KR102299305B1 - 유전적 변이의 비침습 평가를 위한 방법 및 프로세스 - Google Patents

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Abstract

본원은 유전적 변이의 비침습 평가 방법, 프로세스, 시스템, 기계 및 장치를 제공한다.

Description

유전적 변이의 비침습 평가를 위한 방법 및 프로세스{METHODS AND PROCESSES FOR NON-INVASIVE ASSESSMENT OF GENETIC VARIATIONS}
관련 특허 출원
본 특허출원은 2013년 6월 21일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/838,048호(발명의 명칭: METHODS AND PROCESSES FOR NON-INVASIVE ASSESSMENT OF GENETIC VARIATIONS; 발명자: Sung K. Kim et al.; 지정된 변리사 사건 번호 SEQ-6071-PV)의 이익을 주장한다. 모든 본문, 표 및 도면을 포함하는 상기 출원의 전체 내용은 본원에 참고로 도입된다.
분야
본원에서 제공된 기술은 부분적으로 유전적 변이의 비침습 평가를 위한 방법, 프로세스, 기계 및 장치에 관한 것이다.
살이있는 유기체(예를 들면, 동물, 식물 및 미생물)의 유전 정보 및 다른 형태의 복제 유전 정보(예를 들면, 바이러스)는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)에 코딩되어 있다. 유전 정보는 화학적 또는 가상적 핵산의 일차 구조를 나타내는 뉴클레오티드 또는 변경된 뉴클레오티드의 연속물이다. 인간에서, 완전한 게놈은 이십사(24)개의 염색체 상에 위치하는 약 30,000개의 유전자를 함유한다(문헌(The Human Genome, T. Strachan, BIOS Scientific Publishers, 1992) 참조). 각각의 유전자는 전사 및 번역을 통한 발현 후 살아있는 세포 내에서 특정 생화학적 기능을 수행하는 특정 단백질을 코딩한다.
많은 의학적 질환들이 하나 이상의 유전적 변이에 의해 야기된다. 일부 유전적 변이들은 예를 들면, 혈우병, 지중해빈혈, 뒤시엔느 근위축증(DMD), 헌팅톤병(HD), 알쯔하이머병 및 낭성 섬유증(CF)을 포함하는 의학적 질환을 야기한다(Human Genome Mutations, D. N. Cooper and M. Krawczak, BIOS Publishers, 1993). 이러한 유전 질환들은 특정 유전자의 DNA에서 단일 뉴클레오티드의 추가, 치환 또는 결실로부터 발생할 수 있다. 일부 출생 결함은 이배수성(aneuploidy)으로서도 지칭되는 염색체 이상, 예컨대, 삼염색체성(trisomy) 21(다운(Down) 증후군), 삼염색체성 13(파타우(Patau) 증후군), 삼염색체성 18(에드워드(Edward) 증후군), 일염색체성 X(터너(Turner) 증후군) 및 일부 성염색체 이배수성, 예컨대, 클라인펠터(Klinefelter) 증후군(XXY)에 의해 야기된다. 또 다른 유전적 변이는 종종 성염색체 X 및 Y를 기초로 확인될 수 있는 태아 성별이다. 일부 유전적 변이들은 개체가 다수의 질환들, 예를 들면, 당뇨병, 동맥경화증, 비만, 다양한 자가면역 질환들 및 암(예를 들면, 대장, 유방, 난소, 폐) 중 임의의 질환에 취약하게 만들 수 있거나 이러한 질환을 야기할 수 있다.
하나 이상의 유전적 변이 또는 변경의 확인은 특정 의학적 질환의 진단 또는 특정 의학적 질환에 대한 소인의 확인으로 이어질 수 있다. 유전적 변이의 확인은 의학적 결정을 용이하게 할 수 있고/있거나 도움이 되는 의학적 절차를 이용하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전적 변이 또는 변경의 확인은 세포 유리 DNA의 분석을 포함한다. 세포 유리 DNA(cell-free DNA; CF-DNA)는 세포 사멸로부터 유래하고 말초 혈액에서 순환하는 DNA 단편으로 구성된다. 고농도의 CF-DNA는 일부 임상 질환, 예컨대, 암, 외상, 화상, 심근경색, 뇌졸중, 패혈증, 감염 및 다른 질환을 표시할 수 있다. 추가로, 세포 유리 태아 DNA(cell-free fetal DNA; CFF-DNA)는 모체 혈류에서 검출될 수 있고 다양한 비침습 산전 진단을 위해 사용될 수 있다.
모체 혈장에서의 태아 핵산의 존재는 모체 혈액 샘플의 분석을 통한 비침습 산전 진단을 가능하게 한다. 예를 들면, 모체 혈장에서의 태아 DNA의 정량적 이상은 임신중독증, 조산, 분만전 출혈, 침습 태반형성, 태아 다운 증후군 및 다른 태아 염색체 이배수성을 포함하는 다수의 임신 관련 장애들과 관련될 수 있다. 따라서, 모체 혈장에서의 태아 핵산 분석은 태아-모체 건강의 모니터링을 위한 유용한 기작일 수 있다.
일부 양태에서, 본원은 (a) 기준 게놈의 부분들에 맵핑된(mapped) 서열 리드(sequence reads)의 카운트(counts)를 수득하는 단계로서, 이때 상기 서열 리드는 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플로부터의 세포 유리 순환 핵산의 리드인 단계, (b) 마이크로프로세서를 이용하여, (i) 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트, 또는 (ii) 다른 부분 특이적 파라미터를, 각각의 부분과 독립적으로 관련된 가중치(weighting factor)에 따라 태아 핵산의 부분 특이적 분획(fraction)에 가중하여, 가중치에 따른 부분 특이적 태아 분획 추정치를 제공하는 단계로서, 이때 각각의 가중치는 (i) 다수의 샘플들 각각에 대한 태아 핵산 분획과 (ii) 다수의 샘플들에 대한, 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트 또는 다른 부분 특이적 파라미터 사이의, 각각의 부분에 대한 피팅된 관계로부터 결정되는 것인 단계; 및 (c) 부분 특이적 태아 분획 추정치를 기초로 검사 샘플에 대한 태아 핵산 분획을 추정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본원은 (a) 기준 게놈의 부분들에 맵핑된 서열 리드의 카운트를 수득하는 단계로서, 이때 상기 서열 리드는 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플로부터의 세포 유리 순환 핵산의 리드인 단계, (b) (i) 마이크로프로세서를 이용하여, 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트를 각각의 부분에 독립적으로 할당된 가중치에 따라 조정하여, 부분에 대한 조정된 카운트를 제공하거나, (b) (ii) 마이크로프로세서를 이용하여, 부분들의 서브세트를 선택하여, 카운트의 서브세트를 제공하는 단계로서, 이때 (b) (i)에서의 조정 또는 (b) (ii)에서의 선택은, 태아 핵산으로부터의 증가된 양의 리드가 맵핑되는 부분에 따른 것인 단계; 및 (c) 조정된 카운트 또는 카운트의 서브세트에 기초하여 검사 샘플에 대한 태아 핵산 분획을 추정하는 단계를 포함하는, 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플에서 태아 핵산 분획을 추정하는 방법도 제공한다.
본원은 기준 게놈의 부분들에 맵핑된 서열 리드의 카운트를 수득하는 단계로서, 이때 상기 서열 리드는 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플로부터의 세포 유리 순환 핵산의 리드이고, 이때 수득된 카운트의 적어도 서브세트는, 게놈의 다른 영역의 총 카운트 대비 태아 핵산의 카운트보다 큰 수의, 총 카운트 대비 태아 핵산 유래의 카운트를 제공하는 게놈의 영역으로부터 유래하는 것인 단계를 포함하는, 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플에서 태아 핵산 분획 추정의 정확도를 증가시키는 방법도 제공한다.
본원은 하나 이상의 마이크로프로세서 및 메모리를 포함하는 시스템, 기계 또는 장치로서, 상기 메모리는 상기 하나 이상의 마이크로프로세서에 의해 실행될 수 있는 명령어를 포함하고 상기 하나 이상의 마이크로프로세서에 의해 실행될 수 있는 상기 명령어는 (a) 기준 게놈의 부분들에 맵핑된 뉴클레오티드 서열 리드에 액세스하고, 이때 상기 서열 리드는 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플로부터의 세포 유리 순환 핵산의 리드이고, (b) (i) 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트, 또는 (ii) 다른 부분 특이적 파라미터를, 각각의 부분과 독립적으로 관련된 가중치에 따라 태아 핵산의 부분 특이적 분획에 가중하여, 가중치에 따른 부분 특이적 태아 분획 추정치를 제공하고, 이때 각각의 가중치는 (i) 다수의 샘플들 각각에 대한 태아 핵산 분획과 (ii) 다수의 샘플들에 대한 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트 또는 다른 부분 특이적 파라미터 사이의 각각의 부분에 대한 피팅된 관계로부터 결정되고, (c) 부분 특이적 태아 분획 추정치를 기초로 검사 샘플에 대한 태아 핵산 분획을 추정하도록 구성되는 것인 시스템, 기계 또는 장치도 제공한다.
본원은 하나 이상의 마이크로프로세서 및 메모리를 포함하는 기계로서, 상기 메모리는 상기 하나 이상의 마이크로프로세서에 의해 실행될 수 있는 명령어를 포함하고 기준 게놈의 부분들에 맵핑된 뉴클레오티드 서열 리드를 포함하며, 상기 서열 리드는 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플로부터의 세포 유리 순환 핵산의 리드이고, 상기 하나 이상의 마이크로프로세서에 의해 실행될 수 있는 상기 명령어는 (a) 마이크로프로세서를 이용하여, (i) 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트, 또는 (ii) 다른 부분 특이적 파라미터를, 각각의 부분과 독립적으로 관련된 가중치에 따라 태아 핵산의 부분 특이적 분획에 가중하여, 가중치에 따른 부분 특이적 태아 분획 추정치를 제공하고, 이때 각각의 가중치는 (i) 다수의 샘플들 각각에 대한 태아 핵산 분획과 (ii) 다수의 샘플들에 대한 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트 또는 다른 부분 특이적 파라미터 사이의 각각의 부분에 대한 피팅된 관계로부터 결정되고 (b) 부분 특이적 태아 분획 추정치를 기초로 검사 샘플에 대한 태아 핵산 분획을 추정하도록 구성되는 것인 기계도 제공한다.
본원은 마이크로프로세서가 하기 단계들을 수행하도록 명령하는 실행 가능한 프로그램이 저장되어 있는 비일시적 컴퓨터 판독 가능 기억 매체도 제공한다: (a) 기준 게놈의 부분들에 맵핑된 뉴클레오티드 서열 리드에 액세스하는 단계로서, 이때 상기 서열 리드는 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플로부터의 세포 유리 순환 핵산의 리드인 단계; (b) 마이크로프로세서를 이용하여, (i) 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트, 또는 (ii) 다른 부분 특이적 파라미터를, 각각의 부분과 독립적으로 관련된 가중치에 따라 태아 핵산의 부분 특이적 분획에 가중하여, 가중치에 따른 부분 특이적 태아 분획 추정치를 제공하는 단계로서, 이때 각각의 가중치는 (i) 다수의 샘플들 각각에 대한 태아 핵산 분획과 (ii) 다수의 샘플들에 대한 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트 또는 다른 부분 특이적 파라미터 사이의 각각의 부분에 대한 피팅된 관계로부터 결정되는 것인 단계; 및 (c) 부분 특이적 태아 분획 추정치를 기초로 검사 샘플에 대한 태아 핵산 분획을 추정하는 단계.
기술의 일부 양태는 하기 설명, 실시예, 청구범위 및 도면에 더 기재되어 있다.
도면은 기술의 실시양태를 예시하고 한정하지 않는다. 명료함 및 용이한 예시를 위해, 도면은 비례척에 맞춰지지 않았고, 일부 경우 다양한 양태들이 특정 실시양태의 이해를 용이하게 하기 위해 과장되거나 확장된 상태로 표시될 수 있다.
도 1은 13번 염색체에 대한 FRS(좌측 수직 축, 상부 히스토그램)와 50 kb 빈(bin)당 엑손의 수(우측 수직 축, 하부 히스토그램)의 쌍별 비교를 보여준다. 부분은 하부 수평 X-축 상에 표시되어 있다.
도 2는 13번 염색체에 대한 FRS(좌측 수직 축, 상부 히스토그램)와 50 kb 빈당 GC 함량(우측 수직 축, 하부 히스토그램)의 쌍별 비교를 보여준다. 부분은 하부 수평 X-축 상에 표시되어 있다.
도 3은 13번 염색체에 대한 50 kb 부분당 엑손의 수(좌측 수직 축, 상부 히스토그램)와 50 kb 부분당 GC 함량(우측 수직 축, 하부 히스토그램)의 쌍별 비교를 보여준다. 부분은 하부 수평 X-축 상에 표시되어 있다.
도 4는 18번 염색체에 대한 FRS(좌측 수직 축, 상부 히스토그램)와 50 kb 부분당 엑손의 수(우측 수직 축, 하부 히스토그램)의 쌍별 비교를 보여준다. 부분은 하부 수평 X-축 상에 표시되어 있다.
도 5는 18번 염색체에 대한 FRS(좌측 수직 축, 상부 히스토그램)와 50 kb 부분당 GC 함량(우측 수직 축, 하부 히스토그램)의 쌍별 비교를 보여준다. 부분은 하부 수평 X-축 상에 표시되어 있다.
도 6은 18번 염색체에 대한 50 kb 부분당 엑손의 수(좌측 수직 축, 상부 히스토그램)와 50 kb 부분당 GC 함량(우측 수직 축, 하부 히스토그램)의 쌍별 비교를 보여준다. 부분은 하부 수평 X-축 상에 표시되어 있다.
도 7은 21번 염색체에 대한 FRS(좌측 수직 축, 상부 히스토그램)와 50 kb 부분당 엑손의 수(우측 수직 축, 하부 히스토그램)의 쌍별 비교를 보여준다. 부분은 하부 수평 X-축 상에 표시되어 있다.
도 8은 21번 염색체에 대한 FRS(좌측 수직 축, 상부 히스토그램)와 50 kb 부분당 GC 함량(우측 수직 축, 하부 히스토그램)의 쌍별 비교를 보여준다. 부분은 하부 수평 X-축 상에 표시되어 있다.
도 9는 21번 염색체에 대한 50 kb 부분당 엑손의 수(좌측 수직 축, 상부 히스토그램)와 50 kb 부분당 GC 함량(우측 수직 축, 하부 히스토그램)의 쌍별 비교를 보여준다. 부분은 하부 수평 X-축 상에 표시되어 있다.
도 10은 21번 염색체에 대한 LOESS Z 점수를 가진 PERUN PAD(X-축) 대 "태아 비농축된" 부분에 기초한 LOESS Z 점수를 가진 PERUN PAD(Y-축)를 보여준다. 4개의 사분원은 일치 및 불일치를 표시한다. 사분원 선은 Z=3에서 그려져 있다. 상부 우측 사분원과 하부 좌측 사분원은 회색 대각 쇄선에 의해 분리되어 있다. 쇄점선은 비-T21 샘플만에 대한 회귀 선이다. 점선은 높은 FRS 부분에 기초한 T21 샘플에 대한 회귀 선이다.
도 11은 21번 염색체에 대한 LOESS Z 점수를 가진 PERUN PAD(X-축) 대 "태아 농축된" 부분(즉, 높은 FRS를 가진 부분)에 기초한 LOESS Z 점수를 가진 PERUN PAD(Y-축)를 보여준다. 4개의 사분원은 일치 및 불일치를 표시한다. 사분원 선은 Z=3에서 그려져 있다. 상부 우측 사분원과 하부 좌측 사분원은 회색 대각 쇄선에 의해 분리되어 있다. 쇄점선은 비-T21 샘플만에 대한 회귀 선이다. 점선은 높은 FRS 부분에 기초한 T21 샘플에 대한 회귀 선이다.
도 12는 1) 프로브(P; 점선)를 단편(직선)에 혼성화하는 단계, 2) 프로브를 트리밍(trimming)하는 단계, 및 3) 프로브 길이를 측정하는 단계를 포함하는, 핵산 단편 길이를 측정하는 방법을 보여준다. 태아 유래의 단편(F) 및 모체 유래의 단편(M)에 대한 단편 크기 측정이 제시되어 있다.
도 13은 3종의 상이한 라이브러리 제조 방법들에 대한 단편 길이의 분포를 보여준다. 이들은 자동화된 비드 청소(cleanup)를 이용하는 효소적 방법, 자동화된 비드 청소를 이용하지 않는 효소적 방법 및 자동화된 비드 청소를 이용하는 TRUSEQ를 포함한다. 수직 선은 143개 염기 및 166개 염기 단편 크기를 표시한다.
도 14는 단편 크기 필터를 이용하지 않고 13번 염색체 표시치를 보여준다.
도 15는 150개 염기에서 단편 크기 필터를 이용하여 13번 염색체 표시치를 보여준다.
도 16은 단편 크기 필터를 이용하지 않고 18번 염색체 표시치를 보여준다.
도 17은 150개 염기에서 단편 크기 필터를 이용하여 18번 염색체 표시치를 보여준다.
도 18은 단편 크기 필터를 이용하지 않고 21번 염색체 표시치를 보여준다.
도 19는 150개 염기에서 단편 크기 필터를 이용하여 21번 염색체 표시치를 보여준다.
도 20은 가변 단편 크기 필터를 이용하여 13번 염색체 표시치(LOESS를 이용한 PERUN PAD)를 보여준다.
도 21은 가변 단편 크기 필터를 이용하여 18번 염색체 표시치(LOESS를 이용한 PERUN PAD)를 보여준다.
도 22는 가변 단편 크기 필터를 이용하여 21번 염색체 표시치(LOESS를 이용한 PERUN PAD)를 보여준다.
도 23은 일부 분석들을 위해 사용된 데이터의 설명을 제시하는 표를 보여준다.
도 24는 기술의 일부 실시양태들이 실시될 수 있는 시스템의 예시적 실시양태를 보여준다.
도 25a는 삼염색체성 21 태아(별표로 표시됨) 또는 정배수체(euploid) 태아(원으로 표시됨)를 가진 임신 여성으로부터 수득된 샘플에 대한 21번 염색체의 부분들의 서브세트의 평균 FRS(x-축) 대 동일한 부분들의 서브세트에 대한 PERUN 정규화된 카운트의 Z-점수(y-축)의 관계를 보여준다. 도 25a를 위해 선택된 부분들의 서브세트에서 각각의 부분은 카운트가 수득된 21번 염색체의 모든 부분들에 대해 측정된 중간 FRS보다 높은 FRS를 가진다. 도 25b는 카운트가 수득된 21번 염색체의 모든 부분들에 대한 삼염색체성 21 태아(별표로 표시됨) 또는 정배수체 태아(원으로 표시됨)를 가진 임신 여성으로부터 수득된 21번 염색체에 대한 FQA 태아 분획 추정치(x-축) 대 PERUN 정규화된 카운트(y-축)의 Z-점수의 관계를 보여준다.
도 26은 21번 염색체에 대한 표시된 범위의 단편 길이(하부 우측 삽입도에 나타나 있음)의 리드에 대한 리드당 GC 함량(x-축) 대 리드 길이에 기초한 누적 분포 함수(CDF, y-축)의 관계를 보여준다.
도 27은 빈당 FRS에 따라 분위(quantile)(높음, 중간 높음, 중간 낮음, 및 낮음)로 분할된 PERUN 절편의 분포(x-축)를 보여준다.
도 28은 빈당 FRS에 따라 분위(높음, 중간 높음, 중간 낮음, 및 낮음)로 분할된 PERUN 최대 교차검증 오차의 분포(x-축)를 보여준다.
도 29는 Y 염색체 수준으로부터 측정된 태아 분획 백분율(ChrFF, y-축)에 비해 6000개의 트레이닝 샘플들에 기초한 BFF 모델로부터 19,312개의 검사 샘플들에 대해 예측된 태아 분획 백분율(x-축)의 상관관계(R = 0.81, RMedSE = 1.5)를 보여준다.
도 30은 FRS에 기초한 높은 태아 분획 함량(좌측 상에 나타낸 분포) 및 낮은 태아 분획 함량(우측 상에 나타낸 분포)을 가진 빈(즉, 부분)에 대한 상대적 예측 오차(x-축)를 보여준다. 높은 태아 함량을 가진 빈은 보다 더 우수한 성능 및 보다 더 낮은 오차를 가진다. 예측 점수는 엘라스틱-넷(elastic-net) 회귀 절차에 기초하고, 이때 부트스트랩핑(bootstrapping)이 밀도 프로파일을 수득하는 데에 이용된다.
도 31은 태아 분획 함량(예를 들면, 낮음, 중간 낮음, 중간 높음, 높음)에 따라 분리된 빈의 서브세트에 대해 엘라스틱-넷 회귀 절차를 이용하여 측정한 4개의 모델 계수 분포들(x-축)을 보여준다. 보다 더 높은 태아 분획 함량을 가진 빈은 보다 큰 계수(양수 또는 음수)를 생성하는 경향을 가진다.
도 32는 여성 검사 샘플 및 남성 검사 샘플에 대해 BFF 방법을 이용하여 측정한 태아 분획 추정치에 대한 2개의 분포(x-축)를 보여준다. 2개의 분포는 실질적으로 중첩된다. 남아 태아와 여아 태아는 태아 분획의 분포에서 차이를 보이지 않았다(KS-검정 P = 0.49).
본원은 예를 들면, 유전적 변이의 존재 또는 부재를 확인하는 방법을 포함하는, 핵산 혼합물에서 폴리뉴클레오티드를 분석하는 방법을 제공한다. 모체 샘플로부터의 유전적 변이, 예를 들면, 태아 이배수성의 평가는 전형적으로 샘플에 존재하는 핵산을 서열결정하는 단계, 서열 리드를 게놈 내의 특정 영역에 맵핑하는 단계, 샘플에 대한 서열 리드를 정량하는 단계 및 정량을 분석하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 종종 샘플에서 핵산을 직접적으로 분석하고 샘플 중의 모든 또는 실질적으로 모든 핵산들에 대한 뉴클레오티드 서열 리드를 수득하는데, 이것은 비용이 많이 소요될 수 있고 불필요한 및/또는 무관한 데이터를 생성할 수 있다. 그러나, 특정 서열 기반 및/또는 길이 기반 분석과 병용된 특정 서열 기반 및/또는 길이 기반 분리 방법은 표적화된 게놈 영역, 예를 들면, 특정 염색체에 대한 구체적인 정보를 생성할 수 있고, 일부 경우 핵산 단편 기원, 예컨대, 모체 대 태아 기원을 구별할 수 있다. 특정 방법들은 서열결정 방법, 농축 기법 및 길이 기반 분석의 사용을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 특정 방법들은 핵산 단편의 뉴클레오티드 서열을 결정하지 않고 수행될 수 있다. 본원은 서열 기반 및/또는 길이 기반 분리 방법과 분석 방법을 병용하여 핵산 혼합물에서 폴리뉴클레오티드를 분석하는(예를 들면, 태아 이배수성의 존재 또는 부재를 확인하는) 방법을 제공한다.
유전적 변이를 확인하는 데에 유용한 방법, 공정 및 기계도 제공한다. 유전적 변이의 확인은 종종 카피 수 변이를 검출하는 단계를 포함하고/하거나 종종 카피 수 변이를 포함하는 수준을 조절하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수준이 조절되어 거짓 양성 또는 거짓 음성 진단의 가능성을 감소시키면서 하나 이상의 유전적 변이 또는 변경의 확인을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의한 유전적 변이의 확인은 특정 의학적 질환의 진단 또는 특정 의학적 질환에 대한 소인의 확인으로 이어질 수 있다. 유전적 변이의 확인은 의학적 결정을 용이하게 할 수 있고/있거나 도움이 되는 의학적 절차를 이용하게 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 방법을 수행하는 시스템, 기계 및 모듈도 제공한다.
샘플
본원은 핵산을 분석하는 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 핵산 단편의 혼합물 중의 핵산 단편이 분석된다. 핵산의 혼합물은 상이한 뉴클레오티드 서열, 상이한 단편 길이, 상이한 기원(예를 들면, 게놈 기원, 태아 대 모체 기원, 세포 또는 조직 기원, 샘플 기원, 대상체 기원 등) 또는 이들의 조합을 가진 2개 이상의 핵산 단편 종(species)을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법 및 장치에서 사용되는 핵산 또는 핵산 혼합물은 종종 대상체로부터 수득된 샘플로부터 단리된다. 대상체는 인간, 비-인간 동물, 식물, 세균, 진균 또는 원생생물을 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 살아있거나 살아있지 않는 유기체일 수 있다. 포유동물, 파충류, 조류, 양서류, 어류, 유제류, 반추동물, 솟과 동물(예를 들면, 소), 말과 동물(예를 들면, 말), 염소과 동물 및 양과 동물(예를 들면, 양, 염소), 돼지과 동물(예를 들면, 돼지), 낙타과 동물(예를 들면, 낙타, 라마, 알파카), 원숭이, 유인원(예를 들면, 고릴라, 침팬지), 곰과 동물(예를 들면, 곰), 가금류, 개, 고양이, 마우스, 래트, 물고기, 돌고래, 고래 및 상어를 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 인간 또는 비-인간 동물이 선택될 수 있다. 대상체는 남성 또는 여성(예를 들면, 여성, 임신 여성)일 수 있다. 대상체는 임의의 연령(예를 들면, 배아, 태아, 유아, 소아, 성체)일 수 있다.
핵산은 임의의 종류의 적합한 생물학적 표본 또는 샘플(예를 들면, 검사 샘플)로부터 단리될 수 있다. 샘플 또는 검사 샘플은 대상체 또는 이의 부분(예를 들면, 인간 대상체, 임신 여성, 태아)으로부터 단리되거나 수득된 임의의 표본일 수 있다. 표본의 비한정적 예는 혈액 또는 혈액 생성물(예를 들면, 혈청, 혈장 등), 제대혈, 융모막융모, 양수, 뇌척수액, 척수액, 세척액(예를 들면, 기관지폐포, 위, 복막, 도관, 귀, 관절경), 생검 샘플(예를 들면, 착상 전 배아로부터의 생검 샘플), 복강천자 샘플, 세포(혈액 세포, 태반 세포, 배아 또는 태아 세포, 태아 유핵 세포 또는 태아 세포 잔류물) 또는 이들의 부분(예를 들면, 미토콘드리아, 핵, 추출물 등), 여성 생식관의 세척물, 소변, 대변, 객담, 침, 코 점액, 전립선액, 세척물, 정액, 림프액, 담즙, 눈물, 땀, 모유, 가슴액 등 또는 이들의 조합물을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 대상체로부터의 유체 또는 조직을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 대상체로부터의 자궁경부 면봉이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액 및 종종 혈장 또는 혈청일 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "혈액"은 임신 여성 또는 가능한 임신에 대해 검사받는 여성으로부터의 혈액 샘플 또는 제제를 지칭한다. 상기 용어는 통상적으로 정의된 바와 같은 전혈, 혈액 생성물 또는 혈액의 임의의 분획, 예컨대, 혈청, 혈장, 버피 코트 등을 포괄한다. 혈액 또는 이의 분획은 종종 뉴클레오좀(nucleosomes)(예를 들면, 모체 및/또는 태아 뉴클레오좀)을 포함한다. 뉴클레오좀은 핵산을 포함하고 종종 세포 유리 또는 세포내 뉴클레오좀이다. 혈액은 버피 코트도 포함한다. 버피 코트는 종종 피콜 구배를 이용함으로써 단리된다. 버피 코트는 백혈 세포(예를 들면, 백혈구, T-세포, B-세포, 혈소판 등)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 버피 코트는 모체 및/또는 태아 핵산을 포함한다. 혈액 혈장은 항응고제로 처리된 혈액의 원심분리로부터 생성된 전혈의 분획을 지칭한다. 혈액 혈청은 혈액 샘플이 응고된 후 남아있는 유체의 묽은 부분을 지칭한다. 유체 또는 조직 샘플은 종종 병원 또는 진료소가 일반적으로 따르는 표준 프로토콜에 따라 채취된다. 혈액의 경우, 적절한 양(예를 들면, 3 내지 40 ㎖)의 말초 혈액이 종종 채취되고 준비 전에 또는 후에 표준 절차에 따라 저장될 수 있다. 핵산이 추출되는 유체 또는 조직 샘플은 세포 유리(예를 들면, 세포 무함유) 상태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유체 또는 조직 샘플은 세포 요소 또는 세포 잔류물을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 태아 세포 또는 암세포가 샘플에 포함될 수 있다.
샘플은 종종 불균질한데, 이것은 1종 초과의 핵산 종이 샘플에 존재한다는 것을 의미한다. 예를 들면, 불균질한 핵산은 (i) 태아로부터 유래한 핵산 및 모체로부터 유래한 핵산, (ii) 암 핵산 및 비-암 핵산, (iii) 병원체 핵산 및 숙주 핵산, 및 보다 일반적으로 (iv) 돌연변이된 핵산 및 야생형 핵산을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 샘플은 1종 초과의 세포, 예컨대, 태아 세포 및 모체 세포, 암세포 및 비-암세포, 또는 병원체 및 숙주 세포가 존재하기 때문에 불균질할 수 있다. 일부 실시양태에서, 소수의 핵산 종 및 다수의 핵산 종이 존재한다.
본원에 기재된 기술의 출생전 적용을 위해, 유체 또는 조직 샘플은 검사에 적합한 임신 연령의 여성, 또는 가능한 임신에 대해 검사받는 여성으로부터 채취될 수 있다. 적합한 임신 연령은 수행되는 출생전 검사에 따라 달라질 수 있다. 일부 실시양태에서, 임신 여성 대상체는 종종 임신의 첫 번째 3개월, 종종 임신의 두 번째 3개월, 또는 종종 임신의 세 번째 3개월에 있다. 일부 실시양태에서, 유체 또는 조직은 태아 임신의 약 1주 내지 약 45주(예를 들면, 태아 임신의 1주 내지 4주, 4주 내지 8주, 8주 내지 12주, 12주 내지 16주, 16주 내지 20주, 20주 내지 24주, 24주 내지 28주, 28주 내지 32주, 32주 내지 36주, 36주 내지 40주, 또는 40주 내지 44주), 종종 태아 임신의 약 5주 내지 약 28주(예를 들면, 태아 임신의 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주, 15주, 16주, 17주, 18주, 19주, 20주, 21주, 22주, 23주, 24주, 25주, 26주 또는 27주)에서 임신 여성으로부터 채취된다. 일부 실시양태에서, 유체 또는 조직 샘플은 분만(예를 들면, 질 분만 또는 비-질 분만(예를 들면, 수술적 분만)) 동안 또는 직후에 임신 여성으로부터 채취된다.
혈액 샘플의 획득 및 DNA의 추출
본원의 방법은 종종 모체 및/또는 태아 유전적 변이의 존재 또는 부재를 검출하고/하거나 임신 동안 및 종종 후에 태아 및/또는 임신 여성의 건강을 모니터링하기 위해 비침습 수단으로서 모체 혈액에서 발견된 태아 DNA를 분리하고 농축하고 분석하는 단계를 포함한다. 따라서, 본원의 일부 방법들을 실시하는 제1 단계는 종종 임신 여성으로부터 혈액 샘플을 수득하고 샘플로부터 DNA를 추출하는 것을 포함한다.
혈액 샘플의 획득
혈액 샘플은 본 기술의 방법을 이용한 검사에 적합한 임신 연령의 임신 여성으로부터 수득될 수 있다. 적합한 임신 연령은 하기 논의된 바와 같이 검사되는 장애에 따라 달라질 수 있다. 여성으로부터의 혈액의 채취는 종종 병원 또는 진료소가 일반적으로 따르는 표준 프로토콜에 따라 수행된다. 적절한 양, 예를 들면, 전형적으로 5 내지 50 ㎖의 말초 혈액이 종종 채취되고 추가 준비 전에 표준 절차에 따라 저장될 수 있다. 혈액 샘플은 샘플에 존재하는 핵산의 분해 또는 질 손상을 최소화하는 방식으로 채취될 수 있거나, 저장될 수 있거나 수송될 수 있다.
혈액 샘플의 준비
모체 혈액에서 발견된 태아 DNA의 분석은 예를 들면, 전혈, 혈청 또는 혈장을 사용함으로써 수행될 수 있다. 모체 혈액으로부터 혈청 또는 혈장을 준비하는 방법은 공지되어 있다. 예를 들면, 임신 여성의 혈액은 혈액 응고를 방지하기 위해 EDTA를 함유하는 튜브 또는 특수 상업용 제품, 예컨대, 바큐테이너(Vacutainer) SST(벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson), 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재) 내에 놓여질 수 있고, 그 후 혈장이 원심분리를 통해 전혈로부터 수득될 수 있다. 혈청은 혈액 응고 후 원심분리를 이용하거나 이용하지 않고 수득될 수 있다. 원심분리가 이용되는 경우, 원심분리는 (배타적으로는 아니지만) 전형적으로 적절한 속도, 예를 들면, 1,500xg 내지 3,000xg에서 수행된다. 혈장 또는 혈청은 DNA 추출을 위해 새로운 튜브로 옮겨지기 전에 추가 원심분리 단계로 처리될 수 있다.
DNA는 전혈의 세포 유리 부분 이외에 여성으로부터의 전혈 샘플의 원심분리 및 혈장의 제거 후 수득될 수 있는, 버피 코트 부분이 풍부한 세포 분획으로부터도 회수될 수 있다.
DNA의 추출
혈액을 포함하는 생물학적 샘플로부터 DNA를 추출하는 다수의 공지된 방법들이 존재한다. (예를 들면, 문헌(Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d ed., 2001)에 기재된) 일반적인 DNA 준비 방법을 따를 수 있고; 다양한 상업적으로 입수가능한 시약들 또는 키트들, 예컨대, 퀴아젠(Qiagen)의 QIAamp 순환 핵산 키트, QiaAmp DNA 미니 키트 또는 QiaAmp DNA 혈액 미니 키트(퀴아젠, 독일 힐덴 소재), 게노믹프렙(GenomicPrep)™ 혈액 DNA 단리 키트(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재), 및 GFX™ 게놈 혈액 DNA 정제 키트(아머샴(Amersham), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)도 임신 여성으로부터의 혈액 샘플로부터 DNA를 수득하는 데에 사용될 수 있다. 이 방법들 중 1종 초과의 방법들이 병용될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 샘플은 먼저 1종 이상의 방법에 의해 태아 핵산에 대해 농축될 수 있거나 상대적으로 농축될 수 있다. 예를 들면, 본 기술의 조성물 및 프로세스를 단독으로 또는 다른 식별 인자들과 함께 사용하여 태아 DNA와 모체 DNA의 식별을 수행할 수 있다. 이 인자들의 예는 X 염색체와 Y 염색체 사이의 단일 뉴클레오티드 차이, Y 염색체 특이적 서열, 게놈의 다른 부분에 위치하는 다형성, 태아 DNA와 모체 DNA 사이의 크기 차이, 및 모체 조직과 태아 조직 사이의 메틸화 패턴의 차이를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
특정 핵산 종에 대해 샘플을 농축하는 다른 방법은 2007년 5월 30일자로 출원된 PCT 특허출원 제PCT/US07/69991호, 2007년 6월 15일자로 출원된 PCT 특허출원 제PCT/US2007/071232호, 미국 가특허출원 제60/968,876호 및 미국 가특허출원 제60/968,878호(출원인에게 양도됨), 및 2005년 11월 28일자로 출원된 PCT 특허출원 제PCT/EP05/012707호(이들 모두 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 모체 핵산은 샘플로부터 (부분적으로, 실질적으로, 거의 완전히 또는 완전히) 선택적으로 제거된다.
용어 "핵산" 및 "핵산 분자"는 본 개시내용 전체에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 용어들은 임의의 조성의 핵산, 예컨대, DNA(예를 들면, 상보적 DNA(cDNA), 게놈 DNA(gDNA) 등), RNA(예를 들면, 메신저 RNA(mRNA), 짧은 억제 RNA(siRNA), 리보좀 RNA(rRNA), tRNA, 마이크로RNA, 태아 또는 태반에 의해 고도로 발현된 RNA 등), 및/또는 DNA 또는 RNA 유사체(예를 들면, 염기 유사체, 당 유사체 및/또는 비천연 골격 등을 함유함), RNA/DNA 하이브리드 및 폴리아미드 핵산(PNA)(이들 모두 단일 또는 이중 가닥 형태로 존재할 수 있음)을 지칭하고, 달리 한정되어 있지 않은 한, 천연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 작용할 수 있는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 포괄할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 시험관내 또는 숙주 세포, 세포, 세포 핵 또는 세포의 세포질에서 복제할 수 있거나 복제될 수 있는 플라스미드, 파지, 자가 복제 서열(ARS), 센트로미어(centromere), 인공 염색체, 염색체 또는 다른 핵산일 수 있거나 이들로부터 유래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 주형 핵산은 단일 염색체로부터 유래할 수 있다(예를 들면, 핵산 샘플은 이배수체 유기체로부터 수득된 샘플의 한 염색체로부터 유래할 수 있다). 달리 구체적으로 한정되어 있지 않은 한, 상기 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 성질을 갖고 천연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 달리 표시되어 있지 않은 한, 특정 핵산 서열은 명시적으로 표시된 서열뿐만 아니라 이의 보존적으로 변경된 변이체(예를 들면, 축퇴 코돈 치환), 대립형질, 오르톨로그(orthologs), 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) 및 상보적 서열도 함축적으로 포괄한다. 구체적으로, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환되어 있는 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다. 용어 핵산은 좌위, 유전자, cDNA, 및 유전자에 의해 코딩된 mRNA와 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 뉴클레오티드 유사체로부터 합성된 RNA 또는 DNA의 등가물, 유도체, 변이체 및 유사체로서 단일 가닥("센스" 또는 "안티센스", "플러스" 가닥 또는 "마이너스" 가닥, "정방향" 리딩 프레임 또는 "역방향" 리딩 프레임) 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드도 포함할 수 있다. 용어 "유전자"는 폴리펩티드 쇄를 생성하는 데에 관여하는 DNA의 분절을 의미하고; 상기 용어는 개별 코딩 분절(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)뿐만 아니라 유전자 생성물의 전사/번역 및 전사/번역의 조절에 관여하는, 코딩 서열 앞 및 뒤의 영역(리더 및 트레일러)도 포함한다. 데옥시리보뉴클레오티드는 데옥시아데노신, 데옥시사이티딘, 데옥시구아노신 및 데옥시타이미딘을 포함한다. RNA의 경우, 염기 사이토신은 우라실로 대체된다. 주형 핵산은 대상체로부터 수득된 핵산을 주형으로서 사용함으로써 제조될 수 있다.
핵산 단리 및 프로세싱
핵산은 당분야에서 공지된 방법에 의해 하나 이상의 공급원(예를 들면, 세포, 혈청, 혈장, 버피 코트, 림프액, 피부, 토양 등)으로부터 유래할 수 있다. 임의의 적합한 방법이 생물학적 샘플(예를 들면, 혈액 또는 혈액 생성물)로부터 DNA를 단리하고/하거나, 추출하고/하거나 정제하는 데에 사용될 수 있고, 이러한 방법의 비한정적 예는 (예를 들면, 문헌(Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d ed., 2001)에 기재된) DNA 준비 방법, 다양한 상업적으로 입수가능한 시약들 또는 키트들, 예컨대, 퀴아젠의 QIAamp 순환 핵산 키트, QIAamp DNA 미니 키트 또는 QIAamp DNA 혈액 미니 키트(퀴아젠, 독일 힐덴 소재), 게노믹프렙™ 혈액 DNA 단리 키트(프로메가, 미국 위스콘신주 매디슨 소재), 및 GFX™ 게놈 혈액 DNA 정제 키트(아머샴, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 등 또는 이들의 조합을 포함한다.
세포 용해 절차 및 시약은 당분야에서 공지되어 있고 일반적으로 화학적(예를 들면, 세제, 저장성 용액, 효소적 절차 등, 또는 이들의 조합), 물리적(예를 들면, 프렌치 프레스(French press), 초음파처리 등), 또는 전기용해적 용해 방법에 의해 수행될 수 있다. 임의의 적합한 용해 절차가 이용될 수 있다. 예를 들면, 화학적 방법은 일반적으로 용해제를 사용하여 세포를 파괴하고 세포로부터 핵산을 추출한 후 카오트로픽(chaotropic) 염으로 처리한다. 물리적 방법, 예컨대, 동결/해동 후 분쇄, 세포 프레스의 사용 등도 유용하다. 높은 염 용해 절차도 통상적으로 이용된다. 예를 들면, 알칼리성 용해 절차가 이용될 수 있다. 후자 절차는 전통적으로 페놀-클로로포름 용액의 사용을 도입하고, 3개의 용액을 사용하는 대안적 페놀-클로로포름 무함유 절차도 이용될 수 있다. 후자 절차에서, 한 용액은 15 mM 트리스(Tris)(pH 8.0), 10 mM EDTA 및 100 ㎍/㎖ Rnase A를 함유할 수 있고; 제2 용액은 0.2 N NaOH 및 1% SDS를 함유할 수 있고; 제3 용액은 3 M KOAc(pH 5.5)를 함유할 수 있다. 이 절차들은 본원에 전체적으로 도입된 문헌(Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6 (1989))에서 찾아볼 수 있다.
핵산은 또 다른 핵산에 비해 상이한 시점에서 단리될 수 있고, 이때 각각의 샘플은 동일한 또는 상이한 공급원으로부터 유래한다. 핵산은 예를 들면, 핵산 라이브러리, 예컨대, cDNA 또는 RNA 라이브러리로부터 유래할 수 있다. 핵산은 샘플로부터의 핵산 분자의 핵산 정제 또는 단리 및/또는 증폭의 결과일 수 있다. 본원에 기재된 프로세스를 위해 제공된 핵산은 1개 샘플 또는 2개 이상의 샘플(예를 들면, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상 또는 20개 이상의 샘플)로부터의 핵산을 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산은 세포외 핵산을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "세포외 핵산"은 세포를 실질적으로 갖지 않는 공급원으로부터 단리된 핵산을 지칭할 수 있고, "세포 유리" 핵산, "세포 유리 순환 핵산"(예를 들면, CCF 단편) 및/또는 "세포 유리 순환" 핵산으로서도 지칭된다. 세포외 핵산은 혈액(예를 들면, 임신 여성의 혈액)에 존재할 수 있고 이 혈액으로부터 수득될 수 있다. 세포외 핵산은 종종 검출가능한 세포를 포함하지 않고 세포 요소 또는 세포 잔류물을 함유할 수 있다. 세포외 핵산을 위한 무세포 공급원의 비한정적 예는 혈액, 혈액 혈장, 혈액 혈청 및 소변이다. 본원에서 사용된 용어 "세포 유리 순환 샘플 핵산을 수득하는"은 샘플을 직접적으로 수득하는 것(예를 들면, 샘플, 예를 들면, 검사 샘플을 채취하는 것) 또는 샘플을 채취한 또 다른 대상체로부터 샘플을 수득하는 것을 포함한다. 이론에 의해 한정되지 않지만, 세포외 핵산은 종종 광범위한 일련의 길이를 가진 세포외 핵산(예를 들면, "래더(ladder)")을 위한 기초를 제공하는, 세포 아폽토시스 및 세포 분해의 생성물일 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포외 핵산은 상이한 핵산 종들을 포함할 수 있으므로 본원에서 "불균질한" 세포외 핵산으로서 지칭된다. 예를 들면, 암을 가진 사람으로부터의 혈액 혈청 또는 혈장은 암세포로부터의 핵산 및 비-암세포로부터의 핵산을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 임신 여성으로부터의 혈액 혈청 또는 혈장은 모체 핵산 및 태아 핵산을 포함할 수 있다. 일부 경우, 태아 핵산은 종종 전체 핵산의 약 5% 내지 약 50%이다(예를 들면, 총 핵산의 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48% 또는 49%가 태아 핵산이다). 일부 실시양태에서, 핵산 중의 태아 핵산의 대다수는 약 500개 이하의 염기쌍의 길이를 가진다(예를 들면, 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 태아 핵산이 약 500개 이하의 염기쌍의 길이를 가진다). 일부 실시양태에서, 핵산 중의 태아 핵산의 대다수는 약 250개 이하의 염기쌍의 길이를 가진다(예를 들면, 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 태아 핵산이 약 250개 이하의 염기쌍의 길이를 가진다). 일부 실시양태에서, 핵산 중의 태아 핵산의 대다수는 약 200개 이하의 염기쌍의 길이를 가진다(예를 들면, 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 태아 핵산이 약 200개 이하의 염기쌍의 길이를 가진다). 일부 실시양태에서, 핵산 중의 태아 핵산의 대다수는 약 150개 이하의 염기쌍의 길이를 가진다(예를 들면, 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 태아 핵산이 약 150개 이하의 염기쌍의 길이를 가진다). 일부 실시양태에서, 핵산 중의 태아 핵산의 대다수는 약 100개 이하의 염기쌍의 길이를 가진다(예를 들면, 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 태아 핵산이 약 100개 이하의 염기쌍의 길이를 가진다). 일부 실시양태에서, 핵산 중의 태아 핵산의 대다수는 약 50개 이하의 염기쌍의 길이를 가진다(예를 들면, 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 태아 핵산이 약 50개 이하의 염기쌍의 길이를 가진다). 일부 실시양태에서, 핵산 중의 태아 핵산의 대다수는 약 25개 이하의 염기쌍의 길이를 가진다(예를 들면, 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 태아 핵산이 약 25개 이하의 염기쌍의 길이를 가진다).
일부 실시양태에서, 핵산은 핵산을 함유하는 샘플(들)의 프로세싱 없이 본원에 기재된 방법을 수행하기 위해 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 핵산을 함유하는 샘플(들)의 프로세싱 후 본원에 기재된 방법을 수행하기 위해 제공된다. 예를 들면, 핵산은 샘플(들)로부터 추출될 수 있거나, 단리될 수 있거나, 정제될 수 있거나, 부분적으로 정제될 수 있거나 증폭될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "단리된"은 그의 최초 환경(예를 들면, 천연 발생 핵산인 경우 천연 환경 또는 외생적으로 발현된 경우 숙주 세포)으로부터 제거된 핵산을 지칭하므로, 그의 최초 환경으로부터 인간 중재에 의해(예를 들면, "인간의 손에 의해") 변경된다. 본원에서 사용된 용어 "단리된 핵산"은 대상체(예를 들면, 인간 대상체)로부터 제거된 핵산을 지칭할 수 있다. 단리된 핵산은 공급원 샘플에 존재하는 성분의 양보다 더 적은 비-핵산 성분(예를 들면, 단백질, 지질)을 구비할 수 있다. 단리된 핵산을 포함하는 조성물은 약 50% 내지 99% 초과의 비-핵산 성분을 함유하지 않을 수 있다. 단리된 핵산을 포함하는 조성물은 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 초과의 비-핵산 성분을 함유하지 않을 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "정제된"은 핵산을 정제 절차로 처리하기 전에 존재하는 비-핵산 성분의 양보다 더 적은 비-핵산 성분(예를 들면, 단백질, 지질, 탄수화물)을 함유하는 제공된 핵산을 지칭할 수 있다. 정제된 핵산을 포함하는 조성물은 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 초과의 다른 비-핵산 성분을 함유하지 않을 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "정제된"은 핵산이 유래한 샘플 공급원에 존재하는 핵산 종보다 더 적은 핵산 종을 함유하는 제공된 핵산을 지칭할 수 있다. 정제된 핵산을 포함하는 조성물은 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 초과의 다른 핵산 종을 함유하지 않을 수 있다. 예를 들면, 태아 핵산은 모체 핵산 및 태아 핵산을 포함하는 혼합물로부터 정제될 수 있다. 일부 예에서, 태아 핵산의 작은 단편을 포함하는 뉴클레오좀은 모체 핵산의 보다 큰 단편을 포함하는 보다 큰 뉴클레오좀 복합체의 혼합물로부터 정제될 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산은 본원에 기재된 방법 전, 동안 또는 후에 단편화되거나 절단된다. 단편화된 또는 절단된 핵산은 약 5개 내지 약 10,000개 염기쌍, 약 100개 내지 약 1,000개 염기쌍, 약 100개 내지 약 500개 염기쌍, 또는 약 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 2000개, 3000개, 4000개, 5000개, 6000개, 7000개, 8000개 또는 9000개 염기쌍의 공칭, 평균치(average) 또는 평균(mean) 길이를 가질 수 있다. 단편은 당분야에서 공지된 적합한 방법에 의해 생성될 수 있고, 핵산 단편의 평균치, 평균 또는 공칭 길이는 적절한 단편 생성 절차를 선택함으로써 조절될 수 있다.
핵산 단편은 중첩 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있고, 이러한 중첩 서열은 단편화되지 않은 대응물 핵산 또는 이의 분절의 뉴클레오티드 서열의 구축을 용이하게 할 수 있다. 예를 들면, 한 단편은 하위서열 x 및 y를 가질 수 있고, 또 다른 단편은 하위서열 y 및 z를 가질 수 있고, 이때 x, y 및 z는 5개 이상의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있는 뉴클레오티드 서열이다. 일부 실시양태에서, 중첩 서열 y는 샘플로부터의 핵산에서 x-y-z 뉴클레오티드 서열의 구축을 용이하게 하는 데에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 (예를 들면, 불완전한 또는 종결된 특이적 절단 반응으로부터) 부분적으로 단편화될 수 있거나 전체적으로 단편화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산은 적합한 방법에 의해 단편화되거나 절단되고, 이러한 방법의 비한정적 예는 물리적 방법(예를 들면, 전단, 예를 들면, 초음파처리, 프렌치 프레스, 가열, UV 방사선조사 등), 효소적 방법(예를 들면, 효소적 절단제(예를 들면, 적합한 뉴클레아제(nuclease), 적합한 제한 효소, 적합한 메틸화 민감성 제한 효소)), 화학적 방법(예를 들면, 알킬화, DMS, 피페리딘, 산 가수분해, 염기 가수분해, 가열 등 또는 이들의 조합), 미국 특허출원 공보 제20050112590호에 기재된 공정 등 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "단편화" 또는 "절단"은 핵산 분자, 예컨대, 핵산 주형 유전자 분자 또는 이의 증폭된 생성물이 2개 이상의 보다 작은 핵산 분자들로 잘라질 수 있는 절차 또는 조건을 지칭한다. 이러한 단편화 또는 절단은 서열 특이적, 염기 특이적 또는 비특이적일 수 있고, 예를 들면, 화학적, 효소적 또는 물리적 단편화를 포함하는 임의의 다양한 방법, 시약 또는 조건에 의해 달성될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "단편", "절단 생성물", "절단된 생성물" 또는 이의 문법적 파생어는 핵산 주형 유전자 분자 또는 이의 증폭된 생성물의 단편화 또는 절단으로부터 생성된 핵산 분자를 지칭한다. 이러한 단편 또는 절단된 생성물은 절단 반응으로부터 생성된 모든 핵산 분자들을 지칭할 수 있지만, 전형적으로 이러한 단편 또는 절단된 생성물은 핵산 주형 유전자 분자, 또는 핵산 주형 유전자 분자의 상응하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 이의 증폭된 생성물의 분절의 단편화 또는 절단으로부터 생성된 핵산 분자만을 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "증폭된"은 표적 핵산 또는 이의 분절과 동일한 또는 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 가진 앰플리콘 핵산을 선형적으로 또는 기하급수적으로 생성하는 공정으로 샘플 중의 표적 핵산을 처리하는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 용어 "증폭된"은 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 포함하는 방법을 지칭한다. 예를 들면, 증폭된 생성물은 핵산 주형 서열의 증폭된 뉴클레오티드 영역보다 하나 이상 더 많은 뉴클레오티드를 함유할 수 있다(예를 들면, 프라이머는 핵산 주형 유전자 분자에 상보적인 뉴클레오티드들 이외에 "가외의" 뉴클레오티드, 예컨대, 전사 개시 서열을 함유하여, "가외의" 뉴클레오티드 또는 핵산 주형 유전자 분자의 증폭된 뉴클레오티드 영역에 상응하지 않는 뉴클레오티드를 함유하는 증폭된 생성물을 생성할 수 있다). 따라서, 단편은 대표적인 핵산 주형 분자로부터의 또는 이러한 분자에 기초한 뉴클레오티드 서열 정보를 적어도 부분적으로 함유하는 증폭된 핵산 분자의 분절 또는 부분으로부터 생성된 단편을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "상보적 절단 반응"은 동일한 표적 또는 기준 핵산 또는 단백질의 대안적 절단 패턴이 생성되도록 상이한 절단 시약을 사용하거나 동일한 절단 시약의 절단 특이성을 변경시킴으로써 동일한 핵산에 대해 수행되는 절단 반응을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 하나 이상의 반응 용기에서 하나 이상의 특이적 절단제(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이상의 특이적 절단제)로 처리될 수 있다(예를 들면, 핵산은 별개의 용기에서 각각의 특이적 절단제로 처리된다). 본원에서 사용된 용어 "특이적 절단제"는 하나 이상의 특이적 부위에서 핵산을 절단할 수 있는 물질, 종종 화학물질 또는 효소를 지칭한다.
핵산은 본원에 기재된 방법을 위해 핵산을 제공하기 전에 핵산에서 일부 뉴클레오티드들을 변경시키는 공정에 노출될 수 있다. 예를 들면, 핵산 내의 뉴클레오티드의 메틸화 상태를 기초로 핵산을 선택적으로 변경시키는 공정이 핵산에 적용될 수 있다. 추가로, 조건, 예컨대, 높은 온도, 자외선 방사선조사, x-방사선조사 등은 핵산 분자의 서열에서 변화를 유도할 수 있다. 핵산은 적합한 핵산 분석을 수행하기에 유용한 임의의 적합한 형태로 제공될 수 있다.
핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 예를 들면, 단일 가닥 DNA는 예를 들면, 가열 또는 알칼리를 사용한 처리로 이중 가닥 DNA를 변성시킴으로써 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 올리고뉴클레오티드 또는 DNA 유사 분자, 예컨대, 펩티드 핵산(PNA)에 의한 이중체 DNA 분자의 가닥 침습에 의해 형성된 D 루프(loop) 구조로 존재한다. D 루프 형성은 예를 들면, 당분야에서 공지된 방법을 이용한 이. 콜라이(E. Coli) RecA 단백질의 첨가 및/또는 염 농도의 변경에 의해 용이해질 수 있다.
게놈 표적
일부 실시양태에서, 본원에서 표적 단편으로서도 지칭되는 표적 핵산은 특정 게놈 영역 또는 복수의 게놈 영역들(예를 들면, 단일 염색체, 염색체의 세트 및/또는 특정 염색체 영역)로부터의 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 게놈 영역은 태아 유전적 이상(예를 들면, 이배수성)뿐만 아니라, 돌연변이(예를 들면, 점 돌연변이), 삽입, 추가, 결실, 전위, 트리뉴클레오티드 반복부 장애 및/또는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 유전적 이상과 관련될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기준 단편으로서도 지칭되는 기준 핵산은 태아 유전적 이상과 관련되지 않은 특정 게놈 영역 또는 복수의 게놈 영역들로부터의 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 및/또는 기준 핵산(즉, 표적 단편 및/또는 기준 단편)은 관심있는 염색체 또는 기준 염색체에 실질적으로 유일하게 존재하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다(예를 들면, 동일한 뉴클레오티드 서열 또는 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열이 게놈의 다른 부분에서 발견되지 않는다).
일부 실시양태에서, 복수의 게놈 영역들로부터의 단편이 분석된다. 일부 실시양태에서, 복수의 게놈 영역들로부터의 표적 단편 및 기준 단편이 분석된다. 일부 실시양태에서, 복수의 게놈 영역들로부터의 단편은 예를 들면, 관심있는 염색체의 존재, 부재, 양(예를 들면, 상대적 양) 또는 비를 확인하기 위해 분석된다. 일부 실시양태에서, 관심있는 염색체는 이배수체인 것으로 의심되는 염색체이고 본원에서 "검사 염색체"로서 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 게놈 영역들로부터의 단편은 추정되는 정배수체 염색체에 대헤 분석된다. 이러한 염색체는 본원에서 "기준 염색체"로서 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 검사 염색체들이 분석된다. 일부 실시양태에서, 검사 염색체는 13번 염색체(Chr13), 18번 염색체(Chr18) 및 21번 염색체(Chr21)로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 기준 염색체는 1번 염색체, 2번 염색체, 3번 염색체, 4번 염색체, 5번 염색체, 6번 염색체, 7번 염색체, 8번 염색체, 9번 염색체, 10번 염색체, 11번 염색체, 12번 염색체, 13번 염색체, 14번 염색체, 15번 염색체, 16번 염색체, 17번 염색체, 18번 염색체, 19번 염색체, 20번 염색체, 21번 염색체, 22번 염색체, X 염색체 및 Y 염색체로부터 선택되고, 종종 기준 염색체는 상염색체로부터 선택된다(즉, X 및 Y가 아니다). 일부 실시양태에서, 20번 염색체(Chr20)가 기준 염색체로서 선택된다. 일부 실시양태에서, 14번 염색체가 기준 염색체로서 선택된다. 일부 실시양태에서, 9번 염색체가 기준 염색체로서 선택된다. 일부 실시양태에서, 검사 염색체 및 기준 염색체는 동일한 개체로부터의 염색체이다. 일부 실시양태에서, 검사 염색체 및 기준 염색체는 상이한 개체로부터의 염색체이다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 게놈 영역으로부터의 단편이 검사 염색체 및/또는 기준 염색체에 대해 분석된다. 일부 실시양태에서, 10개 이상의 게놈 영역들(예를 들면, 약 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개 또는 90개의 게놈 영역들)로부터의 단편들이 검사 염색체 및/또는 기준 염색체에 대해 분석된다. 일부 실시양태에서, 100개 이상의 게놈 영역들(예를 들면, 약 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개 또는 900개의 게놈 영역들)로부터의 단편들이 검사 염색체 및/또는 기준 염색체에 대해 분석된다. 일부 실시양태에서, 1,000개 이상의 게놈 영역들(예를 들면, 약 2,000개, 3,000개, 4,000개, 5,000개, 6,000개, 7,000개, 8,000개 또는 9,000개의 게놈 영역들)로부터의 단편들이 검사 염색체 및/또는 기준 염색체에 대해 분석된다. 일부 실시양태에서, 10,000개 이상의 게놈 영역들(예를 들면, 약 20,000개, 30,000개, 40,000개, 50,000개, 60,000개, 70,000개, 80,000개 또는 90,000개의 게놈 영역들)로부터의 단편들이 검사 염색체 및/또는 기준 염색체에 대해 분석된다. 일부 실시양태에서, 100,000개 이상의 게놈 영역들(예를 들면, 약 200,000개, 300,000개, 400,000개, 500,000개, 600,000개, 700,000개, 800,000개 또는 900,000개의 게놈 영역들)로부터의 단편들이 검사 염색체 및/또는 기준 염색체에 대해 분석된다.
핵산의 하위집단의 농축 및 분리
일부 실시양태에서, 핵산(예를 들면, 세포외 핵산)은 핵산의 하위집단 또는 종에 대해 농축되거나 상대적으로 농축된다. 핵산 하위집단은 예를 들면, 태아 핵산, 모체 핵산, 특정 길이 또는 길이 범위의 단편을 포함하는 핵산, 또는 특정 게놈 영역(예를 들면, 단일 염색체, 염색체의 세트 및/또는 일부 염색체 영역)으로부터의 핵산을 포함할 수 있다. 이러한 농축된 샘플은 본원에서 제공된 방법과 함께 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 기술의 방법은 샘플 중의 핵산, 예를 들면, 태아 핵산의 하위집단을 농축하는 추가 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 태아 분획을 측정하는 방법도 태아 핵산을 농축하는 데에 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 모체 핵산은 샘플로부터 (부분적으로, 실질적으로, 거의 완전히 또는 완전히) 선택적으로 제거된다. 일부 실시양태에서, 특정 낮은 카피 수 종 핵산(예를 들면, 태아 핵산)의 농축은 정량적 민감성을 개선할 수 있다. 핵산의 특정 종에 대해 샘플을 농축하는 방법은 예를 들면, 미국 특허 제6,927,028호, 국제 특허출원 공보 제WO2007/140417호, 국제 특허출원 공보 제WO2007/147063호, 국제 특허출원 공보 제WO2009/032779호, 국제 특허출원 공보 제WO2009/032781호, 국제 특허출원 공보 제WO2010/033639호, 국제 특허출원 공보 제WO2011/034631호, 국제 특허출원 공보 제WO2006/056480호 및 국제 특허출원 공보 제WO2011/143659호(이들 모두 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 핵산은 일부 표적 단편 종 및/또는 기준 단편 종에 대해 농축된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 후술된 하나 이상의 길이 기초 분리 방법을 이용함으로써 특정 핵산 단편 길이 또는 단편 길이의 범위에 대해 농축된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 본원에 기재되어 있고/있거나 당분야에서 공지되어 있는 하나 이상의 서열 기초 분리 방법을 이용함으로써 선택 게놈 영역(예를 들면, 염색체)으로부터의 단편에 대해 농축된다. 샘플에서 핵산 하위집단(예를 들면, 태아 핵산)을 농축하는 일부 방법들이 상세히 후술되어 있다.
본원에 기재된 방법과 함께 이용될 수 있는 핵산 하위집단(예를 들면, 태아 핵산)을 농축하는 일부 방법들은 모체 핵산과 태아 핵산 사이의 유전외적 차이를 활용하는 방법을 포함한다. 예를 들면, 태아 핵산은 메틸화 차이를 기초로 모체 핵산으로부터 식별될 수 있고 분리될 수 있다. 메틸화 기초 태아 핵산 농축 방법은 본원에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공보 제2010/0105049호에 기재되어 있다. 이러한 방법들은 종종 샘플 핵산을 메틸화 특이적 결합제(메틸-CpG 결합 단백질(MBD), 메틸화 특이적 항체 등)에 결합시키는 단계 및 상이한 메틸화 상태를 기초로 결합되지 않은 핵산으로부터 결합된 핵산을 분리하는 단계를 포함한다. 이러한 방법들은 하나 이상의 태아 핵산 영역에 대해 샘플을 농축하기 위해 모체 핵산을 선택적으로 및 완전히 또는 실질적으로 분해하는 효소를 사용하여 모체 샘플로부터의 핵산을 선택적으로 분해함으로써 모체 샘플에서 태아 핵산 영역을 농축할 수 있게 하는 메틸화 민감성 제한 효소(전술된 바와 같음; 예를 들면, HhaI 및 HpaII)의 사용을 포함할 수도 있다.
본원에 기재된 방법과 함께 이용될 수 있는 핵산 하위집단(예를 들면, 태아 핵산)을 농축하는 또 다른 방법은 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease) 향상 다형성 서열 방법, 예컨대, 본원에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공보 제2009/0317818호에 기재된 방법이다. 이러한 방법은 비-표적 대립형질을 포함하는 핵산을 인식하나 표적 대립형질을 인식하지 않는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 비-표적 대립형질을 포함하는 핵산을 절단하는 단계; 및 절단된 핵산을 증폭하지 않으면서 절단되지 않은 핵산을 증폭하는 단계로서, 이때 절단되지 않은 증폭된 핵산이 비-표적 핵산(예를 들면, 모체 핵산)에 비해 상대적으로 농축된 표적 핵산(예를 들면, 태아 핵산)을 나타내는 것인 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 예를 들면, 절단제에 의한 선택적 분해에 민감한 다형성 부위를 가진 대립형질을 포함하도록 선택될 수 있다.
본원에 기재된 방법과 함께 사용될 수 있는 핵산 하위집단(예를 들면, 태아 핵산)을 농축하는 일부 방법들은 선택적 효소 분해 방법을 포함한다. 이러한 방법은 엑소뉴클레아제(exonuclease) 분해로부터 표적 서열을 보호하여 샘플에서 원하지 않는 서열(예를 들면, 모체 DNA)의 제거를 용이하게 하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 한 방법에서, 샘플 핵산을 변성시켜 단일 가닥 핵산을 생성하고, 단일 가닥 핵산을 적합한 어닐링 조건 하에서 하나 이상의 표적 특이적 프라이머 쌍과 접촉시키고, 어닐링된 프라이머를 뉴클레오티드 중합으로 연장하여 이중 가닥 표적 서열을 생성하고 단일 가닥(즉, 비-표적) 핵산을 분해하는 뉴클레아제를 사용하여 단일 가닥 핵산을 분해한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 추가 주기에 동안 반복될 수 있다. 일부 실시양태에서, 동일한 표적 특이적 프라이머 쌍을 사용하여 연장의 제1 주기 및 제2 주기 각각을 프라이밍하고, 일부 실시양태에서 제1 주기 및 제2 주기를 위해 상이한 표적 특이적 프라이머 쌍을 사용한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 서열 기반 분리 방법을 이용하여 핵산을 선택된 게놈 영역(예를 들면, 염색체)으로부터의 단편에 대해 농축한다. 일부 실시양태에서, 길이 기반 분리 방법과 서열 기반 분리 방법을 병용하여 핵산을 특정 폴리뉴클레오티드 단편 길이 또는 단편 길이의 범위에 대해 또는 선택된 게놈 영역(예를 들면, 염색체)로부터의 단편에 대해 농축한다. 이러한 길이 기반 분리 방법 및 서열 기반 분리 방법은 더 상세히 후술되어 있다.
본원에 기재된 방법과 함께 이용될 수 있는 핵산 하위집단(예를 들면, 태아 핵산)을 농축하는 일부 방법들은 대량 병렬 시그너처(signature) 서열결정(MPSS) 방법을 포함한다. MPSS는 전형적으로 어댑터(즉, 태그) 연결 단계, 이에 이은 어댑터 해독 단계, 및 약간씩 증가시키면서 핵산 서열을 판독하는 단계를 이용하는 고체상 방법이다. 태깅된 PCR 생성물은 전형적으로 각각의 핵산이 유일한 태그를 가진 PCR 생성물을 생성하도록 증폭된다. 태그는 종종 PCR 생성물을 마이크로비드에 부착시키는 데에 사용된다. 연결 기초 서열 결정의 수회 라운드 후, 예를 들면, 서열 시그너처가 각각의 비드로부터 확인될 수 있다. MPSS 데이터세트에서 각각의 시그너처 서열(MPSS 태그)이 분석되고 모든 다른 시그너처와 비교되고, 모든 동일한 시그너처가 카운팅된다.
일부 실시양태에서, 일부 농축 방법들(예를 들면, 일부 MPS 및/또는 MPSS 기초 농축 방법들)은 증폭(예를 들면, PCR) 기초 방법을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, (예를 들면, 좌위 특이적 증폭 프라이머를 사용하는) 좌위 특이적 증폭 방법이 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다중체 SNP 대립형질 PCR 방법이 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다중체 SNP 대립형질 PCR 방법이 단일체 서열결정과 함께 이용될 수 있다. 예를 들면, 이러한 방법은 다중체 PCR(예를 들면, MASSARRAY 시스템)의 사용 및 앰플리콘(amplicons) 내로의 포획 프로브 서열의 도입, 및 이에 이은, 예를 들면, 일루미나(Illumina) MPSS 시스템을 사용한 서열결정을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다중체 SNP 대립형질 PCR 방법은 3-프라이머 시스템 및 인덱스화(indexed) 서열결정과 함께 이용될 수 있다. 예를 들면, 이러한 방법은 일부 좌위 특이적 정방향 PCR 프라이머 내로 도입된 제1 포획 프로브 및 좌위 특이적 역방향 PCR 프라이머 내로 도입된 어댑터 서열을 가진 프라이머들과 함께 다중체 PCR(예를 들면, MASSARRAY 시스템)을 이용하여 앰플리콘을 생성한 후, 예를 들면, 일루미나 MPSS 시스템을 사용한 서열결정을 위해 이차 PCR을 이용하여 역방향 포획 서열 및 분자 인덱스 바코드를 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다중체 SNP 대립형질 PCR 방법은 4-프라이머 시스템 및 인덱스화 서열결정과 함께 이용될 수 있다. 예를 들면, 이러한 방법은 좌위 특이적 정방향 PCR 프라이머 및 좌위 특이적 역방향 PCR 프라이머 둘 다 내로 도입된 어댑터 서열을 가진 프라이머와 함께 다중체 PCR(예를 들면, MASSARRAY 시스템)을 이용한 후, 예를 들면, 일루미나 MPSS 시스템을 사용한 서열결정을 위해 이차 PCR을 이용하여 정방향 및 역방향 포획 서열들 및 분자 인덱스 바코드 둘 다를 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 마이크로플루이딕 방법이 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 어레이 기초 마이크로플루이딕 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 이러한 방법은 낮은 플렉스에서의 증폭을 위해 마이크로플루이딕 어레이(예를 들면, 플루이다임(Fluidigm))를 이용하는 단계, 및 인덱스 및 포획 프로브를 도입한 후 서열결정하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 에멀젼 마이크로플루이딕 방법, 예를 들면, 디지털 소적 PCR이 이용될 수 있다.
일부 실시양태에서, (예를 들면, 보편적인 또는 비-좌위 특이적 증폭 프라이머를 사용하는) 보편적인 증폭 방법이 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 보편적인 증폭 방법이 풀-다운(pull-down) 방법과 함께 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 보편적으로 증폭된 서열결정 라이브러리로부터의 바이오티닐화된 울트라머(ultramer) 풀-다운(예를 들면, 아질런트(Agilent) 또는 IDT로부터의 바이오티닐화된 풀-다운 분석)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 이러한 방법은 표준 라이브러리를 제조하는 단계, 선택된 영역을 풀-다운 분석으로 농축하는 단계 및 이차 보편적인 증폭 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 풀-다운 방법은 연결 기초 방법과 함께 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 서열 특이적 어댑터 연결에 의한 바이오티닐화된 울트라머 풀-다운(예를 들면, HALOPLEX PCR, 할로 게노믹스(Halo Genomics))을 포함할 수 있다. 예를 들면, 이러한 방법은 선택자 프로브를 사용하여 제한 효소에 의해 분해된 단편을 포획한 후 포획된 생성물을 어댑터에 연결하는 단계 및 보편적인 증폭 후 서열결정을 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 풀-다운 방법은 연장 및 연결 기초 방법과 함께 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 분자 역위 프로브(MIP) 연장 및 연결을 포함할 수 있다. 예를 들면, 이러한 방법은 서열 어댑터와 함께 분자 역위 프로브를 사용한 후 보편적인 증폭 및 서열결정을 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상보적 DNA가 증폭 없이 합성될 수 있고 서열결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 연장 및 연결 방법은 풀-다운 성분 없이 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 좌위 특이적 정방향 및 역방향 프라이머 혼성화, 연장 및 연결을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 보편적인 증폭 또는 증폭 없는 상보적 DNA 합성 후 서열결정을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 분석 동안 배경 서열을 감소시킬 수 있거나 배제시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 풀-다운 방법은 임의적인 증폭 성분과 함께 이용될 수 있거나 증폭 성분 없이 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 보편적인 증폭 없이 포획 프로브를 완전히 도입하는 변경된 풀-다운 분석 및 연결을 포함할 수 있다. 예를 들면, 이러한 방법은 변경된 선택자 프로브를 사용하여 제한 효소에 의해 분해된 단편을 포획한 후 포획된 생성물을 어댑터에 연결하는 단계, 임의적인 증폭 단계 및 서열결정 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 환형 단일 가닥 연결과 함께 어댑터 서열의 연장 및 연결을 이용하는 바이오티닐화된 풀-다운 분석을 포함할 수 있다. 예를 들면, 이러한 방법은 선택자 프로브를 사용하여 관심있는 영역(즉, 표적 서열)을 포획하는 단계, 프로브 연장 단계, 어댑터 연결 단계, 단일 가닥 환형 연결 단계, 임의적인 증폭 단계 및 서열결정 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열결정 결과의 분석은 배경으로부터 표적 서열을 분리할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 서열 기초 분리 방법을 이용하여 선택 게놈 영역(예를 들면, 염색체)로부터의 단편에 대해 핵산을 농축한다. 서열 기초 분리는 일반적으로 관심있는 단편(예를 들면, 표적 및/또는 기준 단편)에 존재하고 샘플의 다른 단편에 실질적으로 존재하지 않거나 비-실질적인 양(예를 들면, 5% 이하)으로 상기 다른 단편에 존재하는 뉴클레오티드 서열에 기초한다. 일부 실시양태에서, 서열 기초 분리는 분리된 표적 단편 및/또는 분리된 기준 단편을 생성할 수 있다. 분리된 표적 단편 및/또는 분리된 기준 단편은 종종 핵산 샘플에 남아있는 단편들로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 분리된 표적 단편 및 분리된 기준 단편은 서로로부터 단리된다(예를 들면, 별도의 분석 구획에서 단리된다). 일부 실시양태에서, 분리된 표적 단편 및 분리된 기준 단편은 함께 단리된다(예를 들면, 동일한 분석 구획에서 단리된다). 일부 실시양태에서, 결합되지 않은 단편은 상이하게 제거될 수 있거나, 분해될 수 있거나 절단될 수 있다.
일부 실시양태에서, 선택적 핵산 포획 공정을 이용하여 핵산 샘플로부터 표적 및/또는 기준 단편을 분리한다. 상업적으로 입수가능한 핵산 포획 시스템은 예를 들면, 님블레겐(Nimblegen) 서열 포획 시스템(로슈 님블레겐(Roche NimbleGen), 미국 위스콘신주 매디슨 소재); 일루미나 비드어레이(BEADARRAY) 플랫폼(일루미나, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재); 아피메트릭스 진칩(Affymetrix GENECHIP) 플랫폼(아피메트릭스, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재); 아질런트 슈어셀렉트(SureSelect) 표적 농축 시스템(아질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies), 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재); 및 관련 플랫폼들을 포함한다. 이러한 방법은 전형적으로 포획 올리고뉴클레오티드를 표적 또는 기준 단편의 뉴클레오티드 서열의 분절 또는 전체에 혼성화시키는 단계를 포함하고, 고체상(예를 들면, 고체상 어레이) 및/또는 용액 기제 플랫폼의 사용을 포함할 수 있다. 포획 올리고뉴클레오티드(종종 "미끼(bait)"로서 지칭됨)는 선택된 게놈 영역 또는 좌위(예를 들면, 21번, 18번, 13번, X 및 Y 염색체 중 하나, 또는 기준 염색체)로부터의 핵산 단편에 우선적으로 혼성화하도록 선택될 수 있거나 디자인될 수 있다. 일부 실시양태에서, (예를 들면, 올리고뉴클레오티드 어레이를 사용하는) 혼성화 기초 방법을 이용하여 일부 염색체(예를 들면, 잠재적 이배수체 염색체, 기준 염색체 또는 관심있는 다른 염색체) 또는 이의 관심있는 분절로부터의 핵산 서열을 농축할 수 있다.
포획 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 관심있는 핵산 단편(예를 들면, 표적 단편, 기준 단편) 또는 이의 부분에 혼성화할 수 있거나 어닐링할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 포획 올리고뉴클레오티드는 천연 생성 또는 합성 올리고뉴클레오티드일 수 있고 DNA 또는 RNA에 기초할 수 있다. 포획 올리고뉴클레오티드는 예를 들면, 핵산 샘플에서 다른 단편으로부터의 표적 및/또는 기준 단편의 특이적 분리를 가능하게 할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "특이적" 또는 "특이성"은 한 분자와 또 다른 분자, 예컨대, 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 올리고뉴클레오티드의 결합 또는 혼성화를 지칭한다. "특이적" 또는 "특이성"은 2개의 분자들 중 어느 한 분자와 다른 분자의 실질적으로 더 약한 인식, 접촉 또는 복합체 형성에 비해 이들 2개의 분자들 사이의 인식, 접촉 및 안정한 복합체 형성을 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "어닐링"은 2개의 분자들 사이의 안정한 복합체의 형성을 지칭한다. 용어 "포획 올리고뉴클레오티드", "포획 올리고", "올리고" 또는 "올리고뉴클레오티드"는 포획 올리고뉴클레오티드를 지칭할 때 명세서 전체에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 하기 특징은 프라이머 및 다른 올리고뉴클레오티드, 예컨대, 본원에서 제공된 프로브에 적용될 수 있다.
포획 올리고뉴클레오티드는 적합한 공정을 이용함으로써 디자인될 수 있고 합성될 수 있고, 관심있는 뉴클레오티드 서열에 혼성화하고 본원에 기재된 분리 및/또는 분석 공정을 수행하기에 적합한 임의의 길이를 가질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 관심있는 뉴클레오티드 서열(예를 들면, 표적 단편 서열, 기준 단편 서열)을 기초로 디자인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이에 있어서 약 10개 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 10개 내지 약 100개의 뉴클레오티드, 약 10개 내지 약 70개의 뉴클레오티드, 약 10개 내지 약 50개의 뉴클레오티드, 약 15개 내지 약 30개의 뉴클레오티드, 또는 약 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개 또는 100개의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 천연 생성 뉴클레오티드 및/또는 비천연 생성 뉴클레오티드(예를 들면, 표지된 뉴클레오티드) 또는 이들의 혼합물로 구성될 수 있다. 본원에 기재된 실시양태에서 사용되기에 적합한 올리고뉴클레오티드는 공지된 기법을 이용함으로써 합성될 수 있고 표지될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 자동화된 합성기를 이용함으로써 문헌(Beaucage and Caruthers (1981) Tetrahedron Letts. 22:1859-1862)에 최초로 기재되어 있고/있거나 문헌(Needham-VanDevanter et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:6159-6168)에 기재되어 있는 고체상 포스포라미다이트 트리에스테르 방법에 따라 화학적으로 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 정제는 예를 들면, 문헌(Pearson and Regnier (1983) J. Chrom. 255:137-149)에 기재되어 있는 천연 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 음이온-교환 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, (천연 생성 또는 합성) 올리고뉴클레오티드 서열들의 전부 또는 일부는 표적 및/또는 기준 단편 서열 또는 이의 부분에 실질적으로 상보적일 수 있다. 서열과 관련하여 본원에서 언급된 "실질적으로 상보적"은 서로 혼성화할 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 혼성화 조건의 엄격성은 다양한 양의 서열 불일치를 견디도록 변경될 수 있다. 서로 55% 이상, 56% 이상, 57% 이상, 58% 이상, 59% 이상, 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 상보적인 표적/기준 및 올리고뉴클레오티드 서열이 포함된다.
관심있는 핵산 서열(예를 들면, 표적 단편 서열, 기준 단편 서열) 또는 이의 일부에 실질적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 서열 또는 이의 관련된 부분의 상보체와도 실질적으로 유사하다(예를 들면, 핵산의 안티센스 가닥과 실질적으로 유사하다). 2개의 뉴클레오티드 서열들이 실질적으로 유사한 지를 확인하기 위한 한 검사는 공유된 동일한 뉴클레오티드 서열의 %를 측정하는 것이다. 서열과 관련하여 본원에서 언급된 "실질적으로 유사한"은 55% 이상, 56% 이상, 57% 이상, 58% 이상, 59% 이상, 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상이 서로 동일한 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
어닐링 조건(예를 들면, 혼성화 조건)은 분석에서 사용된 올리고뉴클레오티드의 특성에 따라 결정될 수 있고/있거나 조절될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 서열 및/또는 길이는 종종 관심있는 핵산 서열과의 혼성화에 영향을 미칠 수 있다. 올리고뉴클레오티드와 관심있는 핵산 사이의 불일치 정도에 따라, 낮은, 중간 또는 높은 엄격성 조건을 이용하여 어닐링을 수행할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "엄격한 조건"은 혼성화 및 세척을 위한 조건을 지칭한다. 혼성화 반응 온도 조건 최적화 방법은 당분야에서 공지되어 있고, 문헌(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6 (1989))에서 찾을 수 있다. 수성 방법 및 비수성 방법이 상기 참조문헌에 기재되어 있고 이들 중 어느 하나가 이용될 수 있다. 엄격한 혼성화 조건의 비한정적 예는 약 45℃의 6X 염화나트륨/구연산나트륨(SSC)에서의 혼성화, 및 이에 이은 50℃의 0.2X SSC 및 0.1% SDS에서의 1회 이상의 세척이다. 엄격한 혼성화 조건의 또 다른 예는 약 45℃의 6X 염화나트륨/구연산나트륨(SSC)에서의 혼성화, 및 이에 이은 55℃의 0.2X SSC 및 0.1% SDS에서의 1회 이상의 세척이다. 엄격한 혼성화 조건의 추가 예는 약 45℃의 6X 염화나트륨/구연산나트륨(SSC)에서의 혼성화, 및 이에 이은 60℃의 0.2X SSC 및 0.1% SDS에서의 1회 이상의 세척이다. 종종, 엄격한 혼성화 조건은 약 45℃의 6X 염화나트륨/구연산나트륨(SSC)에서의 혼성화, 및 이에 이은 65℃의 0.2X SSC 및 0.1% SDS에서의 1회 이상의 세척이다. 보다 더 통상적으로, 엄격한 조건은 65℃의 0.5 M 인산나트륨 및 7% SDS에서의 혼성화, 및 이에 이은 65℃의 0.2X SSC 및 0.1% SDS에서의 1회 이상의 세척이다. 엄격한 혼성화 온도는 특정 유기 용매, 예를 들면, 포름아미드의 첨가에 의해 변경될 수도 있다(즉, 낮아질 수 있다). 유기 용매, 예컨대, 포름아미드는 엄격한 조건을 여전히 유지하고 열 불안정할 수 있는 핵산의 유용한 수명을 연장시키면서 혼성화가 보다 더 낮은 온도에서 수행될 수 있도록 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 열 안정성을 감소시킨다.
본원에서 사용된 어구 "혼성화" 또는 이의 문법적 파생어는 낮은, 중간 또는 높은 엄격성 조건 하에서 또는 핵산 합성 조건 하에서 제1 핵산 분자를 제2 핵산 분자에 어닐링시키는 것을 지칭한다. 혼성화는 제1 핵산 분자가 제2 핵산 분자에 어닐링하는 경우를 포함할 수 있고, 이때 제1 핵산 분자와 제2 핵산 분자는 상보적이다. 본원에서 사용된 "특이적으로 혼성화한다"는 핵산 합성 조건 하에서 올리고뉴클레오티드가 상보적인 서열을 갖지 않는 핵산 분자와의 혼성화에 비해 그 자신에 상보적인 서열을 가진 핵산 분자와 우선적으로 혼성화하는 것을 지칭한다. 예를 들면, 특이적 혼성화는 포획 올리고뉴클레오티드와 이 올리고뉴클레오티드에 상보적인 표적 단편 서열의 혼성화를 포함한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드는 포획제, 예컨대, 아비딘, 스트렙타비딘, 항체 또는 수용체에 결합할 수 있는 친화성 리간드, 예컨대, 결합 쌍의 구성원(예를 들면, 바이오틴) 또는 항원과 결합된다. 예를 들면, 포획 올리고뉴클레오티드는 스트렙타비딘으로 코팅된 비드 상에 포획될 수 있도록 바이오티닐화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 포획 올리고뉴클레오티드 및/또는 포획제는 고체 지지체 또는 기판에 효과적으로 연결된다. 고체 지지체 또는 기판은 마이크로어레이 및 웰에 의해 제공된 표면, 및 입자, 예컨대, 비드(예를 들면, 상자성 비드, 자성 비드, 마이크로비드, 나노비드), 마이크로입자 및 나노입자를 포함하나 이들로 한정되지 않는, 포획 올리고뉴클레오티드가 직접적으로 또는 간접적으로 부착될 수 있는 임의의 물리적으로 분리가능한 고체일 수 있다. 고체 지지체는 예를 들면, 칩, 컬럼, 광학 섬유, 와이프(wipe), 필터(예를 들면, 평면 필터), 하나 이상의 모세관, 유리 및 변형된 또는 작용화된 유리(예를 들면, 조절된-공극 유리(CPG)), 석영, 운모, 디아조화된(diazotized) 막(종이 또는 나일론), 폴리포름알데하이드, 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 종이, 세라믹, 금속, 준금속, 반도체 물질, 양자점, 코팅된 비드 또는 입자, 다른 크로마토그래피 물질, 자성 입자; 플라스틱(아크릴, 폴리스티렌, 스티렌 또는 다른 물질의 공중합체, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, 테플론(TEFLON)™, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 등), 폴리사카라이드, 나일론 또는 니트로셀룰로스, 수지, 실리카 또는 실리카-기제 물질(규소, 실리카 겔 및 변형된 규소를 포함함), 세파덱스(Sephadex)®, 세파로스(Sepharose)®, 탄소, 금속(예를 들면, 강철, 금, 은, 알루미늄, 규소 및 구리), 무기 유리, 전도성 중합체(중합체, 예컨대, 폴리피롤 및 폴리인돌을 포함함); 마이크로구조 또는 나노구조를 가진 표면, 예컨대, 핵산 타일링(tiling) 어레이, 나노튜브, 나노와이어 또는 나노미립자 장식된 표면; 또는 다공성 표면 또는 겔, 예컨대, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 당 중합체, 셀룰로스, 실리케이트, 또는 다른 섬유성 또는 가닥 중합체도 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 고체 지지체 또는 기판은 중합체, 예컨대, 덱스트란, 아크릴아미드, 젤라틴 또는 아가로스를 포함하는 임의의 수의 물질을 사용한 수동 또는 화학적으로 유도체화된 코팅을 이용함으로써 코팅될 수 있다. 비드 및/또는 입자는 자유 상태 또는 서로 연결된(예를 들면, 소결된) 상태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 고체상은 입자의 집합체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 입자는 실리카를 포함할 수 있고, 실리카는 이산화규소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실리카는 다공성 실리카일 수 있고, 일부 실시양태에서 실리카는 비다공성 실리카일 수 있다. 일부 실시양태에서, 입자는 상자성을 입자에 부여하는 물질을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 물질은 금속을 포함하고, 일부 실시양태에서 상기 물질은 금속 산화물(예를 들면, 철 또는 산화철, 이때 산화철은 Fe2+과 Fe3+의 혼합물을 함유함)이다. 올리고뉴클레오티드는 공유 결합 또는 비공유 상호작용에 의해 고체 지지체에 연결될 수 있고 고체 지지체에 직접적으로 또는 간접적으로(예를 들면, 매개 물질, 예컨대, 스페이서 분자 또는 바이오틴을 통해) 연결될 수 있다. 프로브는 핵산 포획 전, 동안 또는 후에 고체 지지체에 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 길이 기초 분리 방법을 이용하여 핵산을 특정 핵산 단편 길이, 길이 범위, 또는 특정 역치 또는 컷오프 미만 또는 초과의 길이에 대해 농축한다. 핵산 단편 길이는 전형적으로 단편 내의 뉴클레오티드의 수를 지칭한다. 핵산 단편 길이는 종종 핵산 단편 크기로서도 지칭된다. 일부 실시양태에서, 개별 단편의 길이를 측정하지 않으면서 길이 기초 분리 방법을 수행한다. 일부 실시양태에서, 개별 단편의 길이를 측정하는 방법과 함께 길이 기초 분리 방법을 수행한다. 일부 실시양태에서, 길이 기초 분리는 크기 분별 절차를 지칭하고, 이때 분별된 풀의 전부 또는 일부가 단리될(예를 들면, 보유될) 수 있고/있거나 분석될 수 있다. 크기 분별 절차는 당분야에서 공지되어 있다(예를 들면, 어레이 상에서의 분리, 분자체에 의한 분리, 겔 전기영동에 의한 분리, 컬럼 크로마토그래피(예를 들면, 크기 배제 컬럼)에 의한 분리, 및 마이크로플루이딕 기초 방법). 일부 실시양태에서, 길이 기초 분리 방법은 예를 들면, 단편 환형화, 화학적 처리(예를 들면, 포름알데하이드, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)), 질량 분광측정 및/또는 크기 특이적 핵산 증폭을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 특정 길이, 길이 범위, 또는 특정 역치 또는 컷오프 미만 또는 초과의 길이를 가진 핵산 단편은 샘플로부터 분리된다. 일부 실시양태에서, 특정 역치 또는 컷오프(예를 들면, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp) 미만의 길이를 가진 단편은 "짧은" 단편으로서 지칭되고, 특정 역치 또는 컷오프(예를 들면, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp) 초과의 길이를 가진 단편은 "긴" 단편으로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, 특정 길이, 길이 범위, 또는 특정 역치 또는 컷오프 미만 또는 초과의 길이를 가진 단편은 분석을 위해 보유되는 반면, 상이한 길이 또는 길이 범위, 또는 상기 역치 또는 컷오프 초과 또는 미만의 길이를 가진 단편은 분석을 위해 보유되지 않는다. 일부 실시양태에서, 약 500 bp 미만의 길이를 가진 단편은 보유된다. 일부 실시양태에서, 약 400 bp 미만의 길이를 가진 단편은 보유된다. 일부 실시양태에서, 약 300 bp 미만의 길이를 가진 단편은 보유된다. 일부 실시양태에서, 약 200 bp 미만의 길이를 가진 단편은 보유된다. 일부 실시양태에서, 약 150 bp 미만의 길이를 가진 단편은 보유된다. 예를 들면, 약 190 bp, 180 bp, 170 bp, 160 bp, 150 bp, 140 bp, 130 bp, 120 bp, 110 bp 또는 100 bp 미만의 길이를 가진 단편은 보유된다. 일부 실시양태에서, 약 100 bp 내지 약 200 bp의 길이를 가진 단편은 보유된다. 예를 들면, 약 190 bp, 180 bp, 170 bp, 160 bp, 150 bp, 140 bp, 130 bp, 120 bp 또는 110 bp의 길이를 가진 단편은 보유된다. 일부 실시양태에서, 약 100 bp 내지 약 200 bp의 범위 내의 길이를 가진 단편은 보유된다. 예를 들면, 약 110 bp 내지 약 190 bp, 130 bp 내지 약 180 bp, 140 bp 내지 약 170 bp, 140 bp 내지 약 150 bp, 150 bp 내지 약 160 bp, 또는 145 bp 내지 약 155 bp의 범위 내의 길이를 가진 단편은 보유된다. 일부 실시양태에서, 특정 길이 또는 길이 범위의 다른 단편보다 약 10 bp 내지 약 30 bp 더 짧은 길이를 가진 단편은 보유된다. 일부 실시양태에서, 특정 길이 또는 길이 범위의 다른 단편보다 약 10 bp 내지 약 20 bp 더 짧은 길이를 가진 단편은 보유된다. 일부 실시양태에서, 특정 길이 또는 길이 범위의 다른 단편보다 약 10 bp 내지 약 15 bp 더 짧은 길이를 가진 단편은 보유된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 생물정보(bioinformatics) 기반(예를 들면, 인 실리코(in silico)) 방법을 이용하여 특정 핵산 단편 길이, 길이 범위, 또는 특정 역치 또는 컷오프 미만 또는 초과의 길이에 대해 핵산을 농축한다. 예를 들면, 적합한 뉴클레오티드 서열결정 공정을 이용하여 핵산 단편에 대한 뉴클레오티드 서열 리드를 수득할 수 있다. 일부 경우, 예컨대, 페어링된-말단 서열결정 방법을 이용할 때, 단편의 각각의 말단으로부터 수득된 맵핑된 서열 리드의 위치를 기초로 특정 단편의 길이를 측정할 수 있다. 본원에 더 상세히 기재되어 있는 바와 같이, 상응하는 단편의 하나 이상의 선택된 단편 길이 또는 단편 길이 역치 값에 따라 특정 분석(예를 들면, 유전적 변이의 존재 또는 부재의 확인)에 사용되는 서열 리드를 농축할 수 있거나 필터링할 수 있다.
본원에 기재된 방법과 함께 이용될 수 있는 일부 길이 기초 분리 방법들은 종종 예를 들면, 선택적 서열 태깅 방법을 이용한다. 용어 "서열 태깅"은 인식가능하고 구별되는 서열을 핵산 또는 핵산 집단 내로 도입하는 것을 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "서열 태깅"은 본원에 나중에 기재된 용어 "서열 태그"와 상이한 의미를 가진다. 이러한 서열 태깅 방법에서, 단편 크기 종(예를 들면, 짧은 단편) 핵산은 긴 핵산 및 짧은 핵산을 포함하는 샘플에서 선택적 서열 태깅으로 처리된다. 이러한 방법은 전형적으로 내부 프라이머 및 외부 프라이머를 포함하는 네스티드(nested) 프라이머의 세트를 사용하여 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 내부 프라이머들 중 하나 또는 둘 다를 태깅하여 태그를 표적 증폭 생성물 내로 도입할 수 있다. 외부 프라이머는 일반적으로 (내부) 표적 서열을 보유하는 짧은 단편에 어닐링하지 않는다. 내부 프라이머는 짧은 단편에 어닐링할 수 있고 태그 및 표적 서열을 보유하는 증폭 생성물을 생성할 수 있다. 전형적으로, 긴 단편의 태깅은 예를 들면, 외부 프라이머의 사전 어닐링 및 연장에 의한 내부 프라이머의 차단된 연장을 포함하는 기작들의 조합을 통해 억제된다. 태깅된 단편의 농축은 예를 들면, 단일 가닥 핵산의 엑소뉴클레아제 분해 및 하나 이상의 태그에 대한 특이성을 가진 증폭 프라이머를 사용한 태깅된 단편의 증폭을 포함하는 다양한 방법들 중 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다.
본원에 기재된 방법과 함께 이용될 수 있는 또 다른 길이 기초 분리 방법은 핵산 샘플을 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 침전으로 처리하는 단계를 포함한다. 방법의 예는 국제 특허출원 공보 제WO2007/140417호 및 국제 특허출원 공보 제WO2010/115016호에 기재된 방법들을 포함한다. 이 방법은 일반적으로 작은(예를 들면, 300개 미만의 뉴클레오티드) 핵산을 실질적으로 침전시키지 않으면서 큰 핵산을 실질적으로 침전시키기에 충분한 조건 하에서 하나 이상의 1가 염의 존재 하에서 핵산 샘플을 PEG와 접촉시키는 단계를 수반한다.
본원에 기재된 방법과 함께 이용될 수 있는 또 다른 크기 기초 농축 방법은 예를 들면, 서클리가제(circligase)를 사용한 연결에 의한 환형화를 포함한다. 짧은 핵산 단편은 전형적으로 긴 단편보다 더 높은 효율로 환형화될 수 있다. 환형화되지 않은 서열은 환형화된 서열로부터 분리될 수 있고, 농축된 짧은 단편은 추가 분석을 위해 사용될 수 있다.
단편 길이의 측정
일부 실시양태에서, 하나 이상의 핵산 단편에 대한 길이를 측정한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 표적 단편에 대한 길이를 측정하여 하나 이상의 표적 단편 크기 종을 확인한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 표적 단편 및 하나 이상의 기준 단편에 대한 길이를 측정하여 하나 이상의 표적 단편 길이 종 및 하나 이상의 기준 단편 길이 종을 확인한다. 일부 실시양태에서, 단편 길이는 단편에 혼성화하는 프로브의 길이를 측정함으로써 측정되고, 이것은 하기 더 상세히 논의되어 있다. 핵산 단편 길이를 측정하기에 적합한 당분야의 임의의 방법, 예를 들면, 질량 민감성 공정(예를 들면, 질량 분광측정(예를 들면, 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화(MALDI) 질량 분광측정 및 전기분무(ES) 질량 분광측정), 전기영동(예를 들면, 모세관 전기영동), 현미경관찰(스캐닝 터널링(scanning tunneling) 현미경관찰, 원자력 현미경관찰), 나노공극을 이용한 길이의 측정, 및 서열 기반 길이 측정(예를 들면, 페어링된-말단 서열결정)을 이용하여 핵산 단편 또는 프로브 길이를 측정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단편 전하에 기초한 분리 방법을 이용하지 않고 단편 또는 프로브 길이를 측정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전기영동 공정을 이용하지 않고 단편 또는 프로브 길이를 측정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열결정 공정을 이용하지 않고 단편 또는 프로브 길이를 측정할 수 있다.
질량 분광측정
일부 실시양태에서, 질량 분광측정은 핵산 단편 길이를 측정하는 데에 이용된다. 질량 분광측정 방법은 전형적으로 분자, 예컨대, 핵산 단편의 질량을 측정하는 데에 이용된다. 일부 실시양태에서, 핵산 단편 길이는 단편의 질량으로부터 추정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 단편 길이의 예측된 범위는 단편의 질량으로부터 추정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 단편 길이는 단편에 혼성화하는 프로브의 질량으로부터 추정될 수 있고, 이것은 하기 더 상세히 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 주어진 길이의 표적 및/또는 기준 핵산의 존재는 검출된 신호의 질량을 표적 및/또는 기준 단편의 예상된 질량과 비교함으로써 검증될 수 있다. 특정 핵산 단편 및/또는 단편 길이에 대한 상대적 신호 강도, 예를 들면, 스펙트럼 상의 질량 피크는 종종 샘플 중의 다른 핵산들 중에서 단편 종의 상대적 집단을 표시할 수 있다(예를 들면, 문헌(Jurinke et al. (2004) Mol. Biotechnol. 26, 147-164) 참조).
질량 분광측정은 일반적으로 화합물을 이온화하여 하전된 분자 또는 분자 단편을 생성하고 이들의 질량-대-전하 비를 측정함으로써 작용한다. 전형적인 질량 분광측정 절차는 (1) 샘플을 질량 분광측정 기계 상에 적재한 후 증발시키는 단계, (2) 다양한 방법들 중 어느 한 방법(예를 들면, 전자 광선과의 충돌)으로 샘플 성분을 이온화시켜 하전된 입자(이온)를 생성하는 단계, (3) 이온들을 분석기에서 그들의 질량-대-전하 비에 따라 전자기장으로 분리하는 단계, (4) (예를 들면, 정량 방법으로) 이온들을 검출하는 단계, 및 (5) 이온 신호를 질량 스펙트럼으로 프로세싱하는 단계를 포함하는 여러 단계들을 포함한다.
당분야에서 잘 공지되어 있고(예를 들면, 문헌(Burlingame et al. Anal. Chem. 70:647R-716R (1998)) 참조), 예를 들면, 사중극 질량 분광측정, 이온 트랩 질량 분광측정, 비행시간 질량 분광측정, 기체 크로마토그래피 질량 분광측정 및 탠덤 질량 분광측정을 포함하는 질량 분광측정 방법이 본원에 기재된 방법과 함께 이용될 수 있다. 질량 분광측정 방법과 관련된 기초 공정은 샘플로부터 유래한 기체상 이온들의 생성 및 이들의 질량의 측정이다. 기체상 이온들의 이동은 질량 분광측정기에서 생성된 전자기장을 이용함으로써 정밀하게 조절될 수 있다. 이 전자기장에서의 이온들의 이동은 이온의 m/z(질량 대 전하 비)에 비례하고 이것은 m/z 측정의 기초를 형성함으로써 샘플의 질량 측정의 기초를 형성한다. 이 전자기장에서의 이온들의 이동은 이온들의 봉쇄 및 집속을 가능하게 하고, 이것은 질량 분광측정의 높은 민감성을 설명한다. m/z 측정의 과정 동안에 이온들은 이 이온들의 도착을 기록사는 입자 검출기에게 높은 효율로 전달된다. 각각의 m/z에서 이온들의 양은 x 축이 m/z이고 y 축이 상대적 존재도인 그래프 상의 피크로 표시된다. 상이한 질량 분광측정기는 상이한 해상도, 즉 질량에서 밀접하게 관련된 이온들 사이에 피크를 해상하는 능력을 가진다. 해상도는 R=m/델타 m으로서 정의되고, 이때 m은 이온 질량이고 델타 m은 질량 스펙트럼에서 2개의 피크들 사이의 질량 차이이다. 예를 들면, 1000의 해상도를 가진 질량 분광측정기는 100.1의 m/z를 가진 이온으로부터 100.0의 m/z를 가진 이온을 해상할 수 있다. 일부 질량 분광측정 방법은 이온 공급원과 질량 분석기의 다양한 조합을 이용할 수 있고, 이것은 주문제작된 검출 프로토콜을 디자인하는 데에 있어서 유연성을 허용한다. 일부 실시양태에서, 질량 분광측정기는 모든 이온들을 이온 공급원으로부터 질량 분광측정기 내로 순차적으로 또는 동시에 전달하도록 프로그래밍될 수 있다. 일부 실시양태에서, 질량 분광측정기는 다른 이온들을 차단하면서 질량 분광측정기 내로 전달할 특정 질량의 이온을 선택하도록 프로그래밍될 수 있다.
여러 종류의 질량 분광측정기가 이용될 수 있거나 다양한 구성으로 제조될 수 있다. 일반적으로, 질량 분광측정기는 하기 주요 구성요소들을 가진다: 샘플 입구, 이온 공급원, 질량 분석기, 검출기, 진공 시스템, 기계-제어 시스템 및 데이터 시스템. 샘플 입구, 이온 공급원 및 질량 분석기에서의 차이는 일반적으로 기계의 종류 및 그의 능력을 한정한다. 예를 들면, 입구는 모세관-컬럼 액체 크로마토그래피 공급원일 수 있거나, 예컨대, 매트릭스-보조 레이저 탈착에서 사용되는 직접적인 프로브 또는 단(stage)일 수 있다. 흔한 이온 공급원은 예를 들면, 나노분무 및 마이크로분무를 포함하는 전기분무, 또는 매트릭스-보조 레이저 탈착이다. 질량 분석기는 예를 들면, 사중극 질량 필터, 이온 트랩 질량 분석기 및 비행시간 질량 분석기를 포함한다.
이온 형성 공정은 질량 스펙트럼 분석을 위한 출발 점이다. 여러 이온화 방법들이 이용될 수 있고, 이온화 방법의 선택은 분석에 사용되는 샘플에 의존한다. 예를 들면, 폴리펩티드의 분석을 위해 상대적으로 온화한 이온화 절차, 예컨대, 전기분무 이온화(ESI)가 바람직할 수 있다. ESI의 경우, 샘플을 함유하는 용액이 강한 전기장을 생성하는 높은 전위에서 미세한 바늘을 통과하여 질량 분광측정기 내로 향하는 고도로 하전된 소적의 미세한 분무를 생성한다. 다른 이온화 절차는 예를 들면, 중성 원자의 고에너지 광선을 이용하여 고체 샘플에 충돌하여 탈착 및 이온화를 야기하는 고속-원자 충격(FAB)을 포함한다. 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화(MALDI)는 레이저 펄스가 UV 흡수 화합물 매트릭스(예를 들면, 2,5-디하이드록시벤조산, 알파-시아노-4-하이드록시신남산, 3-하이드록시피콜린산(3-HPA), 디암모늄시트레이트(DAC) 및 이들의 조합물)에서 결정화된 샘플에 충돌하는 데에 이용되는 방법이다. 당분야에서 공지된 다른 이온화 절차는 예를 들면, 플라즈마 및 글로(glow) 방전, 플라즈마 탈착 이온화, 공명 이온화 및 이차 이온화를 포함한다.
상이한 이온 공급원과 페어링될 수 있는 다양한 질량 분석기들이 이용될 수 있다. 상이한 질량 분석기는 당분야에서 공지되어 있고 본원에 기재되어 있는 바와 같이 상이한 이점을 가진다. 검출을 위해 선택된 질량 분광측정기 및 방법은 구체적인 분석에 의존하는데, 예를 들면, 소량의 이온이 검출을 위해 생성되는 경우 보다 더 민감한 질량 분석기가 이용될 수 있다. 여러 종류의 질량 분석기 및 질량 분광측정 방법들이 이하에 기재되어 있다.
이온 이동 질량(IM) 분광측정은 기체상 분리 방법이다. IM은 기체상 이온들을 그들의 충돌 횡단면을 기초로 분리하고 비행시간(TOF) 질량 분광측정과 커플링될 수 있다. IM-MS는 문헌(Verbeck et al. in the Journal of Biomolecular Techniques (Vol. 13, Issue 2, 56-61))에 더 상세히 논의되어 있다.
사중극 질량 분광측정은 사중극 질량 필터 또는 분석기를 이용한다. 이러한 종류의 질량 분석기는 2개의 전기적으로 연결된 막대들의 2개 세트로서 정렬된 4개의 막대들로 구성된다. rf 전압과 dc 전압의 조합이 각각의 쌍의 막대에 인가되어, 이온의 질량 필터의 시작 부분부터 말단까지 이동할 때 이온의 진동 이동을 야기하는 장(field)을 생성한다. 이 장의 결과는 한 쌍의 막대에서의 고-통과 질량 필터 및 다른 쌍의 막대에서의 저-통과 필터의 생성이다. 고-통과 필터와 저-통과 필터 사이의 중첩은 두 필터들을 통과할 수 있고 사중극의 길이를 횡단할 수 있는 한정된 m/z를 남긴다. 이 m/z는 선택되고 사중극 질량 필터에서 안정한 상태로 남아있는 반면, 모든 다른 m/z들은 불안정한 궤도를 갖고 질량 필터에서 남아있지 않다. 질량 스펙트럼은 증가하는 m/z가 질량 필터를 통과하고 검출기에 도달하도록 선택되게끔 인가된 장을 상승시킴으로써 생성된다. 또한, 사중극은 rf 단독 장을 인가함으로써 모든 m/z의 이온들을 함유하고 전달하도록 설정될 수도 있다. 이것은 사중극이 질량 필터링 없이 이온 전달을 요구하는 질량 분광측정기의 영역에서 렌즈 또는 집속 시스템으로서 작용할 수 있게 한다.
사중극 질량 분석기 및 본원에 기재된 다른 질량 분석기는 한정된 m/z 또는 질량 범위를 분석하도록 프로그래밍될 수 있다. 일부 경우, 원하는 질량 범위의 핵산 단편이 공지되어 있기 때문에, 질량 분광측정기는 보다 더 높은 또는 보다 더 낮은 질량 범위의 이온을 배제하면서 예상된 정확한 질량 범위의 이온을 전달하도록 프로그래밍될 수 있다. 질량 범위를 선택하는 능력은 분석에서 배경 노이즈를 감소시켜 신호-대-노이즈 비를 증가시킬 수 있다. 따라서, 일부 경우, 질량 분광측정기는 특정 질량-식별가능한 핵산 단편의 검출 및 확인뿐만 아니라 분리 단계도 달성할 수 있다.
이온 트랩 질량 분광측정은 이온 트랩 질량 분석기를 이용한다. 전형적으로, 모든 m/z의 이온들이 질량 분석기에서 초기에 포획되고 진동하도록 장이 인가된다. 이온은 집속 디바이스, 예컨대, 팔중극 렌즈 시스템을 통해 이온 공급원으로부터 이온 트랩으로 들어간다. 이온 포획은 여기되고 전극을 통해 검출기 내로 배출되기 전에 포획 영역에서 일어난다. 질량 분석은 트랩으로부터 증가하는 m/z의 이온을 검출기 내로 배출하는 방식으로 진동의 진폭을 증가시키는 전압을 순차적으로 인가함으로써 달성될 수 있다. 사중극 질량 분광측정과 대조적으로, 선택된 m/z를 가진 이온을 제외한 모든 이온들이 질량 분석기의 장에서 보유된다. 이온 수의 조절은 이온이 트랩 내로 주입되는 시간을 변화시킴으로써 달성될 수 있다.
비행시간 질량 분광측정은 비행시간 질량 분석기를 이용한다. 전형적으로, 이온은 (고전압에 의해 생성된) 전기장에서의 가속화에 의해 고정된 양의 운동 에너지를 먼저 제공받는다. 가속화 후, 이온은 그의 m/z에 반비례하는 속도로 이동하는 장 부재 또는 "표류(drift)" 영역으로 들어간다. 따라서, 낮은 m/z를 가진 이온은 높은 m/z를 가진 이온보다 더 빨리 이동한다. 이온이 장 부재 영역의 길이를 이동하는 데에 요구되는 시간이 측정되고 이온의 m/z를 계산하는 데에 이용된다.
기체 크로마토그래피 질량 분광측정은 종종 실시간으로 표적을 측정할 수 있다. 시스템의 기체 크로마토그래피(GC) 부분은 화학적 혼합물을 분석물의 펄스로 분리하고, 질량 분광측정기(MS)는 분석물을 확인하고 정량한다.
탠덤 질량 분광측정은 전술된 질량 분석기들을 병용할 수 있다. 탠덤 질량 분광측정기는 추가 분석을 위한 관심있는 이온을 단리하기 위해 제1 질량 분석기를 이용하여 이온들을 그들의 m/z에 따라 분리한다. 그 다음, 단리된 관심있는 이온은 단편 이온으로 깨지고(충돌에 의해 활성화된 해리 또는 충돌에 의해 유도된 해리로서 지칭됨) 단편 이온은 제2 질량 분석기에 의해 분석된다. 이러한 종류의 탠덤 질량 분광측정기 시스템은 2개의 질량 분석기가 통상적으로 충돌 셀에 의해 공간에서 분리되어 있기 때문에 탠덤 인 스페이스(tandem in space) 시스템으로서 지칭된다. 탠덤 질량 분광측정기 시스템은 한 질량 분석기가 이용되되 이 질량 분석기가 순차적으로 이용되어 이온을 단리하고 단편화를 유도한 후 질량 분석을 수행하는 탠덤 인 타입(tandem in time) 시스템도 포함한다.
탠덤 인 스페이스 카테고리 내의 질량 분광측정기는 하나 초과의 질량 분석기를 가진다. 예를 들면, 탠덤 사중극 질량 분광측정기 시스템은 제1 사중극 질량 필터, 이에 이은 충돌 셀, 이에 이은 제2 사중극 질량 필터 및 이에 이은 검출기를 가질 수 있다. 또 다른 배열은 2개의 질량 분석기들을 분리하는 충돌 셀과 함께 제1 질량 분석기용 사중극 질량 필터 및 제2 질량 분석기용 비행시간 질량 분석기를 이용하는 것이다. 리플렉트론(reflectron) 비행시간, 탠덤 섹터(sector) 및 섹터-사중극 질량 분광측정을 포함하는 다른 탠덤 시스템은 당분야에서 공지되어 있다.
탠덤 인 타임 카테고리 내의 질량 분광측정기는 상이한 시간에서 상이한 기능을 수행하는 1개의 질량 분석기를 가진다. 예를 들면, 이온 트랩 질량 분광측정기는 모든 m/z의 이온들을 포획하는 데에 이용될 수 있다. 관심있는 m/z의 이온을 제외한 모든 m/z의 이온들을 트랩으로부터 배출하는 일련의 rf 스캔 기능이 적용된다. 관심있는 m/z가 단리된 후, rf 펄스가 인가되어 트랩에서 기체 분자와의 충돌을 발생시킴으로써 이온의 단편화를 유도한다. 그 다음, 단편화된 이온의 m/z 값이 질량 분석기에 의해 측정된다. 푸리에 변환 질량 분광측정기로서도 공지되어 있는 이온 사이클로트론(cyclotron) 공명 기계가 탠덤 인 타임 시스템의 일례이다.
여러 종류의 탠덤 질량 분광측정 실험들이 실험의 각각의 단계에서 선택된 이온을 조절함으로써 수행될 수 있다. 상이한 종류의 실험은 질량 분석기의 상이한 작동 방식(종종 "스캔"으로서 지칭됨)을 이용한다. 질량 스펙트럼 스캔으로서 지칭되는 제1 예에서, 제1 질량 분석기 및 충돌 셀은 질량 분석을 위해 모든 이온들을 제2 질량 분석기 내로 전달한다. 생성물 이온 스캔으로서 지칭되는 제2 예에서, 관심있는 이온은 제1 질량 분석기에서 질량 선택된 후 충돌 셀에서 단편화된다. 그 다음, 형성된 이온은 제2 질량 분석기를 스캐닝함으로써 질량 분석된다. 전구체 이온 스캔으로서 지칭되는 제3 예에서, 제1 질량 분석기는 단편화를 위해 질량 분석된 이온을 충돌 셀 내로 순차적으로 전달하도록 스캐닝된다. 제2 질량 분석기는 검출기로의 전달을 위해 관심있는 생성물 이온을 질량 선택한다. 따라서, 검출기 신호는 공통된 생성물 이온으로 단편화될 수 있는 모든 전구체 이온들의 결과물이다. 다른 실험 포맷은 중성 손실 스캔을 포함하고, 이때 일정한 질량 차이가 질량 스캔에서 설명된다.
정량을 위해, 예를 들면, 존재하거나 도입되는 핵산 단편의 양에 대한 신호를 제공할 수 있는 조절이 이용될 수 있다. 상대적 질량 신호를 절대적 양으로 전환시킬 수 있게 하는 조절은 핵산 단편의 검출 전에 공지된 양의 질량 태그 또는 질량 표지를 각각의 샘플에 첨가함으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Ding and Cantor (2003) PNAS U.S.A. Mar 18;100(6):3059-64)을 참조한다. 단편의 검출을 방해하지 않는 임의의 질량 태그가 질량 신호를 정규화하는 데에 사용될 수 있다. 이러한 표준물은 전형적으로 샘플 중의 임의의 분자 태그의 분리 성질과 상이한 분리 성질을 갖고, 동일한 또는 상이한 질량 시그너처를 가질 수 있었다.
분리 단계는 종종 핵산 샘플로부터 염, 효소 또는 다른 완충제 성분을 제거하는 데에 이용될 수 있다. 당분야에서 잘 공지된 여러 방법들, 예컨대, 크로마토그래피, 겔 전기영동 또는 침전이 샘플을 세척하는 데에 이용될 수 있다. 예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피가 샘플로부터 염을 제거하는 데에 이용될 수 있다. 분리 방법의 선택은 샘플의 양에 의존할 수 있다. 예를 들면, 소량의 샘플이 이용될 수 있거나 소형화된 장치가 이용되는 경우, 마이크로-친화성 크로마토그래피 분리 단계가 이용될 수 있다. 추가로, 분리 단계가 요구되는 지 및 분리 방법의 선택은 이용된 검출 방법에 의존할 수 있다. 염은 종종 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화에서 레이저로부터 에너지를 흡수할 수 있고 이온화 효율을 낮출 수 있다. 따라서, 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 및 전기분무 이온화의 효율은 종종 샘플로부터 염을 제거함으로써 개선될 수 있다.
전기영동
일부 실시양태에서, 전기영동이 핵산 단편 길이를 측정하는 데에 이용된다. 일부 실시양태에서, 전기영동이 핵산 단편 길이를 측정하는 데에 이용되지 않는다. 일부 실시양태에서, 전기영동을 이용하여 상응하는 프로브(예를 들면, 본원에 기재된 상응하는 트리밍된 프로브)의 길이를 측정한다. 일부 실시양태에서, 전기영동은 본원에 기재된 길이 기반 분리 방법으로서 이용될 수도 있다. 표준 전기영동 기법 및 전문화된 전기영동 기법, 예컨대, 모세관 전기영동을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 핵산이 길이별로 분리되는, 당분야에서 공지되어 있는 임의의 전기영동 방법이 본원에서 제공된 방법과 함께 이용될 수 있다. 표준 전기영동 기법을 이용하여 핵산을 분리하고 핵산 단편 길이를 측정하는 방법의 예는 당분야에서 발견될 수 있다. 비한정적 예가 본원에 제시되어 있다. 핵산 샘플을 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔에서 런닝시킨 후, 겔을 에티듐 브로마이드로 표지(예를 들면, 염색)할 수 있다(문헌(Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d ed., 2001) 참조). 표준 대조군과 동일한 크기의 밴드의 존재는 특정 핵산 서열 길이의 존재의 표시이고, 그 후 이의 양을 밴드의 강도를 기초로 대조군과 비교하여 관심있는 핵산 서열 길이를 검출하고 정량할 수 있다.
일부 실시양태에서, 모세관 전기영동은 핵산 단편을 분리하고 확인하고 종종 정량하는 데에 이용된다. 모세관 전기영동(CE)은 협공(narrow-bore) 융합된 실리카 모세관을 이용하여 대분자 및 소분자, 예컨대, 상이한 길이의 핵산들의 복합 어레이를 분리하는 일군의 관련된 분리 기법들을 포괄한다. 높은 전기장 강도가 전하, 크기 및 소수성의 차이를 기초로 핵산 분자를 분리하는 데에 이용될 수 있다. 샘플 도입은 모세관의 말단을 샘플 바이알 내로 담구고 압력, 진공 또는 전압을 인가함으로써 달성된다. 사용된 모세관 및 전해질의 종류에 따라 CE의 기술이 여러 분리 기법들로 나누어질 수 있고, 이 기법들 중 임의의 기법이 본원에서 제공된 방법에 맞게 개조될 수 있다. 이들의 비한정적 예는 자유 용액 CE(FSCE)로서도 공지된 모세관 대역 전기영동(CZE), 모세관 등전 집속(CIEF), 등속전기영동(Isotachophoresis)(ITP), 동전기 크로마토그래피(EKC), 마이셀 동전기 모세관 크로마토그래피(MECC 또는 MEKC), 마이크로 에멀젼 동전기 크로마토그래피(MEEKC), 비수성 모세관 전기영동(NACE), 및 모세관 전기크로마토그래피(CEC)를 포함한다.
모세관 전기영동을 수행할 수 있는 임의의 디바이스, 기계 또는 기구가 본원에서 제공된 방법과 함께 이용될 수 있다. 일반적으로, 모세관 전기영동 시스템의 주요 구성요소는 샘플 바이알, 공급원 및 목적 바이알, 모세관, 전극, 고전압 전원, 검출기, 및 데이터 출력 및 취급 디바이스이다. 공급원 바이알, 목적 바이알 및 모세관은 전해질, 예컨대, 수성 완충제 용액으로 충전되어 있다. 샘플을 도입하기 위해, 모세관 입구를 샘플 함유 바이알 내에 배치한 후 공급원 바이알로 향하게 한다(샘플은 모세관 작용, 압력 또는 사이포닝(siphoning)을 통해 모세관 내로 도입된다). 그 다음, 분석물(즉, 핵산)의 이동이 공급원과 목적 바이알 사이에 인가되는 전기장에 의해 개시되고 고전압 전원에 의해 전극으로 공급된다. 양성 또는 음성 이온은 전기삼투 유동에 의해 동일한 방향으로 모세관을 통해 끌어당겨진다. 분석물들(즉, 핵산들)은 그들의 전기영동 이동성으로 인해 이동할 때 분리되고 모세관의 출구 말단 근처에서 검출된다. 검출기의 출력은 데이터 출력 및 취급 디바이스, 예컨대, 적분기 또는 컴퓨터로 보내진다. 그 다음, 데이터는 시간의 함수로서 검출기 반응을 보고할 수 있는 전기영동도(electropherogram)로서 디스플레이된다. 분리된 핵산은 전기영동도에서 상이한 이동 시간을 가진 피크로서 나타날 수 있다.
모세관 전기영동에 의한 분리는 여러 검출 디바이스들에 의해 검출될 수 있다. 대다수의 상업적 시스템들은 그들의 일차 검출 방식으로서 UV 또는 UV-가시광선 흡광도를 이용한다. 이 시스템들에서, 모세관 구획 자체는 검출 셀로서 사용된다. 온-튜브(on-tube) 검출의 이용은 해상 손실 없이 분리된 분석물의 검출을 가능하게 한다. 일반적으로, 모세관 전기영동에서 이용된 모세관은 증가된 안정성을 위해 중합체로 코팅될 수 있다. UV 검출을 위해 이용된 모세관의 부분은 종종 광학적으로 투명하다. 모세관 전기영동에서 검출 셀의 경로 길이(약 50 ㎛)는 전통적인 UV 셀의 경로 길이(약 1 cm)보다 훨씬 더 짧다. 비어-램버트(Beer-Lambert) 규칙에 따라, 검출기의 민감성은 셀의 경로 길이에 비례한다. 민감성을 개선하기 위해, 경로 길이는 증가될 수 있지만, 이것은 해상 손실을 초래할 수 있다. 모세관 튜브 자체는 검출 점에서 확장되어 보다 더 긴 경로 길이를 가진 "버블 셀"을 생성할 수 있거나, 추가 튜빙이 검출 점에서 추가될 수 있다. 그러나, 이 방법들 둘 다가 분리의 해상을 감소시킬 수 있다.
형광 검출도 천연적으로 형광을 나타내거나 형광 태그, 예를 들면, 본원에 기재된 표지된 핵산 단편 또는 프로브를 함유하도록 화학적으로 변형된 샘플을 위한 모세관 전기영동에서 이용될 수 있다. 이 검출 방식은 이 샘플에 대한 높은 민감성 및 개선된 선택성을 제공한다. 상기 방법은 광선이 모세관에 초점을 맞출 것을 요구한다. 레이저-유도 형광이 10-18 내지 10-21 mol만큼 낮은 검출 한계로 CE 시스템에서 이용될 수 있다. 이 기법의 민감성은 입사광의 높은 강도 및 광의 초점을 모세관에 정확히 맞추는 능력에 기인한다.
여러 모세관 전기영동 기계들이 당분야에서 공지되어 있고 본원에서 제공된 방법과 함께 이용될 수 있다. 이들은 CALIPER LAB CHIP GX(칼리퍼 라이프 사이언시스(Caliper Life Sciences), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재), P/ACE 2000 시리즈(벡크만 코울터(Beckman Coulter), 미국 캘리포니아주 브레아 소재), HP G1600A CE(휴렛-팩커드(Hewlett-Packard), 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재), AGILENT 7100 CE(아질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies), 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재), 및 ABI PRISM 유전 분석기(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems), 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
현미경관찰
일부 실시양태에서, 핵산 단편 길이는 영상화에 기초한 방법, 예컨대, 현미경관찰 방법을 이용함으로써 측정된다. 일부 실시양태에서, 상응하는 프로브(예를 들면, 본원에 기재된 상응하는 트리밍된 프로브)의 길이는 영상화에 기초한 방법을 이용함으로써 측정된다. 일부 실시양태에서, 단편 길이는 단일 핵산 단편의 현미경 가시화에 의해 측정될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,720,928호 참조). 일부 실시양태에서, 핵산 단편은 연신된 상태로 표면(예를 들면, 변형된 유리 표면)에 고정되고 염색되고 현미경에 의해 가시화된다. 단편의 영상은 수집될 수 있고 프로세싱될 수 있다(예를 들면, 길이에 대해 측정될 수 있다). 일부 실시양태에서, 영상화 및 영상 분석 단계는 자동화될 수 있다. 현미경관찰을 이용하여 핵산 단편을 직접적으로 가시화하는 방법은 당분야에서 공지되어 있다(예를 들면, 문헌(Lai et al. (1999) Nat Genet. 23(3):309-13); 문헌(Aston et al. (1999) Trends Biotechnol. 17(7):297-302); 문헌(Aston et al. (1999) Methods Enzymol. 303:55-73); 문헌(Jing et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA. 95(14):8046-51); 및 미국 특허 제5,720,928호 참조). 본원에 기재된 방법과 함께 이용될 수 있는 다른 현미경관찰 방법은 스캐닝 터널링 현미경관찰(STM), 원자력 현미경관찰(ATM), 스캐닝 힘 현미경 관찰(SFM), 광자 스캐닝 현미경관찰(PSTM), 스캐닝 터널링 전위차측정(STP), 자기력 현미경관찰(MFM), 스캐닝 프로브 현미경관찰, 스캐닝 전압 현미경관찰, 광전도 원자력 현미경관찰, 전기화학 스캐닝 터널링 현미경관찰, 전자 현미경관찰, 회전 편광 스캐닝 터널링 현미경관찰(SPSTM), 스캐닝 열 현미경관찰, 스캐닝 줄(joule) 팽창 현미경관찰, 광열 마이크로분광법 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 스캐닝 터널링 현미경관찰(STM)은 핵산 단편 길이를 측정하는 데에 이용될 수 있다. STM 방법은 종종 분자, 예컨대, 핵산 단편의 원자-수준 영상을 생성할 수 있다. STM은 예를 들면, 공기, 물, 초고 진공, 다양한 다른 액체 또는 기체 환경에서 수행될 수 있고, 예를 들면, 거의 0 켈빈 내지 수백 섭씨온도의 온도에서 수행될 수 있다. STM 시스템의 구성요소는 전형적으로 스캐닝 팁, 압전 제어된 높이 및 x, y 스캐너, 조질 샘플-대-팁 제어, 진동 단리 시스템, 및 컴퓨터를 포함한다. STM 방법은 일반적으로 양자 터널링의 개념에 기초한다. 예를 들면, 전도 팁이 분자(예를 들면, 핵산 단편)의 표면에 가까이 오게 될 때, 이들 둘 사이에 인가된 편향(bias)(즉, 전압 차이)이 전자로 하여금 이들 사이의 진공을 통해 터널링할 수 있게 한다. 생성된 터널링 전류는 팁 위치, 인가된 전압, 및 샘플의 상태의 국소 밀도(LDOS)의 함수이다. 정보는 팁의 위치가 표면을 가로질러 스캐닝할 때 전류를 모니터링함으로써 획득되고 영상 형태로 디스플레이될 수 있다. 팁이 x-y 평면에서 샘플을 가로질러 이동하는 경우, 표면 높이 및 상태 밀도의 변화가 전류의 변화를 야기한다. 이 변화들은 영상에서 맵핑될 수 있다. 위치에 대한 전류의 변화는 종종 그 자체로 측정될 수 있거나, 일정한 전류에 상응하는 팁의 높이 z가 측정될 수 있다. 이들 두 방식들은 종종 각각 일정한 높이 방식 및 일정한 전류 방식으로서 지칭된다.
일부 실시양태에서, 원자력 현미경관찰(AFM)은 핵산 단편 길이를 측정하는 데에 이용될 수 있다. AFM은 일반적으로 높이-해상 종류의 나노스케일 현미경관찰이다. 물체(예를 들면, 핵산 단편)에 대한 정보는 전형적으로 기계적 프로브로 표면을 "필링(feeling)"함으로써 모아진다. 전자적 명령에 대한 작지만 정확하고 정밀한 이동을 용이하게 하는 압전 요소는 매우 정밀한 스캐닝을 용이하게 할 수 있다. 일부 변경에서, 전도 캔틸레버(cantilever)를 이용하여 전위를 스캐닝할 수 있다. AFM 시스템의 구성요소는 전형적으로 표본(예를 들면, 핵산 단편)의 표면을 스캐닝하는 데에 이용되는, 그의 말단에서 날카로운 팁(즉, 프로브)을 가진 캔틸레버를 포함한다. 캔틸레버는 전형적으로 대략 나노미터의 곡률 팁 반경을 가진 규소 또는 질화규소이다. 팁이 샘플 표면의 근처에 올 때, 팁과 샘플 사이의 힘은 훅의 법칙(Hooke's law)에 따라 캔틸레버의 굴절을 유발한다. 상황에 따라, AFM에서 측정되는 힘은 예를 들면, 기계적 접촉력, 반데르 발스 힘, 모세관 힘, 화학적 결합, 전정기 힘, 자기력, 캐시미르(Casimir) 힘, 용매화 힘 등을 포함한다. 전형적으로, 굴절은 캔틸레버의 상부 표면으로부터 광다이오드의 어레이 내로 반사되는 레이저 점을 이용함으로써 측정된다. 이용되는 다른 방법은 광학 간섭측정, 전기용량 감응(capacitive sensing) 또는 압전저항 AFM 캔틸레버를 포함한다.
나노공극
일부 실시양태에서, 핵산 단편 길이는 나노공극을 이용함으로써 측정된다. 일부 실시양태에서, 상응하는 프로브(예를 들면, 본원에 기재된 상응하는 트리밍된 프로브)의 길이는 나노공극을 이용함으로써 측정된다. 나노공극은 전형적으로 대략 1 나노미터의 직경을 가진 작은 홀 또는 채널이다. 특정 경막 세포 단백질들(예를 들면, 알파-헤모라이신)은 나노공극으로서 작용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노공극은 (예를 들면, 규소 플랫폼을 이용함으로써) 합성될 수 있다. 나노공극을 전도 유체에 담구고 이를 가로질러 전위를 인가하는 것은 나노공극을 통한 이온의 전도로 인해 약간의 전류를 발생시킨다. 흐르는 전류의 양은 나노공극의 크기에 민감하다. 핵산 단편이 을 통과할 때, 핵산 분자는 나노공극을 일정한 정도까지 차단하고 전류의 변화를 발생시킨다. 핵산 단편이 나노공극을 통과할 때 전류 변화의 지속시간이 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 단편 길이는 이 측정을 기초로 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산 단편 길이는 시간의 함수로서 측정될 수 있다. 보다 더 긴 핵산 단편은 종종 나노공극을 통과하기 위해 상대적으로 더 많은 시간을 소요할 수 있고, 보다 더 짧은 핵산 단편은 종종 나노공극을 통과하기 위해 상대적으로 더 적은 시간을 소요할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 단편의 상대적 길이가 나노공극 통과 시간을 기초로 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대략적 또는 절대적 단편 길이는 표적 단편 및/또는 기준 단편의 나노공극 통과 시간을 표준물(즉, 공지된 길이를 가진) 세트에 대한 통과 시간과 비교함으로써 측정될 수 있다.
프로브
일부 실시양태에서, 단편 길이는 하나 이상의 프로브를 사용함으로써 측정된다. 일부 실시양태에서, 프로브들은 이들 각각이 샘플 중의 관심있는 핵산에 혼성화하도록 디자인된다. 예를 들면, 프로브는 관심있는 핵산에 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있거나 관심있는 핵산에 결합할 수 있는 일련의 단량체들을 포함할 수 있다. 프로브는 하나 이상의 관심있는 핵산 단편에 혼성화하기에(예를 들면, 완전히 혼성화하기에) 적합한 임의의 길이를 가질 수 있다. 예를 들면, 프로브는 그 자신이 혼성화하는 핵산 단편의 길이를 초과하여 걸쳐 있거나 확장되는 임의의 길이를 가질 수 있다. 프로브는 약 100 bp 이상의 길이를 가질 수 있다. 예를 들면, 프로브는 약 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 bp 이상의 길이를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로브는 관심있는 핵산에 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열, 및 관심있는 핵산에 상보적이지 않은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열(즉, 비상보적인 서열)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 비상보적인 서열은 프로브의 5' 및/또는 3' 말단에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비상보적인 서열은 관심있는 유기체에 존재하지 않는 뉴클레오티드 서열 및/또는 인간 게놈 내의 임의의 서열에 혼성화할 수 없는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 비상보적인 서열은 당분야에서 공지된 임의의 비-인간 게놈, 예를 들면, 비-포유동물 동물 게놈, 식물 게놈, 진균 게놈, 세균 게놈 또는 바이러스 게놈으로부터 유래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비상보적인 서열은 PhiX 174 게놈으로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 비상보적인 서열은 상보적인 뉴클레오티드에 혼성화할 수 없는 변형된 또는 합성 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
프로브는 올리고뉴클레오티드(예를 들면, 포획 올리고뉴클레오티드)에 대해 당분야에서 공지되어 있고 본원에 기재되어 있는 방법에 따라 디자인될 수 있고 합성될 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드에 대해 당분야에서 공지되어 있고 본원에 기재되어 있는 성질들 중 임의의 성질을 포함할 수도 있다. 본원에서 프로브는 뉴클레오티드(예를 들면, 아데닌(A), 타이민(T), 사이토신(C), 구아닌(G) 및 우라실(U)), 변형된 뉴클레오티드(예를 들면, 슈도유리딘, 디하이드로유리딘, 이노신(I) 및 7-메틸구아노신), 합성 뉴클레오티드, 축퇴 염기(예를 들면, 6H,8H-3,4-디하이드로피리미도[4,5-c][1,2]옥사진-7-온(P), 2-아미노-6-메톡시아미노푸린(K), N6-메톡시아데닌(Z) 및 하이포잔틴(I)), 뉴클레오티드 이외의 보편적인 염기 및/또는 단량체, 변형된 뉴클레오티드 또는 합성 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합물을 포함하도록 디자인될 수 있고, 일반적으로 처음에 그 자신이 혼성화하는 단편보다 더 긴 길이를 가지도록 디자인된다.
일부 실시양태에서, 프로브는 뉴클레오티드의 천연 생성 또는 변형된 버전들, 예컨대, 아데닌(A), 타이민(T), 사이토신(C), 구아닌(G) 및 우라실(U) 중 어느 하나에 혼성화할 수 있는 복수의 단량체들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브는 아데닌, 타이민, 사이토신 및 구아닌 중 3개 이상에 혼성화할 수 있는 복수의 단량체들을 포함한다. 예를 들면, 프로브는 A, T 및 C; A, T 및 G; G, C 및 T; 또는 G, C 및 A에 혼성화할 수 있는 종의 단량체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로브는 아데닌, 타이민, 사이토신 및 구아닌 모두에 혼성화할 수 있는 복수의 단량체들을 포함한다. 예를 들면, 프로브는 A, T, C 및 G 모두에 혼성화할 수 있는 종의 단량체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 혼성화 조건(예를 들면, 엄격성)은 예를 들면, 특정 단량체 종들과 다양한 뉴클레오티드 종들의 혼성화를 용이하게 하기 위해 본원에 기재된 방법에 따라 조절될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단량체는 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단량체는 천연 생성 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단량체는 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 프로브의 단량체는 이노신을 포함한다. 이노신은 tRNA에서 흔히 발견되는 뉴클레오티드이고, 일부 경우 A, T 및 C에 혼성화할 수 있다. 본원의 실시예 9는 핵산 단편 크기의 측정을 위해 폴리이노신 프로브를 사용하는 방법을 기술한다. 일부 실시양태에서, 폴리이노신 프로브는 낮은 엄격한 또는 엄격하지 않은 혼성화 조건(예를 들면, 본원에 기재된 엄격한 혼성화 조건에 비해 낮은 온도 및/또는 높은 염) 하에서 핵산 단편에 혼성화된다. 일부 실시양태에서, 핵산 단편은 단편에서 메틸화되지 않은 사이토신 잔기의 탈아민화를 야기하여 우라실 잔기를 형성하는 중아황산나트륨으로 처리된다. 일부 실시양태에서, 중아황산나트륨으로 처리된 핵산 단편은 중아황산나트륨 처리 전에 증폭된다(예를 들면, PCR 증폭된다). 일부 실시양태에서, 핵산 단편은 사이토신 잔기를 갖지 않는 보편적인 증폭 프라이머 부위를 포함하는 서열에 연결된다. 그 다음, 상보적인 제2 가닥이 예를 들면, 보편적인 증폭 프라이머 및 연장 반응을 이용함으로써 생성될 수 있다. 전형적으로, 제1 가닥에서 우라실 잔기는 제2 가닥에서 상보적인 아데닌 잔기를 생성한다. 따라서, 구아닌 잔기를 갖지 않는 제2 가닥이 생성될 수 있다. 일부 경우, 이러한 구아닌 무함유 상보적인 제2 가닥은 엄격한 혼성화 조건 하에서 폴리이노신 프로브에 혼성화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로브의 단량체는 보편적인 염기 단량체를 포함한다. 보편적인 염기 단량체는 전형적으로 각각의 천연 염기(예를 들면, A, G, C, T)에 비선택적으로 혼성화할 수 있는 뉴클레오염기 유사체 또는 합성 단량체이다. 따라서, 보편적인 염기 단량체를 포함하는 프로브는 종종 뉴클레오티드 서열과 관계없이 핵산 단편에 혼성화할 수 있다. 보편적인 염기는 3-니트로피롤, 4-니트로인돌, 5-니트로인돌, 6-니트로인돌, 3-메틸 7-프로피닐 이소카보스티릴(PIM), 3-메틸 이소카보스티릴(MICS) 및 5-메틸 이소카보스티릴(5MICS)을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다(예를 들면, 문헌(Nichols et al. (1994) Nature 369, 492-493); 문헌(Bergstrom et al. (1995) J. Am. Chem. Soc. 117, 1201-1209); 문헌(Loakes and Brown (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4039-4043); 문헌(Lin and Brown (1992) Nucleic Acids Res. 20, 5149-5152); 문헌(Lin and Brown (1989) Nucleic Acids Res. 17, 10383); 문헌(Brown and Lin (1991) Carbohydrate Research 216, 129-139); 및 문헌(Berger et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28(15): 2911??2914) 참조).
일부 실시양태에서, 프로브의 단량체는 비-뉴클레오티드 단량체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단량체는 합성 중합체의 서브유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단량체는 피롤리돈을 포함한다. 피롤리돈은 합성 중합체 폴리피롤리돈의 단량체이고, 일부 경우 A, T, G 및 C 모두에 혼성화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 단편 길이를 측정하는 방법은 어닐링 조건 하에서 핵산 단편(예를 들면, 표적 및/또는 기준 단편)을, 이 단편에 어닐링할 수 있는 복수의 프로브들과 접촉시켜 단편-프로브 종, 예를 들면, 표적-프로브 종 및 기준물-프로브 종을 생성하는 단계를 포함한다. 프로브 및/또는 혼성화 조건(예를 들면, 엄격성)은 완전한 또는 실질적으로 완전한 단편 결합에 유리하도록 최적화될 수 있다(예를 들면, 높은 엄격성). 이하에 더 상세히 기재된 바와 같이, 완전한 또는 실질적으로 완전한 단편-프로브 혼성화는 일반적으로 이중체를 포함하고, 이때 단편은 혼성화되지 않은 부분을 포함하지 않고 프로브는 혼성화되지 않은 부분을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 예컨대, 프로브 길이가 단편 길이보다 더 긴 경우, 표적-프로브 종 및/또는 기준물-프로브 종은 혼성화되지 않은 프로브 부분(즉, 단일 가닥 프로브 부분; 예를 들면, 도 12 참조)을 각각 포함할 수 있다. 혼성화되지 않은 프로브 부분은 프로브의 어느 한 말단(예를 들면, 프로브의 3' 또는 5' 말단) 또는 프로브의 양 말단(즉, 프로브의 3' 말단 및 5' 말단)에 존재할 수 있고 임의의 수의 단량체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 혼성화되지 않은 프로브 부분은 약 1개 내지 약 500개의 단량체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 혼성화되지 않은 프로브 부분은 약 5개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 100개, 200개, 300개 또는 400개의 단량체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 혼성화되지 않은 프로브 부분은 표적-프로브 종 및/또는 기준물-프로브 종으로부터 제거되어 트리밍된 프로브를 생성할 수 있다. 혼성화되지 않은 프로브 부분의 제거는 당분야에서 공지되어 있는 임의의 중합체 절단 및/또는 분해 방법, 예를 들면, 단일 가닥 핵산을 절단하거나 분해하는 방법에 의해 달성될 수 있다. 혼성화되지 않은 프로브 부분은 프로브의 5' 말단 및/또는 프로브의 3' 말단으로부터 제거될 수 있다. 이러한 방법은 화학적 및/또는 효소적 절단 또는 분해의 이용을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산의 뉴클레오티드 서브유닛들 사이의 포스포디에스테르 결합을 절단할 수 있는 효소가 혼성화되지 않은 프로브 부분을 제거하는 데에 사용된다. 이러한 효소는 뉴클레아제(예를 들면, DNAse I, RNAse I), 엔도뉴클레아제(예를 들면, 녹두 뉴클레아제, S1 뉴클레아제 등), 제한 뉴클레아제, 엑소뉴클레아제(예를 들면, 엑소뉴클레아제 I, 엑소뉴클레아제 III, 엑소뉴클레아제 T, T7 엑소뉴클레아제, 람다 엑소뉴클레아제 등), 포스포디에스터라제(예를 들면, 포스포디에스터라제 II, 소 비장 포스포디에스터라제, 뱀독 포스포디에스터라제 등), 데옥시리보뉴클레아제(DNAse), 리보뉴클레아제(RNAse), 플랩(flap) 엔도뉴클레아제, 5' 뉴클레아제, 3' 뉴클레아제, 3'-5' 엑소뉴클레아제, 5'-3' 엑소뉴클레아제 등, 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 트리밍된 프로브는 일반적으로 그 자신이 혼성화하는 단편과 동일한 또는 실질적으로 동일한 길이를 가진다. 따라서, 본원의 트리밍된 프로브의 길이 측정은 상응하는 핵산 단편 길이 측정을 제공할 수 있다. 트리밍된 프로브 길이는 당분야에서 공지되어 있거나 본원에 기재되어 있는 핵산 단편 길이 측정 방법들 중 임의의 방법을 이용함으로써 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로브는 검출 및/또는 길이 측정을 용이하게 하기 위한 검출가능한 분자 또는 물체(예를 들면, 형광단, 방사성동위원소, 비색 물질, 입자, 효소 등)를 함유할 수 있다. 트리밍된 프로브 길이는 혼성화되지 않은 부분이 제거된 후 이 부분의 생성물을 분리하거나 분리하지 않고 평가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 트리밍된 프로브는 그의 상응하는 핵산 단편으로부터 해리(즉, 분리)된다. 프로브는 열 변성을 포함하나 이것으로 한정되지 않는, 당분야에서 공지되어 있는 임의의 방법을 이용함으로써 그의 상응하는 핵산 단편으로부터 분리될 수 있다. 트리밍된 프로브는 당분야에서 공지되어 있거나 본원에 기재되어 있는, 혼합물에서 분자의 한 종을 표지하고/하거나 단리하는 방법에 의해 상응하는 핵산 단편으로부터 구별될 수 있다. 예를 들면, 프로브 및/또는 핵산 단편은 프로브가 그 자신에 혼성화하는 핵산으로부터 구별될 수 있도록 검출가능한 성질을 포함할 수 있다. 검출가능한 성질의 비한정적 예는 광학적 성질, 전기적 성질, 자기적 성질, 화학적 성질, 및 공지된 크기의 개구를 통과하는 시간 및/또는 속도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브와 샘플 핵산 단편은 서로 물리적으로 분리된다. 분리는 예를 들면, 포획 리간드, 예컨대, 바이오틴 또는 다른 친화성 리간드, 및 포획제, 예컨대, 아비딘, 스트렙타비딘, 항체 또는 수용체를 사용함으로써 달성될 수 있다. 프로브 또는 핵산 단편은 포획제에 대한 특이적 결합 활성을 가진 포획 리간드를 함유할 수 있다. 예를 들면, 핵산 샘플로부터의 단편은 당분에서 잘 공지되어 있는 방법을 이용함으로써 바이오티닐화될 수 있거나 친화성 리간드에 부착될 수 있고, 예를 들면, 스트렙타비딘으로 코팅된 비드를 사용한 풀-다운(pull-down) 분석을 이용함으로써 프로브로부터 분리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 포획 리간드 및 포획제 또는 임의의 다른 모이어티(예를 들면, 질량 태그)는 핵산 단편이 질량 분광측정기에서 검출된 질량 범위의 프로브로부터 배제될 수 있도록 질량을 상기 핵산 단편에 추가하는 데에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 질량은 단량체 그 자체 및/또는 질량 태그의 추가에 의해 프로브에 추가되어 상기 질량 범위를 핵산 단편에 대한 질량 범위로부터 변동시킨다.
핵산 라이브러리
일부 실시양태에서, 핵산 라이브러리는 특정 공정을 위해 제조되고/되거나, 조립되고/되거나 변경되는 복수의 폴리뉴클레오티드 분자들(예를 들면, 핵산의 샘플)이고, 상기 공정의 비한정적 예는 고체상(예를 들면, 고체 지지체, 예를 들면, 유동 셀, 비드) 상에의 고정, 농축, 증폭, 클로닝, 검출 및/또는 핵산 서열결정을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 라이브러리는 서열결정 공정 전 또는 동안에 제조된다. 핵산 라이브러리(예를 들면, 서열결정 라이브러리)는 당분야에서 공지된 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 핵산 라이브러리는 표적화된 또는 표적화되지 않은 제조 공정에 의해 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산의 라이브러리는 핵산을 고체 지지체에 고정시키도록 구성된 화학 모이어티(예를 들면, 작용기)를 포함하도록 변경된다. 일부 실시양태에서, 핵산의 라이브러리는 라이브러리를 고체 지지체에 고정시키도록 구성된 생체분자(예를 들면, 작용기) 및/또는 결합 쌍의 구성원을 포함하도록 변경되고, 상기 고체 지지체의 비한정적 예는 티록신 결합 글로불린, 스테로이드 결합 단백질, 항체, 항원, 햅텐, 효소, 렉틴, 핵산, 리프레서, 단백질 A, 단백질 G, 아비딘, 스트렙타비딘, 바이오틴, 보체 성분 C1q, 핵산 결합 단백질, 수용체, 탄수화물, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 상보적 핵산 서열 등 및 이들의 조합물을 포함한다. 특정 결합 쌍의 일부 예는 하기 결합 쌍들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다: 아비딘 모이어티 및 바이오틴 모이어티; 항원성 에피토프 및 항체 또는 이의 면역학적 반응성 단편; 항체 및 햅텐; 디곡시겐 모이어티 및 항-디곡시겐 항체; 플루오레세인 모이어티 및 항-플루오레세인 항체; 오퍼레이터 및 리프레서; 뉴클레아제 및 뉴클레오티드; 렉틴 및 폴리사카라이드; 스테로이드 및 스테로이드 결합 단백질; 활성 화합물 및 활성 화합물 수용체; 호르몬 및 호르몬 수용체; 효소 및 기질; 면역글로불린 및 단백질 A; 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 및 이의 상응하는 상보체 등; 또는 이들의 조합물.
일부 실시양태에서, 핵산의 라이브러리는 공지된 조성의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 변경되고, 이때 상기 폴리뉴클레오티드의 비한정적 예는 식별자(예를 들면, 태그, 인덱스화 태그), 포획 서열, 표지, 어댑터, 제한 효소 부위, 프로모터, 인핸서, 복제기점, 줄기 루프, 상보적 서열(예를 들면, 프라이머 결합 부위, 어닐링 부위), 적합한 삽입 부위(예를 들면, 트랜스포존, 바이러스 삽입 부위), 변경된 뉴클레오티드 등 또는 이들의 조합물을 포함한다. 공지된 서열의 폴리뉴클레오티드는 적합한 위치, 예를 들면, 5' 말단, 3' 말단 또는 핵산 서열 내에서 추가될 수 있다. 공지된 서열의 폴리뉴클레오티드는 동일한 또는 상이한 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 공지된 서열의 폴리뉴클레오티드는 표면(예를 들면, 유동 셀의 표면) 상에 고정된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드에 혼성화하도록 구성된다. 예를 들면, 5' 공지된 서열을 포함하는 핵산 분자는 복수의 제1 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 반면, 3' 공지된 서열은 복수의 제2 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산의 라이브러리는 염색체 특이적 태그, 포획 서열, 표지 및/또는 어댑터를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산의 라이브러리는 하나 이상의 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 검출가능한 표지는 5' 말단, 3' 말단 및/또는 라이브러리의 핵산 내의 임의의 뉴클레오티드 위치에서 핵산 라이브러리 내로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산의 라이브러리는 혼성화된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 혼성화된 올리고뉴클레오티드는 표지된 프로브이다. 일부 실시양태에서, 핵산의 라이브러리는 고체상에의 고정 전에 혼성화된 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함한다.
일부 실시양태에서, 공지된 서열의 폴리뉴클레오티드는 보편적인 서열을 포함한다. 보편적인 서열은 2개 이상의 핵산 분자들 또는 2개 이상의 핵산 분자들의 서브세트 내로 삽입되는 특정 뉴클레오티드 서열이고, 이때 보편적인 서열은 그 자신이 삽입되어 있는 모든 분자들 또는 분자들의 서브세트에 대해 동일하다. 보편적인 서열은 종종 보편적인 서열에 상보적인 단일 보편적인 프라이머를 사용하여 복수의 상이한 서열들에 혼성화하고/하거나 이러한 상이한 서열들을 증폭하도록 디자인된다. 일부 실시양태에서, 2개(예를 들면, 한 쌍) 이상의 보편적인 서열들 및/또는 보편적인 프라이머들이 사용된다. 보편적인 프라이머는 종종 보편적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 어댑터(예를 들면, 보편적인 어댑터)는 보편적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 보편적인 서열을 사용하여 핵산의 다수의 종 또는 서브세트를 포획하고/하거나, 확인하고/하거나 검출한다.
핵산 라이브러리를 제조하는 일부 실시양태에서(예를 들면, 합성 절차에 의한 일부 서열결정에서), 핵산은 (예를 들면, 라이브러리 생성을 위한 제조에서) 수백 개 이하의 염기쌍 길이로 크기 선택되고/되거나 단편화된다. 일부 실시양태에서, 라이브러리 제조는 (예를 들면, ccfDNA를 사용할 때) 단편화 없이 수행된다.
일부 실시양태에서, 연결 기초 라이브러리 제조 방법이 이용된다(예를 들면, 일루미나 TRUSEQ, 일루미나, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재). 연결 기초 라이브러리 제조 방법은 초기 연결 단계에서 인덱스 서열을 도입할 수 있고 종종 단일-리드 서열결정, 페어링된-말단 서열결정 및 다중체화된 서열결정을 위한 샘플을 제조하는 데에 사용될 수 있는 어댑터(예를 들면, 메틸화된 어댑터) 디자인을 종종 이용한다. 예를 들면, 종종 핵산(예를 들면, 단편화된 핵산 또는 ccfDNA)은 필-인(fill-in) 반응, 엑소뉴클레아제 반응 또는 이들의 조합에 의해 말단 복구된다. 그 다음, 일부 실시양태에서, 생성된 블런트(blunt)-말단 복구된 핵산은 어댑터/프라이머의 3' 말단 상의 단일 뉴클레오티드 오버행(overhang)에 상보적인 단일 뉴클레오티드에 의해 연장될 수 있다. 임의의 뉴클레오티드가 연장/오버행 뉴클레오티드용으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 라이브러리 제조는 어댑터 올리고뉴클레오티드를 연결하는 단계를 포함한다. 어댑터 올리고뉴클레오티드는 종종 유동 셀 고착제(anchors)에 상보적이고, 종종 핵산 라이브러리를 고체 지지체, 예컨대, 유동 셀의 내부 표면에 고정시키는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 어댑터 올리고뉴클레오티드는 식별자, 하나 이상의 서열결정 프라이머 혼성화 부위(예를 들면, 보편적인 서열결정 프라이머, 단일 말단 서열결정 프라이머, 페어링된-말단 서열결정 프라이머, 다중체화된 서열결정 프라이머 등에 상보적인 서열) 또는 이들의 조합(예를 들면, 어댑터/서열결정, 어댑터/식별자, 어댑터/식별자/서열결정)을 포함한다.
식별자는 식별자를 포함하는 핵산의 검출 및/또는 식별을 가능하게 하는, 핵산(예를 들면, 폴리뉴클레오티드) 내로 도입된 또는 이러한 핵산에 부착된 적합한 검출가능한 표지일 수 있다. 일부 실시양태에서, 식별자는 서열결정 방법 동안에 (예를 들면, 중합효소에 의해) 핵산 내로 도입되거나 핵산에 부착된다. 식별자의 비한정적 예는 핵산 태그, 핵산 인덱스 또는 바코드, 방사성표지(예를 들면, 동위원소), 금속성 표지, 형광 표지, 화학발광 표지, 인광 표지, 형광단 소광제(quencher), 염료, 단백질(예를 들면, 효소, 항체 또는 이의 부분, 링커, 결합 쌍의 구성원) 등 또는 이들의 조합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식별자(예를 들면, 핵산 인덱스 또는 바코드)는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체의 유일한, 공지된 및/또는 식별가능한 서열이다. 일부 실시양태에서, 식별자는 6개 이상의 연속 뉴클레오티드이다. 다양한 상이한 여기 및 방사 스펙트럼을 가진 다수의 형광단들이 사용될 수 있다. 임의의 적합한 종류 및/또는 수의 형광단들이 식별자로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상 또는 50개 이상의 상이한 식별자들이 본원에 기재된 방법(예를 들면, 핵산 검출 및/또는 서열결정 방법)에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 1종 또는 2종의 식별자(예를 들면, 형광 표지)가 라이브러리의 각각의 핵산에 연결된다. 식별자의 검출 및/또는 정량은 적합한 방법, 장치 또는 기계에 의해 수행될 수 있고, 이러한 방법, 장치 또는 기계의 비한정적 예는 유동 세포측정, 정량 중합효소 연쇄 반응(qPCR), 겔 전기영동, 광도계(luminometer), 형광계(fluorometer), 분광광도계, 적합한 유전자-칩 또는 마이크로어레이 분석, 웨스턴 블롯, 질량 분광측정, 크로마토그래피, 세포형광측정(cytofluorimetric) 분석, 형광 현미경관찰, 적합한 형광 또는 디지털 영상화 방법, 공초점 레이저 스캐닝 현미경관찰, 레이저 스캐닝 세포측정, 친화성 크로마토그래피, 수동 배치 모드(batch mode) 분리, 전기장 현탁, 적합한 핵산 서열결정 방법 및/또는 핵산 서열결정 장치 등 및 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 트랜스포존(transposon) 기초 라이브러리 제조 방법이 이용된다(예를 들면, EPICENTRE NEXTERA, 에피센터(Epicentre), 미국 위스콘신주 매디슨 소재). 트랜스포존 기초 방법은 전형적으로 (종종 플랫폼 특이적 태그 및 임의적인 바코드의 도입을 가능하게 하는) 단일 튜브 반응에서 시험관내 전위(transposition)를 이용하여 동시에 DNA를 단편화하고 태깅하고, 서열결정기-준비된(sequencer-ready) 라이브러리를 제조한다.
일부 실시양태에서, 핵산 라이브러리 또는 이의 부분이 증폭된다(예를 들면, PCR 기초 방법에 의해 증폭된다). 일부 실시양태에서, 서열결정 방법은 핵산 라이브러리의 증폭을 포함한다. 핵산 라이브러리는 고체 지지체(예를 들면, 유동 셀 내의 고체 지지체) 상에의 고정 전 또는 후에 증폭될 수 있다. 핵산 증폭은 주형 및/또는 이의 상보체의 하나 이상의 카피를 생성함으로써 (예를 들면, 핵산 라이브러리에) 존재하는 핵산 주형 및/또는 이의 상보체의 수를 증폭하거나 증가시키는 공정을 포함한다. 증폭은 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 핵산 라이브러리는 열순환(thermocycling) 방법 또는 등온 증폭 방법에 의해 증폭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 롤링 서클 증폭 방법이 이용된다. 일부 실시양태에서, 증폭은 (예를 들면, 유동 셀 내의) 고체 지지체 상에서 일어나고, 이때 핵산 라이브러리 또는 이의 부분이 고정된다. 일부 서열결정 방법에서, 핵산 라이브러리는 유동 셀에 첨가되고, 적합한 조건 하에서 고착제와의 혼성화에 의해 고정된다. 이러한 종류의 핵산 증폭은 종종 고체상 증폭으로서 지칭된다. 고체상 증폭의 일부 실시양태에서, 증폭된 생성물의 전부 또는 부분은 고정된 프라이머로부터 시작되는 연장에 의해 합성된다. 고체상 증폭 방법은 하나 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드(예를 들면, 프라이머)가 고체 지지체 상에 고정된다는 점을 제외하고 표준 용액상 증폭과 유사하다.
일부 실시양태에서, 고체상 증폭은 표면에 고정된 1개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 종만을 포함하는 핵산 증폭 반응을 포함한다. 일부 실시양태에서, 고체상 증폭은 복수의 상이한 고정된 올리고뉴클레오티드 프라이머 종들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 고체상 증폭은 고체 표면 상에 고정된 1개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 종, 및 용액 중의 상이한 제2 올리고뉴클레오티드 프라이머 종을 포함하는 핵산 증폭 반응을 포함할 수 있다. 다수의 상이한 고정된 또는 용액 기초 프라이머 종들이 사용될 수 있다. 고체상 핵산 증폭 반응의 비한정적 예는 계면 중합, 가교 중합, 에멀젼 PCR, 와일드파이어(WildFire) 중합(예를 들면, 미국 특허출원 공보 제20130012399호) 등 또는 이들의 조합을 포함한다.
서열결정
일부 실시양태에서, 핵산(예를 들면, 핵산 단편, 샘플 핵산, 세포 무함유 핵산)이 서열결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전체 또는 실질적으로 전체 서열이 수득되고 종종 부분 서열이 수득된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법을 수행할 때, 핵산은 서열결정되지 않고, 핵산의 서열은 서열결정 방법에 의해 결정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 단편 길이는 서열결정 방법을 이용함으로써 측정된다. 일부 실시양태에서, 단편 길이는 서열결정 방법의 이용 없이 측정된다. 서열결정, 맵핑 및 관련된 분석 방법이 본원에 기재되어 있고 당분야에서 공지되어 있다(예를 들면, 참고로 도입되는 미국 특허출원 공보 제2009/0029377호 참조). 이러한 공정의 특정 양태들이 이하에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 단편 길이는 서열결정 방법을 이용함으로써 측정된다. 일부 실시양태에서, 단편 길이는 페어링된-말단 서열결정 플랫폼을 이용함으로써 측정된다. 이러한 플랫폼은 핵산 단편의 양 말단의 서열결정을 포함한다. 일반적으로, 단편의 양 말단에 상응하는 서열은 기준 게놈(예를 들면, 기준 인간 게놈)에 맵핑될 수 있다. 특정 실시양태에서, 양 말단은 각각의 단편 말단에 대해 개별적으로 기준 게놈에 맵핑되기에 충분한 리드 길이에서 서열결정된다. 페어링된-말단 서열 리드 길이의 예는 이하에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 서열 리드들의 전부 또는 일부가 불일치 없이 기준 게놈에 맵핑될 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 리드는 독립적으로 맵핑된다. 일부 실시양태에서, (즉, 각각의 말단으로부터의) 서열 리드들 둘 다로부터의 정보가 맵핑 공정에서 팩토링된다. 단편의 길이는 예를 들면, 각각의 맵핑된 페어링된-말단 리드에 할당된 게놈 좌표들 사이의 차이를 계산함으로써 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 단편 길이는 단편에 대한 완전한 또는 실질적으로 완전한 뉴클레오티드 서열을 수득하는 서열결정 공정을 이용함으로써 측정될 수 있다. 이러한 서열결정 공정은 상대적으로 긴 리드 길이를 생성하는 플랫폼(예를 들면, 로슈 454, 이온 토렌트, 단일 분자(파시픽 바이오사이언시스(Pacific Biosciences)), 실시간 SMRT 기술 등)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 샘플 중의 일부 또는 모든 핵산들이 서열결정 전 또는 동안에 (예를 들면, 비특이적으로, 예를 들면, PCR 기초 방법에 의해) 농축되고/되거나 증폭된다. 일부 실시양태에서, 샘플 중의 핵산의 특정 부분 또는 서브세트가 서열결정 전 또는 동안에 농축되고/되거나 증폭된다. 일부 실시양태에서, 핵산의 미리 선택된 풀의 부분 또는 서브세트가 무작위적으로 서열결정된다. 일부 실시양태에서, 샘플 중의 핵산은 서열결정 전 또는 동안에 농축되지 않고/않거나 증폭되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "리드"(즉, "리드", "서열 리드")는 본원에 기재되어 있거나 당분야에서 공지되어 있는 임의의 서열결정 공정에 의해 생성된 짧은 뉴클레오티드 서열이다. 리드는 핵산 단편의 한 말단으로부터 생성될 수 있고("단일-말단 리드"), 종종 핵산의 양 말단으로부터 생성된다(예를 들면, 페어링된-말단 리드, 이중-말단 리드).
서열 리드의 길이는 종종 특정 서열결정 기술과 관련되어 있다. 예를 들면, 고속처리 방법은 크기 면에서 수십 개 내지 수백 개의 염기쌍(bp)만큼 상이할 수 있는 서열 리드를 제공한다. 예를 들면, 나노공극 서열결정은 크기 면에서 수십 개 내지 수천 개의 염기쌍만큼 상이할 수 있는 서열 리드를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열 리드는 약 15 bp 내지 약 900 bp 길이의 평균, 중간, 평균치 또는 절대 길이를 가진다. 일부 실시양태에서, 서열 리드는 약 1000 bp 이상의 평균, 중간, 평균치 또는 절대 길이를 가진다.
일부 실시양태에서, 단일-말단 리드의 공칭, 평균치, 평균 또는 절대 길이는 종종 약 1개의 연속 뉴클레오티드 내지 약 500개 이상의 연속 뉴클레오티드, 약 15개의 연속 뉴클레오티드 내지 약 50개의 연속 뉴클레오티드, 약 30개의 연속 뉴클레오티드 내지 약 40개의 연속 뉴클레오티드, 종종 약 35개의 연속 뉴클레오티드 또는 약 36개의 연속 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 단일-말단 리드의 공칭, 평균치, 평균 또는 절대 길이는 약 20개 내지 약 30개 염기, 또는 약 24개 내지 약 28개 염기이다. 일부 실시양태에서, 단일-말단 리드의 공칭, 평균치, 평균 또는 절대 길이는 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 약 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개 또는 49개 염기이다.
일부 실시양태에서, 페어링된-말단 리드의 공칭, 평균치, 평균 또는 절대 길이는 약 10개의 연속 뉴클레오티드 내지 약 25개의 연속 뉴클레오티드(예를 들면, 길이에서 약 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개의 뉴클레오티드), 또는 약 15개의 연속 뉴클레오티드 내지 약 20개의 연속 뉴클레오티드이고, 종종 약 17개의 연속 뉴클레오티드, 약 18개의 연속 뉴클레오티드, 약 20개의 연속 뉴클레오티드, 약 25개의 연속 뉴클레오티드, 약 36개의 연속 뉴클레오티드 또는 약 45개의 연속 뉴클레오티드이다.
리드는 일반적으로 물리적 핵산에서 뉴클레오티드 서열의 표시치이다. 예를 들면, ATGC로 표시된 서열을 함유하는 리드에서, "A"는 물리적 핵산에서 아데닌 뉴클레오티드를 표시하고, "T"는 물리적 핵산에서 타이민 뉴클레오티드를 표시하고, "G"는 물리적 핵산에서 구아닌 뉴클레오티드를 표시하고, "C"는 물리적 핵산에서 사이토신 뉴클레오티드를 표시한다. 임신 여성의 혈액으로부터 수득된 서열 리드는 태아 핵산과 모체 핵산의 혼합물로부터의 리드일 수 있다. 상대적으로 짧은 리드의 혼합물은 본원에 기재된 공정에 의해 임신 여성 및/또는 태아에 존재하는 게놈 핵산의 표시치로 변환될 수 있다. 예를 들면, 상대적으로 짧은 리드의 혼합물은 카피 수 변이(예를 들면, 모체 및/또는 태아 카피 수 변이), 유전적 변이 또는 이배수성의 표시치로 변환될 수 있다. 모체 핵산과 태아 핵산의 혼합물의 리드는 모체 염색체 및 태아 염색체 중 하나 또는 둘 다의 특징을 포함하는 복합 염색체 또는 이의 분절의 표시치로 변환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 샘플의 핵산 서열 리드를 "수득하는 것" 및/또는 1명 이상의 기준 개체로부터의 생물학적 표본의 핵산 서열 리드를 "수득하는 것"은 핵산을 직접적으로 서열결정하여 서열 정보를 수득하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, "수득하는 것"은 또 다른 개체에 의해 핵산으로부터 직접적으로 수득된 서열 정보를 제공받는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 게놈의 분획이 서열결정되어 종종 결정된 뉴클레오티드 서열로 커버된 게놈의 양(예를 들면, 1 미만의 "배" 커버리지(coverage))으로 표현된다. 게놈이 약 1배 커버리지로 서열결정되는 경우, 게놈의 대략 100%의 뉴클레오티드 서열이 리드로 표시된다. 게놈은 중복적으로 서열결정될 수도 있는데, 이때 게놈의 주어진 영역이 2개 이상의 리드들 또는 중첩 리드들(예를 들면, 1 초과의 "배" 커버리지)로 커버될 수 있다. 일부 실시양태에서, 게놈은 약 0.01배 내지 약 100배 커버리지, 약 0.2배 내지 20배 커버리지, 또는 약 0.2배 내지 약 1배 커버리지(예를 들면, 약 0.02배, 0.03배, 0.04배, 0.05배, 0.06배, 0.07배, 0.08배, 0.09배, 0.1배, 0.2배, 0.3배, 0.4배, 0.5배, 0.6배, 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배 또는 90배 커버리지)로 서열결정된다.
일부 실시양태에서, 게놈 커버리지 또는 서열 커버리지는 총 서열 리드 카운트에 비례한다. 예를 들면, 보다 더 높은 양의 서열 리드 카운트를 생성하고/하거나 분석하는 분석은 전형적으로 보다 더 높은 수준의 서열 커버리지와 관련되어 있다. 보다 더 적은 서열 리드 카운트를 생성하고/하거나 분석하는 분석은 전형적으로 보다 더 낮은 수준의 서열 커버리지와 관련되어 있다. 일부 실시양태에서, 서열 커버리지 및/또는 서열 리드 카운트는 본원에 기재된 방법의 정확도(예를 들면, 민감성 및/또는 특이성)를 유의하게 감소시키지 않으면서 감소될 수 있다. 정확도의 유의한 감소는 감소된 서열 리드 카운트를 사용하지 않는 방법에 비해 약 1% 내지 약 20%의 정확도의 감소일 수 있다. 예를 들면, 정확도의 유의한 감소는 약 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% 또는 15% 이상의 감소일 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열 커버리지 및/또는 서열 리드 카운트는 약 50% 이상 감소된다. 예를 들면, 서열 커버리지 및/또는 서열 리드 카운트는 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열 커버리지 및/또는 서열 리드 카운트는 약 60% 내지 약 85%까지 감소된다. 예를 들면, 서열 커버리지 및/또는 서열 리드 카운트는 약 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83% 또는 84%까지 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열 커버리지 및/또는 서열 리드 카운트는 특정 서열 리드들을 제거함으로써 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 특정 길이보다 더 긴 단편(예를 들면, 약 160개 염기보다 더 긴 단편)으로부터의 서열 리드가 제거된다.
일부 실시양태에서, 리드의 서브세트가 분석을 위해 선택되고 종종 리드의 특정 부분이 분석을 위해 제거된다. 특정 경우, 리드의 서브세트의 선택은 핵산의 한 종(예를 들면, 태아 핵산)을 농축할 수 있다. 예를 들면, 태아 핵산으로부터의 리드의 농축은 종종 본원에 기재된 방법(예를 들면, 태아 이배수성 검출)의 정확도를 증가시킨다. 그러나, 분석으로부터의 리드의 선택 및 제거는 종종 (예를 들면, 증가된 분산으로 인해) 본원에 기재된 방법의 정확도를 감소시킨다. 따라서, 이론에 의해 한정되지 않지만, 일반적으로 (예를 들면, 특정 크기 범위 내의 단편들로부터의) 리드의 선택 및/또는 제거를 포함하는 방법에서 태아 리드 농축과 관련된 증가된 정확도와 감소된 양의 리드와 관련된 감소된 정확도 사이에 균형이 존재한다. 일부 실시양태에서, 방법은 방법의 정확도를 유의하게 감소시키지 않으면서 태아 핵산으로부터의 리드에 대해 농축된 리드의 서브세트를 선택하는 단계를 포함한다. 이 명백한 균형에도 불구하고, 본원에 기재된 바와 같이, 뉴클레오티드 서열 리드(예를 들면, 상대적으로 짧은 단편으로부터의 리드)의 서브세트의 사용이 태아 유전 분석의 정확도를 개선할 수 있거나 유지할 수 있다는 것이 확인되었다. 예를 들면, 특정 실시양태에서, 약 80% 이상의 뉴클레오티드 서열 리드가 이러한 뉴클레오티드 서열 리드를 버리지 않는 필적할만한 방법에 대한 값과 유사한 민감성 및 특이성 값을 유지하면서 버려질 수 있다.
특정 실시양태에서, 핵산 단편의 서브세트는 서열결정 전에 선택된다. 특정 실시양태에서, (예를 들면, 올리고뉴클레오티드 어레이를 사용하는) 혼성화 기반 기법을 이용하여 특정 염색체들(예를 들면, 성염색체 및/또는 잠재적으로 이배수체인 염색체, 및 검사된 이배수성에 관여하지 않는 다른 염색체(들))로부터 핵산 서열을 먼저 선택할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 (예를 들면, 겔 전기영동, 크기 배제 크로마토그래피 또는 마이크로플루이딕 기초 방법에 의해) 크기별로 분별될 수 있고, 특정 경우 태아 핵산은 보다 더 낮은 분자량(예를 들면, 300개 염기쌍 미만, 200개 염기쌍 미만, 150개 염기쌍 미만, 100개 염기쌍 미만)을 가진 핵산을 선택함으로써 농축될 수 있다. 일부 실시양태에서, 태아 핵산은 예컨대, 포름알데하이드의 첨가로 모체 배경 핵산을 억제함으로써 농축될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 단편의 미리 선택된 세트의 부분 또는 서브세트는 무작위적으로 서열결정된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열결정 전에 증폭된다. 일부 실시양태에서, 핵산의 부분 또는 서브세트는 서열결정 전에 증폭된다.
일부 실시양태에서, 1명의 개체로부터의 1개 핵산 샘플이 서열결정된다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 샘플들 각각으로부터의 핵산이 서열결정되고, 이때 샘플들은 1명의 개체로부터 유래하거나 상이한 개체들로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 생물학적 샘플들로부터의 핵산 샘플들이 풀링되고, 이때 각각의 생물학적 샘플이 1명의 개체 또는 2명 이상의 개체들로부터 유래하고, 풀이 서열결정된다. 후자 실시양태에서, 각각의 생물학적 샘플로부터의 핵산 샘플은 종종 하나 이상의 유일한 식별자 또는 식별 태그에 의해 식별된다.
일부 실시양태에서, 서열결정 방법은 서열결정 공정에서 서열 반응의 다중체화를 가능하게 하는 식별자를 사용한다. 유일한 식별자의 수가 클수록, 예를 들면, 서열결정 공정에서 다중체화될 수 있는 검출될 샘플 및/또는 염색체의 수가 커진다. 서열결정 공정은 임의의 적합한 수(예를 들면, 4개, 8개, 12개, 24개, 48개 또는 96개 이상)의 유일한 식별자를 사용함으로써 수행될 수 있다.
서열결정 공정은 종종 고체상을 사용하고, 종종 고체상은 라이브러리로부터의 핵산이 부착될 수 있고 시약이 유동될 수 있고 부착된 핵산과 접촉될 수 있는 유동 셀을 포함한다. 유동 셀은 종종 유동 셀 레인을 포함하고, 식별자의 사용은 각각의 레인에서 다수의 샘플들을 분석하는 것을 용이하게 할 수 있다. 유동 셀은 종종 시약 용액이 결합된 분석물 상에서 차례로 통과하는 것을 유지하고/하거나 가능하게 하도록 구성될 수 있는 고체 지지체이다. 유동 셀은 종종 형태 면에서 평면이고, 광학적으로 투명하고, 일반적으로 밀리미터 또는 밀리미터 미만의 크기를 갖고, 종종 분석물/시약 상호작용이 일어나는 채널 또는 레인을 가진다. 일부 실시양태에서, 주어진 유동 셀 레인에서 분석되는 샘플의 수는 단일 유동 셀 레인에서 라이브러리 제조 및/또는 프로브 디자인 동안에 사용된 유일한 식별자의 수에 의존한다. 예를 들면, 12개의 식별자를 사용하는 다중체화는 8개 레인 유동 셀에서 96개의 샘플들(예를 들면, 96웰 마이크로웰 플레이트 내의 웰의 수와 동등함)의 동시적인 분석을 가능하게 한다. 유사하게, 예를 들면, 48개의 식별자를 사용하는 다중체화는 8개 레인 유동 셀에서 384개의 샘플들(예를 들면, 384웰 마이크로웰 플레이트 내의 웰의 수와 동등함)의 동시적인 분석을 가능하게 한다. 상업적으로 입수가능한 다중체 서열결정 키트의 비한정적 예는 일루미나의 다중체화 샘플 제조 올리고뉴클레오티드 키트 및 다중체화 서열결정 프라이머 및 PhiX 대조군 키트(예를 들면, 각각 일루미나의 카탈로그 번호 PE-400-1001 및 PE-400-1002)를 포함한다.
임의의 적합한 핵산 서열결정 방법이 이용될 수 있고, 이러한 방법의 비한정적 예는 막심 & 길버트(Maxim & Gilbert), 쇄-종결 방법, 합성에 의한 서열결정, 연결에 의한 서열결정, 질량 분광측정에 의한 서열결정, 현미경관찰 기초 기법 등 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 세대 기술, 예를 들면, 마이크로플루이딕 생거(Sanger) 서열결정을 포함하는 자동화된 생거 서열결정 방법을 포함하는 생거 서열결정 방법이 본원에서 제공된 방법에서 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 영상화 기술(예를 들면, 투과 전자 현미경관찰(TEM) 및 원자력 현미경관찰(AFM))의 사용을 포함하는 서열결정 기술이 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 고속처리 서열결정 방법이 이용된다. 고속처리 서열결정 방법은 일반적으로 종종 유동 셀 내에서 대량 병렬 방식으로 서열결정되는 클론적으로 증폭된 DNA 주형 또는 단일 DNA 분자를 사용한다. 대량 병렬 방식으로 DNA를 서열결정할 수 있는 차세대(예를 들면, 2세대 및 3세대) 서열결정 기법이 본원에 기재된 방법을 위해 이용될 수 있고 본원에서 "대량 병렬 서열결정"(MPS)으로서 총칭된다. 일부 실시양태에서, MPS 서열결정 방법은 표적화된 방식을 이용하고, 이때 관심있는 특정 염색체, 유전자 또는 영역이 서열결정된다. 일부 실시양태에서, 비-표적화된 방식이 이용되고, 이때 샘플 중의 대다수 또는 모든 핵산들이 무작위적으로 서열결정되고/되거나, 증폭되고/되거나 포획된다.
일부 실시양태에서, 표적화된 농축, 증폭 및/또는 서열결정 방식이 이용된다. 표적화된 방식은 종종 서열 특이적 올리고뉴클레오티드의 사용에 의한 추가 프로세싱을 위해 샘플 중의 핵산의 서브세트를 단리하고/하거나, 선택하고/하거나 농축한다. 일부 실시양태에서, 서열 특이적 올리고뉴클레오티드의 라이브러리를 사용하여 샘플 중의 핵산의 하나 이상의 세트를 표적화한다(예를 들면, 이러한 세트에 혼성화한다). 서열 특이적 올리고뉴클레오티드 및/또는 프라이머는 종종 관심있는 하나 이상의 염색체, 유전자, 엑손, 인트론 및/또는 조절 영역에 존재하는 특정 서열(예를 들면, 유일한 핵산 서열)에 대한 선택성을 가진다. 임의의 적합한 방법 또는 방법의 조합이 하나 이상의 표적화된 핵산의 서브세트의 농축, 증폭 및/또는 서열결정을 위해 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화된 서열은 하나 이상의 서열 특이적 고착제를 사용하여 고체상(예를 들면, 유동 셀, 비드)에 포획시킴으로써 단리되고/되거나 농축된다. 일부 실시양태에서, 표적화된 서열은 서열 특이적 프라이머 및/또는 프라이머의 세트를 사용하는 중합효소 기초 방법(예를 들면, PCR 기초 방법, 임의의 적합한 중합효소 기초 연장)에 의해 농축되고/되거나 증폭된다. 서열 특이적 고착제는 종종 서열 특이적 프라이머로서 사용될 수 있다.
MPS 서열결정은 종종 합성 및 일부 영상화 공정에 의한 서열결정을 이용한다. 본원에 기재된 방법에서 이용될 수 있는 핵산 서열결정 기술은 합성에 의한 서열결정 및 가역적 종결요소(terminator) 기초 서열결정(예를 들면, 일루미나의 게놈 분석기; 게놈 분석기 II; HISEQ 2000; HISEQ 2500(일루미나, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)이다. 이 기술을 이용하여 수백만 개의 핵산(예를 들면, DNA) 단편들을 동시에 서열결정할 수 있다. 이러한 종류의 서열결정 기술의 일례에서, 그의 표면 상에 올리고뉴클레오티드 고착제(예를 들면, 어댑터 프라이머)가 결합되어 있는 8개의 개별 레인들을 가진 광학적으로 투명한 슬라이드를 함유하는 유동 셀이 사용된다. 유동 셀은 종종 시약 용액이 결합된 분석물 상에서 차례로 통과하는 것을 유지하고/하거나 가능하게 하도록 구성될 수 있는 고체 지지체이다. 유동 셀은 종종 형태 면에서 평면이고, 광학적으로 투명하고, 일반적으로 밀리미터 또는 밀리미터 미만의 크기를 갖고, 종종 분석물/시약 상호작용이 일어나는 채널 또는 레인을 가진다.
일부 실시양태에서, 합성에 의한 서열결정은 주형-지정된 방식으로 뉴클레오티드를 프라이머 또는 기존 핵산 가닥에 (예를 들면, 공유 추가로) 반복적으로 추가하는 단계를 포함한다. 각각의 반복적 뉴클레오티드 추가가 검출되고, 핵산 가닥의 서열이 수득될 때까지 상기 공정이 다회 반복된다. 수득된 서열의 길이는 수행되는 추가 및 검출 단계의 수에 부분적으로 의존한다. 합성에 의한 서열결정의 일부 실시양태에서, 동일한 종류의 1개, 2개 또는 3개 이상의 뉴클레오티드(예를 들면, A, G, C 또는 T)가 뉴클레오티드 추가 라운드에서 추가되고 검출된다. 뉴클레오티드는 임의의 적합한 방법(예를 들면, 효소적 또는 화학적 방법)에 의해 추가될 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 중합효소 또는 연결효소(ligase)가 주형-지정된 방식으로 뉴클레오티드를 프라이머 또는 기존 핵산 가닥에 추가한다. 합성에 의한 서열결정의 일부 실시양태에서, 상이한 종류의 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체 및/또는 식별자가 사용된다. 일부 실시양태에서, 가역적 종결요소 및/또는 제거가능한(예를 들면, 절단가능한) 식별자가 사용된다. 일부 실시양태에서, 형광 표지된 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체가 사용된다. 일부 실시양태에서, 합성에 의한 서열결정은 절단(예를 들면, 식별자의 절단 및 제거) 및/또는 세척 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 뉴클레오티드의 추가는 본원에 기재되어 있거나 당분야에서 공지되어 있는 적합한 방법에 의해 검출되고, 이러한 방법의 비한정적 예는 임의의 적합한 영상화 장치 또는 기계, 적합한 카메라, 디지털 카메라, CCD(전하 커플 디바이스) 기초 영상화 장치(예를 들면, CCD 카메라), CMOS(상보적 금속 산화물 규소) 기초 영상화 장치(예를 들면, CMOS 카메라), 광 다이오드(예를 들면, 광전자증배관), 전자 현미경관찰, 필드-효과 트랜지스터(예를 들면, DNA 필드-효과 트랜지스터), ISFET 이온 센서(예를 들면, CHEMFET 센서) 등 또는 이들의 조합을 포함한다. 본원의 방법을 수행하기 위해 이용될 수 있는 다른 서열결정 방법은 디지털 PCR 및 혼성화에 의한 서열결정을 포함한다.
본원의 방법을 수행하기 위해 이용될 수 있는 다른 서열결정 방법은 디지털 PCR 및 혼성화에 의한 서열결정을 포함한다. 디지털 중합효소 연쇄 반응(디지탈 PCR 또는 dPCR)은 샘플에서 핵산을 직접적으로 확인하고 정량하는 데에 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 디지털 PCR은 에멀젼에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 개별 핵산들이 예를 들면, 마이크로플루이딕 챔버 디바이스에서 분리되고, 각각의 핵산이 PCR에 의해 개별적으로 증폭된다. 핵산은 웰 당 1개 이하의 핵산이 존재하도록 분리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상이한 프로브들이 다양한 대립형질(예를 들면, 태아 대립형질 및 모체 대립형질)을 식별하는 데에 사용될 수 있다. 카피 수를 측정하기 위해 대립형질의 수를 셀 수 있다.
일부 실시양태에서, 혼성화에 의한 서열결정이 이용될 수 있다. 이 방법은 복수의 폴리뉴클레오티드 서열들을 복수의 폴리뉴클레오티드 프로브들과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이때 복수의 폴리뉴클레오티드 프로브들 각각은 임의적으로 기판에 고착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기판은 공지된 뉴클레오티드 서열의 어레이를 가진 평평한 표면일 수 있다. 어레이에의 혼성화의 패턴은 샘플에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열을 확인하는 데에 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브는 비드, 예를 들면, 자성 비드 등에 고착된다. 비드에의 혼성화는 확인될 수 있고 샘플 내의 복수의 폴리뉴클레오티드 서열들을 확인하는 데에 이용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 나노공극 서열결정이 본원에 기재된 방법에서 이용될 수 있다. 나노공극 서열결정은 단일 분자 서열결정 기술이고, 이 기술에 의해 단일 핵산 분자(예를 들면, DNA)가 나노공극을 통과할 때 직접적으로 서열결정된다.
본원에 기재된 방법을 수행하기 위한 적합한 MPS 방법, 시스템 또는 기술 플랫폼이 핵산 서열결정 리드를 수득하는 데에 이용될 수 있다. MPS 플랫폼의 비한정적 예는 일루미나/솔렉스(Solex)/HiSeq(예를 들면, 일루미나의 게놈 분석기; 게놈 분석기 II; HISEQ 2000; HISEQ), SOLiD, 로슈(Roche)/454, PACBIO 및/또는 SMRT, 헬리코스 트루(Helicos True) 단일 분자 서열결정, 이온 토렌트(Torrent) 및 이온 반도체 기초 서열결정(예를 들면, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)에 의해 개발됨), 와일드파이어, 5500, 5500xl W 및/또는 5500xl W 유전 분석기 기초 기술(예를 들면, 라이프 테크놀로지스에 의해 개발되고 시판됨, 미국 특허출원 공보 제20130012399호); 폴로니(Polony) 서열결정, 피로서열결정(Pyrosequencing), 대량 병렬 시그너처 서열결정(MPSS), RNA 중합효소(RNAP) 서열결정, 레이저겐(LaserGen) 시스템 및 방법, 나노공극 기초 플랫폼, 화학적 민감성 필드-효과 트랜지스터(CHEMFET) 어레이, 전자 현미경관찰 기초 서열결정(예를 들면, 제트에스 제네틱스, 할사이온 몰레큘라(ZS Genetics, Halcyon Molecular)에 의해 개발됨), 및 나노볼(nanoball) 서열결정을 포함한다.
일부 실시양태에서, 염색체 특이적 서열결정이 수행된다. 일부 실시양태에서, DANSR(선택된 영역의 디지털 분석)을 이용하는 염색체 특이적 서열결정이 수행된다. 선택된 영역의 디지털 분석은 개재 '가교' 올리고뉴클레오티드를 통해 2개의 좌위 특이적 올리고뉴클레오티들을 cfDNA 의존적으로 연쇄적으로 연결하여 PCR 주형을 형성함으로써 수백 개의 좌위들의 동시적 정량을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 염색체 특이적 서열결정은 염색체 특이적 서열이 풍부한 라이브러리를 생성함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, 서열 리드는 염색체의 선택된 세트에 대해서만 수득된다. 일부 실시양태에서, 서열 리드는 21번 염색체, 18번 염색체 및 13번 염색체에 대해서만 수득된다.
리드의 맵핑
서열 리드가 맵핑될 수 있고, 특정된 핵산 영역(예를 들면, 염색체, 또는 이의 부분 또는 분절)에 맵핑되는 리드의 수는 카운트로서 지칭된다. 임의의 적합한 맵핑 방법(예를 들면, 프로세스, 알고리즘, 프로그램, 소프트웨어, 모듈 등 또는 이들의 조합)이 이용될 수 있다. 맵핑 프로세스의 일부 양태는 이하에 기재되어 있다.
뉴클레오티드 서열 리드(즉, 물리적 게놈 위치가 공지되어 있지 않은 단편으로부터의 서열 정보)의 맵핑은 다수의 방식으로 수행될 수 있고, 종종 수득된 서열 리드를 기준 게놈 내의 일치 서열과 정렬하는 단계를 포함한다. 이러한 정렬에서, 서열 리드는 일반적으로 기준 서열과 정렬되고, 정렬되는 서열 리드는 "맵핑된" 것, "맵핑된 서열 리드" 또는 "맵핑된 리드"로서 표기된다. 일부 실시양태에서, 맵핑된 서열 리드는 "히트(hit)" 또는 "카운트"로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, 맵핑된 서열 리드는 다양한 파라미터에 따라 함께 분류되고, 하기에 더 상세히 논의되어 있는 특정 부분에 할당된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "정렬된", "정렬" 또는 "정렬하는"은 일치(예를 들면, 100% 동일성) 또는 부분적 일치로서 확인될 수 있는 2개 이상의 핵산 서열을 지칭한다. 정렬은 수동으로 수행될 수 있거나 컴퓨터(예를 들면, 소프트웨어, 프로그램, 모듈 또는 알고리즘)에 의해 수행될 수 있고, 이러한 컴퓨터 프로그램의 비한정적 예는 일루미나 게놈 분석 파이프라인의 부분으로서 배포된 뉴클레오티드 데이터의 효율적 국소 정렬(ELAND) 컴퓨터 프로그램을 포함하다. 서열 리드의 정렬은 100% 서열 일치일 수 있다. 일부 경우, 정렬은 100% 미만의 서열 일치(즉, 완벽하지 않은 일치, 부분적 일치, 부분적 정렬)이다. 일부 실시양태에서, 정렬은 약 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76% 또는 75% 일치이다. 일부 실시양태에서, 정렬은 불일치를 포함한다. 일부 실시양태에서, 정렬은 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 불일치를 포함한다. 어느 한 가닥을 사용하여 2개 이상의 서열을 정렬할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 또 다른 핵산 서열의 역 상보체와 정렬된다.
컴퓨터를 이용한 다양한 방법들이 각각의 서열 리드를 부분들에 맵핑하는 데에 이용될 수 있다. 서열을 정렬하는 데에 사용될 수 있는 컴퓨터 알고리즘의 비한정적 예는 BLAST, BLITZ, FASTA, BOWTIE 1, BOWTIE 2, ELAND, MAQ, PROBEMATCH, SOAP 또는 SEQMAP, 또는 이들의 변경물 또는 이들의 조합물을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 서열 리드는 기준 게놈 내의 서열과 정렬될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열 리드는 예를 들면, 진뱅크(GenBank), dbEST, dbSTS, EMBL(유럽 분자생물학 실험실(European Molecular Biology Laboratory)) 및 DDBJ(일본의 DNA 데이터뱅크(DNA Databank of Japan))를 포함하는, 당분야에서 공지된 핵산 데이터베이스에서 발견될 수 있고/있거나 이러한 데이터베이스 내의 서열과 정렬될 수 있다. BLAST 또는 유사한 수단이 확인된 서열을 서열 데이터베이스에서 검색하는 데에 사용될 수 있다. 그 다음, 예를 들면, 검색 히트가 확인된 서열을 적절한 부분(이하에 기재됨)으로 분류하는 데에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 리드는 기준 게놈 내의 부분으로 유일하게 또는 유일하지 않게 맵핑될 수 있다. 리드는 기준 게놈 내의 단일 서열과 정렬되는 경우 "유일하게 맵핑된" 것으로서 간주된다. 리드는 기준 게놈 내의 2개 이상의 서열들과 정렬되는 경우 "유일하지 않게 맵핑된" 것으로서 간주된다. 일부 실시양태에서, 유일하지 않게 맵핑된 리드는 추가 분석(예를 들면, 정량)으로부터 제거된다. 일부 실시양태에서, 기준 게놈과 맵핑되는 개별 샘플로부터의 리드 사이에 존재할 수 있는 단일 뉴클레오티드 다형성을 설명하기 위해 미미한 정도(0개 또는 1개)의 불일치가 허용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기준 서열에 맵핑되는 리드에 대해 어느 정도의 불일치도 허용되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "기준 게놈"은 부분적 게놈이든 아니면 완전한 게놈이든 관계없이 대상체로부터의 확인된 서열의 기준물로서 사용될 수 있는 임의의 유기체 또는 바이러스의 임의의 특정 공지된, 서열결정된 또는 특징규명된 게놈을 지칭할 수 있다. 예를 들면, 인간 대상체뿐만 아니라 많은 다른 유기체를 위해서도 사용되는 기준 게놈은 www. ncbi.nlm.nih.gov의 국립 생물공학 정보 센터에서 발견될 수 있다. "게놈"은 핵산 서열로 발현된 유기체 또는 바이러스의 완전한 유전 정보를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 기준 서열 또는 기준 게놈은 종종 한 개체 또는 다수의 개체들로부터의 조립된 또는 부분적으로 조립된 게놈 서열이다. 일부 실시양태에서, 기준 게놈은 1명 이상의 인간 개체로부터의 조립된 또는 부분적으로 조립된 게놈 서열이다. 일부 실시양태에서, 기준 게놈은 염색체에 배정된 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 샘플 핵산이 임신 여성으로부터 유래하는 경우, 기준 서열은 종종 태아, 태아의 모 또는 태아의 부로부터 유래하지 않고, 본원에서 "외부 기준물"로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, 모체 기준물이 제조되고 사용될 수 있다. 외부 기준물을 기초로 임신 여성으로부터의 기준물이 제조된 경우("모체 기준 서열"), 태아 DNA를 실질적으로 함유하지 않는 임신 여성의 DNA로부터의 리드가 종종 외부 기준 서열에 맵핑되고 조립된다. 일부 실시양태에서, 외부 기준물은 임신 여성과 실질적으로 동일한 인종을 가진 개체의 DNA로부터 유래한다. 모체 기준 서열은 모체 게놈 DNA를 완전히 커버하지 않을 수 있고(예를 들면, 이 기준 서열은 모체 게놈 DNA의 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상을 커버할 수 있고), 모체 기준물은 모체 게놈 DNA 서열과 완벽히 일치하지 않을 수 있다(예를 들면, 모체 기준 서열은 다수의 불일치를 포함할 수 있다).
일부 실시양태에서, 게놈 영역(예를 들면, 부분, 게놈 부분, 부분)에 대한 맵핑 가능성(mappability)이 평가된다. 맵핑 가능성은 뉴클레오티드 서열 리드를, 전형적으로 특정된 수의 불일치(예를 들면, 0개, 1개 또는 2개 이상의 불일치를 포함함)를 가진 기준 게놈의 부분과 명확히 정렬하는 능력이다. 주어진 게놈 영역에 대해, 미리 설정된 리드 길이의 슬라이딩 윈도우(window) 방법을 이용하고 수득된 리드-수준 맵핑 가능성 값의 평균을 산출함으로써 예상된 맵핑 가능성을 추정할 수 있다. 유일한 뉴클레오티드 서열의 스트레치를 포함하는 게놈 영역은 종종 높은 맵핑 가능성 값을 가진다.
부분
일부 실시양태에서, 맵핑된 서열 리드(즉, 서열 태그)는 다양한 파라미터에 따라 함께 분류되고 특정 부분(예를 들면, 기준 게놈의 부분)에 할당된다. 종종, 개별 맵핑된 서열 리드가 샘플에 존재하는 부분(예를 들면, 부분의 존재, 부재 또는 양)을 확인하는 데에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 부분의 양은 샘플 중의 보다 큰 서열(예를 들면, 염색체)의 양을 표시한다. 용어 "부분"은 본원에서 "게놈 구획", "빈(bin)", "영역", "구획", "기준 게놈의 부분", "염색체의 부분" 또는 "게놈 부분"으로서도 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 부분은 전체 염색체, 염색체의 분절, 기준 게놈의 분절, 다수의 염색체에 걸쳐있는 분절, 다수의 염색체 분절 및/또는 이들의 조합물이다. 일부 실시양태에서, 부분은 특정 파라미터(예를 들면, 표시자)를 기초로 미리 정해진다. 일부 실시양태에서, 부분은 게놈의 분할을 기초로 임의로 또는 비임의로 정해진다(예를 들면, 크기, GC 함량, 연속 영역, 임의로 정해진 크기의 연속 영역 등에 의해 분할된다). 일부 실시양태에서, 부분은 이산 게놈 빈(discrete genomic bins), 소정의 길이의 연속 서열을 가진 게놈 빈, 가변-크기 빈, 평활화된 커버리지 맵의 포인트 베이스 뷰(point-based views) 및/또는 이들의 조합물로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 부분은 예를 들면, 서열의 길이 또는 특정 특징 또는 특징들을 포함하는 하나 이상의 파라미터를 기초로 기술된다. 부분은 당분야에서 공지되어 있거나 본원에 기재되어 있는 임의의 적합한 기준을 사용함으로써 고려사항으로부터 선택될 수 있고/있거나, 필터링될 수 있고/있거나 제거될 수 있다. 일부 실시양태에서, 부분은 게놈 서열의 특정 길이에 기초한다. 일부 실시양태에서, 방법은 복수의 부분들에 대한 다수의 맵핑된 서열 리드들의 분석을 포함할 수 있다. 부분은 거의 동일한 길이를 가질 수 있거나, 부분은 상이한 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 부분은 거의 동등한 길이를 가진다. 일부 실시양태에서, 상이한 길이의 부분들은 조절되거나 가중된다. 일부 실시양태에서, 부분은 약 10 킬로염기(kb) 내지 약 20 kb, 약 10 kb 내지 약 100 kb, 약 20 kb 내지 약 80 kb, 약 30 kb 내지 약 70 kb, 약 40 kb 내지 약 60 kb이다. 일부 실시양태에서, 부분은 약 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb 또는 약 60 kb의 길이를 가진다. 부분은 서열의 연속물로 한정되지 않는다. 따라서, 부분은 연속 및/또는 비-연속 서열로 구성될 수 있다. 부분은 단일 염색체로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 부분은 한 염색체의 전부 또는 일부, 또는 2개 이상의 염색체의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 부분은 1개 또는 2개 이상의 전체 염색체에 걸쳐 있을 수 있다. 추가로, 부분은 다수의 염색체들의 연결된 또는 연결되지 않은 영역들에 걸쳐 있을 수 있다.
일부 실시양태에서, 부분은 관심있는 염색체, 예를 들면, 유전적 변이(예를 들면, 13번 염색체, 18번 염색체 및/또는 21번 염색체 또는 성염색체의 이배수성)가 평가되는 염색체 내의 특정 염색체 분절일 수 있다. 부분은 병원체 게놈(예를 들면, 세균, 진균 또는 바이러스) 또는 이의 단편일 수도 있다. 부분은 유전자, 유전자 단편, 조절 서열, 인트론, 엑손 등일 수 있다.
일부 실시양태에서, 게놈(예를 들면, 인간 게놈)은 특정 영역의 정보 내용을 기초로 부분으로 분할된다. 일부 실시양태에서, 게놈의 분할은 게놈에 걸쳐 유사한 영역들(예를 들면, 동일한 또는 상동성 영역들 또는 서열들)을 제거할 수 있고 유일한 영역들만을 남길 수 있다. 분할 동안 제거된 영역은 단일 염색체 내에 존재할 수 있거나 다수의 염색체들에 걸쳐 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 분할된 게놈은 보다 더 빠른 정렬을 위해 줄어들고 최적화되어, 종종 유일하게 식별가능한 서열에 초점을 맞출 수 있게 한다.
일부 실시양태에서, 분할은 유사한 영역들을 하향 가중할 수 있다. 부분을 하향 가중하는 프로세스는 하기 더 상세히 논의되어 있다.
일부 실시양태에서, 염색체를 능가하는 영역으로의 게놈의 분할은 분류 면에서 생성된 정보 획득에 기초할 수 있다. 예를 들면, 확인된 정상 대상체 군과 비정상 대상체 군(예를 들면, 각각 정배수체 대상체와 삼염색체성 대상체)을 식별하기 위해 특정 게놈 위치의 유의성을 측정하는 p-값 프로파일을 사용하여 정보 내용을 정량할 수 있다. 일부 실시양태에서, 염색체를 능가하는 영역으로의 게놈의 분할은 임의의 다른 기준, 예컨대, 태그를 정렬하는 동안의 속도/편의성, GC 함량(예를 들면, 높은 또는 낮은 GC 함량), GC 함량의 균일성, 서열 함량의 다른 척도(예를 들면, 개별 뉴클레오티드의 분율, 피리미딘 또는 푸린의 분율, 천연 대 비천연 핵산의 분율, 메틸화된 뉴클레오티드의 분율 및 CpG 함량), 메틸화 상태, 이중체 용융 온도, 서열결정 또는 PCR로의 처리가능성, 기준 게놈의 개별 부분에 할당된 불확실성 값, 및/또는 특정 특징에 대한 표적화된 검색에 기초할 수 있다.
염색체의 "분절"은 일반적으로 염색체의 일부이고, 전형적으로 부분과 상이한 염색체의 일부이다. 염색체의 분절은 종종 부분과 상이한 염색체의 영역에 존재하고, 종종 부분과 폴리뉴클레오티드를 공유하지 않고, 종종 부분에 존재하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 염색체의 분절은 종종 부분보다 더 많은 수의 뉴클레오티드를 함유하고(예를 들면, 분절은 종종 부분을 포함하고), 종종 염색체의 분절은 부분보다 더 적은 수의 뉴클레오티드를 함유한다(예를 들면, 분절은 종종 부분 내에 존재한다).
부분의 필터링 및/또는 선택
부분은 종종 본원에 기재되어 있거나 당분야에서 공지되어 있는 하나 이상의 특징, 파라미터, 기준 및/또는 방법에 따라 프로세싱된다(예를 들면, 정규화, 필터링, 선택 등 또는 이들의 조합에 의해 프로세싱된다). 부분은 임의의 적합한 방법에 의해 임의의 적합한 파라미터에 따라 프로세싱될 수 있다. 부분을 필터링하고/하거나 선택하는 데에 사용될 수 있는 특징 및/또는 파라미터의 비한정적 예는 카운트, 커버리지, 맵핑 가능성, 가변성, 불확실성 수준, 구아닌-사이토신(GC) 함량, CCF 단편 길이 및/또는 리드 길이(예를 들면, 단편 길이 비(FLR), 태아 비 통계(FRS)), DNaseI 민감성, 메틸화 상태, 아세틸화, 히스톤 분포, 염색질 구조 등 또는 이들의 조합을 포함한다. 부분은 본원에 나열되어 있거나 기재되어 있는 특징 또는 파라미터와 상관관계를 가진 임의의 적합한 특징 또는 파라미터에 따라 필터링될 수 있고/있거나 선택될 수 있다. 부분은 부분에 대한 특이성을 가진(예를 들면, 다수의 샘플들에 따라 단일 부분에 대해 확인된) 특징 또는 파라미터, 및/또는 샘플에 대한 특이성을 가진(예를 들면, 한 샘플 내의 다수의 부분들에 대해 확인된) 특징 또는 파라미터에 따라 필터링될 수 있고/있거나 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 부분은 상대적으로 낮은 맵핑 가능성, 상대적으로 높은 가변성, 고도의 불확실성, 상대적으로 긴 CCF 단편 길이(예를 들면, 낮은 FRS, 낮은 FLR), 반복적 서열의 상대적으로 큰 분획, 높은 GC 함량, 낮은 GC 함량, 낮은 카운트, 0 카운트, 높은 카운트 등 또는 이들의 조합에 따라 필터링되고/되거나 제거된다. 일부 실시양태에서, 부분(예를 들면, 부분들의 서브세트)은 적합한 수준의 맵핑 가능성, 가변성, 불확실성 수준, 반복적 서열의 분획, 카운트, GC 함량 등 또는 이들의 조합에 따라 선택된다. 일부 실시양태에서, 부분(예를 들면, 부분들의 서브세트)은 상대적으로 짧은 CCF 단편 길이(예를 들면, 높은 FRS, 높은 FLR)에 따라 선택된다. 부분에 맵핑된 카운트 및/또는 리드는 종종 부분(예를 들면, 부분들의 서브세트)의 필터링 또는 선택 전 및/또는 후에 프로세싱된다(예를 들면, 정규화된다). 일부 실시양태에서, 부분에 맵핑된 카운트 및/또는 리드는 부분(예를 들면, 부분들의 서브세트)의 필터링 또는 선택 전 및/또는 후에 프로세싱되지 않는다.
임의의 적합한 수의 샘플들로부터의 서열 리드를 사용하여 본원에 기재되어 있는 하나 이상의 기준, 파라미터 및/또는 특징을 충족시키는 부분들의 서브세트를 확인할 수 있다. 다수의 임신 여성들로부터의 샘플들의 군으로부터의 서열 리드가 종종 사용된다. 다수의 임신 여성들 각각으로부터의 하나 이상의 샘플(예를 들면, 각각의 임신 여성으로부터의 1개 내지 약 20개 샘플(예를 들면, 약 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개 또는 19개 샘플))이 다루어질 수 있고, 적합한 수의 임신 여성들(예를 들면, 약 2명 내지 약 10,000명의 임신 여성들(예를 들면, 약 10명, 20명, 30명, 40명, 50명, 60명, 70명, 80명, 90명, 100명, 150명, 200명, 250명, 300명, 350명, 400명, 500명, 600명, 700명, 800명, 900명, 1000명, 2000명, 3000명, 4000명, 5000명, 6000명, 7000명, 8000명 또는 9000명의 임신 여성들))이 다루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 동일한 임신 여성으로부터의 동일한 검사 샘플(들)로부터의 서열 리드가 기준 게놈 내의 부분에 맵핑되고 부분들의 서브세트를 생성하는 데에 사용된다.
임신 여성으로부터 수득된 순환 세포 무함유 핵산 단편(CCF 단편)은 일반적으로 태아 세포로부터 유래한 핵산 단편(즉, 태아 단편) 및 모체 세포로부터 유래한 핵산 단편(즉, 모체 단편)을 포함한다는 것이 관찰되었다. 태아로부터 유래된 CCF 단편으로부터 유래한 서열 리드는 본원에서 "태아 리드"로서 지칭된다. 태아를 가진 임신 여성(즉, 모체)의 게놈으로부터 유래한 CCF 단편으로부터 유래한 서열 리드는 본원에서 "모체 리드"로서 지칭된다. 태아 리드가 수득되는 CCF 단편은 본원에서 태아 주형으로서 지칭되고, 모체 리드가 수득되는 CCF 단편은 본원에서 모체 주형으로서 지칭된다.
CCF 단편에서 태아 단편은 일반적으로 상대적으로 짧고(예를 들면, 길이에 있어서 약 200개 염기쌍 이하) 모체 단편은 이러한 상대적으로 짧은 단편 및 상대적으로 더 긴 단편을 포함한다는 것도 관찰되었다. 상대적으로 짧은 단편으로부터의 상당한 양의 리드가 맵핑되는 부분들의 서브세트가 선택될 수 있고/있거나 확인될 수 있다. 이론에 의해 한정되지 않지만, 이러한 부분에 맵핑된 리드는 태아 리드에 대해 농축되고, 이러한 농축은 태아 유전 분석(예를 들면, 태아 유전적 변이(예를 들면, 태아 염색체 이배수성(예를 들면, T21, T18 및/또는 T13)의 존재 또는 부재의 검출)의 정확도를 개선할 수 있을 것으로 예상된다.
그러나, 태아 유전 분석이 리드의 서브세트에 기초할 때, 상당한 수의 리드가 종종 고려되지 않는다. 태아 유전 분석의 경우, 부분의 선택된 서브세트에 맵핑된 리드의 서브세트의 선택 및 선택되지 않은 부분에서의 리드의 제거는 예를 들면, 증가된 분산으로 인해 유전 분석의 정확도를 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체 또는 샘플 맵으로부터 수득된 서열결정 리드의 약 30% 내지 약 70%(예를 들면, 약 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 또는 65%)가 태아 유전 분석을 위한 부분들의 서브세트의 선택 시 고려사항으로부터 제거된다. 특정 실시양태에서, 대상체 또는 샘플로부터 수득된 서열결정 리드의 약 30% 내지 약 70%(예를 들면, 약 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 또는 65%)가 태아 유전 분석을 위해 사용된 부분들의 서브세트에 맵핑된다.
따라서, 이론에 의해 한정되지 않지만, 태아 유전 분석의 경우, 일반적으로 태아 리드 농축과 관련된 증가된 정확도와 감소된 양의 리드 데이터(예를 들면, 부분 및/또는 리드의 제거)와 관련된 감소된 정확도 사이에 균형이 존재한다. 일부 실시양태에서, 방법은 태아 핵산으로부터의 리드(예를 들면, 태아 리드)에 대해 농축된 부분들의 서브세트를 선택하는 단계를 포함하는데, 이 단계는 태아 유전 분석의 정확도를 개선하거나 유의하게 감소시키지 않는다. 이 명백한 균형에도 불구하고, 본원에 기재된 바와 같이, 상대적으로 짧은 단편으로부터의 상당한 양의 리드가 맵핑되는 부분들의 서브세트의 사용은 태아 유전 분석의 정확도를 개선할 수 있다는 것이 확인되었다.
일부 실시양태에서, 부분들의 서브세트는 CCF 단편으로부터의 리드에 따라 선택되고, 이때 부분에 맵핑된 리드는 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진다. 종종, 부분들의 서브세트는 이 기준을 충족시키지 않는 부분을 필터링함으로써 선택된다. 특정 실시양태에서, 부분들의 서브세트는 부분에 맵핑되는 상대적으로 짧은 CCF 단편(예를 들면, 약 200개 염기쌍 이하)으로부터 유래한 리드의 양에 따라 선택된다. 임의의 적합한 방법을 이용하여 선택된 단편 길이(예를 들면, 제1의 선택된 단편 길이)보다 더 짧은 길이를 가진 CCF 단편으로부터의 상당한 양의 리드가 맵핑되는 부분을 확인할 수 있고/있거나 선택할 수 있다. 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 CCF 단편은 종종 상대적으로 짧은 CCF 단편이고, 종종 선택된 단편 길이는 약 200개 염기쌍 이하이다(예를 들면, 약 190개, 180개, 170개, 160개, 150개, 140개, 130개, 120개, 110개, 100개, 90개 또는 80개 염기의 길이를 가진 CCF 단편). CCF 단편의 길이는 단편으로부터 유래한 2개 이상의 리드(예를 들면, 페어링된-말단 리드)를 기준 게놈에 맵핑함으로써 측정될 수 있다(예를 들면, 유추될 수 있거나 추정될 수 있다). 예를 들면, CCF 단편으로부터 유래한 페어링된-말단 리드의 경우, 리드가 기준 게놈에 맵핑될 수 있고, 맵핑된 리드들 사이의 게놈 서열의 길이가 측정될 수 있고, 2개의 리드 길이 및 리드들 사이의 게놈 서열의 길이의 합계가 CCF 단편의 길이와 동등하다. CCF 단편 주형의 길이는 종종 단편으로부터 유도된 리드(예를 들면, 단일-말단 리드)의 길이로부터 직접적으로 측정된다.
일부 실시양태에서, 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 CCF 단편으로부터의 상당한 양의 리드가 맵핑되는 부분들의 서브세트는 제1의 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 CCF 단편으로부터의 맵핑된 리드의 양이 제2의 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 CCF 단편으로부터의 맵핑된 리드의 양보다 큰지에 따라 선택되고/되거나 확인된다. 특정 실시양태에서, 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 CCF 단편으로부터의 상당한 양의 리드가 맵핑되는 부분들의 서브세트는 부분에 대한 제1의 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 CCF 단편으로부터의 맵핑된 리드의 양이 분석된 부분에 대한 제2의 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 CCF 단편으로부터의 맵핑된 리드의 평균치, 평균 또는 중간 양보다 큰지에 따라 선택되고/되거나 확인된다. 일부 실시양태에서, 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 CCF 단편으로부터의 상당한 양의 리드가 맵핑되는 부분들의 서브세트는 각각의 부분에 대해 측정된 단편 길이 비(FLR)을 기초로 선택되고/되거나 확인된다. "단편 길이 비"는 본원에서 태아 비 통계(FRS)로서도 지칭된다.
특정 실시양태에서, FLR은 부분적으로, 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 CCF 단편으로부터의 부분에 맵핑된 리드의 양에 따라 결정된다. 일부 실시양태에서, FLR 값은 종종 X 대 Y의 비이고, 이때 X는 제1의 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 CCF 단편으로부터 유도된 리드의 양이고, Y는 제2의 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 CCF 단편으로부터 유도된 리드의 양이다. 제1의 선택된 단편 길이는 종종 제2의 선택된 단편 길이와 무관하게 선택되고, 역으로 제2의 선택된 단편 길이는 제1의 선택된 단편 길이와 무관하게 선택되고, 제2의 선택된 단편 길이는 전형적으로 제1의 선택된 단편 길이보다 더 크다. 제1의 선택된 단편 길이는 약 200개 염기 이하 내지 약 30개 염기 이하일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1의 선택된 단편 길이는 약 200개, 190개, 180개, 170개, 160개, 155개, 150개, 145개, 140개, 135개, 130개, 125개, 120개, 115개, 110개, 105개, 100개, 95개, 90개, 85개, 80개, 75개, 70개, 65개, 60개, 55개 또는 50개 염기이다. 일부 실시양태에서, 제1의 선택된 단편 길이는 약 170개 내지 약 130개 염기이고, 종종 약 160개 내지 약 140개 염기이다. 일부 실시양태에서, 제2의 선택된 단편 길이는 약 2000개 염기 내지 약 200개 염기이다. 특정 실시양태에서, 제2의 선택된 단편 길이는 약 1000개, 950개, 800개, 850개, 800개, 750개, 700개, 650개, 600개, 550개, 500개, 450개, 400개, 350개, 300개 또는 250개 염기이다. 일부 실시양태에서, 제1의 선택된 단편 길이는 약 140개 내지 약 160개 염기(예를 들면, 약 150개 염기)이고, 제2의 선택된 단편 길이는 약 500개 내지 약 700개 염기(예를 들면, 약 600개 염기)이다. 일부 실시양태에서, 제1의 선택된 단편 길이는 약 150개 염기이고, 제2의 선택된 단편 길이는 약 600개 염기이다.
일부 실시양태에서, FLR은 다수의 FLR 값들의 평균치, 평균 또는 중간치이다. 예를 들면, 종종 주어진 부분에 대한 FLR은 (i) 2개 이상의 검사 샘플, (ii) 2명 이상의 대상체 또는 (iii) 2개 이상의 검사 샘플 및 2명 이상의 대상체에 대한 FLR 값들의 평균치, 평균 또는 중간치이다. 특정 실시양태에서, 평균치, 평균 또는 중간치 FLR은 게놈, 염색체 또는 이들의 분절의 2개 이상의 부분에 대한 FLR 값들로부터 유도된다. 일부 실시양태에서, 평균치, 평균 또는 중간치 FLR은 불확실성(예를 들면, 표준 편차, 중간 절대 편차)과 관련되어 있다.
일부 실시양태에서, 부분들의 서브세트는 하나 이상의 FLR 값(예를 들면, 하나 이상의 FLR 값의 비교)에 따라 선택되고/되거나 확인된다. 특정 실시양태에서, 부분들의 서브세트는 FLR 및 역치(예를 들면, FLR 및 역치의 비교)에 따라 선택되고/되거나 확인된다. 특정 실시양태에서, 주어진 부분으로부터 유도된 평균치, 평균 또는 중간치 FLR은 게놈, 염색체 또는 이들의 분절의 2개 이상의 부분들로부터 유도된 평균치, 평균 또는 중간치 FLR과 비교된다. 예를 들면, 종종 주어진 부분에 대한 평균 FLR은 주어진 부분에 대한 중간치 FLR과 비교된다. 특정 실시양태에서, 부분은 부분에 대해 측정된 평균치, 평균 또는 중간치 FLR 및 부분(예를 들면, 게놈, 염색체 또는 이들의 분절로부터의 부분)의 집합체에 대해 측정된 평균치, 평균 또는 중간치 FLR에 따라 선택되고/되거나 확인된다. 일부 실시양태에서, 부분에 대한 평균치 FLR은 중간치 FLR에 따라 결정된 특정 역치 미만이고, 상기 부분은 (예를 들면, 태아 유전 분석에서) 고려사항으로부터 제거된다. 일부 실시양태에서, 부분에 대한 평균치, 평균 또는 중간치 FLR은 게놈, 염색체 또는 이들의 분절에 대한 평균치, 평균 또는 중간치 FLR에 따라 결정된 특정 역치를 초과하고, 상기 부분은 (예를 들면, 유전적 변이의 존재 또는 부재를 확인할 때) 고려를 위해 선택되고/되거나 부분들의 서브세트에 추가된다. 일부 실시양태에서, 부분에 대한 FLR은 약 0.15 이상 내지 약 0.30(예를 들면, 약 0.16, 0.17, 0.18, 0.19, 0.20, 0.21, 0.21, 0.22, 0.23, 0.24, 0.25, 0.26, 0.27, 0.28, 0.29)이고, 상기 부분은 고려를 위해 선택된다(예를 들면, 태아 유전 분석을 위한 부분들의 서브세트에 추가되거나 이 부분들의 서브세트 내로 도입된다). 일부 실시양태에서, 부분에 대한 FLR은 약 0.20 이하 내지 약 0.10(예를 들면, 약 0.19, 0.18, 0.17, 0.16, 0.15, 0.14, 0.13, 0.12, 0.11)이고, 상기 부분은 고려사항으로부터 제거된다(예를 들면, 필터링된다).
서브세트 내의 부분은 종종 부분적으로, 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 CCF 단편으로부터의 상당한 양의 리드가 (예를 들면, FLR에 따라) 부분에 맵핑되는 지에 따라 선택되고/되거나 확인된다. 일부 실시양태에서, 서브세트 내의 부분은 선택된 단편 길이보다 짧은 단편 길이로부터 맵핑된 서열 리드의 양 이외의 하나 이상의 특성 또는 기준에 따라 선택될 수 있고/있거나 확인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 부분들의 서브세트는 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 CCF 단편으로부터의 상당한 양의 리드가 (예를 들면, FLR에 따라) 부분에 맵핑되는 지 및 하나 이상의 다른 특징에 따라 선택되고/되거나 확인된다. 다른 특징의 비한정적 예는 게놈, 염색체 또는 이들의 분절, 및/또는 하나 이상의 부분의 엑손 수 및/또는 GC 함량을 포함한다. 따라서, 종종 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 CCF 단편으로부터의 상당한 양의 리드가 (예를 들면, FLR에 따라) 서브세트에 대한 부분에 맵핑되는 지에 따라 선택되고/되거나 확인된 부분은 부분의 GC 함량 및/또는 부분 내의 엑손 수에 따라 더 선택되거나 제거된다. 일부 실시양태에서, 부분의 GC 함량 및/또는 부분 내의 엑손 수가 부분에 대한 FLR과 상관관계를 갖지 않는 경우 부분은 선택되지 않거나 고려사항으로부터 제거된다(예를 들면, 필터링된다).
일부 실시양태에서, 부분들의 서브세트는 본원에 기재된 하나 이상의 특정 기준을 충족시키는 부분으로 구성되거나 본질적으로 구성되거나, 이러한 부분을 포함한다(예를 들면, 부분은 특정 값 이상의 FLR을 특징으로 한다). 특정 실시양태에서, 기준을 충족시키지 않는 부분은 예를 들면, 태아 유전 분석의 정확도를 증가시키기 위해 상기 기준을 충족시키는 부분들의 서브세트에 포함된다. 특정 실시양태에서, 기준(예를 들면, 특정 값 이상의 FLR)에 따라 선택된 부분으로 "본질적으로 구성된" 부분들의 서브세트에서 약 90% 이상(예를 들면, 약 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상)의 부분이 상기 기준을 충족시키고 약 10% 이하(예를 들면, 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 약 1% 이하)의 부분이 상기 기준을 충족시키지 않는다.
부분은 임의의 적합한 방법에 의해 선택될 수 있고/있거나 필터링될 수 있다. 일부 실시양태에서, 부분은 데이터, 그래프, 도표 및/또는 차트의 시각적 검사에 따라 선택된다. 특정 실시양태에서, 부분은 (예를 들면, 부분적으로) 하나 이상의 마이크로프로세서 및 메모리를 포함하는 시스템 또는 기계에 의해 선택되고/되거나 필터링된다. 일부 실시양태에서, 부분은 (예를 들면, 부분적으로) 실행 가능한 프로그램이 저장되어 있는 비-일시적 컴퓨터 판독 가능 기억 매체에 의해 선택되고/되거나 필터링되는데, 이때 상기 프로그램은 마이크로프로세서가 선택 및/또는 필터링을 수행하도록 명령한다.
본원에 기재된 방법에 의해 부분의 선택된 서브세트는 상이한 방식으로 태아 유전 분석을 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 샘플로부터 유래한 리드는 본원에 기재된 미리 선택된 부분들의 서브세트를 사용하되 기준 게놈 내의 부분들 전부 또는 대다수를 사용하지 않는 맵핑 공정에서 사용된다. 부분의 미리 선택된 서브세트에 맵핑되는 리드는 종종 태아 유전 분석의 추가 단계에서 사용되고, 부분의 미리 선택된 서브세트에 맵핑되지 않은 리드는 종종 태아 유전 분석의 추가 단계에서 사용되지 않는다(예를 들면, 맵핑되지 않은 리드는 제거되거나 필터링된다).
일부 실시양태에서, 샘플로부터 유래한 서열 리드가 기준 게놈의 모든 또는 대다수의 부분들에 맵핑된 후, 본원에 기재된 부분의 미리 선택된 서브세트가 선택된다. 부분의 선택된 서브세트로부터의 리드는 종종 태아 유전 분석의 추가 단계에서 사용된다. 후자 실시양태에서, 선택되지 않은 부분으로부터의 리드는 종종 태아 유전 분석의 추가 단계에서 사용되지 않는다(예를 들면, 선택되지 않은 부분에서의 리드는 제거되거나 필터링된다).
카운트
일부 실시양태에서, 하나 이상의 부분들(예를 들면, 기준 게놈의 부분)에 맵핑된 리드의 수를 측정하기 위해 선택된 특징 또는 변수를 기초로 맵핑되거나 분할된 서열 리드를 정량할 수 있다. 일부 실시양태에서, 부분들에 맵핑된 서열 리드의 양은 카운트(예를 들면, 카운트 값)로서 지칭된다. 종종 카운트는 부분과 관련되어 있다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 부분(예를 들면, 부분의 세트)에 대한 카운트는 수학적으로 조작된다(예를 들면, 평균 산출, 덧셈, 정규화 등 또는 이들의 조합). 일부 실시양태에서, 카운트는 부분들에 맵핑된(즉, 부분과 관련된) 서열 리드의 일부 또는 전부로부터 측정된다. 일부 실시양태에서, 카운트는 미리 정해진 맵핑된 서열 리드의 서브세트로부터 측정된다. 미리 정해진 맵핑된 서열 리드의 서브세트는 임의의 적합한 특징 또는 변수를 사용함으로써 정해질 수 있거나 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 미리 정해진 맵핑된 서열 리드의 서브세트는 1개 내지 n개의 서열 리드를 포함할 수 있고, 이때 n은 검사 대상체 또는 기준 대상체 샘플로부터 생성된 모든 서열 리드들의 합계와 동등한 수를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 카운트는 당분야에서 공지된 적합한 방법, 연산 또는 수학적 프로세스에 의해 프로세싱되거나 조작된 서열 리드로부터 유도된다. 카운트(예를 들면, 카운트 값)는 적합한 방법, 연산 또는 수학적 프로세스에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 카운트는 부분과 관련된 서열 리드로부터 유도되고, 이때 서열 리드의 일부 또는 전부가 가중되거나, 제거되거나, 필터링되거나, 정규화되거나, 조정되거나, 평균으로서 산출되거나, 평균으로서 유도되거나, 더해지거나, 빼지거나 이들의 조합에 의해 프로세싱된다. 일부 실시양태에서, 카운트는 미가공(raw) 서열 리드 및/또는 필터링된 서열 리드로부터 유도된다. 일부 실시양태에서, 카운트 값은 수학적 프로세스에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 카운트 값은 부분들에 맵핑된 서열 리드의 평균치, 평균 또는 합계이다. 종종, 카운트는 카운트의 평균 수이다. 일부 실시양태에서, 카운트는 불확실성 값과 관련되어 있다.
일부 실시양태에서, 카운트는 조작될 수 있거나 변환될 수 있다(예를 들면, 정규화될 수 있거나, 조합될 수 있거나, 더해질 수 있거나, 필터링될 수 있거나, 선택될 수 있거나, 평균으로서 산출될 수 있거나, 평균으로서 유도될 수 있거나, 이들의 조합에 의해 프로세싱될 수 있다). 일부 실시양태에서, 카운트는 정규화된 카운트를 생성하도록 변환될 수 있다. 카운트는 당분야에서 공지되어 있고/있거나 본원에 기재되어 있는 방법(예를 들면, 부분별 정규화, GC 함량에 의한 정규화, 선형 및 비선형 최소 자승 회귀, GC LOESS, LOWESS, PERUN, RM, GCRM, cQn 및/또는 이들의 조합)에 의해 프로세싱(예를 들면, 정규화)될 수 있다.
카운트(예를 들면, 미가공, 필터링된 및/또는 정규화된 카운트)는 프로세싱될 수 있고 하나 이상의 수준으로 정규화될 수 있다. 수준 및 프로파일은 이하에 더 상세히 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 카운트는 프로세싱될 수 있고/있거나 기준 수준으로 정규화될 수 있다. 기준 수준은 본원에서 나중에 다루어진다. 수준에 따라 프로세싱된 카운트(예를 들면, 프로세싱된 카운트)는 불확실성 값(예를 들면, 계산된 분산, 오차, 표준 편차, Z-점수, p-값, 평균 절대 편차 등)과 관련될 수 있다. 일부 실시양태에서, 불확실성 값은 수준 초과 및 미만의 범위를 한정한다. 편차에 대한 값은 불확실성 값 대신에 사용될 수 있고, 편차의 척도의 비한정적 예는 표준 편차, 평균 절대 편차, 중간 절대 편차, 표준 점수(예를 들면, Z-점수, 표준 점수, 표준화된 변수) 등을 포함한다.
카운트는 종종 태아를 가진 임신 여성으로부터의 핵산 샘플로부터 수득된다. 하나 이상의 부분들에 맵핑된 핵산 서열 리드의 카운트는 태아 및 태아의 모체(예를 들면, 임신 여성 대상체) 둘 다를 표시하는 카운트이다. 일부 실시양태에서, 부분들에 맵핑된 카운트 중 일부는 태아 게놈으로부터의 카운트이고, 동일한 부분들에 맵핑된 카운트 중 일부는 모체 게놈으로부터의 카운트이다.
데이터 프로세싱 및 정규화
카운팅되어 있는 맵핑된 서열 리드는 본원에서 미가공 데이터로서 지칭되는데, 이는 상기 데이터가 조작되지 않은 카운트(예를 들면, 미가공 카운트)를 나타내기 때문이다. 일부 실시양태에서, 데이터 세트에서 서열 리드 데이터는 결과 제공을 용이하게 하기 위해 더 프로세싱될 수 있고(예를 들면, 수학적으로 및/또는 통계학적으로 조작될 수 있고)/있거나 디스플레이될 수 있다. 일부 실시양태에서, 보다 큰 데이터 세트를 포함하는 데이터 세트는 추가 분석을 용이하게 하기 위한 사전프로세싱으로부터 이익을 얻을 수 있다. 데이터 세트의 사전프로세싱은 종종 중복되고/되거나 비-정보제공 부분 또는 기준 게놈의 부분(예를 들면, 비-정보제공 데이터를 가진 기준 게놈의 부분, 중복 맵핑된 리드, 0의 중간치 카운트를 가진 부분, 과다표시된 또는 과소표시된 서열)의 제거를 포함한다. 이론에 의해 한정되지 않지만, 데이터 프로세싱 및/또는 사전프로세싱은 (i) 무의미한(noisy) 데이터를 제거할 수 있고/있거나, (ii) 비-정보제공 데이터를 제거할 수 있고/있거나, (iii) 중복 데이터를 제거할 수 있고/있거나, (iv) 보다 큰 데이터 세트의 복잡성을 감소시킬 수 있고/있거나, (v) 데이터를 한 형태로부터 하나 이상의 다른 형태로 변환시키는 것을 용이하게 할 수 있다. 데이터 또는 데이터 세트와 관련하여 사용될 때 용어 "사전프로세싱" 및 "프로세싱"은 본원에서 "프로세싱"으로서 총칭된다. 일부 실시양태에서, 프로세싱은 데이터가 더 잘 추가 분석될 수 있게 만들 수 있고 결과를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 또는 모든 프로세싱 방법(예를 들면, 정규화 방법, 부분 필터링, 맵핑, 검증 등 또는 이들의 조합)이 프로세서에 의해, 마이크로프로세서에 의해, 컴퓨터에 의해, 메모리와 함께 및/또는 마이크로프로세서 제어 기계에 의해 수행된다.
본원에서 사용된 용어 "무의미한 데이터"는 (a) 분석되거나 작도될 때 데이터 점들 사이에 유의한 분산을 가진 데이터, (b) 유의한 표준 편차(예를 들면, 3 초과의 표준 편차)를 가진 데이터, (c) 평균의 유의한 표준 오차를 가진 데이터 등 및 이들의 조합물을 지칭한다. 무의미한 데이터는 종종 출발 물질(예를 들면, 핵산 샘플)의 양 및 질로 인해 생성되고, 종종 서열 리드를 생성하는 데에 사용된 DNA를 제조하거나 복제하는 프로세스의 일부로서 생성된다. 일부 실시양태에서, 무의미한 데이터는 PCR 기초 방법을 이용함으로써 제조되었을 때 과다표시되는 일부 서열들로부터 생성된다. 본원에 기재된 방법은 무의미한 데이터의 기여를 감소시킬 수 있거나 제거할 수 있으므로, 제공된 결과에 대한 무의미한 데이터의 영향을 감소시킬 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "비-정보제공 데이터", "기준 게놈의 비-정보제공 부분" 및 "비-정보제공 부분"은 소정의 역치 값과 유의하게 상이하거나 소정의 컷오프 값 범위를 벗어나는 수치 값을 가진 부분 또는 이로부터 유도된 데이터를 지칭한다. 본원에서 용어 "역치" 및 "역치 값"은 자격을 갖춘 데이터 세트를 사용함으로써 계산되고 유전적 변이(예를 들면, 카피 수 변이, 이배수성, 염색체 이상 등)의 진단의 한계로서 작용하는 임의의 수를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 수득된 결과는 역치를 초과하고, 대상체는 유전적 변이(예를 들면, 삼염색체성 21)를 가진 것으로서 진단된다. 일부 실시양태에서, 역치 값 또는 값 범위는 종종 (예를 들면, 기준물 및/또는 대상체로부터의) 서열 리드 데이터를 수학적으로 및/또는 통계학적으로 조작함으로써 계산되고, 일부 실시양태에서 역치 값 또는 값 범위를 생성하도록 조작된 서열 리드 데이터는 (예를 들면, 기준물 및/또는 대상체로부터의) 서열 리드 데이터이다. 일부 실시양태에서, 불확실성 값이 측정된다. 불확실성 값은 일반적으로 분산 또는 오차의 척도이고, 분산 또는 오차의 임의의 적합한 척도일 수 있다. 일부 실시양태에서, 불확실성 값은 표준 편차, 표준 오차, 계산된 분산, p-값 또는 평균 절대 편차(MAD)이다. 일부 실시양태에서, 불확실성 값은 실시예 4의 식에 따라 계산될 수 있다.
임의의 적합한 절차가 본원에 기재된 데이터 세트의 프로세싱을 위해 사용될 수 있다. 데이터 세트의 프로세싱을 위해 사용되기에 적합한 절차의 비한정적 예는 필터링, 정규화, 가중, 피크 높이의 모니터링, 피크 면적의 모니터링, 피크 에지의 모니터링, 면적 비의 측정, 데이터의 수학적 프로세싱, 데이터의 통계학적 프로세싱, 통계학적 알고리즘의 적용, 고정된 변수를 사용한 분석, 최적화된 변수를 사용한 분석, 추가 프로세싱을 위한 패턴 또는 경향을 확인하기 위한 데이터의 작도 등 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 데이터 세트는 다양한 특징들(예를 들면, GC 함량, 중복 맵핑된 리드, 센트로미어 영역, 텔로미어 영역 등 및 이들의 조합) 및/또는 변수(예를 들면, 태아 성별, 모체 연령, 모체 배수성, 태아 핵산의 % 기여 등 또는 이들의 조합)을 기초로 프로세싱된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 데이터 세트의 프로세싱은 크고/크거나 복잡한 데이터 세트의 복잡성 및/또는 차원수를 감소시킬 수 있다. 복잡한 데이터 세트의 비한정적 예는 상이한 연령 및 인종 배경을 가진 하나 이상의 검사 대상체 및 복수의 기준 대상체로부터 생성된 서열 리드 데이터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 데이터 세트는 각각의 검사 및/또는 기준 대상체에 대한 수천 개 내지 수백만 개의 서열 리드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 데이터 프로세싱은 임의의 수의 단계로 수행될 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서 데이터는 단일 프로세싱 절차만을 이용함으로써 프로세싱될 수 있고, 일부 실시양태에서 데이터는 1개 이상, 5개 이상, 10개 이상 또는 20개 이상의 프로세싱 단계(예를 들면, 1개 이상의 프로세싱 단계, 2개 이상의 프로세싱 단계, 3개 이상의 프로세싱 단계, 4개 이상의 프로세싱 단계, 5개 이상의 프로세싱 단계, 6개 이상의 프로세싱 단계, 7개 이상의 프로세싱 단계, 8개 이상의 프로세싱 단계, 9개 이상의 프로세싱 단계, 10개 이상의 프로세싱 단계, 11개 이상의 프로세싱 단계, 12개 이상의 프로세싱 단계, 13개 이상의 프로세싱 단계, 14개 이상의 프로세싱 단계, 15개 이상의 프로세싱 단계, 16개 이상의 프로세싱 단계, 17개 이상의 프로세싱 단계, 18개 이상의 프로세싱 단계, 19개 이상의 프로세싱 단계, 또는 20개 이상의 프로세싱 단계)를 이용함으로써 프로세싱될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로세싱 단계는 2회 이상 반복된 동일한 단계(예를 들면, 2회 이상의 필터링, 2회 이상의 정규화)일 수 있고, 일부 실시양태에서 프로세싱 단계는 동시에 또는 순차적으로 수행된 2회 이상의 상이한 프로세싱 단계(예를 들면, 필터링, 정규화; 정규화, 피크 높이 및 에지의 모니터링; 필터링, 정규화, 기준물로의 정규화, p-값을 측정하기 위한 통계학적 조작 등)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 임의의 적합한 수 및/또는 조합의 동일한 또는 상이한 프로세싱 단계들이 결과의 제공을 용이하게 하기 위해 서열 리드 데이터를 프로세싱하는 데에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 기준에 의한 데이터 세트의 프로세싱은 데이터 세트의 복잡성 및/또는 차원수를 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 프로세싱 단계는 하나 이상의 필터링 단계를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 "필터링"은 고려사항으로부터 부분 또는 기준 게놈의 부분을 제거하는 것을 지칭한다. 기준 게놈의 부분은 중복 데이터(예를 들면, 중복 또는 중첩 맵핑된 리드), 비-정보제공 데이터(예를 들면, 0의 중간치 카운트를 가진 기준 게놈의 부분), 과다표시된 또는 과소표시된 서열을 가진 기준 게놈의 부분, 무의미한 데이터 또는 이들의 조합물을 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 적합한 기준을 기초로 제거를 위해 선택될 수 있다. 필터링 프로세스는 종종 고려사항으로부터 기준 게놈의 하나 이상의 부분을 제거하는 단계 및 기준 게놈, 염색체 또는 염색체들, 또는 고려되는 게놈의 부분에 대한 카운팅된 또는 합산된 카운트로부터 제거를 위해 선택된 기준 게놈의 하나 이상의 부분에서의 카운트를 빼는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 기준 게놈의 부분은 연속적으로(예를 들면, 각각의 개별 부분의 제거 효과의 평가를 가능하게 하기 위해 한 번에 하나씩) 제거될 수 있고, 일부 실시양태에서 제거를 위해 표시된 기준 게놈의 모든 부분들이 동시에 제거될 수 있다. 일부 실시양태에서, 일정 수준 초과 또는 미만의 분산을 특징으로 하는 기준 게놈의 부분이 제거되는데, 이것은 종종 본원에서 기준 게놈의 "무의미한" 부분의 필터링으로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, 필터링 프로세스는 부분, 염색체 또는 염색체의 분절의 평균 프로파일 수준으로부터 프로파일 분산의 소정의 배수만큼 벗어나는 데이터 점을 데이터 세트로부터 수득하는 단계를 포함하고, 일부 실시양태에서 필터링 프로세스는 부분, 염색체 또는 염색체의 분절의 평균 프로파일 수준으로부터 프로파일 분산의 소정의 배수만큼 벗어나지 않는 데이터 점을 데이터 세트로부터 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 필터링 프로세스는 유전적 변이의 존재 또는 부재에 대해 분석되는 기준 게놈의 후보 부분의 수를 감소시키는 데에 사용된다. 유전적 변이(예를 들면, 미세결실, 미세중복)의 존재 또는 부재에 대해 분석되는 기준 게놈의 후보 부분의 수의 감소는 종종 데이터 세트의 복잡성 및/또는 차원수를 감소시키고, 종종 유전적 변이 및/또는 유전적 이상을 검색하고/하거나 확인하는 속도를 두 자릿수 이상의 크기만큼 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 프로세싱 단계는 하나 이상의 정규화 단계를 포함할 수 있다. 정규화는 본원에 기재되어 있거나 당분야에서 공지되어 있는 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 정규화는 상이한 스케일로 측정된 값을 개념적으로 공통된 스케일로 조정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 정규화는 조정된 값의 확률 분포를 정렬하는 정교한 수학적 조정을 포함한다. 일부 실시양태에서, 정규화는 분포를 표준 분포로 정렬하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 정규화는 일부 중대한 결과(예를 들면, 오차 및 예외)의 영향을 제거하는 방식으로 상이한 데이터 세트에 대한 상응하는 정규화된 값의 비교를 가능하게 하는 수학적 조절을 포함한다. 일부 실시양태에서, 정규화는 크기 조정을 포함한다. 정규화는 종종 하나 이상의 데이터 세트를 소정의 변수 또는 식으로 나누는 단계를 포함한다. 정규화 방법의 비한정적 예는 부분별 정규화, GC 함량에 의한 정규화, 선형 및 비선형 최소 자승 회귀, LOESS, GC LOESS, LOWESS(국소적으로 가중된 산란도 평활화), PERUN, 반복부 마스킹((repeat masking; RM), GC-정규화 및 반복부 마스킹(GC-normalizatin and repeat masking; GCRM), 조건부 분위 정규화(conditional quantile normalization; cQn) 및/또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전적 변이(예를 들면, 이배수성)의 존재 또는 부재의 확인은 정규화 방법(예를 들면, 부분별 정규화, GC 함량에 의한 정규화, 선형 및 비선형 최소 자승 회귀, LOESS, GC LOESS, LOWESS(국소적으로 가중된 산란도 평활화), PERUN, 반복부 마스킹(RM), GC-정규화 및 반복부 마스킹(GCRM), cQn, 당분야에서 공지된 정규화 방법 및/또는 이들의 조합)을 이용한다. 일부 실시양태에서, 카운트는 정규화된다.
예를 들면, LOESS는 k-최근접 이웃 기초 메타-모델에서 다중 회귀 모델을 병용하는, 당분야에서 공지된 회귀 모델링 방법이다. LOESS는 종종 국소적으로 가중된 다항 회귀로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, GC LOESS는 LOESS 모델을 기준 게놈의 부분에 대한 단편 카운트(예를 들면, 서열 리드, 카운트)와 GC 조성 사이의 관계에 적용한다. LOESS를 이용하여 데이터 점 세트를 통해 평활 곡선을 작도하는 것은 특히 각각의 평활화된 값이 y-축 산점도 기준 변수의 값의 범위에 걸쳐 가중된 이차 최소 자승 회귀에 의해 제공될 때 종종 LOESS 곡선으로서 지칭된다. 데이터 세트에서 각각의 점에 대해, LOESS 방법은 반응이 평가되는 점 근처의 설명 변수 값으로 저차(low-degree) 다항식을 데이터의 서브세트에 피팅한다. 상기 다항식은 반응이 평가되는 점 근처의 점에게 더 많은 가중을 주고 더 멀리 떨어져 있는 점에게 더 적은 가중을 주는 가중된 최소 자승을 이용함으로써 피팅된다. 그 다음, 점에 대한 회귀 함수의 값이 그 데이터 점에 대한 설명 변수 값을 사용하여 국소 다항식을 평가함으로써 수득된다. LOESS 피트는 종종 회귀 함수 값이 각각의 데이터 점에 대해 계산된 후 완결된 것으로서 간주된다. 이 방법의 세부사항들 중 대부분, 예컨대, 다항 모델의 차수 및 가중은 변화가능하다.
임의의 적합한 수의 정규화가 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 데이터 세트는 1회 이상, 5회 이상, 10회 이상 또는 심지어 20회 이상 정규화될 수 있다. 데이터 세트는 임의의 적합한 특징 또는 변수(예를 들면, 샘플 데이터, 기준 데이터, 또는 이들 둘 다)를 표시하는 값(예를 들면, 정규화 값)으로 정규화될 수 있다. 사용될 수 있는 데이터 정규화의 종류의 비한정적 예는 하나 이상의 선택된 검사 또는 기준 부분에 대한 미가공 카운트 데이터를 선택된 부분 또는 구획이 맵핑되는 염색체 또는 전체 게놈에 맵핑된 카운트의 총수로 정규화하는 것; 하나 이상의 선택된 부분에 대한 미가공 카운트 데이터를 선택된 부분 또는 분절이 맵핑되는 하나 이상의 부분 또는 염색체에 대한 중간 기준 카운트로 정규화하는 것; 미가공 카운트 데이터를 미리 정규화된 데이터 또는 이의 유도체로 정규화하는 것; 및 미리 정규화된 데이터를 하나 이상의 다른 소정의 정규화 변수로 정규화하는 것을 포함한다. 데이터 세트의 정규화는 종종 소정의 정규화 변수로서 선택된 특징 또는 성질에 따라 통계학적 오차를 단리하는 효과를 가진다. 또한, 데이터 세트의 정규화는 종종 데이터가 공통된 스케일(예를 들면, 소정의 정규화 변수)을 갖게 함으로써 상이한 스케일을 가진 데이터의 데이터 특성의 비교를 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 통계학적으로 유도된 값으로의 1회 이상의 정규화는 데이터 차이를 최소화하고 이상치 데이터의 중요성을 감소시키는 데에 이용될 수 있다. 정규화 값과 관련하여 부분 또는 기준 게놈의 부분의 정규화는 종종 "부분별 정규화"로서 지칭된다.
일부 실시양태에서, 정규화를 포함하는 프로세싱 단계는 정적 윈도우(window)로의 정규화를 포함하고, 일부 실시양태에서 정규화를 포함하는 프로세싱 단계는 이동 또는 슬라이딩 윈도우로의 정규화를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "윈도우"는 분석을 위해 선택된 하나 이상의 부분을 지칭하고, 종종 비교를 위한 기준물로서 사용된다(예를 들면, 정규화 및/또는 다른 수학적 또는 통계학적 조작을 위해 사용된다). 본원에서 사용된 용어 "정적 윈도우로의 정규화"는 검사 대상체 데이터 세트와 기준 대상체 데이터 세트 사이의 비교를 위해 선택된 하나 이상의 부분을 사용하는 정규화 프로세스를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 선택된 부분은 프로파일을 생성하는 데에 사용된다. 정적 윈도우는 일반적으로 조작 및/또는 분석 동안 변화하지 않는 소정의 부분의 세트를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "이동 윈도우로의 정규화" 및 "슬라이딩 윈도우로의 정규화"는 선택된 검사 부분의 게놈 영역(예를 들면, 바로 옆의 유전적 주변, 인접한 부분 또는 구획 등)에 위치하는 부분에 대해 수행된 정규화를 지칭하고, 이때 하나 이상의 선택된 검사 부분이 선택된 검사 부분을 직접적으로 둘러싸는 부분으로 정규화된다. 일부 실시양태에서, 선택된 부분은 프로파일을 생성하는 데에 사용된다. 슬라이딩 또는 이동 윈도우 정규화는 종종 인접한 검사 부분으로의 반복적 이동 또는 슬라이딩, 및 새로 선택된 검사 부분을 직접적으로 둘러싸거나 인접하는 부분으로의 새로 선택된 검사 부분의 정규화를 포함하고, 이때 인접한 윈도우는 하나 이상의 부분을 공유한다. 일부 실시양태에서, 복수의 선택된 검사 부분들 및/또는 염색체들이 슬라이딩 윈도우 프로세스에 의해 분석될 수 있다.
일부 실시양태에서, 슬라이딩 또는 이동 윈도우로의 정규화는 하나 이상의 값을 생성할 수 있고, 이때 각각의 값은 게놈(예를 들면, 염색체)의 상이한 영역들로부터 선택된 부분의 상이한 기준 세트로의 정규화를 표시한다. 일부 실시양태에서, 생성된 하나 이상의 값은 누적 합산(예를 들면, 선택된 부분, 도메인(예를 들면, 염색체의 일부) 또는 염색체에 대한 정규화된 카운트 프로파일의 적분의 수치적 추정치)이다. 슬라이딩 또는 이동 윈도우 프로세스에 의해 생성된 값은 프로파일을 생성하고 결과에 도달하는 것을 용이하게 하는 데에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 부분의 누적 합산은 게놈 위치의 함수로서 디스플레이될 수 있다. 이동 또는 슬라이딩 윈도우 분석은 종종 미세결실 및/또는 미세삽입의 존재 또는 부재에 대해 게놈을 분석하는 데에 이용된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 부분의 누적 합계의 디스플레이는 유전적 변이(예를 들면, 미세결실, 미세중복)의 영역의 존재 또는 부재를 확인하는 데에 이용된다. 일부 실시양태에서, 이동 또는 슬라이딩 윈도우 분석은 미세결실을 함유하는 게놈 영역을 확인하는 데에 이용되고, 일부 실시양태에서 이동 또는 슬라이딩 윈도우 분석은 미세중복을 함유하는 게놈 영역을 확인하는 데에 이용된다.
핵산 표시자와 관련된 오차를 감소시키는 특히 유용한 정규화 방법은 본원 및 예를 들면, 미국 특허출원 제13/669,136호 및 국제 특허출원 제PCT/US12/59123호(WO2013/052913)(모든 본문, 표, 방정식 및 도면을 포함하는 전체 내용이 본원에 참고로 도입됨)에 기재된 파라미터화된 오차 제거 및 비편향된 정규화(PERUN)로서 본원에서 지칭된다. PERUN 방법은 다양한 핵산 표시자(예를 들면, 핵산 서열 리드)에 기초한 예측을 혼동시키는 오차의 영향을 감소시킬 목적으로 이러한 핵산 표시자에 적용될 수 있다.
예를 들면, PERUN 방법은 샘플로부터의 핵산 서열 리드에 적용될 수 있고 게놈 구획 수준 측정을 방해할 수 있는 오차의 영향을 감소시킬 수 있다. 이러한 적용은 핵산 서열 리드를 사용하여 뉴클레오티드 서열의 상이한 수준(예를 들면, 부분, 게놈 구획 수준)으로서 나타나는 유전적 변이의 존재 또는 부재를 대상체에서 확인하는 데에 유용하다. 부분에서의 변이의 비한정적 예는 염색체 이배수성(예를 들면, 삼염색체성 21, 삼염색체성 18, 삼염색체성 13) 및 성염색체(예를 들면, 여성에서의 XX 대 남성에서의 XY)의 존재 또는 부재이다. 상염색체(예를 들면, 성염색체 이외의 염색체)의 삼염색체성은 영향을 받은 상염색체로서 지칭될 수 있다. 게놈 구획 수준에서의 변이의 다른 비한정적 예는 미세결실, 미세삽입, 중복 및 모자이크 현상을 포함한다.
특정 적용에서, PERUN 방법은 특정 게놈 군에 대한 핵산 표시자를 정규화함으로써 실험적 편향을 감소시킬 수 있고, 이들 중 후자는 부분으로서 지칭된다. 부분은 핵산 표시자의 적합한 집합체를 포함하고, 이러한 표시자의 비한정적 예는 본원에서 기준 게놈의 게놈 구획 또는 부분으로서 지칭되는 인접 뉴클레오티드들의 길이를 포함한다. 빈은 본원에 기재되어 있는 다른 핵산 표시자도 포함할 수 있다. 이러한 적용에서, PERUN 방법은 일반적으로 3차원에서 다수의 샘플들에 걸쳐 특정 빈에서 핵산 표시자를 정규화한다.
특정 적용에서, PERUN 방법은 기준 게놈의 특정 분절(예를 들면, 부분)에 맵핑된 핵산 표시자(예를 들면, 카운트, 리드)를 정규화함으로써 실험적 및/또는 시스템적 편향을 감소시킬 수 있다. 이러한 적용에서, PERUN 방법은 일반적으로 3차원에서 다수의 샘플들에 걸쳐 기준 게놈의 특정 부분에서 핵산 리드의 카운트를 정규화한다. PERUN 및 이의 적용의 상세한 설명은 본원의 실시예 부분, 국제 특허출원 제PCT/US12/59123호(WO2013/052913) 및 미국 특허출원 공보 제20130085681호(모든 본문, 표, 방정식 및 도면을 포함하는 전체 내용이 본원에 참고로 도입됨)에서 제공되어 있다.
일부 실시양태에서, PERUN 방법은 (a) 검사 샘플에 대한 기준 게놈의 부분들에 맵핑된 서열 리드 카운트, (b) 검사 샘플에 대한 실험적 편향(예를 들면, GC 편향), 및 (c) (i) 서열 리드가 맵핑되는 기준 게놈의 부분에 대한 실험적 편향과 (ii) 상기 부분들에 맵핑된 서열 리드의 카운트 사이의 피팅된 관계에 대한 하나 이상의 피트 파라미터(예를 들면, 피트의 추정치)로부터 기준 게놈의 부분에 대한 게놈 구획 수준을 계산하는 단계를 포함한다. 기준 게놈의 각각의 부분들에 대한 실험적 편향은 (i) 기준 게놈의 각각의 부분들에 맵핑된 서열 리드의 카운트와 (ii) 기준 게놈의 각각의 부분들에 대한 맵핑 특징 사이의 각각 샘플에 대한 피팅된 관계에 따라 다수의 샘플들에 걸쳐 측정될 수 있다. 각각의 샘플에 대한 이 피팅된 관계는 3차원에서 다수의 샘플들에 대해 조립될 수 있다. PERUN 방법이 실험적 편향에 따라 조립의 순서를 정하지 않고 실시될 수 있지만, 일부 실시양태에서 조립은 실험적 편향에 따라 순서가 정해질 수 있다. 각각의 샘플에 대한 피팅된 관계 및 기준 게놈의 각각의 부분들에 대한 피팅된 관계는 당분야에서 공지된 적합한 피팅 방법(예를 들면, 피팅 모델)에 의해 선형 함수 또는 비선형 함수에 독립적으로 피팅될 수 있다. 관계를 피팅하는 데에 이용될 수 있는 적합한 모델의 비한정적 예는 선형 회귀 모델, 단순 회귀 모델, 표준 최소 자승 회귀 모델, 다중 회귀 모델, 일반 다중 회귀 모델, 다항 회귀 모델, 일반 선형 모델, 일반화 선형 모델, 이산 선택 회귀 모델, 로지스틱 회귀 모델, 다항 로짓(logit) 모델, 혼합 로짓 모델, 프로빗(probit) 모델, 다항 프로빗 모델, 순서형 로짓 모델, 순서형 프로빗 모델, 푸아송(Poisson) 모델, 다변량 반응 회귀 모델, 다층 모델, 고정 효과 모델, 변량 효과 모델, 혼합 모델, 비선형 회귀 모델, 비모수 모델, 준모수 모델, 로버스트(robust) 모델, 분위 모델, 등위(isotonic) 모델, 주성분 모델, 최소 각 모델, 로컬(local) 모델, 세그먼트(segmented) 모델 및 변수 오차(errors-in-variables) 모델을 포함한다.
일부 실시양태에서, 관계는 기하학적 및/또는 도식적 관계이다. 본원에서 사용된 용어 "관계" 및 "관련"은 동의어이다. 일부 실시양태에서, 관계는 수학적 관계이다. 일부 실시양태에서, 관계는 작도된다. 일부 실시양태에서, 관계는 선형 관계이다. 일부 실시양태에서, 관계는 비선형 관계이다. 일부 실시양태에서, 관계는 회귀(예를 들면, 회귀 선)이다. 회귀는 선형 회귀 또는 비선형 회귀일 수 있다. 관계는 수학적 방정식으로 표현될 수 있다. 종종, 관계는 부분적으로 하나 이상의 상수 및/또는 하나 이상의 변수에 의해 정의된다. 관계는 당분야에서 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 샘플에 대한 2차원 관계가 생성될 수 있고, 오차를 증명하는 또는 오차를 증명할 수 있는 변수가 하나 이상의 차원에 대해 선택될 수 있다. 관계는 예를 들면, 사용자에 의해 제공된 2개 이상의 변수의 값을 사용하여 그래프를 작도하는, 당분야에서 공지된 도식화 소프트웨어를 사용함으로써 생성될 수 있다. 관계는 당분야에서 공지된 방법을 이용함으로써(예를 들면, 회귀 또는 회귀 분석을 적합한 회귀 프로그램, 예를 들면, 소프트웨어로 수행함으로써) 피팅될 수 있다. 일부 관계는 선형 회귀에 의해 피팅될 수 있고, 선형 회귀는 기울기 값 및 절편 값을 생성할 수 있다. 예를 들면, 일부 관계는 종종 선형이 아니고 비선형 함수, 예컨대, 포물선, 쌍곡선 또는 지수 함수(예를 들면, 이차 함수)에 의해 피팅될 수 있다.
PERUN 방법에서, 하나 이상의 피팅된 관계는 선형일 수 있다. 임신 여성으로부터의 세포 유리 순환 핵산을 분석하는 경우, 실험적 편향이 GC 편향이고 맵핑 특징이 GC 함량일 때, (i) 각각의 부분들에 맵핑된 서열 리드의 카운트와 (ii) 기준 게놈의 각각의 부분들에 대한 GC 함량 사이의 샘플에 대한 피팅된 관계는 선형일 수 있다. 후자 피팅된 관계의 경우, 기울기는 GC 편향에 관한 것이고, GC 편향 계수는 피팅된 관계가 다수의 샘플들에 걸쳐 조립될 때 각각의 샘플에 대해 측정될 수 있다. 이러한 실시양태에서, (i) 부분에 대한 GC 편향 계수와 (ii) 부분들에 맵핑된 서열 리드의 카운트 사이의 다수의 샘플들 및 부분에 대한 피팅된 관계도 선형일 수 있다. 절편 및 기울기는 후자 피팅된 관계로부터 수득될 수 있다. 이러한 적용에서, 기울기는 GC 함량을 기초로 샘플 특이적 편향을 다루고, 절편은 모든 샘플들에 공통된 부분 특이적 약화 패턴을 다룬다. PERUN 방법은 결과(예를 들면, 유전적 변이의 존재 또는 부재; 태아 성별의 확인)를 제공하기 위해 게놈 구획 수준을 계산할 때 이러한 샘플 특이적 편향 및 부분 특이적 약화를 유의하게 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, PERUN 정규화는 선형 함수에의 피팅을 이용하고 방정식 A, 방정식 B 또는 이들로부터 유도된 식에 의해 기재된다.
방정식 A
M = LI + GS
방정식 B
L = (M - GS)/I
일부 실시양태에서, L은 PERUN 정규화된 수준 또는 프로파일이다. 일부 실시양태에서, L은 PERUN 정규화 절차로부터의 원하는 결과이다. 일부 실시양태에서, L은 부분 특이적이다. 일부 실시양태에서, L은 기준 게놈의 다수의 부분들에 따라 측정되고 게놈, 염색체, 또는 이들의 부분 또는 분절의 PERUN 정규화된 수준을 나타낸다. 수준 L은 종종 추가 분석을 위해(예를 들면, Z-값, 모체 결실/중복, 태아 미세결실/미세중복, 태아 성별, 성 이배수성 등을 확인하기 위해) 사용된다. 방정식 B에 따라 정규화하는 방법은 파라미터화된 오차 제거 및 비편향된 정규화(PERUN)로서 명명된다.
일부 실시양태에서, G는 선형 모델, LOESS 또는 임의의 등가 방법을 이용함으로써 측정된 GC 편향 계수이다. 일부 실시양태에서, G는 기울기이다. 일부 실시양태에서, GC 편향 계수 G는 기준 게놈으로부터 측정된 부분 i에 대한 카운트 M(예를 들면, 미가공 카운트) 및 부분 i의 GC 함량에 대한 회귀의 기울기로서 평가된다. 일부 실시양태에서, G는 M으로부터 추출되고 관계에 따라 측정된 이차 정보를 나타낸다. 일부 실시양태에서, G는 부분 특이적 카운트의 세트와 샘플(예를 들면, 검사 샘플)에 대한 부분 특이적 GC 함량 값의 세트의 관계를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 부분 특이적 GC 함량은 기준 게놈으로부터 유도된다. 일부 실시양태에서, 부분 특이적 GC 함량은 관찰된 또는 측정된(예를 들면, 샘플로부터 측정된) GC 함량으로부터 유도된다. GC 편향 계수는 종종 샘플 군 내의 각각의 샘플에 대해 측정되고, 일반적으로 시험 샘플에 대해 측정된다. GC 편향 계수는 종종 샘플 특이적이다. 일부 실시양태에서, GC 편향 계수는 상수이다. 일부 실시양태에서, 일단 샘플에 대해 유도된 GC 편향 계수는 변하지 않는다.
일부 실시양태에서, I는 절편이고, S는 선형 관계로부터 유도된 기울기이다. 일부 실시양태에서, I 및 S가 유도되는 관계는 G가 유도되는 관계와 상이하다. 일부 실시양태에서, I 및 S가 유도되는 관계는 주어진 실험 셋업에 대해 고정된다. 일부 실시양태에서, I 및 S는 다수의 샘플들에 따른 카운트(예를 들면, 미가공 카운트) 및 GC 편향 계수에 따라 선형 관계로부터 유도된다. 일부 실시양태에서, I 및 S는 시험 샘플과 관계없이 유도된다. 일부 실시양태에서, I 및 S는 다수의 샘플들로부터 유도된다. I 및 S는 종종 부분 특이적이다. 일부 실시양태에서, I 및 S는 정배수체 샘플에서 기준 게놈의 모든 부분들에 대해 L이 1이라는 가정 하에 측정된다. 일부 실시양태에서, 선형 관계는 정배수체 샘플에 대해 결정되고, 선택된 부분(L이 1이라고 가정함)에 대한 특이성을 가진 I 및 S 값이 측정된다. 일부 실시양태에서, 동일한 절차가 인간 게놈 내의 기준 게놈의 모든 부분들에 적용되고, 절편 I 및 기울기 S의 세트가 모든 부분에 대해 측정된다.
일부 실시양태에서, 교차검증 방법이 적용된다. 교차검증은 종종 회전 평가로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, 교차검증 방법은 예측 모델(예를 들면, PERUN)이 검사 샘플을 사용하여 실제로 얼마나 정확히 수행할 것인지를 평가하기 위해 적용된다. 일부 실시양태에서, 한 라운드의 교차검증은 데이터의 샘플을 상보적 서브세트로 분할하는 단계, 한 서브세트(예를 들면, 종종 트레이닝 세트로서 지칭됨)에 대한 교차검증 분석을 수행하는 단계, 및 또 다른 서브세트(예를 들면, 종종 검증 세트 또는 검사 세트로서 지칭됨)를 사용하여 분석을 검증하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상이한 구획들 및/또는 상이한 서브세트를 사용하여 다수의 라운드의 교차검증을 수행한다. 교차검증 방법의 비한정적 예는 리브-원-아웃, 슬라이딩 에지, K-폴드(fold), 2-폴드, 반복부 무작위 서브샘플링 등 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 교차검증은 공지된 정배수체 태아를 포함하는 90%의 샘플 세트를 함유하는 작업 세트를 무작위적으로 선택하고 그 서브세트를 사용하여 모델을 트레이닝한다. 일부 실시양태에서, 무작위 선택을 100회 반복하여 모든 부분들에 대한 100개 기울기 및 100개 절편의 세트를 생성한다.
일부 실시양태에서, M의 값은 검사 샘플로부터 유도된 측정된 값이다. 일부 실시양태에서, M은 부분에 대해 측정된 미가공 카운트이다. 일부 실시양태에서, 값 I 및 S가 부분에 대해 사용가능한 경우, 측정치 M은 검사 샘플로부터 측정되고 방정식 B에 따라 게놈, 염색체, 또는 이들의 분절 또는 부분에 대한 PERUN 정규화된 수준 L을 측정하는 데에 사용된다.
따라서, PERUN 방법을 다수의 샘플들에 걸쳐 서열 리드에 동시에 적용하는 것은 (i) 샘플 특이적 실험적 편향(예를 들면, GC 편향) 및 (ii) 샘플들에 공통된 부분 특이적 약화에 의해 약기된 오차를 유의하게 감소시킬 수 있다. 오차의 이들 2개 공급원들 각각이 별도로 또는 순차적으로 다루어지는 다른 방법은 종종 PERUN 방법만큼 효과적으로 이들을 감소시킬 수 없다. 이론에 의해 한정되지 않지만, PERUN 방법은 부분적으로 그의 일반적인 덧셈 프로세스가 다른 정규화 방법(예를 들면, GC-LOESS)에서 이용된 일반적인 곱셈 프로세스만큼 많이 넓게 확대하지 않기 때문에 오차를 더 효과적으로 감소시킨다고 생각된다.
추가 정규화 및 통계학적 기법이 PERUN 방법과 함께 이용될 수 있다. 추가 프로세스는 PERUN 방법의 이용 전, 후 및/또는 동안에 적용될 수 있다. PERUN 방법과 함께 이용될 수 있는 프로세스의 비한정적 예는 이하에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, GC 함량에 대한 게놈 구획 수준의 이차 정규화 또는 조절이 PERUN 방법과 함께 이용될 수 있다. 적합한 GC 함량 조절 또는 정규화 절차(예를 들면, GC-LOESS, GCRM)가 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 특정 샘플이 추가 GC 정규화 프로세스의 적용을 위해 선택될 수 있고/있거나 확인될 수 있다. 예를 들면, PERUN 방법의 적용은 각각의 샘플에 대한 GC 편향을 측정할 수 있고, 특정 역치 초과의 GC 편향과 관련된 샘플이 추가 GC 정규화 프로세스를 위해 선택될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 소정의 역치 수준이 추가 GC 정규화를 위해 이러한 샘플을 선택하는 데에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 부분 필터링 또는 가중 프로세스가 PERUN 방법과 함께 이용될 수 있다. 적합한 부분 필터링 또는 가중 프로세스가 이용될 수 있고, 비한정적 예가 본원, 국제 특허출원 제PCT/US12/59123호(WO2013/052913) 및 미국 특허출원 공보 제20130085681호(모든 본문, 표, 방정식 및 도면을 포함하는 전체 내용이 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 모체 삽입, 중복 및/또는 결실(예를 들면, 모체 및/또는 태아 카피 수 변이)과 관련된 오차를 감소시키는 정규화 기법이 PERUN 방법과 함께 이용된다.
PERUN 방법에 의해 계산된 게놈 구획 수준은 결과를 제공하는 데에 직접적으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 게놈 구획 수준은 태아 분획이 약 2% 내지 약 6% 이상(예를 들면, 약 4% 이상의 태아 분획)인 샘플에 대한 결과를 제공하는 데에 직접적으로 사용될 수 있다. PERUN 방법에 의해 계산된 게놈 구획 수준은 종종 결과의 제공을 위해 더 프로세싱된다. 일부 실시양태에서, 계산된 게놈 구획 수준은 표준화된다. 일부 실시양태에서, 검사 부분(예를 들면, 21번 염색체)에 대한 계산된 게놈 구획 수준의 합계, 평균 또는 중간치를 검사 부분 이외의 부분(예를 들면, 21번 염색체 이외의 상염색체)에 대한 계산된 게놈 구획 수준의 합계, 평균 또는 중간치로 나누어 실험적 게놈 구획 수준을 생성할 수 있다. 실험적 게놈 구획 수준 또는 미가공 게놈 구획 수준은 표준화 분석, 예컨대, Z-점수의 계산의 일부로서 사용될 수 있다. Z-점수는 예상된 게놈 구획 수준을 실험적 게놈 구획 수준 또는 미가공 게놈 구획 수준으로부터 뺌으로써 샘플에 대해 생성될 수 있고, 생성된 값은 샘플에 대한 표준 편차로 나누어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 생성된 Z-점수는 상이한 샘플들에 대해 분포되고 분석되거나, 다른 변수, 예컨대, 태아 분획 등과 관련되고 분석되어 결과를 제공할 수 있다.
상기 인지된 바와 같이, PERUN 방법은 GC 편향 및 GC 함량에 따른 정규화 그 자체로 한정되지 않고, 다른 오차 공급원과 관련된 오차를 감소시키는 데에 사용될 수 있다. 비-GC 함량 편향의 공급원의 비한정적 예는 맵핑 가능성이다. GC 편향 및 함량 이외의 정규화 파라미터가 다루어질 때, 하나 이상의 피팅된 관계는 비선형(예를 들면, 쌍곡선, 지수)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 실험적 편향이 비선형 관계로부터 측정되는 경우, 예를 들면, 실험적 편향 곡률 추정치가 분석될 수 있다.
PERUN 방법은 다양한 핵산 표시자들에게 적용될 수 있다. 핵산 표시자의 비한정적 예는 마이크로어레이 상의 특정 위치에서의 핵산 서열 리드 및 핵산 수준이다. 서열 리드의 비한정적 예는 세포 유리 순환 DNA, 세포 유리 순환 RNA, 세포 DNA 및 세포 RNA로부터 수득된 서열 리드를 포함한다. PERUN 방법은 적합한 기준 서열, 예컨대, 게놈 기준 DNA, 세포 기준 RNA(예를 들면, 전사체(transcriptome)), 및 이들의 부분(예를 들면, DNA 또는 RNA 전사체의 게놈 상보체의 일부(들), 염색체의 일부(들))에 맵핑된 서열 리드에 적용될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 세포 핵산(예를 들면, DNA 또는 RNA)은 핵산 표시자로서 사용될 수 있다. PERUN 방법을 이용하여 기준 게놈 부분들에 맵핑된 세포 핵산 리드를 정규화할 수 있다. 특정 단백질에 결합된 세포 핵산은 종종 염색질 면역침전(ChIP) 공정으로서 지칭된다. ChIP에 의해 농축된 핵산은 세포 단백질과 회합된 핵산, 예를 들면, DNA 또는 RNA이다. 당분야에서 공지된 기술을 이용하여 ChIP에 의해 농축된 핵산의 리드를 수득할 수 있다. ChIP에 의해 농축된 핵산의 리드를 기준 게놈의 하나 이상의 부분들에 맵핑할 수 있고, PERUN 방법을 이용하여 맵핑 결과를 정규화하여 결과를 제공할 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포 RNA가 핵산 표시자로서 사용될 수 있다. 세포 RNA 리드를 기준 RNA 부분들에 맵핑할 수 있고 PERUN 방법을 이용하여 정규화하여 결과를 제공할 수 있다. 전사체로서 지칭되는 세포 RNA 또는 이의 분절에 대한 공지된 서열은 샘플로부터의 RNA 리드가 맵핑될 수 있는 기준물로서 사용될 수 있다. 당분야에서 공지된 기술을 이용하여 샘플 RNA의 리드를 수득할 수 있다. PERUN 방법을 이용하여 기준물에 맵핑된 RNA 리드의 결과를 정규화하여 결과를 제공할 수 있다.
일부 실시양태에서, 마이크로어레이 핵산 수준이 핵산 표시자로서 사용될 수 있다. PERUN 방법을 이용하여 어레이 상에서 특정 어드레스(address) 또는 혼성화 핵산에 대해 샘플들 전체에 걸쳐 수득된 핵산 수준을 분석함으로써 마이크로어레이 분석에 의해 제공된 핵산 표시자를 정규화할 수 있다. 이 방식에서, 마이크로어레이 상의 특정 어드레스 또는 혼성화 핵산은 맵핑된 핵산 서열 리드에 대한 부분과 유사하고, PERUN 방법은 마이크로어레이 데이터를 정규화하여 개선된 결과를 제공하는 데에 이용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로세싱 단계는 가중을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "가중된", "가중" 또는 "가중 함수" 또는 이의 문법적 파생어 또는 등가어는 일부 데이터 세트 특징 또는 변수의 영향을 다른 데이터 세트 특징 또는 변수에 비해 변경시키는 데에(예를 들면, 기준 게놈의 선택된 부분 또는 부분들에서의 데이터의 질 또는 유용성을 기초로 하나 이상의 부분 또는 기준 게놈의 부분에 함유된 데이터의 유의성 및/또는 기여를 증가시키거나 감소시키는 데에) 종종 이용되는, 데이터 세트의 일부 또는 전부의 수학적 조작을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 가중 함수는 상대적으로 작은 측정 분산을 가진 데이터의 영향을 증가시키고/시키거나 상대적으로 큰 측정 분산을 가진 데이터의 영향을 감소시키는 데에 사용될 수 있다. 예를 들면, 과소표시된 또는 낮은 질의 서열 데이터를 가진 기준 게놈의 부분은 데이터 세트에 대한 영향을 최소화하기 위해 "하향 가중될" 수 있는 반면, 기준 게놈의 선택된 부분은 데이터 세트에 대한 영향을 증가시키기 위해 "상향 가중될" 수 있다. 가중 함수의 비한정적 예는 [1/(표준 편차)2]이다. 가중 단계는 종종 정규화 단계와 실질적으로 유사한 방식으로 수행된다. 일부 실시양태에서, 데이터 세트는 소정의 변수(예를 들면, 가중 변수)로 나누어진다. 소정의 변수(예를 들면, 최소화된 표적 함수, Phi)는 종종 데이터 세트의 상이한 부분들을 상이하게 가중하도록(예를 들면, 다른 종류의 데이터의 영향을 감소시키면서 일부 종류의 데이터의 영향을 증가시키도록) 선택된다.
일부 실시양태에서, 프로세싱 단계는 하나 이상의 수학적 및/또는 통계학적 조작을 포함할 수 있다. 임의의 적합한 수학적 및/또는 통계학적 조작이 본원에 기재된 데이터 세트를 분석하고/하거나 조작하는 데에 단독으로 또는 조합으로 이용될 수 있다. 임의의 적합한 수의 수학적 및/또는 통계학적 조작이 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 데이터 세트는 1회 이상, 5회 이상, 10회 이상 또는 20회 이상 수학적으로 및/또는 통계학적으로 조작될 수 있다. 이용될 수 있는 수학적 및 통계학적 조작의 비한정적 예는 덧셈, 뺄셈, 곱셈, 나눗셈, 대수적 함수, 최소 자승 추정량, 곡선 피팅, 미분 방정식, 유리 다항식, 이중 다항식, 직교 다항식, z-점수, p-값, chi 값, phi 값, 피크 수준의 분석, 피크 에지 위치의 확인, 피크 면적 비의 계산, 중간 염색체 수준의 분석, 평균 절대 편차의 계산, 제곱 잔차의 합계, 평균, 표준 편차, 표준 오차 등 또는 이들의 조합을 포함한다. 수학적 및/또는 통계학적 조작은 서열 리드 데이터 또는 이의 프로세싱된 생성물의 전부 또는 일부에 대해 수행될 수 있다. 통계학적으로 조작될 수 있는 데이터 세트 변수 또는 특징의 비한정적 예는 미가공 카운트, 필터링된 카운트, 정규화된 카운트, 피크 높이, 피크 폭, 피크 면적, 피크 에지, 측면 허용오차(lateral tolerance), P-값, 중간 수준, 평균 수준, 게놈 영역 내의 카운트 분포, 핵산 종의 상대적 표시치 등 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 프로세싱 단계는 하나 이상의 통계학적 알고리즘의 사용을 포함할 수 있다. 임의의 적합한 통계학적 알고리즘이 본원에 기재된 데이터 세트를 분석하고/하거나 조작하는 데에 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 임의의 적합한 수의 통계학적 알고리즘이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 데이터 세트는 1개 이상, 5개 이상, 10개 이상 또는 20개 이상의 통계학적 알고리즘을 사용함으로써 분석될 수 있다. 본원에 기재된 방법과 함께 사용되기에 적합한 통계학적 알고리즘의 비한정적 예는 결정 트리, 카운터널(counternulls), 다중 비교, 옴니버스 검정, 베렌스-피셔 문제(Behrens-Fisher problem), 부트스트랩핑(bootstrapping), 독립적인 유의성 검정을 조합하기 위한 피셔의 방법, 널(null) 가설, I형 오차, II형 오차, 정확 검정, 1-샘플 Z 검정, 2-샘플 Z 검정, 1-샘플 t-검정, 페어링된 t-검정, 등분산을 가진 2-샘플 풀링된 t-검정, 이분산을 가진 2-샘플 비-풀링된 t-검정, 1-비율 z-검정, 풀링된 2-비율 z-검정, 비-풀링된 2-비율 z-검정, 1-샘플 chi-제곱 검정, 분산의 등가성에 대한 2-샘플 F 검정, 신뢰 구간, 신뢰가능한 구간, 유의성, 메타 분석, 단순 선형 회귀, 로버스트 선형 회귀 등 또는 이들의 조합을 포함한다. 통계학적 알고리즘을 사용함으로써 분석될 수 있는 데이터 세트 변수 또는 특징의 비한정적 예는 미가공 카운트, 필터링된 카운트, 정규화된 카운트, 피크 높이, 피크 폭, 피크 에지, 측면 허용오차, P-값, 중간 수준, 평균 수준, 게놈 영역 내의 카운트 분포, 핵산 종의 상대적 표시치 등 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 데이터 세트는 다수의(예를 들면, 2개 이상의) 통계학적 알고리즘(예를 들면, 최소 자승 회귀, 주성분 분석, 선형 판별식 분석, 이차 판별식 분석, 배깅(bagging), 신경망(neural network), 서포트-벡터 머신(support-vector machine) 모델, 무작위 포레스트(random forests), 분류 트리 모델, K-최근접 이웃(K-nearest neighbors), 로지스틱 회귀 및/또는 손실 평활화(loss smoothing)), 및/또는 수학적 및/또는 통계학적 조작(예를 들면, 본원에서 조작으로서 지칭됨)을 이용함으로써 분석될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수의 조작의 이용은 결과를 제공하는 데에 사용될 수 있는 N-차원 공간을 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수의 조작을 이용한 데이터 세트의 분석은 데이터 세트의 복잡성 및/또는 차원수를 감소시킬 수 있다. 예를 들면, 기준 데이터 세트에 대한 다수의 조작의 이용은 기준 샘플의 유전적 상태(예를 들면, 선택된 유전적 변이에 대한 양성 또는 음성)에 따라 유전적 변이의 존재 또는 부재를 표시하는 데에 사용될 수 있는 N-차원 공간(예를 들면, 확률도)를 생성할 수 있다. 실질적으로 유사한 조작 세트를 사용한 검사 샘플의 분석은 검사 샘플 각각에 대한 N-차원 점을 생성하는 데에 사용될 수 있다. 검사 대상체 데이터 세트의 복잡성 및/또는 차원수는 종종 기준 데이터로부터 생성된 N-차원 공간과 용이하게 비교될 수 있는 단일 값 또는 N-차원 점까지 감소된다. 기준 대상체 데이터가 차지하는 N-차원 공간 내에 속하는 검사 샘플 데이터는 기준 대상체의 유전적 상태와 실질적으로 유사한 유전적 상태를 표시한다. 기준 대상체 데이터가 차지하는 N-차원 공간을 벗어나는 검사 샘플 데이터는 기준 대상체의 유전적 상태와 실질적으로 유사하지 않은 유전적 상태를 표시한다. 일부 실시양태에서, 기준물은 정배수체이거나 유전적 변이 또는 의학적 질환을 갖지 않는다.
일부 실시양태에서, 데이터 세트가 카운팅되고 임의적으로 필터링되고 정규화된 후, 프로세싱된 데이터 세트는 하나 이상의 필터링 및/또는 정규화 절차에 의해 더 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 필터링 및/또는 정규화 절차에 의해 더 조작된 데이터 세트는 프로파일을 생성하는 데에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 필터링 및/또는 정규화 절차는 종종 데이터 세트 복잡성 및/또는 차원수를 감소시킬 수 있다. 결과는 감소된 복잡성 및/또는 차원수의 데이터 세트를 기초로 제공될 수 있다.
일부 실시양태에서, 부분은 오차의 척도(예를 들면, 표준 편차, 표준 오차, 계산된 분산, p-값, 평균 절대 오차(MAE), 평균치 절대 편차 및/또는 평균 절대 편차(MAD)에 따라 필터링될 수 있다. 일부 실시양태에서, 오차의 척도는 카운트 가변성을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 부분은 카운트 가변성에 따라 필터링될 수 있다. 일부 실시양태에서, 카운트 가변성은 다수의 샘플들(예를 들면, 다수의 대상체들, 예를 들면, 50명 이상, 100명 이상, 500명 이상, 1,000명 이상, 5,000명 이상 또는 10,000명 이상의 대상체들로부터 수득된 다수의 샘플들)에 대한 기준 게놈의 부분(즉, 부분)에 맵핑된 카운트에 대해 측정된 오차의 척도이다. 일부 실시양태에서, 소정의 상한 범위 초과의 카운트 가변성을 가진 부분이 필터링된다(예를 들면, 고려사항으로부터 배제된다). 일부 실시양태에서, 소정의 상한 범위는 약 50, 약 52, 약 54, 약 56, 약 58, 약 60, 약 62, 약 64, 약 66, 약 68, 약 70, 약 72, 약 74 또는 약 76 이상의 MAD 값이다. 일부 실시양태에서, 소정의 하한 범위 미만의 카운트 가변성을 가진 부분이 필터링된다(예를 들면, 고려사항으로부터 배제된다). 일부 실시양태에서, 소정의 하한 범위는 약 40, 약 35, 약 30, 약 25, 약 20, 약 15, 약 10, 약 5, 약 1 또는 약 0 이하의 MAD 값이다. 일부 실시양태에서, 소정의 범위를 벗어난 카운트 가변성을 가진 부분이 필터링된다(예를 들면, 고려사항으로부터 배제된다). 일부 실시양태에서, 소정의 범위는 0 초과 내지 약 76 미만, 약 74 미만, 약 73 미만, 약 72 미만, 약 71 미만, 약 70 미만, 약 69 미만, 약 68 미만, 약 67 미만, 약 66 미만, 약 65 미만, 약 64 미만, 약 62 미만, 약 60 미만, 약 58 미만, 약 56 미만, 약 54 미만, 약 52 미만 또는 약 50 미만의 MAD 값이다. 일부 실시양태에서, 소정의 범위는 0 초과 내지 약 67.7 미만의 MAD 값이다. 일부 실시양태에서, 소정의 범위 내의 카운트 가변성을 가진 부분이 선택된다(예를 들면, 유전적 변이의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 사용된다).
일부 실시양태에서, 부분의 카운트 가변성은 분포(예를 들면, 정규 분포)를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 부분은 분포의 분위 내에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 분포에 대한 약 99.9%, 99.8%, 99.7%, 99.6%, 99.5%, 99.4%, 99.3%, 99.2%, 99.1%, 99.0%, 98.9%, 98.8%, 98.7%, 98.6%, 98.5%, 98.4%, 98.3%, 98.2%, 98.1%, 98.0%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 85% 또는 80% 이하의 분위, 또는 약 75% 이하의 분위를 가진 부분이 선택된다. 일부 실시양태에서, 카운트 가변성의 분포의 99% 분위 내의 부분이 선택된다. 일부 실시양태에서, 99% 분위 내에서 0 초과 내지 67.725 미만의 MAD를 가진 부분이 선택되어, 기준 게놈의 안정한 부분의 세트를 확인시켜 준다.
PERUN과 관련하여 부분 필터링의 비한정적 예가 본원 및 국제 특허출원 제PCT/US12/59123호(WO2013/052913)(모든 본문, 표, 방정식 및 도면을 포함하는 전체 내용이 본원에 참고로 도입됨)에서 제공되어 있다. 부분은 오차의 척도를 기초로 또는 부분적으로 오차의 척도를 기초로 필터링될 수 있다. 일부 실시양태에서, 편차의 절대 값, 예컨대, R-계수를 포함하는 오차의 척도가 부분 제거 또는 가중을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, R-계수는 실제 측정으로부터의 예상된 카운트 값으로 나누어진 실제 측정으로부터의 예상된 카운트 값의 절대 편차의 합계로서 정의된다(예를 들면, 본원의 방정식 B). 편차의 절대 값을 포함하는 오차의 척도가 사용될 수 있지만, 오차의 적합한 척도가 대안적으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 편차의 절대 값을 포함하지 않는 오차의 척도, 예컨대, 제곱에 기초한 분산이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 부분은 맵핑 가능성의 척도(예를 들면, 맵핑 가능성 점수)에 따라 필터링되거나 가중된다. 부분은 종종 부분들에 맵핑된 상대적으로 낮은 수의 서열 리드(예를 들면, 부분들에 맵핑된 0개, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 리드)에 따라 필터링되거나 가중된다. 부분은 수행되는 분석의 종류에 따라 필터링될 수 있거나 가중될 수 있다. 예를 들면, 13번, 18번 및/또는 21번 염색체 이배수성 분석을 위해, 성염색체가 필터링될 수 있고, 상염색체 또는 상염색체의 서브세트만이 분석될 수 있다. 태아 성별 확인의 경우, 상염색체는 필터링될 수 있고, 성염색체들(X 및 Y) 또는 성염색체들 중 하나(X 또는 Y)만이 분석될 수 있다.
특정 실시양태에서, 하기 필터링 프로세스가 이용될 수 있다. 주어진 염색체(예를 들면, 21번 염색체) 내의 부분(예를 들면, 기준 게놈의 부분)의 동일한 세트가 선택되고, 영향을 받은 샘플 및 영향을 받지 않은 샘플에서 리드의 수가 비교된다. 갭(gap)은 삼염색체성 21 및 정배수체 샘플과 관련되고, 21번 염색체의 대부분을 커버하는 부분의 세트를 포함한다. 상기 부분의 세트는 정배수체 샘플과 T21 샘플 사이에 동일하다. 부분이 한정될 수 있기 때문에 부분의 세트와 단일 구획 사이의 식별은 중요하지 않다. 동일한 게놈 영역이 상이한 환자들에서 비교된다. 이 프로세스는 T21 이외에 또는 대신에 삼염색체성 분석, 예컨대, T13 또는 T18에 대한 삼염색체성 분석을 위해 이용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 데이터 세트가 카운팅되고 임의적으로 필터링되고 정규화된 후, 프로세싱된 데이터 세트는 가중에 의해 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 부분이 선택된 부분에 함유된 데이터(예를 들면, 무의미한 데이터, 비-정보제공 데이터)의 영향을 감소시키기 위한 가중을 위해 선택될 수 있고, 일부 실시양태에서 하나 이상의 부분이 선택된 부분에 함유된 데이터(예를 들면, 작은 측정된 분산을 가진 데이터)의 영향을 향상시키거나 증가시키기 위한 가중을 위해 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 데이터 세트는 큰 분산을 가진 데이터의 영향을 감소시키고 작은 분산을 가진 데이터의 영향을 증가시키는 단일 가중 함수를 사용함으로써 가중된다. 가중 함수는 종종 큰 분산을 가진 데이터의 영향을 감소시키고 작은 분산을 가진 데이터의 영향을 증가시키는 데에 사용된다(예를 들면, [1/(표준 편차)2]). 일부 실시양태에서, 가중에 의해 더 조작된 프로세싱된 데이터의 프로파일 도표가 분류 및/또는 결과의 제공을 용이하게 하기 위해 생성된다. 결과는 가중된 데이터의 프로파일 도표를 기초로 제공될 수 있다.
부분의 필터링 또는 가중은 분석에서 하나 이상의 적합한 점에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 부분은 서열 리드가 기준 게놈의 부분들에 맵핑되기 전 또는 후에 필터링될 수 있거나 가중될 수 있다. 일부 실시양태에서, 부분은 개별 게놈 부분에 대한 실험적 편향이 측정되기 전 또는 후에 필터링될 수 있거나 가중될 수 있다. 일부 실시양태에서, 부분은 게놈 구획 수준이 계산되기 전 또는 후에 필터링될 수 있거나 가중될 수 있다.
일부 실시양태에서, 데이터 세트가 카운팅되고 임의적으로 필터링되고 정규화되고 임의적으로 가중된 후, 프로세싱된 데이터 세트는 하나 이상의 수학적 및/또는 통계학적(예를 들면, 통계학적 함수 또는 통계학적 알고리즘) 조작에 의해 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로세싱된 데이터 세트는 하나 이상의 선택된 부분, 염색체 또는 염색체의 부분에 대한 Z-점수를 계산함으로써 더 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로세싱된 데이터 세트는 P-값을 계산함으로써 더 조작될 수 있다. Z-점수 및 p-값을 계산하기 위한 방정식의 한 실시양태는 방정식 1(실시예 2)에 제시되어 있다. 일부 실시양태에서, 수학적 및/또는 통계학적 조작은 배수성 및/또는 태아 분획에 관한 하나 이상의 가정을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 통계학적 및/또는 수학적 조작에 의해 더 조작된 프로세싱된 데이터의 프로파일 도표는 분류 및/또는 결과의 제공을 용이하게 하기 위해 생성된다. 결과는 통계학적으로 및/또는 수학적으로 조작된 데이터의 프로파일 도표를 기초로 제공될 수 있다. 통계학적으로 및/또는 수학적으로 조작된 데이터의 프로파일 도표를 기초로 제공된 결과는 배수성 및/또는 태아 분획에 관한 하나 이상의 가정을 포함한다.
일부 실시양태에서, 데이터 세트가 카운팅되고 임의적으로 필터링되고 정규화된 후, N-차원 공간 및/또는 N-차원 점을 생성하기 위해 프로세싱된 데이터 세트에 대한 다수의 조작이 수행된다. 결과는 N-차원에서 분석된 데이터 세트의 프로파일 도표를 기초로 제공될 수 있다.
일부 실시양태에서, 데이터 세트의 일부로서 또는 데이터 세트가 프로세싱되고/되거나 조작된 후에 하나 이상의 피크 수준 분석, 피크 폭 분석, 피크 에지 위치 분석, 피크 측면 허용오차 등, 이들로부터 유도된 분석, 또는 이들의 조합을 이용하여 데이터 세트를 프로세싱한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 피크 수준 분석, 피크 폭 분석, 피크 에지 위치 분석, 피크 측면 허용오차 등, 이들로부터 유도된 분석, 또는 이들의 조합을 이용함으로써 프로세싱된 데이터의 프로파일 도표는 분류 및/또는 결과의 제공을 용이하게 하기 위해 생성된다. 결과는 하나 이상의 피크 수준 분석, 피크 폭 분석, 피크 에지 위치 분석, 피크 측면 허용오차 등, 이들로부터 유도된 분석, 또는 이들의 조합을 이용함으로써 프로세싱된 데이터의 프로파일 도표를 기초로 제공될 수 있다.
일부 실시양태에서, 해당 유전적 변이를 실질적으로 갖지 않는 하나 이상의 기준 샘플은 기준 중간 카운트 프로파일을 생성하는 데에 사용될 수 있고, 이 기준 중간 카운트 프로파일은 유전적 변이의 부재를 표시하는 소정의 값을 생성할 수 있고, 검사 대상체가 유전적 변이를 가진 경우 유전적 변이가 검사 대상체에서 위치하는 게놈 위치에 상응하는 영역에서 소정의 값으로부터 종종 벗어난다. 유전적 변이와 관련된 의학적 질환에 대한 위험을 갖거나 이러한 의학적 질환을 앓고 있는 검사 대상체에서, 선택된 부분 또는 구획에 대한 수치 값은 영향을 받지 않은 게놈 위치에 대한 소정의 값과 유의하게 상이할 것으로 예상된다. 일부 실시양태에서, 해당 유전적 변이를 가진 것으로서 공지된 하나 이상의 기준 샘플은 기준 중간 카운트 프로파일을 생성하는 데에 사용될 수 있고, 이 기준 중간 카운트 프로파일은 유전적 변이의 존재를 표시하는 소정의 값을 생성할 수 있고, 검사 대상체가 유전적 변이를 갖지 않는 게놈 위치에 상응하는 영역에서 소정의 값으로부터 종종 벗어난다. 유전적 변이와 관련된 의학적 질환에 대한 위험을 갖지 않거나 이러한 의학적 질환을 앓고 있지 않은 검사 대상체에서, 선택된 부분 또는 구획에 대한 수치 값은 영향을 받은 게놈 위치에 대한 소정의 값과 유의하게 상이할 것으로 예상된다.
일부 실시양태에서, 데이터의 분석 및 프로세싱은 하나 이상의 가정의 사용을 포함할 수 있다. 적합한 수 또는 종류의 가정이 데이터 세트를 분석하거나 프로세싱하는 데에 사용될 수 있다. 데이터 프로세싱 및/또는 분석을 위해 사용될 수 있는 가정의 비한정적 예는 모체 배수성, 태아 기여, 기준 집단에서의 일부 서열들의 우세, 인종적 배경, 관련된 가족 구성원에서 선택된 의학적 질환의 우세, GC 정규화 및 반복부 마스킹(예를 들면, GCRM) 후 상이한 환자들 및/또는 실시로부터의 미가공 카운트 프로파일들 사이의 유사성, 동일한 일치가 PCR 인공물을 나타낸다는 가정(예를 들면, 동일한 염기 위치), 태아 정량자 분석(예를 들면, FQA)에 내재하는 가정, 쌍생아에 대한 가정(예를 들면, 2명의 쌍둥이 중 1명만이 영향을 받은 경우 유효 태아 분획은 총 측정된 태아 분획의 단지 50%임(세쌍둥이, 네쌍둥이 등의 경우에도 유사함)), 태아 세포 유리 DNA(예를 들면, cfDNA)가 전체 게놈을 균일하게 커버한다는 가정 등 및 이들의 조합을 포함한다.
맵핑된 서열 리드의 질 및/또는 깊이가 원하는 신뢰 수준(예를 들면, 95% 이상의 신뢰 수준)에서 유전적 변이의 존재 또는 부재의 결과 예측을 허용하지 않는 경우, 정규화된 카운트 프로파일을 기초로 하나 이상의 추가 수학적 조작 알고리즘 및/또는 통계학적 예측 알고리즘이 데이터 분석 및/또는 결과의 제공에 유용한 추가 수치 값을 생성하는 데에 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "정규화된 카운트 프로파일"은 정규화된 카운트를 사용함으로써 생성된 프로파일을 지칭한다. 정규화된 카운트 및 정규화된 카운트 프로파일을 생성하는 데에 이용될 수 있는 방법의 예는 본원에 기재되어 있다. 인지된 바와 같이, 카운팅되어 있는 맵핑된 서열 리드는 검사 샘플 카운트 또는 기준 샘플 카운트에 대하여 정규화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 정규화된 카운트 프로파일은 도표로서 제시될 수 있다.
프로파일
일부 실시양태에서, 프로세싱 단계는 데이터 세트 또는 이의 유도체(예를 들면, 당분야에서 공지되어 있고/있거나 본원에 기재되어 있는 하나 이상의 수학적 및/또는 통계학적 데이터 프로세싱 단계의 생성물)의 다양한 양태들로부터 하나 이상의 프로파일(예를 들면, 프로파일 도표)을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "프로파일"은 다량의 데이터에서 패턴 및/또는 상관관계의 확인을 용이하게 할 수 있는 데이터의 수학적 및/또는 통계학적 조작의 생성물을 지칭한다. "프로파일"은 종종 하나 이상의 기준을 기초로 데이터 또는 데이터 세트의 하나 이상의 조작으로부터 생성된 값을 포함한다. 프로파일은 종종 다수의 데이터 점들을 포함한다. 임의의 적합한 수의 데이터 점이 데이터 세트의 성질 및/또는 복잡성에 따라 프로파일에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로파일은 2개 이상의 데이터 점, 3개 이상의 데이터 점, 5개 이상의 데이터 점, 10개 이상의 데이터 점, 24개 이상의 데이터 점, 25개 이상의 데이터 점, 50개 이상의 데이터 점, 100개 이상의 데이터 점, 500개 이상의 데이터 점, 1000개 이상의 데이터 점, 5000개 이상의 데이터 점, 10,000개 이상의 데이터 점, 또는 100,000개 이상의 데이터 점을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로파일은 데이터 세트의 전체를 표시하고, 일부 실시양태에서 프로파일은 데이터 세트의 부분 또는 서브세트를 표시한다. 즉, 프로파일은 종종 임의의 데이터를 제거하도록 필터링되지 않은 데이터를 표시하는 데이터 점을 포함하거나 이러한 데이터 점으로부터 생성되고, 종종 프로파일은 원하지 않는 데이터를 제거하도록 필터링된 데이터를 표시하는 데이터 점을 포함하거나 이러한 데이터 점으로부터 생성된다. 일부 실시양태에서, 프로파일에서의 데이터 점은 부분에 대한 데이터 조작의 결과를 표시한다. 일부 실시양태에서, 프로파일에서의 데이터 점은 부분의 군에 대한 데이터 조작의 결과를 포함한다. 일부 실시양태에서, 부분의 군은 서로 인접할 수 있고, 일부 실시양태에서 부분의 군은 염색체 또는 게놈의 상이한 부분들로부터의 군일 수 있다.
데이터 세트로부터 유도된 프로파일에서의 데이터 점은 임의의 적합한 데이터 분류를 표시할 수 있다. 데이터가 분류되어 프로파일 데이터 점을 생성할 수 있는 카테고리의 비한정적 예는 크기에 기초한 부분, 서열 특징(예를 들면, GC 함량, AT 함량, 염색체 상의 위치(예를 들면, 짧은 아암(arm), 긴 아암, 센트로미어, 텔로미어) 등)에 기초한 부분, 발현 수준, 염색체 등 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로파일은 또 다른 프로파일로부터 수득된 데이터 점으로부터 셍성될 수 있다(예를 들면, 재정규화된 데이터 프로파일을 생성하도록 상이한 정규화 값으로 재정규화된 정규화된 데이터 프로파일). 일부 실시양태에서, 또 다른 프로파일로부터 수득된 데이터 점으로부터 생성된 프로파일은 데이터 점의 수 및/또는 데이터 세트의 복잡성을 감소시킨다. 데이터 점의 수 및/또는 데이터 세트의 복잡성의 감소는 종종 데이터의 핵석을 용이하게 하고/하거나 결과의 제공을 용이하게 한다.
프로파일(예를 들면, 게놈 프로파일, 염색체 프로파일, 염색체의 분절의 프로파일)은 종종 2개 이상의 부분들에 대한 정규화된 또는 비-정규화된 카운트의 집합체이다. 프로파일은 종종 하나 이상의 수준(예를 들면, 게놈 구획 수준)을 포함하고, 종종 2개 이상의 수준을 포함한다(예를 들면, 프로파일은 종종 다수의 수준을 가진다). 수준은 일반적으로 거의 동일한 카운트 또는 정규화된 카운트를 가진 부분의 세트에 대한 수준이다. 일부 실시양태에서, 프로파일은 가중될 수 있거나, 제거될 수 있거나, 필터링될 수 있거나, 정규화될 수 있거나, 조절될 수 있거나, 평균으로서 산출될 수 있거나, 평균으로서 유도될 수 있거나, 더해질 수 있거나, 빼질 수 있거나, 프로세싱될 수 있거나 이들의 임의의 조합에 의해 변환될 수 있는 하나 이상의 부분을 포함한다. 프로파일은 종종 2개 이상의 수준을 정의하는 부분들에 맵핑된 정규화된 카운트를 포함하고, 이때 상기 카운트는 적합한 방법에 의해 상기 수준 중 하나에 따라 더 정규화된다. 종종, 프로파일의 카운트(예를 들면, 프로파일 수준)는 불확실성 값과 관련되어 있다.
하나 이상의 수준을 포함하는 프로파일은 종종 패딩된다(예를 들면, 홀 패딩(hole padding)). 패딩(예를 들면, 홀 패딩)은 모체 미세결실 또는 모체 중복(예를 들면, 카피 수 변이)에 기인하는 프로파일 내의 수준을 확인하고 조절하는 프로세스를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 태아 미세중복 또는 태아 미세결실에 기인하는 수준이 패딩된다. 일부 실시양태에서, 프로파일 내의 미세중복 또는 미세결실은 프로파일(예를 들면, 염색체의 프로파일)의 전체 수준을 인위적으로 상승시키거나 하강시켜 염색체 이배수성(예를 들면, 삼염색체성)의 거짓 양성 또는 거짓 음성 확인을 유발할 수 있다. 일부 실시양태에서, 미세중복 및/또는 결실에 기인하는 프로파일 내의 수준은 종종 패딩 또는 홀 패딩으로서 지칭되는 프로세스에 의해 확인되고 조절된다(예를 들면, 패딩되고/되거나 제거된다). 일부 실시양태에서, 프로파일은 프로파일 내의 제2 수준과 유의하게 상이한 하나 이상의 제1 수준을 포함하고, 하나 이상의 제1 수준 각각은 모체 카피 수 변이, 태아 카피 수 변이, 또는 모체 카피 수 변이 및 태아 카피 수 변이를 포함하고, 하나 이상의 제1 수준은 조절된다.
하나 이상의 수준을 포함하는 프로파일은 제1 수준 및 제2 수준을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 수준은 제2 수준과 상이(예를 들면, 유의하게 상이)하다. 일부 실시양태에서, 제1 수준은 부분의 제1 세트를 포함하고, 제2 수준은 부분의 제2 세트를 포함하고, 부분의 제1 세트는 부분의 제2 세트의 서브세트가 아니다. 일부 실시양태에서, 부분의 제1 세트는 부분의 제2 세트와 상이하고, 이들로부터 제1 수준 및 제2 수준이 측정된다. 일부 실시양태에서, 프로파일은 프로파일 내의 제2 수준과 상이한(예를 들면, 유의하게 상이한, 예를 들면, 유의하게 상이한 값을 가진) 다수의 제1 수준을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로파일은 프로파일 내의 제2 수준과 유의하게 상이한 하나 이상의 제1 수준을 포함하고, 하나 이상의 제1 수준은 조절된다. 일부 실시양태에서, 프로파일은 프로파일 내의 제2 수준과 유의하게 상이한 하나 이상의 제1 수준을 포함하고, 하나 이상의 제1 수준 각각은 모체 카피 수 변이, 태아 카피 수 변이, 또는 모체 카피 수 변이 및 태아 카피 수 변이를 포함하고, 하나 이상의 제1 수준은 조절된다. 일부 실시양태에서, 프로파일 내의 제1 수준은 프로파일로부터 제거되거나 조절된다(예를 들면, 패딩된다). 프로파일은 하나 이상의 제2 수준과 유의하게 상이한 하나 이상의 제1 수준을 포함하는 다수의 수준을 포함할 수 있고, 종종 프로파일 내의 대다수의 수준이 제2 수준이고, 이 제2 수준은 서로 거의 동등하다. 일부 실시양태에서, 프로파일 내의 수준 중 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과 또는 95% 초과의 수준이 제2 수준이다.
프로파일은 종종 도표로서 디스플레이된다. 예를 들면, 부분의 카운트(예를 들면, 정규화된 카운트)를 표시하는 하나 이상의 수준이 작도될 수 있고 가시화될 수 있다. 생성될 수 있는 프로파일 도표의 비한정적 예는 미가공 카운트(예를 들면, 미가공 카운트 프로파일 또는 미가공 프로파일), 정규화된 카운트, 가중된 부분, z-점수, p-값, 면적 비 대 피팅된 배수성, 중간 수준 대 피팅된 태아 분획과 측정된 태아 분획 사이의 비, 주성분 등 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로파일 도표는 조작된 데이터의 가시화를 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 프로파일 도표는 결과(예를 들면, 면적 비 대 피팅된 배수성, 중간 수준 대 피팅된 태아 분획과 측정된 태아 분획 사이의 비, 주성분)를 제공하는 데에 이용될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "미가공 카운트 프로파일 도표" 또는 "미가공 프로파일 도표"는 영역(예를 들면, 게놈, 부분, 염색체, 기준 게놈의 염색체 부분 또는 염색체의 분절)에서의 총 카운트로 정규화된 영역 내의 각각의 부분에서의 카운트의 도표를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 프로파일은 정적 윈도우 프로세스를 이용함으로써 생성될 수 있고, 일부 실시양태에서 프로파일은 슬라이딩 윈도우 프로세스를 이용함으로써 생성될 수 있다.
검사 대상체에 대해 생성된 프로파일은 종종 데이터 세트의 수학적 및/또는 통계학적 조작의 해석을 용이하게 하고/하거나 결과를 제공하기 위해 하나 이상의 기준 대상체에 대해 생성된 프로파일과 비교된다. 일부 실시양태에서, 프로파일은 하나 이상의 출발 가정(예를 들면, 핵산의 모체 기여(예를 들면, 모체 분획), 핵산의 태아 기여(예를 들면, 태아 분획), 기준 샘플의 배수성 등 또는 이들의 조합)을 기초로 생성된다. 일부 실시양태에서, 검사 프로파일은 종종 유전적 변이의 부재를 표시하는 소정의 값 주변에 모이고, 검사 대상체가 유전적 변이를 가진 경우 종종 유전적 변이가 검사 대상체에서 위치하는 게놈 위치에 상응하는 영역에서 소정의 값으로부터 벗어난다. 유전적 변이와 관련된 의학적 질환에 대한 위험을 갖거나 이러한 의학적 질환을 앓고 있는 검사 대상체에서, 선택된 부분에 대한 수치 값은 영향을 받지 않은 게놈 위치에 대한 소정의 값과 유의하게 상이할 것으로 예상된다. 출발 가정(예를 들면, 고정된 배수성 또는 최적화된 배수성, 고정된 태아 분획 또는 최적화된 태아 분획, 또는 이들의 조합)에 따라, 유전적 변이의 존재 또는 부재를 확인하는 데에 유용한 결과를 여전히 제공하면서 유전적 변이의 존재 또는 부재를 표시하는 소정의 역치 또는 컷오프 값, 또는 역치 값 범위가 달라질 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로파일은 표현형을 표시하고/하거나 나타낸다.
비한정적 예로서, 정규화된 샘플 및/또는 기준 카운트 프로파일은 (a) 유전적 변이를 갖지 않는 것으로서 공지된 기준 세트로부터 선택된 염색체, 또는 이의 부분 또는 분절에 대한 기준 중간 카운트를 계산하고; (b) 비-정보제공 부분을 기준 샘플 미가공 카운트로부터 제거하고(예를 들면, 필터링); (c) 기준 게놈의 모든 남은 부분들에 대한 기준 카운트를 선택된 염색체 또는 선택된 게놈 위치에서 기준 샘플에 대한 카운트의 총 잔류 수(예를 들면, 기준 게놈의 비-정보제공 부분의 제거 후 남은 카운트의 합계)로 정규화하여 정규화된 기준 대상체 프로파일을 생성하고; (d) 상응하는 부분을 검사 대상체 샘플로부터 제거하고; (e) 하나 이상의 선택된 게놈 위치에 대한 남은 검사 대상체 카운트를, 선택된 게놈 위치를 함유하는 염색체 또는 염색체들에 대한 잔류 기준 중간 카운트의 합계로 정규화하여 정규화된 검사 대상체 프로파일을 생성함으로써 미가공 서열 리드 데이터로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, (b)에서 필터링된 부분에 의해 감소된, 전체 게놈에 대한 추가 정규화 단계는 (c)와 (d) 사이에 포함될 수 있다.
데이터 세트 프로파일은 카운팅된 맵핑된 서열 리드 데이터의 하나 이상의 조작에 의해 생성될 수 있다. 일부 실시양태는 하기 사항들을 포함한다. 서열 리드가 맵핑되고, 각각의 게놈 부분들에 맵핑되는 카운트(즉, 서열 태그)의 수가 측정된다(예를 들면, 카운팅된다). 미가공 카운트 프로파일은 카운팅되는 맵핑된 서열 리드로부터 생성된다. 일부 실시양태에서, 결과는 검사 대상체로부터의 미가공 카운트 프로파일을, 유전적 변이를 갖지 않는 것으로서 공지된 기준 대상체 세트로부터의 염색체, 또는 이의 부분 또는 분절에 대한 기준 중간 카운트 프로파일과 비교함으로써 제공된다.
일부 실시양태에서, 서열 리드 데이터는 임의적으로 무의미한 데이터 또는 비-정보제공 부분을 제거하도록 필터링된다. 필터링 후, 남은 카운트는 전형적으로 필터링된 데이터 세트를 생성하도록 합산된다. 일부 실시양태에서, 필터링된 카운트 프로파일은 필터링된 데이터 세트로부터 생성된다.
서열 리드 데이터가 카운팅되고 임의적으로 필터링된 후, 데이터 세트는 수준 또는 프로파일을 생성하도록 정규화될 수 있다. 데이터 세트는 하나 이상의 선택된 부분을 적합한 정규화 기준 값으로 정규화함으로써 정규화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 정규화 기준 값은 부분이 선택되는 염색체 또는 염색체들에 대한 총 카운트를 표시한다. 일부 실시양태에서, 정규화 기준 값은 유전적 변이를 갖지 않는 것으로서 공지된 기준 대상체 세트로부터 준비된 기준 데이터 세트로부터 하나 이상의 상응하는 부분, 염색체의 부분 또는 염색체를 표시한다. 일부 실시양태에서, 정규화 기준 값은 유전적 변이의 존재 또는 부재에 대해 분석되는 검사 대상체로부터 준비된 검사 대상체 데이터 세트로부터 하나 이상의 상응하는 부분, 염색체의 부분 또는 염색체를 표시한다. 일부 실시양태에서, 정규화 프로세스는 정적 윈도우 방법을 이용함으로써 수행되고, 일부 실시양태에서 정규화 프로세스는 이동 또는 슬라이딩 윈도우 방법을 이용함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, 정규화된 카운트를 포함하는 프로파일은 분류 및/또는 결과의 제공을 용이하게 하기 위해 생성된다. 결과는 정규화된 카운트를 포함하는 프로파일의 도표를 기초로(예를 들면, 이러한 프로파일의 도표를 사용함으로써) 제공될 수 있다.
수준
일부 실시양태에서, 값(예를 들면, 수, 정량적 값)은 수준에 기인한다. 수준은 적합한 방법, 연산 또는 수학적 프로세스에 의해 측정될 수 있다(예를 들면, 프로세싱된 수준). 수준은 종종 부분의 세트에 대한 카운트(예를 들면, 정규화된 카운트)이거나 이러한 카운트로부터 유도된다. 일부 실시양태에서, 부분의 수준은 부분들에 맵핑된 카운트(예를 들면, 카운트, 정규화된 카운트)의 총수와 실질적으로 동등하다. 종종, 수준은 당분야에서 공지된 적합한 방법, 연산 또는 수학적 프로세스에 의해 프로세싱되거나, 변환되거나 조작된 카운트로부터 결정된다. 일부 실시양태에서, 수준은 프로세싱된 카운트로부터 유도되고, 프로세싱된 카운트의 비한정적 예는 가중된, 제거된, 필터링된, 정규화된, 조절된, 평균으로서 산출된, 평균(예를 들면, 평균 수준)으로서 유도된, 더해진, 빼진 또는 변환된 카운트 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수준은 정규화된 카운트(예를 들면, 부분의 정규화된 카운트)를 포함한다. 수준은 적합한 프로세스에 의해 정규화된 카운트에 대한 수준일 수 있고, 이 프로세스의 비한정적 예는 부분별 정규화, GC 함량에 의한 정규화, 선형 및 비선형 최소 자승 회귀, GC LOESS, LOWESS, PERUN, RM, GCRM, cQn 등 및/또는 이들의 조합을 포함한다. 수준은 정규화된 카운트 또는 상대적 양의 카운트를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 수준은 평균으로서 산출된 2개 이상의 부분에 대한 카운트 또는 정규화된 카운트에 대한 수준이고, 상기 수준은 평균 수준으로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, 수준은 평균 수준으로서 지칭되는 평균 카운트 또는 정규화된 카운트의 평균을 가진 부분의 세트에 대한 수준이다. 일부 실시양태에서, 수준은 미가공 카운트 및/또는 필터링된 카운트를 포함하는 부분에 대해 유도된다. 일부 실시양태에서, 수준은 미가공 상태의 카운트에 기초한다. 일부 실시양태에서, 수준은 불확실성 값(예를 들면, 표준 편차, MAD)과 관련되어 있다. 일부 실시양태에서, 수준은 Z-점수 또는 p-값에 의해 표시된다.
하나 이상의 부분에 대한 수준은 본원에서 "게놈 구획 수준"과 동의어이다. 본원에서 사용된 용어 "수준"은 종종 용어 "상승"과 동의어이다. 용어 "수준"의 의미는 그것이 사용되는 문맥으로부터 결정될 수 있다. 예를 들면, 게놈 구획, 프로파일, 리드 및/또는 카운트와 관련하여 사용될 때 용어 "수준"은 종종 상승을 의미한다. 물질 또는 조성물과 관련하여 사용될 때 용어 "수준"(예를 들면, RNA의 수준, 플렉싱 수준)은 종종 양을 지칭한다. 불확실성과 관련하여 사용될 때 용어 "수준"(예를 들면, 오차 수준, 신뢰 수준, 편차 수준, 불확실성 수준)은 종종 양을 지칭한다.
2개 이상의 수준(예를 들면, 프로파일 내의 2개 이상의 수준)에 대한 정규화된 또는 비-정규화된 카운트는 종종 수준에 따라 수학적으로 조작된다(예를 들면, 덧셈, 곱셈, 평균 산출, 정규화 등 또는 이들의 조합에 의해 조작된다). 예를 들면, 2개 이상의 수준에 대한 정규화된 또는 비-정규화된 카운트는 프로파일 내의 수준 중 하나, 일부 또는 전부에 따라 정규화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로파일 내의 모든 수준의 정규화된 또는 비-정규화된 카운트는 프로파일 내의 1개 수준에 따라 정규화된다. 일부 실시양태에서, 프로파일 내의 제1 수준의 정규화된 또는 비-정규화된 카운트는 프로파일 내의 제2 수준의 정규화된 또는 비-정규화된 카운트에 따라 정규화된다.
수준(예를 들면, 제1 수준, 제2 수준)의 비한정적 예는 프로세싱된 카운트를 포함하는 부분의 세트에 대한 수준, 카운트의 평균, 중간치 또는 평균치를 포함하는 부분의 세트에 대한 수준, 정규화된 카운트를 포함하는 부분의 세트에 대한 수준 등 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 프로파일 내의 제1 수준 및 제2 수준은 동일한 염색체들에 맵핑된 부분의 카운트로부터 유도된다. 일부 실시양태에서, 프로파일 내의 제1 수준 및 제2 수준은 상이한 염색체들에 맵핑된 부분의 카운트로부터 유도된다.
일부 실시양태에서, 수준은 하나 이상의 부분들에 맵핑된 정규화된 또는 비-정규화된 카운트로부터 결정된다. 일부 실시양태에서, 수준은 2개 이상의 부분들에 맵핑된 정규화된 또는 비-정규화된 카운트로부터 결정되고, 이때 각각의 부분들에 대한 정규화된 카운트는 종종 거의 동일하다. 수준에 대한 부분의 세트에서의 카운트(예를 들면, 정규화된 카운트)의 변경이 있을 수 있다. 수준에 대한 부분의 세트에서, 이 세트의 다른 부분(예를 들면, 피크 및/또는 고랑(dips))에서의 카운트와 유의하게 상이한 카운트를 가진 하나 이상의 부분이 존재할 수 있다. 임의의 적합한 수의 부분과 관련된 임의의 적합한 수의 정규화된 또는 비-정규화된 카운트는 수준을 정의할 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 수준은 게놈의 부분들의 전부 또는 일부의 정규화된 또는 비-정규화된 카운트로부터 결정될 수 있다. 종종, 수준은 염색체 또는 이의 분절의 정규화된 또는 비-정규화된 카운트의 전부 또는 일부로부터 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 부분들(예를 들면, 부분의 세트)로부터 유도된 2개 이상의 카운트가 수준을 결정한다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 카운트(예를 들면, 2개 이상의 부분으로부터의 카운트)가 수준을 결정한다. 일부 실시양태에서, 2개 내지 약 100,000개의 부분으로부터의 카운트가 수준을 결정한다. 일부 실시양태에서, 2개 내지 약 50,000개, 2개 내지 약 40,000개, 2개 내지 약 30,000개, 2개 내지 약 20,000개, 2개 내지 약 10,000개, 2개 내지 약 5,000개, 2개 내지 약 2,500개, 2개 내지 약 1,250개, 2개 내지 약 1,000개, 2개 내지 약 500개, 2개 내지 약 250개, 2개 내지 약 100개, 또는 2개 내지 약 60개의 부분으로부터의 카운트가 수준을 결정한다. 일부 실시양태에서, 약 10개 내지 약 50개의 부분으로부터의 카운트가 수준을 결정한다. 일부 실시양태에서, 약 20개 내지 약 40개 이상의 부분으로부터의 카운트가 수준을 결정한다. 일부 실시양태에서, 수준은 약 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 45개, 50개, 55개 또는 60개 이상의 부분으로부터의 카운트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수준은 부분의 세트(예를 들면, 기준 게놈의 부분의 세트, 염색체의 부분의 세트 또는 염색체 분절의 부분의 세트)에 상응한다.
일부 실시양태에서, 수준은 인접한 부분들의 정규화된 또는 비-정규화된 카운트에 대해 결정된다. 일부 실시양태에서, 인접한 부분들(예를 들면, 부분의 세트)은 게놈의 인접한 분절, 또는 염색체 또는 유전자의 인접한 분절을 표시한다. 예를 들면, 2개 이상의 인접한 부분들은 이들을 한 줄로 병합함으로써 정렬될 때 각각의 부분보다 더 긴 DNA 서열의 서열 조립체를 표시할 수 있다. 예를 들면, 2개 이상의 인접한 부분들은 온전한 게놈, 염색체, 유전자, 인트론, 엑손 또는 이들의 분절을 표시할 수 있다. 일부 실시양태에서, 수준은 인접한 부분들 및/또는 비-인접한 부분들의 집합체(예를 들면, 세트)로부터 측정된다.
상이한 수준
일부 실시양태에서, 정규화된 카운트의 프로파일은 프로파일 내의 또 다른 수준(예를 들면, 제2 수준)과 유의하게 상이한 수준(예를 들면, 제1 수준)을 포함한다. 제1 수준은 제2 수준보다 더 높을 수 있거나 낮을 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 수준은 카피 수 변이(예를 들면, 모체 카피 수 변이, 태아 카피 수 변이, 또는 모체 카피 수 변이 및 태아 카피 수 변이)를 포함하는 하나 이상의 리드를 포함하는 부분의 세트에 대한 수준이고, 제2 수준은 카피 수 변이를 실질적으로 갖지 않는 리드를 포함하는 부분의 세트에 대한 수준이다. 일부 실시양태에서, "유의하게 상이한"은 관찰가능한 차이를 지칭한다. 일부 실시양태에서, "유의하게 상이한"은 통계학적으로 상이한 또는 통계학적으로 유의한 차이를 지칭한다. 통계학적으로 유의한 차이는 종종 관찰된 차이의 통계학적 평가이다. 통계학적으로 유의한 차이는 당분야의 적합한 방법에 의해 평가될 수 있다. 임의의 적합한 역치 또는 범위를 사용하여 2개의 수준이 유의하게 상이한지를 확인할 수 있다. 일부 실시양태에서, 약 0.01% 이상(예를 들면, 수준 값들 중 하나 또는 어느 하나의 0.01%)만큼 상이한 2개의 수준(예를 들면, 평균 수준)은 유의하게 상이하다. 일부 실시양태에서, 약 0.1% 이상만큼 상이한 2개의 수준(예를 들면, 평균 수준)은 유의하게 상이하다. 일부 실시양태에서, 약 0.5% 이상만큼 상이한 2개의 수준(예를 들면, 평균 수준)은 유의하게 상이하다. 일부 실시양태에서, 약 0.5%, 0.75%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5% 또는 약 10% 이상만큼 상이한 2개의 수준(예를 들면, 평균 수준)은 유의하게 상이하다. 일부 실시양태에서, 2개의 수준(예를 들면, 평균 수준)은 유의하게 상이하고, 어느 한 수준에서 중첩되지 않고/않거나 1개 또는 2개의 수준에 대해 계산된 불확실성 값에 의해 정의된 범위에서 중첩되지 않는다. 일부 실시양태에서, 불확실성 값은 시그마로서 표현된 표준 편차이다. 일부 실시양태에서, 2개의 수준(예를 들면, 평균 수준)은 유의하게 상이하고 불확실성 값의 약 1배 이상(예를 들면, 1 시그마)만큼 상이하다. 일부 실시양태에서, 2개의 수준(예를 들면, 평균 수준)은 유의하게 상이하고 불확실성 값의 약 2배 이상(예를 들면, 2 시그마), 불확실성 값의 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상 또는 약 10배 이상만큼 상이하다. 일부 실시양태에서, 2개의 수준(예를 들면, 평균 수준)은 불확실성 값의 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 2.6배, 2.7배, 2.8배, 2.9배, 3.0배, 3.1배, 3.2배, 3.3배, 3.4배, 3.5배, 3.6배, 3.7배, 3.8배, 3.9배 또는 4.0배 이상만큼 상이할 때 유의하게 상이하다. 일부 실시양태에서, 2개의 수준 사이의 차이가 증가할 때 신뢰 수준이 증가한다. 일부 실시양태에서, 2개의 수준 사이의 차이가 감소할 때 및/또는 불확실성 값이 증가할 때 신뢰 수준이 감소한다. 예를 들면, 종종 신뢰 수준은 수준과 표준 편차(예를 들면, MAD) 사이의 차이의 비와 함께 증가한다.
하나 이상의 예측 알고리즘이 서로 독립적으로 또는 의존적으로 가중될 수 있는 변수 조건 하에서 수집된 검출 데이터에 대한 유의성을 확인하거나 의미를 부여하는 데에 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "변수"는 값 또는 값의 세트를 가진 알고리즘의 인자, 양 또는 함수를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 부분의 제1 세트는 종종 부분의 제2 세트와 상이한(예를 들면, 중첩되지 않는) 부분을 포함한다. 예를 들면, 종종 정규화된 카운트의 제1 수준은 프로파일 내의 정규화된 카운트의 제2 수준과 유의하게 상이하고, 제1 수준은 부분의 제1 세트에 대한 수준이고, 제2 수준은 부분의 제2 세트에 대한 수준이고, 부분은 부분의 제1 세트 및 부분의 제2 세트에서 중첩되지 않는다. 일부 실시양태에서, 부분의 제1 세트는 부분의 제2 세트의 서브세트가 아니고, 이 세트들로부터 각각 제1 수준 및 제2 수준이 측정된다. 일부 실시양태에서, 부분의 제1 세트는 부분의 제2 세트와 상이하고/하거나 구별되고, 이 세트들로부터 각각 제1 수준 및 제2 수준이 측정된다.
일부 실시양태에서, 부분의 제1 세트는 프로파일 내의 부분의 제2 세트의 서브세트이다. 예를 들면, 종종 프로파일 내의 부분의 제2 세트에 대한 정규화된 카운트의 제2 수준은 프로파일 내의 제1 수준에 대한 부분의 제1 세트의 정규화된 카운트를 포함하고, 부분의 제1 세트는 프로파일 내의 부분의 제2 세트의 서브세트이다. 일부 실시양태에서, 평균치, 평균 또는 중간 수준은 제2 수준으로부터 유도되고, 이때 제2 수준은 제1 수준을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 수준은 전체 염색체를 표시하는 부분의 제2 세트를 포함하고, 제1 수준은 부분의 제1 세트를 포함하고, 이때 부분의 제1 세트는 부분의 제2 세트의 서브세트이고, 제1 수준은 염색체에 존재하는 모체 카피 수 변이, 태아 카피 수 변이, 또는 모체 카피 수 변이 및 태아 카피 수 변이를 표시한다.
일부 실시양태에서, 제2 수준의 값은 제1 수준보다 염색체 또는 이의 분절에 대한 카운트 프로파일의 평균, 평균치 또는 중간 수준에 더 가깝다. 일부 실시양태에서, 제2 수준은 염색체, 염색체의 부분 또는 이의 분절의 평균 수준이다. 일부 실시양태에서, 제1 수준은 염색체 또는 이의 분절을 표시하는 우세한 수준(예를 들면, 제2 수준)과 유의하게 상이하다. 프로파일은 제2 수준과 유의하게 상이한 다수의 제1 수준을 포함할 수 있고, 각각의 제1 수준은 독립적으로 제2 수준보다 더 높을 수 있거나 낮을 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 수준 및 제2 수준은 동일한 염색체로부터 유래하고, 제1 수준은 제2 수준보다 더 높거나 더 낮고, 제2 수준은 염색체의 우세한 수준이다. 일부 실시양태에서, 제1 수준 및 제2 수준은 동일한 염색체로부터 유래하고, 제1 수준은 카피 수 변이(예를 들면, 모체 및/또는 태아 카피 수 변이, 결실, 삽입, 중복)를 표시하고, 제2 수준은 염색체 또는 이의 분절에 대한 부분의 평균 수준 또는 우세한 수준이다.
일부 실시양태에서, 제2 수준에 대한 부분의 제2 세트에서의 리드는 유전적 변이(예를 들면, 카피 수 변이, 모체 및/또는 태아 카피 수 변이)를 실질적으로 포함하지 않는다. 종종, 제2 수준에 대한 부분의 제2 세트는 일부 가변성(예를 들면, 수준의 가변성, 부분에 대한 카운트의 가변성)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 존재하지 않는 카피 수 변이와 관련된 수준에 대한 부분의 세트 내의 하나 이상의 부분은 모체 및/또는 태아 게놈에 존재하는 카피 수 변이를 가진 하나 이상의 리드를 포함한다. 예를 들면, 종종 부분의 세트는 염색체의 작은 분절(예를 들면, 10개 미만의 부분)에 존재하는 카피 수 변이를 포함하고, 상기 부분의 세트는 실질적으로 존재하지 않는 카피 수 변이와 관련된 수준에 대한 부분의 세트이다. 따라서, 카피 수 변이를 실질적으로 포함하지 않는 부분의 세트는 수준의 약 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 미만의 부분에 존재하는 카피 수 변이를 여전히 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 수준은 부분의 제1 세트에 대한 수준이고, 제2 수준은 부분의 제2 세트에 대한 수준이고, 부분의 제1 세트와 부분의 제2 세트는 인접한다(예를 들면, 염색체 또는 이의 분절의 핵산 서열 면에서 인접한다). 일부 실시양태에서, 부분의 제1 세트와 부분의 제2 세트는 인접하지 않는다.
태아 핵산과 모체 핵산의 혼합물로부터의 상대적으로 짧은 서열 리드를 사용하여 수준 및/또는 프로파일로 변환될 수 있는 카운트를 제공할 수 있다. 카운트, 수준 및 프로파일은 전자적 또는 유형의 형태로 도식화될 수 있고 가시화될 수 있다. (예를 들면, 수준 및/또는 프로파일로서 표시되는) 부분들에 맵핑된 카운트는 태아 및/또는 임신 여성에 존재하는 태아 및/또는 모체 게놈, 염색체, 또는 염색체의 부분 또는 분절의 가시적 표시치를 제공할 수 있다.
기준 수준 및 정규화된 기준 값
일부 실시양태에서, 프로파일은 기준 수준(예를 들면, 기준물로서 사용된 수준)을 포함한다. 종종, 정규화된 카운트의 프로파일은 기준 수준을 제공하고, 이 기준 수준으로부터 기대 수준 및 기대 범위가 결정된다(기대 수준 및 범위에 대해서는 하기 논의를 참조한다). 기준 수준은 종종 모체 및 태아 둘 다로부터의 맵핑된 리드를 포함하는 부분의 정규화된 카운트에 대한 수준이다. 기준 수준은 종종 태아 및 모체(예를 들면, 임신 여성)로부터의 맵핑된 리드의 정규화된 카운트의 합계이다. 일부 실시양태에서, 기준 수준은 정배수체 모체 및/또는 정배수체 태아로부터의 맵핑된 리드를 포함하는 부분에 대한 수준이다. 일부 실시양태에서, 기준 수준은 태아 및/또는 모체 유전적 변이(예를 들면, 이배수성(예를 들면, 삼염색체성), 카피 수 변이, 미세중복, 미세결실, 삽입)를 가진 맵핑된 리드를 포함하는 부분에 대한 수준이다. 일부 실시양태에서, 기준 수준은 모체 및/또는 태아 유전적 변이(예를 들면, 이배수성(예를 들면, 삼염색체성), 카피 수 변이, 미세중복, 미세결실, 삽입)를 실질적으로 포함하지 않는 부분에 대한 수준이다. 일부 실시양태에서, 제2 수준은 기준 수준으로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 프로파일은 정규화된 카운트의 제1 수준 및 정규화된 카운트의 제2 수준을 포함하고, 제1 수준은 제2 수준과 유의하게 상이하고, 제2 수준은 기준 수준이다. 일부 실시양태에서, 프로파일은 부분의 제1 세트에 대한 정규화된 카운트의 제1 수준 및 부분의 제2 세트에 대한 정규화된 카운트의 제2 수준을 포함하고, 부분의 제1 세트는 모체 및/또는 태아 카피 수 변이를 가진 맵핑된 리드를 포함하고, 부분의 제2 세트는 모체 카피 수 변이 및/또는 태아 카피 수 변이를 실질적으로 갖지 않는 맵핑된 리드를 포함하고, 제2 수준은 기준 수준이다.
일부 실시양태에서, 프로파일의 하나 이상의 수준에 대한 부분들에 맵핑된 카운트는 기준 수준의 카운트에 따라 정규화된다. 일부 실시양태에서, 기준 수준의 카운트에 따라 수준의 카운트를 정규화하는 것은 수준의 카운트를 기준 수준의 카운트, 또는 이의 배수 또는 분율로 나누는 것을 포함한다. 기준 수준의 카운트에 따라 정규화된 카운트는 종종 또 다른 프로세스(예를 들면, PERUN)에 따라 정규화되고, 기준 수준의 카운트도 종종 (예를 들면, PERUN에 의해) 정규화된다. 일부 실시양태에서, 수준의 카운트는 기준 수준의 카운트에 따라 정규화되고, 기준 수준의 카운트는 정규화 전 또는 후에 적합한 값까지 크기 조정될 수 있다. 기준 수준의 카운트를 크기 조정하는 프로세스는 임의의 적합한 상수(즉, 수)를 포함할 수 있고, 임의의 적합한 수학적 조작이 기준 수준의 카운트에 적용될 수 있다.
정규화된 기준 값(NRV)은 종종 기준 수준의 정규화된 카운트에 따라 측정된다. NRV의 측정은 기준 수준의 카운트에 적용된 임의의 적합한 정규화 프로세스(예를 들면, 수학적 조작)을 포함할 수 있고, 이때 동일한 정규화 프로세스가 동일한 프로파일 내의 다른 수준의 카운트를 정규화하는 데에 사용된다. NRV의 측정은 종종 기준 수준을 그 자체로 나누는 것을 포함한다. NRV의 측정은 종종 기준 수준을 그 자체의 배수로 나누는 것을 포함한다. NRV의 측정은 종종 기준 수준을 기준 수준 및 상수(예를 들면, 임의의 수)의 합계 또는 차이로 나누는 것을 포함한다.
NRV는 종종 널(null) 값으로서 지칭된다. NRV는 임의의 적합한 값일 수 있다. 일부 실시양태에서, NRV는 0 이외의 임의의 값이다. 일부 실시양태에서, NRV는 정수이다. 일부 실시양태에서, NRV는 양의 정수이다. 일부 실시양태에서, NRV는 1, 10, 100 또는 1000이다. 종종, NRV는 1과 동등하다. 일부 실시양태에서, NRV는 0과 동등하다. 기준 수준의 카운트는 임의의 적합한 NRV로 정규화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기준 수준의 카운트는 0의 NRV로 정규화된다. 종종, 기준 수준의 카운트는 1의 NRV로 정규화된다.
기대 수준
기대 수준은 종종 미리 정해진 수준(예를 들면, 이론적 수준, 예측된 수준)이다. "기대 수준"은 종종 본원에서 "소정의 수준 값"으로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, 기대 수준은 카피 수 변이를 포함하는 부분의 세트에 대한 정규화된 카운트의 수준에 대한 예측된 값이다. 일부 실시양태에서, 기대 수준은 카피 수 변이를 실질적으로 포함하지 않는 부분의 세트에 대해 결정된다. 기대 수준은 염색체 배수성(예를 들면, 0개, 1개, 2개(즉, 이배수체), 3개 또는 4개 염색체) 또는 미세배수성(동형접합 또는 이형접합 결실, 중복, 삽입 또는 이들의 부재)에 대해 결정될 수 있다. 종종, 기대 수준은 모체 미세배수성(예를 들면, 모체 및/또는 태아 카피 수 변이)에 대해 결정된다.
유전적 변이 또는 카피 수 변이에 대한 기대 수준은 임의의 적합한 방법에 의해 결정될 수 있다. 종종, 기대 수준은 수준(예를 들면, 수준에 대한 부분의 세트에 맵핑된 카운트)의 적합한 수학적 조작에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 기대 수준은 종종 기대 수준 상수로서 지칭되는 상수를 사용함으로써 결정된다. 카피 수 변이에 대한 기대 수준은 종종 기준 수준, 기준 수준의 정규화된 카운트 또는 NRV를 기대 수준 상수와 곱하거나, 기대 수준 상수를 더하거나, 기대 수준 상수를 빼거나 기대 수준 상수로 나눔으로써, 또는 이들의 조합된 조작에 의해 계산된다. 종종, 동일한 대상체, 샘플 또는 검사 군에 대해 측정된 기대 수준(예를 들면, 모체 및/또는 태아 카피 수 변이의 기대 수준)은 동일한 기준 수준 또는 NRV에 따라 결정된다.
종종, 기대 수준은 기준 수준, 기준 수준의 정규화된 카운트 또는 NRV를 기대 수준 상수와 곱함으로써 결정되고, 이때 기준 수준, 기준 수준의 정규화된 카운트 또는 NRV는 0과 동등하지 않다. 일부 실시양태에서, 기대 수준은 기대 수준 상수를 0과 동등한 기준 수준, 기준 수준의 정규화된 카운트 또는 NRV에 더함으로써 결정된다. 일부 실시양태에서, 기대 수준, 기준 수준의 정규화된 카운트, NRV 및 기대 수준 상수는 크기 조정가능하다. 크기조정하는 프로세스는 임의의 적합한 상수(즉, 수) 및 임의의 적합한 수학적 조작을 포함할 수 있고, 이때 동일한 크기조정 프로세스가 고려되는 모든 값들에게 적용된다.
기대 수준 상수
기대 수준 상수는 적합한 방법에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기대 수준 상수는 임의로 결정된다. 종종, 기대 수준 상수는 실험적으로 결정된다. 일부 실시양태에서, 기대 수준 상수는 수학적 조작에 따라 결정된다. 일부 실시양태에서, 기대 수준 상수는 기준물(예를 들면, 기준 게놈, 기준 샘플, 기준 검사 데이터)에 따라 결정된다. 일부 실시양태에서, 기대 수준 상수는 유전적 변이 또는 카피 수 변이(예를 들면, 중복, 삽입 또는 결실)의 존재 또는 부재를 표시하는 수준에 대해 예정된다. 일부 실시양태에서, 기대 수준 상수는 모체 카피 수 변이, 태아 카피 수 변이, 또는 모체 카피 수 변이 및 태아 카피 수 변이의 존재 또는 부재를 표시하는 수준에 대해 예정된다. 카피 수 변이에 대한 기대 수준 상수는 임의의 적합한 상수 또는 상수의 세트일 수 있다.
일부 실시양태에서, 동형접합 중복(예를 들면, 동형접합 중복)에 대한 기대 수준 상수는 약 1.6 내지 약 2.4, 약 1.7 내지 약 2.3, 약 1.8 내지 약 2.2, 또는 약 1.9 내지 약 2.1일 수 있다. 일부 실시양태에서, 동형접합 중복에 대한 기대 수준 상수는 약 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3 또는 약 2.4이다. 종종, 동형접합 중복에 대한 기대 수준 상수는 약 1.90, 1.92, 1.94, 1.96, 1.98, 2.0, 2.02, 2.04, 2.06, 2.08 또는 약 2.10이다. 종종, 동형접합 중복에 대한 기대 수준 상수는 약 2이다.
일부 실시양태에서, 이형접합 중복(예를 들면, 동형접합 중복)에 대한 기대 수준 상수는 약 1.2 내지 약 1.8, 약 1.3 내지 약 1.7, 또는 약 1.4 내지 약 1.6이다. 일부 실시양태에서, 이형접합 중복에 대한 기대 수준 상수는 약 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7 또는 약 1.8이다. 종종, 이형접합 중복에 대한 기대 수준 상수는 약 1.40, 1.42, 1.44, 1.46, 1.48, 1.5, 1.52, 1.54, 1.56, 1.58 또는 약 1.60이다. 일부 실시양태에서, 이형접합 중복에 대한 기대 수준 상수는 약 1.5이다.
일부 실시양태에서, 카피 수 변이의 부재(예를 들면, 모체 카피 수 변이 및/또는 태아 카피 수 변이의 부재)에 대한 기대 수준 상수는 약 1.3 내지 약 0.7, 약 1.2 내지 약 0.8, 또는 약 1.1 내지 약 0.9이다. 일부 실시양태에서, 카피 수 변이의 부재에 대한 기대 수준 상수는 약 1.3, 1.2, 1.1, 1.0, 0.9, 0.8 또는 약 0.7이다. 종종, 카피 수 변이의 부재에 대한 기대 수준 상수는 약 1.09, 1.08, 1.06, 1.04, 1.02, 1.0, 0.98, 0.96, 0.94 또는 약 0.92이다. 일부 실시양태에서, 카피 수 변이의 부재에 대한 기대 수준 상수는 약 1이다.
일부 실시양태에서, 이형접합 결실(예를 들면, 모체, 태아, 또는 모체 및 태아 이형접합 결실)에 대한 기대 수준 상수는 약 0.2 내지 약 0.8, 약 0.3 내지 약 0.7, 또는 약 0.4 내지 약 0.6이다. 일부 실시양태에서, 이형접합 결실에 대한 기대 수준 상수는 약 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 또는 약 0.8이다. 종종 이형접합 결실에 대한 기대 수준 상수는 약 0.40, 0.42, 0.44, 0.46, 0.48, 0.5, 0.52, 0.54, 0.56, 0.58 또는 약 0.60이다. 일부 실시양태에서, 이형접합 결실에 대한 기대 수준 상수는 약 0.5이다.
일부 실시양태에서, 동형접합 결실(예를 들면, 동형접합 결실)에 대한 기대 수준 상수는 약 -0.4 내지 약 0.4, 약 -0.3 내지 약 0.3, 약 -0.2 내지 약 0.2, 또는 약 -0.1 내지 약 0.1일 수 있다. 일부 실시양태에서, 동형접합 결실에 대한 기대 수준 상수는 약 -0.4, -0.3, -0.2, -0.1, 0.0, 0.1, 0.2, 0.3 또는 약 0.4이다. 종종, 동형접합 결실에 대한 기대 수준 상수는 약 -0.1, -0.08, -0.06, -0.04, -0.02, 0.0, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08 또는 약 0.10이다. 종종, 동형접합 결실에 대한 기대 수준 상수는 약 0이다.
기대 수준 범위
일부 실시양태에서, 유전적 변이 또는 카피 수 변이(예를 들면, 모체 카피 수 변이, 태아 카피 수 변이, 또는 모체 카피 수 변이 및 태아 카피 수 변이)의 존재 또는 부재는 기대 수준 범위 내에 또는 밖에 속하는 수준에 의해 확인된다. 기대 수준 범위는 종종 기대 수준에 따라 결정된다. 일부 실시양태에서, 기대 수준 범위는 유전적 변이를 실질적으로 포함하지 않거나 카피 수 변이를 실질적으로 포함하지 않는 수준에 대해 결정된다. 적합한 방법이 기대 수준 범위를 결정하는 데에 이용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 기대 수준 범위는 수준에 대해 계산된 적합한 불확실성 값에 따라 정의된다. 불확실성 값의 비한정적 예는 표준 편차, 표준 오차, 계산된 분산, p-값 및 평균 절대 편차(MAD)이다. 일부 실시양태에서, 유전적 변이 또는 카피 수 변이에 대한 기대 수준 범위는 부분적으로 수준(예를 들면, 제1 수준, 제2 수준, 제1 수준 및 제2 수준)에 대한 불확실성 값을 계산함으로써 결정된다. 일부 실시양태에서, 기대 수준 범위는 프로파일(예를 들면, 염색체 또는 이의 분절에 대한 정규화된 카운트의 프로파일)에 대해 계산된 불확실성 값에 따라 한정된다. 일부 실시양태에서, 불확실성 값은 유전적 변이를 실질적으로 포함하지 않거나 카피 수 변이를 실질적으로 포함하지 않는 수준에 대해 계산된다. 일부 실시양태에서, 불확실성 값은 제1 수준, 제2 수준, 또는 제1 수준 및 제2 수준에 대해 계산된다. 일부 실시양태에서, 불확실성 값은 제1 수준, 제2 수준, 또는 제1 수준을 포함하는 제2 수준에 대해 결정된다.
기대 수준 범위는 종종 부분적으로 불확실성 값을 상수(예를 들면, 소정의 상수) n과 곱하거나, n에 더하거나, n으로부터 빼거나 n으로 나눔으로써 계산된다. 적합한 수학적 절차 또는 절차들의 조합이 이용될 수 있다. 상수 n(예를 들면, 소정의 상수 n)은 종종 신뢰 구간으로서 지칭된다. 선택된 신뢰 구간은 선택된 상수 n에 따라 결정된다. 상수 n(예를 들면, 소정의 상수 n, 신뢰 구간)은 적합한 방식에 의해 결정될 수 있다. 상수 n은 0보다 큰 수 또는 0보다 큰 수의 분율일 수 있다. 상수 n은 정수일 수 있다. 종종, 상수 n은 10 미만의 수이다. 일부 실시양태에서, 상수 n은 약 10 미만, 약 9 미만, 약 8 미만, 약 7 미만, 약 6 미만, 약 5 미만, 약 4 미만, 약 3 미만 또는 약 2 미만의 수이다. 일부 실시양태에서, 상수 n은 약 10, 9.5, 9, 8.5, 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2 또는 1이다. 상수 n은 공지된 유전적 소인을 가진 대상체(임신 여성 및/또는 태아)로부터 유도된 데이터로부터 실험적으로 결정될 수 있다.
종종, 불확실성 값 및 상수 n은 범위(예를 들면, 불확실성 컷오프)를 한정한다. 예를 들면, 종종 불확실성 값은 표준 편차(예를 들면, +/- 5)이고 상수 n(예를 들면, 신뢰 구간)을 곱하여 범위 또는 불확실성 컷오프(예를 들면, 5n 내지 -5n)를 한정한다.
일부 실시양태에서, 유전적 변이(예를 들면, 모체 카피 수 변이, 태아 카피 수 변이, 또는 모체 카피 수 변이 및 태아 카피 수 변이)에 대한 기대 수준 범위는 기대 수준 + 상수 n x 불확실성(예를 들면, n x 시그마(예를 들면, 6 시그마))의 합계이다. 일부 실시양태에서, k로 표시되는 유전적 변이 또는 카피 수 변이에 대한 기대 수준 범위는 하기 식에 의해 한정될 수 있다:
식 R: (기대 수준 범위) k = (기대 수준) k + nσ
상기 식에서, σ는 불확실성 값이고, n은 상수(예를 들면, 소정의 상수)이고, 기대 수준 범위 및 기대 수준은 유전적 변이 k(예를 들면, k = 이형접합 결실, 예를 들면, k = 유전적 변이의 부재)에 대한 것이다. 예를 들면, 기대 수준이 1과 동등하고(예를 들면, 카피 수 변이의 부재) 불확실성 값(즉, σ)이 +/- 0.05와 동등하고 n이 3인 경우, 기대 수준 범위는 1.15 내지 0.85로서 한정된다. 일부 실시양태에서, 이형접합 중복에 대한 기대 수준 범위는 이형접합 중복에 대한 기대 수준이 1.5이고 n이 3이고 불확실성 값 σ가 +/- 0.05일 때 1.65 내지 1.35로서 결정된다. 일부 실시양태에서, 이형접합 결실에 대한 기대 수준 범위는 이형접합 중복에 대한 기대 수준이 0.5이고 n이 3이고 불확실성 값 σ가 +/- 0.05일 때 0.65 내지 0.35로서 결정된다. 일부 실시양태에서, 동형접합 중복에 대한 기대 수준 범위는 이형접합 중복에 대한 기대 수준이 2.0이고 n이 3이고 불확실성 값 σ가 +/- 0.05일 때 2.15 내지 1.85로서 결정된다. 일부 실시양태에서, 동형접합 결실에 대한 기대 수준 범위는 이형접합 중복에 대한 기대 수준이 0.0이고 n이 3이고 불확실성 값 σ가 +/- 0.05일 때 0.15 내지 -0.15로서 결정된다.
일부 실시양태에서, 동형접합 카피 수 변이(예를 들면, 모체, 태아, 또는 모체 및 태아 동형접합 카피 수 변이)에 대한 기대 수준 범위는 부분적으로 상응하는 이형접합 카피 수 변이에 대한 기대 수준 범위에 따라 결정된다. 예를 들면, 종종 동형접합 중복에 대한 기대 수준 범위는 이형접합 중복에 대한 기대 수준 범위의 상한보다 큰 모든 값들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 동형접합 중복에 대한 기대 수준 범위는 이형접합 중복에 대한 기대 수준 범위의 상한 이상의 모든 값들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 동형접합 중복에 대한 기대 수준 범위는 이형접합 중복에 대한 기대 수준 범위의 상한보다 더 크고 식 R에 의해 한정된 상한보다 작은 모든 값들을 포함하고, 이때 σ는 불확실성 값이고 양의 값이며, n은 상수이고, k는 동형접합 중복이다. 일부 실시양태에서, 동형접합 중복에 대한 기대 수준 범위는 이형접합 중복에 대한 기대 수준 범위의 상한 이상이고 식 R에 의해 한정된 상한 이하인 모든 값들을 포함하고, 이때 σ는 불확실성 값이고 σ는 양의 값이며, n은 상수이고, k는 동형접합 중복이다.
일부 실시양태에서, 동형접합 결실에 대한 기대 수준 범위는 이형접합 결실에 대한 기대 수준 범위의 하한보다 작은 모든 값들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 동형접합 결실에 대한 기대 수준 범위는 이형접합 결실에 대한 기대 수준 범위의 하한 이하인 모든 값들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 동형접합 결실에 대한 기대 수준 범위는 이형접합 결실에 대한 기대 수준 범위의 하한보다 더 작고 식 R에 의해 한정된 하한보다 큰 모든 값들을 포함하고, 이때 σ는 불확실성 값이고 σ는 음의 값이며, n은 상수이고, k는 동형접합 결실이다. 일부 실시양태에서, 동형접합 결실에 대한 기대 수준 범위는 이형접합 결실에 대한 기대 수준 범위의 하한 이하이고 식 R에 의해 한정된 하한 이상인 모든 값들을 포함하고, 이때 σ는 불확실성 값이고 σ는 음의 값이며, n은 상수이고, k는 동형접합 결실이다.
불확실성 값은 역치 값을 결정하는 데에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 범위(예를 들면, 역치 범위)는 미가공 카운트, 필터링된 카운트 및/또는 정규화된 카운트로부터 결정된 불확실성 값을 계산함으로써 수득된다. 일부 실시양태에서, 범위는 수준(예를 들면, 수준의 정규화된 카운트)에 대한 불확실성 값을, 컷오프 역치로서 선택된 불확실성의 배수(예를 들면, 표준 편차의 수)를 나타내는 소정의 상수(예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6 등)와 곱하여(예를 들면, 3 표준 편차의 경우 3과 곱하여) 범위를 생성함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 범위는 값(예를 들면, 소정의 값, 불확실성 값, 소정의 상수와 곱해진 불확실성 값)을 수준에 더하고/더하거나 수준으로부터 빼어 범위를 생성함으로써 결정될 수 있다. 예를 들면, 수준이 1과 동등하고 표준 편차가 +/- 0.2이고 소정의 상수가 3인 경우, 범위는 (1 + 3(0.2)) 내지 (1 + 3(-0.2)), 또는 1.6 내지 0.4로서 계산될 수 있다. 범위는 종종 카피 수 변이에 대한 기대 범위 또는 기대 수준 범위를 한정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 역치 값을 초과하거나, 범위 밖에 속하거나 값의 범위 내에 속하는 부분들의 일부 또는 전부가 정규화 프로세스의 일부로서, 또는 정규화 프로세스의 전 또는 후에 제거된다. 일부 실시양태에서, 계산된 역치 값을 초과하거나, 범위 밖에 또는 범위 내에 속하는 부분들의 일부 또는 전부가 정규화 또는 분류 프로세스의 일부로서, 또는 정규화 또는 분류 프로세스 전에 가중되거나 조절된다. 가중의 예는 본원에 기재되어 있다. 본원에서 사용된 용어 "중복 데이터" 및 "중복 맵핑된 리드"는 게놈 위치(예를 들면, 염기 위치)에 이미 할당되어 있고/있거나 부분에 대해 카운팅되어 있는 것으로 확인되는, 샘플로부터 유래한 서열 리드를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 불확실성 값은 하기 식에 따라 결정된다:
Figure 112016006621635-pct00001
상기 식에서, Z는 2개의 수준 사이의 표준화된 편차를 표시하고, L은 평균(중간) 수준이고, 시그마는 표준 편차(또는 MAD)이다. 아래첨자 0은 프로파일의 분절(예를 들면, 제2 수준, 염색체, NRV, "정배수체 수준", 카피 수 변이 부재를 표시하는 수준)를 표시하고, A는 프로파일의 또 다른 분절(예를 들면, 제1 수준, 카피 수 변이를 표시하는 수준, 이배수성(예를 들면, 삼염색체성)을 표시하는 수준)을 표시한다. 변수 N0는 아래첨자 0으로 표시된 프로파일의 분절 내의 부분의 총수를 표시한다. NA는 아래첨자 A로 표시된 프로파일의 분절 내의 부분의 총수를 표시한다.
카피 수 변이의 분류
또 다른 수준(예를 들면, 제2 수준)과 유의하게 상이한 수준(예를 들면, 제1 수준)은 종종 기대 수준 범위에 따라 카피 수 변이(예를 들면, 모체 및/또는 태아 카피 수 변이, 태아 카피 수 변이, 결실, 중복, 삽입)로서 분류될 수 있다. 일부 실시양태에서, 카피 수 변이의 존재는 제1 수준이 제2 수준과 유의하게 상이하고 제1 수준이 카피 수 변이에 대한 기대 수준 범위 내에 속할 때 분류된다. 예를 들면, 카피 수 변이(예를 들면, 모체 및/또는 태아 카피 수 변이, 태아 카피 수 변이)는 제1 수준이 제2 수준과 유의하게 상이하고 제1 수준이 카피 수 변이에 대한 기대 수준 범위 내에 속할 때 분류될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이형접합 중복(예를 들면, 모체 또는 태아, 또는 모체 및 태아 이형접합 중복) 또는 이형접합 결실(예를 들면, 모체 또는 태아, 또는 모체 및 태아 이형접합 결실)은 제1 수준이 제2 수준과 유의하게 상이하고 제1 수준이 각각 이형접합 중복 또는 이형접합 결실에 대한 기대 수준 범위 내에 속할 때 분류된다. 일부 실시양태에서, 동형접합 중복 또는 동형접합 결실은 제1 수준이 제2 수준과 유의하게 상이하고 제1 수준이 각각 동형접합 중복 또는 동형접합 결실에 대한 기대 수준 범위 내에 속할 때 분류된다.
수준 조절
일부 실시양태에서, 하나 이상의 수준은 조절된다. 수준을 조절하는 프로세스는 종종 패딩으로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, 프로파일(예를 들면, 게놈의 프로파일, 염색체 프로파일, 염색체의 부분 또는 분절의 프로파일) 내의 다수의 수준은 조절된다. 일부 실시양태에서, 프로파일 내의 약 1개 내지 약 10,000개 이상의 수준은 조절된다. 일부 실시양태에서, 프로파일 내의 약 1개 내지 약 1,000개, 1개 내지 약 900개, 1개 내지 약 800개, 1개 내지 약 700개, 1개 내지 약 600개, 1개 내지 약 500개, 1개 내지 약 400개, 1개 내지 약 300개, 1개 내지 약 200개, 1개 내지 약 100개, 1개 내지 약 50개, 1개 내지 약 25개, 1개 내지 약 20개, 1개 내지 약 15개, 1개 내지 약 10개, 또는 1개 내지 약 5개의 수준은 조절된다. 일부 실시양태에서, 1개의 수준은 조절된다. 일부 실시양태에서, 제2 수준과 유의하게 상이한 수준(예를 들면, 정규화된 카운트 프로파일의 제1 수준)은 조절된다. 일부 실시양태에서, 카피 수 변이로서 분류된 수준은 조절된다. 일부 실시양태에서, 제2 수준과 유의하게 상이한 수준(예를 들면, 정규화된 카운트 프로파일의 제1 수준)은 카피 수 변이(예를 들면, 카피 수 변이, 예를 들면, 모체 카피 수 변이)로서 분류되고 조절된다. 일부 실시양태에서, 수준(예를 들면, 제1 수준)은 모체 카피 수 변이, 태아 카피 수 변이, 또는 모체 카피 수 변이 및 태아 카피 수 변이에 대한 기대 수준 범위 내에 있고, 상기 수준은 조절된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 수준(예를 들면, 프로파일 내의 수준)은 조절되지 않는다. 일부 실시양태에서, 수준(예를 들면, 제1 수준)은 카피 수 변이에 대한 기대 수준 범위 밖에 있고, 상기 수준은 조절되지 않는다. 종종, 카피 수 변이의 부재에 대한 기대 수준 범위 내의 수준은 조절되지 않는다. 프로파일 내의 하나 이상의 수준에 대한 임의의 적합한 수의 조절을 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 수준은 조절된다. 일부 실시양태에서, 2개 이상, 3개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 종종 10개 이상의 수준은 조절된다.
일부 실시양태에서, 제1 수준의 값은 제2 수준의 값에 따라 조절된다. 일부 실시양태에서, 카피 수 변이를 표시하는 것으로서 확인된 제1 수준은 제2 수준의 값으로 조절되고, 이때 제2 수준은 종종 카피 수 변이의 부재와 관련되어 있다. 일부 실시양태에서, 카피 수 변이를 표시하는 것으로서 확인된 제1 수준의 값은 제1 수준의 값이 제2 수준의 값과 거의 동등하도록 조절된다.
조절은 적합한 수학적 연산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조절은 하나 이상의 수학적 연산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수준은 정규화, 필터링, 평균 산출, 곱셈, 나눗셈, 덧셈 또는 뺄셈, 또는 이들의 조합에 의해 조절된다. 일부 실시양태에서, 수준은 소정의 값 또는 상수에 의해 조절된다. 일부 실시양태에서, 수준은 수준의 값을 또 다른 수준의 값으로 변경시킴으로써 조절된다. 예를 들면, 제1 수준은 그의 값을 제2 수준의 값으로 변경시킴으로써 조절될 수 있다. 이러한 경우 값은 프로세싱된 값(예를 들면, 평균, 정규화된 값 등)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 수준은 카피 수 변이(예를 들면, 모체 카피 수 변이)로서 분류되고 본원에서 소정의 조절 값(PAV)으로서 지칭되는 소정의 값에 따라 조절된다. 종종, PAV는 특정 카피 수 변이에 대해 결정된다. 종종, 특정 카피 수 변이(예를 들면, 동형접합 중복, 동형접합 결실, 이형접합 중복, 이형접합 결실)에 대해 결정된 PAV는 특정 카피 수 변이(예를 들면, 동형접합 중복, 동형접합 결실, 이형접합 중복, 이형접합 결실)로서 분류된 수준을 조절하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 수준은 카피 수 변이로서 분류된 후 분류된 카피 수 변이의 종류에 대한 특이성을 가진 PAV에 따라 조절된다. 일부 실시양태에서, 수준(예를 들면, 제1 수준)은 모체 카피 수 변이, 태아 카피 수 변이, 또는 모체 카피 수 변이 및 태아 카피 수 변이로서 분류되고 PAV를 상기 수준에 더하거나 상기 수준으로부터 뺌으로써 조절된다. 종종, 수준(예를 들면, 제1 수준)은 모체 카피 수 변이로서 분류되고 PAV를 상기 수준에 더함으로써 조절된다. 예를 들면, 중복(예를 들면, 모체, 태아, 또는 모체 및 태아 동형접합 중복)으로서 분류된 수준은 특정 중복(예를 들면, 동형접합 중복)에 대해 결정된 PAV를 더하여 조절된 수준을 제공함으로써 조절될 수 있다. 종종, 카피 수 중복에 대해 결정된 PAV는 음의 값이다. 일부 실시양태에서, 중복에 대해 결정된 PAV를 사용함으로써 중복을 표시하는 수준으로의 조절을 제공하는 것은 상기 수준의 값을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 수준과 유의하게 상이한 수준(예를 들면, 제1 수준)은 카피 수 결실(예를 들면, 동형접합 결실, 이형접합 결실, 동형접합 중복, 동형접합 중복)로서 분류되고, 제1 수준은 카피 수 결실에 대해 결정된 PAV를 더함으로써 조절된다. 종종, 카피 수 결실에 대해 결정된 PAV는 양의 값이다. 일부 실시양태에서, 결실에 대해 결정된 PAV를 사용함으로써 결실을 표시하는 수준으로의 조절을 제공하는 것은 상기 수준의 값을 증가시킨다.
PAV는 임의의 적합한 값일 수 있다. 종종, PAV는 카피 수 변이(예를 들면, 분류된 카피 수 변이)에 따라 결정되고 이러한 카피 수 변이에 대한 특이성을 가진다. 일부 실시양태에서, PAV는 카피 수 변이(예를 들면, 분류된 카피 수 변이)에 대한 기대 수준 및/또는 PAV 계수에 따라 결정된다. PAV는 종종 기대 수준을 PAV 계수와 곱함으로써 결정된다. 예를 들면, 카피 수 변이에 대한 PAV는 카피 수 변이(예를 들면, 이형접합 결실)에 대해 결정된 기대 수준을 동일한 카피 수 변이(예를 들면, 이형접합 결실)에 대해 결정된 PAV 계수와 곱함으로써 결정될 수 있다. 예를 들면, 카피 수 변이 k(예를 들면, k = 이형접합 결실)에 대한 PAV는 하기 식에 의해 결정될 수 있다:
PAV k = (기대 수준) k x (PAV 계수) k
PAV 계수는 임의의 적합한 값일 수 있다. 일부 실시양태에서, 동형접합 중복에 대한 PAV 계수는 약 -0.6 내지 약 -0.4이다. 일부 실시양태에서, 동형접합 중복에 대한 PAV 계수는 약 -0.60, -0.59, -0.58, -0.57, -0.56, -0.55, -0.54, -0.53, -0.52, -0.51, -0.50, -0.49, -0.48, -0.47, -0.46, -0.45, -0.44, -0.43, -0.42, -0.41 또는 -0.40이다. 종종, 동형접합 중복에 대한 PAV 계수는 약 -0.5이다.
예를 들면, NRV가 약 1이고 동형접합 중복에 대한 기대 수준이 약 2와 동등한 경우, 동형접합 중복에 대한 PAV는 상기 식에 따라 약 -1로서 결정된다. 이 경우, 동형접합 중복으로서 분류된 제1 수준은 예를 들면, 약 -1을 제1 수준의 값에 더함으로써 조절된다.
일부 실시양태에서, 이형접합 중복에 대한 PAV 계수는 약 -0.4 내지 약 -0.2이다. 일부 실시양태에서, 이형접합 중복에 대한 PAV 계수는 약 -0.40, -0.39, -0.38, -0.37, -0.36, -0.35, -0.34, -0.33, -0.32, -0.31, -0.30, -0.29, -0.28, -0.27, -0.26, -0.25, -0.24, -0.23, -0.22, -0.21 또는 -0.20이다. 종종, 이형접합 중복에 대한 PAV 계수는 약 -0.33이다.
예를 들면, NRV가 약 1이고 이형접합 중복의 기대 수준이 약 1.5와 동등한 경우, 이형접합 중복에 대한 PAV는 상기 식에 따라 약 -0.495로서 결정된다. 이 경우, 이형접합 중복으로서 분류된 제1 수준은 예를 들면, 약 -0.495를 제1 수준의 값에 더함으로써 조절된다.
일부 실시양태에서, 이형접합 결실에 대한 PAV 계수는 약 0.4 내지 약 0.2이다. 일부 실시양태에서, 이형접합 결실에 대한 PAV 계수는 약 0.40, 0.39, 0.38, 0.37, 0.36, 0.35, 0.34, 0.33, 0.32, 0.31, 0.30, 0.29, 0.28, 0.27, 0.26, 0.25, 0.24, 0.23, 0.22, 0.21 또는 0.20이다. 종종, 이형접합 결실에 대한 PAV 계수는 약 0.33이다.
예를 들면, NRV가 약 1이고 이형접합 결실에 대한 기대 수준이 약 0.5와 동등한 경우, 이형접합 결실에 대한 PAV는 상기 식에 따라 약 -0.495로서 결정된다. 이 경우, 이형접합 결실로서 분류된 제1 수준은 예를 들면, 약 -0.495를 제1 수준의 값에 더함으로써 조절된다.
일부 실시양태에서, 동형접합 결실에 대한 PAV 계수는 약 0.6 내지 약 0.4이다. 일부 실시양태에서, 동형접합 결실에 대한 PAV 계수는 약 0.60, 0.59, 0.58, 0.57, 0.56, 0.55, 0.54, 0.53, 0.52, 0.51, 0.50, 0.49, 0.48, 0.47, 0.46, 0.45, 0.44, 0.43, 0.42, 0.41 또는 0.40이다. 종종, 동형접합 결실에 대한 PAV 계수는 약 0.5이다.
예를 들면, NRV가 약 1이고 동형접합 결실의 기대 수준이 약 0과 동등한 경우, 동형접합 결실에 대한 PAV는 상기 식에 따라 약 1로서 측정된다. 이 경우, 동형접합 결실로서 분류된 제1 수준은 예를 들면, 약 1을 제1 수준의 값에 더함으로써 조절된다.
일부 실시양태에서, PAV는 카피 수 변이에 대한 기대 수준(예를 들면, 카피 수 변이의 기대 수준)과 동등하거나 거의 동등하다.
일부 실시양태에서, 수준의 카운트는 조절을 수행하기 전에 정규화된다. 일부 실시양태에서, 프로파일 내의 일부 또는 모든 수준의 카운트는 조절을 수행하기 전에 정규화된다. 예를 들면, 수준의 카운트는 기준 수준의 카운트 또는 NRV에 따라 정규화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 수준(예를 들면, 제2 수준)의 카운트는 기준 수준의 카운트 또는 NRV에 따라 정규화되고, 프로파일 내의 모든 다른 수준(예를 들면, 제1 수준)의 카운트는 조절을 수행하기 전에 동일한 기준 수준의 카운트 또는 NRV에 비해 상대적으로 정규화된다.
일부 실시양태에서, 프로파일의 수준은 1회 이상의 조절로부터 생성된다. 일부 실시양태에서, 프로파일의 수준은 프로파일 내의 하나 이상의 수준이 조절된 후 측정된다. 일부 실시양태에서, 프로파일의 수준은 1회 이상의 조절이 수행된 후 다시 계산된다.
일부 실시양태에서, 카피 수 변이(예를 들면, 모체 카피 수 변이, 태아 카피 수 변이, 또는 모체 카피 수 변이 및 태아 카피 수 변이)는 조절로부터 확인된다(예를 들면, 직접적으로 또는 간접적으로 확인된다). 예를 들면, 조절된 프로파일 내의 수준(예를 들면, 조절된 제1 수준)은 모체 카피 수 변이로서 확인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조절의 규모는 카피 수 변이(예를 들면, 이형접합 결실, 동형접합 중복 등)의 종류를 표시한다. 일부 실시양태에서, 프로파일 내의 조절된 수준은 카피 수 변이에 대한 PAV의 값에 따라 카피 수 변이를 표시하는 것으로서 확인될 수 있다. 예를 들면, 주어진 프로파일에 대한 PAV는 동형접합 중복의 경우 약 -1이고 이형접합 중복의 경우 약 -0.5이고 이형접합 결실의 경우 약 0.5이고 동형접합 결실의 경우 약 1이다. 상기 예에서, 예를 들면, 약 -1까지 조절된 수준은 동형접합 중복으로서 확인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 카피 수 변이는 1회 이상의 조절을 포함하는 프로파일 또는 수준으로부터 확인될 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로파일 내의 조절된 수준은 비교된다. 일부 실시양태에서, 예외 및 오류는 조절된 수준을 비교함으로써 확인된다. 예를 들면, 종종 프로파일 내의 하나 이상의 조절된 수준이 비교되고, 특정 수준이 예외 또는 오류로서 확인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예외 또는 오류는 수준을 구성하는 하나 이상의 부분 내에서 확인된다. 예외 또는 오류는 (예를 들면, 프로파일 내의) 동일한 수준, 또는 인접하는, 근접하는, 서로 접하는 또는 이웃하는 부분들을 표시하는 하나 이상의 수준 내에서 확인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 조절된 수준은 인접하는, 근접하는, 서로 접하는 또는 이웃하는 부분들의 수준이고, 이때 하나 이상의 조절된 수준이 비교되고, 예외 또는 오류가 확인된다. 예외 또는 오류는 프로파일 또는 수준에서의 피크 또는 고랑일 수 있고, 이때 피크 또는 고랑의 원인은 공지되어 있거나 공지되어 있지 않다. 일부 실시양태에서, 조절된 수준이 비교되고 예외 또는 오류가 확인되고, 이때 예외 또는 오류는 확률적, 시스템적, 무작위적 또는 사용자 오류에 기인한다. 일부 실시양태에서, 조절된 수준이 비교되고, 예외 또는 오류가 프로파일로부터 제거된다. 일부 실시양태에서, 조절된 수준이 비교되고, 예외 또는 오류가 조절된다.
태아 핵산 함량의 측정
일부 실시양태에서, 핵산 중의 태아 핵산의 양(예를 들면, 농도, 상대적 양, 절대적 양, 카피 수 등)이 측정된다. 일부 실시양태에서, 샘플 중의 태아 핵산의 양은 "태아 분획(fetal fraction)"으로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, "태아 분획"은 임신 여성으로부터 수득된 샘플(예를 들면, 혈액 샘플, 혈청 샘플, 혈장 샘플) 중의 세포 유리 순환 핵산 중의 태아 핵산 분획을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 유전적 변이가 확인되는 방법은 태아 분획을 측정하는 단계도 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전적 변이의 존재 또는 부재는 태아 분획(예를 들면, 샘플에 대한 태아 분획 측정)에 따라 확인된다. 태아 분획의 측정은 적합한 방식으로 수행될 수 있고, 이러한 방식의 비한정적 예는 이하에 기재된 방법들을 포함한다.
일부 실시양태에서, 태아 분획은 본원에 기재되어 있는 단편 길이 측정 방법을 이용함으로써 측정될 수 있다. 세포 무함유 태아 핵산 단편은 일반적으로 모체로부터 유래한 핵산 단편보다 더 짧다(예를 들면, 문헌(Chan et al. (2004) Clin. Chem. 50:88-92); 및 문헌(Lo et al. (2010) Sci. Transl. Med. 2:61ra91) 참조). 따라서, 일부 실시양태에서, 태아 분획은 특정 길이 역치 미만의 단편을 카운팅하고 카운트를 샘플 중의 총 핵산의 양과 비교함으로써 측정될 수 있다. 특정 길이의 핵산 단편을 카운팅하는 방법은 이하에 더 상세히 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 태아 핵산의 양은 남아 태아에 대한 특이성을 가진 마커(예를 들면, Y 염색체 STR 마커(예를 들면, DYS 19, DYS 385, DYS 392 마커); RhD 음성 여성에서 RhD 마커) 또는 다형성 서열의 대립형질 비에 따라, 또는 태아 핵산에 대한 특이성을 갖지만 모체 핵산에 대한 특이성을 갖지 않는 하나 이상의 마커(예를 들면, 모체와 태아 사이의 상이한 유전외적(epigenetic) 생체마커(예를 들면, 메틸화; 하기 더 상세히 기재됨), 또는 모체 혈액 혈장 중의 태아 RNA 마커에 따라 측정된다(예를 들면, 문헌(Lo, 2005, Journal of Histochemistry and Cytochemistry 53 (3): 293-296) 참조).
태아 핵산 함량(예를 들면, 태아 분획)의 측정은 종종 예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공보 제2010/0105049호에 기재된 태아 정량자 분석(FQA)을 이용함으로써 수행된다. 이러한 종류의 분석은 샘플 중의 핵산의 메틸화 상태를 기초로 모체 샘플에서 태아 핵산을 검출하고 정량할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 모체 샘플로부터의 태아 핵산의 양은 존재하는 핵산의 총량에 비해 상대적으로 측정되어 샘플 중의 태아 핵산의 백분율을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 태아 핵산의 카피 수가 모체 샘플에서 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 태아 핵산의 양은 정확한 염색체 용량 분석을 가능하게 할 정도로(예를 들면, 태아 이배수성의 존재 또는 부재를 검출할 정도로) 서열 특이적(또는 부분 특이적) 방식으로 종종 충분한 민감도로 측정될 수 있다.
태아 정량자 분석(FQA)은 본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법과 함께 수행될 수 있다. 이러한 분석은 당분야에서 공지되어 있고/있거나 미국 특허출원 공보 제2010/0105049호에 기재되어 있는 임의의 방법, 예를 들면, 상이한 메틸화 상태를 기초로 모체 DNA와 태아 DNA를 식별할 수 있는 방법에 의해 수행될 수 있고 태아 DNA를 정량(즉, 양을 측정)할 수 있다. 메틸화 상태를 기초로 핵산을 식별하는 방법은 예를 들면, MBD2의 메틸 결합 도메인이 항체의 Fc 단편에 융합되어 있는(MBD-FC) MBD2-Fc 단편(Gebhard et al. (2006) Cancer Res. 66(12):6118-28)을 사용한 메틸화 민감성 포획; 메틸화 특이적 항체; 중아황산 전환 방법, 예를 들면, MSP(메틸화 민감성 PCR), COBRA, 메틸화 민감성 단일 뉴클레오티드 프라이머 연장(Ms-SNuPE) 또는 시쿼놈 매스클레이브(Sequenom MassCLEAVE)™ 기술; 및 메틸화 민감성 제한 효소의 사용(예를 들면, 하나 이상의 메틸화 민감성 제한 효소를 사용하여 모체 샘플 중의 모체 DNA를 분해하여 태아 DNA를 농축하는 것)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 메틸 민감성 효소도 메틸화 상태를 기초로 핵산을 식별하는 데에 사용될 수 있는데, 상기 효소는 예를 들면, 그의 DNA 인식 서열이 메틸화되어 있지 않은 경우 이 인식 서열에서 우선적으로 또는 실질적으로 절단할 수 있거나 분해할 수 있다. 따라서, 메틸화되지 않은 DNA 샘플은 메틸화된 DNA 샘플보다 작은 단편으로 절단될 것이고, 과다메틸화된 DNA 샘플은 절단되지 않을 것이다. 명확히 언급된 경우를 제외하고, 메틸화 상태를 기초로 핵산을 식별하는 임의의 방법이 본원의 기술의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다. 태아 DNA의 양은 예를 들면, 증폭 반응 동안 공지된 농도로 하나 이상의 경쟁자를 도입함으로써 측정될 수 있다. 태아 DNA의 양의 측정은 예를 들면, RT-PCR, 프라이머 연장, 서열결정 및/또는 카운팅에 의해 수행될 수도 있다. 일부 경우, 핵산의 양은 미국 특허출원 공보 제2007/0065823호에 기재된 BEAMing 기술을 이용함으로써 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제한 효율이 측정될 수 있고, 이 효율도 태아 DNA의 양을 측정하는 데에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 태아 정량자 분석(FQA)은 예를 들면, 하기 방법으로 모체 샘플 중의 태아 DNA의 농도를 측정하는 데에 사용될 수 있다: a) 모체 샘플에 존재하는 DNA의 총량을 측정하고; b) 하나 이상의 메틸화 민감성 제한 효소를 사용하여 모체 샘플 중의 모체 DNA를 선택적으로 분해하여 태아 DNA를 농축하고; c) 단계 b)로부터의 태아 DNA의 양을 측정하고; d) 단계 c)로부터의 태아 DNA의 양을 단계 a)로부터의 DNA의 총량과 비교하여 모체 샘플에서 태아 DNA의 농도를 측정한다. 일부 실시양태에서, 예를 들면, 절대 카피 수 측정을 위한 경쟁적 PCR 방법을 이용하는 질량 분광측정 및/또는 시스템을 사용하여 모체 샘플 중의 태아 핵산의 절대 카피 수를 측정할 수 있다. 예를 들면, 문헌(Ding and Cantor (2003) PNAS USA 100:3059-3064) 및 미국 특허출원 공보 제2004/0081993호(이들 둘 다 본원에 참고로 도입됨)를 참조한다.
일부 실시양태에서, 태아 분획은 예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공보 제2011/0224087호에 기재된 방법을 이용함으로써 다형성 서열(예를 들면, 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP))의 대립형질 비를 기초로 측정될 수 있다. 이러한 방법에서, 모체 샘플에 대한 뉴클레오티드 서열 리드를 수득하고 기준 게놈 내의 정보제공 다형성 부위(예를 들면, SNP)에서 제1 대립형질에 맵핑되는 뉴클레오티드 서열 리드의 총수를 제2 대립형질에 맵핑되는 뉴클레오티드 서열 리드의 총수와 비교함으로써 태아 분획을 측정한다. 일부 실시양태에서, 태아 대립형질은 예를 들면, 모체 핵산이 샘플 중의 태아 핵산과 모체 핵산의 혼합물에 크게 기여하는 것과 비교될 때 태아 대립형질이 상기 혼합물에 상대적으로 미미하게 기여한다는 사실에 의해 확인된다. 따라서, 모체 샘플 중의 태아 핵산의 상대적 존재도는 다형성 부위의 2개 대립형질들 각각에 대한 기준 게놈 상의 표적 핵산 서열에 맵핑된 유일한 서열 리드의 총수의 파라미터로서 측정될 수 있다.
세포외 핵산 중의 태아 핵산의 양이 정량될 수 있고 본원에서 제공된 방법과 함께 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 기술의 방법은 태아 핵산의 양을 측정하는 추가 단계를 포함한다. 태아 핵산의 양은 샘플 핵산을 준비하기 위한 프로세싱 전 또는 후에 대상체로부터의 핵산 샘플에서 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 태아 핵산의 양은 샘플 핵산이 프로세싱되고 준비된 후에 샘플에서 측정되고, 이 양은 추가 평가를 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 결과는 샘플 핵산 중의 태아 핵산 분획을 팩토링하는(factoring) 것(예를 들면, 카운트를 조정하거나, 샘플을 제거하거나, 판정하거나 판정하지 않는 것)을 포함한다.
측정 단계는 본원에 기재된 방법에서 어느 한 시점 전, 이 시점 동안 또는 이 시점에서, 또는 본원에 기재된 일부(예를 들면, 이배수성 검출, 태아 성별 결정) 방법 후에 수행될 수 있다. 예를 들면, 주어진 민감성 또는 특이성으로 태아 성별 또는 이배수성 확인 방법을 달성하기 위해, 태아 성별 또는 이배수성 확인 전, 동안 또는 후에 태아 핵산 정량 방법을 실시하여 약 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24% 또는 25% 이상의 태아 핵산을 가진 샘플을 확인할 수 있다. 일부 실시양태에서, 일정한 역치 양의 태아 핵산(예를 들면, 약 15% 이상의 태아 핵산; 약 4% 이상의 태아 핵산)을 가진 것으로 확인된 샘플은 예를 들면, 태아 성별 또는 이배수성 확인, 또는 이배수성 또는 유전적 변이의 존재 또는 부재에 대해 더 분석된다. 일부 실시양태에서, 예를 들면, 태아 성별의 확인, 또는 이배수성의 존재 또는 부재의 확인은 일정한 역치 양의 태아 핵산(예를 들면, 약 15% 이상의 태아 핵산; 약 4% 이상의 태아 핵산)을 가진 샘플에 대해서만 선택된다(예를 들면, 선택되고 환자에게 통보된다).
일부 실시양태에서, 태아 분획의 측정 또는 태아 핵산의 양의 측정은 염색체 이배수성의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 요구되지 않거나 필요하지 않다. 일부 실시양태에서, 염색체 이배수성의 존재 또는 부재의 확인은 태아 대 모체 DNA의 서열 식별을 요구하지 않는다. 일부 실시양태에서, 이것은 부모의 합산된 기여 때문이고, 특정 염색체, 염색체 부분 또는 이의 분절에서 태아 서열이 분석된다. 일부 실시양태에서, 염색체 이배수성의 존재 또는 부재의 확인은 모체 DNA로부터 태아 DNA를 식별시켜 줄 종래 서열 정보에 의존하지 않는다.
수준에 기초한 태아 분획 측정
일부 실시양태에서, 태아 분획은 모체 및/또는 태아 카피 수 변이를 표시하는 것으로서 분류된 수준에 따라 측정된다. 예를 들면, 태아 분획의 측정은 종종 태아 분획의 측정에 사용된 모체 및/또는 태아 카피 수 변이에 대한 기대 수준을 평가하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 태아 분획은 동일한 종류의 카피 수 변이에 대해 결정된 기대 수준 범위에 따라 카피 수 변이를 표시하는 것으로서 분류된 수준(예를 들면, 제1 수준)에 대해 측정된다. 종종, 태아 분획은 기대 수준 범위 내에 속하는 관찰된 수준에 따라 측정됨으로써 모체 및/또는 태아 카피 수 변이로서 분류된다. 일부 실시양태에서, 태아 분획은 모체 및/또는 태아 카피 수 변이로서 분류된 관찰된 수준(예를 들면, 제1 수준)이 동일한 모체 및/또는 태아 카피 수 변이에 대해 결정된 기대 수준과 상이할 때 측정된다.
일부 실시양태에서, 수준(예를 들면, 제1 수준, 관찰된 수준)은 제2 수준과 유의하게 상이하고, 제1 수준은 모체 및/또는 태아 카피 수 변이로서 분류되고, 태아 분획은 제1 수준에 따라 측정된다. 일부 실시양태에서, 제1 수준은 프로파일 내의 제2 수준과 유의하게 상이한 관찰된 및/또는 실험적으로 수득된 수준이고, 태아 분획은 제1 수준에 따라 측정된다. 일부 실시양태에서, 제1 수준은 평균치, 평균 또는 합산된 수준이고, 태아 분획은 제1 수준에 따라 측정된다. 일부 실시양태에서, 제1 수준 및 제2 수준은 관찰된 및/또는 실험적으로 수득된 수준이고, 태아 분획은 제1 수준에 따라 측정된다. 일부 경우, 제1 수준은 부분의 제1 세트에 대한 정규화된 카운트를 포함하고, 제2 수준은 부분의 제2 세트에 대한 정규화된 카운트를 포함하고, 태아 분획은 제1 수준에 따라 측정된다. 일부 실시양태에서, 제1 수준의 부분의 제1 세트는 카피 수 변이를 포함하고(예를 들면, 제1 수준은 카피 수 변이를 표시함), 태아 분획은 제1 수준에 따라 측정된다. 일부 실시양태에서, 제1 수준의 부분의 제1 세트는 동형접합 또는 이형접합 모체 카피 수 변이를 포함하고, 태아 분획은 제1 수준에 따라 측정된다. 일부 실시양태에서, 프로파일은 부분의 제1 세트에 대한 제1 수준 및 부분의 제2 세트에 대한 제2 수분을 포함하고, 부분의 제2 세트는 카피 수 변이(예를 들면, 모체 카피 수 변이, 태아 카피 수 변이, 또는 모체 카피 수 변이 및 태아 카피 수 변이)를 실질적으로 포함하지 않고, 태아 분획은 제1 수준에 따라 측정된다.
일부 실시양태에서, 수준(예를 들면, 제1 수준, 관찰된 수준)은 제2 수준과 유의하게 상이하고, 제1 수준은 모체 및/또는 태아 카피 수 변이에 대한 것으로서 분류되고, 태아 분획은 제1 수준 및/또는 카피 수 변이의 기대 수준에 따라 측정된다. 일부 실시양태에서, 제1 수준은 카피 수 변이에 대한 기대 수준에 따라 카피 수 변이에 대한 것으로서 분류되고, 태아 분획은 제1 수준과 기대 수준 사이의 차이에 따라 측정된다. 일부 실시양태에서, 수준(예를 들면, 제1 수준, 관찰된 수준)은 모체 및/또는 태아 카피 수 변이로서 분류되고, 태아 분획은 제1 수준과 카피 수 변이의 기대 수준 사이의 차이의 2배로서 측정된다. 일부 실시양태에서, 수준(예를 들면, 제1 수준, 관찰된 수준)은 모체 및/또는 태아 카피 수 변이로서 분류되고, 제1 수준을 기대 수준으로부터 뺌으로써 차이를 제공하고, 태아 분획은 상기 차이의 2배로서 측정된다. 일부 실시양태에서, 수준(예를 들면, 제1 수준, 관찰된 수준)은 모체 및/또는 태아 카피 수 변이로서 분류되고, 기대 수준을 제1 수준으로부터 뺌으로써 차이를 제공하고, 태아 분획은 상기 차이의 2배로서 측정된다.
종종, 태아 분획은 %로서 제공된다. 예를 들면, 태아 분획을 100으로 나누어 % 값을 제공할 수 있다. 예를 들면, 모체 동형접합 중복을 표시하고 155의 수준을 가진 제1 수준, 및 150의 수준을 가진 모체 동형접합 중복에 대한 기대 수준의 경우, 태아 분획은 10%로서 측정될 수 있다(예를 들면, (태아 분획 = 2 x (155 - 150)).
일부 실시양태에서, 태아 분획은 카피 수 변이로서 분류되는 프로파일 내의 2개 이상의 수준으로부터 측정된다. 예를 들면, 종종 프로파일 내의 2개 이상의 수준(예를 들면, 2개 이상의 제1 수준)은 기준 수준(예를 들면, 제2 수준, 카피 수 변이를 실질적으로 포함하지 않는 수준)과 유의하게 상이한 것으로서 확인되고, 상기 2개 이상의 수준은 모체 및/또는 태아 카피 수 변이를 표시하는 것으로서 분류되고, 태아 분획은 상기 2개 이상의 수준 각각으로부터 측정된다. 일부 실시양태에서, 태아 분획은 프로파일 내에서의 약 3회 이상, 약 4회 이상, 약 5회 이상, 약 6회 이상, 약 7회 이상, 약 8회 이상 또는 약 9회 이상의 태아 분획 측정으로부터 측정된다. 일부 실시양태에서, 태아 분획은 프로파일 내에서의 약 10회 이상, 약 20회 이상, 약 30회 이상, 약 40회 이상, 약 50회 이상, 약 60회 이상, 약 70회 이상, 약 80회 이상 또는 약 90회 이상의 태아 분획 측정으로부터 측정된다. 일부 실시양태에서, 태아 분획은 프로파일 내에서의 약 100회 이상, 약 200회 이상, 약 300회 이상, 약 400회 이상, 약 500회 이상, 약 600회 이상, 약 700회 이상, 약 800회 이상, 약 900회 이상 또는 약 1000회 이상의 태아 분획 측정으로부터 측정된다. 일부 실시양태에서, 태아 분획은 프로파일 내에서의 약 10회 내지 약 1000회, 약 20회 내지 약 900회, 약 30회 내지 약 700회, 약 40회 내지 약 600회, 약 50회 내지 약 500회, 약 50회 내지 약 400회, 약 50회 내지 약 300회, 약 50회 내지 약 200회, 또는 약 50회 내지 약 100회의 태아 분획 측정으로부터 측정된다.
일부 실시양태에서, 태아 분획은 프로파일 내에서의 다회 태아 분획 측정의 평균치 또는 평균으로서 측정된다. 일부 실시양태에서, 다회 태아 분획 측정으로부터 측정된 태아 분획은 다회 태아 분획 측정의 평균(예를 들면, 평균치, 평균, 표준 평균치, 중간치 등)이다. 종종, 다회 태아 분획 측정으로부터 측정된 태아 분획은 당분야에서 공지되어 있거나 본원에 기재되어 있는 적합한 방법에 의해 측정된 평균 값이다. 일부 실시양태에서, 태아 분획 측정의 평균 값은 가중된 평균이다. 일부 실시양태에서, 태아 분획 측정의 평균 값은 비가중된 평균이다. 다회 태아 분획 측정으로부터 수득된 평균, 중간 또는 평균치 태아 분획 측정치(즉, 평균, 중간 또는 평균치 태아 분획 측정 값)는 종종 불확실성 값(예를 들면, 분산, 표준 편차, MAD 등)과 관련되어 있다. 일부 실시양태에서, 다회 측정으로부터 평균, 중간 또는 평균치 태아 분획 값을 측정하기 전에, 하나 이상의 벗어난 측정치는 제거된다(본원에 더 상세히 기재됨).
프로파일 내의 일부 태아 분획 측정치는 종종 태아 분획의 전체 측정치(예를 들면, 평균 또는 평균치 태아 분획 측정치)에 포함되지 않는다. 일부 실시양태에서, 태아 분획 측정치는 프로파일 내의 제1 수준(예를 들면, 제2 수준과 유의하게 상이한 제1 수준)으로부터 유도되고, 제1 수준은 유전적 변이를 표시하지 않는다. 예를 들면, 프로파일 내의 일부 제1 수준(예를 들면, 봉우리(spike) 또는 고랑)은 예외 또는 공지되지 않은 원인으로부터 생성된다. 이러한 값은 종종 진짜 카피 수 변이로부터 수득된 다른 태아 분획 측정치와 유의하게 상이한 태아 분획 측정치를 생성한다. 일부 실시양태에서, 프로파일 내의 다른 태아 분획 측정치와 유의하게 상이한 태아 분획 측정치는 확인되고 태아 분획 측정치로부터 제거된다. 예를 들면, 예외적인 봉우리 및 고랑으로부터 수득된 일부 태아 분획 측정치는 이를 프로파일 내의 다른 태아 분획 측정치와 비교함으로써 확인되고 태아 분획의 전체 측정치로부터 배제된다.
일부 실시양태에서, 평균, 중간 또는 평균치 태아 분획 측정치와 유의하게 상이한 독립적인 태아 분획 측정치는 확인되고/되거나, 인식되고/되거나 관찰가능한 차이이다. 일부 실시양태에서, 용어 "유의하게 상이한"은 통계학적으로 상이하고/하거나 통계학적으로 유의한 차이를 의미할 수 있다. "독립적인" 태아 분획 측정치는 카피 수 변이로서 분류된 특정 수준으로부터 측정된 태아 분획(예를 들면, 일부 실시양태에서 단일 측정치)일 수 있다. 임의의 적합한 역치 또는 범위를 사용하여 태아 분획 측정치가 평균, 중간 또는 평균치 태아 분획 측정치와 유의하게 상이한지를 확인할 수 있다. 일부 실시양태에서, 태아 분획 측정치는 평균, 중간 또는 평균치 태아 분획 측정치와 유의하게 상이하고, 측정치는 평균치 또는 평균 값으로부터 % 이탈로서 표현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 평균, 중간 또는 평균치 태아 분획 측정치와 유의하게 상이한 태아 분획 측정치는 약 10% 이상만큼 상이하다. 일부 실시양태에서, 평균, 중간 또는 평균치 태아 분획 측정치와 유의하게 상이한 태아 분획 측정치는 약 15% 이상만큼 상이하다. 일부 실시양태에서, 평균, 중간 또는 평균치 태아 분획 측정치와 유의하게 상이한 태아 분획 측정치는 약 15% 내지 약 100% 이상만큼 상이하다.
일부 실시양태에서, 태아 분획 측정치는 평균 또는 평균치 태아 분획 측정치와 관련된 불확실성 값의 배수에 따라 평균, 중간 또는 평균치 태아 분획 측정치와 유의하게 상이하다. 종종, 불확실성 값 및 상수 n(예를 들면, 신뢰 구간)은 범위(예를 들면, 불확실성 컷오프)를 한정한다. 예를 들면, 종종 불확실성 값은 태아 분획 측정치에 대한 표준 편차(예를 들면, +/- 5)이고 상수 n(예를 들면, 신뢰 구간)과 곱해져 범위 또는 불확실성 컷오프(예를 들면, 종종 5 시그마로서 지칭되는 5n 내지 -5n)를 한정한다. 일부 실시양태에서, 독립적인 태아 분획 측정치는 불확실성 컷오프에 의해 한정된 범위를 벗어나고 평균, 중간 또는 평균치 태아 분획 측정치와 유의하게 상이한 것으로서 간주된다. 예를 들면, 평균 값이 10이고 불확실성 컷오프가 3인 경우, 13 초과 또는 7 미만의 독립적인 태아 분획이 유의하게 상이하다. 일부 실시양태에서, 평균, 중간 또는 평균치 태아 분획 측정치와 유의하게 상이한 태아 분획 측정치는 불확실성 값의 n배(예를 들면, n x 시그마) 이상만큼 상이하고, 이때 n은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 이상이다. 일부 실시양태에서, 평균, 중간 또는 평균치 태아 분획 측정치와 유의하게 상이한 태아 분획 측정치는 불확실성 값의 n배(예를 들면, n x 시그마) 이상만큼 상이하고, 이때 n은 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9 또는 4.0 이상이다.
일부 실시양태에서, 수준은 태아 및/또는 모체 미세배수성을 표시한다. 일부 실시양태에서, 수준(예를 들면, 제1 수준, 관찰된 수준)은 제2 수준과 유의하게 상이하고, 제1 수준은 모체 및/또는 태아 카피 수 변이로서 분류되고, 제1 수준 및/또는 제2 수준은 태아 미세배수성 및/또는 모체 미세배수성을 표시한다. 일부 실시양태에서, 제1 수준은 태아 미세배수성을 표시한다. 일부 실시양태에서 제1 수준은 모체 미세배수성을 표시한다. 종종, 제1 수준은 태아 미세배수성 및 모체 미세배수성을 표시한다. 일부 실시양태에서, 수준(예를 들면, 제1 수준, 관찰된 수준)은 제2 수준과 유의하게 상이하고, 제1 수준은 모체 및/또는 태아 카피 수 변이로서 분류되고, 제1 수준은 태아 및/또는 모체 미세배수성을 표시하고, 태아 분획은 태아 및/또는 모체 미세배수성에 따라 측정된다. 일부 경우, 제1 수준은 모체 및/또는 태아 카피 수 변이로서 분류되고, 제1 수준은 태아 미세배수성을 표시하고, 태아 분획은 태아 미세배수성에 따라 측정된다. 일부 실시양태에서, 제1 수준은 모체 및/또는 태아 카피 수 변이로서 분류되고, 제1 수준은 모체 미세배수성을 표시하고, 태아 분획은 모체 미세배수성에 따라 측정된다. 일부 실시양태에서, 제1 수준은 모체 및/또는 태아 카피 수 변이로서 분류되고, 제1 수준은 모체 및 태아 미세배수성을 표시하고, 태아 분획은 모체 및 태아 미세배수성에 따라 측정된다.
일부 실시양태에서, 태아 분획의 측정은 태아 및/또는 모체 미세배수성의 측정을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수준(예를 들면, 제1 수준, 관찰된 수준)은 제2 수준과 유의하게 상이하고, 제1 수준은 모체 및/또는 태아 카피 수 변이로서 분류되고, 태아 및/또는 모체 미세배수성은 제1 수준 및/또는 제2 수준에 따라 측정되고, 태아 분획은 측정된다. 일부 실시양태에서, 제1 수준은 모체 및/또는 태아 카피 수 변이로서 분류되고, 태아 미세배수성은 제1 수준 및/또는 제2 수준에 따라 측정되고, 태아 분획은 태아 미세배수성에 따라 측정된다. 일부 실시양태에서, 제1 수준은 모체 및/또는 태아 카피 수 변이로서 분류되고, 모체 미세배수성은 제1 수준 및/또는 제2 수준에 따라 측정되고, 태아 분획은 모체 미세배수성에 따라 측정된다. 일부 실시양태에서, 제1 수준은 모체 및/또는 태아 카피 수 변이로서 분류되고, 모체 및 태아 미세배수성은 제1 수준 및/또는 제2 수준에 따라 측정되고, 태아 분획은 모체 및 태아 미세배수성에 따라 측정된다.
태아 분획은 종종 모체의 미세배수성이 주어진 수준 또는 카피 수 변이로서 분류된 수준에 대해 태아의 미세배수성과 상이할(예를 들면, 동일하지 않을) 때 측정된다. 일부 실시양태에서, 태아 분획은 모체가 중복에 대한 동형접합성(예를 들면, 2의 미세배수성)을 갖고 태아가 동일한 중복에 대한 이형접합성(예를 들면, 1.5의 미세배수성)을 가질 때 측정된다. 일부 실시양태에서, 태아 분획은 모체가 중복에 대한 이형접합성(예를 들면, 1.5의 미세배수성)을 갖고 태아가 동일한 중복에 대한 동형접합성(예를 들면, 2의 미세배수성)을 갖거나 중복이 태아에 부재할(예를 들면, 1의 미세배수성) 때 측정된다. 일부 실시양태에서, 태아 분획은 모체가 결실에 대한 동형접합성(예를 들면, 0의 미세배수성)을 갖고 태아가 동일한 결실에 대한 이형접합성(예를 들면, 0.5의 미세배수성)을 가질 때 측정된다. 일부 실시양태에서, 태아 분획은 모체가 결실에 대한 이형접합성(예를 들면, 0.5의 미세배수성)을 갖고 태아가 동일한 결실에 대한 동형접합성(예를 들면, 0의 미세배수성)을 갖거나 결실이 태아에 부재할(예를 들면, 1의 미세배수성) 때 측정된다.
일부 실시양태에서, 태아 분획은 모체의 미세배수성이 카피 수 변이로서 확인된 주어진 수준에 대해 태아의 미세배수성과 동일할(예를 들면, 동일한 것으로서 확인될) 때 측정될 수 없다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 모체 및 태아 둘 다가 동일한 수의 카피의 카피 수 변이를 가진 경우 주어진 수준에 대한 태아 분획은 측정되지 않는다. 예를 들면, 태아 분획은 모체 및 태아 둘 다가 동일한 결실에 대한 동형접합성 또는 동일한 중복에 대한 동형접합성을 가질 때 카피 수 변이로서 분류된 수준에 대해 측정될 수 없다. 일부 실시양태에서, 태아 분획은 모체 및 태아가 동일한 결실에 대한 이형접합성 또는 동일한 중복에 대한 이형접합성을 가질 때 카피 수 변이로서 분류된 수준에 대해 측정될 수 없다. 샘플에 대한 다회 태아 분획 측정이 수행되는 실시양태에서, 평균, 중간 또는 평균치 값으로부터 유의하게 벗어나는 측정치는 모체 배수성이 태아 배수성과 동등한 카피 수 변이로부터 비롯될 수 있고, 이러한 측정치는 고려사항으로부터 제거될 수 있다.
일부 실시양태에서, 모체 카피 수 변이 및 태아 카피 수 변이의 미세배수성은 공지되어 있지 않다. 일부 실시양태에서, 카피 수 변이에 대한 태아 및/또는 모체 미세배수성의 측정이 없는 경우, 태아 분획이 생성되고 평균, 중간 또는 평균치 태아 분획 측정치와 비교된다. 평균, 중간 또는 평균치 태아 분획 측정치와 유의하게 상이한 카피 수 변이에 대한 태아 분획 측정치는 종종 모체 및 태아의 미세배수성이 카피 수 변이에 대해 동일하기 때문이다. 평균, 중간 또는 평균치 태아 분획 측정치와 유의하게 상이한 태아 분획 측정치는 종종 차이의 원천 또는 원인과 관계없이 전체 태아 분획 측정치로부터 배제된다. 일부 실시양태에서, 모체 및/또는 태아의 미세배수성은 당분야에서 공지된 방법(예를 들면, 표적화된 서열결정 방법)에 의해 측정되고/되거나 검증된다.
태아 분획 측정 추가 방법
일부 실시양태에서, (샘플에 대한) 태아 분획은 부분 특이적 태아 분획 추정치에 따라 측정될 수 있다. 이론에 의해 한정되지 않지만, 태아 CCF 단편(예를 들면, 특정 길이 또는 길이 범위의 단편)으로부터의 일정량의 리드가 (예를 들면, 동일한 서열결정 실시에서, 예를 들면, 동일한 샘플 내에서) 넓은 빈도로 부분에 맵핑된다는 것이 본원에서 확인되었다. 또한, 이론에 의해 한정되지 않지만, 다수의 샘플들 사이에 비교될 때 일부 부분들이 태아 CCF 단편(예를 들면, 특정 길이 또는 길이 범위의 단편)으로부터의 리드의 유사한 표시치를 갖는 경향을 나타내고, 그 표시치가 부분 특이적 태아 분획(예를 들면, 태아로부터 유래한 CCF 단편의 상대적 양, 백분율 또는 비)과 상관관계를 가진다는 것이 본원에서 확인되었다.
일부 실시양태에서, 부분 특이적 태아 분획 추정치는 부분적으로 부분 특이적 파라미터들 및 이들과 태아 분획의 관계를 기초로 측정된다. 부분 특이적 파라미터는 부분에서 특정 크기(예를 들면, 크기 범위)의 CCF 단편 길이로부터의 리드의 양 또는 비율을 반영하는(예를 들면, 이러한 양 또는 비율과 상관관계를 가진) 임의의 적합한 파라미터일 수 있다. 부분 특이적 파라미터는 다수의 샘플들에 대해 측정된 부분 특이적 파라미터의 평균치, 평균 또는 중간치일 수 있다. 임의의 적합한 부분 특이적 파라미터가 사용될 수 있다. 부분 특이적 파라미터의 비한정적 예는 FLR(예를 들면, FRS), 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 리드의 양, 게놈 커버리지(즉, 커버리지), 맵핑 가능성, 카운트(예를 들면, 부분들에 맵핑된 서열 리드의 카운트, 예를 들면, 정규화된 카운트, PERUN 정규화된 카운트), DNase I 민감성, 메틸화 상태, 아세틸화, 히스톤 분포, 구아닌-사이토신(GC) 함량, 염색질 구조 등 또는 이들의 조합을 포함한다. 부분 특이적 파라미터는 부분 특이적 방식으로 FLR 및/또는 FRS와 상관관계를 가진 임의의 적합한 파라미터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 일부 또는 모든 부분 특이적 파라미터들이 부분에 대한 FLR의 직접적인 또는 간접적인 표시치이다. 일부 실시양태에서, 부분 특이적 파라미터는 구아닌-사이토신(GC) 함량이 아니다.
일부 실시양태에서, 부분 특이적 파라미터는 CCF 단편으로부터의 리드의 양을 나타내거나, 이러한 양과 상관관계를 갖거나 이러한 양에 비례하는 임의의 적합한 값이고, 이때 부분에 맵핑된 리드는 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진다. 일부 실시양태에서, 부분 특이적 파라미터는 부분에 맵핑되는 상대적으로 짧은 CCF 단편(예를 들면, 약 200개 이하의 염기쌍)으로부터 유래한 리드의 양의 표시치이다. 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 CCF 단편은 종종 상대적으로 짧은 CCF 단편이고, 종종 선택된 단편 길이는 약 200개 이하의 염기쌍이다(예를 들면, 길이에서 약 190개, 180개, 170개, 160개, 150개, 140개, 130개, 120개, 110개, 100개, 90개 또는 80개의 염기를 가진 CCF 단편). CCF 단편, 또는 CCF 단편으로부터 유도된 리드의 길이는 임의의 적합한 방법(예를 들면, 서열결정 방법, 혼성화 방법)에 의해 측정될 수 있다(예를 들면, 추정될 수 있거나 유추될 수 있다). 일부 실시양태에서, CCF 단편의 길이는 페어링된-말단 서열결정 방법으로부터 수득된 리드에 의해 측정된다(예를 들면, 추정되거나 유추된다). 일부 실시양태에서, CCF 단편 주형의 길이는 CCF 단편으로부터 유도된 리드(예를 들면, 단일-말단 리드)의 길이로부터 직접적으로 측정된다.
부분 특이적 파라미터는 하나 이상의 가중치에 의해 가중될 수 있거나 조절될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가중된 또는 조절된 부분 특이적 파라미터는 샘플(예를 들면, 검사 샘플)에 대한 부분 특이적 태아 분획 추정치를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 가중 또는 조절은 일반적으로 부분(예를 들면, 부분에 맵핑된 리드)의 카운트 또는 또 다른 부분 특이적 파라미터를 부분 특이적 태아 분획 추정치로 전환시키고, 이러한 전환은 종종 변환으로서 간주된다.
일부 실시양태에서, 가중치는 부분적으로 태아 분획(예를 들면, 다수의 샘플들로부터 측정된 태아 분획)과 다수의 샘플들(예를 들면, 트레이닝 세트)에 대한 부분 특이적 파라미터 사이의 관계를 기술하고/하거나 정의하는 계수 또는 상수이다. 일부 실시양태에서, 가중치는 다수의 태아 분획 측정치들과 다수의 부분 특이적 파라미터들 사이의 관계에 따라 결정된다. 관계는 하나 이상의 가중치에 의해 정의될 수 있고, 하나 이상의 가중치는 관계로부터 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가중치(예를 들면, 하나 이상의 가중치)은 (i) 다수의 샘플들 각각에 대해 측정된 태아 핵산 분획, 및 (ii) 다수의 샘플들에 대한 부분 특이적 파라미터에 따라 부분에 대한 피팅된 관계로부터 결정된다.
가중치는 적합한 관계(예를 들면, 적합한 수학적 관계, 대수적 관계, 피팅된 관계, 회귀, 회귀 분석, 회귀 모델)로부터 유도된 임의의 적합한 계수, 추정된 계수 또는 상수일 수 있다. 가중치는 적합한 관계에 따라 결정될 수 있거나, 적합한 관계로부터 유도될 수 있거나 적합한 관계로부터 추정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가중치는 피팅된 관계로부터 추정된 계수이다. 다수의 샘플들에 대한 관계의 피팅은 종종 본원에서 모델의 트레이닝으로서 지칭된다. 관계를 피팅하는(예를 들면, 트레이닝 세트에 대한 모델을 트레이닝하는) 임의의 적합한 모델 및/또는 방법이 이용될 수 있다. 이용될 수 있는 적합한 모델의 비한정적 예는 회귀 모델, 선형 회귀 모델, 단순 회귀 모델, 표준 최소 자승 회귀 모델, 다중 회귀 모델, 일반 다중 회귀 모델, 다항 회귀 모델, 일반 선형 모델, 일반화 선형 모델, 이산 선택 회귀 모델, 로지스틱 회귀 모델, 다항 로짓 모델, 혼합 로짓 모델, 프로빗 모델, 다항 프로빗 모델, 순서형 로짓 모델, 순서형 프로빗 모델, 푸아송 모델, 다변량 반응 회귀 모델, 다층 모델, 고정 효과 모델, 변량 효과 모델, 혼합 모델, 비선형 회귀 모델, 비모수 모델, 준모수 모델, 로버스트 모델, 분위 모델, 등위 모델, 주성분 모델, 최소 각 모델, 로컬 모델, 세그먼트 모델 및 변수 오차 모델을 포함한다. 일부 실시양태에서, 고정된 관계는 회귀 모델이 아니다. 일부 실시양태에서, 고정된 관계는 결정 트리(decision tree) 모델, 서포트-백터 머신 모델 및 신경망 모델로부터 선택된다. 모델(예를 들면, 회귀 모델, 관계)을 트레이닝한 결과는 종종 관계가 하나 이상의 계수(예를 들면, 가중치)를 포함하는 경우 수학적으로 기술될 수 있는 관계이다. 예를 들면, 선형 최소 자승 모델의 경우, 태아 분획 값 및 부분 특이적 파라미터(예를 들면, 커버리지, 예를 들면, 실시예 7 참조)를 사용하여 일반 다중 회귀 모델을 트레이닝함으로써 방정식 30으로 기재된 관계를 생성할 수 있고, 이때 가중치 β는 방정식 31, 32 및 33에서 더 정의되어 있다. 보다 더 복잡한 다변량 모델은 1개, 2개 또는 3개 이상의 가중치를 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 모델은 다수의 샘플들로부터 수득된 태아 분획 및 2개 이상의 부분 특이적 파라미터(예를 들면, 계수)(예를 들면, 행렬에 의해 다수의 샘플들에 피팅된 피팅된 관계)에 따라 트레이닝된다.
가중치는 적합한 방법에 의해 적합한 관계(예를 들면, 적합한 수학적 관계, 대수적 관계, 피팅된 관계, 회귀, 회귀 분석, 회귀 모델)로부터 유도될 수 있다. 일부 실시양태에서, 피팅된 관계는 추정에 의해 피팅되고, 이의 비한정적 예는 최소 자승 회귀, 표준 최소 자승 회귀, 선형 회귀, 부분 회귀, 전회귀, 일반화 회귀, 가중 회귀, 비선형 회귀, 반복 재가중 회귀, 능형(ridge) 회귀, 최소 절대 편차, 베이지안(Bayesian), 베이지안 다변량, 축소 랭크(reduced-rank) 회귀, LASSO, 가중 랭크 선택 기준(WRSC), 랭크 선택 기준(RSC), 엘라스틱 넷 추정량(elastic net estimator)(예를 들면, 엘라스틱 넷 회귀) 및 이들의 조합을 포함한다.
가중치는 임의의 적합한 값을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 가중치는 약 -1 x 10-2 내지 약 1 x 10-2, 약 -1 x 10-3 내지 약 1 x 10-3, 약 -5 x 10-4 내지 약 5 x 10-4, 또는 약 -1 x 10-4 내지 약 1 x 10-4이다. 일부 실시양태에서, 다수의 샘플들에 대한 가중치의 분포는 실질적으로 대칭적이다. 다수의 샘플들에 대한 가중치의 분포는 종종 정규 분포이다. 다수의 샘플들에 대한 가중치의 분포는 정규 분포가 아니다. 일부 실시양태에서, 가중치의 분포 폭은 CCF 태아 핵산 단편으로부터의 리드의 양에 의존한다. 일부 실시양태에서, 보다 더 높은 태아 핵산 함량을 포함하는 부분은 보다 큰 계수(예를 들면, 양의 또는 음의 계수, 예를 들면, 도 31 참조)를 생성한다. 가중치는 0일 수 있거나, 가중치는 0보다 더 클 수 있다. 일부 실시양태에서, 부분에 대한 가중치의 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상 또는 약 98% 이상이 0보다 더 크다.
가중치는 게놈의 임의의 적합한 부분에 대해 결정될 수 있거나 이러한 임의의 적합한 부분과 관련될 수 있다. 가중치는 임의의 적합한 염색체의 임의의 적합한 부분에 대해 결정될 수 있거나 이러한 임의의 적합한 부분과 관련될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가중치는 게놈 내의 일부 또는 모든 부분들에 대해 결정되거나 이들과 관련되어 있다. 일부 실시양태에서, 가중치는 게놈 내의 일부 또는 모든 염색체들의 부분에 대해 결정되거나 이들과 관련되어 있다. 가중치는 종종 선택된 염색체의 부분에 대해 결정되거나 이러한 부분과 관련되어 있다. 가중치는 하나 이상의 상염색체(autosome)의 부분에 대해 결정될 수 있거나 이러한 부분과 관련될 수 있다. 가중치는 상염색체 또는 이의 서브세트 내의 부분을 포함하는 복수의 부분들 내의 부분에 대해 결정될 수 있거나 이러한 부분과 관련될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가중치는 성염색체(예를 들면, ChrX 및/또는 ChrY)의 부분에 대해 결정되거나 이러한 부분과 관련되어 있다. 가중치는 하나 이상의 상염색체 및 하나 이상의 성염색체의 부분에 대해 결정될 수 있거나 이러한 부분과 관련될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가중치는 모든 상염색체들, X 염색체 및 Y 염색체 내의 복수의 부분들 내의 부분에 대해 결정되거나 이러한 부분과 관련되어 있다. 가중치는 X 염색체 및/또는 Y 염색체 내의 부분을 포함하지 않는 복수의 부분들 내의 부분에 대해 결정될 수 있거나 이러한 부분과 관련될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가중치는 염색체의 부분에 대해 결정되거나 이러한 부분과 관련되어 있고, 이때 상기 염색체는 이배수성(예를 들면, 전체 염색체 이배수성)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가중치는 염색체의 부분에 대해서만 결정되거나 이러한 부분과만 관련되어 있고, 이때 상기 염색체는 이배수체가 아니다(예를 들면, 정배수체 염색체). 가중치는 13번 염색체, 18번 염색체 및/또는 21번 염색체 내의 부분을 포함하지 않는 복수의 부분들 내의 부분에 대해 결정될 수 있거나 이러한 부분과 관련될 수 있다.
일부 실시양태에서, 가중치는 하나 이상의 샘플(예를 들면, 샘플의 트레이닝 세트)에 따라 부분에 대해 결정된다. 가중치는 종종 부분에 대한 특이성을 가진다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 가중치는 부분에 독립적으로 할당된다. 일부 실시양태에서, 가중치는 다수의 샘플들에 대한 태아 분획 측정치(예를 들면, 샘플 특이적 태아 분획 측정치)와 다수의 샘플들에 따라 측정된 부분 특이적 파라미터 사이의 관계에 따라 결정된다. 가중치는 종종 다수의 샘플들, 예를 들면, 약 20개 내지 약 100,000개 이상, 약 100개 내지 약 100,000개 이상, 약 500개 내지 약 100,000개 이상, 약 1,000개 내지 약 100,000개 이상, 또는 약 10,000개 내지 약 100,000개 이상의 샘플들로부터 결정된다. 가중치는 정배수체인 샘플(예를 들면, 정배수체 태아를 포함하는 대상체로부터의 샘플, 예를 들면, 이수체 염색체가 존재하지 않는 샘플)로부터 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가중치는 이배수체 염색체를 포함하는 샘플(예를 들면, 정배수체 태아를 포함하는 대상체로부터의 샘플)로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 가중치는 정배수체 태아를 가진 대상체 및 삼염색체성 태아를 가진 대상체로부터의 다수의 샘플들로부터 결정된다. 가중치는 다수의 샘플들로부터 유도될 수 있고, 이때 상기 샘플들은 남아 태아 및/또는 여아 태아를 가진 대상체로부터의 샘플들이다.
태아 분획은 종종 가중치가 유도되는 트레이닝 세트의 하나 이상의 샘플에 대해 측정된다. 가중치가 결정되는 태아 분획은 종종 샘플 특이적 태아 분획 측정치이다. 가중치가 결정되는 태아 분획은 본원에 기재되어 있거나 당분야에서 공지되어 있는 임의의 적합한 방법에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 태아 핵산 함량(예를 들면, 태아 분획)의 측정은 본원에 기재되어 있거나 당분야에서 공지되어 있는 적합한 태아 정량자 분석(FQA)을 이용함으로써 수행되고, 이러한 분석의 비한정적 예는 남아 태아에 대한 특이성을 가진 마커에 따른 태아 분획 측정, 다형성 서열의 대립형질 비에 기초한 태아 분획 측정, 태아 핵산에 대한 특이성을 갖지만 모체 핵산에 대한 특이성을 갖지 않는 하나 이상의 마커에 따른 태아 분획 측정, 메틸화에 기초한 DNA 식별의 이용에 의한 태아 분획 측정(예를 들면, 문헌(A. Nygren, et al., (2010) Clinical Chemistry 56(10):1627-1635)), 경쟁 PCR 방법을 이용하는 질량 분광측정 방법 및/또는 시스템에 의한 태아 분획 측정, 본원에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공보 제2010/0105049호에 기재된 방법에 의한 태아 분획 측정 등 또는 이들의 조합을 포함한다. 종종 태아 분획은 부분적으로 Y 염색체의 수준(예를 들면, 하나 이상의 게놈 구획 수준, 프로파일의 수준)에 따라 측정된다. 일부 실시양태에서, 태아 분획은 Y 염색체의 적합한 분석에 따라(예를 들면, 정량 실시간 PCR을 이용하여 태아 특이적 좌위(예컨대, 남아 임신에서 Y 염색체 상의 SRY 좌위)의 양을 모체 및 태아 둘 다에 공통된 임의의 상염색체 상의 좌위의 양과 비교함으로써) 측정된다(예를 들면, 문헌(Lo YM, et al.(1998) Am J Hum Genet 62:768-775)).
(예를 들면, 검사 샘플에 대한) 부분 특이적 파라미터는 하나 이상의 가중치(예를 들면, 트레이닝 세트로부터 유도된 가중치)에 의해 가중될 수 있거나 조절될 수 있다. 예를 들면, 가중치는 다수의 샘플들의 트레이닝 세트에 대한 부분 특이적 파라미터와 태아 분획 측정치 사이의 관계에 따라 부분에 대해 유도될 수 있다. 그 다음, 검사 샘플의 부분 특이적 파라미터는 트레이닝 세트로부터 유도된 가중치에 따라 조정될 수 있고/있거나 가중될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가중치가 유도된 부분 특이적 파라미터는 조절되거나 가중된 (예를 들면, 검사 샘플의) 부분 특이적 파라미터와 동일하다(예를 들면, 두 파라미터들이 FLR이다). 일부 실시양태에서, 가중치가 유도된 부분 특이적 파라미터는 조절되거나 가중된 (예를 들면, 검사 샘플의) 부분 특이적 파라미터와 상이하다. 예를 들면, 가중치는 샘플의 트레이닝 세트에 대한 커버리지(즉, 부분 특이적 파라미터)와 태아 분획 사이의 관계로부터 결정될 수 있고, 검사 샘플의 부분에 대한 FLR(즉, 또 다른 부분 특이적 파라미터)은 커버리지로부터 유도된 가중치에 따라 조정될 수 있다. 이론에 의해 한정되지 않지만, (예를 들면, 검사 샘플에 대한) 부분 특이적 파라미터는 종종 각각의 부분 특이적 파라미터와 공통된 부분 특이적 FLR 사이의 관계 및/또는 상관관계로 인해 (예를 들면, 트레이닝 세트의) 상이한 부분 특이적 파라미터로부터 유도된 가중치에 의해 조절될 수 있고/있거나 가중될 수 있다.
부분 특이적 파라미터를 그 부분에 대해 결정된 가중치로 가중함으로써 샘플(예를 들면, 검사 샘플)에 대한 부분 특이적 태아 분획 추정치를 측정할 수 있다. 가중은 임의의 적합한 수학적 조작을 적용함으로써 가중치에 따라 부분 특이적 파라미터를 조절하고/하거나 전환시키고/시키거나 변환시키는 단계를 포함할 수 있고, 상기 수학적 조작의 비한정적 예는 곱셈, 나눗셈, 덧셈, 뺄셈, 적분, 기호 연산, 대수적 연산, 알고리즘, 삼각법 또는 기하학 함수, 변환(예를 들면, 푸리에(Fourier) 변환) 등 또는 이들의 조합을 포함한다. 가중은 적합한 수학적 모델(예를 들면, 실시예 7에서 제공된 모델)로 가중치에 따라 부분 특이적 파라미터를 조절하고/하거나, 전환시키고/시키거나 변환시키는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 부분 특이적 태아 분획 추정치에 따라 샘플에 대한 태아 분획이 측정된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 부분에 대한 부분 특이적 파라미터의 가중 또는 조절에 따라 샘플(예를 들면, 검사 샘플)에 대한 태아 분획이 측정(예를 들면, 추정)된다. 일부 실시양태에서, 검사 샘플에 대한 태아 핵산 분획은 조정된 카운트 또는 조정된 카운트의 서브세트에 기초하여 추정된다. 일부 실시양태에서, 검사 샘플에 대한 태아 핵산 분획은 부분에 대한 조절된 FLR, 조절된 FRS, 조절된 커버리지 및/또는 조절된 맵핑 가능성을 기초로 추정된다. 일부 실시양태에서, 약 1개 내지 약 500,000개, 약 100개 내지 약 300,000개, 약 500개 내지 약 200,000개, 약 1,000개 내지 약 200,000개, 약 1,500개 내지 약 200,000개, 또는 약 1,500개 내지 약 50,000개의 부분 특이적 파라미터들이 가중되거나 조절된다.
(예를 들면, 검사 샘플에 대한) 태아 분획은 임의의 적합한 방법에 의해 (예를 들면, 동일한 검사 샘플에 대한) 다수의 부분 특이적 태아 분획 추정치에 따라 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플에서 태아 핵산 분획의 추정 정확도를 증가시키는 방법은 하나 이상의 부분 특이적 태아 분획 추정치를 측정하는 단계를 포함하고, 이때 샘플에 대한 태아 분획의 추정치는 하나 이상의 부분 특이적 태아 분획 추정치에 따라 측정된다. 일부 실시양태에서, 샘플(예를 들면, 검사 샘플)에 대한 태아 핵산 분획의 추정 또는 측정은 하나 이상의 부분 특이적 태아 분획 추정치를 합산하는 단계를 포함한다. 합산은 다수의 부분 특이적 태아 분획 추정치에 따라 평균치, 평균, 중간치, AUC 또는 적분값을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플에서 태아 핵산 분획의 추정 정확도를 증가시키는 방법은 기준 게놈의 부분들에 맵핑된 서열 리드의 카운트를 수득하는 단계를 포함하고, 이때 상기 서열 리드는 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플로부터의 세포 유리 순환 핵산의 리드이고, 이때 수득된 카운트의 적어도 서브세트는 게놈의 또 다른 영역의 총 카운트에 대비한 태아 핵산의 카운트보다 큰 수의, 게놈의 영역으로부터의 총 카운트에 대비한, 태아 핵산으로부터 유래한 카운트를 제공하는 게놈의 영역으로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 태아 핵산 분획의 추정치는 부분들의 서브세트에 따라 측정되고, 이때 부분들의 서브세트는 또 다른 부분의 태아 핵산의 카운트보다 큰 수의, 태아 핵산으로부터 유래한 카운트가 맵핑되는 부분에 따라 선택된다. 일부 실시양태에서, 부분들의 서브세트는 또 다른 부분의, 비태아 핵산에 대비한 태아 핵산의 카운트보다 큰 수의, 비태아 핵산에 대비한, 태아 핵산으로부터 유래한 카운트가 맵핑되는 부분에 따라 선택된다. 부분의 전부 또는 서브세트에 맵핑된 카운트는 가중되어, 가중된 카운트를 제공할 수 있다. 가중된 카운트는 태아 핵산 분획을 추정하는 데에 사용될 수 있고, 카운트는 또 다른 부분의 태아 핵산의 카운트보다 큰 수의, 태아 핵산으로부터 유래한 카운트가 맵핑되는 부분에 따라 가중될 수 있다. 일부 실시양태에서, 카운트는 또 다른 부분의 비태아 핵산에 대비한 태아 핵산의 카운트보다 큰 수의, 비태아 핵산에 대비한, 태아 핵산으로부터 유래한 카운트가 맵핑되는 부분에 따라 가중된다.
샘플에 대한 다수의 부분 특이적 태아 분획 추정치들에 따라 샘플(예를 들면, 검사 샘플)에 대한 태아 분획을 측정할 수 있고, 이때 부분 특이적 추정치는 게놈의 임의의 적합한 영역 또는 분절의 부분으로부터 유래한다. 적합한 염색체(예를 들면, 하나 이상의 선택된 염색체, 하나 이상의 상염색체, 성염색체(예를 들면, ChrX 및/또는 ChrY), 이배수체 염색체, 정배수체 염색체 등 또는 이들의 조합)의 하나 이상의 부분에 대한 부분 특이적 태아 분획 추정치를 측정할 수 있다.
부분 특이적 파라미터, 가중치, 부분 특이적 태아 분획 추정치(예를 들면, 가중), 및/또는 태아 분획 측정치는 적합한 시스템, 기계, 장치, (예를 들면, 실행 가능한 프로그램이 저장되어 있는) 비일시적 컴퓨터 판독 가능 기억 매체 등 또는 이들의 조합물에 의해 측정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 부분 특이적 파라미터, 가중치, 부분 특이적 태아 분획 추정치(예를 들면, 가중), 및/또는 태아 분획 측정치는 (예를 들면, 부분적으로) 하나 이상의 마이크로프로세서 및 메모리를 포함하는 시스템 또는 기계에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 부분 특이적 파라미터, 가중치, 부분 특이적 태아 분획 추정치(예를 들면, 가중), 및/또는 태아 분획 측정치는 (예를 들면, 부분적으로) 실행 가능한 프로그램이 저장되어 있는 비일시적 컴퓨터 판독 가능 기억 매체에 의해 측정되고, 이때 상기 프로그램은 마이크로프로세서가 측정을 수행하도록 명령한다.
태아 배수성
일부 실시양태에서, 태아 배수성 측정은 부분적으로 유전적 변이(예를 들면, 염색체 이배수성, 삼염색체성)의 존재 또는 부재를 확인하는 데에 이용된다. 태아 배수성은 부분적으로 본원에 기재된 방법을 포함하는, 적합한 태아 분획 측정 방법에 의해 측정된 태아 분획의 측정치로부터 측정될 수 있다. 태아 배수성 및/또는 유전적 변이(예를 들면, 이배수성)의 존재는 태아 분획에 따라 확인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 태아 배수성은 태아 분획 측정 및 방정식 8, 20 또는 21, 또는 이들의 변경된 식 또는 유도된 식에 따라 측정된다(실시예 2). 일부 실시양태에서, 태아 배수성은 하기 방법에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 하기 각각의 방법은 다수의 샘플들에 대한 게놈의 부분(즉, 부분 i)에 대해 측정된 계산된 기준 카운트 Fi (종종 fi 로서 표시됨)를 요구하고, 이때 상기 게놈의 부분 i에 대한 태아의 배수성은 정배수체이다. 일부 실시양태에서, 불확실성 값(예를 들면, 표준 편차, σ)은 기준 카운트 fi 에 대해 측정된다. 일부 실시양태에서, 기준 카운트 fi , 불확실성 값, 검사 샘플 카운트 및/또는 측정된 태아 분획(F)이 하기 방법에 따라 태아 배수성을 측정하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 기준 카운트(예를 들면, 평균치, 평균 또는 중간 기준 카운트)는 본원에 기재된 방법(예를 들면, 부분별 정규화, GC 함량에 의한 정규화, 선형 및 비선형 최소 자승 회귀, LOESS, GC LOESS, LOWESS, PERUN, RM, GCRM 및/또는 이들의 조합)에 의해 정규화된다. 일부 실시양태에서, 정배수체인 게놈의 분절의 기준 카운트는 기준 카운트가 PERUN에 의해 정규화될 때 1과 동등하다. 일부 실시양태에서, (예를 들면, 정배수체인 것으로 공지된 태아에 대한) 기준 카운트 및 게놈의 부분 또는 분절에 대한 검사 샘플의 카운트 둘 다가 PERUN에 의해 정규화되고, 기준 카운트는 1과 동등하다. 마찬가지로, 일부 실시양태에서, 정배수체인 게놈의 부분 또는 분절의 기준 카운트는 이 카운트가 기준 카운트의 중간치에 의해 정규화될(즉, 나누어질) 때 1과 동등하다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, (예를 들면, 정배수체인 태아에 대한) 기준 카운트 및 게놈의 부분 또는 분절에 대한 검사 샘플의 카운트 둘 다가 중간 기준 카운트에 의해 정규화되고, 정규화된 기준 카운트는 1과 동등하고, 검사 샘플 카운트는 중간 기준 카운트에 의해 정규화된다(예를 들면, 나누어진다). 일부 실시양태에서, (예를 들면, 정배수체인 태아에 대한) 기준 카운트 및 게놈의 부분 또는 분절에 대한 검사 샘플의 카운트 둘 다가 GCRM, GC, RM 또는 적합한 방법에 의해 정규화된다. 일부 실시양태에서, 기준 카운트는 평균치, 평균 또는 중간 기준 카운트이다. 기준 카운트는 종종 부분에 대한 정규화된 카운트(예를 들면, 정규화된 게놈 구획 수준)이다. 일부 실시양태에서, 기준 카운트 및 검사 샘플에 대한 카운트는 미가공 카운트이다. 일부 실시양태에서, 기준 카운트는 평균치, 평균 또는 중간 카운트 프로파일로부터 측정된다. 일부 실시양태에서, 기준 카운트는 계산된 게놈 구획 수준이다. 일부 실시양태에서, 기준 샘플의 기준 카운트 및 검사 샘플(예를 들면, 환자 샘플, 예를 들면, yi )의 카운트는 동일한 방법 또는 프로세스에 의해 정규화된다.
일부 실시양태에서, 태아 분획(F)의 측정치가 측정된다. 그 다음, 이 태아 분획 값은 방정식 8, 이의 유도된 식 또는 변경된 식에 따라 태아 배수성을 측정하는 데에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 태아가 정배수체인 경우 음의 값이 수득되고, 태아가 정배수체가 아닌 경우 양의 값이 수득된다. 일부 실시양태에서, 음의 값은 태아가 고려되는 게놈의 분절에 대한 정배수체라는 것을 표시한다. 일부 실시양태에서, 음의 값이 아닌 값은 태아가 이배수성(예를 들면, 중복)을 포함한다는 것을 표시한다. 일부 실시양태에서, 음의 값이 아닌 값은 태아가 삼염색체성을 포함한다는 것을 표시한다. 일부 실시양태에서, 임의의 양의 값은 태아가 이배수성(예를 들면, 삼염색체성, 중복)을 포함한다는 것을 표시한다.
일부 실시양태에서, 제곱 잔차의 합계가 측정된다. 예를 들면, 방정식 8로부터 유도된 제곱 잔차의 합계를 나타내는 방정식은 방정식 18로 예시된다. 일부 실시양태에서, 제곱 잔차의 합계는 1의 값으로 설정된 배수성 값 X(방정식 9 참조) 및 3/2의 값으로 설정된 배수성 값(방정식 13 참조)에 대해 방정식 8로부터 측정된다. 일부 실시양태에서, 제곱 잔차의 합계(방정식 9 및 13)는 게놈 또는 염색체의 분절(예를 들면, 게놈의 분절 내의 기준 게놈 i의 모든 부분들)에 대해 측정된다. 예를 들면, 제곱 잔차의 합계(예를 들면, 방정식 9 및 13)는 21번 염색체, 13번 염색체, 18번 염색체 또는 이들의 부분에 대해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 태아의 배수성 상태를 확인하기 위해, 방정식 13의 결과를 방정식 9로부터 빼어 값 phi에 도달한다(예를 들면, 방정식 14 참조). 일부 실시양태에서, 값 phi의 부호(즉, 양 또는 음)는 태아 이배수성의 존재 또는 부재를 결정한다. 일부 실시양태에서, 음의 값인 phi 값(예를 들면, 방정식 14로부터 유도됨)은 이배수성의 부재(예를 들면, 태아가 기준 게놈 i의 부분에 대한 정배수체라는 것)를 표시하고, 음의 값이 아닌 phi 값은 이배수성(예를 들면, 삼염색체성)의 존재를 표시한다.
일부 실시양태에서, 기준 카운트 fi , 기준 카운트에 대한 불확실성 값 σ 및/또는 측정된 태아 분획(F)은 기준 게놈 i의 모든 부분들의 합계에 대한 제곱 잔차의 합계를 측정하기 위해 방정식 9 및 13에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 기준 카운트 fi , 기준 카운트에 대한 불확실성 값 σ 및/또는 측정된 태아 분획(F)은 태아 배수성을 측정하기 위해 방정식 9 및 13에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 검사 샘플에 대한 카운트(예를 들면, 정규화된 카운트, 예를 들면, 계산된 게놈 구획 수준)(부분 i에 대해 yi 로 표시됨)는 부분 i에 대한 태아의 배수성 상태를 확인하는 데에 사용된다. 예를 들면, 일부 실시양태에서 게놈의 분절에 대한 배수성 상태는 기준 카운트 fi , (예를 들면, 기준 카운트로부터의) 불확실성 값, 검사 샘플에 대해 측정된 태아 분획(F) 및 검사 샘플에 대해 측정된 카운트 yi 에 따라 확인되고, 이때 배수성 상태는 방정식 14, 또는 이의 유도된 식 또는 변경된 식에 따라 확인된다. 일부 실시양태에서, 카운트 yi 및/또는 기준 카운트는 본원에 기재된 방법(예를 들면, 부분별 정규화, GC 함량에 의한 정규화, 선형 및 비선형 최소 자승 회귀, LOESS, GC LOESS, LOWESS, PERUN, RM, GCRM 및 이들의 조합)에 의해 정규화된다. 일부 실시양태에서, 게놈 또는 염색체의 부분 또는 분절에 대한 태아 배수성 상태(예를 들면, 정배수체, 이수체, 삼염색체성)는 상기 단락들 및 실시예 단락에 기재된 비한정적 예에 의해 확인된다.
일부 실시양태에서, 태아 분획이 검사 샘플로부터 측정되고, 카운트 y가 검사 샘플에 대해 측정되고, 이들 둘 다가 검사 샘플로부터 태아에 대한 배수성을 측정하는 데에 사용된다. 본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, X로 표시된 태아 배수성의 값은 고정되지 않거나 추정되지 않는다. 본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 태아 분획 F는 고정된다. 일부 실시양태에서, 배수성(예를 들면, 배수성 값)은 방정식 20 또는 21에 따라 게놈의 부분 또는 분절에 대해 측정된다(실시예 2). 이 방법의 일부 실시양태에서, 배수성 값이 측정되고, 이때 이 값은 1, 3/2 또는 5/4에 가깝다. 일부 실시양태에서, 약 1의 배수성 값은 정배수체 태아를 표시하고, 약 3/2의 값은 태아 삼염색체성을 표시하고, 쌍둥이의 경우 약 5/4의 값은 1명의 태아가 삼염색체성을 포함하고 다른 태아가 고려되는 게놈의 부분 또는 분절에 대한 정배수체라는 것을 표시한다. 태아 배수성 측정으로부터 태아 이배수성의 존재 또는 부재를 확인하는 것에 대한 추가 정보는 하기 또 다른 단락에서 논의되어 있다.
일부 실시양태에서, 태아 분획이 측정되고 그의 측정된 값에서 고정되고 태아 배수성이 회귀로부터 측정된다. 임의의 적합한 회귀가 이용될 수 있고, 이의 비한정적 예는 선형 회귀, 비선형 회귀(예를 들면, 다항 회귀) 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선형 회귀는 방정식 8, 20 또는 21, 및/또는 이들의 유도된 식 또는 변경된 식에 따라 이용된다. 일부 실시양태에서, 이용된 선형 회귀는 방정식 8, 20 또는 21, 및/또는 이들의 유도된 식 또는 변경된 식으로부터 유도된 제곱 잔차의 합계에 따른다. 일부 실시양태에서, 태아 배수성은 방정식 8, 20 또는 21, 및/또는 이들의 유도된 식 또는 변경된 식에 따라 측정되고, 회귀는 이용되지 않는다. 일부 실시양태에서, 태아 배수성은 기준 게놈 i의 다수의 부분들에 대해 방정식 8, 20 또는 21, 및/또는 이들의 유도된 식 또는 변경된 식으로부터 유도된 제곱 잔차의 합계에 따라 측정되고, 회귀는 이용되지 않는다. 방정식의 유도된 식은 방정식의 수학적 증명으로부터 수득된 방정식의 임의의 변경된 식이다.
일부 실시양태에서, (앞서 본원에 기재된) 기준 카운트 fi , 불확실성 값 σ 및/또는 측정된 태아 분획(F)은 태아 배수성을 측정하기 위해 방정식 20 및 21에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 기준 카운트 fi , 불확실성 값 σ 및/또는 측정된 태아 분획(F)은 부분 i에 대한 또는 기준 게놈 i의 다수의 부분들 전체(예를 들면, 염색체 또는 이의 분절에 대한 기준 게놈 i의 모든 부분들 전체)에 대한 태아 배수성 X를 측정하기 위해 방정식 20 또는 21에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 검사 샘플에 대한 카운트(예를 들면, 정규화된 카운트, 계산된 게놈 구획 수준)(부분 i에 대해 yi 로 표시됨)는 기준 게놈 i의 다수의 부분들로 표시된 게놈의 분절에 대한 태아의 배수성을 측정하는 데에 사용된다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 게놈의 분절에 대한 배수성 X는 기준 카운트 fi , 불확실성 값, 검사 샘플에 대해 측정된 태아 분획(F) 및 검사 샘플에 대해 측정된 카운트 yi 에 따라 측정되고, 이때 배수성은 방정식 20 또는 21, 또는 이들의 유도된 식 또는 변경된 식에 따라 측정된다. 일부 실시양태에서, 카운트 yi 및/또는 기준 카운트는 본원에 기재된 방법(예를 들면, 부분별 정규화, GC 함량에 의한 정규화, 선형 및 비선형 최소 자승 회귀, LOESS, GC LOESS, LOWESS, PERUN, RM, GCRM 및 이들의 조합)에 의해 정규화된다. 일부 실시양태에서, 카운트 yi 및/또는 기준 카운트는 본원에 기재된 방법(예를 들면, 부분별 정규화, GC 함량에 의한 정규화, 선형 및 비선형 최소 자승 회귀, LOESS, GC LOESS, LOWESS, PERUN, RM, GCRM 및 이들의 조합)에 의해 정규화되고/되거나 프로세싱된다. 일부 실시양태에서, 카운트 yi 및 fi 는 게놈 또는 염색체의 동일한 부분 또는 분절에 맵핑된 카운트이다.
불확실성 값 σ는 오차의 적합한 척도일 수 있고, 이러한 척도의 비한정적 예는 표준 편차, 표준 오차, 계산된 분산, p-값 및/또는 평균 절대 편차(MAD)를 포함한다. 불확실성 값 σ는 임의의 적합한 측정치에 대해 측정될 수 있고, 이러한 측정치의 비한정적 예는 Z-점수, Z-값, t-값, p-값, 교차검증 오차, 게놈 구획 수준, 계산된 게놈 구획 수준, 수준, 카운트 등 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, σ는 1의 값으로 설정된다. 일부 실시양태에서, σ는 1의 값으로 설정되지 않는다. 일부 실시양태에서, σ의 값은 추정되고 종종 측정되고/되거나 계산된다.
일부 실시양태에서, M i 은 게놈 i의 부분에 대한 모체의 배수성(즉, 모체 배수성)이다. 일부 실시양태에서, M i 은 y i 가 측정되는 환자와 동일한 환자(예를 들면, 동일한 검사 샘플)에 대해 측정된다. 일부 실시양태에서, 모체 배수성 M i 은 공지되어 있거나 본원에 기재된 방법에 따라 측정된다. 일부 실시양태에서, 모체 배수성은 패딩 전 또는 후에(예를 들면, 수준을 조절한 후에) 측정된다. 일부 실시양태에서, M i 은 프로파일의 가시화로부터 추정되거나 측정된다. 일부 실시양태에서, 모체 배수성 M i 는 공지되어 있지 않다. 일부 실시양태에서, 모체 배수성 M i 은 추정된다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 모체가 평가되는 게놈의 분절에서 결실 및/또는 중복을 갖지 않는다는 것이 추정되거나 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 모체 배수성이 1인 것이 추정되거나 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 모체 배수성은 패딩 후(예를 들면, 수준을 조절한 후)에 1의 값으로 설정된다. 일부 실시양태에서, 모체 배수성은 무시되고 1의 값으로 설정된다. 일부 실시양태에서, 방정식 21은 모체가 평가되는 게놈의 분절에서 결실 및/또는 중복을 갖지 않는다는 가정 하에 방정식 20으로부터 유도된다.
일부 실시양태에서, 태아 배수성을 측정하는 방법은 임신 여성으로부터 수득된 검사 샘플에 대한 핵산 서열 리드에 따른다. 일부 실시양태에서, 서열 리드는 샘플(예를 들면, 검사 샘플)로부터의 세포 유리 순환 핵산의 리드이다. 일부 실시양태에서, 태아 배수성을 측정하는 방법은 기준 게놈의 부분들에 맵핑된 서열 리드의 카운트를 수득하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 리드는 기준 게놈의 부분들의 서브세트에 맵핑된다. 특정 실시양태에서, 태아 배수성의 측정은 태아 분획의 측정을 포함한다. 일부 실시양태에서, 태아 배수성의 측정은 게놈 구획 수준의 계산 또는 측정을 포함한다. 특정 실시양태에서, 태아 배수성의 측정은 태아 분획의 측정 및 게놈 구획 수준의 계산 또는 측정을 포함한다. 태아 분획 및 계산된 게놈 구획 수준은 동일한 검사 샘플(예를 들면, 검사 샘플의 동일한 부분)로부터 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 태아 분획 및 계산된 게놈 구획 수준은 동일한 검사 샘플(예를 들면, 검사 샘플의 동일한 부분)로부터 수득된 동일한 리드로부터 측정된다. 특정 실시양태에서, 태아 분획 및 계산된 게놈 구획 수준은 동일한 서열결정 실시 및/또는 동일한 유동 셀로부터 수득된 동일한 리드로부터 측정된다. 일부 실시양태에서, 태아 분획 및 계산된 게놈 구획 수준은 동일한 장치 및/또는 기계(예를 들면, 서열결정 장치, 유동 셀 등)로부터 측정된다.
일부 실시양태에서, 태아 배수성을 측정하는 방법은 태아 분획 측정치 및 정규화된 카운트(예를 들면, 계산된 게놈 구획 수준)에 따라 결정되고, 이때 태아 분획 측정치 및 정규화된 카운트(예를 들면, 계산된 게놈 구획 수준)는 검사 샘플의 상이한 부분들(예를 들면, 동일한 대상체 또는 환자로부터 거의 동일한 시간에 채취된 상이한 분취물들 또는 예를 들면, 상이한 검사 샘플들)로부터 측정된다. 예를 들면, 종종 태아 분획은 검사 샘플의 제1 부분으로부터 측정되고, 정규화된 카운트 및/또는 게놈 구획 수준은 검사 샘플의 제2 부분으로부터 측정된다. 일부 실시양태에서, 태아 분획 및 계산된 게놈 구획 수준은 동일한 대상체(예를 들면, 환자)로부터 채취된 상이한 검사 샘플들(예를 들면, 검사 샘플의 상이한 부분들)로부터 측정된다. 일부 실시양태에서, 태아 분획 및 계산된 게놈 구획 수준은 상이한 시간에 수득된 리드로부터 측정된다. 일부 실시양태에서, 태아 분획 측정치 및 정규화된 카운트(예를 들면, 계산된 게놈 구획 수준)는 상이한 장치 및/또는 상이한 기계(예를 들면, 서열결정 장치, 유동 셀 등)로부터 측정된다.
결과
본원에 기재된 방법은 샘플에 대한 유전적 변이(예를 들면, 태아 이배수성)의 존재 또는 부재의 확인을 제공하여 결과를 제공(예를 들면, 유전적 변이(예를 들면, 태아 이배수성)의 존재 또는 부재를 확인시켜주는 결과를 제공)할 수 있다. 유전적 변이는 종종 기준물에 비해 검사 대상체의 게놈 또는 유전 정보에서 검출가능한 변화를 초래하는, 유전 정보(예를 들면, 염색체, 염색체의 분절, 다형성 영역, 전위된 영역, 변경된 뉴클레오티드 서열 등 또는 이들의 조합)의 획득, 상실 및/또는 변경(예를 들면, 중복, 결실, 융합, 삽입, 돌연변이, 재조직화, 치환 또는 비정상적인 메틸화)을 포함한다. 유전적 변이의 존재 또는 부재는 부분들에 맵핑된 서열 리드(예를 들면, 카운트, 기준 게놈의 게놈 부분의 카운트)를 변환시키고/시키거나, 분석하고/하거나 조작함으로써 확인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 결과의 확인은 임신 여성으로부터의 핵산을 분석하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결과는 임신 여성으로부터 수득된 카운트(예를 들면, 정규화된 카운트)에 따라 확인되고, 이때 카운트는 임신 여성으로부터 수득된 핵산으로부터의 카운트이다.
본원에 기재된 방법은 종종 태아를 가진 임신 여성으로부터의 검사 샘플에 대한 태아 이배수성(예를 들면, 전체적인 염색체 이배수성, 부분적인 염색체 이배수성 또는 분절 염색체 이상(예를 들면, 모자이크 현상, 결실 및/또는 삽입))의 존재 또는 부재를 확인한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 태아를 가진 임신 여성으로부터의 샘플에 대한 정배수성 또는 정배수성의 결여(비-정배수성)를 검출한다. 본원에 기재된 방법은 하나 이상의 염색체(예를 들면, 13번 염색체, 18번 염색체, 21번 염색체 또는 이들의 조합) 또는 이의 분절에 대한 삼염색체성을 검출한다.
일부 실시양태에서, 유전적 변이(예를 들면, 태아 이배수성)의 존재 또는 부재는 본원에 기재된 방법, 당분야에서 공지된 방법, 또는 이들의 조합에 의해 확인된다. 유전적 변이의 존재 또는 부재는 일반적으로 기준 게놈의 부분들에 맵핑된 서열 리드의 카운트로부터 확인된다. 유전적 변이의 존재 또는 부재를 확인하는 데에 사용된 서열 리드의 카운트는 종종 미가공 카운트 및/또는 필터링된 카운트이고, 종종 정규화된 카운트이다. 적합한 정규화 프로세스 또는 프로세스들을 이용하여 정규화된 카운트를 생성할 수 있고, 이러한 프로세스의 비한정적 예는 부분별 정규화, GC 함량에 의한 정규화, 선형 및 비선형 최소 자승 회귀, LOESS, GC LOESS, LOWESS, PERUN, RM, GCRM 및 이들의 조합을 포함한다. 정규화된 카운트는 종종 부분의 특정 세트 또는 세트들에 대한 프로파일 내의 하나 이상의 수준 또는 수준들로서 표현된다. 정규화된 카운트는 종종 유전적 변이의 존재 또는 부재의 확인 전에 조정되거나 패딩된다.
일부 실시양태에서, 결과는 하나 이상의 수준에 따라 확인된다. 일부 실시양태에서, 유전적 변이(예를 들면, 염색체 이배수성)의 존재 또는 부재는 하나 이상의 조절된 수준에 따라 확인된다. 일부 실시양태에서, 유전적 변이(예를 들면, 염색체 이배수성)의 존재 또는 부재는 1개 내지 약 10,000개의 조절된 수준을 포함하는 프로파일에 따라 확인된다. 종종, 유전적 변이(예를 들면, 염색체 이배수성)의 존재 또는 부재의 확인은 약 1회 내지 약 1,000회, 1회 내지 약 900회, 1회 내지 약 800회, 1회 내지 약 700회, 1회 내지 약 600회, 1회 내지 약 500회, 1회 내지 약 400회, 1회 내지 약 300회, 1회 내지 약 200회, 1회 내지 약 100회, 1회 내지 약 50회, 1회 내지 약 25회, 1회 내지 약 20회, 1회 내지 약 15회, 1회 내지 약 10회, 또는 1회 내지 약 5회의 조절을 포함하는 프로파일에 따라 확인된다. 일부 실시양태에서, 유전적 변이(예를 들면, 염색체 이배수성)의 존재 또는 부재는 약 1회의 조절(예를 들면, 1개의 조절된 수준)을 포함하는 프로파일에 따라 확인된다. 일부 실시양태에서, 결과는 1회 이상, 2회 이상, 3회 이상, 5회 이상, 6회 이상, 7회 이상, 8회 이상, 9회 이상 또는 종종 10회 이상의 조절을 포함하는 하나 이상의 프로파일(예를 들면, 염색체 또는 이의 분절의 프로파일)에 따라 확인된다. 일부 실시양태에서, 유전적 변이(예를 들면, 염색체 이배수성)의 존재 또는 부재는 프로파일 내의 일부 수준들이 조절되어 있지 않은 프로파일에 따라 확인된다. 일부 실시양태에서, 유전적 변이(예를 들면, 염색체 이배수성)의 존재 또는 부재는 조절되지 않은 프로파일에 따라 확인된다.
일부 실시양태에서, 프로파일 내의 수준(예를 들면, 제1 수준)의 조절은 거짓 확인 또는 거짓 결과를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 프로파일 내의 수준(예를 들면, 제1 수준)의 조절은 거짓 확인 또는 거짓 결과의 빈도 및/또는 확률(예를 들면, 통계학적 확률, 가능성)을 감소시킨다. 거짓 확인 또는 결과는 정확하지 않은 확인 또는 결과일 수 있다. 거짓 확인 또는 결과는 대상체(예를 들면, 임신 여성, 태아 및/또는 이들의 조합)의 실제 또는 진짜 유전적 구성, 또는 실제 또는 진짜 유전적 소인(예를 들면, 유전적 변이의 존재 또는 부재)을 반영하지 않는 확인 또는 결과일 수 있다. 일부 실시양태에서, 거짓 확인 또는 결과는 거짓 음성 확인이다. 일부 실시양태에서, 음성 확인 또는 음성 결과는 유전적 변이(예를 들면, 이배수성, 카피 수 변이)의 부재이다. 일부 실시양태에서, 거짓 확인 또는 거짓 결과는 거짓 양성 확인 또는 거짓 양성 결과이다. 일부 실시양태에서, 양성 확인 또는 양성 결과는 유전적 변이(예를 들면, 이배수성, 카피 수 변이)의 존재이다. 일부 실시양태에서, 확인 또는 결과는 진단에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 확인 또는 결과는 태아에 대한 확인 또는 결과이다.
유전적 변이(예를 들면, 태아 이배수성)의 존재 또는 부재는 종종 부분의 세트에 대한 카운트를 기준물과 비교하지 않고 확인된다. 검사 샘플에 대해 측정되고 검사 영역(예를 들면, 관심있는 부분의 세트) 내에 있는 카운트는 본원에서 "검사 카운트"로서 지칭된다. 검사 카운트는 종종 본원에 기재된 프로세싱된 카운트, 평균으로서 산출된 또는 합산된 카운트, 표시치, 정규화된 카운트, 또는 하나 이상의 수준 또는 수준들이다. 일부 실시양태에서, 검사 카운트는 부분의 세트에 대해 평균으로서 산출되거나 합산되고(예를 들면, 평균치, 평균, 중간치, 모드 또는 합계가 계산되고), 평균으로서 산출되거나 합산된 카운트는 역치 또는 범위와 비교된다. 검사 카운트는 종종 부분의 제1 세트에 대한 카운트 대 부분의 제2 세트에 대한 카운트의 비 또는 백분율로서 표현될 수 있는 표시치로서 표현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 부분의 제1 세트는 하나 이상의 검사 염색체(예를 들면, 13번 염색체, 18번 염색체, 21번 염색체, 또는 이들의 조합)에 대한 부분의 세트이고, 종종 부분의 제2 세트는 게놈 또는 게놈의 일부(예를 들면, 상염색체, 또는 상염색체 및 성염색체)에 대한 부분의 세트이다. 일부 실시양태에서, 부분의 제1 세트는 하나 이상의 성염색체(예를 들면, X 염색체, Y 염색체 또는 이들의 조합물)에 대한 부분의 세트이고, 종종 부분의 제2 세트는 하나 이상의 상염색체에 대한 부분의 세트이다. 일부 실시양태에서, 부분의 제1 세트는 검사 염색체(예를 들면, X 염색체, Y 염색체 또는 이들의 조합물)의 하나 이상의 제1 영역에 대한 부분의 세트이고, 종종 부분의 제2 세트는 검사 염색체(예를 들면, X 염색체, Y 염색체 또는 이들의 조합물)의 하나 이상의 제2 영역 또는 전체 검사 염색체에 대한 부분의 세트이다. 일부 실시양태에서, 표시치는 역치 또는 범위와 비교된다. 일부 실시양태에서, 검사 카운트는 부분의 세트에 대한 정규화된 카운트에 대한 하나 이상의 수준 또는 수준들로서 표현되고, 하나 이상의 수준 또는 수준들은 역치 또는 범위와 비교된다. 특정 역치 초과 또는 미만의, 특정 범위 내의 또는 특정 범위 밖의 검사 카운트(예를 들면, 평균으로서 산출되거나 합산된 카운트, 표시치, 정규화된 카운트, 하나 이상의 수준 또는 수준들)는 종종 유전적 변이의 존재 또는 정배수성의 결여(예를 들면, 비-정배수성)를 확인시켜준다. 특정 역치 초과 또는 미만의, 특정 범위 내의 또는 특정 범위 밖의 검사 카운트(예를 들면, 평균으로서 산출되거나 합산된 카운트, 표시치, 정규화된 카운트, 하나 이상의 수준 또는 수준들)는 종종 유전적 변이의 부재 또는 정배수성을 확인시켜준다.
유전적 변이(예를 들면, 태아 이배수성)의 존재 또는 부재는 종종 카운트의 비교에 의해 확인되고, 이러한 카운트의 비한정적 예는 검사 카운트, 기준 카운트, 미가공 카운트, 필터링된 카운트, 평균으로서 산출되거나 합산된 카운트, 표시치(예를 들면, 염색체 표시치), 정규화된 카운트, (예를 들면, 부분의 세트, 예를 들면, 게놈 구획 수준, 프로파일에 대한) 하나 이상의 수준 또는 수준들, Z-점수 등 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 검사 카운트는 기준물(예를 들면, 기준 카운트)과 비교된다. 기준물(예를 들면, 기준 카운트)은 카운트의 적합한 측정치일 수 있고, 이러한 카운트의 비한정적 예는 미가공 카운트, 필터링된 카운트, 평균으로서 산출되거나 합산된 카운트, 표시치(예를 들면, 염색체 표시치), 정규화된 카운트, (예를 들면, 부분의 세트, 예를 들면, 게놈 구획 수준, 프로파일에 대한) 하나 이상의 수준 또는 수준들, Z-점수 등 또는 이들의 조합을 포함한다. 기준 카운트는 종종 정배수체 검사 영역에 대한 카운트, 또는 정배수체인 게놈 또는 염색체의 분절로부터의 카운트이다. 일부 실시양태에서, 기준 카운트 및 검사 카운트는 동일한 샘플 및/또는 동일한 대상체로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 기준 카운트는 상이한 샘플 및/또는 상이한 대상체로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 기준 카운트는 검사 카운트가 유도되고/되거나 측정되는 게놈의 상응하는 분절로부터 측정되고/되거나 이 분절과 비교된다. 상응하는 분절은 기준 게놈의 동일한 위치에 맵핑되는 분절, 부분 또는 부분의 세트를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 기준 카운트는 시험 카운트가 유도되고/되거나 측정되는 게놈의 상이한 분절로부터 측정되고/되거나 이 분절과 비교된다.
일부 실시양태에서, 검사 카운트는 종종 부분의 제1 세트에 대한 카운트이고, 기준물은 부분의 제1 세트와 상이한 부분의 제2 세트에 대한 카운트를 포함한다. 기준 카운트는 종종 검사 샘플이 수득된 임신 여성과 동일한 임신 여성으로부터의 핵산 샘플에 대한 카운트이다. 일부 실시양태에서, 기준 카운트는 검사 샘플이 수득된 여성과 상이한 1명 이상의 임신 여성으로부터의 핵산 샘플에 대한 카운트이다. 일부 실시양태에서, 부분의 제1 세트는 13번 염색체, 18번 염색체, 21번 염색체, 이들의 분절 또는 이들의 조합에 존재하고, 부분의 제2 세트는 또 다른 염색체 또는 염색체들, 또는 이들의 분절에 존재한다. 비한정적 예에서, 부분의 제1 세트가 21번 염색체 또는 이의 분절에 존재하는 경우, 부분의 제2 세트는 종종 또 다른 염색체(예를 들면, 1번 염색체, 13번 염색체, 14번 염색체, 18번 염색체, 19번 염색체, 이들의 분절 또는 이들의 조합)에 존재한다. 기준물은 종종 전형적으로 정배수체인 염색체 또는 이의 분절에 위치한다. 예를 들면, 1번 염색체 및 19번 염색체는 종종 1번 염색체 및 19번 염색체 이배수성과 관련된 높은 초기 태아 사망률로 인해 태아에서 정배수체이다. 검사 카운트와 기준 카운트 사이의 편차의 척도가 생성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 기준물은 검사 카운트의 경우와 동일한 부분의 세트에 대한 카운트를 포함하고, 이때 기준물에 대한 카운트는 하나 이상의 기준 샘플(예를 들면, 다수의 기준 대상체들로부터의 다수의 기준 샘플들)로부터의 카운트이다. 기준 샘플은 종종 검사 샘플이 수득된 여성과 상이한 1명 이상의 임신 여성으로부터의 샘플이다. 검사 카운트와 기준 카운트 사이의 편차의 척도(예를 들면, 불확실성의 척도, 불확실성 값)가 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 편차의 척도는 검사 카운트로부터 결정된다. 일부 실시양태에서, 편차의 척도는 기준 카운트로부터 결정된다. 일부 실시양태에서, 편차의 척도는 전체 프로파일 또는 프로파일 내의 부분들의 서브세트로부터 결정된다.
적합한 편차의 척도가 선택될 수 있고, 이의 비한정적 예는 표준 편차, 평균 절대 편차, 중간 절대 편차, 최대 절대 편차, 표준 점수(예를 들면, z-값, z-점수, 표준 점수, 표준화된 변수) 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기준 샘플은 검사 영역에 대한 정배수체이고, 검사 카운트와 기준 카운트 사이의 편차가 평가된다. 일부 실시양태에서, 유전적 변이의 존재 또는 부재는 게놈 또는 염색체의 분절 또는 부분에 대한 검사 카운트와 기준 카운트 사이의 편차의 수(예를 들면, 편차의 척도, MAD)에 따라 확인된다. 일부 실시양태에서, 유전적 변이의 존재는 검사 카운트와 기준 카운트 사이의 편차의 수가 약 1보다 더 크거나, 약 1.5보다 더 크거나, 약 2보다 더 크거나, 약 2.5보다 더 크거나, 약 2.6보다 더 크거나, 약 2.7보다 더 크거나, 약 2.8보다 더 크거나, 약 2.9보다 더 크거나, 약 3보다 더 크거나, 약 3.1보다 더 크거나, 약 3.2보다 더 크거나, 약 3.3보다 더 크거나, 약 3.4보다 더 크거나, 약 3.5보다 더 크거나, 약 4보다 더 크거나, 약 5보다 더 크거나 약 6보다 더 클 때 확인된다. 예를 들면, 종종 검사 카운트는 3의 편차의 척도(예를 들면, 3 시그마, 3 MAD) 초과의 수준만큼 기준 카운트와 상이하고, 유전적 변이의 존재가 확인된다. 일부 실시양태에서, 임신 여성으로부터 수득된 검사 카운트는 3의 편차의 척도(예를 들면, 3 시그마, 3 MAD) 초과의 수준만큼 기준 카운트보다 더 크고, 태아 염색체 이배수성(예를 들면, 태아 삼염색체성)의 존재가 확인된다. 검사 카운트와 기준 카운트 사이의 3 초과의 편차는 종종 비-정배수체 검사 영역(예를 들면, 유전적 변이의 존재)을 표시한다. 정배수성을 표시하는 기준 카운트보다 유의하게 더 큰 검사 카운트는 종종 삼염색체성을 확인시켜준다. 일부 실시양태에서, 임신 여성으로부터 수득된 검사 카운트는 3의 편차의 척도(예를 들면, 3 시그마, 3 MAD) 초과의 수준만큼 기준 카운트보다 더 작고, 태아 염색체 이배수성(예를 들면, 태아 일염색체성)의 존재가 확인된다. 정배수성을 표시하는 기준 카운트보다 유의하게 더 작은 검사 카운트는 종종 일염색체성을 확인시켜준다.
일부 실시양태에서, 유전적 변이의 부재는 검사 카운트와 기준 카운트 사이의 편차의 수가 약 3.5 미만, 약 3.4 미만, 약 3.3 미만, 약 3.2 미만, 약 3.1 미만, 약 3.0 미만, 약 2.9 미만, 약 2.8 미만, 약 2.7 미만, 약 2.6 미만, 약 2.5 미만, 약 2.0 미만, 약 1.5 미만 또는 약 1.0 미만일 때 확인된다. 예를 들면, 종종 검사 카운트는 3의 편차의 척도(예를 들면, 3 시그마, 3 MAD) 미만의 수준만큼 기준 카운트와 상이하고, 유전적 변이의 부재가 확인된다. 일부 실시양태에서, 임신 여성으로부터 수득된 검사 카운트는 3의 편차의 척도(예를 들면, 3 시그마, 3 MAD) 미만의 수준만큼 기준 카운트와 상이하고, 태아 염색체 이배수성(예를 들면, 태아 정배수체)의 부재가 확인된다. 일부 실시양태에서, 예를 들면, 검사 카운트와 기준 카운트 사이의 3 미만의 편차(예를 들면, 표준 편차에 대한 3-시그마)는 종종 정배수체 검사 영역(예를 들면, 유전적 변이의 부재)을 표시한다. 검사 샘플에 대한 검사 카운트와 하나 이상의 기준 대상체에 대한 기준 카운트 사이의 편차의 척도는 작도될 수 있고 가시화될 수 있다(예를 들면, z-점수 도표).
임의의 다른 적합한 기준물이 검사 샘플의 검사 영역에 대한 유전적 변이의 존재 또는 부재의 확인(또는 정배수체 또는 비-정배수체의 확인)을 위해 검사 카운트로 팩토링될 수 있다. 예를 들면, 태아 분획 측정치는 유전적 변이의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 검사 카운트로 팩토링될 수 있다. 태아 분획을 정량하는 적합한 프로세스가 이용될 수 있고, 이러한 프로세스의 비한정적 예는 질량 분광측정 프로세스, 서열결정 프로세스 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 태아 염색체 이배수성(예를 들면, 삼염색체성)의 존재 또는 부재는 부분적으로 태아 배수성 측정치로부터 확인된다. 일부 실시양태에서, 태아 배수성은 본원에 기재된 적합한 방법에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 약 1.20 이상, 1.25 이상, 1.30 이상, 약 1.35 이상, 약 1.4 이상 또는 약 1.45 이상의 태아 배수성 측정치는 태아 염색체 이배수성의 존재(예를 들면, 태아 삼염색체성의 존재)를 표시한다. 일부 실시양태에서, 약 1.20 내지 약 2.0, 약 1.20 내지 약 1.9, 약 1.20 내지 약 1.85, 약 1.20 내지 약 1.8, 약 1.25 내지 약 2.0, 약 1.25 내지 약 1.9, 약 1.25 내지 약 1.85, 약 1.25 내지 약 1.8, 약 1.3 내지 약 2.0, 약 1.3 내지 약 1.9, 약 1.3 내지 약 1.85, 약 1.3 내지 약 1.8, 약 1.35 내지 약 2.0, 약 1.35 내지 약 1.9, 약 1.35 내지 약 1.8, 약 1.4 내지 약 2.0, 약 1.4 내지 약 1.85, 또는 약 1.4 내지 약 1.8의 태아 배수성 측정치는 태아 염색체 이배수성의 존재(예를 들면, 태아 삼염색체성의 존재)를 표시한다. 일부 실시양태에서, 태아 이배수성은 삼염색체성이다. 일부 실시양태에서, 태아 이배수성은 13번 염색체, 18번 염색체 및/또는 21번 염색체의 삼염색체성이다.
일부 실시양태에서, 약 1.35 미만, 약 1.30 미만, 약 1.25 미만, 약 1.20 미만 또는 약 1.15 미만의 태아 배수성은 태아 이배수성의 부재(예를 들면, 태아 삼염색체성의 부재, 예를 들면, 정배수체)를 표시한다. 일부 실시양태에서, 약 0.7 내지 약 1.35, 약 0.7 내지 약 1.30, 약 0.7 내지 약 1.25, 약 0.7 내지 약 1.20, 약 0.7 내지 약 1.15, 약 0.75 내지 약 1.35, 약 0.75 내지 약 1.30, 약 0.75 내지 약 1.25, 약 0.75 내지 약 1.20, 약 0.75 내지 약 1.15, 약 0.8 내지 약 1.35, 약 0.8 내지 약 1.30, 약 0.8 내지 약 1.25, 약 0.8 내지 약 1.20, 또는 약 0.8 내지 약 1.15의 태아 배수성 측정치는 태아 염색체 이배수성의 부재(예를 들면, 태아 삼염색체성의 부재, 예를 들면, 정배수체)를 표시한다.
일부 실시양태에서, 약 0.8 미만, 약 0.75 미만, 약 0.70 미만 또는 약 0.6 미만의 태아 배수성은 태아 이배수성의 존재(예를 들면, 염색체 결실의 존재)를 표시한다. 일부 실시양태에서, 약 0 내지 약 0.8, 약 0 내지 약 0.75, 약 0 내지 약 0.70, 약 0 내지 약 0.65, 약 0 내지 약 0.60, 약 0.1 내지 약 0.8, 약 0.1 내지 약 0.75, 약 0.1 내지 약 0.70, 약 0.1 내지 약 0.65, 약 0.1 내지 약 0.60, 약 0.2 내지 약 0.8, 약 0.2 내지 약 0.75, 약 0.2 내지 약 0.70, 약 0.2 내지 약 0.65, 약 0.2 내지 약 0.60, 약 0.25 내지 약 0.8, 약 0.25 내지 약 0.75, 약 0.25 내지 약 0.70, 약 0.25 내지 약 0.65, 약 0.25 내지 약 0.60, 약 0.3 내지 약 0.8, 약 0.3 내지 약 0.75, 약 0.3 내지 약 0.70, 약 0.3 내지 약 0.65, 또는 약 0.3 내지 약 0.60의 태아 배수성 측정치는 태아 염색체 이배수성의 존재(예를 들면, 염색체 결실의 존재)를 표시한다. 일부 실시양태에서, 측정된 태아 이배수성은 전체 염색체 결실이다.
일부 실시양태에서, (예를 들면, 상기 배수성 측정치의 범위들 중 하나 이상의 범위에 따른) 태아 이배수성의 존재 또는 부재의 확인은 판정 대역에 따라 확인된다. 일부 실시양태에서, 값(예를 들면, 배수성 값, 태아 분획 값, 불확실성 수준) 또는 일군의 값들이 미리 한정된 범위(예를 들면, 대역, 판정 대역) 내에 속할 때 판정(예를 들면, 유전적 변이의 존재 또는 부재, 예를 들면, 결과를 확인하는 판정)이 수행된다. 일부 실시양태에서, 판정 대역은 동일한 환자 샘플로부터 수득된 일군의 값들에 따라 한정된다. 일부 실시양태에서, 판정 대역은 동일한 염색체 또는 이의 분절로부터 유도된 일군의 값들에 따라 한정된다. 일부 실시양태에서, 배수성 측정치에 기초한 판정 대역은 신뢰 수준(예를 들면, 높은 신뢰 수준, 예를 들면, 낮은 불확실성 수준) 및/또는 태아 분획에 따라 한정된다. 일부 실시양태에서, 판정 대역은 배수성 측정치 및 약 2.0% 이상, 약 2.5% 이상, 약 3% 이상, 약 3.25% 이상, 약 3.5% 이상, 약 3.75% 이상 또는 약 4.0% 이상의 태아 분획에 따라 한정된다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 태아를 가진 임신 여성으로부터 수득된 샘플에 대한 2% 이상 또는 4% 이상의 태아 분획 측정치와 함께 1.25 초과의 배수성 측정치를 기초로 태아가 삼염색체성 21을 포함한다고 판정한다. 일부 실시양태에서, 예를 들면, 태아를 가진 임신 여성으로부터 수득된 샘플에 대한 2% 이상 또는 4% 이상의 태아 분획 측정치와 함께 1.25 미만의 배수성 측정치를 기초로 태아가 정배수체라고 판정한다. 일부 실시양태에서, 판정 대역은 약 99% 이상, 약 99.1% 이상, 약 99.2% 이상, 약 99.3% 이상, 약 99.4% 이상, 약 99.5% 이상, 약 99.6% 이상, 약 99.7% 이상, 약 99.8% 이상 또는 약 99.9% 이상의 신뢰 수준에 의해 한정된다. 일부 실시양태에서, 판정 대역을 사용하지 않고 판정한다. 일부 실시양태에서, 판정 대역 및 추가 데이터 또는 정보를 사용하여 판정한다. 일부 실시양태에서, 판정 대역을 사용하지 않고 배수성 값을 기초로 판정한다. 일부 실시양태에서, 배수성 값을 계산하지 않고 판정한다. 일부 실시양태에서, 프로파일의 시각적 검사(예를 들면, 게놈 구획 수준의 시각적 검사)를 기초로 판정한다. 전체적으로 또는 부분적으로 본원에 기재된 방법에 의해 수득된 측정치, 값 및/또는 데이터를 기초로 임의의 적합한 방법으로 판정할 수 있고, 이러한 측정치, 값 및/또는 데이터의 비한정적 예는 태아 배수성 측정치, 태아 분획 측정치, 모체 배수성, 불확실성 및/또는 신뢰도 측정치, 부분 수준, 수준, 프로파일, z-점수, 기대된 염색체 표시치, 측정된 염색체 표시치, 카운트(예를 들면, 정규화된 카운트, 미가공 카운트), 태아 또는 모체 카피 수 변이(예를 들면, 분류된 카피 수 변이), 유의하게 상이한 수준, 조절된 수준(예를 들면, 패딩) 등 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-판정 대역은 판정하지 않는 대역이다. 일부 실시양태에서, 비-판정 대역은 낮은 정확도, 높은 위험, 높은 오차, 낮은 신뢰 수준, 높은 불확실성 수준 등 또는 이들의 조합을 표시하는 값 또는 일군의 값들에 의해 한정된다. 일부 실시양태에서, 비-판정 대역은 부분적으로 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2.5% 이하, 약 2.0% 이하, 약 1.5% 이하 또는 약 1.0% 이하의 태아 분획에 의해 한정된다.
일부 실시양태에서, 유전적 변이(예를 들면, 태아 이배수성)의 존재 또는 부재를 확인하는 방법은 약 90% 이상 내지 약 100%의 정확도로 수행된다. 예를 들면, 유전적 변이의 존재 또는 부재는 약 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 이상의 정확도로 확인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전적 변이의 존재 또는 부재는 다른 유전적 변이 확인 방법(예를 들면, 핵형 분석)을 이용한 경우의 정확도와 거의 동일한 또는 이 정확도보다 더 높은 정확도로 확인된다. 일부 실시양태에서, 유전적 변이의 존재 또는 부재는 약 80% 내지 약 100%의 신뢰 구간(CI)을 가진 정확도로 확인된다. 예를 들면, 신뢰 구간(CI)은 약 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 수 있다.
결과는 종종 서열 태그 밀도의 관점에서 확인될 수 있다. "서열 태그 밀도"는 정해진 게놈 구획에 대한 서열 태그 또는 리드의 정규화된 값을 지칭하고, 이때 서열 태그 밀도는 상이한 샘플들의 비교 및 후속 분석을 위해 사용된다. 서열 태그 밀도의 값은 종종 한 샘플 내에서 정규화된다. 일부 실시양태에서, 정규화는 각각의 게놈 구획 내에 속하는 태그의 수를 카운팅하고; 각각의 염색체에 대한 총 서열 태그 카운트의 중간 값을 수득하고; 상염색체 값들 전부의 중간 값을 수득하고; 이 값을, 상이한 샘플들에 대해 수득된 서열 태그의 총수의 차이를 설명하기 위한 정규화 상수로서 사용함으로써 수행될 수 있다. 서열 태그 밀도는 종종 이염색체성 염색체의 경우 약 1이다. 서열 태그 밀도는 (예를 들면, 일부 실시양태에서, 예를 들면, 단일 염색체일 수 있거나 모든 상염색체들로부터의 계산된 값일 수 있는, 실질적으로 모든 서열 태그들(게놈 서열들)로부터 유래한) 외부 표준물 또는 내부 기준물의 사용에 의해 보정될 수 있는 서열결정 인공물, 특히 G/C 편향에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 염색체 또는 염색체 영역의 용량 불균형은 표본의 다른 맵핑가능한 서열결정된 태그들 중에서 좌위의 백분율 표시치로부터 유추될 수 있다. 따라서, 특정 염색체 또는 염색체 영역의 용량 불균형은 정량적으로 측정될 수 있고 정규화될 수 있다. 서열 태그 밀도 정규화 및 정량 방법은 이하에 더 상세히 논의되어 있다.
일부 실시양태에서, 모든 서열 리드들의 일부가 성염색체(예를 들면, X 염색체, Y 염색체) 또는 이배수성에 관여하는 염색체(예를 들면, 13번 염색체, 18번 염색체, 21번 염색체)로부터의 서열 리드이고, 다른 서열 리드들은 다른 염색체로부터의 서열 리드이다. 일부 실시양태에서, 다른 염색체에 비해 성염색체 또는 이배수성에 관여하는 염색체(예를 들면, “표적 염색체”: 21번 염색체)의 상대적 크기를 고려함으로써 표적 염색체 특이적 서열의 정규화된 빈도를 기준 범위 내에서 수득할 수 있다. 예를 들면, 태아가 표적 염색체에서 이배수성을 가진 경우, 표적 염색체로부터 유래한 서열의 정규화된 빈도는 비-표적 염색체로부터 유래한 서열의 정규화된 빈도보다 통계적으로 더 크므로 이배수성의 검출을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 정규화된 빈도에서의 변화 정도는 분석된 샘플 중의 태아 핵산의 분율 농도에 의존할 것이다.
유전적 변이는 종종 의학적 질환과 관련되어 있다. 유전적 변이를 확인시켜주는 결과는 종종 질환(예를 들면, 의학적 질환), 질병, 증후군 또는 기형의 존재 또는 부재를 확인시켜주는 결과이거나, 질환, 질병, 증후군 또는 기형(예를 들면, 표 1에 나열된 비한정적 예)의 검출을 포함한다. 일부 실시양태에서, 진단은 결과의 평가를 포함한다. 본원에 기재된 방법으로 질환(예를 들면, 의학적 질환), 질병, 증후군 또는 기형의 존재 또는 부재를 확인시켜주는 결과는 종종 추가 검사(예를 들면, 핵형분석 및/또는 양수천자)에 의해 독립적으로 검증될 수 있다. 데이터의 분석 및 프로세싱은 하나 이상의 결과를 제공할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "결과"는 유전적 변이(예를 들면, 이배수성, 카피 수 변이)의 존재 또는 부재의 확인을 용이하게 하는 데이터 프로세싱의 결과를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 사용된 용어 "결과"는 유전적 변이(예를 들면, 이배수성, 카피 수 변이)의 존재 또는 부재를 예측하고/하거나 확인하는 결론을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 사용된 용어 "결과"는 대상체(예를 들면, 태아)에서 유전적 변이(예를 들면, 이배수성, 카피 수 변이)의 존재 또는 부재의 위험 또는 확률을 예측하고/하거나 확인하는 결론을 지칭한다. 진단은 종종 결과의 사용을 포함한다. 예를 들면, 건강 전문가는 결과를 분석할 수 있고 결과를 기초로 또는 부분적으로 결과를 기초로 진단을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 질환, 증후군 또는 기형(예를 들면, 표 1에 나열됨)의 확인, 검출 또는 진단은 유전적 변이의 존재 또는 부재를 확인시켜주는 결과의 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 카운팅된 맵핑된 서열 리드 또는 이의 변환물에 기초한 결과는 유전적 변이의 존재 또는 부재를 확인시켜 준다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 방법(예를 들면, 데이터 프로세싱 방법)을 이용함으로써 생성된 결과는 표 1에 나열된 하나 이상의 질환, 증후군 또는 기형의 존재 또는 부재를 확인시켜준다. 일부 실시양태에서, 진단은 질환, 증후군 또는 기형의 존재 또는 부재의 확인을 포함한다. 종종, 진단은 질환, 증후군 또는 기형의 성질 및/또는 원인으로서 유전적 변이의 확인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결과는 진단이 아니다. 결과는 종종 하나 이상의 확률의 고려와 관련하여 본원에 기재된 프로세싱 방법을 이용함으로써 생성된 하나 이상의 수치 값을 포함한다. 위험 또는 확률의 고려는 불확실성 값, 가변성의 척도, 신뢰 수준, 민감성, 특이성, 표준 편차, 변동 계수(CV) 및/또는 신뢰 수준, Z-점수, Chi 값, Phi 값, 배수성 값, 피팅된 태아 분획, 면적 비, 중간 수준 등 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 확률의 고려는 대상체가 유전적 변이를 가질 위험에 있는지 아니면 유전적 변이를 갖는지를 확인하는 것을 용이하게 할 수 있고, 유전 장애의 존재 또는 부재를 확인시켜주는 결과는 종종 이러한 고려를 포함한다.
결과는 종종 표현형이다. 결과는 종종 관련된 신뢰 수준을 가진 표현형이다(예를 들면, 불확실성 값, 예를 들면, 태아는 99%의 신뢰 수준으로 삼염색체성 21에 대한 양성을 나타내고; 임신 여성은 95%의 신뢰 수준으로 남아 태아를 갖고; 검사 대상체는 95%의 신뢰 수준에서 유전적 변이와 관련된 암에 대한 음성을 나타낸다). 결과 값을 생성하는 상이한 방법들은 종종 상이한 종류의 결과를 생성할 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 방법을 이용함으로써 생성된 결과 값을 기초로 만들어질 수 있는 4종의 가능한 점수 또는 판정이 존재한다: 진짜 양성, 거짓 양성, 진짜 음성 및 거짓 음성. 본원에서 사용된 용어 "점수", "점수들", "판정" 및 "판정들"은 특정 유전적 변이가 대상체/샘플에 존재하거나 부재할 확률의 계산을 지칭한다. 점수의 값은 예를 들면, 변이, 차이, 또는 유전적 변이에 상응할 수 있는 맵핑된 서열 리드의 비를 측정하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들면, 선택된 유전적 변이 또는 부분에 대한 양의 점수를 기준 게놈에 대해 데이터 세트로부터 계산하여 종종 의학적 질환(예를 들면, 암, 임신중독증, 삼염색체성, 일염색체성 등)와 관련된 유전적 변이의 존재 또는 부재를 확인할 수 있다. 일부 실시양태에서, 결과는 수준, 프로파일 및/또는 도표(예를 들면, 프로파일 도표)를 포함한다. 결과가 프로파일을 포함하는 실시양태에서, 적합한 프로파일 또는 프로파일의 조합이 결과를 위해 사용될 수 있다. 결과를 위해 사용될 수 있는 프로파일의 비한정적 예는 z-점수 프로파일, p-점수 프로파일, chi 값 프로파일, phi 값 프로파일 등 또는 이들의 조합을 포함한다.
유전적 변이의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 생성된 결과는 종종 널 결과(예를 들면, 2개의 클러스터들 사이의 데이터 점, 유전적 변이의 존재 및 부재 둘 다에 대한 값을 포괄하는 표준 편차를 가진 수치 값, 조사되는 유전적 변이를 갖거나 갖지 않는 대상체에 대한 프로파일 도표와 유사하지 않은 프로파일 도표를 가진 데이터 세트)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 널 결과를 표시하는 결과는 여전히 확정적인 결과이고, 확인은 유전적 변이의 존재 또는 부재의 확인을 위해 추가 정보 및/또는 데이터 생성 및/또는 분석의 반복을 필요로 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 결과는 본원에 기재된 하나 이상의 프로세싱 단계를 수행한 후에 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 결과는 본원에 기재된 프로세싱 단계들 중 하나의 결과로서 생성되고, 일부 실시양태에서 결과는 데이터 세트의 각각의 통계학적 및/또는 수학적 조작이 수행된 후 생성될 수 있다. 유전적 변이의 존재 또는 부재의 확인에 대한 결과는 대상체 또는 샘플에 대한 유전적 변이의 존재 또는 부재와 관련된 적합한 형태로 표현될 수 있고, 이 형태는 확률(예를 들면, 승산비, p-값), 가능성, 클러스터 내의 또는 밖의 값, 역치 값 초과 또는 미만의 값, 범위(예를 들면, 역치 범위) 내의 값, 분산 또는 신뢰의 척도를 가진 값 또는 위험 계수를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 샘플들 사이의 비교는 샘플 동일성의 확인을 가능하게 한다(예를 들면, 반복된 샘플 및/또는 혼합된(예를 들면, 잘못 표지된 또는 조합된) 샘플 등의 확인을 가능하게 한다).
일부 실시양태에서, 결과는 소정의 역치 또는 컷오프 값 초과 또는 미만(예를 들면, 1 초과 또는 1 미만)의 값, 및 이 값과 관련된 불확실성 또는 신뢰 수준을 포함한다. 일부 실시양태에서, 소정의 역치 또는 컷오프 값은 기대 수준 또는 기대 수준 범위이다. 결과는 데이터 프로세싱에서 사용된 가정을 기술할 수도 있다. 일부 실시양태에서, 결과는 소정의 값 범위(예를 들면, 역치 범위) 내 또는 밖에 속하는 값, 및 상기 범위 내 또는 밖에 있는 그 값에 대한 관련된 불확실성 또는 신뢰 수준을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결과는 소정의 값과 동등한(예를 들면, 1과 동등하거나 0과 동등한) 값 또는 소정의 값 범위 내의 값과 동등한 값, 및 동등하거나 범위 내에 또는 밖에 있는 그 값에 대한 그의 관련된 불확실성 또는 신뢰 수준을 포함한다. 결과는 종종 도표(예를 들면, 프로파일 도표)로서 도식적으로 표시된다.
상기 인지된 바와 같이, 결과는 진짜 양성, 진짜 음성, 거짓 양성 또는 거짓 음성으로서 특징규명될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "진짜 양성"은 유전적 변이를 가진 것으로서 정확히 진단된 대상체를 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "거짓 양성"은 유전적 변이를 가진 것으로서 잘못 확인된 대상체를 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "진짜 음성"은 유전적 변이를 갖지 않는 것으로서 정확히 확인된 대상체를 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "거짓 음성"은 유전적 변이를 갖지 않는 것으로서 잘못 확인된 대상체를 지칭한다. 임의의 주어진 방법에 대한 수행의 2개 척도가 이들 발생의 비를 기초로 계산될 수 있다: (i) 일반적으로 양성으로서 정확히 확인되는 예측된 양성의 분율인 민감성 값; 및 (ii) 일반적으로 음성으로서 정확히 확인되는 예측된 음성의 분율인 특이성 값.
일부 실시양태에서, 민감성, 특이성 및/또는 신뢰 수준 중 하나 이상은 백분율로서 표현된다. 일부 실시양태에서, 독립적으로 각각의 변수에 대한 백분율은 약 90%보다 더 크다(예를 들면, 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 또는 99% 초과(예를 들면, 약 99.5% 이상, 약 99.9% 이상, 약 99.95% 이상, 약 99.99% 이상)). 일부 실시양태에서, 변동 계수(CV)는 백분율로서 표현되고, 종종 이 백분율은 약 10% 이하(예를 들면, 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%, 또는 1% 미만(예를 들면, 약 0.5% 이하, 약 0.1% 이하, 약 0.05% 이하, 약 0.01% 이하))이다. 일부 실시양태에서, 확률(예를 들면, 특정 결과가 우연에 기인하지 않는 것)은 Z-점수, p-값, 또는 t-검정의 결과로서 표현된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 데이터 프로세싱 조작을 이용하여 결과에 대한 측정된 분산, 신뢰 수준, 민감성, 특이성 등(예를 들면, 신뢰 파라미터로서 총칭됨)을 생성할 수 있다. 결과 생성 및 관련된 신뢰 수준의 구체적인 예는 실시예 단락 및 국제 특허출원 제PCT/US12/59123호(WO2013/052913)(모든 본문, 표, 방정식 및 도면을 포함하는 전체 내용이 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있다.
본원에서 사용된 용어 "민감성"은 진짜 양성의 수 + 거짓 음성의 수로 나누어진 진짜 양성의 수를 지칭하고, 이때 민감성(sens)은 0 ≤ sens ≤ 1의 범위 내에 있을 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "특이성"은 진짜 음성의 수 + 거짓 양성의 수로 나누어진 진짜 음성의 수를 지칭하고, 이때 특이성(spec)은 0 ≤ spec ≤ 1의 범위 내에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 1, 100%, 또는 거의 1(예를 들면, 약 90% 내지 약 99%)과 동등한 민감성 및 특이성을 가진 방법이 종종 선택된다. 일부 실시양태에서, 1 또는 100%와 동등한 민감성을 가진 방법이 선택되고, 일부 실시양태에서 거의 1의 민감성(예를 들면, 약 90%의 민감성, 약 91%의 민감성, 약 92%의 민감성, 약 93%의 민감성, 약 94%의 민감성, 약 95%의 민감성, 약 96%의 민감성, 약 97%의 민감성, 약 98%의 민감성 또는 약 99%의 민감성)을 가진 방법이 선택된다. 일부 실시양태에서, 1 또는 100%의 특이성을 가진 방법이 선택되고, 일부 실시양태에서 거의 1의 특이성(예를 들면, 약 90%의 특이성, 약 91%의 특이성, 약 92%의 특이성, 약 93%의 특이성, 약 94%의 특이성, 약 95%의 특이성, 약 96%의 특이성, 약 97%의 특이성, 약 98%의 특이성 또는 약 99%의 특이성)을 가진 방법이 선택된다.
이상적으로, 대상체들이 실제로 하나 이상의 유전적 변이를 가질 때 어떠한 대상체도 하나 이상의 유전적 변이를 갖지 않는 것으로서 잘못 확인되지 않도록 거짓 음성의 수가 0이거나 0에 가깝다. 대조적으로, 종종 음성을 정확히 분류하는 예측 알고리즘의 능력이 평가된다(민감성에 대한 상보적 측정). 이상적으로, 대상체들이 평가되는 유전적 변이를 갖지 않을 때 어떠한 대상체도 하나 이상의 유전적 변이를 가진 것으로서 잘못 확인되지 않도록 거짓 양성의 수가 0이거나 0에 가깝다.
일부 실시양태에서, 태아에 대한 유전적 변이(예를 들면, 염색체 이배수성)의 존재 또는 부재가 확인된다. 이러한 실시양태에서, 태아 유전적 변이(예를 들면, 태아 염색체 이배수성)의 존재 또는 부재가 확인된다.
일부 실시양태에서, 샘플에 대한 유전적 변이(예를 들면, 염색체 이배수성)의 존재 또는 부재가 확인된다. 이러한 실시양태에서, 샘플 핵산에서의 유전적 변이(예를 들면, 염색체 이배수성)의 존재 또는 부재가 확인된다. 일부 실시양태에서, 검출되거나 검출되지 않는 변이가 한 공급원으로부터의 샘플 핵산에 존재하지만 또 다른 공급원으로부터의 샘플 핵산에는 존재하지 않는다. 공급원의 비한정적 예는 태반 핵산, 태아 핵산, 모체 핵산, 암세포 핵산, 비-암세포 핵산 등 및 이들의 조합물을 포함한다. 비한정적 예에서, 검출되거나 검출되지 않는 특정 유전적 변이는 (i) 태반 핵산에는 존재하지만 태아 핵산 및 모체 핵산에는 존재하지 않거나; (ii) 태아 핵산에는 존재하지만 모체 핵산에는 존재하지 않거나; (iii) 모체 핵산에는 존재하지만 태아 핵산에는 존재하지 않는다.
하나 이상의 결과가 생성된 후, 결과는 종종 유전적 변이 및/또는 관련된 의학적 질환의 존재 또는 부재의 확인을 제공하는 데에 사용된다. 결과는 전형적으로 건광 관리 전문가(예를 들면, 실험실 기술자 또는 관리자; 의사 또는 보조자)에게 제공된다. 종종, 결과는 결과 모듈에 의해 제공된다. 일부 실시양태에서, 결과는 작도 모듈에 의해 제공된다. 일부 실시양태에서, 결과는 기계의 주변장치 또는 부품 상에서 제공된다. 예를 들면, 종종 결과는 프린터 또는 디스플레이에 의해 제공된다. 일부 실시양태에서, 유전적 변이의 존재 또는 부재를 확인시켜주는 결과는 보고서의 형태로 건강관리 전문가에게 제공되고, 일부 실시양태에서 보고서는 결과 값 및 관련된 신뢰 파라미터의 디스플레이를 포함한다. 일반적으로, 결과는 유전적 변이 및/또는 의학적 질환의 존재 또는 부재의 확인을 용이하게 하는 적합한 포맷으로 디스플레이될 수 있다. 데이터 세트를 보고하고/하거나 디스플레이하거나 결과를 보고하는 데에 사용되기에 적합한 포맷의 비한정적 예는 디지털 데이터, 그래프, 2D 그래프, 3D 그래프 및 4D 그래프, 사진, 상형문자, 차트, 막대 그래프, 파이 그래프, 도표, 순서도, 산점도, 지도, 히스토그램, 밀도 차트, 함수 그래프, 회로도, 블록도, 버블 지도, 성상도, 이체선도, 통계지도, 방사도(spider chart), 벤(Venn) 도표, 계산 도표 등 및 이들의 조합을 포함한다. 결과 표시의 다양한 예들이 도면에 제시되어 있고 실시예에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 결과의 생성은 대상체의 세포 핵산의 표시치로의 핵산 서열 리드의 변환으로서 간주될 수 있다. 대상체의 세포 핵산의 표시치는 종종 특정 염색체 또는 이의 부분에 대한 용량 또는 카피 수를 반영하므로, 상기 표시치는 종종 대상체의 핵산의 성질이다. 예를 들면, 다수의 상대적으로 작은 서열 리드들을 상대적으로 큰 염색체의 표시치로 전환시키는 것이 변환으로서 간주될 수 있다. 예로서, 대략 36개 염기쌍의 길이를 가진 리드를 사용하여 약 4천 7백만 개 염기의 길이를 가진 21번 염색체의 표시치를 생성하는 프로세스에서 상기 염색체보다 100,000배 이상 더 작은 수천 개의 리드들이 유의하게 더 큰 염색체의 표시치로 변환된다. 염색체의 이러한 표시치의 생성은 전형적으로 본원에 기재되어 있는 바와 같이 상대적으로 큰 염색체의 표시치에 도달하기 위한 리드의 수회 조작(예를 들면, 맵핑, 필터링 및/또는 정규화)을 포함한다. 하나 이상의 컴퓨터, 종종 동시에 작동하는 통합된 다수의 컴퓨터들의 사용을 요구할 수 있는 다회 조작이 종종 이용된다.
임신 여성으로부터의 샘플을 사용하여 태아 염색체에 대한 염색체의 표시치를 제공할 때, 다수의 리드들이 종종 모체 핵산으로부터의 리드이고 소수의 리드들이 종종 태아 핵산으로부터의 리드인 것을 고려하면, 이러한 변환은 자명한 것이기도 하다. 모체 핵산의 리드는 종종 태아 핵산의 리드보다 우세하고, 다수의 모체 핵산 리드들은 종종 태아 염색체의 표시치를 가린다. 모체 리드의 전형적으로 큰 배경은 태아 염색체 핵산과 모체 염색체 핵산의 차이를 모호하게 할 수 있고, 이러한 배경으로부터 태아 염색체의 표시치를 수득하는 것은 본원에 기재되어 있는 바와 같이 모체 리드의 기여를 디콘볼루션하는(de-convolute) 프로세스를 포함한다.
일부 실시양태에서, 결과는 대상체(예를 들면, 임신 여성)로부터의 서열 리드를 상기 대상체(예를 들면, 모체 및/또는 태아)에 존재하는 기존 구조물(예를 들면, 게놈, 염색체 또는 이들의 분절)의 표시치로 변환시키는 것으로부터 생성된다. 일부 실시양태에서, 결과는 제1 대상체(예를 들면, 임신 여성)로부터의 서열 리드를 구조물(예를 들면, 게놈, 염색체 또는 이들의 분절)의 복합 표시치로 변환시키는 제1 변환, 및 제1 대상체(예를 들면, 임신 여성) 및/또는 제2 대상체(예를 들면, 태아)에 존재하는 구조물의 표시치를 생성하는 상기 복합 표시치의 제2 변환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결과는 제1 대상체(예를 들면, 여성 대상체, 임신 여성)로부터의 서열 리드를 제2 대상체(예를 들면, 태아)에 존재하는 구조물(예를 들면, 게놈, 염색체 또는 이들의 분절)의 표시치로 변환시킨 것을 포함한다.
본원의 변환 방법은 종종 태아를 가진 임신 여성 대상체로부터 수득된 샘플 중의 핵산 리드로부터 태아에서의 삼염색체성 염색체(즉, 염색체 삼염색체성)(예를 들면, T21, T18 및/또는 T13)의 존재 또는 부재를 확인하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원의 변환 방법은 태아를 가진 임신 여성 대상체로부터 수득된 샘플 중의 핵산 리드로부터 태아에 대한 염색체(예를 들면, 염색체 카피 수, 염색체 용량)의 표시치를 준비하는(예를 들면, 측정하거나, 가시화하거나, 디스플레이하거나 제공하는) 단계를 포함할 수 있다. 후자 실시양태에서, 태아에 대한 염색체의 표시치는 종종 13번 염색체, 18번 염색체 및/또는 21번 염색체에 대한 표시치이다.
결과의 용도
유전적 변이의 존재 또는 부재를 확인시켜주는 하나 이상의 결과를 포함하는 보고서를 제공받는 건강관리 전문가 또는 다른 자격을 갖춘 개체는 상기 보고서에서 검사 대상체 또는 환자의 상태에 대해 판정하는 디스플레이된 데이터를 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 건강관리 전문가는 제공된 결과를 기초로 권고할 수 있다. 일부 실시양태에서, 건강관리 전문가 또는 자격을 갖춘 개체는 보고서에서 제공된 결과 값 또는 값들 및 관련된 신뢰 파라미터를 기초로 유전적 변이의 존재 또는 부재에 대한 판정 또는 점수를 검사 대상체 또는 환자에게 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 건강관리 전문가 또는 자격을 갖춘 개체는 제공된 보고서의 시각적 관찰을 이용하여 점수 또는 판정을 수동으로 만든다. 일부 실시양태에서, 점수 또는 판정은 종종 소프트웨어로 구현된 자동화된 루틴(routine)에 의해 만들어지고 정보를 검사 대상체 또는 환자에게 제공하기 전에 정확도에 대해 건강관리 전문가 또는 자격을 갖춘 개체에 의해 검토된다. 본원에서 사용된 용어 "보고서를 제공받는"은 검토 시 건강관리 전문가 또는 다른 자격을 갖춘 개체가 검사 대상체 또는 환자에서의 유전적 변이의 존재 또는 부재에 대해 확인할 수 있게 하는, 결과를 포함하는 작성된 및/또는 도식적 표시치를 통신 수단으로 수득하는 것을 지칭한다. 상기 보고서는 컴퓨터 또는 인간 데이터 도입에 의해 생성될 수 있고 전자적 수단의 이용을 통해(예를 들면, 동일한 또는 상이한 물리적 장소에서 인터넷 상에서, 컴퓨터를 통해, 팩스를 통해, 또는 한 네트워크 위치로부터 또 다른 위치로), 또는 데이터를 보내거나 받는 또 다른 방법(예를 들면, 우편 서비스, 택배 서비스 등)에 의해 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 결과는 언어, 문서 또는 다른 파일 형태를 포함하나 이들로 한정되지 않는 적합한 매체로 건강관리 전문가에게 전달된다. 상기 파일은 예를 들면, 음향 파일, 컴퓨터 판독 가능한 파일, 종이 파일, 실험실 파일 또는 의료 기록 파일일 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "결과를 제공하는" 및 이의 문법적 등가어는 실험실로부터 정보(예를 들면, 실험실 파일)를 수득하는 것을 포함하나 이것으로 한정되지 않는, 이러한 정보를 수득하는 방법도 지칭할 수 있다. 실험실 파일은 의학적 질환의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 하나 이상의 분석 또는 하나 이상의 데이터 프로세싱 단계를 수행한 실험실에 의해 생성될 수 있다. 실험실은 실험실 파일로부터 의학적 질환의 존재 또는 부재를 확인하는 사람과 동일한 위치 또는 상이한 위치(예를 들면, 또 다른 국가)에 존재할 수 있다. 예를 들면, 실험실 파일은 한 위치에서 생성되어, 그 내의 정보가 임신 여성 대상체에게 전달될 또 다른 위치로 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 실험실 파일은 유형 형태 또는 전자적 형태(예를 들면, 컴퓨터 판독 가능한 형태)로 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 결과는 실험실로부터 건강관리 전문가, 의사 또는 자격을 갖춘 개체에게 제공될 수 있고, 건강관리 전문가, 의사 또는 자격을 갖춘 개체는 결과를 기초로 진단할 수 있다. 일부 실시양태에서, 결과는 실험실로부터 건강관리 전문가, 의사 또는 자격을 갖춘 개체에게 제공될 수 있고, 건강관리 전문가, 의사 또는 자격을 갖춘 개체는 부분적으로 추가 데이터 및/또는 정보 및 다른 결과와 함께 결과를 기초로 진단할 수 있다.
건강관리 전문가 또는 자격을 갖춘 개체는 보고서에서 제공된 결과 또는 결과들을 기초로 적합한 권고를 제공할 수 있다. 제공된 결과 보고서를 기초로 제공될 수 있는 권고의 비한정적 예는 수술, 방사선요법, 화학요법, 유전 상담, 출생 후 치료 해법(예를 들면, 생활 설계, 장기간 보조 관리, 약제, 증상 치료), 임신 종결, 장기 이식, 수혈 등 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 권고는 제공된 결과에 기초한 분류(예를 들면, 다운 증후군, 터너 증후군, T13에서의 유전적 변이와 관련된 의학적 질환, T18에서의 유전적 변이와 관련된 의학적 질환)에 의존한다.
실험실 직원(예를 들면, 실험실 관리자)은 유전적 변이의 존재 또는 부재의 확인(또는 검사 영역에 대한 정배수체 또는 비-정배수체의 확인)의 근거가 되는 값(예를 들면, 검사 카운트, 기준 카운트, 편차 수준)을 분석할 수 있다. 아슬아슬한 또는 의문스러운 유전적 변이의 존재 또는 부재에 대한 판정의 경우, 실험실 직원은 검사 대상체로부터의 동일한 또는 상이한 샘플 핵산을 사용하는 동일한 검사를 다시 지시할 수 있고/있거나 상이한 검사(예를 들면, 태아 이배수성 확인의 경우 핵형분석 및/또는 양수천자)를 지시할 수 있다.
유전적 변이 및 의학적 질환
유전적 변이의 존재 또는 부재는 본원에 기재된 방법, 장치 또는 기계를 이용함으로써 확인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전적 변이의 존재 또는 부재는 본원에 기재된 방법, 기계 및 장치에 의해 제공된 결과에 따라 확인된다. 유전적 변이는 일반적으로 일부 개체들에 존재하는 특정 유전적 표현형이고, 종종 유전적 변이는 통계학적으로 유의한 개체 하위집단에 존재한다. 일부 실시양태에서, 유전적 변이는 염색체 이상(예를 들면, 이배수성), 부분적 염색체 이상 또는 모자이크 현상이고, 이들 각각은 본원에 더 상세히 기재되어 있다. 유전적 변이의 비한정적 예는 하나 이상의 결실(예를 들면, 미세결실), 중복(예를 들면, 미세중복), 삽입, 돌연변이, 다형성(예를 들면, 단일 뉴클레오티드 다형성), 융합, 반복부(예를 들면, 짧은 직렬 반복부), 상이한 메틸화 부위, 상이한 메틸화 패턴 등 또는 이들의 조합을 포함한다. 삽입, 반복부, 결실, 중복, 돌연변이 또는 다형성은 임의의 길이를 가질 수 있고, 일부 실시양태에서 약 1 염기 또는 염기쌍(bp) 내지 약 250 메가염기(Mb)의 길이를 가진다. 일부 실시양태에서, 삽입, 반복부, 결실, 중복, 돌연변이 또는 다형성은 약 1 염기 또는 염기쌍(bp) 내지 약 1,000 킬로염기(kb)의 길이(예를 들면, 약 10 bp, 50 bp, 100 bp, 500 bp, 1 kb, 5 kb, 10 kb, 50 kb, 100 kb, 500 kb 또는 1000 kb의 길이)를 가진다.
유전적 변이는 종종 결실이다. 일부 실시양태에서, 결실은 염색체 또는 DNA 서열의 일부가 상실되는 돌연변이(예를 들면, 유전적 이상)이다. 결실은 종종 유전 물질의 상실이다. 임의의 수의 뉴클레오티드가 결실될 수 있다. 결실은 하나 이상의 전체 염색체, 염색체의 분절, 대립형질, 유전자, 인트론, 엑손, 임의의 비-코딩 영역, 임의의 코딩 영역, 이들의 분절 또는 이들의 조합물의 결실을 포함할 수 있다. 결실은 미세결실을 포함할 수 있다. 결실은 단일 염기의 결실을 포함할 수 있다.
유전적 변이는 종종 유전자 중복이다. 일부 실시양태에서, 중복은 염색체 또는 DNA 서열의 일부가 카피되고 게놈 내로 다시 삽입되는 돌연변이(예를 들면, 유전적 이상)이다. 일부 실시양태에서, 유전자 중복(즉, 중복)은 DNA의 영역의 임의의 중복이다. 일부 실시양태에서, 중복은 게놈 또는 염색체 내에서 종종 직렬로 반복되는 핵산 서열이다. 일부 실시양태에서, 중복은 하나 이상의 전체 염색체, 염색체의 분절, 대립형질, 유전자, 인트론, 엑손, 임의의 비-코딩 영역, 임의의 코딩 영역, 이들의 분절 또는 이들의 조합물의 카피를 포함할 수 있다. 중복은 미세중복을 포함할 수 있다. 중복은 종종 중복된 핵산의 하나 이상의 카피를 포함한다. 중복은 종종 1회 이상 반복된(예를 들면, 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회 또는 10회 반복된) 유전 영역으로서 특징규명된다. 중복의 범위는 일부 경우 작은 영역(수천 개의 염기쌍)부터 전체 염색체까지 이를 수 있다. 중복은 종종 상동성 재조합에서의 오류의 결과로서 일어나거나 레트로트랜스포존(retrotransposon) 이벤트로 인해 일어난다. 중복은 특정 종류의 증식 질환들과 관련되어 있다. 중복은 게놈 마이크로어레이 또는 비교 유전 혼성화(CGH)를 이용함으로써 특징규명될 수 있다.
유전적 변이는 종종 삽입이다. 삽입은 종종 하나 이상의 뉴클레오티드 염기쌍을 핵산 서열 내로 추가하는 것이다. 삽입은 종종 미세삽입이다. 일부 실시양태에서, 삽입은 염색체의 분절을 게놈, 염색체 또는 이들의 분절 내로 추가하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 삽입은 대립형질, 유전자, 인트론, 엑손, 임의의 비-코딩 영역, 임의의 코딩 영역, 이들의 분절 또는 이들의 조합물을 게놈 또는 이의 분절 내로 추가하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 삽입은 기원이 공지되어 있지 않은 핵산을 게놈, 염색체 또는 이들의 분절 내로 추가(즉, 삽입)하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 삽입은 단일 염기의 추가(즉, 삽입)를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "카피 수 변이"는 일반적으로 유전적 변이 또는 염색체 이상의 한 클래스 또는 종류이다. 카피 수 변이는 결실(예를 들면, 미세결실), 중복(예를 들면, 미세중복) 또는 삽입(예를 들면, 미세삽입)일 수 있다. 종종, 본원에서 사용된 접두사 "미세"는 5 Mb 미만의 길이를 가진 핵산의 분절이다. 카피 수 변이는 염색체의 분절의 하나 이상의 결실(예를 들면, 미세결실), 중복 및/또는 삽입(예를 들면, 미세중복, 미세삽입)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 중복은 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 삽입은 중복이다. 일부 실시양태에서, 삽입은 중복이 아니다. 예를 들면, 종종 부분 내의 서열의 중복은 중복이 발견되는 부분에 대한 카운트를 증가시킨다. 종종, 부분 내의 서열의 중복은 수준을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 제1 수준을 구성하는 부분에 존재하는 중복은 중복이 부재하는 제2 수준에 비해 상대적으로 수준을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 삽입은 부분의 카운트를 증가시키고, 삽입을 나타내는 서열은 동일한 부분 내의 또 다른 위치에서 존재한다(즉, 중복된다). 일부 실시양태에서, 삽입은 부분의 카운트 또는 수준을 유의하게 증가시키지 않고, 삽입되는 서열은 동일한 부분 내의 서열의 중복이 아니다. 일부 실시양태에서, 삽입은 중복으로서 검출되지 않거나 표시되지 않고, 삽입을 표시하는 중복 서열은 동일한 부분에 존재하지 않는다.
일부 실시양태에서, 카피 수 변이는 태아 카피 수 변이이다. 종종, 태아 카피 수 변이는 태아의 게놈 내의 카피 수 변이이다. 일부 실시양태에서, 카피 수 변이는 모체 및/또는 태아 카피 수 변이이다. 일부 실시양태에서, 모체 및/또는 태아 카피 수 변이는 임신 여성(예를 들면, 태아를 가진 여성 대상체), 출산한 여성 대상체 또는 태아를 가질 수 있는 여성의 게놈 내의 카피 수 변이이다. 카피 수 변이는 이종 카피 수 변이일 수 있고, 이때 변이(예를 들면, 중복 또는 결실)는 게놈의 한 대립형질 상에 존재한다. 카피 수 변이는 동종 카피 수 변이일 수 있고, 이때 변이는 게놈의 두 대립형질 상에 존재한다. 일부 실시양태에서, 카피 수 변이는 이종 또는 동종 태아 카피 수 변이이다. 일부 실시양태에서, 카피 수 변이는 이종 또는 동종 모체 및/또는 태아 카피 수 변이이다. 카피 수 변이는 종종 모체 게놈 및 태아 게놈에 존재하거나, 모체 게놈에 존재하고 태아 게놈에 존재하지 않거나, 태아 게놈에 존재하고 모체 게놈에 존재하지 않는다.
"배수성"은 태아 또는 모체에 존재하는 염색체의 수를 지칭한다. 일부 실시양태에서, "배수성"은 "염색체 배수성"과 동일하다. 예를 들면, 인간에서 상염색체성 염색체는 종종 쌍으로 존재한다. 예를 들면, 유전적 변이의 부재 하에서 대다수의 인간들은 2개의 각각의 상염색체성 염색체(예를 들면, 1번 염색체 내지 22번 염색체)를 가진다. 인간에서 2개의 상염색체성 염색체의 정상 상보체의 존재는 종종 정배수체로서 지칭된다. "미세배수성"은 의미에서 배수성과 유사하다. "미세배수성"은 종종 염색체의 분절의 배수성을 지칭한다. 용어 "미세배수성"은 종종 염색체 내의 카피 수 변이(예를 들면, 결실, 중복 및/또는 삽입)의 준재 또는 부재(예를 들면, 동형접합 또는 이형접합 결실, 중복 또는 삽입 등 또는 이들의 부재)를 지칭한다. "배수성" 및 "미세배수성"은 종종 프로파일 내의 수준의 카운트의 정규화 후 측정된다. 따라서, 상염색체성 염색체 쌍(예를 들면, 정배수체)을 표시하는 수준은 종종 1의 배수성으로 정규화된다. 유사하게, 중복, 결실 또는 삽입의 부재를 표시하는 염색체의 분절 내의 수준은 종종 1의 미세배수성으로 정규화된다. 배수성 및 미세배수성은 종종 부분 특이적(예를 들면, 부분 특이적) 및 샘플 특이적이다. 배수성은 종종 각각 정배수체(예를 들면, 2개 염색체), 존재하는 1개 염색체(예를 들면, 염색체 결실), 염색체 부재, 3개 염색체(예를 들면, 삼염색체성) 및 4개 염색체를 표시하는 1, ½, 0, 3/2 및 2의 값과 ½의 정배수로서 정의된다. 마찬가지로, 미세배수성은 각각 정배수체(예를 들면, 카피 수 변이 없음), 이형접합 결실, 동형접합 결실, 이형접합 중복 및 동형접합 중복을 표시하는 1, ½, 0, 3/2 및 2의 값과 ½의 정배수로서 정의된다. 태아에 대한 배수성 값의 일부 예들이 표 2에서 제공되어 있다.
일부 실시양태에서, 태아의 미세배수성은 태아의 모체(즉, 임신 여성 대상체)의 미세배수성과 일치한다. 일부 실시양태에서, 태아의 미세배수성은 태아의 모체의 미세배수성과 일치하고, 모체 및 태아 둘 다가 동일한 이형접합 카피 수 변이 또는 동형접합 카피 수 변이를 갖거나, 둘 다가 정배수체이다. 일부 실시양태에서, 태아의 미세배수성은 태아의 모체의 미세배수성과 상이하다. 예를 들면, 종종 태아의 미세배수성은 카피 수 변이에 대한 이형접합성을 갖고, 모체는 카피 수 변이에 대한 동형접합성을 갖고, 태아의 미세배수성은 특정된 카피 수 변이에 대해 모체의 미세배수성과 일치하지 않는다(예를 들면, 동등하지 않다).
미세배수성은 종종 기대 수준과 관련되어 있다. 예를 들면, 종종 수준(예를 들면, 프로파일 내의 수준, 종종 카피 수 변이를 실질적으로 포함하지 않는 수준)은 1의 값(예를 들면, 1의 배수성, 1의 미세배수성)으로 정규화되고, 동형접합 중복의 미세배수성은 2이고, 이형접합 중복은 1.5이고, 이형접합 결실은 0.5이고, 동형접합 결실은 0이다.
일부 실시양태에서, 존재 또는 부재가 대상체에 대해 확인되는 유전적 변이는 의학적 질환과 관련되어 있다. 따라서, 본원에 기재된 기술은 의학적 질환 또는 의학적 상태와 관련되어 있는 하나 이상의 유전적 변이의 존재 또는 부재를 확인하는 데에 이용될 수 있다. 의학적 질환의 비한정적 예는 지적 장애(예를 들면, 다운 증후군), 비정상적인 세포 증식(예를 들면, 암), 미생물 핵산의 존재(예를 들면, 바이러스, 세균, 진균, 효모) 및 임신중독증과 관련된 의학적 질환을 포함한다.
유전적 변이, 의학적 질환 및 상태의 비한정적 예는 이하에 기재되어 있다.
태아 성별
일부 실시양태에서, 태아 성별 또는 성별 관련 장애(예를 들면, 성염색체 이배수성)의 예측은 본원에 기재된 방법, 기계 또는 장치에 의해 결정될 수 있다. 성별 확인은 일반적으로 성염색체에 기초한다. 인간에서, 2개의 성염색체들, 즉 X 염색체 및 Y 염색체가 존재한다. Y 염색체는 남성으로서의 배아 발생을 유발하는 유전자인 SRY를 함유한다. 인간 및 다른 포유동물의 Y 염색체는 정상적인 정자 생성을 위해 필요한 다른 유전자도 함유한다. XX를 가진 개체는 여성이고 XY는 남성이고, 종종 성염색체 이배수성으로서 지칭되는 비한정적 변이는 XO, XYY, XXX 및 XXY를 포함한다. 일부 실시양태에서, 남성은 2개의 X 염색체 및 1개의 Y 염색체(XXY; 클라인펠터 증후군), 또는 1개의 X 염색체 및 2개의 Y 염색체(XYY 증후군; 자콥 증후군)를 갖고, 일부 여성들은 3개의 X 염색체(XXX; 삼중 X 증후군) 또는 2개 대신에 1개의 X 염색체(XO; 터너 증후군)를 가진다. 일부 실시양태에서, 개체 내의 일부 세포들만이 성염색체 이배수성에 의해 영향을 받고, 이것은 모자이크 현상(예를 들면, 터너 모자이크 현상)으로서 지칭될 수 있다. 다른 경우는 SRY가 손상되거나(XY 여성을 유발함) X로 카피되는(XX 남성을 유발함) 경우를 포함한다.
일부 실시양태에서, 태아 성별을 확인하는 방법은 태아 분획을 측정하고/하거나 태아 유전적 변이(예를 들면, 태아 염색체 이배수성)의 존재 또는 부재를 확인하는 단계도 포함할 수 있다. 태아 유전적 변이의 존재 또는 부재의 확인은 적합한 방식으로 수행될 수 있고, 이러한 방식의 비한정적 예는 핵형 분석, 양수검사, 순환 세포 무함유 핵산 분석, 세포 무함유 태아 DNA 분석, 뉴클레오티드 서열 분석, 서열 리드 정량, 표적화된 방법, 증폭에 기반한 방법, 질량 분광측정 기반 방법, 상이한 메틸화 기반 방법, 상이한 분해 기반 방법, 다형성 기반 방법, (예를 들면, 프로브를 사용한) 혼성화 기반 방법 등을 포함한다.
일부 경우, 자궁에서 태아의 성별을 확인하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 성-연관 장애의 가족력을 가진 환자(예를 들면, 임신 여성)는 태아가 이러한 장애를 유전받을 위험을 평가하는 것을 돕기 위해 그녀가 가진 태아의 성별을 확인하는 것을 원할 수 있다. 성-연관 장애는 X-연관 장애 및 Y-연관 장애를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. X-연관 장애는 X-연관 열성 장애 및 X-연관 우성 장애를 포함한다. X-연관 열성 장애의 예는 면역 장애(예를 들면, 만성 육아종 질환(CYBB), 비스콧-알드리치(Wiskott-Aldrich) 증후군, X-연관 중증 복합 면역결핍, X-연관 무감마글로불린혈증, 과다-IgM 증후군 1형, IPEX, X-연관 림프증식 질환, 프로퍼딘(Properdin) 결핍), 혈액 장애(예를 들면, 혈우병 A, 혈우병 B, X-연관 철적혈모구빈혈), 내분비 장애(예를 들면, 안드로겐 불감성 증후군/케네디병(Kennedy disease), KAL1 칼만(Kallmann) 증후군, X-연관 선천성 부신 발육부전), 대사 장애(예를 들면, 오르니틴 트랜스카브아밀라제(transcarbamylase) 결핍, 안뇌신 증후군, 부신백색질형성장애, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제(dehydrogenase) 결핍, 피루베이트 데하이드로게나제 결핍, 다논병(Danon disease)/글리코겐 저장 질환 IIb형, 파브리병(Fabry's disease), 헌터(Hunter) 증후군, 레슈-니한(Lesch-Nyhan) 증후군, 멘케스병(Menkes disease)/후두각 증후군), 신경계 장애(예를 들면, 코핀-로우리(Coffin-Lowry) 증후군, MASA 증후군, X-연관 알파 지중해빈혈, 정신지체 증후군, 시더리우스(Siderius) X-연관 정신지체 증후군, 색맹, 눈 백색증, 노리에병(Norrie disease), 범맥락막위축, 샤르코-마리-투쓰병(Charcot-Marie-Tooth disease)(CMTX2-3), 펠리체우스-메르츠바허병(Pelizaeus-Merzbacher disease), SMAX2), 피부 및 관련 조직 장애(예를 들면, 선천성 이상각화증, 땀저하외배엽형성이상증(EDA), X-연관 비늘증, X-연관 내피 각막 퇴행위축), 신경근 장애(예를 들면, 베커 근육 퇴행위축/뒤시엔느(Duchenne), 중심핵근육병증(MTM1), 콘라디-후너만(Conradi-Hunermann) 증후군, 에머리-드레이푸스(Emery-Dreifuss) 근육 퇴행위축 1), 비뇨 장애(예를 들면, 알포트(Alport) 증후군, 덴트병(Dent's disease), X-연관 신장기원 요붕증), 골/치아 장애(예를 들면, AMELX 불완전사기질형성증), 및 다른 장애(예를 들면, 바쓰(Barth) 증후군, 맥레오드(McLeod) 증후군, 스미쓰-피네만-메이어스(Smith-Fineman-Myers) 증후군, 심슨-골라비-베멜(Simpson-Golabi-Behmel) 증후군, 모어 트라네브제르그(Mohr-Tranebjærg) 증후군, 나소디지토어쿠스틱(Nasodigitoacoustic) 증후군)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. X-연관 우성 장애의 예는 X-연관 저인산혈증, 국소 피부 형성저하증, 프래질(Fragile) X 증후군, 에카르디(Aicardi) 증후군, 색소실조증(Incontinentia pigmenti), 레트(Rett) 증후군, CHILD 증후군, 루잔-프린스(Lujan-Fryns) 증후군 및 구강안면손가락(Orofaciodigital) 증후군 1을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. Y-연관 장애의 예는 남성 불임, 색소성 망막염 및 무정자증을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
염색체 이상
일부 실시양태에서, 태아 염색체 이상의 존재 또는 부재는 본원에 기재된 방법, 기계 또는 장치를 이용함으로써 확인될 수 있다. 염색체 이상은 전체 염색체 또는 하나 이상의 유전자를 포함하는 염색체 영역의 획득 또는 상실을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 염색체 이상은 일염색체성, 삼염색체성, 다염색체성, 이형접합성의 상실, 하나 이상의 뉴클레오티드 서열(예를 들면, 하나 이상의 유전자)의 전위, 결실 및/또는 중복(불균형 전위에 의해 야기된 결실 및 중복을 포함함)을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "염색체 이상", "이배수성" 및/또는 "이배수체"는 대상체 염색체의 구조와 정상 상동성 염색체의 구조 사이의 편차를 지칭한다. 용어 "정상"은 특정 종의 건강한 개체, 예를 들면, 정배수체 게놈에서 발견된 우세한 핵형 또는 밴딩 패턴(인간에서 46, XX 또는 46, XY)을 지칭한다. 상이한 유기체가 광범위하게 상이한 염색체 상보체를 갖기 때문에, 용어 "이배수성" 및 "이배수체"는 염색체의 구체적인 수를 지칭하는 것이 아니라, 유기체의 주어진 세포 또는 세포들 내의 염색체 함량이 비정상적인 상황을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 용어 "이배수성" 및 "이배수체"는 전체 염색체 또는 염색체의 일부의 상실 또는 획득에 의해 야기된 유전 물질의 불균형을 지칭한다. "이배수성"은 염색체의 분절의 하나 이상의 결실 및/또는 삽입을 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 용어 "정배수체"는 염색체의 정상 상보체를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "일염색체성"은 정상 상보체의 1개 염색체의 결여를 지칭한다. 부분적 일염색체성은 불균형 전위 또는 결실에서 발생할 수 있고, 이때 염색체의 분절만이 단일 카피로 존재한다. 예를 들면, 성염색체의 일염색체성(45, X)은 터너 증후군을 야기한다. 용어 "이염색체성"은 염색체의 2개 카피의 존재를 지칭한다. 각각의 염색체의 2개 카피를 가진 유기체, 예컨대, 인간(이배수체 또는 "정배수체"인 유기체)의 경우 이염색체성은 정상 상태이다. 정상적으로 각각의 염색체의 3개 이상의 카피를 가진 유기체(삼배수체 이상인 유기체)의 경우, 이염색체성은 이배수체 염색체 상태이다. 단위생식 이염색체성에서, 염색체의 카피 둘 다가 동일한 부모로부터 나온다(다른 부모로부터의 기여가 없다).
본원에서 사용된 용어 "삼염색체성"은 특정 염색체의 2개 카피 대신에 3개 카피의 존재를 지칭한다. 인간 다운 증후군에서 발견되는 추가 21번 염색체의 존재는 "삼염색체성 21"로서 지칭된다. 삼염색체성 18 및 삼염색체성 13은 2종의 다른 인간 상염색체 삼염색체성이다. 성염색체의 삼염색체성은 여성(예를 들면, 삼중 X 증후군에서 47, XXX) 또는 남성(예를 들면, 클라인펠터 증후군에서 47, XXY; 또는 자콥 증후군에서 47, XYY)에서 관찰될 수 있다. 일부 실시양태에서, 삼염색체성은 대부분의 또는 모든 상염색체의 중복이다. 일부 실시양태에서, 삼염색체성은 (예를 들면, 정배수체에 대한 특정 종류의 염색체의 2개 존재(즉, 한 쌍) 대신에) 특정 종류의 염색체의 3개 존재(예를 들면, 3개 카피)를 초래하는 전체 염색체 이배수성이다.
본원에서 사용된 용어 "사염색체성" 및 "오염색체성"은 각각 염색체의 4개 또는 5개 카피의 존재를 지칭한다. 상염색체에서 거의 관찰되지 않지만, XXXX, XXXY, XXYY, XYYY, XXXXX, XXXXY, XXXYY, XXYYY 및 XYYYY를 포함하는 성염색체 사염색체성 및 오염색체성이 인간에서 보고되었다.
염색체 이상은 다양한 기작들에 의해 야기될 수 있다. 기작은 (i) 약화된 유사분열 체크포인트의 결과로서 발생하는 비분리, (ii) 다수의 염색체들에서 비분리를 야기하는 불활성 유사분열 체크포인트, (iii) 1개의 동원체가 양쪽 유사분열 방추극에 부착될 때 발생하는 메로텔릭(merotelic) 부착, (iv) 2개 초과의 방추극이 형성될 때 형성되는 다중극 방추, (v) 1개의 방추극만이 형성될 때 형성되는 단일극 방추, 및 (vi) 단일극 방추 기작의 최종 결과로서 발생하는 사배수체 중간체를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "부분적 일염색체성" 및 "부분적 삼염색체성"은 염색체의 일부의 상실 또는 획득에 의해 야기된 유전 물질의 불균형을 지칭한다. 부분적 일염색체성 또는 부분적 삼염색체성은 불균형 전위로부터 발생할 수 있고, 이때 개체는 2개의 상이한 염색체들의 절단 및 융합으로부터 형성된 유도체 염색체를 가진다. 이 상황에서, 개체는 한 염색체의 일부의 3개 카피(2개의 정상 카피, 및 유도체 염색체 상에 존재하는 분절), 및 유도체 염색체에 포함된 다른 염색체의 일부의 단지 1개 카피를 가질 것이다.
본원에서 사용된 용어 "모자이크 현상"은 유기체의 모든 세포들이 아니라 일부 세포들에서의 이배수성을 지칭한다. 일부 염색체 이상은 모자이크 염색체 이상 및 비-모자이크 염색체 이상으로서 존재할 수 있다. 예를 들면, 일부 삼염색체성 21 개체들은 모자이크 다운 증후군을 갖고, 일부는 비-모자이크 다운 증후군을 가진다. 상이한 기작들이 모자이크 현상을 유발할 수 있다. 예를 들면, (i) 초기 접합체는 정상적으로 단순 삼염색체성 21을 초래할 3개의 21번째 염색체들을 가질 수 있으나, 세포 분열의 과정 동안 하나 이상의 세포주가 21번째 염색체들 중 하나를 상실하고; (ii) 초기 접합체는 2개의 21번째 염색체들을 가질 수 있으나, 세포 분열의 과정 동안 21번째 염색체들 중 하나가 중복되었다. 체세포 모자이크 현상은 완전한 또는 모자이크 이배수성을 수반하는 유전 증후군과 전형적으로 관련된 기작과 상이한 기작을 통해 발생할 가능성이 있다. 예를 들면, 체세포 모자이크 현상은 일부 종류의 암 및 신경에서 확인되었다. 일부 경우, 삼염색체성 12는 만성 림프구성 백혈병(CLL)에서 확인되었고, 삼염색체성 8은 급성 골수성 백혈병(AML)에서 확인되었다. 또한, 개체가 염색체의 절단에 취약한 유전 증후군(염색체 불안정성 증후군)은 종종 다양한 종류의 암에 대한 증가된 위험과 관련되어 있으므로, 암발생에서 체세포 이배수성의 역할을 강조한다. 본원에 기재된 방법 및 프로토콜은 비-모자이크 염색체 이상 및 모자이크 염색체 이상의 존재 또는 부재를 확인할 수 있다.
표 1A 및 1B는 본원에 기재된 방법, 기계 및 장치에 의해 잠재적으로 확인될 수 있는 염색체 상태, 증후군 및/또는 이상의 비한정적 목록을 제공한다. 표 1B는 2011년 10월 6일자 DECIPHER 데이터베이스(예를 들면, GRCh37에 맵핑된 위치들에 기초한 버전 5.1; 균일 자원 위치주소(URL) dechipher.sanger.ac.uk에서 입수가능함)로부터의 목록이다.
[표 1A]
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Figure 112016006621635-pct00003
Figure 112016006621635-pct00004
Figure 112016006621635-pct00005
[표 1B]
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1 등급 상태는 종종 하기 특성들 중 하나 이상을 가진다: 병원성 비정상; 유전학자들 사이의 강한 동의; 고도 침투성; 여전히 가변성 표현형을 가질 수 있으나 일부 공통된 특성을 가짐; 문헌의 모든 사례들이 임상 표현형을 가짐; 비정상을 가진 건강한 개체의 사례 부재; DVG 데이터베이스 상에서 보고되어 있지 않거나 건강한 집단에서 발견되지 않음; 단일 유전자 또는 다중 유전자 용량 효과를 확인시켜주는 기능성 데이터; 확인된 또는 강한 후보 유전자; 정의된 임상 관리 영향; 감시할 가치가 있는 공지된 암 위험; 다수의 정보 공급원(OMIM, 진리뷰스(GeneReviews), 오파넷(Orphanet), 유니크(Unique), 위키페디아(Wikipedia)); 및/또는 진단 용도(생식 상담)를 위한 사용가능성.
2 등급 상태는 종종 하기 특성들 중 하나 이상을 가진다: 가능성이 있는 병원성 비정상; 고도 침투성; DD 이외의 일관된 특징을 갖지 않는 가변성 표현형; 문헌에서의 작은 수의 사례/보고; 모든 보고된 사례가 임상 표현형을 가짐; 기능성 데이터 또는 확인된 병원성 유전자의 부재; 다수의 정보 공급원(OMIM, 진리뷰스, 오파넷, 유니크, 위키페디아); 및/또는 진단 목적 및 생식 상담을 위해 사용될 수 있음.
3 등급 상태는 종종 하기 특성들 중 하나 이상을 가진다: 민감성 좌위; 기재된 발단자(proband)의 건강한 개체 또는 영향을 받지 않은 부모; 대조군 집단에의 존재; 비-침투성; 경미하고 특이적이지 않은 표현형; 덜 일관된 특징; 기능성 데이터 또는 확인된 병원성 유전자의 부재; 보다 더 한정된 데이터 공급원; 제2 진단의 가능성이 대다수로부터 벗어나는 사례 또는 신규 임상 발견이 존재하는 경우에 대한 가능성을 남김; 및/또는 진단 목적으로 사용될 때 주의 및 생식 상담에 대한 신중한 충고.
임신중독증
일부 실시양태에서, 임신중독증의 존재 또는 부재는 본원에 기재된 방법, 기계 또는 장치를 이용함으로써 확인된다. 임신중독증은 임신 동안에 고혈압이 발생하는 상태(즉, 임신에 의해 유도된 고혈압)이고 소변 중의 상당한 양의 단백질과 관련되어 있다. 일부 실시양태에서, 임신중독증은 상승된 수준의 세포외 핵산 및/또는 메틸화 패턴의 변경과도 관련되어 있다. 예를 들면, 세포외 태아로부터 유래한 과다메틸화된 RASSF1A 수준과 임신중독증의 중증도 사이에 양의 상관관계가 관찰되었다. 일부 예에서, 증가된 DNA 메틸화는 정상 대조군에 비해 임신중독증성 태반에서 H19 유전자에 대해 관찰된다.
임신중독증은 전세계적으로 모체 및 태아/신생아 사망률 및 이환율의 주원인들 중 하나이다. 혈장 및 혈청 중의 세포 유리 순환 핵산은 산전 진단을 포함하는 상이한 의학 분야들에서 기대되는 임상 적용을 가진 신규 생체마커이다. 임박한 임신중독증에 대한 표시자로서 모체 혈장 중의 세포 유리 태아 (cff)DNA의 정량적 변화가 예를 들면, 남성 특이적 SRY 또는 DYS 14 좌위에 대한 실시간 정량 PCR을 이용한 상이한 연구들에서 보고되었다. 초기 발병 임신중독증의 경우, 상승된 수준이 처음 3개월에서 관찰될 수 있다. 증상의 발생 전 증가된 수준의 cffDNA는 조직 산화 스트레스 및 증가된 태반 아폽토시스 및 괴사를 유발하는, 융모사이 공간 내의 저산소증/재산소화에 기인할 수 있다. 모체 순환계 내로의 cffDNA의 증가된 배출에 대한 증거 이외에 임신중독증에서 cffDNA의 감소된 신장 제거에 대한 증거도 존재한다. 태아 DNA의 양이 현재 Y 염색체 특이적 서열을 정량함으로써 측정되기 때문에, 대안적 방법, 예컨대, 총 세포 유리 DNA의 측정 또는 성별 독립적 태아 유전외적 마커, 예컨대, DNA 메틸화의 사용이 대안을 제공한다. 태반 유래의 세포 유리 RNA는 임상 실시에서 임신중독증을 스크리닝하고 진단하는 데에 사용될 수 있는 또 다른 대안적 생체마커이다. 태아 RNA는 이를 분해로부터 보호하는, 세포보다 작은 태반 입자와 회합되어 있다. 태아 RNA 수준은 종종 대조군에 비해 임신중독증을 가진 임신 여성에서 10배 더 높으므로, 임상 실시에서 임신중독증을 스크리닝하고 진단하는 데에 사용될 수 있는 대안적 생체마커이다.
병원체
일부 실시양태에서, 병원성 상태의 존재 또는 부재는 본원에 기재된 방법 또는 장치에 의해 확인된다. 병원성 상태는 세균, 바이러스 또는 진균을 포함하나 이들로 한정되지 않는 병원체에 의한 숙주의 감염에 의해 야기될 수 있다. 병원체는 전형적으로 숙주 핵산과 식별될 수 있는 핵산(예를 들면, 게놈 DNA, 게놈 RNA, mRNA)을 갖기 때문에, 본원에서 제공된 방법, 기계 및 장치는 병원체의 존재 또는 부재를 확인하는 데에 이용될 수 있다. 종종, 병원체는 특정 병원체 특유의 특성, 예를 들면, 유전외적 상태 및/또는 하나 이상의 서열 변경, 중복 및/또는 결실을 가진 핵산을 가진다. 따라서, 본원에서 제공된 방법은 특정 병원체 또는 병원체 변이체(예를 들면, 균주)를 확인하는 데에 사용될 수 있다.
암
일부 실시양태에서, 세포 증식 장애(예를 들면, 암)의 존재 또는 부재는 본원에 기재된 방법, 기계 또는 장치를 이용함으로써 확인된다. 예를 들면, 혈청 중의 세포 유리 핵산의 수준은 건강한 환자에 비해 다양한 종류의 암을 가진 환자들에서 상승될 수 있다. 예를 들면, 전이성 질환을 가진 환자는 종종 비-전이성 환자보다 대략 2배 더 높은 혈청 DNA 수준을 가진다. 전이성 질환을 가진 환자는 예를 들면, 암 특이적 마커 및/또는 일부 단일 뉴클레오티드 다형성 또는 짧은 직렬 반복부에 의해 확인될 수도 있다. 상승된 수준의 순환 DNA와 양의 상관관계를 가질 수 있는 암 종류의 비한정적 예는 유방암, 대장암, 위장암, 간세포암, 폐암, 흑색종, 비-호지킨 림프종, 백혈병, 다발성 골수종, 방광암, 간암, 자궁경부암, 식도암, 췌장암 및 전립선암을 포함한다. 다양한 암들이 비-암성 건강한 세포로부터의 핵산과 식별될 수 있는 특성, 예를 들면, 유전외적 상태 및/또는 서열 변경, 중복 및/또는 결실을 가진 핵산을 가질 수 있고 종종 이러한 핵산을 혈류 내로 방출할 수 있다. 이러한 특성은 예를 들면, 특정 종류의 암에 특이적일 수 있다. 따라서, 본원에서 제공된 방법이 특정 종류의 암을 확인하는 데에 이용될 수 있다는 것도 고려된다.
소프트웨어는 이하에 더 상세히 기재된 바와 같이 본원에 기재된 프로세스들에서 카운팅, 데이터 프로세싱, 결과의 생성, 및/또는 생성된 결과에 기초한 하나 이상의 권고의 제공을 포함하나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 단계를 수행하는 데에 사용될 수 있다.
기계, 소프트웨어 및 인터페이스
본원에 기재된 일부 프로세스들 및 방법들(예를 들면, 서열 리드, 카운트, 수준(예를 들면, 수준들) 및/또는 프로파일의 정량, 맵핑, 정규화, 범위 설정, 조절, 분류, 카운팅 및/또는 측정)은 종종 컴퓨터, 마이크로프로세서, 소프트웨어, 모듈 또는 다른 기계 없이 수행될 수 없다. 본원에 기재된 방법은 전형적으로 컴퓨터에 의해 실행되는 방법이고, 방법의 하나 이상의 부분은 종종 하나 이상의 프로세서(예를 들면, 마이크로프로세서), 컴퓨터, 또는 마이크로프로세서 제어 기계에 의해 수행된다. 본 명세서에 기재된 방법에 대한 실시양태들은 일반적으로 본원에 기재된 시스템, 기계 및 컴퓨터 프로그램 제품에서 명령어에 의해 실행되는 동일한 또는 관련된 프로세스들에 적용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법에 관한 실시양태는 일반적으로 실행 가능한 프로그램이 저장되어 있는 비일시적 컴퓨터 판독 가능 기억 매체에 의해 실시될 수 있는 동일한 또는 관련된 프로세스에 적용될 수 있고, 이때 상기 프로그램은 마이크로프로세서가 상기 방법 또는 이의 일부를 수행하도록 명령한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 프로세스 및 방법(예를 들면, 서열 리드, 카운트, 수준 및/또는 프로파일의 정량, 카운팅 및/또는 측정)은 자동화된 방법에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 단계 및 방법은 마이크로프로세서 및/또는 컴퓨터에 의해 수행되고/되거나, 메모리와 함께 수행된다. 일부 실시양태에서, 서열 리드, 카운트, 맵핑, 맵핑된 서열 태그, 수준, 프로파일 등의 측정, 정규화, 비교, 범위 설정, 분류, 조절, 작도, 결과, 변환 및 확인을 포함하는 자동화된 방법은 소프트웨어, 모듈, 마이크로프로세서, 주변장치 및/또는 기계에서 구현된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 소프트웨어는 본원에 기재된 바와 같이 마이크로프로세서에 의해 실행될 때 컴퓨터 작동을 수행하는 컴퓨터 판독 가능한 프로그램 명령어를 지칭한다.
검사 대상체(예를 들면, 환자, 임신 여성) 및/또는 기준 대상체로부터 유도된 서열 리드, 카운트, 수준 및 프로파일은 유전적 변이의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 더 분석되고 프로세싱될 수 있다. 서열 리드, 카운트, 수준 및/또는 프로파일은 종종 "데이터" 또는 "데이터 세트"로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, 데이터 또는 데이터 세트는 하나 이상의 특징 또는 변수(예를 들면, 서열에 기초한 특징 또는 변수[예를 들면, GC 함량, 특정 뉴클레오티드 서열 등], 기능 특이적 특징 또는 변수[예를 들면, 발현된 유전자, 암 유전자 등], 위치에 기초한 특징 또는 변수[게놈 특이적, 염색체 특이적, 부분 또는 부분 특이적] 등 및 이들의 조합)를 특징으로 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 데이터 또는 데이터 세트는 하나 이상의 특징 또는 변수를 기초로 2개 이상의 차원을 가진 행렬로 조직화될 수 있다. 행렬로 조직화된 데이터는 임의의 적합한 특징 또는 변수를 사용함으로써 조직화될 수 있다. 행렬 내의 데이터의 비한정적 예는 모체 연령, 모체 배수성 및 태아 기여에 의해 조직화되는 데이터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 특징 또는 변수를 특징으로 하는 데이터 세트는 종종 카운팅 후 프로세싱된다.
기계, 소프트웨어 및 인터페이스를 이용하여 본원에 기재된 방법을 수행할 수 있다. 예를 들면, 사용자는 기계, 소프트웨어 및 인터페이스를 사용함으로써 통계학적 분석 알고리즘, 통계학적 유의성 알고리즘, 통계학적 알고리즘, 반복적 단계, 검증 알고리즘 및 도식적 표시를 실행하는 것을 포함할 수 있는 특정 정보, 프로그램 또는 프로세스(예를 들면, 서열 리드의 맵핑, 맵핑된 데이터의 프로세싱 및/또는 결과의 제공)의 사용을 위한 옵션을 도입할 수 있거나 요청할 수 있거나, 질의할 수 있거나 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 데이터 세트는 입력 정보로서 사용자에 의해 도입될 수 있고, 사용자는 적합한 하드웨어 매체(예를 들면, 플래쉬 드라이브)로 하나 이상의 데이터 세트를 다운로딩할 수 있고/있거나, 사용자는 결과의 후속 프로세싱 및/또는 제공을 위해 데이터 세트를 한 시스템으로부터 또 다른 시스템으로 보낼 수 있다(예를 들면, 서열 리드 데이터를 서열결정기로부터 서열 리드 맵핑용 컴퓨터 시스템으로 보내고; 맵핑된 서열 리드 데이터를 결과 및/또는 보고의 프로세싱 및 생성용 컴퓨터 시스템으로 보낸다).
시스템은 전형적으로 하나 이상의 기계를 포함한다. 각각의 기계는 하나 이상의 메모리, 하나 이상의 마이크로프로세서 및 명령어를 포함한다. 시스템이 2개 이상의 기계를 포함하는 경우, 기계들의 일부 또는 전부는 동일한 위치에 위치할 수 있고/있거나, 기계들의 일부 또는 전부는 상이한 위치에 위치할 수 있고/있거나, 기계들 전부는 한 위치에 위치할 수 있고/있거나, 기계들 전부는 상이한 위치에 위치할 수 있다. 시스템이 2개 이상의 기계를 포함하는 경우, 기계들의 일부 또는 전부는 사용자와 동일한 위치에 위치할 수 있고/있거나, 기계들 중 일부 또는 전부는 사용자와 상이한 위치에 위치할 수 있고/있거나, 기계들 전부는 사용자와 동일한 위치에 위치할 수 있고/있거나, 기계들 전부는 사용자와 상이한 하나 이상의 위치에 위치할 수 있다.
시스템은 종종 연산 기계 및 서열결정 장치 또는 기계를 포함하고, 이때 서열결정 장치 또는 기계는 물리적 핵산을 수용하고 서열 리드를 생성하도록 구성되고, 연산 기계는 서열결정 장치 또는 기계로부터의 리드를 프로세싱하도록 구성된다. 연산 기계는 종종 서열 리드로부터 유전적 변이(예를 들면, 카피 수 변이; 태아 염색체 이배수성)의 존재 또는 부재를 확인하도록 구성된다.
예를 들면, 사용자는 인터넷 접근을 통해 데이터 세트를 획득할 수 있는 소프트웨어에게 질의를 할 수 있고, 일부 실시양태에서 프로그래밍가능한 마이크로프로세서가 주어진 파라미터를 기초로 적합한 데이터 세트를 획득하도록 촉구될 수 있다. 프로그래밍가능한 마이크로프로세서는 사용자로 하여금 주어진 파라미터를 기초로 마이크로프로세서에 의해 선택된 하나 이상의 데이터 세트 옵션을 선택하도록 촉구할 수도 있다. 프로그래밍가능한 마이크로프로세서는 사용자로 하여금 인터넷을 통해 발견된 정보, 다른 내부 또는 외부 정보 등을 기초로 마이크로프로세서에 의해 선택된 하나 이상의 데이터 세트 옵션을 선택하도록 촉구할 수 있다. 옵션은 하나 이상의 데이터 특징 선택, 하나 이상의 통계학적 알고리즘, 하나 이상의 통계학적 분석 알고리즘, 하나 이상의 통계학적 유의성 알고리즘, 반복적 단계, 하나 이상의 검증 알고리즘, 및 방법, 기계, 장치, 컴퓨터 프로그램, 또는 실행 가능한 프로그램이 저장되어 있는 비일시적 컴퓨터 판독 가능 기억 매체의 하나 이상의 도식적 표시를 선택하기 위해 선택될 수 있다.
본원에서 다루어진 시스템은 컴퓨터 시스템의 일반적인 구성요소, 예컨대, 네트워크 서버, 휴대용(laptop) 시스템, 데스크탑 시스템, 초소형(handheld) 시스템, 개인 디지털 보조장치, 연산 키오스크(kiosk) 등을 포함할 수 있다. 컴퓨터 시스템은 하나 이상의 입력 수단, 예컨대, 키보드, 터치 스크린, 마우스, 음성 인식, 또는 사용자가 데이터를 시스템 내로 도입할 수 있게 하는 다른 수단을 포함할 수 있다. 시스템은 디스플레이 스크린(예를 들면, CRT 또는 LCD), 스피커, FAC 기기, 프린터(예를 들면, 레이저, 잉크 젯, 임팩트, 흑백 또는 칼라 프린터), 또는 정보(예를 들면, 결과 및/또는 보고)의 시각적, 청각적 및/또는 하드카피 출력물을 제공하는 데에 유용한 다른 출력 수단을 포함하나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 출력 수단을 추가로 포함할 수 있다.
시스템에서, 입력 수단 및 출력 수단은 다른 구성요소들 중에서 프로그램 명령어를 실행하기 위한 마이크로프로세서, 및 프로그램 코드 및 데이터를 저장하기 위한 메모리를 포함할 수 있는 중심 프로세싱 유닛에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로세스는 단일 지리학적 장소에 위치하는 단일 사용자 시스템으로서 실행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로세스는 다중사용자 시스템으로서 실행될 수 있다. 다중사용자 실행의 경우, 다수의 중심 프로세싱 유닛들이 네트워크에 의해 연결될 수 있다. 네트워크는 건축물의 한 부분 내의 단일 부서 또는 전체 건축물을 포괄하거나, 다수의 건축물들에 걸쳐 있거나, 한 지역에 걸쳐 있거나 전체 국가에 걸쳐 있는 지역 네트워크 또는 전세계 네트워크일 수 있다. 네트워크는 공급자에 의해 소유되고 제어되는 사유 네트워크일 수 있거나, 사용자가 웹 페이지에 접근하여 정보를 도입하고 검색하는 인터넷 기초 서비스로서 실행될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 시스템은 사용자의 관점에서 근거리 또는 원거리에 위치할 수 있는 하나 이상의 기계를 포함한다. 한 위치 또는 다수의 위치들에서 하나 초과의 기계가 사용자에 의해 접근될 수 있고, 데이터가 연속적으로 및/또는 동시에 맵핑될 수 있고/있거나 프로세싱될 수 있다. 따라서, 예컨대, 적합한 배열 및 제어가 예컨대, 지역 네트워크, 원격 네트워크 및/또는 "클라우드(cloud)" 연산 플랫폼에서 다수의 기계들을 이용하여 데이터를 맵핑하고/하거나 프로세싱하는 데에 이용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 시스템은 통신 인터페이스를 포함할 수 있다. 통신 인터페이스는 컴퓨터 시스템과 하나 이상의 외부 디바이스 사이의 소프트웨어 및 데이터의 전달을 가능하게 한다. 통신 인터페이스의 비한정적 예는 모뎀, 네트워크 인터페이스(예컨대, 에터넷(Ethernet) 카드), 통신 포트, PCMCIA 슬롯 및 카드 등을 포함한다. 통신 인터페이스를 통해 전달된 소프트웨어 및 데이터는 일반적으로 통신 인터페이스에 의해 제공받을 수 있는 전자, 전자기, 광학 및/또는 다른 신호일 수 있는 신호의 형태로 존재한다. 신호는 종종 채널을 통해 통신 인터페이스에게 제공된다. 채널은 종종 신호를 보유하고 와이어 또는 케이블, 광섬유, 전화선, 휴대전화 링크, RF 링크 및/또는 다른 통신 채널을 이용함으로써 실행될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 통신 인터페이스는 신호 검출 모듈에 의해 검출될 수 있는 신호 정보를 제공받는 데에 사용될 수 있다.
데이터는 수동 입력 디바이스 또는 직접 데이터 도입 디바이스(DDE)를 포함하나 이들로 한정되지 않는 적합한 디바이스 및/또는 방법에 의해 입력될 수 있다. 수동 디바이스의 비한정적 예는 키보드, 컨셉(concept) 키보드, 터치 민감성 스크린, 라이트 펜, 마우스, 트랙커 볼(tracker ball), 조이스틱(joystick), 그래픽 태블릿(graphic tablet), 스캐너, 디지털 카메라, 비디오 디지털화기 및 음성 인식 디바이스를 포함한다. DDE의 비한정적 예는 바 코드 판독기, 자기 스트립 코드, 스마트 카드, 자기 잉크 캐릭터 인식, 광학 캐릭터 인식, 광학 마크 인식 및 반환 문서를 포함한다.
일부 실시양태에서, 서열결정 장치 또는 기계로부터의 출력물은 입력 디바이스를 통해 입력될 수 있는 데이터로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 맵핑된 서열 리드는 입력 디바이스를 통해 입력될 수 있는 데이터로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 단편 크기(예를 들면, 길이)는 입력 디바이스를 통해 입력될 수 있는 데이터로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 포획 프로세스로부터의 출력물(예를 들면, 게놈 영역 기원 데이터)은 입력 디바이스를 통해 입력될 수 있는 데이터로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 단편 크기(예를 들면, 길이)와 핵산 포획 프로세스로부터의 출력물(예를 들면, 게놈 영역 기원 데이터)의 조합물은 입력 디바이스를 통해 입력될 수 있는 데이터로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시뮬레이팅된 데이터는 인 실리코(in silico) 프로세스에 의해 생성되고, 시뮬레이팅된 데이터는 입력 디바이스를 통해 입력될 수 있는 데이터로서 사용된다. 용어 "인 실리코"는 컴퓨터를 이용함으로써 수행된 연구 및 실험을 지칭한다. 인 실리코 프로세스는 본원에 기재된 프로세스에 따라 서열 리드를 맵핑하고 맵핑된 서열 리드를 프로세싱하는 것을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
시스템은 본원에 기재된 프로세스를 수행하는 데에 유용한 소프트웨어를 포함할 수 있고, 소프트웨어는 이러한 프로세스를 수행하기 위한 하나 이상의 모듈(예를 들면, 서열결정 모듈, 논리 프로세싱 모듈, 데이터 디스플레이 조직화 모듈)을 포함할 수 있다. 용어 "소프트웨어"는 컴퓨터에 의해 실행될 때 컴퓨터 작동을 수행하는 컴퓨터 판독 가능한 프로그램 명령어를 지칭한다. 하나 이상의 마이크로프로세서에 의해 실행될 수 있는 명령은 종종 실행될 때 하나 이상의 마이크로프로세서가 본원에 기재된 방법을 실행하게 할 수 있는 실행 가능한 코드로서 제공된다. 본원에 기재된 모듈은 소프트웨어로서 존재할 수 있고, 소프트웨어에서 구현된 명령어(예를 들면, 프로세스, 루틴, 서브루틴)는 마이크로프로세서에 의해 실행될 수 있거나 수행될 수 있다. 예를 들면, 모듈(예를 들면, 소프트웨어 모듈)은 특정 프로세스 또는 과제를 수행하는 프로그램의 일부일 수 있다. 용어 "모듈"은 보다 큰 기계 또는 소프트웨어 시스템에서 사용될 수 있는 자가-함유된 기능성 유닛을 지칭한다. 모듈은 모듈의 기능을 수행하기 위한 명령어 세트를 포함할 수 있다. 모듈은 데이터 및/또는 정보를 변환시킬 수 있다. 데이터 및/또는 정보는 적합한 형태로 존재할 수 있다. 예를 들면, 데이터 및/또는 정보는 디지털 또는 아날로그일 수 있다. 일부 실시양태에서, 데이터 및/또는 정보는 종종 팩킷(packet), 바이트(byte), 캐릭터(character) 또는 비트(bit)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 데이터 및/또는 정보는 임의의 모아진, 조립된 또는 사용가능한 데이터 또는 정보일 수 있다. 데이터 및/또는 정보의 비한정적 예는 적합한 매체, 사진, 비디오, 음향(예를 들면, 들리거나 들리지 않는 주파수), 숫자, 상수, 값, 물체, 시간, 함수, 명령어, 지도, 참고자료, 서열, 리드, 맵핑된 리드, 수준, 범위, 역치, 신호, 디스플레이, 표시치 또는 이의 변환물을 포함한다. 모듈은 데이터 및/또는 정보를 수용할 수 있거나 제공받을 수 있고, 데이터 및/또는 정보를 제2 형태로 변환시킬 수 있고, 상기 제2 형태를 기계, 주변장치, 구성요소 또는 또 다른 모듈에게 제공할 수 있거나 전달할 수 있다. 예를 들면, 모듈은 하기 비한정적 기능들 중 하나 이상을 수행할 수 있다: 서열 리드의 맵핑, 카운트의 제공, 부분의 조립, 수준의 제공 또는 측정, 카운트 프로파일의 제공, 정규화(예를 들면, 리드의 정규화, 카운트의 정규화 등), 정규화된 카운트 프로파일 또는 정규화된 카운트의 수준의 제공, 2개 이상의 수준의 비교, 불확실성 값의 제공, 기대 수준 및 기대 범위(예를 들면, 기대 수준 범위, 역치 범위 및 역치 값)의 제공 또는 측정, 수준의 조절(예를 들면, 제1 수준의 조절, 제2 수준의 조절, 염색체 또는 이의 분절의 프로파일의 조절 및/또는 패딩)의 제공, 확인(예를 들면, 카피 수 변이, 유전적 변이 또는 이배수성의 확인)의 제공, 분류, 작도 및/또는 결과의 확인. 일부 실시양태에서, 마이크로프로세서는 모듈에서 명령어를 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 마이크로프로세서가 모듈 또는 모듈 군에서 명령어를 수행하는 데에 요구된다. 모듈은 데이터 및/또는 정보를 또 다른 모듈, 기계 또는 공급원에게 제공할 수 있고 또 다른 모듈, 기계 또는 공급원으로부터 데이터 및/또는 정보를 제공받을 수 있다.
컴퓨터 프로그램 제품은 종종 유형의 컴퓨터 판독 가능한 매체 상에서 구현되고, 종종 비-일시적 컴퓨터 판독 가능한 매체 상에서 유형적으로 구현된다. 모듈은 종종 컴퓨터 판독 가능한 매체(예를 들면, 디스크, 드라이브) 상에 또는 메모리(예를 들면, 무작위 접근 메모리) 내에 저장된다. 모듈로부터의 명령어를 실행할 수 있는 모듈 및 마이크로프로세서는 한 기계 또는 상이한 기계에 위치할 수 있다. 모듈, 및/또는 모듈을 위한 명령어를 실행할 수 있는 마이크로프로세서는 사용자와 동일한 위치(예를 들면, 지역 네트워크) 또는 사용자와 상이한 위치(예를 들면, 원격 네트워크, 클라우드 시스템)에 위치할 수 있다. 방법이 2개 이상의 모듈들과 함께 수행되는 실시양태에서, 모듈들은 동일한 기계에 위치할 수 있고, 하나 이상의 모듈은 동일한 물리적 위치에서 상이한 기계에 위치할 수 있고, 하나 이상의 모듈은 상이한 물리적 위치에서 상이한 기계에 위치할 수 있다.
일부 실시양태에서, 기계는 모듈에서 명령어를 수행하기 위한 하나 이상의 마이크로프로세서를 포함한다. 기준 게놈의 부분들에 맵핑된 서열 리드의 카운트는 종종 본원에 기재된 방법을 수행하도록 구성된 명령어를 실행하는 마이크로프로세서에 의해 접근된다. 마이크로프로세서에 의해 접근되는 카운트는 시스템의 메모리 내에 존재할 수 있고, 상기 카운트는 수득된 후 접근될 수 있고 시스템의 메모리 내에 놓일 수 있다. 일부 실시양태에서, 기계는 모듈로부터의 하나 이상의 명령어(예를 들면, 프로세스, 루틴 및/또는 서브루틴)를 수행할 수 있고/있거나 실행할 수 있는 마이크로프로세서(예를 들면, 하나 이상의 마이크로프로세서)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 기계는 다수의 마이크로프로세서들, 예컨대, 동시에 작동하는 통합된 마이크로프로세서들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기계는 하나 이상의 외부 마이크로프로세서(예를 들면, 내부 또는 외부 네트워크, 서버, 저장 디바이스 및/또는 저장 네트워크(예를 들면, 클라우드))와 함께 작동한다. 일부 실시양태에서, 기계는 모듈을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기계는 하나 이상의 모듈을 포함한다. 모듈을 포함하는 기계 종종 하나 이상의 데이터 및/또는 정보를 다른 모듈로부터 제공받을 수 있고 다른 모듈에게 전달할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기계는 주변장치 및/또는 구성요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 기계는 데이터 및/또는 정보를 다른 모듈, 주변장치 및/또는 구성요소에게 전달할 수 있고 다른 모듈, 주변장치 및/또는 구성요소로부터 전달받을 수 있는 하나 이상의 주변장치 또는 구성요소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기계는 데이터 및/또는 정보를 제공하는 주변장치 및/또는 구성요소와 상호작용한다. 일부 실시양태에서, 주변장치 및 구성요소는 기능을 수행하는 데에 있어서 기계를 보조하거나 모듈과 직접적으로 상호작용한다. 주변장치 및/또는 구성요소의 비한정적 예는 스캐너, 프린터, 디스플레이(예를 들면, 모니터, LED, LCT 또는 CRT), 카메라, 마이크로폰, 패드(예를 들면, 아이패드, 태블릿), 터치 스크린, 스마트 전화, 이동 전화, USB I/O 디바이스, USB 대량 저장 디바이스, 키보드, 컴퓨터 마우스, 디지털 펜, 모뎀, 하드 드라이브, 점프 드라이브, 플래쉬 드라이브, 마이크로프로세서, 서버, CD, DVD, 그래픽 카드, 전문화된 I/O 디바이스(예를 들면, 서열결정기, 포토 셀, 광전자증배관, 광학 판독기, 센서 등), 하나 이상의 유동 셀, 유체 취급 구성요소, 네트워크 인터페이스 제어기, ROM, RAM, 무선 전달 방법 및 디바이스(블루투쓰(Bluetooth), 와이파이(WiFi) 등), 월드 와이드 웹(www), 인터넷, 컴퓨터 및/또 다른 모듈을 포함하나 이들로 한정되지 않는 적합한 컴퓨터 주변장치, I/O 또는 저장 방법 또는 디바이스를 포함한다.
종종, 소프트웨어는 플로피 디스크, 하드 디스크 및 자기 테이프를 포함하는 자기 매체; 및 CD-ROM 디스크, DVD 디스크, 자기광학 디스크, 플래쉬 드라이브, RAM, 플로피 디스크 등을 포함하는 광학 매체, 및 프로그램 명령어가 기록될 수 있는 다른 이러한 매체를 포함하나 이들로 한정되지 않는 컴퓨터 판독 가능한 매체 상에 기록된 프로그램 명령어를 포함하는 프로그램 제품 상에 제공된다. 온라인 실행에서, 단체에 의해 유지되는 서버 및 웹 사이트가 소프트웨어 다운로드를 원거리 사용자에게 제공하도록 구성될 수 있거나, 원거리 사용자가 단체에 의해 유지된 원격 시스템에 접근하여 소프트웨어를 원격으로 접근할 수 있다. 소프트웨어는 입력 정보를 수득할 수 있거나 수용할 수 있다. 소프트웨어는 구체적으로 데이터를 수득하거나 수용하는 모듈(예를 들면, 서열 리드 데이터 및/또는 맵핑된 리드 데이터를 수용하는 데이터 수용 모듈)을 포함할 수 있고 구체적으로 데이터를 프로세싱하는 모듈(예를 들면, 수용된 데이터를 프로세싱하는(예를 들면, 필터링하고/하거나, 정규화하고/하거나, 결과를 제공하고/하거나 보고하는) 프로세싱 모듈)을 포함할 수 있다. 용어 입력 정보를 "수득하는" 및 "수용하는"은 근거리 또는 원거리 장소로부터의 컴퓨터 통신 수단, 인간 데이터 도입, 또는 임의의 다른 데이터 수용 방법으로 데이터(예를 들면, 서열 리드, 맵핑된 리드)를 수용하는 것을 지칭한다. 입력 정보는 이것이 수용되는 위치와 동일한 위치에서 생성될 수 있거나, 상이한 위치에서 생성되어 수용 위치로 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 입력 정보는 프로세싱되기(예를 들면, 프로세싱될 수 있는 포맷으로 놓이기(예를 들면, 표로 작성되기)) 전에 변형된다. 일부 실시양태에서, 컴퓨터 프로그램 제품, 예를 들면, 그 내부에 구현된 컴퓨터 판독 가능한 프로그램 코드를 가진 컴퓨터 사용가능한 매체를 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품이 제공되고, 이때 상기 컴퓨터 판독 가능한 프로그램 코드는 실행되어 하기 단계들을 포함하는 방법을 수행하도록 개조되어 있다: (a) 검사 대상체로부터 샘플 핵산의 서열 리드를 수득하는 단계; (b) (a)에서 수득된 서열 리드를 부분으로 나누어진 공지된 게놈에 맵핑하는 단계; (c) 상기 부분 내의 맵핑된 서열 리드를 카운팅하는 단계; (d) (c)에서 수득된 부분에 대한 카운트를 정규화함으로써 샘플 정규화된 카운트 프로파일을 생성하는 단계; 및 (e) (d)에서 수득된 샘플 정규화된 카운트 프로파일로부터 유전적 변이의 존재 또는 부재를 확인하는 단계.
일부 실시양태에서, 소프트웨어는 하나 이상의 알고리즘을 포함할 수 있다. 알고리즘은 유한 수열의 명령어에 따라 데이터를 프로세싱하고/하거나 결과 또는 보고를 제공하는 데에 사용될 수 있다. 알고리즘은 종종 과제를 완료하기 위한 정해진 명령어의 목록이다. 명령어는 초기 상태부터 출발하여 정해진 일련의 연속적인 상태를 통해 진행하고 궁극적으로 최종 종결 상태로 종결되는 연산을 기술할 수 있다. 한 상태로부터 다음 상태로의 전이는 반드시 확정적인 것은 아니다(예를 들면, 일부 알고리즘들은 무작위성을 도입한다). 예를 들면(그러나, 한정되지 않음), 알고리즘은 검색 알고리즘, 분류 알고리즘, 병합 알고리즘, 수치 알고리즘, 그래프 알고리즘, 스트링 알고리즘, 모델링 알고리즘, 연산 게노메트릭(genometric) 알고리즘, 조합 알고리즘, 기계 학습 알고리즘, 암호작성 알고리즘, 데이터 압축 알고리즘, 파싱(parsing) 알고리즘 등일 수 있다. 알고리즘은 1개의 알고리즘, 또는 함께 작동하는 2개 이상의 알고리즘을 포함할 수 있다. 알고리즘은 임의의 적합한 복잡성 클래스 및/또는 파라미터화된 복잡성의 알고리즘일 수 있다. 알고리즘은 계산 및/또는 데이터 프로세싱을 위해 사용될 수 있고, 일부 실시양태에서 확정적 또는 확률적/예측 방법에서 사용될 수 있다. 알고리즘은 적합한 프로그래밍 언어의 사용에 의해 연산 환경에서 실행될 수 있고, 이러한 언어의 비한정적 예는 C, C++, 자바(Java), 펄(Perl), 파이톤(Python), 포트란(Fortran) 등이다. 일부 실시양태에서, 알고리즘은 오차의 한계, 통계학적 분석, 통계학적 유의성, 및/또는 다른 정보 또는 데이터 세트와의 비교(예를 들면, 신경 네트 또는 클러스터링 알고리즘을 사용할 때 적용가능함)를 포함하도록 구성될 수 있거나 변형될 수 있다.
일부 실시양태에서, 여러 알고리즘들이 소프트웨어에서 사용되도록 실행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이 알고리즘들은 미가공 데이터로 트레이닝될 수 있다. 각각의 새로운 미가공 데이터 샘플에 대해, 트레이닝된 알고리즘은 대표적인 프로세싱된 데이터 세트 또는 결과를 생성할 수 있다. 프로세싱된 데이터 세트는 종종 프로세싱된 모 데이터 세트에 비해 감소된 복잡성을 가진다. 일부 실시양태에서, 프로세싱된 세트를 기초로, 트레이닝된 알고리즘의 성능은 민감성 및 특이성을 기초로 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가장 높은 민감성 및/또는 특이성을 가진 알고리즘이 확인될 수 있고 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 시뮬레이팅된(또는 시뮬레이션) 데이터는 예를 들면, 알고리즘을 트레이닝하거나 알고리즘을 시험함으로써 데이터 프로세싱을 도울 수 있다. 일부 실시양태에서, 시뮬레이팅된 데이터는 서열 리드의 상이한 군들의 다양한 가상 샘플링을 포함한다. 시뮬레이팅된 데이터는 실제 집단으로부터 예상된 데이터에 기초할 수 있거나, 알고리즘을 시험하고/하거나 정확한 분류를 배정하도록 왜곡될 수 있다. 시뮬레이팅된 데이터는 본원에서 "가상" 데이터로서도 지칭된다. 일부 실시양태에서, 시뮬레이션은 컴퓨터 프로그램에 의해 수행될 수 있다. 시뮬레이팅된 데이터 세트의 사용에서 한 가능한 단계는 확인된 결과의 신뢰도, 예를 들면, 무작위 샘플링이 원래의 데이터와 얼마나 잘 일치하는지 또는 원래의 데이터를 얼마나 가장 잘 표시하는지를 평가하는 것이다. 한 방법은 무작위 샘플이 선택된 샘플보다 더 우수한 점수를 가질 확률을 추정하는 확률 값(p-값)을 계산하는 것이다. 일부 실시양태에서, 실험 모델이 평가될 수 있고, 이때 하나 이상의 샘플이 (해상 변경을 이용하거나 이용하지 않을 때) 기준 샘플과 일치한다고 가정된다. 일부 실시양태에서, 또 다른 분포, 예컨대, 포아송(Poisson) 분포가 확률 분포를 정의하는 데에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 시스템은 하나 이상의 마이크로프로세서를 포함할 수 있다. 마이크로프로세서는 통신 버스(bus)에 연결될 수 있다. 컴퓨터 시스템은 주 메모리, 종종 무작위 접근 메모리(RAM)를 포함할 수 있고, 이차 메모리도 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 메모리는 비-일시적 컴퓨터 판독 가능 기억 매체를 포함한다. 이차 메모리는 예를 들면, 하드 디스크 드라이브 및/또는 제거가능한 저장 드라이브(플로피 디스크 드라이브, 자기 테이프 드라이브, 광학 디스크 드라이브, 메모리 카드 등을 나타냄)를 포함할 수 있다. 제거가능한 저장 드라이브는 종종 제거가능한 저장 유닛으로부터 읽고/읽거나 제거가능한 저장 유닛에 쓴다. 제거가능한 저장 유닛의 비한정적 예는 예를 들면, 제거가능한 저장 드라이브에 의해 읽혀질 수 있고 쓰여질 수 있는 플로피 디스크, 자기 테이프, 광학 디스크 등을 포함한다. 제거가능한 저장 유닛은 그 내부에 저장된 컴퓨터 소프트웨어 및/또는 데이터를 가진 컴퓨터 사용가능한 기억 매체를 포함할 수 있다.
마이크로프로세서는 시스템에서 소프트웨어를 실행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 마이크로프로세서는 사용자가 수행할 수 있는 본원에 기재된 과제를 자동적으로 수행하도록 프로그래밍될 수 있다. 따라서, 마이크로프로세서, 또는 이러한 마이크로프로세서에 의해 수행된 알고리즘은 사용자로부터의 감시 또는 입력을 거의 또는 전혀 요구하지 않을 수 있다(예를 들면, 소프트웨어는 자동적으로 기능을 실행하도록 프로그래밍될 수 있다). 일부 실시양태에서, 프로세스의 복잡성은 1명의 사람 또는 일군의 사람들이 유전적 변이의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 충분히 짧은 시간 내에 프로세스를 수행할 수 없을 정도로 크다.
일부 실시양태에서, 이차 메모리는 컴퓨터 프로그램 또는 다른 명령어가 컴퓨터 시스템 내로 적재될 수 있게 하는 다른 유사한 수단을 포함할 수 있다. 예를 들면, 시스템은 제거가능한 저장 유닛 및 인터페이스 디바이스를 포함할 수 있다. 이러한 시스템의 비한정적 예는 프로그램 카트리지 및 카트리지 인터페이스(예컨대, 비디오 게임 디바이스에서 발견된 것), 제거가능한 메모리 칩(예컨대, EPROM 또는 PROM) 및 관련 소켓, 및 소프트웨어 및 데이터가 제거가능한 저장 유닛으로부터 컴퓨터 시스템으로 전달될 수 있게 하는 다른 제거가능한 저장 유닛 및 인터페이스를 포함한다.
일부 실시양태에서, 한 엔터티(entity)가 본원에 기재된 방법, 시스템, 기계, 장치 또는 컴퓨터 프로그램 제품에서 서열 리드의 카운트를 생성할 수 있고, 서열 리드를 부분들에 맵핑할 수 있고, 맵핑된 리드를 카운팅할 수 있고, 카운팅된 맵핑된 리드를 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 부분들에 맵핑된 서열 리드의 카운트는 종종 본원에 기재된 방법, 시스템, 기계, 장치 또는 컴퓨터 프로그램 제품에서 제2 엔터티에 의한 사용을 위해 한 엔터티에 의해 제2 엔터티에게 전달된다.
일부 실시양태에서, 한 엔터티는 서열 리드를 생성하고 제2 엔터티는 서열 리드를 기준 게놈 내의 부분들에 맵핑한다. 제2 엔터티는 종종 맵핑된 리드를 카운팅하고 카운팅된 맵핑된 리드를 본원에 기재된 방법, 시스템, 기계 또는 컴퓨터 프로그램 제품에서 사용한다. 일부 실시양태에서, 제2 엔터티는 맵핑된 리드를 제3 엔터티에게 전달하고, 제3 엔터티는 맵핑된 리드를 카운팅하고 맵핑된 리드를 본원에 기재된 방법, 시스템, 기계 또는 컴퓨터 프로그램 제품에서 사용한다. 일부 실시양태에서, 제2 엔터티는 맵핑된 리드를 카운팅하고 카운팅된 맵핑된 리드를 제3 엔터티에게 전달하고, 제3 엔터티는 카운팅된 맵핑된 리드를 본원에 기재된 방법, 시스템, 기계 또는 컴퓨터 프로그램에서 사용한다. 제3 엔터티를 포함하는 실시양태에서, 제3 엔터티는 종종 제1 엔터티와 동일하다. 즉, 제1 엔터티는 종종 서열 리드를 제2 엔터티에게 전달하고, 상기 제2 엔터티는 서열 리드를 기준 게놈 내의 부분들에 맵핑할 수 있고/있거나 맵핑된 리드를 카운팅할 수 있고, 제2 엔터티는 맵핑되고/되거나 카운팅된 리드를 제3 엔터티에게 전달할 수 있다. 제3 엔터티는 맵핑되고/되거나 카운팅된 리드를 종종 본원에 기재된 방법, 시스템, 기계 또는 컴퓨터 프로그램 제품에서 사용할 수 있고, 이때 제3 엔터티는 종종 제1 엔터티와 동일하고, 종종 제3 엔터티는 제1 또는 제2 엔터티와 상이하다.
일부 실시양태에서, 한 엔터티는 임신 여성으로부터 혈액을 수득하고 임의적으로 상기 혈액(예를 들면, 혈장 또는 혈청)으로부터 핵산을 단리하고 상기 혈액 또는 핵산을, 이 핵산으로부터 서열 리드를 생성하는 제2 엔터티에게 전달한다.
도 24는 본원에 기재된 다양한 시스템, 방법, 알고리즘 및 데이터 구조물이 실행될 수 있는 연산 환경(510)의 비한정적 예를 보여준다. 연산 환경(510)은 적합한 연산 환경의 일례일 뿐이고, 본원에 기재된 시스템, 방법 및 데이터 구조물의 사용 또는 기능성의 범위에 대한 임의의 한정을 암시하기 위한 것이 아니다. 연산 환경(510)은 연산 환경(510)에 예시된 구성요소들 중 어느 하나 또는 조합에 관한 임의의 의존 또는 요구를 가진 것으로서 해석되어서도 안 된다. 일부 실시양태에서, 도 24에 나타낸 시스템, 방법 및 데이터 구조물의 서브세트가 사용될 수 있다. 본원에 기재된 시스템, 방법 및 데이터 구조물은 다수의 다른 일반 목적 또는 특수 목적의 연산 시스템 환경 또는 구성과 함께 작동할 수 있다. 적합할 수 있는 공지된 연산 시스템, 환경 및/또는 구성의 예는 개인용 컴퓨터, 서버 컴퓨터, 씬 클라이언트(thin clients), 씩 클라이언트(thick client), 초소형 또는 휴대용 디바이스, 멀티프로세서 시스템, 마이크로프로세서 기초 시스템, 셋 탑 박스, 프로그래밍가능한 가전제품, 네트워크 PC, 미니컴퓨터, 메인프레임 컴퓨터, 상기 시스템들 또는 디바이스들 중 임의의 시스템 또는 디바이스를 포함하는 분산된 연산 환경 등을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
도 24의 연산 환경(510)은 프로세싱 유닛(521), 시스템 메모리(522), 및 시스템 메모리(522)를 포함하는 다양한 시스템 구성요소들을 프로세싱 유닛(521)에 작동가능하게 커플링시키는 시스템 버스(523)를 포함하는, 컴퓨터(520) 형태의 일반 목적 연산 디바이스를 포함한다. 컴퓨터(520)의 마이크로프로세서가 단일 중앙-프로세싱 유닛(CPU), 또는 통상적으로 병렬 프로세싱 환경으로서 지칭되는 복수의 프로세싱 유닛들을 포함하도록 단지 1개의 프로세싱 유닛(521)이 존재할 수 있거나 하나 초과의 프로세싱 유닛(521)이 존재할 수 있다. 컴퓨터(520)는 보편적인 컴퓨터, 분산 컴퓨터, 또는 임의의 다른 종류의 컴퓨터일 수 있다.
시스템 버스(523)는 메모리 버스 또는 메모리 제어기, 주변 버스, 및 다양한 버스 구조물들 중 임의의 버스 구조물을 사용하는 지역 버스를 포함하는 여러 종류의 버스 구조물들 중 임의의 버스 구조물일 수 있다. 시스템 메모리는 단순히 메모리로서 지칭될 수도 있고 읽기 전용 메모리(ROM) 및 무작위 접근 메모리(RAM)를 포함한다. 예컨대, 스타트-업(start-up) 동안 컴퓨터(520) 내의 요소들 사이에 정보를 전달하는 데에 도움을 주는 기본 루틴을 함유하는 기본 입력/출력 시스템(BIOS)(526)이 ROM(524)에 저장된다. 컴퓨터(520)는 하드 디스크(도시되어 있지 않음)로부터 읽고 쓰기 위한 하드 디스크 드라이브 인터페이스(527), 제거가능한 자기 디스크(529)로부터 읽거나 쓰기 위한 자기 디스크 드라이브(528), 및 제거가능한 광학 디스크(531), 예컨대, CD ROM 또는 다른 광학 매체로부터 읽거나 쓰기 위한 광학 디스크 드라이브(530)를 추가로 포함할 수 있다.
하드 디스크 드라이브(527), 자기 디스크 드라이브(528) 및 광학 디스크 드라이브(530)는 각각 하드 디스크 드라이브 인터페이스(532), 자기 디스크 드라이브 인터페이스(533) 및 광학 디스크 드라이브 인터페이스(534)에 의해 시스템 버스(523)에 연결된다. 상기 드라이브들 및 이들의 관련된 컴퓨터 판독 가능한 매체는 컴퓨터 판독 가능한 명령어, 데이터 구조물, 프로그램 모듈 및 다른 데이터의 지구성 저장(nonvolatile storage)을 컴퓨터(520)에게 제공한다. 컴퓨터에 의해 접근될 수 있는 데이터를 저장할 수 있는 임의의 종류의 컴퓨터 판독 가능한 매체, 예컨대, 자기 카세트, 플래쉬 메모리 카드, 디지털 비디오 디스크, 베르누이(Bernoulli) 카트리지, 무작위 접근 메모리(RAM), 읽기 전용 메모리(ROM) 등이 운영 환경에서 사용될 수 있다.
운영 시스템(535), 하나 이상의 응용 프로그램(536), 다른 프로그램 모듈(537) 및 프로그램 데이터(538)를 포함하는 다수의 프로그램 모듈들이 하드 디스크, 자기 디스크(529), 광학 디스크(531), ROM(524) 또는 RAM 상에 저장될 수 있다. 사용자는 입력 디바이스, 예컨대, 키보드(540) 및 포인팅 디바이스(542)를 통해 명령 및 정보를 개인용 컴퓨터(520)에 도입할 수 있다. 다른 입력 디바이스(도시되어 있지 않음)는 마이크로폰, 조이스틱, 게임 패드, 위성방송 수신 안테나, 스캐너 등을 포함할 수 있다. 이 입력 디바이스들 및 다른 입력 디바이스들은 종종 시스템 버스에 커플링되는 직렬 포트 인터페이스(546)를 통해 프로세싱 유닛(521)에 연결되지만, 다른 인터페이스, 예컨대, 병렬 포트, 게임 포트 또는 보편적인 직렬 버스(USB)에 의해 연결될 수 있다. 모니터(547) 또는 다른 종류의 디스플레이 디바이스도 인터페이스, 예컨대, 비디오 어댑터(548)를 통해 시스템 버스(523)에 연결된다. 컴퓨터는 모니터 이외에 전형적으로 다른 주변 출력 디바이스(도시되어 있지 않음), 예컨대, 스피커 및 프린터를 포함한다.
컴퓨터(520)는 하나 이상의 원격 컴퓨터, 예컨대, 원격 컴퓨터(549)에의 논리적 연결을 이용하여 네트워킹 환경에서 작동할 수 있다. 이 논리적 연결은 컴퓨터(520) 또는 이 컴퓨터의 일부에 커플링된 통신 디바이스에 의해 또는 다른 방식으로 달성될 수 있다. 원격 컴퓨터(549)는 또 다른 컴퓨터, 서버, 루터(router), 네트워크 PC, 클라이언트, 피어(peer) 디바이스 또는 다른 통상의 네트워크 노드일 수 있고, 메모리 저장 디바이스(550)만이 도 24에 예시되어 있지만 전형적으로 컴퓨터(520)와 관련하여 전술된 요소들 중 대다수 또는 전부를 포함한다. 도 24에 도시된 논리적 연결은 근거리 네트워크(LAN)(551) 및 광역 네트워크(WAN)(552)를 포함한다. 이러한 네트워킹 환경은 사무실 네트워크, 전사적 컴퓨터 네트워크, 인트라넷 및 인터넷(모드 네트워크의 종류임)에서 매우 흔하다.
LAN-네트워킹 환경에서 사용될 때, 컴퓨터(520)는 통신 디바이스의 일종인 네트워크 인터페이스 또는 어댑터(553)를 통해 지역 네트워크(551)에 연결된다. WAN-네트워킹 환경에서 사용될 때, 컴퓨터(520)는 종종 통신 디바이스의 일종인 모뎀(554), 또는 광역 네트워크(552) 상에서의 통신을 확립하기 위한 임의의 다른 종류의 통신 디바이스를 포함한다. 내부 또는 외부에 존재할 수 있는 모뎀(554)은 직렬 포트 인터페이스(546)를 통해 시스템 버스(523)에 연결된다. 네트워킹 환경에서, 개인용 컴퓨터(520)와 관련하여 도시된 프로그램 모듈 또는 이의 부분은 원격 메모리 저장 디바이스에 저장될 수 있다. 도시된 네트워크 연결이 비한정적 예이고 컴퓨터들 사이의 통신 연결을 확립하기 위한 다른 통신 디바이스가 사용될 수 있다는 것이 인식된다.
모듈
하나 이상의 모듈이 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있고, 이의 비한정적 예는 논리 프로세싱 모듈, 데이터 디스플레이 조직화 모듈, 서열결정 모듈, 맵핑 모듈, 카운팅 모듈, 필터링 모듈, 가중 모듈, 정규화 모듈, GC 편향 모듈, 수준 모듈, 비교 모듈, 범위 설정 모듈, 분류 모듈, 조절 모듈, 작도 모듈, 표시 모듈, 관계 모듈, 결과 모듈 및/또는 데이터 디스플레이 조직화 모듈 등 또는 이들의 조합을 포함한다. 모듈은 종종 마이크로프로세서에 의해 제어된다. 일부 실시양태에서, 모듈, 또는 하나 이상의 모듈을 포함하는 기계는 데이터 및/또는 정보를 또 다른 모듈, 기계, 구성요소, 주변장치 또는 기계의 작동자에게 또는 이로부터 모으고/으거나, 조립하고/하거나, 수용하고/하거나, 수득하고/하거나, 액세스하고/하거나, 회수하고/하거나, 제공하고/하거나 전달한다. 일부 실시양태에서, 데이터 및/또는 정보(예를 들면, 서열결정 리드)는 하나 이상의 유동 셀, 카메라, 검출기(예를 들면, 광 검출기, 광 셀, 전기 검출기(예를 들면, 진폭 조절 검출기, 주파수 및 위상 조절 검출기, 위상-잠겨진 루프 검출기), 카운터, 센서(예를 들면, 압력, 온도, 부피, 유동 또는 중량의 센서), 유체 취급 디바이스, 프린터, 디스플레이(예를 들면, LED, LCT 또는 CRT) 등 및 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하는 기계에 의해 모듈에게 제공된다. 예를 들면, 종종 기계의 작동자는 상수, 역치 값, 식 또는 소정의 값을 모듈에게 제공한다. 모듈은 종종 데이터 및/또는 정보를 또 다른 모듈 또는 기계에게 전달하거나 또 다른 모듈 또는 기계로부터 전달받도록 구성된다. 모듈은 또 다른 모듈로부터 데이터 및/또는 정보를 수용할 수 있고, 이러한 또 다른 모듈의 비한정적 예는 논리 프로세싱 모듈, 서열결정 모듈, 맵핑 모듈, 카운팅 모듈, 필터링 모듈, 가중 모듈, 정규화 모듈, GC 편향 모듈, 수준 모듈, 비교 모듈, 범위 설정 모듈, 분류 모듈, 작도 모듈, 표시 모듈, 관계 모듈, 결과 모듈 및/또는 데이터 디스플레이 조직화 모듈 등 또는 이들의 조합을 포함한다. 모듈은 데이터 및/또는 정보를 조작할 수 있고/있거나 변환시킬 수 있다. 모듈로부터 유도되거나 모듈에 의해 변환된 데이터 및/또는 정보는 또 다른 적합한 기계 및/또는 모듈에게 전달될 수 있고, 이러한 기계 및/또는 모듈의 비한정적 예는 논리 프로세싱 모듈, 데이터 디스플레이 조직화 모듈, 서열결정 모듈, 맵핑 모듈, 카운팅 모듈, 필터링 모듈, 가중 모듈, 정규화 모듈, GC 편향 모듈, 수준 모듈, 비교 모듈, 범위 설정 모듈, 분류 모듈, 조절 모듈, 작도 모듈, 표시 모듈, 관계 모듈, 결과 모듈 및/또는 데이터 디스플레이 조직화 모듈 등 또는 이들의 조합을 포함한다. 모듈을 포함하는 기계는 하나 이상의 마이크로프로세서를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 데이터 및/또는 정보는 모듈을 포함하는 기계에 의해 수용되고/되거나 제공된다. 모듈을 포함하는 기계는 모듈의 하나 이상의 명령어(예를 들면, 프로세스, 루틴 및/또는 서브루틴)를 수행할 수 있고/있거나 실행할 수 있는 마이크로프로세서(예를 들면, 하나 이상의 마이크로프로세서)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 모듈은 하나 이상의 외부 마이크로프로세서(예를 들면, 내부 또는 외부 네트워크, 서버, 저장 장치 및/또는 저장 네트워크(예를 들면, 클라우드))로 작동한다.
논리 프로세싱 모듈
일부 실시양태에서, 논리 프로세싱 모듈은 데이터 및/또는 정보를 편성하고/하거나, 제어하고/하거나, 한정하고/하거나, 조직화하고/하거나, 정돈하고/하거나, 분산시키고/시키거나, 분할하고/하거나, 변환시키고/시키거나 조절하거나, 데이터 및/또는 정보를 하나 이상의 다른 모듈, 주변장치 또는 디바이스에게 전달하고 하나 이상의 다른 모듈, 주변장치 또는 디바이스로부터 전달받는다.
데이터 디스플레이 조직화 모듈
일부 실시양태에서, 데이터 디스플레이 조직화 모듈은 데이터 및/또는 정보를 적합한 시각적 매체로 프로세싱하고/하거나 변환시키고, 이러한 시각적 매체의 비한정적 예는 영상, 비디오 및/또는 문자(예를 들면, 숫자, 글자 및 부호)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 데이터 디스플레이 조직화 모듈은 적합한 디스플레이(예를 들면, 모니터, LED, LCD, CRT 등 또는 이들의 조합), 프린터, 적합한 주변장치 또는 디바이스 상에서의 제시를 위해 데이터 및/또는 정보를 프로세싱하고/하거나, 변환시키고/시키거나 전달한다. 일부 실시양태에서, 데이터 디스플레이 조직화 모듈은 데이터 및/또는 정보를 태아 또는 모체 게놈, 염색체 또는 이의 부분의 시각적 표시치로 프로세싱하거나 변환시킨다.
서열결정 모듈
일부 실시양태에서, 서열결정 모듈은 서열 리드를 수득하고/하거나, 생성하고/하거나, 모으고/으거나, 조립하고/하거나, 조작하고/하거나, 변환시키고/시키거나, 프로세싱하고/하거나, 변환시키고/시키거나 전달한다. 본원에서 사용된 "서열 수용 모듈"은 "서열결정 모듈"과 동일하다. 서열결정 모듈을 포함하는 기계는 당분야에서 공지된 서열결정 기술을 이용하여 핵산의 서열을 결정하는 임의의 기계일 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열결정 모듈은 서열 리드를 정렬할 수 있거나, 조립할 수 있거나, 단편화할 수 있거나, 보완할 수 있거나, 역보완할 수 있거나, 오류 점검할 수 있거나 오류 보정할 수 있다.
맵핑 모듈
서열 리드는 맵핑 모듈, 또는 맵핑 모듈을 포함하는 기계에 의해 맵핑될 수 있고, 이 맵핑 모듈은 일반적으로 리드를 기준 게놈 또는 이의 분절에 맵핑한다. 맵핑 모듈은 당분야에서 공지된 적합한 방법으로 서열결정 리드를 맵핑할 수 있다. 일부 실시양태에서, 맵핑 모듈, 또는 맵핑 모듈을 포함하는 기계는 맵핑된 서열 리드를 제공하는 데에 요구된다.
카운팅 모듈
카운트는 카운팅 모듈, 또는 카운팅 모듈을 포함하는 기계에 의해 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 카운팅 모듈은 기준 게놈에 맵핑된 서열 리드를 카운팅한다. 일부 실시양태에서, 카운팅 모듈은 당분야에서 공지된 카운팅 방법에 따라 카운트를 생성하고/하거나, 조립하고/하거나 제공한다. 일부 실시양태에서, 카운팅 모듈, 또는 카운팅 모듈을 포함하는 기계는 카운트를 제공하는 데에 요구된다.
필터링 모듈
부분(예를 들면, 기준 게놈의 부분)의 필터링은 필터링 모듈(예를 들면, 필터링 모듈을 포함하는 기계)에 의해 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 필터링 모듈은 필터링된 부분 데이터(예를 들면, 필터링된 부분)를 제공하고/하거나 부분을 고려사항으로부터 제거하는 데에 요구된다. 일부 실시양태에서, 필터링 모듈은 부분들에 맵핑된 카운트를 고려사항으로부터 제거한다. 일부 실시양태에서, 필터링 모듈은 부분들에 맵핑된 카운트를 수준 또는 프로파일의 측정으로부터 제거한다. 필터링 모듈은 당분야에서 공지되어 있거나 본원에 기재되어 있는 하나 이상의 필터링 방법으로 데이터(예를 들면, 카운트, 부분들에 맵핑된 카운트, 부분, 부분 수준, 정규화된 카운트, 미가공 카운트 등)를 필터링할 수 있다.
가중 모듈
부분(예를 들면, 기준 게놈의 부분)의 가중은 가중 모듈(예를 들면, 가중 모듈을 포함하는 기계)에 의해 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가중 모듈은 게놈 구획을 가중하고/하거나 가중된 부분 값을 제공하는 데에 요구된다. 가중 모듈은 당분야에서 공지되어 있거나 본원에 기재되어 있는 하나 이상의 가중 방법으로 부분을 가중할 수 있다.
정규화 모듈
정규화된 데이터(예를 들면, 정규화된 카운트)는 정규화 모듈(예를 들면, 정규화 모듈을 포함하는 기계)에 의해 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 정규화 모듈은 서열결정 리드로부터 수득된 정규화된 데이터(예를 들면, 정규화된 카운트)를 제공하는 데에 요구된다. 정규화 모듈은 본원에 기재되어 있거나(예를 들면, PERUN, 하이브리드 정규화 등 또는 이들의 조합) 또는 당분야에서 공지되어 있는 하나 이상의 정규화 방법으로 데이터(예를 들면, 카운트, 필터링된 카운트, 미가공 카운트)를 정규화할 수 있다.
GC 편향 모듈
GC 편향의 측정(예를 들면, 기준 게놈의 각각의 부분(예를 들면, 부분, 기준 게놈의 부분)에 대한 GC 편향의 측정)은 GC 편향 모듈(예를 들면, GC 편향 모듈을 포함하는 기계)에 의해 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, GC 편향 모듈은 GC 편향의 측정을 제공하는 데에 요구된다. 일부 실시양태에서, GC 편향 모듈은 기준 게놈의 각각의 부분들에 맵핑된 서열 리드의 카운트와 각각의 부분의 GC 함량 사이의 피팅된 관계(예를 들면, 피팅된 선형 관계)로부터 GC 편향의 측정을 제공한다. GC 편향 모듈은 종종 정규화 모듈(예를 들면, PERUN 정규화 모듈)의 일부이다.
수준 모듈
수준(예를 들면, 수준들)의 측정 및/또는 기준 게놈의 부분에 대한 게놈 구획 수준의 계산은 수준 모듈(예를 들면, 수준 모듈을 포함하는 기계)에 의해 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 수준 모듈은 (예를 들면, 방정식 A, B, L, M, N, O 및/또는 Q에 따라) 수준 또는 계산된 게놈 구획 수준을 제공하는 데에 요구된다. 일부 실시양태에서, 수준 모듈은 기준 게놈의 각각의 부분들에 맵핑된 서열 리드의 GC 편향과 카운트 사이의 피팅된 관계(예를 들면, 피팅된 선형 관계)로부터 수준을 제공한다. 일부 실시양태에서, 수준 모듈은 PERUN의 일부로서 게놈 구획 수준을 계산한다. 일부 실시양태에서, 수준 모듈은 방정식 Li = (mi - GiS)I-1에 따라 게놈 구획 수준(즉, Li)을 제공하고, 이때 Gi는 GC 편향이고, mi는 기준 게놈의 각각의 부분들에 맵핑된 측정된 카운트이고, i는 샘플이고, I는 절편이고, S는 기준 게놈의 각각의 부분들에 맵핑된 서열 리드의 GC 편향과 카운트 사이의 피팅된 관계(예를 들면, 피팅된 선형 관계)의 기울기이다.
비교 모듈
제1 수준은 비교 모듈, 또는 비교 모듈을 포함하는 기계에 의해 제2 수준과 유의하게 상이한 것으로서 확인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비교 모듈, 또는 비교 모듈을 포함하는 기계는 2개의 수준들 사이의 비교를 제공하는 데에 요구된다.
범위 설정 모듈
다양한 카피 수 변이(예를 들면, 중복, 삽입 및/또는 결실)에 대한 기대 범위(예를 들면, 기대 수준 범위) 또는 카피 수 변이의 부재에 대한 범위는 범위 설정 모듈, 또는 범위 설정 모듈을 포함하는 기계에 의해 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기대 수준은 범위 설정 모듈, 또는 범위 설정 모듈을 포함하는 기계에 의해 제공된다. 일부 실시양태에서, 범위 설정 모듈, 또는 범위 설정 모듈을 포함하는 기계는 기대 수준 및/또는 범위를 제공하는 데에 요구된다.
분류 모듈
카피 수 변이(예를 들면, 모체 및/또는 태아 카피 수 변이, 태아 카피 수 변이, 중복, 삽입, 결실)는 분류 모듈, 또는 분류 모듈을 포함하는 기계에 의해 분류될 수 있다. 일부 실시양태에서, 카피 수 변이(예를 들면, 모체 및/또는 태아 카피 수 변이)는 분류 모듈에 의해 분류된다. 일부 실시양태에서, 또 다른 수준(예를 들면, 제2 수준)과 유의하게 상이한 것으로서 확인된 수준(예를 들면, 제1 수준)은 분류 모듈에 의해 카피 수 변이의 표시치로서 확인된다. 일부 실시양태에서, 카피 수 변이의 부재는 분류 모듈에 의해 확인된다. 일부 실시양태에서, 카피 수 변이의 확인은 분류 모듈을 포함하는 기계에 의해 확인될 수 있다. 분류 모듈은 모체 및/또는 태아 카피 수 변이, 태아 카피 수 변이, 중복, 결실 또는 삽입, 또는 이들의 결여 또는 조합을 분류하도록 전문화될 수 있다. 예를 들면, 모체 결실을 확인하는 분류 모듈은 태아 중복을 확인하는 분류 모듈과 상이할 수 있고/있거나 구별될 수 있다. 일부 실시양태에서, 분류 모듈, 또는 분류 모듈을 포함하는 기계는 카피 수 변이, 또는 카피 수 변이를 확인시켜주는 결과를 확인하는 데에 요구된다.
조절 모듈
일부 실시양태에서, 수준의 조절(예를 들면, 게놈 구획 수준, 프로파일 수준, 카피 수 변이 수준, 하나 이상의 부분의 수준 등 또는 이들의 조합에 대한 조절)은 조절 모듈에 의해 또는 조절 모듈을 포함하는 기계에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 조절 모듈 또는 조절 모듈을 포함하는 기계는 수준을 조절하는 데에 요구된다. 본원에 기재된 방법에 의해 조절된 수준은 추가 검사(예를 들면, 모체 핵산 및/또는 태아 핵산의 표적화된 서열결정)에 의해 독립적으로 검증될 수 있고/있거나 조절될 수 있다.
작도 모듈
일부 실시양태에서, 작도 모듈은 데이터 및/또는 정보를 적합한 시각적 매체로 프로세싱하고/하거나 변환시키고, 이러한 시각적 매체의 비한정적 예는 차트, 도표, 그래프 등 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 작도 모듈은 적합한 디스플레이(예를 들면, 모니터, LED, LCD, CRT 등 또는 이들의 조합), 프린터, 적합한 주변장치 또는 디바이스 상에서의 제시를 위해 데이터 및/또는 정보를 프로세싱하고/하거나, 변환시키고/시키거나 전달한다. 일부 실시양태에서, 작도 모듈은 카운트, 수준 및/또는 프로파일의 시각적 디스플레이를 제공한다. 일부 실시양태에서, 데이터 디스플레이 조직화 모듈은 데이터 및/또는 정보를 태아 또는 모체 게놈, 염색체 또는 이들의 일부의 시각적 표시치로 프로세싱하거나 변환시킨다. 일부 실시양태에서, 작도 모듈, 또는 작도 모듈을 포함하는 기계는 카운트, 수준 또는 프로파일을 작도하는 데에 요구된다.
관계 모듈
일부 실시양태에서, 관계 모듈은 데이터 및/또는 정보를 관계로 프로세싱하고/하거나 변환시킨다. 일부 실시양태에서, 관계는 관계 모듈에 의해 생성되고/되거나 관계 모듈로부터 전달된다.
결과 모듈
일부 실시양태에서, 유전적 변이(이배수성, 태아 이배수성, 카피 수 변이)의 존재 또는 부재는 결과 모듈, 또는 결과 모듈을 포함하는 기계에 의해 확인된다. 일부 실시양태에서, 유전적 변이는 결과 모듈에 의해 확인된다. 종종 이배수성의 존재 또는 부재는 결과 모듈에 의해 확인된다. 일부 실시양태에서, 유전적 변이(이배수성, 카피 수 변이)를 확인시켜주는 결과는 결과 모듈, 또는 결과 모듈을 포함하는 기계에 의해 확인될 수 있다. 결과 모듈은 특정 유전적 변이(예를 들면, 삼염색체성, 삼염색체성 21, 삼염색체성 18)를 확인하도록 전문화될 수 있다. 예를 들면, 삼염색체성 21을 확인하는 결과 모듈은 삼염색체성 18을 확인하는 결과 모듈과 상이할 수 있고/있거나 구별될 수 있다. 일부 실시양태에서, 결과 모듈, 또는 결과 모듈을 포함하는 기계는 유전적 변이를 확인하거나 유전적 변이(예를 들면, 이배수성, 카피 수 변이)를 확인시켜주는 결과를 확인하는 데에 요구된다. 본원에 기재된 방법에 의해 확인된 유전적 변이, 또는 유전적 변이를 확인시켜주는 결과는 추가 검사(예를 들면, 모체 및/또는 태아 핵산의 표적화된 서열결정)에 의해 독립적으로 검증될 수 있다.
변환
상기 인지된 바와 같이, 데이터는 종종 한 형태로부터 또 다른 형태로 변환된다. 본원에서 사용된 용어 "변환된", "변환" 및 이의 문법적 파생어 또는 등가어는 물리적 출발 물질(예를 들면, 검사 대상체 및/또는 기준 대상체 샘플 핵산)로부터의 데이터를 물리적 출발 물질의 디지털 표시치(예를 들면, 서열 리드 데이터)로 변경시키는 것을 지칭하고, 일부 실시양태에서 결과(예를 들면, 검사 샘플에 대한 태아 분획 측정 또는 추정)를 제공하는 데에 사용될 수 있는 디지털 표시치의 하나 이상의 수치 값 또는 도식적 표시치로의 추가 변환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 디지털적으로 표시된 데이터의 하나 이상의 수치 값 및/또는 도식적 표시치는 검사 대상체의 물리적 게놈의 외관을 표시하는 데(예를 들면, 게놈 삽입, 중복 또는 결실의 존재 또는 부재를 사실적으로 표시하거나 시각적으로 표시하거나; 의학적 질환과 관련된 서열의 물리적 양의 변경의 존재 또는 부재를 표시하는 데)에 사용될 수 있다. 사실적 표시치는 종종 출발 물질의 디지털 표시치의 하나 이상의 수치 값 또는 도식적 표시치로 더 변환된다. 이 방법들은 물리적 출발 물질을 수치 값 또는 도식적 표시치, 또는 검사 대상체의 게놈의 물리적 외관의 표시치로 변환시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 데이터 세트의 변환은 데이터 복잡성 및/또는 데이터 차원수를 감소시킴으로써 결과의 제공을 용이하게 한다. 데이터 세트 복잡성은 종종 물리적 출발 물질을 이 출발 물질의 사실적 표시치(예를 들면, 물리적 출발 물질을 표시하는 서열 리드)로 변환시키는 프로세스 동안 감소된다. 적합한 특징 또는 변수가 데이터 세트 복잡성 및/또는 차원수를 감소시키는 데에 사용될 수 있다. 데이터 프로세싱을 위한 표적 특징으로서 사용되기 위해 선택될 수 있는 특징의 비한정적 예는 GC 함량, 태아 성별 예측, 단편 크기(예를 들면, CCF 단편의 길이, 리드 또는 이들의 적합한 표시치(예를 들면, FRS)), 단편 서열, 염색체 이배수성의 확인, 특정 유전자 또는 단백질의 확인, 암의 확인, 질환, 유전된 유전자/형질, 염색체 이상, 생물학적 카테고리, 화학적 카테고리, 생화학적 카테고리, 유전자 또는 단백질의 카테고리, 유전자 존재론(ontology), 단백질 존재론, 함께 조절되는 유전자, 세포 신호전달 유전자, 세포 주기 유전자, 상기 유전자들과 관련된 단백질, 유전자 변이체, 단백질 변이체, 함께 조절되는 유전자, 함께 조절되는 단백질, 아미노산 서열, 뉴클레오티드 서열, 단백질 구조 데이터 등 및 이들의 조합을 포함한다. 데이터 세트 복잡성 및/또는 차원수 감소의 비한정적 예는 복수의 서열 리드를 프로파일 도표로 단순화하는 것, 복수의 서열 리드를 수치 값(예를 들면, 정규화된 값, Z-점수, p-값)으로 단순화하는 것, 다수의 분석 방법들을 확률 도표 또는 단일 점으로 단순화하는 것, 유도된 양의 주성분 분석 등 또는 이들의 조합을 포함한다.
특정 시스템, 기계, 컴퓨터 프로그램 제품 실시양태
특정 양태에서, 유전적 변이의 존재 또는 부재를 확인하는 컴퓨터 실행 방법으로서, (a) 기준 게놈의 게놈 구획에 맵핑된 뉴클레오티드 서열 리드의 카운트를 수득하는 단계로서, 이때 상기 서열 리드는 (i) 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플로부터의 세포 유리 순환 핵산의 리드 및 (ii) 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 핵산 단편으로부터의 리드인 단계; (b) 상기 카운트를 정규화하여 게놈 구획에 맵핑된 서열 리드의 정규화된 카운트를 생성하는 단계; 및 (c) 정규화된 카운트에 따라 유전적 변이의 존재 또는 부재를 확인하는 단계를 포함하는 컴퓨터 실행 방법을 제공한다.
특정 양태에서, 하나 이상의 마이크로프로세서 및 메모리를 포함하는 시스템으로서, 상기 메모리가 상기 하나 이상의 마이크로프로세서에 의해 실행될 수 있는 명령어를 포함하고 기준 게놈의 게놈 구획에 맵핑된 뉴클레오티드 서열 리드의 카운트를 포함하며, 상기 서열 리드가 (i) 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플로부터의 세포 유리 순환 핵산의 리드 및 (ii) 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 핵산 단편으로부터의 리드이고, 상기 하나 이상의 마이크로프로세서에 의해 실행될 수 있는 상기 명령어는 (a) 상기 카운트를 정규화하여 게놈 구획에 맵핑된 서열 리드의 정규화된 카운트를 생성하고 (b) 정규화된 카운트에 따라 유전적 변이의 존재 또는 부재를 확인하도록 구성되는 것인 시스템도 제공한다.
특정 양태에서, 하나 이상의 마이크로프로세서 및 메모리를 포함하는 기계로서, 상기 메모리가 상기 하나 이상의 마이크로프로세서에 의해 실행될 수 있는 명령어를 포함하고 기준 게놈의 게놈 구획에 맵핑된 뉴클레오티드 서열 리드의 카운트를 포함하며, 상기 서열 리드가 (i) 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플로부터의 세포 유리 순환 핵산의 리드 및 (ii) 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 핵산 단편으로부터의 리드이고, 상기 하나 이상의 마이크로프로세서에 의해 실행될 수 있는 상기 명령어는 (a) 상기 카운트를 정규화하여 게놈 구획에 맵핑된 서열 리드의 정규화된 카운트를 생성하고 (b) 정규화된 카운트에 따라 유전적 변이의 존재 또는 부재를 확인하도록 구성되는 것인 기계도 제공한다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 마이크로프로세서에 의해 실행될 때 (a) 기준 게놈의 게놈 구획에 맵핑된 뉴클레오티드 서열 리드의 카운트에 액세스하고 (b) 상기 카운트를 정규화하여 게놈 구획에 맵핑된 서열 리드의 정규화된 카운트를 생성하고 (c) 정규화된 카운트에 따라 유전적 변이의 존재 또는 부재를 확인하도록 구성된 명령어를 포함하는, 컴퓨터 판독 가능한 매체 상에 유형으로 구현된 컴퓨터 프로그램 제품으로서, 상기 서열 리드가 (i) 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플로부터의 세포 유리 순환 핵산의 리드 및 (ii) 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 핵산 단편으로부터의 리드인 컴퓨터 프로그램 제품도 제공한다.
본원은 하나 이상의 마이크로프로세서 및 메모리를 포함하는 시스템으로서, 상기 메모리는 상기 하나 이상의 마이크로프로세서에 의해 실행될 수 있는 명령어를 포함하고 기준 게놈의 부분들에 맵핑된 뉴클레오티드 서열 리드를 포함하며, 상기 서열 리드는 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플로부터의 세포 유리 순환 핵산의 리드이고, 상기 하나 이상의 마이크로프로세서에 의해 실행될 수 있는 상기 명령어는 (a) 마이크로프로세서를 이용하여, (i) 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트, 또는 (ii) 다른 부분 특이적 파라미터를, 각각의 부분과 독립적으로 관련된 가중치에 따라 태아 핵산의 부분 특이적 분획에 가중하여, 가중치에 따른 부분 특이적 태아 분획 추정치를 제공하고, 이때 각각의 가중치가 (i) 다수의 샘플들 각각에 대한 태아 핵산 분획과 (ii) 다수의 샘플들에 대한 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트 또는 다른 부분 특이적 파라미터 사이의 각각의 부분에 대한 피팅된 관계로부터 결정되고 (b) 부분 특이적 태아 분획 추정치를 기초로 검사 샘플에 대한 태아 핵산 분획을 추정하도록 구성되는 것인 시스템도 제공한다.
본원은 하나 이상의 마이크로프로세서 및 메모리를 포함하는 기계로서, 상기 메모리가 상기 하나 이상의 마이크로프로세서에 의해 실행될 수 있는 명령어를 포함하고 기준 게놈의 부분들에 맵핑된 뉴클레오티드 서열 리드를 포함하고, 상기 서열 리드가 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플로부터의 세포 유리 순환 핵산의 리드이고, 상기 하나 이상의 마이크로프로세서에 의해 실행될 수 있는 상기 명령어는 (a) 마이크로프로세서를 이용하여, (i) 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트, 또는 (ii) 다른 부분 특이적 파라미터를, 각각의 부분과 독립적으로 관련된 가중치에 따라 태아 핵산의 부분 특이적 분획에 가중하여, 가중치에 따른 부분 특이적 태아 분획 추정치를 제공하고, 이때 각각의 가중치가 (i) 다수의 샘플들 각각에 대한 태아 핵산 분획과 (ii) 다수의 샘플들에 대한 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트 또는 다른 부분 특이적 파라미터 사이의 각각의 부분에 대한 피팅된 관계로부터 결정되고 (b) 부분 특이적 태아 분획 추정치를 기초로 검사 샘플에 대한 태아 핵산 분획을 추정하도록 구성되는 것인 기계도 제공한다.
본원은 마이크로프로세서가 하기 단계들을 수행하도록 명령하는 실행 가능한 프로그램이 저장되어 있는 비일시적 컴퓨터 판독 가능 기억 매체도 제공한다: (a) 기준 게놈의 부분들에 맵핑된 뉴클레오티드 서열 리드에 액세스하는 단계로서, 이때 상기 서열 리드는 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플로부터의 세포 유리 순환 핵산의 리드인 단계; (b) 마이크로프로세서를 이용하여, (i) 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트, 또는 (ii) 다른 부분 특이적 파라미터를, 각각의 부분과 독립적으로 관련된 가중치에 따라 태아 핵산의 부분 특이적 분획에 가중하여, 가중치에 따른 부분 특이적 태아 분획 추정치를 제공하는 단계로서, 이때 각각의 가중치는 (i) 다수의 샘플들 각각에 대한 태아 핵산 분획과 (ii) 다수의 샘플들에 대한 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트 또는 다른 부분 특이적 파라미터 사이의 각각의 부분에 대한 피팅된 관계로부터 결정되는 것인 단계; 및 (c) 부분 특이적 태아 분획 추정치를 기초로 검사 샘플에 대한 태아 핵산 분획을 추정하는 단계.
특정 실시양태에서, 시스템, 기계 및/또는 컴퓨터 프로그램 제품은 기준 게놈의 게놈 구획 또는 이의 부분(예를 들면, 게놈 구획의 서브세트, 게놈 구획의 선택된 세트)에 맵핑된 리드를 카운팅하도록 구성된 카운팅 모듈을 포함한다. 카운팅 모듈은 종종 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 핵산 단편으로부터의 리드를 카운팅하도록 구성된다. 카운트는 종종 미가공 카운트, 필터링된 카운트, 정규화된 카운트 또는 이들의 조합물이다. 일부 실시양태에서, 카운팅 모듈은 예를 들면, 본원에 기재되어 있거나 당분야에서 공지되어 있는 임의의 적합한 정규화 프로세스를 이용하여 카운트를 정규화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 시스템, 기계 및/또는 컴퓨터 프로그램 제품은 카운트 비교 모듈을 포함한다. 카운트 비교 모듈은 종종 카운팅 모듈에 의해 카운팅된 리드의 카운트의 수를 비교하여 카운트를 비교하도록 구성된다. 카운트 비교 모듈은 종종 (예를 들면, 카운팅 모듈 또는 정규화 모듈로부터의) 리드의 카운트에 액세스하고/하거나, 이러한 카운트를 수용하고/하거나, 이용하고/하거나, 저장하고/하거나, 검색하고/하거나 정렬하도록 구성된다. 카운트 비교 모듈은 종종 카운트들 사이의 적합한 비교를 제공하도록 구성되고, 이러한 비교의 비한정적 예는 단순 비교(예를 들면, 게놈 구획의 제2 세트에 비해 게놈 구획의 제1 세트에 맵핑된 리드의 카운트들 사이의 일치 또는 불일치), 수학적 비교(예를 들면, 비, 백분율), 통계학적 비교(예를 들면, 다중 비교, 다중 검정, 표준화(예를 들면, z-점수 분석)) 등 및 이들의 조합을 포함한다. 적합한 카운트 비교 값은 카운트 비교 모듈에 의해 제공될 수 있고, 이의 비한정적 예는 카운트들 사이의 일치의 존재 또는 부재, 비, 백분율, z-점수, 분산 또는 불확실성의 척도(예를 들면, 표준 편차, 중간 절대 편차, 신뢰 구간)와 커플링된 값 등 및 이들의 조합을 포함한다. 카운트 비교 모듈은 종종 예를 들면, 비교 값을 또 다른 모듈 또는 기계, 예컨대, 유전적 변이 모듈, 디스플레이 기계 또는 프린터 기계에게 전달하도록 구성된다.
특정 실시양태에서, 시스템, 기계 및/또는 컴퓨터 프로그램 제품은 유전적 변이 모듈을 포함한다. 유전적 변이 모듈은 종종 기준 게놈의 게놈 구획에 맵핑된 리드의 카운트에 따라 유전적 변이의 존재 또는 부재의 확인을 제공하도록 구성된다. 유전적 변이 모듈은 종종 카운트의 비교에 따라 유전적 변이의 존재 또는 부재의 확인을 제공하도록 구성된다. 유전적 변이 모듈은 종종 카운트 비교 모듈로부터의 하나 이상의 비교 및/또는 카운팅 모듈로부터의 카운트에 액세스하고/하거나, 이러한 비교 및/또는 카운트를 수용하고/하거나, 이용하고/하거나, 저장하고/하거나, 검색하고/하거나 정렬하도록 구성된다. 유전적 변이 모듈은 적합한 방식으로 하나 이상의 비교 또는 카운트로부터 유전적 변이의 존재 또는 부재를 확인할 수 있다. 유전적 변이 모듈은 종종 기준 게놈 내의 게놈 구획의 상이한 세트들에 대한 카운트들 사이에 유의한 차이가 존재하는 지를 확인한다. 차이의 유의성은 적합한 방식(예를 들면, % 차이, z-점수 분석)으로 유전적 변이 모듈에 의해 측정될 수 있다. 유전적 변이 모듈은 종종 카운트 측정 또는 카운트의 비교가 특정 카테고리 내에 있는 지를 확인한다. 예를 들면, 유전적 변이 모듈은 특정 비교를 정배수체 확인과 관련된 특정 비 역치 또는 비의 범위, 또는 이배수체 확인과 관련된 특정 비 역치 또는 비의 범위로 분류할 수 있다. 또 다른 비한정적 예에서, 유전적 변이 모듈은 특정 카운트 측정을 정배수체 확인과 관련된 특정 카운트 역치 또는 카운트의 범위, 또는 이배수체 확인과 관련된 특정 카운트 역치 또는 카운트의 범위로 분류할 수 있다. 유전적 변이 모듈은 종종 임의적으로 분산 또는 불확실성의 척도(예를 들면, 표준 편차, 중간 절대 편차, (예를 들면, 특정 신뢰 구간 내의) 정확도)와 관련된 유전적 변이에 대한 판정인 결과를 적합한 포맷으로 제공할 수 있다. 유전적 변이 모듈은 종종 예를 들면, 유전적 변이의 존재 또는 부재의 확인을 또 다른 모듈 또는 기계, 예컨대, 디스플레이 기계 또는 프린터에게 전달하도록 구성된다.
본원에 기재된 모듈(예를 들면, 기준 비교 모듈)을 포함하는 기계 또는 시스템은 하나 이상의 마이크로프로세서를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기계 또는 시스템은 다수의 마이크로프로세서들, 예를 들면, 동시에 작동하는 통합된 마이크로프로세서들을 포함할 수 있다. 시스템 또는 기계 내의 마이크로프로세서(예를 들면, 하나 이상의 마이크로프로세서)는 본원에 기재된 모듈에서 하나 이상의 명령어(예를 들면, 프로세스, 루틴 및/또는 서브루틴)를 수행할 수 있고/있거나 실행할 수 있다. 본원에 기재된 모듈은 종종 메모리에 위치하거나 기계 또는 시스템과 연결되어 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 모듈은 하나 이상의 외부 마이크로프로세서(예를 들면, 내부 또는 외부 네트워크, 서버, 저장 디바이스 및/또는 저장 네트워크(예를 들면, 클라우드))로 작동한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 모듈은 또 다른 모듈, 기계 또는 시스템(예를 들면, 구성요소, 주변장치)으로부터 데이터 및/또는 정보에 액세스하고/하거나, 이러한 데이터 및/또는 정보를 모으고/으거나, 조립하고/하거나 수용하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 모듈은 데이터 및/또는 정보를 또 다른 모듈, 기계 또는 시스템(예를 들면, 구성요소, 주변장치)에게 제공하고/하거나 전달하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 모듈은 기계 또는 시스템의 작동자(즉, 사용자)로부터 입력 데이터 및/또는 정보에 액세스하고/하거나, 이러한 데이터 및/또는 정보를 수용하고/하거나, 제공받고/받거나 모으도록 구성된다. 예를 들면, 종종 사용자는 상수, 역치 값, 식 및/또는 소정의 값을 모듈에게 제공한다. 본원에 기재된 모듈은 종종 그가 액세스하고/하거나, 수용하고/하거나, 모으고/으거나 조립하는 데이터 및/또는 정보를 변환시키도록 구성된다.
특정 실시양태에서, 시스템, 기계 및/또는 컴퓨터 프로그램 제품은 (i) 핵산 서열 리드 및/또는 부분적 뉴클레오티드 서열 리드를 수득하고/하거나 이러한 리드에 접근하도록 구성된 서열결정 모듈; (ii) 핵산 서열 리드를 기준 게놈의 부분들에 맵핑하도록 구성된 맵핑 모듈; (iii) 기준 게놈의 부분들에 맵핑된 핵산 서열 리드의 카운트를 제공하도록 구성된 카운팅 모듈; (iv) 정규화된 카운트를 제공하도록 구성된 정규화 모듈; (v) 제2 상승과 유의하게 상이한 제1 상승의 확인을 제공하도록 구성된 비교 모듈; (vi) 하나 이상의 기대 수준 범위를 제공하도록 구성된 범위 설정 모듈; (vii) 카피 수 변이를 표시하는 상승을 확인하도록 구성된 분류 모듈; (viii) 카피 수 변이로서 확인된 수준을 조절하도록 구성된 조절 모듈; (ix) 수준 및/또는 프로파일을 그래프화하고 디스플레이하도록 구성된 작도 모듈; (x) 유전적 변이의 존재 또는 부재를 확인하거나 결과(예를 들면, 태아 이배수성의 존재 또는 부재를 확인시켜주는 결과)를 확인하도록 구성된 결과 모듈; (xi) 유전적 변이 확인을 디스플레이하도록 구성된 데이터 디스플레이 조직화 모듈; (xii) 하나 이상의 맵 서열 리드를 수행하고 맵핑된 서열 리드를 카운팅하고 카운트를 정규화하고 결과를 생성하도록 구성된 논리 프로세싱 모듈; (xiii) 카운트 비교 모듈; (xiv) 태아 분획 측정을 제공하도록 구성된 태아 분획 모듈; (xv) 유전적 변이의 존재 또는 부재의 확인을 제공하도록 구성된 유전적 변이 모듈; 또는 (xvi) 상기 모듈들 중 둘 이상의 모듈들의 조합물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 서열결정 모듈 및 맵핑 모듈은 서열 리드를 서열결정 모듈로부터 맵핑 모듈에게 전달하도록 구성된다. 맵핑 모듈 및 카운팅 모듈은 종종 맵핑된 서열 리드를 맵핑 모듈로부터 카운팅 모듈에게 전달하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 정규화 모듈 및/또는 비교 모듈은 정규화된 카운트를 비교 모듈 및/또는 범위 설정 모듈에게 전달하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 비교 모듈, 범위 설정 모듈 및/또는 분류 모듈은 독립적으로 (i) 제2 상승과 유의하게 상이한 제1 상승의 확인 및/또는 (ii) 기대 수준 범위를 비교 모듈 및/또는 범위 설정 모듈로부터 분류 모듈에게 전달하도록 구성된다. 특정 실시양태에서, 분류 모듈 및 조절 모듈은 카피 수 변이로서 분류된 상승을 분류 모듈로부터 조절 모듈에게 전달하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 조절 모듈, 작도 모듈 및 결과 모듈은 하나 이상의 조절된 수준을 조절 모듈로부터 작도 모듈 또는 결과 모듈에게 전달하도록 구성된다. 정규화 모듈은 종종 맵핑된 정규화된 서열 리드 카운트를 비교 모듈, 범위 설정 모듈, 분류 모듈, 조절 모듈, 결과 모듈 및 작도 모듈 중 하나 이상에게 전달하도록 구성된다.
실시예
하기 실시예들은 단지 예시로서 제공되고 한정으로서 제공되지 않는다. 따라서, 하기 실시예들은 일부 실시양태를 예시하고 기술을 한정하지 않는다. 당업자는 본질적으로 동일한 또는 유사한 결과를 생성하도록 변경될 수 있거나 변형될 수 있는 다양한 비-임계적 파라미터들을 용이하게 인식할 것이다.
실시예 1: 유전적 변이와 관련된 상태를 검출하는 PERUN 및 일반적인 방법.
본원에 기재된 방법 및 기저 이론은 유전적 변이와 관련된 다양한 상태를 검출하고 유전적 변이의 존재 또는 부재를 확인시켜주는 결과를 제공하거나 유전적 변이의 존재 또는 부재를 확인하는 데에 이용될 수 있다.
기준 게놈의 비-정보제공 부분의 제거
기준 게놈의 비-정보제공 부분을 제거하기 위한 다수의 시도들은 부분 선택이 분류를 개선하는 잠재력을 가진다는 것을 시사하였다.
방정식 A
M = LI + GS
방정식 A에서 다양한 용어들은 하기 의미를 가진다:
Figure 112016006621635-pct00009
M: 원하지 않는 변이에 의해 오염된 일차 정보를 표시하는 측정된 카운트.
Figure 112016006621635-pct00010
L: 염색체 수준 - 이것은 데이터 프로세싱 절차로부터의 원하는 출력물이다. L은 정배수체로부터의 태아 및/또는 모체 이상을 표시한다. 이것은 확률적 오차 및 시스템적 편향 둘 다에 의해 감춰지는 양이다. 염색체 수준 L은 샘플 특이적 및 부분 특이적이다.
Figure 112016006621635-pct00011
G: 선형 모델, LOESS 또는 임의의 등가 방법을 이용함으로써 측정된 GC 편향 계수. G는 통상적으로 기준 게놈으로부터 유도된, M 및 부분 특이적 GC 함량 값의 세트로부터 추출된 이차 정보를 표시한다(그러나, 실제 관찰된 GC 함량으로부터도 유도될 수 있다). G는 샘플 특이적이고 게놈 위치에 따라 변경되지 않는다. 이것은 원하지 않는 변이의 부분을 요약한다.
Figure 112016006621635-pct00012
I: 선형 모델의 절편. 이 모델 파라미터는 주어진 실험 셋업에 대해 고정되고 샘플에 의존하지 않고 부분 특이적이다.
Figure 112016006621635-pct00013
S: 선형 모델의 기울기. 이 모델 파라미터는 주어진 실험 셋업에 대해 고정되고 샘플에 의존하지 않고 부분 특이적이다.
양 M 및 G가 측정된다. 처음에, 부분 특이적 값 I 및 S는 공지되어 있지 않다. 공지되어 있지 않은 I 및 S를 평가하기 위해, 본 발명자들은 정배수체 샘플에서 기준 게놈의 모든 부분들에 대해 L이 1이라고 가정해야 한다. 이 가정은 항상 옳지는 않지만, 정상 염색체 수준을 가진 샘플이 결실/중복을 가진 임의의 샘플을 압도할 것이라고 합리적으로 예측할 수 있다. 정배수체 샘플에 적용된 선형 모델은 선택된 부분에 대한 특이성을 가진 I 및 S 파라미터 값을 추출한다(L이 1이라고 가정함). 동일한 절차를 인간 게놈 내의 기준 게놈의 모든 부분들에 적용하여 모든 게놈 위치에 대한 절편 I 및 기울기 S의 세트를 생성한다. 교차검증은 모든 LDTv2CE 정배수체의 90%를 함유하는 작업 세트를 무작위적으로 선택하고 그 서브세트를 사용하여 모델을 트레이닝한다. 무작위 선택을 100회 반복하여 모든 부분들에 대한 100개 기울기 및 100개 절편의 세트를 생성한다.
측정된 카운트로부터의 염색체 수준의 추출
모델 파라미터 값 I 및 S가 모든 부분에 대해 이용될 수 있다고 가정하면서, 새로운 검사 샘플에 대해 수집된 측정치 M을 사용하여 하기 방정식 B에 따라 염색체 수준을 평가한다.
방정식 B
L = (M - GS)/I
방정식 A와 같이, GC 편향 계수 G는 부분별로 측정된 미가공 카운트 M과 기준 게놈의 GC 함량 사이의 회귀의 기울기로서 평가된다. 그 다음, 염색체 수준 L은 추가 분석(Z-값, 모체 결실/중복, 태아 미세결실/미세중복, 태아 성별, 성 이배수성 등)을 위해 사용된다. 방정식 B에 의해 요약된 절차는 파라미터화된 오차 제거 및 비편향된 정규화(PERUN)로서 명명된다.
실시예 2: 식의 예
본원에 기재된 방법에서 이용될 수 있는 수학적 및/또는 통계학적 식의 비한정적 예가 하기 제공된다.
평균 수준에서의 불확실성에 대한 추정치를 고려하여 1의 기대 수준으로부터의 편차와 관련된 Z-점수, 및 Z-점수로부터 계산된 p-값을 평가할 수 있다. p-값은 t-분포에 기초하고, 이 분포의 차수는 피크에서 기준 게놈의 부분의 수에 의해 결정된다. 원하는 신뢰 수준에 따라 컷오프는 노이즈를 억제할 수 있고 실제 신호의 분명한 검출을 가능하게 할 수 있다.
방정식 1
Figure 112016006621635-pct00014
방정식 1은 2개의 상이한 샘플들로부터의 피크 수준을 직접적으로 비교하는 데에 이용될 수 있고, 이때 N 및 n은 각각 전체 염색체 및 비정상적인 염색체 내의 기준 게놈의 부분의 수를 지칭한다. 2개의 샘플들 사이의 유사성을 측정하는 p-값을 제공할 t-검정의 차수는 2개의 비정상적인 스트레치들 중 보다 더 짧은 스트레치 내의 기준 게놈의 부분의 수에 의해 결정된다.
방정식 8은 태아 이배수성에 대한 유전적 변이의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 태아 분획, 모체 배수성 및 중간 기준 카운트를 분류 체계 내로 도입하는 데에 이용될 수 있다.
방정식 8
Figure 112016006621635-pct00015
상기 식에서,
Yi 는 중간 카운트 프로파일 내의 부분에 상응하는 검사 샘플의 부분에 대한 측정된 카운트를 표시하고, F는 태아 분획을 표시하고, X는 태아 배수성을 표시하고, Mi 는 각각의 부분에 할당된 모체 배수성을 표시한다. 방정식 8에서 X를 위해 사용된 가능한 값은 다음과 같다: 태아가 정배수체인 경우 1; 태아가 삼배수체인 경우 3/2; 및 쌍둥이 태아가 존재하고 1명이 영향을 받고 1명이 영향을 받지 않는 경우 5/4. 방정식 8에서 용어 F가 총 태아 DNA를 표시하므로, 모든 태아 DNA가 고려되어야 하기 때문에, 5/4는 1명의 태아가 영향을 받고 나머지 1명의 태아가 영향을 받지 않는 쌍둥이의 경우 사용된다. 일부 실시양태에서, 모체 게놈 내의 큰 결실 및/또는 중복은 모체 배수성 Mi 를 각각의 부분 또는 부분에 할당함으로써 설명될 수 있다. 일부 실시양태에서, 모체 배수성은 종종 1/2의 배수로서 할당되고, 부분별 정규화를 이용함으로써 평가될 수 있다. 모체 배수성이 종종 1/2의 배수이기 때문에, 모체 배수성은 용이하게 설명될 수 있으므로, 유도를 단순화하기 위한 추가 방정식에 포함되지 않을 것이다.
X = 1(예를 들면, 정배수체 가정)에서 방정식 8을 평가할 때, 태아 분획이 삭제되고, 하기 방정식이 제곱 잔차의 합계를 제공한다.
방정식 9
Figure 112016006621635-pct00016
방정식 9 및 후속 계산을 단순화하기 위해, 하기 방정식들을 이용한다.
방정식 10
Figure 112016006621635-pct00017
방정식 11
Figure 112016006621635-pct00018
방정식 12
Figure 112016006621635-pct00019
X = 3/2(예를 들면, 삼배수체 가정)에서 방정식 8을 평가할 때, 하기 방정식이 제곱 잔차의 합계를 제공한다.
방정식 13
Figure 112016006621635-pct00020
방정식 9와 방정식 13 사이의 차이는 대안적 가설(예를 들면, 삼염색체성 외둥이, X = 3/2)에 대한 널 가설(예를 들면, 정배수체, X = 1)을 검정하는 데에 사용될 수 있는 함수 결과(예를 들면, phi)를 형성한다.
방정식 14
Figure 112016006621635-pct00021
방정식 18
Figure 112016006621635-pct00022
최적 배수성 값은 종종 방정식 20에 의해 제공된다.
방정식 20
Figure 112016006621635-pct00023
모체 배수성 M i 에 대한 용어는 일부 수학적 유도식으로부터 생략될 수 있다. 그 결과 X에 대한 표현은 상대적으로 단순하고 종종 가장 빈번하게 발생하는 특별한 경우인 모체가 평가되는 염색체 또는 염색체들에서 결실 또는 중복을 갖지 않는 때에 상응한다.
방정식 21
Figure 112016006621635-pct00024
Xiff 및 Xify는 각각 방정식 11 및 12에 의해 제공된다. 모든 실험 오차가 무시할만한 실시양태에서, 방정식 21의 풀이는 정배수체에 대한 1의 값을 생성하고, 이때 Xiff = Xify이다. 모든 실험 오차가 무시할만한 일부 실시양태에서, 방정식 21의 풀이는 삼배수체에 대한 3/2의 값을 생성한다(Xiff와 Xify 사이의 삼배수체 관계에 대해서는 방정식 15를 참조한다).
[표 2]
Figure 112016006621635-pct00025
실시예 3: FRS를 사용한 부분 선택
높은 가변성 및 낮은 맵핑 가능성을 가진 부분을 제거하고 큰 백분율의 반복적 요소와 결합하는 PERUN 기초 방법을 이용하여 HG19로 명명된 인간 기준 게놈의 부분을 먼저 미리 필터링하였다. 높은 가변성, 낮은 맵핑 가능성 및 큰 분획의 반복적 요소를 가진 부분(LDTv2를 위해 선택됨)을 배제하였다. 각각의 50 kb 부분(예를 들면, 부분)에 대해, 150개 염기보다 더 짧은 CCF 단편 및 600개 염기보다 더 짧은 CCF 단편으로부터의 페어링된-말단 서열 리드에 대한 태아 비 통계를 계산하였다. 그 다음, 자동화된 비드 청소를 이용한 TruSeq 생화학적 라이브러리 제조를 이용하여 프로세싱된 264개의 비풀링된 샘플들에 걸쳐 FRS의 평균을 산출하였다. 중간(FRS) 초과의 FRS를 가진 부분이 선택되었고 염색체 특이적 시작 및 종결 위치에 대하여 표 4에 제시되어 있다. 표 4의 염색체 특이적 시작 및 종결 위치는 인간 기준 게놈 HG19에서의 기준 뉴클레오티드 염기 위치이다.
중간(FRS) 초과의 FRS를 가진 모든 부분들을 각각의 부분 내의 유일한 엑손 시작 위치의 수와 함께 작도하였다. 작은 단편들의 과다표시를 함유하는 유전자의 영역들에 대한 유의한 상관관계가 나타났다(도 1 내지 9). GC 함량(50 kb 부분 내의 GC 염기의 백분율)과 FRS 사이에 유의하게 더 강한 상관관계가 나타났다(표 3).
부분 선택을 게놈의 부분(즉, 부분)으로 더 한정하였는데, 이때 염색체 삼염색체성 검출의 경우 FRS는 중간(FRS)를 초과한다. 이 방식을 264개의 샘플들의 예비 데이터 세트에 적용하여 50%의 데이터를 버렸음에도 불구하고 일관된 분류 한계를 제공하였다. 대조적으로, FRS가 중간(FRS)를 초과하는 부분의 한정 시, 분류 한계는 현저히 감소되었는데, 이것은 분석을 위한 태아 DNA의 희석을 암시한다(도 10 및 11).
도 10 및 11에는 2개의 회귀 선, 즉 비-T21 샘플만에 대한 회귀 선(쇄점선) 및 T21 샘플에 대한 회귀 선(점선)이 존재한다. 높은 FRS 부분에 기초한 T21 샘플에 대한 회귀 선은 높은 FRS에 기초한 비-T21 샘플에 대한 회귀 선 위에 있었다(도 10). 대조적으로, 이 유사한 회귀는 낮은 FRS 부분에 대한 계산된 Z 점수를 비교할 때 비-T21 샘플보다 더 낮았다(도 11). 이것은 Z 점수가 T21 샘플의 경우 더 큰 경향을 갖기 때문에 높은 FRS 부분의 사용이 결과 확인의 정확도를 개선할 수 있다는 것을 암시한다.
[표 3]
Figure 112016006621635-pct00026
실시예 4: 서열 기반 분리와 길이 기반 분석을 병용한 삼염색체성 21의 검출
하기 방법을 이용하여 임신 여성으로부터 수득된 세포 유리 순환 DNA를 함유하는 혈장 샘플을 삼염색체성 21에 대해 검사한다.
서열 기반 분리
주문제작 디자인된 바이오티닐화된 포획 RNA의 세트를 포함하는 SURESELECT 주문제작 포획 라이브러리를 아질런트(Agilent)로부터 입수한다. 21번 염색체(검사 염색체)에 대한 특이성 및 14번 염색체(기준 염색체)에 대한 특이성을 가진 뉴클레오티드 서열에 따라 포획 RNA를 디자인하고 아질런트의 EARRAY 웹 기초 디자인 수단으로 확인한다. 14번 염색체 및 21번 염색체 각각에 대한 100개의 독립적인 포획 RNA들을 디자인한다. 14번 염색체 또는 21번 염색체에 유일하게 존재하고 AT가 풍부한 40개 내지 60개 염기쌍 범위 내의 단일 카피 뉴클레오티드 서열을 주문제작 포획 RNA 디자인을 위해 선택한다.
임신 첫 번째 3개월 이내의 임신 여성으로부터의 세포 유리 혈장 핵산인 샘플 핵산을 2개의 튜브 내로 분할하고 제조자의 지시에 따라 65℃에서 24시간 동안 21번 염색체 포획 RNA 또는 14번 염색체 포획 RNA와 함께 항온처리한다. 혼성화 후, 스트렙타비딘으로 코팅된 자성 비드(DYNAL DYNAMAG-2, 인비트로겐(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 사용하여 바이오티닐화된 RNA/단편 하이브리드를 끌어내림으로써 포획된 표적 단편 및 포획된 기준 단편(포획된 단편으로서 총칭됨)을 선택하고 MINELUTE PCR 정제 키트(퀴아젠(Qiagen), 미국 메릴랜드주 저먼타운 소재)로 정제한다. 포획 RNA를 분해하고 남은 DNA 단편을 제조자의 지시에 따라 증폭한다.
길이 기반 분석
전술된 바와 같이 분리된 핵산 단편을 함유하는 샘플은 엄격하지 않은 혼성화 조건 하에서 바이오티닐화된 이노신을 포함하는 폴리이노신 프로브와 혼성화되는데, 이때 상기 프로브는 그가 혼성화하는 DNA 단편보다 더 길고 500개 염기쌍의 길이를 가진다. 일부 실시양태에서, 혼성화를 65℃에서 6X SSC 및 1% SDS에서 밤새 수행한다. 일부 실시양태에서, 혼성화를 43℃에서 1.0 M NaCl, 50 mM 인산나트륨 완충제(pH 7.4), 1.0 mM EDTA, 2%(중량/부피) 나트륨 도데실 설페이트, 0.1%(중량/부피) 젤라틴, 50 ㎍/ml tRNA 및 30%(부피/부피) 포름아미드에서 밤새 수행한다. 4회 30분 세척을 55℃에서 1.2X SSC(1X SSC는 0.15 M NaCl + 0.015 M 구연산나트륨임), 10 mM 인산나트륨(pH 7.4), 1.0 mM EDTA 및 0.5%(중량/부피) 나트륨 도데실 설페이트에서 수행한다. 혼성화 후, 엑소뉴클레아제 I(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 미국 매사추세츠주 입스위치 소재) 및 포스포디에스터라제 II(워싱톤 바이오케미칼 코포레이션(Worthington Biochemical Corp.), 미국 뉴저지주 레이크우드 소재)를 사용하여 혼성화되지 않은 프로브 부분을 분해한다. 프로브-단편 이중체를 95℃에서 2분 동안 변성시키고, 스트렙타비딘으로 코팅된 자성 비드(DYNAL DYNAMAG-2, 인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 사용하여 프로브를 단편으로부터 분리하고(즉, 끌어내리고) MINELUTE PCR 정제 키트(퀴아젠, 미국 메릴랜드주 저먼타운 소재)로 정제한다. 트리밍되고 단리되고 정제된 폴리이노신 프로브의 질량을 MALDI 질량 분광측정을 이용하여 측정한다. 공지된 길이의 바이오티닐화된 폴리이노신 표준물에 대한 질량 피크와 비교함으로써 각각의 프로브 길이 종에 대한 질량 피크로부터 프로브 길이 및 이로써 상응하는 단편 길이를 추정한다.
삼염색체성 21의 확인
각각의 프로브 길이 종에 대한 질량 피크의 진폭을 기초로 각각의 단편 길이 종의 상대적 양을 측정한다. 14번 염색체 및 21번 염색체에 대해 150개 염기쌍 이하의 단편을 정량한다. 14번 염색체 및 21번 염색체로부터의 실질적으로 동등한 양의 단편을 가진 샘플은 21번 염색체에 대한 정배수체로서 확인된다. 14번 염색체에 비해 21번 염색체로부터의 통계학적으로 유의하게 더 높은 양의 단편을 가진(예를 들면, 14번 염색체에 비해 21번 염색체로부터의 단편의 2% 상승) 샘플은 21번 염색체에 대한 삼배수체로서 확인된다.
실시예 5: 단편 길이 필터링 및 염색체 표시를 이용한 삼염색체성 검출
본 실시예에서, 특정 길이 파라미터를 가진 단편의 서브세트로부터의 뉴클레오티드 서열 리드 카운트를 기초로 세포 유리 핵산을 함유하는 모체 샘플을 정배수체 태아 또는 이배수성(즉, 삼염색체성 13, 삼염색체성 18, 삼염색체성 21)을 가진 태아를 가진 것으로서 분류하였다. 여성 및 영유아 병원(WI 연구; Palomaki et al. (2011) Genet. Med. 13(11):913-20)으로부터 샘플을 입수하였다. 일루미나 페어링된-말단 서열결정 플랫폼(일루미나 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)을 이용하여 각각의 샘플에 대한 뉴클레오티드 서열 리드(36-염기 리드)를 수득하였다. BOWTIE 2 베타 3 정렬기(aligner) 프로그램을 이용하여 페어링된-말단 뉴클레오티드 서열 리드를 기준 게놈(빌드 37(hg19))과 정렬하고 페어링된-말단 리드의 정렬을 기초로 단편 길이를 측정하였다.
하기 핵산 단편 길이 파라미터에 따라 특정 뉴클레오티드 서열 리드들을 필터링하였다: 1) 120개 염기 이상의 길이를 가진 단편; 2) 130개 염기 이상의 길이를 가진 단편; 3) 140개 염기 이상의 길이를 가진 단편; 4) 150개 염기 이상의 길이를 가진 단편; 5) 160개 염기 이상의 길이를 가진 단편; 또는 6) 170개 염기 이상의 길이를 가진 단편. 따라서, 주어진 길이 역치(예를 들면, 120개 염기, 130개 염기, 140개 염기, 150개 염기, 160개 염기, 170개 염기)와 동등하거나 이러한 역치보다 더 긴 단편에 상응하는 페어링된-말단 리드가 필터링되었고 주어진 길이 역치보다 더 짧은 단편에 상응하는 페어링된-말단 리드가 분석을 위해 보유되었다.
150개 염기 단편의 역치에서 1) 필터링되지 않은 서열 리드 및 2) 길이-필터링된 서열 리드를 사용하여 도 23에 제시된 데이터 세트에 대해 13번 염색체, 18번 염색체 및 21번 염색체에 대한 염색체 표시치를 계산하였다. 13번 염색체, 18번 염색체 및 21번 염색체 각각에 대한 염색체 표시치를 하기 식에 따라 계산하였다:
13번 염색체(Chr 13) 표시치 = Σ Chr 13 서열 리드 카운트(필터링되지 않음)/Σ 모든 상염색체 서열 리드 카운트들(필터링되지 않음)
13번 염색체(Chr 13) 표시치 = Σ Chr 13 서열 리드 카운트(필터링됨)/Σ 모든 상염색체 서열 리드 카운트들(필터링됨)
18번 염색체(Chr 18) 표시치 = Σ Chr 18 서열 리드 카운트(필터링되지 않음)/Σ 모든 상염색체 서열 리드 카운트들(필터링되지 않음)
18번 염색체(Chr 18) 표시치 = Σ Chr 18 서열 리드 카운트(필터링됨)/Σ 모든 상염색체 서열 리드 카운트들(필터링됨)
21번 염색체(Chr 21) 표시치 = Σ Chr 21 서열 리드 카운트(필터링되지 않음)/Σ 모든 상염색체 서열 리드 카운트들(필터링되지 않음)
21번 염색체(Chr 21) 표시치 = Σ Chr 21 서열 리드 카운트(필터링됨)/Σ 모든 상염색체 서열 리드 카운트들(필터링됨)
도 14, 16 및 18은 필터링되지 않은 서열 리드를 사용하여 각각 13번 염색체, 18번 염색체 및 21번 염색체에 대한 염색체 표시치를 보여준다. 도 15, 17 및 19는 길이-필터링된 서열 리드를 사용하여 각각 13번 염색체, 18번 염색체 및 21번 염색체에 대한 염색체 표시치를 보여준다. 필터링된 데이터 세트의 경우, 삼염색체성 샘플에 대한 증가된 염색체 표시치는 태아 기여된 서열 데이터의 증가에 부분적으로 기인한다. 염색체 표시치의 이 증가가 염색체 이상을 검출하는 힘을 증가시킬 수 있지만, 비삼염색체성 샘플에 대한 염색체 표시치의 분산은 리드 카운트의 대략 63% 내지 82% 감소로 인해 증가되었다. 다양한 단편 길이 역치 값에서 리드 카운트의 예시적 분포가 도 13에 예시되어 있고 하기 표 5에 제시되어 있다.
[표 5]
Figure 112016006621635-pct00027
평균적으로 관찰된 리드(즉, 서열 커버리지)의 전체 감소를 보여주기 위해 특정 길이보다 짧은 단편으로부터의 리드에 대한 평균 곡선하면적(AUC) 값을 측정하였다. 예를 들면, 약 1천5백만 개의 서열 리드(또는 0.2X 커버리지의 인간 게놈)를 생성하는 주어진 분석의 경우, 150개 염기보다 큰 리드의 배제는 약 0.035X 커버리지와 동등하다.
염색체 표시치에 대한 최적 단편 크기 역치를 측정하기 위해, 단편 크기 역치를 10개 염기씩 증가시키면서 120개 염기부터 170개 염기까지 변화시켰다. 각각의 길이-필터링된 데이터 세트(페어링된-말단 리드) 및 필터링되지 않은 데이터 세트(단일-말단 리드; "전부"로서도 지칭됨)에 대한 서열 리드 카운트 정규화(즉, LOESS를 이용한 PERUN PADDED) 후 (즉, 13번 염색체, 18번 염색체 및 21번 염색체에 대한) 염색체 표시치를 계산하였다. 13번 염색체, 18번 염색체 및 21번 염색체 표시치는 각각 도 20, 21 및 22에 제시되어 있다. 150개, 160개 및 170개 염기 역치에서 필터링된 데이터 세트에 대한 염색체 표시치는 필터링되지 않은 데이터 세트와 상당히 일치하였다. 하기 표는 각각의 Z-점수 컷오프 값(즉, 13번 염색체의 경우 3.95, 18번 염색체의 경우 3.95, 및 21번 염색체의 경우 3)에서 13번 염색체, 18번 염색체 및 21번 염색체 삼염색체성 검출에 대한 관찰된 특이성 및 민감성을 제공한다. Z-점수 값은 유동 셀 특이적 중간치 및 데이터 세트 특이적 역사적 및 집단 MAD 값에 기초하였다. 추가로, 수신자 조작 특성(ROC) 분석의 10배 교차검증을 수행하였고(즉, 10배 계층화된 교차검증, 반복된 100회), (모든 민감성 배수(1-특이성) 값들을 합산함으로써 계산되고 R 팩키지 ROCR을 사용함으로써 실행된) 각각의 분석에 대한 평균 곡선하면적(AUC; 즉, 정확도의 척도)이 하기 표 6, 7 및 8에 제시되어 있다.
[표 6]
Figure 112016006621635-pct00028
[표 7]
Figure 112016006621635-pct00029
[표 8]
Figure 112016006621635-pct00030
데이터는 길이-필터링된 샘플에 대한 서열 커버리지의 유의한 감소에도 불구하고 필터링되지 않은 샘플에 비해 유사한 정확도, 민감성 및 특이성으로 특정 단편 길이 역치(예를 들면, 150개 염기, 160개 염기)에서 필터링된 샘플을 사용하여 삼염색체성을 확인할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 6:
본 실시예는 부분적으로 태아 분획과 태아 비 통계(FRS) 사이의 관계를 예시한다. 도 25a 및 25b에 나타낸 바와 같이, 샘플당 Z-점수 대 중간 FRS의 도표는 Z-점수 대 태아 분획의 FQA-기초 추정치의 도표와의 현저한 유사성을 보여주었다. 뿐만 아니라, 높은 FRS 부분으로 한정된 삼염색체성 21 샘플당 중간 FRS는 0.188이었고(도 25a, 쇄선 위), 모든 부분들에 대한 삼염색체성 21 샘플당 중간 FRS는 0.172이었다(도 25b, 쇄선 위). 비삼염색체성 Chr21 샘플의 경우, 높은 FRS 부분에 대한 중간 FRS는 0.181이었고(도 25a, 쇄선 아래), 모든 부분들에 대한 중간 FRS는 0.166이었다(도 25b, 쇄선 아래). 이것은 삼염색체성 21 샘플이 실제로 비삼염색체성 21 샘플, 특히 보다 더 높은 태아 기여 성향을 가진 부분보다 약간 더 높은 부분 표시치를 가진다는 것을 암시하였다.
도 26에 나타낸 바와 같이, 상이한 단편 길이의 리드들은 상이한 GC 함량을 포함한다는 것이 확인되었다. 기원 면에서 태아에 보다 더 가까운 것으로 공지되어 있는 보다 작은 단편은 보다 큰 단편에 비해 보다 더 높은 GC 함량을 보였다. 보다 더 높은 FRS를 가진 빈이 빈당 GC 함량과 양의 상관관계를 갖기 때문에 GC 함량의 차이는 FRS가 GC 함량 및 유전자 밀도와 어떻게 상관관계를 갖는지와도 관련되어 있었다. 단편 길이의 이 미묘한 GC 차이는 태아 분획 정보를 제공하도록 활용될 수 있다. 예를 들면, 인간 기준 게놈 전체에 걸친 GC 차이, 단편 길이 및/또는 단편 길이 분산은 단편의 태아 또는 모체 기원을 예측하는 데에 사용될 수 있다. 이 데이터는 리드당 GC 함량이 태아 기여를 평가하는 데에 사용될 수 있다는 것을 입증한다.
PERUN은 커버리지의 리드 깊이에서의 GC 편향을 제거하기 위한 영역 특이적 추가 보정이다. 이 정규화 절차는 2개의 영역 특이적 파라미터인 기울기, 즉 GC 편향의 영향, 및 절편, 즉 GC 편향의 부재 하에서의 염기 수준 커버리지의 트레이닝된 추정을 포함하였다. FRS 분위로 분할된 PERUN 절편의 분포는 FRS의 증가가 PERUN 절편을 증가시킨다는 것을 암시하였다(도 27). 종합하건대, 가장 작은 FRS를 가진 게놈 영역은 아마도 전체 커버리지 표시치에 비해 태아 기여의 감소로 인해 가장 낮은 절편을 갖는 경향을 나타내었다. 또한, 영역 선택을 위한 초기 노력은 최대 교차검증 오차를 도입하였는데, 이때 보다 큰 값은 커버리지의 가변성의 증가를 표시하였다. 도 28은 분위로 분할된 최대 교차검증 오차의 분포를 보여준다. 극단의 분위(높음 및 낮음)는 영역 안정성에서의 가장 큰 가변성을 나타내었다. 극단의 FRS 게놈 영역이 잠재적으로 태아 기여에 대한 보다 더 높은 민감성을 갖기 때문에, 최대 교차검증 오차에서의 증가된 가변성은 사실상 태아 신호의 가변성에 기인할 수 있다.
실시예 7: 빈 기반 태아 분획
본 실시예는 서열결정 커버리지 데이터를 사용하여 모체 혈액 샘플에서 순환 세포 유리 태아 DNA의 양을 정량하는 방법을 입증한다. 기술은 서열결정 커버리지 맵을 사용하여 모체 혈액 샘플에서 태아 DNA의 분획을 정량하는, 본원에서 빈 기반 태아 분획(BFF)으로서 공지되어 있는 방법을 포괄한다. 상기 방법은 기계 학습 방법을 이용하여 서열결정 커버리지를 태아 분획과 연관시키는 모델을 구축한다.
BFF 방법의 제1 단계는 게놈 커버리지 데이터를 수득하는 것이었다. 서열결정 실시 및 정렬로부터 게놈 커버리지 데이터를 수득하였다. 그 다음, 이 커버리지 데이터는 태아 분획에 대한 예측자로서 사용되었다. 이산 게놈 빈, 가변 크기의 빈, 또는 평활화된 커버리지 맵의 포인트 베이스 뷰(point-based views)를 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 적합한 방법으로 커버리지 예측자 변수를 생성할 수 있다.
BFF 방법의 제2 단계는 커버리지 데이터 예측자(예를 들면, 파라미터)로부터 태아 분획을 추정하는 모델을 트레이닝하는 것이었다. 본 실시예에서, 특정 빈의 공지된 비례적 서열결정 수준으로부터 직접적으로 태아 분획을 추정하기 위해 단순 최소 자승을 이용하여 일반 다중 회귀 모델을 트레이닝하였다. 이 방식은 태아 분획에 비례하는 것으로 공지되어 있는 빈(이것으로부터 태아 분획이 유도될 수 있음)을 예측하기 위한 다변량 다중 회귀 모델까지 확장될 수 있다. 유사하게, 빈이 상관관계를 가진 경우, 다변량-반응 모델을 트레이닝하여 상관관계를 가진 반응을 설명할 수 있다. 하기 예는 그의 가장 단순한 형태의 예이다:
다중 회귀 모델은 하기 방정식 30으로서 선택되었다:
방정식 30
Figure 112016006621635-pct00031
상기 식에서, X bin 은 빈 카운트의 m x p 행렬이고, y ff 는 트레이닝 샘플의 수 m 및 예측자 빈의 수 p의 m x 1 벡터이고, ε는 기대치 E(ε) = 0을 가진 노이즈 벡터이고, 이때 공분산 Cov(ε)은 σ 2 I이고, 이때 I는 동일성 행렬이고(즉, 오차는 등분산성을 갖고), 랭크(X bin )는 p 미만이다. 벡터 y ff 는 태아 분획에 비례하는 것으로 공지되어 있는 수준을 가진 빈에 상응하였다.
본 발명자들은 일반성을 잃지 않으면서 X bin 이 그의 평균에 집중되어 있다고 가정하였다. 따라서, β, 즉 회귀 계수의 p x 1 벡터는 다음과 같이
Figure 112016006621635-pct00032
에 대한 표준 방정식을 푸는 것으로부터 추정될 수 있다:
방정식 31
Figure 112016006621635-pct00033
다변량 다중 반응 모델로의 확장은 단순히 종래 모델을 다수의 반응 변수들을 갖도록 확장하거나 크기 m x n의 행렬 Y ff 로서 확장하고, 이때 n은 태아 분획에 비례하는 수준을 가진 상이한 빈들의 수이다. 따라서, 모델은 다음과 같다:
방정식 32
Figure 112016006621635-pct00034
상기 식에서, E는 다중 모델에 대한 병렬 가정을 가진 노이즈 행렬이다. 계수 B의 행렬는 하기 방정식에서
Figure 112016006621635-pct00035
에 대해 풀음으로써 추정될 수 있다:
방정식 33
Figure 112016006621635-pct00036
상기 식에서,
Figure 112016006621635-pct00037
는 p x n 행렬이다.
랭크인 랭크(X bin )가 p 미만인 경우, 문제는 다중공선성(multicollinearilty)을 설명하기 위해 임의의 수의 적합한 회귀 모델로 분해될 수 있다. 이것 이외에, 축소 랭크의
Figure 112016006621635-pct00038
의 추정량은 다변량 반응 내에서의 잠재적인 상관관계를 설명하는 랭크(
Figure 112016006621635-pct00039
) <= min(n,p)이도록 발견될 수도 있다. 그 다음, 수득된 추정량은 적합한 방법에 의해 평균으로서 산출될 수 있거나 함께 가중될 수 있다.
BFF 방법은 이 회귀 방법으로 한정되지 않는다. 다른 다중 회귀 방법, 다변량-반응 회귀, 결정 트리, 서포트-벡터 머신 및 신경망를 포함하나 이들로 한정되지 않는 많은 적합한 기계 학습 방법들이 추정을 개선하는 데에 이용될 수 있다. 모든 관련 빈들이 모델 내로 도입될 수 있도록 가정을 완화할 수 있고 고차원 추정을 제공할 수 있는 방법도 존재한다. 이러한 추정량의 비한정적 예는 제한(constraint) 기초 추정량, 예컨대, 축소 랭크, LASSO, 가중된 랭크 선택 기준(WRSC), 랭크 선택 기준(RSC), 및 예측력을 개선하는 것으로 밝혀진 엘라스틱 넷 추정자이다.
태아 분획 예측은 게놈 커버리지 편향의 측정 및 파이프라인 내로의 도입을 통해서도 개선되었다. 이 편향은 GC 함량, DNaseI 과다민감성, 맵핑 가능성 및 염색질 구조를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다수의 공급원들로부터 나올 수 있다. 이러한 프로파일은 샘플당 기준으로 정량될 수 있고 게놈 커버리지 데이터를 조절하는 데에 사용될 수 있거나, 태아 분획 모델에 대한 예측자 또는 제한으로서 추가될 수 있다.
예를 들면, 모든 빈들 전체에 걸친 Y 염색체 커버리지의 상대적 수준을 태아 분획의 실제 값(ChrFF)으로서 사용하여 6000개의 남성 정배수체 샘플들에 대한 다중 회귀 방법을 트레이닝하였다. 흔한 삼염색체성의 검출로 순환성을 방지하기 위해, 상염색체 커버리지 빈에 대해서만 모델을 트레이닝하였고, 이 모델은 13번 염색체, 18번 염색체 또는 21번 염색체를 포함하지 않았다. 상기 모델은 19,312개의 독립적인 샘플들로 구성된 시험 데이터에 대한 강한 성능을 나타내었다(도 29).
BFF의 강한 성능은 태아 DNA를 끌어들이는 경향을 나타내는 빈 및 영역에 의해 유도된다. 이 영역은 보다 더 높은 커버리지 분산을 갖는 경향을 나타내고, 상기 모델은 이 변화를 이용한다. 부트스트랩 방법을 이용하여 (FRS를 기초로) 높은 또는 낮은 태아 분획 표시치를 가진 빈에 대해 배타적으로 트레이닝된 모델들을 비교하였다. 보다 더 높은 태아 함량을 가진 빈은 태아 분획의 보다 더 우수한 예측자인 것으로 발견되었다(도 30). 이것은 보다 더 높은 태아 표시치를 가진 빈에 대해 구축된 모델이 보다 큰 회귀 계수를 갖는 경향을 나타낸다는 발견에 상응하였다(도 31).
실시예 트레이닝 세트가 남성 샘플들만을 포함하였지만, 여성 샘플 및 남성 삼염색체성 샘플 둘 다에 대해 예측하였고, 이 샘플들에 대한 태아 분획이 삼염색체성 염색체 표시치를 사용함으로써 독립적으로 추정될 수 있다. 남성 샘플 및 여성 샘플의 태아 분획 추정은 전체 분산에서의 차이를 보이지 않았다(도 32). 이것은 BFF가 다른 성(gender)에 비해 한 성에 대한 태아 분획을 추정하는 데에 있어서 시스템적으로 편향되어 있지 않다는 것을 입증한다.
실시예 8: 실시양태의 예
하기 기재된 본 실시예는 특정 실시양태들을 예시하고 기술을 한정하지 않는다.
A1. 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플에서 태아 핵산 분획을 추정하는 방법으로서,
(a) 기준 게놈의 부분들에 맵핑된 서열 리드의 카운트를 수득하는 단계로서, 이때 상기 서열 리드는 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플로부터의 세포 유리 순환 핵산의 리드인 단계;
(b) 마이크로프로세서를 이용하여, (i) 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트, 또는 (ii) 다른 부분 특이적 파라미터를, 각각의 부분과 독립적으로 관련된 가중치에 따라 태아 핵산의 부분 특이적 분획에 가중하여, 가중치에 따른 부분 특이적 태아 분획 추정치를 제공하는 단계로서, 이때 각각의 가중치는 (i) 다수의 샘플들 각각에 대한 태아 핵산 분획과 (ii) 다수의 샘플들에 대한, 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트 또는 다른 부분 특이적 파라미터 사이의, 각각의 부분에 대한 피팅된 관계로부터 결정되는 것인 단계; 및
(c) 부분 특이적 태아 분획 추정치를 기초로 검사 샘플에 대한 태아 핵산 분획을 추정하는 단계
를 포함하는 방법.
A2. 실시양태 A1에 있어서, 가중치가 모든 상염색체들, X 염색체 및 Y 염색체 내의 복수의 부분들 내의 부분과 관련되어 있는 것인 방법.
A2.1. 실시양태 A1에 있어서, 가중치가 Y 염색체 내의 부분을 포함하지 않는 복수의 부분들 내의 부분과 관련되어 있는 것인 방법.
A3. 실시양태 A2.1에 있어서, 가중치가 X 염색체 및 Y 염색체 내의 부분을 포함하지 않는 복수의 부분들 내의 부분과 관련되어 있는 것인 방법.
A4. 실시양태 A2에 있어서, 가중치가 상염색체 또는 이의 서브세트 내의 부분을 포함하는 복수의 부분들 내의 부분과 관련되어 있는 것인 방법.
A5. 실시양태 A3 또는 A4에 있어서, 가중치가 13번 염색체, 18번 염색체 및 21번 염색체 내의 부분을 포함하지 않는 복수의 부분들 내의 부분과 관련되어 있는 것인 방법.
A6. 실시양태 A1 내지 A5 중 어느 한 실시양태에 있어서, (b) (i) 또는 (b) (ii)에서의 카운트가 정규화된 카운트인 방법.
A7. 실시양태 A6에 있어서, 정규화된 카운트가 미가공 카운트에 비해 감소된 구아닌-사이토신(GC) 편향을 가진 것인 방법.
A8. 실시양태 A6 또는 A7에 있어서, 정규화된 카운트가 빈별(bin-wise) 정규화, GC 함량에 의한 정규화, 선형 최소 자승 회귀, 비선형 최소 자승 회귀, LOESS, GC LOESS, LOWESS, PERUN, 반복부 마스킹(RM), GC-정규화 및 반복부 마스킹(GCRM), 조건부 분위 정규화(cQn), 또는 이들의 조합의 결과물인 방법.
A9. 실시양태 A1 내지 A8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 검사 샘플에 대한 태아 핵산 분획의 추정이 부분 특이적 태아 분획 추정치의 평균 산출 또는 합산을 포함하는 것인 방법.
A10. 실시양태 A1 내지 A9 중 어느 한 실시양태에 있어서, 부분 특이적 파라미터가 1개의 부분 특이적 파라미터이거나 2개 이상의 부분 특이적 파라미터들 중 하나인 방법.
A11. 실시양태 A1 내지 A10 중 어느 한 실시양태에 있어서, 부분 특이적 파라미터가 게놈 커버리지, 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 리드의 양, 맵핑 가능성, DNaseI 민감성, 메틸화 상태, 아세틸화, 히스톤 분포 및 염색질 구조로부터 선택되는 것인 방법.
A12. 실시양태 A1 내지 A10 중 어느 한 실시양태에 있어서, 부분 특이적 파라미터가 구아닌-사이토신(GC) 함량인 방법.
A13. 실시양태 A1 내지 A10 중 어느 한 실시양태에 있어서, 부분 특이적 파라미터가 구아닌-사이토신(GC) 함량이 아닌 것인 방법.
A14. 실시양태 A11에 있어서, 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 리드의 양을 X 대 Y의 비에 따라 결정하고, 이때 X는 제1의 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 세포 유리 순환(CCF) 단편으로부터 유도된 리드의 양이고, Y는 제2의 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 CCF 단편으로부터 유도된 리드의 양인 방법.
A15. 실시양태 A14에 있어서, 제1의 선택된 단편 길이가 약 140개 내지 약 160개 염기이고, 제2의 선택된 단편 길이가 약 500개 내지 약 700개 염기인 방법.
A16. 실시양태 A15에 있어서, 제1의 선택된 단편 길이가 약 150개 염기이고, 제2의 선택된 단편 길이가 약 600개 염기인 방법.
A17. 실시양태 A14 내지 A16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 각각의 부분에 대한 가중치가 다수의 샘플들에 대한 부분에 대한 평균 비와 관련되어 있는 것인 방법.
A18. 실시양태 A1 내지 A16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 각각의 부분에 대한 가중치가 다수의 샘플들에 대한 부분에 맵핑된 CCF 태아 핵산 단편으로부터의 리드의 평균 양에 비례하는 것인 방법.
A19. 실시양태 A1 내지 A18 중 어느 한 실시양태에 있어서, 부분이 이산 게놈 빈, 소정의 길이의 연속 서열을 가진 게놈 빈, 가변 크기의 빈, 평활화된 커버리지 맵의 포인트 베이스 뷰 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것인 방법.
A20. 실시양태 A1 내지 A19 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다수의 샘플들이 정배수체 태아를 가진 대상체로부터의 샘플들인 방법.
A21. 실시양태 A1 내지 A19 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다수의 샘플들이 삼염색체성 태아를 가진 대상체로부터의 샘플들인 방법.
A22. 실시양태 A1 내지 A19 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다수의 샘플들이 정배수체 태아를 가진 대상체 및 삼염색체성 태아를 가진 대상체로부터의 샘플들인 방법.
A23. 실시양태 A1 내지 A22 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다수의 샘플들이 남아 태아를 가진 대상체로부터의 샘플들인 방법.
A24. 실시양태 A23에 있어서, 태아 핵산 분획을 Y 염색체의 분석에 따라 결정하는 것인 방법.
A25. 실시양태 A1 내지 A24 중 어느 한 실시양태에 있어서, 약 1,500개의 부분들 내지 약 200,000개의 부분들에서의 카운트를 조정하는 것인 방법.
A25.1. 실시양태 A25에 있어서, 각각의 부분이 기준 게놈으로부터의 약 10 연속 킬로염기 내지 약 75 연속 킬로염기인 방법.
A26. 실시양태 A1 내지 A25.1 중 어느 한 실시양태에 있어서, 가중치의 약 75% 이상이 0보다 큰 것인 방법.
A26.1. 실시양태 A26에 있어서, 가중치의 약 85% 이상이 0보다 큰 것인 방법.
A26.2. 실시양태 A26.1에 있어서, 가중치의 약 95% 이상이 0보다 큰 것인 방법.
A27. 실시양태 A1 내지 A26.2 중 어느 한 실시양태에 있어서, 가중치의 분포 폭이 CCF 태아 핵산 단편으로부터의 리드의 양에 의존하는 것인 방법.
A28. 실시양태 A1 내지 A27 중 어느 한 실시양태에 있어서, 가중치의 분포가 실질적으로 대칭 분포인 방법.
A28.1. 실시양태 A1 내지 A27 중 어느 한 실시양태에 있어서, 가중치의 분포가 실질적으로 정규 분포인 방법.
A29. 실시양태 A1 내지 A28.1 중 어느 한 실시양태에 있어서, 가중치가 피팅된 관계로부터의 추정된 계수인 방법.
A30. 실시양태 A1 내지 A29 중 어느 한 실시양태에 있어서, (i) 다수의 샘플들 각각에 대한 태아 핵산 분획과 (ii) 다수의 샘플들에 대한, 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트 또는 다른 부분 특이적 파라미터 사이의, 각각의 부분에 대한 관계로부터 계수를 추정하는 단계를 포함하는 방법.
A31. 실시양태 A29 또는 A30에 있어서, 각각의 피팅된 관계가 회귀 모델이고 가중치가 피팅된 관계로부터의 회귀 계수이거나 이 회귀 계수에 기초하는 것인 방법.
A32. 실시양태 A31에 있어서, 회귀 모델이 선형 회귀 모델, 단순 회귀 모델, 표준 최소 자승 회귀 모델, 다중 회귀 모델, 일반 다중 회귀 모델, 다항 회귀 모델, 일반 선형 모델, 일반화 선형 모델, 이산 선택 회귀 모델, 로지스틱 회귀 모델, 다항 로짓(logit) 모델, 혼합 로짓 모델, 프로빗(probit) 모델, 다항 프로빗 모델, 순서형 로짓 모델, 순서형 프로빗 모델, 푸아송(Poisson) 모델, 다변량 반응 회귀 모델, 다층 모델, 고정 효과 모델, 변량 효과 모델, 혼합 모델, 비선형 회귀 모델, 비모수 모델, 준모수 모델, 로버스트(robust) 모델, 분위 모델, 등위 모델, 주성분 모델, 최소 각 모델, 로컬 모델, 세그먼트 모델 및 변수 오차(errors-in-variables) 모델로부터 선택되는 것인 방법.
A33. 실시양태 A29 또는 A30에 있어서, 각각의 피팅된 관계가 회귀 모델이 아닌 것인 방법.
A34. 실시양태 A33에 있어서, 각각의 피팅된 관계가 결정 트리 모델, 서포트-벡터 머신 모델 및 신경망 모델로부터 선택되는 것인 방법.
A35. 실시양태 A1 내지 A34 중 어느 한 실시양태에 있어서, 피팅된 관계를 최소 자승 회귀, 표준 최소 자승 회귀, 선형 회귀, 부분 회귀, 전회귀, 일반화 회귀, 가중 회귀, 비선형 회귀, 반복 재가중된 회귀, 능형 회귀, 최소 절대 편차, 베이지안, 베이지안 다변량, 축소 랭크 회귀, LASSO, 엘라스틱 넷 추정량 및 이들의 조합으로부터 선택된 추정으로 피팅하는 것인 방법.
A36. 실시양태 A1 내지 A35 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단계 (a) 전에, 검사 대상체로부터의 세포 유리 순환 핵산을 서열결정하여 서열 리드를 확인하는 단계를 포함하는 방법.
A37. 실시양태 A36에 있어서, 단계 (a) 전에, 서열 리드를 기준 게놈의 부분들에 맵핑하는 단계를 포함하는 방법.
A38. 실시양태 A36 또는 A37에 있어서, 단계 (a) 전에, 검사 대상체로부터 세포 유리 순환 핵산을 단리하는 단계를 포함하는 방법.
A39. 실시양태 A38에 있어서, 단계 (a) 전에, 검사 대상체로부터 검사 샘플을 단리하는 단계를 포함하는 방법.
A40. 실시양태 A1 내지 A39 중 어느 한 실시양태에 있어서, 태아 핵산의 추정된 분획을 기초로 검사 샘플에 대한 태아 염색체 이배수성의 존재 또는 부재를 확인하는 단계를 포함하는 방법.
A41. 실시양태 A40에 있어서, 태아 염색체 이배수성이 삼염색체성인 방법.
A42. 실시양태 A41에 있어서, 삼염색체성이 21번 염색체의 삼염색체성, 18번 염색체의 삼염색체성, 13번 염색체의 삼염색체성 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것인 방법.
A43. 실시양태 A41 또는 A42에 있어서, 삼염색체성의 존재 또는 부재를 95% 이상의 민감성 또는 95% 이상의 특이성, 또는 95% 이상의 민감성 및 95% 이상의 특이성으로 확인하는 것인 방법.
A44. 하나 이상의 마이크로프로세서 및 메모리를 포함하는 시스템으로서, 상기 메모리는 상기 하나 이상의 마이크로프로세서에 의해 실행될 수 있는 명령어를 포함하고 기준 게놈의 부분들에 맵핑된 뉴클레오티드 서열 리드를 포함하며, 상기 서열 리드는 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플로부터의 세포 유리 순환 핵산의 리드이고, 상기 하나 이상의 마이크로프로세서에 의해 실행될 수 있는 상기 명령어는
(a) 마이크로프로세서를 이용하여, (i) 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트, 또는 (ii) 다른 부분 특이적 파라미터를, 각각의 부분과 독립적으로 관련된 가중치에 따라 태아 핵산의 부분 특이적 분획에 가중하여, 가중치에 따른 부분 특이적 태아 분획 추정치를 제공하고, 이때 각각의 가중치는 (i) 다수의 샘플들 각각에 대한 태아 핵산 분획과 (ii) 다수의 샘플들에 대한, 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트 또는 다른 부분 특이적 파라미터 사이의, 각각의 부분에 대한 피팅된 관계로부터 결정되고;
(b) 부분 특이적 태아 분획 추정치를 기초로 검사 샘플에 대한 태아 핵산 분획을 추정하도록
구성되는 것인 시스템.
A45. 하나 이상의 마이크로프로세서 및 메모리를 포함하는 기계로서, 상기 메모리는 상기 하나 이상의 마이크로프로세서에 의해 실행될 수 있는 명령어를 포함하고 기준 게놈의 부분들에 맵핑된 뉴클레오티드 서열 리드를 포함하며, 상기 서열 리드는 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플로부터의 세포 유리 순환 핵산의 리드이고, 상기 하나 이상의 마이크로프로세서에 의해 실행될 수 있는 상기 명령어는
(a) 마이크로프로세서를 이용하여, (i) 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트, 또는 (ii) 다른 부분 특이적 파라미터를, 각각의 부분과 독립적으로 관련된 가중치에 따라 태아 핵산의 부분 특이적 분획에 가중하여, 가중치에 따른 부분 특이적 태아 분획 추정치를 제공하고, 이때 각각의 가중치는 (i) 다수의 샘플들 각각에 대한 태아 핵산 분획과 (ii) 다수의 샘플들에 대한, 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트 또는 다른 부분 특이적 파라미터 사이의, 각각의 부분에 대한 피팅된 관계로부터 결정되고;
(b) 부분 특이적 태아 분획 추정치를 기초로 검사 샘플에 대한 태아 핵산 분획을 추정하도록
구성되는 것인 기계.
A46. 마이크로프로세서가 하기 단계들을 수행하도록 명령하는 실행 가능한 프로그램이 저장되어 있는 비일시적 컴퓨터 판독 가능 기억 매체:
(a) 기준 게놈의 부분들에 맵핑된 뉴클레오티드 서열 리드에 액세스하는 단계로서, 이때 상기 서열 리드는 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플로부터의 세포 유리 순환 핵산의 리드인 단계;
(b) 마이크로프로세서를 이용하여, (i) 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트, 또는 (ii) 다른 부분 특이적 파라미터를, 각각의 부분과 독립적으로 관련된 가중치에 따라 태아 핵산의 부분 특이적 분획에 가중하여, 가중치에 따른 부분 특이적 태아 분획 추정치를 제공하는 단계로서, 이때 각각의 가중치는 (i) 다수의 샘플들 각각에 대한 태아 핵산 분획과 (ii) 다수의 샘플들에 대한, 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트 또는 다른 부분 특이적 파라미터 사이의, 각각의 부분에 대한 피팅된 관계로부터 결정되는 것인 단계; 및
(c) 부분 특이적 태아 분획 추정치를 기초로 검사 샘플에 대한 태아 핵산 분획을 추정하는 단계.
B1. 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플에서 태아 핵산 분획을 추정하는 방법으로서,
(a) 기준 게놈의 부분들에 맵핑된 서열 리드의 카운트를 수득하는 단계로서, 이때 상기 서열 리드는 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플로부터의 세포 유리 순환 핵산의 리드인 단계;
(b) (i) 마이크로프로세서를 이용하여, 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트를 각각의 부분에 독립적으로 할당된 가중치에 따라 조정하여, 부분에 대한 조정된 카운트를 제공하거나, (b) (ii) 마이크로프로세서를 이용하여, 부분들의 서브세트를 선택하여, 카운트의 서브세트를 제공하는 단계로서, 이때 (b) (i)에서의 조정 또는 (b) (ii)에서의 선택은, 태아 핵산으로부터의 증가된 양의 리드가 맵핑되는 부분에 따른 것인 단계; 및
(c) 조정된 카운트 또는 카운트의 서브세트에 기초하여 검사 샘플에 대한 태아 핵산 분획을 추정하는 단계
를 포함하는 방법.
B2. 실시양태 B1에 있어서, 태아 핵산으로부터의 증가된 양의 리드가 맵핑되는 부분을 X 대 Y의 비에 따라 결정하고, 이때 X는 제1의 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 세포 유리 순환(CCF) 단편으로부터 유도된 리드의 양이고, Y는 제2의 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 CCF 단편으로부터 유도된 리드의 양인 방법.
B3. 실시양태 B2에 있어서, 비가 다수의 샘플들에 대한 평균 비인 방법.
B4. 실시양태 B3에 있어서, 부분들에 대하여 평균한 평균 비보다 큰 평균 비를 가진 부분에 따라 가중치를 결정하거나 부분들을 선택하는 것인 방법.
B5. 실시양태 B2 내지 B4 중 어느 한 실시양태에 있어서, 제1의 선택된 단편 길이가 약 140개 내지 약 160개 염기이고, 제2의 선택된 단편 길이가 약 500개 내지 약 700개 염기인 방법.
B6. 실시양태 B5에 있어서, 제1의 선택된 단편 길이가 약 150개 염기이고, 제2의 선택된 단편 길이가 약 600개 염기인 방법.
B7. 하나 이상의 마이크로프로세서 및 메모리를 포함하는 시스템으로서, 상기 메모리는 상기 하나 이상의 마이크로프로세서에 의해 실행될 수 있는 명령어를 포함하고 기준 게놈의 부분들에 맵핑된 뉴클레오티드 서열 리드를 포함하며, 상기 서열 리드는 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플로부터의 세포 유리 순환 핵산의 리드이고, 상기 하나 이상의 마이크로프로세서에 의해 실행될 수 있는 상기 명령어는
(a) (i) 마이크로프로세서를 이용하여, 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트를 각각의 부분에 독립적으로 할당된 가중치에 따라 조정하여, 부분에 대한 조정된 카운트를 제공하거나, (a) (ii) 마이크로프로세서를 이용하여, 부분들의 서브세트를 선택하여, 카운트의 서브세트를 제공하고, 이때 (a) (i)에서의 조정 또는 (a) (ii)에서의 선택은, 태아 핵산으로부터의 증가된 양의 리드가 맵핑되는 부분에 따른 것이고;
(b) 조정된 카운트 또는 카운트의 서브세트에 기초하여 검사 샘플에 대한 태아 핵산 분획을 추정하도록
구성되는 것인 시스템.
B8. 하나 이상의 마이크로프로세서 및 메모리를 포함하는 기계로서, 상기 메모리는 상기 하나 이상의 마이크로프로세서에 의해 실행될 수 있는 명령어를 포함하고 기준 게놈의 부분들에 맵핑된 뉴클레오티드 서열 리드를 포함하며, 상기 서열 리드는 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플로부터의 세포 유리 순환 핵산의 리드이고, 상기 하나 이상의 마이크로프로세서에 의해 실행될 수 있는 상기 명령어는
(a) (i) 마이크로프로세서를 이용하여, 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트를 각각의 부분에 독립적으로 할당된 가중치에 따라 조정하여, 부분에 대한 조정된 카운트를 제공하거나, (a) (ii) 마이크로프로세서를 이용하여, 부분들의 서브세트를 선택하여, 카운트의 서브세트를 제공하고, 이때 (a) (i)에서의 조정 또는 (a) (ii)에서의 선택은, 태아 핵산으로부터의 증가된 양의 리드가 맵핑되는 부분에 따른 것이고;
(b) 조정된 카운트 또는 카운트의 서브세트에 기초하여 검사 샘플에 대한 태아 핵산 분획을 추정하도록
구성되는 것인 기계.
B9. 마이크로프로세서가 하기 단계들을 수행하도록 명령하는 실행 가능한 프로그램이 저장되어 있는 비일시적 컴퓨터 판독 가능 기억 매체:
(a) 기준 게놈의 부분들에 맵핑된 뉴클레오티드 서열 리드에 액세스하는 단계로서, 이때 상기 서열 리드는 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플로부터의 세포 유리 순환 핵산의 리드인 단계;
(b) (i) 마이크로프로세서를 이용하여, 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트를 각각의 부분에 독립적으로 할당된 가중치에 따라 조정하여, 부분에 대한 조정된 카운트를 제공하거나, (b) (ii) 마이크로프로세서를 이용하여, 부분들의 서브세트를 선택하여, 카운트의 서브세트를 제공하는 단계로서, 이때 (b) (i)에서의 조정 또는 (b) (ii)에서의 선택은, 태아 핵산으로부터의 증가된 양의 리드가 맵핑되는 부분에 따른 것인 단계; 및
(c) 조정된 카운트 또는 카운트의 서브세트에 기초하여 검사 샘플에 대한 태아 핵산 분획을 추정하는 단계.
C1. 기준 게놈의 부분들에 맵핑된 서열 리드의 카운트를 수득하는 단계를 포함하는, 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플에서 태아 핵산 분획의 추정 정확도를 증가시키는 방법으로서, 이때 상기 서열 리드는 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플로부터의 세포 유리 순환 핵산의 리드이고, 수득된 카운트의 적어도 서브세트는, 게놈의 다른 영역의 총 카운트 대비 태아 핵산의 카운트보다 큰 수의, 총 카운트 대비 태아 핵산 유래의 카운트를 제공하는 게놈의 영역으로부터 유래하는 것인 방법.
C2. 실시양태 C1에 있어서, 마이크로프로세서를 이용하여, 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트를 각각의 부분에 독립적으로 할당된 가중치에 따라 조정하여, 부분에 대한 조정된 카운트를 제공하거나, 마이크로프로세서를 이용하여, 부분들의 서브세트를 선택하여, 카운트의 서브세트를 제공하는 단계; 및 조정된 카운트 또는 카운트의 서브세트에 기초하여 검사 샘플에 대한 태아 핵산 분획을 추정하는 단계를 포함하는 방법.
C3. 실시양태 C1 또는 C2에 있어서, 더 큰 수의, 태아 핵산으로부터 유래한 카운트를 제공하는 게놈의 영역을 X 대 Y의 비에 따라 결정하고, 이때 X는 제1의 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 세포 유리 순환(CCF) 단편으로부터 유도된 리드의 양이고, Y는 제2의 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 CCF 단편으로부터 유도된 리드의 양인 방법.
C4. 실시양태 C3에 있어서, 비가 다수의 샘플들에 대한 평균 비인 방법.
C5. 실시양태 C4에 있어서, 부분들에 대하여 평균한 평균 비보다 큰 평균 비를 가진 부분에 따라 가중치를 결정하거나 부분들을 선택하는 것인 방법.
C6. 실시양태 C3 내지 C5 중 어느 한 실시양태에 있어서, 제1의 선택된 단편 길이가 약 140개 내지 약 160개 염기이고, 제2의 선택된 단편 길이가 약 500개 내지 약 700개 염기인 방법.
C7. 실시양태 C6에 있어서, 제1의 선택된 단편 길이가 약 150개 염기이고, 제2의 선택된 단편 길이가 약 600개 염기인 방법.
본원에서 참조된 각각의 특허, 특허출원, 공개문헌 및 문헌 전체가 참고로 도입된다. 상기 특허, 특허출원, 공개문헌 및 문헌의 인용은 이들 중 임의의 참고문헌이 적절한 선행기술임을 인정하는 것이 아니고 이 공개문헌들 또는 문헌들의 내용 또는 날짜에 대한 임의의 인정을 구성하는 것도 아니다.
본 기술의 기본 양태로부터 벗어나지 않으면서 전술된 기술을 변경시킬 수 있다. 기술이 하나 이상의 특정 실시양태와 관련하여 실질적으로 상세히 기재되어 있지만, 당업자는 본원에 구체적으로 개시된 실시양태를 변경시킬 수 있고 이 변경 및 개선이 본 기술의 범위 및 사상 내에 있다는 것을 인식할 것이다.
본원에 예시적으로 기재된 기술은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소(들)의 부재 하에서 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 각각의 경우 본원에서 용어 "포함하는", "본질적으로 구성된" 및 "구성된" 중 임의의 용어는 다른 2개의 용어들 중 어느 하나로 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 기술하기 위한 용어로서 사용되고 한정하는 용어로서 사용되지 않고, 이러한 용어 및 표현의 사용은 제시되어 있고 기재되어 있는 특징 또는 이의 분절의 임의의 등가물을 배제하지 않고, 다양한 변경이 특허청구된 기술의 범위 내에서 가능하다. 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소가 기재된다는 것이 문맥상 명확하지 않은 한, 단수형 용어는 그가 수식하는 하나의 또는 복수의 요소를 지칭할 수 있다(예를 들면, "시약"은 하나 이상의 시약을 의미할 수 있다). 본원에서 사용된 용어 "약"은 기저 파라미터의 10% 이내(즉, + 또는 - 10%)의 값을 지칭하고, 일련의 값들의 시작부에서 용어 "약"의 사용은 각각의 값을 수식한다(즉, "약 1, 2 및 3"은 약 1, 약 2 및 약 3을 지칭한다). 예를 들면, "약 100 그램"의 중량은 90 그램 내지 110 그램의 중량을 포함할 수 있다. 또한, 값의 목록(예를 들면, 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85% 또는 86%)이 본원에 기재되어 있을 때, 상기 목록은 이의 모든 중간 값 및 분수 값(예를 들면, 54%, 85.4%)을 포함한다. 따라서, 본 기술이 대표적인 실시양태 및 임의적인 특징에 의해 구체적으로 개시되어 있지만, 당업자는 본원의 사상을 변형시킬 수 있거나 변경시킬 수 있고, 이러한 변형 및 변경이 본 기술의 범위 내에 있는 것으로서 간주된다는 것을 이해해야 한다.
본 기술의 일부 실시양태들은 하기 청구범위에 기재되어 있다.

Claims (67)

  1. 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플에서 태아 핵산 분획(fraction)을 추정하는 방법으로서,
    (a) 기준 게놈의 부분들에 맵핑된(mapped) 서열 리드(sequence reads)의 카운트(counts)를 수득하는 단계로서, 이 때 상기 서열 리드는 임신 여성으로부터 얻은 검사 샘플로부터의 세포 유리 순환 핵산의 리드인 단계;
    (b) 마이크로프로세서를 이용하여, (i) 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트, 또는 (ii) 다른 부분 특이적 파라미터를, 각각의 부분과 독립적으로 관련된 가중치(weighting factor)에 따라 태아 핵산의 부분 특이적 분획에 가중하여, 가중치에 따른 부분 특이적 태아 분획 추정치를 제공하는 단계로서, 이 때 각각의 가중치는 (1) 트레이닝 세트의 다수의 샘플들 각각에 대한 태아 핵산 분획과 (2) 트레이닝 세트의 다수의 샘플들에 대한, 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트 또는 다른 부분 특이적 파라미터 사이의, 각각의 부분에 대한 피팅된 관계로부터 결정되는 것인 단계; 및
    (c) 부분 특이적 태아 분획 추정치를 기초로 검사 샘플에 대한 태아 핵산 분획을 추정하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 가중치가 상염색체 또는 이의 서브세트 내의 부분을 포함하는 복수의 부분들 내의 부분과 관련되어 있는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 가중치가 13번 염색체, 18번 염색체 및 21번 염색체 내의 부분을 포함하지 않는 복수의 부분들 내의 부분과 관련되어 있는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, (b) (i) 및/또는 (b) (2)에서의 카운트가 정규화된 카운트이고, 정규화된 카운트가 미가공(raw) 카운트에 비해 감소된 구아닌-사이토신(GC) 편향(bias)을 갖는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 검사 샘플에 대한 태아 핵산 분획의 추정이 부분 특이적 태아 분획 추정치의 평균 산출 또는 합산을 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 부분 특이적 파라미터가 구아닌-사이토신(GC) 함량, 게놈 커버리지(genomic coverage), 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 리드의 양, 맵핑 가능성(mappability), DNaseI 민감성, 메틸화 상태, 아세틸화, 히스톤 분포 및 염색질 구조로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 리드의 양은 X 대 Y의 비에 따라 결정되고, 이 때 X는 제1의 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 세포 유리 순환(circulating cell-free; CCF) 단편으로부터 유도된 리드의 양이고, Y는 제2의 선택된 단편 길이보다 짧은 길이를 가진 CCF 단편으로부터 유도된 리드의 양인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 제1의 선택된 단편 길이가 약 140개 내지 약 160개 염기이고, 제2의 선택된 단편 길이가 약 500개 내지 약 700개 염기인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 제1의 선택된 단편 길이가 약 150개 염기이고, 제2의 선택된 단편 길이가 약 600개 염기인 방법.
  10. 제7항에 있어서, 각각의 부분에 대한 가중치가, 트레이닝 세트의 다수의 샘플들에 대한 부분에 대한 평균 비와 관련되어 있는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 부분에 대한 가중치가, 트레이닝 세트의 다수의 샘플들에 대한 부분에 맵핑된 CCF 태아 핵산 단편으로부터의 리드의 평균 양에 비례하는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 부분이 이산 게놈 빈(discrete genomic bins), 소정의 길이의 연속 서열을 가진 게놈 빈, 가변 크기의 빈, 평활화된(smoothed) 커버리지 맵의 포인트 베이스 뷰(point-based views) 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 가중치가 피팅된 관계로부터의 추정된 계수인 방법.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 트레이닝 세트의 다수의 샘플들 각각에 대한 태아 핵산 분획과 (ii) 트레이닝 세트의 다수의 샘플들에 대한, 각각의 부분에 맵핑된 서열 리드의 카운트 또는 다른 부분 특이적 파라미터 사이의, 각각의 부분에 대한 관계로부터 계수를 추정하는 단계를 포함하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 각각의 피팅된 관계가 회귀 모델이고, 가중치가 피팅된 관계로부터의 회귀 계수이거나 이 회귀 계수에 기초하는 것인 방법.
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