座(12,930个SNP)，对于当前数据集中的每个事例，我们能够将chr21上的特征性SNP的数目增加至约1,500个SNP。如果我们获得了chrRef上特征性SNP的相同数目，并将血浆DNA测序至87次的深度，我们将分别收获chr21和chrRef上的约130,000个特征性等位基因计数(1,500×87)。
假定分数形式的胎儿DNA浓度为15％或更高，此类数目将允许将母本继承的T21与整倍性事例相对更强的区分(图5A)。考虑到在本研究中特征性SNP的平均频率为约12％，且约50％的阅读结果能够作图回归至靶标区域(剩下的阅读结果为脱靶的)，获得130,000个特征性等位基因计数所需的阅读结果的总数目将为约430万(130000个阅读结果×2/(12％×50％))。
然而，如果分数形式的胎儿DNA浓度减至5％，阅读结果的数目将需要增加至约1.2亿(图5B)。这里分析了5％和15％，因为5％接近用于多种当前研究的测序深度的非基于多态性的标签计数法的下限，而15％为公布的基于标签计数法的临床试验的分数形式的胎儿DNA浓度的近似均值[12-14]。
B.测序深度
为了获得足够数目的等位基因计数，替代性的方法为对具有相对较小数目的特征性SNP的每个基因座进行更深度的测序。根据我们先前的公开，我们证明每毫升的血浆含有约1,000个基因组当量的DNA，其针对每个基因座可产生2,000个等位基因计数[4]。如果我们能够计数5mL血浆中每个基因座的所有等位基因，我们能够针对每个基因座获得10,000个等位基因计数。在这种情形下，26个特征性SNP(chr21上13个SNP，chrRef上13个SNP)可在含有15％胎儿DNA的样品中提供用于母本来源的T21检测的足够的特征性等位基因计数，分别代表了chr21和chrRef上的130,000个特征性等位基因计数(10 000×13)。含有5％的分数形式的胎儿DNA浓度的样品的特征性SNP的数目需要增加至720个(chr21上360个SNP，chrRef上360个SNP)。由于该策略所需的高阅读深度(即，每个特征性等位基因10,000个计数)，用于靶标富集的基于PCR的方法(即，扩增方法)可能为用于该类应用的替代性方法[18,19]。
VIII.材料和方法
我们征募了怀有单个胎儿的14名孕妇(孕龄范围为12周至13周加5天)。在CVS前收集母体外周血样品。CVS后，从绒毛膜绒毛获得胎儿基因组DNA样品。通过完整核型分析确认非整倍性或整倍性状态。在14个事例中，7个为T21胎儿，而其余为整倍的。
在一实施方案中，以下述方式提取DNA。4℃，1600g下将母体外周血样品(5-10mL)离心10min。4℃，16000g下将血浆部分(2-5mL)再次离心10min。我们通过在2500g下再次离心5min从血细胞部分去除任何残留的血浆[16]。使用DSP DNA Blood Mini Kit(Qiagen)按先前的描述[11]提取血浆DNA。使用QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen)根据厂商的方案，分别从绒毛膜绒毛和外周血细胞提取胎儿和母体基因组DNA。通过使用ABI 7300序列检测仪(Applied Biosystems)的实时PCR对提取的血浆DNA进行定量。按先前所述进行β-球蛋白实时PCR检测[4]。使用每细胞6.6pg DNA的换算系数来计算提取的血浆DNA的量。
A.血浆DNA文库的靶向测序
下述为可用于实施方案的测序技术的实例。由于血浆DNA分子天然下已被片段化，该实例不需要另外的片段化步骤。按先前所述[15](除了将连接物和引物替换为来自Multiplexing样品制备寡核苷酸试剂盒(Multiplexing Sample PreparationOligonucleotide Kit,Illumina)和SureSelect靶标富集系统试剂盒(SureSelect TargetEnrichment System Kit,Agilent)的寡核苷酸外)，通过基因组DNA样品制备试剂盒(Genomic DNA Sample Preparation Kit,Illumina)，根据厂商的说明书，将每个事例10-30ng的血浆DNA用于DNA文库构建。
为了获得SNP的高倍数的测序覆盖，使用了SureSelect靶标富集系统(Agilent)来捕获靶标区域中的SNP。作为原理论证研究，设计了约5％的探针以靶向chr7(313个SNP)、chr13(564个SNP)、chr18(592个SNP)和chr21(1437个SNP)上的总共2906个SNP基因座，而剩下的探针被设计用于另一项目。在65℃下将500ng的每种构建的血浆DNA文库与探针一起孵育24h。杂交后，洗脱捕获的DNA分子并根据厂商说明书通过12轮PCR扩增。将进行和未进行靶标富集的文库编入索引，用于以50-bp×2双端形式在基因组分析仪IIx(Illumina)上进行多重测序。进行另外的7轮测序以解码索引序列。
借助SOAPaligner/soap2(soap.genomics.org.cn)将所有的测序阅读结果与揭露的人参照基因组(Hg18)(genome.ucsc.edu)比对。比对期间允许两个错配。双末端阅读的片段大小范围定义为50-600bp。重复的双末端阅读(例如，具有相同的序列和起始-终止匹配物(coordinate)的阅读)被认为是相同的原始血浆DNA模板的克隆。滤除了除一个以外的所有的重复阅读结果，仅留下1个拷贝用于随后按先前所述[15]进行生物信息学分析。
B.微阵列基因型分型
基因型分型被用于确认测序技术的精确度。使用基因组范围的人SNP阵列6.0(Affymetrix)进行母体和胎儿基因组DNA样品的基因型分型。使用绒毛膜绒毛样品的微阵列分析确定7名T21胎儿中chr21的额外拷贝的亲本来源，其中分析了chr21上SNP的等位基因信号强度。如果胎儿具有父本来源的T21，胎儿特异性等位基因(B等位基因)的信号强度应当为共有的等位基因(A等位基因)的2倍，因为chr21上的胎儿基因型将成为ABB，并且反之亦然。使用该方法，1名胎儿被确定为父本来源的T21，而6名为母本来源的T21。
IX.计算机系统
本文提及的任何计算机系统可使用任何合适数目的子系统。此类子系统的实例显示在图7的计算机装置700中。在一些实施方案中，计算机系统包括单个计算机装置，而子系统可为计算机装置的组件。在其他实施方案中，计算机系统可包括多个计算机装置，每个为具有内部组件的子系统。
图7中所示的子系统通过系统总线775互连。显示了另外的子系统如打印机774、键盘778、硬盘779、与显示器适配器782连接的监视器776，以及其他子系统。与I/O控制器771连接的外围设备和输入/输出(I/O)装置可通过本领域已知的众多方式如串行端口777与计算机系统相连。例如，串行端口777或外部接口781(例如，以太网、Wi-Fi等)可用于将计算机系统700与广域网如因特网、鼠标输入装置或扫描仪连接。通过系统总线775的互连允许中央处理器773与每个子系统交流并控制来自系统存储器772或硬盘779的指令的执行，以及子系统间信息的交换。系统存储器772和/或硬盘779可包括计算机可读介质。本文提及的任何值可从一个组件输出至另一组件并可输出至用户。
计算机系统可包括多个相同的组件或子系统，例如，通过外部接口781或通过内部接口连接在一起的组件或子系统。在一些实施方案中，计算机系统、子系统或装置可通过网络交流。在这种情形下，一台计算机可被认为是客户端，且另一台计算可被认为是服务器，其中每台可为相同计算机系统的一部分。客户端和服务器每个可包含多个系统、子系统或组件。
应当理解本发明的任何实施方案可使用硬件以控制逻辑的形式实施(例如，专用集成电路或现场可编程门阵列)，和/或使用具有通用可编程处理器的计算机软件以模块化或集成方式实施。基于本文提供的公开和教导，本领域技术人员知道和理解使用硬件以及硬件与软件的组合来实施本发明的实施方案的其他方式和/或方法。
本申请中描述的任何软件组件或功能可通过以下实施：使用例如常规或面向对象的技术，使用任何合适的计算机语言如Java、C++或Perl的由处理器执行的软件代码。软件代码可储存为用于储存和/或传送的计算机可读介质上的指令串或命令，合适的介质包括随机存储存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、磁介质如硬盘驱动器或软盘，或者光介质如光盘(CD)或DVD(数字通用光盘)、闪存等。计算机可读介质可为此类存储或传输装置的任何组合。
还可使用经调整用于遵循各种方案包括因特网通过有线、光学和/或无线网络传输的载体信号编码和传输此类程序。由此，可使用以这类程序编码的数据信号生成根据本发明实施方案的计算机可读介质。可将以程序代码编码的计算机可读介质与兼容设备包装在一起或与其他装置分开提供(例如，通过因特网下载)。任何此类计算机可读介质可放置于单个计算机程序产品(例如，硬盘驱动器、CD或整个计算机系统)中或其内，并且可以存在于系统或网络中的不同的计算机程序产品上或其内。计算机系统可包括监视器、打印机或用于向用户提供本文提及的任何结果的其他合适的显示装置。
可完全或部分地使用包括可被配置用于进行步骤的一个或多个处理器的计算机系统进行本文描述的任何方法。因此，实施方案可涉及被配置用于进行任何本文描述的方法的步骤的计算机系统，其可能具有进行单独的步骤或各个步骤组的不同的组件。尽管展现为编号的步骤，可同时或以不同的顺序进行本文方法的步骤。另外，这些步骤中的部分可与来自其他方法的其它步骤的部分一起使用。另外，所有或部分的步骤可为任选的。此外，可与用于进行这些步骤的模块、电路或其他方式一起进行任何方法的任何步骤。
可以任何合适的方式将特定实施方案的具体细节组合，而不脱离本发明的实施方案的实质和范围。然而，本发明的其他实施方案可涉及与每个单独的方面相关的特定实施方案，或这些单独的方面的特定组合。
为说明和描述目的展现了以上描述的本发明的示例性实施方案。其并非旨在为详尽的或将本发明限制于所述的确切形式，并且根据上述教导许多修饰和变化是可能的。挑选和描述了实施方案以最好地解释本发明的原理及其实际应用，从而使得本领域其他技术人员能够最好地将本发明用于各种实施方案以及与适于预期的具体应用的各种形式一起使用。
叙述“一个(a)”、“一个(an)”或“所述(the)”旨在指“一个或多个”，除非明确另有所指。
本文提及的所有专利、专利申请、出版物和描述均通过引用整体并入本文，用于所有目的。均不承认为现有技术。
参考文献
1.Driscoll DA,Gross S(2009)Prenatal screening for aneuploidy.N Engl JMed 360:2556-2562.
2.Mujezinovic F,Alfirevic Z(2007)Procedure-related complications ofamniocentesis and chorionic villous sampling:a systematic review.ObstetGynecol 110:687-694.
3.Lo YMD,Corbetta N,Chamberlain PF,Rai V,Sargent IL,et al.(1997)Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum.Lancet 350:485-487.
4.Lo YMD,Tein MSC,Lau TK,Haines CJ,Leung TN,et al.(1998)Quantitativeanalysis of fetal DNA in maternal plasma and serum:implications fornoninvasive prenatal diagnosis.Am J Hum Genet 62:768-775.
5.Tong YK,Ding CM,Chiu RWK,Gerovassili A,Chim SSC,et al.(2006)Noninvasive prenatal detection of fetal trisomy 18by epigenetic allelic ratioanalysis in maternal plasma:theoretical and empirical considerations.ClinChem 52:2194-2202.
6.Lo YMD,Tsui NBY,Chiu RWK,Lau TK,Leung TN,et al.(2007)Plasmaplacental RNA allelic ratio permits noninvasive prenatal chromosomalaneuploidy detection.Nat Med 13:218-223.
7.Dhallan R,Guo X,Emche S,Damewood M,Bayliss P,et al.(2007)A non-invasive test for prenatal diagnosis based on fetal DNA present in maternalblood:a preliminary study.Lancet 369:474-481.
8.Benachi A,Yamgnane A,Olivi M,Dumez Y,Gautier E,et al.(2005)Impactof formaldehyde on the in vitro proportion of fetal DNA in maternal plasmaand serum.Clin Chem 51:242-244.
9.Chinnapapagari SKR,Holzgreve W,Lapaire O,Zimmermann B,Hahn S(2005)Treatment of maternal blood samples with formaldehyde does not alter theproportion of circulatory fetal nucleic acids(DNA and mRNA)in maternalplasma.Clin Chem 51:652-655.
10.Chung GTY,Chiu RWK,Chan KCA,Lau TK,Leung TN,et al.(2005)Lack ofdramatic enrichment of fetal DNA in maternal plasma by formaldehydetreatment.Clin Chem 51:655-658.
11.Chiu RWK,Chan KCA,Gao YA,Lau VYM,Zheng WL,et al.(2008)Noninvasiveprenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallelgenomic sequencing of DNA in maternal plasma.Proc Natl Acad Sci U S A 105:20458-20463.
12.Chiu RWK,Akolekar R,Zheng YWL,Leung TY,Sun H,et al.(2011)Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21by multiplexed maternal plasma DNAsequencing:large scale validity study.BMJ 342:9.
13.Palomaki GE,Kloza EM,Lambert-Messerlian GM,Haddow JE,Neveux LM,etal.(2011)DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome:aninternational clinical validation study.Genet Med 13:913-920.
14.Bianchi DW,Platt LD,Goldberg JD,Abuhamad AZ,Sehnert AJ,et al.(2012)genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNAsequencing.Obstet Gynecol.In press.doi:10.1097/AOG.0b013e31824fb482
15.Liao GJW,Lun FMF,Zheng YWL,Chan KCA,Leung TY,et al.(2011)Targetedmassively parallel sequencing of maternal plasma DNA permits efficient andunbiased detection of fetal alleles.Clin Chem 57:92-101.
16.Chiu RWK,Poon LLM,Lau TK,Leung TN,Wong EMC,et al.(2001)Effects ofblood-processing protocols on fetal and total DNA quantification in maternalplasma.Clin Chem 47:1607-1613.
17.Antonarakis SE(1991)Parental origin of the extra chromosome intrisomy 21 as indicated by analysis of DNA polymorphisms.N Engl J Med 324:872-876.
18.Mamanova L,Coffey AJ,Scott CE,Kozarewa I,Turner EH,et al.(2010)Target-enrichment strategies for next-generation sequencing.Nat Methods 7:111-118.
19.Tewhey R,Warner JB,Nakano M,Libby B,Medkova M,et al.(2009)Microdroplet-based PCR enrichment for large-scale targeted sequencing.NatBiotechnol 27:1025-1031.
20.Albert TJ,Molla MN,Muzny DM,Nazareth L,Wheeler D,Song X,et al.(2007)Direct selection ofhuman genomic loci by microarray hybridization.NatMethods；4:903-5.
21.Gnirke A,Melnikov A,Maguire J,Rogov P,LeProust EM,Brockman W,etal.(2009)Solution hybridselection with ultra-long oligonucleotidesformassively parallel targeted sequencing.Nat Biotechnol；27:182-9.

Claims (21)

1.分析来自怀有胎儿的女性个体的生物样品以确定所述胎儿是否具有与第一染色体相关的非整倍性的系统，所述生物样品包含来自所述胎儿和所述女性个体的DNA分子的混合物，所述系统包括：
富集装置，所述富集装置用于针对来自多个靶标区域的DNA分子富集所述生物样品；
测序装置，所述测序装置用于对来自所述生物样品的DNA分子进行测序以获得多个序列阅读结果；
分析装置，所述分析装置用于分析所述多个序列阅读结果，其中分析序列阅读结果包括：
通过将所述序列阅读结果与参照基因组比对来鉴定所述
序列阅读结果在所述参照基因组中的位置；和
确定所述序列阅读结果各自的等位基因；
第一鉴定装置，所述第一鉴定装置用于鉴定第一染色体上的多个第一基因座，所述多个第一基因座对应于部分的所述靶标区域；
第二鉴定装置，所述第二鉴定装置用于鉴定一个或多个参照染色体上的多个第二基因座，所述多个第二基因座对应于部分的所述靶标区域，其中所述怀孕的女性在所述第一基因座和第二基因座中的每个基因座处针对各个母本等位基因为纯合的，并且其中所述胎儿在所述第一基因座和第二基因座中的每个基因座处针对所述各个母本等位基因和各个父本等位基因为杂合的，所述各个父本等位基因与所述各个母本等位基因不同；
第一确定装置，所述第一确定装置用于确定所述多个第一基因座处所述各个母本等位基因的第一母本量；
第二确定装置，所述第二确定装置用于确定所述多个第一基因座处所述各个父本等位基因的第一父本量；
第一计算装置，所述第一计算装置用于计算所述第一母本量与所述第一父本量的第一比率；
第三确定装置，所述第三确定装置用于确定所述多个第二基因座处所述各个母本等位基因的第二母本量；
第四确定装置，所述第四确定装置用于确定所述多个第二基因座处所述各个父本等位基因的第二父本量；
第二计算装置，所述第二计算装置用于计算所述第二母本量与所述第二父本量的第二比率；
第三计算装置，所述第三计算装置用于计算所述第一比率与所述第二比率的第三比率；以及
比较装置，所述比较装置用于将所述第三比率与一个或多个阈值比较，以确定所述胎儿是否具有与所述第一染色体相关的非整倍性。
2.如权利要求1所述的系统，其中所述富集装置包括：
捕获装置，所述捕获装置用于用对应于所述多个靶标区域的固定的探针捕获所述生物样品的DNA分子。
3.如权利要求1所述的系统，其中所述富集装置包括：
扩增装置，所述扩增装置用于用对应于所述多个靶标区域的引物扩增所述生物样品的DNA分子。
4.如权利要求1所述的系统，所述系统还包括：
比对装置，所述比对装置用于将多个序列阅读结果与所述第一基因座比对；和
第五鉴定装置，所述第五鉴定装置用于鉴定所述多个序列阅读结果中与所述第一基因座对齐的两个等位基因。
5.如权利要求4所述的系统，还包括：
第五确定装置，所述第五确定装置用于确定对应于所述第一基因座处的第一等位基因的序列阅读结果的第一数目；
第六确定装置，所述第六确定装置用于确定对应于所述第一基因座处的第二等位基因的序列阅读结果的第二数目；
第四计算装置，所述第四计算装置用于计算所述第一数目与所述第二数目的等位基因比率；
第七确定装置，所述第七确定装置用于确定所述等位基因比率是否大于第一阈值且小于第二阈值。
6.如权利要求1所述的系统，所述系统还包括：
第三鉴定装置，所述第三鉴定装置用于鉴定所述胎儿的父本针对所述第一基因座处的第一等位基因是纯合的；和
第四鉴定装置，所述第四鉴定装置用于鉴定所述怀孕的女性针对所述第一基因座处的第二等位基因是纯合的。
7.如权利要求1所述的系统，其中所述第一比率对应于由所述第一母本量和所述第一父本量确定的所述混合物中胎儿DNA分子的第一百分比，并且其中所述第二比率对应于由所述第二母本量和所述第二父本量确定的所述混合物中胎儿核酸分子的第二百分比。
8.如权利要求1所述的系统，其中所述第一比率包括所述第一父本量除以所述第一父本量与所述第一母本量之和。
9.如权利要求1所述的系统，其中所述第一比率包括所述第一父本量除以所述第一母本量，且所述第二比率包括所述第二父本量除以所述第二母本量。
10.如权利要求1所述的系统，其中第一阈值对应于母本来源的非整倍性，且第二阈值对应于父本来源的非整倍性。
11.如权利要求10所述的系统，其中当所述非整倍性为父本来源时，所述第三比率为约2。
12.如权利要求10所述的系统，其中当所述非整倍性为母本来源时，所述第三比率为约1-f/2，其中f为所述混合物中分数形式的胎儿DNA的浓度。
13.如权利要求12所述的系统，还包括：
第八确定装置，所述第八确定装置用于从所述第二父本量和所述第二母本量确定所述分数形式的胎儿DNA浓度f。
14.如权利要求1所述的系统，其中所述第一染色体为第21号染色体、第13号染色体或第18号染色体。
15.如权利要求1所述的系统，其中所述第一基因座中的至少一个为单核苷酸多态性(SNP)。
16.如权利要求1所述的系统，其中所述多个第二基因座位于多个参照染色体上。
17.分析来自怀有胎儿的女性个体的生物样品，以确定所述胎儿是否具有与第一染色体相关的非整倍性的系统，所述生物样品包含来自所述胎儿和所述女性个体的DNA分子的混合物，所述系统包括：
接收装置，所述接收装置用于接收对来自所述生物样品的DNA分子进行测序而获得的多个序列阅读结果，其中针对来自多个靶标区域的DNA分子富集所述生物样品；
分析装置，所述分析装置用于分析所述多个序列阅读结果，其中分析序列阅读结果包括：
通过将所述序列阅读结果与参照基因组比对来鉴定所述序列阅读结果在所述参照基因组中的位置；和
确定所述序列阅读结果的各个等位基因；
第一鉴定装置，所述第一鉴定装置用于鉴定第一染色体上的多个第一基因座，所述多个第一基因座对应于部分的所述靶标区域；
第二鉴定装置，所述第二鉴定装置用于鉴定一个或多个参照染色体上的多个第二基因座，所述多个第二基因座对应于部分的所述靶标区域，其中所述怀孕的女性在所述第一基因座和第二基因座中的每个基因座处针对各个母本等位基因为纯合的，并且其中所述胎儿在所述第一基因座和第二基因座中的每个基因座处针对所述各个母本等位基因和各个父本等位基因为杂合的，所述各个父本等位基因与所述各个母本等位基因不同；
第一确定装置，所述第一确定装置用于确定所述多个第一基因座处所述各个母本等位基因的第一母本量；
第二确定装置，所述第二确定装置用于确定所述多个第一基因座处所述各个父本等位基因的第一父本量；
第一计算装置，所述第一计算装置用于计算所述第一母本量与所述第一父本量的第一比率；
第三确定装置，所述第三确定装置用于确定所述多个第二基因座处所述各个母本等位基因的第二母本量；
第四确定装置，所述第四确定装置用于确定所述多个第二基因座处所述各个父本等位基因的第二父本量；
第二计算装置，所述第二计算装置用于计算所述第二母本量与所述第二父本量的第二比率；
第三计算装置，所述第三计算装置用于计算所述第一比率与所述第二比率的第三比率；以及
比较装置，所述比较装置用于将所述第三比率与一个或多个阈值比较，以确定所述胎儿是否具有与所述第一染色体相关的非整倍性。
18.如权利要求17所述的系统，其中第一阈值对应于母本来源的非整倍性，且第二阈值对应于父本来源的非整倍性。
19.如权利要求18所述的系统，其中当所述非整倍性为父本来源时，所述第三比率为约2。
20.如权利要求18所述的系统，其中当所述非整倍性为母本来源时，所述第三比率为约1-f/2，其中f为所述混合物中分数形式的胎儿DNA浓度。
21.如权利要求17所述的系统，其中所述第一比率包括所述第一父本量除以所述第一母本量，且所述第二比率包括所述第二父本量除以所述第二母本量。
CN201380029904.0A 2012-04-06 2013-04-08 通过使用靶向大规模并行测序的等位基因比率分析进行的胎儿三体性的非侵入性产前诊断 Active CN104640997B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711164143.6A CN107841543B (zh) 2012-04-06 2013-04-08 通过使用靶向大规模并行测序的等位基因比率分析进行的胎儿三体性的非侵入性产前诊断

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261621454P 2012-04-06 2012-04-06
US61/621,454 2012-04-06
PCT/IB2013/052804 WO2013150503A1 (en) 2012-04-06 2013-04-08 Noninvasive prenatal diagnosis of fetal trisomy by allelic ratio analysis using targeted massively parallel sequencing

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711164143.6A Division CN107841543B (zh) 2012-04-06 2013-04-08 通过使用靶向大规模并行测序的等位基因比率分析进行的胎儿三体性的非侵入性产前诊断

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104640997A CN104640997A (zh) 2015-05-20
CN104640997B true CN104640997B (zh) 2017-12-19

Family

ID=49292781

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380029904.0A Active CN104640997B (zh) 2012-04-06 2013-04-08 通过使用靶向大规模并行测序的等位基因比率分析进行的胎儿三体性的非侵入性产前诊断
CN201711164143.6A Active CN107841543B (zh) 2012-04-06 2013-04-08 通过使用靶向大规模并行测序的等位基因比率分析进行的胎儿三体性的非侵入性产前诊断

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711164143.6A Active CN107841543B (zh) 2012-04-06 2013-04-08 通过使用靶向大规模并行测序的等位基因比率分析进行的胎儿三体性的非侵入性产前诊断

Country Status (10)

Country Link
US (3) US20130267425A1 (zh)
EP (2) EP2834376B1 (zh)
JP (1) JP6073461B2 (zh)
CN (2) CN104640997B (zh)
AU (2) AU2013245272B2 (zh)
CA (1) CA2869371C (zh)
ES (1) ES2623089T3 (zh)
HK (3) HK1201300A1 (zh)
TR (1) TR201815541T4 (zh)
WO (1) WO2013150503A1 (zh)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9418203B2 (en) * 2013-03-15 2016-08-16 Cypher Genomics, Inc. Systems and methods for genomic variant annotation
GB2520765A (en) * 2013-12-02 2015-06-03 Vanadis Diagnostics Ab Multiplex detection of nucleic acids
GB2524948A (en) * 2014-03-07 2015-10-14 Oxford Gene Technology Operations Ltd Detecting Increase or Decrease in the Amount of a Nucleic Acid having a Sequence of Interest
WO2016011414A1 (en) * 2014-07-18 2016-01-21 Illumina, Inc. Non-invasive prenatal diagnosis of fetal genetic condition using cellular dna and cell free dna
US10319463B2 (en) 2015-01-23 2019-06-11 The Chinese University Of Hong Kong Combined size- and count-based analysis of maternal plasma for detection of fetal subchromosomal aberrations
US10395759B2 (en) 2015-05-18 2019-08-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for copy number variant detection
CN110475874A (zh) * 2017-04-18 2019-11-19 安捷伦科技比利时有限公司 脱靶序列在dna分析中的应用
WO2019028462A1 (en) * 2017-08-04 2019-02-07 Billiontoone, Inc. TARGET-ASSOCIATED MOLECULES FOR CHARACTERIZATION ASSOCIATED WITH BIOLOGICAL TARGETS
WO2019028470A2 (en) * 2017-08-04 2019-02-07 Billiontoone, Inc. DETERMINING AND ANALYZING SEQUENCING OUTPUTS USING TARGET-ASSOCIATED MOLECULES IN QUANTIFICATION ASSOCIATED WITH BIOLOGICAL TARGETS
WO2020257709A1 (en) * 2019-06-21 2020-12-24 Coopersurgical, Inc. Systems and methods for determining pattern of inheritance in embryos
WO2021134513A1 (zh) * 2019-12-31 2021-07-08 深圳华大医学检验实验室 确定染色体非整倍性、构建分类模型的方法和装置
CN114645080A (zh) * 2020-12-21 2022-06-21 高嵩 一种利用多态性位点和靶位点测序检测胎儿遗传变异的方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5641628A (en) * 1989-11-13 1997-06-24 Children's Medical Center Corporation Non-invasive method for isolation and detection of fetal DNA
US6440706B1 (en) 1999-08-02 2002-08-27 Johns Hopkins University Digital amplification
US20030180765A1 (en) 2002-02-01 2003-09-25 The Johns Hopkins University Digital amplification for detection of mismatch repair deficient tumor cells
US6977162B2 (en) 2002-03-01 2005-12-20 Ravgen, Inc. Rapid analysis of variations in a genome
US7727720B2 (en) 2002-05-08 2010-06-01 Ravgen, Inc. Methods for detection of genetic disorders
EP2354253A3 (en) 2003-09-05 2011-11-16 Trustees of Boston University Method for non-invasive prenatal diagnosis
WO2005035725A2 (en) * 2003-10-08 2005-04-21 The Trustees Of Boston University Methods for prenatal diagnosis of chromosomal abnormalities
US7645576B2 (en) * 2005-03-18 2010-01-12 The Chinese University Of Hong Kong Method for the detection of chromosomal aneuploidies
PL1981995T5 (pl) 2006-02-02 2019-10-31 Univ Leland Stanford Junior Nieinwazyjne genetyczne badania przesiewowe płodu metodą analizy cyfrowej
HUE030510T2 (hu) * 2007-07-23 2017-05-29 Univ Hong Kong Chinese Magzati kromoszómális aneuploidia diagnosztizálása genomszekvenálás alkalmazásával
AU2011255641A1 (en) * 2010-05-18 2012-12-06 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
AU2011365507A1 (en) * 2011-04-14 2013-05-02 Verinata Health, Inc. Normalizing chromosomes for the determination and verification of common and rare chromosomal aneuploidies

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A non-invasive test for prenatal diagnosis based on fetal DNA present in maternal blood: a preliminary study;Ravinder Dhallan et al.;《The Lancet》;20070202;第369卷;第474-481页 *
Targeted Massively Parallel Sequencing of Maternal Plasma DNA Permits Efficient and Unbiased Detection of Fetal Alleles;Gary J.W. Liao et al.;《Clinical Chemistry》;20111231;第57卷(第1期);第92-101页 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP6073461B2 (ja) 2017-02-01
US20200063207A1 (en) 2020-02-27
CN107841543A (zh) 2018-03-27
EP2834376A4 (en) 2015-11-18
JP2015521028A (ja) 2015-07-27
WO2013150503A1 (en) 2013-10-10
AU2013245272A1 (en) 2014-10-23
CN107841543B (zh) 2021-12-31
EP3178945B1 (en) 2018-10-17
AU2018204344B2 (en) 2018-09-27
EP2834376B1 (en) 2017-03-15
US20130267425A1 (en) 2013-10-10
HK1245851A1 (zh) 2018-08-31
US10501797B2 (en) 2019-12-10
AU2013245272B2 (en) 2018-04-05
HK1204658A1 (zh) 2015-11-27
EP3178945A1 (en) 2017-06-14
CN104640997A (zh) 2015-05-20
CA2869371C (en) 2021-01-12
TR201815541T4 (tr) 2018-11-21
AU2018204344A1 (en) 2018-07-05
US20160201134A1 (en) 2016-07-14
EP2834376A1 (en) 2015-02-11
CA2869371A1 (en) 2013-10-10
HK1201300A1 (zh) 2015-08-28
ES2623089T3 (es) 2017-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104640997B (zh) 通过使用靶向大规模并行测序的等位基因比率分析进行的胎儿三体性的非侵入性产前诊断
TWI661049B (zh) 使用不含細胞之ｄｎａ片段大小以測定複製數變異之方法
CN106834474B (zh) 利用基因组测序诊断胎儿染色体非整倍性
CN107077537B (zh) 用短读测序数据检测重复扩增
CN110800063B (zh) 使用无细胞dna片段大小检测肿瘤相关变体
CN104254618B (zh) 母体血浆中胎儿dna分数的基于大小的分析
CN102791881B (zh) 基于大小的基因组分析
CN102770558B (zh) 由母本生物样品进行胎儿基因组的分析
CN105143466B (zh) 通过大规模平行rna测序分析母亲血浆转录组
CN105555970B (zh) 同时进行单体型分析和染色体非整倍性检测的方法和系统

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1204658

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant