JP2016533173A - 遺伝子の変動の非侵襲的評価のための方法および処理 - Google Patents

遺伝子の変動の非侵襲的評価のための方法および処理 Download PDF

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Abstract

本明細書では、遺伝子の変動の非侵襲的評価のための、方法、処理、システム、マシン、および装置が提供される。ある特定の態様では、妊娠中の雌に由来する試験試料中の胎児核酸のフラクションを推定するための方法が提供される。本明細書ではまた、妊娠中の雌に由来する試験試料中の胎児核酸のフラクションを推定するための方法が提供される。本明細書ではまた、妊娠中の雌に由来する試験試料中の胎児核酸のフラクションの推定の精度を増加させるための方法が提供される。

Description

本出願は、２０１３年６月２１日に出願され、遺伝子の変動の非侵襲的評価のための方法および処理というタイトルであり、発明者としてＳｕｎｇ Ｋ． Ｋｉｍらが挙げられ、代理人整理番号ＳＥＱ−６０７１−ＰＶが指定されている、米国特許出願第６１／８３８，０４８号の利益を請求する。本文、表および図面を含む前述の出願のすべての内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書において提供する技術は一部分、遺伝子の変動を非侵襲性に評価するための方法、処理（ｐｒｏｃｅｓｓ）、マシンおよび装置に関する。
生きている生物（例えば、動物、植物および微生物）ならびに遺伝情報を複製するその他の形態（例えば、ウイルス）の遺伝情報は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）中にコードされる。遺伝情報は連続的なヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドであり、これらは化学的なまたは仮定上の核酸の一次構造を示す。ヒトの場合、完全なゲノムは、２４本の染色体上に位置する約３０，０００個の遺伝子を含有する（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ、Ｔ．Ｓｔｒａｃｈａｎ、ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９２年を参照されたい）。各遺伝子が特定のタンパク質をコードし、該タンパク質は、生きている細胞内で転写および翻訳を経て発現した後、特定の生化学的機能を果たす。
多くの医学的状態が、１つまたは複数の遺伝子の変動により引き起こされる。特定の遺伝子の変動が医学的状態を引き起こし、これらとして、例えば、血友病、サラセミア、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、アルツハイマー病および嚢胞性線維症（ＣＦ）が挙げられる（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ、Ｄ．Ｎ．ＣｏｏｐｅｒおよびＭ．Ｋｒａｗｃｚａｋ、ＢＩＯＳ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９３年）。そのような遺伝性疾患は、特定の遺伝子のＤＮＡ中の単一ヌクレオチドの付加、置換または欠失の結果生じ得る。例えば、特定の出生時欠損が、異数性とも呼ばれる染色体異常、例として、２１トリソミー（ダウン症候群）、１３トリソミー（パトー症候群）、１８トリソミー（エドワーズ症候群）、Ｘモノソミー（ターナー症候群）、および特定の性染色体異数性、例として、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ）により引き起こされる。別の遺伝子の変動が胎児の性別であり、これはしばしば、性染色体のＸおよびＹに基づいて決定され得る。いくつかの遺伝子の変動により、例えば、糖尿病、動脈硬化、肥満、種々の自己免疫疾患およびがん（例えば、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、肺がん）等のいくつかの疾患のうちのいずれかに、個体が、罹患しやすくなる恐れ、またはそうした疾患を発症する恐れがある。
Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ、Ｔ．Ｓｔｒａｃｈａｎ、ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９２年 Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ、Ｄ．Ｎ．ＣｏｏｐｅｒおよびＭ．Ｋｒａｗｃｚａｋ、ＢＩＯＳ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９３年
１つまたは複数の遺伝子の変動または分散の同定が、特定の医学的状態の診断またはそうした状態に対する素因の決定につながり得る。遺伝子の分散の同定は、医学的決定の促進および／または有用な医学的手順の利用をもたらすことができる。特定の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子の変動または分散の同定が、無細胞ＤＮＡの分析を含む。無細胞ＤＮＡ（ＣＦ−ＤＮＡ）は、細胞死から生じ、末梢血中を循環するＤＮＡ断片から構成される。高い濃度のＣＦ−ＤＮＡは、特定の臨床状態、例として、がん、外傷、熱傷、心筋梗塞、脳卒中、敗血症、感染およびその他の疾病の指標となり得る。さらに、無細胞胎児ＤＮＡ（ＣＦＦ−ＤＮＡ）を、母体の血流中で検出し、種々の非侵襲性の出生前診断法のために使用することもできる
母体の血漿中の胎児核酸の存在は、母体の血液試料の分析を介する、非侵襲的な出産前診断を可能とする。例えば、母体の血漿中の胎児ＤＮＡの定量的異常は、子癇前症、早産、分娩前出血、侵襲的胎盤形成、胎児ダウン症候群、および他の胎児の染色体異数性を含む、いくつかの妊娠関連障害と関連しうる。よって、母体の血漿中の胎児核酸の分析は、胎児−母体の健康状態をモニタリングするのに有用な機構でありうる。
ある特定の態様では、妊娠中の雌に由来する試験試料中の胎児核酸のフラクションを推定するための方法であって、（ａ）参照ゲノムの部分へとマッピングした配列の読取りのカウントを得るステップであって、配列の読取りが、妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取りである、ステップと、（ｂ）マイクロプロセッサを使用して、（ｉ）各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または（ｉｉ）他の部分特異的パラメータを、部分特異的な胎児核酸のフラクションへと、各部分と独立に関連する重み付け係数に従って重み付けし、これにより、部分特異的胎児フラクションの推定値を、重み付け係数に従って提示するステップであって、重み付け係数の各々が、（ｉ）複数の試料の各々についての胎児核酸のフラクションと、（ｉｉ）複数の試料についての、各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または他の部分特異的パラメータとの、各部分について適合させた関係から決定されている、ステップと、（ｃ）胎児核酸のフラクションを、試験試料について、部分特異的胎児フラクションの推定値に基づき推定するステップとを含む方法が本明細書に提供される。
本明細書ではまた、妊娠中の雌に由来する試験試料中の胎児核酸のフラクションを推定するための方法であって、（ａ）参照ゲノムの部分へとマッピングした配列の読取りのカウントを得るステップであって、配列の読取りが、妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取りである、ステップと、（ｂ）（ｉ）マイクロプロセッサを使用して、各部分へとマッピングした配列の読取りのカウントを、各部分へと独立に割り当てられた重み付け係数に従って調整し、これにより、調整されたカウントを、部分について提示するか、または（ｂ）（ｉｉ）マイクロプロセッサを使用して、部分のサブセットを選択し、これにより、カウントのサブセットを提示するステップであって、（ｂ）（ｉ）における調整するステップ、または（ｂ）（ｉｉ）における選択するステップが、マッピングした、胎児核酸に由来する読取りの量が多い部分に従う、ステップと、（ｃ）胎児核酸のフラクションを、試験試料について、調整されたカウントまたはカウントのサブセットに基づき推定するステップとを含む方法も提供される。
本明細書ではまた、妊娠中の雌に由来する試験試料中の胎児核酸のフラクションの推定の精度を増加させるための方法であって、参照ゲノムの部分へとマッピングした配列の読取りのカウントを得るステップを含み、配列の読取りが、妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取りであり、得られたカウントの少なくともサブセットが、ゲノムの領域であって、ゲノムの別の領域の、全カウントと比べた胎児核酸のカウントより、その領域に由来する、全カウントと比べた胎児核酸に由来するカウント数が大きいことに寄与する領域に由来する方法も提供される。
本明細書ではまた、１つまたは複数のマイクロプロセッサおよびメモリを含む、システム、マシン、または装置であって、メモリが、１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な命令を含み、１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な命令が、（ａ）参照ゲノムの部分へとマッピングしたヌクレオチド配列の読取りにアクセスし、配列の読取りが、妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取りであり、（ｂ）（ｉ）各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または（ｉｉ）他の部分特異的パラメータを、部分特異的な胎児核酸のフラクションへと、各部分と独立に関連する重み付け係数に従って重み付けし、これにより、部分特異的胎児フラクションの推定値を、重み付け係数に従って提示し、ここで、重み付け係数の各々が、（ｉ）複数の試料の各々についての胎児核酸のフラクションと、（ｉｉ）複数の試料についての、各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または他の部分特異的パラメータとの、各部分について適合させた関係から決定されており、（ｃ）胎児核酸のフラクションを、試験試料について、部分特異的胎児フラクションの推定値に基づき推定するように構成されている、システム、マシン、または装置も提供される。
本明細書ではまた、１つまたは複数のマイクロプロセッサおよびメモリを含むマシンであって、メモリが、１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な命令を含み、メモリが、参照ゲノムの部分へとマッピングしたヌクレオチド配列の読取りを含み、配列の読取りが、妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取りであり、１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な命令が、（ａ）マイクロプロセッサを使用して、（ｉ）各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または（ｉｉ）他の部分特異的パラメータを、部分特異的な胎児核酸のフラクションへと、各部分と独立に関連する重み付け係数に従って重み付けし、これにより、部分特異的胎児フラクションの推定値を、重み付け係数に従って提示し、ここで、重み付け係数の各々が、（ｉ）複数の試料の各々についての胎児核酸のフラクションと、（ｉｉ）複数の試料についての、各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または他の部分特異的パラメータとの、各部分について適合させた関係から決定されており、（ｂ）胎児核酸のフラクションを、試験試料について、部分特異的胎児フラクションの推定値に基づき推定するように構成されている、マシンも提供される。
本明細書ではまた、実行可能なプログラムをその上に内蔵した非一時的なコンピュータ可読記憶媒体であって、プログラムが、マイクロプロセッサに、以下を行う：（ａ）参照ゲノムの部分へとマッピングしたヌクレオチド配列の読取りにアクセスし、配列の読取りが、妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取りであり、（ｂ）マイクロプロセッサを使用して、（ｉ）各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または（ｉｉ）他の部分特異的パラメータを、部分特異的な胎児核酸のフラクションへと、各部分と独立に関連する重み付け係数に従って重み付けし、これにより、部分特異的胎児フラクションの推定値を、重み付け係数に従って提示し、ここで、重み付け係数の各々が、（ｉ）複数の試料の各々についての胎児核酸のフラクションと、（ｉｉ）複数の試料についての、各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または他の部分特異的パラメータとの、各部分について適合させた関係から決定されており、（ｃ）胎児核酸のフラクションを、試験試料について、部分特異的胎児フラクションの推定値に基づき推定するように命令する、非一時的なコンピュータ可読記憶媒体も提供される。
技術のある特定の態様について、以下の記載、実施例、特許請求の範囲、および図面でさらに記載する。
図面は、技術の実施形態を例示するものであり、限定的なものではない。例示の明確さおよび容易さのために、図面は、実寸で作成されるものではなく、場合によって、特定の実施形態の理解を容易とするように、多様な態様を、誇張または拡大して示す場合がある。
図１は、第１３染色体についての、ＦＲＳ（左の垂直軸、上のヒストグラム）と、５０ｋｂのビン当たりのエクソンの数（右の垂直軸、下のヒストグラム）との対応のある比較を示す図である。部分は、下の水平方向のＸ軸上に示す。
図２は、第１３染色体についての、ＦＲＳ（左の垂直軸、上のヒストグラム）と、５０ｋｂのビン当たりのＧＣ含有量（右の垂直軸、下のヒストグラム）との対応のある比較を示す図である。部分は、下の水平方向のＸ軸上に示す。
図３は、第１３染色体についての、５０ｋｂの部分当たりのエクソンの数（左の垂直軸、上のヒストグラム）と、５０ｋｂの部分当たりのＧＣ含有量（右の垂直軸、下のヒストグラム）との対応のある比較を示す図である。部分は、下の水平方向のＸ軸上に示す。
図４は、第１８染色体についての、ＦＲＳ（左の垂直軸、上のヒストグラム）と、５０ｋｂの部分当たりのエクソンの数（右の垂直軸、下のヒストグラム）との対応のある比較を示す図である。部分は、下の水平方向のＸ軸上に示す。
図５は、第１８染色体についての、ＦＲＳ（左の垂直軸、上のヒストグラム）と、５０ｋｂの部分当たりのＧＣ含有量（右の垂直軸、下のヒストグラム）との対応のある比較を示す図である。部分は、下の水平方向のＸ軸上に示す。
図６は、第１８染色体についての、５０ｋｂの部分当たりのエクソンの数（左の垂直軸、上のヒストグラム）と、５０ｋｂの部分当たりのＧＣ含有量（右の垂直軸、下のヒストグラム）との対応のある比較を示す図である。部分は、下の水平方向のＸ軸上に示す。
図７は、第２１染色体についての、ＦＲＳ（左の垂直軸、上のヒストグラム）と、５０ｋｂの部分当たりのエクソンの数（右の垂直軸、下のヒストグラム）との対応のある比較を示す図である。部分は、下の水平方向のＸ軸上に示す。
図８は、第２１染色体についての、ＦＲＳ（左の垂直軸、上のヒストグラム）と、５０ｋｂの部分当たりのＧＣ含有量（右の垂直軸、下のヒストグラム）との対応のある比較を示す図である。部分は、下の水平方向のＸ軸上に示す。
図９は、第２１染色体についての、５０ｋｂの部分当たりのエクソンの数（左の垂直軸、上のヒストグラム）と、５０ｋｂの部分当たりのＧＣ含有量（右の垂直軸、下のヒストグラム）との対応のある比較を示す図である。部分は、下の水平方向のＸ軸上に示す。
図１０は、第２１染色体について、ＬＯＥＳＳによるＺスコアを伴うＰＥＲＵＮ ＰＡＤ（Ｘ軸）を、「胎児非富化」部分に基づく、ＬＯＥＳＳによるＺスコアを伴うＰＥＲＵＮ ＰＡＤ（Ｙ軸）と対比して示す図である。４つの象限は、一致および不一致を表示する。象限直線は、Ｚ＝３に引く。右上および左下の象限は、グレーの対角破線で区切られる。点破線は、非Ｔ２１試料のみについての回帰直線である。点線は、高ＦＲＳ部分に基づく、Ｔ２１試料についての回帰直線である。
図１１は、第２１染色体について、ＬＯＥＳＳによるＺスコアを伴うＰＥＲＵＮ ＰＡＤ（Ｘ軸）を、「胎児富化」部分に基づく、ＬＯＥＳＳによるＺスコアを伴うＰＥＲＵＮ ＰＡＤ（すなわち、高ＦＲＳの部分）（Ｙ軸）と対比して示す図である。４つの象限は、一致および不一致を表示する。象限直線は、Ｚ＝３に引く。右上および左下の象限は、グレーの対角破線で区切られる。点破線は、非Ｔ２１試料のみについての回帰直線である。点線は、高ＦＲＳ部分に基づく、Ｔ２１試料についての回帰直線である。
図１２は、核酸断片の長さを決定するための方法であって、１）プローブ（Ｐ；点線）の、断片（実線）とのハイブリダイゼーションステップと、２）プローブをトリミングするステップと、３）プローブの長さを測定するステップとを含む方法を示す図である。断片サイズの決定は、胎児由来の断片（Ｆ）および母体由来の断片（Ｍ）について示す。
図１３は、３つの異なるライブラリー調製法について、断片の長さの分布を示す図である。３つの異なるライブラリー調製法は、自動式ビーズクリーンアップを伴う酵素法、自動式ビーズクリーンアップを伴わない酵素法、および自動式ビーズクリーンアップを伴うＴＲＵＳＥＱ法を含む。垂直方向の直線は、１４３塩基および１６６塩基の断片サイズを表示する。
図１４は、断片サイズフィルター無しでの第１３染色体の表示を示す図である。
図１５は、１５０塩基の断片サイズフィルターを用いての第１３染色体の表示を示す図である。
図１６は、断片サイズフィルター無しでの第１８染色体の表示を示す図である。
図１７は、１５０塩基の断片サイズフィルターを用いての第１８染色体の表示を示す図である。
図１８は、断片サイズフィルター無しでの第２１染色体の表示を示す図である。
図１９は、１５０塩基の断片サイズフィルターを用いての第２１染色体の表示を示す図である。
図２０は、可変断片サイズフィルターを用いての第１３染色体の表示（ＬＯＥＳＳによるＰＥＲＵＮ ＰＡＤ）を示す図である。
図２１は、可変断片サイズフィルターを用いての第１８染色体の表示（ＬＯＥＳＳによるＰＥＲＵＮ ＰＡＤ）を示す図である。
図２２は、可変断片サイズフィルターを用いての第２１染色体の表示（ＬＯＥＳＳによるＰＥＲＵＮ ＰＡＤ）を示す図である。
図２３は、ある特定の分析のために使用されたデータについての記載を提示する表である。
図２４は、技術のある特定の実施形態を実行しうるシステムの例示的な実施形態を示す図である。
図２５Ａは、トリソミー２１胎児（アステリスクにより指し示される）または正倍数体胎児（丸により指し示される）を有する妊娠中の雌から得られた試料の同じ部分のサブセットについて、Ｃｈｒ２１の部分のサブセットの平均ＦＲＳ（ｘ軸）の、ＰＥＲＵＮにより正規化されたカウントのＺスコア（ｙ軸）に対する関係を示す図である。図２５Ａで選択された部分のサブセット内の各部分は、カウントを得た第２１染色体の全ての部分について決定された中央値ＦＲＳ超のＦＲＳを有する。図２５Ｂは、トリソミー２１胎児（アステリスクにより指し示される）または正倍数体胎児（丸により指し示される）を有する妊娠中の雌から得られたＣｈｒ２１の、カウントを得たＣｈｒ２１の全ての部分について、ＦＱＡによる胎児フラクションの推定値（ｘ軸）の、ＰＥＲＵＮにより正規化されたカウントのＺスコア（ｙ軸）と対比した関係を示す。
図２６は、第２１染色体の、断片の長さの指し示された範囲（右下挿入図に示される）の読取りについて、読取り当たりのＧＣ含有量（ｘ軸）の、読取りの長さに基づく累積分布関数（ＣＤＦ、ｙ軸）に対する関係を示す図である。
図２７は、ビン当たりのＦＲＳに従って、四分位数（高値、中程度の高値、中程度の低値、および低値）へと区分化された、ＰＥＲＵＮ切片（ｘ軸）の分布を示す図である。
図２８は、ビン当たりのＦＲＳに従って、四分位数（高値、中程度の高値、中程度の低値、および低値）へと区分化された、ＰＥＲＵＮによる最大交差検証誤差（ｘ軸）の分布を示す図である。
図２９は、６０００例のトレーニング試料に基づき、ＢＦＦモデルにより、１９，３１２例の試験試料について予測された胎児フラクション百分率（ｘ軸）の、Ｙ染色体レベルから決定された胎児フラクション百分率（ＣｈｒＦＦ、ｙ軸）と比較した相関（Ｒ＝０．８１、ＲＭｅｄＳＥ＝１．５）を示す図である。
図３０は、ＦＲＳに基づく、胎児フラクション含有量（左に示した分布）が大きなビン（すなわち、部分）および胎児フラクション含有量（右に示した分布）が小さなビンについての相対予測誤差（ｘ軸）を示す図である。胎児含有量が大きなビンは、良好な効能を有し、誤差を低下させる。予測スコアは、密度プロファイルを得るのに使用されるブートストラップ法を伴うエラスティックネット回帰手順に基づく。
図３１は、エラスティックネット回帰手順を使用して決定された、胎児フラクション含有量（例えば、低量、中程度量〜低量、中程度量〜高量、高量）に従って区切られたビンのサブセットについての、モデル係数（ｘ軸）の４つの分布を示す図である。胎児フラクション含有量が大きなビンは、大きな係数（正または負）をもたらす傾向がある。
図３２は、雌および雄の試験試料について、ＢＦＦ法を使用して決定された、胎児フラクションの推定値（ｘ軸）についての２つの分布を示す図である。２つの分布は、実質的にオーバーラップする。雄胎児と雌胎児とは、胎児フラクションの分布の差違を示さなかった（ＫＳ検定；Ｐ＝０．４９）。
本明細書では、核酸混合物中のポリヌクレオチドを分析するための方法であって、例えば、遺伝子の変動の存在または非存在を決定するための方法を含む方法が提供される。母体試料に由来する、例えば、胎児異数性など、遺伝子の変動の評価は、試料中に存在する核酸の配列決定と、配列の読取りを、ゲノム中のある特定の領域へとマッピングすることと、試料について配列の読取りを定量することと、定量を分析することとを伴うことが典型的である。このような方法は、試料中の核酸を直接分析し、試料中の核酸のうちの全てまたは実質的に全てについて、ヌクレオチド配列の読取りを得ることが多く、これは、費用がかかり、余分なデータおよび／または無関係のデータを生成する可能性がある。しかし、ある特定の配列ベースの分析および／または長さベースの分析と組み合わせた、ある特定の配列ベースの分離法および／または長さベースの分離法により、例えば、特異的な染色体など、標的とされたゲノム領域についての具体的な情報を生成することができ、場合によって、胎児起源と対比した母体起源など、核酸断片の起源を差別化することができる。ある特定の方法は、配列決定法、富化法、および長さベースの分析の使用を含みうる。一部の実施形態では、本明細書で記載されるある特定の方法は、核酸断片のヌクレオチド配列を決定せずに実施することができる。本明細書では、配列ベースの分離法および分析法、ならびに／または長さベースの分離法および分析法の組合せを使用して、核酸混合物中のポリヌクレオチドを分析する（例えば、胎児異数性の存在または非存在を決定する）ための方法が提供される。
また、遺伝子の変動を同定するのに有用な方法、処理、およびマシンも提供される。遺伝子の変動を同定することは、場合によって、コピー数の変動を検出することを含み、かつ／または、場合によって、コピー数の変動を含むレベルを調整することを含む。一部の実施形態では、レベルを調整することから、偽陽性診断または偽陰性診断の尤度を低減した、１つまたは複数の遺伝子の変動または遺伝子の分散の同定がなされる。一部の実施形態では、本明細書で記載される方法により遺伝子の変動を同定することから、特定の医学的状態の診断、または特定の医学的状態への素因の決定をもたらすことができる。遺伝子の分散を同定する結果として、医学的決定を容易とし、かつ／または有益な医学的手順を援用することができる。
本明細書ではまた、一部の実施形態で、本明細書で記載される方法を実行する、システム、マシン、およびモジュールも提供される。
試料
本明細書では、核酸を分析するための方法および組成を提供する。一部の実施形態では、核酸断片の混合物中の核酸断片を分析する。核酸の混合物は、異なるヌクレオチド配列、異なる断片長、異なる起源（例えば、ゲノム起源、胎児起源対母体起源、細胞起源もしくは組織起源、試料起源、被験体起源等）、またはそれらの組合せを有する２つまたはそれ超の核酸断片種を含むことができる。
しばしば、本明細書に記載する方法および装置において利用する核酸または核酸混合物を、被験体から得られた試料から単離する。被験体は、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト動物、植物、細菌、真菌または原生生物を含めた、任意の生きているまたは生きていない生物であり得る。これらに限定されないが、哺乳動物、爬虫類、トリ、両生類、魚、有蹄動物、反芻動物、ウシ科（例えば、ウシ）、ウマ科（例えば、ウマ）、ヤギ（ｃａｐｒｉｎｅ）およびヒツジ（ｏｖｉｎｅ）（例えば、ヒツジ、ヤギ）、ブタ（ｓｗｉｎｅ）（例えば、ブタ）、ラクダ科（例えば、ラクダ、ラマ、アルパカ）、サル、類人猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー）、クマ科（例えば、クマ）、家禽、イヌ、ネコ、マウス、ラット、魚、イルカ、クジラおよびサメを含めて、任意のヒトまたは非ヒト動物を選択することができる。被験体は、雄または雌（例えば、女性、妊婦）であり得る。被験体は、任意の年齢（例えば、胚、胎児、乳児、小児、成人）であり得る。
核酸を、任意のタイプの適切な生物学的検体または試料（例えば、試験試料）から単離することができる。試料または試験試料は、被験体またはその一部分（ｐａｒｔ）（例えば、ヒト被験体、妊娠中の雌、胎児）から単離されるまたは得られる任意の検体であり得る。検体の非限定的な例として、被験体から得られた体液または組織が挙げられ、これらには、非限定的に、血液または血液生成物（例えば、血清、血漿等）、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、脳脊髄液、脊髄液、洗浄した液（例えば、気管支肺胞洗浄液、胃洗浄液、腹膜洗浄液、管洗浄液、耳洗浄液、関節鏡検査洗浄液）、生検試料（例えば、着床前胚生検試料から得られた試料）、腹腔穿刺試料（ｃｅｌｏｃｅｎｔｅｓｉｓ ｓａｍｐｌｅ）、細胞（血液細胞、胎盤細胞、胚もしくは胎児細胞、胎児有核細胞もしくは胎児細胞残余物）またはそれらの一部分（例えば、ミトコンドリア、核、抽出物等）、雌の生殖器系の洗浄物、尿、糞便、痰、唾液、鼻粘液、前立腺液、洗浄液（ｌａｖａｇｅ）、精液、リンパ液、胆汁、涙、汗、乳汁、乳房液等、あるいはそれらの組合せが含まれる。一部の実施形態では、生物学的試料は、被験体から得られた子宮頚部スワブである。一部の実施形態では、生物学的試料は、血液であり得、時には、血漿または血清であり得る。用語「血液」は、本明細書で使用する場合、妊婦または妊娠の可能性について試験されている女性から得られた血液の試料または調製物を指す。この用語は、全血、血液生成物または血液の任意の画分、例として、従来の定義どおりの血清、血漿、バフィーコート等を包含する。血液またはその画分はしばしば、ヌクレオソーム（例えば、母体および／または胎児のヌクレオソーム）を含む。ヌクレオソームは、核酸を含み、時には、無細胞または細胞内ヌクレオソームである。血液はまた、バフィーコートも含む。バフィーコートを時には、フィコール勾配を利用することによって単離する。バフィーコートは、白血球細胞（例えば、白血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、血小板等）を含むことができる。特定の実施形態では、バフィーコートは、母体核酸および／または胎児核酸を含む。血漿は、抗凝固剤で処理した血液の遠心分離の結果得られた、全血の画分を指す。血清は、血液試料が凝固した後に残存する水性の液体部分を指す。体液試料または組織試料をしばしば、病院またはクリニックが一般に従う標準的なプロトコールに従って収集する。血液の場合、末梢血の適切な量（例えば、３〜４０ミリリットル）をしばしば収集し、調製する前または調製した後に標準的な手順に従って保存することができる。核酸を抽出する体液試料または組織試料は、無細胞の場合がある（例えば、無細胞）。一部の実施形態では、体液試料または組織試料は、細胞要素または細胞残余物を含有する場合がある。一部の実施形態では、胎児細胞またはがん細胞を、試料中に含む場合がある。
しばしば、試料は不均一であり、これは、１つ超のタイプの核酸種が試料中に存在することを意味する。例えば、不均一核酸として、これらに限定されないが、（ｉ）胎児由来の核酸および母体由来の核酸、（ｉｉ）がんの核酸および非がんの核酸、（ｉｉｉ）病原体の核酸および宿主の核酸、より一般的には、（ｉｖ）変異した核酸および野生型の核酸を挙げることができる。試料は、不均一であり得、これは、１つ超の細胞型、例として、胎児細胞および母体細胞、がん細胞および非がん細胞、または病原体細胞および宿主細胞が存在するからである。一部の実施形態では、少量の核酸種および多量の核酸種が存在する。
本明細書に記載する技術を出生前に適用する場合、体液試料または組織試料を、試験するのに適切な在胎齢において雌から、または妊娠の可能性について試験されている雌から収集することができる。適切な在胎齢は、実施されている出生前試験に応じて様々であり得る。特定の実施形態では、妊娠中の雌の被験体は、時には妊娠第一期にあり、時には妊娠第二期にあり、または時には妊娠第三期にある。特定の実施形態では、体液または組織を、妊娠中の雌から、在胎約１〜約４５週（例えば、在胎１〜４、４〜８、８〜１２、１２〜１６、１６〜２０、２０〜２４、２４〜２８、２８〜３２、３２〜３６、３６〜４０または４０〜４４週）において、時には、在胎約５〜約２８週（例えば、在胎６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７週）において収集する。特定の実施形態では、体液試料または組織試料を、妊娠中の雌から、出産（例えば、経膣分娩または非経膣分娩（例えば、外科的分娩））の間または直後（例えば、０〜７２時間後）に収集する。
血液試料の入手およびＤＮＡの抽出
本明細書の方法はしばしば、妊娠中および時には妊娠後に、母体および／もしくは胎児の遺伝子の変動の存在または非存在を検出するため、ならびに／または胎児および／もしくは妊娠中の雌の健康状態をモニターするための非侵襲性手段として、母体の血液中に見出される胎児のＤＮＡを分離すること、富化することおよび分析することを含む。したがって、本明細書の特定の方法を実行する最初のステップはしばしば、妊婦から血液試料を得ること、および試料からＤＮＡを抽出することを含む。
血液試料の入手
血液試料を、本技術による方法を使用して、妊婦から試験するのに適切な在胎齢において得ることができる。適切な在胎齢は、下記に論じるように、試験する障害に応じて変化させることができる。女性からの血液の収集はしばしば、病院またはクリニックが一般に従う標準的なプロトコールに従って実施される。末梢血の適切な量、例えば、典型的には５〜５０ｍｌをしばしば収集し、さらに調製する前に、標準的な手順に従って保存することができる。血液試料は、試料中に存在する核酸の品質の劣化を最小限に留める様式で、収集し、保存し、または輸送することができる。
血液試料の調製
母体の血液中に見出される胎児のＤＮＡの分析を、例えば、全血、血清または血漿を使用して行うことができる。母体の血液から血清または血漿を調製する方法が公知である。例えば、妊婦の血液を、ＥＤＴＡまたはＶａｃｕｔａｉｎｅｒ ＳＳＴ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、Ｎ．Ｊ．）等の特殊な市販製品を含有するチューブ中に入れて、血液凝固を阻止することができ、次いで、血漿を、全血から遠心分離により得ることができる。血清は、血液凝固後の遠心分離有りまたは無しで得ることができる。遠心分離を使用する場合には、典型的には、適切なスピード、例えば、１，５００〜３，０００回転ｇで実施するが、必ずしもそうではない。血漿または血清を、ＤＮＡ抽出のための新しいチューブに移す前に、追加の遠心分離のステップに付してもよい。
全血の、無細胞の部分に加えて、また、ＤＮＡも、細胞画分から回収し、バフィーコート部分中で富化することができ、このバフィーコート部分は、女性から得られた全血試料を遠心分離し、血漿を除去して得ることができる。
ＤＮＡの抽出
血液を含めた、生物学的試料からＤＮＡを抽出するための多数の公知の方法がある。ＤＮＡの調製の一般な方法（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｄ ｅｄ．２００１年による記載）に従うことができ、また、種々の市販されている試薬またはキット、例として、ＱｉａｇｅｎのＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ、ＱｉａＡｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、またはＱｉａＡｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）、ＧｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐ（商標）Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、およびＧＦＸ（商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用して、妊婦から得られた血液試料からＤＮＡを得ることもできる。また、これらの方法のうちの１つ超の組合せを使用することもできる。
一部の実施形態では、最初に、１つまたは複数の方法により、試料を、胎児核酸について富化またはある程度まで富化することもできる。例えば、本技術の組成および処理を、単独で、またはその他の識別因子と組み合わせて使用して、胎児のＤＮＡと母体のＤＮＡとの識別を行うことができる。これらの因子の例として、Ｘ染色体とＹ染色体との間の単一ヌクレオチドの差、Ｙ染色体に特異的な配列、ゲノム中の他の箇所に位置する多型、胎児のＤＮＡと母体のＤＮＡとの間のサイズの差、および母体組織と胎児組織との間のメチル化パターンの差が挙げられるが、これらに限定されない。
試料を核酸の特定の種について富化するためのその他の方法が、２００７年５月３０日出願のＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／６９９９１号、２００７年６月１５日出願のＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７１２３２号、米国仮出願第６０／９６８，８７６号および同第６０／９６８，８７８号（本出願人に譲渡）（２００５年１１月２８日出願のＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ０５／０１２７０７号）に記載されており、これらは全て、参照により本明細書に援用されている。特定の実施形態では、母体核酸を、試料から、選択的に（部分的に、実質的に、ほとんど完全に、または完全に）除去する。
用語「核酸」および「核酸分子」を、本開示全体を通して交換可能に使用することができる。これらの用語は、ＤＮＡ（例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）等）、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャー（ｍｅｓｓａｇｅ）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、胎児または胎盤が高度に発現するＲＮＡ等）、ならびに／またはＤＮＡもしくはＲＮＡのアナログ（例えば、塩基のアナログ、糖のアナログおよび／もしくは外来の骨格等を含有するもの）、ＲＮＡ／ＤＮＡのハイブリッドおよびポリアミド核酸（ＰＮＡ）等に由来する任意の組成の核酸を指し、これらは全て、一本鎖または二本鎖の形態であり得、別段の限定がない限り、天然に存在するヌクレオチドに類似する様式で機能することができる天然ヌクレオチドの公知のアナログを包含することができる。特定の実施形態では、核酸は、プラスミド、ファージ、自律複製性配列（ＡＲＳ）、セントロメア、人工染色体、染色体、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで、または宿主細胞、細胞、細胞核もしくは細胞の細胞質中で、複製し得るまたは複製され得るその他の核酸であってもよく、あるいはそれらに由来してもよい。鋳型核酸は、一部の実施形態では、単一の染色体に由来し得る（例えば、核酸試料は、二倍体生物から得られた試料の１つの染色体に由来し得る）。特段の限定がない限り、この用語は、参照核酸に類似する結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドに類似する様式で代謝される天然ヌクレオチドの公知のアナログを含有する核酸を包含する。別段の記載がない限り、特定の核酸配列は、明確に示す配列のみならず、また、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、一塩基多型（ＳＮＰ）および相補配列も暗に包含する。具体的には、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が、混合性塩基の残基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって、縮重コドン置換を得ることができる。核酸という用語は、座位、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子がコードするｍＲＮＡと交換可能に使用する。この用語はまた、均等物として、ヌクレオチドのアナログから合成されたＲＮＡまたはＤＮＡの誘導体、バリアントおよびアナログ、一本鎖（「センス」鎖または「アンチセンス」鎖、「プラス」鎖または「マイナス」鎖、「フォワード」リーディングフレームまたは「リバース」リーディングフレーム）、および二本鎖ポリヌクレオチドも含むことができる。用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の生成に関わるＤＮＡのセグメントを意味し、これは、遺伝子産物の転写／翻訳および転写／翻訳の調節に関わる、コード領域に先行する領域およびコード領域に続く領域（リーダーおよびトレーラー）、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
デオキシリボヌクレオチドは、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、およびデオキシチミジンを含む。ＲＮＡの場合、塩基シトシンが、ウラシルで置き換えられる。被験体から得られた核酸を鋳型として使用して、鋳型核酸を調製することができる。
核酸の単離および処理
核酸を、１つまたは複数の供給源（例えば、細胞、血清、血漿、バフィーコート、リンパ液、皮膚、土壌等）から、当技術分野で公知の方法により得ることができる。任意の適切な方法を使用して、生物学的試料（例えば、血液または血液生成物から）からのＤＮＡを単離する、抽出するおよび／または精製することができ、それらの非限定的な例として、ＤＮＡの調製の方法（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｄ ｅｄ．２００１年による記載）、種々の市販されている試薬またはキット、例として、ＱｉａｇｅｎのＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ、ＱｉａＡｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、またはＱｉａＡｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）、ＧｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐ（商標）Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、およびＧＦＸ（商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）等、またはそれらの組合せが挙げられる。
細胞溶解の手順および試薬は、当技術分野で公知であり、一般に、化学的方法（例えば、洗剤、低張溶液、酵素による手順等、もしくはそれらの組合せ）、物理的方法（例えば、フレンチプレス、超音波処理等）、または電解質による溶解方法により行うことができる。任意の適切な溶解手順を利用することができる。例えば、化学的方法は一般に、溶解剤を利用して、細胞を破壊し、細胞から核酸を抽出し、続いて、カオトロピック塩を用いて処理する。物理的方法、例として、凍結／解凍、それに続く、粉砕；細胞プレスの使用等もまた有用である。高い塩濃度による溶解の手順もまた、一般に使用される。例えば、アルカリによる溶解の手順を利用することができる。後者の手順には従来、フェノール−クロロホルム溶液の使用を組み入れており、３つの溶液が関与する、代替のフェノール−クロロホルムを用いない手順も利用することができる。後者の手順の場合、１つの溶液が、１５ｍＭトリス、ｐＨ８．０；１０ｍＭ ＥＤＴＡ、および１００μｇ／ｍｌリボヌクレアーゼＡを含有することができ；第２の溶液が、０．２Ｎ ＮａＯＨおよび１％ＳＤＳを含有することができ；第３の溶液が、３Ｍ ＫＯＡｃ、ｐＨ５．５を含有することができる。これらの手順は、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、N.Y.、６．３．１〜６．３．６（１９８９年）に見出すことができ、その全体が本明細書に援用されている。
核酸を、別の核酸と比較する場合、異なる時点で単離することができ、試料のそれぞれが、同じ供給源または異なる供給源に由来する。例えば、核酸は、核酸ライブラリー、例として、ｃＤＮＡライブラリーまたはＲＮＡライブラリーに由来し得る。核酸は、核酸の精製もしくは単離、および／または試料から得られた核酸分子の増幅の結果であり得る。本明細書に記載する処理に提供される核酸は、１つの試料に由来する核酸、あるいは２つまたはそれ超の試料（例えば、１つもしくは複数、２つもしくはそれ超、３つもしくはそれ超、４つもしくはそれ超、５つもしくはそれ超、６つもしくはそれ超、７つもしくはそれ超、８つもしくはそれ超、９つもしくはそれ超、１０個もしくはそれ超、１１個もしくはそれ超、１２個もしくはそれ超、１３個もしくはそれ超、１４個もしくはそれ超、１５個もしくはそれ超、１６個もしくはそれ超、１７個もしくはそれ超、１８個もしくはそれ超、１９個もしくはそれ超、または２０個もしくはそれ超の試料）に由来する核酸を含有することができる。
特定の実施形態では、核酸は、細胞外核酸を含むことができる。用語「細胞外核酸」は、本明細書で使用する場合、実質的に細胞を有さない供給源から単離された核酸を指すことができ、また、「無細胞」核酸、「循環無細胞核酸」（例えば、ＣＣＦ断片）および／または「無細胞循環」核酸とも呼ぶ。細胞外核酸は、血液（例えば、妊娠中の雌の血液）中に存在し、そこから得ることができる。細胞外核酸はしばしば、検出可能な細胞を含まず、細胞要素または細胞残余物を含有する場合がある。細胞外核酸のための、無細胞の供給源の非限定的な例が、血液、血漿、血清および尿である。本明細書で使用する場合、用語「無細胞循環試料核酸を得る」は、試料を直接得ること（例えば、試料、例えば、試験試料を収集すること）、または試料を収集した他者から試料を得ることを含む。理論により制限されることなく、細胞外核酸は、細胞アポトーシスおよび細胞分解の産物であり得、これらは、スペクトル（例えば、「ラダー」）にわたる一連の長さをしばしば有する細胞外核酸の基を提供する。
特定の実施形態では、細胞外核酸は、異なる核酸種を含むことができ、したがって、本明細書では、「不均一である」と呼ばれる。例えば、がんを有する人から得られた血清または血漿は、がん細胞に由来する核酸および非がん細胞に由来する核酸を含む場合がある。別の例では、妊娠中の雌から得られた血清または血漿は、母体核酸および胎児核酸を含む場合がある。一部の事例では、胎児核酸は時には、核酸全体の約５％〜約５０％である（例えば、全ての核酸の約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９％が、胎児核酸である）。一部の実施形態では、核酸中の胎児核酸のうちの大半は、約５００塩基対またはそれ未満の長さである（例えば、胎児核酸のうちの約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％は、約５００塩基対またはそれ未満の長さである）。一部の実施形態では、核酸中の胎児核酸のうちの大半は、約２５０塩基対またはそれ未満の長さである（例えば、胎児核酸のうちの約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％は、約２５０塩基対またはそれ未満の長さである）。一部の実施形態では、核酸中の胎児核酸のうちの大半は、約２００塩基対またはそれ未満の長さである（例えば、胎児核酸のうちの約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％は、約２００塩基対またはそれ未満の長さである）。一部の実施形態では、核酸中の胎児核酸のうちの大半は、約１５０塩基対またはそれ未満の長さである（例えば、胎児核酸のうちの約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％は、約１５０塩基対またはそれ未満の長さである）。一部の実施形態では、核酸中の胎児核酸のうちの大半は、約１００塩基対またはそれ未満の長さである（例えば、胎児核酸のうちの約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％は、約１００塩基対またはそれ未満の長さである）。一部の実施形態では、核酸中の胎児核酸のうちの大半は、約５０塩基対またはそれ未満の長さである（例えば、胎児核酸のうちの約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％は、約５０塩基対またはそれ未満の長さである）。一部の実施形態では、核酸中の胎児核酸のうちの大半は、約２５塩基対またはそれ未満の長さである（例えば、胎児核酸のうちの約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％は、約２５塩基対またはそれ未満の長さである）。
特定の実施形態では、核酸を含有する試料（複数可）を処理せずに、核酸を提供して、本明細書に記載する方法を実施することができる。一部の実施形態では、核酸を含有する試料（複数可）を処理してから、核酸を提供して、本明細書に記載する方法を実施する。例えば、核酸を、試料（複数可）から、抽出し、単離し、精製し、部分的に精製し、または増幅することができる。用語「単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」は、本明細書で使用する場合、核酸をその元々の環境（例えば、核酸が天然に存在する場合の天然の環境、または外因性に発現させる場合の宿主細胞）から取り出すことを指し、したがって、ヒトの介入により（例えば、「人の手により」）、核酸は、その元々の環境から変化している。用語「単離核酸」は、本明細書で使用する場合、被験体（例えば、ヒト被験体）から取り出された核酸を指すことができる。単離核酸は、供給源の試料中に存在する成分の量よりも少ない非核酸成分（例えば、タンパク質、脂質）を伴って提供され得る。単離核酸を含む組成は、その約５０％〜９９％超が非核酸成分を含有しない場合がある。単離核酸を含む組成は、その約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％超が非核酸成分を含有しない場合がある。用語「精製（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」は、本明細書で使用する場合、核酸を精製手順に付す前に存在する非核酸成分（例えば、タンパク質、脂質、炭水化物）の量よりも少ない非核酸成分を含有する核酸を提供することを指すことができる。精製核酸を含む組成は、その約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％超がその他の非核酸成分を含有しない場合がある。用語「精製」は、本明細書で使用する場合、核酸が由来する試料供給源中よりも少ない核酸種を含有する核酸を提供することを指すことができる。精製核酸を含む組成は、その約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％超がその他の核酸種を含有しない場合がある。例えば、胎児核酸を、母体核酸および胎児核酸を含む混合物から精製することができる。特定の例では、胎児核酸の小さな断片を含むヌクレオソームを、母体核酸のより大きな断片を含むより大きなヌクレオソーム複合体の混合物から精製することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載する方法の前、間または後に、核酸を断片化または切断する。断片化または切断した核酸は、約５〜約１０，０００塩基対、約１００〜約１，０００塩基対、約１００〜約５００塩基対、または約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００もしくは９０００塩基対の基準の（ｎｏｍｉｎａｌ）、平均（ａｖｅｒａｇｅ）または平均値（ｍｅａｎ）の長さを有することができる。断片を、当技術分野で公知の適切な方法により生成することができ、核酸断片の平均、平均値または基準の長さを、適切な断片生成手順を選択することによって制御することができる。
核酸断片は、オーバーラップするヌクレオチド配列を含有することができ、そのようなオーバーラップする配列は、断片化されていない、対応する核酸のヌクレオチド配列、またはそのセグメントの構築を促進することができる。例えば、１つの断片が、サブ配列ｘおよびｙを有する場合があり、別の断片が、サブ配列ｙおよびｚを有する場合があり、ｘ、ｙおよびｚは、５ヌクレオチド長またはそれ超であり得るヌクレオチド配列である。特定の実施形態では、オーバーラップ配列ｙを利用して、試料に由来する核酸中のｘ−ｙ−ｚのヌクレオチド配列の構築を促進することができる。特定の実施形態では、核酸は、部分的に（例えば、不完全なもしくは終結した特定の切断反応から）断片化させてもよく、または完全に断片化させてもよい。
一部の実施形態では、核酸を、適切な方法により断片化または切断し、それらの非限定的な例として、物理的方法（例えば、せん断、例えば、超音波処理、フレンチプレス、加熱、ＵＶ照射等）、酵素処理（例えば、酵素切断剤（例えば、適切なヌクレアーゼ、適切な制限酵素、適切なメチル化感受性制限酵素））、化学的方法（例えば、アルキル化、ＤＭＳ、ピペリジン、酸加水分解、塩基加水分解、加熱等、もしくはそれらの組合せ）、米国特許出願公開第２００５０１１２５９０号に記載されている処理等、またはそれらの組合せが挙げられる。
本明細書で使用する場合、「断片化」または「切断」は、核酸分子、例として、核酸鋳型遺伝子分子またはその増幅産物を、２つまたはそれ超のより小さな核酸分子に分断することができる手順または条件を指す。そのような断片化または切断は、配列特異的、塩基特異的、または非特異的であり得、例えば、化学的、酵素的、物理的断片化を含めた、多様な方法、試薬または条件のうちのいずれかにより達成することができる。
本明細書で使用する場合、「断片」、「切断産物」、「切断された産物」、またはそれらの文法上の変型は、核酸鋳型遺伝子分子の断片化もしくは切断の結果として得られた核酸分子、またはそれらの増幅産物を指す。そのような断片または切断された産物は、切断反応の結果として得られた全ての核酸分子を指す場合があるが、典型的には、そのような断片または切断された産物は、核酸鋳型遺伝子分子のうちの対応するヌクレオチド配列を含有する、核酸鋳型遺伝子分子の断片化もしくは切断の結果として得られた核酸分子またはそれらの増幅産物セグメントのみを指す。用語「増幅（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）」は、本明細書で使用する場合、試料中の標的核酸を、標的核酸またはそのセグメントと同じまたは実質的に同じヌクレオチド配列を有するアンプリコン核酸を線形にまたは指数関数的に生成する処理に付すことを指す。特定の実施形態では、用語「増幅」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む方法を指す。例えば、増幅産物は、核酸鋳型配列の増幅されるヌクレオチド領域よりもヌクレオチドを１つまたは複数多く含有することができる（例えば、プライマーは、核酸鋳型遺伝子分子に相補的なヌクレオチドに加えて、「余分な」ヌクレオチド、例として、転写開始配列を含有することができ、その結果、「余分な」ヌクレオチド、または核酸鋳型遺伝子分子のうちの増幅されるヌクレオチド領域に対応しないヌクレオチドを含有する増幅産物が生じる）。したがって、断片は、表示される核酸鋳型分子から得られたまたはそれに基づくヌクレオチド配列情報を、少なくとも一部において含有する、増幅された核酸分子のセグメントまたは一部分から生じる断片を含むことができる。
本明細書で使用する場合、用語「補完的切断反応」は、異なる切断試薬を使用して、または同じ切断試薬の切断特異性を変化させることによって、同じ核酸に対して行われる切断反応を指し、したがって、同じ標的または参照の核酸またはタンパク質の代替の切断パターンを生成させる。特定の実施形態では、核酸を、１つまたは複数の反応槽中で、１つまたは複数の特異的切断剤（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ超の特異的切断剤）を用いて処理することができる（例えば、核酸を、別個の槽中でそれぞれの特異的切断剤を用いて処理する）。用語「特異的切断剤」は、本明細書で使用する場合、核酸を１つまたは複数の特異的な部位において切断することができる作用剤、時には、化学物質または酵素を指す。
また、本明細書に記載する方法に核酸を提供する前に、核酸中の特定のヌクレオチドを改変する処理に、核酸を曝露させることができる。例えば、核酸を、その中のヌクレオチドのメチル化状況に基づいて選択的に改変する処理を、核酸に適用することができる。加えて、高温、紫外線照射、Ｘ線照射等の条件が、核酸分子の配列中に変化を引き起こすことができる。核酸を、適切な配列分析を行うのに有用な任意の適切な形態で提供することができる。
核酸は、一本鎖であっても、または二本鎖であってもよい。例えば、二本鎖ＤＮＡを、例えば、加熱またはアルカリを用いる処理により変性させることによって、一本鎖ＤＮＡを生成することができる。特定の実施形態では、核酸は、二重鎖ＤＮＡ分子の鎖へオリゴヌクレオチドを侵入させることによって形成されるＤ−ループ構造で存在するか、またはＤＮＡ様分子、例として、ペプチド核酸（ＰＮＡ）で存在する。Ｄループの形成は、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＲｅｃＡタンパク質を添加すること、および／または塩濃度を、例えば、当技術分野で公知の方法を使用して変化させることによって促進することができる。
ゲノム標的
一部の実施形態では、本明細書ではまた、標的断片とも称する、標的核酸は、特定のゲノム領域または複数のゲノム領域（例えば、単一の染色体、染色体のセット、および／またはある特定の染色体領域）に由来するポリヌクレオチド断片を含む。一部の実施形態では、このようなゲノム領域は、胎児の遺伝子異常（例えば、異数性）のほか、変異（例えば、点変異）、挿入、付加、欠失、転座、トリヌクレオチドリピート障害、および／または一塩基多型（ＳＮＰ）を含むがこれらに限定されない、他の遺伝子の変動と関連しうる。一部の実施形態では、本明細書ではまた、参照断片とも称する、参照核酸は、特定のゲノム領域または複数のゲノム領域に由来するポリヌクレオチド断片であって、胎児の遺伝子異常と関連しないポリヌクレオチド断片を含む。一部の実施形態では、標的核酸および／または参照核酸（すなわち、標的断片および／または参照断片）は、目的の染色体または参照染色体に実質的にユニークな（例えば、同一なヌクレオチド配列または実質的に同様なヌクレオチド配列が、ゲノム中の別の場所に見出されない）ヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、複数のゲノム領域に由来する断片をアッセイする。一部の実施形態では、複数のゲノム領域に由来する、標的断片および参照断片をアッセイする。一部の実施形態では、複数のゲノム領域に由来する断片をアッセイして、例えば、目的の染色体の存在、非存在、量（例えば、相対量）または比を決定する。一部の実施形態では、目的の染色体は、異数体であることが疑われる染色体であり、本明細書では、「試験染色体」と称する場合がある。一部の実施形態では、複数のゲノム領域に由来する断片を、正倍数体と推定される染色体についてアッセイする。本明細書では、このような染色体を、「参照染色体」と称する場合がある。一部の実施形態では、複数の試験染色体についてアッセイする。一部の実施形態では、試験染色体を、第１３染色体（Ｃｈｒ１３：ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １３）、第１８染色体（Ｃｈｒ１８）、および第２１染色体（Ｃｈｒ２１）の中から選択する。一部の実施形態では、参照染色体を、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、ＸおよびＹ染色体の中から選択し、場合によって、参照染色体を、常染色体（すなわち、Ｘ染色体およびＹ染色体以外の染色体）から選択する。一部の実施形態では、第２０染色体（Ｃｈｒ２０）を、参照染色体として選択する。一部の実施形態では、第１４染色体を、参照染色体として選択する。一部の実施形態では、第９染色体を、参照染色体として選択する。一部の実施形態では、試験染色体および参照染色体は、同じ個体に由来する。一部の実施形態では、試験染色体および参照染色体は、異なる個体に由来する。
一部の実施形態では、少なくとも１つのゲノム領域に由来する断片を、試験染色体および／または参照染色体についてアッセイする。一部の実施形態では、少なくとも１０のゲノム領域（例えば、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０のゲノム領域）に由来する断片を、試験染色体および／または参照染色体についてアッセイする。一部の実施形態では、少なくとも１００のゲノム領域（例えば、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、または９００のゲノム領域）に由来する断片を、試験染色体および／または参照染色体についてアッセイする。一部の実施形態では、少なくとも１，０００のゲノム領域（例えば、約２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、または９０００のゲノム領域）に由来する断片を、試験染色体および／または参照染色体についてアッセイする。一部の実施形態では、少なくとも１０，０００のゲノム領域（例えば、約２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、または９０，０００のゲノム領域）に由来する断片を、試験染色体および／または参照染色体についてアッセイする。一部の実施形態では、少なくとも１００，０００のゲノム領域（例えば、約２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、または９００，０００のゲノム領域）に由来する断片を、試験染色体および／または参照染色体についてアッセイする。
核酸の亜集団の富化および分離
一部の実施形態では、核酸（例えば、細胞外核酸）を、富化し、または相対的に富化して、核酸の亜集団または種を得る。核酸の亜集団は、例えば、胎児核酸、母体核酸、特定の長さもしくは特定の範囲の長さの断片を含む核酸、または特定のゲノム領域（例えば、単一の染色体、一連の染色体および／もしくは特定の染色体領域）に由来する核酸を含むことができる。そのような富化試料は、本明細書に提供する方法と併せて使用することができる。したがって、特定の実施形態では、本技術の方法は、試料中の核酸の亜集団、例えば、胎児核酸等について富化する追加のステップを含む。特定の実施形態では、富化して、胎児核酸を得るために、本明細書において記載された、胎児フラクションを決定するための方法もまた使用することができる。特定の実施形態では、母体核酸を、試料から、選択的に（部分的に、実質的に、ほとんど完全に、または完全に）除去する。特定の実施形態では、富化して、特定の低いコピー数の種の核酸（例えば、胎児核酸）を得ることによって、定量的感度を改善することができる。試料を核酸の特定の種について富化するための方法が、例えば、米国特許第６，９２７，０２８号、国際特許出願公開第ＷＯ２００７／１４０４１７号、国際特許出願公開第ＷＯ２００７／１４７０６３号、国際特許出願公開第ＷＯ２００９／０３２７７９号、国際特許出願公開第ＷＯ２００９／０３２７８１号、国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／０３３６３９号、国際特許出願公開第ＷＯ２０１１／０３４６３１号、国際特許出願公開第ＷＯ２００６／０５６４８０号および国際特許出願公開第ＷＯ２０１１／１４３６５９号に記載されており、これらは全て、参照により本明細書に援用されている。
一部の実施形態では、核酸を富化して、特定の標的断片種および／または参照断片種を得る。特定の実施形態では、下記に記載する１つまたは複数の、長さに基づく分離の方法を使用して、核酸を富化して、特定の核酸の断片長または特定の範囲の断片長を得る。特定の実施形態では、本明細書に記載するおよび／または当技術分野で公知である１つまたは複数の、配列に基づく分離方法を使用して、核酸を富化して、選択ゲノム領域（例えば、染色体）に由来する断片を得る。下記に、試料中の核酸の亜集団（例えば、胎児核酸）について富化するための特定の方法を詳細に記載する。
本明細書に記載する方法と共に使用することができる、核酸の亜集団（例えば、胎児核酸）について富化するためのいくつかの方法は、母体核酸と胎児核酸との間のエピジェネティックな差を活用する方法を含む。例えば、メチル化の差に基づいて、胎児核酸を、母体核酸と差別化し、それから分離することができる。メチル化に基づく胎児核酸の富化方法が、参照により本明細書に援用されている米国特許出願公開第２０１０／０１０５０４９号に記載されている。そのような方法は時には、試料核酸を、メチル化特異的結合剤（メチル−ＣｐＧ結合タンパク質（ＭＢＤ）、メチル化特異的抗体等）に結合させるステップと、差次的メチル化状況に基づいて、未結合の核酸から、結合した核酸を分離するステップとを含む。そのような方法はまた、メチル化感受性制限酵素（上記に記載のとおり；例えば、ＨｈａＩおよびＨｐａＩＩ）の使用を含むこともでき、この方法により、母体核酸を選択的かつ完全または実質的に消化して、試料を少なくとも１つの胎児核酸の領域について富化する酵素を用いて、母体試料に由来する核酸を選択的に消化することによって、母体試料中の胎児核酸の領域の富化が可能になる。
本明細書に記載する方法と共に使用することができる、核酸の亜集団（例えば、胎児核酸）について富化するための別の方法が、参照により本明細書に援用されている米国特許出願公開第２００９／０３１７８１８号に記載の方法等の制限エンドヌクレアーゼにより多型配列を増強するアプローチである。そのような方法は、非標的対立遺伝子を含む核酸を、非標的対立遺伝子を含むが、標的対立遺伝子は含まない核酸を認識する制限エンドヌクレアーゼを用いて切断するステップと、切断された核酸は増幅せずに、未切断の核酸を増幅するステップとを含み、ここで、未切断の、増幅された核酸は、非標的核酸（例えば、母体核酸）と比べて富化された標的核酸（例えば、胎児核酸）を表す。特定の実施形態では、例えば、切断剤による選択的消化を受けやすい多型の部位を有する対立遺伝子を含むように、核酸を選択することができる。
本明細書に記載する方法と共に使用することができる、核酸の亜集団（例えば、胎児核酸）について富化するためのいくつかの方法は、選択的酵素分解のアプローチを含む。そのような方法は、エキソヌクレアーゼ消化から標的配列を保護し、それにより、試料中の望まれない配列（例えば、母体のＤＮＡ）の排除を促進するステップを含む。例えば、１つのアプローチでは、試料核酸を変性させて、一本鎖核酸を生成し、一本鎖核酸を、適切なアニーリング条件下で、少なくとも１つの、標的特異的プライマーの対と接触させ、アニールさせたプライマーを、ヌクレオチドの重合により伸長して、二本鎖標的配列を生成し、一本鎖（すなわち、非標的）の核酸を消化するヌクレアーゼを使用して、一本鎖核酸を消化する。特定の実施形態では、少なくとも１回の追加のサイクルにおいて、この方法を繰り返すことができる。特定の実施形態では、同じ、標的特異的プライマーの対を使用して、第１サイクルおよび第２サイクルのそれぞれにおいてプライマーの伸長を行い、特定の実施形態では、第１サイクルおよび第２サイクルのために、異なる、標的特異的プライマーの対を使用する。
一部の実施形態では、本明細書で記載される、１つまたは複数の配列ベースの分離法を使用して、核酸を、選択ゲノム領域（例えば、染色体）に由来する断片について富化する。一部の実施形態では、長さベースの分離法と、配列ベースの分離法との組合せを使用して、核酸を、特異的なポリヌクレオチド断片の長さまたは断片の長さの範囲と、選択ゲノム領域（例えば、染色体）に由来する断片とについて富化する。このような長さベースの分離法および配列ベースの分離法については、下記でさらに詳細に記載する。
本明細書に記載する方法と共に使用することができる、核酸の亜集団（例えば、胎児核酸）について富化するためのいくつかの方法は、大規模並行シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）のアプローチを含む。ＭＰＳＳは典型的には、アダプター（すなわち、タグ）のライゲーションを使用し、続いて、アダプターのデコーディングを行い、核酸配列をこきざみに読み取る固相法である。典型的には、タグを付けたＰＣＲ産物が増幅され、結果として、それぞれの核酸から、ユニークなタグを有するＰＣＲ産物が生成する。しばしば、ＰＣＲ産物をマイクロビーズにつなぐために、タグを使用する。ライゲーションに基づく配列決定を数ラウンド行った後に、例えば、配列のシグネチャーを、それぞれのビーズから同定することができる。ＭＰＳＳデータセット中のそれぞれのシグネチャー配列（ＭＰＳＳタグ）を、分析し、全てのその他のシグネチャーと比較し、全ての同一のシグネチャーを計数する。
特定の実施形態では、特定の富化方法（例えば、特定の、ＭＰＳおよび／またはＭＰＳＳに基づく富化方法）は、増幅（例えば、ＰＣＲ）に基づくアプローチを含むことができる。特定の実施形態では、座位に特異的な増幅方法を使用することができる（例えば、座位に特異的な増幅プライマーを使用する）。特定の実施形態では、マルチプレックスＳＮＰ対立遺伝子ＰＣＲのアプローチを使用することができる。特定の実施形態では、マルチプレックスＳＮＰ対立遺伝子ＰＣＲのアプローチを、ユニプレックス配列決定と組み合わせて使用することができる。例えば、そのようなアプローチは、マルチプレックスＰＣＲ（例えば、ＭＡＳＳＡＲＲＡＹシステム）の使用、および捕捉プローブ配列のアンプリコン中への組み入れ、続いて、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭＰＳＳシステムを使用する配列決定を含むことができる。特定の実施形態では、マルチプレックスＳＮＰ対立遺伝子ＰＣＲのアプローチを、３つのプライマーからなるシステムおよびインデックス化配列決定と組み合わせて使用することができる。例えば、そのようなアプローチは、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭＰＳＳシステムを使用する配列決定のために、特定の座位に特異的なフォワードＰＣＲプライマー中に組み入れた第１の捕捉プローブ、および座位に特異的なリバースＰＣＲプライマー中に組み入れたアダプター配列を有するプライマーを用いる、マルチプレックスＰＣＲ（例えば、ＭＡＳＳＡＲＲＡＹシステム）を使用し、それにより、アンプリコンを生成し、続いて、リバース捕捉配列および分子インデックスバーコードを組み入れるための第２のＰＣＲを行うことを含むことができる。特定の実施形態では、マルチプレックスＳＮＰ対立遺伝子ＰＣＲのアプローチを、４つのプライマーからなるシステムおよびインデックス化配列決定と組み合わせて使用することができる。例えば、そのようなアプローチは、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭＰＳＳシステムを使用する配列決定のために、座位に特異的なフォワードＰＣＲプライマーおよび座位に特異的なリバースＰＣＲプライマーの両方中に組み入れたアダプター配列を有するプライマーを用いる、マルチプレックスＰＣＲ（例えば、ＭＡＳＳＡＲＲＡＹシステム）を使用し、続いて、フォワード捕捉配列およびリバース捕捉配列の両方ならびに分子インデックスバーコードを組み入れるための第２のＰＣＲを行うことを含むことができる。特定の実施形態では、マイクロ流体技術のアプローチを使用することができる。特定の実施形態では、アレイに基づくマイクロ流体技術のアプローチを使用することができる。例えば、そのようなアプローチは、マイクロ流体技術によるアレイ（例えば、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を使用して、低いプレックスでの増幅ならびにインデックスおよび捕捉プローブの組み入れを行い、続いて、配列決定を行うことを含むことができる。特定の実施形態では、例えば、デジタル小滴ＰＣＲ等のエマルジョンマイクロ流体技術のアプローチを使用することができる。
特定の実施形態では、（例えば、ユニバーサルプライマーまたは座位に特異的でない増幅プライマーを使用して）ユニバーサル増幅法を使用することができる。特定の実施形態では、ユニバーサル増幅法を、プルダウンのアプローチと組み合わせて使用することができる。特定の実施形態では、方法は、ユニバーサルに増幅された配列決定ライブラリーからのビオチン化ウルトラマーによるプルダウン（例えば、ＡｇｉｌｅｎｔまたはＩＤＴ製のビオチン化プルダウンアッセイ）を含むことができる。例えば、そのようなアプローチは、標準ライブラリーの調製、プルダウンアッセイによる選択された領域についての富化、および第２のユニバーサル増幅のステップを含むことができる。特定の実施形態では、プルダウンのアプローチは、ライゲーションに基づく方法と組み合わせて使用することができる。特定の実施形態では、方法は、配列特異的アダプターのライゲーションを用いるビオチン化ウルトラマーによるプルダウン（例えば、ＨＡＬＯＰＬＥＸ ＰＣＲ、Ｈａｌｏ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を含むことができる。例えば、そのようなアプローチは、制限酵素消化断片を捕捉するためのセレクタープローブの使用、続いて、捕捉された産物のアダプターへのライゲーション、およびユニバーサル増幅、続いて、配列決定を含むことができる。特定の実施形態では、プルダウンのアプローチを、伸長およびライゲーションに基づく方法と組み合わせて使用することができる。特定の実施形態では、方法は、分子反転プローブ（ＭＩＰ）による伸長およびライゲーションを含むことができる。例えば、そのようなアプローチは、配列アダプターと組み合わせた分子反転プローブの使用、続いて、ユニバーサル増幅および配列決定を含むことができる。特定の実施形態では、相補的ＤＮＡを、合成し、増幅せずに配列決定することができる。
特定の実施形態では、伸長およびライゲーションのアプローチを、プルダウンのコンポーネントなしで行うことができる。特定の実施形態では、方法は、座位に特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーによるハイブリダイゼーション、伸長、ならびにライゲーションを含むことができる。そのような方法は、ユニバーサル増幅、または増幅なしの相補的ＤＮＡ合成、続いて、配列決定をさらに含むことができる。特定の実施形態では、そのような方法は、分析の間のバックグラウンドの配列を低下させるまたは排除することができる。
特定の実施形態では、プルダウンのアプローチを、任意選択の増幅コンポーネントを伴わせて、または増幅コンポーネントなしで使用することができる。特定の実施形態では、方法は、改変されたプルダウンアッセイおよびライゲーションを含むことができ、捕捉プローブを十分に組み入れ、ユニバーサル増幅は行わない。例えば、そのようなアプローチは、制限酵素消化断片を捕捉するための、改変されたセレクタープローブの使用、続いて、捕捉された産物のアダプターへのライゲーション、任意選択の増幅、および配列決定を含むことができる。特定の実施形態では、方法は、環状一本鎖ライゲーションと組み合わせた、アダプター配列の伸長およびライゲーションを伴う、ビオチン化プルダウンアッセイを含むことができる。例えば、そのようなアプローチは、目的の捕捉領域（すなわち、標的配列）に対するセレクタープローブの使用、プローブの伸長、アダプターのライゲーション、一本鎖環状ライゲーション、任意選択の増幅、および配列決定を含むことができる。特定の実施形態では、配列決定の結果の分析により、バックグラウンドから標的配列を分離することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載する１つまたは複数の、配列に基づく分離方法を使用して、核酸を富化して、選択ゲノム領域（例えば、染色体）に由来する断片を得る。配列に基づく分離は一般に、ヌクレオチド配列が、目的の断片（例えば、標的断片および／または参照断片）中には存在し、試料のその他の断片中に実質的に存在しない、またはその他の断片はごくわずかな量でしか存在しない（例えば、５％もしくはそれ未満）ことに基づく。一部の実施形態では、配列に基づく分離は、標的断片の分離および／または参照断片の分離をもたらすことができる。分離された標的断片および／または分離された参照断片をしばしば、核酸試料中の残存する断片から単離し、取り出す。特定の実施形態では、また、分離された標的断片と分離された参照断片とを、相互に単離し、取り出す（例えば、分離アッセイのコンパートメントとして単離する）。特定の実施形態では、分離された標的断片と分離された参照断片とを、一緒に単離する（例えば、同じアッセイコンパートメントとして単離する）。一部の実施形態では、未結合断片を、分別的に除去または分解または消化することができる。
一部の実施形態では、選択的に核酸を捕捉する処理を使用して、核酸試料から、標的断片および／または参照断片を分離し、取り出す。市販されている、核酸を捕捉するシステムとして、例えば、Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ配列捕捉システム（Ｒｏｃｈｅ ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）；Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢＥＡＤＡＲＲＡＹプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰプラットフォーム（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）；Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）；および関連のプラットフォームが挙げられる。そのような方法は典型的には、標的断片または参照断片のヌクレオチド配列のセグメントまたは全てに対する捕捉オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを含み、固相（例えば、固相アレイ）および／または溶液に基づくプラットフォームの使用を含むことができる。選択されたゲノム領域または座位（例えば、第２１、１８、１３、ＸもしくはＹ染色体のうちの１つ、または参照の染色体）に由来する核酸断片に優先的にハイブリダイズするように、捕捉オリゴヌクレオチド（時には、「おとり」と呼ぶ）を、選択するまたは設計することができる。特定の実施形態では、（例えば、オリゴヌクレオチドアレイを使用する）ハイブリダイゼーションに基づく方法を使用し、富化して、特定の染色体（例えば、潜在的に異数体の染色体、参照の染色体、もしくは目的のその他の染色体）、またはそれらの目的のセグメントに由来する核酸配列を得ることができる。
捕捉オリゴヌクレオチドは、目的の核酸断片（例えば、標的断片、参照断片）またはその部分とハイブリダイズまたはアニールすることが可能なヌクレオチド配列を含むことが典型的である。捕捉オリゴヌクレオチドは、天然に存在するオリゴヌクレオチドの場合もあり、合成のオリゴヌクレオチドの場合もあり、ＤＮＡベースの場合もあり、ＲＮＡベースの場合もある。捕捉オリゴヌクレオチドは、例えば、標的断片および／または参照断片の、核酸試料中の他の断片からの特異的な分離を可能としうる。本明細書で使用される「特異的」または「特異性」という用語は、標的ポリヌクレオチドに対するオリゴヌクレオチドなど、１つの分子の別の分子への結合またはハイブリダイゼーションを指す。「特異的」または「特異性」とは、２つの分子の間の、これらの２つの分子の一方の、他の分子との、実質的に弱い認識、弱い接触、または弱い複合体の形成と比較した、認識、接触、および安定的な複合体の形成を指す。本明細書で使用される「アニールする」という用語は、２つの分子の間の、安定的な複合体の形成を指す。「捕捉オリゴヌクレオチド」、「捕捉オリゴ」、「オリゴ」、または「オリゴヌクレオチド」という用語は、捕捉オリゴヌクレオチドを指す場合、本明細書を通して互換的に使用されうる。オリゴヌクレオチドについての以下の特徴は、本明細書で提供されるプローブなど、プライマーおよび他のオリゴヌクレオチドへと適用することができる。
捕捉オリゴヌクレオチドは、適切な処理を使用して、デザインおよび合成することができ、目的のヌクレオチド配列とハイブリダイズさせ、本明細書で記載される分離処理および／または分析処理を行うのに適する任意の長さでありうる。オリゴヌクレオチドは、目的のヌクレオチド配列（例えば、標的断片配列、参照断片配列）に基づきデザインすることができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１０〜約３００ヌクレオチド、約１０〜約１００ヌクレオチド、約１０〜約７０ヌクレオチド、約１０〜約５０ヌクレオチド、約１５〜約３０ヌクレオチド、または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ヌクレオチドの長さでありうる。オリゴヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチドおよび／もしくは天然に存在しないヌクレオチド（例えば、標識されたヌクレオチド）、またはこれらの混合物からなりうる。本明細書で記載される実施形態での使用に適するオリゴヌクレオチドは、公知の技法を使用して合成および標識することができる。オリゴヌクレオチドは、BeaucageおよびCaruthers（１９８１年）、Tetrahedron Letts.、２２巻：１８５９〜１８６２頁により最初に記載された、固相ホスホルアミダイトトリエステル法に従って、自動式合成器を使用することにより化学合成することもでき、かつ／またはNeedham-VanDevanterら（１９８４年）、Nucleic Acids Res.、１２巻：６１５９〜６１６８頁において記載されている通りに化学合成することもできる。オリゴヌクレオチドの精製は、例えば、PearsonおよびRegnier（１９８３年）、J. Chrom.、２５５巻：１３７〜１４９頁において記載されている通り、ネイティブアクリルアミドゲル電気泳動またはアニオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により実行することができる。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド配列（天然に存在するまたは合成の）の全部または部分は、標的断片配列および／もしくは参照断片配列、またはこれらの部分と実質的に相補的でありうる。本明細書で配列に関して言及される場合の「実質的に相補的」とは、互いとハイブリダイズするヌクレオチド配列を指す。ハイブリダイゼーション条件の厳密性は、種々の量の配列ミスマッチを許容するように変化させることができる。５５％もしくはそれ超、５６％もしくはそれ超、５７％もしくはそれ超、５８％もしくはそれ超、５９％もしくはそれ超、６０％もしくはそれ超、６１％もしくはそれ超、６２％もしくはそれ超、６３％もしくはそれ超、６４％もしくはそれ超、６５％もしくはそれ超、６６％もしくはそれ超、６７％もしくはそれ超、６８％もしくはそれ超、６９％もしくはそれ超、７０％もしくはそれ超、７１％もしくはそれ超、７２％もしくはそれ超、７３％もしくはそれ超、７４％もしくはそれ超、７５％もしくはそれ超、７６％もしくはそれ超、７７％もしくはそれ超、７８％もしくはそれ超、７９％もしくはそれ超、８０％もしくはそれ超、８１％もしくはそれ超、８２％もしくはそれ超、８３％もしくはそれ超、８４％もしくはそれ超、８５％もしくはそれ超、８６％もしくはそれ超、８７％もしくはそれ超、８８％もしくはそれ超、８９％もしくはそれ超、９０％もしくはそれ超、９１％もしくはそれ超、９２％もしくはそれ超、９３％もしくはそれ超、９４％もしくはそれ超、９５％もしくはそれ超、９６％もしくはそれ超、９７％もしくはそれ超、９８％もしくはそれ超、または９９％もしくはそれ超が互いと相補的な標的配列／参照配列およびオリゴヌクレオチド配列が含まれる。
目的の核酸配列（例えば、標的断片配列、参照断片配列）またはその部分と実質的に相補的なオリゴヌクレオチドはまた、標的核酸配列またはその関与性の部分の相補体とも実質的に同様（例えば、核酸のアンチセンス鎖と実質的に同様）である。２つのヌクレオチド配列が実質的に同様であるのかどうかを決定するための１つの試験は、共有された同一なヌクレオチド配列のパーセントを決定することである。配列に関して本明細書で言及される場合の「実質的に同様」とは、５５％もしくはそれ超、５６％もしくはそれ超、５７％もしくはそれ超、５８％もしくはそれ超、５９％もしくはそれ超、６０％もしくはそれ超、６１％もしくはそれ超、６２％もしくはそれ超、６３％もしくはそれ超、６４％もしくはそれ超、６５％もしくはそれ超、６６％もしくはそれ超、６７％もしくはそれ超、６８％もしくはそれ超、６９％もしくはそれ超、７０％もしくはそれ超、７１％もしくはそれ超、７２％もしくはそれ超、７３％もしくはそれ超、７４％もしくはそれ超、７５％もしくはそれ超、７６％もしくはそれ超、７７％もしくはそれ超、７８％もしくはそれ超、７９％もしくはそれ超、８０％もしくはそれ超、８１％もしくはそれ超、８２％もしくはそれ超、８３％もしくはそれ超、８４％もしくはそれ超、８５％もしくはそれ超、８６％もしくはそれ超、８７％もしくはそれ超、８８％もしくはそれ超、８９％もしくはそれ超、９０％もしくはそれ超、９１％もしくはそれ超、９２％もしくはそれ超、９３％もしくはそれ超、９４％もしくはそれ超、９５％もしくはそれ超、９６％もしくはそれ超、９７％もしくはそれ超、９８％もしくはそれ超、または９９％もしくはそれ超が互いと同一なヌクレオチド配列を指す。
アニーリング条件（例えば、ハイブリダイゼーション条件）は、アッセイで使用されるオリゴヌクレオチドの特徴に応じて決定および／または調整することができる。オリゴヌクレオチドの配列および／または長さは、場合によって、目的の核酸配列とのハイブリダイゼーションに影響を及ぼしうる。オリゴヌクレオチドと目的の核酸とのミスマッチの程度に応じて、低度、中程度、または高度な厳密性条件を使用して、アニーリングを実行することができる。本明細書で使用される「厳密な条件」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を指す。当技術分野では、ハイブリダイゼーション反応の温度条件を最適化するための方法が公知であり、Current Protocols in Molecular Biology、JohnWiley & Sons、N.Y.、６．３．１〜６．３．６（１９８９年）において見出すことができる。この参考文献では、水性法および非水性法について記載されており、いずれも使用することができる。厳密なハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、約４５℃で６Ｘの塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーションに続く、５０℃で０．２ＸのＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中の、１回または複数回の洗浄である。厳密なハイブリダイゼーション条件の別の例は、約４５℃で６Ｘの塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーションに続く、５５℃で０．２ＸのＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中の、１回または複数回の洗浄である。厳密なハイブリダイゼーション条件のさらなる例は、約４５℃で６Ｘの塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーションに続く、６０℃で０．２ＸのＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中の、１回または複数回の洗浄である。厳密なハイブリダイゼーション条件は、約４５℃で６Ｘの塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーションに続く、６５℃で０．２ＸのＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中の、１回または複数回の洗浄であることが多い。厳密性条件は、６５℃で０．５Ｍのリン酸ナトリウム、７％のＳＤＳに続く、６５℃で０．２ＸのＳＳＣ、１％のＳＤＳ中の１回または複数回の洗浄であることがさらに多い。厳密なハイブリダイゼーション温度はまた、ある特定の有機溶媒、例えば、ホルムアミドを添加することにより変化させる（すなわち、低下させる）こともできる。厳密な条件をやはり維持し、熱に不安定性でありうる核酸の有用な寿命を延長しながら、ハイブリダイゼーションを低温で行いうるように、ホルムアミドなどの有機溶媒により、二本鎖ポリヌクレオチドの熱安定性を低減する。
本明細書で使用される、「ハイブリダイズすること」という語句またはその文法的変化形は、第１の核酸分子が、第２の核酸分子と、低度、中程度、もしくは高度な厳密性条件下で、または核酸合成条件下でアニールすることを指す。ハイブリダイズすることは、第１の核酸分子が、第２の核酸分子とアニールする場合、第１の核酸分子と第２の核酸分子とが相補的である場合を含みうる。本明細書で使用される「特異的にハイブリダイズする」とは、オリゴヌクレオチドの、核酸合成条件下における、オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有する核酸分子との、相補的な配列を有さない核酸分子とのハイブリダイゼーションと比較して優先的なハイブリダイゼーションを指す。例えば、特異的なハイブリダイゼーションは、捕捉オリゴヌクレオチドの、該オリゴヌクレオチドと相補的な標的断片配列とのハイブリダイゼーションを含む。
一部の実施形態では、１つまたは複数の捕捉オリゴヌクレオチドは、結合対のメンバー（例えば、ビオチン）または抗原などのアフィニティーリガンドであって、アビジン、ストレプトアビジン、抗体、または受容体などの捕捉剤に結合しうるアフィニティーリガンドと関連する。例えば、捕捉オリゴヌクレオチドは、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズへと捕捉しうるように、ビオチニル化することができる。
一部の実施形態では、１つまたは複数の捕捉オリゴヌクレオチドおよび／または捕捉剤を、固体支持体または固体基材へと効果的に連結する。固体支持体または固体基材は、捕捉オリゴヌクレオチドを直接的または間接的に接合させうる、任意の物理的に分離可能な固体であって、マイクロアレイおよびウェル、ならびに、ビーズ（例えば、常磁性ビーズ、磁性ビーズ、マイクロビーズ、ナノビーズ）、マイクロ粒子、およびナノ粒子などの粒子により提供される表面を含むがこれらに限定されない固体でありうる。固体支持体はまた、例えば、チップ、カラム、光ファイバー、ワイプ、フィルター（例えば、平面フィルター）、１つまたは複数のキャピラリー、ガラスおよび修飾ガラスまたは機能化ガラス（例えば、ＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ））、水晶、雲母、ジアゾ化膜（紙またはナイロン）、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、紙、セラミックス、金属、半金属、半導体材料、量子ドット、コーティングビーズまたはコーティング粒子、他のクロマトグラフィー材料、磁性粒子；プラスチック（アクリル、ポリスチレン、スチレンまたは他の材料のコポリマー、ポリブチレン、ポリウレタン、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）などを含む）、多糖、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、シリカまたはケイ素、シリカゲル、および修飾ケイ素を含むシリカベースの材料、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、炭素、金属（例えば、鉄鋼、金、銀、アルミニウム、ケイ素、および銅）、無機ガラス、導電性ポリマー（ポリピロールおよびポリインドールなどのポリマーを含む）；核酸タイリングアレイ、ナノチューブ、ナノワイヤー、またはナノ微粒子装飾表面など、マイクロ構造化表面またはナノ構造化表面；またはメタクリレート、アクリルアミド、糖ポリマー、セルロース、シリケートなどの多孔性表面もしくは多孔性ゲル、あるいは他の繊維状ポリマーもしくは直鎖状ポリマーも含みうる。一部の実施形態では、固体支持体または固体基材は、デキストラン、アクリルアミド、ゼラチン、またはアガロースなどのポリマーを含む任意の数の材料を伴う、受動的コーティングまたは化学的に誘導体化されたコーティングを使用して、コーティングすることができる。ビーズおよび／または粒子は、遊離の場合もあり、互いと連結する（例えば、焼結する）場合もある。一部の実施形態では、固相は、粒子のコレクションでありうる。一部の実施形態では、粒子は、シリカを含む場合があり、シリカは、二酸化ケイ素を含みうる。一部の実施形態では、シリカは、多孔性の場合があり、ある特定の実施形態では、シリカは、非多孔性の場合がある。一部の実施形態では、粒子は、常磁性特性を粒子に付与する剤をさらに含む。ある特定の実施形態では、剤は、金属を含み、ある特定の実施形態では、剤は、金属酸化物（例えば、鉄または酸化鉄であり、ここで、酸化鉄は、Ｆｅ２＋とＦｅ３＋との混合物を含有する）である。オリゴヌクレオチドは、固体支持体へと、共有結合により連結することもでき、非共有結合的相互作用により連結することもでき、固体支持体へと、直接的に連結することもでき、間接的に連結する（例えば、スペーサー分子またはビオチンなどの仲介剤を介して）こともできる。プローブは、核酸捕捉の前に、間に、または後に固体支持体へと連結することができる。
一部の実施形態では、１つまたは複数の、長さに基づく分離の方法を使用して、核酸を、特定の核酸断片の長さ、特定の範囲の長さ、または特定の閾もしくはカットオフを下回るもしくは上回る長さについて富化する。核酸断片の長さは典型的には、断片中のヌクレオチドの数を指す。また、核酸断片の長さは時には、核酸断片のサイズとも呼ぶ。一部の実施形態では、長さに基づく分離の方法を、個々の断片の長さを測定することなく実施する。一部の実施形態では、長さに基づく分離の方法を、個々の断片の長さを決定するための方法と併せて実施する。一部の実施形態では、長さに基づく分離は、サイズ分画の手順を指し、分画されたプールの全部または一部を、単離（例えば、保持）および／または分析することができる。サイズ分画の手順は、当技術分野で公知である（例えば、アレイ上での分離、分子ふるいによる分離、ゲル電気泳動による分離、カラムクロマトグラフィー（例えば、分子ふるいカラム）による分離、およびマイクロ流体技術に基づくアプローチ）。特定の実施形態では、長さに基づく分離のアプローチとして、例えば、断片の環状化、化学物質による処理（例えば、ホルムアルデヒド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、質量分析、および／またはサイズに特異的な核酸増幅を挙げることができる。
一部の実施形態では、ある特定の長さ、長さの範囲、または特定の閾もしくはカットオフを下回るかもしくは上回る長さの核酸断片を、試料から分離する。一部の実施形態では、特定の閾またはカットオフ（例えば、５００ｂｐ、４００ｂｐ、３００ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ）を下回る長さを有する断片を、「短い」断片と称し、特定の閾またはカットオフ（例えば、５００ｂｐ、４００ｂｐ、３００ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ）を上回る長さを有する断片を、「長い」断片と称する。一部の実施形態では、ある特定の長さ、長さの範囲、または特定の閾もしくはカットオフを下回るかもしくは上回る長さの断片は、分析のために保持するが、異なる長さもしくは長さの範囲、または閾もしくはカットオフを上回るかもしくは下回る長さの断片は、分析のために保持しない。一部の実施形態では、約５００ｂｐ未満の断片を保持する。一部の実施形態では、約４００ｂｐ未満の断片を保持する。一部の実施形態では、約３００ｂｐ未満の断片を保持する。一部の実施形態では、約２００ｂｐ未満の断片を保持する。一部の実施形態では、約１５０ｂｐ未満の断片を保持する。例えば、約１９０ｂｐ、１８０ｂｐ、１７０ｂｐ、１６０ｂｐ、１５０ｂｐ、１４０ｂｐ、１３０ｂｐ、１２０ｂｐ、１１０ｂｐ、または１００ｂｐ未満の断片を保持する。一部の実施形態では、約１００ｂｐ〜約２００ｂｐの断片を保持する。例えば、約１９０ｂｐ、１８０ｂｐ、１７０ｂｐ、１６０ｂｐ、１５０ｂｐ、１４０ｂｐ、１３０ｂｐ、１２０ｂｐ、または１１０ｂｐの断片を保持する。一部の実施形態では、約１００ｂｐ〜約２００ｂｐの範囲の断片を保持する。例えば、約１１０ｂｐ〜約１９０ｂｐ、１３０ｂｐ〜約１８０ｂｐ、１４０ｂｐ〜約１７０ｂｐ、１４０ｂｐ〜約１５０ｂｐ、１５０ｂｐ〜約１６０ｂｐ、または１４５ｂｐ〜約１５５ｂｐの範囲の断片を保持する。一部の実施形態では、ある特定の長さまたは長さの範囲の他の断片より約１０ｂｐ〜約３０ｂｐ短い断片を保持する。一部の実施形態では、ある特定の長さまたは長さの範囲の他の断片より約１０ｂｐ〜約２０ｂｐ短い断片を保持する。一部の実施形態では、ある特定の長さまたは長さの範囲の他の断片より約１０ｂｐ〜約１５ｂｐ短い断片を保持する。
一部の実施形態では、核酸を、１つまたは複数のバイオインフォマティクスベースの（例えば、インシリコによる）方法を使用して、特定の核酸断片の長さ、長さの範囲、または特定の閾もしくはカットオフを下回るかもしくは上回る長さについて富化する。例えば、適切なヌクレオチド配列決定処理を使用して、ヌクレオチド配列の読取りを、核酸断片について得ることができる。ペアエンドシーケンシング法を使用する場合など、場合によって、特定の断片の長さは、断片の各末端から得られた、マッピングした配列の読取りの位置に基づき決定することができる。特定の分析（例えば、遺伝子の変動の存在または非存在を決定すること）のために使用された配列の読取りは、本明細書でさらに詳細に記載されている通り、対応する断片の１つまたは複数の選択された断片の長さまたは断片の長さの閾値に従って、富化またはフィルタリングすることができる。
本明細書に記載する方法と共に使用することができる、特定の長さに基づく分離の方法は、例えば、選択的な配列によるタグ付けのアプローチを時には利用する。用語「配列によるタグ付け」は、認識可能であり、かつ明確に異なる配列を、核酸または核酸の集団中に組み入れることを指す。用語「配列によるタグ付け」は、本明細書で使用する場合、本明細書で後に記載する用語「配列タグ」とは異なる意味を有する。そのような配列によるタグ付けの方法では、ある断片サイズの種（例えば、短い断片）の核酸を、長い核酸および短い核酸を含む試料中で、選択的な配列によるタグ付けに付す。そのような方法は典型的には、核酸増幅反応を、内側プライマーおよび外側プライマーを含むセットのネステッドプライマーを使用して実施するステップを含む。特定の実施形態では、内側プライマーの一方または両方にタグを付け、それにより、タグを標的の増幅産物上に導入することができる。外側プライマーは一般に、（内側の）標的配列を担持する短い断片にはアニールしない。内側プライマーは、短い断片にアニールし、タグおよび標的配列を担持する増幅産物を生成することができる。典型的には、長い断片のタグ付けは、例えば、外側プライマーの以前のアニーリングおよび伸長による、内側プライマーの伸長の遮断を含む、機構の組合せを通して阻害される。例えば、一本鎖核酸のエキソヌクレアーゼ消化、および少なくとも１つのタグに特異的な増幅プライマーを使用する、タグを付けた断片の増幅を含めた、多様な方法のうちのいずれかにより、タグを付けた断片についての富化を行うことができる。
本明細書に記載する方法と共に使用することができる、別の、長さに基づく分離の方法は、核酸試料を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿に付すステップを含む。方法の例として、国際特許出願公開第ＷＯ２００７／１４０４１７号および同第ＷＯ２０１０／１１５０１６号に記載されているものが挙げられる。この方法は一般に、小さな（例えば、３００ヌクレオチド未満の）核酸を実質的に沈澱させることなく、大きな核酸を実質的に沈殿させるのに十分な条件下において、１つまたは複数の一価の塩の存在下で、核酸試料をＰＥＧと接触させることを必要とする。
本明細書に記載する方法と共に使用することができる、別のサイズに基づく富化方法は、ライゲーション、例えば、ｃｉｒｃｌｉｇａｓｅを使用するライゲーションによる環状化を含む。短い核酸断片は典型的には、長い断片よりも高い効率で環状化させることができる。環状化しなかった配列を、環状化した配列から分離することができ、富化した短い断片を使用して、さらなる分析を行うことができる。
断片の長さの決定
一部の実施形態では、長さを、１つまたは複数の核酸断片について決定する。一部の実施形態では、長さを、１つまたは複数の標的断片について決定し、これにより、１つまたは複数の標的断片サイズの種を同定する。一部の実施形態では、長さを、１つまたは複数の標的断片および１つまたは複数の参照断片について決定し、これにより、１つまたは複数の標的断片長の種および１つまたは複数の参照断片長の種を同定する。一部の実施形態では、断片の長さは、断片とハイブリダイズするプローブの長さを測定することにより決定し、これについては、下記でさらに詳細に論じる。核酸断片または核酸プローブの長さは、例えば、質量についての高感度処理（例えば、質量分析（例えば、マトリックス支援レーザー脱着イオン化（ＭＡＬＤＩ：ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）質量分析、およびエレクトロスプレー（ＥＳ：ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）質量分析）、電気泳動（例えば、キャピラリー電気泳動）、顕微鏡法（走査型トンネル顕微鏡法、原子間力顕微鏡法）、ナノポアを使用する長さの測定、および配列ベースの長さの決定（例えば、ペアエンドシーケンシング）など、当技術分野における、核酸断片の長さを決定するのに適する任意の方法を使用して決定することができる。一部の実施形態では、断片またはプローブの長さは、断片の電荷に基づく分離法を使用せずに決定することができる。一部の実施形態では、断片またはプローブの長さは、電気泳動処理を使用せずに決定することができる。一部の実施形態では、断片またはプローブの長さは、ヌクレオチド配列決定処理を使用せずに決定することができる。
質量分析
一部の実施形態では、質量分析を使用して、核酸断片の長さを決定する。質量分析法は、核酸断片など、分子の質量を決定するのに使用することが典型的である。一部の実施形態では、核酸断片の長さは、断片の質量から外挿することができる。一部の実施形態では、核酸断片の長さの予測された範囲は、断片の質量から外挿することができる。一部の実施形態では、核酸断片の長さは、断片とハイブリダイズするプローブの質量から外挿することができ、これについては、下記でさらに詳細に記載する。一部の実施形態では、所与の長さの標的核酸および／または参照核酸の存在は、検出されたシグナルの質量を、標的断片および／または参照断片の期待質量と比較することにより確かめることができる。特定の核酸断片および／または断片の長さについての相対シグナル強度、例えば、スペクトル上の質量ピークは、場合によって、試料中の他の核酸中の断片種の相対集団を指し示し得る（例えば、Jurinkeら（２００４年）、Mol. Biotechnol.、２６巻、１４７〜１６４頁を参照されたい）。
質量分析は一般に、化合物をイオン化して、帯電分子または帯電分子断片を生成し、それらの質量対電荷比を測定することにより働く。典型的な質量分析手順は、（１）試料を質量分析装置上にロードした後で気化させるステップと、（２）帯電粒子（イオン）を結果としてもたらす、様々な方法（例えば、電子ビームにより衝撃を与える方法）のうちの任意の１つによる試料成分のイオン化ステップと、（３）電磁界による分析計内のそれらの質量対電荷比に従うイオンの分離ステップと、（４）イオンの検出ステップ（例えば、定量的方法による）と、（５）イオンシグナルの質量スペクトルへの処理ステップとを含む、いくつかのステップを伴う。
当技術分野では、質量分析法が周知であり（例えば、Burlingameら、Anal. Chem.、７０巻：６４７Ｒ〜７１６Ｒ頁（１９９８年）を参照されたい）、例えば、四重極質量分析、イオントラップ質量分析、飛行時間質量分析、ガスクロマトグラフィー質量分析、およびタンデム質量分析を含み、本明細書で記載される方法と共に使用することができる。質量分析法と関連する基本的なプロセスは、試料から導出される気相イオンの生成、およびそれらの質量の測定である。気相イオンの運動は、質量分析計内で生成された電磁界を使用して、正確に制御することができる。これらの電磁界内のイオンの運動は、イオンのｍ／ｚ（質量対電荷比）に比例し、これにより、ｍ／ｚを測定する基盤が形成され、したがって、試料の質量を測定する基盤が形成される。これらの電磁界内のイオンの運動は、質量分析の高感度の一因となる、イオンの封じ込めおよび集束を可能とする。ｍ／ｚ測定の経過中において、イオンは、これらのイオンの到来を記録する粒子検出器へと、高効率で伝送される。各ｍ／ｚにおけるイオンの量は、グラフ上のピークにより明示され、ここで、ｘ軸は、ｍ／ｚであり、ｙ軸は、相対存在度である。異なる質量分析計は、異なるレベルの分解能、すなわち、質量において近接するイオン間のピークを分解する能力を有する。分解能は、Ｒ＝ｍ／デルタｍ［式中、ｍは、イオン質量であり、デルタｍは、質量スペクトル中の２つのピークの間の質量の差違である］として規定される。例えば、分解能が１０００である質量分析計は、ｍ／ｚが１００．０であるイオンを、ｍ／ｚが１００．１であるイオンから分離しうる。
ある特定の質量分析法では、イオン源と質量分析器との多様な組合せを活用することができ、これにより、カスタマイズされた検出プロトコールのデザインにおける柔軟性が可能となる。一部の実施形態では、質量分析計をプログラムして、全てのイオンを、イオン源から質量分析計へと、逐次的に伝送することもでき、同時に伝送することもできる。一部の実施形態では、質量分析計をプログラムして、他のイオンを遮断しながら、特定の質量のイオンを、質量分析計への伝送のために選択することができる。
いくつかの種類の質量分析計が利用可能であり、多様な構成を伴う質量分析計を作製することができる。一般に、質量分析計は、以下の主要な構成要素：試料注入口、イオン源、質量分析器、検出器、真空システム、および装置制御システム、およびデータシステムを有する。試料注入口、イオン源、および質量分析器の差違は一般に、装置の種類およびその能力を規定する。例えば、注入口は、キャピラリーカラム液体クロマトグラフィー供給源の場合もあり、マトリックス支援レーザー脱離で使用されるなどの、ダイレクトプローブまたはステージの場合もある。一般的なイオン源は、例えば、ナノスプレーおよびマイクロスプレーを含むエレクトロスプレー、またはマトリックス支援レーザー脱離である。質量分析器は、例えば、四重極マスフィルター、イオントラップ質量分析器、および飛行時間質量分析器を含む。
イオン形成プロセスは、質量スペクトル分析の出発点である。いくつかのイオン化法が利用可能であり、イオン化法の選択は、分析のために使用される試料に依存する。例えば、ポリペプチドを分析するためには、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ：ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）など、比較的穏和なイオン化手順が望ましい場合がある。ＥＳＩのためには、試料を含有する溶液を、強く帯電させた液滴であって、質量分析計へと方向づけられた液滴の微細噴霧を結果としてもたらす、強力な電界を作り出す高電位にある細針内を通過させる。他のイオン化手順は、例えば、中性原子の高エネルギービームを使用して、固体試料に衝突させ、脱離およびイオン化を引き起こす高速原子衝撃法（ＦＡＢ）を含む。マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）とは、レーザーパルスを使用して、ＵＶ吸収化合物のマトリクス（例えば、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、アルファ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡ）、クエン酸二アンモニウム（ＤＡＣ）、およびこれらの組合せ）中で結晶化させた試料に衝突させる方法である。当技術分野で公知の他のイオン化手順は、例えば、プラズマおよびグロー放電、プラズマ脱離イオン化、共鳴イオン化、および二次イオン化を含む。
異なるイオン源と対をなしうる、様々な質量分析器が利用可能である。異なる質量分析器は、当技術分野で公知であり、本明細書で記載される、異なる利点を有する。質量分析計および検出のために選択される方法は、特定のアッセイに依存し、例えば、検出のために少量のイオンを生成する場合は、より高感度の質量分析器を使用することができる。質量分析器および質量分析法のいくつかの種類については、下記で記載する。
イオンモビリティー（ＩＭ：ｉｏｎ ｍｏｂｉｌｉｔｙ）質量分析とは、気相分離法である。ＩＭは、それらの衝突断面に基づき気相イオンを分離し、飛行時間（ＴＯＦ）質量分析とカップリングすることができる。ＩＭ−ＭＳは、Verbeckらにより、Journal of BiomolecularTechniques（１３巻、２号、５６〜６１頁）において、より詳細に論じられている。
四重極質量分析では、四重極マスフィルターまたは四重極質量分析器を活用する。この種類の質量分析器は、電気的に接続された２本のロッドの２つのセットとして配置された４本のロッドからなる。ｒｆ電圧とｄｃ電圧との組合せを各ロッド対へと印加すると、イオンがマスフィルターの始端から終端へと運動するときに、イオンの振動運動を引き起こす電界がもたらされる。これらの電界の結果が、ロッドの一方の対におけるハイパスマスフィルター、およびロッドの他方の対におけるローパスフィルターの生成である。ハイパスフィルターとローパスフィルターとの間をオーバーラップさせることにより、両方のフィルターを通過し、四重極の全長を縦断しうる、規定されたｍ／ｚが残される。このｍ／ｚは、選択され、四重極マスフィルター内で安定性を維持するが、他の全てのｍ／ｚは、不安定な軌道をとり、マスフィルター内にとどまらない。印加電界を上げ、それにより増えているｍ／ｚを選択して、マスフィルターを通過させ、検出器に到達させることによる質量スペクトルを得る。加えて、四重極はまた、ｒｆのみの電界を印加することにより、全てのｍ／ｚのイオンを封じ込め、伝送するように設定することもできる。これにより、四重極は、イオン伝送がマスフィルタリングを伴わずに必要とされる質量分析計の領域で、レンズまたは集束システムとして機能することが可能となる。
四重極質量分析器のほか、本明細書で記載される他の質量分析器も、規定されたｍ／ｚまたは質量範囲を分析するようにプログラムすることができる。核酸断片の所望の質量範囲は既知であるので、場合によって、高質量範囲または低質量範囲のイオンを排除しながら、推定される正確な質量範囲のイオンを伝送するように、質量分析計をプログラムすることができる。質量範囲を選択する能力は、アッセイ中のバックグラウンドノイズを減少させ、これにより、シグナル対ノイズ比を増加させうる。したがって、場合によって、質量分析計は、分離ステップのほか、ある特定の質量を識別可能な核酸断片の検出および同定を達成しうる。
イオントラップ質量分析では、イオントラップ質量分析器を活用する。全てのｍ／ｚのイオンがまず、質量分析器内にトラップされ、振動するような電界を印加することが典型的である。イオンは、イオン源から、八重極レンズシステムなどの集束デバイスを介して、イオントラップに入る。イオントラッピングは、電極を介する励起および検出器への駆出の前に、トラッピング領域内でおこる。質量分析は、振動の振幅を増加させる電圧を逐次的に印加することにより、ｍ／ｚが増加するイオンを、トラップから検出器へと駆出する様式で達成することができる。四重極質量分析と異なり、選択されたｍ／ｚを有するイオンを除く全てのイオンは、質量分析器の電界内に保持される。イオン数の制御は、イオンがトラップ内に注入されている時間を変化させることにより達成することができる。
飛行時間質量分析では、飛行時間質量分析器を活用する。イオンにはまず、電界（高電圧により生成される）内の加速化により、一定量の運動エネルギーを与えることが典型的である。加速化の後、イオンは、電界のかからない領域または「ドリフト」領域に入り、ここで、そのｍ／ｚに反比例する速度で移動する。したがって、低ｍ／ｚを有するイオンは、高ｍ／ｚを有するイオンより高速で移動する。イオンが、電界のかからない領域の全長を移動するのに要求される時間を測定し、イオンのｍ／ｚを計算するのに使用する。
ガスクロマトグラフィー質量分析では、標的を、リアルタイムでしうることが多い。システムのガスクロマトグラフィー（ＧＣ）部分では、化学的混合物を、分析物のパルスへと分離し、質量分析計（ＭＳ）により、分析物を同定および定量する。
タンデム質量分析では、上記で記載した質量分析器の組合せを活用することができる。タンデム質量分析計では、さらなる分析のための目的のイオンを単離するために、それらのｍ／ｚに従って、イオンを分離するのに第１の質量分析器を使用することができる。次いで、単離された目的のイオンを、フラグメントイオンへと分解し（衝突活性化解離または衝突誘起解離と呼ばれる）、フラグメントイオンを、第２の質量分析器により分析する。これらの種類のタンデム質量分析計システムは、２つの質量分析器が、空間内で、通例衝突セルにより隔てられているため、空間内タンデムシステム(tandem in space system)と呼ばれる。タンデム質量分析計システムはまた、１つの質量分析器を使用するが、質量分析器を逐次的に使用して、イオンを単離し、フラグメント化を誘導し、次いで、質量分析を行う、時間内タンデムシステム(tandem in time system)も含む。
空間内タンデム部類の質量分析計は、複数の質量分析器を有する。例えば、タンデム四重極質量分析計システムは、第１の四重極マスフィルターに続く、衝突セルに続く、第２の四重極マスフィルター、次いで、検出器を有しうる。別の配置は、第１の質量分析器に、四重極マスフィルターを使用し、第２の質量分析器に、２つの質量分析器を隔てる衝突セルを有する飛行時間質量分析器を使用することである。当技術分野では、リフレクトロン−飛行時間質量分析、タンデムセクター質量分析、およびセクター−四重極質量分析を含む、他のタンデムシステムが公知である。
時間内タンデム部類の質量分析計は、異なる時間に異なる機能を果たす１つの質量分析器を有する。例えば、イオントラップ質量分析計を使用して、全てのｍ／ｚのイオンをトラップすることができる。目的のイオンのｍ／ｚを除く全てのｍ／ｚのイオンをトラップから駆出する、一連のｒｆ走査機能を適用する。目的のｍ／ｚを単離した後で、ｒｆパルスを印加して、トラップ内の気体分子との衝突をもたらして、イオンのフラグメント化を誘導する。次いで、フラグメント化されたイオンのｍ／ｚ値を、質量分析器により測定する。フーリエ変換質量分析計としてもまた公知のイオンサイクロトロン共鳴装置は、時間内タンデムシステムの例である。
実験の各段階で選択されたイオンを制御することにより、いくつかの種類のタンデム質量分析実験を行うことができる。異なる種類の実験では、場合によって、質量分析器の「走査」と呼ばれる、異なる作動方式を活用する。質量スペクトル走査と呼ばれる第１の例では、第１の質量分析器および衝突セルは、質量分析のための全てのイオンを、第２の質量分析器へと伝送する。生成物イオン走査と呼ばれる第２の例では、目的のイオンを、第１の質量分析器で質量選択し、次いで、衝突セル内でフラグメント化する。次いで、第２の質量分析器を走査することにより、形成されたイオンを質量分析する。前駆体イオン走査と呼ばれる第３の例では、第１の質量分析器を走査して、質量分析されたイオンを、フラグメント化のために、衝突セルへと逐次的に伝送する。第２の質量分析器では、検出器へと伝送するために、目的の生成物イオンを質量選択する。したがって、検出器シグナルは、共通の生成物イオンへとフラグメント化されうる全ての前駆体イオンの結果である。他の実験フォーマットは、質量走査における一定の質量差の一因となるニュートラルロス走査を含む。
定量のために、例えば、存在するかまたは導入された核酸断片の量と関連するシグナルをもたらしうる対照を使用することができる。相対質量シグナルの、絶対量への変換を可能とする対照は、核酸断片を検出する前に、既知量の質量タグまたは質量標識を各試料に添加することにより達成することができる。例えば、DingおよびCantor（２００３年）、PNAS U S A.、３月１８日、１００巻（６号）：３０５９〜６４頁を参照されたい。断片の検出に干渉しない任意の質量タグを、質量シグナルを正規化するために使用することができる。このような標準物質は、試料中の分子タグのうちのいずれかの分離特性と異なる分離特性を有することが典型的であり、同じ質量シグネチャーを有する場合もあり、異なる質量シグネチャーを有する場合もある。
場合によって、分離ステップを使用して、塩、酵素、または他のバッファ成分を、核酸試料から除去することができる。クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、または沈殿など、当技術分野で周知の複数の方法を使用して、試料を清浄化することができる。例えば、サイズ除外クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーを使用して、塩を試料から除去することができる。分離法の選択は、試料の量に依存しうる。例えば、利用可能な試料が少量であるか、または小型機器を使用する場合、マイクロアフィニティークロマトグラフィー分離ステップを使用することができる。加えて、分離ステップが所望されるのかどうか、および分離法の選択は、使用される検出法に依存しうる。場合によって、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化では、塩が、レーザーからエネルギーを吸収し、イオン化効率の低下を結果としてもたらす可能性がある。したがって、場合によって、塩を試料から除去することにより、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化およびエレクトロスプレーイオン化の効率を向上させることができる。
電気泳動
一部の実施形態では、電気泳動を使用して、核酸断片の長さを決定する。一部の実施形態では、電気泳動を使用せずに、核酸断片の長さを決定する。一部の実施形態では、電気泳動を使用して、対応するプローブの長さ（例えば、本明細書で記載される、対応するトリミングされたプローブ）を決定する。一部の実施形態ではまた、電気泳動を、本明細書で記載される、長さベースの分離法としても使用することができる。当技術分野で公知の、任意の電気泳動法であって、核酸を長さで分離する電気泳動法を、本明細書で提供される方法であって、標準的な電気泳動法および、例えば、キャピラリー電気泳動など、特化した電気泳動法を含むがこれらに限定されない方法と共に使用することができる。標準的な電気泳動法を使用して、核酸を分離し、核酸断片の長さを測定するための方法の例は、当技術分野で見出すことができる。本明細書では、非限定的な例を提示する。アガロースゲル中またはポリアクリルアミドゲル中で核酸試料を泳動させた後で、ゲルを、臭化エチジウムで標識する（例えば、染色する）ことができる（SambrookおよびRussell、MolecularCloning: A Laboratory Manual、第３版、２００１年を参照されたい）。標準物質対照と同じサイズのバンドの存在は、特定の核酸配列の長さの存在の指標であり、次いで、その量を、バンドの強度に基づき、対照と比較することができ、これにより、目的の核酸配列の長さを検出し、定量することができる。
一部の実施形態では、キャピラリー電気泳動を使用して、核酸断片を分離し、同定し、場合によって、定量する。キャピラリー電気泳動（ＣＥ：ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）は、例えば、長さが様々な核酸など、大きな分子と小さな分子の一連の複合体を分離するのに、小口径融合シリカキャピラリー(narrow-borefused-silica capillary)を使用する類縁の分離法のファミリーを包含する。高電界強度を使用して、電荷、サイズ、および疎水性の差違に基づき、核酸分子を分離することができる。試料の導入は、キャピラリーの末端を、試料バイアル内に浸漬し、圧力、真空、または電圧を適用することにより達成する。使用されるキャピラリーおよび電解質の種類に応じて、ＣＥ技術をいくつかの分離法に分けることができ、それらのうちのいずれかを、本明細書で提供される方法へと適応させることができる。これらのうちの非限定的な例は、溶液非含有ＣＥ（ＦＳＣＥ）としてもまた公知の、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）、等速電気泳動（ＩＴＰ）、界面動電クロマトグラフィー（ＥＫＣ）、ミセル動電キャピラリークロマトグラフィー（ＭＥＣＣまたはＭＥＫＣ）、マイクロエマルジョン界面動電クロマトグラフィー（ＭＥＥＫＣ）、非水性キャピラリー電気泳動（ＮＡＣＥ）、およびキャピラリー電気クロマトグラフィー（ＣＥＣ）を含む。
キャピラリー電気泳動を行うことが可能な、任意のデバイス、装置、またはマシンを、本明細書で提供される方法と共に使用することができる。一般に、キャピラリー電気泳動システムの主要構成要素は、試料バイアル、供給源バイアルおよび泳動先バイアル(destination vial)、キャピラリー、電極、高電圧電源、検出器、ならびにデータ出力および操作デバイスである。供給源バイアル、泳動先バイアル、およびキャピラリーに、水性緩衝液などの電解質を充填する。試料を導入するために、キャピラリー注入口を、試料を含有するバイアルに入れ、次いで、供給源バイアルへと戻す（試料を、毛管作用、圧力、またはサイフォン作用を介して、キャピラリーへと導入する）。次いで、供給源バイアルと泳動先バイアルとの間で印加され、高電圧電源により電極へと供給される電界により、分析物（すなわち、核酸）の泳動を開始する。電気浸透流により、キャピラリーを介して、陽イオンまたは陰イオンを、同じ方向に引き寄せる。分析物（すなわち、核酸）は、それらが、それらの電気泳動移動度に起因して泳動するときに分離され、キャピラリーの流出口末端近傍で検出される。検出器の出力は、積分器またはコンピュータなど、データ出力および操作デバイスへと送信する。次いで、データを、検出器の応答を時間の関数として報告しうる、電気泳動図として表示する。分離された核酸は、電気泳動図内の異なる泳動時間と共にピークとして現れうる。
キャピラリー電気泳動による分離は、複数の検出デバイスにより検出することができる。市販のシステムの大半では、ＵＶまたはＵＶ−Ｖｉｓにおける吸光度を、それらの検出の一次モードとして使用する。これらのシステムでは、キャピラリー自体のセクションを、検出セルとして使用する。管上検出の使用により、分離された分析物の検出が、分解能を低下させずに可能となる。一般に、キャピラリー電気泳動で使用されるキャピラリーは、安定性を増加させるために、ポリマーでコーティングすることができる。ＵＶによる検出のために使用されるキャピラリーの部分は、光学的に透明であることが多い。キャピラリー電気泳動における検出セルの経路の長さ（約５０マイクロメーター）は、従来のＵＶセルの経路の長さ（約１ｃｍ）よりはるかに短い。ベールランベルトの法則によると、検出器の感度は、セルの経路の長さに比例する。これにより、分解能の低下が結果としてもたらされうるが、感度を向上させるために、経路の長さを増加させることができる。検出点において、キャピラリー管（ｔｕｂｅ）自体を伸長させ、経路の長さが長い「バブルセル」を作り出す場合もあり、検出点において、さらなる管（ｔｕｂｉｎｇ）を追加する場合もある。しかし、これらの方法のいずれも、分離の分解能を低下させる可能性がある。
天然で蛍光発光するか、または、例えば、本明細書で記載される、標識された核酸断片またはプローブなどの蛍光タグを含有するように化学的に修飾された試料についてのキャピラリー電気泳動ではまた、蛍光の検出も使用することができる。この検出方式では、これらの試料についての高感度および選択性の向上がもたらされる。方法では、光ビームを、キャピラリー上に集束することが要求される。ＣＥシステムでは、レーザーにより誘導される蛍光は、１０−１８〜１０−２１モルという低値の検出限界で使用することができる。技法の感度は、入射光の大きな強度および光をキャピラリー上に正確に集束させる能力に帰せられる。
当技術分野では、いくつかのキャピラリー電気泳動機が公知であり、本明細書で提供される方法と共に使用することができる。これらは、ＣＡＬＩＰＥＲ ＬＡＢ ＣＨＩＰ ＧＸ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、Ｐ／ＡＣＥ ２０００ Ｓｅｒｉｅｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）、ＨＰ Ｇ１６００Ａ ＣＥ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）、ＡＧＩＬＥＮＴ ７１００ ＣＥ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）、およびＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含むがこれらに限定されない。
顕微鏡法
一部の実施形態では、核酸断片の長さを、顕微鏡法など、イメージングベースの方法を使用して決定する。一部の実施形態では、イメージングベースの方法を使用して、対応するプローブの長さ（例えば、本明細書で記載される、対応するトリミングされたプローブ）を決定する。一部の実施形態では、断片の長さは、単一の核酸断片の顕微鏡法による視覚化によって決定することができる（例えば、米国特許第５，７２０，９２８号を参照されたい）。一部の実施形態では、核酸断片を、伸長させた状態で表面（例えば、修飾ガラス表面）へと固定し、染色し、顕微鏡法により視覚化する。断片の画像は、収集および処理する（例えば、長さについて測定する）ことができる。一部の実施形態では、イメージングステップおよび画像分析ステップを自動化することができる。当技術分野では、顕微鏡法を使用して、核酸断片を直接視覚化するための方法が公知である（例えば、Laiら（１９９９年）、Nat Genet.、２３巻（３号）：３０９〜１３頁；Astonら（１９９９年）、Trends Biotechnol.、１７巻（７号）：２９７〜３０２頁；Astonら（１９９９年）、Methods Enzymol.、３０３巻：５５〜７３頁；Jingら（１９９８年）、Proc Natl Acad Sci USA.、９５巻（１４号）：８０４６〜５１頁；および米国特許第５，７２０，９２８号を参照されたい）。本明細書で記載される方法と共に使用されうる、他の顕微鏡法は、限定せずに述べると、走査型トンネル顕微鏡法（ＳＴＭ：ｓｃａｎｎｉｎｇ ｔｕｎｎｅｌｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、原子間力顕微鏡法（ＡＴＭ）、走査フォース顕微鏡法（ＳＦＭ：ｓｃａｎｎｉｎｇ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、フォトン走査型トンネル顕微鏡法（ＰＳＴＭ）、走査型トンネル電位差測定法（ＳＴＰ）、磁気力顕微鏡法（ＭＦＭ）、走査型プローブ顕微鏡法、走査型電圧顕微鏡法(scanning voltagemicroscopy)、光伝導原子間力顕微鏡法(photoconductive atomic forcemicroscopy)、電気化学走査型トンネル顕微鏡法(electrochemical scanningtunneling microscopy)、電子顕微鏡法、スピン偏極走査型トンネル顕微鏡法（ＳＰＳＴＭ：spin polarized scanning tunneling microscopy）、走査型熱顕微鏡法、走査型ジュール膨張顕微鏡法(scanning jouleexpansion microscopy)、光熱顕微分光法(photothermal microspectroscopy)などを含む。
一部の実施形態では、走査型トンネル顕微鏡法（ＳＴＭ）を使用して、核酸断片の長さを決定することができる。ＳＴＭ法は、核酸断片などの分子についての、原子レベルの画像を生成しうることが多い。ＳＴＭは、例えば、空気、水、超高真空、他の多様な液体、または気体の環境中で実施することができ、例えば、絶対ゼロ度近傍〜摂氏数百度の範囲の温度で実施することができる。ＳＴＭシステムの構成要素は、走査チップ、圧電制御型高さおよびｘ、ｙスキャナー、粗試料−チップ間制御、振動単離システム、およびコンピュータを含むことが典型的である。ＳＴＭ法は一般に、量子トンネルの概念に基づく。例えば、導電性チップを、分子（例えば、核酸断片）の表面へと近づけるとき、両者の間に印加されるバイアス（すなわち、電圧差）により、電子が、それらの間の真空中をトンネルすることが可能となりうる。結果として生じるトンネル電流は、チップの位置、印加された電圧、および試料の局所的状態密度（ＬＤＯＳ）の関数である。情報は、チップの位置が、表面にわたり走査するときの電流をモニタリングすることにより収集し、画像形態で表示することができる。ｘｙ平面内の試料にわたりチップを動かす場合、表面の高さおよび状態密度の変化により、電流の変化が引き起こされる。これらの変化は、画像中にマッピングすることができる。場合によって、位置に対する電流の変化自体を測定することもでき、一定の電流に対応するチップの高さであるｚを測定することもできる。これらの２つの方式は、それぞれ、高さ一定方式および電流一定方式と称することが多い。
一部の実施形態では、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ：ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を使用して、核酸断片の長さを決定することができる。ＡＦＭは一般に、高分解能型のナノスケールの顕微鏡法である。対象（例えば、核酸断片）についての情報は、力学的プローブで表面を「感知すること」により集めることが典型的である。電子的コマンドにより、微細であるが正確で精密な動きを容易とする圧電素子により、極めて精密な走査を容易とすることができる。一部の変化形では、導電性カンチレバーを使用して、電位を走査することができる。ＡＦＭシステムの構成要素は、その末端において、検体（例えば、核酸断片）の表面を走査するのに使用される、鋭利なチップ（すなわち、プローブ）を有するカンチレバーを含むことが典型的である。カンチレバーは、曲率がナノメートルのオーダーのチップ半径を有するケイ素または窒化ケイ素であることが典型的である。チップを、試料表面に近接させると、チップと試料との間の力により、フックの法則に従って、カンチレバーの振れがもたらされる。状況に応じて、ＡＦＭにより測定される力は、例えば、機械的接触力、ファンデルワールス力、毛細管力、化学結合、静電力、磁力、カシミール力、溶媒和力などを含む。振れは、カンチレバーの上面から反射して、一連の光ダイオードに入るレーザースポットを使用して測定することが典型的である。使用される他の方法は、光干渉法、容量センシング、または圧電抵抗型ＡＦＭカンチレバーを含む。
ナノポア
一部の実施形態では、核酸断片の長さは、ナノポアを使用して決定する。一部の実施形態では、対応するプローブの長さ（例えば、本明細書で記載される、対応するトリミングされたプローブ）は、ナノポアを使用して決定する。ナノポアとは、直径が典型的に１ナノメートルのオーダーの、小型の穴またはチャネルである。ある特定の膜貫通細胞タンパク質は、ナノポアとして作用しうる（例えば、アルファ−ヘモリシン）。一部の実施形態では、ナノポアは、合成する（例えば、ケイ素プラットフォームを使用して）ことができる。ナノポアを導電性流体中に浸漬し、それを隔てて電位を印加すると、ナノポアを介したイオンの伝導に起因して、微弱な電流が結果としてもたらされる。流れる電流の量は、ナノポアのサイズに感受性である。核酸断片がナノポアを通過するとき、核酸分子は、ある程度ナノポアを塞ぎ、電流の変化を発生させる。核酸断片がナノポアを通過するときの電流変化の持続時間は、測定することができる。一部の実施形態では、核酸断片の長さは、この測定に基づき決定することができる。
一部の実施形態では、核酸断片の長さは、時間の関数として決定することができる。長い核酸断片は、場合によって、ナノポアを通過するのにかかる時間が比較的長く、短い核酸断片は、場合によって、ナノポアを通過するのにかかる時間が比較的短いことがある。したがって、一部の実施形態では、断片の相対的な長さは、ナノポアの通過時間に基づき決定することができる。一部の実施形態では、断片の近似的な長さまたは絶対的な長さは、標的断片および／または参照断片によるナノポアの通過時間を、標準物質のセット（すなわち、公知の長さを有する）の通過時間と比較することにより決定することができる。
プローブ
一部の実施形態では、断片の長さは、１つまたは複数のプローブを使用して決定する。一部の実施形態では、プローブは、それらの各々が、試料中の目的の核酸とハイブリダイズするようにデザインする。例えば、プローブは、目的の核酸と相補的であるか、または目的の核酸に結合しうる一連の単量体を含みうる、ポリヌクレオチド配列を含みうる。プローブは、１つまたは複数の目的の核酸断片とハイブリダイズする（例えば、完全にハイブリダイズする）のに適する任意の長さでありうる。例えば、プローブは、それがハイブリダイズする核酸断片の長さにわたるかまたはこれを超える任意の長さでありうる。プローブは、約１００ｂｐまたはそれ超の長さでありうる。例えば、プローブは、少なくとも約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ｂｐの長さでありうる。
一部の実施形態では、プローブは、目的の核酸と相補的なポリヌクレオチド配列と、目的の核酸と相補的ではない、１つまたは複数のポリヌクレオチド配列（すなわち、非相補的な配列）とを含みうる。非相補的な配列は、例えば、プローブの５’末端および／または３’末端に存在（ｒｅｓｉｄｅ）しうる。一部の実施形態では、非相補的な配列は、目的の生物中に存在（ｅｘｉｓｔ）しないヌクレオチド配列および／またはヒトゲノム中の任意の配列とハイブリダイズすることが可能ではない配列を含みうる。例えば、非相補的な配列は、例えば、非哺乳動物ゲノム、植物ゲノム、真菌ゲノム、細菌ゲノム、またはウイルスゲノムなど、当技術分野で公知の任意の非ヒトゲノムに由来しうる。一部の実施形態では、非相補的な配列は、ＰｈｉＸ１７４ゲノムに由来する。一部の実施形態では、非相補的な配列は、相補的なヌクレオチドとハイブリダイズすることが可能ではない、修飾ヌクレオチドまたは合成ヌクレオチドを含みうる。
プローブは、オリゴヌクレオチド（例えば、捕捉オリゴヌクレオチド）について当技術分野で公知であり、本明細書で記載される方法に従って、デザインおよび合成することができる。プローブはまた、オリゴヌクレオチドについて当技術分野で公知であり、本明細書で記載される特性のうちのいずれかも含みうる。本明細書におけるプローブは、それらが、ヌクレオチド（例えば、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、およびウラシル（Ｕ））、修飾ヌクレオチド（例えば、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、イノシン（Ｉ）、および７−メチルグアノシン）、合成ヌクレオチド、縮重塩基（例えば、６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−７−オン（Ｐ）、２−アミノ−６−メトキシアミノプリン（Ｋ）、Ｎ６−メトキシアデニン（Ｚ）、およびヒポキサンチン（Ｉ））、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、もしくは合成ヌクレオチド、またはこれらの組合せ以外のユニバーサル塩基および／または単量体を含むようにデザインすることができ、一般にはまず、それらがハイブリダイズする断片より長い長さを有するようにデザインする。
一部の実施形態では、プローブは、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、およびウラシル（Ｕ）など、ヌクレオチドの天然に存在する変化形または修飾変化形のうちの任意の１つとハイブリダイズすることが可能な、複数の単量体を含む。一部の実施形態では、プローブは、アデニン、チミン、シトシン、およびグアニンのうちの少なくとも３つとハイブリダイズすることが可能な、複数の単量体を含む。例えば、プローブは、Ａ、Ｔ、およびＣ；Ａ、Ｔ、およびＧ；Ｇ、Ｃ、およびＴ；またはＧ、Ｃ、およびＡとハイブリダイズすることが可能な単量体の種を含みうる。一部の実施形態では、プローブは、アデニン、チミン、シトシン、およびグアニンの全てとハイブリダイズすることが可能な、複数の単量体を含む。例えば、プローブは、Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧの全てとハイブリダイズすることが可能な、単量体の種を含みうる。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション条件（例えば、厳密性）は、例えば、本明細書で記載される方法に従って、ある特定の単量体種の、多様なヌクレオチド種とのハイブリダイゼーションを容易とするように調整することができる。一部の実施形態では、単量体は、ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、単量体は、天然に存在するヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、単量体は、修飾ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、プローブの単量体は、イノシンを含む。イノシンとは、一般にｔＲＮＡ中に見出され、場合によって、Ａ、Ｔ、およびＣとハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドである。本明細書の実施例９では、核酸断片のサイズを決定するために、ポリイノシンプローブを活用する方法について記載する。一部の実施形態では、ポリイノシンプローブは、厳密性の低度なハイブリダイゼーション条件下または厳密でないハイブリダイゼーション条件（例えば、本明細書で記載される厳密なハイブリダイゼーション条件と比較して低温および／または高塩濃度などの）下で、核酸断片とハイブリダイズする。一部の実施形態では、核酸断片を、亜硫酸水素ナトリウムで処理し、これにより、断片中の非メチル化シトシン残基の脱アミノ化を引き起こして、ウラシル残基を形成する。一部の実施形態では、亜硫酸水素ナトリウム処理される核酸断片を、亜硫酸水素ナトリウム処理の前に増幅する（例えば、ＰＣＲ増幅する）。一部の実施形態では、核酸断片を、シトシン残基を有さないユニバーサル増幅プライマー部位を含む配列へとライゲーションする。次いで、例えば、ユニバーサル増幅プライマーおよび伸長反応を使用して、相補的な第２の鎖を生成することができる。第１の鎖中のウラシル残基は、第２の鎖中の相補的なアデニン残基を生成することが典型的である。したがって、グアニン残基を有さない第２の鎖を生成することができる。このようなグアニン非含有の相補的な第２の鎖は、場合によって、厳密なハイブリダイゼーション条件下で、ポリイノシンプローブとハイブリダイズしうる。
一部の実施形態では、プローブの単量体は、ユニバーサル塩基の単量体を含む。ユニバーサル塩基の単量体は、天然塩基（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）の各々と非選択的にハイブリダイズしうる、ヌクレオ塩基の類似体または合成の単量体であることが典型的である。したがって、ユニバーサル塩基の単量体を含むプローブは、場合によって、ヌクレオチド配列に関わらず、核酸断片とハイブリダイズしうる。ユニバーサル塩基は、限定なしに述べると、３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、６−ニトロインドール、３−メチル７−プロピニルイソカルボスチリル（ＰＩＭ）、３−メチルイソカルボスチリル（ＭＩＣＳ）、および５−メチルイソカルボスチリル（５ＭＩＣＳ）を含みうる（例えば、Nicholsら（１９９４年）、Nature、３６９巻、４９２〜４９３頁；Bergstromら（１９９５年）、J. Am. Chem. Soc.、１１７巻、１２０１〜１２０９頁；LoakesおよびBrown（１９９４年）、Nucleic Acids Res.、２２巻、４０３９〜４０４３頁；LinおよびBrown（１９９２年）、Nucleic Acids Res.、２０巻、５１４９〜５１５２頁；LinおよびBrown（１９８９年）、NucleicAcids Res.、１７巻、１０３８３頁；BrownおよびLin（１９９１年）、Carbohydrate Research、２１６巻、１２９〜１３９頁；Bergerら（２０００年）、Nucleic Acids Res.、２８巻（１５号）：２９１１〜２９１４頁を参照されたい）。
一部の実施形態では、プローブの単量体は、ヌクレオチド以外の単量体を含む。一部の実施形態では、単量体は、合成ポリマーのサブユニットを含む。一部の実施形態では、単量体は、ピロリドンを含む。ピロリドンは、合成ポリマーであるポリピロリドンの単量体であり、場合によって、Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣの全てとハイブリダイズすることが可能である。
一部の実施形態では、断片の長さを決定するための方法は、核酸断片（例えば、標的断片および／または参照断片）を、アニーリング条件下で、断片にアニールしうる複数のプローブと接触させ、これにより、例えば、標的−プローブ種および参照基準−プローブ種などの、断片−プローブ種を生成するステップを含む。プローブおよび／またはハイブリダイゼーション条件（例えば、厳密性）は、完全な断片または実質的に完全な断片の結合（例えば、高度な厳密性）に好適となるように最適化することができる。下記でさらに詳細に記載する通り、完全な断片−プローブ間ハイブリダイゼーションまたは実質的に完全な断片−プローブ間ハイブリダイゼーションは一般に、二重鎖を含み、ここで、断片は、ハイブリダイズしなかった部分を含まないが、プローブは、ハイブリダイズしなかった部分を含みうる。
プローブの長さが、断片の長さより長い場合など、一部の実施形態では、標的−プローブ種および／または参照基準−プローブ種の各々は、ハイブリダイズしなかったプローブ部分を含みうる（すなわち、一本鎖プローブ部分；例えば、図１２を参照されたい）。ハイブリダイズしなかったプローブ部分は、プローブの片方の末端（例えば、プローブの３’末端または５’末端）にある場合もあり、プローブの両方の末端（すなわち、プローブの３’末端および５’末端）にある場合もあり、任意の数の単量体を含みうる。一部の実施形態では、ハイブリダイズしなかったプローブ部分は、約１〜約５００の単量体を含みうる。例えば、ハイブリダイズしなかったプローブ部分は、約５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、または４００の単量体を含みうる。
一部の実施形態では、ハイブリダイズしなかったプローブ部分は、標的−プローブ種および／または参照基準−プローブ種から除去し、これにより、トリミングされたプローブを生成することができる。ハイブリダイズしなかったプローブ部分の除去は、ポリマーを切断および／または消化するための、当技術分野で公知の任意の方法であって、例えば、一本鎖核酸を切断または消化するための方法などの方法により達成することができる。ハイブリダイズしなかったプローブ部分は、プローブの５’末端および／またはプローブの３’末端から除去することができる。このような方法は、化学的切断および／もしくは酵素的切断または化学的消化および／もしくは酵素的消化の使用を含みうる。一部の実施形態では、核酸のヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を切断することが可能な酵素を、ハイブリダイズしなかったプローブ部分を除去するために使用する。このような酵素は、限定なしに述べると、ヌクレアーゼ（例えば、ＤＮアーゼＩ、ＲＮアーゼＩ）、エンドヌクレアーゼ（例えば、ヤエナリヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼなど）、制限ヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼ（例えば、エクソヌクレアーゼＩ、エクソヌクレアーゼＩＩＩ、エクソヌクレアーゼＴ、Ｔ７エクソヌクレアーゼ、ラムダエクソヌクレアーゼなど）、ホスホジエステラーゼ（例えば、ホスホジエステラーゼＩＩ、ウシ脾臓ホスホジエステラーゼ、ヘビ毒ホスホジエステラーゼなど）、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ、５’ヌクレアーゼ、３’ヌクレアーゼ、３’−５’エクソヌクレアーゼ、５’−３’エクソヌクレアーゼなど、またはこれらの組合せを含みうる。トリミングされたプローブは一般に、それらがハイブリダイズする断片と同じ長さまたは実質的に同じ長さである。したがって、本明細書におけるトリミングされたプローブの長さを決定することにより、対応する核酸断片の長さの測定値をもたらすことができる。トリミングされたプローブの長さは、核酸断片の長さを決定するための方法であって、当技術分野で公知であるかまたは本明細書で記載される方法のうちのいずれかを使用して測定することができる。一部の実施形態では、プローブは、検出および／または長さの決定を容易とする、検出可能な分子または実体（例えば、フルオロフォア、放射性同位元素、比色剤、粒子、酵素など）を含有しうる。トリミングされたプローブの長さは、それらを除去した後における、ハイブリダイズしなかった部分の生成物を分離して評価する場合もあり、分離せずに評価する場合もある。
一部の実施形態では、トリミングされたプローブを、それらの対応する核酸断片から解離する（すなわち、分離する）。プローブは、熱変性を含むがこれに限定されない、当技術分野で公知の任意の方法を使用して、それらの対応する核酸断片から分離することができる。トリミングされたプローブは、混合物中の分子種に標識付けし、かつ／またはこれらを単離するための、当技術分野で公知であるかまたは本明細書で記載される方法により、対応する核酸断片から識別することができる。例えば、プローブおよび／または核酸断片は、プローブが、それがハイブリダイズする核酸から識別可能となるように、検出可能な特性を含みうる。検出可能な特性の非限定的な例は、光学的特性、電気的特性、磁気的特性、化学的特性、ならびに既知のサイズの開口部を通る時間および／または速度を含む。一部の実施形態では、プローブおよび試料核酸断片を、互いから物理的に分離する。分離は、例えば、ビオチンなどの捕捉リガンドまたは他のアフィニティーリガンド、ならびにアビジン、ストレプトアビジン、抗体、または受容体などの捕捉剤を使用して達成することができる。プローブまたは核酸断片は、捕捉剤に対する特異的結合活性を有する捕捉リガンドを含有しうる。例えば、核酸試料に由来する断片は、当技術分野で周知の方法を使用して、ビオチニル化するか、またはアフィニティーリガンドへと結合させ、例えば、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズをによるプルダウンアッセイを使用してプローブから分離することができる。一部の実施形態では、それらを、質量分析計内で検出されるプローブの質量範囲から除外しうるように、捕捉リガンドおよび捕捉剤または他の任意の成分（ｍｏｉｅｔｙ）（例えば、質量タグ）を使用して、質量を核酸断片へと付加することができる。一部の実施形態では、単量体自体および／または質量タグの付加を介して、質量をプローブへと付加して、質量範囲を、核酸断片の質量範囲からシフトさせる。
核酸ライブラリー
一部の実施形態では、核酸ライブラリーは、特定の処理（それらの非限定的な例として、固相（例えば、固体の支持体、例えば、フローセル、ビーズ）上への固定化、富化、増幅、クローニング、検出が挙げられる）のために、および／または核酸の配列決定のために、調製され、アセンブルされ、かつ／または改変される複数のポリヌクレオチド分子（例えば、核酸の試料）である。特定の実施形態では、核酸ライブラリーを、配列決定の処理の前または間に調製する。核酸ライブラリー（例えば、配列決定ライブラリー）を、当技術分野で公知の適切な方法により調製することができる。核酸ライブラリーを、標的化する調製処理または標的化しない調製処理により調製することができる。
一部の実施形態では、核酸のライブラリーを改変して、固体の支持体への核酸の固定化のために構成される化学的部分（例えば、官能基）を含める。一部の実施形態では、核酸のライブラリーを改変して、固体の支持体へのライブラリーの固定化のために構成される、生体分子（例えば、官能基）および／または結合対のメンバーを含め、それらの非限定的な例として、チロキシン結合グロブリン、ステロイド結合タンパク質、抗体、抗原、ハプテン、酵素、レクチン、核酸、リプレッサー、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、補体成分Ｃ１ｑ、核酸結合タンパク質、受容体、炭水化物、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、相補的核酸配列等、およびそれらの組合せが挙げられる。特異的な結合対のいくつかの例として、非限定的に、アビジン部分とビオチン部分；抗原性エピトープと、抗体もしくはその免疫学的反応性断片；抗体とハプテン；ジゴキシゲニン（digoxigen）部分と抗ジゴキシゲニン（anti-digoxigen）抗体；フルオレセイン部分と抗フルオレセイン抗体；オペレーターとリプレッサー；ヌクレアーゼとヌクレオチド；レクチンと多糖；ステロイドとステロイド結合タンパク質；活性化合物と活性化合物の受容体；ホルモンとホルモン受容体；酵素と基質；免疫グロブリンとプロテインＡ；オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドと、それに対応する相補体等、またはそれらの組合せが挙げられる。
一部の実施形態では、核酸のライブラリーを改変して、既知の組成の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含め、それらの非限定的な例として、識別子（例えば、タグ、インデックス化タグ）、捕捉配列、標識、アダプター、制限酵素部位、プロモーター、エンハンサー、複製開始点、ステムループ、相補配列（例えば、プライマー結合部位、アニーリング部位）、適切な組込み部位（例えば、トランスポゾン、ウイルス組込み部位）、改変ヌクレオチド等、またはそれらの組合せが挙げられる。既知の配列のポリヌクレオチドを、適切な位置、例えば、核酸配列の５’末端、３’末端または内部に付加することができる。既知の配列のポリヌクレオチドは、同じ配列であっても、または異なる配列であってもよい。一部の実施形態では、既知の配列のポリヌクレオチドを、表面（例えば、フローセル中の表面）上に固定化された１つまたは複数のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするように構成する。例えば、５’既知配列を含む核酸分子を、第１の、複数のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることができ、一方、その分子の３’既知配列を、第２の、複数のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることができる。一部の実施形態では、核酸のライブラリーは、染色体に特異的なタグ、捕捉配列、標識および／またはアダプターを含むことができる。一部の実施形態では、核酸のライブラリーは、１つまたは複数の検出可能な標識を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の検出可能な標識を、核酸ライブラリー中に、５’末端において、３’末端において、かつ／または該ライブラリー中の核酸の内部の任意のヌクレオチドの位置において組み入れることができる。一部の実施形態では、核酸のライブラリーは、ハイブリダイズさせたオリゴヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ハイブリダイズさせたオリゴヌクレオチドは、標識されたプローブである。一部の実施形態では、核酸のライブラリーは、固相上への固定化する前のハイブリダイズさせたオリゴヌクレオチドプローブを含む。
一部の実施形態では、既知の配列のポリヌクレオチドは、ユニバーサル配列を含む。ユニバーサル配列は、２つもしくはそれ超の核酸分子、または核酸分子の２つもしくはそれ超のサブセット中に組み込む特異的なヌクレオチド配列であり、ユニバーサル配列は、それが組み込まれている分子またはサブセットの分子全てについて同じである。ユニバーサル配列はしばしば、ユニバーサル配列に対して相補性である単一のユニバーサルプライマーを使用して、複数の異なる配列にハイブリダイズし、かつ／またはそれらを増幅するように設計される。一部の実施形態では、２つ（例えば、対）またはそれ超のユニバーサル配列および／またはユニバーサルプライマーを使用する。ユニバーサルプライマーはしばしば、ユニバーサル配列を含む。一部の実施形態では、アダプター（例えば、ユニバーサルアダプター）は、ユニバーサル配列を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のユニバーサル配列を使用して、核酸の複数の種またはサブセットを、捕捉、同定および／または検出する。
核酸ライブラリーの調製の特定の実施形態では（例えば、合成の手順による特定の配列決定の場合には）、核酸を、サイズにより選択および／または断片化して、数百塩基対またはそれ未満の長さにする（例えば、ライブラリーの生成のための調製の場合）。一部の実施形態では、ライブラリーの調製を、断片化せずに行う（例えば、ｃｃｆＤＮＡを使用する場合）。
特定の実施形態では、ライゲーションに基づくライブラリーの調製方法を使用する（例えば、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＴＲＵＳＥＱ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）。ライゲーションに基づくライブラリーの調製方法はしばしば、アダプター（例えば、メチル化アダプター）の設計を活用し、この設計は、最初のライゲーションのステップにおいて、インデックス配列を組み入れることができ、しばしば、シングルリードシーケンシング、ペアエンドシーケンシング、およびマルチプレックスシーケンシングのための試料を調製するために使用することができる。例えば、ｆｉｌｌ−ｉｎ反応、エキソヌクレアーゼ反応、またはそれらの組合せにより、時には、核酸（例えば、断片化核酸またはｃｃｆＤＮＡ）の末端の修復をもたらす。一部の実施形態では、次いで、得られた平滑末端修復核酸を、アダプター／プライマーの３’末端上の単一ヌクレオチドのオーバーハングに対して相補性である単一ヌクレオチドにより伸長することができる。任意のヌクレオチドを、伸長／オーバーハングヌクレオチドのために使用することができる。一部の実施形態では、核酸ライブラリーの調製は、アダプターオリゴヌクレオチドのライゲーションを含む。アダプターオリゴヌクレオチドはしばしば、フローセルアンカーに対して相補性であり、時には、例えば、核酸ライブラリーを、固体の支持体、例として、フローセルの内側表面に固定化するために利用される。一部の実施形態では、アダプターオリゴヌクレオチドは、識別子、１つもしくは複数の配列決定プライマーハイブリダイゼーション部位（例えば、ユニバーサル配列決定プライマーに対して相補性である配列、シングルエンド配列決定プライマー、ペアエンド配列決定プライマー、マルチプレックス配列決定プライマー等）、またはそれらの組合せ（例えば、アダプター／配列決定、アダプター／識別子、アダプター／識別子／配列決定）を含む。
識別子は、核酸（例えば、ポリヌクレオチド）中に組み入れるまたはそれにつなぐ、適切な検出可能な標識であり、識別子により、識別子を含む核酸の検出および／または同定が可能になる。一部の実施形態では、識別子を、配列決定法の間に、（例えば、ポリメラーゼにより）核酸中に組み入れるまたはそれにつなぐ。識別子の非限定的な例として、核酸タグ、核酸のインデックスもしくはバーコード、放射標識（例えば、同位体）、金属標識、蛍光標識、化学発光標識、リン光標識、フルオロフォアクエンチャー、色素、タンパク質（例えば、酵素、抗体もしくはその一部分、リンカー、結合対のメンバー）等、またはそれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、識別子（例えば、核酸のインデックスまたはバーコード）は、ユニークな、既知のおよび／または同定可能な配列のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である。一部の実施形態では、識別子は、６つまたはそれ超の連続ヌクレオチドである。多様な異なる励起スペクトルおよび発光スペクトルを有する多数のフルオロフォアが入手可能である。任意の適切なタイプおよび／または数のフルオロフォアを、識別子として使用することができる。一部の実施形態では、１つもしくは複数、２つもしくはそれ超、３つもしくはそれ超、４つもしくはそれ超、５つもしくはそれ超、６つもしくはそれ超、７つもしくはそれ超、８つもしくはそれ超、９つもしくはそれ超、１０個もしくはそれ超、２０個もしくはそれ超、３０個もしくはそれ超、または５０個もしくはそれ超の異なる識別子が、本明細書に記載する方法（例えば、核酸の検出および／または配列決定法）において利用される。一部の実施形態では、１つまたは２つのタイプの識別子（例えば、蛍光標識）を、ライブラリー中のそれぞれの核酸に連結する。識別子の検出および／または定量を、適切な方法、装置またはマシンにより行うことができ、それらの非限定的な例として、フローサイトメトリー、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ゲル電気泳動、ルミノメーター、蛍光光度計、分光光度計、適切な遺伝子チップもしくはマイクロアレイによる分析、ウエスタンブロット、質量分析、クロマトグラフィー、細胞蛍光測定法による分析、蛍光顕微鏡法、適切な蛍光法もしくはデジタル撮像法、共焦点レーザー走査顕微鏡法、レーザー走査細胞数測定、親和性クロマトグラフィー、手作業バッチモードによる分離、電場懸濁、適切な核酸配列決定法および／または核酸シーケンサー等、ならびにそれらの組合せが挙げられる。
一部の実施形態では、トランスポゾンに基づくライブラリーの調製方法を使用する（例えば、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ ＮＥＸＴＥＲＡ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）。トランスポゾンに基づく方法は典型的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転位を使用して、単一チューブ中での反応においてＤＮＡの断片化およびタグ付けを同時に行い（しばしば、プラットフォームに特異的なタグおよび任意選択のバーコードの組み入れが可能である）、シーケンサーで使用できるライブラリーを調製する。
一部の実施形態では、核酸ライブラリーまたはその一部分を増幅する（例えば、ＰＣＲに基づく方法により増幅する）。一部の実施形態では、配列決定法は、核酸ライブラリーの増幅を含む。核酸ライブラリーを、固体の支持体（例えば、フローセル中の固体の支持体）上への固定化の前または後に増幅することができる。核酸増幅は、（例えば、核酸ライブラリー中に）存在する核酸鋳型および／またはその相補体の数を、鋳型および／またはその相補体の１つまたは複数のコピーを生成することによって増幅するまたは増加させる処理を含む。増幅は、適切な方法により行うことができる。核酸ライブラリーを、サーモサイクリング法または等温増幅法により増幅することができる。一部の実施形態では、ローリングサークル増幅法を使用する。一部の実施形態では、増幅は、核酸ライブラリーまたはその部分が固定化されている、固体の支持体（例えば、フローセルの内部）上で起きる。特定の配列決定法では、核酸ライブラリーを、フローセルに添加し、適切な条件下でのハイブリダイゼーションによりアンカーに固定化する。このタイプの核酸増幅をしばしば、固相増幅と呼ぶ。固相増幅の一部の実施形態では、全部または一部の増幅産物を、固定化されたプライマーから開始する伸長により合成する。固相増幅反応は、増幅オリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）のうちの少なくとも１つを固体の支持体上に固定化する点を除き、標準的な溶液相の増幅に類似する。
一部の実施形態では、固相増幅は、表面へと固定化された、オリゴヌクレオチドプライマーの１つの種のみを含む、核酸増幅反応を含む。ある特定の実施形態では、固相増幅は、複数の異なる、固定化されたオリゴヌクレオチドプライマー種を含む。一部の実施形態では、固相増幅は、固体表面上に固定化された、オリゴヌクレオチドプライマーの１つの種と、溶液中の第２の異なるオリゴヌクレオチドプライマー種とを含む、核酸増幅反応を含みうる。固定化されたプライマーまたは溶液ベースのプライマーの複数の異なる種を使用することができる。固相核酸増幅反応の非限定的な例は、界面増幅、架橋増幅、エマルジョンＰＣＲ、ＷｉｌｄＦｉｒｅ増幅（例えば、米国特許公開第ＵＳ２０１３００１２３９９号）など、またはこれらの組合せを含む。
配列決定
一部の実施形態では、核酸（例えば、核酸断片、試料核酸、無細胞核酸）を配列決定することができる。一部の実施形態では、全長配列または実質的な全長配列を得るが、場合によって、部分配列を得る。一部の実施形態では、本明細書で記載される方法を実施する場合、核酸を配列決定せず、核酸の配列を配列決定法により決定しない。一部の実施形態では、配列決定法を使用して、断片の長さを決定する。一部の実施形態では、配列決定法を使用せずに、断片の長さを決定する。本明細書では、配列決定、マッピング、および関連する分析的方法が記載されており、当技術分野で公知である（例えば、参照により組み込まれる、米国特許出願公開第ＵＳ２００９／００２９３７７号）。このような処理のある特定の態様については、本明細書の下記で記載する。
一部の実施形態では、配列決定法を使用して、断片の長さを決定する。一部の実施形態では、ペアエンドシーケンシングプラットフォームを使用して、断片の長さを決定する。このようなプラットフォームは、核酸断片の両方の末端の配列決定を伴う。一般に、断片の両方の末端に対応する配列は、参照ゲノム（例えば、参照ヒトゲノム）へとマッピングすることができる。ある特定の実施形態では、両方の末端を、各断片末端について個別に、参照ゲノムへとマッピングするのに十分な読取りの長さで配列決定する。ペアエンド配列の読取りの長さの例を、下記に記載する。ある特定の実施形態では、配列の読取りの全部または部分を、ミスマッチを伴わずに参照ゲノムへとマッピングすることができる。一部の実施形態では、各読取りを、独立にマッピングする。一部の実施形態では、マッピング処理において、両方の配列の読取り（すなわち、各末端に由来する）に由来する情報の寄与の程度を加減する。例えば、各々のマッピングしたペアエンド読取り(paired-endread)へと割り当てられたゲノム座標の間の差違を計算することにより、断片の長さを決定することができる。
一部の実施形態では、断片の長さは、断片について、完全なヌクレオチド配列または実質的に完全なヌクレオチド配列を得る、配列決定処理を使用して決定することができる。このような配列決定処理は、比較的長い読取りの長さを生成するプラットフォーム（例えば、Ｒｏｃｈｅ ４５４技術、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術、単一分子技術（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、リアルタイムＳＭＲＴ技術など）を含む。
一部の実施形態では、試料中の一部または全部の核酸を、配列決定の前または間に（例えば、非特異的に、例えば、ＰＣＲに基づく方法により）富化および／または増幅する。特定の実施形態では、試料中の特異的な、核酸の部分またはサブセットを、配列決定の前または間に富化および／または増幅する。一部の実施形態では、核酸のあらかじめ選択されたプールの部分またはサブセットの配列決定をランダムに行う。一部の実施形態では、配列決定の前または間に、試料中の核酸の富化および／または増幅を行わない。
本明細書で使用する場合、「読取り」（ｒｅａｄｓ）（すなわち、「読取り」（ａ ｒｅａｄ）、「配列の読取り」（ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅａｄ））は、本明細書に記載するまたは当技術分野で公知である、任意の配列決定の処理により生成された短いヌクレオチド配列である。読取りは、核酸断片の一方の末端から生成させることができ（「シングルエンドリード」）、時には、核酸の両方の末端から生成させる（例えば、ペアードエンドリード、ダブルエンドリード（ｄｏｕｂｌｅ−ｅｎｄ ｒｅａｄ））。
配列の読取りの長さはしばしば、特定の配列決定の技術と関連する。例えば、高スループット法は、塩基対（ｂｐ）のサイズが数十から数百まで様々であり得る配列の読取りを提供する。例えば、ナノポア配列決定は、塩基対のサイズが数十から数百または数千まで様々であり得る配列の読取りを提供することができる。一部の実施形態では、配列の読取りの平均値、中央値、平均の長さまたは絶対長が、約１５ｂｐ〜約９００ｂｐ長である。特定の実施形態では、配列の読取りの平均値、中央値、平均の長さまたは絶対長が、約１０００ｂｐまたはそれ超である。
一部の実施形態では、シングルエンドリードの名目の長さ、平均の長さ、平均値の長さ、または絶対の長さは、場合によって、約１ヌクレオチド〜約５００連続ヌクレオチド、約１５連続ヌクレオチド〜約５０連続ヌクレオチド、約３０連続ヌクレオチド〜約４０連続ヌクレオチドであり、場合によって、約３５連続ヌクレオチドまたは約３６連続ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、シングルエンドリードの名目の長さ、平均の長さ、平均値の長さ、または絶対の長さは、約２０〜約３０塩基、または約２４〜約２８塩基の長さである。ある特定の実施形態では、シングルエンドリードの名目の長さ、平均の長さ、平均値の長さ、または絶対の長さは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３，１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、または４９塩基の長さである。
ある特定の実施形態では、ペアエンド読取りの名目の長さ、平均の長さ、平均値の長さ、または絶対の長さは、場合によって、約１０連続ヌクレオチド〜約２５連続ヌクレオチド（例えば、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドの長さ）、約１５連続ヌクレオチド〜約２０連続ヌクレオチドであり、場合によって、約１７連続ヌクレオチド、約１８連続ヌクレオチド、約２０連続ヌクレオチド、約２５連続ヌクレオチド、約３６連続ヌクレオチドまたは約４５連続ヌクレオチドである。
読取りとは、一般に、物理的核酸中のヌクレオチド配列の表示である。例えば、配列のＡＴＧＣ描示を含有する読取り中では、「Ａ」は、物理的核酸中のアデニンヌクレオチドを表示し、「Ｔ」は、物理的核酸中のチミンヌクレオチドを表示し、「Ｇ」は、物理的核酸中のグアニンヌクレオチドを表示し、「Ｃ」は、物理的核酸中のシトシンヌクレオチドを表示する。妊娠中の雌の血液から得られた配列の読取りは、胎児の核酸と母体核酸との混合物からの読取りでありうる。比較的短い読取りの混合物は、本明細書で記載される処理により、妊娠中の雌中および／または胎児中に存在するゲノム核酸の表示へと変換することができる。比較的短い読取りの混合物は、例えば、コピー数の変動（例えば、母体および／または胎児のコピー数の変動）、遺伝子の変動、または異数性の表示へと変換することができる。母体核酸と胎児の核酸との混合物の読取りは、母体の染色体および胎児の染色体のうちの一方または両方の特徴を含む複合染色体またはそのセグメントの表示へと変換することができる。ある特定の実施形態では、試料の核酸配列の読取りを被験体から「得ること」および／または生物学的検体の核酸配列の読取りを１人または複数の参照の人から「得ること」は、核酸を直接配列決定して、配列情報を得ることを伴いうる。一部の実施形態では、「得ること」は、他者が核酸から直接得た配列情報を受けることを含みうる。
一部の実施形態では、ゲノムのフラクションを配列決定するが、これは、場合によって、決定されたヌクレオチド配列によりカバーされるゲノムの量で表される（例えば、１「倍」未満のカバレッジ）。ゲノムを、約１倍のカバレッジで配列決定する場合、ゲノムのヌクレオチド配列のおよそ１００％が、読取りにより表示される。ゲノムはまた、冗長性を伴って配列決定することもでき、ここで、ゲノムの所与の領域は、２つもしくはそれ超の読取りまたはオーバーラップする読取りによりカバーされうる（例えば、１「倍」超のカバレッジ）。一部の実施形態では、ゲノムを、約０．０１倍〜約１００倍のカバレッジ、約０．２倍〜２０倍のカバレッジ、または約０．２倍〜約１倍のカバレッジ（例えば、約０．０２倍、０．０３倍、０．０４倍、０．０５倍、０．０６倍、０．０７倍、０．０８、０．０９倍、０．１倍、０．２倍、０．３倍、０．４倍、０．５倍、０．６倍、０．７倍、０．８倍、０．９倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍のカバレッジ）で配列決定する。
一部の実施形態では、ゲノムカバレッジまたは配列カバレッジは、全体的な配列の読取りのカウントに比例する。例えば、高量の配列の読取りのカウントを生成および／または分析するアッセイは、高レベルの配列カバレッジと関連することが典型的である。少数の配列の読取りのカウントを生成および／または分析するアッセイは、低レベルの配列カバレッジと関連することが典型的である。一部の実施形態では、配列カバレッジおよび／または配列の読取りのカウントは、本明細書で記載される方法の精度（例えば、感度および／または特異性）を有意に減少させずに低減することができる。精度の有意な減少は、配列の読取りのカウントの低減を使用しない方法と比較して、約１％〜約２０％の精度の減少でありうる。例えば、精度の有意な減少は、約２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％またはそれ超の減少でありうる。一部の実施形態では、配列カバレッジおよび／または配列の読取りのカウントを、約５０％またはそれ超低減する。例えば、配列カバレッジおよび／または配列の読取りのカウントは、約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ超低減することができる。一部の実施形態では、配列カバレッジおよび／または配列の読取りのカウントを、約６０％〜約８５％低減する。例えば、配列カバレッジおよび／または配列の読取りのカウントは、約６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、または８４％低減することができる。一部の実施形態では、配列カバレッジおよび／または配列の読取りのカウントは、ある特定の配列の読取りを除去することにより低減することができる。場合によって、特定の長さより長い断片（例えば、約１６０塩基より長い断片）に由来する配列の読取りを除去する。
一部の実施形態では、読取りのサブセットを、分析について選択し、場合によって、読取りのある特定の部分を、分析から除去する。ある特定の場合は、読取りのサブセットの選択により、核酸の種（例えば、胎児核酸）について富化することができる。胎児核酸に由来する読取りの富化は、例えば、本明細書で記載される方法（例えば、胎児異数性の検出）の精度を増加させることが多い。しかし、分析からの読取りの選択および除去は、本明細書で記載される方法の精度を減少させる（例えば、分散の増加に起因する）ことが多い。したがって、理論に制約されずに述べると、一般に、読取りの選択および／または除去（例えば、特定のサイズ範囲内の断片からの）を含む方法では、胎児読取りの富化と関連する精度の増加と、読取りの量の低減と関連する精度の減少との間にトレードオフが存在する。一部の実施形態では、方法は、方法の精度を有意に減少させずに、胎児核酸に由来する読取りについて富化された読取りのサブセットを選択するステップを含む。本明細書で記載される通り、この見かけのトレードオフにも拘らず、ヌクレオチド配列の読取り（例えば、比較的短い断片に由来する読取り）のサブセットを活用することにより、胎児遺伝子分析の精度を向上させうるかまたは維持しうることが決定されている。例えば、ある特定の実施形態では、このようなヌクレオチド配列の読取りを廃棄しない同等な方法の場合の値と同様な感度値および特異性値を維持しながら、ヌクレオチド配列の読取りのうちの約８０％またはそれ超を廃棄することができる。
ある特定の実施形態では、核酸断片のサブセットを、配列決定する前に選択する。ある特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションベースの技法（例えば、オリゴヌクレオチドアレイを使用する）を使用して、ある特定の染色体（例えば、性染色体および／または潜在的に異数性の染色体、ならびに被験異数性に関与しない他の染色体（複数可））に由来する核酸配列についてまず選択することができる。一部の実施形態では、核酸を、サイズにより（例えば、ゲル電気泳動、サイズ除外クロマトグラフィー、またはマイクロ流体技術ベースの手法により）分画することができ、ある特定の場合、胎児核酸は、低分子量（例えば、３００塩基対未満、２００塩基対未満、１５０塩基対未満、１００塩基対未満）を有する核酸について選択することにより富化することができる。一部の実施形態では、胎児核酸は、ホルムアルデヒドを添加することなどにより、母体のバックグラウンド核酸を抑制することにより富化することができる。一部の実施形態では、核酸断片のあらかじめ選択されたセットの部分またはサブセットを、ランダムに配列決定する。一部の実施形態では、配列決定する前に、核酸を増幅する。一部の実施形態では、配列決定する前に、核酸の部分またはサブセットを増幅する。
一部の実施形態では、１つの個体から得られた１つの核酸試料の配列決定を行う。特定の実施形態では、２つまたはそれ超の試料のそれぞれから得られた核酸の配列決定を行い、この場合、試料は、１つの個体から得られるか、または異なる個体から得られる。特定の実施形態では、２つまたはそれ超の生物学的試料から得られた核酸試料をプールし、この場合、それぞれの生物学的試料が、１つの個体、または２つもしくはそれ超の個体から得られ、プールした試料の配列決定を行う。後者の実施形態では、それぞれの生物学的試料から得られた核酸試料をしばしば、１つまたは複数のユニークな識別子または識別タグにより同定する。
一部の実施形態では、配列決定法は、配列決定の処理における配列決定反応（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）のマルチプレックス化を可能にする識別子を利用する。ユニークな識別子の数が多くなるほど、例えば、配列決定の処理においてマルチプレックス化することができる、検出される試料および／または染色体の数が増える。任意の適切な数（例えば、４、８、１２、２４、４８、９６個またはそれ超）のユニークな識別子を使用して、配列決定の処理を行うことができる。
配列決定の処理は、時には固相を使用し、固相は、時にはフローセルを含み、フローセルの上に、ライブラリーに由来する核酸をつなぐことができ、試薬を、流し、つなげた核酸と接触させることができる。フローセルは時には、フローセルのレーンを含み、識別子の使用により、それぞれのレーン中のいくつかの試料の分析を促進することができる。フローセルはしばしば、結合させた被検体を保持し、かつ／または結合させた被検体上を試薬溶液が順序正しく通過するのを可能にするように構成することができる固体の支持体である。フローセルは、多くの場合、平面形状であり、光学的に透明であり、一般に、ミリメートルのまたはミリメートルを下回るスケールであり、しばしば、チャネルまたはレーンを有し、それらの中で、被検体と試薬との相互作用が発生する。一部の実施形態では、フローセルの所与のレーン中の分析される試料の数は、ライブラリーの調製および／またはプローブの設計の間に利用されるユニークな識別子の数に依存する。単一のフローセルのレーン。例えば、１２個の識別子を使用するマルチプレックス化により、８レーンのフローセル中の（例えば、９６ウエルのマイクロウエルプレート中のウエルの数に等しい）９６個の試料を同時に分析するのが可能になる。同様に、例えば、４８個の識別子を使用するマルチプレックス化により、８レーンのフローセル中の（例えば、３８４ウエルのマイクロウエルプレート中のウエルの数に等しい）３８４個の試料を同時に分析するのも可能になる。市販されているマルチプレックス配列決定キットの非限定的な例として、Ｉｌｌｕｍｉｎａのマルチプレックス化試料調製オリゴヌクレオチドキット、ならびにマルチプレックス化配列決定プライマーおよびＰｈｉＸコントロールキット（例えば、それぞれ、Ｉｌｌｕｍｉｎａのカタログ番号ＰＥ−４００−１００１およびＰＥ−４００−１００２）が挙げられる。
核酸の配列決定を行う任意の適切な方法を使用することができ、それらの非限定的な例として、Ｍａｘｉｍ ＆ Ｇｉｌｂｅｒｔ、鎖停止法、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、質量分析による配列決定、顕微鏡法に基づく技法等、またはそれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に提供する方法では、第一世代の技術、例えば、サンガー配列決定法等（これらとして、マイクロ流体サンガー配列決定を含めた、自動化サンガー配列決定法が挙げられる）を使用することができる。一部の実施形態では、核酸の撮像技術（例えば、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）および原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ））の使用を含む配列決定の技術を使用することができる。一部の実施形態では、高スループット配列決定法を使用する。高スループット配列決定法は一般に、ＤＮＡ鋳型または単一のＤＮＡ分子をクローン的に増幅させることを含み、これらのクローン増幅させた鋳型または分子の配列決定を、大規模に並行して、時にはフローセルの内部で行う。大規模に並行してＤＮＡの配列決定を行うことが可能な次世代（例えば、第２世代および第３世代）の配列決定の技法を、本明細書に記載する方法のために使用することができ、本明細書では、これらをまとめて「大規模並行配列決定」（ＭＰＳ）と呼ぶ。一部の実施形態では、ＭＰＳ配列決定法は、標的化のアプローチを利用し、この場合、特定の染色体、遺伝子、または目的の領域の配列決定を行う。特定の実施形態では、標的化しないアプローチを使用し、この場合、ランダムに、試料中のほとんどまたは全ての核酸の配列決定を行い、それらを増幅し、かつ／または捕捉する。
一部の実施形態では、富化、増幅および／または配列決定の標的化アプローチを使用する。標的化のアプローチはしばしば、試料中の核酸のサブセットを単離、選択および／または富化して、配列に特異的なオリゴヌクレオチドの使用によりさらなる処理を行う。一部の実施形態では、配列に特異的なオリゴヌクレオチドのライブラリーを利用して、試料中の核酸の１つまたは複数のセットを標的にする（例えば、それらにハイブリダイズさせる）。しばしば、配列に特異的なオリゴヌクレオチドおよび／またはプライマーは、目的の染色体、遺伝子、エクソン、イントロンおよび／または調節領域の１つまたは複数中に存在する特定の配列（例えば、ユニークな核酸配列）に選択的である。任意の適切な方法または方法の組合せを使用して、標的とされる核酸の１つまたは複数のサブセットの富化、増幅および／または配列決定を行うことができる。一部の実施形態では、標的とされる配列を、１つまたは複数の配列特異的アンカーを使用して固相（例えば、フローセル、ビーズ）に捕捉することにより単離および／または富化する。一部の実施形態では、配列に特異的なプライマーおよび／またはプライマーセットを使用する、ポリメラーゼに基づく方法（例えば、任意の適切なポリメラーゼに基づく伸長による、ＰＣＲに基づく方法）により、標的とされる配列を富化および／または増幅する。配列特異的アンカーはしばしば、配列特異的プライマーとして使用することができる。
ＭＰＳ配列決定は時には、合成による配列決定および特定の可視化処理を使用する。本明細書に記載する方法において使用することができる核酸の配列決定の技術は、合成による配列決定および可逆的ターミネーターに基づく配列決定（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩ；ＨＩＳＥＱ２０００；ＨＩＳＥＱ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ））である。この技術を用いれば、数百万個の核酸（例えば、ＤＮＡ）断片に対して、並行して配列決定を行うことができる。このタイプの配列決定の技術の１つの例では、８つの個々のレーンを有する光学的に透明なスライドを含有するフローセルを使用し、それらの表面上に、オリゴヌクレオチドアンカー（例えば、アダプタープライマー）が結合している。フローセルはしばしば、結合させた被検体を保持し、かつ／または結合させた被検体上を試薬溶液が順序正しく通過するのを可能にするように構成することができる固体の支持体である。フローセルは、多くの場合、平面形状であり、光学的に透明であり、一般に、ミリメートルのまたはミリメートルを下回るスケールであり、しばしば、チャネルまたはレーンを有し、それらの中で、被検体と試薬との相互作用が発生する。
一部の実施形態では、合成による配列決定は、鋳型指向性の様式で、プライマーまたは既存の核酸鎖に、ヌクレオチドを反復して付加すること（例えば、共有結合による付加により）を含む。ヌクレオチドが反復付加される度に、検出を行い、核酸鎖の配列が得られるまで、この処理を複数回繰り返す。得られる配列の長さは一部分、実施される付加および検出のステップの数に依存する。合成による配列決定の一部の実施形態では、１ラウンドのヌクレオチド付加で、同じタイプ（例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）の１、２、３つまたはそれ超のヌクレオチドを、付加し、検出する。ヌクレオチドは、任意の適切な方法により（例えば、酵素にまたは化学的に）付加することができる。例えば、一部の実施形態では、ポリメラーゼまたはリガーゼが、鋳型指向性の様式で、プライマーまたは既存の核酸鎖にヌクレオチドを付加する。合成による配列決定の一部の実施形態では、異なるタイプのヌクレオチド、ヌクレオチド類似体および／または識別子を使用する。一部の実施形態では、可逆的ターミネーターおよび／または除去可能（例えば、切断可能）な識別子を使用する。一部の実施形態では、蛍光標識されたヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体を使用する。特定の実施形態では、合成による配列決定は、切断（例えば、識別子の切断および除去）ならびに／または洗浄ステップを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドの付加を、本明細書に記載するまたは当技術分野で公知である適切な方法により検出し、それらの非限定的な例として、任意の適切な撮像装置またはマシン、適切なカメラ、デジタルカメラ、ＣＣＤ（チャージカップルデバイス）に基づく撮像装置（例えば、ＣＣＤカメラ）、ＣＭＯＳ（相補型金属酸化物シリコン（Complementary Metal Oxide Silicon））に基づく撮像装置（例えば、ＣＭＯＳカメラ）、光ダイオード（例えば、光電子増倍管）、電子顕微鏡法、電界効果トランジスタ（例えば、ＤＮＡ電界効果トランジスタ）、ＩＳＦＥＴイオンセンサー（例えば、ＣＨＥＭＦＥＴセンサー）等、またはそれらの組合せが挙げられる。本明細書の方法を実施するために使用することができるその他の配列決定法には、デジタルＰＣＲおよびハイブリダイゼーションによる配列決定が含まれる。
本明細書の方法を実施するために使用することができるその他の配列決定法には、デジタルＰＣＲおよびハイブリダイゼーションによる配列決定が含まれる。デジタルポリメラーゼ連鎖反応（デジタルＰＣＲまたはｄＰＣＲ）を使用して、試料中の核酸の同定および定量を直接行うことができる。一部の実施形態では、デジタルＰＣＲを、エマルジョン中で行うことができる。例えば、個々の核酸を、例えば、マイクロ流体チャンバーデバイス中で分離し、それぞれの核酸を、ＰＣＲにより個々に増幅する。１個のウエル当たり１つ以下の核酸が存在するように核酸を分離することができる。一部の実施形態では、異なるプローブを使用して、種々の対立遺伝子（例えば、胎児の対立遺伝子と母体の対立遺伝子と）を区別することができる。対立遺伝子を数え上げて、コピー数を決定することができる。
特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションによる配列決定を使用することができる。この方法は、複数のポリヌクレオチド配列を、複数のポリヌクレオチドプローブと接触させるステップを含み、複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれを、基材に任意選択でつなぎ止めることができる。一部の実施形態では、基材は、一群のの既知のヌクレオチド配列を有する平らな表面であり得る。アレイへのハイブリダイゼーションのパターンを使用して、試料中に存在するポリヌクレオチド配列を決定することができる。一部の実施形態では、それぞれのプローブを、ビーズ、例えば、磁性ビーズ等につなぎ止める。ビーズへのハイブリダイゼーションを同定し、試料内の複数のポリヌクレオチド配列を同定するために使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載する方法において、ナノポア配列決定を使用することができる。ナノポア配列決定は、単一分子の配列決定の技術であり、それにより、単一の核酸分子（例えば、ＤＮＡ）がナノポアを通過する度に、その配列を直接決定する。本明細書に記載する実施方法に適切なＭＰＳの方法、システムまたは技術プラットフォームを使用して、核酸を配列決定した読取りを得ることができる。ＭＰＳプラットフォームの非限定的な例として、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘ／ＨｉＳｅｑ（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩ；ＨＩＳＥＱ２０００；ＨＩＳＥＱ）、ＳＯＬｉＤ、Ｒｏｃｈｅ／４５４、ＰＡＣＢＩＯおよび／またはＳＭＲＴ、Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｔｒｕｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔおよびイオン半導体に基づく配列決定（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが開発したもの）、ＷｉｌｄＦｉｒｅ、５５００、５５００ｘｌ Ｗおよび／または５５００ｘｌ Ｗ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒに基づく技術（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが開発し、販売するもの、米国特許公開第ＵＳ２０１３００１２３９９号）；ポロニー配列決定、パイロシーケンシング、大規模並行シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）配列決定、ＬａｓｅｒＧｅｎのシステムおよび方法、ナノポアに基づくプラットフォーム、化学感応性電界効果トランジスタ（ＣＨＥＭＦＥＴ）アレイ、電子顕微鏡法に基づく配列決定（例えば、ＺＳ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｈａｌｃｙｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒが開発したもの）、ナノボール配列決定が挙げられる。
一部の実施形態では、染色体に特異的な配列決定を行う。一部の実施形態では、ＤＡＮＳＲ（選択された領域のデジタル分析）を利用して、染色体に特異的な配列決定を行う。選択された領域のデジタル分析を行うことによって、ＰＣＲ鋳型を形成するための、介在「ブリッジ」オリゴヌクレオチドを介する、２つの座位特異的オリゴヌクレオチドのｃｆＤＮＡに依存するカテネーションにより、数百個の座位を同時に定量することが可能になる。一部の実施形態では、染色体に特異的な配列が富化されたライブラリーを生成することによって、染色体に特異的な配列決定を行う。一部の実施形態では、配列の読取りを、選択された一連の染色体についてのみ得る。一部の実施形態では、配列の読取りを、第２１、１８および１３染色体についてのみ得る。
マッピングの読取り
配列の読取りをマッピングすることができ、特定の核酸領域（例えば、染色体、その部分またはセグメント）に対してマッピングする読取りの数を、カウントと呼ぶ。任意の適切なマッピングの方法（例えば、処理、アルゴリズム、プログラム、ソフトウエア、モジュール等、またはそれらの組合せ）を使用することができる。下記に、マッピング処理の特定の態様を記載する。
ヌクレオチド配列の読取り（すなわち、ゲノムの物理的な位置が不明である断片から得られた配列情報）のマッピングを、いくつかの方法で実施することができ、これはしばしば、得られた配列の読取りの、参照ゲノム中の一致する配列とのアラインメントを含む。そのようなアラインメントでは、配列の読取りを一般に、参照配列に対して整列させ、整列させた読取りを、「マッピング」されている、「マッピングされた配列の読取り」または「マッピングされた読取り」と呼ぶ。特定の実施形態では、マッピングされた配列の読取りを、「ヒット」または「カウント」と呼ぶ。一部の実施形態では、マッピングされた配列の読取りを、種々のパラメータに従って、一緒にしてグループ化し、特定の部分に割り当てるが、これに関しては、下記にさらに詳細に論じる。
本明細書で使用する場合、用語「整列させた（ａｌｉｇｎｅｄ）」、「アラインメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）」または「整列する（ａｌｉｇｎｉｎｇ）」により、一致（例えば、１００％同一）または部分一致と同定され得る２つまたはそれ超の核酸配列について言及する。アラインメントは、手作業でまたはコンピュータ（例えば、ソフトウェア、プログラム、モジュールもしくはアルゴリズム）により行うことができ、それらの非限定的な例として、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓパイプラインの一部として流通されているＥｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄａｔａ（ＥＬＡＮＤ）コンピュータプログラムが挙げられる。配列の読取りのアラインメントは、１００％配列一致であり得る。場合によっては、アラインメントは、１００％配列一致よりも低い（すなわち、不完全一致、部分一致、部分アラインメント）。一部の実施形態では、アラインメントは、約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％または７５％一致である。一部の実施形態では、アラインメントは、不一致を含む。一部の実施形態では、アラインメントは、１、２、３、４または５つの不一致を含む。２つまたはそれ超の配列は、いずれかの鎖を使用して整列させることができる。特定の実施形態では、核酸配列を、別の核酸配列の逆相補体と整列させる。
種々の計算方法を使用して、それぞれの配列の読取りをある部分に対してマッピングすることができる。配列を整列させるために使用することができるコンピュータアルゴリズムの非限定的な例として、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＩＴＺ、ＦＡＳＴＡ、ＢＯＷＴＩＥ１、ＢＯＷＴＩＥ２、ＥＬＡＮＤ、ＭＡＱ、ＰＲＯＢＥＭＡＴＣＨ、ＳＯＡＰもしくはＳＥＱＭＡＰ、またはそれらの変更形態もしくはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、配列の読取りを、参照ゲノム中の配列と整列させることができる。一部の実施形態では、配列の読取りを、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ｄｂＥＳＴ、ｄｂＳＴＳ、ＥＭＢＬ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）およびＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）を含めた、当技術分野で公知の核酸のデータベース中に見出し、かつ／またはそれらの中の配列と整列させることができる。ＢＬＡＳＴまたは類似のツールを使用して、同定された配列を配列データベースに照らして検索することができる。次いで、例えば、（下記に記載するように）検索ヒットを使用して、同定された配列を適切な部分へと選別することができる。
一部の実施形態では、読取りを、参照ゲノム中の部分に対してユニークまたは非ユニークにマッピングすることができる。参照ゲノム中の単一配列との整列の場合であれば、読取りは、「ユニークにマッピングされる」とみなされる。参照ゲノム中の２つまたはそれ超の配列との整列の場合であれば、読取りは、「非ユニークにマッピングされる」とみなされる。一部の実施形態では、非ユニークにマッピングされた読取りは、さらなる分析（例えば、定量）から排除される。特定の実施形態では、特定の、低い程度の不一致（０〜１つ）は、参照ゲノムと、マッピングされている、個々の試料から得られた読取りとの間に存在し得る一塩基多型であると説明することができる場合がある。一部の実施形態では、参照配列に対してマッピングされる読取りには、いかなる程度の不一致も許されない。
本明細書で使用する場合、用語「参照ゲノム」は、部分であれ、完全であれ、任意の生物またはウイルスの任意の特定の公知の配列決定されたまたは特徴付けられたゲノムであって、被験体由来の同定された配列を照会するために使用することができるゲノムを指すことができる。例えば、ヒト被験体および多くのその他の生物のために使用する参照ゲノムを、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおけるＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにおいて見出すことができる。「ゲノム」は、核酸配列として表される、生物またはウイルスの完全な遺伝情報を指す。本明細書で使用する場合、参照配列または参照ゲノムはしばしば、１つの個体または複数の個体から得られた、アセンブルしたまたは部分的にアセンブルしたゲノム配列である。一部の実施形態では、参照ゲノムは、１つまたは複数のヒト個体から得られた、アセンブルしたまたは部分的にアセンブルしたゲノム配列である。一部の実施形態では、参照ゲノムは、染色体に割り当てられた配列を含む。
特定の実施形態では、試料核酸が妊娠中の雌に由来する場合、参照配列が時には、胎児にも、胎児の母親にも、胎児の父親にも由来せず、これを本明細書では「外部参照」と呼ぶ。一部の実施形態では、母体の参照を調製し、使用することができる。外部参照に基づいて、妊娠中の雌からの参照（「母体の参照配列」）を調製する場合、胎児のＤＮＡを実質的に含有しない、妊娠中の雌のＤＮＡから得られた読取りをしばしば、外部参照配列に対してマッピングし、アセンブルする。特定の実施形態では、外部参照は、妊娠中の雌と実質的に同じ民族性を有する個体のＤＮＡに由来する。母体の参照配列は、母体のゲノムＤＮＡを完全にはカバーしない場合があり（例えば、母体のゲノムＤＮＡの約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ超をカバーする場合がある）、母体の参照は、母体のゲノムＤＮＡ配列と完全には一致しない場合がある（例えば、母体の参照配列は、複数の不一致を含む場合がある）。
特定の実施形態では、マッピング可能性を、ゲノム領域（例えば、部分、ゲノム部分、部分）について評価する。マッピング可能性は、ヌクレオチド配列の読取りを、参照ゲノムのある部分に対して、典型的には、例えば、０、１、２つまたはそれ超の不一致を含めた、特定の数の不一致が存在するだけで、明確に整列させることができることである。所与のゲノム領域について、事前にセットされた、読取りの長さのスライディングウィンドウのアプローチを使用し、得られた、読取りレベルのマッピング可能性の値を平均化して、予想されるマッピング可能性を推定することができる。ユニークなヌクレオチド配列のストレッチを含むゲノム領域が時には、高いマッピング可能性の値を有する。
部分
一部の実施形態では、マッピングされる配列の読取り（すなわち、配列タグ）を、種々のパラメータに従って、一緒にしてグループ化し、特定の部分（例えば、参照ゲノムの部分）に割り当てる。しばしば、個々のマッピングされる配列の読取りを使用して、試料中に存在する、ある部分（例えば、ある部分の存在、不在または量）を同定することができる。一部の実施形態では、部分の量は、試料中のより大きな配列（例えば、染色体）の量を示す。用語「部分」はまた、本明細書では、「ゲノム区分」、「ビン」、「領域」、「区画」、「参照ゲノムの部分」、「染色体の部分」または「ゲノム部分」と呼ぶこともできる。一部の実施形態では、部分は、染色体全体、染色体のセグメント、参照ゲノムのセグメント、複数の染色体に広がるセグメント、複数の、染色体のセグメント、および／またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、部分は、特定のパラメータ（例えば、指標）に基づいてあらかじめ定義される。一部の実施形態では、部分は、ゲノムの区分化（例えば、サイズ、ＧＣ含有量、連続した領域、恣意的に定義されたサイズの連続した領域等による区分化）に基づいて恣意的にまたは非恣意的に定義される。一部の実施形態では、部分は、個別ゲノムビン、所定の長さの連続配列を有するゲノムビン、可変サイズビン、スムージングされたカバレッジマップの地点ベースの図示、および／またはこれらの組み合わせから選択される。
一部の実施形態では、部分は、例えば、配列の長さまたは１つもしくは複数の特定の特徴を含む、１つまたは複数のパラメータに基づいて描写される。当技術分野で公知であるまたは本明細書に記載する任意の適切な判定基準を使用して、部分は、選択し、フィルタリングし、かつ／または検討事項から除去することができる。一部の実施形態では、部分は、ゲノム配列の特定の長さに基づく。一部の実施形態では、方法は、複数の部分に対してマッピングされた、複数の配列の読取りの分析を含むことができる。部分はおよそ同じ長さであってもよく、または部分は異なる長さであってもよい。一部の実施形態では、部分は、ほぼ等しい長さのものである。一部の実施形態では、異なる長さの部分を調整する、またはそれらに重み付けする。一部の実施形態では、部分は、約１０キロベース（ｋｂ）〜約２０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約２０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂである。一部の実施形態では、部分は、約１０ｋｂ、約２０ｋｂ、約３０ｋｂ、約４０ｋｂ、約５０ｋｂまたは約６０ｋｂの長さである。部分は、配列の連続するランに限定されない。したがって、部分は、連続するおよび／または連続しない配列から構成され得る。部分は、単一の染色体に限定されない。一部の実施形態では、部分は、１つの染色体の全部もしくは一部、または２つもしくはそれ超の染色体の全部もしくは一部を含む。一部の実施形態では、部分は、１、２つまたはそれ超の染色体全体に広がり得る。さらに、部分は、複数の染色体のつながっているまたは離れた領域にも広がり得る。
一部の実施形態では、部分は、目的の染色体、例えば、遺伝子の変動（例えば、第１３、１８および／もしくは２１染色体、または性染色体の異数性）を評価する染色体等における特定の染色体のセグメントであり得る。部分はまた、病原体のゲノム（例えば、細菌の、真菌の、もしくはウイルスの）、またはその断片であり得る。部分は、遺伝子、遺伝子の断片、調節配列、イントロン、エクソン等であり得る。
一部の実施形態では、ゲノム（例えば、ヒトゲノム）を、特定の領域の情報内容に基づいて、部分に区分化する。一部の実施形態では、ゲノムの区分化は、ゲノムにわたって類似の領域（例えば、同一または相同な領域または配列）を排除し、ユニークな領域のみを保持することができる。区分化する間に除去される領域は、単一の染色体内にある場合または複数の染色体に広がる場合がある。一部の実施形態では、区分化されたゲノムを、より迅速なアラインメントのために、切り詰め、最適化して、しばしば、ユニークに同定することが可能な配列に焦点を当てるのを可能にする。
一部の実施形態では、区分化して、類似の領域の重み付けを減らすことができる。下記に、部分の重み付けを減らすための処理について、さらに詳細に論じる。
一部の実施形態では、染色体の範囲を超える領域へのゲノムの区分化は、分類の状況で生成した情報のゲインに基づいて行うことができる。例えば、正常と確認された被験体群と異常と確認された被験体群と（例えば、それぞれ、正倍数体の被験体とトリソミーの被験体と）を区別するための特定のゲノムの場所の有意性を測定するｐ値プロファイルを使用して、情報内容を定量することができる。一部の実施形態では、例えば、タグを整列させる間のスピード／利便性、ＧＣ含有量（例えば、高いもしくは低いＧＣ含有量）、ＧＣ含有量の一様性、配列の含有量のその他の尺度（例えば、個々のヌクレオチドの割合、ピリミジンもしくはプリンの割合、天然核酸対非天然核酸の割合、メチル化ヌクレオチドの割合、およびＣｐＧ含有量）、メチル化状況、二重鎖の融解温度、配列決定もしくはＰＣＲへの適用可能性、参照ゲノムの個々の部分に割り当てられた不確実性の値、ならびに／または特定の特徴を標的とする検索等の任意のその他の判定基準に基づいて、染色体の範囲を超える領域へのゲノムの区分化を行うことができる。
染色体の「セグメント」は、一般に染色体の一部分であり、典型的には部分とは異なる染色体の一部分である。染色体のセグメントは、時には部分とは異なる染色体の領域中にあり、時には部分とはポリヌクレオチドを共有せず、時には部分中にあるポリヌクレオチドを含む。染色体のセグメントは、しばしば部分よりも大きな数のヌクレオチドを含有し（例えば、セグメントは、時には部分を含む）、染色体のセグメントは、時には部分よりも小さな数のヌクレオチドを含有する（例えば、セグメントは、時には部分内にある）。
部分のフィルタリングおよび／または選択
場合によって、本明細書で記載されるか、または当技術分野で公知の、１つもしくは複数の特徴、パラメータ、判定基準、および／または方法に従って、部分を処理する（例えば、正規化、フィルタリング、選択など、またはこれらの組合せを施す）。部分は、任意の適切な方法により、かつ、任意の適切なパラメータに従って処理することができる。部分をフィルタリングおよび／または選択するのに使用しうる特徴および／またはパラメータの非限定的な例は、カウント、カバレッジ、マッピング可能性、可変性、不確定性のレベル、グアニン−シトシン（ＧＣ：ｇｕａｎｉｎｅ−ｃｙｔｏｓｉｎｅ）含有量、ＣＣＦ断片の長さおよび／または読取りの長さ（例えば、断片長比（ＦＬＲ：ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｒａｔｉｏ）、胎児比統計値（ＦＲＳ：ｆｅｔａｌ ｒａｔｉｏ ｓｔａｔｉｓｔｉｃ））、ＤＮアーゼＩ感受性、メチル化状況、アセチル化、ヒストン分布、クロマチン構造など、またはこれらの組合せを含む。部分は、本明細書で列挙または記載される特徴またはパラメータと相関する、任意の適切な特徴またはパラメータに従って、フィルタリングおよび／または選択することができる。部分は、部分に特異的な（例えば、複数の試料に従って、単一の部分について決定された）特徴もしくはパラメータおよび／または試料に特異的な（例えば、試料中の複数の部分について決定された）特徴もしくはパラメータに従って、フィルタリングおよび／または選択することができる。一部の実施形態では、部分を、比較的小さなマッピング可能性、比較的大きな可変性、高い不確定性のレベル、比較的長いＣＣＦ断片の長さ（例えば、低ＦＲＳ、低ＦＬＲ）、反復配列の比較的大きなフラクション、高ＧＣ含有量、低ＧＣ含有量、低カウント、ゼロカウント、高カウントなど、またはこれらの組合せに従って、フィルタリングおよび／または除去する。一部の実施形態では、部分（例えば、部分のサブセット）を、適切なマッピング可能性のレベル、可変性、不確定性のレベル、反復配列のフラクション、カウント、ＧＣ含有量など、またはこれらの組合せに従って選択する。一部の実施形態では、部分（例えば、部分のサブセット）を、比較的短いＣＣＦ断片の長さ（例えば、高ＦＲＳ、高ＦＬＲ）に従って選択する。場合によって、部分（例えば、部分のサブセット）をフィルタリングもしくは選択する前に、かつ／またはフィルタリングもしくは選択した後で、部分へとマッピングしたカウントおよび／または読取りを処理する（例えば、正規化する）。一部の実施形態では、部分（例えば、部分のサブセット）をフィルタリングもしくは選択する前に、かつ／またはフィルタリングもしくは選択した後で、部分へとマッピングしたカウントおよび／または読取りを処理しない。
任意の適切な数の試料に由来する配列の読取りを活用して、本明細書で記載される、１つまたは複数の判定基準、パラメータ、および／または特徴を満たす部分のサブセットを同定することができる。場合によって、複数の妊娠中の雌に由来する試料の群に由来する配列の読取りを活用する。複数の妊娠中の雌の各々に由来する１または複数の試料（例えば、各妊娠中の雌に由来する１〜約２０の試料（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９の試料））に対処することができ、適切な数の妊娠中の雌（例えば、約２〜約１０，０００例の妊娠中の雌（例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００例の妊娠中の雌））に対処することができる。一部の実施形態では、同じ妊娠中の雌に由来する同じ試験試料（複数可）に由来する配列の読取りを、参照ゲノム中の部分へとマッピングし、部分のサブセットを生成するのに使用する。
妊娠中の雌から得られた循環無細胞核酸断片（ＣＣＦ断片）は一般に、胎児細胞に由来する核酸断片（すなわち、胎児断片）と、母体細胞に由来する核酸断片（すなわち、母体断片）とを含むことが観察されている。本明細書では、胎児に由来するＣＣＦ断片から導出された配列の読取りを、「胎児読取り」と称する。本明細書では、胎児を出産する妊娠中の雌（例えば、母親）のゲノムに由来するＣＣＦ断片から導出された配列の読取りを、「母体読取り」と称する。本明細書では、胎児読取りが得られるＣＣＦ断片を、胎児鋳型と称し、本明細書では、母体読取りが得られるＣＣＦ断片を、母体鋳型と称する。
また、ＣＣＦ断片中では、胎児断片は一般に、比較的短く（例えば、約２００塩基対またはそれ未満の長さであり）、母体断片は、このような比較的短い断片と、比較的長い断片とを含むことも観察されている。比較的短い断片に由来する有意な量の読取りをマッピングした部分のサブセットを、選択および／または同定することができる。理論に制約されずに述べると、このような部分へとマッピングした読取りは、胎児読取りについて富化されており、これは、胎児遺伝子分析（例えば、胎児の遺伝子の変動（例えば、胎児の染色体異数性（例えば、Ｔ２１、Ｔ１８および／またはＴ１３））の存在または非存在の検出）の精度を向上させうることが期待される。
しかし、胎児遺伝子分析が、読取りのサブセットに基づく場合、有意な数の読取りを検討しないことが多い。胎児遺伝子分析のための、選択された部分のサブセットへとマッピングした読取りのサブセットの選択と、選択されなかった部分中の読取りの除去とは、例えば、分散の増加に起因して、遺伝子分析の精度を減少させうる。一部の実施形態では、被験体または試料のマップから得られた配列決定の読取りのうちの約３０％〜約７０％（例えば、約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％）は、胎児遺伝子分析のための部分のサブセットを選択するときに検討から除去する。ある特定の実施形態では、被験体または試料から得られた配列決定の読取りのうちの約３０％〜約７０％（例えば、約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％）を、胎児遺伝子分析のために活用される部分のサブセットへとマッピングする。
したがって、理論に制約されずに述べると、胎児読取りの富化と関連する精度の増加と、胎児遺伝子分析のための読取りデータ量の低減（例えば、部分および／または読取りの除去）と関連する精度の減少との間では一般に、トレードオフが存在する。一部の実施形態では、方法は、胎児核酸に由来する読取り（例えば、胎児読取り）について富化された部分のサブセットであって、胎児遺伝子分析の精度を向上させるかまたは有意には減少させない部分のサブセットを選択するステップを含む。本明細書で記載される通り、この見かけのトレードオフにも拘らず、比較的短い断片に由来する有意な量の読取りをマッピングした部分のサブセットを活用することにより、胎児遺伝子分析の精度を向上させうることが決定されている。
一部の実施形態では、部分のサブセットを、ＣＣＦ断片に由来する読取りに従って選択するが、ここで、部分へとマッピングした読取りは、選択された断片の長さ未満の長さを有する。場合によって、部分のサブセットは、この判定基準を満たさない部分をフィルタリングすることにより選択する。ある特定の実施形態では、部分のサブセットを、部分へとマッピングされる比較的短いＣＣＦ断片（例えば、約２００塩基対またはそれ未満）から導出された読取りの量に従って選択する。任意の適切な方法を活用して、選択された断片の長さ未満の長さ（例えば、第１の選択された断片の長さ）を有するＣＣＦ断片に由来する有意な量の読取りをマッピングした部分を同定および／または選択することができる。選択された断片の長さ未満の長さを有するＣＣＦ断片は、比較的短いＣＣＦ断片であることが多く、場合によって、選択された断片の長さは、約２００塩基対またはそれ未満である（例えば、約１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、または８０塩基の長さであるＣＣＦ断片である）。ＣＣＦ断片の長さは、断片から導出された２つまたはそれ超の読取り（例えば、ペアエンド読取り）を、参照ゲノムへとマッピングすることにより決定（例えば、指定または推測）することができる。ＣＣＦ断片から導出されたペアエンド読取りでは、例えば、読取りを、参照ゲノムへとマッピングすることができ、マッピングした読取りの間のゲノム配列の長さを決定することができ、２つの読取りの長さおよび読取りの間のゲノム配列の長さのすべては、ＣＣＦ断片の長さに等しい。場合によって、ＣＣＦ断片鋳型の長さは、断片から導出された読取り（例えば、シングルエンドリード）の長さから直接決定する。
一部の実施形態では、ＣＣＦ断片に由来する有意量の読取りであって、選択された断片の長さ未満の長さを有する読取りについての部分のサブセットは、ＣＣＦ断片に由来する、マッピングした読取りであり、第１の選択された断片の長さ未満の長さを有する読取りの量が、ＣＣＦ断片に由来する、マッピングした読取りであり、第２の選択された断片の長さ未満の長さを有する読取りの量超であるのかどうかに従って選択および／または同定する。ある特定の実施形態では、ＣＣＦ断片に由来する有意な量の読取りであって、選択された断片の長さ未満の長さを有する読取りについての部分のサブセットは、部分についての、ＣＣＦ断片に由来する、マッピングした読取りであり、第１の選択された断片の長さ未満の長さを有する読取りの量が、分析される部分についての、ＣＣＦ断片に由来する、マッピングした読取りであり、第２の選択された断片の長さ未満の長さを有する読取りの量の平均超、平均値超、または中央値超であるのかどうかに従って選択および／または同定する。一部の実施形態では、ＣＣＦ断片に由来する有意な量の読取りであって、選択された断片の長さ未満の長さを有する読取りについての部分のサブセットは、各部分について決定された断片長比（ＦＬＲ）に基づき、選択および／または同定する。本明細書ではまた、「断片長比」を、胎児比統計値（ＦＲＳ）とも称する。
ある特定の実施形態では、ＦＬＲは一部分、部分へとマッピングした、ＣＣＦ断片に由来する読取りであって、選択された断片の長さ未満の長さを有する読取りの量に従って決定する。一部の実施形態では、ＦＬＲ値は、ＸのＹに対する比であることが多く、ここで、Ｘは、第１の選択された断片の長さ未満の長さを有する、ＣＣＦ断片に由来する読取りの量であり、Ｙは、第２の選択された断片の長さ未満の長さを有する、ＣＣＦ断片に由来する読取りの量である。第１の選択された断片の長さは、第２の選択された断片の長さから独立に選択することが多く、この逆も成り立ち、第２の選択された断片の長さは、第１の選択された断片の長さより長いことが典型的である。第１の選択された断片の長さは、約２００塩基またはそれ未満〜約３０塩基またはそれ未満でありうる。一部の実施形態では、第１の選択された断片の長さは、約２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５５、１５０、１４５、１４０、１３５、１３０、１２５、１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、または５０塩基である。一部の実施形態では、第１の選択された断片の長さは、約１７０〜約１３０塩基であり、場合によって、約１６０〜約１４０塩基である。一部の実施形態では、第２の選択された断片の長さは、約２０００塩基〜約２００塩基である。ある特定の実施形態では、第２の選択された断片の長さは、約１０００、９５０、８００、８５０、８００、７５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０塩基である。一部の実施形態では、第１の選択された断片の長さは、約１４０〜約１６０塩基（例えば、約１５０塩基）であり、第２の選択された断片の長さは、約５００〜約７００塩基（例えば、約６００塩基）である。一部の実施形態では、第１の選択された断片の長さは、約１５０塩基であり、第２の選択された断片の長さは、約６００塩基である。
一部の実施形態では、ＦＬＲは、複数のＦＬＲ値の平均、平均値、または中央値である。例えば、場合によって、所与の部分についてのＦＬＲは、（ｉ）２つまたはそれ超の試験試料、（ｉｉ）２体またはそれ超の被験体、または（ｉｉｉ）２つまたはそれ超の試験試料および２体またはそれ超の被験体についてのＦＬＲ値の平均、平均値、または中央値である。ある特定の実施形態では、平均、平均値、または中央値のＦＬＲは、ゲノム、染色体、またはこれらのセグメントの２つまたはそれ超の部分についてのＦＬＲ値から導出する。一部の実施形態では、平均、平均値、または中央値のＦＬＲは、不確定性（例えば、標準偏差、中央値の絶対偏差）と関連する。
一部の実施形態では、部分のサブセットは、１つまたは複数のＦＬＲ値（例えば、１つまたは複数のＦＬＲ値の比較）に従って選択および／または同定する。ある特定の実施形態では、部分のサブセットは、ＦＬＲおよび閾（例えば、ＦＬＲと閾との比較）に従って選択および／または同定する。ある特定の実施形態では、所与の部分から導出された、平均、平均値、または中央値のＦＬＲを、ゲノム、染色体、またはこれらのセグメントの２つまたはそれ超の部分から導出された平均、平均値、または中央値のＦＬＲと比較する。例えば、場合によって、所与の部分についての平均ＦＬＲを、所与の部分についての中央値ＦＬＲと比較する。ある特定の実施形態では、部分は、部分について決定された、平均、平均値、または中央値のＦＬＲと、部分のコレクション（例えば、ゲノム、染色体、またはこれらのセグメントに由来する部分）について決定された、平均、平均値、または中央値のＦＬＲとに従って選択および／または同定する。一部の実施形態では、部分についての平均ＦＬＲは、中央値ＦＬＲに従って決定された、ある特定の閾を下回り、部分を、検討（例えば、胎児遺伝子分析における）から除去する。一部の実施形態では、部分についての平均、平均値、または中央値のＦＬＲは、ゲノム、染色体、またはこれらのセグメントについての平均、平均値、または中央値のＦＬＲに従って決定された、ある特定の閾を上回り、部分を、検討（例えば、遺伝子の変動の存在または非存在を決定する場合の）のために選択し、かつ／またはこのための部分のサブセットへと付加する。一部の実施形態では、部分についてのＦＬＲは、約０．１５〜約０．３０（例えば、約０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９）に等しいかまたはそれ超であり、部分を、検討のために選択する（例えば、胎児遺伝子分析のための部分のサブセットへと付加するかまたは組み込む）。一部の実施形態では、部分についてのＦＬＲは、約０．２０〜約０．１０（例えば、約０．１９、０．１８、０．１７、０．１６、０．１５、０．１４、０．１３、０．１２、０．１１）に等しいかまたはそれ未満であり、部分を、検討から除去する（例えば、フィルタリングする）。
サブセット中の部分は、場合によって、ＣＣＦ断片に由来する有意な量の読取りであって、選択された断片の長さ未満の長さを有する読取りを、部分へとマッピングしたのかどうかに一部分従って（例えば、ＦＬＲに従って）、選択および／または同定する。一部の実施形態では、サブセット中の部分は、マッピングした配列の読取りであって、選択された断片の長さ未満の長さの断片に由来する読取りの量に加えて、１つまたは複数の特徴または判定基準に従って、選択および／または同定することができる。一部の実施形態では、部分のサブセットは、ＣＣＦ断片に由来する有意な量の読取りであって、選択された断片の長さ未満の長さを有する読取りを、部分へとマッピングしたのかどうか（例えば、ＦＬＲに従って）、および１つまたは複数の他の特徴に従って、選択および／または同定する。他の特徴の非限定的な例は、ゲノム中、染色体中、もしくはこれらのセグメント中、および／または部分のうちの１または複数中のエクソンの数および／またはこれらのＧＣ含有量を含む。したがって、場合によって、ＣＣＦ断片に由来する有意な量の読取りであって、選択された断片の長さ未満の長さを有する読取りを、部分へとマッピングしたのかどうかに従って（例えば、ＦＬＲに従って）、サブセットについて選択および／または同定された部分を、部分のＧＣ含有量および／または部分中のエクソンの数に従って、さらに選択または除去する。一部の実施形態では、部分中のＧＣ含有量および／またはエクソンの数が、部分について、ＦＬＲと相関しない場合は、部分を、選択せず、検討から除去しない（例えば、フィルタリングしない）。
一部の実施形態では、部分のサブセットは、本明細書で記載される１つまたは複数の特定の判定基準を満たす部分からなるか、これらから本質的になるか、またはこれらを含む（例えば、部分は、ある特定の値に等しいかまたはそれ超であるＦＬＲを特徴とする）。ある特定の実施形態では、判定基準を満たさない部分を、判定基準を満たす部分のサブセット内に含めて、例えば、胎児遺伝子分析の精度を増加させる。ある特定の実施形態では、判定基準（例えば、ある特定の値に等しいかまたはそれ超であるＦＬＲ）に従って選択された部分「から本質的になる」部分のサブセット内の、部分のうちの約９０％またはそれ超（例えば、約９１％、９１％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ超）は、判定基準を満たし、部分のうちの約１０％またはそれ未満（例えば、約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、約１％またはそれ未満）は、判定基準を満たさない。
部分は、任意の適切な方法により選択および／またはフィルタリングすることができる。一部の実施形態では、部分を、データ、グラフ、プロット、および／または図表の目視に従って選択する。ある特定の実施形態では、部分を、１つまたは複数のマイクロプロセッサおよびメモリを含むシステムまたはマシンにより、選択および／またはフィルタリングする（例えば、一部分）。一部の実施形態では、部分を、実行可能なプログラムをその上に内蔵した非一時的なコンピュータ可読記憶媒体であって、プログラムが、マイクロプロセッサに、選択および／またはフィルタリングを行うように命令する非一時的なコンピュータ可読記憶媒体により、選択および／またはフィルタリングする（例えば、一部分）。
本明細書で記載される方法により選択された部分のサブセットは、胎児遺伝子分析のために、異なる様式で活用することができる。ある特定の実施形態では、試料から導出された読取りを、本明細書で記載される、あらかじめ選択された部分のサブセットを使用し、参照ゲノム中の部分の全てまたは大半を使用しない、マッピング処理において活用する。あらかじめ選択された部分のサブセットへとマッピングされる読取りは、胎児遺伝子分析のさらなるステップで活用することが多く、あらかじめ選択された部分のサブセットへとマッピングされない読取りは、胎児遺伝子分析のさらなるステップで活用しない（例えば、マッピングされない読取りは、除去またはフィルタリングする）ことが多い。
一部の実施形態では、試料から導出された配列の読取りを、参照ゲノムの部分の全てまたは大半へとマッピングし、本明細書で記載される、あらかじめ選択された部分のサブセットを、その後に選択する。選択された部分のサブセットに由来する読取りは、胎児遺伝子分析のさらなるステップで活用することが多い。後者の実施形態では、選択されなかった部分に由来する読取りを、胎児遺伝子分析のさらなるステップで活用しない（例えば、選択されなかった部分中の読取りを除去またはフィルタリングする）ことが多い。
カウント
一部の実施形態では、選択された特徴または変数に基づいてマッピングまたは区分化される配列の読取りを定量して、１つまたは複数の部分（例えば、参照ゲノムの部分）に対してマッピングされる読取りの数を決定することができる。特定の実施形態では、部分に対してマッピングされる配列の読取りの分量をカウントと呼ぶ（例えば、１カウント）。しばしば、カウントを、部分と関連付ける。特定の実施形態では、２つまたはそれ超の部分（例えば、一連の部分）についてのカウントは、数学的に操作される（例えば、平均化、加算、正規化等、またはそれらの組合せ）。一部の実施形態では、カウントは、部分に対してマッピングされる（すなわち、部分と関連付けられる）配列の読取りの一部または全部から決定される。特定の実施形態では、カウントは、マッピングされた配列の読取りのあらかじめ定義されたサブセットから決定される。任意の適切な特徴または変数を利用して、マッピングされる配列の読取りのあらかじめ定義されるサブセットを定義または選択することができる。一部の実施形態では、マッピングされる配列の読取りのあらかじめ定義されたサブセットは、１〜ｎ個の配列の読取りを含むことができ、ここで、ｎは、試験被験体または参照被験体の試料から生成された全ての配列の読取りの合計に等しい数を表わす。
特定の実施形態では、カウントは、当技術分野で公知の適切な方法、演算または数学的処理により処理または操作される配列の読取りから誘導される。カウント（ａ ｃｏｕｎｔ）（例えば、カウント（ｃｏｕｎｔｓ））は、適切な方法、演算または数学的処理により決定することができる。特定の実施形態では、カウントを、ある部分と関連付けた配列の読取りから誘導し、この場合、配列の読取りの一部または全部に対して、重み付け、除去、フィルタリングすること、正規化、調整、平均化、平均値として誘導すること、加算もしくは減算、またはそれらの組合せによる処理が行われる。一部の実施形態では、カウントを、未加工の配列の読取りおよび／またはフィルタリングした配列の読取りから誘導する。特定の実施形態では、カウントの値を、数学的処理により決定する。特定の実施形態では、カウントの値は、ある部分に対してマッピングされた配列の読取りの平均、平均値または合計である。しばしば、カウントは、カウントの平均の数である。一部の実施形態では、カウントは、不確実性の値と関連付けられる。
一部の実施形態では、カウントを操作または転換することができる（例えば、正規化する、組み合わせる、加算する、フィルタリングする、選択する、平均化する、平均値として誘導する等、またはそれらの組合せ）。一部の実施形態では、カウントを転換して、正規化したカウントを生成することができる。当技術分野で公知の方法により、かつ／または本明細書の記載のとおり（例えば、部分に関する（ｐｏｒｔｉｏｎ−ｗｉｓｅ）正規化、ＧＣ含有量による正規化、線形および非線形最小二乗回帰、ＧＣ ＬＯＥＳＳ、ＬＯＷＥＳＳ、ＰＥＲＵＮ、ＲＭ、ＧＣＲＭ、ｃＱｎ、および／またはそれらの組合せにより）、カウントを処理する（例えば、正規化する）ことができる。
カウント（例えば、未加工の、フィルタリングした、および／または正規化したカウント）を、１つまたは複数のレベルに対して処理し、正規化することができる。下記に、レベルおよびプロファイルについてより詳細に記載する。特定の実施形態では、カウントを、参照レベルに対して処理し、かつ／または正規化することができる。本明細書では後に、参照レベルについて扱う。レベルに従って処理したカウント（例えば、処理したカウント）を、不確実性の値（例えば、計算した分散、誤差、標準偏差、Ｚスコア、ｐ値、平均絶対偏差（ｍｅａｎ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）等）と関連付けることができる。一部の実施形態では、不確実性の値が、あるレベルを上回る範囲および下回る範囲を定義する。偏差についての値を、不確実性の値の代わりに使用することができ、偏差の尺度の非限定的な例として、標準偏差、平均絶対偏差（ａｖｅｒａｇｅ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）、絶対偏差の中央値、標準スコア（例えば、Ｚスコア、Ｚスコア、正常スコア、標準化した変数）等が挙げられる。
カウントはしばしば、胎児を出産する妊娠中の雌に由来する核酸試料から得られる。１つまたは複数の部分に対してマッピングされた核酸配列の読取りのカウントはしばしば、胎児および胎児の母親（例えば、妊娠中の雌の被験体）の両方を表示するカウントである。特定の実施形態では、ある部分に対してマッピングされたカウントの一部は、胎児のゲノムに由来し、同じ部分に対してマッピングされたカウントの一部は、母体のゲノムに由来する。
データの処理および正規化
本明細書では、計数されるに至った、マッピングされた配列の読取りを、未加工データと呼び、その理由は、これらのデータが、操作されていないカウント（例えば、未加工カウント）を表示するからである。一部の実施形態では、データセット中の配列の読取りのデータを、さらに処理し（例えば、数学的および／もしくは統計学的に操作し）、かつ／または示して、アウトカムの提供を促進することができる。特定の実施形態では、より大きなデータセットを含めて、データセットは、さらなる分析を促進するために、前処理が役立つ場合がある。データセットの前処理は時には、余分の、かつ／または有益でない部分または参照ゲノムの部分（例えば、有益でないデータを有する参照ゲノムの部分、余分の、マッピングされた読取り、カウントの中央値がゼロである部分、大きな比率を占めるまたは少ない比率を占める配列）の除去を含む。理論により制限されることなく、データの処理および／または前処理は、（ｉ）ノイズの多いデータ（ｎｏｉｓｙ ｄａｔａ）を除去し、（ｉｉ）有益でないデータを除去し、（ｉｉｉ）余分のデータを除去し、（ｉｖ）より大きなデータセットの複雑性を低下させ、かつ／または（ｖ）１つの形態から１つもしくは複数のその他の形態へのデータの転換を促進することができる。本明細書では、用語「前処理」および「処理」は、データまたはデータセットに関して用いる場合には、まとめて「処理」と呼ぶ。処理は、データをさらなる分析に、より適用可能にすることができ、一部の実施形態では、アウトカムをもたらすことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数または全ての処理方法（例えば、正規化の方法、部分をフィルタリングすること、マッピング、検証等、またはそれらの組合せ）が、メモリと併せたプロセッサ、マイクロプロセッサ、コンピュータにより、かつ／またはマイクロプロセッサが制御するマシンにより行われる。
用語「ノイズの多いデータ」は、本明細書で使用する場合、（ａ）分析またはプロットした場合にデータ点間に有意な分散を示すデータ、（ｂ）有意な標準偏差を有する（例えば、３標準偏差よりも大きい）データ、（ｃ）平均値の有意な標準誤差を有するデータ等、および上記の組合せを指す。ノイズの多いデータは、時には出発材料（例えば、核酸試料）の分量および／または品質に起因して発生し、時には配列の読取りを生成するために使用するＤＮＡを調製または複製するための処理の一部から発生する。特定の実施形態では、ノイズは、ＰＣＲに基づく方法を使用して調製する場合の、大きな比率を占める特定の配列から生じる。本明細書に記載する方法は、ノイズの多いデータの寄与を低下させるまたは排除することができ、したがって、ノイズの多いデータの、提供されるアウトカムに対する作用を低下させる。
用語「有益でないデータ」、「有益でない、参照ゲノムの部分」、および「有益でない部分」は、本明細書で使用する場合、所定の閾値とは有意に異なる数値、または値のあらかじめ定義された値の限界範囲の外側に存在する数値を有する部分、またはそこから誘導されたデータを指す。用語「閾」および「閾値」は、本明細書では、適格なデータセットを使用して計算される任意の数を指し、遺伝子の変動（例えば、コピー数の変動、異数性、染色体異常等）の診断の限界として役立つ。特定の実施形態では、本明細書に記載する方法により得られた結果が閾を上回り、被験体が、遺伝子の変動（例えば、２１トリソミー）を有すると診断される。一部の実施形態では、閾値または値の範囲はしばしば、（例えば、参照および／または被験体から得られた）配列の読取りのデータを数学的および／または統計学的に操作することによって計算され、特定の実施形態では、閾値または値の範囲を生成するために操作される配列の読取りのデータは、（例えば、参照および／または被験体から得られた）配列の読取りのデータである。一部の実施形態では、不確実性の値を決定する。不確実性の値は、一般に分散または誤差の尺度であり、分散または誤差の任意の適切な尺度であり得る。一部の実施形態では、不確実性の値は、標準偏差、標準誤差、計算した分散、ｐ値または平均絶対偏差（ＭＡＤ）である。一部の実施形態では、不確実性の値を、実施例４の方式に従って計算することができる。
本明細書に記載するデータセットを処理するために、任意の適切な手順を利用することができる。データセットを処理するために使用するのに適切な手順の非限定的な例として、フィルタリングすること、正規化すること、重み付けすること、ピークの高さをモニタリングすること、ピークの面積をモニタリングすること、ピークのエッジをモニタリングすること、面積比を決定すること、データを数学的に処理すること、データを統計学的に処理すること、統計学的アルゴリズムを適用すること、固定変数を用いて分析すること、最適化された変数を用いて分析すること、データをプロットし、パターンまたは傾向を確認して、さらなる処理を行うこと等、および上記の組合せが挙げられる。一部の実施形態では、種々の特徴（例えば、ＧＣ含有量、余分の、マッピングされた読取り、セントロメア領域、テロメア領域等、およびそれらの組合せ）、ならびに／または変数（例えば、胎児の性別、母体の年齢、母体の倍数性、胎児核酸のパーセント寄与等、またはそれらの組合せ）に基づいて、データセットは処理される。特定の実施形態では、本明細書の記載のとおりデータセットを処理することによって、大きいおよび／または複雑なデータセットの複雑性および／または次元性を低下させることができる。複雑なデータセットの非限定的な例として、年齢および民族性の背景が異なる１つまたは複数の試験被験体および複数の参照被験体から生成された配列の読取りのデータが挙げられる。一部の実施形態では、データセットは、それぞれの試験被験体および／または参照被験体について、数千〜数百万個の配列の読取りを含むことができる。
特定の実施形態では、データ処理を、任意の数のステップで行うことができる。例えば、一部の実施形態では、単一の処理手順のみを使用して、データを処理することができ、特定の実施形態では、１つもしくは複数、５つもしくはそれ超、１０個もしくはそれ超、または２０個もしくはそれ超の処理ステップ（例えば、１つもしくは複数の処理ステップ、２つもしくはそれ超の処理ステップ、３つもしくはそれ超の処理ステップ、４つもしくはそれ超の処理ステップ、５つもしくはそれ超の処理ステップ、６つもしくはそれ超の処理ステップ、７つもしくはそれ超の処理ステップ、８つもしくはそれ超の処理ステップ、９つもしくはそれ超の処理ステップ、１０個もしくはそれ超の処理ステップ、１１個もしくはそれ超の処理ステップ、１２個もしくはそれ超の処理ステップ、１３個もしくはそれ超の処理ステップ、１４個もしくはそれ超の処理ステップ、１５個もしくはそれ超の処理ステップ、１６個もしくはそれ超の処理ステップ、１７個もしくはそれ超の処理ステップ、１８個もしくはそれ超の処理ステップ、１９個もしくはそれ超の処理ステップ、または２０個もしくはそれ超の処理ステップ）を使用して、データを処理することができる。一部の実施形態では、処理ステップは、２回またはそれ超の回数繰り返される同じステップであり得（例えば、２回またはそれ超の回数フィルタリングする、２回またはそれ超の回数正規化する）、特定の実施形態では、処理ステップは、同時または順次に行われる２つまたはそれ超の異なる処理ステップであり得る（例えば、フィルタリングし、正規化する；正規化し、ピークの高さおよびエッジをモニタリングする；フィルタリングし、正規化し、参照に対して正規化し、統計学的に操作して、ｐ値を決定する等）。一部の実施形態では、同じまたは異なる処理ステップの任意の適切な数および／または組合せを利用し、配列の読取りのデータを処理して、アウトカムの提供を促進することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載する判定基準によりデータセットを処理することによって、データセットの複雑性および／または次元性を低下させることができる。
一部の実施形態では、１つまたは複数の処理ステップは、１つまたは複数のフィルタリングステップを含むことができる。用語「フィルタリングする」は、本明細書で使用する場合、部分または参照ゲノムの部分を検討事項から除去することを指す。これらに限定されないが、余分のデータ（例えば、余分なまたはオーバーラップする、マッピングされた読取り）、有益でないデータ（例えば、カウントの中央値がゼロである参照ゲノムの部分）、大きな比率を占めるもしくは少ない比率を占める配列を有する参照ゲノムの部分、ノイズの多いデータ等、または上記の組合せを含めた、任意の適切な判定基準に基づいて、参照ゲノムの部分を選択して、除去することができる。フィルタリング処理はしばしば、参照ゲノムの１つまたは複数の部分を検討事項から除去すること、および、除去するために選択された参照ゲノムの１つまたは複数の部分におけるカウントを、参照ゲノム、１つもしくは複数の染色体、または検討下のゲノムの部分について計数したかまたは合計したカウントから減算することを含む。一部の実施形態では、参照ゲノムの部分を、逐次的に除去する（例えば、１つずつ除去して、それぞれの個々の部分の除去の作用の評価を可能にする）ことができ、特定の実施形態では、除去するためにマークされた、参照ゲノムの部分全てを、同時に除去することができる。一部の実施形態では、特定のレベルを上回るまたは下回る分散により特徴付けられた参照ゲノムの部分を除去し、本明細書では、これを時には、参照ゲノムの「ノイズの多い」部分をフィルタリングすると呼ぶ。特定の実施形態では、フィルタリング処理は、部分、染色体または染色体のセグメントの平均プロファイルレベルから、プロファイルの分散の所定の倍数だけ逸脱するデータ点を、データセットから得ることを含み、特定の実施形態では、フィルタリング処理は、部分、染色体または染色体のセグメントの平均プロファイルレベルから、プロファイルの分散の所定の倍数だけ逸脱しないデータ点を、データセットから除去することを含む。一部の実施形態では、フィルタリング処理を利用して、遺伝子の変動の存在または非存在について分析する、参照ゲノムの候補となる部分の数を低下させる。遺伝子の変動（例えば、微小欠失、微小重複）の存在または非存在について分析する、参照ゲノムの候補となる部分の数を低下させることによって、しばしばデータセットの複雑性および／または次元性を低下させ、時には遺伝子変動および／または遺伝子異常の検索および／または同定のスピードを２桁またはそれ超だけ増加させる。
一部の実施形態では、１つまたは複数の処理ステップは、１つまたは複数の正規化ステップを含むことができる。正規化は、本明細書に記載するまたは当技術分野で公知である適切な方法により行うことができる。特定の実施形態では、正規化は、異なるスケールで測定された値を、概念的に（ｎｏｔｉｏｎａｌｌｙ）共通のスケールに調整することを含む。特定の実施形態では、正規化は、調整された値の確率分布をアラインメントに至らせるための高度な数学的調整を含む。一部の実施形態では、正規化は、分布を正規分布にそろえることを含む。特定の実施形態では、正規化は、特定の全体的な影響（例えば、誤差および異常）の作用を排除する方法で、異なるデータセットについて正規化した対応する値を比較するのを可能にする数学的調整を含む。特定の実施形態では、正規化は、スケーリングを含む。正規化は時には、所定の変数または式による１つまたは複数のデータセットの除算を含む。正規化の方法の非限定的な例として、部分に関する正規化、ＧＣ含有量による正規化、線形および非線形最小二乗回帰、ＬＯＥＳＳ、ＧＣ ＬＯＥＳＳ、ＬＯＷＥＳＳ（局所重み付け散布図平坦化）、ＰＥＲＵＮ、リピートマスクキング（ＲＭ）、ＧＣ正規化およびリピートマスクキング（ＧＣＲＭ）、条件付分位数正規化（ｃＱｎ）、ならびに／またはそれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、遺伝子の変動の存在または非存在（例えば、異数性、）の決定は、正規化の方法（例えば、部分に関する正規化、ＧＣ含有量による正規化、線形および非線形最小二乗回帰、ＬＯＥＳＳ、ＧＣ ＬＯＥＳＳ、ＬＯＷＥＳＳ（局所重み付け散布図平坦化）、ＰＥＲＵＮ、リピートマスクキング（ＲＭ）、ＧＣ正規化およびリピートマスクキング（ＧＣＲＭ）、ｃＱｎ、当技術分野で公知の正規化の方法、ならびに／またはそれらの組合せ）を利用する。一部の実施形態において、カウントは正規化される。
例えば、ＬＯＥＳＳとは、当技術分野で公知の回帰モデル化法であって、多重回帰モデルを、最近傍法ベースのメタモデル内で組み合わせる回帰モデル化法である。ＬＯＥＳＳは、場合によって、局所重み付け多項式回帰と称する。一部の実施形態では、ＧＣ ＬＯＥＳＳでは、ＬＯＥＳＳモデルを、断片のカウント（例えば、配列の読取り、カウント）と、参照ゲノムの部分についてのＧＣ組成との間の関係へと適用する。データ点のセットを通る滑らかな曲線のプロッティングであって、ＬＯＥＳＳを使用するプロッティングは、場合によって、ＬＯＥＳＳ曲線と呼ばれ、特に、各平滑値が、ｙ軸の散布図基準変数の値の区間にわたる、重み付き二次最小二乗回帰により与えられる場合、そう呼ばれる。データセット中の各点について、ＬＯＥＳＳ法は、低次多項式を、説明変数値がその応答が推定される点の近傍にあるデータのサブセットへと適合させる。多項式は、その応答が推定される点の近傍の点には大きな重みを与え、遠く離れた点には小さな重みを与える、重み付き最小二乗法を使用して適合させる。次いで、点についての回帰関数値を、そのデータ点についての説明変数値を使用して、局所多項式の値を評価することにより得る。ＬＯＥＳＳ適合は、場合によって、回帰関数値を、データ点の各々について計算した後において、完全であると考えられる。多項式モデルの次数および重みなど、この方法の詳細の多くは、適応性がある。
任意の適切な数の正規化を使用することができる。一部の実施形態では、データセットを、１回もしくは複数回、５回もしくはそれ超の回数、１０回もしくはそれ超の回数、または２０回またはそれ超の回数さえ正規化することができる。データセットを、任意の適切な特徴または変数（例えば、試料データ、参照データ、または両方）を表示する値（例えば、正規化する値）に対して正規化することができる。使用することができるデータの正規化のタイプの非限定的な例として、１つまたは複数の選択された試験部分または参照部分についての未加工カウントデータを、その上で、選択された部分または区分がマッピングされる染色体またはゲノム全体に対してマッピングされるカウントの総数に対して正規化すること；１つまたは複数の選択された部分についての未加工カウントデータを、その上で、選択された部分またはセグメントがマッピングされる１つもしくは複数の部分または染色体についての参照のカウントの中央値に対して正規化すること；未加工カウントデータを、あらかじめ正規化されたデータまたはそれらの誘導値に対して正規化すること；および先に正規化されたデータを、１つまたは複数のその他の所定の正規化変数に対して正規化することが挙げられる。データセットの正規化は時には、所定の正規化変数として選択された特徴または特性に応じて、統計学的誤差を単離する作用を有する。また、データセットの正規化は時には、異なるスケールを有するデータのデータとしての特徴の比較を、データに共通のスケール（例えば、所定の正規化変数）を与えることによって可能にする。一部の実施形態では、統計学的に誘導された値に対する１回または複数回の正規化を利用して、データの差を最小化し、外れたデータの重要性を減少させることができる。部分または参照ゲノムの部分を正規化する値に関して正規化することを時には、「部分に関する正規化」と呼ぶ。
特定の実施形態では、正規化を含む処理ステップは、静止したウィンドウに対して正規化することを含み、一部の実施形態では、正規化を含む処理ステップは、移動するウィンドウまたはスライディングウィンドウに対して正規化することを含む。用語「ウィンドウ」は、本明細書で使用する場合、分析のために選ばれた１つまたは複数の部分を指し、時には、比較のための参照として使用される（例えば、正規化および／またはその他の数学的もしくは統計学的な操作ために使用される）。用語「静止したウィンドウに対して正規化する」は、本明細書で使用する場合、試験被験体のデータセットと参照被験体のデータセットとを比較するために選択された１つまたは複数の部分を使用する正規化の処理を指す。一部の実施形態では、選択された部分を利用して、プロファイルを生成する。静止したウィンドウは一般に、操作および／または分析の間に変化しない所定の一連の部分を含む。用語「移動するウィンドウに対して正規化する」および「スライディングウィンドウに対して正規化する」は、本明細書で使用する場合、選択された試験部分のゲノム領域に限局される部分（例えば、遺伝子の直近の周囲の、隣接する部分または区分等）に対して行われる正規化を指し、この場合、１つまたは複数の選択された試験部分は、選択された試験部分の直近の周囲の部分に対して正規化される。特定の実施形態では、選択された部分を利用して、プロファイルを生成する。スライディングウィンドウまたは移動するウィンドウの正規化はしばしば、隣接する試験部分に向けて繰り返し移動またはスライディングさせ、新たに選択された試験部分を、新たに選択された試験部分の直近の周囲の部分または新たに選択された試験部分に隣接する部分に対して正規化することを含み、この場合、隣接するウィンドウは、共通する１つまたは複数の部分を有する。特定の実施形態では、複数の選択された試験部分および／または染色体を、スライディングウィンドウ処理により分析することができる。
一部の実施形態では、スライディングウィンドウまたは移動するウィンドウに対して正規化することによって、１つまたは複数の値を生成することができ、この場合、それぞれ値は、ゲノムの異なる領域（例えば、染色体）から選択された異なる一連の参照部分に対する正規化を表示する。特定の実施形態では、生成された１つまたは複数の値は、累積合計（例えば、選択された部分、ドメイン（例えば、染色体の一部分）または染色体にわたり正規化されたカウントプロファイルの積分の数的な推定値）である。スライディングウィンドウまたは移動するウィンドウの処理により生成された値を使用して、プロファイルを生成し、アウトカムに到達するのを促進することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分の累積合計を、ゲノムの位置の関数として示すことができる。時には、移動するウィンドウまたはスライディングウィンドウの分析を使用して、ゲノムを微小欠失および／または微小挿入の存在または非存在について分析する。特定の実施形態では、１つまたは複数の部分の累積合計を示すことを使用して、遺伝子の変動（例えば、微小欠失、微小重複）の領域の存在または非存在を同定する。一部の実施形態では、移動するウィンドウまたはスライディングウィンドウの分析を使用して、微小欠失を含有するゲノム領域を同定し、特定の実施形態では、移動するウィンドウまたはスライディングウィンドウの分析を使用して、微小重複を含有するゲノム領域を同定する。
本明細書では、核酸指標と関連する誤差を低減するための特定の有用な正規化法を、パラメータ化誤差除去および不偏正規化（ＰＥＲＵＮ：ｐａｒａｍｅｔｅｒｉｚｅｄ ｅｒｒｏｒ ｒｅｍｏｖａｌ ａｎｄ ｕｎｂｉａｓｅｄ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）と称するが、これは、本明細書ならびに本文、表、等式、および図面の全てを含むその全内容が参照により本明細書に援用される、例えば、米国特許出願第１３／６６９，１３６号および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／５９１２３号（ＷＯ２０１３／０５２９１３）において記載されている。ＰＥＲＵＮ法は、このような指標に基づく予測を交絡させる誤差の影響を低減する目的で、様々な核酸指標（例えば、核酸配列の読取り）へと適用することができる。
例えば、ＰＥＲＵＮ法を、試料に由来する核酸配列の読取りへと適用し、ゲノム区分のレベルの決定を損ないうる誤差の影響を低減することができる。このような適用は、核酸配列の読取りを使用して、被験体における遺伝子の変動の存在または非存在であって、ヌクレオチド配列の様々なレベル（例えば、部分レベル、ゲノム区分のレベル）として顕在化される存在または非存在を決定するのに有用である。部分中の変動の非限定的な例は、染色体の異数性（例えば、トリソミー２１、トリソミー１８、トリソミー１３）および性染色体の存在または非存在（例えば、女性におけるＸＸ対男性におけるＸＹ）である。常染色体（例えば、性染色体以外の染色体）のトリソミーは、罹患した常染色体と称することができる。ゲノム区分のレベルにおける変動の他の非限定的な例は、微小欠失、微小挿入、重複、およびモザイク現象を含む。
ある特定の適用では、ＰＥＲＵＮ法では、部分と称する特定のゲノム群についての核酸指標を正規化することにより、実験上の偏りを低減することができる。部分は、その非限定的な例が、本明細書では、ゲノム区分または参照ゲノムの部分と称する、連続的なヌクレオチドの長さを含む、核酸指標の適切なコレクションを含む。ビンは、本明細書で記載される、他の核酸指標を含みうる。このような適用では、ＰＥＲＵＮ法は一般に、いくつかの試料にわたる、特定のビンにおいて核酸指標を三次元で正規化する。
ある特定の適用では、ＰＥＲＵＮ法では、参照ゲノムの特定のセグメント（例えば、部分）へとマッピングした核酸指標（例えば、カウント、読取り）を正規化することにより、実験上および／またはシステム上の偏りを低減することができる。このような適用では、ＰＥＲＵＮ法は一般に、いくつかの試料にわたり、参照ゲノムの特定の部分における核酸の読取りのカウントを、三次元で正規化する。ＰＥＲＵＮについての詳細な記載およびその適用については、本明細書の実施例節、本文、表、等式、および図面の全てを含むその全内容が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／５９１２３号（ＷＯ２０１３／０５２９１３）および米国特許出願公開第ＵＳ２０１３００８５６８１号において提示されている。
ある特定の実施形態では、ＰＥＲＵＮ法は、参照ゲノム部分についてのゲノム区分のレベルを、（ａ）試験試料についての、参照ゲノム部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、（ｂ）試験試料についての、実験上の偏り（例えば、ＧＣの偏り）、および（ｃ）（ｉ）配列の読取りがマッピングされる参照ゲノム部分についての実験上の偏りと、（ｉｉ）部分へとマッピングした配列の読取りのカウントとの適合させた関係についての、１つまたは複数の適合パラメータ（例えば、適合の推定値）から計算するステップを含む。参照ゲノム部分の各々についての実験上の偏りは、複数の試料にわたり、各試料についての適合させた関係であって、（ｉ）参照ゲノム部分の各々へとマッピングした配列の読取りのカウントと、（ｉｉ）参照ゲノム部分の各々についてのマッピング特徴との関係に従って決定することができる。各試料についてのこの適合させた関係は、複数の試料について、三次元でアセンブルすることができる。ある特定の実施形態では、アセンブリーを、実験上の偏りに従って整序することができるが、ＰＥＲＵＮ法は、実験上の偏りに従ってアセンブリーを整序することなく実施することができる。各試料についての適合させた関係と、参照ゲノムの各部分についての適合させた関係とは、当技術分野で公知の適切な適合法（例えば、適合モデル）により、線形関数または非線形関数へと独立に適合させることができる。関係を適合させるのに使用しうる適切なモデルの非限定的な例は、線形回帰モデル、単純回帰モデル、通常の最小二乗回帰モデル、重回帰モデル、一般的な重回帰モデル、多項式回帰モデル、一般線形モデル、一般化線形モデル、離散選択回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、多項ロジットモデル、混合ロジットモデル、プロビットモデル、多項プロビットモデル、順序ロジットモデル、順序プロビットモデル、ポアソンモデル、多変量応答回帰モデル、マルチレベルモデル、固定効果モデル、ランダム効果モデル、混合モデル、非線形回帰モデル、ノンパラメトリックモデル、セミパラメトリックモデル、ロバストモデル、クォンタイルモデル、アイソトニックモデル、主成分モデル、最小角モデル、ローカルモデル、セグメント化モデル、および変数誤差モデルを含む。
一部の実施形態では、関係は、幾何学的関係および／またはグラフ的関係である。本明細書で使用される「関係（ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）」および「関係（ｒｅｌａｔｉｏｎ）」という用語は、同義である。一部の実施形態では、関係は、数学的関係である。一部の実施形態では、関係は、プロットされる。一部の実施形態では、関係は、線形関係である。ある特定の実施形態では、関係は、非線形関係である。ある特定の実施形態では、関係は、回帰（例えば、回帰直線）である。回帰は、線形回帰の場合もあり、非線形回帰の場合もある。関係は、数式により表すことができる。関係は一部分、１つもしくは複数の定数および／または１つもしくは複数の変数により規定されることが多い。関係は、当技術分野で公知の方法により生成することができる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の試料について、二次元の関係を生成することができ、誤差の証明となる変数、または誤差の証明となる可能性が高い変数を、次元のうちの１または複数について選択することができる。関係は、例えば、当技術分野で公知のグラフ作成ソフトウェアであって、使用者により用意される２つまたはそれ超の変数の値を使用してグラフをプロットするソフトウェアを使用して、生成することができる。関係は、当技術分野で公知の方法を使用して（例えば、回帰、回帰分析を行うことにより、例えば、適切な回帰プログラム、例えば、ソフトウェアにより）適合させることができる。ある特定の関係には、線形回帰を適合させることができ、線形回帰により、傾き値および切片値を生成することができる。ある特定の関係は、場合によって、線形ではなく、例えば、放物線関数、双曲線関数、または指数関数（例えば、二次関数）などの非線形関数を適合させることができる。
ＰＥＲＵＮ法では、適合させた関係のうちの１または複数は、線形でありうる。妊娠中の雌に由来する無細胞循環核酸ついての分析であって、実験上の偏りをＧＣの偏りとし、マッピング特徴をＧＣ含有量とする分析では、試料についての適合させた関係であって、（ｉ）各部分へとマッピングした配列の読取りのカウントと、（ｉｉ）参照ゲノムの部分の各々についてのＧＣ含有量との間の関係は、線形でありうる。この適合させた関係では、傾きは、ＧＣの偏りに関連し、適合させた関係を、複数の試料にわたりアセンブルする場合、ＧＣの偏り係数は、各試料について決定することができる。このような実施形態では、複数の試料および部分についての適合させた関係であって、（ｉ）部分についてのＧＣの偏り係数と、（ｉｉ）部分へとマッピングした配列の読取りのカウントとの間の関係もまた、線形でありうる。切片および傾きは、この適合させた関係から得ることができる。このような適用では、傾きは、ＧＣ含有量に基づく試料特異的な偏りに対処し、切片は、全ての試料に共通する、部分特異的な減衰パターンに対処する。ＰＥＲＵＮ法により、このような試料特異的な偏りおよび部分特異的な減衰であって、アウトカム（例えば、遺伝子の変動の存在または非存在；胎児の性別の決定）をもたらすためにゲノム区分のレベルを計算する場合の偏りおよび減衰を有意に低減することができる。
一部の実施形態では、ＰＥＲＵＮ正規化に、線形関数への適合を使用し、これを、等式Ａ、等式Ｂ、またはその派生形により記載する。
等式Ａ：
Ｍ＝ＬＩ＋ＧＳ （Ａ）
等式Ｂ：
Ｌ＝（Ｍ−ＧＳ）／Ｉ （Ｂ）
一部の実施形態では、Ｌは、ＰＥＲＵＮにより正規化されたレベルまたはＰＥＲＵＮにより正規化されたプロファイルである。一部の実施形態では、Ｌは、ＰＥＲＵＮ正規化手順からの所望の出力である。ある特定の実施形態では、Ｌは、部分特異的である。一部の実施形態では、Ｌは、参照ゲノムの複数の部分に従って決定され、ゲノム、染色体、その部分またはセグメントの、ＰＥＲＵＮにより正規化されたレベルを表示する。レベルＬは、さらなる分析（例えば、Ｚ値、母体の欠失／重複、胎児の微小欠失／微小重複、胎児の性別、性異数性などを決定する分析）に使用されることが多い。等式Ｂに従う正規化法を、ＰＥＲＵＮ（Ｐａｒａｍｅｔｅｒｉｚｅｄ Ｅｒｒｏｒ Ｒｅｍｏｖａｌ ａｎｄ Ｕｎｂｉａｓｅｄ Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）と名付ける。
一部の実施形態では、Ｇは、線形モデル、ＬＯＥＳＳ、または任意の同等の手法を使用して測定されたＧＣの偏り係数である。一部の実施形態では、Ｇは、傾きである。一部の実施形態では、ＧＣの偏り係数であるＧは、部分ｉについてのカウントＭ（例えば、未加工のカウント）および参照ゲノムから決定された部分ｉのＧＣ含有量についての回帰の傾きとして評価する。一部の実施形態では、Ｇは、Ｍから抽出された副次情報を表し、関係に従って決定される。一部の実施形態では、Ｇは、試料（例えば、試験試料）についての、部分特異的なカウントのセットと、部分特異的なＧＣ含有量値のセットとの関係を表わす。一部の実施形態では、部分特異的なＧＣ含有量は、参照ゲノムから導出される。一部の実施形態では、部分特異的なＧＣ含有量は、観察または測定されたＧＣ含有量（例えば、試料から測定されたＧＣ含有量）から導出される。ＧＣの偏り係数は、試料群中の各試料について決定されることが多く、一般に、試験試料について決定される。ＧＣの偏り係数は、試料特異的であることが多い。一部の実施形態では、ＧＣの偏り係数は、定数である。ある特定の実施形態では、ＧＣの偏り係数は、試料について導出されたら変化しない。
一部の実施形態では、Ｉは、線形関係から導出される切片であり、Ｓは、線形関係から導出される傾きである。一部の実施形態では、ＩおよびＳが導出される関係は、Ｇが導出される関係と異なる。一部の実施形態では、ＩおよびＳが導出される関係は、所与の実験設定について一定である。一部の実施形態では、ＩおよびＳは、複数の試料に従って、カウント（例えば、未加工のカウント）と、ＧＣの偏り係数とに従う線形関係から導出される。一部の実施形態では、ＩおよびＳは、試験試料とは独立に導出される。一部の実施形態では、ＩおよびＳは、複数の試料から導出される。ＩおよびＳは、部分特異的であることが多い。一部の実施形態では、ＩおよびＳを、正倍数体試料中の参照ゲノムの全ての部分についてＬ＝１であるという仮定により決定する。一部の実施形態では、線形関係を、正倍数体試料について決定し、選択部分に特異的なＩ値およびＳ値を決定する（Ｌ＝１と仮定する）。ある特定の実施形態では、同じ手順を、ヒトゲノム中の参照ゲノムの全ての部分へと適用し、切片Ｉおよび傾きＳのセットを、あらゆる部分について決定する。
一部の実施形態では、交差検証法を適用する。交差検証は、場合によって、回転推定とも称する。一部の実施形態では、交差検証法を適用して、試験試料を使用する実践において、予測モデル（例えば、ＰＥＲＵＮなど）が、どのくらい正確に機能するのかについて評価する。一部の実施形態では、１ラウンドの交差検証は、データの試料を、相補サブセットへとパーティショニングするステップと、１つのサブセット（例えば、場合によって、訓練セットと称する）に対して交差検証分析を実施するステップと、別のサブセット（例えば、場合によって、検証セットまたは試験セットと呼ばれる）を使用して、分析の検証するステップとを含む。ある特定の実施形態では、異なるパーティションおよび／または異なるサブセットを使用して、複数ラウンドの交差検証を実施する。交差検証法の非限定的な例は、リーブワンアウト、スライディングエッジ、Ｋ分割、二分割、反復ランダムサブサンプリングなど、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、交差検証では、既知の正倍数性胎児を含む試料のセットのうちの９０％を含有する作業セットをランダムに選択し、このサブセットを使用して、モデルを訓練する。ある特定の実施形態では、ランダムな選択を１００回にわたり反復し、あらゆる部分について、１００の傾きおよび１００の切片のセットを得る。
一部の実施形態では、Ｍの値は、試験試料に由来する実測値である。一部の実施形態では、Ｍは、部分についての測定された未加工のカウントである。値ＩおよびＳが部分について利用可能である一部の実施形態では、測定値Ｍを試験試料から決定し、それを使用して、等式Ｂに従って、ゲノム、染色体、そのセグメントまたは部分についてのＰＥＲＵＮにより正規化されたレベルであるＬを決定する。
したがって、ＰＥＲＵＮ法の、複数の試料にわたり平行した、配列の読取りへの適用により、（ｉ）試料特異的な実験上の偏り（例えば、ＧＣの偏り）および（ｉｉ）試料に共通する部分特異的な減衰により引き起こされる誤差を有意に低減することができる。これらの２つの誤差の発生源の各々に、個別にまたは逐次的に対処する他の方法は、ＰＥＲＵＮ法ほど有効にはこれらを低減することが可能でないことが多い。理論に制約されずに述べると、一部分、その一般に加法的な処理が、他の正規化法（例えば、ＧＣ−ＬＯＥＳＳ）で活用される、一般に乗算的な処理ほど広がりを拡大しないため、ＰＥＲＵＮ法は、誤差をより有効に低減することが期待される。
さらなる正規化技法および統計学的技法も、ＰＥＲＵＮ法と組み合わせて活用することができる。さらなる処理は、ＰＥＲＵＮ法の使用の前、使用の後、および／または使用の間に適用することができる。ＰＥＲＵＮ法と組み合わせて使用されうる処理の非限定的な例については、本明細書の下記で記載される。
一部の実施形態では、ゲノム区分のレベルの、ＧＣ含有量についての二次的正規化または調整は、ＰＥＲＵＮ法と共に活用することができる。適切なＧＣ含有量の調整手順またはＧＣ含有量の正規化手順を活用することができる（例えば、ＧＣ−ＬＯＥＳＳ、ＧＣＲＭ）。ある特定の実施形態では、さらなるＧＣの正規化処理を適用するための特定の試料を選択および／または同定することができる。例えば、ＰＥＲＵＮ法を適用することにより、各試料についてのＧＣの偏りを決定することができ、ある特定の閾を上回るＧＣの偏りと関連する試料を、さらなるＧＣの正規化処理のために選択することができる。このような実施形態では、所定の閾レベルを使用して、このような試料をさらなるＧＣの正規化のために選択することができる。
ある特定の実施形態では、部分のフィルタリング処理または重み付き処理を、ＰＥＲＵＮ法と共に活用することができる。適する部分のフィルタリング処理または重み付き処理を活用することができ、非限定的な例は、本明細書、本文、表、等式、および図面の全てを含むその全内容が参照により本明細書に援用される、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／５９１２３号（ＷＯ２０１３／０５２９１３）および米国特許出願公開第ＵＳ２０１３００８５６８１号において記載されている。一部の実施形態では、母体の挿入、重複、および／または欠失（例えば、母体および／または胎児のコピー数の変動）と関連する誤差を低減する正規化技法を、ＰＥＲＵＮ法と共に活用する。
ＰＥＲＵＮ法により計算されたゲノム区分のレベルは、アウトカムを提示するために直接活用することができる。一部の実施形態では、ゲノム区分のレベルは、胎児フラクションが約２％〜約６％またはそれ超の（例えば、胎児フラクションが約４％またはそれ超の）試料についてのアウトカムを提示するのに直接活用することができる。ＰＥＲＵＮ法により計算されたゲノム区分のレベルは、場合によって、アウトカムを提示するためにさらに処理される。一部の実施形態では、計算されたゲノム区分のレベルを標準化する。ある特定の実施形態では、試験部分（例えば、第２１染色体）について計算されたゲノム区分のレベルの合計、平均値、または中央値を、試験部分以外の部分（例えば、第２１染色体以外の常染色体）について計算されたゲノム区分のレベルの合計、平均値、または中央値で除して、試験ゲノム区分のレベルを生成することができる。試験ゲノム区分のレベルまたは未加工のゲノム区分のレベルは、ＺスコアまたはＺスコアの計算などの標準化分析の一部として使用することができる。Ｚスコアは、期待されたゲノム区分のレベルを、試験ゲノム区分のレベルまたは未加工のゲノム区分のレベルから減算することにより、試料について生成することができ、結果として得られる値を、試料についての標準偏差で除算することができる。ある特定の実施形態では、結果として得られるＺスコアを、異なる試料について分布させ、分析することもできるか、または胎児フラクションおよび他の変数など、他の変数と関係づけ、分析して、アウトカムを提示することもできる。
本明細書で注目される通り、ＰＥＲＵＮ法は、ＧＣの偏りおよびＧＣ含有量に従う正規化自体に限定されず、他の誤差の発生源と関連する誤差を低減するのにも使用することができる。ＧＣ含有量以外の偏りの発生源の非限定的な例は、マッピング可能性である。ＧＣの偏りおよびＧＣ含有量以外の正規化されたパラメータに対処する場合、適合させた関係のうちの１または複数は、非線形（例えば、双曲線、指数）でありうる。一部の実施形態では、実験上の偏りを、非線形関係から決定する場合、例えば、実験上の偏りの曲率の推定について分析することができる。
ＰＥＲＵＮ法は、様々な核酸指標へと適用することができる。核酸指標の非限定的な例は、マイクロアレイ上の特定の位置における核酸配列の読取りおよび核酸レベルである。配列の読取りの非限定的な例は、無細胞循環ＤＮＡ、無細胞循環ＲＮＡ、細胞ＤＮＡおよび細胞ＲＮＡから得られる読取りを含む。ＰＥＲＵＮ法は、参照ゲノムＤＮＡ、参照細胞ＲＮＡ（例えば、トランスクリプトーム）、およびこれらの部分（例えば、ゲノムＤＮＡの相補体またはＲＮＡトランスクリプトームの一部分（複数可）、染色体の一部分（複数可））など、適切な参照配列へとマッピングした配列の読取りへと適用することができる。
したがって、ある特定の実施形態では、細胞核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、核酸指標として役立ちうる。参照ゲノムの部分へとマッピングした細胞核酸の読取りは、ＰＥＲＵＮ法を使用して正規化することができる。細胞核酸の、特定のタンパク質への結合は、場合によって、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ：ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）過程と称する。ＣｈＩＰに富む核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど、細胞タンパク質と会合する核酸である。ＣｈＩＰに富む核酸の読取りは、当技術分野で公知の技術を使用して得ることができる。ＣｈＩＰに富む核酸の読取りは、１つまたは複数の参照ゲノムの部分へとマッピングすることができ、結果は、アウトカムを提示するためのＰＥＲＵＮ法を使用して正規化することができる。
ある特定の実施形態では、細胞ＲＮＡは、核酸指標として用いられうる。細胞ＲＮＡ読取りは、参照ＲＮＡ部分へとマッピングし、アウトカムを提示するためのＰＥＲＵＮ法を使用して正規化することができる。トランスクリプトームと称する細胞ＲＮＡまたはそのセグメントについての公知の配列を、試料に由来するＲＮＡ読取りをマッピングしうる参照として使用することができる。試料ＲＮＡの読取りは、当技術分野で公知の技術を使用して得ることができる。参照へとマッピングしたＲＮＡ読取りの結果は、アウトカムを提示するためのＰＥＲＵＮ法を使用して正規化することができる。
一部の実施形態では、マイクロアレイによる核酸レベルは、核酸指標として役立ちうる。試料にわたり、アレイ上の特定のアドレスの核酸レベルまたはアレイ上でハイブリダイズしている核酸を、ＰＥＲＵＮ法を使用して分析し、これにより、マイクロアレイ分析によりもたらされる核酸指標を正規化することができる。このようにして、マイクロアレイ上の特定のアドレスまたはマイクロアレイ上でハイブリダイズしている核酸は、マッピングした核酸配列の読取りの部分と類義であり、ＰＥＲＵＮ法を使用して、マイクロアレイデータを正規化して、アウトカムの改善をもたらすことができる。
一部の実施形態では、処理ステップは、重み付けを含む。用語「重み付けされる」、「重み付けする」もしくは「重み付け関数」、またはそれらの文法上の派生語もしくは相当語句は、本明細書で使用する場合、特定のデータセットの特徴または変数の影響を、その他のデータセットの特徴または変数に関して変化させる（例えば、１つもしくは複数の部分または参照ゲノムの部分中に含有されるデータの有意性および／または寄与を、参照ゲノムの選択された１つまたは複数の部分中のデータの品質または有用性に基づいて増加または減少させる）ために利用するデータセットの一部または全部の数学的操作を指す。一部の実施形態では、重み付け関数を使用して、比較的小さな測定値の分散を有するデータの影響を増加させること、および／または比較的大きな測定値の分散を有するデータの影響を減少させることができる。例えば、少ない比率を占めるまたは低い品質の配列データを有する参照ゲノムの部分の「重み付けを減らし」て、データセットに対する影響を最小化することができ、一方、参照ゲノムの選択された部分の「重み付けを増やし」て、データセットに対する影響を増加させることもできる。重み付け関数の非限定的な例が、［１／（標準偏差）２］である。重み付けステップは時には、正規化ステップに実質的に類似する様式で行われる。一部の実施形態では、データセットは、所定の変数（例えば、重み付け変数）により除算される。しばしば、所定の変数（例えば、最小化標的関数、Ｐｈｉ）を選択して、データセットの異なる一部分に異なる重み付けを加える（例えば、特定のデータのタイプの影響を増加させ、一方、その他のデータのタイプの影響を減少させる）。
特定の実施形態では、処理ステップは、１つまたは複数の数学的および／または統計学的な操作を含むことができる。任意の適切な数学的および／または統計学的な操作を、単独でまたは組み合わせて使用して、本明細書に記載するデータセットを分析および／操作することができる。任意の適切な数の数学的および／または統計学的な操作を使用することができる。一部の実施形態では、データセットを、数学的および／または統計学的に、１回もしくは複数回、５回もしくはそれ超の回数、１０回もしくはそれ超の回数、または２０回もしくはそれ超の回数操作することができる。使用することができる数学的および統計学的な操作の非限定的な例として、加算、減算、乗算、除算、代数関数、最小二乗推定量、曲線近似、微分方程式、有理多項式、二重多項式、直交多項式、ｚスコア、ｐ値、カイ値、ｐｈｉ値、ピークレベルの分析、ピークのエッジの場所の決定、ピーク面積比の計算、染色体レベルの中央値の分析、平均絶対偏差の計算、残余の二乗の合計、平均値、標準偏差、標準誤差等、またはそれらの組合せが挙げられる。数学的および／または統計学的な操作を、配列の読取りのデータまたはそれらの処理された生成物の全部または一部に対して行うことができる。統計学的に操作することができるデータセットの変数または特徴の非限定的な例として、未加工カウント、フィルタリングしたカウント、正規化したカウント、ピークの高さ、ピークの幅、ピークの面積、ピークのエッジ、ラテラルトレランス（ｌａｔｅｒａｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、Ｐ値、レベルの中央値、平均レベル、ゲノム領域内のカウントの分布、核酸種の相対的な表示等、またはそれらの組合せが挙げられる。
一部の実施形態では、処理ステップは、１つまたは複数の統計学的アルゴリズムの使用を含むことができる。任意の適切な統計学的アルゴリズムを、単独でまたは組み合わせて使用して、本明細書に記載するデータセットを分析および／操作することができる。任意の適切な数の統計学的アルゴリズムを使用することができる。一部の実施形態では、１つもしくは複数、５つもしくはそれ超、１０個もしくはそれ超、または２０個もしくはそれ超の統計学的アルゴリズムを使用して、データセットを分析することができる。本明細書に記載する方法と共に使用するのに適切な統計学的アルゴリズムの非限定的な例として、決定木、対立帰無、多重比較、オムニバス検定、ベーレンス−フィッシャー問題、ブートストラッピング、有意性の独立性検定を組み合わせるためのフィッシャー法、帰無仮説、第一種の過誤、第二種の過誤、正確検定、１標本Ｚ検定、２標本Ｚ検定、１標本ｔ検定、対応のあるｔ検定、等分散を有する２標本プールｔ検定、不等分散を有する２標本非プールｔ検定、１比率ｚ検定、２比率ｚ検定プール、２比率ｚ検定非プール、１標本カイ二乗検定、分散の一様性についての２標本Ｆ検定、信頼区間、信頼区間（ｃｒｅｄｉｂｌｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ）、有意性、メタ分析、単一線形回帰、ロバスト線形回帰等、または上記のものの組合せが挙げられる。統計学的アルゴリズムを使用して分析することができるデータセットの変数または特徴の非限定的な例として、未加工カウント、フィルタリングしたカウント、正規化したカウント、ピークの高さ、ピークの幅、ピークのエッジ、ラテラルトレランス、Ｐ値、レベルの中央値、平均レベル、ゲノム領域内のカウントの分布、核酸種の相対的な表示等、またはそれらの組合せが挙げられる。
特定の実施形態では、複数（例えば、２つもしくはそれ超）の統計学的アルゴリズム（例えば、最小二乗回帰、主成分分析、線形判別分析、二次判別分析、バギング、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシンモデル、ランダムフォレスト、分類木モデル、Ｋ最近傍、ロジスティック回帰および／もしくは損失平滑化）、ならびに／または（例えば、本明細書では操作と呼ぶ）数学的および／もしくは統計学的な操作を利用することによって、データセットを分析することができる。一部の実施形態では、複数の操作の使用により、アウトカムをもたらすために使用することができるＮ次元空間を生成することができる。特定の実施形態では、複数の操作を利用することによりデータセットを分析することによって、データセットの複雑性および／または次元性を低下させることができる。例えば、複数の操作を参照データセットに対して使用することによって、参照試料の遺伝子の状況（例えば、選択された遺伝子の変動について陽性または陰性）に応じて、遺伝子の変動の存在または非存在を表示するために使用することができるＮ次元空間（例えば、確率プロット）を生成することができる。実質的に類似する一連の操作を使用する試験試料の分析を使用して、試験試料のそれぞれについてＮ次元の点を生成することができる。試験被験体のデータセットの複雑性および／または次元性は時には、参照データから生成されたＮ次元空間と容易に比較することができる単一の値またはＮ次元の点に低減される。参照被験体のデータが存在するＮ次元空間に存在する試験試料データは、参照被験体の遺伝子の状況に実質的に類似する遺伝子の状況を示す。参照被験体のデータが存在するＮ次元空間の外側に存在する試験試料データは、参照被験体の遺伝子の状況に実質的に類似しない遺伝子の状況を示す。一部の実施形態では、参照は、正倍数体であるかまたは、別段に、遺伝子の変動も医学的状態も有しない。
一部の実施形態では、データセットを、計数し、任意選択でフィルタリングして正規化した後で、フィルタリングし、かつ／または正規化する１つまたは複数の手順により、これらの処理されたデータセットをさらに操作することができる。特定の実施形態では、フィルタリングし、かつ／または正規化する１つまたは複数の手順によりさらに操作されているデータセットを使用して、プロファイルを生成することができる。一部の実施形態では、時には、フィルタリングし、かつ／または正規化する１つまたは複数の手順により、データセットの複雑性および／または次元性を低下させることができる。低下させた複雑性および／または次元性のデータセットに基づいて、アウトカムをもたらすことができる。
一部の実施形態では、誤差の尺度（例えば、標準偏差、標準誤差、計算した分散、ｐ値、平均絶対誤差（ｍｅａｎ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｅｒｒｏｒ）（ＭＡＥ）、平均絶対偏差および／または平均絶対偏差（ＭＡＤ））に従って、部分をフィルタリングすることができる。特定の実施形態では、誤差の尺度は、カウントの可変性を指す。一部の実施形態では、カウントの可変性に従って、部分をフィルタリングする。特定の実施形態では、カウントの可変性は、複数の試料（例えば、複数の被験体、例えば、５０人／匹もしくはそれ超、１００人／匹もしくはそれ超、５００人／匹もしくはそれ超、１０００人／匹もしくはそれ超、５０００人／匹もしくはそれ超、または１０，０００人／匹もしくはそれ超の被験体から得られた複数の試料）について、参照ゲノムのある部分（すなわち、部分）に対してマッピングされたカウントについて決定した誤差の尺度である。一部の実施形態では、所定の上方範囲を上回るカウントの可変性を有する部分をフィルタリングする（例えば、検討事項から排除する）。一部の実施形態では、所定の上方範囲は、約５０に等しいもしくはそれ超、約５２に等しいもしくはそれ超、約５４に等しいもしくはそれ超、約５６に等しいもしくはそれ超、約５８に等しいもしくはそれ超、約６０に等しいもしくはそれ超、約６２に等しいもしくはそれ超、約６４に等しいもしくはそれ超、約６６に等しいもしくはそれ超、約６８に等しいもしくはそれ超、約７０に等しいもしくはそれ超、約７２に等しいもしくはそれ超、約７４に等しいもしくはそれ超、または約７６に等しいもしくはそれ超のＭＡＤ値である。一部の実施形態では、所定の下方範囲を下回るカウントの可変性を有する部分をフィルタリングする（例えば、検討事項から排除する）。一部の実施形態では、所定の下方範囲は、約４０に等しいもしくはそれ未満、約３５に等しいもしくはそれ未満、約３０に等しいもしくはそれ未満、約２５に等しいもしくはそれ未満、約２０に等しいもしくはそれ未満、約１５に等しいもしくはそれ未満、約１０に等しいもしくはそれ未満、約５に等しいもしくはそれ未満、約１に等しいもしくはそれ未満、または約０に等しいもしくはそれ未満のＭＡＤ値である。一部の実施形態では、所定の範囲の外側にあるカウントの可変性を有する部分をフィルタリングする（例えば、検討事項から排除する）。一部の実施形態では、所定の範囲は、ゼロ超から、約７６未満、約７４未満、約７３未満、約７２未満、約７１未満、約７０未満、約６９未満、約６８未満、約６７未満、約６６未満、約６５未満、約６４未満、約６２未満、約６０未満、約５８未満、約５６未満、約５４未満、約５２未満または約５０未満までのＭＡＤ値である。一部の実施形態では、所定の範囲は、ゼロ超から約６７．７未満までのＭＡＤ値である。一部の実施形態では、所定の範囲内のカウントの可変性を有する部分を選択する（例えば、遺伝子の変動の存在または非存在を決定するために使用する）。
一部の実施形態では、部分のカウントの可変性が、分布（例えば、正規分布）を示す。一部の実施形態では、部分は、分布のクォンタイル内で選択される。一部の実施形態では、分布の約９９．９％に等しいもしくはそれ未満、約９９．８％に等しいもしくはそれ未満、約９９．７％に等しいもしくはそれ未満、約９９．６％に等しいもしくはそれ未満、約９９．５％に等しいもしくはそれ未満、約９９．４％に等しいもしくはそれ未満、約９９．３％に等しいもしくはそれ未満、約９９．２％に等しいもしくはそれ未満、約９９．１％に等しいもしくはそれ未満、約９９．０％に等しいもしくはそれ未満、約９８．９％に等しいもしくはそれ未満、約９８．８％に等しいもしくはそれ未満、約９８．７％に等しいもしくはそれ未満、約９８．６％に等しいもしくはそれ未満、約９８．５％に等しいもしくはそれ未満、約９８．４％に等しいもしくはそれ未満、約９８．３％に等しいもしくはそれ未満、約９８．２％に等しいもしくはそれ未満、約９８．１％に等しいもしくはそれ未満、約９８．０％に等しいもしくはそれ未満、約９７％に等しいもしくはそれ未満、約９６％に等しいもしくはそれ未満、約９５％に等しいもしくはそれ未満、約９４％に等しいもしくはそれ未満、約９３％に等しいもしくはそれ未満、約９２％に等しいもしくはそれ未満、約９１％に等しいもしくはそれ未満、約９０％に等しいもしくはそれ未満、約８５％に等しいもしくはそれ未満、約８０％に等しいもしくはそれ未満、または約７５％に等しいもしくはそれ未満のクォンタイル内の部分が選択される。一部の実施形態では、カウントの可変性の分布の９９％クォンタイル内の部分が選択される。一部の実施形態では、９９％クォンタイル内で、ＭＡＤ＞０およびＭＡＤ＜６７．７２５を有する部分が選択され、その結果、参照ゲノムの一連の安定な部分が同定される。
ＰＥＲＵＮに関する、部分をフィルタリングすることの非限定的な例が、本明細書および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／５９１２３（ＷＯ２０１３／０５２９１３）号に示されており、後者は、全ての文書、表、等式および図面を含めた、その内容全体が、参照により本明細書に援用されている。誤差の尺度に基づいて、または誤差の尺度の一部に基づいて、部分をフィルタリングすることができる。特定の実施形態では、Ｒ因子等の偏差の絶対値を含む誤差の尺度を使用して、部分の除去または部分への重み付けを行うことができる。Ｒ因子は、一部の実施形態では、実際の測定値から予測されるカウントの値の絶対偏差の合計を、実際の測定値から予測されるカウントの値で除算した結果と定義する（例えば、本明細書の等式Ｂ）。偏差の絶対値を含む誤差の尺度を使用することができるが、誤差の適切な尺度もそれに代わって利用することができる。特定の実施形態では、偏差の絶対値を含まない誤差の尺度、例として、二乗に基づくばらつきを利用することができる。一部の実施形態では、マッピング可能性の尺度（例えば、マッピング可能性スコア）に従って、部分をフィルタリングするまたは重み付けする。時には、部分に対してマッピングされた、比較的低い数の配列の読取り（例えば、部分に対してマッピングされた、０、１、２、３、４、５つの読取り）に従って、その部分をフィルタリングするまたは重み付けする。実施している分析のタイプに従って、部分をフィルタリングするまたは重み付けすることができる。例えば、第１３、１８および／または２１染色体の異数性の分析の場合、性染色体をフィルタリングすることができ、常染色体のみまたは常染色体のサブセットを分析することができる。胎児の性別の決定の場合、常染色体はフィルターされ得、性染色体（ＸおよびＹ）のみ、または性染色体（ＸまたはＹ）のうちの一方が分析され得る。
特定の実施形態では、以下のフィルタリングする処理を利用することができる。所与の染色体（例えば、第２１染色体）内の同じ一連の部分（例えば、参照ゲノムの部分）を選択し、読取りの数を、罹患試料と非罹患試料とで比較する。ギャップにより、２１トリソミー試料と正倍数体試料とを関係付け、これには、ほとんどの第２１染色体をカバーする一連の部分を含める。これらの一連の部分は、正倍数体試料とＴ２１試料との間で同じである。部分を定義することができるので、一連の部分と単一区分との区別はあまり重要でない。同じゲノム領域を、異なる患者において比較する。この処理を、トリソミーの分析、例として、Ｔ２１に加えてまたはその代わりに、Ｔ１３またはＴ１８について利用することができる。一部の実施形態では、データセットを、計数し、任意選択でフィルタリングし正規化した後で、重み付けすることによって、これらの処理されたデータセットを操作することができる。
特定の実施形態では、１つまたは複数の部分を選択し、それらに重み付けして、選択された部分中に含有されるデータ（例えば、ノイズの多いデータ、有益でないデータ）の影響を低下させることができ、一部の実施形態では、１つまたは複数の部分を選択し、それらに重み付けして、選択された部分中に含有されるデータ（例えば、小さな分散が測定されたデータ）の影響を増強または増大させることができる。一部の実施形態では、大きな分散を有するデータの影響を減少させ、小さな分散を有するデータの影響を増加させる単一の重み付け関数を利用して、データセットに重み付けする。時には、重み付け関数を使用して、大きな分散を有するデータの影響を低下させ、小さな分散を有するデータの影響を増大させる（例えば、［１／（標準偏差）２］）。一部の実施形態では、重み付けによりさらに操作した処理済データのプロファイルのプロットを生成して、分類、および／またはアウトカムの提供を促進する。重み付けされたデータのプロファイルのプロットに基づいて、アウトカムをもたらすことができる。
部分をフィルタリングすることまたは重み付けすることは、分析における１つまたは複数の適切な点で行うことができる。例えば、配列の読取りを、参照ゲノムの部分に対してマッピングする前または後に、部分をフィルタリングするまたは重み付けすることができる。一部の実施形態では、個々のゲノム部分についての実験の偏りを決定する前または後に、部分をフィルタリングするまたは重み付けすることができる。特定の実施形態では、ゲノム区分のレベルを計算する前または後に、部分をフィルタリングするまたは重み付けすることができる。
一部の実施形態では、データセットを、計数し、任意選択でフィルタリングし、正規化し、任意選択で重み付けした後に、これらの処理されたデータセットを、１つまたは複数の数学的および／または統計学的な（例えば、統計学的関数または統計学的アルゴリズムによる）操作により操作することができる。特定の実施形態では、１つまたは複数の選択された部分、染色体、または染色体の部分についてＺスコアを計算することによって、処理されたデータセットをさらに操作することができる。一部の実施形態では、Ｐ値を計算することによって、処理されたデータセットをさらに操作することができる。Ｚスコアおよびｐ値を計算するための等式の一実施形態を、等式１（実施例２）に示す。特定の実施形態では、数学的および／または統計学的な操作は、倍数性および／または胎児フラクションに関する１つまたは複数の仮定を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の統計学的および／または数学的な操作によりさらに操作した処理済データのプロファイルのプロットを生成して、分類、および／またはアウトカムの提供を促進する。統計学的および／または数学的に操作したデータのプロファイルのプロットに基づいて、アウトカムをもたらすことができる。統計学的および／または数学的に操作したデータのプロファイルのプロットに基づいてもたらされたアウトカムはしばしば、倍数性および／または胎児フラクションに関する１つまたは複数の仮定を含む。
特定の実施形態では、データセットを、計数し、任意選択でフィルタリングし正規化した後で、複数の操作を、処理されたデータセットに対して行って、Ｎ次元空間および／またはＮ次元の点を生成する。Ｎ次元で分析したデータセットのプロファイルのプロットに基づいて、アウトカムをもたらすことができる。
一部の実施形態では、データセットの処理および／または操作の一部としてまたはその後に、１つまたは複数のピークレベルの分析、ピーク幅の分析、ピークのエッジの場所の分析、ピークのラテラルトレランス等、それらの誘導物、または上記の組合せを利用して、データセットを処理する。一部の実施形態では、１つまたは複数のピークレベルの分析、ピーク幅の分析、ピークのエッジの場所の分析、ピークのラテラルトレランス等、それらの誘導物、または上記の組合せを利用して処理したデータのプロファイルのプロットを生成して、分類、および／またはアウトカムの提供を促進する。１つまたは複数のピークレベルの分析、ピーク幅の分析、ピークのエッジの場所の分析、ピークのラテラルトレランス等、それらの誘導物、または上記の組合せを利用して処理してあるデータのプロファイルのプロットに基づいて、アウトカムをもたらすことができる。
一部の実施形態では、問題の遺伝子変動を実質的に含有しない１つまたは複数の参照試料を使用して、参照のカウントプロファイルの中央値を得ることができ、この中央値は、遺伝子の変動の不在を表示する所定の値をもたらし得、しばしば、もし試験被験体が遺伝子の変動を保有するならば、その遺伝子の変動が試験被験体において位置するゲノムの場所に対応する領域における所定の値から、当該中央値は逸脱する。遺伝子の変動と関連する医学的状態のリスクがある、またはそうした医学的状態に罹患している試験被験体において、選択された部分または区分についての数値は、罹患していない場合のゲノムの場所についての所定の値とは有意に異なるものになることが予想される。特定の実施形態では、問題の遺伝子変動を担持することが分かっている１つまたは複数の参照試料を使用して、参照のカウントプロファイルの中央値を生成することができ、この中央値は、遺伝子の変動の存在を表示する所定の値をもたらし得、しばしば、試験被験体がその遺伝子の変動を担持しないゲノムの場所に対応する領域における所定の値から、当該中央値は逸脱する。遺伝子の変動と関連する医学的状態のリスクがない、またはそうした医学的状態に罹患していない試験被験体においては、選択された部分または区分についての数値は、罹患している場合のゲノムの場所についての所定の値とは有意に異なることが予想される。
一部の実施形態では、データの分析および処理は、１つまたは複数の仮定の使用を含むことができる。適切な数またはタイプの仮定を利用して、データセットを分析または処理することができる。データの処理および／または分析のために使用することができる仮定の非限定的な例として、母体の倍数性、胎児の寄与、参照集団中の特定の配列の存在率、民族性背景、血縁の家族における選択された医学的状態の存在率、異なる患者から得られた未加工カウントのプロファイル間の平行度および／またはＧＣ正規化およびリピートマスクキング（ＧＣ−ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐｅａｔ ｍａｓｋｉｎｇ）（例えば、ＧＣＲＭ）後のラン、ＰＣＲの人工産物を表わす同一の一致（例えば、同一塩基の位置）、胎児数量アッセイ（例えば、ＦＱＡ）に固有の仮定、双子に関する仮定（例えば、双子の両方のうち、一方のみが罹患している場合、有効な胎児フラクションは、測定された全胎児フラクションの５０％のみである（三つ子、四つ子等についても同様））、ゲノム全体を一様にカバーする胎児の無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｆＤＮＡ）等、ならびにそれらの組合せが挙げられる。
正規化されたカウントプロファイルに基づいて、遺伝子の変動の存在または非存在のアウトカムを所望の信頼性のレベル（例えば、９５％またはそれ超の信頼性のレベル）で予測することが、マッピングされた配列の読取りの品質および／または深さでは可能でない事例では、１つまたは複数の追加の数学的操作のアルゴリズムおよび／または統計学的予測アルゴリズムを利用して、データ分析および／またはアウトカムの提供に有用な追加の数値を生成することができる。用語「正規化されたカウントプロファイル」は、本明細書で使用する場合、正規化されたカウントを使用して生成されたプロファイルを指す。正規化されたカウントおよび正規化されたカウントプロファイルを生成するために使用することができる方法の例を、本明細書に記載する。上記で述べたように、計数されるに至った、マッピングされた配列の読取りを、試験試料のカウントまたは参照試料のカウントに関して正規化することができる。一部の実施形態では、正規化されたカウントプロファイルは、プロットして示すことができる。
プロファイル
一部の実施形態では、処理するステップは、データセットまたはその派生形の多様な側面（例えば、当技術分野で公知であり、かつ／または本明細書で記載される、１つまたは複数の数学的データ処理ステップおよび／または統計学的データ処理ステップの産物）からの、１つまたは複数のプロファイルの生成（例えば、プロファイルのプロット）を含みうる。
本明細書で使用される「プロファイル」という用語は、大量のデータ中のパターンおよび／または相関の同定を容易としうるデータに対する数学的操作および／または統計学的操作の産物を指す。「プロファイル」は、データまたはデータセットに対する、１つまたは複数の判定基準に基づく、１つまたは複数の操作から結果として得られる値を含むことが多い。プロファイルは、複数のデータ点を含むことが多い。データセットの性格および／または複雑性に応じて、任意の適切な数のデータ点を、プロファイルに含めることができる。ある特定の実施形態では、プロファイルには、２つまたはそれ超のデータ点、３つもしくはそれ超のデータ点、５つもしくはそれ超のデータ点、１０もしくはそれ超のデータ点、２４もしくはそれ超のデータ点、２５もしくはそれ超のデータ点、５０もしくはそれ超のデータ点、１００もしくはそれ超のデータ点、５００もしくはそれ超のデータ点、１０００もしくはそれ超のデータ点、５０００もしくはそれ超のデータ点、１０，０００もしくはそれ超のデータ点、または１００，０００もしくはそれ超のデータ点を含むことができる。
一部の実施形態では、プロファイルは、データセットの全体を表し、ある特定の実施形態では、プロファイルは、データセットの一部分またはサブセットを表わす。すなわち、プロファイルは、ある場合には、いかなるデータも除外するようにフィルタリングされていないデータを表示するデータ点を含むかまたはこれらから生成されており、プロファイルは、ある場合には、望ましくないデータを除外するようにフィルタリングされたデータを表示するデータ点を含むかまたはこれらから生成されている。一部の実施形態では、プロファイル中のデータ点は、部分についてのデータ操作の結果を表示する。ある特定の実施形態では、プロファイル中のデータ点は、部分の群についてのデータ操作の結果を含む。一部の実施形態では、部分の群は、互いと隣接することが可能であり、ある特定の実施形態では、部分の群は、染色体またはゲノムの異なる一部分に由来しうる。
データセットから導出されたプロファイル中のデータ点は、任意の適切なデータの類別を表示しうる。プロファイルデータ点を生成するようにデータを群分けしうるカテゴリーの非限定的な例は、サイズに基づく部分、配列特徴（例えば、ＧＣ含有量、ＡＴ含有量、染色体上の場所（例えば、短腕部、長腕部、セントロメア、テロメア）など）に基づく部分、発現のレベル、染色体など、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、プロファイルは、別のプロファイルから得られるデータ点から生成することができる（例えば、再正規化データプロファイルを生成するように、異なる正規化する値に対して再正規化された正規化データプロファイル）。ある特定の実施形態では、別のプロファイルから得られるデータ点から生成されたプロファイルにより、データ点の数および／またはデータセットの複雑性を低減する。データ点の数および／またはデータセットの複雑性の低減により、データの解釈が容易となり、かつ／またはアウトカムの提示が容易となることが多い。
プロファイル（例えば、ゲノムプロファイル、染色体プロファイル、染色体のセグメントのプロファイル）は、２つまたはそれ超の部分のための正規化されたカウントまたは正規化されていないカウントのコレクションであることが多い。プロファイルは、少なくとも１つのレベル（例えば、ゲノム区分のレベル）を含むことが多く、２つまたはそれ超のレベルを含むことが多い（例えば、プロファイルは、複数のレベルを有することが多い）。レベルは一般に、ほぼ同じカウントまたは正規化されたカウントを有する部分のセットについてのレベルである。レベルについては、本明細書でより詳細に記載される。ある特定の実施形態では、プロファイルは、１つまたは複数の部分であって、重み付けするか、除外するか、フィルタリングするか、正規化するか、調整するか、平均するか、平均値として導出するか、加算するか、減算するか、処理するか、またはこれらの任意の組合せにより変換しうる部分を含む。プロファイルは、２つまたはそれ超のレベルを規定する部分へとマッピングした正規化されたカウントを含むことが多く、ここで、カウントは、適切な方法により、レベルのうちの１つに従ってさらに正規化される。プロファイル（例えば、プロファイルレベル）のカウントは、不確定値と関連することが多い。
１つまたは複数のレベルを含むプロファイルは、場合によって、穴埋め（例えば、ホールの穴埋め）される。穴埋め（ｐａｄｄｉｎｇ）（例えば、ホールの穴埋め）とは、母体の微小欠失または母体の重複（例えば、コピー数の変動）に起因するプロファイル中のレベルを同定および調整する処理を指す。一部の実施形態では、胎児の微小重複または胎児の微小欠失に起因するレベルを穴埋めする。一部の実施形態では、プロファイル中の微小重複または微小欠失により、プロファイル（例えば、染色体プロファイル）の全体的なレベルを人工的に上昇または低下させ、染色体の異数性（例えば、トリソミー）についての、偽陽性または偽陰性の決定をもたらすことができる。一部の実施形態では、微小重複および／または欠失に起因するプロファイル中のレベルを同定し、場合によって、穴埋めまたはホールの穴埋めと称する処理により調整する（例えば、穴埋めおよび／または除外する）。ある特定の実施形態では、プロファイルは、プロファイル中の第２のレベルと有意に異なる、１つまたは複数の第１のレベルを含み、１つまたは複数の第１のレベルの各々は、母体のコピー数の変動、胎児のコピー数の変動、または母体のコピー数の変動および胎児のコピー数の変動を含み、第１のレベルのうちの１または複数を調整する。
１つまたは複数のレベルを含むプロファイルは、第１のレベルおよび第２のレベルを含みうる。一部の実施形態では、第１のレベルは、第２のレベルと異なる（例えば、有意に異なる）。一部の実施形態では、第１のレベルは、第１の部分のセットを含み、第２のレベルは、第２の部分のセットを含み、第１の部分のセットは、第２の部分のセットのサブセットではない。ある特定の実施形態では、第１の部分のセットは、第２の部分のセットと異なり、これらから第１のレベルおよび第２のレベルが決定される。一部の実施形態では、プロファイルは、プロファイル中の第２のレベルと異なる（例えば、有意に異なる、例えば、有意に異なる値を有する）複数の第１のレベルを有しうる。一部の実施形態では、プロファイルは、プロファイル中の第２のレベルと有意に異なる、１つまたは複数の第１のレベルを含み、第１のレベルのうちの１または複数を調整する。一部の実施形態では、プロファイルは、プロファイル中の第２のレベルと有意に異なる、１つまたは複数の第１のレベルを含み、１つまたは複数の第１のレベルの各々は、母体のコピー数の変動、胎児のコピー数の変動、または母体のコピー数の変動および胎児のコピー数の変動を含み、第１のレベルのうちの１または複数を調整する。一部の実施形態では、プロファイル中の第１のレベルを、プロファイルから除外するかまたは調整する（例えば、穴埋めする）。プロファイルは、１つまたは複数の第２のレベルと有意に異なる、１つまたは複数の第１のレベルを含む複数のレベルを含むことが可能であり、プロファイル中のレベルの大半は、互いとほぼ等しい第２のレベルであることが多い。一部の実施形態では、プロファイル中のレベルのうちの５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超または９５％超は、第２のレベルである。
プロファイルは、場合によって、プロットとして示される。例えば、部分のカウント（例えば、正規化されたカウント）を表示する１つまたは複数のレベルは、プロットし、視覚化することができる。生成されうるプロファイルのプロットの非限定的な例は、未加工のカウント（例えば、未加工のカウントプロファイルまたは未加工のプロファイル）、正規化されたカウント、部分重み付け、ｚスコア、ｐ値、適合させた倍数性と対比した面積比、適合させた胎児フラクションと測定した胎児フラクションとの間の比と対比した中央値レベル、主成分など、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、プロファイルのプロットにより、操作データの視覚化が可能となる。ある特定の実施形態では、プロファイルのプロットを活用して、アウトカム（例えば、適合させた倍数性と対比した面積比、適合させた胎児フラクションと測定した胎児フラクションとの間の比と対比した中央値レベル、主成分）を提示することができる。本明細書で使用される「未加工のカウントプロファイルのプロット」または「未加工のプロファイルのプロット」という用語は、領域中の全カウントに対して正規化された、領域中の各部分（例えば、ゲノム、部分、染色体、参照ゲノムの染色体部分、または染色体のセグメント）中のカウントのプロットを指す。一部の実施形態では、プロファイルは、スタティックウィンドウ処理を使用して生成することができ、ある特定の実施形態では、プロファイルは、スライディングウィンドウ処理を使用して生成することができる。
試験被験体について生成されたプロファイルは、場合によって、１つまたは複数の参照被験体について生成されたプロファイルと比較して、データセットの数学的操作および／もしくは統計学的操作の解釈を容易とし、かつ／またはアウトカムを提示する。一部の実施形態では、プロファイルは、１つまたは複数の出発仮定（例えば、母体の核酸寄与（例えば、母体のフラクション）、胎児の核酸寄与（例えば、胎児フラクション）、参照試料の倍数性など、またはこれらの組合せ）に基づき生成する。ある特定の実施形態では、試験プロファイルは、遺伝子の変動の非存在を表示する所定の値を中心とすることが多く、試験被験体が遺伝子の変動を保有したとする場合に、試験被験体において遺伝子の変動が位置するゲノム位置に対応するエリア中の所定の値からは逸脱することが多い。遺伝子の変動と関連する医学的状態の危険性があるか、またはこれを患っている試験被験体では、選択部分についての数値が、罹患していないゲノム位置についての所定の値から有意に変化することが期待される。出発仮定（例えば、一定の倍数性もしくは最適化された倍数性、一定の胎児フラクションもしくは最適化された胎児フラクション、またはこれらの組合せ）に応じて、遺伝子の変動の存在または非存在を指し示す所定の閾もしくはカットオフ値またはの閾範囲は、遺伝子の変動の存在または非存在を決定するために有用なアウトカムをやはり提示しながらも、変化しうる。一部の実施形態では、プロファイルは、表現型を指し示し、かつ／またはこれを表示する。
非限定的な例として述べると、正規化された試料および／または参照カウントプロファイルは、（ａ）遺伝子の変動を保有しないことが既知である参照基準のセットから選択された、染色体、部分、またはこれらのセグメントについての、参照中央値カウントを計算すること、（ｂ）有益でない部分の、参照試料の未加工のカウントからの除外（例えば、フィルタリング）、（ｃ）残りの参照ゲノムの全ての部分についての参照カウントを、参照試料、選択された染色体、または選択されたゲノム位置についての、残りカウントの総数（例えば、有益でない参照ゲノムの部分を除外した後の残りのカウントの合計）に対して正規化し、これにより、正規化された参照被験体プロファイルを生成すること、（ｄ）対応する部分を試験被験体試料から除外すること、および（ｅ）１つまたは複数の選択されたゲノム位置についての、残りの試験被験体カウントを、選択されたゲノム位置を含有する１つまたは複数の染色体についての、残りの参照中央値カウントの合計に対して正規化し、これにより、正規化された試験被験体プロファイルを生成することにより、未加工の配列の読取りデータから得ることができる。ある特定の実施形態では、（ｂ）における、フィルタリングした部分により低減された全ゲノムに関する、さらなる正規化ステップを、（ｃ）と（ｄ）との間に含めることができる。
データセットプロファイルは、カウントされたマッピングした配列の読取りデータに対する１つまたは複数の操作により生成することができる。一部の実施形態は、以下を含む：配列の読取りをマッピングし、各ゲノム部分へとマッピングされるカウント（すなわち、配列タグ）の数を決定する（例えば、カウントする）。未加工のカウントプロファイルを、カウントされたマッピングした配列の読取りから生成する。ある特定の実施形態では、試験被験体に由来する未加工のカウントプロファイルを、遺伝子の変動を保有しないことが既知である、参照被験体のセットに由来する、染色体、部分、またはこれらのセグメントについての、参照中央値カウントプロファイルと比較することにより、アウトカムを提示する。
一部の実施形態では、配列の読取りデータは、ノイズの多いデータまたは有益でない部分を除外するように、任意選択でフィルタリングする。フィルタリングの後、残りのカウントを足し合わせて、フィルタリングされたデータセットを生成することが典型的である。ある特定の実施形態では、フィルタリングされたカウントプロファイルを、フィルタリングされたデータセットから生成する。
配列の読取りデータをカウントし、任意選択でフィルタリングした後で、データセットを正規化して、レベルまたはプロファイルを生成することができる。１つまたは複数の選択部分を、適切な正規化された参照値に対して正規化することにより、データセットを正規化することができる。一部の実施形態では、正規化された参照値は、部分が選択される１つまたは複数の染色体についての全カウントを表示する。ある特定の実施形態では、正規化された参照値は、遺伝子の変動を保有しないことが既知である、参照被験体のセットから調製された、参照データセットに由来する染色体の部分または染色体である、１つまたは複数の対応する部分を表示する。一部の実施形態では、正規化された参照値は、遺伝子の変動の存在または非存在について分析される試験被験体から調製された、試験被験体データセットに由来する、染色体の部分または染色体である、１つまたは複数の対応する部分を表示する。ある特定の実施形態では、正規化処理は、スタティックウィンドウ法を活用して実施し、一部の実施形態では、正規化処理は、ムービングウィンドウ法またはスライディングウィンドウ法を活用して実施する。ある特定の実施形態では、正規化されたカウントを含むプロファイルを生成して、アウトカムの分類および／または提示を容易とする。アウトカムは、正規化されたカウントを含むプロファイルのプロットに基づき（例えば、このようなプロファイルのプロットを使用して）提示することができる。
レベル
一部の実施形態では、値（例えば、数、定量的値）を、レベルに帰する。レベルは、適切な方法、演算、または数学的処理（例えば、処理されたレベル）により決定することができる。レベルは、部分のセットについてのカウント（例えば、正規化されたカウント）であるか、またはこれから導出されることが多い。一部の実施形態では、部分のレベルは、部分へとマッピングしたカウント（例えば、カウント、正規化されたカウント）の総数と実質的に等しい。レベルは、当技術分野で公知の適切な方法、演算、または数学的処理により処理、変換、または操作されたカウントから決定することが多い。一部の実施形態では、レベルは、処理されたカウントから導出し、処理されたカウントの非限定的な例は、重み付けされるか、除外されるか、フィルタリングされるか、正規化されるか、調整されるか、平均されるか、平均値として導出される（例えば、平均レベル）か、加算されるか、減算されるか、変換されたカウント、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、レベルは、正規化されたカウント（例えば、部分の正規化されたカウント）を含む。レベルは、その非限定的な例が、部分に関する正規化、ＧＣ含有量による正規化、線形最小二乗回帰および非線形最小二乗回帰、ＧＣ ＬＯＥＳＳ、ＬＯＷＥＳＳ、ＰＥＲＵＮ、ＲＭ、ＧＣＲＭ、ｃＱｎなど、および／またはこれらの組合せを含む、適切な処理により正規化されたカウントについてのレベルでありうる。レベルは、正規化されたカウントまたはカウントの相対量を含みうる。一部の実施形態では、レベルは、平均された、２つもしくはそれ超の部分のカウントまたは正規化されたカウントについてのレベルであり、レベルを、平均レベルと称する。一部の実施形態では、レベルは、平均カウントまたは正規化されたカウントの平均値を有する部分のセットについてのレベルであり、これを、平均レベルと称する。一部の実施形態では、レベルを、未加工のカウントおよび／またはフィルタリングされたカウントを含む部分について導出する。一部の実施形態では、レベルは、未加工のカウントであるカウントに基づく。一部の実施形態では、レベルは、不確定値（例えば、標準偏差、ＭＡＤ）と関連する。一部の実施形態では、レベルを、Ｚスコアまたはｐ値により表示する。
本明細書では、１つまたは複数の部分についてのレベルは、「ゲノム区分のレベル」と同義である。本明細書で使用される「レベル」という用語は、場合によって、「水準（ｅｌｅｖａｔｉｏｎ）」という用語と同義である。「レベル」という用語の意味の決定は、それを使用する文脈から決定することができる。例えば、ゲノム区分、プロファイル、読取り、および／またはカウントの文脈で使用される場合の「レベル」という用語は、水準を意味することが多い。物質または組成物の文脈で使用される場合の「レベル」という用語（例えば、ＲＮＡのレベル、網状（ｐｌｅｘｉｎｇ）レベル）は、量を指すことが多い。不確定性の文脈で使用される場合の「レベル」という用語（例えば、誤差のレベル、信頼性のレベル、偏差のレベル、不確定性のレベル）は、量を指すことが多い。
２つまたはそれ超のレベル（例えば、２つまたはそれ超のプロファイル中のレベル）についての正規化されたカウントまたは正規化されていないカウントは、場合によって、レベルに従って、数学的に操作する（例えば、これに加算する、これに乗算する、これを平均する、これを正規化するなど、またはこれらの組合せ）ことができる。例えば、２つまたはそれ超のレベルについての正規化されたカウントまたは正規化されていないカウントは、プロファイル中のレベルの１つ、一部、または全部に従って正規化することができる。一部の実施形態では、プロファイル中の全てのレベルについての正規化されたカウントまたは正規化されていないカウントを、プロファイル中の１つのレベルに従って正規化する。一部の実施形態では、プロファイル中の第１のレベルについての正規化されたカウントまたは正規化されていないカウントを、プロファイル中の第２のレベルについての正規化されたカウントまたは正規化されていないカウントに従って正規化する。
レベル（例えば、第１のレベル、第２のレベル）の非限定的な例は、処理されたカウントを含む部分のセットについてのレベル、カウントの平均値、中央値、もしくは平均を含む部分のセットについてのレベル、正規化されたカウントを含む部分のセットについてのレベルなど、またはこれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、プロファイル中の第１のレベルおよび第２のレベルは、同じ染色体へとマッピングした部分のカウントから導出する。一部の実施形態では、プロファイル中の第１のレベルおよび第２のレベルは、異なる染色体へとマッピングした部分のカウントから導出する。
一部の実施形態では、レベルを、１つまたは複数の部分へとマッピングした正規化されたカウントまたは正規化されていないカウントから決定する。一部の実施形態では、レベルを、２つまたはそれ超の部分へとマッピングした正規化されたカウントまたは正規化されていないカウントから決定するが、ここで、各部分の正規化されたカウントは、ほぼ同じであることが多い。レベルについての部分のセット中のカウント（例えば、正規化されたカウント）には、変動があり得る。レベルについての部分のセット内には、セットの他の部分（例えば、ピークおよび／またはディップ）内とは、カウントが有意に異なる１つまたは複数の部分が存在し得る。任意の適切な数の部分と関連する、任意の適切な数の正規化されたカウントまたは正規化されていないカウントは、レベルを規定しうる。
一部の実施形態では、１つまたは複数のレベルは、ゲノムの部分の全部または一部の正規化されたカウントまたは正規化されていないカウントから決定することができる。レベルは、染色体またはそのセグメントの正規化されたカウントまたは正規化されていないカウントの全部または一部から決定しうることが多い。一部の実施形態では、２つまたはそれ超の部分（例えば、部分のセット）から導出された、２つまたはそれ超のカウントにより、レベルを決定する。一部の実施形態では、２つまたはそれ超のカウント（例えば、２つまたはそれ超の部分に由来するカウント）により、レベルを決定する。一部の実施形態では、２〜約１００，０００の部分に由来するカウントにより、レベルを決定する。一部の実施形態では、２〜約５０，０００、２〜約４０，０００、２〜約３０，０００、２〜約２０，０００、２〜約１０，０００、２〜約５０００、２〜約２５００、２〜約１２５０、２〜約１０００、２〜約５００、２〜約２５０、２〜約１００、または２〜約６０の部分に由来するカウントにより、レベルを決定する。一部の実施形態では、約１０〜約５０の部分に由来するカウントにより、レベルを決定する。一部の実施形態では、約２０〜約４０またはそれ超の部分に由来するカウントにより、レベルを決定する。一部の実施形態では、レベルは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０またはそれ超の部分に由来するカウントを含む。一部の実施形態では、レベルは、部分のセット（例えば、参照ゲノムの部分のセット、染色体の部分のセット、または染色体のセグメントの部分のセット）に対応する。
一部の実施形態では、レベルを、連続的な部分の正規化されたカウントまたは正規化されていないカウントについて決定する。一部の実施形態では、連続的な部分（例えば、部分のセット）は、ゲノムの隣接セグメントまたは染色体もしくは遺伝子の隣接セグメントを表示する。例えば、２つまたはそれ超の連続的な部分は、部分を末端から末端へとマージすることにより整列させる場合、各部分より長いＤＮＡ配列の配列アセンブリーを表示し得る。例えば、２つまたはそれ超の連続的な部分は、無傷ゲノム、染色体、遺伝子、イントロン、エクソン、またはそのセグメントを表示しうる。一部の実施形態では、レベルを、連続的な部分および／または非連続的な部分のコレクション（例えば、セット）から決定する。
異なるレベル
一部の実施形態では、正規化されたカウントのプロファイルは、プロファイル中の別のレベル（例えば、第２のレベル）と有意に異なるレベル（例えば、第１のレベル）を含む。第１のレベルは、第２のレベルより高レベルの場合もあり、低レベルの場合もある。一部の実施形態では、第１のレベルは、コピー数の変動（例えば、母体のコピー数の変動、胎児のコピー数の変動、または母体のコピー数の変動および胎児のコピー数の変動）を含む１つまたは複数の読取りを含む部分のセットについてのレベルであり、第２のレベルは、コピー数の変動を実質的に有さない読取りを含む部分のセットについてのレベルである。一部の実施形態では、「有意に異なる」とは、観察可能な差違を指す。一部の実施形態では、「有意に異なる」とは、「統計学的に異なる」または「統計学的な有意差」を指す。統計学的な有意差は、場合によって、観察された差違についての統計学的評価である。統計学的な有意差は、当技術分野で適切な方法により評価することができる。任意の適切な閾または範囲を使用して、２つのレベルが有意に異なることを決定することができる。ある特定の実施形態では、約０．０１パーセント（例えば、レベル値のうちの１つまたは一方の０．０１パーセント）またはそれ超異なる２つのレベル（例えば、平均レベル）は、有意に異なる。一部の実施形態では、約０．１パーセントまたはそれ超異なる２つのレベル（例えば、平均レベル）は、有意に異なる。ある特定の実施形態では、約０．５パーセントまたはそれ超異なる２つのレベル（例えば、平均レベル）は、有意に異なる。一部の実施形態では、約０．５、０．７５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５％、または約１０％超異なる２つのレベル（例えば、平均レベル）は、有意に異なる。一部の実施形態では、２つのレベル（例えば、平均レベル）は、有意に異なり、いずれのレベルにも重複はなく、かつ／または一方もしくは両方のレベルについて計算された不確定値により規定される範囲に重複はない。ある特定の実施形態では、不確定値は、シグマとして表される標準偏差である。一部の実施形態では、２つのレベル（例えば、平均レベル）は、有意に異なり、不確定値の約１倍（例えば、１シグマ）またはそれ超異なる。一部の実施形態では、２つのレベル（例えば、平均レベル）は、有意に異なり、不確定値の約２倍（例えば、２シグマ）もしくはそれ超、不確定値の約３倍もしくはそれ超、約４倍もしくはそれ超、約５倍もしくはそれ超、約６倍もしくはそれ超、約７倍もしくはそれ超、約８倍もしくはそれ超、約９倍もしくはそれ超、または約１０倍もしくはそれ超異なる。一部の実施形態では、２つのレベル（例えば、平均レベル）は、不確定値の約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、もしくは４．０倍、またはそれ超異なる場合に有意に異なる。一部の実施形態では、信頼性レベルは、２つのレベルの間の差違が増加するとともに増加する。ある特定の実施形態では、信頼性レベルは、２つのレベルの間の差違が減少するとともに、かつ／または不確定値が増加するとともに減少する。例えば、場合によって、信頼性レベルは、レベル間の差違と標準偏差（例えば、ＭＡＤ）との比に応じて増加する。
１つまたは複数の予測アルゴリズムを使用して、互いに対して非依存的に重み付けされる場合もあり、依存的に重み付けされる場合もある可変条件下で収集された検出データの有意性を決定するか、またはこれに意味を与えることができる。本明細書で使用される「変数」という用語は、値または値のセットを有するアルゴリズムの因子、量、または関数を指す。
一部の実施形態では、第１の部分のセットは、第２の部分のセットと異なる（例えば、第２の部分のセットと重複しない）部分を含むことが多い。例えば、場合によって、正規化されたカウントの第１のレベルは、プロファイル中の正規化されたカウントの第２のレベルと有意に異なり、第１のレベルは、第１の部分のセットについてのレベルであり、第２のレベルは、第２の部分のセットについてのレベルであり、部分は、第１の部分のセットおよび、第２の部分のセットにおいて重複しない。ある特定の実施形態では、第１の部分のセットは、第２の部分のセットのサブセットではなく、これらから、それぞれ、第１のレベルおよび第２のレベルが決定される。一部の実施形態では、第１の部分のセットは、第２の部分のセットと異なり、かつ／または別個であり、これらから、それぞれ、第１のレベルおよび第２のレベルが決定される。
一部の実施形態では、第１の部分のセットは、プロファイル中の第２の部分のセットのサブセットである。例えば、場合によって、プロファイル中の第２の部分のセットについての正規化されたカウントの第２のレベルは、プロファイル中の第１のレベルについての、第１の部分のセットの正規化されたカウントを含み、第１の部分のセットは、プロファイル中の第２の部分のセットのサブセットである。一部の実施形態では、平均レベル、平均値レベル、または中央値レベルは、第２のレベルから導出され、ここで、第２のレベルは、第１のレベルを含む。一部の実施形態では、第２のレベルは、全染色体を表示する第２の部分のセットを含み、第１のレベルは、第１の部分のセットを含み、ここで、第１のセットは、第２の部分のセットのサブセットであり、第１のレベルは、染色体内に存在する、母体のコピー数の変動、胎児のコピー数の変動、または母体のコピー数の変動および胎児のコピー数の変動を表示する。
一部の実施形態では、第２のレベルの値は、第１のレベルより、染色体またはそのセグメントについてのカウントプロファイルの、平均値、平均、または中央値の値に近い。一部の実施形態では、第２のレベルは、染色体、染色体の部分またはそのセグメントの平均レベルである。一部の実施形態では、第１のレベルは、染色体またはそのセグメントを表示する主要レベル（例えば、第２のレベル）と有意に異なる。プロファイルには、第２のレベルと有意に異なる、複数の第１のレベルを含むことができ、各第１のレベルは独立に、第２のレベルより高レベルの場合もあり、低レベルの場合もある。一部の実施形態では、第１のレベルおよび第２のレベルは、同じ染色体から導出し、第１のレベルは、第２のレベルより高レベルであるか、低レベルであり、第２のレベルは、染色体の主要レベルである。一部の実施形態では、第１のレベルおよび第２のレベルは、同じ染色体から導出し、第１のレベルは、コピー数の変動（例えば、母体および／または胎児のコピー数の変動、欠失、挿入、重複）を指し示し、第２のレベルは、染色体またはそのセグメントについての部分の平均レベルまたは主要レベルである。
ある特定の実施形態では、第２のレベルについての第２の部分のセット中の読取りは、遺伝子の変動（例えば、コピー数の変動、母体および／または胎児のコピー数の変動）を実質的に含まない。第２のレベルについての第２の部分のセットは、何らかの可変性（例えば、部分についてのレベルの可変性、カウントの可変性）を含むことが多い。一部の実施形態では、実質的にコピー数の変動がないことと関連するレベルについての部分のセット中の１つまたは複数の部分は、母体および／または胎児のゲノム内に存在するコピー数の変動を有する１つまたは複数の読取りを含む。例えば、場合によって、部分のセットは、小さな染色体のセグメント（例えば、１０未満の部分）内に存在するコピー数の変動を含み、部分のセットは、実質的にコピー数の変動がないことと関連するレベルについての部分のセットである。したがって、実質的にコピー数の変動を含まない部分のセットはやはり、レベルの約１０、９つ、８つ、７つ、６つ、５つ、４つ、３つ、２つ、または１つ未満の部分に存在するコピー数の変動を含みうる。
一部の実施形態では、第１のレベルは、第１の部分のセットについてのレベルであり、第２のレベルは、第２の部分のセットについてのレベルであり、第１の部分のセットおよび第２の部分のセットは、連続している（例えば、染色体またはそのセグメントの核酸配列に関して隣接する）。一部の実施形態では、第１の部分のセットおよび第２の部分のセットは、連続していない。
胎児核酸と母体核酸との混合物に由来する比較的短い配列の読取りを活用して、レベルおよび／またはプロファイルへと変換されうるカウントを提示することができる。カウント、レベル、およびプロファイルは、電子的形態で描示することもでき、実体的形態で描示することもでき、視覚化することができる。部分へとマッピングした（例えば、レベルおよび／またはプロファイルとして表された）カウントは、胎児および／または妊娠中の雌において存在する胎児および／または母体のゲノム、染色体、または染色体の部分もしくはセグメントについての視覚的表示をもたらしうる。
参照レベルおよび正規化された参照値
一部の実施形態では、プロファイルは、参照レベル（例えば、参照として使用されるレベル）を含む。正規化されたカウントのプロファイルにより、期待レベルおよび期待範囲（期待レベルおよび期待範囲についての下記の議論を参照されたい）が決定される参照レベルを提示することが多い。参照レベルは、母親および胎児の両方に由来するマッピングした読取りを含む部分の正規化されたカウントについての参照レベルであることが多い。参照レベルは、胎児および母親（例えば、妊娠中の雌）に由来するマッピングした読取りの正規化されたカウントの合計であることが多い。一部の実施形態では、参照レベルは、正倍数性の母親および／または正倍数性の胎児に由来するマッピングした読取りを含む部分についての参照レベルである。一部の実施形態では、参照レベルは、胎児および／または母体の遺伝子の変動（例えば、異数性（例えば、トリソミー）、コピー数の変動、微小重複、微小欠失、挿入）を有するマッピングした読取りを含む部分についての参照レベルである。一部の実施形態では、参照レベルは、母体および／または胎児の遺伝子の変動（例えば、異数性（例えば、トリソミー）、コピー数の変動、微小重複、微小欠失、挿入）を実質的に含まない部分についての参照レベルである。一部の実施形態では、第２のレベルは、参照レベルとして使用されるレベルである。ある特定の実施形態では、プロファイルは、正規化されたカウントの第１のレベルおよび正規化されたカウントの第２のレベルを含み、第１のレベルは、第２のレベルと有意に異なり、第２のレベルは、参照レベルである。ある特定の実施形態では、プロファイルは、第１の部分のセットについての正規化されたカウントの第１のレベル、第２の部分のセットについての正規化されたカウントの第２のレベルを含み、第１の部分のセットは、母体および／または胎児のコピー数の変動を有するマッピングした読取りを含み、第２の部分のセットは、母体および／または胎児のコピー数の変動を実質的に有さないマッピングした読取りを含み、第２のレベルは、参照レベルである。
一部の実施形態では、プロファイルについての１つまたは複数のレベルについての部分へとマッピングしたカウントを、参照レベルのカウントに従って正規化する。一部の実施形態では、参照レベルのカウントに従った、レベルのカウントを正規化することは、レベルのカウントを、参照レベルのカウントまたはその倍数もしくは分数で除算することを含む。参照レベルのカウントに従って正規化されたカウントは、別の処理（例えば、ＰＥＲＵＮ）に従って正規化されていることが多く、参照レベルのカウントもまた正規化されている（例えば、ＰＥＲＵＮにより）ことが多い。一部の実施形態では、レベルのカウントを、参照レベルのカウントに従って正規化し、参照レベルのカウントは、正規化する前に、または正規化した後で、適切な値へとスケーリング可能である。参照レベルのカウントのスケーリング処理は、任意の適切な定数（すなわち、数）を含むことが可能であり、任意の適切な数学的操作を、参照レベルのカウントへと適用することができる。
正規化された参照値（ＮＲＶ：ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｖａｌｕｅ）は、参照レベルの正規化されたカウントに従って決定することが多い。ＮＲＶの決定は、参照レベルのカウントへと適用された任意の適切な正規化処理（例えば、数学的操作）を含むことが可能であり、ここでは、同じプロファイル内の他のレベルのカウントを正規化するのに、同じ正規化処理を使用する。ＮＲＶの決定は、参照レベルを、参照レベル自体で除算することを含むことが多い。ＮＲＶの決定は、参照レベルを、参照レベル自体の倍数で除算することを含むことが多い。ＮＲＶの決定は、参照レベルを、参照レベルと定数（例えば、任意の数）との和または差で除算することを含むことが多い。
ＮＲＶは、場合によって、ヌル値と称する。ＮＲＶは、任意の適切な値でありうる。一部の実施形態では、ＮＲＶは、ゼロ以外の任意の値である。一部の実施形態では、ＮＲＶは、整数（ｗｈｏｌｅ ｎｕｍｂｅｒ）である。一部の実施形態では、ＮＲＶは、正の整数（ｉｎｔｅｇｅｒ）である。一部の実施形態では、ＮＲＶは、１、１０、１００、または１０００である。ＮＲＶは、１に等しいことが多い。一部の実施形態では、ＮＲＶは、ゼロに等しい。参照レベルのカウントを、任意の適切なＮＲＶに対して正規化することができる。一部の実施形態では、参照レベルのカウントを、ゼロであるＮＲＶに対して正規化する。参照レベルのカウントは、１であるＮＲＶに対して正規化することが多い。
期待レベル
期待レベルは、場合によって、あらかじめ規定されたレベル（例えば、理論レベル、予測レベル）である。本明細書では、場合によって、「期待レベル」を、「所定のレベル値」と称する。一部の実施形態では、期待レベルは、コピー数の変動を含む部分のセットについての正規化されたカウントのレベルについての予測値である。ある特定の実施形態では、期待レベルを、実質的にコピー数の変動を含まない部分のセットについて決定する。期待レベルは、染色体の倍数性（例えば、０、１つ、２つ（すなわち、二倍体）、３つ、または４つの染色体）または微小倍数性（ホモ接合性またはヘテロ接合性の欠失、重複、挿入、またはこれらの非存在）について決定することができる。期待レベルは、母体の微小倍数性（例えば、母体および／または胎児のコピー数の変動）について決定することが多い。
遺伝子の変動またはコピー数の変動についての期待レベルは、任意の適切な様式で決定することができる。期待レベルは、レベルの適切な数学的操作（例えば、レベルについての部分のセットへとマッピングしたカウント）により決定することが多い。一部の実施形態では、期待レベルを、場合によって、期待レベル定数と称する定数を活用することにより決定する。コピー数の変動についての期待レベルは、場合によって、参照レベル、参照レベルの正規化されたカウント、もしくはＮＲＶに、期待レベル定数を乗算すること、参照レベル、参照レベルの正規化されたカウント、もしくはＮＲＶに期待レベル定数を加算すること、参照レベル、参照レベルの正規化されたカウント、もしくはＮＲＶから期待レベル定数を減算すること、参照レベル、参照レベルの正規化されたカウント、もしくはＮＲＶを期待レベル定数で除算すること、またはこれらの組合せにより計算する。同じ被験体、試料、または試験群について決定された期待レベル（例えば、母体および／または胎児のコピー数の変動の期待レベル）は、同じ参照レベルまたはＮＲＶに従って決定することが多い。
期待レベルは、参照レベル、参照レベルの正規化されたカウント、またはＮＲＶに、期待レベル定数を乗算することにより決定することが多く、ここで、参照レベル、参照レベルの正規化されたカウント、またはＮＲＶは、ゼロに等しくない。一部の実施形態では、期待レベル定数を、参照レベル、参照レベルの正規化されたカウント、またはゼロに等しいＮＲＶへと加算することにより、期待レベルを決定する。一部の実施形態では、期待レベル、参照レベルの正規化されたカウント、ＮＲＶおよび期待レベル定数は、スケーリング可能である。スケーリングの処理は、任意の適切な定数（すなわち、数）および任意の適切な数学的操作を含むことが可能であり、同じスケーリング処理を、検討される全ての値へと適用する。
期待レベル定数
期待レベル定数は、適切な方法により決定することができる。一部の実施形態では、期待レベル定数を任意に決定する。期待レベル定数は、経験的に決定することが多い。一部の実施形態では、期待レベル定数を、数学的操作に従って決定する。一部の実施形態では、期待レベル定数を、参照（例えば、参照ゲノム、参照試料、参照試験データ）に従って決定する。一部の実施形態では、期待レベル定数は、遺伝子の変動またはコピー数の変動（例えば、重複、挿入、または欠失）の存在または非存在を表示するレベルについての、所定の期待レベル定数である。一部の実施形態では、期待レベル定数は、母体のコピー数の変動、胎児のコピー数の変動、または母体のコピー数の変動および胎児のコピー数の変動の存在または非存在を表示するレベルについての、所定の期待レベル定数である。コピー数の変動についての期待レベル定数は、任意の適切な定数または定数のセットでありうる。
一部の実施形態では、ホモ接合性の重複（例えば、ホモ接合性の重複）についての期待レベル定数は、約１．６〜約２．４、約１．７〜約２．３、約１．８〜約２．２、または約１．９〜約２．１でありうる。一部の実施形態では、ホモ接合性の重複についての期待レベル定数は、約１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、または約２．４である。ホモ接合性の重複についての期待レベル定数は、約１．９０、１．９２、１．９４、１．９６、１．９８、２．０、２．０２、２．０４、２．０６、２．０８、または約２．１０であることが多い。ホモ接合性の重複についての期待レベル定数は、約２であることが多い。
一部の実施形態では、ヘテロ接合性の重複（例えば、ホモ接合性の重複）についての期待レベル定数は、約１．２〜約１．８、約１．３〜約１．７、または約１．４〜約１．６である。一部の実施形態では、ヘテロ接合性の重複についての期待レベル定数は、約１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、または約１．８である。ヘテロ接合性の重複についての期待レベル定数は、約１．４０、１．４２、１．４４、１．４６、１．４８、１．５、１．５２、１．５４、１．５６、１．５８、または約１．６０であることが多い。一部の実施形態では、ヘテロ接合性の重複についての期待レベル定数は、約１．５である。
一部の実施形態では、コピー数の変動の非存在（例えば、母体および／または胎児のコピー数の変動の非存在）についての期待レベル定数は、約１．３〜約０．７、約１．２〜約０．８、または約１．１〜約０．９である。一部の実施形態では、コピー数の変動の非存在についての期待レベル定数は、約１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、または約０．７である。コピー数の変動の非存在についての期待レベル定数は、約１．０９、１．０８、１．０６、１．０４、１．０２、１．０、０．９８、０．９６、０．９４、または約０．９２であることが多い。一部の実施形態では、コピー数の変動の非存在についての期待レベル定数は、約１である。
一部の実施形態では、ヘテロ接合性の欠失（例えば、母体の、胎児の、または母体および胎児のヘテロ接合性の欠失）についての期待レベル定数は、約０．２〜約０．８、約０．３〜約０．７、または約０．４〜約０．６である。一部の実施形態では、ヘテロ接合性の欠失についての期待レベル定数は、約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、または約０．８である。ヘテロ接合性の欠失についての期待レベル定数は、約０．４０、０．４２、０．４４、０．４６、０．４８、０．５、０．５２、０．５４、０．５６、０．５８、または約０．６０であることが多い。一部の実施形態では、ヘテロ接合性の欠失についての期待レベル定数は、約０．５である。
一部の実施形態では、ホモ接合性の欠失（例えば、ホモ接合性の欠失）についての期待レベル定数は、約−０．４〜約０．４、約−０．３〜約０．３、約−０．２〜約０．２、または約−０．１〜約０．１でありうる。一部の実施形態では、ホモ接合性の欠失についての期待レベル定数は、約−０．４、−０．３、−０．２、−０．１、０．０、０．１、０．２、０．３、または約０．４である。ホモ接合性の欠失についての期待レベル定数は、約−０．１、−０．０８、−０．０６、−０．０４、−０．０２、０．０、０．０２、０．０４、０．０６、０．０８、または約０．１０であることが多い。ホモ接合性の欠失についての期待レベル定数は、約０であることが多い。
期待レベルの範囲
一部の実施形態では、遺伝子の変動またはコピー数の変動の存在または非存在（例えば、母体のコピー数の変動、胎児のコピー数の変動、または母体のコピー数の変動および胎児のコピー数の変動）を、期待レベルの範囲内または範囲外にあるレベルにより決定する。期待レベルの範囲は、期待レベルに従って決定することが多い。一部の実施形態では、期待レベルの範囲を、遺伝子の変動を実質的に含まないかまたはコピー数の変動を実質的に含まないレベルについて決定する。適切な方法を使用して、期待レベルの範囲を決定することができる。
一部の実施形態では、期待レベルの範囲を、レベルについて計算された適切な不確定値に従って規定する。不確定値の非限定的な例は、標準偏差、標準誤差、計算された分散、ｐ値、および平均絶対偏差（ＭＡＤ：ｍｅａｎ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）である。一部の実施形態では、遺伝子の変動またはコピー数の変動についての期待レベルの範囲は、一部分、レベル（例えば、第１のレベル、第２のレベル、第１のレベルおよび第２のレベル）についての不確定値を計算することにより決定する。一部の実施形態では、期待レベルの範囲を、プロファイル（例えば、染色体またはそのセグメントについての正規化されたカウントのプロファイル）について計算された不確定値に従って規定する。一部の実施形態では、不確定値を、遺伝子の変動を実質的に含まないかまたはコピー数の変動を実質的に含まないレベルについて計算する。一部の実施形態では、不確定値を、第１のレベル、第２のレベルまたは第１のレベルおよび第２のレベルについて計算する。一部の実施形態では、不確定値を、第１のレベル、第２のレベル、または第１のレベルを含む第２のレベルについて決定する。
期待レベルの範囲は、場合によって、一部分、不確定値に定数（例えば、所定の定数）ｎを乗算すること、不確定値に定数（例えば、所定の定数）ｎを加算すること、不確定値から定数（例えば、所定の定数）ｎを減算すること、または不確定値を定数（例えば、所定の定数）ｎで除算することにより計算する。適切な数学的手順または手順の組合せを使用することができる。定数ｎ（例えば、所定の定数ｎ）は、場合によって、信頼区間と称する。選択された信頼区間は、選択された定数ｎに従って決定する。定数ｎ（例えば、所定の定数ｎ、信頼区間）は、適切な様式で決定することができる。定数ｎは、数またはゼロ超の数の分数でありうる。定数ｎは、整数でありうる。定数ｎは、１０未満の数であることが多い。一部の実施形態では、定数ｎは、約１０未満、約９未満、約８未満、約７未満、約６未満、約５未満、約４未満、約３未満、または約２未満の数である。一部の実施形態では、定数ｎは、約１０、９．５、９、８．５、８、７．５、７、６．５、６、５．５、５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、または１である。定数ｎは、遺伝的素質が既知である被験体（妊娠中の雌および／または胎児）に由来するデータから経験的に決定することができる。
不確定値および定数ｎにより、範囲（例えば、不確定カットオフ）を規定することが多い。例えば、場合によって、不確定値は、標準偏差（例えば、±５）であり、これに、定数ｎ（例えば、信頼区間）を乗じ、これにより、範囲または不確定カットオフ（ｕｎｃｅｒｔａｉｎｔｙ ｃｕｔｏｆｆ）（例えば、５ｎ〜−５ｎ）を規定する。
一部の実施形態では、遺伝子の変動（例えば、母体のコピー数の変動、胎児のコピー数の変動、または母体のコピー数の変動および胎児のコピー数の変動）についての期待レベルの範囲は、期待レベルに、不確定値を乗算した定数ｎ（例えば、ｎ×シグマ（例えば、６シグマ））を加えた和である。一部の実施形態では、ｋと命名される遺伝子の変動またはコピー数の変動についての期待レベルの範囲は、式：
式Ｒ：（期待レベルの範囲）ｋ＝（期待レベル）ｋ＋ｎσ
［式中、σは、不確定値であり、ｎは、定数（例えば、所定の定数）であり、期待レベルの範囲および期待レベルは、遺伝子の変動ｋ（例えば、ｋ＝ヘテロ接合性の欠失、例えば、ｋ＝遺伝子の変動の非存在）についての期待レベルの範囲および期待レベルである。例えば、１に等しい期待レベル（例えば、コピー数の変動の非存在）、±０．０５に等しい不確定値（すなわち、σ）、およびｎ＝３について、期待レベルの範囲を、１．１５〜０．８５と規定する］により規定することができる。一部の実施形態では、ヘテロ接合性の重複についての期待レベルを１．５とし、ｎ＝３とし、不確定値σを±０．０５とする場合、ヘテロ接合性の重複についての期待レベルの範囲を、１．６５〜１．３５と決定する。一部の実施形態では、ヘテロ接合性の重複についての期待レベルを０．５とし、ｎ＝３とし、不確定値σを±０．０５とする場合、ヘテロ接合性の欠失についての期待レベルの範囲を、０．６５〜０．３５と決定する。一部の実施形態では、ヘテロ接合性の重複についての期待レベルを２．０とし、ｎ＝３とし、不確定値σを±０．０５とする場合、ホモ接合性の重複についての期待レベルの範囲を、２．１５〜１．８５と決定する。一部の実施形態では、ヘテロ接合性の重複についての期待レベルを０．０とし、ｎ＝３とし、不確定値σを±０．０５とする場合、ホモ接合性の欠失についての期待レベルの範囲を、０．１５〜−０．１５と決定する。
一部の実施形態では、ホモ接合性のコピー数の変動についての期待レベルの範囲（例えば、母体の、胎児のまたは母体および胎児のホモ接合性のコピー数の変動）は一部分、対応するヘテロ接合性のコピー数の変動についての期待レベルの範囲に従って決定する。例えば、場合によって、ホモ接合性の重複についての期待レベルの範囲は、ヘテロ接合性の重複についての期待レベルの範囲の上限を超える全ての値を含む。一部の実施形態では、ホモ接合性の重複についての期待レベルの範囲は、ヘテロ接合性の重複についての期待レベルの範囲の上限を超えるかまたはこれに等しい全ての値を含む。一部の実施形態では、ホモ接合性の重複についての期待レベルの範囲は、ヘテロ接合性の重複についての期待レベルの範囲の上限を超え、かつ、式Ｒ［式中、σは、不確定値であり、正の値であり、ｎは、定数であり、ｋは、ホモ接合性の重複である］により規定される上限未満である全ての値を含む。一部の実施形態では、ホモ接合性の重複についての期待レベルの範囲は、ヘテロ接合性の重複についての期待レベルの範囲の上限を超えるかまたはこれに等しく、かつ、式Ｒ［式中、σは、不確定値であり、σは、正の値であり、ｎは、定数であり、ｋは、ホモ接合性の重複である］により規定される上限未満であるかまたはこれに等しい全ての値を含む。
一部の実施形態では、ホモ接合性の欠失についての期待レベルの範囲は、ヘテロ接合性の欠失についての期待レベルの範囲の下限未満の全ての値を含む。一部の実施形態では、ホモ接合性の欠失についての期待レベルの範囲は、ヘテロ接合性の欠失についての期待レベルの範囲の下限未満であるかまたはこれに等しい全ての値を含む。一部の実施形態では、ホモ接合性の欠失についての期待レベルの範囲は、ヘテロ接合性の欠失についての期待レベルの範囲の下限未満であり、かつ、式Ｒ［式中、σは、不確定値であり、σは、負の値であり、ｎは、定数であり、ｋは、ホモ接合性の欠失である］により規定される下限を超える全ての値を含む。一部の実施形態では、ホモ接合性の欠失についての期待レベルの範囲は、ヘテロ接合性の欠失についての期待レベルの範囲の下限未満であるかまたはこれに等しく、かつ、式Ｒ［式中、σは、不確定値であり、σは、負の値であり、ｎは、定数であり、ｋは、ホモ接合性の欠失である］により規定される下限を超えるかまたはこれに等しい全ての値を含む。
不確定値を活用して、閾値を決定することができる。一部の実施形態では、範囲（例えば、閾範囲）は、未加工のカウント、フィルタリングされたカウント、および／または正規化されたカウントから決定された不確定値を計算することにより得られる。一部の実施形態では、範囲は、範囲を生成するレベルについての不確定値（例えば、レベルの正規化されたカウント）に、カットオフ閾（例えば、３標準偏差では、３を乗算する）として選択された、不確定値の倍数（例えば、ある数だけの標準偏差）を表わす所定の定数（例えば、１、２、３、４、５、６など）を乗算することにより決定することができる。一部の実施形態では、範囲は、値（例えば、所定の値、不確定値、所定の定数を乗じられた不確定値）を、範囲を生成するレベルに加算することおよび／または範囲を生成するレベルから減算することにより決定することができる。例えば、レベルを１に等しいとし、標準偏差を±０．２とし、ここで、所定の定数を３とすると、範囲は、（１＋３（０．２））〜（１＋３（−０．２））、または１．６〜０．４と計算することができる。範囲は、場合によって、コピー数の変動についての期待範囲または期待レベルの範囲を規定しうる。ある特定の実施形態では、値の範囲外であれ、値の範囲内であれ、閾値を超える部分の一部または全部を、正規化処理の一部として、正規化処理の前に、または正規化処理の後で除外する。一部の実施形態では、範囲外であれ、範囲内であれ、計算された閾値を超える部分の一部または全部を、正規化処理もしくは分類処理の一部として、正規化処理もしくは分類処理の前に、重み付けするかまたは調整する。重み付けの例については、本明細書で記載される。本明細書で使用される「冗長データ」および「冗長なマッピングした読取り」という用語は、試料に由来する配列の読取りであって、既にゲノム位置（例えば、塩基の場所）へと割り当てられ、かつ／または部分についてカウントされたものとして同定される配列の読取りを指す。
一部の実施形態では、不確定値を、下記の式：
Figure 2016533173
［式中、Ｚは、２つのレベルの間の標準化した偏差を表示し、Ｌは、平均値（または中央値）レベルであり、シグマは、標準偏差（またはＭＡＤ）である。添え字Ｏは、プロファイルのセグメント（例えば、第２のレベル、染色体、ＮＲＶ、「正倍数性レベル」、コピー数の変動が存在しないレベル）について描示し、Ａは、別のプロファイルのセグメント（例えば、第１のレベル、コピー数の変動を表示するレベル、異数性（例えば、トリソミー）を表示するレベル）について描示する。変数Ｎｏは、添え字Ｏにより描示されるプロファイルのセグメント中の部分の総数を表示する。ＮＡは、添え字Ａにより描示されるプロファイルのセグメント中の部分の総数を表示する］に従って決定する。
コピー数の変動の類別
別のレベル（例えば、第２のレベル）と有意に異なるレベル（例えば、第１のレベル）は、期待レベルの範囲に従って、コピー数の変動（例えば、母体および／または胎児のコピー数の変動、胎児のコピー数の変動、欠失、重複、挿入）として類別しうることが多い。一部の実施形態では、第１のレベルが、第２のレベルと有意に異なり、第１のレベルが、コピー数の変動についての期待レベルの範囲内にある場合に、コピー数の変動の存在を類別する。例えば、コピー数の変動（例えば、母体および／または胎児のコピー数の変動、胎児のコピー数の変動）は、第１のレベルが、第２のレベルと有意に異なり、第１のレベルが、コピー数の変動についての期待レベルの範囲内にある場合に類別することができる。一部の実施形態では、ヘテロ接合性の重複（例えば、母体もしくは胎児の、または母体および胎児の、ヘテロ接合性の重複）またはヘテロ接合性の欠失（例えば、母体または胎児の、または母体および胎児の、ヘテロ接合性の欠失）は、第１のレベルが、第２のレベルと有意に異なり、第１のレベルが、ヘテロ接合性の重複またはヘテロ接合性の欠失のそれぞれについての期待レベルの範囲内にある場合に類別される。一部の実施形態では、ホモ接合性の重複またはホモ接合性の欠失は、第１のレベルが、第２のレベルと有意に異なり、第１のレベルが、ホモ接合性の重複またはホモ接合性の欠失のそれぞれについての期待レベルの範囲内にある場合に類別される。
レベルの調整
一部の実施形態では、１つまたは複数のレベルを調整する。レベルを調整するための処理は、穴埋めと称することが多い。一部の実施形態では、プロファイル中の複数のレベル（例えば、ゲノムのプロファイル、染色体のプロファイル、染色体の部分またはセグメントのプロファイル）を調整する。一部の実施形態では、プロファイル中の約１つ〜約１０，０００またはそれ超のレベルを調整する。一部の実施形態では、プロファイル中の約１つ〜約１０００、１つ〜約９００、１つ〜約８００、１つ〜約７００、１つ〜約６００、１つ〜約５００、１つ〜約４００、１つ〜約３００、１つ〜約２００、１つ〜約１００、１つ〜約５０、１つ〜約２５、１つ〜約２０、１つ〜約１５、１つ〜約１０、または１つ〜約５つのレベルを調整する。一部の実施形態では、１つのレベルを調整する。一部の実施形態では、第２のレベルと有意に異なるレベル（例えば、正規化されたカウントプロファイルの第１のレベル）を調整する。一部の実施形態では、コピー数の変動として類別されたレベルを調整する。一部の実施形態では、第２のレベルと有意に異なるレベル（例えば、正規化されたカウントプロファイルの第１のレベル）を、コピー数の変動（例えば、コピー数の変動、例えば、母体のコピー数の変動）として類別し、調整する。一部の実施形態では、レベル（例えば、第１のレベル）は、母体のコピー数の変動、胎児のコピー数の変動、または母体のコピー数の変動および胎児のコピー数の変動についての期待レベルの範囲内にあり、そのレベルを調整する。一部の実施形態では、１つまたは複数のレベル（例えば、プロファイル中のレベル）を調整しない。一部の実施形態では、レベル（例えば、第１のレベル）は、コピー数の変動についての期待レベルの範囲外にあり、そのレベルを調整しない。コピー数の変動の非存在についての期待レベルの範囲中のレベルは、調整しないことが多い。任意の適切な数の調整を、プロファイル中の１つまたは複数のレベルに対して施すことができる。一部の実施形態では、１つまたは複数のレベルを調整する。一部の実施形態では、２またはそれ超、３またはそれ超、５またはそれ超、６またはそれ超、７またはそれ超、８またはそれ超、９またはそれ超、場合によって、１０またはそれ超のレベルを調整する。
一部の実施形態では、第１のレベルの値を、第２のレベルの値に従って調整する。一部の実施形態では、コピー数の変動を表示するものとして同定される第１のレベルを、第２のレベルの値に対して調整し、ここで、第２のレベルは、コピー数の変動が存在しないことと関連することが多い。ある特定の実施形態では、コピー数の変動を表示するものとして同定される第１のレベルの値を、第１のレベルの値が、第２のレベルの値とほぼ等しくなるように調整する。
調整は、適切な数学的演算を含みうる。一部の実施形態では、調整は、１つまたは複数の数学的演算を含む。一部の実施形態では、レベルは、それを正規化すること、それをフィルタリングすること、それを平均すること、それに乗算すること、それを除算すること、それに加算すること、もしくはそれから減算すること、またはこれらの組合せにより調整される。一部の実施形態では、所定の値または定数によりレベルを調整する。一部の実施形態では、レベルの値を、別のレベルの値へと改変することによりレベルを調整する。例えば、第１のレベルは、その値を第２のレベルの値へと改変することにより調整することができる。このような場合の値は、処理値（例えば、平均値、正規化した値など）でありうる。
一部の実施形態では、レベルを、コピー数の変動（例えば、母体のコピー数の変動）として類別し、本明細書では所定の調整値（ＰＡＶ：ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ ｖａｌｕｅ）と称する、所定の値に従って調整する。ＰＡＶは、特異的コピー数の変動について決定することが多い。特異的コピー数の変動（例えば、ホモ接合性の重複、ホモ接合性の欠失、ヘテロ接合性の重複、ヘテロ接合性の欠失）について決定されたＰＡＶは、特異的コピー数の変動（例えば、ホモ接合性の重複、ホモ接合性の欠失、ヘテロ接合性の重複、ヘテロ接合性の欠失）として類別されたレベルを調整するのに使用することが多い。ある特定の実施形態では、レベルを、コピー数の変動として類別し、次いで、類別されたコピー数の変動の種類に特異的なＰＡＶに従って調整する。一部の実施形態では、レベル（例えば、第１のレベル）を、母体のコピー数の変動、胎児のコピー数の変動、または母体のコピー数の変動および胎児のコピー数の変動として類別し、ＰＡＶを、レベルへと加算すること、またはレベルから減算することにより調整する。レベル（例えば、第１のレベル）を、母体のコピー数の変動として類別し、ＰＡＶを、レベルへと加算することにより調整することが多い。例えば、重複（例えば、母体の、胎児の、または母体および胎児のホモ接合性の重複）として類別されたレベルは、特異的重複（例えば、ホモ接合性の重複）について決定されたＰＡＶを加算することにより調整し、これにより、調整されたレベルを提示することができる。コピー数の重複について決定されるＰＡＶは、負の値であることが多い。一部の実施形態では、重複について決定されたＰＡＶを活用することにより、重複を表示するレベルに調整を施す結果として、レベルの値が低減される。一部の実施形態では、第２のレベルと有意に異なるレベル（例えば、第１のレベル）を、コピー数の欠失（例えば、ホモ接合性の欠失、ヘテロ接合性の欠失、ホモ接合性の重複、ホモ接合性の重複）として類別し、コピー数の欠失について決定されたＰＡＶを加算することにより、第１のレベルを調整する。コピー数の欠失について決定されたＰＡＶは、正の値であることが多い。一部の実施形態では、欠失について決定されたＰＡＶを活用することにより、欠失を表示するレベルに調整を施す結果として、レベルの値が増加する。
ＰＡＶは、任意の適切な値でありうる。ＰＡＶは、コピー数の変動（例えば、類別されたコピー数の変動）に従って決定され、これに特異的であることが多い。ある特定の実施形態では、ＰＡＶを、コピー数の変動（例えば、類別されたコピー数の変動）についての期待レベルおよび／またはＰＡＶ係数に従って決定する。ＰＡＶは、場合によって、期待レベルにＰＡＶ係数を乗算することにより決定する。例えば、コピー数の変動についてのＰＡＶは、コピー数の変動（例えば、ヘテロ接合性の欠失）について決定された期待レベルに、同じコピー数の変動（例えば、ヘテロ接合性の欠失）について決定されたＰＡＶ係数を乗算することにより決定することができる。例えば、ＰＡＶは、コピー数の変動ｋ（例えば、ｋ＝ヘテロ接合性の欠失）についての下記の式：
ＰＡＶｋ＝（期待レベル）ｋ×（ＰＡＶ係数）ｋ
により決定することができる。
ＰＡＶ係数は、任意の適切な値でありうる。一部の実施形態では、ホモ接合性の重複についてのＰＡＶ係数は、約−０．６〜約−０．４の間である。一部の実施形態では、ホモ接合性の重複についてのＰＡＶ係数は、約−０．６０、−０．５９、−０．５８、−０．５７、−０．５６、−０．５５、−０．５４、−０．５３、−０．５２、−０．５１、−０．５０、−０．４９、−０．４８、−０．４７、−０．４６、−０．４５、−０．４４、−０．４３、−０．４２、−０．４１、および−０．４０である。ホモ接合性の重複についてのＰＡＶ係数は、約−０．５であることが多い。
例えば、ＮＲＶを約１とし、ホモ接合性の重複の期待レベルを約２に等しいとすると、ホモ接合性の重複についてのＰＡＶは、上記の式に従って、約−１と決定される。この場合、例えば、約−１を、第１のレベルの値へと加算することにより、ホモ接合性の重複として類別された第１のレベルを調整する。
一部の実施形態では、ヘテロ接合性の重複についてのＰＡＶ係数は、約−０．４〜約−０．２の間である。一部の実施形態では、ヘテロ接合性の重複についてのＰＡＶ係数は、約−０．４０、−０．３９、−０．３８、−０．３７、−０．３６、−０．３５、−０．３４、−０．３３、−０．３２、−０．３１、−０．３０、−０．２９、−０．２８、−０．２７、−０．２６、−０．２５、−０．２４、−０．２３、−０．２２、−０．２１、および−０．２０である。ヘテロ接合性の重複についてのＰＡＶ係数は、約−０．３３であることが多い。
例えば、ＮＲＶを約１とし、ヘテロ接合性の重複の期待レベルを約１．５に等しいとすると、ホモ接合性の重複についてのＰＡＶは、上記の式に従って、約−０．４９５と決定される。この場合、例えば、約−０．４９５を、第１のレベルの値へと加算することにより、ヘテロ接合性の重複として類別された第１のレベルを調整する。
一部の実施形態では、ヘテロ接合性の欠失についてのＰＡＶ係数は、約０．４〜約０．２の間である。一部の実施形態では、ヘテロ接合性の欠失についてのＰＡＶ係数は、約０．４０、０．３９、０．３８、０．３７、０．３６、０．３５、０．３４、０．３３、０．３２、０．３１、０．３０、０．２９、０．２８、０．２７、０．２６、０．２５、０．２４、０．２３、０．２２、０．２１、および０．２０である。ヘテロ接合性の欠失についてのＰＡＶ係数は、約０．３３であることが多い。
例えば、ＮＲＶを約１とし、ヘテロ接合性の欠失の期待レベルを約０．５に等しいとすると、ヘテロ接合性の欠失についてのＰＡＶは、上記の式に従って、約０．４９５と決定される。この場合、例えば、約０．４９５を、第１のレベルの値へと加算することにより、ヘテロ接合性の欠失として類別された第１のレベルを調整する。
一部の実施形態では、ホモ接合性の欠失についてのＰＡＶ係数は、約０．６〜約０．４の間である。一部の実施形態では、ホモ接合性の欠失についてのＰＡＶ係数は、約０．６０、０．５９、０．５８、０．５７、０．５６、０．５５、０．５４、０．５３、０．５２、０．５１、０．５０、０．４９、０．４８、０．４７、０．４６、０．４５、０．４４、０．４３、０．４２、０．４１、および０．４０である。ホモ接合性の欠失についてのＰＡＶ係数は、約０．５であることが多い。
例えば、ＮＲＶを約１とし、ホモ接合性の欠失の期待レベルを約０に等しいとすると、ホモ接合性の欠失についてのＰＡＶは、上記の式に従って、約１と決定される。この場合、例えば、約１を、第１のレベルの値へと加算することにより、ホモ接合性の欠失として類別された第１のレベルを調整する。
ある特定の実施形態では、ＰＡＶは、コピー数の変動についての期待レベル（例えば、コピー数の変動の期待レベル）にほぼ等しいかまたは等しい。
一部の実施形態では、調整を施す前にレベルのカウントを正規化する。ある特定の実施形態では、調整を施す前に、プロファイル中の一部または全部のレベルのカウントを正規化する。例えば、参照レベルのカウントまたはＮＲＶに従って、レベルのカウントを正規化することができる。ある特定の実施形態では、調整を施す前に、レベルのカウント（例えば、第２のレベル）を、参照レベルのカウントまたはＮＲＶに従って正規化し、プロファイル中の他の全てのレベル（例えば、第１のレベル）のカウントを、同じ参照レベルのカウントまたはＮＲＶと比べて正規化する。
一部の実施形態では、プロファイルのレベルは、１つまたは複数の調整の結果として得られる。ある特定の実施形態では、プロファイルのレベルを、プロファイル中の１つまたは複数のレベルを調整した後で決定する。一部の実施形態では、１つまたは複数の調整を施した後で、プロファイルのレベルを再計算する。
一部の実施形態では、コピー数の変動（例えば、母体のコピー数の変動、胎児のコピー数の変動、または母体のコピー数の変動および胎児のコピー数の変動）を、調整により決定する（例えば、直接的または間接的に決定する）。例えば、プロファイル中の調整されたレベル（例えば、調整された第１のレベル）は、母体のコピー数の変動として同定することができる。一部の実施形態では、調整の大きさは、コピー数の変動の種類（例えば、ヘテロ接合性の欠失、ホモ接合性の重複など）を指し示す。ある特定の実施形態では、プロファイル中の調整されたレベルを、コピー数の変動を表示するものとして、コピー数の変動についてのＰＡＶの値に従って同定することができる。例えば、所与のプロファイルについて、ＰＡＶは、ホモ接合性の重複では約−１であり、ヘテロ接合性の重複では約−０．５であり、ヘテロ接合性の欠失では約０．５であり、ホモ接合性の欠失では約１である。前出の例では、約−１で調整されるレベルは、例えば、ホモ接合性の重複として同定することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数のコピー数の変動は、１つまたは複数の調整を含むプロファイルまたはレベルから決定することができる。
ある特定の実施形態では、プロファイル内の調整されたレベルを比較する。一部の実施形態では、異常および誤差は、調整されたレベルを比較することにより確認する。例えば、プロファイル中の１つまたは複数の調整されたレベルについて比較し、特定のレベルを、異常または誤差として確認することができることが多い。一部の実施形態では、異常または誤差を、レベルを構成する１つまたは複数の部分内で確認する。異常または誤差は、同じレベル内で（例えば、プロファイル内で）確認することもでき、隣接する（ａｄｊａｃｅｎｔ、ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ、ａｄｊｏｉｎｉｎｇ、またはａｂｕｔｔｉｎｇ）部分を表示する１つまたは複数のレベルにおいて確認することもできる。一部の実施形態では、１つまたは複数の調整されたレベルは、隣接する（ａｄｊａｃｅｎｔ、ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ、ａｄｊｏｉｎｉｎｇ、またはａｂｕｔｔｉｎｇ）部分のレベルであり、ここで、１つまたは複数の調整されたレベルについて比較し、異常または誤差を確認する。異常または誤差は、プロファイル内またはレベル中のピークまたはディップである可能性があり、ここで、ピークまたはディップの原因は、既知または未知である。ある特定の実施形態では、調整されたレベルについて比較し、異常または誤差を確認し、ここで、異常または誤差は、確率誤差、系統誤差、偶然誤差、または使用者誤差に起因する。一部の実施形態では、調整されたレベルについて比較し、異常または誤差を、プロファイルから除外する。ある特定の実施形態では、調整されたレベルについて比較し、異常または誤差を調整する。
胎児核酸の含有量の決定
一部の実施形態では、核酸中の胎児核酸の量（例えば、濃度、相対量、絶対量、コピー数など）を決定する。ある特定の実施形態では、試料中の胎児核酸の量を、「胎児フラクション」と称する。一部の実施形態では、「胎児フラクション」は、妊娠中の雌から得られた試料（例えば、血液試料、血清試料、血漿試料）中の循環無細胞核酸中の胎児核酸のフラクションを指す。一部の実施形態では、遺伝子の変動を決定する方法はまた、胎児フラクションを決定するステップも含む場合がある。一部の実施形態では、遺伝子の変動の存在または非存在を、胎児フラクション（例えば、試料についての胎児フラクションの決定）に従って決定する。胎児フラクションを決定するステップは、その非限定的な例が、下記に記載される方法を含む、適切な様式で実施することができる。
一部の実施形態では、本明細書で記載される、断片の長さを決定するための方法を使用して、胎児フラクションを決定することができる。無細胞胎児核酸の断片は一般に、母体に由来する核酸の断片よりも短い（例えば、Chanら、（２００４年）Clin. Chem. ５０巻：８８〜９２頁；Loら（２０１０年）Sci. Transl. Med. ２巻：６１〜９１頁を参照されたい）。したがって、一部の実施形態では、特定の長さの閾を下回る断片をカウントし、それらのカウントを試料中の全ての核酸の量と比較することにより、胎児フラクションを決定することができる。特定の長さの核酸断片をカウントするための方法については、下記でさらに詳細に記載する。
ある特定の実施形態では、胎児核酸の量を、雄の胎児に特異的なマーカー（例えば、Ｙ染色体ＳＴＲマーカー（例えば、ＤＹＳ１９、ＤＹＳ３８５、ＤＹＳ３９２マーカー）；ＲｈＤ陰性の雌中のＲｈＤマーカー）、多型配列の対立遺伝子比に従って、または胎児核酸に特異的であり、母体核酸には特異的でない１つもしくは複数のマーカー（例えば、母親と胎児との間で差次的な、エピジェネティックなバイオマーカー（例えば、メチル化；下記でさらに詳細に記載する）、もしくは母体の血漿中の胎児ＲＮＡマーカー（例えば、Lo、２００５年、Journal of Histochemistry andCytochemistry、５３巻（３号）：２９３〜２９６頁を参照されたい））に従って決定する。
胎児核酸の含有量（例えば、胎児フラクション）の決定は、場合によって、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１０／０１０５０４９号において記載される通りに、胎児数量アッセイ（ＦＱＡ：ｆｅｔａｌ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ ａｓｓａｙ）を使用して行う。この種類のアッセイにより、母体試料中の胎児核酸を、該試料中の核酸のメチル化状況に基づいて検出および定量することが可能となる。ある特定の実施形態では、母体試料に由来する胎児核酸の量を、存在する核酸の総量と比べて決定することができ、これにより、試料中の胎児核酸の百分率がもたらされる。ある特定の実施形態では、母体試料中の胎児核酸のコピー数を決定することができる。ある特定の実施形態では、胎児核酸の量を、配列に特異的（または部分に特異的）な様式で、場合によって、正確な染色体量分析(chromosomal dosage analysis)を可能にする（例えば、胎児異数性の存在または非存在を検出する）のに十分な感度を伴って決定することができる。
胎児数量アッセイ（ＦＱＡ）は、本明細書で記載される方法のうちのいずれかと共に行うことができる。このようなアッセイは、任意の当技術分野で公知の方法、および／または米国特許出願公開第２０１０／０１０５０４９号において記載される方法により、例えば、差次的なメチル化状況に基づいて母体のＤＮＡと胎児ＤＮＡとを区別し、胎児ＤＮＡを定量しうる（すなわち、その量を決定しうる）方法などにより、行うことができる。メチル化状況に基づいて核酸を差別化するための方法は、メチル化感受性による捕捉であって、例えば、ＭＢＤ２のメチル結合性ドメインを、抗体のＦｃ断片に融合させた、ＭＢＤ２−Ｆｃ断片（ＭＢＤ−ＦＣ）を使用する捕捉（Gebhardら（２００６年）、Cancer Res.、６６巻（１２号）：６１１８〜２８頁）；メチル化特異的抗体；亜硫酸水素塩により変換する方法、例えば、ＭＳＰ（メチル化感受性ＰＣＲ）、ＣＯＢＲＡ、メチル化感受性単一ヌクレオチドによるプライマー伸長（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ）、またはＳｅｑｕｅｎｏｍ ＭａｓｓＣＬＥＡＶＥ（商標）技術；およびメチル化感受性制限酵素の使用（例えば、母体試料中の母体のＤＮＡを、１つまたは複数のメチル化感受性制限酵素を使用して消化し、これにより、胎児ＤＮＡを富化する）を含むがこれらに限定されない。また、メチル感受性酵素を使用して、メチル化状況に基づいて核酸を差別化することもでき、これらの酵素は、例えば、後者がメチル化されていない場合には、それらのＤＮＡ認識配列において優先的または実質的に切断または消化することができる。したがって、非メチル化ＤＮＡ試料は、メチル化ＤＮＡ試料よりも小さな断片に切られ、超メチル化ＤＮＡ試料は切断されない。明示的に言明される場合を除き、メチル化状況に基づいて核酸を差別化するための任意の方法を、本明細書の技術による組成物および方法と共に使用することができる。胎児ＤＮＡの量は、例えば、１つまたは複数の競合物質を、既知の濃度で、増幅反応中に導入することにより決定することができる。胎児ＤＮＡの量の決定はまた、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、プライマー伸長、配列決定、および／またはカウント計測により行うこともできる。ある特定の場合には、核酸の量は、米国特許出願公開第２００７／００６５８２３号において記載される通り、ＢＥＡＭｉｎｇ技術を使用して決定することができる。ある特定の実施形態では、制限の効率を決定することができ、効率の比率を使用して、胎児ＤＮＡの量をさらに決定する。
ある特定の実施形態では、胎児数量アッセイ（ＦＱＡ）を使用して、母体試料中の胎児ＤＮＡの濃度を、例えば、以下の方法：ａ）母体試料中に存在するＤＮＡの総量を決定し；ｂ）母体試料中の母体のＤＮＡを、１つまたは複数のメチル化感受性制限酵素を使用して選択的に消化し、これにより、胎児ＤＮＡを富化し；ｃ）ステップｂ）から得られた胎児ＤＮＡの量を決定し；ｄ）ステップｃ）から得られた胎児ＤＮＡの量を、ステップａ）から得られたＤＮＡの総量と比較し、これにより、母体試料中の胎児ＤＮＡの濃度を決定する方法により決定することができる。ある特定の実施形態では、母体試料中の胎児核酸の絶対コピー数を、例えば、質量分析および／または絶対コピー数を測定するために競合的ＰＣＲ法を使用するシステムを使用して決定することができる。例えば、それらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、DingおよびCantor（２００３年）PNASUSA、１００巻：３０５９〜３０６４頁、ならびに米国特許出願公開第２００４／００８１９９３号を参照されたい。
ある特定の実施形態では、胎児フラクションは、例えば、参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２０１１／０２２４０８７号において記載されている方法などを使用して、多型配列（例えば、一塩基多型（ＳＮＰ））の対立遺伝子比に基づいて決定することができる。このような方法では、ヌクレオチド配列の読取りを、母体試料について得、参照ゲノム中の参考となる多型部位（例えば、ＳＮＰ）において、第１の対立遺伝子へとマッピングされるヌクレオチド配列の読取りの総数と、第２の対立遺伝子へとマッピングされるヌクレオチド配列の読取りの総数とを比較することにより、胎児フラクションを決定する。ある特定の実施形態では、胎児の対立遺伝子を、例えば、それらの、試料中の胎児核酸と母体核酸との混合物への、母体核酸による混合物への大きな寄与と比較した、相対的に小さい寄与により同定する。したがって、母体試料中の胎児核酸の相対存在度は、多型部位の２つの対立遺伝子の各々についての、参照ゲノム上の標的核酸配列へとマッピングしたユニークな配列の読取りの総数のパラメータとして決定することができる。
本明細書で提供される方法と共に、細胞外核酸中の胎児核酸の量を、定量し、使用することができる。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書で記載される技術の方法は、胎児核酸の量を決定する、さらなるステップを含む。被験体に由来する核酸試料中の胎児核酸の量は、試料核酸を調製するための処理の前に決定することもでき、この後で決定することもできる。ある特定の実施形態では、試料核酸を処理し、調製した後で、試料中の胎児核酸の量を決定し、さらなる評価のためにこの量を活用する。一部の実施形態では、アウトカムは、試料核酸中の胎児核酸のフラクションの寄与の程度を加減すること（例えば、カウントを調整すること、試料を除去すること、判定を行うこと、または判定を行わないこと）を含む。
決定ステップは、本明細書で記載される方法の前、方法の間、方法中の任意の一時点において実施することもでき、本明細書で記載されるある特定の方法（例えば、異数性の検出法、胎児の性別の決定法）の後で行うこともできる。例えば、胎児の性別または異数性の決定法を、所与の感度または特異性で達成するために、胎児核酸の定量法を、胎児の性別または異数性の決定の前に、決定の間に、または決定の後で実施して、約２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％またはそれ超の胎児核酸を有する試料を同定することができる。一部の実施形態では、ある特定の閾量（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ａｍｏｕｎｔ）の胎児核酸（例えば、約１５％またはそれ超の胎児核酸；約４％またはそれ超の胎児核酸）を有すると決定された試料を、例えば、胎児の性別もしくは異数性の決定のために、または異数性もしくは遺伝子の変動の存在もしくは非存在について、さらに分析する。ある特定の実施形態では、例えば、胎児の性別または異数性の存在もしくは非存在の決定を、ある特定の閾量の胎児核酸（例えば、約１５％またはそれ超の胎児核酸；約４％またはそれ超の胎児核酸）を有する試料のみについて選択する（例えば、選択し、患者に伝える）。
一部の実施形態では、染色体異数性の存在または非存在を同定するために、胎児フラクションの決定または胎児核酸の量の決定が、要求されることも、必要になることもない。一部の実施形態では、染色体異数性の存在または非存在の同定は、母体のＤＮＡと対比した、胎児のＤＮＡの配列の差別化を要求しない。ある特定の実施形態では、これは、特定の染色体、染色体部分、またはこれらのセグメントにおける母体配列および胎児配列の両方の寄与の合計を分析するためである。一部の実施形態では、染色体異数性の存在または非存在の同定は、胎児のＤＮＡを母体のＤＮＡから識別する、先験的な配列情報に依拠しない。
レベルに基づく胎児フラクションの決定
一部の実施形態では、胎児フラクションを、母体および／または胎児のコピー数の変動を表示するものとして類別されたレベルに従って決定する。例えば、胎児フラクションの決定は、胎児フラクションを決定するために活用される、母体および／または胎児のコピー数の変動についての期待レベルの評価を含むことが多い。一部の実施形態では、胎児フラクションを、コピー数の変動を表示するものとして類別されたレベル（例えば、第１のレベル）について、同じ種類のコピー数の変動について決定された期待レベルの範囲に従って決定する。胎児フラクションは、期待レベルの範囲内にある観察レベルに従って決定し、これにより、母体および／または胎児のコピー数の変動として類別することが多い。一部の実施形態では、胎児フラクションを、母体および／または胎児のコピー数の変動として類別された観察レベル（例えば、第１のレベル）が、同じ母体および／または胎児のコピー数の変動について決定された期待レベルと異なる場合に決定する。
一部の実施形態では、レベル（例えば、第１のレベル、観察レベル）は、第２のレベルと有意に異なり、第１のレベルを、母体および／または胎児のコピー数の変動として類別し、胎児フラクションを、第１のレベルに従って決定する。一部の実施形態では、第１のレベルは、プロファイル中の第２のレベルと有意に異なる観察レベルおよび／または実験的に得られたレベルであり、胎児フラクションを、第１のレベルに従って決定する。一部の実施形態では、第１のレベルは、平均レベル、平均値レベル、または合計レベルであり、胎児フラクションを、第１のレベルに従って決定する。ある特定の実施形態では、第１のレベルおよび第２のレベルは、観察レベルおよび／または実験的に得られたレベルであり、胎児フラクションを、第１のレベルに従って決定する。場合によって、第１のレベルは、第１の部分のセットについての正規化されたカウントを含み、第２のレベルは、第２の部分のセットについての正規化されたカウントを含み、胎児フラクションを、第１のレベルに従って決定する。一部の実施形態では、第１のレベルの第１の部分のセットは、コピー数の変動（例えば、第１のレベルは、コピー数の変動を表示する）を含み、胎児フラクションを、第１のレベルに従って決定する。一部の実施形態では、第１のレベルの第１の部分のセットは、ホモ接合性またはヘテロ接合性の母体のコピー数の変動を含み、胎児フラクションを、第１のレベルに従って決定する。一部の実施形態では、プロファイルは、第１の部分のセットについての第１のレベルおよび第２の部分のセットについての第２のレベルを含み、第２の部分のセットは、実質的にコピー数の変動（例えば、母体のコピー数の変動、胎児のコピー数の変動、または母体のコピー数の変動および胎児のコピー数の変動）を含まず、胎児フラクションを、第１のレベルに従って決定する。
一部の実施形態では、レベル（例えば、第１のレベル、観察レベル）は、第２のレベルと有意に異なり、第１のレベルを、母体および／または胎児のコピー数の変動に関して類別し、胎児フラクションを、第１のレベルおよび／またはコピー数の変動の期待レベルに従って決定する。一部の実施形態では、第１のレベルを、コピー数の変動についての期待レベルに従って、コピー数の変動に関して類別し、胎児フラクションを、第１のレベルと期待レベルとの差に従って決定する。ある特定の実施形態では、レベル（例えば、第１のレベル、観察レベル）を、母体および／または胎児のコピー数の変動として類別し、胎児フラクションを、第１のレベルとコピー数の変動の期待レベルとの差の２倍として決定する。一部の実施形態では、レベル（例えば、第１のレベル、観察レベル）を、母体および／または胎児のコピー数の変動として類別し、第１のレベルを、期待レベルから減じ、これにより、差を提供し、胎児フラクションを、差の２倍として決定する。一部の実施形態では、レベル（例えば、第１のレベル、観察レベル）を、母体および／または胎児のコピー数の変動として類別し、期待レベルを、第１のレベルから減じ、これにより、差を提供し、胎児フラクションを、差の２倍として決定する。
胎児フラクションは、パーセントとして提示することが多い。例えば、胎児フラクションを、１００で除算することができ、これにより、パーセント値を提供する。例えば、母体のホモ接合性の重複を表示し、１５５のレベルである第１のレベルと、母体のホモ接合性の重複についての期待レベルであって、１５０のレベルである期待レベルとでは、胎児フラクションは、１０％（例えば、（胎児フラクション＝２×（１５５−１５０））として決定することができる。
一部の実施形態では、胎児フラクションを、プロファイル中の２つまたはそれ超のレベルであって、コピー数の変動として類別されたレベルから決定する。例えば、場合によって、プロファイル中の２つまたはそれ超のレベル（例えば、２つまたはそれ超の第１のレベル）を、参照レベル（例えば、実質的にコピー数の変動を含まないレベルである、第２のレベル）と有意に異なるものとして同定し、２つまたはそれ超のレベルを、母体および／または胎児のコピー数の変動を表示するものとして類別し、胎児フラクションを、２つまたはそれ超のレベルの各々から決定する。一部の実施形態では、胎児フラクションを、プロファイル中の約３つもしくはそれ超、約４つもしくはそれ超、約５つもしくはそれ超、約６つもしくはそれ超、約７つもしくはそれ超、約８つもしくはそれ超、または約９つもしくはそれ超の胎児フラクションの決定から決定する。一部の実施形態では、胎児フラクションを、プロファイル中の約１０もしくはそれ超、約２０もしくはそれ超、約３０もしくはそれ超、約４０もしくはそれ超、約５０もしくはそれ超、約６０もしくはそれ超、約７０もしくはそれ超、約８０もしくはそれ超、または約９０もしくはそれ超の胎児フラクションの決定から決定する。一部の実施形態では、胎児フラクションを、プロファイル中の約１００もしくはそれ超、約２００もしくはそれ超、約３００もしくはそれ超、約４００もしくはそれ超、約５００もしくはそれ超、約６００もしくはそれ超、約７００もしくはそれ超、約８００もしくはそれ超、約９００もしくはそれ超、または約１０００もしくはそれ超の胎児フラクションの決定から決定する。一部の実施形態では、胎児フラクションを、プロファイル中の約１０〜約１０００、約２０〜約９００、約３０〜約７００、約４０〜約６００、約５０〜約５００、約５０〜約４００、約５０〜約３００、約５０〜約２００、または約５０〜約１００の胎児フラクションの決定から決定する。
一部の実施形態では、胎児フラクションを、プロファイル中の複数の胎児フラクションの決定の平均または平均値として決定する。ある特定の実施形態では、複数の胎児フラクションの決定から決定された胎児フラクションは、複数の胎児フラクションの決定の平均（例えば、平均、平均値、標準平均、中央値など）である。複数の胎児フラクションの決定から決定された胎児フラクションは、当技術分野で公知であるか、または本明細書で記載される適切な方法により決定される平均値であることが多い。一部の実施形態では、胎児フラクションの決定の平均値は、重み付き平均値である。一部の実施形態では、胎児フラクションの決定の平均値は、非重み付き平均値である。複数の胎児フラクションの決定から生成された平均値、中央値、または平均胎児フラクションの決定（すなわち、平均値、中央値、または平均胎児フラクションの決定値）は、場合によって、不確定値（例えば、分散、標準偏差、ＭＡＤなど）と関連する。一部の実施形態では、複数の決定に由来する、平均値、中央値、または平均胎児フラクション値を決定する前に、１つまたは複数の逸脱した決定を除外する（本明細書でより詳細に記載される）。
プロファイル中の一部の胎児フラクションの決定は、場合によって、全体的な胎児フラクションの決定（例えば、平均値または平均胎児フラクションの決定）に含まれない。一部の実施形態では、胎児フラクションの決定を、プロファイル中の第１のレベル（例えば、第２のレベルと有意に異なる第１のレベル）から導出し、第１のレベルは、遺伝子の変動を指し示さない。例えば、プロファイル中のいくつかの第１のレベル（例えば、スパイクまたはディップ）は、異常または未知の原因から生成される。このような値からは、真のコピー数の変動から得られる他の胎児フラクションの決定から有意に異なる胎児フラクションの決定を生じることが多い。一部の実施形態では、プロファイル中の他の胎児フラクションの決定から有意に異なる胎児フラクションの決定を確認し、胎児フラクションの決定から除外する。例えば、異常なスパイクおよびディップから得られる一部の胎児フラクションの決定は、それらをプロファイル中の他の胎児フラクションの決定と比較することにより確認し、全体的な胎児フラクションの決定から排除する。
一部の実施形態では、平均値、中央値、または平均胎児フラクションの決定と有意に異なる、独立の胎児フラクションの決定は、確認され、認識され、かつ／または観察可能な差違である。ある特定の実施形態では、「有意に異なる」という用語は、「統計学的に異なる」および／または「統計学的な有意差」を意味し得る。「独立の」胎児フラクションの決定は、コピー数の変動として類別された特異的レベルから決定（例えば、一部の実施形態では、単一の決定）された胎児フラクションでありうる。任意の適切な閾または範囲を使用して、胎児フラクションの決定が、平均値、中央値、または平均胎児フラクションの決定と有意に異なることを決定することができる。ある特定の実施形態では、胎児フラクションの決定は、平均値、中央値、または平均胎児フラクションの決定と有意に異なり、決定は平均または平均値からの逸脱パーセントとして表すことができる。ある特定の実施形態では、胎児フラクションの決定は、平均値、中央値、または平均胎児フラクションの決定と有意に異なり、約１０パーセントまたはそれ超異なる。一部の実施形態では、胎児フラクションの決定は、平均値、中央値、または平均胎児フラクションの決定と有意に異なり、約１５パーセントまたはそれ超異なる。一部の実施形態では、胎児フラクションの決定は、平均値、中央値、または平均胎児フラクションの決定と有意に異なり、約１５％〜約１００％またはそれ超異なる。
ある特定の実施形態では、胎児フラクションの決定は、平均値または平均胎児フラクションの決定と関連する複数の不確定値に従った、平均値、中央値、または平均胎児フラクションの決定と有意に異なる。不確定値および定数ｎ（例えば、信頼区間）により、範囲（例えば、不確定カットオフ）を規定することが多い。例えば、場合によって、不確定値は、胎児フラクションの決定についての標準偏差（例えば、±５）であり、これに、定数ｎ（例えば、信頼区間）を乗じ、これにより、範囲または不確定カットオフ（例えば、５ｎ〜−５ｎ、場合によって、５シグマと称する）を規定する。一部の実施形態では、独立の胎児フラクションの決定は、不確定カットオフにより規定される範囲外にあり、平均値、中央値、または平均胎児フラクションの決定と有意に異なると考えられる。例えば、平均を１０とし、不確定カットオフを３とすると、１３超かまたは７未満である独立の胎児フラクションは、有意に異なる。一部の実施形態では、胎児フラクションの決定は、平均値、中央値、または平均胎児フラクションの決定と有意に異なり、不確定値のｎ倍（例えば、ｎ×シグマ）を超えて異なり、ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０にほぼ等しいか、またはそれ超である。一部の実施形態では、胎児フラクションの決定は、平均値、中央値、または平均胎児フラクションの決定と有意に異なり、不確定値のｎ倍（例えば、ｎ×シグマ）を超えて異なり、ここで、ｎは、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、または４．０にほぼ等しいか、またはそれ超である。
一部の実施形態では、レベルは、胎児および／または母体の微小倍数性を表示する。一部の実施形態では、レベル（例えば、第１のレベル、観察レベル）は、第２のレベルと有意に異なり、第１のレベルは、母体および／または胎児のコピー数の変動として類別され、第１のレベルおよび／または第２のレベルは、胎児の微小倍数性および／または母体の微小倍数性を表示する。ある特定の実施形態では、第１のレベルは、胎児の微小倍数性を表示し、一部の実施形態では、第１のレベルは、母体の微小倍数性を表示する。第１のレベルは、胎児の微小倍数性および母体の微小倍数性を表示することが多い。一部の実施形態では、レベル（例えば、第１のレベル、観察レベル）は、第２のレベルと有意に異なり、第１のレベルは、母体および／または胎児のコピー数の変動として類別され、第１のレベルは、胎児および／または母体の微小倍数性を表示し、胎児フラクションは、胎児および／または母体の微小倍数性に従って決定される。場合によって、第１のレベルは、母体および／または胎児のコピー数の変動として類別され、第１のレベルは、胎児の微小倍数性を表示し、胎児フラクションは、胎児の微小倍数性に従って決定される。一部の実施形態では、第１のレベルは、母体および／または胎児のコピー数の変動として類別され、第１のレベルは、母体の微小倍数性を表示し、胎児フラクションは、母体の微小倍数性に従って決定される。一部の実施形態では、第１のレベルは、母体および／または胎児のコピー数の変動として類別され、第１のレベルは、母体および胎児の微小倍数性を表示し、胎児フラクションは、母体および胎児の微小倍数性に従って決定される。
一部の実施形態では、胎児フラクションの決定は、胎児および／または母体の微小倍数性を決定することを含む。一部の実施形態では、レベル（例えば、第１のレベル、観察レベル）は、第２のレベルと有意に異なり、第１のレベルを、母体および／または胎児のコピー数の変動として類別し、胎児および／または母体の微小倍数性を、第１のレベルおよび／または第２のレベルに従って決定し、胎児フラクションを決定する。一部の実施形態では、第１のレベルを、母体および／または胎児のコピー数の変動として類別し、胎児の微小倍数性を、第１のレベルおよび／または第２のレベルに従って決定し、胎児フラクションを、胎児の微小倍数性に従って決定する。ある特定の実施形態では、第１のレベルを、母体および／または胎児のコピー数の変動として類別し、母体の微小倍数性を、第１のレベルおよび／または第２のレベルに従って決定し、胎児フラクションを、母体の微小倍数性に従って決定する。一部の実施形態では、第１のレベルを、母体および／または胎児のコピー数の変動として類別し、母体および胎児の微小倍数性を、第１のレベルおよび／または第２のレベルに従って決定し、胎児フラクションを、母体および胎児の微小倍数性に従って決定する。
胎児フラクションは、所与のレベルについて、またはコピー数の変動として類別されたレベルについて、母親の微小倍数性が、胎児の微小倍数性と異なる（例えば、胎児の微小倍数性と同じではない）場合に決定することが多い。一部の実施形態では、胎児フラクションは、母親が、重複についてホモ接合性（例えば、２の微小倍数性）であり、胎児が、同じ重複についてヘテロ接合性（例えば、１．５の微小倍数性）である場合に決定する。一部の実施形態では、胎児フラクションは、母親が、重複についてヘテロ接合性（例えば、１．５の微小倍数性）であり、胎児が、同じ重複についてホモ接合性（例えば、２の微小倍数性）であるか、または胎児において重複が存在しない（例えば、１の微小倍数性）場合に決定する。一部の実施形態では、胎児フラクションは、母親が、欠失についてホモ接合性（例えば、０の微小倍数性）であり、胎児が、同じ欠失についてヘテロ接合性（例えば、０．５の微小倍数性）である場合に決定する。一部の実施形態では、胎児フラクションは、母親が、欠失についてヘテロ接合性（例えば、０．５の微小倍数性）であり、胎児が、同じ欠失についてホモ接合性（例えば、０の微小倍数性）であるか、または胎児において欠失が存在しない（例えば、１の微小倍数性）場合に決定する。
ある特定の実施形態では、母親の微小倍数性が、コピー数の変動として確認された所与のレベルについて、胎児の微小倍数性と同じである（例えば、同じとして確認された）場合は、胎児フラクションを決定することができない。一部の実施形態では、例えば、母親および胎児の両方が、同じコピー数のコピー数の変動を保有する場合の所与のレベルについて、胎児フラクションは決定されない。例えば、母親および胎児の両方が、同じ欠失についてホモ接合性であるか、または同じ重複についてホモ接合性である場合は、胎児フラクションを、コピー数の変動として類別されたレベルについて決定することができない。ある特定の実施形態では、母親および胎児の両方が、同じ欠失についてヘテロ接合性であるか、または同じ重複についてヘテロ接合性である場合は、胎児フラクションを、コピー数の変動として類別されたレベルについて決定することができない。複数の胎児フラクションの決定を試料について行う実施形態では、平均値、中央値、または平均の値から有意に逸脱する決定は、母体の倍数性が、胎児の倍数性に等しいコピー数の変動の結果として得られる場合があり、このような決定は、検討事項から除外することができる。
一部の実施形態では、母体のコピー数の変動および胎児のコピー数の変動の微小倍数性は未知である。一部の実施形態では、コピー数の変動についての、胎児の微小倍数性および／または母体の微小倍数性の決定がなされない場合は、胎児フラクションを生成し、平均値、中央値、または平均胎児フラクションの決定と比較する。コピー数の変動についての胎児フラクションの決定であって、平均値、中央値、または平均胎児フラクションの決定と有意に異なる決定は、場合によって、母親および胎児の微小倍数性が、コピー数の変動について同じであるためである。胎児フラクションの決定であって、平均値、中央値、または平均胎児フラクションの決定と有意に異なる決定は、差違の発生源または原因に関わらず、全体的な胎児フラクションの決定から排除することが多い。一部の実施形態では、母親および／または胎児の微小倍数性を、当技術分野で公知の方法（例えば、標的化配列決定法）により決定および／または確かめる。
胎児フラクション決定のさらなる方法
一部の実施形態では、部分特異的胎児フラクションの推定値に従って、胎児フラクション（例えば、試料についての）を決定することができる。理論に制約されずに述べると、本明細書では、胎児のＣＣＦ断片（例えば、特定の長さまたは長さの範囲の断片）に由来する読取りの量は、広範な頻度で、部分（例えば、同じ試料内、例えば、同じ配列決定のラン内の）へとマッピングされることが決定されている。また、理論に制約されずに述べると、本明細書では、ある特定の部分は、複数の試料間で比較する場合、胎児のＣＣＦ断片（例えば、特定の長さまたは長さの範囲の断片）に由来する、読取りの類似の表示を有する傾向があり、表示は、部分特異的胎児フラクション（例えば、胎児に由来するＣＣＦ断片の相対量、百分率、または比）と相関することも決定されている。
一部の実施形態では、部分特異的胎児フラクションの推定値は、部分特異的パラメータ、および胎児フラクションとのそれらの関係に一部分基づいて決定する。部分特異的パラメータは、部分中の特定のサイズ（例えば、サイズ範囲）のＣＣＦ断片の長さに由来する読取りの量または比率を反映する（例えば、これらと相関する）、任意の適切なパラメータでありうる。部分特異的パラメータは、複数の試料について決定された部分特異的パラメータの平均、平均値、または中央値でありうる。任意の適切な部分特異的パラメータを使用することができる。部分特異的パラメータの非限定的な例は、ＦＬＲ（例えば、ＦＲＳ）、選択された断片の長さ未満の長さを有する読取りの量、ゲノムカバレッジ（すなわち、カバレッジ）、マッピング可能性、カウント（例えば、部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、例えば、正規化されたカウント、ＰＥＲＵＮにより正規化されたカウント）、ＤＮアーゼＩ感受性、メチル化状況、アセチル化、ヒストン分布、グアニン−シトシン（ＧＣ）含有量、クロマチン構造など、またはそれらの組合せを含む。部分特異的パラメータは、ＦＬＲおよび／またはＦＲＳと部分特異的な様式で相関する、任意の適切なパラメータでありうる。一部の実施形態では、一部または全部の部分特異的パラメータが、部分についての、ＦＬＲの直接的または間接的な表示である。一部の実施形態では、部分特異的パラメータは、グアニン−シトシン（ＧＣ）含有量ではない。
一部の実施形態では、部分特異的パラメータは、ＣＣＦ断片から得られた読取りの量を表示する、それと相関する、またはそれに比例する任意の適切な値であり、この場合、部分に対してマッピングされる読取りは、選択された断片長未満の長さを有する。特定の実施形態では、部分特異的パラメータは、部分に対してマッピングされる比較的短いＣＣＦ断片（例えば、約２００塩基対もしくはそれ未満）から得られた読取りの量の表示である。選択された断片長未満の長さを有するＣＣＦ断片はしばしば、比較的短いＣＣＦ断片であり、時には、選択された断片長は、約２００塩基対またはそれ未満（例えば、約１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０または８０塩基長であるＣＣＦ断片）である。任意の適切な方法（例えば、配列決定法、ハイブリダイゼーションのアプローチ）により、ＣＣＦ断片の長さ、またはＣＣＦ断片から得られる読取りを決定（例えば、推定または推測）することができる。一部の実施形態では、ＣＣＦ断片の長さを、ペアエンドシーケンシング法から得られた読取りにより決定（例えば、推定または推測）する。特定の実施形態では、ＣＣＦ断片の鋳型の長さを、ＣＣＦ断片から得られた読取り（例えば、シングルエンドリード）の長さから直接決定する。
１つまたは複数の重み付け係数により、部分特異的パラメータに重み付けする、または部分特異的パラメータを調整することができる。一部の実施形態では、重み付けしたまたは調整した部分特異的パラメータは、試料（例えば、試験試料）についての、部分特異的胎児フラクションの推定値を提供することができる。一部の実施形態では、重み付けまたは調整は一般に、部分のカウント（例えば、部分に対してマッピングされた読取り）、または別の部分特異的パラメータを、部分特異的胎児フラクションの推定値へと変換し、そのような変換は時には、転換とみなされる。
一部の実施形態では、重み付け係数は一部分、胎児フラクション（例えば、複数の試料から決定した胎児フラクション）と、複数の試料（例えば、トレーニングセット）についての部分特異的パラメータとの間の関係式を記載および／または定義する係数または定数である。一部の実施形態では、重み付け係数を、複数の、胎児フラクションの確定と、複数の部分特異的パラメータとについての関係式に従って決定する。１つの関係式を、１つまたは複数の重み付け係数により定義することができ、１つまたは複数の重み付け係数を、１つの関係式から決定することができる。一部の実施形態では、重み付け係数（例えば、１つまたは複数の重み付け係数）を、（ｉ）複数の試料のそれぞれについて決定した胎児核酸のフラクションと（ｉｉ）複数の試料についての部分特異的パラメータとに従って適合させた、部分についての関係式から決定する。
重み付け係数は、適切な関係式（例えば、適切な数学的関係式、代数関係式、適合させた関係式（ｆｉｔｔｅｄ ｒｅｌａｔｉｏｎ）、回帰、回帰分析、回帰モデル）から得られる、任意の適切な係数、推定係数または定数であり得る。適切な関係式に従って、そこから誘導して、またはそれから推定して、重み付け係数を決定することができる。一部の実施形態では、重み付け係数は、適合させた関係式から推定された係数である。本明細書において、複数の試料について、関係式を適合させることを時には、モデルをトレーニングすると呼ぶ。関係（ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）を適合させる（例えば、モデルをトレーニングして、トレーニングセットを得る）任意の適切なモデルおよび／または方法を使用することができる。使用することができる適切なモデルの非限定的な例として、回帰モデル、線形回帰モデル、単純回帰モデル、通常の最小二乗回帰モデル、重回帰モデル、一般的な重回帰モデル、多項式回帰モデル、一般線形モデル、一般化線形モデル、離散選択回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、多項ロジットモデル、混合ロジットモデル、プロビットモデル、多項プロビットモデル、順序ロジットモデル、順序プロビットモデル、ポアソンモデル、多変量応答回帰モデル、マルチレベルモデル、固定効果モデル、ランダム効果モデル、混合モデル、非線形回帰モデル、ノンパラメトリックモデル、セミパラメトリックモデル、ロバストモデル、クォンタイルモデル、アイソトニックモデル、主成分モデル、最小角モデル、ローカルモデル、セグメント化モデル、および変数誤差モデルが挙げられる。一部の実施形態では、適合させた関係式は、回帰モデルではない。一部の実施形態では、適合させた関係式は、決定木モデル、サポート−ベクターマシンモデル、およびニューラルネットワークモデルから選択される。モデルをトレーニングした結果（例えば、回帰モデル、関係式）はしばしば、数学的に記載することができる関係式となり、この関係式は、１つまたは複数の係数（例えば、重み付け係数）を含む。例えば、線形最小二乗モデルのために、胎児フラクション値および部分特異的パラメータ（例えば、カバレッジ、例えば、実施例７を参照されたい）を使用して、一般的な重回帰モデルをトレーニングする結果として、等式（３０）［式中、重み付け係数βは、等式（３１）、（３２）、および（３３）においてさらに規定される］により記載される関係をもたらすことができる。より複雑な多変量モデルは、１、２、３つまたはそれ超の重み付け係数を決定することができる。一部の実施形態では、複数の試料から得られた胎児フラクションおよび２つまたはそれ超の部分特異的パラメータ（例えば、係数）に従って、モデルをトレーニングする（例えば、複数の試料に、例えば、行列により適合させた関係）。
重み付け係数は、適切な方法により、適切な関係式（例えば、適切な数学的関係式、代数関係式、適合させた関係式、回帰、回帰分析、回帰モデル）から得ることができる。一部の実施形態では、適合させた関係式に、推定により適合させ、この非限定的な例として、最小二乗法、通常の最小二乗法、線形回帰、部分回帰、全回帰、一般化回帰、加重回帰、非線形回帰、反復再加重回帰、リッジ回帰、最小絶対偏差、ベイズ、ベイズ多変量、縮小ランク、ＬＡＳＳＯ、Ｗｅｉｇｈｔｅｄ Ｒａｎｋ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ（ＷＲＳＣ）、Ｒａｎｋ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ（ＲＳＣ）、エラスティックネット推定法（例えば、エラスティックネット回帰）、およびそれらの組合せが挙げられる。
重み付け係数は、任意の適切な値をとりうる。一部の実施形態では、重み付け係数は、約−１×１０−２〜約１×１０−２の間、約−１×１０−３〜約１×１０−３の間、約−５×１０−４〜約５×１０−４の間、または約−１×１０−４〜約１×１０−４の間である。一部の実施形態では、複数の試料についての重み付け係数の分布は、実質的に対称分布である。複数の試料についての重み付け係数の分布は、場合によって、正規分布である。複数の試料についての重み付け係数の分布は、場合によって、正規分布ではない。一部の実施形態では、重み付け係数の分布の幅は、ＣＣＦ胎児核酸断片に由来する読取りの量に依存する。一部の実施形態では、高胎児核酸含有量を含む部分は、大きな係数（例えば、正または負、例えば、図３１を参照されたい）を生成する。重み付け係数は、ゼロの場合もあり、重み付け係数は、ゼロ超の場合もある。一部の実施形態では、部分についての重み付け係数のうちの約７０％もしくはそれ超、約７５％もしくはそれ超、約８０％もしくはそれ超、約８５％もしくはそれ超、約９０％もしくはそれ超、約９５％もしくはそれ超、または約９８％もしくはそれ超は、ゼロ超である。
重み付け係数を、ゲノムの任意の適切な部分について決定する、またはそれと関連付けることができる。重み付け係数を、任意の適切な染色体の任意の適切な部分について決定する、またはそれと関連付けることができる。一部の実施形態では、重み付け係数を、ゲノム中の一部または全部の部分について決定する、またはそれらと関連付ける。一部の実施形態では、重み付け係数を、ゲノム中の一部または全部の染色体の部分について決定する、またはそれらと関連付ける。重み付け係数を時には、選択された染色体の部分について決定する、またはそれらと関連付ける。重み付け係数を、１つまたは複数の常染色体の部分について決定する、またはそれらと関連付けることができる。重み付け係数を、常染色体またはそれらのサブセットの中の部分を含む複数の部分中の部分について決定する、またはそれらと関連付けることができる。一部の実施形態では、重み付け係数を、性染色体（例えば、ＣｈｒＸおよび／またはＣｈｒＹ）の部分について決定する、またはそれらと関連付ける。重み付け係数を、１つまたは複数の常染色体および１つまたは複数の性染色体の部分について決定する、またはそれらと関連付けることができる。特定の実施形態では、重み付け係数を、全ての常染色体ならびにＸ染色体およびＹ染色体中の複数の部分中の部分について決定する、またはそれらと関連付ける。重み付け係数を、Ｘ染色体および／またはＹ染色体中の部分を含まない複数の部分中の部分について決定する、またはそれらと関連付けることができる。特定の実施形態では、重み付け係数を、ある染色体の部分について決定する、またはそれらと関連付け、この染色体は、異数性（例えば、全染色体異数性）を含む。特定の実施形態では、重み付け係数を、ある染色体の部分について決定する、またはそれらのみと関連付け、この染色体は、異数体ではない（例えば、正倍数体染色体である）。重み付け係数を、第１３、１８および／または２１染色体中の部分を含まない複数の部分中の部分について決定する、またはそれらと関連付けることができる。
一部の実施形態では、重み付け係数を、１つまたは複数の試料（例えば、トレーニングセットの試料）に従って、部分について決定する。重み付け係数はしばしば、部分に特異的である。一部の実施形態では、１つまたは複数の重み付け係数を、部分に独立に割り当てる。一部の実施形態では、重み付け係数を、複数の試料についての胎児フラクションの確定（例えば、試料に特異的な胎児フラクションの確定）のための関係式および複数の試料に従って決定した部分特異的パラメータに従って決定する。重み付け係数はしばしば、複数の試料、例えば、約２０個〜約１００，０００個もしくはそれ超、約１００個〜約１００，０００個もしくはそれ超、約５００個〜約１００，０００個もしくはそれ超、約１０００個〜約１００，０００個もしくはそれ超、または約１０，０００個〜約１００，０００個もしくはそれ超の試料から決定する。重み付け係数を、正倍数体である試料（例えば、正倍数体の胎児を含む被験体から得られた試料、例えば、異数体染色体が存在しない試料）から決定することができる。一部の実施形態では、重み付け係数を、異数体染色体を含む試料（例えば、正倍数体の胎児を含む被験体から得られた試料）から得る。一部の実施形態では、重み付け係数を、正倍数体の胎児を有する被験体およびトリソミーの胎児を有する被験体から得られた複数の試料から決定する。重み付け係数を、複数の試料から得ることができ、これらの試料は、雄の胎児および／または雌の胎児を有する被験体から得られる。
胎児フラクションをしばしば、トレーニングセットの１つまたは複数の試料について決定し、そこから、重み付け係数を誘導する。重み付け係数を決定する胎児フラクションは時には、試料に特異的な胎児フラクションの確定である。重み付け係数を決定する胎児フラクションは、本明細書に記載するまたは当技術分野で公知である任意の適切な方法により決定することができる。一部の実施形態では、胎児核酸の含有量（例えば、胎児フラクション）の決定を、本明細書に記載するまたは当技術分野で公知である適切な胎児数量アッセイ（ＦＱＡ）を使用して行い、それらの胎児フラクションの確定の非限定的な例として、雄の胎児に特異的なマーカーに従う確定、多型配列の対立遺伝子の比に基づく確定、胎児核酸に特異的であり、母体核酸にはそうでない１つもしくは複数のマーカーに従う確定、メチル化に基づくＤＮＡの識別の使用による確定（例えば、A. Nygrenら（２０１０年）Clinical Chemistry、５６巻（１０号）：１６２７〜１６３５頁）、競合ＰＣＲのアプローチを使用する質量分析の方法および／もしくはシステムによる確定、参照により本明細書に援用されている米国特許出願公開第２０１０／０１０５０４９号に記載の方法による確定等、またはそれらの組合せが挙げられる。しばしば胎児フラクションを、一部分、Ｙ染色体のレベル（例えば、１つまたは複数のゲノム区分のレベル；プロファイルのレベル）に従って決定する。一部の実施形態では、Ｙ染色体の適切なアッセイに従って、胎児フラクションを決定する（例えば、定量的リアルタイムＰＣＲを使用することによって、胎児特異的座位（例として、雄を妊娠している場合のＹ染色体上のＳＲＹ座位）の量を、母親および胎児の両方に共通する任意の常染色体上の座位の量と比較する（例えば、Lo YMら（１９９８年）Am J Hum Genet、６２巻：７６８〜７７５頁））。
（例えば、試験試料についての）部分特異的パラメータに、１つまたは複数の重み付け係数（例えば、トレーニングセットから誘導した重み付け係数）により重み付けまたは調整を行うことができる。例えば、重み付け係数を、部分について、トレーニングセットの複数の試料についての、部分特異的パラメータと胎児フラクションの確定との関係式に従って誘導することができる。次いで、試験試料の部分特異的パラメータの調整および／または重み付けを、トレーニングセットから誘導した重み付け係数に従って行うことができる。一部の実施形態では、重み付け係数を誘導する部分特異的パラメータが、調整または重み付けを行う（例えば、試験試料の）部分特異的パラメータと同じである（例えば、両方のパラメータがＦＬＲである）。特定の実施形態では、重み付け係数を誘導する部分特異的パラメータが、調整または重み付けを行う（例えば、試験試料の）部分特異的パラメータと異なる。例えば、重み付け係数を、トレーニングセットの試料についての、カバレッジ（すなわち、部分特異的パラメータ）と胎児フラクションとの間の関係式から決定することができ、試験試料の部分についてのＦＬＲ（すなわち、別の部分特異的パラメータ）を、カバレッジから誘導した重み付け係数に従って調整することができる。理論により制限されることなく、（例えば、試験試料についての）部分特異的パラメータに時には、それぞれの部分特異的パラメータと共通の部分特異的ＦＬＲとの間の関係および／または相関関係に起因して、（例えば、トレーニングセットの）異なる部分特異的パラメータから誘導された重み付け係数により調整および／または重み付けを行うことができる。
部分特異的胎児フラクションの推定値を、試料（例えば、試験試料）について、部分特異的パラメータに対して、その部分について決定した重み付け係数により重み付けすることによって決定することができる。重み付けは、任意の適切な数学的操作を適用することによって、部分特異的パラメータを、重み付け係数により調整、変換および／または転換することを含むことができ、それらの非限定的な例として、乗算、除算、加算、減算、積分、記号計算、代数的計算、アルゴリズム、三角関数もしくは幾何関数、転換（例えば、フーリエ変換）等、またはそれらの組合せが挙げられる。重み付けは、適切な数学的モデル（例えば、実施例７において提示されるモデル）によって、部分特異的パラメータを、重み付け係数により調整、変換および／または転換することを含むことができる。
一部の実施形態では、胎児フラクションを、試料について、１つまたは複数の部分特異的胎児フラクションの推定値に従って決定する。一部の実施形態では、胎児フラクションを、試料（例えば、試験試料）について、１つまたは複数の部分についての部分特異的パラメータの重み付けまたは調整に従って決定（例えば、推定）する。特定の実施形態では、試験試料についての胎児核酸のフラクションを、調整したカウントまたは調整したサブセットのカウントに基づいて推定する。特定の実施形態では、試験試料についての胎児核酸のフラクションを、部分についての、調整したＦＬＲ、調整したＦＲＳ、調整したカバレッジおよび／または調整したマッピング可能性に基づいて推定する。一部の実施形態では、約１〜約５００，０００個、約１００〜約３００，０００個、約５００〜約２００，０００個、約１０００〜約２００，０００個、約１５００〜約２００，０００個、または約１５００〜約５０，０００個の部分特異的パラメータの重み付けまたは調整を行う。
（例えば、試験試料についての）胎児フラクションを、任意の適切な方法により、（例えば、同じ試験試料についての）複数の部分特異的胎児フラクションの推定値に従って決定することができる。一部の実施形態では、妊娠中の雌から得られたある試験試料中の胎児核酸のフラクションの推定の精度を向上させるための方法は、１つまたは複数の部分特異的胎児フラクションの推定値を決定するステップを含み、この試料についての胎児フラクションの推定値は、これら１つまたは複数の部分特異的胎児フラクションの推定値に従って決定される。一部の実施形態では、胎児核酸のフラクションを、試料（例えば、試験試料）について推定または決定するステップは、１つまたは複数の部分特異的胎児フラクションの推定値を合計するステップを含む。合計するステップは、複数の部分特異的胎児フラクションの推定値に従って、平均、平均値、中央値、ＡＵＣまたは積分値を決定することを含むことができる。
一部の実施形態では、妊娠中の雌から得られた試験試料中の胎児核酸のフラクションの推定の精度を向上させるための方法は、参照ゲノムの部分に対してマッピングした配列の読取りのカウントを得るステップを含み、これらの配列の読取りは、妊娠中の雌に由来する試験試料から得られた循環無細胞核酸の読取りであり、得られたカウントの少なくとも１つのサブセットは、ゲノムのある領域から得られ、この領域が提供する、この領域に由来する全カウントと比べた胎児核酸から得られたカウントは、ゲノムの別の領域の全カウントと比べた胎児核酸のカウントよりも多い。一部の実施形態では、胎児核酸のフラクションの推定値を、部分のあるサブセットに従って決定し、部分のこのサブセットは、別の部分の胎児核酸のカウントよりも多い数の、胎児核酸から得られたカウントがマッピングされる部分に従って選択される。一部の実施形態では、部分のこのサブセットは、別の部分の非胎児核酸と比べた胎児核酸のカウントよりも多い数の、非胎児核酸と比べた胎児核酸から得られたカウントがマッピングされる部分に従って選択される。部分の全てまたはサブセットへとマッピングしたカウントを重み付けすることができ、これにより、重み付けされたカウントがもたらされる。胎児核酸のフラクションを推定するのに、重み付けされたカウントを活用することができ、胎児核酸に由来するカウントであって、別の部分の胎児核酸のカウントよりも多い数のカウントがマッピングされる部分に従って、カウントを重み付けすることができる。一部の実施形態では、非胎児核酸と比べた胎児核酸に由来するカウントであって、別の部分の非胎児核酸と比べた胎児核酸のカウントよりも多い数のカウントがマッピングされる部分に従って、カウントを重み付けする。
胎児フラクションを、試料（例えば、試験試料）について、該試料についての複数の部分特異的胎児フラクションの推定値に従って決定することができ、部分に特異的な推定値は、ゲノムの任意の適切な領域またはセグメントの部分から得られる。部分特異的胎児フラクションの推定値を、適切な染色体（例えば、１つもしくは複数の選択された染色体、１つもしくは複数の常染色体、性染色体（例えば、ＣｈｒＸおよび／もしくはＣｈｒＹ）、異数体染色体、正倍数体染色体等、またはそれらの組合せ）の１つまたは複数の部分について決定することができる。
部分特異的パラメータ、重み付け係数、部分特異的胎児フラクションの推定値（例えば、重み付け）、および／または胎児フラクションの決定は、適切なシステム、マシン、装置、非一時的なコンピュータ可読記憶媒体（例えば、実行可能なプログラムをその上に内蔵した）など、またはこれらの組合せにより決定することができる。ある特定の実施形態では、部分特異的パラメータ、重み付け係数、部分特異的胎児フラクションの推定値（例えば、重み付け）、および／または胎児フラクションの決定は、１つまたは複数のマイクロプロセッサおよびメモリを含むシステムまたはマシンにより決定する（例えば、一部分）。一部の実施形態では、部分特異的パラメータ、重み付け係数、部分特異的胎児フラクションの推定値（例えば、重み付け）、および／または胎児フラクションの決定は、実行可能なプログラムをその上に内蔵した非一時的なコンピュータ可読記憶媒体であって、プログラムが、マイクロプロセッサに、決定を行うように命令する、非一時的なコンピュータ可読記憶媒体により決定する（例えば、一部分）。
胎児の倍数性
一部の実施形態では、胎児の倍数性の決定を使用して、一部分、遺伝子の変動（例えば、染色体異数性、トリソミー）の存在または非存在の決定を行う。胎児の倍数性は、一部分、本明細書で記載される方法を含む、胎児フラクションの決定の適切な方法により決定された胎児フラクションの尺度から決定することができる。胎児の倍数性および／または遺伝子の変動（異数性）の存在を、胎児フラクションに従って決定することができる。一部の実施形態では、胎児の倍数性を、胎児フラクションの決定および等式（８）、（２０）、（２１）、またはこれらの変化形もしくは派生形に従って決定する（実施例２）。一部の実施形態では、胎児の倍数性を、下記に記載される方法により決定する。一部の実施形態では、下記に記載される各方法は、複数の試料について、ゲノムの部分（すなわち、部分ｉ）について決定された計算参照カウントＦｉ（場合によって、ｆｉとしても表示される）を必要とし、ここで、ゲノムの部分ｉについての胎児の倍数性は、正倍数性である。一部の実施形態では、不確定値（例えば、標準偏差、σ）を、参照カウントｆｉについて決定する。一部の実施形態では、参照カウントｆｉ、不確定値、試験試料カウントおよび／または測定された胎児フラクション（Ｆ）を、下記に記載される方法に従って、胎児の倍数性を決定するのに使用する。一部の実施形態では、参照カウント（例えば、平均、平均値、または中央値による参照カウント）を、本明細書で記載される方法（例えば、部分に関する正規化、ＧＣ含有量による正規化、線形最小二乗回帰および非線形最小二乗回帰、ＬＯＥＳＳ、ＧＣ ＬＯＥＳＳ、ＬＯＷＥＳＳ、ＰＥＲＵＮ、ＲＭ、ＧＣＲＭおよび／またはこれらの組合せ）により正規化する。一部の実施形態では、参照カウントを、ＰＥＲＵＮにより正規化する場合、正倍数体であるゲノムのセグメントの参照カウントは、１に等しい。一部の実施形態では、ゲノムの部分またはセグメントについての参照カウント（例えば、正倍数体であることが既知の胎児についての）および試験試料のカウントの両方を、ＰＥＲＵＮにより正規化し、参照カウントは、１に等しい。同様に、一部の実施形態では、カウントを、参照カウントの中央値により正規化する（すなわち、参照カウントの中央値で除算する）場合も、正倍数体であるゲノムの部分またはセグメントの参照カウントは、１に等しい。例えば、一部の実施形態では、ゲノムの部分またはセグメントについての、参照カウント（例えば、正倍数体である胎児についての）および試験試料のカウントの両方を、中央値参照カウントにより正規化し、正規化された参照カウントは、１に等しく、試験試料カウントは、中央値参照カウントにより正規化する（例えば、中央値参照カウントで除算する）。一部の実施形態では、ゲノムの部分またはセグメントについての、参照カウント（例えば、正倍数体である胎児についての）および試験試料のカウントの両方を、ＧＣＲＭ、ＧＣ、ＲＭ、または適切な方法により正規化する。一部の実施形態では、参照カウントは、平均、平均値、または中央値による参照カウントである。参照カウントは、部分についての正規化されたカウント（例えば、正規化されたゲノム区分のレベル）であることが多い。一部の実施形態では、参照カウントおよび試験試料についてのカウントは、未加工のカウントである。一部の実施形態では、参照カウントを、平均、平均値、または中央値によるカウントプロファイルから決定する。一部の実施形態では、参照カウントは、計算されたゲノム区分のレベルである。一部の実施形態では、参照試料の参照カウントおよび試験試料のカウント（例えば、患者試料、例えば、ｙｉ）を、同じ方法または処理により正規化する。
一部の実施形態では、胎児フラクション（Ｆ）の測定値を決定する。次いで、この胎児フラクション値を、等式（８）、これらの派生形、または変化形に従って胎児の倍数性を決定するのに使用することができる。一部の実施形態では、胎児が正倍数体であれば負の値となり、胎児が正倍数体でなければ正の値となる。一部の実施形態では、負の値は、胎児が、検討されるゲノムのセグメントについて正倍数体であることを指し示す。ある特定の実施形態では、負ではない値は、胎児が、異数性（例えば、重複）を含むことを指し示す。ある特定の実施形態では、負ではない値は、胎児が、トリソミーを含むことを指し示す。ある特定の実施形態では、任意の正の値は、胎児が、異数性（例えば、トリソミー、重複）を含むことを指し示す。
一部の実施形態では、残差平方和を決定する。例えば、残差平方和を表示する等式であって、等式（８）から導出された等式を、等式（１８）に例示する。一部の実施形態では、残差平方和を、等式（８）から、１の値へと設定した倍数性値Ｘ（等式（９）を参照されたい）および３／２の値へと設定した倍数性値（等式（１３）を参照されたい）について決定する。一部の実施形態では、残差平方和（等式（９）および（１３））を、ゲノムまたは染色体のセグメントについて（例えば、ゲノムのセグメント中の参照ゲノムの部分ｉ全てについて）決定する。例えば、残差平方和（例えば、等式（９）および（１３））を、第２１染色体、第１３染色体、第１８染色体、またはこれらの部分について決定することができる。一部の実施形態では、胎児の倍数性状態を決定するために、等式（１３）の結果を、等式（９）から減じて、値ファイ（例えば、等式（１４）を参照されたい）に到達する。ある特定の実施形態では、値ファイの符号（すなわち、正または負）により、胎児の異数性の存在または非存在を決定する。ある特定の実施形態では、負であるファイの値（例えば、等式（１４）に由来する）は、異数性の非存在を指し示し（例えば、胎児は、参照ゲノムの部分ｉについて正倍数体であり）、負ではないファイの値は、異数性の存在（例えば、トリソミー）を指し示す。
一部の実施形態では、参照カウントｆｉ、参照カウントについての不確定値σ、および／または測定された胎児フラクション（Ｆ）を、等式（９）および（１３）において使用して、参照ゲノムの部分ｉの全ての合計についての残差平方和を決定する。一部の実施形態では、参照カウントｆｉ、参照カウントについての不確定値σ、および／または測定された胎児フラクション（Ｆ）を、等式（９）および（１３）において使用して、胎児の倍数性を決定する。一部の実施形態では、試験試料についての、部分ｉについてのｙｉにより表示されるカウント（例えば、正規化されたカウント、例えば、計算されたゲノム区分のレベル）を使用して、部分ｉについての胎児の倍数性状態を決定する。例えば、ある特定の実施形態では、ゲノムのセグメントについての倍数性状態を、試験試料について決定された参照カウントｆｉ、不確定値（例えば、参照カウントに由来する）、胎児フラクション（Ｆ）、および試験試料について決定されたカウントｙｉに従って決定し、ここで、倍数性状態は、等式（１４）、またはこれらの派生形もしくは変化形に従って決定する。一部の実施形態では、カウントｙｉおよび／または参照カウントを、本明細書で記載される方法（例えば、部分に関する正規化、ＧＣ含有量による正規化、線形最小二乗回帰および非線形最小二乗回帰、ＬＯＥＳＳ、ＧＣ ＬＯＥＳＳ、ＬＯＷＥＳＳ、ＰＥＲＵＮ、ＲＭ、ＧＣＲＭ、およびこれらの組合せ）により正規化する。一部の実施形態では、ゲノムまたは染色体の部分またはセグメントについての胎児の倍数性状態（例えば、正倍数体、異数体、トリソミー）を、上記および実施例の節で記載される非限定的な例により決定する。
一部の実施形態では、胎児フラクションを、試験試料から決定し、カウントｙを、試験試料について決定し、これらの両方を使用して、胎児についての倍数性を、試験試料から決定する。本明細書で記載される方法についてのある特定の実施形態では、Ｘにより表示された胎児の倍数性値は、一定値または仮定値ではない。本明細書で記載される方法についてのある特定の実施形態では、胎児フラクションＦは、一定である。一部の実施形態では、倍数性（例えば、倍数性値）を、ゲノムの部分またはセグメントについて、等式（２０）または（２１）に従って決定する（実施例２）。この方法についての一部の実施形態では、倍数性値を決定し、ここで、値は、１、３／２、または５／４に近い。一部の実施形態では、約１の倍数性値は、正倍数体の胎児を指し示し、約３／２の値は、胎児のトリソミーを指し示し、双子の場合は、約５／４の値は、検討されるゲノムの部分またはセグメントについて、一方の胎児が、トリソミーを含み、他方の胎児が正倍数体であることを指し示す。胎児の倍数性の決定から、胎児の異数性の存在または非存在を決定することに関するさらなる情報については、下記の別の節で論じる。
一部の実施形態では、その決定値で一定の胎児フラクションを決定し、胎児の倍数性を、回帰から決定する。任意の適切な回帰であって、その非限定的な例が、線形回帰、非線形回帰（例えば、多項式回帰）などを含む、任意の適切な回帰を活用することができる。一部の実施形態では、線形回帰を、等式（８）、（２０）、（２１）、および／またはこれらの派生形もしくは変化形に従って使用する。一部の実施形態では、線形回帰は、等式（８）、（２０）、（２１）、および／またはこれらの派生形もしくは変化形から導出される残差平方和に従って使用する。一部の実施形態では、胎児の倍数性を、等式（８）、（２０）、（２１）、および／またはこれらの派生形もしくは変化形に従って決定し、回帰は使用しない。一部の実施形態では、胎児の倍数性を、等式（８）、（２０）、（２１）、および／またはこれらの派生形もしくは変化形から導出される残差平方和に従って、参照ゲノムの複数の部分ｉについて決定し、回帰は使用しない。等式の派生形とは、等式の数学的証明から得られる、等式の任意の変化形である。
一部の実施形態では、参照カウントｆｉ（本明細書で既に記載した）、不確定値σ、および／または測定された胎児フラクション（Ｆ）を、等式（２０）および（２１）で使用して、胎児の倍数性を決定する。一部の実施形態では、参照カウントｆｉ、不確定値σ、および／または測定された胎児フラクション（Ｆ）を、等式（２０）または（２１）で使用して、胎児の倍数性Ｘを、部分ｉについて、または参照ゲノムの複数の部分ｉの合計について（例えば、染色体またはそのセグメントについての、参照ゲノムの部分ｉの全ての合計について）決定する。一部の実施形態では、試験試料の部分ｉについて、ｙｉにより表示されるカウント（例えば、正規化されたカウント、計算されたゲノム区分のレベル）を、参照ゲノムの複数の部分ｉにより表示されるゲノムのセグメントについての、胎児の倍数性を決定するのに使用する。例えば、ある特定の実施形態では、ゲノムのセグメントについての倍数性Ｘを、試験試料について決定された参照カウントｆｉ、不確定値、胎児フラクション（Ｆ）、および試験試料について決定されたカウントｙｉに従って決定し、ここで、倍数性を、等式（２０）、（２１）、またはこれらの派生形もしくは変化形に従って決定する。一部の実施形態では、カウントｙｉおよび／または参照カウントを、本明細書で記載される方法（例えば、部分に関する正規化、ＧＣ含有量による正規化、線形最小二乗回帰および非線形最小二乗回帰、ＬＯＥＳＳ、ＧＣ ＬＯＥＳＳ、ＬＯＷＥＳＳ、ＰＥＲＵＮ、ＲＭ、ＧＣＲＭ、およびこれらの組合せ）により正規化する。一部の実施形態では、カウントｙｉおよび／または参照カウントを、同じ方法（例えば、部分に関する正規化、ＧＣ含有量による正規化、線形最小二乗回帰および非線形最小二乗回帰、ＬＯＥＳＳ、ＧＣ ＬＯＥＳＳ、ＬＯＷＥＳＳ、ＰＥＲＵＮ、ＲＭ、ＧＣＲＭ、本明細書で記載される方法またはこれらの組合せ）により正規化および／または処理する。一部の実施形態では、カウントｙｉおよびｆｉは、ゲノムまたは染色体の同じ部分またはセグメントへとマッピングしたカウントである。
不確定値σは、その非限定的な例が、標準偏差、標準誤差、計算された分散、ｐ値、および／または平均絶対偏差（ＭＡＤ）を含む、適切な誤差の尺度でありうる。不確定値σは、その非限定的な例が、Ｚスコア、Ｚ値、ｔ値、ｐ値、交差検証誤差、ゲノム区分のレベル、計算されたゲノム区分のレベル、レベル、カウントなど、またはこれらの組合せを含む、任意の適切な測定値について決定することができる。一部の実施形態では、σを、１の値に設定する。一部の実施形態では、σを、１の値に設定しない。一部の実施形態では、σの値を推定し、場合によって、測定および／または計算する。
一部の実施形態では、Ｍｉとは、ゲノムの部分ｉについての母親の倍数性（すなわち、母体の倍数性）である。一部の実施形態では、Ｍｉを、ｙｉを決定する同じ患者（例えば、同じ試験試料）について決定する。一部の実施形態では、母体の倍数性Ｍｉは、既知であるか、または本明細書で記載される方法に従って決定する。一部の実施形態では、穴埋めの前に、または穴埋めの後で（例えば、レベルの調整を施した後で）、母体の倍数性を決定する。ある特定の実施形態では、Ｍｉを、プロファイルの視覚化から推定または決定する。一部の実施形態では、母体の倍数性Ｍｉは、既知ではない。一部の実施形態では、母体の倍数性Ｍｉを、仮定する。例えば、一部の実施形態では、母親が、評価されるゲノムのセグメントに欠失および／または重複を有さないことが仮定されるかまたは既知である。一部の実施形態では、母体の倍数性が１であることが仮定されるかまたは既知である。一部の実施形態では、穴埋めの後で（例えば、レベルの調整を施した後で）、母体の倍数性を１の値に設定する。一部の実施形態では、母体の倍数性を無視し、１の値に設定する。一部の実施形態では、母親が、評価されるゲノムのセグメントに欠失および／または重複を有さないと仮定して、等式（２１）を、等式（２０）から導出する。
一部の実施形態では、胎児の倍数性を決定するための方法は、妊娠中の雌から得られた試験試料についての核酸配列の読取りに従った方法である。一部の実施形態では、配列の読取りは、試料（例えば、試験試料）に由来する循環無細胞核酸についての読取りである。一部の実施形態では、胎児の倍数性を決定するための方法は、参照ゲノムの部分へとマッピングした配列の読取りのカウントを得るステップを含む。一部の実施形態では、配列の読取りを、参照ゲノムの部分のサブセットへとマッピングする。ある特定の実施形態では、胎児の倍数性の決定は、胎児フラクションを決定することを含む。一部の実施形態では、胎児の倍数性の決定は、ゲノム区分のレベルの計算または決定を含む。ある特定の実施形態では、胎児の倍数性の決定は、胎児フラクションの決定およびゲノム区分のレベルの計算または決定を含む。胎児フラクションおよび計算されたゲノム区分のレベルは、同じ試験試料（例えば、試験試料の同じ部分）から決定することができる。一部の実施形態では、胎児フラクションおよび計算されたゲノム区分のレベルは、同じ試験試料（例えば、試験試料の同じ部分）から得られる同じ読取りから決定する。ある特定の実施形態では、胎児フラクションおよび計算されたゲノム区分のレベルは、同じ配列決定の実行および／または同じフローセルから得られる同じ読取りから決定する。一部の実施形態では、胎児フラクションおよび計算されたゲノム区分のレベルは、同じ器具および／または機器（例えば、配列決定装置、フローセルなど）により決定する。
一部の実施形態では、胎児の倍数性を決定するための方法を、胎児フラクションの決定および正規化されたカウント（例えば、計算されたゲノム区分のレベル）に従って決定し、ここで、胎児フラクションの決定および正規化されたカウント（例えば、計算されたゲノム区分のレベル）は、試験試料の異なる一部分（例えば、異なるアリコート、または、例えば、同じ被験体もしくは患者からほぼ同時に採取された異なる試験試料）から決定する。例えば、場合によって、胎児フラクションを、試験試料の第１の一部分から決定し、正規化されたカウントおよび／またはゲノム区分のレベルは、試験試料の第２の部分から決定する。一部の実施形態では、胎児フラクションおよび計算されたゲノム区分のレベルは、同じ被験体（例えば、患者）から採取される、異なる試験試料（例えば、試験試料の異なる一部分）から決定する。一部の実施形態では、胎児フラクションおよび計算されたゲノム区分のレベルは、異なる時点において得られた読取りから決定する。一部の実施形態では、胎児フラクションの決定および正規化されたカウント（例えば、計算されたゲノム区分のレベル）は、異なる器具および／または異なる機器（例えば、配列決定装置、フローセルなど）により決定する。
アウトカム
本明細書で記載される方法により、試料についての、遺伝子の変動の存在または非存在の決定（例えば、胎児の異数性）をもたらすことができ、これにより、アウトカムを提示する（例えば、これにより、遺伝子の変動（例えば、胎児の異数性）の存在または非存在の決定因であるアウトカムを提示する）ことができる。遺伝子の変動は、遺伝子情報（例えば、染色体、染色体のセグメント、多型領域、転座領域、ヌクレオチド配列の変化など、または前出の組合せ）の獲得、喪失、および／または変化（例えば、重複、欠失、融合、挿入、変異、再構成、置換、または異常なメチル化）であって、参照に対する、試験被験体のゲノム情報または遺伝子情報の検出可能な変化を結果としてもたらす、遺伝子情報の獲得、喪失、および／または変化を含むことが多い。遺伝子の変動の存在または非存在は、部分へとマッピングした配列の読取り（例えば、カウント、参照ゲノムの、ゲノムの部分のカウント）を変換、分析、および／または操作することにより決定することができる。一部の実施形態では、アウトカムを決定することは、妊娠中の雌に由来する核酸を分析することを含む。ある特定の実施形態では、アウトカムを、妊娠中の雌から得られたカウント（例えば、正規化されたカウント）であって、妊娠中の雌から得られた核酸にからのカウントに従って決定する。
本明細書で記載される方法は、場合によって、胎児を出産する妊娠中の雌からの試験試料について、胎児の異数性の存在または非存在（例えば、完全な染色体異数性、部分的な染色体異数性、または部分的染色体異常（例えば、モザイク現象、欠失、および／または挿入））を決定する。ある特定の実施形態では、本明細書で記載される方法により、胎児を出産する妊娠中の雌からの試料について、正倍数性または正倍数性の欠如（非正倍数性）を検出する。本明細書で記載される方法では、場合によって、１つもしくは複数の染色体（例えば、第１３染色体、第１８染色体、第２１染色体またはこれらの組合せ）またはそのセグメントについて、トリソミーを検出する。
一部の実施形態では、遺伝子の変動（例えば、胎児の異数性）の存在または非存在を、本明細書で記載される方法、当技術分野で公知の方法、またはこれらの組合せにより決定する。遺伝子の変動の存在または非存在は一般に、参照ゲノムの部分へとマッピングした配列の読取りのカウントから決定する。遺伝子の変動の存在または非存在を決定するのに活用される配列の読取りのカウントは、場合によって、未加工のカウントおよび／またはフィルタリングされたカウントであり、正規化されたカウントであることが多い。１つまたは複数の適切な正規化処理を使用して、その非限定的な例が、部分に関する正規化、ＧＣ含有量による正規化、線形最小二乗回帰および非線形最小二乗回帰、ＬＯＥＳＳ、ＧＣ ＬＯＥＳＳ、ＬＯＷＥＳＳ、ＰＥＲＵＮ、ＲＭ、ＧＣＲＭ、およびこれらの組合せを含む、正規化されたカウントを生成することができる。正規化されたカウントは、場合によって、特定のセットまたは部分のセットについての１つまたは複数のレベルまたはプロファイル中のレベルとして表される。正規化されたカウントは、場合によって、遺伝子の変動の存在または非存在を決定する前に、調整または穴埋めされる。
一部の実施形態では、アウトカムを、１つまたは複数のレベルに従って決定する。一部の実施形態では、遺伝子の変動（例えば、染色体異数性）の存在または非存在の決定を、１つまたは複数の調整されたレベルに従って決定する。一部の実施形態では、遺伝子の変動（例えば、染色体異数性）の存在または非存在の決定を、１つ〜約１０，０００の調整されたレベルを含むプロファイルに従って決定する。遺伝子の変動（例えば、染色体異数性）の存在または非存在の決定は、約１つ〜約１０００、１つ〜約９００、１つ〜約８００、１つ〜約７００、１つ〜約６００、１つ〜約５００、１つ〜約４００、１つ〜約３００、１つ〜約２００、１つ〜約１００、１つ〜約５０、１つ〜約２５、１つ〜約２０、１つ〜約１５、１つ〜約１０、または１つ〜約５つの調整を含むプロファイルに従って決定することが多い。一部の実施形態では、遺伝子の変動（例えば、染色体異数性）の存在または非存在の決定を、約１つの調整（例えば、１つの調整されたレベル）を含むプロファイルに従って決定する。一部の実施形態では、アウトカムを、１つもしくは複数、２つもしくはそれ超、３つもしくはそれ超、５つもしくはそれ超、６つもしくはそれ超、７つもしくはそれ超、８つもしくはそれ超、９つもしくはそれ超、または、場合によって、１０もしくはそれ超の調整を含む、１つまたは複数のプロファイル（例えば、染色体またはそのセグメントのプロファイル）に従って決定する。一部の実施形態では、遺伝子の変動（例えば、染色体異数性）の存在または非存在の決定を、プロファイルに従って決定するが、ここで、プロファイル中の一部のレベルは調整しない。一部の実施形態では、遺伝子の変動（例えば、染色体異数性）の存在または非存在の決定を、プロファイルに従って決定するが、ここで、調整は施さない。
一部の実施形態では、プロファイル中のレベル（例えば、第１のレベル）の調整により、偽決定または偽アウトカムを低減する。一部の実施形態では、プロファイル中のレベル（例えば、第１のレベル）の調整により、偽決定または偽アウトカムの頻度および／または確率（例えば、統計学的確率、尤度）を低減する。偽決定または偽アウトカムは、正確ではない決定またはアウトカムでありうる。偽決定または偽アウトカムは、被験体（例えば、妊娠中の雌、胎児、および／またはこれらの組合せ）の、実際の遺伝子構成もしくは真の遺伝子構成または実際の遺伝的素質もしくは真の遺伝的素質（例えば、遺伝子の変動の存在または非存在）を反映しない決定またはアウトカムでありうる。一部の実施形態では、偽決定または偽アウトカムは、偽陰性決定である。一部の実施形態では、陰性決定または陰性アウトカムとは、遺伝子の変動（例えば、異数性、コピー数の変動）の非存在である。一部の実施形態では、偽決定または偽アウトカムは、偽陽性決定または偽陽性アウトカムである。一部の実施形態では、陽性決定または陽性アウトカムとは、遺伝子の変動（例えば、異数性、コピー数の変動）の存在である。一部の実施形態では、決定またはアウトカムを診断で活用する。一部の実施形態では、決定またはアウトカムは、胎児についての決定またはアウトカムである。
遺伝子の変動（例えば、胎児の異数性）の存在または非存在は、場合によって、部分のセットについてのカウントを参照と比較せずに決定する。本明細書では、試験試料について測定されたカウントであり、試験領域（例えば、目的の部分のセット）中のカウントを、「試験カウント」と称する。試験カウントは、場合によって、本明細書で記載される、処理されたカウント、平均されたカウントもしくは合計されたカウント、表示、正規化されたカウント、あるいは１つもしくは複数のレベルまたは複数のレベルである。ある特定の実施形態では、部分のセットについて、試験カウントを平均または合計し（例えば、平均、平均値、中央値、モード、または合計を計算し）、平均されたカウントまたは合計されたカウントを、閾または範囲と比較する。試験カウントは、場合によって、第１の部分のセットについてのカウントの、第２の部分のセットについてのカウントに対する比または百分率として表されうる、表示として表される。ある特定の実施形態では、第１の部分のセットは、１つまたは複数の試験染色体（例えば、第１３染色体、第１８染色体、第２１染色体、またはこれらの組合せ）についてのセットであり、場合によって、第２の部分のセットは、ゲノムまたはゲノムの部分（例えば、常染色体または常染色体および性染色体）についてのセットである。一部の実施形態では、部分の第１のセットは、１つまたは複数の性染色体（例えば、Ｘ染色体、Ｙ染色体、またはこれらの組合せ）についてのセットであり、場合によって、部分の第２のセットは、１つまたは複数の常染色体についてのセットである。一部の実施形態では、部分の第１のセットは、試験染色体（例えば、Ｘ染色体、Ｙ染色体、またはこれらの組合せ）の１つまたは複数の第１の領域についてのセットであり、場合によって、部分の第２のセットは、試験染色体（例えば、Ｘ染色体、Ｙ染色体、またはこれらの組合せ）の１つもしくは複数の第２の領域または全試験染色体についてのセットである。ある特定の実施形態では、表示を、閾または範囲と比較する。ある特定の実施形態では、試験カウントを、部分のセットにわたり正規化されたカウントについての１つもしくは複数のレベルまたは複数のレベルとして表し、１つもしくは複数のレベルまたは複数のレベルを、閾または範囲と比較する。特定の閾を上回るかまたは下回り、場合によって、特定の範囲内または特定の範囲外にある、試験カウント（例えば、平均されたカウントまたは合計されたカウント、表示、正規化されたカウント、１つもしくは複数のレベルまたは複数のレベル）は、遺伝子の変動の存在または正倍数性の欠如（例えば、非正倍数性）の決定因である。特定の閾を上回るかまたは下回り、場合によって、特定の範囲内または特定の範囲外にある、試験カウント（例えば、平均されたカウントまたは合計されたカウント、表示、正規化されたカウント、１つもしくは複数のレベルまたは複数のレベル）は、遺伝子の変動または正倍数性の非存在の決定因である。
遺伝子の変動（例えば、胎児の異数性）の存在または非存在は、場合によって、その非限定的な例が、試験カウント、参照カウント、未加工のカウント、フィルタリングされたカウント、平均されたカウントまたは合計されたカウント、表示（例えば、染色体表示）、正規化されたカウント、１つもしくは複数のレベルまたは複数のレベル（例えば、部分のセットについて、例えば、ゲノム区分のレベル、プロファイル）、Ｚスコアなど、またはこれらの組合せを含む、カウントを比較することにより決定する。一部の実施形態では、試験カウントを、参照（例えば、参照カウント）と比較する。参照（例えば、参照カウント）は、その非限定的な例が、未加工のカウント、フィルタリングされたカウント、平均されたカウントまたは合計されたカウント、表示（例えば、染色体表示）、正規化されたカウント、１つもしくは複数のレベルまたは複数のレベル（例えば、部分のセットについて、例えば、ゲノム区分のレベル、プロファイル）、Ｚスコアなど、またはこれらの組合せを含む、カウントの適切な決定でありうる。参照カウントは、正倍数体の試験領域についてのカウントまたは正倍数性であるゲノムもしくは染色体のセグメントからのカウントであることが多い。一部の実施形態では、参照カウントおよび試験カウントを、同じ試料および／または同じ被験体から得る。一部の実施形態では、参照カウントは、異なる試料および／または異なる被験体からのものである。一部の実施形態では、参照カウントは、試験カウントを導出および／または決定する、対応するゲノムのセグメントから決定し、かつ／またはそれと比較する。対応するセグメントとは、参照ゲノムの同じ位置へとマッピングされる、セグメント、部分、または部分のセットを指す。一部の実施形態では、参照カウントは、試験カウントを導出および／または決定する、異なるゲノムのセグメントから決定し、かつ／またはそれと比較する。
ある特定の実施形態では、試験カウントは、場合によって、第１の部分のセットについてのカウントであり、参照は、第１の部分のセットと異なる、第２の部分のセットについてのカウントを含む。参照カウントは、場合によって、試験試料を得る同じ妊娠中の雌に由来する核酸試料についてのカウントである。ある特定の実施形態では、参照カウントは、試験試料を得た雌と異なる、１例または複数例の妊娠中の雌に由来する核酸試料についてのカウントである。一部の実施形態では、第１の部分のセットは、第１３染色体中、第１８染色体中、第２１染色体中、これらのセグメント中、または前出の組合せ中にあり、第２の部分のセットは、別の１つまたは複数の染色体中またはそのセグメント中にある。第１の部分のセットが、第２１染色体中またはそのセグメント中にある、非限定的な例では、第２の部分のセットは、別の染色体（例えば、第１染色体、第１３染色体、第１４染色体、第１８染色体、第１９染色体、そのセグメント、または前出の組合せ）中にあることが多い。参照は、正倍数体であることが典型的な染色体中またはそのセグメント中に位置することが多い。例えば、第１染色体および第１９染色体は、胎児では、第１染色体異数性および第１９染色体異数性と関連する、早期の胎児の死亡率が高率であることに起因して、正倍数体であることが多い。試験カウントと参照カウントとの偏差の尺度を、生成することができる。
ある特定の実施形態では、参照は、試験カウントの場合と同じ部分のセットについてのカウントを含み、参照についてのカウントは、１つまたは複数の参照試料（例えば、複数の参照被験体に由来する複数の参照試料であることが多い）からのカウントである。参照試料は、試験試料を得る雌と異なる、１例または複数例の妊娠中の雌に由来することが多い。試験カウントと参照カウントとの偏差の尺度（例えば、不確定性の尺度、不確定値）を、生成することができる。一部の実施形態では、偏差の尺度を、試験カウントから決定する。一部の実施形態では、偏差の尺度を、参照カウントから決定する。一部の実施形態では、偏差の尺度を、全プロファイルまたはプロファイル中の部分のサブセットから決定する。
偏差の適切な尺度であって、その非限定的な例が、標準偏差、平均絶対偏差、中央値絶対偏差、最大絶対偏差、標準スコア（例えば、ｚ値、ｚスコア、正規スコア、標準化された変数）などを含む尺度を選択することができる。一部の実施形態では、参照試料は、試験領域について正倍数体であり、試験カウントと参照カウントとの偏差を評価する。一部の実施形態では、遺伝子の変動の存在または非存在の決定は、ゲノムまたは染色体のセグメントまたは部分についての、試験カウントと参照カウントとの偏差（例えば、偏差の尺度、ＭＡＤ）の数に従う。一部の実施形態では、試験カウントと参照カウントとの偏差の数が、約１超、約１．５超、約２超、約２．５超、約２．６超、約２．７超、約２．８超、約２．９超、約３超、約３．１超、約３．２超、約３．３超、約３．４超、約３．５超、約４超、約５超、または約６超である場合に、遺伝子の変動の存在を決定する。例えば、場合によって、試験カウントが、参照カウントと、偏差の尺度（例えば、３シグマ、３ＭＡＤ）で３超異なれば、遺伝子の変動の存在を決定する。一部の実施形態では、妊娠中の雌から得られる試験カウントが、参照カウントより、偏差の尺度（例えば、３シグマ、３ＭＡＤ）で３超大きければ、胎児の染色体異数性（例えば、胎児のトリソミー）の存在が決定される。試験カウントと参照カウントとの３超の偏差は、非正倍数体の試験領域（例えば、遺伝子の変動の存在）を指し示すことが多い。場合によって、正倍数性を指し示す参照カウントを有意に上回る試験カウントは、トリソミーの決定因である。一部の実施形態では、妊娠中の雌から得られる試験カウントが、参照カウントより偏差の尺度（例えば、３シグマ、３ＭＡＤ）で３超小さければ、胎児の染色体異数性（例えば、胎児のモノソミー）の存在が決定される。場合によって、正倍数性を指し示す参照カウントを有意に下回る試験カウントは、モノソミーの決定因である。
一部の実施形態では、試験カウントと参照カウントとの偏差の数が、約３．５未満、約３．４未満、約３．３未満、約３．２未満、約３．１未満、約３．０未満、約２．９未満、約２．８未満、約２．７未満、約２．６未満、約２．５未満、約２．０未満、約１．５未満、または約１．０未満である場合に、遺伝子の変動の非存在を決定する。例えば、場合によって、試験カウントが、参照カウントと、偏差の尺度（例えば、３シグマ、３ＭＡＤ）で３未満異なれば、遺伝子の変動の非存在が決定される。一部の実施形態では、妊娠中の雌から得られる試験カウントが、参照カウントと、偏差の尺度（例えば、３シグマ、３ＭＡＤ）で３未満異なれば、胎児の染色体異数性の非存在（例えば、胎児の正倍数体）が決定される。一部の実施形態では、（例えば、試験カウントと参照カウントとの３未満の偏差（例えば、標準偏差では、３シグマ）は、正倍数体の試験領域（例えば、遺伝子の変動の非存在）を指し示すことが多い。試験試料についての試験カウントと、１つまたは複数の参照被験体についての参照カウントとの偏差の尺度は、プロットし、視覚化する（例えば、ｚスコアプロット）ことができる。
他の任意の適切な参照は、試験試料の試験領域について、遺伝子の変動の存在または非存在を決定する（または正倍数体もしくは非正倍数体の決定の）ための試験カウントで因子分解することができる。例えば、胎児フラクションの決定は、試験カウントで因子分解して、遺伝子の変動の存在または非存在を決定することができる。胎児フラクションを定量するための適切な処理であって、その非限定的な例が、質量分析処理、配列決定処理、またはこれらの組合せを含む処理を活用することができる。
一部の実施形態では、胎児の染色体異数性（例えば、トリソミー）の存在または非存在は、一部分、胎児の倍数性の決定から決定される。一部の実施形態では、胎児の倍数性を、本明細書で記載される適切な方法により決定する。一部のある特定の実施形態では、約１．２０もしくはそれ超、１．２５もしくはそれ超、１．３０もしくはそれ超、約１．３５もしくはそれ超、約１．４もしくはそれ超、または約１．４５もしくはそれ超の胎児の倍数性の決定は、胎児の染色体異数性の存在（例えば、胎児のトリソミーの存在）を指し示す。一部の実施形態では、約１．２０〜約２．０、約１．２０〜約１．９、約１．２０〜約１．８５、約１．２０〜約１．８、約１．２５〜約２．０、約１．２５〜約１．９、約１．２５〜約１．８５、約１．２５〜約１．８、約１．３〜約２．０、約１．３〜約１．９、約１．３〜約１．８５、約１．３〜約１．８、約１．３５〜約２．０、約１．３５〜約１．９、約１．３５〜約１．８、約１．４〜約２．０、約１．４〜約１．８５、または約１．４〜約１．８の胎児の倍数性の決定は、胎児の染色体異数性の存在（例えば、胎児のトリソミーの存在）を指し示す。一部の実施形態では、胎児の異数性は、トリソミーである。一部の実施形態では、胎児の異数性は、第１３染色体、第１８染色体、および／または第２１染色体のトリソミーである。
一部の実施形態では、約１．３５未満、約１．３０未満、約１．２５未満、約１．２０未満、または約１．１５未満の胎児の倍数性は、胎児の異数性の非存在（例えば、胎児のトリソミーの非存在、例えば、正倍数体）を指し示す。一部の実施形態では、約０．７〜約１．３５、約０．７〜約１．３０、約０．７〜約１．２５、約０．７〜約１．２０、約０．７〜約１．１５、約０．７５〜約１．３５、約０．７５〜約１．３０、約０．７５〜約１．２５、約０．７５〜約１．２０、約０．７５〜約１．１５、約０．８〜約１．３５、約０．８〜約１．３０、約０．８〜約１．２５、約０．８〜約１．２０、または約０．８〜約１．１５の胎児の倍数性の決定は、胎児の染色体異数性の非存在（例えば、胎児のトリソミーの非存在、例えば、正倍数体）を指し示す。
一部の実施形態では、約０．８未満、約０．７５未満、約０．７０未満、または約０．６未満の胎児の倍数性は、胎児の異数性の存在（例えば、染色体欠失の存在）を指し示す。一部の実施形態では、約０〜約０．８、約０〜約０．７５、約０〜約０．７０、約０〜約０．６５、約０〜約０．６０、約０．１〜約０．８、約０．１〜約０．７５、約０．１〜約０．７０、約０．１〜約０．６５、約０．１〜約０．６０、約０．２〜約０．８、約０．２〜約０．７５、約０．２〜約０．７０、約０．２〜約０．６５、約０．２〜約０．６０、約０．２５〜約０．８、約０．２５〜約０．７５、約０．２５〜約０．７０、約０．２５〜約０．６５、約０．２５〜約０．６０、約０．３〜約０．８、約０．３〜約０．７５、約０．３〜約０．７０、約０．３〜約０．６５、約０．３〜約０．６０の胎児の倍数性の決定は、胎児の染色体異数性の存在（例えば、染色体欠失の存在）を指し示す。一部の実施形態では、決定される胎児の異数性は、全染色体欠失である。
一部の実施形態では、胎児の異数性の存在または非存在の決定（例えば、上記の倍数性の決定の範囲のうちの１または複数に従う）を、判定域（ｃａｌｌ ｚｏｎｅ）に従って決定する。ある特定の実施形態では、値（例えば、倍数性値、胎児フラクション値、不確定性のレベル）または値のコレクションが、あらかじめ規定された範囲（例えば、帯域、判定域）内にある場合に、判定（例えば、遺伝子の変動の存在または非存在を決定する判定、例えば、アウトカム）を下す。一部の実施形態では、判定域を、同じ患者試料から得られる値のコレクションに従って規定する。ある特定の実施形態では、判定域を、同じ染色体またはそのセグメントから導出される値のコレクションに従って規定する。一部の実施形態では、倍数性の決定に基づく判定域を、信頼性レベル（例えば、高い信頼性レベル、例えば、低い不確定性のレベル）および／または胎児フラクションに従って規定する。一部の実施形態では、判定域を、倍数性の決定および約２．０％もしくはそれ超、約２．５％もしくはそれ超、約３％もしくはそれ超、約３．２５％もしくはそれ超、約３．５％もしくはそれ超、約３．７５％もしくはそれ超、または約４．０％もしくはそれ超の胎児フラクションに従って規定する。例えば、一部の実施形態では、胎児を出産する妊娠中の雌から得られた試料についての、２％もしくはそれ超または４％もしくはそれ超の胎児フラクションの決定を伴う、１．２５超の倍数性の決定に基づき、胎児は、トリソミー２１を含むという判定を下す。ある特定の実施形態では、例えば、胎児を出産する妊娠中の雌から得られた試料についての、２％もしくはそれ超または４％もしくはそれ超の胎児フラクションの決定を伴う、１．２５未満の倍数性の決定に基づき、胎児は、正倍数体であるという判定を下す。一部の実施形態では、判定域は、約９９％もしくはそれ超、約９９．１％もしくはそれ超、約９９．２％もしくはそれ超、約９９．３％もしくはそれ超、約９９．４％もしくはそれ超、約９９．５％もしくはそれ超、約９９．６％もしくはそれ超、約９９．７％もしくはそれ超、約９９．８％もしくはそれ超、または約９９．９％もしくはそれ超の信頼性レベルにより規定する。一部の実施形態では、判定域を使用せずに判定を下す。一部の実施形態では、判定域およびさらなるデータまたは情報を使用して判定を下す。一部の実施形態では、判定域の使用を伴わずに、倍数性値に基づき判定を下す。一部の実施形態では、倍数性値を計算せずに判定を下す。一部の実施形態では、プロファイルの目視（例えば、ゲノム区分のレベルの目視）に基づき判定を下す。判定は、その非限定的な例が、胎児の倍数性の決定、胎児フラクションの決定、母体の倍数性、不確定性および／または信頼性決定、部分レベル、レベル、プロファイル、ｚスコア、期待された染色体表示、測定された染色体表示、カウント（例えば、正規化されたカウント、未加工のカウント）、胎児のまたは母体のコピー数の変動（例えば、類別されたコピー数の変動）、有意に異なるレベル、調整されたレベル（例えば、穴埋め）など、またはこれらの組合せを含む、本明細書で記載される方法により得られた決定、値、および／またはデータに完全に、または一部分基づく任意の適切な方法により下すことができる。
一部の実施形態では、判定を下さない場合、判定域は存在しない。一部の実施形態では、判定域が存在しないことは、低い精度、高い危険性、大きな誤差、低い信頼性レベル、高い不確定性のレベルなど、またはこれらの組合せを指し示す値または値のコレクションにより規定される。一部の実施形態では、判定域が存在しないことは、約５％もしくはそれ未満、約４％もしくはそれ未満、約３％もしくはそれ未満、約２．５％もしくはそれ未満、約２．０％もしくはそれ未満、約１．５％もしくはそれ未満、または約１．０％もしくはそれ未満の胎児フラクションにより一部分規定される。
一部の実施形態では、遺伝子の変動（例えば、胎児異数性）の存在または非存在を決定するための方法を、少なくとも約９０％〜約１００％の精度で実施する。例えば、遺伝子の変動の存在または非存在は、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の精度で決定することができる。一部の実施形態では、遺伝子の変動の存在または非存在は、遺伝子変動決定の他の方法（例えば、核型分析）を使用するときの精度とほぼ同じであるかまたはこれより高い精度で決定する。一部の実施形態では、遺伝子の変動の存在または非存在は、約８０％〜約１００％の信頼区間（ＣＩ）を有する精度で決定する。例えば、信頼区間（ＣＩ）は、約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％でありうる。
アウトカムは、場合によっては、配列タグ密度に関して決定することができる。「配列タグ密度」とは、規定されたゲノム区分についての配列タグまたは読取りの正規化された値を指し、ここで、配列タグ密度は、異なる試料を比較するために使用され、その後の分析のために使用される。配列タグ密度の値は、試料中で正規化することが多い。一部の実施形態では、各ゲノム区分中に収まるタグの数をカウントし；各染色体についての全配列タグカウントの中央値を得；常染色体値全体の中央値を得；この値を正規化定数とし使用して、異なる試料について得られる配列タグの総数の差違を説明することにより、正規化を行うことができる。配列タグ密度は、場合によって、ジソミー（ｄｉｓｏｍｉｃ）染色体について約１である。配列タグ密度は、配列決定アーチファクト、最も顕著には、外部標準または内部参照基準（例えば、配列タグ（ゲノム配列）の実質的に全てから導出される内部参照基準であって、例えば、単一の染色体の場合もあり、一部の実施形態では、全ての常染色体に由来する計算値の場合もある内部参照基準）の使用により補正されうる、Ｇ／Ｃの偏りに従って変化しうる。したがって、染色体または染色体領域の量の不均衡(dosageimbalance)は、検体の、配列決定された、他のマッピング可能なタグの間の、遺伝子座の百分率表示から推定することができる。したがって、特定の染色体または染色体領域の量の不均衡は、定量的に決定することができ、正規化することができる。配列タグ密度を正規化および定量するための方法については、下記でさらに詳細に論じる。
一部の実施形態では、配列の読取りの全てのうちのある比率は、性染色体（例えば、Ｘ染色体、Ｙ染色体）または異数性に関与する染色体（例えば、第１３染色体、第１８染色体、第２１染色体）に由来し、他の配列の読取りは、他の染色体に由来する。一部の実施形態では、性染色体または異数性に関与する染色体（例えば、「標的染色体」：第２１染色体）の、他の染色体と比較した相対サイズを考慮することにより、参照範囲内で、標的染色体に特異的な配列の、正規化された頻度を得ることができる。胎児が、例えば、標的染色体中に異数性を有する場合は、標的染色体由来の配列の、正規化された頻度は、標的染色体以外に由来する配列の正規化された頻度を統計学的に超え、したがって、異数性の検出が可能となる。一部の実施形態では、正規化された頻度の変化の程度は、分析される試料中の胎児核酸の分別濃度に依存する。
遺伝子の変動は、場合によって、医学的状態と関連する。遺伝子の変動の決定因であるアウトカムは、場合によって、状態（例えば、医学的状態）、疾患、症候群、もしくは異常の存在または非存在の決定因であるアウトカムであるか、または状態、疾患、症候群、もしくは異常（例えば、表１に列挙された非限定的な例）の検出を含む。ある特定の実施形態では、診断は、アウトカムについての評価を含む。本明細書で記載される方法による状態（例えば、医学的状態）、疾患、症候群、または異常の存在または非存在の決定因であるアウトカムは、場合によって、さらに調べることにより（例えば、核型分析および／または羊水穿刺により）、独立に確かめることができる。データの分析および処理は、１つまたは複数のアウトカムを提示しうる。本明細書で使用される「アウトカム」という用語は、遺伝子の変動（例えば、異数性、コピー数の変動）の存在または非存在を決定することを容易とする、データ処理の結果を指すことができる。ある特定の実施形態では、本明細書で使用される「アウトカム」という用語は、遺伝子の変動（例えば、異数性、コピー数の変動）の存在または非存在を予測および／または決定する結論を指す。ある特定の実施形態では、本明細書で使用される「アウトカム」という用語は、被験体（例えば、胎児）における遺伝子の変動の存在または非存在（例えば、異数性、コピー数の変動）の危険性または確率を予測および／または決定する結論を指す。診断は、場合によって、アウトカムの使用を含む。例えば、医療従事者は、アウトカムを分析し、アウトカムに基づくか、またはアウトカムに一部分基づき、診断を提示することができる。一部の実施形態では、状態、症候群、または異常（例えば、表１に列挙された）についての決定、検出、または診断は、遺伝子の変動の存在または非存在の決定因であるアウトカムの使用を含む。一部の実施形態では、カウントされた、マッピングした配列の読取りまたはその変換に基づくアウトカムは、遺伝子の変動の存在または非存在の決定因である。ある特定の実施形態では、本明細書で記載される１つまたは複数の方法（例えば、データ処理法）を活用して生成されたアウトカムは、表１に列挙された１つまたは複数の状態、症候群、または異常の存在または非存在の決定因である。ある特定の実施形態では、診断は、状態、症候群、または異常の存在または非存在の決定を含む。診断は、状態、症候群、または異常の性質および／または原因としての遺伝子の変動の決定を含むことが多い。ある特定の実施形態では、アウトカムは、診断ではない。１つまたは複数の確率の検討事項の文脈では、アウトカムは、本明細書で記載される処理法を使用して生成される１つまたは複数の数値を含むことが多い。危険性または確率の検討事項は、不確定値、可変性の尺度、信頼性レベル、感度、特異性、標準偏差、変動係数（ＣＶ）および／または信頼性レベル、Ｚスコア、カイ値、ｐｈｉ値、倍数性値、適合させた胎児フラクション、面積比、中央値レベルなど、またはこれらの組合せを含みうるがこれらに限定されない。確率の検討事項により、被験体に遺伝子の変動を有する危険性があるかまたは被験体が遺伝子の変動を有するのかどうかを決定することを容易とすることが可能になり、遺伝子障害の存在または非存在の決定因であるアウトカムは、このような検討事項を含むことが多い。
アウトカムは、場合によって、表現型である。アウトカムは、場合によって、関連する信頼性レベル（例えば、不確定値、例えば、胎児は、９９％の信頼性レベルでトリソミー２１について陽性であり、妊娠中の雌は、９５％の信頼性レベルで雄の胎児を身ごもっており、試験被験体は、９５％の信頼性レベルで、遺伝子の変動と関連するがんについて陰性である）を有する表現型である。アウトカム値を生成する異なる方法は、場合によって、異なる種類の結果をもたらしうる。一般に、本明細書で記載される方法を使用して生成されるアウトカム値に基づき下されうる４種類の可能なスコアまたは判定：真陽性、偽陽性、真陰性、および偽陰性が存在する。本明細書で使用される「スコア（ｓｃｏｒｅ）」、「スコア（ｓｃｏｒｅｓ）」、「判定（ｃａｌｌ）」、および「判定（ｃａｌｌｓ）」という用語は、特定の遺伝子の変動が、被験体／試料に存在するかまたは非存在である確率を計算することを指す。スコアの値を使用して、例えば、遺伝子の変動に対応しうる、マッピングした配列の読取りの変動、差違、または比を決定することができる。例えば、データセットに由来する、選択された遺伝子の変動または部分について、参照ゲノムに対して正のスコアを計算することにより、場合によって、医学的状態（例えば、がん、子癇前症、トリソミー、モノソミーなど）と関連する、遺伝子の変動の存在または非存在の同定をもたらすことができる。一部の実施形態では、アウトカムは、レベル、プロファイル、および／またはプロット（例えば、プロファイルのプロット）を含む。アウトカムが、プロファイルを含む実施形態では、適切なプロファイルまたはプロファイルの組合せを、アウトカムのために使用することができる。アウトカムのために使用されうる、プロファイルの非限定的な例は、ｚスコアプロファイル、ｐ値プロファイル、カイ値プロファイル、ｐｈｉ値プロファイルなど、およびこれらの組合せを含む。
遺伝子の変動の存在または非存在を決定するために生成されたアウトカムは、場合によって、ヌルの結果（例えば、２つのクラスター間のデータ点、遺伝子の変動の存在および非存在の両方についての値を包含する標準偏差を有する数値、調査される遺伝子の変動を有するかまたは含まない被験体についてのプロファイルのプロットと同様ではないプロファイルのプロットを有するデータセット）を含む。一部の実施形態では、ヌルの結果を指し示すアウトカムもやはり決定因の結果であり、決定は、遺伝子の変動の存在または非存在を決定するためのさらなる情報および／またはデータ生成の反復および／または分析に対する必要を含みうる。
一部の実施形態では、アウトカムは、本明細書で記載される、１つまたは複数の処理ステップを実施した後で生成することができる。ある特定の実施形態では、アウトカムは、本明細書で記載される処理ステップのうちの１つの結果として生成し、一部の実施形態では、アウトカムは、データセットの各統計学的操作および／または各数学的操作を実施した後で生成することができる。遺伝子の変動の存在または非存在の決定に関するアウトカムは、限定せずに述べると、確率（例えば、オッズ比、ｐ値）、尤度、クラスター中またはクラスター外の値、閾を上回る値または閾を下回る値、範囲（例えば、閾範囲）内の値、分散または信頼性の尺度を有する値、または被験体もしくは試料についての遺伝子の変動の存在もしくは非存在と関連する危険性因子を含む、適切な形態で表すことができる。ある特定の実施形態では、試料間の比較は、試料の識別の確認を可能とする（例えば、反復された試料および／または混合された試料（例えば、誤表示された試料、組み合わされた試料など）の同定を可能とする）。
一部の実施形態では、アウトカムは、所定の閾またはカットオフ値を上回るかまたは下回る値（例えば、１超の値、１未満の値）、およびその値と関連する不確定性のレベルまたは信頼性レベルを含む。ある特定の実施形態では、所定の閾値またはカットオフ値は、期待レベルまたは期待レベルの範囲である。アウトカムはまた、データ処理において使用される仮定についても記載しうる。ある特定の実施形態では、アウトカムは、所定の値の範囲（例えば、閾範囲）内または範囲外にある値、および範囲内または範囲外にあるその値についての、関連する不確定性のレベルまたは信頼性レベルを含む。一部の実施形態では、アウトカムは、所定の値に等しい（例えば、１に等しい、ゼロに等しい）か、または所定の値の範囲内の値に等しい値、および等しいかまたは範囲内にあるかもしくは範囲外にあるその値についての、その関連する不確定性のレベルまたは信頼性レベルを含む。アウトカムは、場合によって、プロット（例えば、プロファイルのプロット）としてグラフ的に表される。
上記で注目した通り、アウトカムは、真陽性、真陰性、偽陽性、または偽陰性として特徴づけることができる。本明細書で使用される「真陽性」という用語は、遺伝子の変動を有するとして被験体が正しく診断されたことを指す。本明細書で使用される「偽陽性」という用語は、遺伝子の変動を有するとして被験体が誤って同定されたことを指す。本明細書で使用される「真陰性」という用語は、遺伝子の変動を有さないとして被験体が正しく同定されたことを指す。本明細書で使用される「偽陰性」という用語は、遺伝子の変動を有さないとして被験体が誤って同定されたことを指す。任意の所与の方法についての性能の２つの尺度は、（ｉ）一般に、予測された陽性の割合であって、陽性として正しく同定された割合である感度値；および（ｉｉ）一般に、予測された陰性の割合であって、陰性として正しく同定された割合である特異性値の発生比に基づき計算することができる。
ある特定の実施形態では、感度、特異性、および／または信頼性レベルのうちの１または複数は、百分率として表される。一部の実施形態では、百分率は、各変数について独立に、約９０％超（例えば、約９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％、または９９％超（例えば、約９９．５％またはそれ超、約９９．９％またはそれ超、約９９．９５％またはそれ超、約９９．９９％またはそれ超））である。一部の実施形態では、変動係数（ＣＶ）は、百分率として表され、場合によって、百分率は、約１０％またはそれ未満（例えば、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１％、または１％未満（例えば、約０．５％またはそれ未満、約０．１％またはそれ未満、約０．０５％またはそれ未満、約０．０１％またはそれ未満））である。ある特定の実施形態では、確率（例えば、特定のアウトカムが、偶然に起因しない確率）は、Ｚスコア、ｐ値、またはｔ検定の結果として表される。一部の実施形態では、アウトカムについての、測定された分散、信頼区間、感度、特異性など（例えば、併せて、信頼性パラメータと称する）は、本明細書で記載される、１つまたは複数のデータ処理操作を使用して生成することができる。アウトカムおよび関連する信頼性レベルを生成することの具体例は、実施例の節ならびに本文、表、等式、および図面の全てを含むその全内容が参照により本明細書に援用される、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／５９１２３号（ＷＯ２０１３／０５２９１３）において記載されている。
本明細書で使用される「感度」という用語は、真陽性の数を、真陽性の数に偽陰性の数を加算して得た数で除算して得たものを指し、ここで感度（ｓｅｎｓ）は、０≦ｓｅｎｓ≦１の範囲内でありうる。本明細書で使用される「特異性」という用語は、真陰性の数を、真陰性の数に偽陽性の数を加算して得た数で除算して得たものを指し、ここで感度（ｓｐｅｃ）は、０≦ｓｐｅｃ≦１の範囲内でありうる。一部の実施形態では、場合によって、感度および特異性が１もしくは１００％に等しいか、または１の近傍にある（例えば、約９０％〜約９９％間にある）方法を選択する。一部の実施形態では、感度が１または１００％に等しい方法を選択し、ある特定の実施形態では、感度が１の近傍にある（例えば、約９０％の感度、約９１％の感度、約９２％の感度、約９３％の感度、約９４％の感度、約９５％の感度、約９６％の感度、約９７％の感度、約９８％の感度、または約９９％の感度である）方法を選択する。一部の実施形態では、特異性が１または１００％に等しい方法を選択し、ある特定の実施形態では、特異性が１の近傍にある（例えば、約９０％の特異性、約９１％の特異性、約９２％の特異性、約９３％の特異性、約９４％の特異性、約９５％の特異性、約９６％の特異性、約９７％の特異性、約９８％の特異性、または約９９％の特異性である）方法を選択する。
被験体が、少なくとも１つの遺伝子の変動を実際に有する場合に、被験体が、少なくとも１つの遺伝子の変動を有さないものとして誤って同定されないように、偽陰性の数は、ゼロに等しいかまたはゼロに近いことが理想的である。逆に、陰性を正確に分類する予測アルゴリズムの能力についても評価を行うことが多く、これは、感度と補完的な測定である。被験体が、評価される遺伝子の変動を有さない場合に、被験体が、少なくとも１つの遺伝子の変動を有するものとして誤って同定されないように、偽陽性の数は、ゼロに等しいかまたはゼロに近いことが理想的である。
一部の実施形態では、遺伝子の変動の存在または非存在（例えば、染色体異数性）を、胎児について決定する。このような実施形態では、胎児の遺伝子の変動（例えば、胎児の染色体異数性）の存在または非存在を決定する。
ある特定の実施形態では、試料についての、遺伝子の変動（例えば、染色体異数性）の存在または非存在を決定する。このような実施形態では、試料核酸中の、遺伝子の変動（例えば、染色体異数性）の存在または非存在を決定する。一部の実施形態では、検出される変動または検出されない変動は、１つの供給源に由来する試料核酸中には存在するが、別の供給源に由来する試料核酸中には存在しない。供給源の非限定的な例は、胎盤の核酸、胎児核酸、母体核酸、がん細胞の核酸、非がん細胞の核酸など、およびこれらの組合せを含む。非限定的な例では、検出されるまたは検出されない、特定の遺伝子の変動は、（ｉ）胎盤の核酸中には存在するが、胎児核酸中には存在せず、母体核酸中にも存在しないか、（ｉｉ）胎児核酸中には存在するが、母体核酸中には存在しないか、または（ｉｉｉ）母体核酸中には存在するが、胎児核酸中には存在しない。
１つまたは複数のアウトカムを生成した後で、アウトカムを使用して、遺伝子の変動の存在もしくは非存在および／または関連する医学的状態の決定をもたらすことが多い。アウトカムは、医療従事者（例えば、検査室技師または管理者；医師または助手）へと提示することが典型的である。アウトカムは、アウトカムモジュールにより提示することが多い。ある特定の実施形態では、アウトカムを、プロッティングモジュールにより提示する。ある特定の実施形態では、アウトカムは、マシンの周辺機器上またはコンポーネント上に提示される。例えば、場合によって、アウトカムを、プリンターまたはディスプレイにより提示する。一部の実施形態では、遺伝子の変動の存在または非存在の決定因であるアウトカムは、医療従事者へと、レポートの形態で提示され、ある特定の実施形態では、レポートは、アウトカム値および関連する信頼性パラメータの提示を含む。一般に、アウトカムは、遺伝子の変動の存在もしくは非存在および／または医学的状態の決定を容易とする、適切なフォーマットで示すことができる。データセットを報告および／もしくは提示するか、またはアウトカムを報告するための使用に適するフォーマットの非限定的な例は、ディジタルデータ、グラフ、２Ｄグラフ、３Ｄグラフ、および４Ｄグラフ、写真、ピクトグラフ、チャート、棒グラフ、円グラフ、概略図、フローチャート、散布図、マップ、ヒストグラム、密度図、関数グラフ、回路図、ブロック図、バブルマップ、信号空間ダイヤグラム、コンターダイアグラム、カルトグラム、レーダーチャート、ベン図、ノモグラムなど、および前出の組合せを含む。アウトカム表示の多様な例については、図面で示し、実施例で記載する。
ある特定の実施形態では、アウトカムの生成は、核酸配列の読取りの、被験体の細胞核酸の表示への転換とみなすことができる。被験体の細胞核酸の表示は、特定の染色体またはその部分についての量（ｄｏｓａｇｅ）またはコピー数を反映することが多く、これにより、表示は、被験体の核酸の特性であることが多い。例えば、多数の比較的小さな配列の読取りを、比較的大きな染色体の表示へと変換することは、転換とみなすことができる。例示として述べると、約３６塩基対の長さの読取りを使用して、約４７００万塩基の長さである第２１染色体の表示を生成するための処理では、染色体の少なくとも１００，０００分の１である、何千もの読取りを、有意に大きな染色体の表示へと転換する。染色体のこのような表示の生成は、本明細書で記載される、比較的大きな染色体の表示に到達するように、読取りの複数の操作（例えば、マッピング、フィルタリング、および／または正規化）を伴うことが典型的である。１つまたは複数のコンピュータの使用を要求しうる、複数の操作を活用することが多く、複数のコンピュータは、平行して協調することが多い。
妊娠中の雌に由来する試料を使用して、胎児染色体についての染色体の表示をもたらす場合、読取りのうちの大半は、母体核酸に由来することが多く、読取りのうちの少数は、胎児核酸に由来することが多いことを踏まえると、このような転換はさらに明らかである。母体核酸の読取りは、胎児核酸の読取りに優越することが多く、母体核酸の読取りのうちの大半は、胎児染色体の表示を遮蔽することが多い。母体読取りの大きなバックグラウンドは、胎児の染色体核酸と、母体の染色体核酸との差違を不鮮明にしうることが典型的であり、このようなバックグラウンドに抗して胎児染色体の表示を得ることは、本明細書で記載される通り、母体読取りの寄与をデコンボリュートする処理を伴う。
一部の実施形態では、アウトカムは、被験体（例えば、妊娠中の雌）に由来する配列の読取りの、被験体（例えば、母親および／または胎児）中に存在する既存の構造（例えば、ゲノム、染色体、またはこれらのセグメント）の表示への転換から得られる。一部の実施形態では、アウトカムは、第１の被験体（例えば、妊娠中の雌）に由来する配列の読取りの、構造（例えば、ゲノム、染色体、またはこれらのセグメント）の複合表示への転換と、複合表示の第２の転換であって、第１の被験体（例えば、妊娠中の雌）中および／または第２の被験体（例えば、胎児）中に存在する構造の表示をもたらす転換とを含む。一部の実施形態では、アウトカムは、第１の被験体（例えば、雌被験体、妊娠中の雌）に由来する配列の読取りの、第２の被験体（例えば、胎児）中に存在する、構造の表示（例えば、ゲノム、染色体、またはこれらのセグメント）への転換を含む。
本明細書の転換法は、場合によって、胎児を保有する妊娠中の雌被験体から得られた試料中の核酸の読取りから、胎児（例えば、Ｔ２１、Ｔ１８および／またはＴ１３）中のトリソミー染色体（すなわち、染色体のトリソミー）の存在または非存在を決定するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書の転換法は、胎児を保有する妊娠中の雌被験体から得られた試料中の核酸の読取りから、胎児についての染色体の表示（例えば、染色体のコピー数、染色体の量）を調製するステップ（例えば、決定するステップ、視覚化するステップ、表示するステップ、提示するステップ）を含みうる。後者の実施形態では、胎児についての染色体の表示は、第１３染色体、第１８染色体、および／または第２１染色体についての表示であることが多い。
アウトカムの使用
遺伝子の変動の存在または非存在の決定因の１つまたは複数のアウトカムを含むレポートを受け取る医療従事者または他の有資格者は、レポート内に示されたデータを使用して、試験被験体または患者の状態についての判定を下すことができる。一部の実施形態では、医療従事者は、提示されたアウトカムに基づき、推奨を行うことができる。一部の実施形態では、医療従事者または有資格者は、レポートで提示された、１つまたは複数のアウトカム値および関連する信頼性パラメータに基づき、試験被験体または患者に、遺伝子の変動の存在または非存在に関する判定またはスコアを提示することができる。ある特定の実施形態では、提示されたレポートの目視観察を使用して、医療従事者または有資格者が、手作業でスコアを作成するかまたは判定を下す。ある特定の実施形態では、場合によって、ソフトウェア内に埋め込まれた自動式のルーチンにより、スコアを作成するかまたは判定を下し、試験被験体または患者へと情報を提供する前に、医療従事者または有資格者が、精度について精査する。本明細書で使用される「レポートを受け取ること」という用語は、精査されると、医療従事者または他の有資格者が、試験被験体または患者における遺伝子の変動の存在または非存在について決定することを可能とする、アウトカムを含む通信手段、書面表示、および／またはグラフ表示により得ることを指す。レポートは、コンピュータにより作成することもでき、手作業によるデータ入力により作成することもでき、電子的手段（例えば、インターネットを介する、コンピュータを介する、ファックスを介する、同じ物理的施設または異なる物理的施設における１つのネットワーク拠点から別の拠点への）を使用して通信することもでき、データを送付または受領する別の方法（例えば、郵便、宅急便（登録商標）など）により通信することもできる。一部の実施形態では、アウトカムは、限定せずに述べると、言語形態、文書形態、またはファイル形態を含む適切な媒体により、医療従事者へと伝送する。ファイルは、例えば、音声ファイル、コンピュータ可読ファイル、書類ファイル、検査室ファイル、または医療記録ファイルでありうるがこれらに限定されない。
本明細書で使用される、「アウトカムを提示すること」という用語およびその文法的な同等物はまた、このような情報を得るための方法であって、限定せずに述べると、情報を検査室から得る（例えば、検査室ファイル）ステップを含む方法も指す場合がある。検査室ファイルは、医学的状態の存在または非存在を決定するための、１つまたは複数のアッセイまたは１つまたは複数のデータ処理ステップを実行した検査室により作成することができる。検査室は、医学的状態の存在または非存在を検査室ファイルから確認する職員と同じ場所にある場合もあり、異なる場所（例えば、別の国）にある場合もある。例えば、検査室ファイルは、１つの場所で作成し、その中の情報が妊娠中の雌被験体へと伝送される別の場所へと伝送することができる。ある特定の実施形態では、検査室ファイルは、実体的形態（ｔａｎｇｉｂｌｅ ｆｏｒｍ）の場合もあり、電子的形態（例えば、コンピュータ可読形態）の場合もある。
一部の実施形態では、アウトカムは、検査室から、医療従事者、医師、または有資格者へと提示することができ、医療従事者、医師、または有資格者は、アウトカムに基づき、診断を下すことができる。一部の実施形態では、アウトカムは、検査室から、医療従事者、医師、または有資格者へと提示することができ、医療従事者、医師、または有資格者は、さらなるデータおよび／または情報、ならびに他のアウトカムと共に、アウトカムに一部分基づき、診断を下すことができる。
医療従事者または有資格者は、レポートで提示された１つまたは複数のアウトカムに基づき、適切な推奨を提示することができる。提示されたアウトカムレポートに基づき提示されうる、推奨の非限定的な例は、手術、放射線療法、化学療法、遺伝子カウンセリング、生後処置解決手段（ａｆｔｅｒ ｂｉｒｔｈ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）（例えば、人生設計、長期にわたる介護ケア、医薬、対症的処置）、妊娠中絶、臓器移植、輸血など、または前出の組合せを含む。一部の実施形態では、推奨は、提示されたアウトカムベースの分類（例えば、ダウン症候群、ターナー症候群、Ｔ１３における遺伝子の変動と関連する医学的状態、Ｔ１８における遺伝子の変動と関連する医学的状態）に依存する。
検査室関係者（例えば、検査室管理者）は、遺伝子の変動の存在または非存在の決定（または試験領域についての正倍数体もしくは非正倍数体の決定）の根底をなす値（例えば、試験カウント、参照カウント、偏差のレベル）を分析することができる。遺伝子の変動の存在または非存在に関する判定であって、微妙であるかまたは疑わしい判定について、検査室関係者は、同じ試験を再発注することもでき、かつ／または試験被験体に由来する同じ試料核酸または異なる試料核酸を使用する、異なる試験（例えば、胎児の異数性の決定の場合における核型分析および／または羊水穿刺）を発注することもできる。
遺伝子の変動および医学的状態
遺伝子の変動（ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｎｃｅ）の存在または非存在は、本明細書に記載する方法、装置またはマシンを使用して決定することができる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子の変動（ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）の存在または非存在は、本明細書に記載する方法、マシンおよび装置により提供されるアウトカムにより決定される。遺伝子の変動は、一般的に、ある特定の個体中に存在する特定の遺伝的表現型であり、多くの場合、遺伝子の変動は、個体の統計的に有意な部分母集団の中に存在する。一部の実施形態では、遺伝子の変動は、染色体異常（例えば、異数性）、部分的染色体異常、またはモザイク現象であり、そのそれぞれについて、本明細書でより詳細に記載する。遺伝子の変動の非限定的な例として、１つまたは複数の欠失（例えば、微小欠失）、重複（例えば、微小重複）、挿入、変異、多型（例えば、一塩基多型）、融合、リピート（例えば、短いタンデムリピート）、異なるメチル化部位、異なるメチル化パターン等、およびその組合せが挙げられる。挿入、リピート、欠失、重複、変異、または多型は、任意の長さのものであり得、一部の実施形態では、長さ約１塩基または塩基対（ｂｐ）〜約２５０メガ塩基（Ｍｂ）である。一部の実施形態では、挿入、リピート、欠失、重複、変異、または多型は、長さ約１塩基または塩基対（ｂｐ）〜約１，０００キロ塩基（ｋｂ）である（例えば、長さ約１０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、５０ｋｂ、１００ｋｂ、５００ｋｂ、または１０００ｋｂ）。
遺伝子の変動は、欠失の場合もある。ある特定の実施形態では、欠失は染色体またはＤＮＡ配列の一部分が欠損している変異である（例えば、遺伝子異常）。欠失は、多くの場合、遺伝物質の喪失である。任意の数のヌクレオチドが欠失し得る。欠失は、１つもしくは複数の染色体全体、染色体のセグメント、対立遺伝子、遺伝子、イントロン、エクソン、任意の非コード領域、任意のコード領域、そのセグメント、またはその組合せの欠失を含み得る。欠失は、微小欠失を含み得る。欠失は、単一塩基の欠失を含み得る。
遺伝子の変動は、遺伝子の重複の場合もある。ある特定の実施形態では、重複は染色体またはＤＮＡ配列の一部分がコピーされ、ゲノムへと挿入される変異（例えば、遺伝子異常）である。ある特定の実施形態では、遺伝子の重複（すなわち、重複）は、ＤＮＡ領域の任意の重複である。一部の実施形態では、重複は、ゲノムまたは染色体内の、多くの場合タンデムに反復した核酸配列である。一部の実施形態では、重複は、１つもしくは複数の染色体全体、染色体のセグメント、対立遺伝子、遺伝子、イントロン、エクソン、任意の非コード領域、任意のコード領域、そのセグメント、またはその組み合わせのコピーを含み得る。重複は、微小重複を含み得る。重複は、１つまたは複数の重複した核酸のコピーを含む場合もある。重複は、１回または複数回反復した（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回反復した）遺伝子領域として特徴付けられる場合もある。重複は、小領域（数千塩基対）から一部の事例では染色体全体の範囲であり得る。重複は、相同組換えにおける誤差の結果として、またはレトロトランスポゾンイベントに起因して高頻度で生ずる。重複は、ある特定の種類の増殖性疾患と関連していた。重複は、ゲノムマイクロアレイまたは比較遺伝子交雑法（ＣＧＨ）を使用して特徴付けできる。
遺伝子の変動は、挿入の場合もある。挿入は、１つまたは複数のヌクレオチド塩基対の核酸配列への付加の場合もある。挿入は、微小挿入の場合もある。ある特定の実施形態では、挿入は、染色体のセグメントのゲノム、染色体、またはそのセグメントへの付加を含む。ある特定の実施形態では、挿入は、対立遺伝子、遺伝子、イントロン、エクソン、任意の非コード領域、任意のコード領域、そのセグメントまたはその組合せの、ゲノムまたはそのセグメントへの付加を含む。ある特定の実施形態では、挿入は、起源が不明の核酸の、ゲノム、染色体、またはそのセグメントへの付加（すなわち、挿入）を含む。ある特定の実施形態では、挿入は、単一塩基の付加（すなわち、挿入）を含む。
本明細書で使用する場合、「コピー数の変動」は、一般的に遺伝子の変動または染色体異常のクラスまたは種類である。コピー数の変動は、欠失（例えば、微小欠失）、重複（例えば、微小重複）、または挿入（例えば、微小挿入）であり得る。多くの場合、本明細書で時に使用される接頭辞「微小」は、長さ５Ｍｂ未満の核酸のセグメントである。コピー数の変動は、染色体のセグメントの１つまたは複数の欠失（例えば、微小欠失）、重複、および／または挿入（例えば、微小重複、微小挿入）を含み得る。ある特定の実施形態では、重複は挿入を含む。ある特定の実施形態では、挿入は重複である。ある特定の実施形態では、挿入は重複ではない。例えば、多くの場合、ある部分で配列が重複すると、重複が見出される部分に関するカウントが増加する。多くの場合、ある部分で配列が重複するとレベルが高まる。特定の実施形態では、第１のレベルを構成する部分に重複が存在すると、重複が存在しない第２のレベルと比較してレベルが高まる。ある特定の実施形態では、挿入は、部分のカウントを増加させ、挿入を表す配列が同一部分内の別の位置に存在する（すなわち、重複される）。ある特定の実施形態では、挿入は、部分のカウント、またはレベルを有意に増加させず、挿入された配列は、同一部分内の配列の重複ではない。ある特定の実施形態では、挿入は重複として検出または表示されず、挿入を表す重複配列は、同一部分に存在しない。
一部の実施形態では、コピー数の変動は、胎児のコピー数の変動である。多くの場合、胎児のコピー数の変動は、胎児のゲノム内のコピー数の変動である。一部の実施形態では、コピー数の変動は、母体および／または胎児のコピー数の変動である。ある特定の実施形態では、母体および／または胎児のコピー数の変動は、妊娠中の雌（例えば、胎児を出産する雌の被験体）、分娩経験のある雌の被験体、または胎児を出産する能力を有する雌のゲノム内のコピー数の変動である。コピー数の変動は、ヘテロ接合性のコピー数の変動であり得、この場合、変動（例えば、重複または欠失）は、ゲノムの１方の対立遺伝子上に存在する。コピー数の変動は、ホモ接合性のコピー数の変動であり得、この場合、変動は、ゲノムの両方の対立遺伝子に存在する。一部の実施形態では、コピー数の変動はヘテロ接合性またはホモ接合性の胎児のコピー数の変動である。一部の実施形態では、コピー数の変動は、ヘテロ接合性またはホモ接合性の母体および／または胎児のコピー数の変動ある。コピー数の変動は、母体ゲノムおよび胎児ゲノムに存在する、母体ゲノムに存在するが胎児ゲノムに存在しない、または胎児ゲノムに存在するが母体ゲノムに存在しない場合がある。
「倍数性」とは、胎児または母親中に存在する染色体の数への言及である。ある特定の実施形態では、「倍数性」は、「染色体倍数性」と同じである。ヒトでは、例えば常染色体は、多くの場合、対で存在する。例えば、遺伝子の変動が存在しない場合、ほとんどのヒトは各常染色体（例えば、第１〜２２染色体）を２つ有する。ヒトにおける２つの常染色体の正常な相補の存在は、これは多くの場合、正倍数体と呼ばれる。「微小倍数性」は、意味上では、倍数性に類似する。「微小倍数性」は、多くの場合、染色体のセグメントの倍数性を指す。用語「微小倍数性」とは、染色体内のコピー数の変動（例えば、欠失、重複、および／または挿入）の存在または非存在（例えば、ホモ接合性またはヘテロ接合性の欠失、重複、または挿入等またはその非存在）への言及の場合もある。「倍数性」および「微小倍数性」は、プロファイル内のレベルのカウントを正規化した後に決定される場合もある。したがって、常染染色体の対を表すレベル（例えば、正倍数体）は、多くの場合、倍数性１に正規化される。同様に、重複、欠失、または挿入が存在しないことを表す染色体のセグメント内のレベルは、多くの場合、微小倍数性１に正規化される。倍数性および微小倍数性は、多くの場合、部分−特異的（例えば、部分特異的）および試料−特異的である。倍数性は、多くの場合、１／２の整数倍として規定され、正倍数体（例えば、２つの染色体）、染色体１つ存在（例えば、染色体欠失）、染色体非存在、染色体３つ（例えば、トリソミー）、および染色体４つをそれぞれ表す、１、１／２、０、３／２、および２の値を有する。同様に、微小倍数性は、多くの場合、１／２の整数倍として規定され、正倍数体（例えば、コピー数の変動無し）、ヘテロ接合性の欠失、ホモ接合性の欠失、ヘテロ接合性の重複、およびホモ接合性の重複をそれぞれ表す、１、１／２、０、３／２、および２の値を有する。胎児に関する倍数性値についての一部の例を表２に提示する。
ある特定の実施形態では、胎児の微小倍数性は、胎児の母親（すなわち、妊娠中の雌の被験体）の微小倍数性と一致する。ある特定の実施形態では、胎児の微小倍数性は、胎児の母親の微小倍数性と一致し、母親および胎児いずれも、同一のヘテロ接合性のコピー数の変動、ホモ接合性のコピー数の変動を担持する、または両方とも正倍数体である。ある特定の実施形態では、胎児の微小倍数性は、胎児の母親の微小倍数性と異なる。例えば、胎児の微小倍数性は、コピー数の変動についてヘテロ接合性であり、母親は、コピー数の変動についてホモ接合性であり、胎児の微小倍数性は、特定のコピー数の変動に関して母親の微小倍数性と一致しない（例えば、等しくない）場合もある。
微小倍数性は、多くの場合、期待されるレベルと関連する。例えば、レベル（例えば、プロファイル内のレベル、時にコピー数の変動を実質的に含まないレベル）は、値１に正規化される場合もあり（例えば、倍数性１、微小倍数性１）、ホモ接合性の重複の微小倍数性は２、ヘテロ接合性の重複は１．５、ヘテロ接合性の欠失は０．５、およびホモ接合性の欠失は０である。
被験体について存在または非存在が同定された遺伝子の変動は、ある特定の実施形態では医学的状態と関連する。したがって、本明細書に記載する技術は、医学的状態または病状と関連する１つまたは複数の遺伝子の変動の存在または非存在を同定するのに使用することができる。医学的状態の非限定的な例として、知的障害（例えば、ダウン症候群）、異常な細胞増殖（例えば、がん）、微生物核酸（例えば、ウイルス、細菌、真菌、酵母）の存在、および子癇前症と関連した状態が挙げられる。
遺伝子の変動、医学的状態および病状の非限定的な例は、以下に記載されている。
胎児の性別
一部の実施形態では、胎児の性別または性別関連の障害（例えば、性染色体異数性）の予測は、本明細書に記載する方法、マシンまたは装置により決定することができる。性別の決定は、性染色体に一般的に基づく。ヒトでは、２つの性染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体が存在する。Ｙ染色体は、雄としての胚発生を引き起こす遺伝子、ＳＲＹを含有する。ヒトおよび他の哺乳動物のＹ染色体は、正常な精子産生に必要とされる他の遺伝子も含有する。ＸＸを有する個体は雌であり、ＸＹは雄であり、多くの場合、性染色体異数性と呼ばれる非限定的な変動として、Ｘ０、ＸＹＹ、ＸＸＸ、およびＸＸＹが挙げられる。ある特定の実施形態では、雄は、２つのＸ染色体および１つのＹ染色体（ＸＸＹ；クラインフェルター症候群）、または１つのＸ染色体および２つのＹ染色体（ＸＹＹ症候群；ジェイコブス症候群）を有し、ならびに一部の雌は、３つのＸ染色体（ＸＸＸ；トリプルＸ症候群）または２つではなく単一のＸ染色体（Ｘ０；ターナー症候群）を有する。ある特定の実施形態では、個体内の一部の細胞のみが、性染色体異数性により影響を受け、モザイク現象（例えば、ターナーモザイク現象）と呼ばれる場合もある。他の症例として、ＳＲＹが損傷を受けている症例（ＸＹの雌となる）、またはＸにコピーされた症例（ＸＸの雄となる）が挙げられる。
一部の実施形態では、胎児の性別を決定する方法はまた、胎児フラクションおよび／または胎児の遺伝子の変動（例えば、胎児の染色体異数性）の存在もしくは非存在を決定するステップも含みうる。胎児の遺伝子の変動の存在または非存在を決定するステップは、その非限定的な例が、核型分析、羊水穿刺、循環無細胞核酸分析、無細胞胎児ＤＮＡ分析、ヌクレオチド配列分析、配列読取りの定量、標的化法、増幅ベースの手法、質量分析ベースの手法、差次的メチル化ベースの手法、差次的消化ベースの手法、多型ベースの手法、ハイブリダイゼーションベースの手法（例えば、プローブを使用する）などを含む、適切な様式で実施することができる。
ある特定の症例では、子宮内の胎児の性別を決定することが有益な場合もある。例えば、１つまたは複数の伴性障害の家族歴を有する患者（例えば、妊娠中の雌）は、かかる障害を受け継ぐ胎児のリスクを評価するのに役立つように、身ごもっている胎児の性別を決定したいと欲する場合がある。伴性障害として、非限定的に、Ｘ連鎖およびＹ連鎖障害が挙げられる。Ｘ連鎖障害として、Ｘ連鎖劣性障害およびＸ連鎖優性障害が挙げられる。Ｘ関連劣性障害の例として、非限定的に、免疫障害（例えば、慢性肉芽腫性疾患（ＣＹＢＢ）、ヴィスコット・アルドリッチ症候群、Ｘ連鎖重症複合型免疫不全症、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、１型高ＩｇＭ症候群、ＩＰＥＸ、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患、プロパージン欠損症)、血液学的障害（例えば、血友病Ａ、血友病Ｂ、Ｘ連鎖鉄芽球性貧血）、内分泌障害（例えば、アンドロゲン不感性症候群／ケネディ病、ＫＡＬ１カルマン症候群、Ｘ連鎖先天性副腎低形成)、代謝障害（例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、眼脳腎症候群、副腎白質ジストロトフィー、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ欠損症、ダノン病／ＩＩｂ型グリコーゲン蓄積症、ファブリー病、ハンター症候群、レッシュ−ナイハン症候群、メンケス病／オクシピタル・ホーン症候群）、神経系障害（例えば、コフィン−ローリー症候群、ＭＡＳＡ症候群、Ｘ連鎖アルファサラセミア精神遅滞症候群、シデリウスＸ連鎖精神遅滞症候群、色盲、眼球白皮症、ノリエ病、コロイデレミア、シャルコー−マリー−トゥース病（ＣＭＴＸ２−３）、ペリツェウス−メルツバッハー病、ＳＭＡＸ２）、皮膚および関連組織の障害（例えば、先天性角化不全症、低汗性外胚葉形成不全（ＥＤＡ）、Ｘ連鎖魚鱗癬、Ｘ連鎖角膜内皮ジストロフィ）、神経筋障害（例えば、ベッカー型筋ジストロフィー／デュシェンヌ型筋ジストロフィー、中心核ミオパシー（ＭＴＭ１）、コンラーディ−ヒューネルマン症候群、エメリー−ドレフュス型筋ジストロフィー１）、泌尿器系障害（例えば、アルポート症候群、デント病、Ｘ連鎖腎原性尿崩症）、骨／歯の障害（例えば、ＡＭＥＬＸエナメル質形成不全症）、および他の障害（例えば、バース症候群、マクロード症候群、スミス−ファインマン−マイヤーズ症候群、シンプソン−ゴラビ−ベーメル症候群、Ｍｏｈｒ−Ｔｒａｎｅｂｊａｅｒｇ症候群、鼻指聴覚症候群）。Ｘ連鎖優性障害の例として、非限定的に、Ｘ連鎖低リン酸血症、巣状皮膚低形成、脆弱Ｘ症候群、アイカルディ症候群、色素失調症、Ｒｅｔｔ症候群、ＣＨＩＬＤ症候群、Ｌｕｊａｎ−Ｆｒｙｎｓ症候群、および口腔・顔面・指趾症候群１が挙げられる。Ｙ連鎖障害の例として、非限定的に、雄不妊症、網膜色素変性、および無精子症が挙げられる。
染色体異常
一部の実施形態では、胎児染色体異常の存在または非存在は、本明細書に記載する方法、マシンまたは装置を使用して決定することができる。染色体異常として、非限定的に、染色体全体または１つもしくは複数の遺伝子を含む染色体の領域の取得または喪失が挙げられる。染色体異常には、モノソミー、トリソミー、ポリソミー、ヘテロ接合性の喪失、転座、不均衡な転座により引き起こされた欠失および重複を含む、１つまたは複数のヌクレオチド配列（例えば、１つまたは複数の遺伝子）の欠失および／または重複が含まれる。用語「染色体異常」、「異数性」および／または「異数体」は、本明細書で使用する場合、被験体の染色体構造と正常な相同染色体構造の間の乖離を指す。用語「正常」とは、特定の種の健康な個体に見出される優勢な核型またはバンディングパターン、例えば正倍数体ゲノム（ヒトでは、４６、ＸＸまたは４６、ＸＹ）を指す。生物が異なれば染色体の相補性も幅広く異なるので、用語「異数性」および「異数体」は特定の染色体の数を指すものではなく、生物の所与の細胞の１つまたは複数内の染色体含有量が異常である状況を指す。一部の実施形態では、用語「異数性」および「異数体」は、本明細書では、染色体の全部または染色体の一部の喪失または取得により引き起こされた遺伝物質の不均衡を指す。「異数性」は、染色体のセグメントの１つまたは複数の欠失および／または挿入を指し得る。用語「正倍数体」は、一部の実施形態では、染色体の正常な相補を指す。
用語「モノソミー」は、本明細書で使用する場合、正常な相補の１つの染色体が欠如していることを指す。単一のコピー内に染色体のセグメントのみが存在する、不均衡な転座または欠失においては、部分的モノソミーが生じ得る。性染色体のモノソミー（４５、Ｘ）は、例えばターナー症候群を引き起こす。用語「ダイソミー」は、染色体のコピーが２つ存在することを指す。各染色体の２つのコピーを有するヒト等の生物（二倍体または「正倍数体」の生物）の場合、ダイソミーは正常な状態である。各染色体の３つまたはそれ超のコピーを通常有する生物（三倍体またはそれ超の生物）の場合、ダイソミーは異数体の染色体の状態である。片親性のダイソミーでは、染色体の両方のコピーは同一の親に由来する（他方の親の寄与はない）。
用語「トリソミー」は、本明細書で使用する場合、特定の染色体の２つのコピーではなく３つのコピーが存在することを指す。ヒトのダウン症候群に見出される余分な第２１染色体の存在は、「トリソミー２１」と呼ばれる。トリソミー１８およびトリソミー１３は、他の２つのヒト常染色体トリソミーである。性染色体のトリソミーは、雌（例えば、トリプルＸ症候群の４７、ＸＸＸ）または雄（例えば、クラインフェルター症候群の４７、ＸＸＹ；またはジェイコブス症候群の４７、ＸＹＹ）に認められる場合がある。一部の実施形態では、トリソミーは、ほとんどまたは全ての常染色体の重複である。ある特定の実施形態では、トリソミーは全染色体異数性であり、特定の種類の染色体について３つのインスタンス（例えば、３つのコピー）をもたらす（例えば、正倍数体についての特定の種類の染色体の２つのインスタンス（すなわち対）ではなく）。
用語「テトラソミー」および「ペンタソミー」は、本明細書で使用する場合、４つまたは５つの染色体のコピーがそれぞれ存在することを指す。常染色体ではほとんど認められないが、性染色体のテトラソミーおよびペンタソミーが、ＸＸＸＸ、ＸＸＸＹ、ＸＸＹＹ、ＸＹＹＹ、ＸＸＸＸＸ、ＸＸＸＸＹ、ＸＸＸＹＹ、ＸＸＹＹＹ、およびＸＹＹＹＹを含め、ヒトで報告されている。
染色体異常は、様々な機構により引き起こされ得る。機構には、（ｉ）有糸分裂チェックポイントが脆弱化した結果として生ずる不分離、（ｉｉ）複数の染色体において不分離を引き起こす不活性な有糸分裂チェックポイント、（ｉｉｉ）１つの動原体が両方の有糸分裂紡錘体極に結合したときに生ずるメロテリック結合、（ｉｖ）２つ超の紡錘体極が形成されたときの多極紡錘体形成、（ｖ）単一の紡錘体極しか形成されなかったときの単極紡錘体形成、および（ｖｉ）単極紡錘体機構の最終結果として四倍体中間体が生ずることが含まれるが、これらに限定されない。
用語「部分的モノソミー」および「部分的トリソミー」は、本明細書で使用する場合、染色体の一部分の喪失または取得により引き起こされた遺伝物質の不均衡を指す。部分的モノソミーまたは部分的トリソミーは、不均衡な転座に起因し得るが、この場合、個体は２つの異なる染色体の破断および融合により形成された誘導染色体を担持する。この状況では、個体は１つの染色体の一部分の３つのコピー（２つの正常なコピー、および誘導染色体上に存在するセグメント）、および誘導染色体に関与する他の染色体の一部分の１つのコピーのみを有する。
用語「モザイク現象」は、本明細書で使用する場合、生物の全ての細胞ではなく、一部の細胞内の染色体異数性を指す。ある特定の染色体異常は、モザイク性および非モザイク性の染色体異常として存在し得る。例えば、ある特定のトリソミー２１個体はモザイクダウン症候群を有し、一部は非モザイクダウン症候群を有する。異なる機構が、モザイク現象をもたらし得る。例えば、（ｉ）最初の接合体は、３つの第２１染色体を有すると考えられ、これは単純なトリソミー２１を通常もたらすが、細胞分裂の過程で、１つまたは複数の細胞系が、第２１染色体の１つを喪失する；および（ｉｉ）最初の接合体は、２つの第２１染色体を有すると考えられるが、細胞分裂の過程で、第２１染色体の１つが重複した。体細胞モザイク現象は、完全なまたはモザイク性の異数性を伴う遺伝的症候群と一般的に関連する機構とは異なる機構を通じて生ずる可能性がある。体細胞モザイク現象は、例えばある特定の種類のがんやニューロンにおいて同定された。ある特定の事例では、トリソミー１２は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）において同定され、トリソミー８は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）において同定された。また、個体が染色体の破断しやすい傾向を有するような遺伝的症候群（染色体不安定症候群）では、様々な種類のがんに対するリスクの増大と高頻度で関連し、したがって発癌性における体細胞異数性の役割が注目される。本明細書に記載する方法およびプロトコールは、非モザイク性およびモザイク性の染色体異常の存在または非存在を同定することができる。
表１Ａおよび１Ｂは、本明細書に記載する方法、マシンおよび装置により同定される可能性があり得る染色体の状態、症候群、および／または異常の非限定的なリストを提示する。表１Ｂは、２０１１年１０月６日時点のＤＥＣＩＰＨＥＲデータベースに由来する（例えば、バージョン５．１、ＧＲＣｈ３７に対してマッピングされた場所に基づく；ユニフォームリソースロケーター（ＵＲＬ）ｄｅｃｈｉｐｈｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋにて入手可能）。
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グレード１の状態は、多くの場合、１つまたは複数の以下の特徴を有する；病原的異常；遺伝学者の間で強く合意されている；高い浸透性；なおも多様な表示型を有し得るが、いくつかの一般的な特性も有する；文献中の全ての症例は臨床表示型を有する；異常を有する健康な個体の症例を認めない；ＤＶＧデータベースに報告されていない、または健常母集団では見出されない；単一遺伝子または多重遺伝子の量的効果を確認する機能的データ；確認済みまたは強固な候補遺伝子；臨床マネジメント案が規定済み；がんのリスクが公知でサーベイの案を有する；複数の情報源（ＯＭＩＭ、ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ、Ｏｒｐｈａｎｅｔ、Ｕｎｉｑｕｅ、Ｗｉｋｉｐｅｄｉａ）；および／または診断用途で利用可能（妊娠カウンセリング）。
グレード２の状態は、多くの場合、１つまたは複数の下記の特徴を有する；病原的異常の可能性；高い浸透性；ＤＤを除き一貫した特性を有さない多様な表示型；文献では症例／報告の数が少ない；報告された全ての症例は臨床表示型を有する；機能的データまたは確認済みの病原性遺伝子を認めない；複数の情報源（ＯＭＩＭ、ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ、Ｏｒｐｈａｎｅｔ、Ｕｎｉｑｕｅ、Ｗｉｋｉｐｅｄｉａ）；および／または診断目的および妊娠カウンセリングのために使用できる。
グレード３の状態は、多くの場合、１つまたは複数の下記の特徴を有する；感受性遺伝子座；健常な個体または発端者の未罹患の両親が記載されている；対照母集団中に存在する；非浸透性；表示型が軽度で特異的ではない；特性はあまり一貫していない；機能的データまたは確認済みの病原性遺伝子を認めない；データの供給源がより限定的；大部分から乖離している症例に関して、または新規臨床所見が存在する場合、第２の診断の可能性は、可能性の状態のままである；および／または診断目的で使用する際には要注意、および妊娠カウンセリングの場合、助言には慎重を期す。
子癇前症
一部の実施形態では、子癇前症の存在または非存在は、本明細書に記載する方法、マシンまたは装置を使用して決定される。子癇前症は、妊娠中に高血圧症が発生する状態（すなわち、妊娠誘発性高血圧症）であり、尿中の相当量のタンパク質と関連する。ある特定の実施形態では、子癇前症は、細胞外核酸のレベル上昇および／またはメチル化パターン変化とも関連する。例えば、細胞外の胎児由来過剰メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａレベルと子癇前症の重症度の間に正の相関が認められた。ある特定の例では、子癇前症の胎盤内のＨ１９遺伝子について、正常な対照と比較してＤＮＡのメチル化の増加が認められる。
子癇前症は、世界的に、母体および胎児／新生児の死亡率および疾病率の主因の１つである。血漿および血清中の循環無細胞核酸は新規バイオマーカーであり、出生前診断を含む異なる医学分野における臨床用途として有望である。母体血漿中の無細胞胎児（ｃｆｆ）ＤＮＡの定量的変化は、例えば雄特異的ＳＲＹまたはＤＹＳ１４遺伝子座に関するリアルタイム定量的ＰＣＲを使用して、その変化が切迫した子癇前症に関する指標となることが、異なる試験で報告されている。早期発症型の子癇前症の症例では、最初の三半期にレベルの上昇が認められる場合がある。症状発現前のｃｆｆＤＮＡのレベルの上昇は、組織の酸化ストレスおよび胎盤のアポトーシスおよび壊死の増加をもたらす絨毛間腔内の低酸素／再酸素化に起因する場合もある。ｃｆｆＤＮＡの母体循環への排出増加に関する証拠に加えて、子癇前症では、ｃｆｆＤＮＡの腎臓クリアランスの低下に関する証拠も存在する。胎児ＤＮＡの量は、現在のところ、Ｙ−染色体特異的配列の定量により決定されるので、代替的アプローチ、例えば無細胞総ＤＮＡの測定または性別に依存しない胎児エピジェネティックマーカー、例えばＤＮＡメチル化の使用により、代替法が提供される。胎盤起源の無細胞ＲＮＡは、臨床診療において子癇前症をスクリーニングおよび診断するのに使用できる別の代替的バイオマーカーである。胎児ＲＮＡは、これを分解から保護する細胞内胎盤粒子と関連する。胎児のＲＮＡレベルは、対照と比較して子癇前症の妊娠中の雌では１０倍高い場合があり、したがって、臨床診療において子癇前症をスクリーニングおよび診断するのに使用できる代替的バイオマーカーである。
病原体
一部の実施形態では、病態の存在または非存在は、本明細書に記載する方法または装置により決定される。病態は、細菌、ウイルス、または真菌を含むが、これらに限定されない病原体に宿主が感染することにより引き起こされ得る。病原体は宿主の核酸と区別可能な核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ）を一般的に有するので、本明細書において提供される方法、マシンおよび装置が、病原体の存在または非存在を決定するのに使用できる。多くの場合、病原体は、例えばエピジェネティックな状態および／または１つもしくは複数の配列の変動、重複、および／または欠失等の、特定の病原体に固有の特徴を持つ核酸を有する。したがって、本明細書において提供される方法は、特定の病原体または病原体の変異体（例えば、株）を同定するのに使用できる。
がん
一部の実施形態では、細胞増殖障害（例えば、がん）の存在または非存在が、本明細書に記載する方法、マシンまたは装置を使用して決定される。例えば、血清中の無細胞核酸のレベルは、健康な患者と比較して様々な種類のがんを有する患者で上昇し得る。例えば、転移性の疾患を有する患者は、非転移性の患者の約２倍高い血清ＤＮＡレベルを有する場合があり得る。転移性の疾患を有する患者は、がん特異的マーカー、および／または、例えばある特定の一塩基多型または短いタンデムリピートによっても同定され得る。循環ＤＮＡのレベル上昇と正に相関し得るがんの種類の非限定的な例として、乳がん、結腸直腸がん、消化器がん、肝細胞がん、肺がん、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、膀胱がん、ヘパトーマ、子宮頚がん、食道がん、膵臓がん、および前立腺がんが挙げられる。様々ながんは、非がん性の健康な細胞に由来する核酸から区別可能な特徴、例えばエピジェネティックな状態、ならびに／または配列の変動、重複、および／もしくは欠失等を伴う核酸を有し得る、および、時には、これを血流中に放出し得る。かかる特徴は、例えば特定の種類のがんに特異的であり得る。したがって、本明細書において提供される方法は、特定の種類のがんを同定するのに使用できることがさらに想定される。
本明細書において以後より詳細に記載するように、ソフトウェアが、本明細書に記載する処理において、下記を含むが、これに限定されない１つまたは複数のステップを行うために使用できる；カウント計測、データ処理、アウトカムの生成、および／または生成されたアウトカムに基づく１つもしくは複数の推奨の提供。
マシン、ソフトウェア、およびインターフェース
本明細書で記載されるある特定の処理および方法（例えば、配列読取り、カウント、レベル（例えば、レベル）、および／もしくはプロファイルの定量、マッピング、正規化、範囲の設定、調整、分類、カウント計測、ならびに／または決定）は、コンピュータ、マイクロプロセッサ、ソフトウェア、モジュール、または他のマシンを伴わずには実施できないことが多い。本明細書で記載される方法は、コンピュータにより実施される方法であることが典型的であり、方法の１つまたは複数の部分は、場合によって、１つまたは複数の、プロセッサ（例えば、マイクロプロセッサ）、コンピュータ、またはマイクロプロセッサにより制御されるマシンにより実施する。本明細書で記載される方法に関連する実施形態は一般に、本明細書で記載されるシステム中、マシン中、およびコンピュータプログラム産物中の命令により実施される、同じ処理または関連する処理へと適用可能である。本明細書で記載される方法に関連する実施形態は一般に、実行可能なプログラムをその上に内蔵した非一時的なコンピュータ可読記憶媒体であって、プログラムが、マイクロプロセッサに、方法またはその一部分を実行するように命令する非一時的なコンピュータ可読記憶媒体により実施される、同じ処理または関連する処理へと適用可能でありうる。一部の実施形態では、本明細書で記載される処理および方法（例えば、配列の読取り、カウント、レベル、および／またはプロファイルの定量、カウント計測、および／または決定）を、自動化法により行う。一部の実施形態では、本明細書で記載される１つまたは複数のステップおよび方法は、マイクロプロセッサおよび／もしくはコンピュータにより実行し、かつ／またはメモリを伴って実行する。一部の実施形態では、自動化法を、配列の読取り、カウント、マッピング、マッピングした配列タグ、レベル、プロファイル、正規化、比較、範囲の設定、分類、調整、プロッティング、アウトカム、変換、および同定を決定する、ソフトウェア、モジュール、マイクロプロセッサ、周辺機器、および／またはマシンなどにより実現する。本明細書で使用されるソフトウェアとは、本明細書で記載するように、マイクロプロセッサにより実行されると、コンピュータによる演算を行うコンピュータで読取り可能なプログラムによる命令を指す。
試験被験体（例えば、患者、妊娠中の雌）に由来する、および／または参照被験体に由来する配列の読取り、カウント、レベル、およびプロファイルは、遺伝子の変動の存在または非存在を決定するためにさらに分析および処理することができる。配列の読取り、カウント、レベル、および／またはプロファイルは、「データ」または「データセット」と呼ばれる場合もある。一部の実施形態では、データまたはデータセットは、１つまたは複数の特性または変数（例えば、配列に基づく［例えば、ＧＣ含有量、特異的ヌクレオチド配列等］、機能特異的［例えば、発現した遺伝子、がん遺伝子等］、位置に基づく［ゲノム特異的、染色体特異的、部分または部分特異的］特性または変数等およびその組合せ）により特徴付けることができる。ある特定の実施形態では、データまたはデータセットは、１つまたは複数の特性または変数に基づく２次元またはそれ超の次元を有するマトリックスに組織化され得る。マトリックスに組織化されたデータは、任意の適する特性または変数を使用して組織化され得る。マトリックス中のデータの非限定的な例として、母体の年齢、母体の倍数性、および胎児の寄与により組織化されるデータが挙げられる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の特性または変数により特徴付けられるデータセットは、カウント計測後に処理される場合もある。
マシン、ソフトウェア、およびインターフェースが、本明細書に記載する方法を実施するのに使用できる。マシン、ソフトウェア、およびインターフェースを使用して、ユーザーは、特定の情報、プログラム、または処理（例えば、配列の読取りのマッピング、マッピングされたデータの処理、および／またはアウトカムの提供）を使用するためのオプションを入力、要求、照会、または決定することができ、例えば統計分析アルゴリズム、統計的有意性アルゴリズム、統計的アルゴリズム、反復ステップ、検証アルゴリズム、および図形表示の実施が含まれ得る。一部の実施形態では、データセットは、インプット情報としてユーザーが入力可能であり、ユーザーは、適するハードウェア媒体（例えば、フラッシュドライブ）により１つもしくは複数のデータセットをダウンロードすることができ、ならびに／またはユーザーは、後続する処理のために、および／もしくはアウトカムを提供するために、１つのシステムから別のシステムにデータセットを送信することができる（例えば、シーケンサーからコンピュータシステムに、配列の読取りのマッピング用として配列の読取りデータを送信する；マッピングされた配列データを、処理して、ならびにアウトカムおよび／またはレポートの取得用としてコンピュータシステムに送信する）。
システムは、１つまたは複数のマシンを一般的に含む。各マシンは、１つまたは複数のメモリ、１つまたは複数のマイクロプロセッサ、およびインストラクションを含む。システムが２つまたはそれ超のマシンを含む場合、マシンの一部または全部は同一の場所に位置し得る、マシンの一部または全部は異なる場所に位置し得る、全てのマシンは１つの場所に位置し得る、および／または全てのマシンは異なる場所に位置し得る。システムが２つまたはそれ超のマシンを含む場合、マシンの一部もしくは全部はユーザーと同じ場所に位置し得る、マシンの一部もしくは全部はユーザーと異なる場所に位置し得る、全てのマシンはユーザーと同じ場所に位置し得る、および／または全てのマシンはユーザーとは異なる１つもしく複数の場所に位置し得る。
システムは、演算マシンおよびシーケンサーまたは配列決定マシンを含む場合があり、この場合、シーケンサーまたは配列決定マシンは、身体由来の核酸を入手し、配列の読取りを生成するように構成され、演算装置は、シーケンサーまたは配列決定マシンから得られた読取りを処理するように構成される。演算マシンは、配列の読取りから遺伝子の変動（例えば、コピー数の変動；胎児染色体異数性）の存在または非存在を決定するように構成される場合がある。
ユーザーは、例えばソフトウェアに照会を行うことができ、ソフトウェアは、次にインターネットにアクセスしてデータセットを取得することができ、ある特定の実施形態では、プログラム可能なマイクロプロセッサは、与えられたパラメータに基づいて、適するデータセットを取得するように催促され得る。また、プログラム可能なマイクロプロセッサは、与えられたパラメータに基づいてマイクロプロセッサにより選択された１つまたは複数のデータセットオプションを選択するようにユーザーに促す場合もある。プログラム可能なマイクロプロセッサは、インターネット、他の内部または外部の情報等を経由して見出される情報に基づき、マイクロプロセッサにより選択された１つまたは複数のデータセットオプションを選択するようにユーザーに促し得る。オプションは、１つまたは複数のデータ特性セレクション、１つまたは複数の統計的アルゴリズム、１つまたは複数の統計分析アルゴリズム、１つまたは複数の統計的有意性アルゴリズム、反復ステップ、１つまたは複数の検証アルゴリズム、ならびに方法、マシン、装置、コンピュータプログラム、または実行可能なプログラムが保存される非一時的コンピュータ可読ストレージ媒体の１つまたは複数の図形表示を選択するために選ばれ得る。
本明細書が取り上げるシステムは、コンピュータシステムの一般的なコンポーネント、例えばネットワークサーバー、ラップトップシステム、デスクトップシステム、ハンドヘルドシステム、パーソナルデジタルアシスタント、コンピュータキオスク（computing kiosk）等を含み得る。コンピュータシステムは、ユーザーがデータをシステムに入力できるようにする１つまたは複数のインプット手段、例えばキーボード、タッチスクリーン、マウス、音声認識手段、または他の手段を含み得る。システムは、ディスプレイスクリーン（例えば、ＣＲＴまたはＬＣＤ）、スピーカー、ファックス機、プリンター（例えば、レーザー式、インクジェット式、インパクト式、白黒またはカラープリンター）、または情報（例えば、アウトカムおよび／またはレポート）の視覚的、聴覚的および／もしくはハードコピーアウトプットを提供するのに有用な他のアウトプットを含むが、これらに限定されない、１つまたは複数のアウトプットをさらに含み得る。
システムでは、インプットおよびアウトプット手段は、コンポーネントの中でもとりわけ、プログラムインストラクションを実行するマイクロプロセッサ、ならびにプログラムコードおよびデータを保管するメモリを含み得る中央処理装置と接続され得る。一部の実施形態では、処理は、単一の地理的箇所に所在する単一のユーザーシステムとして実施され得る。ある特定の実施形態では、処理は、マルチユーザーシステムとして実施され得る。マルチユーザーで実施される場合、複数の中央処理装置が、ネットワークによって接続され得る。ネットワークは、建物の一部内の一部門、建物全体を範囲に含むようにローカルであり得、複数の建物にまたがり得、１つの領域にまたがり得、国全体にまたがり得、または世界規模であり得る。ネットワークは個人的であり得、プロバイダーにより所有、および管理され得る、またはユーザーが情報を入力および引き出すためにウェブページにアクセスするような、インターネットに基づくサービスとして実施され得る。したがって、ある特定の実施形態では、システムは、ユーザーにとってローカルまたはリモートであり得る１つまたは複数のマシンを含む。１つの場所または複数の場所にある１つ超のマシンに、ユーザーはアクセスでき、データは、連続しておよび／または並行してマッピングおよび／または処理され得る。したがって、適するコンフィグレーションおよび制御を利用して、ローカルネットワーク、リモートネットワーク、および／または「クラウド」コンピューティングプラットフォーム等において、複数のマシンを使用してデータをマッピングおよび／または処理することができる。
システムは、一部の実施形態では、コミュニケーションインターフェースを含み得る。コミュニケーションインターフェースは、コンピュータシステムと１つまたは複数の外部デバイスの間で、ソフトウェアおよびデータを伝送できるようにする。コミュニケーションインターフェースの非限定的な例として、モデム、ネットワークインターフェース（イーサーネットカード等）、コミュニケーションポート、ＰＣＭＣＩＡスロットおよびカード等が挙げられる。コミュニケーションインターフェース経由で伝送したソフトウェアおよびデータは、一般的にシグナルの形態を取り、これは、電子シグナル、電磁気シグナル、光学シグナル、および／またはコミュニケーションインターフェースにより受信され得る他のシグナルであり得る。シグナルは、多くの場合、チャネルを介してコミュニケーションインターフェースに提供される。チャネルは、多くの場合、シグナルを担持し、ワイヤーまたはケーブル、光ファイバー、電話線、携帯電話リンク、ＲＦリンク、および／または他のコミュニケーションチャネルを使用して実施され得る。したがって、１つの例では、コミュニケーションインターフェースは、シグナル検出モジュールにより検出できるシグナル情報を受信するのに使用できる。
データは、マニュアルインプットデバイスまたはダイレクトデータ入力デバイス（ＤＤＥ）を含むが、これらに限定されない、適するデバイスおよび／または方法によりインプットできる。マニュアルデバイスの非限定的な例として、キーボード、コンセプトキーボード、タッチ感応式スクリーン、ライトペン、マウス、トラックボール、ジョイスティック、グラフィックタブレット、スキャナー、デジタルカメラ、ビデオデジタイザー、および音声認識デバイスが挙げられる。ＤＤＥの非限定的な例として、バーコードリーダー、磁気ストリップコード、スマートカード、磁気インク文字認識、光学式文字認識、光学式マーク認識、およびターンアラウンドドキュメントが挙げられる。
一部の実施形態では、シーケンサーまたは配列決定マシンからのアウトプットは、インプットデバイス経由のインプットとなり得るデータとしての役割を果たすことができる。ある特定の実施形態では、マッピングされた配列の読取りは、インプットデバイス経由のインプットとなり得るデータとしての役割を果たすことができる。ある特定の実施形態では、核酸断片のサイズ（例えば、長さ）は、入力デバイスを介して入力されうるデータとして働きうる。ある特定の実施形態では、核酸捕捉処理からの出力（例えば、ゲノム領域の起源データ）は、入力デバイスを介して入力されうるデータとして働きうる。ある特定の実施形態では、核酸断片のサイズ（例えば、長さ）と、核酸捕捉処理からの出力（例えば、ゲノム領域の起源データ）との組合せは、入力デバイスを介して入力されうるデータとして働きうる。ある特定の実施形態では、シミュレートしたデータは、インシリコ処理により生成され、またシミュレートしたデータは、インプットデバイス経由のインプットとなり得るデータとしての役割を果たす。用語「インシリコ」とは、コンピュータを使用して行う研究および実験を指す。インシリコ処理は、本明細書に記載する処理により、配列の読取りをマッピングすること、およびマッピングされた配列の読取りを処理することを含むが、これらに限定されない。
システムには、本明細書に記載する処理を行うために有用なソフトウェアを含むことができ、ソフトウェアは、かかる処理を行う１つまたは複数のモジュールを含み得る（例えば、配列決定モジュール、論理処理モジュール、データディスプレイ組織化モジュール）。用語「ソフトウェア」は、コンピュータにより実行されると、コンピュータ操作を行う、コンピュータ可読プログラムのインストラクションを指す。１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能なインストラクションは、実行されると、１つまたは複数のマイクロプロセッサに本明細書に記載する方法を実施させることができる実行可能なコードとして提供される場合もある。本明細書に記載するモジュールは、ソフトウェアとして存在し得、ソフトウェアに組み入れたインストラクション（例えば、プロセス、ルーチン、サブルーチン）が、マイクロプロセッサにより実施または行われ得る。例えば、モジュール（例えば、ソフトウェアモジュール）は、特定の処理またはタスクを行うプログラムの一部分であり得る。用語「モジュール」は、より大型のマシンまたはソフトウェアシステムで使用できる自己内蔵機能ユニットを指す。モジュールは、モジュールの機能を実施する一連のインストラクションを含み得る。モジュールは、データおよび／または情報を変換することができる。データおよび／または情報は、適する形態であり得る。例えば、データおよび／または情報は、デジタルまたはアナログであり得る。ある特定の実施形態では、データおよび／または情報は、時には、パケット、バイト、符号、またはビットであり得る。一部の実施形態では、データおよび／または情報は、任意の収集された、集積された、または使用可能なデータまたは情報であり得る。データおよび／または情報の非限定的な例として、適する媒体、画像、ビデオ、音声（例えば、周波数、可聴または非可聴）、番号、定数、値、物体、時間、機能、インストラクション、マップ、参照、配列、読取り、マッピングされた読取り、レベル、範囲、閾、シグナル、ディスプレイ、表示、またはそれらの変換物が挙げられる。モジュールは、データおよび／または情報を受け入れまたは受信し、データおよび／または情報を第２の形態に変換し、第２の形態をマシン、周辺機器、コンポーネント、または別のモジュールに提供または伝送することができる。モジュールは、１つまたは複数の下記の非限定的な機能を行うことができる：例えば、配列の読取りをマッピングする、カウントを提供する、部分を集積する、レベルを提供するまたは決定する、カウントプロファイルを提供する、正規化する（例えば、読取りを正規化する、カウントを正規化する等）、正規化されたカウントプロファイルまたは正規化されたカウントのレベルを提供する、２つまたはそれ超のレベルを比較する、不確実性値を得る、期待されるレベルおよび期待される範囲（例えば、期待されるレベル範囲、閾範囲、および閾レベル）を提供するまたは決定する、レベルに調整を施す（例えば、第１のレベルの調整、第２のレベルの調整、染色体もしくはそのセグメントのプロファイルの調整、および／またはパディング）、識別情報を提供する（例えば、コピー数の変動、遺伝子の変動、または異数性を同定する）、分類する、プロットする、および／またはアウトカムを決定する。マイクロプロセッサは、ある特定の実施形態では、モジュール内でインストラクションを実施することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数のマイクロプロセッサは、モジュールまたはモジュール群内でインストラクションを実施するように要求される。モジュールは、データおよび／または情報を別のモジュール、マシン、またはソースに提供することができ、ならびにデータおよび／または情報を別のモジュール、マシン、またはソースから受信することができる。
コンピュータプログラム産物は、実体的なコンピュータ可読媒体に組み入れる場合もあれば、また非一時的コンピュータ可読媒体に実体的に組み入れる場合もある。モジュールは、コンピュータ可読媒体（例えば、ディスク、ドライブ）上またはメモリ（例えば、ランダムアクセスメモリ）内に保管される場合もある。モジュールからのインストラクションを実施することができるモジュールおよびマイクロプロセッサは、あるマシン内または異なるマシン内に所在し得る。モジュールに関するインストラクションを実施することができるモジュールおよび／またはマイクロプロセッサは、ユーザーと同じ場所（例えば、ローカルネットワーク）、またはユーザーとは異なる場所（例えば、リモートネットワーク、クラウドシステム）に所在し得る。方法が、２つまたはそれ超のモジュールと併せて実施される複数の実施形態では、モジュールは、同一マシン内に所在してもよく、１つまたは複数のモジュールは、物理的な場所が同一である異なるマシン内に所在してもよく、１つまたは複数のモジュールは、物理的な場所が異なる、異なるマシン内に所在してもよい。
マシンは、一部の実施形態では、モジュール内のインストラクションを実施する少なくとも１つのマイクロプロセッサを含む。参照ゲノムの部分に対してマッピングされた配列の読取りのカウントには、本明細書に記載する方法を実施するように構成されたインストラクションを実行するマイクロプロセッサからアクセスする場合がある。マイクロプロセッサがアクセスするカウントは、システムのメモリ内にあってもよく、カウントは、その取得後にアクセス可能およびシステムのメモリ内に配置可能である。一部の実施形態では、マシンはマイクロプロセッサ（例えば、１つまたは複数のマイクロプロセッサ）を含み、マイクロプロセッサは、モジュールからの１つまたは複数のインストラクション（例えば、プロセス、ルーチン、および／またはサブルーチン）を行うおよび／また実施することができる。一部の実施形態では、マシンは、並行同調作業型のマイクロプロセッサ（ｍｉｃｒｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒｓ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ ａｎｄ ｗｏｒｋｉｎｇ ｉｎ ｐａｒａｌｌｅｌ）等の複数のマイクロプロセッサを含む。一部の実施形態では、装置は、１つまたは複数の外部マイクロプロセッサ（例えば、内部または外部のネットワーク、サーバー、保管デバイス、および／または保管ネットワーク（例えば、クラウド））と共に稼働する。一部の実施形態では、マシンはモジュールを含む。ある特定の実施形態では、マシンは、１つまたは複数のモジュールを含む。モジュールを含むマシンは、多くの場合、１つまたは複数のデータおよび／または情報を、他のモジュールから受信し、またそれに対して伝送することができる。ある特定の実施形態では、マシンは周辺機器および／またはコンポーネントを含む。ある特定の実施形態では、マシンは、データおよび／または情報を、他のモジュール、周辺機器、および／またはコンポーネントに対して、およびこれらから伝送することができる１つまたは複数の周辺機器またはコンポーネントを含み得る。ある特定の実施形態では、マシンは、データおよび／または情報を提供する周辺機器および／またはコンポーネントと相互作動する。ある特定の実施形態では、周辺機器およびコンポーネントは、マシンがある機能を実施するのを支援する、またはモジュールと直接相互作動する。周辺機器および／またはコンポーネントの非限定的な例として、適したコンピュータ周辺機器、Ｉ／Ｏもしくは保管方法、またはデバイス挙げられ、これにはスキャナー、プリンター、ディスプレイ（例えば、モニター、ＬＥＤ、ＬＣＴ、またはＣＲＴ）、カメラ、マイクロフォン、パッド（例えば、ｉｐａｄ、タブレット）、タッチスクリーン、スマートフォン、携帯電話、ＵＳＢ Ｉ／Ｏデバイス、ＵＳＢ大容量記憶デバイス、キーボード、コンピュータマウス、デジタルペン、モデム、ハードドライブ、ジャンプドライブ、フラッシュドライブ、マイクロプロセッサ、サーバー、ＣＤ、ＤＶＤ、グラフィックカード、特殊Ｉ／Ｏデバイス（例えば、シーケンサー、フォトセル、光電子増倍管、光学読取りマシン、センサー等）、１つまたは複数のフローセル、流体ハンドリングコンポーネント、ネットワークインターフェースコントローラー、ＲＯＭ、ＲＡＭ、無線転送方法およびデバイス（ブルートゥース、ＷｉＦｉ等）、ワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）、インターネット、コンピュータおよび／または別のモジュールが含まれるが、これらに限定されない。
ソフトウェアは、多くの場合、コンピュータ可読媒体に記録されているプログラムインストラクションを含有するプログラム産物上に提供され、そのような媒体として、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、および磁気テープを含む磁気媒体；ならびにＣＤ−ＲＯＭディスク、ＤＶＤディスク、光磁気ディスクを含む光学式媒体、フラッシュドライブ、ＲＡＭ、フロッピー（登録商標）ディスク等、およびプログラムインストラクションが記録可能である他のそのような媒体が挙げられるが、これらに限定されない。オンラインで実施する際には、組織により維持されるサーバーおよびウェブサイトは、ソフトウェアダウンロードをリモートユーザーに提供するように構成され得る、またはリモートユーザーは、組織により維持されるリモートシステムにアクセスして、遠隔的にソフトウェアにアクセスすることができる。ソフトウェアはインプット情報を取得または受信することができる。ソフトウェアは、データを具体的に取得または受信するモジュール（例えば、配列の読取りデータおよび／またはマッピングされた読取りデータを受信するデータ受信モジュール）を含み得、データを具体的に処理するモジュール（例えば、受信したデータを処理する処理モジュール（例えば、アウトカムおよび／またはレポートをフィルタリングする、正規化する、提供する））を含み得る。用語、インプット情報を「取得する」および「受信する」とは、ローカルもしくはリモートサイトからコンピュータコミュニケーション手段により、ヒトがデータ入力することにより、または任意の他のデータ受信方法により、データ（例えば、配列の読取り、マッピングされた読取り）を受信することを指す。インプット情報は、受信した場所と同一の場所で生成される場合もあれば、異なる場所で生成され、受信場所に送られる場合もある。一部の実施形態では、インプット情報は、処理される前に修正される（例えば、処理しやすいフォーマット（例えば、表形式）に配置される）。
一部かの実施形態では、コンピュータプログラム産物、例えばコンピュータ可読プログラムコードを組み入れたコンピュータ使用可能媒体を含むコンピュータプログラム産物等が提供され、コンピュータ可読プログラムコードは、実行されたときに、下記ステップを含む方法を実施するように適合されている：（ａ）試験被験体から得た試料核酸の配列の読取りを取得するステップ；（ｂ）（ａ）で得られた配列の読取りを公知のゲノムに対してマッピングするステップであって、公知のゲノムが部分に分割されているステップ；（ｃ）部分内のマッピングされた配列の読取りをカウント計測するステップ；（ｄ）（ｃ）で得られた部分についてのカウントを正規化することにより、試料正規化カウントプロファイルを生成するステップ；および（ｅ）（ｄ）の試料正規化カウントプロファイルから遺伝子の変動の存在または非存在を決定するステップ。
ある特定の実施形態では、ソフトウェアは１つまたは複数のアルゴリズムを含み得る。アルゴリズムは、データを処理するのに、および／または有限列のインストラクションにより、アウトカムまたはレポートを提供するのに使用できる。アルゴリズムは、多くの場合、タスクを完了するための規定されたインストラクションのリストである。初期状態から開始し、インストラクションは、規定された一連の連続した状態を経由して進行し、最終的に最終エンディング状態で終了する演算について記載し得る。１つの状態から次の状態への移行は必ずしも確定的ではない（例えば、一部のアルゴリズムには、偶然性を取り入れている）。例として、アルゴリズムは、非限定的にサーチアルゴリズム、ソーティングアルゴリズム、マージアルゴリズム、数値アルゴリズム、グラフアルゴリズム、ストリングアルゴリズム、モデリングアルゴリズム、計算幾何学アルゴリズム、コンビナトリアルアルゴリズム、機械学習アルゴリズム、クリプトグラフィーアルゴリズム、データ圧縮アルゴリズム、パージングアルゴリズム等であり得る。アルゴリズムは、１つのアルゴリズムまたは組み合わせて作業する２つもしくはそれ超のアルゴリズムを含み得る。アルゴリズムは、任意の適する複雑性クラス、および／またはパラメータ化された複雑性のものであってもよい。アルゴリズムは計算および／またはデータ処理するのに使用することができ、一部の実施形態では、確定的または確率的／予測的なアプローチで使用することができる。アルゴリズムは、適するプログラミング言語を使用することにより、演算環境内で実施可能であり、そのような言語の非限定的な例として、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｐｅｒｌ、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｆｏｒｔｒａｎ等がある。一部の実施形態では、アルゴリズムは、許容誤差、統計分析、統計的有意性、および／または他の情報もしくはデータセットとの比較（例えば、ニューラルネットまたはクラスタリングアルゴリズムを使用する際に適用可能）を含むように構成または修正され得る。
ある特定の実施形態では、いくつかのアルゴリズムが、ソフトウェア内で使用するために実施され得る。これらのアルゴリズムは、一部の実施形態では、未加工データを用いてトレーニング可能である。新しい未加工データ試料毎に、トレーニングされたアルゴリズムは、代表的な処理済みデータセットまたはアウトカムを生成し得る。処理済みのデータセットは、処理された親データセットと比較して複雑性が低減されたものの場合もある。処理済みのセットに基づき、一部の実施形態では、感度および特異性に基づきトレーニングされたアルゴリズムの性能を評価することができる。最高の感度および／または特異性を有するアルゴリズムが、ある特定の実施形態では、同定および利用され得る。
ある特定の実施形態では、シミュレートした（またはシミュレーション）データが、例えばアルゴリズムをトレーニングするまたはアルゴリズムを試験することによりデータ処理を補助することができる。一部の実施形態では、シミュレートしたデータには、配列の読取りの異なるグルーピングの、仮想的な様々なサンプリングが含まれる。シミュレートしたデータでは、何が真の母集団から期待されか、またはアルゴリズムを試験する、および／または正しい分類を割り当てる際に何に歪みが生じ得るか、が基準となり得る。また、シミュレートしたデータは、本明細書では、「仮想」データとも呼ばれる。シミュレーションは、ある特定の実施形態では、コンピュータプログラムにより行われ得る。シミュレートしたデータセットを使用する際の１つの可能なステップは、確認された結果の信頼度を評価すること、例えばランダムサンプリングが、どのくらい良好にオリジナルデータと一致するか、またはオリジナルデータを最好に代表するか、評価することである。１つのアプローチは、確率値（ｐ値）を計算することであり、この値は、ランダム試料が選択された試料より良好なスコアを有する確率を推定する。一部の実施形態では、経験的モデルが評価される場合があり、この場合、少なくとも１つの試料が参照試料と一致することを前提とする（分解変動（ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）の有りまたは無しを問わない）。一部の実施形態では、例えばポアソン分布等の別の分布が、確率分布を規定するのに使用することができる。
システムは、ある特定の実施形態では、１つまたは複数のマイクロプロセッサを含み得る。マイクロプロセッサは、コミュニケーションバスと接続され得る。コンピュータシステムは、メインメモリ、多くの場合ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）を含み得、二次メモリも含むことができる。一部の実施形態では、メモリは、非一時的コンピュータ可読記憶媒体を含む。二次メモリは、例えばハードディスクドライブおよび／またはリムーバブル記憶ドライブを含み得、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光学式ディスクドライブ、メモリカード等がこれに該当し得る。リムーバブル記憶ドライブは、多くの場合、リムーバブルストレージユニットから読み取る、および／またはこれに書き込む。リムーバブルストレージユニットの非限定的な例として、フロッピー（登録商標）ディスク、磁気テープ、光学式ディスク等が挙げられ、例えばリムーバブル記憶ドライブにより、読取りおよび書き込み可能である。リムーバブルストレージユニットは、コンピュータソフトウェアおよび／またはデータを内蔵するコンピュータ使用可能記憶媒体を含み得る。
マイクロプロセッサは、システム内でソフトウェアを実施可能である。一部の実施形態では、プロセッサは、ユーザーが行うことができる、本明細書に記載するタスクを自動的に行うようにプログラムされ得る。したがって、マイクロプロセッサまたはかかるマイクロプロセッサにより実施されるアルゴリズムは、ユーザーによる監視またはインプットを、ほとんどまたはまったく必要としないと考えられる（例えば、ソフトウェアは、機能を自動的に実施するようにプログラムされ得る）。一部の実施形態では、処理はあまりにも複雑であり、一人の個人であっても、また個人の群であっても、遺伝子の変動の存在または非存在を決定するのに十分短いタイムフレーム内で処理を行うことは不可能である。
一部の実施形態では、二次メモリは、コンピュータプログラムまたは他のインストラクションをコンピュータシステムにロードできるようにするために、他の類似した手段を含み得る。例えば、システムは、リムーバブルストレージユニットおよびインターフェースデバイスを含み得る。かかるシステムの非限定的な例として、プログラムカートリッジおよびカートリッジインターフェース（ビデオゲームデバイスに見出されるもの等）、リムーバブルメモリチップ（ＥＰＲＯＭまたはＰＲＯＭ等）、および関連するソケット、ならびにソフトウェアおよびデータをリムーバブルストレージユニットからコンピュータシステムに伝送できるようにする、他のリムーバブルストレージユニットおよびインターフェースが挙げられる。
一部の実施形態では、１つの実体は、配列の読取りのカウントを生成すること、配列の読取りを部分に対してマッピングすること、マッピングされた読取りをカウント計測すること、およびカウントが計測されマッピングされた読取りを、本明細書に記載する方法、システム、マシン、装置、またはコンピュータプログラム産物において利用することができる。ある特定の実施形態では、部分に対してマッピングされた配列の読取りのカウントは、本明細書に記載する方法、システム、マシン、装置、またはコンピュータプログラム産物において、第２の実体が使用するために、１つの実体により、第２の実体に伝送される場合もある。
一部の実施形態では、１つの実体は配列の読取りを生成し、一部の実施形態では、第２の実体はその配列の読取りを参照ゲノム内の部分に対してマッピングする。第２の実体は、マッピングされた読取りをカウント計測し、カウントが計測されマッピングされた読取りを、本明細書に記載する方法、システム、マシン、またはコンピュータプログラム産物において利用する場合がある。ある特定の実施形態では、第２の実体は、マッピングされた読取りを第３の実体に伝送し、第３の実体は、マッピングされた読取りをカウント計測し、マッピングされた読取りを、本明細書に記載する方法、システム、マシン、またはコンピュータプログラム産物において利用する。ある特定の実施形態では、第２の実体は、マッピングされた読取りをカウント計測し、カウントが計測されマッピングされた読取りを第３の実体に伝送し、第３の実体は、カウントが計測されマッピングされた読取りを、本明細書に記載する方法、システム、マシン、またはコンピュータプログラム産物において利用する。第３の実体が関与する実施形態では、第３の実体は、第１の実体と同一である場合もある。すなわち、第１の実体は、配列の読取りを第２の実体に伝送する場合があり、この第２の実体は、参照ゲノム内の部分に対して配列の読取りをマッピングする、および／またはマッピングされた読取りをカウント計測することができ、第２の実体は、マッピングされおよび／またはカウントが計測された読取りを第３の実体に伝送することができる。第３の実体は、マッピングされおよび／またはカウントが計測された読取りを本明細書に記載する方法、システム、マシン、またはコンピュータプログラム産物において利用することができる場合もあり、この場合、第３の実体は第１の実体と同一である場合もあれば、第３の実体は第１または第２の実体とは異なる場合もある。
一部の実施形態では、１つの実体は、妊娠中の雌から血液を取得し、任意選択で血液から（例えば、血漿または血清から）核酸を単離し、核酸から配列の読取りを生成する第２の実体に血液または核酸を移送する。
図２４は、本明細書に記載する様々なシステム、方法、アルゴリズム、およびデータ構造の実施が可能である演算環境５１０の非限定的な例を示す。演算環境５１０は、適する演算環境の１つの例に過ぎず、本明細書に記載するシステム、方法、およびデータ構造の使用の範囲または機能性について何らかの制限を示唆するようには意図されない。また、演算環境５１０は、演算環境５１０に示すコンポーネントの任意の１つまたはその組合せと関連する何らかの依存性または要件を有するものと解釈してはならない。図２４に示すシステム、方法、およびデータ構造のサブセットは、ある特定の実施形態で利用可能である。本明細書に記載するシステム、方法、およびデータ構造は、非常に多くの他の汎用または専用の演算システム環境またはコンフィギュレーションと共に運用可能である。適すると考えられる公知の演算システム、環境、および／またはコンフィギュレーションの例として、パーソナルコンピュータ、サーバーコンピュータ、シンクライアント、シッククライアント、携帯式またはラップトップデバイス、マルチプロセッサシステム、マイクロプロセッサに基づくシステム、セットトップボックス、プログラム可能な民生用電子機器、ネットワークＰＣ、ミニコンピュータ、メインフレームコンピュータ、上記システムまたはデバイスのいずれかを含む分散型演算環境等が挙げられるが、これらに限定されない。
図２４のオペレーティング環境５１０はコンピュータ５２０の形態の汎用演算デバイスを含み、これには、処理ユニット５２１、システムメモリ５２２、およびシステムメモリ５２２を含む様々なシステムコンポーネントを処理ユニット５２１に作動可能に連結させるシステムバス５２３が含まれる。コンピュータ５２０のマイクロプロセッサが、単一の中央処理装置（ＣＰＵ）または並列処理環境と一般的に呼ばれる複数の処理ユニットを含むように、処理ユニット５２１は１つのみ存在し得る、または１つ超存在し得る。コンピュータ５２０は、従来型コンピュータ、分散型コンピュータ、またはあらゆる他の種類のコンピュータであり得る。
システムバス５２３は、メモリバスまたはメモリコントローラー、周辺バス、および様々なバスアーキテクチャーのいずれかを使用するローカルバスを含む、任意の数種類のバス構造であり得る。また、システムメモリは、単にメモリと呼ばれる場合もあり、リードオンリメモリ（ＲＯＭ）５２４およびランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）を含む。立ち上げの間等に、コンピュータ５２０内のエレメント間の情報伝送に役立つ基本ルーチンを含む基本入出力システム（ＢＩＯＳ）５２６は、ＲＯＭ５２４に保管される。コンピュータ５２０は、図示しないがハードディスクから読み出し、これに書き込むハードディスクドライブインターフェース５２７、リムーバブル磁気ディスク５２９から読み出し、これに書き込む磁気ディスクドライブ５２８、およびリムーバブル光学式ディスク５３１、例えばＣＤ ＲＯＭまたは他の光学式媒体から読み出し、これに書き込む光学式ディスクドライブ５３０をさらに含み得る。
ハードディスクドライブ５２７、磁気ディスクドライブ５２８、および光学式ディスクドライブ５３０は、ハードディスクドライブインターフェース５３２、磁気ディスクドライブインターフェース５３３、および光学式ディスクドライブインターフェース５３４により、システムバス５２３とそれぞれ接続される。ドライブおよびその関連するコンピュータ可読媒体は、コンピュータ可読インストラクション、データ構造、プログラムモジュール、およびコンピュータ５２０用の他のデータの不揮発性の保管を提供する。コンピュータがアクセス可能なデータを保管することができる、あらゆる種類のコンピュータ可読媒体、例えば磁気カセット、フラッシュメモリカード、デジタルビデオディスク、ベルヌーイカートリッジ、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）等が、オペレーティング環境内で使用することができる。
いくつかのプログラムモジュールが、オペレーティングシステム５３５、１つまたは複数のアプリケーションプログラム５３６、他のプログラムモジュール５３７、およびプログラムデータ５３８を含む、ハードディスク、磁気ディスク５２９、光学式ディスク５３１、ＲＯＭ５２４、またはＲＡＭ上に保管され得る。ユーザーは、コマンドおよび情報を、インプットデバイス、例えばキーボード５４０およびポインティングデバイス５４２を通じてパーソナルコンピュータ５２０に入力することができる。他のインプットデバイス（図示せず）として、マイクロフォン、ジョイスティック、ゲームパッド、サテライトディシュ、スキャナー等を挙げることができる。これらおよび他のインプットデバイスが、多くの場合、システムバスに連結したシリアルポートインターフェース５４６を経由して処理ユニット５２１と接続されるが、他のインターフェース、例えばパラレルポート、ゲームポート、またはユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）により接続される場合もある。モニター５４７または他の種類のディスプレイデバイスも、インターフェース、例えばビデオアダプター５４８を介してシステムバス５２３と接続される。モニターに加えて、コンピュータは、他の周辺アウトプットデバイス（図示せず）、例えばスピーカーおよびプリンターを一般的に含む。
コンピュータ５２０は、１つまたは複数のリモートコンピュータ、例えばリモートコンピュータ５４９との論理接続を使用して、ネットワーク化した環境内で作動可能である。これらの論理接続は、コンピュータ５２０もしくはその一部と連結しているコミュニケーションデバイスにより、または他の方式で達成され得る。図２４ではメモリストレージデバイス５５０しか示さなかったが、リモートコンピュータ５４９は、別のコンピュータ、サーバー、ルーター、ネットワークＰＣ、クライアント、ピアデバイス、もしくは他の一般的なネットワークノードであり得、コンピュータ５２０と関連して上記エレメントの多くまたは全てを一般的に含む。図２４に示す論理接続として、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）５５１およびワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）５５２が挙げられる。かかるネットワーク環境は、オフィスネットワーク、企業全体のコンピュータネットワーク、イントラネット、およびインターネットでは普通であり、そのいずれも典型的なネットワークである。
ＬＡＮ−ネットワーク環境で使用する場合、コンピュータ５２０は、コミュニケーションデバイスの一種であるネットワークインターフェースまたはアダプター５５３を介してローカルネットワーク５５１と接続される。ＷＡＮ−ネットワーク環境で使用する場合、コンピュータ５２０は、多くの場合、コミュニケーションデバイスの一種であるモデム５５４、またはワイドエリアネットワーク５５２全体にわたりコミュニケーションを確立するために他の任意の種類のコミュニケーションデバイスを含む。モデム５５４は、内部または外部であってもよいが、シリアルポートインターフェース５４６を介してシステムバス５２３と接続される。ネットワーク化された環境では、パーソナルコンピュータ５２０またはその一部と関連して示されるプログラムモジュールは、リモートメモリストレージデバイス内に保管され得る。示すようなネットワーク接続は非限定的な例であり、またコンピュータ間のコミュニケーションリンクを確立するための他のコミュニケーションデバイスも使用することができると認識される。
モジュール
１つまたは複数のモジュールが本明細書に記載する方法で利用可能であり、その非限定的な例として、論理処理モジュール、データディスプレイ組織化モジュール、配列決定モジュール、マッピングモジュール、カウント計測モジュール、フィルタリングモジュール、重み付けモジュール、正規化モジュール、ＧＣ偏りモジュール、レベルモジュール、比較モジュール、範囲設定モジュール、分類モジュール、調整モジュール、プロッティングモジュール、表示モジュール、関係モジュール、アウトカムモジュール、および／またはデータディスプレイ組織化モジュール等、またはその組み合わせが挙げられる。モジュールは、マイクロプロセッサにより管理される場合もある。ある特定の実施形態では、モジュールまたは１つもしくは複数のモジュールを含むマシンは、別のモジュール、マシン、コンポーネント、周辺機器、またはマシンのオペレーターに、またはそれらから、データおよび／または情報を収集、集積、受信、取得、アクセス、回収、提供、および／または伝送する。一部の実施形態では、データおよび／または情報（例えば、配列決定の読取り）は、下記の１つまたは複数を含むマシンによりモジュールに提供される：１つまたは複数のフローセル、カメラ、検出器（例えば、光検出器、フォトセル、電気的検出器（例えば、振幅変調検出器、周波数および位相変調検出器、位相ロックループ検出器）、カウンター、センサー（例えば、圧力、温度、容積、フロー、重量のセンサー）、流体ハンドリングデバイス、プリンター、ディスプレイ（例えば、ＬＥＤ、ＬＣＴ、またはＣＲＴ）等またはその組合せ。例えば、マシンのオペレーターは、定数、閾値、式、または所定の値をモジュールに提供する場合もある。モジュールは、多くの場合、データおよび／または情報を、別のモジュールもしくはマシンに、またはそれから伝送するように構成される。モジュールは、別のモジュールからデータおよび／または情報を受信することができ、その非限定的な例として、論理処理モジュール、データディスプレイ組織化モジュール、配列決定モジュール、マッピングモジュール、カウント計測モジュール、フィルタリングモジュール、重み付けモジュール、正規化モジュール、ＧＣ偏りモジュール、レベルモジュール、比較モジュール、範囲設定モジュール、分類モジュール、調整モジュール、プロッティングモジュール、表示モジュール、関係モジュール、アウトカムモジュール、および／またはデータディスプレイ組織化モジュール等またはその組合せが挙げられる。モジュールは、データおよび／または情報を操作および／または変換することができる。モジュールに由来する、またはモジュールにより変換されたデータおよび／または情報は、別の適するマシンおよび／またはモジュールに伝送することができ、その非限定的な例として、論理処理モジュール、配列決定モジュール、マッピングモジュール、カウント計測モジュール、フィルタリングモジュール、重み付けモジュール、正規化モジュール、ＧＣ偏りモジュール、レベルモジュール、比較モジュール、範囲設定モジュール、分類モジュール、プロッティングモジュール、表示モジュール、関係モジュール、アウトカムモジュール、および／またはデータディスプレイ組織化モジュール等またはその組合せが挙げられる。モジュールを含むマシンは、少なくとも１つのマイクロプロセッサを含み得る。一部の実施形態では、データおよび／または情報は、モジュールを含むマシンにより受信および／または提供される。モジュールを含むマシンは、マイクロプロセッサを含むことができ（例えば、１つまたは複数のマイクロプロセッサ）、そのようなマイクロプロセッサは、モジュールの１つまたは複数のインストラクション（例えば、プロセス、ルーチン、および／またはサブルーチン）を行うおよび／または実施することができる。一部の実施形態では、モジュールは、１つまたは複数の外部マイクロプロセッサ（例えば、内部または外部のネットワーク、サーバー、ストレージデバイス、および／またはストレージネットワーク（例えば、クラウド））と共に作動する。
論理処理モジュール
ある特定の実施形態では、論理処理モジュールは、データおよび／もしくは情報を、またはデータおよび／もしくは情報の、１つもしくは複数のその他のモジュール、周辺機器、もしくはデバイスへの、およびそれからの伝送を、統合、管理、制限、組織化、命令、分配、分割、変換、および／もしくは制御する。
データディスプレイ組織化モジュール
ある特定の実施形態では、データディスプレイ組織化モジュールは、データおよび／または情報を適する可視的媒体へと処理および／または変換するが、その媒体の非限定的な例として、画像、ビデオおよび／またはテキスト（例えば、数字、文字、およびシンボル）が挙げられる。一部の実施形態では、データディスプレイ組織化モジュールは、適するディスプレイ（例えば、モニター、ＬＥＤ、ＬＣＤ、ＣＲＴ等、またはその組合せ）、プリンター、適する周辺機器、またはデバイス上に表示するために、データおよび／または情報を、処理、変換、および／または伝送する。一部の実施形態では、データディスプレイ組織化モジュールは、胎児または母体のゲノム、染色体、またはその一部分のデータおよび／または情報を可視的表示に処理、変換する。
配列決定モジュール
一部の実施形態では、配列モジュールは、配列の読取りを取得、生成、収集、集積、操作、変換、処理、変換、および／または伝送する。「配列受信モジュール」は、本明細書で使用する場合、「配列決定モジュール」と同じである。配列決定モジュールを含むマシンは、当技術分野において公知の配列決定技術を利用して核酸の配列を決定するあらゆるマシンであり得る。一部の実施形態では、配列決定モジュールは、配列の読取りを整列、集積、断片化、相補、逆相補、エラーチェック、またはエラー修正することができる。
マッピングモジュール
配列の読取りは、マッピングモジュールにより、またはマッピングモジュールを含むマシンによりマッピング可能であり、このマッピングモジュールは、一般的に、参照ゲノムまたはそのセグメントに対して読取りをマッピングする。マッピングモジュールは、配列決定の読取りを、当技術分野において公知の適する方法によりマッピング可能である。一部の実施形態では、マッピングモジュールまたはマッピングモジュールを含むマシンは、マッピングされた配列の読取りを提供するように要求される。
カウント計測モジュール
カウントは、カウント計測モジュールまたはカウント計測モジュールを含むマシンにより提供され得る。一部の実施形態では、カウント計測モジュールは、参照ゲノムに対してマッピングされた配列の読取りをカウント計測する。一部の実施形態では、カウント計測モジュールは、当技術分野において公知のカウント計測法により、カウントを生成、集積、および／または提供する。一部の実施形態では、カウント計測モジュールまたはカウント計測モジュールを含むマシンは、カウントを提供するように要求される。
フィルタリングモジュール
フィルタリング部分（例えば、参照ゲノムの部分）は、フィルタリングモジュールにより（例えば、フィルタリングモジュールを含むマシンにより）提供され得る。一部の実施形態では、フィルタリングモジュールは、フィルタリングされた部分のデータ（例えば、フィルタリングされた部分）を提供する、および／または検討事項から部分を除去するように要求される。ある特定の実施形態では、フィルタリングモジュールは、部分に対してマッピングされたカウントを検討事項から除去する。ある特定の実施形態では、フィルタリングモジュールは、部分に対してマッピングされたカウントを、レベルまたはプロファイルの決定から除去する。フィルタリングモジュールは、当技術分野において公知の、または本明細書に記載する１つまたは複数のフィルタリング法により、データ（例えば、カウント、部分に対してマッピングされたカウント、部分、部分のレベル、正規化されたカウント、未加工のカウント等）をフィルタリングすることができる。
重み付けモジュール
重み付け部分（例えば、参照ゲノムの部分）は、重み付けモジュールにより（例えば、重み付けモジュールを含むマシンにより）提供され得る。一部の実施形態では、重み付けモジュールは、ゲノム区分を重み付けする、および／または重み付けされた部分の値を提供するように要求される。重み付けモジュールは、当技術分野において公知の、または本明細書に記載する１つまたは複数の重み付け法により、部分を重み付けすることができる。
正規化モジュール
正規化されたデータ（例えば、正規化されたカウント）は、正規化モジュールにより（例えば、正規化モジュールを含むマシンにより）提供され得る。一部の実施形態では、正規化モジュールは、配列決定の読取りから得られた正規化されたデータ（例えば、正規化されたカウント）を提供するように要求される。正規化モジュールは、本明細書に記載する、または当技術分野において公知の１つまたは複数の正規化法（例えば、ＰＥＲＵＮ、ハイブリッド式の正規化等またはその組合せ）により、データ（例えば、カウント、フィルタリングされたカウント、未加工のカウント）を正規化することができる。
ＧＣ偏りモジュール
ＧＣの偏りを決定すること（例えば、参照ゲノムの部分（例えば、部分、参照ゲノムの部分）のそれぞれについてＧＣの偏りを決定すること）は、ＧＣ偏りモジュールにより（例えば、ＧＣ偏りモジュールを含むマシンにより）提供され得る。一部の実施形態では、ＧＣ偏りモジュールは、ＧＣの偏りの決定を提供するように要求される。一部の実施形態では、ＧＣ偏りモジュールは、参照ゲノムの部分のそれぞれに対してマッピングした配列の読取りのカウントと各部分のＧＣ含有量との間で適合させた関係（例えば、線形適合関係）からＧＣの偏りの決定を提供する。ＧＣ偏りモジュールは、正規化モジュール（例えば、ＰＥＲＵＮ正規化モジュール）の一部分である場合もある。
レベルモジュール
参照ゲノムの部分についてレベル（例えば、レベル）を決定すること、および／またはゲノム区分のレベルを計算することプは、レベルモジュールにより（例えば、レベルモジュールを含むマシンにより）提供され得る。一部の実施形態では、レベルモジュールは、レベルまたは計算されたゲノム区分のレベル（例えば、等式Ａ、Ｂ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、および／またはＱによる）を提供するように要求される。一部の実施形態では、レベルモジュールは、ＧＣの偏りと参照ゲノムの部分のそれぞれに対してマッピングした配列の読取りのカウントとの間で適合させた関係（例えば、線形適合関係）からレベルを提供する。一部の実施形態では、レベルモジュールは、ＰＥＲＵＮの一部分としてゲノム区分のレベルを計算する。一部の実施形態では、レベルモジュールは、等式Ｌｉ＝（ｍｉ−ＧｉＳ）Ｉ−１により、ゲノム区分のレベル（すなわち、Ｌｉ）を提供し、式中ＧｉはＧＣの偏り、ｍｉは参照ゲノムの各部分に対してマッピングした測定カウントであり、ｉは試料であり、Ｉは、ＧＣの偏りと参照ゲノムの部分のそれぞれに対してマッピングした配列の読取りのカウントとの間で適合させた関係（例えば、線形適合関係）の切片、Ｓは、それの勾配である。
比較モジュール
第１のレベルは、比較モジュールまたは比較モジュールを含むマシンにより、第２のレベルとは有意に異なるものとして同定され得る。一部の実施形態では、比較モジュールまたは比較モジュールを含むマシンは、２つレベル間の比較を提供するように要求される。
範囲設定モジュール
様々なコピー数の変動（例えば、重複、挿入、および／または欠失）に関する期待される範囲（例えば、期待されるレベル範囲）、またはコピー数の変動が存在しない範囲は、範囲設定モジュールまたは範囲設定モジュールを含むマシンにより提供され得る。ある特定の実施形態では、期待されるレベルは、範囲設定モジュールまたは範囲設定モジュールを含むマシンにより提供される。一部の実施形態では、範囲設定モジュールまたは範囲設定モジュールを含むマシンは、期待されるレベルおよび／または範囲を提供するように要求される。
分類モジュール
コピー数の変動（例えば、母体および／または胎児のコピー数の変動、胎児のコピー数の変動、重複、挿入、欠失）は、分類モジュールまたは分類モジュールを含むマシンにより分類され得る。ある特定の実施形態では、コピー数の変動（例えば、母体および／または胎児のコピー数の変動）は、分類モジュールにより分類される。ある特定の実施形態では、別のレベル（例えば、第２のレベル）とは有意に異なると決定されたレベル（例えば、第１のレベル）は、分類モジュールによりコピー数の変動を表わすものとして同定される。ある特定の実施形態では、コピー数の変動の非存在が分類モジュールにより決定される。一部の実施形態では、コピー数の変動の決定は、分類モジュールを含むマシンにより決定され得る。分類モジュールは、母体および／または胎児のコピー数の変動、胎児のコピー数の変動、重複、欠失、または挿入もしくはその欠如、または上記のものの組合せを分類することに特化し得る。例えば、母体の欠失を同定する分類モジュールは、胎児の重複を同定する分類モジュールとは異なるおよび／または相違し得る。一部の実施形態では、分類モジュールまたは分類モジュールを含むマシンは、コピー数の変動を同定すること、またはコピー数の変動を決定するアウトカムが要求される。
調整モジュール
一部の実施形態では、レベルの調整（例えば、ゲノム区分のレベル、プロファイルのレベル、コピー数の変動のレベル、１つもしくは複数の部分のレベルなど、またはこれらの組合せに対する調整）は、調整モジュールまたは調整モジュールを含むマシンにより行う。一部の実施形態では、調整モジュールまたは調整モジュールを含むマシンは、レベルを調整するように要求される。本明細書で記載される方法により調整されたレベルは、さらなる試験により（例えば、母体核酸および／または胎児核酸の標的化配列決定により）、独立に確認および／または調整することができる。
プロッティングモジュール
一部の実施形態では、プロッティングモジュールは、データおよび／または情報を適する可視的媒体へと処理および／または変換するが、その非限定的な例として、チャート、プロット、グラフ等またはその組合せが挙げられる。一部の実施形態では、プロッティングモジュールは、適するディスプレイ（例えば、モニター、ＬＥＤ、ＬＣＤ、ＣＲＴ等またはその組合せ）、プリンター、適する周辺機器、またはデバイス上に表示するために、データおよび／または情報を処理、変換、および／または伝送する。ある特定の実施形態では、プロッティングモジュールは、カウント、レベル、および／またはプロファイルのビジュアルディスプレイを提供する。一部の実施形態では、データディスプレイ組織化モジュールが、データおよび／または情報を、胎児または母体のゲノム、染色体、またはその一部分について、可視的表示へと処理、変換する。
一部の実施形態では、プロッティングモジュールまたはプロッティングモジュールを含むマシンは、カウント、レベル、またはプロファイルをプロットするように要求される。
関係モジュール
ある特定の実施形態では、関係モジュールが、データおよび／または情報を、関係へと処理および／または変換する。ある特定の実施形態では、関係は、関係モジュールにより生成されるおよび／またはこれから伝送される。
アウトカムモジュール
遺伝子の変動の存在または非存在（異数性、胎児の異数性、コピー数の変動）は、一部の実施形態では、アウトカムモジュールまたはアウトカムモジュールを含むマシンにより同定される。ある特定の実施形態では、遺伝子の変動は、アウトカムモジュールにより同定される。多くの場合、異数性の存在または非存在の決定は、アウトカムモジュールにより同定される。一部の実施形態では、遺伝子の変動（異数性、コピー数の変動）の決定因のアウトカムは、アウトカムモジュールまたはアウトカムモジュールを含むマシンにより同定され得る。アウトカムモジュールは、特異的な遺伝子の変動（例えば、トリソミー、トリソミー２１、トリソミー１８）の決定に特化し得る。例えば、トリソミー２１を同定するアウトカムモジュールは、トリソミー１８を同定するアウトカムモジュールとは異なるおよび／または相違し得る。一部の実施形態では、アウトカムモジュールまたはアウトカムモジュールを含むマシンは、遺伝子の変動または遺伝子の変動の決定因のアウトカム（例えば、異数性、コピー数の変動）を同定するように要求される。本明細書に記載する方法により同定される遺伝子の変動または遺伝子の変動の決定因のアウトカムは、さらなる試験により（例えば、母体および／または胎児の核酸の標的化配列決定法により）独立して確かめ得る。
変換
上記のように、データは１つの形態から別の形態に変換される場合もある。用語「変換された」、「変換」、およびその文法的な派生物または同等物は、本明細書で使用する場合、身体の出発材料（例えば、試験被験体および／または参照被験体試料の核酸）から身体の出発材料のデジタル表示（例えば、配列の読取りデータ）へのデータの変更を指し、一部の実施形態では、アウトカム（例えば、胎児フラクションの決定または試験試料の推定）を提供するのに利用できる１つもしくは複数の数値への、またはデジタル表示の図形表示へのさらなる変換を含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の数値および／またはデジタル的に表示されたデータの図形表示は、試験被験体の身体のゲノムの状況を表すのに利用できる（例えば、ゲノムの挿入、重複、または欠失の存在または非存在を仮想的に表すまたは可視的に表す；医学的状態と関連した配列の物理量の変動の存在または非存在を表す）。仮想表示は、１つもしくは複数の数値、または出発材料のデジタル表示の図形表示にさらに変換される場合もある。これらの方法は、身体の出発材料を、数値もしくは図形表示に、または試験被験体ゲノムの物理的状況表示に変換することができる。
一部の実施形態では、データセットを変換すると、データの複雑性および／またはデータの次元数が低減し、これによりアウトカムの提供が容易になる。データセットの複雑性は、身体の出発材料を出発材料の仮想表示に変換する処理の間に低減する場合もある（例えば、身体の出発材料を表わす配列の読取り）。適する特性または変数が、データセットの複雑性および／または次元数を低減するのに利用できる。データ処理するための標的特性として使用するのに選択できる特性の非限定的な例として、ＧＣ含有量、胎児の性別予測、断片サイズ（ＣＣＦ断片の長さ、読取りまたはその適切な表示）染色体異数性の同定、特定の遺伝子またはタンパク質の同定、がん、疾患、遺伝性の遺伝子／特性、染色体異常の同定、生物学的カテゴリー、化学的カテゴリー、生化学的カテゴリー、遺伝子またはタンパク質のカテゴリー、遺伝子オントロジー、タンパク質オントロジー、共制御された遺伝子、細胞シグナル伝達遺伝子、細胞周期遺伝子、上記遺伝子に関連するタンパク質、遺伝子変異体、タンパク質変異体、共制御された遺伝子、共制御されたタンパク質、アミノ酸配列、ヌクレオチド配列、タンパク質構造データ等、および上記のものの組合せが挙げられる。データセットの複雑性および／または次元数の低減に関する非限定的な例として；複数の配列読取りをプロファイルプロットに低減化すること、複数の配列読取りを数値に低減化すること（例えば、値、Ｚスコア、ｐ値の正規化）；複数の分析方法を確率プロットまたは単一ポイントに低減化すること；導き出された数量の主成分分析等、またはその組合せが挙げられる。
ある特定のシステム、マシン、およびコンピュータプログラム産物の実施形態
ある特定の態様では、遺伝子の変動の存在または非存在を決定するための、コンピュータにより実施される方法であって、（ａ）参照ゲノムのゲノム区分へとマッピングしたヌクレオチド配列の読取りのカウントを得るステップであって、配列の読取りが、（ｉ）妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取り、および（ｉｉ）選択された断片の長さ未満の長さを有する核酸断片に由来する読取りである、ステップと、（ｂ）カウントを正規化し、これにより、ゲノム区分へとマッピングした配列の読取りの正規化されたカウントを生成するステップと、（ｃ）遺伝子の変動の存在または非存在を、正規化されたカウントに従って決定するステップとを含む方法が提供される。
ある特定の態様ではまた、１つまたは複数のマイクロプロセッサおよびメモリを含むシステムであって、メモリが、１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な命令を含み、メモリが、参照ゲノムのゲノム区分へとマッピングしたヌクレオチド配列の読取りのカウントを含み、配列の読取りが、（ｉ）妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取り、および（ｉｉ）選択された断片の長さ未満の長さを有する核酸断片に由来する読取りであり、１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な命令が、（ａ）カウントを正規化し、これにより、ゲノム区分へとマッピングした配列の読取りの正規化されたカウントを生成し、（ｂ）遺伝子の変動の存在または非存在を、正規化されたカウントに従って決定するように構成されている、システムも提供される。
ある特定の態様ではまた、１つまたは複数のマイクロプロセッサおよびメモリを含むマシンであって、メモリが、１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な命令を含み、メモリが、参照ゲノムのゲノム区分へとマッピングしたヌクレオチド配列の読取りのカウントを含み、配列の読取りが、（ｉ）妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取り、および（ｉｉ）選択された断片の長さ未満の長さを有する核酸断片に由来する読取りであり、１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な命令が、（ａ）カウントを正規化し、これにより、ゲノム区分へとマッピングした配列の読取りの正規化されたカウントを生成し、（ｂ）遺伝子の変動の存在または非存在を、正規化されたカウントに従って決定するように構成されている、マシンも提供される。
ある特定の実施形態ではまた、コンピュータ可読媒体上で実体的に組み入れたコンピュータプログラム産物であって、１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行されると、（ａ）参照ゲノムのゲノム区分へとマッピングしたヌクレオチド配列の読取りのカウントにアクセスし、配列の読取りが、（ｉ）妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取り、および（ｉｉ）選択された断片の長さ未満の長さを有する核酸断片に由来する読取りであり、（ｂ）カウントを正規化し、これにより、ゲノム区分へとマッピングした配列の読取りの正規化されたカウントを生成し、（ｃ）遺伝子の変動の存在または非存在を、正規化されたカウントに従って決定するように構成されている命令を含む、コンピュータプログラム産物も提供される。
本明細書ではまた、１つまたは複数のマイクロプロセッサおよびメモリを含むシステムであって、メモリが、１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な命令を含み、メモリが、参照ゲノムの部分へとマッピングしたヌクレオチド配列の読取りを含み、配列の読取りが、妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取りであり、１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な命令が、（ａ）マイクロプロセッサを使用して、（ｉ）各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または（ｉｉ）他の部分特異的パラメータを、部分特異的な胎児核酸のフラクションへと、各部分と独立に関連する重み付け係数に従って重み付けし、これにより、部分特異的胎児フラクションの推定値を、重み付け係数に従って提示し、ここで、重み付け係数の各々が、（ｉ）複数の試料の各々についての胎児核酸のフラクションと、（ｉｉ）複数の試料についての、各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または他の部分特異的パラメータとの、各部分について適合させた関係から決定されており、（ｂ）胎児核酸のフラクションを、試験試料について、部分特異的胎児フラクションの推定値に基づき推定するように構成されている、システムも提供される。
本明細書ではまた、１つまたは複数のマイクロプロセッサおよびメモリを含むマシンであって、メモリが、１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な命令を含み、メモリが、参照ゲノムの部分へとマッピングしたヌクレオチド配列の読取りを含み、配列の読取りが、妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取りであり、１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な命令が、（ａ）マイクロプロセッサを使用して、（ｉ）各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または（ｉｉ）他の部分特異的パラメータを、部分特異的な胎児核酸のフラクションへと、各部分と独立に関連する重み付け係数に従って重み付けし、これにより、部分特異的胎児フラクションの推定値を、重み付け係数に従って提示し、ここで、重み付け係数の各々が、（ｉ）複数の試料の各々についての胎児核酸のフラクションと、（ｉｉ）複数の試料についての、各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または他の部分特異的パラメータとの、各部分について適合させた関係から決定されており、（ｂ）胎児核酸のフラクションを、試験試料について、部分特異的胎児フラクションの推定値に基づき推定するように構成されている、マシンも提供される。
本明細書ではまた、実行可能なプログラムをその上に内蔵した非一時的なコンピュータ可読記憶媒体であって、プログラムが、マイクロプロセッサに、以下を行う：（ａ）参照ゲノムの部分へとマッピングしたヌクレオチド配列の読取りにアクセスし、配列の読取りが、妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取りであり、（ｂ）マイクロプロセッサを使用して、（ｉ）各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または（ｉｉ）他の部分特異的パラメータを、部分特異的な胎児核酸のフラクションへと、各部分と独立に関連する重み付け係数に従って重み付けし、これにより、部分特異的胎児フラクションの推定値を、重み付け係数に従って提示し、ここで、重み付け係数の各々が、（ｉ）複数の試料の各々についての胎児核酸のフラクションと、（ｉｉ）複数の試料についての、各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または他の部分特異的パラメータとの、各部分について適合させた関係から決定されており、（ｃ）胎児核酸のフラクションを、試験試料について、部分特異的胎児フラクションの推定値に基づき推定するように命令する、非一時的なコンピュータ可読記憶媒体も提供される。
ある特定の実施形態では、システム、マシン、および／または、コンピュータプログラム産物は、参照ゲノムのゲノム区分またはその部分（例えば、ゲノム区分のサブセット、ゲノム区分の選択されたセット）へとマッピングした読取りをカウントするように構成されているカウント計測モジュールを含む。カウント計測モジュールは、選択された断片の長さ未満の長さを有する核酸断片に由来する読取りをカウントするように構成されていることが多い。カウントは、場合によって、未加工のカウント、フィルタリングされたカウント、正規化されたカウント、または前出の組合せである。一部の実施形態では、カウント計測モジュールにより、例えば、本明細書で記載されるまたは当技術分野で公知の、任意の適切な正規化処理を使用して、カウントを正規化することができる。
一部の実施形態では、システム、マシン、および／または、コンピュータプログラム産物は、カウント比較モジュールを含む。カウント比較モジュールは、カウント計測モジュールによりカウントされた読取りのカウント数を比較し、これにより、カウントの比較を行うように構成されていることが多い。カウント比較モジュールは、読取りのカウント（例えば、カウント計測モジュールまたは正規化モジュールに由来する）にアクセスし、これを受信し、これを活用し、これを保存し、これを検索し、かつ／またはこれを整列させるように構成されていることが多い。カウント比較モジュールは、その比較の非限定的な例が、単純な比較（例えば、第２のゲノム区分のセットと比較した、第１のゲノム区分のセットへとマッピングした読取りのカウントの間の一致または不一致）、数学的比較（例えば、比、百分率）、統計学的比較（例えば、複数の比較、複数の検定、標準化（例えば、ｚスコア分析））など、およびこれらの組合せを含む、カウントの間の適切な比較をもたらすように構成されていることが多い。適切なカウントの比較値は、その非限定的な例が、カウント、比、百分率、ｚスコア、分散または不確定性（例えば、標準偏差、中央値の絶対偏差、信頼区間）の尺度を加味した値など、およびこれらの組合せの間の一致の存在または非存在を含む、カウント比較モジュールによりもたらすことができる。カウント比較モジュールは、場合によって、比較値を、例えば、遺伝子変動モジュール、ディスプレイマシン、またはプリンターマシンなど、別のモジュールまたはマシンへと伝送するように構成されている。
ある特定の実施形態では、システム、マシン、および／または、コンピュータプログラム産物は、遺伝子変動モジュールを含む。遺伝子変動モジュールは、場合によって、参照ゲノムのゲノム区分へとマッピングした読取りのカウントに従って、遺伝子の変動の存在または非存在の決定をもたらすように構成されている。遺伝子変動モジュールは、場合によって、カウントの比較に従って、遺伝子の変動の存在または非存在の決定をもたらすように構成されている。遺伝子変動モジュールは、カウント比較モジュールに由来する１つまたは複数の比較および／またはカウント計測モジュールに由来するカウントにアクセスし、これを受信し、これを活用し、これを保存し、これを検索し、かつ／またはこれを整列させるように構成されていることが多い。遺伝子変動モジュールにより、適切な様式で、遺伝子の変動の存在または非存在を、１つまたは複数の比較から決定することもでき、カウントから決定することもできる。遺伝子変動モジュールでは、場合によって、参照ゲノム中のゲノム区分の異なるセットについてのカウントの間に有意差が存在するのかどうかを決定する。差の有意性は、遺伝子変動モジュールにより、適切な様式（例えば、パーセントの差、ｚスコア分析）で決定することができる。遺伝子変動モジュールでは、場合によって、カウントの決定またはカウントの比較が、特定の部類内にあるのかどうかを決定する。例えば、遺伝子変動モジュールにより、特定の比較を、正倍数体の決定と関連する特定の比の閾もしくは比の範囲に、または異数体の決定と関連する特定の比の閾もしくは比の範囲に分類することができる。別の非限定的な例では、遺伝子変動モジュールにより、特定のカウントの決定を、正倍数体の決定と関連する特定のカウントの閾もしくはカウントの範囲に、または異数体の決定と関連する特定のカウントの閾もしくはカウントの範囲に分類することができる。遺伝子変動モジュールにより、適切なフォーマットで、アウトカムをもたらすことができ、これは、場合によって、遺伝子の変動に関連する判定であって、任意選択で、分散または不確定性の尺度（例えば、標準偏差、中央値の絶対偏差）、精度（例えば、特定の信頼区間内の）と関連する判定である。遺伝子変動モジュールは、場合によって、遺伝子の変動の存在または非存在の決定を、別のモジュール、または、ディスプレイマシンもしくはプリンターなど、別のマシンへと伝送するように構成されている。
本明細書で記載されるモジュール（例えば、参照比較モジュール）を含むマシンまたはシステムは、１つまたは複数のマイクロプロセッサを含みうる。一部の実施形態では、マシンまたはシステムは、平行して協調し、働く、マイクロプロセッサなど、複数のマイクロプロセッサを含みうる。システム中またはマシン中のマイクロプロセッサ（例えば、１つまたは複数のマイクロプロセッサ）により、本明細書で記載されるモジュール中の１つまたは複数の命令（例えば、処理、ルーチン、および／またはサブルーチン）を行うおよび／または実施することができる。本明細書で記載されるモジュールは、場合によって、メモリ中に配置されるか、またはマシンもしくはシステムと関連する。一部の実施形態では、本明細書で記載されるモジュールは、１つまたは複数の外部マイクロプロセッサ（例えば、内部または外部ネットワーク、サーバー、ストレージデバイスおよび／またはストレージネットワーク（例えば、クラウド））を伴って作動する。一部の実施形態では、本明細書で記載されるモジュールは、別のモジュール、マシン、またはシステム（例えば、コンポーネント、周辺機器）に由来するデータおよび／または情報にアクセスし、これを集め、これをアセンブルし、かつ／またはこれを受信するように構成されている。一部の実施形態では、本明細書で記載されるモジュールは、データおよび／または情報を、別のモジュール、マシン、またはシステム（例えば、コンポーネント、周辺機器）へと提示および／または伝送するように構成されている。一部の実施形態では、本明細書で記載されるモジュールは、マシンまたはシステムの操作者（すなわち、使用者）により入力されたデータおよび／または情報にアクセスし、これを受容し、これを受信し、かつ／またはこれを集めるように構成されている。例えば、場合によって、使用者は、定数、閾値、式、および／または所定の値を、モジュールへと提示する。本明細書で記載されるモジュールは、場合によって、それがアクセスし、受信し、集め、かつ／またはアセンブルする、データおよび／または情報を変換するように構成されている。
ある特定の実施形態では、システム、マシン、および／または、コンピュータプログラム産物は、（ｉ）核酸配列の読取りおよび／または部分的なヌクレオチド配列の読取りを得、かつ／またはこれらにアクセスするように構成されている配列決定モジュール；（ｉｉ）核酸配列の読取りを、参照ゲノムの部分へとマッピングするように構成されているマッピングモジュール；（ｉｉｉ）参照ゲノムの部分へとマッピングした核酸配列の読取りのカウントを提示するように構成されているカウント計測モジュール；（ｉｖ）正規化されたカウントを提示するように構成されている正規化モジュール；（ｖ）第２の水準と有意に異なる第１の水準の同定をもたらすように構成されている比較モジュール；（ｖｉ）１つまたは複数の期待されるレベル範囲を提示するように構成されている範囲設定モジュール；（ｖｉｉ）コピー数の変動を表示する水準を同定するように構成されている分類モジュール；（ｖｉｉｉ）コピー数の変動として同定されたレベルを調整するように構成されている調整モジュール；（ｉｘ）レベルおよび／またはプロファイルをグラフ表示および提示するように構成されているプロッティングモジュール；（ｘ）遺伝子の変動の存在もしくは非存在を決定するか、またはアウトカム（例えば、胎児異数性の存在または非存在の決定因のアウトカム）を決定するように構成されているアウトカムモジュール；（ｘｉ）遺伝子変動決定を表示するように構成されているデータディスプレイ組織化モジュール；（ｘｉｉ）配列読取りのマッピング、マッピングした配列読取りのカウント数計測、カウントの正規化、およびアウトカムの生成のうちの１または複数を行うように構成されている論理処理モジュール；（ｘｉｉｉ）カウント比較モジュール；（ｘｉｖ）胎児フラクションの決定をもたらすように構成されている胎児フラクションモジュール；（ｘｖ）遺伝子の変動の存在または非存在の決定をもたらすように構成されている遺伝子変動モジュール；あるいは（ｘｖｉ）前出のうちの２つまたはそれ超の組合せを含む。
一部の実施形態では、配列決定モジュールおよびマッピングモジュールは、配列決定モジュールから配列の読取りを、マッピングモジュールへと伝送するように構成されている。マッピングモジュールおよびカウント計測モジュールは、場合によって、マッピングモジュールから、マッピングした配列の読取りを、カウント計測モジュールへと伝送するように構成されている。一部の実施形態では、正規化モジュールおよび／または比較モジュールは、正規化されたカウントを、比較モジュールおよび／または範囲設定モジュールへと伝送するように構成されている。一部の実施形態では、比較モジュール、範囲設定モジュール、および／または分類モジュールは独立に、（ｉ）第２の水準と有意に異なる第１の水準の同定、および／または（ｉｉ）期待されるレベル範囲を、比較モジュールおよび／または範囲設定モジュールから、分類モジュールへと伝送するように構成されている。ある特定の実施形態では、分類モジュールおよび調整モジュールは、コピー数の変動として分類された水準を、分類モジュールから、調整モジュールへと伝送するように構成されている。一部の実施形態では、調整モジュール、プロッティングモジュール、およびアウトカムモジュールは、１つまたは複数の調整されたレベルを、調整モジュールから、プロッティングモジュールまたはアウトカムモジュールへと伝送するように構成されている。正規化モジュールは、場合によって、マッピングした、配列の読取りの正規化されたカウントを、比較モジュール、範囲設定モジュール、分類モジュール、調整モジュール、アウトカムモジュール、またはプロッティングモジュールのうちの１または複数へと伝送するように構成されている。
下記の実施例は、もっぱら例示として提示されていて、制限するものではない。したがって、下記の実施例はある特定の実施形態について説明し、本技術に制限を設けるものではない。当業者は、本質的に同一または類似のアウトカムを得るために変更または修正可能な様々な非クリティカルパラメータを容易に認識する。
（実施例１）
ＰＥＲＵＮおよび遺伝子の変動と関連した状態を検出するための一般的方法。
本明細書に記載する方法および基礎理論は、遺伝子の変動と関連した様々な状態を検出するのに利用可能であり、遺伝子の変動の存在または非存在の決定的なアウトカムを提供する、またはその存在または非存在を決定する。
参照ゲノムの有益でない部分の除去
参照ゲノムの有益でない部分を除去するための複数の試みにより、部分を選択することが分類を改善し得ると判明した。
等式Ａ：
Ｍ＝ＬＩ＋ＧＳ （Ａ）
等式Ａの各項は下記の意味を有する：
Ｍ：測定されたカウント、不必要な変動により影響を受けた一次情報を表す。
Ｌ：染色体レベル−これは、データ処理手順に由来する所望のアウトプットである。Ｌは、胎児および／または母体の正倍数体からの逸脱を示す。これは、確率誤差および系統的偏りの両方によりマスクされる数量である。染色体レベルＬは、試料特異的かつ部分特異的である。
Ｇ：線形モデルのＬＯＥＳＳ、または任意の同等のアプローチを使用して測定されたＧＣの偏り係数。Ｇは、Ｍおよび一連の部分特異的ＧＣ含有量の値から抽出される二次情報を表し、通常参照ゲノムに由来する（ただし、実際に観察されたＧＣ含有量に由来する場合もある）。Ｇは、試料特異的であり、またゲノム位置によらず不変である。Ｇは不必要な変動のある部分を包含する。
Ｉ：線形モデルの切片。このモデルパラメータは所与の実験設定について一定であり、試料から独立しており、部分特異的である。
Ｓ：線形モデルの勾配。このモデルパラメータは所与の実験設定について一定であり、試料から独立しており、部分特異的である。
ＭおよびＧの数量を測定する。最初に、部分特異的値ＩおよびＳが未知である。未知のＩおよびＳを評価するために、正倍数体試料中の参照ゲノムの全ての部分についてＬ＝１と仮定しなければならない。仮定は必ずしも真ではないが、欠失／重複を有する試料は、いずれも正常な染色体レベルを有する試料に劣後するものと、合理的に予想することができる。正倍数体試料に適用される線形モデルにより、選択された部分に対して特異的なＩおよびＳパラメータ値が抽出される（Ｌ＝１と仮定）。同一の手順が、ヒトゲノム中の参照ゲノムの全ての部分に適用されて、ゲノムの位置毎に切片Ｉおよび勾配Ｓがセットで得られる。交差検証では、全ＬＤＴｖ２ＣＥ正倍数体の９０％を含有するワークセットがランダムに選択され、モデルをトレーニングするのにそのサブセットを使用する。ランダム選択は１００回繰り返され、部分毎に１００個の勾配および１００個の切片がセットで得られる。
測定されたカウントからの染色体レベルの抽出
部分毎にモデルパラメータ値ＩおよびＳが入手可能であると仮定し、新しい試験試料について収集された測定値Ｍが、下記の等式Ｂに従って、染色体レベルを評価するのに使用される：
Ｌ＝（Ｍ−ＧＳ）／Ｉ （Ｂ）
等式Ａと同様に、ＧＣの偏り係数Ｇを、部分毎に測定された未加工のカウントＭと参照ゲノムのＧＣ含有量との間の回帰式の勾配として評価する。次に、染色体レベルＬをさらなる分析で使用する（Ｚ値、母体の欠失／重複、胎児の微小欠失／微小重複、胎児の性別、性染色体異数性等）。等式Ｂに包含される手順は、ＰＥＲＵＮ（ｐａｒａｍｅｔｅｒｉｚｅｄ ｅｒｒｏｒ ｒｅｍｏｖａｌ ａｎｄ ｕｎｂｉａｓｅｄ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）と命名されている。
（実施例２）
式の例
以下の記載は、本明細書に記載する方法で使用することができる数学的および／または統計的な式の非限定的な例である。
Ｚスコア、およびＺスコアから計算され、予想レベルの１からの偏差と関連するｐ値は、次に、平均レベルにおける不確実性に関する推定値に照らし評価可能である。ｐ値はｔ分布に基づき、ｔ分布の次数はピークにおける参照ゲノムの部分の数によって決定する。所望の信頼度レベルに応じて、カットオフはノイズを抑えることができ、実際のシグナルを確実に検出できるようにする。
等式１：
Figure 2016533173
等式１は、２つの異なる試料に由来するピークレベルを直接比較するのに使用することができ、この場合、Ｎおよびｎは、染色体全体中および異常部分内の参照ゲノムの部分の数をそれぞれ指す。２つの試料間の類似性を測定するｐ値をもたらすｔ−検定の次数は、２つの異常なストレッチのうち短い方における参照ゲノムの部分の数によって決定する。
等式８は、胎児の異数性について遺伝子の変動の存在または非存在を決定するために、胎児フラクション（fetal fraction）、母体の倍数性、および参照カウント中央値を、分類スキームに組み入れるのに利用可能である。
等式８：
ｙｉ＝（１−Ｆ）Ｍｉｆｉ＋ＦＸｆｉ （８）
式中、Ｙｉは試験試料内の部分に関する測定されたカウントを表し、カウントプロファイル中央値内の部分に対応し、Ｆは胎児フラクションを表し、Ｘは胎児の倍数性を表し、Ｍｉは各部分に割り当てられた母体の倍数性を表す。等式（８）のＸに使用される可能な値は：胎児が正倍数体の場合１；胎児が三倍体の場合３／２；および双胎胎児が存在し、一方が罹患し、他方はそうではない場合５／４である。双胎の症例では、一方の胎児が罹患しており、他方はそうではない場合、５／４が使用されるが、その理由は、等式（８）の項Ｆは総胎児ＤＮＡを表し、したがって全ての胎児ＤＮＡが考慮されなければならないためである。一部の実施形態では、母体ゲノムにおける大規模な欠失および／または重複は、各部分または部分に母体の倍数性、Ｍｉを割り当てることにより説明され得る。母体の倍数性は、多くの場合、１／２の倍数として割りあてられ、一部の実施形態では、部分に関する正規化を使用して推定可能である。母体の倍数性は、多くの場合、１／２の倍数なので、母体の倍数性は容易に説明をつけることがつき、したがって導関数を単純化するためのさらなる等式に含まれることはない。
Ｘ＝１で等式（８）を評価すると、（例えば、正倍数体を仮定）、胎児フラクションは相殺され、下記の等式は残差平方和をもたらす。
等式９：
Figure 2016533173
等式（９）および後続する計算を単純化するために、下記の等式が利用される。
等式１０：
Figure 2016533173
 等式１１：
Figure 2016533173
 等式１２：
Figure 2016533173
Ｘ＝３／２で等式（８）を評価する場合（例えば、三倍体を仮定）、下記の等式は残差平方和をもたらす。
等式１３：
Figure 2016533173
等式（９）と（１３）の間の差異は、機能的アウトカム（例えば、ｐｈｉ）をなすが、この機能的アウトカムは、代替仮説（例えば、トリソミー単生児、Ｘ＝３／２）に対して帰無仮説（例えば、正倍数体、Ｘ＝１）を検定するのに使用することができる：
等式１４：
Figure 2016533173
 等式１８：
Figure 2016533173
最適な倍数性値は、等式２０から得られる場合もある：
Figure 2016533173
母体の倍数性に関する項Ｍｉは、一部の数学的導関数から省略され得る。Ｘに関する得られた表示は、母親が評価の目的となる染色体または複数の染色体に欠失または重複を有さないような、比較的単純で、そして多くの場合最も頻繁に生ずる特殊なケースに対応する。
等式２１：
Figure 2016533173
ＸｉｆｆおよびＸｉｆｙは、等式（１１）および（１２）より、それぞれ与えられる。全ての実験誤差が無視し得る実施形態では、等式（２１）を解くことにより、Ｘｉｆｆ＝Ｘｉｆｙの場合、正倍数体について１の値が得られる。全ての実験誤差が無視し得るある特定の実施形態では、等式（２１）を解くことにより、三倍体について３／２の値が得られる（ＸｉｆｆとＸｉｆｙの間の三倍体の関係については等式（１５）を参照）。
Figure 2016533173
（実施例３）
ＦＲＳを使用する部分の選択
可変性が大きく、マッピング可能性が小さな部分を除去し、大きな百分率の反復エレメントを結びつける、ＰＥＲＵＮベースの方法を使用して、ＨＧ１９と命名されたヒト参照ゲノムの部分を、まずあらかじめフィルタリングした。可変性が大きく、マッピング可能性が小さく、反復配列のフラクションが大きな部分（ＬＤＴｖ２について選択された部分）を除外した。５０ｋｂずつの各部分（例えば、部分）について、１５０塩基未満のＣＣＦ断片と、６００塩基未満のＣＣＦ断片とに由来する、ペアエンド配列の読取りについての胎児比統計値を計算した。次いで、ＦＲＳを、ＴｒｕＳｅｑ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙライブラリー調製物を、自動式ビーズクリーンアップと共に使用して処理された、２６４のプールされていない試料にわたり平均した。ＦＲＳ＞中央値（ＦＲＳ）である部分を選択したが、これらを、染色体特異的な開始位置および終結位置に関して表４に示す。表４中の染色体特異的な開始位置および終結位置では、ヒト参照ゲノムであるＨＧ１９中のヌクレオチド塩基位置が参照される。
ＦＲＳ＞中央値（ＦＲＳ）である全ての部分を、各部分それぞれのユニークなエクソン開始位置の数と共にプロットした。有意な相関が、小さい断片の過剰表示を含有する遺伝子の領域について示された（図１〜９）。有意に強い相関が、ＧＣ含有量（５０ｋｂの部分中のＧＣ塩基の百分率）と、ＦＲＳとについて示された（表３）。
染色体のトリソミー検出のために、部分の選択を、ＦＲＳ＞中央値（ＦＲＳ）であるゲノムの部分（すなわち、部分）へとさらに制限した。この手法を、２６４の試料による予備的なデータセットに適用することにより、データのうちの５０％を廃棄するにも拘らず、一貫した分類マージンがもたらされた。逆に、部分を、ＦＲＳ＜中央値（ＦＲＳ）である部分に制限したところ、分類マージンが劇的に低減されたことから、分析のための胎児ＤＮＡの希釈が示唆された（図１０〜１１）。
図１０および図１１では、一方は、Ｔ２１でない試料のみについての回帰直線（点破線）であり、他方は、Ｔ２１の試料についての回帰直線（点線）である、２本の回帰直線がある。高ＦＲＳ部分に基づく、Ｔ２１の試料についての回帰直線は、高ＦＲＳに基づく、Ｔ２１でない試料についての回帰直線の上方にあった（図１０）。逆に、この類似する回帰は、低ＦＲＳ部分について計算されたＺスコアを比較したところ、Ｔ２１でない試料より下方にあった（図１１）。Ｚスコアは、Ｔ２１の試料について、大きくなる傾向があるので、これは、高ＦＲＳ部分の使用により、アウトカム決定の精度を向上させうることを示唆する。
Figure 2016533173
（実施例４）
配列ベースの分離と、長さベースの分析との組合せを使用する、トリソミー２１の検出
以下の方法を使用して、妊娠中の雌から得られた循環無細胞ＤＮＡを含有する血漿試料を、トリソミー２１について調べる。
配列ベースの分離
特注でデザインされた、ビオチニル化捕捉ＲＮＡのセットを含む、ＳＵＲＥＳＥＬＥＣＴ特注捕捉ライブラリーは、Ａｇｉｌｅｎｔから得る。捕捉ＲＮＡは、第２１染色体（試験染色体）に特異的なヌクレオチド配列および第１４染色体（参照染色体）に特異的なヌクレオチド配列に従ってデザインし、ウェブベースデザインツールである、Ａｇｉｌｅｎｔ製のＥＡＲＲＡＹにより同定する。１００の独立の捕捉ＲＮＡを、第１４染色体および第２１染色体の各々についてデザインする。４０〜６０塩基対の範囲内の単一コピーのヌクレオチド配列であって、第１４または第２１染色体にユニークであり、ＡＴに富むヌクレオチド配列を、特注の捕捉ＲＮＡデザインのために選択する。
妊娠第一期の妊娠女性に由来する無細胞循環血漿中の核酸である試料核酸を、２本の試験管へと分け、製造業者の指示に従って、第２１染色体捕捉ＲＮＡまたは第１４染色体捕捉ＲＮＡと共に、６５℃で２４時間にわたりインキュベートする。ハイブリダイゼーションの後、捕捉された標的断片および捕捉された参照断片（併せて、捕捉断片と称する）を、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズ（ＤＹＮＡＬ ＤＹＮＡＭＡＧ−２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、ビオチニル化ＲＮＡ／断片ハイブリッド体をブルダウンすることにより選択し、ＭＩＮＥＬＵＴＥ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）で精製する。製造業者の指示に従って、捕捉ＲＮＡを消化し、残りのＤＮＡ断片を増幅する。
長さベースの分析
上記による、分離された核酸断片を含有する試料を、厳密でないハイブリダイゼーション条件下で、ビオチニル化イノシンを含むポリイノシンプローブであって、それらがハイブリダイズするＤＮＡ断片より長く、５００塩基対の長さであるプローブとハイブリダイズさせる。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、６ＸのＳＳＣおよび１％のＳＤＳ中、６５℃で一晩にわたり行う。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、１．０ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１．０ｍＭのＥＤＴＡ、２％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム、０．１％（ｗ／ｖ）のゼラチン、５０μｇ／ｍｌのｔＲＮＡ、および３０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド中、４３℃で一晩にわたり行う。３０分間ずつ４回にわたる洗浄を、１．２ＸのＳＳＣ（１ＸのＳＳＣとは、０．１５ＭのＮａＣｌに、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウムを加えたものである）、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、１．０ｍＭのＥＤＴＡ、および０．５％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム中、５５℃で行う。ハイブリダイゼーションの後、エクソヌクレアーゼＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）およびホスホジエステラーゼＩＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）を使用して、ハイブリダイズしなかったプローブ部分を消化する。プローブ−断片二重鎖を、９５℃で２分間にわたり変性させ、ストレプトアビジンでコーティングされた磁性ビーズ（ＤＹＮＡＬ ＤＹＮＡＭＡＧ−２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、プローブを、断片から分離し（すなわち、プルダウンし）、ＭＩＮＥＬＵＴＥ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）で精製する。ＭＡＬＤＩ質量分析を使用して、トリミングされた、単離および精製されたポリイノシンプローブを、質量について測定する。既知の長さのビオチニル化ポリイノシン標準物質についての質量ピークと比較することにより、プローブの長さ、したがって対応する断片の長さを各プローブ長の種について質量ピークから外挿する。
トリソミー２１の決定
各断片長の種の相対量は、各プローブ長の種についての質量ピークの振幅に基づき決定する。１５０塩基対またはそれ未満の断片を、第１４染色体および第２１染色体について定量する。第１４染色体に由来する断片の量と、第２１染色体に由来する断片の量とが実質的に等しい試料を、第２１染色体についての正倍数体として決定する。第２１染色体に由来する断片が、第１４染色体に由来する断片と対比して統計学的に有意に高量（例えば、第２１染色体に由来する断片において、第１４染色体に由来する断片と対比して２％の上昇）である試料を、第２１染色体について三倍体として決定する。
（実施例５）
断片長のフィルタリングおよび染色体表示を使用するトリソミー検出
本実施例では、無細胞核酸を含有する母体試料を、ある特定の長さのパラメータを有する断片のサブセットに由来するヌクレオチド配列の読取りのカウントに基づき、正倍数体胎児または異数性（すなわち、トリソミー１３、トリソミー１８、トリソミー２１）を有する胎児を保有するものとして分類した。試料は、Ｗｏｍｅｎ ａｎｄ Ｉｎｆａｎｔｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＷＩ研究；Palomakiら（２０１１年）、Genet. Med.、１３巻（１１号）：９１３〜２０頁）から得た。Ｉｌｌｕｍｉｎａペアエンドシーケンシングプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、各試料について、ヌクレオチド配列の読取り（３６塩基の読取り）を得た。ペアエンドヌクレオチド配列の読取りは、ＢＯＷＴＩＥ ２ ベータ ３アライナプログラム(aligner program)を使用して、参照ゲノムへと整列させ（ｂｕｉｌｄ ３７（ｈｇ１９））、断片の長さは、ペアエンド読取りのアラインメントに基づき決定した。
ある特定のヌクレオチド配列の読取りを、以下の核酸断片長パラメータ：１）１２０塩基超またはこれに等しい長さを有する断片；２）１３０塩基超またはこれに等しい長さを有する断片；３）１４０塩基超またはこれに等しい長さを有する断片；４）１５０塩基超またはこれに等しい長さを有する断片；５）１６０塩基超またはこれに等しい長さを有する断片；または６）１７０塩基超またはこれに等しい長さを有する断片に従って、フィルタリングアウトした。したがって、所与の長さの閾（例えば、１２０塩基、１３０塩基、１４０塩基、１５０塩基、１６０塩基、１７０塩基）に等しいかまたはこれより長い断片に対応するペアエンド読取りは、フィルタリングアウトし、所与の長さの閾より短い断片に対応するペアエンド読取りを、分析のために保持した。
１）フィルタリングされなかった配列の読取り、および２）１５０塩基の断片という閾において、長さでフィルタリングされた配列の読取りを使用して、第１３染色体、第１８染色体、および第２１染色体についての染色体表示を、図２３に提示されるデータセットについて計算した。第１３、第１８、および第２１染色体の各々についての染色体表示を、以下：
第１３染色体（Ｃｈｒ１３）の表示＝ΣＣｈｒ１３の配列の読取りのカウント（フィルタリングされなかった）／Σ全ての常染色体の配列の読取りのカウント（フィルタリングされなかった）
第１３染色体（Ｃｈｒ１３）の表示＝ΣＣｈｒ１３の配列の読取りのカウント（フィルタリングされた）／Σ全ての常染色体の配列の読取りのカウント（フィルタリングされた）
第１８染色体（Ｃｈｒ１８）の表示＝ΣＣｈｒ１８の配列の読取りのカウント（フィルタリングされなかった）／Σ全ての常染色体の配列の読取りのカウント（フィルタリングされなかった）
第１８染色体（Ｃｈｒ１８）の表示＝ΣＣｈｒ１８の配列の読取りのカウント（フィルタリングされた）／Σ全ての常染色体の配列の読取りのカウント（フィルタリングされた）
第２１染色体（Ｃｈｒ２１）の表示＝ΣＣｈｒ２１の配列の読取りのカウント（フィルタリングされなかった）／Σ全ての常染色体の配列の読取りのカウント（フィルタリングされなかった）
第２１染色体（Ｃｈｒ２１）の表示＝ΣＣｈｒ２１の配列の読取りのカウント（フィルタリングされた）／Σ全ての常染色体の配列の読取りのカウント（フィルタリングされた）
に従って、計算した。
図１４、１６、および１８は、それぞれ、フィルタリングされなかった配列の読取りを使用する、第１３、第１８、および第２１染色体についての染色体表示を示す。図１５、１７、および１９は、それぞれ、長さでフィルタリングされた配列の読取りを使用する、第１３、第１８、および第２１染色体についての染色体表示を示す。フィルタリングされたデータセットでは、染色体表示は、胎児が寄与する配列データの増加に一部分起因して、トリソミー試料について増加した。染色体表示のこの増加は、染色体異常の検出力を増加させうるが、トリソミーでない試料についての染色体表示の分散は、読取りのカウントのほぼ６３〜８２％の低減に起因して増加した。多様な断片の長さの閾値における読取りのカウントの例示的分布を、図１３に例示し、下記の表５に提示する。
Figure 2016533173
ある特定の長さ未満の断片に由来する読取りについての平均曲線下面積（ＡＵＣ：ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ）値を決定して、平均で認められる読取り（すなわち、配列カバレッジ）の全体的な低減を例示した。約１５００万の配列の読取り（またはヒトゲノムの０．２Ｘのカバレッジ）を生成する所与のアッセイでは、１５０塩基超の読取りの除外は、例えば、約０．０３５Ｘのカバレッジと同等である。
染色体表示に最適の断片サイズ閾を決定するために、断片サイズ閾を、１２０〜１７０塩基にわたり、１０塩基の増分で変化させた。染色体表示（すなわち、第１３、第１８、および第２１染色体についての）を、配列の読取りのカウントの正規化（すなわち、ＬＯＥＳＳによるＰＥＲＵＮ ＰＡＤＤＥＤ）の後で、長さでフィルタリングされた各データセット（ペアエンド読取り）およびフィルタリングされなかったデータセット（シングルエンドリード；また、「全て」の読取りとも称する）について計算した。第１３、第１８、および第２１染色体表示を、それぞれ、図２０、２１、および２２に提示する。１５０、１６０、および１７０塩基の閾における、フィルタリングされたデータセットについての染色体表示は、フィルタリングされなかったデータセットと十分に一致した。以下の表は、第１３、第１８、および第２１染色体のトリソミー検出について観察された特異性および感度を、それぞれのＺスコアのカットオフ値（すなわち、第１３染色体について３．９５、第１８染色体について３．９５、および第２１染色体について３）において提示する。Ｚスコア値は、フローセル特異的中央値ならびにデータセット特異的な歴史的ＭＡＤ値および集団ＭＡＤ値に基づいた。加えて、受信者動作特性（ＲＯＣ：ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）分析による１０分割の交差検証を実行し（すなわち、１０分割の層別化交差検証を１００回にわたり反復した）、各分析（全ての感度×（１−特異性）値を合計することにより計算され、ＲパッケージによるＲＯＣＲを使用して実施される）についての平均曲線下面積（ＡＵＣ；すなわち、精度の尺度）を、下記の表６、７、および８に提示する。
Figure 2016533173
Figure 2016533173
Figure 2016533173
データは、長さでフィルタリングされた試料についての配列カバレッジの有意な低減にも拘らず、ある特定の断片の長さの閾（例えば、１５０塩基、１６０塩基）でフィルタリングされた試料を使用して、フィルタリングされなかった試料と比較して、同様の精度、感度、および特異性で、トリソミーを同定しうることを示す。
（実施例６）
本実施例では、一部分、胎児フラクションと、胎児比統計値（ＦＲＳ）との関係を例示する。
図２５Ａおよび２５Ｂに示す通り、試料ごとのＺスコア対中央値ＦＲＳのプロットは、胎児フラクションについてのＺスコア対ＦＱＡベースの推定値のプロットとの顕著な類似性を示した。さらに、高ＦＲＳ部分へと制限された、トリソミー２１試料ごとの中央値ＦＲＳ（図２５Ａ、破線より上）は、０．１８８であり、全ての部分についての、トリソミー２１試料ごとの中央値ＦＲＳ（図２５Ｂ、破線より上）は、０．１７２であった。トリソミーでないＣｈｒ２１試料では、高ＦＲＳ部分についての中央値ＦＲＳは、０．１８１であり（図２５Ａ、破線より下）、全ての部分についての中央値ＦＲＳは、０．１６６であった（図２５Ｂ、破線より下）。これは、トリソミー２１試料が、特に、胎児による寄与の傾向が大きな部分にまで、非トリソミー２１試料よりわずかに高値の部分表示を実際に有することを示唆した。
図２６に示す通り、断片の長さが異なる読取りは、異なるＧＣ含有量を含むことが決定された。より一層胎児起源であることが公知の小さな断片は、大きな断片と比較して、高ＧＣ含有量を示した。高ＦＲＳを有するビンは、ビン当たりのＧＣ含有量と正相関するので、ＧＣ含有量の差違はまた、ＦＲＳが、どの程度、ＧＣ含有量および遺伝子密度と相関するのかとも関係した。これらの、断片の長さによる、微細なＧＣの差違を利用して、胎児フラクション情報をもたらすことができる。例えば、ヒト参照ゲノムにわたる、ＧＣの差違、断片の長さ、および／または断片の長さの分散を使用して、断片の胎児起源または母体起源を予測することができる。このデータは、読取り当たりのＧＣ含有量を使用して、胎児の寄与を推定しうることを裏付けた。
ＰＥＲＵＮとは、カバレッジの読取り深度中のＧＣの偏りを除去する、領域特異的な付加的補正である。この正規化手順は、傾き、すなわち、ＧＣの偏りの影響、および切片、すなわち、ＧＣの偏りの非存在下における塩基レベルのカバレッジという、２つの領域特異的なパラメータについての、トレーニングされた推定値を伴った。ＦＲＳの四分位数へと区分化されたＰＥＲＵＮ切片の分布は、ＦＲＳを増加させると、ＰＥＲＵＮ切片が増加することを示唆した（図２７）。全体的に、ＦＲＳが最も小さなゲノム領域は、おそらく、全体的なカバレッジ表示と比べた、胎児の寄与の低減に起因して、切片が最も小さい傾向があった。加えて、領域の選択のための初期的な取り組みでは、最大の交差検証誤差が組み込まれたが、ここで、大きな値は、カバレッジの可変性の増加を指し示した。図２８は、四分位数へと区分化された、最大の交差検証誤差の分布を示す。極大および極小の(extreme)四分位数（高値および低値）は、領域安定性の最も大きな可変性を示した。ＦＲＳが極大および極小であるゲノム領域(extreme FRSgenomic regions)は、胎児の寄与に対して潜在的により感受性であるので、最大の交差検証誤差の可変性の増加は、実際、胎児シグナルの可変性に起因しうる。
（実施例７）
ビンベースの胎児フラクション
本実施例は、シーケンシングカバレッジデータ(sequencing coveragedata)を使用して、母体の血液試料中の循環無細胞胎児ＤＮＡの量を定量するための方法を明らかに示す。技術は、本明細書でビンベースの胎児フラクション（ＢＦＦ：ｂｉｎ−ｂａｓｅｄ ｆｅｔａｌ ｆｒａｃｔｉｏｎ）として公知の方法であって、シーケンシングカバレッジマップ(sequencing coveragemap)を使用して、母体の血液試料中の胎児ＤＮＡのフラクションを定量する方法を包含する。方法では、マシンラーニング法を利用して、シーケンシングカバレッジを、胎児フラクションと関係づけるモデルを構築する。
ＢＦＦ法の第１のステップは、ゲノムカバレッジデータを得ることであった。ゲノムカバレッジデータは、シーケンシングランおよびアラインメントから得た。次いで、このカバレッジデータを、胎児フラクションについての予測因子として用いた。離散ゲノムビン、可変サイズビン、またはスムージングされたカバレッジマップの地点ベースの図示を含むがこれらに限定されない、任意の適切な方法により、カバレッジ予測変数を生成することができる。
ＢＦＦ法の第２のステップは、胎児フラクションを、カバレッジデータの予測因子（例えば、パラメータ）から推定するためのモデルをトレーニングすることであった。本実施例では、一般的な重回帰モデルを、単純最小二乗法を使用して、胎児フラクションを、特定のビンの、既知の、比例する配列決定レベルから直接推定するようにトレーニングした。この手法を、多変量重回帰モデルへと拡張して、胎児フラクションに比例することが既知であるビン（このビンから、次には胎児フラクションを導出することができる）を予測することができる。同様に、ビンが相関する場合は、多変量応答モデルをトレーニングして、相関する応答を明らかにすることができる。以下は、その最も単純な形態における例である。
重回帰モデルは、下記の等式３０：
ｙｆｆ＝Ｘｂｉｎβ＋ε 等式（３０）
［式中、Ｘｂｉｎは、ビンのカウントについてのｍ×ｐ行列であり、ｙｆｆは、ｍ個のトレーニング試料およびｐ個の予測ビンについてのｍ×１ベクトルであり、εは、期待値Ｅ（ε）＝０［式中、共分散Ｃｏｖ（ε）＝σ２Ｉ［式中、Ｉは、恒等行列である（すなわち、誤差は、等分散的である）］］とするノイズベクトルであり、ｒａｎｋ（Ｘｂｉｎ）＜ｐである］として選択した。ベクトルｙｆｆは、胎児フラクションに比例することが既知であるレベルを有するビンに対応した。
一般性を損なわずに述べると、本発明者らは、Ｘｂｉｎが、その平均値を中心とすると仮定した。したがって、回帰係数のｐ×１ベクトルであるβは、
Figure 2016533173
 についての正規方程式である、
Figure 2016533173
 を解くことから推定することができる。
多変量多重応答モデルへの拡張により、前出のモデルを、多重応答変数を有するように、またはサイズｍ×ｎ［式中、ｎは、胎児フラクションに比例するレベルを有する、いくつかの異なるビンである］の行列Ｙｆｆとして、単純に拡張した。よって、モデルは、
Ｙｆｆ＝ＸｂｉｎＢ＋Ｅ 等式（３２）
［式中、Ｅは、複数のモデルに対する並列仮説を伴うノイズ行列である］である。係数の行列Ｂは、
Figure 2016533173
 について、
Figure 2016533173
 ［式中、
Figure 2016533173
 は、ｐ×ｎ行列である］を解くことにより推定することができる。
ランクがｒａｎｋ（Ｘｂｉｎ）＜ｐである場合は、問題を、任意の数の適切な回帰モデルへと分解して、多重共線性を説明することができる。これに加えてまた、
Figure 2016533173
 であることから、多変量応答内の潜在的な相関が説明されるように、ランクを低減した、
Figure 2016533173
 の推定量も見出すことができる。次いで、結果として得られる推定量を、適切な方法により、併せて、平均するかまたは重み付けすることができる。
ＢＦＦ法は、この回帰法に限定されない。他の重回帰法、多変量応答回帰、決定木、サポートベクターマシン、およびニューラルネットワークを含むがこれらに限定されない、多くの適切なマシンラーニング法を使用して、推定を向上させることができる。また、全ての関与性のビンを、モデルへと組み入れ得るように、仮説を緩和し、高次元の推定をもたらしうる方法も存在する。このような推定量の非限定的な例は、予測力を向上させることが示されている、ランク低減推定量、ＬＡＳＳＯ推定量、重み付けランク選択判定基準（ＷＲＳＣ：ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｒａｎｋ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｃｒｉｔｅｒｉａ）推定量、ＲＳＣ（ｒａｎｋ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｃｒｉｔｅｒｉａ）推定量、およびエラスティックネット推定量など、拘束ベースの推定量である。
胎児フラクションの予測はまた、ゲノムカバレッジの偏りの測定およびパイプラインへの組み入れを介しても向上させた。これらの偏りは、ＧＣ含有量、ＤＮアーゼ１過敏性、マッピング可能性、およびクロマチン構造を含むがこれらに限定されない、いくつかの供給源に由来しうる。このようなプロファイルは、試料ごとのベースで定量し、ゲノムカバレッジデータを調整するのに使用することもでき、胎児フラクションモデルに対する予測因子または拘束として付加することもできる。
例えば、全てのビンにわたるＹ染色体カバレッジの相対レベルを、胎児フラクション（ＣｈｒＦＦ）の真の値として使用して、多重回帰法を、６０００例の雄正倍数体試料についてトレーニングした。共通のトリソミーの検出についての循環性を防止するため、モデルを、常染色体のカバレッジビンのみについてトレーニングし、第１３、第１８、または第２１染色体を含めなかった。モデルは、１９，３１２例の独立の試料からなる試験データに対する強力な性能を裏付けた（図２９）。
ＢＦＦの強力な性能は、胎児ＤＮＡを引き寄せる傾向があるビンおよび領域により駆動される。これらの領域は、カバレッジ分散が大きい傾向があり、モデルでは、この変動を使用する。ブーストラップ法を使用して、胎児フラクション表示（ＦＲＳに基づく）が高値または低値であるビンについてもっぱらトレーニングしたモデルを比較した。胎児含有量が大きなビンは、胎児フラクションの良好な予測因子であることが見出された（図３０）。これは、胎児表示が高値であるビンについて構築されたモデルは、回帰係数が大きくなる傾向があるという知見と対応した（図３１）。
例示的なトレーニングセットには、雄試料のみを含めたが、予測は、トリソミー染色体表示を使用して、胎児フラクションを独立に推定しうる、雌試料および雄トリソミー試料の両方に対して行った。雄試料および雌試料についての胎児フラクションの推定は、全体的な分布の差違を示さなかった（図３２）。これにより、ＢＦＦは、胎児フラクションを推定するために、他の性別と比較して、一方の性別に対して、全体的に偏っているわけではないことが裏付けられる。
（実施例８）
実施形態の例
下記に示す例は、ある特定の実施形態を例示するものであり、技術を限定するものではない。
Ａ１．妊娠中の雌に由来する試験試料中の胎児核酸のフラクションを推定するための方法であって、
（ａ）参照ゲノムの部分へとマッピングした配列の読取りのカウントを得るステップであって、配列の読取りが、妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取りである、ステップと、
（ｂ）マイクロプロセッサを使用して、（ｉ）各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または（ｉｉ）他の部分特異的パラメータを、部分特異的な胎児核酸のフラクションへと、各部分と独立に関連する重み付け係数に従って重み付けし、これにより、部分特異的胎児フラクションの推定値を、重み付け係数に従って提示するステップであって、
重み付け係数の各々が、（ｉ）複数の試料の各々についての胎児核酸のフラクションと、（ｉｉ）複数の試料についての、各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または他の部分特異的パラメータとの、各部分について適合させた関係から決定されている、ステップと、
（ｃ）胎児核酸のフラクションを、試験試料について、部分特異的胎児フラクションの推定値に基づき推定するステップと
を含む方法。
Ａ２．重み付け係数が、全ての常染色体中ならびにＸ染色体中およびＹ染色体中の、複数の部分中の部分と関連する、実施形態Ａ１に記載の方法。
Ａ２．１．重み付け係数が、Ｙ染色体中の部分を含まない、複数の部分中の部分と関連する、実施形態Ａ１に記載の方法。
Ａ３．重み付け係数が、Ｘ染色体中およびＹ染色体中の部分を含まない、複数の部分中の部分と関連する、実施形態Ａ２．１に記載の方法。
Ａ４．重み付け係数が、常染色体中またはそのサブセット中の部分を含む、複数の部分中の部分と関連する、実施形態Ａ２に記載の方法。
Ａ５．重み付け係数が、第１３、第１８、および第２１染色体中の部分を含まない、複数の部分中の部分と関連する、実施形態Ａ３またはＡ４に記載の方法。
Ａ６．（ｂ）（ｉ）または（ｂ）（ｉｉ）におけるカウントが、正規化されたカウントである、実施形態Ａ１からＡ５のいずれか１つに記載の方法。
Ａ７．正規化されたカウントの、グアニン−シトシン（ＧＣ）の偏りが、未加工のカウントに関して低減されている、実施形態Ａ６に記載の方法。
Ａ８．正規化されたカウントが、ビン方式の正規化、ＧＣ含有量による正規化、線形最小二乗回帰、非線形最小二乗回帰、ＬＯＥＳＳ、ＧＣ ＬＯＥＳＳ、ＬＯＷＥＳＳ、ＰＥＲＵＮ、リピートマスキング（repeat masking）（ＲＭ）、ＧＣ正規化リピートマスキング（ＧＣＲＭ）、条件付分位数正規化（ｃＱｎ：ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｑｕａｎｔｉｌｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）、またはこれらの組合せの産物である、実施形態Ａ６またはＡ７に記載の方法。
Ａ９．胎児核酸のフラクションを、試験試料について推定するステップが、部分特異的胎児フラクションの推定値を平均または合計することを含む、実施形態Ａ１からＡ８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１０．部分特異的パラメータが、１つの部分特異的パラメータであるか、または２つもしくはそれ超の部分特異的パラメータのうちの１つである、実施形態Ａ１からＡ９のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１１．部分特異的パラメータが、ゲノムカバレッジ、選択された断片の長さ未満の長さを有する読取りの量、マッピング可能性、ＤＮアーゼＩ感受性、メチル化状況、アセチル化、ヒストン分布、およびクロマチン構造から選択される、実施形態Ａ１からＡ１０のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１２．部分特異的パラメータが、グアニン−シトシン（ＧＣ）含有量である、実施形態Ａ１からＡ１０のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１３．部分特異的パラメータが、グアニン−シトシン（ＧＣ）含有量ではない、実施形態Ａ１からＡ１０のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１４．選択された断片の長さ未満の長さを有する読取りの量が、ＸのＹに対する比に従って決定され、Ｘが、第１の選択された断片の長さ未満の長さを有する、循環無細胞（ＣＣＦ）断片に由来する読取りの量であり、Ｙが、第２の選択された断片の長さ未満の長さを有する、ＣＣＦ断片に由来する読取りの量である、実施形態Ａ１１に記載の方法。
Ａ１５．第１の選択された断片の長さが、約１４０〜約１６０塩基であり、第２の選択された断片の長さが、約５００〜約７００塩基である、実施形態Ａ１４に記載の方法。
Ａ１６．第１の選択された断片の長さが、約１５０塩基であり、第２の選択された断片の長さが、約６００塩基である、実施形態Ａ１５に記載の方法。
Ａ１７．各部分についての重み付け係数が、複数の試料についての、部分についての平均値比と関係する、実施形態Ａ１４からＡ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１８．各部分についての重み付け係数が、複数の試料についての、部分へとマッピングした、ＣＣＦ胎児核酸断片に由来する読取りの平均値量と比例する、実施形態Ａ１からＡ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１９．部分が、離散ゲノムビン、所定の長さの連続配列を有するゲノムビン、可変サイズビン、スムージングされたカバレッジマップの地点ベースの図示、およびこれらの組合せから選択される、実施形態Ａ１からＡ１８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２０．複数の試料が、正倍数体胎児を有する被験体に由来する、実施形態Ａ１からＡ１９のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２１．複数の試料が、トリソミー胎児を有する被験体に由来する、実施形態Ａ１からＡ１９のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２２．複数の試料が、正倍数体胎児を有する被験体およびトリソミー胎児を有する被験体に由来する、実施形態Ａ１からＡ１９のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２３．複数の試料が、雄胎児を有する被験体に由来する、実施形態Ａ１からＡ２２のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２４．胎児核酸のフラクションが、Ｙ染色体についてのアッセイに従って決定される、実施形態Ａ２３に記載の方法。
Ａ２５．約１，５００の部分〜約２００，０００の部分中のカウントが調整される、実施形態Ａ１からＡ２４のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２５．１．部分の各々が、参照ゲノムに由来する、連続的な約１０キロベース〜連続的な約７５キロベースである、実施形態Ａ２５に記載の方法。
Ａ２６．重み付け係数のうちの約７５％またはそれ超が、ゼロ超である、実施形態Ａ１からＡ２５．１のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２６．１．重み付け係数のうちの約８５％またはそれ超が、ゼロ超である、実施形態Ａ２６に記載の方法。
Ａ２６．２．重み付け係数のうちの約９５％またはそれ超が、ゼロ超である、実施形態Ａ２６．１に記載の方法。
Ａ２７．重み付け係数の分布の幅が、ＣＣＦ胎児核酸断片に由来する読取りの量に依存する、実施形態Ａ１からＡ２６．２のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２８．重み付け係数の分布が、実質的に対称分布である、実施形態Ａ１からＡ２７のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２８．１．重み付け係数の分布が、実質的に正規分布である、実施形態Ａ１からＡ２７のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２９．重み付け係数が、適合させた関係から推定される係数である、実施形態Ａ１からＡ２８．１のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３０．係数を、（ｉ）複数の試料の各々についての胎児核酸のフラクションと、（ｉｉ）複数の試料についての、各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または他の部分特異的パラメータとの、各部分についての関係から推定するステップを含む、実施形態Ａ１からＡ２９のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３１．適合させた関係の各々が、回帰モデルであり、重み付け係数が、適合させた関係に由来する回帰係数であるかまたはこれに基づく、実施形態Ａ２９またはＡ３０に記載の方法。
Ａ３２．回帰モデルが、線形回帰モデル、単純回帰モデル、通常の最小二乗回帰モデル、重回帰モデル、一般的な重回帰モデル、多項式回帰モデル、一般線形モデル、一般化線形モデル、離散選択回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、多項ロジットモデル、混合ロジットモデル、プロビットモデル、多項プロビットモデル、順序ロジットモデル、順序プロビットモデル、ポアソンモデル、多変量応答回帰モデル、マルチレベルモデル、固定効果モデル、ランダム効果モデル、混合モデル、非線形回帰モデル、ノンパラメトリックモデル、セミパラメトリックモデル、ロバストモデル、クォンタイルモデル、アイソトニックモデル、主成分モデル、最小角モデル、ローカルモデル、セグメント化モデル、および変数誤差モデルから選択される、実施形態Ａ３１に記載の方法。
Ａ３３．適合させた関係の各々が、回帰モデルではない、実施形態Ａ２９またはＡ３０に記載の方法。
Ａ３４．適合させた関係の各々が、決定木モデル、サポート−ベクターマシンモデル、およびニューラルネットワークモデルから選択される、実施形態Ａ３３に記載の方法。
Ａ３５．適合させた関係を、最小二乗法、通常の最小二乗法、線形回帰、部分回帰、全回帰、一般化回帰、加重回帰、非線形回帰、繰返し加重回帰、リッジ回帰、最小絶対偏差、ベイズ、ベイズ多変量、縮小ランク、ＬＡＳＳＯ、エラスティックネット推定法、およびこれらの組合せから選択される推定により適合させている、実施形態Ａ１からＡ３４のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３６．（ａ）の前に、試験被験体に由来する循環無細胞核酸を配列決定することにより、配列の読取りを決定するステップを含む、実施形態Ａ１からＡ３５のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３７．（ａ）の前に、配列の読取りを、参照ゲノムの部分へとマッピングするステップを含む、実施形態Ａ３６に記載の方法。
Ａ３８．（ａ）の前に、循環無細胞核酸を、試験試料から単離するステップを含む、実施形態Ａ３６またはＡ３７に記載の方法。
Ａ３９．（ａ）の前に、試験試料を、試験被験体から単離するステップを含む、実施形態Ａ３８に記載の方法。
Ａ４０．胎児の染色体異数性の存在または非存在を、試験試料について、推定された胎児核酸のフラクションに基づき決定するステップを含む、実施形態Ａ１からＡ３９のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４１．胎児の染色体異数性が、トリソミーである、実施形態Ａ４０に記載の方法。
Ａ４２．トリソミーが、第２１染色体のトリソミー、第１８染色体のトリソミー、第１３染色体のトリソミー、またはこれらの組合せから選択される、実施形態Ａ４１に記載の方法。
Ａ４３．トリソミーの存在または非存在が、９５％もしくはそれ超の感度または９５％もしくはそれ超の特異性、あるいは９５％またはそれ超の感度および９５％またはそれ超の特異性で決定される、実施形態Ａ４１またはＡ４２に記載の方法。
Ａ４４．１つまたは複数のマイクロプロセッサおよびメモリを含むシステムであって、
メモリが、１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な命令を含み、メモリが、参照ゲノムの部分へとマッピングしたヌクレオチド配列の読取りを含み、配列の読取りが、妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取りであり、１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な命令が、
（ａ）マイクロプロセッサを使用して、（ｉ）各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または（ｉｉ）他の部分特異的パラメータを、部分特異的な胎児核酸のフラクションへと、各部分と独立に関連する重み付け係数に従って重み付けし、これにより、部分特異的胎児フラクションの推定値を、重み付け係数に従って提示し、
重み付け係数の各々が、（ｉ）複数の試料の各々についての胎児核酸のフラクションと、（ｉｉ）複数の試料についての、各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または他の部分特異的パラメータとの、各部分について適合させた関係から決定されており、
（ｂ）胎児核酸のフラクションを、試験試料について、部分特異的胎児フラクションの推定値に基づき推定する
ように構成されている、システム。
Ａ４５．１つまたは複数のマイクロプロセッサおよびメモリを含むマシンであって、
メモリが、１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な命令を含み、メモリが、参照ゲノムの部分へとマッピングしたヌクレオチド配列の読取りを含み、配列の読取りが、妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取りであり、１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な命令が、
（ａ）マイクロプロセッサを使用して、（ｉ）各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または（ｉｉ）他の部分特異的パラメータを、部分特異的な胎児核酸のフラクションへと、各部分と独立に関連する重み付け係数に従って重み付けし、これにより、部分特異的胎児フラクションの推定値を、重み付け係数に従って提示し、
重み付け係数の各々が、（ｉ）複数の試料の各々についての胎児核酸のフラクションと、（ｉｉ）複数の試料についての、各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または他の部分特異的パラメータとの、各部分について適合させた関係から決定されており、
（ｂ）胎児核酸のフラクションを、試験試料について、部分特異的胎児フラクションの推定値に基づき推定する
ように構成されている、マシン。
Ａ４６．実行可能なプログラムをその上に内蔵した非一時的なコンピュータ可読記憶媒体であって、プログラムが、マイクロプロセッサに、以下を行う：
（ａ）参照ゲノムの部分へとマッピングしたヌクレオチド配列の読取りにアクセスし、配列の読取りが、妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取りであり、
（ｂ）マイクロプロセッサを使用して、（ｉ）各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または（ｉｉ）他の部分特異的パラメータを、部分特異的な胎児核酸のフラクションへと、各部分と独立に関連する重み付け係数に従って重み付けし、これにより、部分特異的胎児フラクションの推定値を、重み付け係数に従って提示し、
重み付け係数の各々が、（ｉ）複数の試料の各々についての胎児核酸のフラクションと、（ｉｉ）複数の試料についての、各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または他の部分特異的パラメータとの、各部分について適合させた関係から決定されており、
（ｃ）胎児核酸のフラクションを、試験試料について、部分特異的胎児フラクションの推定値に基づき推定する
ように命令する、非一時的なコンピュータ可読記憶媒体。
Ｂ１．妊娠中の雌に由来する試験試料中の胎児核酸のフラクションを推定するための方法であって、
（ａ）参照ゲノムの部分へとマッピングした配列の読取りのカウントを得るステップであって、配列の読取りが、妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取りである、ステップと、
（ｂ）（ｉ）マイクロプロセッサを使用して、各部分へとマッピングした配列の読取りのカウントを、各部分へと独立に割り当てられた重み付け係数に従って調整し、これにより、調整されたカウントを、部分について提示するか、または
（ｂ）（ｉｉ）マイクロプロセッサを使用して、部分のサブセットを選択し、これにより、カウントのサブセットを提示するステップであって、
（ｂ）（ｉ）における調整するステップ、または（ｂ）（ｉｉ）における選択するステップが、マッピングした、胎児核酸に由来する読取りの量が多い部分に従う、ステップと、
（ｃ）胎児核酸のフラクションを、試験試料について、調整されたカウントまたはカウントのサブセットに基づき推定するステップと
を含む方法。
Ｂ２．マッピングした、胎児核酸に由来する読取りの量が多い部分が、ＸのＹに対する比に従って決定され、Ｘが、第１の選択された断片の長さ未満の長さを有する、循環無細胞（ＣＣＦ）断片に由来する読取りの量であり、Ｙが、第２の選択された断片の長さ未満の長さを有する、ＣＣＦ断片に由来する読取りの量である、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ３．比が、複数の試料についての平均値比である、実施形態Ｂ２に記載の方法。
Ｂ４．重み付け係数が、複数の部分について平均された平均値比超の平均値比を有する部分に従って決定されるか、または該複数の部分が、これに従って選択される、実施形態Ｂ３に記載の方法。
Ｂ５．第１の選択された断片の長さが、約１４０〜約１６０塩基であり、第２の選択された断片の長さが、約５００〜約７００塩基である、実施形態Ｂ２からＢ４のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ６．第１の選択された断片の長さが、約１５０塩基であり、第２の選択された断片の長さが、約６００塩基である、実施形態Ｂ５に記載の方法。
Ｂ７．１つまたは複数のマイクロプロセッサおよびメモリを含むシステムであって、
メモリが、１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な命令を含み、メモリが、参照ゲノムの部分へとマッピングしたヌクレオチド配列の読取りを含み、配列の読取りが、妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取りであり、１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な命令が、
（ａ）（ｉ）マイクロプロセッサを使用して、各部分へとマッピングした配列の読取りのカウントを、各部分へと独立に割り当てられた重み付け係数に従って調整し、これにより、調整されたカウントを、部分について提示するか、または
（ａ）（ｉｉ）マイクロプロセッサを使用して、部分のサブセットを選択し、これにより、カウントのサブセットを提示し、
（ｂ）（ｉ）における調整すること、または（ｂ）（ｉｉ）における選択することが、マッピングした、胎児核酸に由来する読取りの量が多い部分に従い、
（ｂ）胎児核酸のフラクションを、試験試料について、調整されたカウントまたはカウントのサブセットに基づき推定する
ように構成されている、システム。
Ｂ８．１つまたは複数のマイクロプロセッサおよびメモリを含むマシンであって、
メモリが、１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な命令を含み、メモリが、参照ゲノムの部分へとマッピングしたヌクレオチド配列の読取りを含み、配列の読取りが、妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取りであり、１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な命令が、
（ａ）（ｉ）マイクロプロセッサを使用して、各部分へとマッピングした配列の読取りのカウントを、各部分へと独立に割り当てられた重み付け係数に従って調整し、これにより、調整されたカウントを、部分について提示するか、または
（ａ）（ｉｉ）マイクロプロセッサを使用して、部分のサブセットを選択し、これにより、カウントのサブセットを提示し、
（ｂ）（ｉ）における調整すること、または（ｂ）（ｉｉ）における選択することが、マッピングした、胎児核酸に由来する読取りの量が多い部分に従い、
（ｂ）胎児核酸のフラクションを、試験試料について、調整されたカウントまたはカウントのサブセットに基づき推定する
ように構成されている、マシン。
Ｂ９．実行可能なプログラムをその上に内蔵した非一時的なコンピュータ可読記憶媒体であって、プログラムが、マイクロプロセッサに、以下を行う：
（ａ）参照ゲノムの部分へとマッピングしたヌクレオチド配列の読取りにアクセスし、配列の読取りが、妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取りであり、
（ｂ）（ｉ）マイクロプロセッサを使用して、各部分へとマッピングした配列の読取りのカウントを、各部分へと独立に割り当てられた重み付け係数に従って調整し、これにより、調整されたカウントを、部分について提示するか、または
（ｂ）（ｉｉ）マイクロプロセッサを使用して、部分のサブセットを選択し、これにより、カウントのサブセットを提示し、
（ｂ）（ｉ）における調整すること、または（ｂ）（ｉｉ）における選択することが、マッピングした、胎児核酸に由来する読取りの量が多い部分に従い、
（ｃ）胎児核酸のフラクションを、試験試料について、調整されたカウントまたはカウントのサブセットに基づき推定する
ように命令する、非一時的なコンピュータ可読記憶媒体。
Ｃ１．妊娠中の雌に由来する試験試料中の胎児核酸のフラクションの推定の精度を増加させるための方法であって、参照ゲノムの部分へとマッピングした配列の読取りのカウントを得るステップを含み、配列の読取りが、妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取りであり、得られたカウントの少なくともサブセットが、ゲノムの領域であって、ゲノムの別の領域の、全カウントと比べた胎児核酸のカウントより、その領域に由来する、全カウントと比べた胎児核酸に由来するカウント数が大きいことに寄与する領域に由来する方法。
Ｃ２．マイクロプロセッサを使用して、各部分へとマッピングした配列の読取りのカウントを、各部分へと独立に割り当てられた重み付け係数に従って調整し、これにより、調整されたカウントを、部分について提示するか、またはマイクロプロセッサを使用して、部分のサブセットを選択し、これにより、カウントのサブセットを提示するステップと、
胎児核酸のフラクションを、試験試料について、調整されたカウントまたはカウントのサブセットに基づき推定するステップとを含む、実施形態Ｃ１に記載の方法。
Ｃ３．胎児核酸に由来するカウント数が大きいことに寄与するゲノムの領域が、ＸのＹに対する比に従って決定され、Ｘが、第１の選択された断片の長さ未満の長さを有する、循環無細胞（ＣＣＦ）断片に由来する読取りの量であり、Ｙが、第２の選択された断片の長さ未満の長さを有する、ＣＣＦ断片に由来する読取りの量である、実施形態Ｃ１またはＣ２に記載の方法。
Ｃ４．比が、複数の試料についての平均値比である、実施形態Ｃ３に記載の方法。
Ｃ５．重み付け係数が、複数の部分について平均された平均値比超の該平均値比を有する部分に従って決定されるか、または該複数の部分が、これに従って選択される、実施形態Ｃ４に記載の方法。
Ｃ６．第１の選択された断片の長さが、約１４０〜約１６０塩基であり、第２の選択された断片の長さが、約５００〜約７００塩基である、実施形態Ｃ３からＣ５のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ７．第１の選択された断片の長さが、約１５０塩基であり、第２の選択された断片の長さが、約６００塩基である、実施形態Ｃ６に記載の方法。
本明細書において参照される特許、特許出願、出版物、および文書それぞれについて、その全体を、本明細書により参照によって援用する。上記特許、特許出願、出版物、および文書の引用は、上記資料のいずれかが、関連する先行技術であることを承認するものではなく、またこれらの出版物または文書の内容または日付に関していかなる承認となるものでもない。
本技術の基本的な態様から逸脱せずに、上記について修正を行うことができる。本技術は、１つまたは複数の特定の実施形態を参照しながら、かなり詳細に記載されており、当業者は、本出願で具体的に開示されている実施形態に変更を行うことが可能であることを認識するであろうが、これらの修正および改良は、依然として本技術の範囲および精神内である。
本明細書に例示として記載する本技術は、本明細書に特に開示されないエレメント（複数可）のいずれかが存在しなくても好適に実践可能である。したがって、例えば、本明細書の各事例において、用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」のいずれも、他方の２つの用語と置き換え可能である。採用された用語および語句は、制限ではなく説明の用語として使用され、またかかる用語および語句の使用が、示され記載された特性、またはそのセグメントと等価なものをいずれも除外するものではなく、様々な修正が、特許請求された技術の範囲内で可能である。用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、エレメントのうちの１つ、またはエレメントのうちの１つ超が記載されていることが文脈上明白でない限り、それが修飾する１つまたは複数のエレメントを指し得る（例えば、「試薬（ａ ｒｅａｇｅｎｔ）」は、１つまたは複数の試薬を意味し得る）。用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、本明細書で使用する場合、基礎となるパラメータの１０％以内の値を指す（すなわち、プラスまたはマイナス１０％）、および連なった値の最初で用語「約」を使用する場合、その用語は値のそれぞれを修飾する（すなわち、「約１、２、および３」は、約１、約２、および約３を指す）。例えば、「約１００グラム」の重量は、９０グラム〜１１０グラムの間の重量を含み得る。さらに、値の列挙が本明細書に記載される場合（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、または８６％）、列挙には、全ての中間の値およびその分数の値（例えば、５４％、８５．４％）が含まれる。したがって、本技術は、代表的な実施形態および任意選択的な特性により具体的に開示されているものの、本明細書で開示する概念の修正および変更は当業者により実施可能であると理解すべきであり、かかる修正および変更は本技術の範囲内とみなされる。
本技術のある特定の実施形態を、後続する特許請求の範囲に記載する。

Claims (67)

  1. 妊娠中の雌に由来する試験試料中の胎児核酸のフラクションを推定するための方法であって、
    （ａ）参照ゲノムの部分へとマッピングした配列の読取りのカウントを得るステップであって、配列の読取りが、妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取りである、ステップと、
    （ｂ）マイクロプロセッサを使用して、（ｉ）各部分へとマッピングした該配列の読取りの該カウント、または（ｉｉ）他の部分特異的パラメータを、部分特異的な胎児核酸のフラクションへと、各部分と独立に関連する重み付け係数に従って重み付けし、これにより、部分特異的胎児フラクションの推定値を、該重み付け係数に従って提示するステップであって、
    該重み付け係数の各々が、（ｉ）複数の試料の各々についての胎児核酸のフラクションと、（ｉｉ）該複数の試料についての、各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または他の部分特異的パラメータとの、各部分について適合させた関係から決定されている、ステップと、
    （ｃ）胎児核酸のフラクションを、該試験試料について、該部分特異的胎児フラクションの推定値に基づき推定するステップと
    を含む方法。
  2. 前記重み付け係数が、全ての常染色体中ならびにＸ染色体中およびＹ染色体中の、複数の部分中の部分と関連する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記重み付け係数が、Ｙ染色体中の部分を含まない、複数の部分中の部分と関連する、請求項１に記載の方法。
  4. 前記重み付け係数が、Ｘ染色体中およびＹ染色体中の部分を含まない、複数の部分中の部分と関連する、請求項３に記載の方法。
  5. 前記重み付け係数が、常染色体中またはそのサブセット中の部分を含む、複数の部分中の部分と関連する、請求項２に記載の方法。
  6. 前記重み付け係数が、第１３、第１８、および第２１染色体中の部分を含まない、複数の部分中の部分と関連する、請求項４または５に記載の方法。
  7. （ｂ）（ｉ）または（ｂ）（ｉｉ）における前記カウントが、正規化されたカウントである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記正規化されたカウントの、グアニン−シトシン（ＧＣ）の偏りが、未加工のカウントに関して低減されている、請求項７に記載の方法。
  9. 前記正規化されたカウントが、ビン方式の正規化、ＧＣ含有量による正規化、線形最小二乗回帰、非線形最小二乗回帰、ＬＯＥＳＳ、ＧＣ ＬＯＥＳＳ、ＬＯＷＥＳＳ、ＰＥＲＵＮ、リピートマスキング（ＲＭ）、ＧＣ正規化リピートマスキング（ＧＣＲＭ）、条件付分位数正規化（ｃＱｎ：ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｑｕａｎｔｉｌｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）、またはこれらの組合せの産物である、請求項７または８に記載の方法。
  10. 胎児核酸の前記フラクションを、前記試験試料について推定するステップが、前記部分特異的胎児フラクションの推定値を平均または合計することを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記部分特異的パラメータが、１つの部分特異的パラメータであるか、または２つもしくはそれ超の部分特異的パラメータのうちの１つである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記部分特異的パラメータが、ゲノムカバレッジ、選択された断片の長さ未満の長さを有する読取りの量、マッピング可能性、ＤＮアーゼＩ感受性、メチル化状況、アセチル化、ヒストン分布、およびクロマチン構造から選択される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記部分特異的パラメータが、グアニン−シトシン（ＧＣ）含有量である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記部分特異的パラメータが、グアニン−シトシン（ＧＣ）含有量ではない、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
  15. 選択された断片の長さ未満の長さを有する読取りの前記量が、ＸのＹに対する比に従って決定され、Ｘが、第１の選択された断片の長さ未満の長さを有する、循環無細胞（ＣＣＦ）断片に由来する読取りの量であり、Ｙが、第２の選択された断片の長さ未満の長さを有する、ＣＣＦ断片に由来する読取りの量である、請求項１２に記載の方法。
  16. 前記第１の選択された断片の長さが、約１４０〜約１６０塩基であり、前記第２の選択された断片の長さが、約５００〜約７００塩基である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記第１の選択された断片の長さが、約１５０塩基であり、前記第２の選択された断片の長さが、約６００塩基である、請求項１６に記載の方法。
  18. 各部分についての前記重み付け係数が、前記複数の試料についての、前記部分についての平均値比と関係する、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 各部分についての前記重み付け係数が、前記複数の試料についての、前記部分へとマッピングした、ＣＣＦ胎児核酸断片に由来する読取りの平均値量と比例する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記部分が、離散ゲノムビン、所定の長さの連続配列を有するゲノムビン、可変サイズビン、スムージングされたカバレッジマップの地点ベースの図示、およびこれらの組合せから選択される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記複数の試料が、正倍数体胎児を有する被験体に由来する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記複数の試料が、トリソミー胎児を有する被験体に由来する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記複数の試料が、正倍数体胎児を有する被験体およびトリソミー胎児を有する被験体に由来する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記複数の試料が、雄胎児を有する被験体に由来する、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 胎児核酸の前記フラクションが、Ｙ染色体についてのアッセイに従って決定される、請求項２４に記載の方法。
  26. 約１，５００の部分〜約２００，０００の部分中の前記カウントが調整される、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記部分の各々が、前記参照ゲノムに由来する、連続的な約１０キロベース〜連続的な約７５キロベースである、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記重み付け係数のうちの約７５％またはそれ超が、ゼロ超である、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記重み付け係数のうちの約８５％またはそれ超が、ゼロ超である、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記重み付け係数のうちの約９５％またはそれ超が、ゼロ超である、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記重み付け係数の分布の幅が、ＣＣＦ胎児核酸断片に由来する読取りの前記量に依存する、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記重み付け係数の分布が、実質的に対称分布である、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記重み付け係数の分布が、実質的に正規分布である、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記重み付け係数が、前記適合させた関係から推定される係数である、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 係数を、（ｉ）複数の試料の各々についての胎児核酸の前記フラクションと、（ｉｉ）前記複数の試料についての、各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または他の部分特異的パラメータとの、各部分についての前記関係から推定するステップを含む、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記適合させた関係の各々が、回帰モデルであり、前記重み付け係数が、該適合させた関係に由来する回帰係数であるかまたはこれに基づく、請求項３４または３５に記載の方法。
  37. 前記回帰モデルが、線形回帰モデル、単純回帰モデル、通常の最小二乗回帰モデル、重回帰モデル、一般的な重回帰モデル、多項式回帰モデル、一般線形モデル、一般化線形モデル、離散選択回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、多項ロジットモデル、混合ロジットモデル、プロビットモデル、多項プロビットモデル、順序ロジットモデル、順序プロビットモデル、ポアソンモデル、多変量応答回帰モデル、マルチレベルモデル、固定効果モデル、ランダム効果モデル、混合モデル、非線形回帰モデル、ノンパラメトリックモデル、セミパラメトリックモデル、ロバストモデル、クォンタイルモデル、アイソトニックモデル、主成分モデル、最小角モデル、ローカルモデル、セグメント化モデル、および変数誤差モデルから選択される、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記適合させた関係の前記各々が、回帰モデルではない、請求項３４または３５に記載の方法。
  39. 前記適合させた関係の各々が、決定木モデル、サポート−ベクターマシンモデル、およびニューラルネットワークモデルから選択される、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記適合させた関係を、最小二乗法、通常の最小二乗法、線形回帰、部分回帰、全回帰、一般化回帰、加重回帰、非線形回帰、繰返し加重回帰、リッジ回帰、最小絶対偏差、ベイズ、ベイズ多変量、縮小ランク、ＬＡＳＳＯ、エラスティックネット推定法、およびこれらの組合せから選択される推定により適合させている、請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. （ａ）の前に、試験被験体に由来する循環無細胞核酸を配列決定することにより、前記配列の読取りを決定するステップを含む、請求項１から４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. （ａ）の前に、前記配列の読取りを、前記参照ゲノムの前記部分へとマッピングするステップを含む、請求項４１に記載の方法。
  43. （ａ）の前に、前記循環無細胞核酸を、前記試験試料から単離するステップを含む、請求項４１または４２に記載の方法。
  44. （ａ）の前に、前記試験試料を、前記試験被験体から単離するステップを含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 胎児の染色体異数性の存在または非存在を、前記試験試料について、推定された胎児核酸の前記フラクションに基づき決定するステップを含む、請求項１から４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記胎児の染色体異数性が、トリソミーである、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記トリソミーが、第２１染色体のトリソミー、第１８染色体のトリソミー、第１３染色体のトリソミー、またはこれらの組合せから選択される、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記トリソミーの存在または非存在が、９５％もしくはそれ超の感度または９５％もしくはそれ超の特異性、あるいは９５％またはそれ超の感度および９５％またはそれ超の特異性で決定される、請求項４６または４７に記載の方法。
  49. １つまたは複数のマイクロプロセッサおよびメモリを含むシステムであって、
    メモリが、該１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な命令を含み、メモリが、参照ゲノムの部分へとマッピングしたヌクレオチド配列の読取りを含み、配列の読取りが、妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取りであり、該１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な前記命令が、
    （ａ）マイクロプロセッサを使用して、（ｉ）各部分へとマッピングした該配列の読取りのカウント、または（ｉｉ）他の部分特異的パラメータを、部分特異的な胎児核酸のフラクションへと、各部分と独立に関連する重み付け係数に従って重み付けし、これにより、部分特異的胎児フラクションの推定値を、該重み付け係数に従って提示し、
    該重み付け係数の各々が、（ｉ）複数の試料の各々についての胎児核酸のフラクションと、（ｉｉ）該複数の試料についての、各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または他の部分特異的パラメータとの、各部分について適合させた関係から決定されており、
    （ｂ）胎児核酸のフラクションを、該試験試料について、該部分特異的胎児フラクションの推定値に基づき推定する
    ように構成されている、システム。
  50. １つまたは複数のマイクロプロセッサおよびメモリを含むマシンであって、
    メモリが、該１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な命令を含み、メモリが、参照ゲノムの部分へとマッピングしたヌクレオチド配列の読取りを含み、配列の読取りが、妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取りであり、該１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な命令が、
    （ａ）マイクロプロセッサを使用して、（ｉ）各部分へとマッピングした該配列の読取りのカウント、または（ｉｉ）他の部分特異的パラメータを、部分特異的な胎児核酸のフラクションへと、各部分と独立に関連する重み付け係数に従って重み付けし、これにより、部分特異的胎児フラクションの推定値を、該重み付け係数に従って提示し、
    該重み付け係数の各々が、（ｉ）複数の試料の各々についての胎児核酸のフラクションと、（ｉｉ）該複数の試料についての、各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または他の部分特異的パラメータとの、各部分について適合させた関係から決定されており、
    （ｂ）胎児核酸のフラクションを、該試験試料について、該部分特異的胎児フラクションの推定値に基づき推定する
    ように構成されている、マシン。
  51. 実行可能なプログラムをその上に内蔵した非一時的なコンピュータ可読記憶媒体であって、該プログラムが、マイクロプロセッサに、以下を行う：
    （ａ）参照ゲノムの部分へとマッピングしたヌクレオチド配列の読取りにアクセスし、該配列の読取りが、妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取りであり、
    （ｂ）マイクロプロセッサを使用して、（ｉ）各部分へとマッピングした該配列の読取りのカウント、または（ｉｉ）他の部分特異的パラメータを、部分特異的な胎児核酸のフラクションへと、各部分と独立に関連する重み付け係数に従って重み付けし、これにより、部分特異的胎児フラクションの推定値を、該重み付け係数に従って提示し、
    該重み付け係数の各々が、（ｉ）複数の試料の各々についての胎児核酸のフラクションと、（ｉｉ）該複数の試料についての、各部分へとマッピングした配列の読取りのカウント、または他の部分特異的パラメータとの、各部分について適合させた関係から決定されており、
    （ｃ）胎児核酸のフラクションを、該試験試料について、該部分特異的胎児フラクションの推定値に基づき推定する
    ように命令する、非一時的なコンピュータ可読記憶媒体。
  52. 妊娠中の雌に由来する試験試料中の胎児核酸のフラクションを推定するための方法であって、
    （ａ）参照ゲノムの部分へとマッピングした配列の読取りのカウントを得るステップであって、配列の読取りが、妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取りである、ステップと、
    （ｂ）（ｉ）マイクロプロセッサを使用して、各部分へとマッピングした該配列の読取りの該カウントを、各部分へと独立に割り当てられた重み付け係数に従って調整し、これにより、調整されたカウントを、該部分について提示するか、または
    （ｂ）（ｉｉ）マイクロプロセッサを使用して、部分のサブセットを選択し、これにより、カウントのサブセットを提示するステップであって、
    （ｂ）（ｉ）における該調整するステップ、または（ｂ）（ｉｉ）における該選択するステップが、マッピングした、胎児核酸に由来する読取りの量が多い部分に従う、ステップと、
    （ｃ）胎児核酸のフラクションを、該試験試料について、該調整されたカウントまたはカウントの該サブセットに基づき推定するステップと
    を含む方法。
  53. マッピングした、胎児核酸に由来する読取りの量が多い前記部分が、ＸのＹに対する比に従って決定され、Ｘが、第１の選択された断片の長さ未満の長さを有する、循環無細胞（ＣＣＦ）断片に由来する読取りの量であり、Ｙが、第２の選択された断片の長さ未満の長さを有する、ＣＣＦ断片に由来する読取りの量である、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記比が、複数の試料についての平均値比である、請求項５２に記載の方法。
  55. 前記重み付け係数が、複数の部分について平均された平均値比超の該平均値比を有する部分に従って決定されるか、または該複数の部分が、これに従って選択される、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記第１の選択された断片の長さが、約１４０〜約１６０塩基であり、前記第２の選択された断片の長さが、約５００〜約７００塩基である、請求項５３から５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記第１の選択された断片の長さが、約１５０塩基であり、前記第２の選択された断片の長さが、約６００塩基である、請求項５６に記載の方法。
  58. １つまたは複数のマイクロプロセッサおよびメモリを含むシステムであって、
    メモリが、該１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な命令を含み、メモリが、参照ゲノムの部分へとマッピングしたヌクレオチド配列の読取りを含み、配列の読取りが、妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取りであり、該１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な命令が、
    （ａ）（ｉ）マイクロプロセッサを使用して、各部分へとマッピングした該配列の読取りのカウントを、各部分へと独立に割り当てられた重み付け係数に従って調整し、これにより、調整されたカウントを、該部分について提示するか、または
    （ａ）（ｉｉ）マイクロプロセッサを使用して、部分のサブセットを選択し、これにより、カウントのサブセットを提示し、
    （ｂ）（ｉ）における該調整すること、または（ｂ）（ｉｉ）における該選択することが、マッピングした、胎児核酸に由来する読取りの量が多い部分に従い、
    （ｂ）胎児核酸のフラクションを、該試験試料について、該調整されたカウントまたはカウントの該サブセットに基づき推定する
    ように構成されている、システム。
  59. １つまたは複数のマイクロプロセッサおよびメモリを含むマシンであって、
    メモリが、該１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な命令を含み、メモリが、参照ゲノムの部分へとマッピングしたヌクレオチド配列の読取りを含み、配列の読取りが、妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取りであり、該１つまたは複数のマイクロプロセッサにより実行可能な命令が、
    （ａ）（ｉ）マイクロプロセッサを使用して、各部分へとマッピングした該配列の読取りのカウントを、各部分へと独立に割り当てられた重み付け係数に従って調整し、これにより、調整されたカウントを、該部分について提示するか、または
    （ａ）（ｉｉ）マイクロプロセッサを使用して、部分のサブセットを選択し、これにより、カウントのサブセットを提示し、
    （ｂ）（ｉ）における該調整すること、または（ｂ）（ｉｉ）における該選択することが、マッピングした、胎児核酸に由来する読取りの量が多い部分に従い、
    （ｂ）胎児核酸のフラクションを、該試験試料について、該調整されたカウントまたはカウントの該サブセットに基づき推定する
    ように構成されている、マシン。
  60. 実行可能なプログラムをその上に内蔵した非一時的なコンピュータ可読記憶媒体であって、該プログラムが、マイクロプロセッサに、以下を行う：
    （ａ）参照ゲノムの部分へとマッピングしたヌクレオチド配列の読取りにアクセスし、配列の読取りが、妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取りであり、
    （ｂ）（ｉ）マイクロプロセッサを使用して、各部分へとマッピングした該配列の読取りのカウントを、各部分へと独立に割り当てられた重み付け係数に従って調整し、これにより、調整されたカウントを、該部分について提示するか、または
    （ｂ）（ｉｉ）マイクロプロセッサを使用して、部分のサブセットを選択し、これにより、カウントのサブセットを提示し、
    （ｂ）（ｉ）における該調整すること、または（ｂ）（ｉｉ）における該選択することが、マッピングした、胎児核酸に由来する読取りの量が多い部分に従い、
    （ｃ）胎児核酸のフラクションを、該試験試料について、該調整されたカウントまたはカウントの該サブセットに基づき推定する
    ように命令する、非一時的なコンピュータ可読記憶媒体。
  61. 妊娠中の雌に由来する試験試料中の胎児核酸のフラクションの推定の精度を増加させるための方法であって、参照ゲノムの部分へとマッピングした配列の読取りのカウントを得るステップを含み、配列の読取りが、妊娠中の雌に由来する試験試料に由来する循環無細胞核酸の読取りであり、得られた該カウントの少なくともサブセットが、該ゲノムの領域であって、該ゲノムの別の領域の、全カウントと比べた胎児核酸のカウントより、該領域に由来する、全カウントと比べた胎児核酸に由来するカウント数が大きいことに寄与する領域に由来する方法。
  62. マイクロプロセッサを使用して、各部分へとマッピングした前記配列の読取りの前記カウントを、各部分へと独立に割り当てられた重み付け係数に従って調整し、これにより、調整されたカウントを、該部分について提示するか、またはマイクロプロセッサを使用して、部分のサブセットを選択し、これにより、カウントのサブセットを提示するステップと、
    胎児核酸のフラクションを、前記試験試料について、該調整されたカウントまたはカウントの該サブセットに基づき推定するステップと
    を含む、請求項６１に記載の方法。
  63. 胎児核酸に由来するカウント数が大きいことに寄与する前記ゲノムの前記領域が、ＸのＹに対する比に従って決定され、Ｘが、第１の選択された断片の長さ未満の長さを有する、循環無細胞（ＣＣＦ）断片に由来する読取りの量であり、Ｙが、第２の選択された断片の長さ未満の長さを有する、ＣＣＦ断片に由来する読取りの量である、請求項６１または６２に記載の方法。
  64. 前記比が、複数の試料についての平均値比である、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記重み付け係数が、複数の部分について平均された平均値比超の該平均値比を有する部分に従って決定されるか、または該複数の部分が、これに従って選択される、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記第１の選択された断片の長さが、約１４０〜約１６０塩基であり、前記第２の選択された断片の長さが、約５００〜約７００塩基である、請求項６３から６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記第１の選択された断片の長さが、約１５０塩基であり、前記第２の選択された断片の長さが、約６００塩基である、請求項６６に記載の方法。
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