CN104254618B - 母体血浆中胎儿dna分数的基于大小的分析 - Google Patents

母体血浆中胎儿dna分数的基于大小的分析 Download PDF

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Abstract

基于多种大小的DNA片段的量，确定来自生物样品的DNA混合物中临床相关DNA的浓度分数。例如，可以确定母体血浆中胎儿DNA或患者血浆中肿瘤DNA的浓度分数。已表明样品中DNA片段的大小分别与胎儿DNA的比例和肿瘤DNA的比例相关。校准数据点(例如，作为校准函数)指示了大小参数值与临床相关DNA的浓度分数值之间的对应性。对于给定的样品，大小参数的第一值可从样品中DNA片段的大小确定。第一值与校准数据点的比较可以提供对临床相关DNA的浓度分数的估算。

Description

母体血浆中胎儿DNA分数的基于大小的分析
相关申请的交叉引用
本申请为2012年3月8日递交的标题为“SIZE-BASED ANALYSIS OF FETAL DNAFRACTION IN MATERNAL PLASMA(母体血浆中胎儿DNA分数的基于大小的分析)”的第61/608,623号美国临时专利申请，和2012年4月6日递交的标题为“SIZE-BASED ANALYSIS OFFETAL DNA FRACTION IN MATERNAL PLASMA(母体血浆中胎儿DNA分数的基于大小的分析)”的第61/621,451号美国临时专利申请的非临时性申请，并要求它们的权益，其通过引用整体并入本文，用于所有目的。
发明背景
母体血浆中无细胞的胎儿DNA的发现开创了非侵入性产前诊断的新的可能(LoYMD et al.Lancet 1997；350:485-487)。胎儿DNA均值/中值浓度分数被报导为约3％-10％(Lo YMD et al.Am J Hum Genet 1998；62:768-775；Lun FMF et al.Clin Chem 2008；54:1664-1672)。胎儿DNA浓度分数是影响使用母体血浆DNA的非侵入性产前诊断测试性能的重要的参数。例如，对于胎儿染色体非整倍性(例如21三体、18三体或13三体)的非侵入性的产前诊断，胎儿DNA浓度分数越高，母体血浆中来源于非整倍性染色体的DNA序列的过度表现越高。确实，已证明母体血浆中胎儿DNA浓度分数每减少2倍，将需要计数4倍的分子数来获得非整倍性检测(Lo YMD et al.Proc Natl Acad Sci USA 2007；104:13116-13121)。
对于通过随机大规模并行测序进行的胎儿三体非侵入性产前检测，样品的胎儿DNA浓度分数将影响获得较强检测所需要进行的测序量(Fan HC and Quake SR.PLoS One2010；5:e10439)。确实，一些研究组已列入了质量控制步骤，其中首先测量胎儿DNA浓度分数，并且只有含有大于最小胎儿DNA浓度分数的样品才有资格产生诊断结果(Palomaki GEet al.Genet Med 2011；13:913-920)。其他研究组已在他们的诊断算法中列入了胎儿DNA浓度分数，用于估算特定母体血浆样品获自非整倍性妊娠的风险(Sparks AB et al.Am JObstet Gynecol 2012；206:319.e1-9)。
除了非整倍性检测，胎儿DNA浓度分数还类似地影响使用母体血浆DNA进行的用于检测单基因疾病如血红蛋白病(Lun FMF et al.Proc Natl Acad Sci USA 2008；105:19920-19925)和血友病(Tsui NBY et al.Blood 2011；117:3684-3691)的非侵入性产前诊断测试。胎儿DNA浓度分数还影响构建胎儿全基因组基因图谱和突变图谱以及胎儿全基因组测序所需要进行的测序深度(Lo YMD et al.Sci Transl Med 2010；2:61ra91和美国专利申请2011/0105353)。
已描述了多种测量胎儿DNA浓度分数的方法。一种方法为测量母本基因组不存在的、胎儿特异性的、父本遗传的序列浓度。此类序列的实例包括男性胎儿中存在的Y染色体上的序列，和来自Rhesus D阴性孕妇怀有的Rhesus D阳性胎儿中的RHD基因的序列。还可使用母亲和胎儿中均存在的序列测量母体总血浆DNA。为了得到胎儿DNA浓度分数，接着可以计算胎儿特异性的、父本遗传的序列浓度相比母体总血浆DNA浓度的比率。
可使用的序列的另一实例包括利用单核苷酸多态性(Lo YMD et al.Sci TranslMed 2010；2:61ra91)。使用用于测量胎儿DNA浓度分数的遗传标志物的缺点是没有哪一组遗传标志物是所有胎儿-母亲对特征性的。然而可采用的另一方法是使用母体血浆中展现胎儿或胎盘特异性DNA甲基化模式的DNA序列(Nygren AO et al.Clin Chem 2010；56:1627-1635)。使用DNA甲基化标志物的可能缺点是可能存在DNA甲基化水平的个体间差异。此外，用于检测DNA甲基化标志物的方法通常较复杂，包括使用甲基化敏感性限制酶消化(Chan KCA et al.Clin Chem 2008；52:2211-2218)，或亚硫酸盐转化(Chim SSC etal.Proc Natl Acad Sci USA2005；102:14753-14758)，或甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)(Papageorgiou EA et al.Nat Med 2011；17:510-513)。
由于胎儿DNA浓度分数是重要的数值，用其他的方法和系统来确定该值是可取的。
发明概述
实施方案能够提供基于多种大小的DNA片段的量，估算来自生物样品的DNA混合物中临床相关DNA的浓度分数的方法和系统。例如，可以确定母体血浆中的胎儿DNA的浓度分数或患者血浆中的肿瘤DNA的浓度分数。已表明DNA片段的大小与胎儿DNA的比例和肿瘤DNA的比例相关。校准数据点(例如，作为校准函数)指示了大小参数值与临床相关DNA的浓度分数值之间的对应性。对于给定的样品，大小参数的第一值可自样品中DNA片段的大小确定而来。第一值与校准数据点的比较提供了关于临床相关DNA的浓度分数的估算。
根据一个实施方案，方法估算生物样品中临床相关DNA的浓度分数，所述生物样品包含所述临床相关的DNA和其他DNA。对于多种大小中的每一种大小，测量了来自生物样品的对应于所述大小的多个DNA片段的量。计算机系统基于多种大小的DNA片段的量，计算第一参数的第一值。第一参数提供了生物样品中DNA片段的大小模式的统计学度量。获得一个或多个第一校准数据点。每个第一校准数据点指定了对应于第一参数的校准值的临床相关DNA的浓度分数。所述一个或多个校准数据点自多个校准样品确定而来。将第一值与至少一个校准数据点的校准值比较。基于所述比较估算生物样品中临床相关DNA的浓度分数。
根据另一个实施方案，方法分析了生物体的生物样品。所述生物样品包含源自正常细胞和可能来自癌症相关细胞的DNA。所述DNA中的至少一些在所述生物样品中是无细胞的。对于多种大小中的每种大小，测量了来自生物样品的对应于所述大小的多个DNA片段的量。计算机系统基于多种大小DNA片段的量，计算了第一参数的第一值。第一参数提供了生物样品中DNA片段的大小模式的统计学度量。将第一值与参考值比较。基于所述比较确定生物体中癌症等级的分级。
其他实施方案涉及系统、便携式用户装置和与本文所述方法相关的计算机可读介质。
参考以下详细描述和附图可获得对本发明的性质和优势的更好的理解。
附图说明
图1显示了根据本发明实施方案，母体血浆中循环无细胞DNA的大小分布的图100。
图2A显示了根据本发明实施方案，具有不同胎儿DNA浓度分数的两个母体血浆样品(妊娠的第一个三个月)中胎儿DNA的大小分布的图200。
图2B显示了根据本发明实施方案，具有不同胎儿DNA浓度分数的两个母体血浆样品(妊娠的第二个三个月)中DNA片段的大小分布的图250。
图3是方法300的流程图，其阐示了根据本发明实施方案估算生物样品中临床相关DNA的浓度分数的方法。
图4是图400，其显示了根据本发明实施方案，使用电泳获得的母体血浆DNA的大小分布(电泳图)。
图5A是图500，其显示了根据本发明实施方案，母体血浆中具有多种胎儿DNA百分比的样品的150bp或更小DNA片段的比例。
图5B是图550，其显示了≤150bp的DNA片段与163bp-169bp的DNA的量的大小比，标示为(CF(大小≤150)/大小(163-169))。
图6A是图600，其显示了140bp-146bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(大小(140-146)/大小(163-169))。
图6B是图650，其显示了140bp-154bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(大小(140-154)/大小(163-169))。
图7是图700，其显示了100bp-150bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(大小(100-150)/大小(163-169))。
图8是图800，其显示了根据本发明实施方案，母体血浆中具有多种胎儿DNA百分比的样品的150bp或更小DNA片段的比例。
图9A是图900，其显示了≤150bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(CF(大小≤150)/大小(163-169))。
图9B是图950，其显示了140bp-146bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(大小(140-146)/大小(163-169))。
图10A是图1000，其显示了140bp-154bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(大小(140-154)/大小(163-169))。
图10B是图1005，其显示了100bp-150bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(大小(100-150)/大小(163-169))。
图11的图显示了根据本发明实施方案，对于所示大小的重复元件，大小比相对于胎儿DNA百分比作图。
图12A是电泳图1200，其根据本发明实施方案可用于确定大小比。
图12B是图1250，其显示了根据本发明实施方案，母体血浆中具有多种胎儿DNA百分比的样品的200bp-267bp的DNA片段与290bp-294bp DNA的量的大小比。
图13是根据本发明实施方案，由校准样品产生的测量结果确定校准数据点的方法1300的流程图。
图14A是根据本发明实施方案，针对训练组，大小比相对于胎儿DNA浓度分数的图1400。
图14B是根据本发明实施方案，从图14A的线性函数1410推导(估算)的浓度分数相对于使用胎儿特异性序列测得的浓度分数的图1450。
图15A是图1500，其显示了根据本发明实施方案，肿瘤切除之前和之后的两名肝细胞癌(HCC)患者血浆中具有多种肿瘤DNA百分比的样品的150bp或更小的DNA片段的比例。
图15B是图1550，其显示了肿瘤切除之前和之后的两名HCC患者的≤150bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(CF(大小≤150)/大小(163-169))。
图16A是图1600，其显示了肿瘤切除之前和之后的两名HCC患者的140bp-146bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(大小(140-146)/大小(163-169))。
图16B是图1650，其显示了肿瘤切除之前和之后的两名HCC患者的140bp-154bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(大小(140-154)/大小(163-169))。
图17是图1700，其显示了肿瘤切除之前和之后的两名HCC患者的100bp-150bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(大小(100-150)/大小(163-169))。
图18A是图1800，其显示了肿瘤切除之前和之后的HCC患者的150bp或更小的DNA片段的比例。
图18B是图1850，其显示了肿瘤切除之前和之后的HCC患者的≤150bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(CF(大小≤150)/大小(163-169))。
图19A是图1900，其显示了肿瘤切除之前和之后的HCC患者的140bp-146bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(大小(140-146)/大小(163-169))。
图19B是图1950，其显示了肿瘤切除之前和之后的HCC患者的140bp-154bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(大小(140-154)/大小(163-169))。
图20是图2000，其显示了肿瘤切除之前和之后的HCC患者的100bp-150bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(大小(100-150)/大小(163-169))。
图21是流程图，其阐示了根据本发明实施方案分析生物体的生物样品以确定癌症等级的分级的方法2100。
图22是表2200，其显示了可见于多种类型的癌症中的一些常见的染色体畸变。
图23显示了可用于根据本发明实施方案的系统和方法的示例性计算机系统2300的方块图。
定义
如本文所用的术语“生物样品”是指取自对象(例如，人，如孕妇)且含有一种或多种目标核酸分子的任何样品。实例包括血浆、唾液、胸膜液、汗液、腹水、胆汁、尿、血清、胰液、粪便和宫颈刮片样品。生物样品可获自人、动物或其他合适的生物体。“校准样品”对应于这样的生物样品，其临床相关DNA分数是已知的，或可通过校准方法如使用临床相关DNA特异性的等位基因确定。临床相关DNA的实例为母体血浆中的胎儿DNA或患者血浆中的肿瘤DNA。
如本文所用，术语“基因座(locus)”或其复数形式“基因座(loci)”是在基因组间存在变异的任何长度的核苷酸(或碱基对)的位点或地址。术语“序列读数”是指获自核酸分子(例如，DNA片段)的全部或一部分的序列。在一个实施方案中，仅对片段的一端测序。可选地，可对片段的两端(例如，从每端起约30bp)测序以生成两个序列读数。然后可将成对的序列读数与参照基因组比对，这可提供片段长度。在又一实施方案中，例如，通过连接，可将线性DNA片段环化，并且可对跨越连接位点的部分测序。
术语“通用测序”是指这样的测序，其中将适配子添加至片段的末端，并且将测序引物连接至适配子。因此，可用相同的引物对任何片段测序，因此测序可为随机的。
术语胎儿DNA浓度分数与术语胎儿DNA比例及胎儿DNA分数可互换使用，并指存在于生物样品(例如，母体血浆或血清样品)中的源自胎儿的胎儿DNA分子的比例(Lo YMD etal.Am J Hum Genet 1998；62:768-775；Lun FMF et al.Clin Chem 2008；54:1664-1672)。类似地，术语肿瘤DNA浓度分数可与术语肿瘤DNA比例和肿瘤DNA分数互换使用，并指生物样品中存在的肿瘤DNA分子的比例。
术语“大小模式(size profile)”通常涉及生物样品中DNA片段的大小。大小模式可为提供多种大小的DNA片段的量的分布的柱形图。可将多种统计学参数(也称为大小参数或仅称为参数)用于区分一种大小模式与另一种。一个参数为特定大小或大小范围的DNA片段相对于所有DNA片段或相对于另一大小或范围的DNA片段的百分比。
“临床相关的”DNA的实例包括母体血浆中的胎儿DNA和患者血浆中的肿瘤DNA。另一实例包括移植患者血浆中的移植物相关的DNA量的测量结果。其他实例包括对象血浆中的造血与非造血DNA的相对量的测量结果。该后一实施方案可用于检测或监测或预测病理进程或造血和/或非造血组织相关的损伤。
“校准数据点”包括目标DNA(即，临床相关的DNA)的“校准值”和测量的或已知的浓度分数。校准值是测定的校准样品的大小参数的值，所述校准样品的临床相关DNA的浓度分数是已知的。校准数据点可以多种方式定义，例如，定义为离散点或校准函数(也称为校准曲线或校准面)。
术语“癌症等级”可指癌症是否存在、癌症阶段、肿瘤大小、涉及多少缺失或扩增的染色体区域(例如，双倍性或三倍性)，和/或癌症严重性的其他度量。癌症等级可为数字或其他特征。该水平可为0。癌症等级还包括与缺失或扩增相关的恶化前的或癌症前期的状况。
发明详述
已经知道母体血浆中的无细胞胎儿DNA分子通常比母体来源的分子短(Chan KCAet al.Clin Chem 2004；50:88-92；Lo YMD et al.Sci Transl Med 2010；2:61ra91)。胎儿DNA的存在导致母体血浆DNA的整体大小分布改变，并且改变的程度与胎儿DNA的浓度分数相关。通过测量母体血浆DNA的大小模式的特定值，实施方案可获得母体血浆中的胎儿DNA浓度分数。
除应用于非侵入性的产前诊断外，实施方案还可用于测量生物体液中可用于临床的不同大小的核酸种类的浓度分数，其可用于癌症检测、移植和医疗监测。先前已证明癌症患者血浆中肿瘤来源的DNA比非癌症来源的DNA短(Diehl F et al.Proc Natl Acad SciUSA 2005；102:16368-16373)。在移植环境下，已证明造血来源的DNA比非造血来源的DNA短(Zheng YW et al.Clin Chem 2012；58:549-558)。例如，如果患者从供体接受了肝，则来源于肝(成体中的非造血器官)的DNA将比血浆中造血来源的DNA短(Zheng YW et al.ClinChem 2012；58:549-558)。类似地，在患有心肌梗死或中风的患者中，预期受损的非造血器官(即，分别为心脏和脑)释放的DNA将导致血浆DNA的大小模式向较短的范围转变。
I.大小分布
为了说明实施方案，我们在以下实例中表明可测量大小模式，例如，通过双端大规模并行测序或通过电泳(例如，使用生物分析仪)。后一实例尤其有用，因为使用生物分析仪的电泳是较快而且相对便宜的方案。这将允许在对血浆DNA样品进行相对较贵的测序方法前，快速进行该分析来作为一种质量控制度量。
图1显示了根据本发明实施方案，母体血浆中循环无细胞DNA的大小分布的图100。大小分布可通过测量DNA片段大小，然后对多种大小DNA片段(例如，50个碱基至约220个碱基范围内)的数目计数获得。图100显示了两种分布。分布110是针对母体血浆样品中所有的DNA片段，而分布120是仅针对来自胎儿的DNA。水平轴是DNA片段碱基对(bp)的大小。垂直轴是测量的DNA片段的百分比。
在图1中，已证明母体血浆中胎儿来源的DNA的大小分布比母体来源的分子短(Chan KC et al.ClinChem 2004；50:88-92)。最近，我们使用双端大规模并行测序分析测定了孕妇中胎儿特异性DNA和总DNA(主要来源于母亲)的高分辨率大小分布。我们证明两种DNA间的主要差异为：对于胎儿来源的DNA，166bp DNA片段分数减小，且150bp以下的较短DNA的比例增加(Lo YM et al.Sci Transl Med 20102:61ra91)。
在本文中，我们概述了母体血浆样品(生物样品的一个实例)中总DNA片段的大小分布的分析如何有利于确定母体血浆中胎儿DNA的浓度分数。母体血浆中胎儿DNA浓度分数的增加将导致总DNA的整体大小分布缩短。在一个实施方案中，约144bp DNA片段和约166bpDNA片段的相对丰度(参数的一个实例)可用于反映胎儿DNA的浓度分数。在另一实施方案中，关于大小模式的其他参数或参数组合可用于反映血浆DNA的大小分布。
图2A显示了根据本发明实施方案，具有不同胎儿DNA浓度分数的两个母体血浆样品(妊娠的第一个三个月)中胎儿DNA的大小分布的图200。这两名孕妇均怀有男性胎儿。胎儿DNA浓度分数由来自Y染色体的序列在总测序DNA片段中的比例而确定。两个样品均采自妊娠第一个三个月的孕妇。个例338(实线，胎儿DNA浓度分数10％)具有比个例263(虚线，胎儿DNA浓度分数20％)低的胎儿DNA浓度分数。当与个例263相比时，个例338在166bp处具有较高的峰，而对于150bp以下的大小峰较低。换句话说，个例263中短于150bp的DNA片段更为丰富，而个例338中约166bp的片段更为丰富。这些观察与假设一致，即长DNA和短DNA的相对量可能与胎儿DNA浓度分数相关。
图2B显示了根据本发明实施方案，具有不同胎儿DNA浓度分数的两个母体血浆样品(妊娠的第二个三个月)中DNA片段的大小分布的图250。两个样品均采自第二个三个月的孕妇。这两名孕妇均怀有男性胎儿。胎儿DNA浓度分数由来自Y染色体的序列在总测序DNA片段中的比例而确定。类似于之前的实例，个例5415(虚线，具有较高的胎儿DNA浓度分数19％)的150bp以下的大小具有较高的峰，而个例5166(实线，具有较低的胎儿DNA浓度分数12％)在166bp处具有较高的峰。
大小参数的不同值与胎儿DNA浓度分数值的相关性显示在下面的数据图中。另外，肿瘤DNA片段的大小与具有肿瘤DNA片段和来自正常细胞的DNA片段的样品中肿瘤DNA片段的百分比相关。因此，肿瘤片段大小还可用于确定样品中肿瘤片段的百分比。
II.方法
因为DNA片段大小与浓度分数(也称为百分比)相关，实施方案可使用该相关性来确定样品中具体类型的DNA(例如，胎儿DNA或来自肿瘤的DNA)的浓度分数。具体类型的DNA是临床相关的，因为其为待估算的浓度分数。因此，方法可基于测得的DNA片段大小，估算生物样品中临床相关DNA的浓度分数。
图3是方法300的流程图，其阐示了根据本发明实施方案，估算生物样品中临床相关DNA的浓度分数的方法。生物样品包含临床相关的DNA和其他DNA。生物样品可获自患者，例如，怀有胎儿的女性对象。在另一实施方案中，患者可患有或疑似患有肿瘤。在一个实施方案中，可将生物样品接收于仪器，例如，测序仪，其输出可用于确定DNA片段大小的测量数据(例如，序列读数)。方法300可全部或部分用计算机系统进行，如同本文所述其他方法所能进行的那样。
在方框310中，测量了对应于多种大小的DNA片段的量。对于多种大小中的每种大小，可测量生物样品的对应于所述大小的多个DNA片段的量。例如，可测量具有140个碱基长度的DNA片段的数目。所述量可保存为柱形图。在一个实施方案中，测量了来自生物样品的多种核酸中的每种的大小，其可基于个体进行(例如，通过单分子测序)或基于群组进行(例如，通过电泳)。所述大小可对应于范围。因此，量可针对具有特定范围大小的DNA片段。
可随机挑选多种DNA片段，或优选地，从基因组的一个或多个预定区域挑选多种DNA片段。例如，可进行靶向富集，如上文所述。在另一实施方案中，可对DNA片段随机测序(例如，使用通用测序)，并且可将得到的序列读数与对应于对象(例如，参照的人基因组)的基因组比对。然后，可仅将序列读数与一个或多个预定区域对齐的DNA片段用于确定大小。
在多个实施方案中，大小可为质量、长度或其他合适的大小度量。测量可以多种方式进行，如本文所述。例如，可进行双端测序和DNA片段比对，或可使用电泳。可测量统计学显著数目的DNA片段，以提供生物样品的精确大小模式。统计学显著数目的DNA片段的实例包括大于100,000；1,000,000；2,000,000，或其他合适的值，这可取决于所需的精确度。
在一个实施方案中，可将获自物理测量如双端测序或电泳的数据接收于计算机，并分析以实现DNA片段大小测量。例如，可分析(例如，通过比对)来自双端测序的序列读数来确定大小。再例如，可分析产生自电泳的电泳图以确定大小。在一个实施方案中，DNA片段的分析确实包括实际的测序过程或对DNA片段进行电泳，但其他实施方案可仅进行所得数据的分析。
在方框320中，基于多种大小DNA片段的量，计算第一参数的第一值。在一个方面，第一参数提供了生物样品中DNA片段的大小模式的统计学度量(例如，柱形图)。所述参数可称为大小参数，因为其自多种DNA片段的大小确定而来。
第一参数可具有多种形式。此类参数为特定大小的DNA片段数除以片段总数，其可从柱形图(任何数据结构，提供了特定大小片段的绝对或相对计数)获得。再例如，参数可为特定大小或特定范围片段的数目除以另一大小或范围片段的数目。该除法可用作标准化，以解释针对不同样品分析的DNA片段的不同数目。标准化可通过针对每个样品分析相同数目的DNA片段实现，其有效地提供了与除以分析的片段的总数相同的结果。本文描述了参数的其他实例。
在方框330中，获得了一个或多个第一校准数据点。每个第一校准数据点可指定对应于第一参数的特定值(校准值)的临床相关DNA的浓度分数。浓度分数可指定为特定浓度或浓度范围。校准值可对应于从多个校准样品确定的第一参数(即，特定大小参数)的值。校准数据点可自具有已知浓度分数(其可通过本文描述的多种技术测量)的校准样品确定而来。校准样品中的至少一些具有不同的浓度分数，但一些校准样品可具有相同的浓度分数。
在多个实施方案中，一个或多个校准点可定义为一个离散点、一组离散点、函数、一个离散点和函数，或离散或连续数值组的任何其他组合。例如，校准数据点可自具有特定浓度分数的样品的大小参数(例如，特定大小或大小范围片段的数目)的一个校准值确定而来。可使用多个柱形图，每个校准样品具有不同的柱形图，其中校准样品中的一些可具有相同的浓度分数。
在一个实施方案中，可将从相同浓度分数的多个样品测得的相同大小参数的值组合，以确定特定浓度分数的校准数据点。例如，可从相同浓度分数的样品的大小数据获得大小参数数值的平均值，以确定特定校准数据点(或提供对应于校准数据点的范围)。在另一个实施方案中，具有相同校准值的多个数据点可用于确定平均浓度分数。
在一个实施方案中，测量了多个校准样品的DNA片段的大小。确定了每个校准样品的相同大小参数的校准值，其中可将所述大小参数针对样品的已知的浓度分数作图。然后可将函数与图的数据点拟合，其中所述函数拟合确定了用于确定新样品的浓度分数的校准数据点。
在方框340中，将第一值与至少一个校准数据点的校准值比较。比较可以多种方式进行。例如，比较可为第一值是否高于或低于校准值。比较可包括与校准曲线(由校准数据点组成)比较，因此比较可确定具有第一参数的第一值的曲线上的点。例如，计算的第一参数的数值X(如从测得的新样品中DNA的大小确定的)可用作函数F(X)的输入，其中F为校准函数(曲线)。F(X)的输出为浓度分数。可提供误差范围，其对于每个X值可能是不同的，从而提供了F(X)的输出值的范围。
在步骤350中，生物样品中临床相关DNA的浓度分数基于比较来估算。在一个实施方案中，可以确定第一参数的第一值是大于还是小于阈值校准值，从而能确定估算的本样品的浓度分数是大于还是小于对应于阈值校准值的浓度分数。例如，如果计算的生物样品的第一值X1大于校准值XC，则生物样品的浓度分数FC1可确定为大于对应于XC的浓度分数FCC。该比较可用于确定生物样品中是否存在进行其他检测(例如，检测胎儿非整倍性)的足够的浓度分数。该大于和小于的关联可取决于参数如何定义。在此类实施方案中，可能仅需要一个校准数据点。
在另一个实施方案中，通过输入第一值至校准函数来实现比较。校准函数可通过确定对应于第一值的曲线上的点，有效地比较第一值与校准值。然后可将估算的浓度分数提供为校准函数的输出值。
在一个实施方案中，可确定生物样品的多于一个参数的值。例如，可确定第二参数的第二值，其对应于生物样品中DNA片段大小模式的不同的统计学度量。第二值可使用DNA片段的相同的大小测量或不同的大小测量确定。每个参数可对应于不同的校准曲线。在一个实施方案中，可将不同的值独立地与不同的校准曲线比较，以获得多个估算的浓度分数，然后可将其平均或用于提供作为输出的范围。
在另一实施方案中，可使用多维校准曲线，其中可将不同的参数值有效地输入至输出浓度分数的单个校准函数。单个校准函数可产生自获自校准样品的所有数据点的函数拟合。因此，在一个实施方案中，第一校准数据点和第二校准数据点可为多维曲线上的点，其中比较包括确定具有对应于第一值和一个或多个第二值的坐标的多维点。
III.测定大小
可测定血浆DNA的大小分布，例如但不限于，使用实时PCR、电泳和质谱分析。在多个实施方案中，所测的大小为长度、分子量或测量的与长度或质量成比例的参数，如电泳图谱中的迁移性和在电泳或质谱仪中移动固定距离所需的时间。在另一个实例中，可用嵌入性荧光染料如溴化乙锭或SYBR Green对DNA染色，其中染料结合的量与DNA分子的长度成比例。可以通过UV光照射于样品上时发出的荧光的强度，确定结合的染料的量。测量大小的一些实例以及得到的数据描述如下。
A.使用测序的第一胎儿样品集
表1显示了以胎儿DNA分数为例的样品信息和测序分析。血浆样品取自80名孕妇，每名怀有一个男性胎儿。在这80名孕妇中，39名怀有整倍体胎儿，18名怀有21三体(T21)胎儿，10名怀有18三体(T18)胎儿，且13名怀有13三体(T13)胎儿。使用双端大规模并行测序确定血浆DNA的大小分布。母体血浆DNA的测序文库按先前所述构建(Lo YM et al.SciTransl Med 2010；2:61ra91)，除了通过三引物PCR扩增将6个碱基的标识符引入至每个血浆样品的DNA分子。
将两个样品引入一个测序道(即，2倍测序)。在其他实施方案中，可将多于两个样品引入一个测序道，例如，6或12或20个，或多于20个。所有文库均通过基因组分析仪IIx(Illumina)使用36-bp×2PE格式测序。进行了另外的7轮测序以解译每个测序的血浆DNA分子上的索引序列。使用短寡核苷酸比对程序2(Short Oligonucleotide AlignmentProgram 2，SOAP2)(soap.genomics.org.cn)，将36-bp的序列读数与非重复掩蔽的(non-repeat-masked)人参照基因组(Hg18)(genome.ucsc.edu)比对。确定了具有单独的成员的双端(PE)读数，所述成员在流动池(flow cell)的相同簇位置上测序，且以正确方向和无任何核苷酸错配地、唯一地与人基因组中的单个位置对齐。在其他实施方案中，比对可能不唯一的且可允许错配。
仅回收展现插入物大小≤600bp的PE读数用于分析。利用这些标准，这些实验中分析的血浆DNA片段的大小范围为36bp-600bp。每个测序的DNA片段的大小从测序片段每端的最外面的核苷酸坐标推导而来。
表1显示了多种非整倍性状态样品的数据。数据包括个例数、孕龄中值和范围，及双端读数数量中值和范围，以及胎儿DNA分数。
母体血浆样品中胎儿DNA的浓度分数按先前所述从与Y染色体对齐的序列的量推导而来(Chiu RW et al.BMJ 2011；342:c7401)。该技术是校准方法的一个实例。因此，表1中测量的胎儿DNA分数可用于评估新样品中的胎儿DNA分数的校准数据点。用于收集表1中的数据的样品可被认为是校准样品。
B.使用靶向测序的第二胎儿样品集
表2显示了根据本发明实施方案，母体血浆DNA的样品信息和靶向富集。血浆样品采自48名孕妇，每名怀有一个胎儿。在这48名孕妇中，21名怀有整倍体胎儿，17名怀有21三体(T21)胎儿，9名怀有18三体(T18)胎儿，且1名怀有13三体(T13)胎儿。这些数据连同以下的实例证明实施方案可使用靶向技术。血浆DNA的大小分布可使用双端大规模并行测序确定。在其他实施方案中，血浆DNA的大小分布可例如但不限于使用实时PCR、电泳和质谱分析确定。
为获得靶标区域的高倍测序覆盖，在一个实施方案中使用了Agilent SureSelect靶标富集系统设计探针来捕获来自chr7(0.9Mb区域)、chr13(1.1Mb区域)、chr18(1.2Mb区域)和chr21(1.3Mb区域)的DNA分子。在探针设计中，首先挑选chr7、chr13、chr18上的外显子和chr21上的唐氏综合症决定区(21q22.1-q22.3)作为靶标区域。因为chr13、chr18和chr21比chr7具有更少的外显子区域，引入了chr13、chr18上的其他非外显子区域和chr21上的唐氏综合症决定区来平衡上述4条染色体间的靶向区域的总长度。所选的非外显子区域长度为120bp，可唯一地映射，GC含量接近0.5，且在所靶向的染色体上均匀分布。
将所有上述外显子和非外显子区域的坐标提交至Agilent eArray平台用于探针设计。将500ng的每种母体血浆DNA文库在65℃下与捕获探针孵育24h。杂交后，洗脱所靶向的DNA分子并根据厂商说明书通过12个循环的PCR进行扩增。使用50-bp×2PE格式在GA IIx(Illumina)上对有靶标富集的文库编索引并测序。进行了另外的7轮测序以解译每个测序的血浆DNA分子上的索引序列。使用短寡核苷酸比对程序2(SOAP2)(soap.genomics.org.cn)，将50-bp序列读数与非重复掩蔽的人参照基因组(Hg18)(genome.ucsc.edu)比对。将具有单独的成员的PE读数在流动池的相同簇位置上进行测序，并以正确方向与人基因组中的单个位置唯一地对齐。允许有两个错配；靶标富集后测序文库的复杂度明显降低。
仅回收展现插入物大小≤600bp的PE读数用于分析。利用这些标准，本研究中分析的血浆DNA片段的大小范围为36bp-600bp。每个测序的DNA片段的大小从测序片段每端最外面的核苷酸坐标推导而来。从携带胎儿特异性等位基因的片段和携带与各自母亲共有的等位基因的片段的比估算母体血浆样品中胎儿DNA的浓度分数。
表2显示了来自多种非整倍性状态样品的靶向测序的数据。
C.胎儿样品的电泳
除了使用大规模并行测序，血浆DNA大小分布的分析还可通过电泳实现。电泳测量片段穿过介质的时间。不同大小的颗粒穿过介质所花的时间不同。因此，在一个实施方案中，可进行母体血浆DNA测序文库的微流体电泳来确定母体血浆DNA的大小分布。
图4是图400，其显示了根据本发明实施方案，使用电泳获得的母体血浆DNA的大小分布(电泳图)。微流体电泳使用Agilent 2100生物分析仪进行。两个样品的测序文库的电泳图显示在图400中。X轴代表DNA到达传感器所花的时间长度，且对应于DNA片段的大小。Y轴代表特定时间DNA片段通过传感器的荧光单位(FU)。
DNA片段到达传感器所花的时间长度与DNA片段的大小正相关。生物分析仪通过将检测样品的运行时间与具有已知长度的DNA片段混合物(即，DNA梯)的运行时间比较，可自动地将时间长度转化为片段大小。然后使用大规模并行测序对DNA测序文库进行测序，并将Y染色体序列的分数用于确定这些样品的胎儿DNA浓度分数。
在图400中，实线410代表样品UK92797，其具有的胎儿DNA浓度分数为8.3％，且虚线420代表样品UK94884，其具有的胎儿DNA浓度分数为20.3％。相比样品UK92797，样品UK94884(该样品具有较高的胎儿DNA分数)具有相对较高量的电泳时间间隔为63秒-73秒的DNA(区域A)(对应于200bp-267bp的DNA大小)，和相对较低量的电泳时间为76s的DNA(区域B)(对应于～292bp的DNA大小)。
根据厂商的方案，将总大小为122bp的DNA适配子和引物组引入血浆DNA用于测序文库构建。因此，区域A对应于约78bp-145bp的血浆DNA片段，且区域B对应于约170bp的血浆DNA片段。此类减除可适合用于DNA文库构建的不同方案。例如，在Illumina单端读数测序文库制备过程中，将引入来自适配子/引物组的92bp总大小，而对于标准的双端测序文库制备该大小将为119bp。
在另一实施方案中，血浆DNA可通过本领域技术人员已知的全基因组扩增系统如Rubicon Genomics PlasmaPlex WGA试剂盒(www.rubicongenomics.com/products)进行扩增。然后可通过生物分析仪分析扩增的产物。在其他实施方案中，扩增的产物可通过来自例如Caliper(www.caliperls.com/products/labchip-systems)的电泳系统进行分析。在其他实施方案中，可使用例如，基于纳米孔的测序仪(例如，来自Oxford NanoporeTechnologies(www.nanoporetech.com))或Helico DNA测序仪(www.helicosbio.com)，不经过扩增直接分析血浆DNA的大小分布。
IV.大小参数
如上文所述，多种参数可提供生物样品中DNA片段的大小模式的统计学度量。可使用分析的所有DNA片段或仅一部分的大小定义参数。在一个实施方案中，参数提供了短和长DNA片段的相对丰度，其中所述短和长DNA可对应于特定的大小或大小范围。
为了研究母体血浆DNA的整体大小分布是否可用于反映胎儿DNA浓度分数，我们使用了不同的参数来定量短和长DNA的相对丰度，并确定了这些参数与胎儿DNA浓度分数间的相关性。这些研究的结果提供在以下部分中。为了说明的目的，我们使用的用于反映短DNA的相对丰度的参数包括：
i.150bp或更小DNA片段的比例，其标示为CF(大小≤150))。CF是指累积频率。因此，CF(大小≤150)是指小于或等于150bp的片段的累积频率；
ii.≤150bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量之比，其标示为(CF(大小≤150)/大小(163-169))；
iii.140bp-146bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量之比，其标示为(大小(140-146)/大小(163-169))；
iv.140bp-154bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量之比，其标示为(大小(140-154)/大小(163-169))；和
v.100bp-150bp的DNA片段和163bp-169bp DNA的量之比，其标示为(大小(100-150)/大小(163-169))。
参数的其他实例为柱形图的频率计。在一个实施方案中，可使用多个参数。例如，每个参数的值可给出差异百分比，然后可以确定平均百分比。在另一实施方案中，每个参数对应于多维校准函数的不同维度，其中新样品的参数值对应于相应的多维面上的坐标。
V.大小与浓度分数的相关性
使用测序的两个样品集被用于阐明多种大小参数与浓度分数的相关性。还提供了重复元件大小的分析。电泳数据还显示了大小参数与浓度分数间的相关性。
A.第一样品集
图5A是图500，其显示了根据本发明实施方案，母体血浆中具有多种胎儿DNA百分比的样品的150bp或更小DNA片段的比例。针对80份母体血浆样品，将DNA≤150bp的比例相对于胎儿DNA浓度分数作图。整倍体样品表示为实心圆。13三体(T13)样品表示为空心三角形。18三体(T18)样品表示为空心菱形，且21三体(T21)样品表示为倒空心三角形。
对于所有样品，胎儿DNA浓度分数与DNA≤150bp的比例间存在正相关性(皮尔森相关系数＝0.787)。该大小参数与胎儿DNA浓度分数间的正相关性在具有不同胎儿染色体状态的样品间呈现为一致的。这些结果表明大小参数的分析可用于估算母体血浆样品中的胎儿DNA浓度分数。因此，图5中的数据点可用作方法300的校准数据点。那么，如果新样品的参数CF(大小≤150)确定为30，则胎儿DNA百分比可估算为约7％-16％。图5中的数据点还可用于确定拟合所示的原始数据点的校准函数。
图5B是图550，其显示了≤150bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(CF(大小≤150)/大小(163-169))。针对80份母体血浆样品，将CF(大小≤150)/大小(163-169)比相对于胎儿DNA浓度分数作图。对于所有的样品，胎儿DNA浓度分数与CF(大小≤150)/大小(163-169)比间存在正相关性(皮尔森相关系数＝0.815)。该大小参数与胎儿DNA浓度分数间的正相关性在具有不同胎儿染色体倍性状态的样品间是一致的。
图6A是图600，其显示了140bp-146bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(大小(140-146)/大小(163-169))。针对80份母体血浆样品，将大小(140-146)/大小(163-169)比相对于胎儿DNA浓度分数作图。对于所有样品，胎儿DNA浓度分数与大小(140-146)/大小(163-169)比间存在正相关性(皮尔森相关系数＝0.808)。该大小参数与胎儿DNA浓度分数之间的正相关性在具有不同胎儿染色体倍性状态的样品间是一致的。
图6B是图650，其显示了140bp-154bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(大小(140-154)/大小(163-169))。针对80份母体血浆样品，将大小(140-154)/大小(163-169)比相对于胎儿DNA浓度分数作图。对于所有样品，胎儿DNA浓度分数与大小(140-154)/大小(163-169)比间存在正相关性(皮尔森相关系数＝0.802)。该大小参数与胎儿DNA浓度分数之间的正相关性在具有不同胎儿染色体倍性状态的样品间呈现为一致的。
图7是图700，其显示了100bp-150bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(大小(100-150)/大小(163-169))。针对80份母体血浆样品，将大小(100-150)/大小(163-169)比相对于胎儿DNA浓度分数作图。对于所有样品，胎儿DNA浓度分数与大小(100-150)/大小(163-169)比间存在正相关性(皮尔森相关系数＝0.831)。该大小参数与胎儿DNA浓度分数之间的正相关性在具有不同胎儿染色体倍性状态的样品间是一致的。
B.第二样品集
图8是图800，其显示了根据本发明实施方案，母体血浆中具有多种胎儿DNA百分比的样品的150bp或更小的DNA片段的比例。针对48份母体血浆样品，将DNA≤150bp的比例相对于胎儿DNA浓度分数作图，所述样品在靶标富集后进行大规模并行双端测序。整倍体样品表示为实心圆。13三体(T13)样品表示为空心三角形。18三体(T18)样品表示为空心菱形，且21三体(T21)样品表示为倒空心三角形。对于所有的样品，胎儿DNA浓度分数与DNA≤150bp的比例间存在正相关性(皮尔森相关系数＝0.816)。该大小参数与胎儿DNA浓度分数之间的正相关性在具有不同胎儿染色体状态的样品间是一致的。这些结果表明大小参数的分析可用于估算母体血浆样品中的胎儿DNA浓度分数。
图9A是图900，其显示了≤150bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(CF(大小≤150)/大小(163-169))。针对48份母体血浆样品，将CF(大小≤150)/大小(163-169)比相对于胎儿DNA浓度分数作图。对于所有样品，胎儿DNA浓度分数与CF(大小≤150)/大小(163-169)比间存在正相关性(皮尔森相关系数＝0.776)。该大小参数与胎儿DNA浓度分数之间的正相关性在具有不同胎儿染色体倍性状态的样品间是一致的。
图9B是图950，其显示了140bp-146bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(大小(140-146)/大小(163-169))。针对48份母体血浆样品，将大小(140-146)/大小(163-169)比相对于胎儿DNA浓度分数作图。对于所有样品，胎儿DNA浓度分数与大小(140-146)/大小(163-169)比间存在正相关性(皮尔森相关系数＝0.790)。该大小参数与胎儿DNA浓度分数之间的正相关性在具有不同胎儿染色体倍性状态的样品间是一致的。
图10A是图1000，其显示了140bp-154bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(大小(140-154)/大小(163-169))。针对48份母体血浆样品，将大小(140-154)/大小(163-169)比相对于胎儿DNA浓度分数作图。对于所有样品，胎儿DNA浓度分数与大小(140-154)/大小(163-169)比间存在正相关性(皮尔森相关系数＝0.793)。该大小参数与胎儿DNA浓度分数之间的正相关性在具有不同胎儿染色体倍性状态的样品间是一致的。
图10B是图1005，其显示了100bp-150bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(大小(100-150)/大小(163-169))。针对48份母体血浆样品，将大小(100-150)/大小(163-169)比相对于胎儿DNA浓度分数作图。对于所有样品，胎儿DNA浓度分数与大小(100-150)/大小(163-169)比间存在正相关性(皮尔森相关系数＝0.798)。该大小参数与胎儿DNA浓度分数之间的正相关性在具有不同胎儿染色体倍性状态的样品间是一致的。
C.重复
在上文，我们已证明母体血浆中的所有可映射的DNA片段的大小与胎儿DNA浓度分数相关。在本节中，我们研究了基因组中重复元件的大小的分析是否也能够用于估算血浆中的胎儿DNA浓度分数。在本实例中，我们分析了映射至基因组的Alu重复的DNA片段的大小分布。
图11的图显示了根据本发明实施方案，对于所示大小的重复元件，大小比相对于胎儿DNA百分比作图。该实例使用100bp-150bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的比(大小(100-150)/大小(163-169))来反映大小分布相对胎儿DNA百分比的改变。该大小比与胎儿DNA浓度分数间存在正相关性(皮尔森相关系数＝0.829)。该结果表明重复元件的大小分析也可用于确定母体样品中的胎儿DNA浓度分数。
除了使用大规模并行测序，其他方法如PCR、实时PCR和质谱分析也可用于确定母体血浆中重复元件(例如，Alu重复)的大小分布。在一个实施方案中，可将母体血浆样品中的DNA连接至接头。然后，可使用一种Alu序列特异性引物和另一种接头特异性引物进行PCR。在PCR后，可分析PCR产物的大小，例如通过电泳、质谱或大规模并行测序。这将允许读取母体血浆中来源于Alu重复的序列的大小。该策略可用于其他靶标序列或序列家族。此外，PCR之后可进行巢式PCR，其涉及另一Alu特异性引物，结合相同的接头特异性引物或接头内部的巢式引物。此类巢式PCR具有的优势为能增加针对目标序列(该情况下为Alu序列)的扩增特异性。
使用重复元件的一个优势为它们具有相对高的拷贝数，因此它们可能更易于进行分析。例如，可能能够使用较少的扩增循环。另外，具有较高的拷贝数，其分析精确度可能更高。潜在的劣势为某些类型的重复元件可能在个体间具有不同的拷贝数。
D.电泳
图12A是电泳图1200，其根据本发明实施方案可用于确定大小比。对于所有分析的DNA文库，在约292bp处存在尖锋，其后的第二个峰范围为300bp-400bp。由于大小范围曲线下的面积可以代表来自该区域的DNA片段的相对量，我们使用区域A(200bp-267bp)与B(290bp-294bp)的面积比定量短和长DNA片段的相对丰度。我们首先手动地将荧光单位(FU)的基线调整至0，然后生成所选区域的面积。
图12B是图1250，其显示了根据本发明实施方案，母体血浆中具有多种胎儿DNA百分比的样品的200bp-267bp的DNA片段与290bp-294bp DNA的量的大小比(即，电泳图上显示的区域A和B的面积比)。存在一个T13个例，其显示低的292-bp峰，FU值为6.1，而所有其他个例均显示FU值≥20FU。由于低FU值会使得面积测量不精确，在分析中忽略了该个例。针对所有其他79份母体血浆样品，将区域A和B的面积比相对于胎儿DNA浓度分数作图。对于这些样品，胎儿DNA浓度分数与面积A和B的比间存在正相关性(皮尔森相关系数＝0.723)。
VI.确定校准数据点
如上文所述，校准数据点可以多种方式定义。另外，校准数据点可以多种方式获得。例如，可简单地从存储器将校准数据点读取为参数以及相应的浓度分数的一系列的校准值。同样，可从存储器(例如，具有预定函数形式的线性或非线性函数)读取校准函数，其中所述函数定义校准数据点。在一些实施方案中，可从校准样品测得的数据计算校准数据点。
A.方法
图13是根据本发明实施方案，由校准样品产生的测量结果确定校准数据点的方法1300的流程图。校准样品包含临床相关的DNA和其他DNA。
在方框1310中，接收了多个校准样品。校准样品可按本文所述获得。可通过单独的实验或通过一些确定分子来自哪个样品的鉴定方法(例如，为DNA片段标上条码)，单独对每个样品进行分析。例如，可将校准样品接收于仪器，例如，测序仪，其输出可用于确定DNA片段大小的测量数据(例如，序列读数)，或将其接收于电泳仪。
在方框1320中，测量了多个校准样品中的每个的临床相关DNA的浓度分数。在测量胎儿DNA浓度的多个实施方案中，可使用父本遗传的序列或胎儿特异性表观遗传标志物。例如，父本遗传的等位基因不存在于孕妇的基因组中，且能够以与胎儿DNA浓度分数成比例的百分比在母体血浆中检测到。胎儿特异性表观遗传标志物可包括母体血浆中展现胎儿或胎盘特异性DNA甲基化模式的DNA序列。
在方框1330中，测量来自每个校准样品的多种大小的DNA片段的量。大小可按本文所述的进行测量。可对大小计数、作图，用于制作柱形图或其他分选程序，以获得有关校准样品大小模式的数据。
在方框1340中，基于多种大小的DNA片段的量，计算参数的校准值。可计算每个校准样品的校准值。在一个实施方案中，将相同的参数用于每个校准值。然而，实施方案可使用本文所述的多个参数。例如，小于150个碱基的DNA片段的累积分数可用作参数，且具有不同浓度分数的样品可能具有不同的校准值。可以确定每个样品的校准数据点，其中所述校准数据点包括校准值和测得的样品的浓度分数。这些校准数据点可用于方法300，或可用于确定最终的校准数据点(例如，如通过函数拟合定义的)。
在方框1350中，确定了近似于多个浓度分数间的校准值的函数。例如，可将线性函数拟合至校准值，作为浓度分数的函数。线性函数可定义将在方法300中使用的校准数据点。
在一些实施方案中，可以计算每个样品的多个参数的校准值。样品的校准值可定义多维坐标(其中每个维度用于每个参数)，其联合浓度分数可提供数据点。因此，在一个实施方案中，可将多维函数拟合至所有的多维数据点。因此，可使用多维校准曲线，其中不同的参数值可被有效地输入至能够输出浓度分数的单个校准函数。并且，单个校准函数可产生自所有获自校准样品的数据点的函数拟合。
B.测量肿瘤DNA浓度
如同所述的，实施方案还可应用于生物样品中肿瘤DNA的浓度。接下来为涉及确定肿瘤DNA的浓度分数的实例。
我们从肿瘤手术切除之前和之后的两名患有肝细胞癌(HCC)的患者采集了血浆样品。使用双端(PE)大规模并行测序进行大小分析。按先前所述构建母体血浆DNA的测序文库(Lo YM et al.Sci Transl Med 2010；2:61ra91)。所有的文库均通过HiSeq 2000(Illumina)使用50-bp×2PE格式测序。使用短核苷酸比对程序2(SOAP2)(soap.genomics.org.cn)，将50-bp序列读数与非重复掩蔽的人参照基因组(Hg18)(http://genome.ucsc.edu)进行比对。每个测序片段的大小自比对片段每端的最外面的核苷酸的坐标推导而来。
我们使用Affymetrix SNP6.0微阵列系统，对提取自HCC患者的血细胞和肿瘤样品的DNA的进行基因型分型。对于每个个例，使用Affymetrix Genotyping Console v4.0，基于SNP基因座的不同等位基因的强度，确定了肿瘤组织中展现杂合性丢失(LOH)的区域。使用下式从LOH区域中携带缺失的和未缺失的等位基因的序列的量的差异，估算了肿瘤来源DNA的浓度分数(F)：F＝(A–B)/A x 100％，其中A是LOH区域中携带杂合SNP的未缺失等位基因的序列读数的数量，并且B是LOH区域中携带杂合SNP的缺失等位基因的序列读数的数量。表3显示了其结果。
表3显示了血浆样品中肿瘤DNA的测序信息和测得的浓度分数。
在另一实施方案中，可使用展现重复的基因座。例如，肿瘤可展现两条同源染色体中的一条增加一个拷贝，使得等位基因重复。然后，可以确定一个或多个杂合基因座(例如，SNP)处具有非重复等位基因的序列读数的第一量A，以及杂合基因座处具有重复等位基因的序列读数的第二量B。可使用比值(B–A)/A，将临床相关DNA的浓度分数F计算为第一量与第二量之比。
在另一实施方案中，可使用一个或多个纯合基因座。例如，可以确定一个或多个这样的基因座：其中患者是纯合的，并且其中肿瘤组织中存在单核苷酸突变。然后，可以确定一个或多个纯合基因座处具有野生型等位基因的序列读数的第一量A。并且，可以确定一个或多个纯合基因座处具有突变等位基因的序列读数的第二量B。可以使用比例2B/(A+B)，将临床相关DNA的浓度分数F计算为第一量与第二量之比。C.数据点的函数拟合的实例
现在描述进行从校准样品确定的参数值的函数拟合的实例。分析了来自80名孕妇(每名怀有一个男性胎儿)的血浆样品。在这80名孕妇中，39名怀有整倍体胎儿，13名怀有13三体(T13)胎儿，10名怀有18三体(T18)胎儿，且18名怀有21三体(T21)胎儿。这些孕妇的中值孕龄为13周加1天。从血浆样品提取DNA，并使用Illumina HiSeq2000平台按照所述的测序(Zheng YW et al.Clin Chem.2012；58:549-58)，除了测序以8倍格式进行。对于每个DNA分子，从两端中的每端测序50个核苷酸，并与参照基因组(hg18)比对。
然后从两端最外面核苷酸的坐标推导每个测序分子的大小。对于每个样品，测序了中值为1.11千万的片段，并唯一地与参照基因组对齐。通过将100bp-150bp大小的DNA分子的比例除以163bp-169bp大小的DNA分子的比例，计算比值，并且该比值称为大小比。由于所有80名孕妇均怀有男性胎儿，将与Y染色体唯一对齐的序列读数的比例用于确定每个血浆DNA样品中胎儿DNA的浓度分数。
将样品随机分成2组，即训练组和验证组。使用线性回归，基于训练组中的样品，确立胎儿DNA浓度分数与大小比间的关系。然后，使用线性回归公式，将大小比用于推导验证组的胎儿DNA浓度分数。验证在下一节中论述。
图14A是根据本发明实施方案，针对训练组，大小比相对于胎儿DNA浓度分数的图1400。如上文所述，通过将100bp-150bp大小的DNA分子的比例除以163bp-169bp大小的DNA分子的比例，计算大小比。将大小比针对胎儿DNA的浓度分数作图，如数据点1405所示。空心圆代表整倍体个例。实心符号代表非整倍性个例(正方形为T13，圆为T18，且三角形为T21)。线性回归线1410由对数据点的函数拟合来产生。可通过任何合适的技术，例如，最小二乘法，进行函数拟合。线1410可用于估算测量的其他样品而非训练组样品的参数的值。线1410的每一部分可被认为是一个校准数据点。
VII.与校准数据点的比较
如上文所述，校准数据点可用于确定临床相关DNA的浓度分数。例如，图14A中的原始数据点1405可用于提供特定校准值的DNA浓度分数(图14A中标记为大小比)的范围，其中所述范围可用于确定浓度分数是否大于阈值量。代替范围，可使用特定大小比的浓度分数平均值。例如，可将对应于新样品的1.3的大小比的测量结果的浓度分数，确定为从1.3的两个数据点计算的平均浓度。在一个实施方案中，可使用函数拟合(例如，线1410)。
图14B是根据本发明实施方案，从图14A的线性函数1410推导(估算)的浓度分数相对于使用胎儿特异性序列测得的浓度分数的图1450。使用基于训练组的数据确定的回归方程(即，线1410)，将确定的验证样品的大小比用于推导验证组样品的胎儿DNA浓度分数。测量的浓度分数对应于血浆DNA样品中Y染色体序列的比例(即，对齐Y染色体的序列读数的比例)。
线1460代表了两组值间的完全相关。数据点1455的偏差表示估算的精确度，线1460上的点是完全精确的。如本文所述，估算不必为完全精确的，因为所需的检测可能仅是为了确定生物样品中是否存在足够百分比的临床相关DNA。空心圆代表整倍体个例。实心符号代表非整倍性个例(正方形为T13，圆为T18，且三角形为T21)。从大小比推导的胎儿DNA浓度分数与从Y染色体序列的比例测得的浓度分数间的中值差异为2.1％。在90％的样品中，差异小于4.9％。
将具有不同倍性状态的样品用于校准组和验证组。如图14A中所示，大小比与胎儿DNA浓度分数间的关系在具有不同倍性状态的样品间是一致的。因此，可在没有关于样品倍性状态的先前了解的情况下，从样品的大小比推导出胎儿DNA浓度分数，如图14B所示。一条校准曲线可用于具有不同倍性状态的样品，因此，我们在使用实施方案确定胎儿DNA浓度分数前不需要知道样品的倍性状态。
VIII.癌症
如本文所述，实施方案可用于评估生物样品中肿瘤DNA的浓度分数。如同胎儿实例，校准样品可用于确定相关性数据点，例如，通过将函数(例如，线性函数)拟合至显示大小参数值与测得的浓度分数间的相关性的数据点。
A.大小与肿瘤DNA浓度的相关性
图15A是图1500，其显示了根据本发明实施方案，肿瘤切除之前和之后的两名HCC患者的血浆中具有多种肿瘤DNA百分比的样品的150bp或更小的DNA片段的比例。针对肿瘤切除之前(实心圆)和之后(空心圆)的两名HCC患者，将DNA≤150bp的比例相对于肿瘤DNA浓度分数作图。两个空心圆在位置上彼此非常接近(实际上在彼此上面)。这些结果表明大小参数的分析可用于估算HCC患者血浆样品中的肿瘤DNA浓度分数。肿瘤切除后肿瘤DNA浓度分数和≤150bp DNA片段的比例均下降。实心圆1505对应于具有低得多的肿瘤DNA百分比(其与较小的肿瘤大小相关)的样品。换句话说，具有较大肿瘤的患者具有较高比例的短DNA，其体现在相比具有较小肿瘤的患者的较高比值的CF(≤150bp)。
图15B是图1550，其显示了肿瘤切除之前和之后的两名HCC患者的≤150bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(CF(大小≤150)/大小(163-169))。针对肿瘤切除之前(实心圆)和之后(空心圆)的两名HCC患者，将CF(大小≤150)/大小(163-169)比相对于肿瘤DNA浓度分数作图。两个空心圆在位置上彼此非常接近。肿瘤切除后肿瘤DNA浓度分数和大小比均下降。
图16A是图1600，其显示了肿瘤切除之前和之后的两名HCC患者的140bp-146bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(大小(140-146)/大小(163-169))。针对肿瘤切除之前(实心圆)和之后(空心圆)的两名HCC患者，将大小(140-146)/大小(163-169)比相对于肿瘤DNA浓度分数作图。肿瘤切除后肿瘤DNA浓度分数和大小比均下降。
图16B是图1650，其显示了肿瘤切除之前和之后的两名HCC患者的140bp-154bp的DNA片段与163bp-169bp的DNA的量的大小比，标示为(大小(140-154)/大小(163-169))。针对肿瘤切除之前(实心圆)和之后(空心圆)的两名HCC患者，将大小(140-154)/大小(163-169)比相对于肿瘤DNA浓度分数作图。肿瘤切除后肿瘤DNA浓度分数与大小比均下降。
图17是图1700，其显示了肿瘤切除之前和之后的两名HCC患者的100bp-150bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(大小(100-150)/大小(163-169))。针对肿瘤切除之前(实心圆)和之后(空心圆)的两名HCC患者，将大小(100-150)/大小(163-169)比相对于肿瘤DNA浓度分数作图。肿瘤切除后肿瘤DNA浓度分数与大小比均下降。
B.治疗引起的大小下降
图18A是图1800，其显示了肿瘤切除之前和之后的HCC患者的150bp或更小的DNA片段的比例。来自同一癌症患者的一对样品表示为通过虚线连接的相同的符号。肿瘤切除后的癌症患者中血浆DNA的DNA≤150bp的比例整体下降。
治疗前和治疗后比例值的间隔证明了肿瘤存在与大小参数值间的相关性。治疗前和治疗后的值的间隔可用于确定治疗的成功度，例如，通过将该比例与阈值比较，其中低于阈值的比例可指示成功。在另一个实例中，可将治疗前和治疗后间的差异与阈值比较。
还可将比例(或大小参数的任何其他值)用于检测肿瘤的出现。例如，可以确定大小参数的基线值。然后，在晚些时候，可再次测量大小参数的值。如果大小参数的值显示显著改变，则患者可能存在患有肿瘤的较高风险。如果大小参数的值在个体间变化不大(图18A表明比例变化不大(即，因为治疗后的值是相同的))，则可将相同的基线值用于其他患者。因此，不需要采集每名患者的基线值。
图18B是图1850，其显示了肿瘤切除之前和之后的HCC患者的≤150bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(CF(大小≤150)/大小(163-169))。来自同一癌症患者的一对样品表示为通过虚线连接的相同的符号。肿瘤切除后两例的该大小比均下降。
图19A是图1900，其显示了肿瘤切除之前和之后的HCC患者的140bp-146bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(大小(140-146)/大小(163-169))。来自同一癌症患者的一对样品表示为通过虚线连接的相同的符号。肿瘤切除后两例的该大小比均下降。
图19B是图1950，其显示了肿瘤切除之前和之后的HCC患者的140bp-154bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(大小(140-154)/大小(163-169))。来自同一癌症患者的一对样品表示为通过虚线连接的相同的符号。肿瘤切除后两例的该大小比均下降。
图20是图2000，其显示了肿瘤切除之前和之后的HCC患者的100bp-150bp的DNA片段与163bp-169bp DNA的量的大小比，标示为(大小(100-150)/大小(163-169))。来自同一癌症患者一对样品的表示为通过虚线连接的相同的符号。肿瘤切除后两例的该大小比均下降。
C.方法
图21是流程图，其阐示了根据本发明实施方案，分析生物体的生物样品以确定癌症等级分级的方法2100。方法2100可分析生物体(例如，人)的生物样品。生物样品包含源自正常细胞和可能来自癌症相关细胞的DNA。所述DNA中的至少一些为生物样品中无细胞的。方法300和1300的方面可与方法2100的实施方案一起使用。
在方框2110中，测量对应于多种大小的DNA片段的量。对于多种大小中的每种大小，可以测量来自生物样品的对应于所述大小的多个DNA片段的量，如方法300所述。所述多个DNA片段可随机挑选，或优选地从基因组的一个或多个预定区域挑选。例如，可进行靶向富集，或者可使用来自基因组的特定区域的序列读数的选择，例如，如上文所述的。
在方框2120中，基于多种大小的DNA片段的量，计算第一参数的第一值。在一个方面，第一参数提供了生物样品中DNA片段的大小模式的统计学度量(例如，柱形图)。参数可称为大小参数，因为其从多个DNA片段的大小确定而来。本文提供了参数的实例。可使用多个参数，其在本文中也有描述。
在方框2130中，将第一值与参考值比较。参考值的实例包括正常值和与正常值具有指定距离(例如，采用标准偏差的单位)的截止值。可从来自相同生物体(例如，当已知该生物体健康时)的不同样品确定参考值。因此，参考值可对应于当推测生物体未患癌症时从样品确定的第一参数的值。在一个实施方案中，生物样品获自治疗后的生物体，且参考值对应于从治疗前采集的样品确定的第一参数的值(例如，如上所述的)。还可从其他健康生物体的样品确定参考值。
在方框2140中，基于所述比较确定生物体中的癌症等级的分级。在多个实施方案中，分级可为数值的、文本的或任何其他指标。分级可提供关于癌症的是或否的二元结果、可能性或其他得分，其可为绝对值或相对值，例如，相对于早些时候生物体的先前的分级。在一个实施方案中，分级为生物体未患癌症，或者癌症等级降低。在另一实施方案中，分级为生物体确实患有癌症，或癌症等级增加。
如本文所述，癌症等级可包括癌症存在、癌症阶段或肿瘤大小。例如，第一值超标(例如，大于或小于，取决于第一参数如何定义)是否可用于确定是否存在癌症，或至少一种可能性(例如，百分比可能性)。超过阈值的程度可提供增加的可能性，其可导致使用多个阈值。另外，超过的程度可对应于不同的癌症等级，例如，更多的肿瘤或更大的肿瘤。因此，实施方案可诊断、定级、预测或监测生物体中癌症等级的进展。
D.确定特定区域的大小分布
如同其他实施方案，第一组DNA片段可对应于生物体基因组的一个或多个预定区域。因此，还可对选定区域进行大小分析，例如，特定染色体、染色体臂或相同长度例如1Mb的多个区域(单元格)。例如，可以聚焦于目标癌症类型中通常发生改变的区域。图22的表2200显示了可见于多种类型的癌症中的一些常见的染色体畸变。获得是指特定节段中具有一个或多个另外拷贝的染色体的扩增，丢失是指特定节段中一个或两个同源染色体的缺失。
在一个实施方案中，可从生物样品确定其他组的DNA片段。每组DNA片段可对应于不同的预定区域，如表2200中所示的区域。还可使用与癌症不相关的区域，例如，用以确定参考值。可以确定对应于多种大小的DNA片段的量，并且可以确定每个其他组DNA片段的参数的大小值，如本文所述。因此，可以确定每个基因组区域的不同的大小值，其中一组DNA片段与基因组区域间存在一一对应的关系。
可将每个大小值与各自的参考值比较。可以确定这样的预定区域：其中对应的大小值相比各自的参考值存在统计学差异。当参考值为正常值时，可通过比较大小值与截止值(例如，其中截止值为基于假定的或测量的统计学分布，与正常值的标准偏差的具体数字)，进行统计学差异的确定。不同区域各自的参考值可以是相同的或不同的。例如，不同的区域可具有不同的大小正常值。
在一个实施方案中，相比参考值具有统计学差异的区域数目可用于确定分级。因此，可以确定鉴定其中相应的大小值相比各自的参考值具有统计学差异的预定区域的数目。可将该数目与区域的阈值数比较来确定生物体中癌症等级的分级。可以基于正常样品中和癌症样品中的方差确定阈值数。
如表2200中所突出显示的，不同的癌症与基因组的不同的部分相关。因此，当可能的癌症类型与鉴定的区域相关时，可将具有统计学差异的区域用于确定一种或多种可能的癌症类型。例如，如果发现来自染色体节段7p的DNA片段的大小值显著低于正常值(例如，如通过截止值所确定的)，当分级表明存在癌症时，则将结肠直肠癌确定为可能的癌症。应当注意染色体节段7p的大小值可用作确定分级的唯一指标，或可使用多个区域。在一个实施方案中，仅在整体分级指示癌症时，才会将染色体节段7p的大小值用于确定结肠直肠癌为可能的癌症。
IX.计算机系统
本文提及的任何计算机系统可以使用任何合适数量的子系统。此类子系统的实例示于图23的计算机设备2300中。在一些实施方案中，计算机系统包括单一的计算机设备，其中子系统可以为计算机设备的部件。在其他的实施方案中，计算机系统可以包括多个具有内部部件的计算机设备(每个为子系统)。
图23所示的子系统通过系统总线2375相互连接。示出与显示适配器2382耦合的其他子系统，例如打印机2374、键盘2378、硬盘2379、监控器2376等。外部和输入/输出(I/O)装置(其与I/O控制器2371耦合)可以通过本领域已知的任意数量的手段(例如串行端口2377)与计算机系统连接。例如，串行端口2377或外部界面2381(例如Ethernet、Wi-Fi等)可以用于将计算机系统2300与诸如Internet的广域网路、滑鼠输入装置或扫描器连接。通过系统总线2375的相互连接允许中央处理器2373与各个子系统连通，并控制来自系统存储器2372或硬盘2379的指令的执行，以及子系统之间的信息交换。系统存储器2372和/或硬盘2379可以表现为计算机可读介质。本文提及的任何值都可以由一个部件输出至另一个部件，并可以输出给用户。
计算机系统可以包括例如通过外部界面2381或通过内部界面连接在一起的多个相同的部件或子系统。在一些实施方案中，计算机系统、子系统或设备可以在网络上连通。在这种情况下，一个计算机可以被认为是客户端，而另一个计算机为服务器，其中它们均可以为同一计算机系统的一部分。客户端和服务器均可以包括多个系统、子系统或部件。
应该理解的是，本发明的任意实施方案均可以使用硬件(例如，专用集成电路或现场可编程门阵列)以控制逻辑的形式实施和/或使用具有通用的可编程处理器的计算机软件以模块或集成的方式实施。基于本文所提供的公开和教导，本领域的普通技术人员将了解并领会使用硬件以及硬件和软件的组合来实施本发明的实施方案的其他方式和/或方法。
本申请中所描述的任意软件部件或功能都可以作为使用例如传统或面向对象的技术、使用任何合适的计算机语言(例如Java,C++或Perl)通过处理器执行的软件代码来实施。软件编码可以在用于储存和/或传输的计算机可读介质上以一系列指令或命令的形式储存，合适的介质包括随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、磁介质(例如硬盘驱动器或软盘)、或光学介质(例如光盘(CD)或DVD(数字通用光盘))、闪存等。计算机可读介质可以为此类存储或传输装置的任意组合。
此类程序还可以使用适用于通过有线、光学和/或无线网络(遵守多种协议，包括Internet)传输的载波信号来编码和传输。由此，可以使用由此类程序编码的数据信号来创建根据本发明的实施方案的计算机可读介质。使用程序代码所编码的计算机可读介质可以使用相容的装置包装，或者与其他装置分开提供(例如通过Internet下载)。任意此类的计算机可读介质可以属于或者在单一的计算机程序产品(例如硬盘驱动器、CD或整个计算机系统)内，并且可以在系统或网络内的不同计算机程序产品上或该产品内存在。计算机系统可以包括监控器、打印机或用于向用户提供本文所提及的任意结果的其他合适的显示器。
本文所述的任何方法可以使用计算机系统(包括一个或多个处理器)全部或部分实施，所述系统可以被配置成实施多个步骤。因此，多个实施方案可以涉及计算机系统，该系统被配置成潜在地使用实施各个步骤或各组步骤的不同部件来实施本文所述的任意方法的步骤。尽管本文所述的方法步骤以编号的步骤呈现，但是这些方法的步骤可以同时或以不同的次序实施。此外，这些步骤的一部分可以与其他方法的其他步骤的一部分一起使用。此外，步骤的全部或一部分可以是任选的。此外，任意方法的任意步骤可以使用模块、电路或用于实施这些步骤的其他手段来实施。
在不脱离本发明实施方案的精神和范围的条件下，特定实施方案的具体详情可以以任何合适的方式组合。但是，本发明的其他实施方案可以涉及与各单一的方面或这些单一方面的特定组合相关的特定实施方案。
为了说明和描述的目的，已经呈现本发明的示例性实施方案的上述描述。无意于穷举或将本发明限定于所述的精确形式，并且根据上文的教导，许多修改和变化也是可能的。选择并描述多个实施方案，以便最好地说明本发明的原理及其实践应用，由此使本领域的技术人员能够在多个实施方案以及各种修改(其适用于所考虑的特定用途)中最好地利用本发明。
除非明确作出相反的说明，描述“一个(a)”、“一(an)”或“所述(the)”意指“一个或多个”。
上文提及的所有专利、专利申请、出版物和描述在此以引用方式全文并入本文，用于所有的目的。这些文件均未确认为现有技术。

Claims (52)

1.估算生物样品中临床相关DNA的浓度分数的非疾病诊断目的方法，所述生物样品包含所述临床相关DNA和其他DNA，所述方法包括：
对于多种大小中的每种大小：
测量来自所述生物样品的对应于所述大小的多个DNA片段的量；
使用计算机系统，基于多种大小的DNA片段的量，计算第一参数的第一值，所述第一参数提供了所述生物样品中DNA片段大小模式的统计学度量，其中将所述第一参数标准化；
获得一个或多个第一校准数据点，其中每个第一校准数据点指定了对应于所述第一参数校准值的临床相关DNA的浓度分数，并且其中所述一个或多个校准数据点自多个校准样品确定而来；
将所述第一值与至少一个校准数据点的校准值比较；以及
基于所述比较，估算所述生物样品中临床相关DNA的浓度分数。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述多个DNA片段对应于基因组的一个或多个预定区域。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述第一参数代表相对于大DNA片段丰度的小DNA片段丰度，并且其中短DNA片段具有比所述大DNA片段更小的大小。
4.如权利要求1所述的方法，还包括
基于多种大小的DNA片段的量，计算一个或多个第二参数的一个或多个第二值，所述一个或多个第二参数提供了所述生物样品中DNA片段大小模式的不同统计学度量；
获得对应于所述一个或多个第二参数的一个或多个第二校准数据点；
将所述一个或多个第二值与所述第二校准数据点的对应的第二校准值比较；并且
基于涉及所述第一值和所述一个或多个第二值的比较，估算所述生物样品中临床相关DNA的浓度分数。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述第一校准数据点和所述第二校准数据点是多维曲线上的点，并且所述比较包括确定具有对应于所述第一值和所述一个或多个第二值的坐标的多维点。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述第一校准数据点形成校准曲线。
7.如权利要求1所述的方法，其中每个第一校准数据点自对应于不同校准样品的柱形图确定而来，其中柱形图提供了多种大小DNA片段的量，并且其中所述不同校准样品的至少一部分具有不同的浓度分数。
8.如权利要求1所述的方法，其中测量对应于所述大小的DNA片段的量包括：
对于来自所述生物样品的多个DNA片段中的每个：
测量所述DNA片段的大小，
其中测量DNA片段的大小包括：
接收获自所述DNA片段的测序的一个或多个序列读数；
将所述一个或多个序列读数与参照基因组比对以获得所述DNA片段的两端的比对的位置；以及
使用所述比对的位置确定所述DNA片段的大小。
9.如权利要求1所述的方法，其中测量对应于所述大小的DNA片段的量包括使用电泳。
10.如权利要求1所述的方法，还包括：
通过如下计算所述一个或多个第一校准数据点：
对于所述多个校准样品中的每个：
测量所述校准样品中临床相关DNA的浓度分数；
测量对应于所述多种大小的DNA片段的量；以及
基于多种大小DNA片段的量，计算所述第一参数的校准值，所述校准样品的校准数据点包括所述校准值和测量的浓度分数。
11.如权利要求10所述的方法，还包括：
确定函数，其近似于所述第一校准数据点在多个浓度分数间的校准值。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述函数为线性函数。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述生物样品来自怀有胎儿的孕妇，其中所述临床相关的DNA为胎儿DNA，并且其中测量临床相关DNA的浓度分数包括以下的至少一种：
测量所述孕妇基因组中不存在的父本遗传的序列；和
测量胎儿特异性的表观遗传标志物。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述胎儿特异性表观遗传标志物包括母体血浆或血清中的展现胎儿或胎盘特异性DNA甲基化模式的DNA序列。
15.如权利要求10所述的方法，其中所述临床相关的DNA为源自获取生物样品的患者肿瘤的DNA。
16.如权利要求15所述的方法，其中测量临床相关DNA的浓度分数包括：
鉴定一个或多个基因座，其中所述患者为杂合的，并且其中所述肿瘤展现杂合性丢失(LOH)使得等位基因缺失；
确定所述生物样品中所述一个或多个基因座处，具有未缺失的等位基因的序列读数的第一量A；
确定所述生物样品中所述一个或多个基因座处，具有缺失的等位基因的序列读数的第二量B；以及
使用比例(A–B)/A将临床相关DNA的浓度分数F计算为所述第一量与所述第二量之比。
17.如权利要求15所述的方法，其中测量临床相关DNA的浓度分数包括：
鉴定一个或多个基因座，其中所述患者为杂合的，并且其中所述肿瘤展现一个等位基因的重复；
确定所述生物样品中所述一个或多个基因座处，具有非重复等位基因的序列读数的第一量A；
确定所述生物样品中所述一个或多个基因座处，具有重复等位基因的序列读数的第二量B；以及
使用比例(B–A)/A将临床相关DNA的浓度分数F计算为所述第一量与所述第二量之比。
18.如权利要求15所述的方法，其中测量临床相关DNA的浓度分数包括：
鉴定一个或多个基因座，其中所述患者为纯合的，并且其中肿瘤组织中存在单核苷酸突变；
确定所述生物样品中所述一个或多个基因座处，具有野生型等位基因的序列读数的第一量A；
确定所述生物样品中所述一个或多个基因座处，具有突变等位基因的序列读数的第二量B；
使用比例2B/(A+B)将临床相关DNA的浓度分数F计算为所述第一量与所述第二量之比。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述测量的大小为长度、分子量或与长度成比例的测量参数。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述多种大小中的至少一种对应于范围。
21.计算机系统，其用于估算生物样品中临床相关DNA的浓度分数，所述生物样品包含所述临床相关的DNA和其他DNA，所述计算机系统包括：
对于多种大小中的每种大小：
测量来自所述生物样品的对应于所述大小的多个DNA片段的量的装置；
基于多种大小的DNA片段的量，计算第一参数的第一值的装置，所述第一参数提供了所述生物样品中DNA片段的大小模式的统计学度量，其中将所述第一参数标准化；
获得一个或多个第一校准数据点的装置，其中每个第一校准数据点指定了对应于所述第一参数的校准值的临床相关DNA的浓度分数，并且其中所述一个或多个校准数据点自多个校准样品确定而来；
将所述第一值与至少一个校准数据点的校准值比较的装置；以及
基于所述比较，估算所述生物样品中临床相关DNA的浓度分数的装置。
22.如权利要求21所述的计算机系统，其中所述多个DNA片段对应于基因组的一个或多个预定区域。
23.如权利要求21所述的计算机系统，其中所述第一参数代表相对于大DNA片段丰度的小DNA片段丰度，并且其中短DNA片段具有比所述大DNA片段更小的大小。
24.如权利要求21所述的计算机系统，还包括
基于多种大小的DNA片段的量，计算一个或多个第二参数的一个或多个第二值的装置，所述一个或多个第二参数提供了所述生物样品中DNA片段大小模式的不同统计学度量；
获得对应于所述一个或多个第二参数的一个或多个第二校准数据点的装置；
将所述一个或多个第二值与所述第二校准数据点的对应的第二校准值比较的装置；和
基于涉及所述第一值和所述一个或多个第二值的比较，估算所述生物样品中临床相关DNA的浓度分数的装置。
25.如权利要求24所述的计算机系统，其中所述第一校准数据点和所述第二校准数据点是多维曲线上的点，并且所述比较包括确定具有对应于所述第一值和所述一个或多个第二值的坐标的多维点。
26.如权利要求21所述的计算机系统，其中所述第一校准数据点形成校准曲线。
27.如权利要求21所述的计算机系统，其中每个第一校准数据点自对应于不同校准样品的柱形图确定而来，其中柱形图提供了多种大小DNA片段的量，并且其中所述不同校准样品的至少一部分具有不同的浓度分数。
28.如权利要求21所述的计算机系统，其中测量对应于所述大小的DNA片段的量包括使用电泳。
29.如权利要求21所述的计算机系统，还包括：
通过如下计算所述一个或多个第一校准数据点的装置：
对于所述多个校准样品中的每个：
测量所述校准样品中临床相关DNA的浓度分数；
测量对应于所述多种大小的DNA片段的量；以及
基于多种大小DNA片段的量，计算所述第一参数的校准值，所述校准样品的校准数据点包括所述校准值和测量的浓度分数。
30.如权利要求29所述的计算机系统，还包括：
确定函数的装置，所述函数近似于所述第一校准数据点在多个浓度分数间的校准值。
31.如权利要求30所述的计算机系统，其中所述函数为线性函数。
32.如权利要求29所述的计算机系统，其中所述生物样品来自怀有胎儿的孕妇，其中所述临床相关的DNA为胎儿DNA，并且其中测量临床相关DNA的浓度分数的装置包括以下的至少一种：
测量所述孕妇基因组中不存在的父本遗传的序列的装置；和
测量胎儿特异性的表观遗传标志物的装置。
33.如权利要求32所述的计算机系统，其中所述胎儿特异性表观遗传标志物包括母体血浆或血清中的展现胎儿或胎盘特异性DNA甲基化模式的DNA序列。
34.如权利要求29所述的计算机系统，其中所述临床相关的DNA为源自获取生物样品的患者肿瘤的DNA。
35.如权利要求34所述的计算机系统，其中测量临床相关DNA的浓度分数的装置包括：
鉴定一个或多个基因座的装置，其中所述患者为杂合的，并且其中所述肿瘤展现杂合性丢失(LOH)使得等位基因缺失；
确定所述生物样品中所述一个或多个基因座处，具有未缺失的等位基因的序列读数的第一量A的装置；
确定所述生物样品中所述一个或多个基因座处，具有缺失的等位基因的序列读数的第二量B的装置；以及
使用比例(A–B)/A将临床相关DNA的浓度分数F计算为所述第一量与所述第二量之比的装置。
36.如权利要求34所述的计算机系统，其中测量临床相关DNA的浓度分数的装置包括：
鉴定一个或多个基因座的装置，其中所述患者为杂合的，并且其中所述肿瘤展现一个等位基因的重复；
确定所述生物样品中所述一个或多个基因座处，具有非重复等位基因的序列读数的第一量A的装置；
确定所述生物样品中所述一个或多个基因座处，具有重复等位基因的序列读数的第二量B的装置；以及
使用比例(B–A)/A将临床相关DNA的浓度分数F计算为所述第一量与所述第二量之比的装置。
37.如权利要求34所述的计算机系统，其中测量临床相关DNA的浓度分数的装置包括：
鉴定一个或多个基因座的装置，其中所述患者为纯合的，并且其中肿瘤组织中存在单核苷酸突变；
确定所述生物样品中所述一个或多个基因座处，具有野生型等位基因的序列读数的第一量A的装置；
确定所述生物样品中所述一个或多个基因座处，具有突变等位基因的序列读数的第二量B的装置；
使用比例2B/(A+B)将临床相关DNA的浓度分数F计算为所述第一量与所述第二量之比的装置。
38.如权利要求21所述的计算机系统，其中所述测量的大小为长度、分子量或与长度成比例的测量参数。
39.如权利要求21所述的计算机系统，其中所述多种大小中的至少一种对应于范围。
40.分析生物体的生物样品的计算机系统，所述生物样品包含源自正常细胞以及可能来自癌症相关细胞的DNA，其中所述DNA中的至少一些为所述生物样品中无细胞的，所述计算机系统包括：
对于来自所述生物样品的多个DNA片段的每一个：
接收获自所述DNA片段的测序的一个或多个序列读数的装置，所述一个或多个序列读数包括所述DNA片段的两端；
将所述一个或多个序列读数与参照基因组比对以获得所述DNA片段的两端的比对的位置的装置；以及
使用所述比对的位置确定所述DNA片段的大小的装置；
对于多种大小中的每种大小：
确定来自生物样品的对应于所述大小的第一组DNA片段的量的装置，所述大小为从所述比对的位置确定的所述第一组的大小；
基于多种大小的DNA片段的量，计算第一参数的第一值的装置，所述第一参数提供了所述生物样品中DNA片段的大小模式的统计学度量，其中将所述第一参数标准化；
将所述第一值与参考值比较的装置；以及
基于所述比较，确定所述生物体中癌症等级的分级的装置。
41.如权利要求40所述的计算机系统，其中所述第一组DNA片段对应于所述生物体基因组的一个或多个预定区域。
42.如权利要求41所述的计算机系统，还包括：
鉴定来自所述生物样品的其他组的DNA片段的装置，其中每组DNA片段对应于不同的预定区域；
测量对应于所述多种大小的DNA片段的量的装置；
计算所述其他组DNA片段的第一参数的大小值的装置；
将每个大小值与各自的参考值比较的装置；以及
确定这样的预定区域的装置：其中相应的大小值相比各自的参考值具有统计学差异。
43.如权利要求42所述的计算机系统，还包括：
使用鉴定的预定区域确定一种或多种可能的癌症类型的装置，其中所述可能的癌症类型与所述确定的预定区域相关。
44.如权利要求42所述的计算机系统，其中基于所述比较确定所述生物体中癌症等级的分级的装置包括：
确定所鉴定的预定区域的数目的装置，其中相比各自的参考值，所述相应的大小值具有统计学差异；以及
将所述数目与阈值区域数比较，以确定所述生物体中癌症等级的分级的装置。
45.如权利要求42所述的计算机系统，其中所述各自的参考值中的至少两个是不同的。
46.如权利要求40所述的计算机系统，其中所述确定的分级对应于肿瘤大小或肿瘤数目。
47.如权利要求40所述的计算机系统，其中所述生物样品获自治疗后的生物体，并且其中所述参考值对应于治疗前采集的样品确定的第一参数的值。
48.如权利要求40所述的计算机系统，其中所述参考值对应于当推测所述生物体未患癌症时从样品确定的第一参数的值。
49.如权利要求40所述的计算机系统，其中所述参考值从获自一个或多个健康生物体的一个或多个生物样品确立。
50.如权利要求40所述的计算机系统，其中所述分级为所述生物体未患癌症或癌症等级已降低。
51.如权利要求40所述的计算机系统，其中所述分级为所述生物体确实患有癌症或者癌症等级已增加。
52.如权利要求40所述的计算机系统，其中所述生物体为人。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI335354B (en) 2006-09-27 2011-01-01 Univ Hong Kong Chinese Methods for the detection of the degree of the methylation of a target dna and kits
JP5770737B2 (ja) 2009-11-06 2015-08-26 ザ チャイニーズ ユニバーシティ オブ ホンコン サイズに基づくゲノム分析
US11939634B2 (en) 2010-05-18 2024-03-26 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US20190010543A1 (en) 2010-05-18 2019-01-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11408031B2 (en) 2010-05-18 2022-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
BR112013020220B1 (pt) 2011-02-09 2020-03-17 Natera, Inc. Método para determinar o estado de ploidia de um cromossomo em um feto em gestação
WO2012177792A2 (en) 2011-06-24 2012-12-27 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of a genetic variation
US10196681B2 (en) 2011-10-06 2019-02-05 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US10424394B2 (en) 2011-10-06 2019-09-24 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CA2850785C (en) 2011-10-06 2022-12-13 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US9367663B2 (en) 2011-10-06 2016-06-14 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US9984198B2 (en) 2011-10-06 2018-05-29 Sequenom, Inc. Reducing sequence read count error in assessment of complex genetic variations
JP6431769B2 (ja) 2012-01-20 2018-11-28 セクエノム， インコーポレイテッド 実験条件を要因として含める診断プロセス
ES2930180T3 (es) 2012-03-02 2022-12-07 Sequenom Inc Métodos para enriquecer ácido nucleico canceroso a partir de una muestra biológica
US9892230B2 (en) 2012-03-08 2018-02-13 The Chinese University Of Hong Kong Size-based analysis of fetal or tumor DNA fraction in plasma
EP4276194A3 (en) * 2012-05-21 2024-03-06 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US10504613B2 (en) 2012-12-20 2019-12-10 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US9920361B2 (en) 2012-05-21 2018-03-20 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
US11261494B2 (en) 2012-06-21 2022-03-01 The Chinese University Of Hong Kong Method of measuring a fractional concentration of tumor DNA
US10497461B2 (en) 2012-06-22 2019-12-03 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US20140100126A1 (en) 2012-08-17 2014-04-10 Natera, Inc. Method for Non-Invasive Prenatal Testing Using Parental Mosaicism Data
US11913065B2 (en) 2012-09-04 2024-02-27 Guardent Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
CA2883901C (en) 2012-09-04 2023-04-11 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10876152B2 (en) 2012-09-04 2020-12-29 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US20160040229A1 (en) 2013-08-16 2016-02-11 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10482994B2 (en) 2012-10-04 2019-11-19 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
EP3561072A1 (en) 2012-12-10 2019-10-30 Resolution Bioscience, Inc. Methods for targeted genomic analysis
US20130309666A1 (en) 2013-01-25 2013-11-21 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
EP2971100A1 (en) 2013-03-13 2016-01-20 Sequenom, Inc. Primers for dna methylation analysis
LT2981921T (lt) 2013-04-03 2023-02-27 Sequenom, Inc. Neinvazinio genetinių variacijų vertinimo būdai ir procesai
KR102540202B1 (ko) 2013-05-24 2023-06-02 시쿼넘, 인코포레이티드 유전적 변이의 비침습 평가를 위한 방법 및 프로세스
KR102299305B1 (ko) 2013-06-21 2021-09-06 시쿼넘, 인코포레이티드 유전적 변이의 비침습 평가를 위한 방법 및 프로세스
US10174375B2 (en) * 2013-09-20 2019-01-08 The Chinese University Of Hong Kong Sequencing analysis of circulating DNA to detect and monitor autoimmune diseases
ES2968644T3 (es) 2013-10-04 2024-05-13 Sequenom Inc Métodos y procedimientos para la evaluación no invasiva de variaciones genéticas
CN111863131A (zh) 2013-10-07 2020-10-30 塞昆纳姆股份有限公司 用于非侵入性评估染色体改变的方法和过程
CA2928185C (en) 2013-10-21 2024-01-30 Verinata Health, Inc. Method for improving the sensitivity of detection in determining copy number variations
KR102649364B1 (ko) 2013-11-07 2024-03-20 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 인간 마이크로바이옴 및 그의 성분의 분석을 위한 무세포 핵산
GB2520765A (en) * 2013-12-02 2015-06-03 Vanadis Diagnostics Ab Multiplex detection of nucleic acids
EP3087204B1 (en) 2013-12-28 2018-02-14 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
GB2524948A (en) * 2014-03-07 2015-10-14 Oxford Gene Technology Operations Ltd Detecting Increase or Decrease in the Amount of a Nucleic Acid having a Sequence of Interest
WO2015138774A1 (en) 2014-03-13 2015-09-17 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
AU2015249846B2 (en) 2014-04-21 2021-07-22 Natera, Inc. Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments
WO2015169947A1 (en) 2014-05-09 2015-11-12 Lifecodexx Ag Detection of dna that originates from a specific cell-type and related methods
EP2942400A1 (en) 2014-05-09 2015-11-11 Lifecodexx AG Multiplex detection of DNA that originates from a specific cell-type
US10318704B2 (en) 2014-05-30 2019-06-11 Verinata Health, Inc. Detecting fetal sub-chromosomal aneuploidies
HUE059031T2 (hu) * 2014-07-25 2022-10-28 Bgi Genomics Co Ltd Módszer a sejtmentes magzati nukleinsavak frakciójának meghatározására egy terhes nõ perifériás vérmintájában és annak alkalmazása
EP3172341A4 (en) 2014-07-25 2018-03-28 University of Washington Methods of determining tissues and/or cell types giving rise to cell-free dna, and methods of identifying a disease or disorder using same
WO2016019042A1 (en) * 2014-07-30 2016-02-04 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
WO2016094853A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Verinata Health, Inc. Using cell-free dna fragment size to determine copy number variations
US11242559B2 (en) 2015-01-13 2022-02-08 The Chinese University Of Hong Kong Method of nuclear DNA and mitochondrial DNA analysis
US10364467B2 (en) 2015-01-13 2019-07-30 The Chinese University Of Hong Kong Using size and number aberrations in plasma DNA for detecting cancer
US10319463B2 (en) * 2015-01-23 2019-06-11 The Chinese University Of Hong Kong Combined size- and count-based analysis of maternal plasma for detection of fetal subchromosomal aberrations
CN113957124A (zh) 2015-02-10 2022-01-21 香港中文大学 用于癌症筛查和胎儿分析的突变检测
CN104789686B (zh) * 2015-05-06 2018-09-07 浙江安诺优达生物科技有限公司 检测染色体非整倍性的试剂盒和装置
EP4428863A2 (en) 2015-05-11 2024-09-11 Natera, Inc. Methods and compositions for determining ploidy
US11111520B2 (en) 2015-05-18 2021-09-07 Karius, Inc. Compositions and methods for enriching populations of nucleic acids
EA038117B1 (ru) 2015-05-22 2021-07-08 ЭнАйПиДи ДЖЕНЕТИКС ПАБЛИК КОМПАНИ ЛИМИТЕД Мультиплексный параллельный анализ целевых геномных областей с целью неинвазивного пренатального тестирования
HUE057821T2 (hu) 2015-07-23 2022-06-28 Univ Hong Kong Chinese Sejtmentes DNS fragmentációs mintázatának elemzése
CA2998530A1 (en) * 2015-09-11 2017-03-16 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Non-invasive methods for assessing genetic integrity of pluripotent stem cells
TWI767888B (zh) 2015-09-22 2022-06-21 香港中文大學 藉由母體血漿ｄｎａ之淺深度測序以準確定量胎兒ｄｎａ含量
KR101848438B1 (ko) * 2015-10-29 2018-04-13 바이오코아 주식회사 디지털 pcr을 이용한 산전진단 방법
EP3168309B8 (en) 2015-11-10 2020-06-03 Eurofins LifeCodexx GmbH Detection of foetal chromosomal aneuploidies using dna regions that are differentially methylated between the foetus and the pregnant female
ES2856598T3 (es) 2015-11-11 2021-09-27 Resolution Bioscience Inc Construcción de alta eficiencia de bibliotecas de ADN
CN108603228B (zh) 2015-12-17 2023-09-01 夸登特健康公司 通过分析无细胞dna确定肿瘤基因拷贝数的方法
US10095831B2 (en) 2016-02-03 2018-10-09 Verinata Health, Inc. Using cell-free DNA fragment size to determine copy number variations
JP2019518223A (ja) 2016-03-24 2019-06-27 バイオロジカル ダイナミクス，インク． 使い捨て可能な流体カートリッジおよびコンポーネント
KR102531487B1 (ko) 2016-03-25 2023-05-10 카리우스, 인코포레이티드 합성 핵산 스파이크-인
WO2018022890A1 (en) 2016-07-27 2018-02-01 Sequenom, Inc. Genetic copy number alteration classifications
RU2019108294A (ru) 2016-08-25 2020-09-25 Резолюшн Байосайенс, Инк. Способы обнаружения изменений количества геномных копий в образцах днк
CN109890984B (zh) * 2016-10-19 2024-03-29 香港中文大学 通过母体血浆dna的甲基化和大小谱分析进行胎龄评估
AU2017347790B2 (en) 2016-10-24 2024-06-13 Grail, Inc. Methods and systems for tumor detection
EP3535422A2 (en) 2016-11-07 2019-09-11 Grail, Inc. Methods of identifying somatic mutational signatures for early cancer detection
KR20230062684A (ko) 2016-11-30 2023-05-09 더 차이니즈 유니버시티 오브 홍콩 소변 및 기타 샘플에서의 무세포 dna의 분석
US10011870B2 (en) 2016-12-07 2018-07-03 Natera, Inc. Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules
CN106591451B (zh) * 2016-12-14 2020-06-23 北京贝瑞和康生物技术有限公司 测定胎儿游离dna含量的方法及其用于实施该方法的装置
US11694768B2 (en) 2017-01-24 2023-07-04 Sequenom, Inc. Methods and processes for assessment of genetic variations
EP4421489A2 (en) 2017-01-25 2024-08-28 The Chinese University of Hong Kong Diagnostic applications using nucleic acid fragments
CA3059370C (en) 2017-04-12 2022-05-10 Karius, Inc. Methods for concurrent analysis of dna and rna in mixed samples
US11342047B2 (en) 2017-04-21 2022-05-24 Illumina, Inc. Using cell-free DNA fragment size to detect tumor-associated variant
IL270445B2 (en) 2017-05-08 2024-06-01 Biological dynamics inc Methods and systems for processing information on tested material
DK3658684T3 (da) 2017-07-26 2023-10-09 Univ Hong Kong Chinese Forbedring af cancerscreening ved hjælp af cellefrie, virale nukleinsyrer
AU2018355575A1 (en) 2017-10-27 2020-05-21 Juno Diagnostics, Inc. Devices, systems and methods for ultra-low volume liquid biopsy
US11168356B2 (en) * 2017-11-02 2021-11-09 The Chinese University Of Hong Kong Using nucleic acid size range for noninvasive cancer detection
WO2019118926A1 (en) 2017-12-14 2019-06-20 Tai Diagnostics, Inc. Assessing graft suitability for transplantation
JP2021509265A (ja) 2017-12-19 2021-03-25 バイオロジカル ダイナミクス，インク． 生体サンプルからの複数の分析物の検出のための方法およびデバイス
CN112041464A (zh) * 2017-12-19 2020-12-04 生物动力学公司 用于检测及量化无细胞dna片段的方法和装置
EP3765631A4 (en) * 2018-03-13 2021-12-08 Guardant Health, Inc. METHOD OF NON-INVASIVE DETECTION AND MONITORING OF THERAPEUTIC NUCLEIC ACID CONSTRUCTS
CA3082601A1 (en) 2018-03-16 2019-09-19 Karius, Inc. Sample series to differentiate target nucleic acids from contaminant nucleic acids
CA3094717A1 (en) 2018-04-02 2019-10-10 Grail, Inc. Methylation markers and targeted methylation probe panels
US11883833B2 (en) 2018-04-02 2024-01-30 Biological Dynamics, Inc. Dielectric materials
EP3781714A1 (en) 2018-04-14 2021-02-24 Natera, Inc. Methods for cancer detection and monitoring by means of personalized detection of circulating tumor dna
WO2019209884A1 (en) 2018-04-23 2019-10-31 Grail, Inc. Methods and systems for screening for conditions
WO2019226822A1 (en) * 2018-05-23 2019-11-28 The Regents Of The University Of California Methods of analyzing capped ribonucleic acids
CN113286881A (zh) 2018-09-27 2021-08-20 格里尔公司 甲基化标记和标靶甲基化探针板
UY38479A (es) 2018-11-19 2020-06-30 Sist Genomicos S L Método y producto informático de análisis de adn fetal por secuenciación masiva
ES2968457T3 (es) * 2018-12-19 2024-05-09 Univ Hong Kong Chinese Características de los extremos del ADN extracelular circulante
US11929148B2 (en) 2019-03-13 2024-03-12 Grail, Llc Systems and methods for enriching for cancer-derived fragments using fragment size
WO2020192680A1 (en) 2019-03-25 2020-10-01 The Chinese University Of Hong Kong Determining linear and circular forms of circulating nucleic acids
CN110136794A (zh) * 2019-05-22 2019-08-16 湖北可汗广电文化有限公司 一种基于人工智能的母婴全生命周期健康医疗服务系统
JP2022544626A (ja) * 2019-08-19 2022-10-19 グリーン クロス ゲノム コーポレーション 核酸断片間距離情報を用いた染色体異常検出方法
EP4066245A1 (en) 2019-11-27 2022-10-05 Grail, LLC Systems and methods for evaluating longitudinal biological feature data
GB2605736B (en) * 2020-02-05 2023-05-24 Univ Hong Kong Chinese Molecular analyses using long cell-free fragments in pregnancy
US11211147B2 (en) 2020-02-18 2021-12-28 Tempus Labs, Inc. Estimation of circulating tumor fraction using off-target reads of targeted-panel sequencing
US11211144B2 (en) 2020-02-18 2021-12-28 Tempus Labs, Inc. Methods and systems for refining copy number variation in a liquid biopsy assay
US11475981B2 (en) 2020-02-18 2022-10-18 Tempus Labs, Inc. Methods and systems for dynamic variant thresholding in a liquid biopsy assay
EP4359562A1 (en) 2021-06-21 2024-05-01 Guardant Health, Inc. Methods and compositions for copy-number informed tissue-of-origin analysis
EP4409024A1 (en) 2021-09-30 2024-08-07 Guardant Health, Inc. Compositions and methods for synthesis and use of probes targeting nucleic acid rearrangements

Family Cites Families (109)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6440706B1 (en) 1999-08-02 2002-08-27 Johns Hopkins University Digital amplification
CA2387035A1 (en) 1999-10-13 2001-04-19 Sequenom, Inc. Methods for generating databases and databases for identifying polymorphic genetic markers
GB0016742D0 (en) 2000-07-10 2000-08-30 Simeg Limited Diagnostic method
US6664056B2 (en) 2000-10-17 2003-12-16 The Chinese University Of Hong Kong Non-invasive prenatal monitoring
US8898021B2 (en) 2001-02-02 2014-11-25 Mark W. Perlin Method and system for DNA mixture analysis
JP2002272497A (ja) 2001-03-15 2002-09-24 Venture Link Co Ltd 癌の診断方法、およびその診断用ベクター
JP4444564B2 (ja) 2001-03-23 2010-03-31 サントリオン 三重螺旋相互作用によるターゲット二本鎖ｄｎａ配列の精製及び検出方法
US7253155B2 (en) 2001-10-05 2007-08-07 Combinatorx, Inc. Combinations for the treatment of immunoinflammatory disorders
US20030180765A1 (en) 2002-02-01 2003-09-25 The Johns Hopkins University Digital amplification for detection of mismatch repair deficient tumor cells
IL163600A0 (en) 2002-03-01 2005-12-18 Ravgen Inc Methods for detection of genetic disorders
US6977162B2 (en) 2002-03-01 2005-12-20 Ravgen, Inc. Rapid analysis of variations in a genome
EP1576131A4 (en) 2002-08-15 2008-08-13 Genzyme Corp EXPRESSION PATTERN IN BRAIN DENTHELIC CELLS
US7704687B2 (en) 2002-11-15 2010-04-27 The Johns Hopkins University Digital karyotyping
JP2006521086A (ja) 2003-02-28 2006-09-21 ラブジェン， インコーポレイテッド 遺伝子疾患の検出方法
US8394582B2 (en) 2003-03-05 2013-03-12 Genetic Technologies, Inc Identification of fetal DNA and fetal cell markers in maternal plasma or serum
AU2003901671A0 (en) 2003-04-02 2003-05-01 The University Of Adelaide Comparative genomic hybridization
RU2249820C1 (ru) 2003-08-18 2005-04-10 Лактионов Павел Петрович Способ ранней диагностики заболеваний, связанных с нарушением функционирования генетического аппарата клетки
US20050282213A1 (en) 2003-09-22 2005-12-22 Trisogen Biotechnology Limited Partnership Methods and kits useful for detecting an alteration in a locus copy number
US7655399B2 (en) 2003-10-08 2010-02-02 Trustees Of Boston University Methods for prenatal diagnosis of chromosomal abnormalities
EP1524321B2 (en) 2003-10-16 2014-07-23 Sequenom, Inc. Non-invasive detection of fetal genetic traits
US20050221341A1 (en) 2003-10-22 2005-10-06 Shimkets Richard A Sequence-based karyotyping
AU2004286845A1 (en) 2003-10-30 2005-05-19 Tufts-New England Medical Center Prenatal diagnosis using cell-free fetal DNA in amniotic fluid
DE102004036285A1 (de) 2004-07-27 2006-02-16 Advalytix Ag Verfahren zum Bestimmen der Häufigkeit von Sequenzen einer Probe
CN1779688A (zh) 2004-11-22 2006-05-31 寰硕数码股份有限公司 交互式医疗信息系统及方法
TWI367259B (en) 2005-03-18 2012-07-01 Univ Hong Kong Chinese A method for the detection of chromosomal aneuploidies
ATE406463T1 (de) 2005-04-06 2008-09-15 Maurice Stroun Methode zur krebsdiagnose mittels nachweis von dna und rna im kreislauf
US20070122823A1 (en) 2005-09-01 2007-05-31 Bianchi Diana W Amniotic fluid cell-free fetal DNA fragment size pattern for prenatal diagnosis
ES2595373T3 (es) 2006-02-02 2016-12-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Prueba genética no invasiva mediante análisis digital
EP2351858B1 (en) 2006-02-28 2014-12-31 University of Louisville Research Foundation Detecting fetal chromosomal abnormalities using tandem single nucleotide polymorphisms
EP2851422A3 (en) 2007-05-24 2015-06-24 Apceth GmbH & Co. KG CD34neg stem cells for the treatment of gastrointestinal disorders
HUE061020T2 (hu) 2007-07-23 2023-05-28 Univ Hong Kong Chinese Nukleinsav-szekvencia kiegyensúlyozatlanságának meghatározására
US20100112590A1 (en) 2007-07-23 2010-05-06 The Chinese University Of Hong Kong Diagnosing Fetal Chromosomal Aneuploidy Using Genomic Sequencing With Enrichment
US20090053719A1 (en) 2007-08-03 2009-02-26 The Chinese University Of Hong Kong Analysis of nucleic acids by digital pcr
PL2200622T5 (pl) 2007-09-19 2016-08-31 Pluristem Ltd Adherentne komórki z tkanki tłuszczowej i łożyska i ich zastosowanie w terapii
WO2009051842A2 (en) 2007-10-18 2009-04-23 The Johns Hopkins University Detection of cancer by measuring genomic copy number and strand length in cell-free dna
CA3069081C (en) 2008-09-20 2023-05-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by sequencing
WO2010053980A2 (en) 2008-11-04 2010-05-14 The Johns Hopkins University Dna integrity assay (dia) for cancer diagnostics, using confocal fluorescence spectroscopy
AU2010230417B2 (en) 2009-03-31 2013-10-10 Oridis Biomarkers Gmbh Method for diagnosis of cancer and monitoring of cancer treatments
WO2011053790A2 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Fluidigm Corporation Assay of closely linked targets in fetal diagnosis and coincidence detection assay for genetic analysis
FI3783110T3 (fi) 2009-11-05 2023-03-02 Fetaalisen genomin analyysi maternaalisesta biologisesta näytteestä
JP5770737B2 (ja) 2009-11-06 2015-08-26 ザ チャイニーズ ユニバーシティ オブ ホンコン サイズに基づくゲノム分析
WO2011060240A1 (en) 2009-11-12 2011-05-19 Genzyme Corporation Copy number analysis of genetic locus
US10388403B2 (en) 2010-01-19 2019-08-20 Verinata Health, Inc. Analyzing copy number variation in the detection of cancer
EP2848704B1 (en) 2010-01-19 2018-08-29 Verinata Health, Inc Sequencing methods for prenatal diagnoses
WO2011091046A1 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Verinata Health, Inc. Identification of polymorphic sequences in mixtures of genomic dna by whole genome sequencing
US9260745B2 (en) 2010-01-19 2016-02-16 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
WO2011090556A1 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Verinata Health, Inc. Methods for determining fraction of fetal nucleic acid in maternal samples
WO2011103236A2 (en) 2010-02-18 2011-08-25 The Johns Hopkins University Personalized tumor biomarkers
US20130143214A1 (en) 2010-06-04 2013-06-06 Chronix Biomedical Prostate cancer associated circulating nucleic acid biomarkers
EP2426217A1 (en) 2010-09-03 2012-03-07 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) Analytical methods for cell free nucleic acids and applications
EP2646579B1 (en) 2010-11-30 2017-06-14 The Chinese University Of Hong Kong Detection of genetic or molecular aberrations associated with cancer
US20130059738A1 (en) 2011-04-28 2013-03-07 Life Technologies Corporation Methods and compositions for multiplex pcr
US8712697B2 (en) 2011-09-07 2014-04-29 Ariosa Diagnostics, Inc. Determination of copy number variations using binomial probability calculations
US20150211070A1 (en) 2011-09-22 2015-07-30 Immu-Metrix, Llc Compositions and methods for analyzing heterogeneous samples
CA2850785C (en) 2011-10-06 2022-12-13 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US10196681B2 (en) 2011-10-06 2019-02-05 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
WO2013060762A1 (en) 2011-10-25 2013-05-02 Roche Diagnostics Gmbh Method for diagnosing a disease based on plasma-dna distribution
WO2013062856A1 (en) 2011-10-27 2013-05-02 Verinata Health, Inc. Set membership testers for aligning nucleic acid samples
FR2981833B1 (fr) 2011-10-28 2013-12-06 Oreal Sachet de conditionnement de produit cosmetique
US9757458B2 (en) 2011-12-05 2017-09-12 Immunomedics, Inc. Crosslinking of CD22 by epratuzumab triggers BCR signaling and caspase-dependent apoptosis in hematopoietic cancer cells
US20140364439A1 (en) 2011-12-07 2014-12-11 The Broad Institute, Inc. Markers associated with chronic lymphocytic leukemia prognosis and progression
US9892230B2 (en) * 2012-03-08 2018-02-13 The Chinese University Of Hong Kong Size-based analysis of fetal or tumor DNA fraction in plasma
US20130261984A1 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Illumina, Inc. Methods and systems for determining fetal chromosomal abnormalities
US11261494B2 (en) 2012-06-21 2022-03-01 The Chinese University Of Hong Kong Method of measuring a fractional concentration of tumor DNA
EP2882867A1 (en) 2012-08-10 2015-06-17 The Broad Institute, Inc. Methods and apparatus for analyzing and quantifying dna alterations in cancer
US20140066317A1 (en) 2012-09-04 2014-03-06 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
CA2883901C (en) 2012-09-04 2023-04-11 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US20160040229A1 (en) 2013-08-16 2016-02-11 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US9769123B2 (en) 2012-09-06 2017-09-19 Intel Corporation Mitigating unauthorized access to data traffic
ES2665273T5 (es) 2012-09-20 2023-10-02 Univ Hong Kong Chinese Determinación no invasiva de metiloma del feto o tumor de plasma
US9732390B2 (en) 2012-09-20 2017-08-15 The Chinese University Of Hong Kong Non-invasive determination of methylome of fetus or tumor from plasma
US20140287937A1 (en) 2013-02-21 2014-09-25 Toma Biosciences, Inc. Methods for assessing cancer
EP3421613B1 (en) 2013-03-15 2020-08-19 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Identification and use of circulating nucleic acid tumor markers
AU2014233373B2 (en) 2013-03-15 2019-10-24 Verinata Health, Inc. Generating cell-free DNA libraries directly from blood
WO2015026873A1 (en) 2013-08-19 2015-02-26 Singular Bio, Inc. Assays for single molecule detection and use thereof
US10262755B2 (en) 2014-04-21 2019-04-16 Natera, Inc. Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments
CA2928185C (en) 2013-10-21 2024-01-30 Verinata Health, Inc. Method for improving the sensitivity of detection in determining copy number variations
GB201319779D0 (en) 2013-11-08 2013-12-25 Cartagenia N V Genetic analysis method
US10465238B2 (en) 2013-12-19 2019-11-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Quantification of mutant alleles and copy number variation using digital PCR with nonspecific DNA-binding dyes
GB2524948A (en) 2014-03-07 2015-10-14 Oxford Gene Technology Operations Ltd Detecting Increase or Decrease in the Amount of a Nucleic Acid having a Sequence of Interest
AU2015249846B2 (en) 2014-04-21 2021-07-22 Natera, Inc. Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments
EP3143163B1 (en) 2014-05-13 2020-11-25 Board of Regents, The University of Texas System Gene mutations and copy number alterations of egfr, kras and met
US10318704B2 (en) 2014-05-30 2019-06-11 Verinata Health, Inc. Detecting fetal sub-chromosomal aneuploidies
MX2016016904A (es) 2014-06-26 2017-03-27 10X Genomics Inc Analisis de secuencias de acidos nucleicos.
DK3543356T3 (da) 2014-07-18 2021-10-11 Univ Hong Kong Chinese Analyse af methyleringsmønster af væv i DNA-blanding
EP3172341A4 (en) 2014-07-25 2018-03-28 University of Washington Methods of determining tissues and/or cell types giving rise to cell-free dna, and methods of identifying a disease or disorder using same
DK3194612T3 (da) 2014-08-22 2024-10-14 Resolution Bioscience Inc Fremgangsmåder til kvantitativ genetisk analyse af cellefrit dna
ES2925014T3 (es) 2014-09-12 2022-10-13 Univ Leland Stanford Junior Identificación y uso de ácidos nucleicos circulantes
WO2016038220A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Illumina Cambridge Limited Detecting repeat expansions with short read sequencing data
EP3018213A1 (en) 2014-11-04 2016-05-11 Genesupport SA Method for determining the presence of a biological condition by determining total and relative amounts of two different nucleic acids
KR20170083563A (ko) 2014-11-14 2017-07-18 리퀴드 제노믹스, 아이엔씨. 암 진단 및/또는 모니터링을 위한 무세포 rna의 사용 방법
WO2016094853A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Verinata Health, Inc. Using cell-free dna fragment size to determine copy number variations
US20170342500A1 (en) 2014-12-19 2017-11-30 Danmarks Tekniske Universitet Method for identification of tissue or organ localization of a tumour
CN107406876B (zh) 2014-12-31 2021-09-07 夸登特健康公司 表现出病变细胞异质性的疾病的检测和治疗以及用于传送测试结果的系统和方法
US10364467B2 (en) 2015-01-13 2019-07-30 The Chinese University Of Hong Kong Using size and number aberrations in plasma DNA for detecting cancer
US10319463B2 (en) 2015-01-23 2019-06-11 The Chinese University Of Hong Kong Combined size- and count-based analysis of maternal plasma for detection of fetal subchromosomal aberrations
CN113957124A (zh) 2015-02-10 2022-01-21 香港中文大学 用于癌症筛查和胎儿分析的突变检测
EP3265079A4 (en) 2015-03-03 2019-01-02 Caris MPI, Inc. Molecular profiling for cancer
JP6995625B2 (ja) 2015-05-01 2022-01-14 ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド 診断方法
ES2881977T3 (es) 2015-05-06 2021-11-30 Seracare Life Sciences Inc Preparaciones liposomales para cribado no invasivo prenatal o de cáncer
EP4428863A2 (en) 2015-05-11 2024-09-11 Natera, Inc. Methods and compositions for determining ploidy
EP3636777A1 (en) 2015-07-13 2020-04-15 Agilent Technologies Belgium NV System and methodology for the analysis of genomic data obtained from a subject
AU2016306292B2 (en) 2015-08-07 2022-08-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Genetic abnormalities in plasma cell dyscrasias
CN108474040B (zh) 2015-10-09 2023-05-16 夸登特健康公司 使用无细胞dna的基于群体的治疗推荐
WO2017070497A1 (en) 2015-10-21 2017-04-27 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions for use of driver mutations in cll
CN108603228B (zh) 2015-12-17 2023-09-01 夸登特健康公司 通过分析无细胞dna确定肿瘤基因拷贝数的方法
US10982286B2 (en) 2016-01-22 2021-04-20 Mayo Foundation For Medical Education And Research Algorithmic approach for determining the plasma genome abnormality PGA and the urine genome abnormality UGA scores based on cell free cfDNA copy number variations in plasma and urine
EP3464626B1 (en) 2016-05-27 2022-04-06 Sequenom, Inc. Methods for detecting genetic variations
AU2017347790B2 (en) 2016-10-24 2024-06-13 Grail, Inc. Methods and systems for tumor detection

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Analysis of the size distributions of fetal and maternal cell-free DNA by paired-end sequencing;Fan CH et al.;《Clinical chemistry》;20100831;第56卷(第8期);第1279-1286页 *

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Publication number Publication date
HUE044746T2 (hu) 2019-11-28
AU2017201258A1 (en) 2017-03-16
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