ES2599967T3 - Procedimientos y composiciones para el enriquecimiento basado en metilación de ácido nucleico fetal de una muestra materna útiles para diagnósticos prenatales no invasivos - Google Patents

Procedimientos y composiciones para el enriquecimiento basado en metilación de ácido nucleico fetal de una muestra materna útiles para diagnósticos prenatales no invasivos Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para determinar la cantidad de ácido nucleico fetal en una muestra, que comprende: a) poner en contacto ácido nucleico de una mujer embarazada, comprendiendo el ácido nucleico ácido nucleico fetal y ácido nucleico materno, comprendiendo la combinación del ácido nucleico fetal y el ácido nucleico materno el ácido nucleico total en la muestra, con un reactivo que digiere específicamente ácido nucleico no metilado, digiriendo así el ácido nucleico materno y enriquciendo el ácido nucleico fetal; y b) determinar la cantidad de ácido nucleico fetal en la muestra analizando la cantidad de ácido nucleico fetal en una pluralidad de locus seleccionados de las SEQ ID NO: 1-59.

Description

Procedimientos y composiciones para el enriquecimiento basado en metilación de ácido nucleico fetal de una muestra materna útiles para diagnósticos prenatales no invasivos
CAMPO
La presente invención está definida por las reivindicaciones. En el presente documento se proporcionan biomarcadores. Los biomarcadores proporcionados pueden ser útiles para la detección no invasiva de rasgos genéticos fetales. Determinados rasgos genéticos fetales incluyen, pero no se limitan a, la presencia o ausencia de ácido nucleico fetal.
ANTECEDENTES
Las pruebas prenatales no invasivas se están convirtiendo en un campo de interés que aumenta rápidamente. La detección temprana de afecciones relacionadas con el embarazo, incluyendo complicaciones durante el embarazo y taras genéticas del feto, es de vital importancia, ya que permite la intervención médica temprana necesaria para la seguridad tanto de la madre como del feto. Se ha realizado el diagnóstico prenatal usando células aisladas del feto a través de procedimientos, tales como biopsia de vellosidades coriónicas (BVC) o amniocentesis. Sin embargo, estos procedimientos convencionales son invasivos y presentan un riesgo apreciable para la madre y el feto. El Servicio Nacional de Salud cita actualmente una tasa de abortos espontáneos de entre un 1 y un 2 por ciento después de las pruebas invasivas de amniocentesis y biopsia de vellosidades coriónicas (BVC).
Se ha desarrollado una alternativa a estos enfoques invasivos para el cribado prenatal, por ejemplo, para la detección de anomalías fetales, después del descubrimiento de que el ácido nucleico fetal libre de células en circulación se puede detectar en el plasma y suero maternos (Lo et al., Lancet 350:485-487,1997; y patente de EE. UU. 6,258,540). El ácido nucleico fetal libre de células en circulación (cffNA) tiene varias ventajas que lo hacen más aplicable para las pruebas prenatales no invasivas. Por ejemplo, el ácido nucleico libre de células está presente en niveles más altos que las células fetales y en concentraciones suficientes para el análisis genético. Además, el cffNA se elimina en horas de la circulación sanguínea materna tras el parto, lo que previene la contaminación de embarazos previos.
Los ejemplos de pruebas prenatales llevadas a cabo mediante la detección de ADN fetal en plasma o suero materno incluyen el genotipado de rhesus D (RhD) fetal (Lo et al., N. Engl. J. Med. 339:1734-1738,1998), determinación del sexo fetal (Costa et al., N. Engl. J. Med. 346:1502, 2002) y el diagnóstico de varios trastornos fetales (Amicucci et al., Clin. Chem. 46:301-302, 2000; Saito et al., Lancet 356:1170, 2000; y Chiu et al., Lancet 360:998-1000, 2002). Además, se han notificado anomalías cuantitativas de ADN fetal en el plasma/suero materno en la preeclampsia (Lo et al., Clin. Chem. 45:184-188, 1999 and Zhong et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 184:414-419, 2001), trisomía 21 fetal (Lo et al., Clin. Chem. 45:1747-1751,1999 and Zhong et al., Prenat. Diagn. 20:795-798, 2000) e hiperemesis gravídica (Sekizawa et al., Clin. Chem. 47:2164-2165, 2001).
El documento WO/2007132166A2 describe que en una mujer embarazada determinados genes (tales como RASSF1A, APC, CASP8, RARB, SCGB3A1, DAB21P, PTPN6, THY1, TMEFF2 y PYCARD) originados a partir de un feto están altamente metilados, mientras que los mismos genes de origen materno están no metilados. Estos genes se pueden medir directamente para el diagnóstico de determinadas afecciones relacionadas con el embarazo. Old (2007), Reproductive Biomedicine online, 15(2):227-235, describe tres biomarcadores epigenéticos candidatos específicos del cromosoma 21 para el diagnóstico prenatal no invasivo de la trisomía 21. El documento WO/2006056480A2 se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido bifuncional que comprende el dominio de unión a ADN de una proteína que pertenece a la familia de las proteínas de unión a metil-CpG (MBD) y la porción Fc de un anticuerpo.
SUMARIO
La tecnología descrita en el presente documento proporciona, entre otras cosas, biomarcadores epigenéticos humanos que son útiles para la detección no invasiva de los rasgos genéticos fetales, incluyendo, pero no limitados a, la presencia o ausencia de ácido nucleico fetal, la cantidad absoluta o relativa de ácido nucleico fetal, el sexo fetal y anomalías cromosómicas fetales, tales como aneuploidia. Los biomarcadores epigenéticos humanos de la tecnología representan ADN genómico que presenta patrones de metilación de CpG diferenciales entre el feto y la madre. Las composiciones y procedimientos de la tecnología permiten la detección y cuantificación de ácido nucleico fetal en una muestra materna basándose en el estado de metilación del ácido nucleico en dicha muestra. Más específicamente, se puede determinar la cantidad de ácido nucleico fetal de una muestra materna con respecto a la cantidad total de ácido nucleico presente, proporcionando así el porcentaje de ácido nucleico fetal en la muestra. Además, se puede determinar la cantidad de ácido nucleico fetal de una manera específica de secuencia (o específica de locus) y con sensibilidad suficiente para permitir el análisis de dosificación cromosómica preciso (por ejemplo, para detectar la presencia o ausencia de una aneuploidia fetal).
La presente invención está definida por las reivindicaciones. En más detalle, la invención se refiere a un procedimiento para determinar la cantidad de ácido nucleico fetal en una muestra que comprende: a) poner en contacto ácido nucleico de una mujer embarazada, comprendiendo el ácido nucleico ácido nucleico fetal y ácido
nucleico materno, comprendiendo la combinación del ácido nucleico fetal y el ácido nucleico materno ácido nucleico total en la muestra, con un reactivo que digiere específicamente ácido nucleico materno no metilado, enriqueciendo así el ácido nucleico fetal; y b) determinar la cantidad de ácido nucleico fetal en la muestra analizando la cantidad de ácido nucleico fetal en una pluralidad de locus seleccionados de las SEQ ID NO: 1-59.
En el presente documento también se describe un procedimiento para enriquecer ácidos nucleicos fetales de una muestra biológica materna, basado en metilación diferencial entre el ácido nucleico fetal y materno, que comprende las etapas de: (a) unir un ácido nucleico diana, de una muestra, y un ácido nucleico de control, de la muestra, a una proteína de unión específica de metilación; y (b) eluir el ácido nucleico unido basándose en el estado de metilación, en el que los ácidos nucleicos diferencialmente metilados se eluyen al menos parcialmente en fracciones separadas. La secuencia de ácido nucleico puede incluir una o más de las secuencias polinucleotídicas de las SEQ ID NO: 1-89. Las SEQ ID NO: 1-89 se proporcionan en la tabla 4. La tecnología incluye las secuencias de las SEQ ID NO: 1-89, y variaciones en las mismas. Puede que no se incluya un ácido nucleico de control en la etapa (a).
En el presente documento también se describe un procedimiento para enriquecer ácido nucleico fetal de una muestra materna, que comprende las siguientes etapas: (a) obtener una muestra biológica de una mujer; (b) separar ácido nucleico fetal y materno basándose en el estado de metilación de una secuencia genómica que contiene CpG en la muestra, en el que la secuencia genómica del feto y la secuencia genómica de la mujer están metiladas diferencialmente, distinguiendo así la secuencia genómica de la mujer y la secuencia genómica del feto en la muestra. La secuencia genómica puede ser de al menos 15 nucleótidos de longitud, comprendiendo al menos una citosina, en la que adicionalmente la región tiene (1) un locus genómico seleccionado de la tabla 1; y (2) una secuencia de ADN de no más de 10 kb en dirección 5′ y/o en dirección 3′ desde el locus. La obtención de una muestra biológica de una mujer no puede limitar el alcance de la tecnología. Esta obtención puede hacer referencia a en realidad recoger una muestra de una mujer (por ejemplo, una extracción sanguínea) o a recibir una muestra de otro lugar (por ejemplo, de una clínica u hospital) y llevar a cabo las etapas de un procedimiento.
En el presente documento también se describe un procedimiento para enriquecer ácido nucleico fetal de una muestra materna, que comprende las siguientes etapas: (a) obtener una muestra biológica de una mujer; (b) digerir o eliminar ácido nucleico materno basándose en el estado de metilación de una secuencia genómica que contiene CpG en la muestra, en el que la secuencia genómica del feto y la secuencia genómica de la mujer están metiladas diferencialmente, enriqueciendo así la secuencia genómica del feto en la muestra. El ácido nucleico materno se puede digerir usando una o más enzimas de restricción sensibles a metilación que escinden o digieren selectivamente ácido nucleico materno basándose en su estado de metilación. La secuencia genómica puede ser de al menos 15 nucleótidos de longitud, comprendiendo al menos una citosina, en la que adicionalmente la región consiste en (1) un locus genómico seleccionado de la tabla 1; y (2) una secuencia de ADN de no más de 10 kb en dirección 5′ y/o en dirección 3′ desde el locus.
En el presente documento también se describe un procedimiento para preparar ácido nucleico que tiene una secuencia nucleotídica de un ácido nucleico fetal, que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una muestra de una mujer embarazada; (b) separar ácido nucleico fetal de ácido nucleico materno de la muestra de la mujer embarazada de acuerdo con un estado de metilación diferente entre el ácido nucleico fetal y el ácido nucleico materno equivalente, en el que la secuencia nucleotídica del ácido nucleico fetal comprende uno o más sitios CpG de una o más de las secuencias polinucleotídicas de las SEQ ID NO: 1-89 en una secuencia polinucleotídica de un gen o locus que contiene una de las secuencias polinucleotídicas de las SEQ ID NO: 1-89; y (c) preparar ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica del ácido nucleico fetal mediante un procedimiento de amplificación en el que se utiliza el ácido nucleico fetal separado en la parte (b) como un molde. Además, en el presente documento se describe un procedimiento para preparar ácido nucleico que tiene una secuencia nucleotídica de un ácido nucleico fetal, que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una muestra de una mujer embarazada; (b) digerir o eliminar ácido nucleico materno de la muestra de la mujer embarazada de acuerdo con un estado de metilación diferente entre el ácido nucleico fetal y el ácido nucleico materno equivalente, en el que la secuencia nucleotídica del ácido nucleico fetal comprende uno o más sitios CpG de una o más de las secuencias polinucleotídicas de las SEQ ID NO: 1-89 en una secuencia polinucleotídica de un gen que contiene una de las secuencias polinucleotídicas de las SEQ ID NO: 1-89; y (c) preparar ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica del ácido nucleico fetal. El procedimiento de preparación de la etapa (c) puede ser un procedimiento de hibridación, un procedimiento de captura
o un procedimiento de amplificación en el que el ácido nucleico fetal separado en parte (b) se utiliza como un molde. También, en caso de que se digiera el ácido nucleico materno, el ácido nucleico materno se puede digerir usando una
o más enzimas de restricción sensibles a metilación que digieren o escinden selectivamente ácido nucleico materno basándose en su estado de metilación. Las secuencias polinucleotídicas de las SEQ ID NO: 1-89 pueden estar en una secuencia polinucleotídica de una isla CpG que contenga una de las secuencias polinucleotídicas de las SEQ ID NO: 1-89. Las secuencias polinucleotídicas de las SEQ ID NO: 1-89 están caracterizadas adicionalmente en las tablas 1-3 en el presente documento, incluyendo la identificación de las islas CpG que se solapan con las secuencias polinucleotídicas proporcionadas en las SEQ ID NO: 1-89. El ácido nucleico preparado mediante la parte (c) puede estar en solución. El procedimiento puede comprender adicionalmente cuantificar el ácido nucleico fetal del procedimiento de amplificación de la etapa (c).
En el presente documento también se describe un procedimiento para enriquecer ácido nucleico fetal de una muestra de una mujer embarazada con respecto al ácido nucleico materno, que comprende las siguientes etapas: (a)
proporcionar una muestra de una mujer embarazada; y (b) separar o capturar ácido nucleico fetal de ácido nucleico materno de la muestra de la mujer embarazada de acuerdo con un estado de metilación diferente entre el ácido nucleico fetal y el ácido nucleico materno, en el que la secuencia nucleotídica del ácido nucleico fetal comprende uno
o más sitios CpG de una o más de las secuencias polinucleotídicas de las SEQ ID NO: 1-89 en una secuencia polinucleotídica de un gen que contiene una de las secuencias polinucleotídicas de las SEQ ID NO: 1-89. Las secuencias polinucleotídicas de las SEQ ID NO: 1-89 pueden estar en una secuencia polinucleotídica de una isla CpG que contenga una de las secuencias polinucleotídicas de las SEQ ID NO: 1-89. Las secuencias polinucleotídicas de las SEQ ID NO: 1-89 están caracterizadas en la tabla 1 en el presente documento. El ácido nucleico separado mediante la parte (b) puede estar en solución. El procedimiento puede comprender adicionalmente amplificar y/o cuantificar el ácido nucleico fetal en el procedimiento de separación de la etapa (b).
En el presente documento también se describe una composición que comprende un ácido nucleico aislado de un feto de una mujer embarazada, en la que la secuencia nucleotídica del ácido nucleico comprende una o más de las secuencias polinucleotídicas de las SEQ ID NO: 1-89. La secuencia nucleotídica puede consistir esencialmente en una secuencia nucleotídica de un gen o porción del mismo. La secuencia nucleotídica también puede consistir esencialmente en una secuencia nucleotídica de una isla CpG o porción de la misma. Las secuencias polinucleotídicas de las SEQ ID NO: 1-89 están caracterizadas adicionalmente en la tabla 1. El ácido nucleico puede estar en solución. El ácido nucleico del feto se puede enriquecer con respecto al ácido nucleico materno. La composición puede comprender adicionalmente un agente que se una a los nucleótidos metilados. Por ejemplo, el agente puede ser una proteína de unión a metil-CpG (MBD) o fragmento de la misma.
En el presente documento también se describe una composición que comprende un ácido nucleico aislado de un feto de una mujer embarazada, en la que la secuencia nucleotídica del ácido nucleico comprende uno o más sitios CpG de una o más de las secuencias polinucleotídicas de las SEQ ID NO: 1-89 en una secuencia polinucleotídica de un gen o porción del mismo que contiene una de las secuencias polinucleotídicas de las SEQ ID NO: 1-89. La secuencia nucleotídica del ácido nucleico puede comprender uno o más sitios CpG de una o más de las secuencias polinucleotídicas de las SEQ ID NO: 1-89 en una secuencia polinucleotídica de una isla CpG o porción de la misma que contiene una de las secuencias polinucleotídicas de las SEQ ID NO: 1-89. Las secuencias polinucleotídicas de las SEQ ID NO: 1-89 están caracterizadas adicionalmente en la tabla 1. El ácido nucleico puede estar en solución. El ácido nucleico del feto se puede enriquecer con respecto al ácido nucleico materno. Las secuencias de ácido nucleico hiper e hipometiladas de la tecnología están identificadas en la tabla 1. La composición puede comprender adicionalmente un agente que se una a los nucleótidos metilados. Por ejemplo, el agente puede ser una proteína de unión a metil-CpG (MBD) o fragmento de la misma.
Una secuencia nucleotídica de la tecnología puede incluir tres o más de los sitios CpG. La secuencia nucleotídica puede incluir cinco o más de los sitios CpG. La secuencia nucleotídica puede proceder de una región génica que comprenda un dominio de PRC2 (véase la tabla 3). La secuencia nucleotídica puede proceder de una región génica implicada en el desarrollo. Por ejemplo, S0X14, que es un marcador epigenético de la presente tecnología (véase la tabla 1), es un miembro de la familia de SOX (secuencia HMG relacionada con SRY) de factores de transcripción implicados en la regulación del desarrollo embrionario y en la determinación del destino celular.
La secuencia genómica de la mujer puede estar metilada y la secuencia genómica del feto puede estar no metilada. La secuencia genómica de la mujer puede estar no metilada y la secuencia genómica del feto puede estar metilada. La secuencia genómica del feto puede estar hipermetilada con respecto a la secuencia genómica de la madre. Las secuencias genómicas fetales que se ha descubierto que están hipermetiladas con respecto a la secuencia genómica materna se proporcionan en las SEQ ID NO: 1-59. De manera alternativa, la secuencia genómica del feto puede estar hipometilada con respecto a la secuencia genómica de la madre. Las secuencias genómicas fetales que se ha descubierto que están hipometiladas con respecto a la secuencia genómica materna se proporcionan en las SEQ ID NO: 60-85. Las enzimas de restricción sensibles a metilación de la tecnología pueden ser sensibles a ácido nucleico hipo o hipermetilado.
El ácido nucleico fetal puede ser ácido nucleico extracelular. Generalmente, el ácido nucleico fetal extracelular puede ser de aproximadamente 500, 400, 300, 250, 200 o 150 (o cualquier número entre medias) bases nucleotídicas o menos. El ácido nucleico materno digerido puede ser de menos de aproximadamente 90, 100, 110, 120, 130, 140 o 150 pares de bases. El ácido nucleico fetal se puede amplificar, capturar o separar selectivamente a partir del o con respecto al ácido nucleico materno digerido basándose en el tamaño. Por ejemplo, se pueden diseñar cebadores de PCR para amplificar ácido nucleico mayor de aproximadamente 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115 o 120 (o cualquier número entre medias) pares de bases, amplificando así el ácido nucleico fetal y el ácido nucleico materno no digerido. El ácido nucleico se puede someter a fragmentación antes de determinados procedimientos de la tecnología. Los ejemplos de procedimientos de fragmentación de ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a, ultrasonidos y digestión con enzimas de restricción. El ácido nucleico fetal puede derivar de la placenta. El ácido nucleico fetal puede ser apoptótico.
La presente tecnología puede proporcionar un procedimiento en el que la muestra sea un miembro seleccionado de los siguientes: sangre entera materna, plasma o suero materno, líquido amniótico, una muestra de vellosidades coriónicas, material de biopsia de un embrión de preimplantación, células nucleadas fetales o restos celulares fetales aislados de la sangre materna, orina materna, saliva materna, lavados del aparato reproductor femenino y una
muestra obtenida mediante celocentesis o lavado pulmonar. La muestra biológica puede ser sangre materna. La muestra biológica puede ser una muestra de vellosidades coriónicas. La muestra materna se puede enriquecer de ácido nucleico fetal antes de determinados procedimientos de la presente tecnología. Se proporcionan ejemplos de procedimientos de enriquecimiento fetal en la publicación PCT n.os WO/2007140417A2, WO2009/032781A2 y la publicación de EE. UU. n.º 20050164241.
Se pueden eliminar las poblaciones de células nucleadas y anucleadas de la muestra antes de poner en práctica determinados procedimientos de la tecnología (por ejemplo, se eliminan sustancialmente todas las poblaciones de células nucleadas y anucleadas). La muestra se puede recoger, almacenar o transportar de una manera conocida por el experto en la técnica para minimizar la degradación o la calidad del ácido nucleico fetal presente en la muestra.
La muestra puede proceder de cualquier animal, incluyendo, pero no limitado a, ser humano, no ser humano, mamífero, reptil, ganado bovino, gato, perro, cabra, cerdo, simio inferior, simio superior, gorila, toro, vaca, oso, caballo, oveja, aves, ratón, rata, peces, delfín, ballena y tiburón o cualquier animal u organismo que pueda tener una anomalía cromosómica o trastorno asociado con el embarazo detectable.
Se puede tratar la muestra con un reactivo que modifique diferencialmente ADN metilado y no metilado. Por ejemplo, el reactivo puede comprender bisulfito; o el reactivo puede comprender una o más enzimas que escindan preferentemente ADN metilado; o el reactivo puede comprender una o más enzimas que escindan preferentemente ADN no metilado. Los ejemplos de enzimas de restricción sensibles a metilación incluyen, pero no se limitan a, Hhal and Hpall.
Se puede separar ácido nucleico fetal del ácido nucleico materno mediante un agente que se una específicamente a nucleótidos metilados en el ácido nucleico fetal. Se puede separar o eliminar ácido nucleico fetal del ácido nucleico materno mediante un agente que se una específicamente a nucleótidos metilados en el ácido nucleico materno equivalente. El agente que se une a nucleótidos metilados puede ser una proteína de unión a metil-CpG (MBD) o fragmento de la misma.
En el presente documento también se describe un procedimiento para determinar la cantidad o el número de copias de ADN fetal en una muestra materna que comprende ADN materno y fetal diferencialmente metilados. El procedimiento se lleva a cabo a) distinguiendo entre el ADN materno y fetal basándose en el estado de metilación diferencial; y b) cuantificando el ADN fetal de la etapa a). El procedimiento puede comprender a) digerir el ADN materno en una muestra materna usando una o más enzimas de restricción sensibles a metilación enriqueciendo así el ADN fetal; y b) determinar la cantidad de ADN fetal de la etapa a). La cantidad de ADN fetal se puede usar, entre otras cosas, para confirmar la presencia o ausencia de ácido nucleico fetal, determinar el sexo fetal, diagnosticar una enfermedad fetal o usar en conjunción con otros procedimientos de diagnóstico fetal para mejorar la sensibilidad o especificidad. El procedimiento para determinar la cantidad de ADN fetal no requiere el uso de una secuencia polimórfica. Por ejemplo, no se usa una proporción alélica para cuantificar el ADN fetal en la etapa b). El procedimiento para determinar la cantidad de ADN fetal puede no requerir el tratamiento de ADN con bisulfito para convertir los residuos de citosina en uracilo. Se sabe que el bisulfito degrada el ADN, reduciendo así adicionalmente el ácido nucleico fetal ya limitado presente en las muestras maternas. La determinación de la cantidad de ADN fetal en la etapa b) se puede hacer introduciendo uno o más competidores en concentraciones conocidas. De manera alternativa, la determinación de la cantidad de ADN fetal en la etapa b) se puede hacer mediante RT-PCR, extensión del cebador, secuenciación o recuento. Se puede determinar la cantidad de ácido nucleico usando la tecnología BEAMing, como se describe en la publicación de patente de EE. UU. n.º US20070065823. Se puede determinar la eficiencia de restricción y se puede usar la tasa de eficiencia para determinar adicionalmente la cantidad de ADN fetal. Se proporcionan ácidos nucleicos diferencialmente metilados ejemplares en las SEQ ID NO: 1-89.
En el presente documento también se describe un procedimiento para determinar la concentración de ADN fetal en una muestra materna, en el que la muestra materna comprende ADN materno y fetal diferencialmente metilados, que comprende a) determinar la cantidad total de ADN presente en la muestra materna; b) digerir selectivamente el ADN materno en una muestra materna usando una o más enzimas de restricción sensibles a metilación, enriqueciendo así el ADN fetal; c) determinar la cantidad de ADN fetal de la etapa b); y d) comparar la cantidad de ADN fetal de la etapa c) con respecto a la cantidad total de ADN de la etapa a), determinando así la concentración de ADN fetal en la muestra materna. Se puede usar la concentración de ADN fetal, entre otras cosas, en conjunción con otros procedimientos de diagnóstico fetal para mejorar la sensibilidad o especificidad. El procedimiento para determinar la cantidad de ADN fetal puede no requerir el uso de una secuencia polimórfica. Por ejemplo, no se usa una proporción alélica para cuantificar el ADN fetal en la etapa b). El procedimiento para determinar la cantidad de ADN fetal puede no requerir el tratamiento de ADN con bisulfito para convertir los residuos de citosina en uracilo. La determinación de la cantidad de ADN fetal en la etapa b) se puede hacer introduciendo uno o más competidores en concentraciones conocidas. De manera alternativa, la determinación de la cantidad de ADN fetal en la etapa b) se puede hacer mediante RT-PCR, secuenciación o recuento. Se puede determinar la eficiencia de restricción y se puede usar para determinar adicionalmente la cantidad de ADN total y ADN fetal. Se proporcionan ácidos nucleicos diferencialmente metilados ejemplares en las SEQ ID NO: 1-89.
En el presente documento también se describe un procedimiento para determinar la presencia o ausencia de una aneuploidia fetal usando ADN fetal de una muestra materna, en el que la muestra materna comprende ADN materno
y fetal diferencialmente metilados, que comprende a) digerir selectivamente el ADN materno en una muestra materna usando una o más enzimas de restricción sensibles a metilación, enriqueciendo así el ADN fetal; b) determinar la cantidad de ADN fetal de un cromosoma diana; c) determinar la cantidad de ADN fetal de un cromosoma de referencia; y d) comparar la cantidad de ADN fetal de la etapa b) con respecto a la etapa c), en el que una diferencia biológica o estadísticamente significativa entre la cantidad de ADN fetal diana y de referencia es indicativa de la presencia de una aneuploidia fetal. El procedimiento para determinar la cantidad de ADN fetal puede no requerir el uso de una secuencia polimórfica. Por ejemplo, no se usa una proporción alélica para cuantificar el ADN fetal en la etapa b). El procedimiento para determinar la cantidad de ADN fetal puede no requerir el tratamiento de ADN con bisulfito para convertir los residuos de citosina en uracilo. La determinación de la cantidad de ADN fetal en las etapas b) y c) se puede hacer introduciendo uno o más competidores en concentraciones conocidas. La determinación de la cantidad de ADN fetal en las etapas b) y c) se puede hacer mediante RT-PCR, secuenciación o recuento. Se puede comparar la cantidad de ADN fetal de un cromosoma diana determinado en la etapa b) con un control estándar, por ejemplo, la cantidad de ADN fetal de un cromosoma diana de embarazos euploides. Se puede determinar la eficiencia de restricción y se puede usar para determinar adicionalmente la cantidad de ADN fetal de un cromosoma diana y de un cromosoma de referencia. Se proporcionan ácidos nucleicos diferencialmente metilados ejemplares en las SEQ ID NO: 1-89.
En el presente documento también se describe un procedimiento para detectar la presencia o ausencia de una anomalía cromosómica analizando la cantidad o número de copias de ácido nucleico diana y ácido nucleico de control de una muestra de ácidos nucleicos diferencialmente metilados que comprende las etapas de: (a) enriquecer un ácido nucleico diana, de una muestra, y un ácido nucleico de control, de la muestra, basándose en su estado de metilación; (b) llevar a cabo un análisis del número de copias del ácido nucleico diana enriquecido en al menos una de las fracciones; (c) llevar a cabo un análisis del número de copias del ácido nucleico de control enriquecido en al menos una de las fracciones; (d) comparar el número de copias de la etapa (b) con el número de copias de la etapa (c); y (e) determinar si existe una anomalía cromosómica basándose en la comparación en la etapa (d), en el que el ácido nucleico diana y el ácido nucleico de control tienen el mismo o sustancialmente el mismo estado de metilación. En el presente documento también se describe un procedimiento para detectar la presencia o ausencia de una anomalía cromosómica analizando la cantidad o número de copias de ácido nucleico diana y ácido nucleico de control de una muestra de ácidos nucleicos diferencialmente metilados que comprende las etapas de: (a) unir un ácido nucleico diana, de una muestra, y un ácido nucleico de control, de la muestra, a un agente de unión; (b) eluir el ácido nucleico unido basándose en el estado de metilación, en el que los ácidos nucleicos diferencialmente metilados se eluyen al menos parcialmente en fracciones separadas; (c) llevar a cabo un análisis del número de copias del ácido nucleico diana eluido en al menos una de las fracciones; (d) llevar a cabo un análisis del número de copias del ácido nucleico de control eluido en al menos una de las fracciones; (e) comparar el número de copias de la etapa (c) con el número de copias de la etapa (d); y (f) determinar si existe una anomalía cromosómica basándose en la comparación en la etapa (e), en el que el ácido nucleico diana y el ácido nucleico de control tienen el mismo o sustancialmente el mismo estado de metilación. Se proporcionan ácidos nucleicos diferencialmente metilados en las SEQ ID NO: 1-89.
En el presente documento también se describe un procedimiento para detectar la presencia o ausencia de una anomalía cromosómica analizando la proporción alélica de ácido nucleico diana y ácido nucleico de control de una muestra de ácidos nucleicos diferencialmente metilados que comprende las etapas de: (a) unir un ácido nucleico diana, de una muestra, y un ácido nucleico de control, de la muestra, a un agente de unión; (b) eluir el ácido nucleico unido basándose en el estado de metilación, en el que los ácidos nucleicos diferencialmente metilados se eluyen al menos parcialmente en fracciones separadas; (c) llevar a cabo un análisis de la proporción alélica del ácido nucleico diana eluido en al menos una de las fracciones; (d) llevar a cabo un análisis de la proporción alélica del ácido nucleico de control eluido en al menos una de las fracciones; (e) comparar la proporción alélica de la etapa c con la proporción alélica de la etapa (d); y (f) determinar si existe una anomalía cromosómica basándose en la comparación en la etapa (e), en el que el ácido nucleico diana y el ácido nucleico de control tienen el mismo o sustancialmente el mismo estado de metilación. Se proporcionan ácidos nucleicos diferencialmente metilados en las SEQ ID NO: 1-89, y se proporcionan SNP en los ácidos nucleicos diferencialmente metilados en la tabla 2. Los procedimientos también pueden ser útiles para detectar un trastorno asociado con el embarazo.
Se puede determinar la cantidad de ácido nucleico materno usando los procedimientos basados en metilación de la tecnología. Por ejemplo, se puede separar ácido nucleico fetal (por ejemplo, digerido usando una enzima sensible a metilación) del ácido nucleico materno en una muestra, y se puede cuantificar el ácido nucleico materno usando los procedimientos de la tecnología. Una vez que se determina la cantidad de ácido nucleico materno, la cantidad se puede restar de la cantidad total de ácido nucleico en una muestra para determinar la cantidad de ácido nucleico fetal. Se puede usar la cantidad de ácido nucleico fetal para detectar rasgos fetales, incluyendo aneuploidia fetal, como se describe en el presente documento.
Los procedimientos descritos en el presente documento también pueden ser útiles para detectar un trastorno asociado con el embarazo. La muestra puede comprender ácido nucleico fetal o ácido nucleico fetal y ácido nucleico materno. En el caso en el que la muestra comprenda ácido nucleico fetal y materno, el ácido nucleico fetal y el ácido nucleico materno pueden tener un estado de metilación diferente. Las especies de ácido nucleico con un estado de metilación diferente se pueden diferenciar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Se puede enriquecer el ácido nucleico fetal mediante la digestión selectiva de ácido nucleico materno mediante una enzima de restricción sensible a metilación. Se puede enriquecer el ácido nucleico fetal mediante la digestión selectiva de ácido
nucleico materno usando dos o más enzimas de restricción sensibles a metilación en el mismo ensayo. El ácido nucleico diana y ácido nucleico de control pueden proceder ambos del feto. El tamaño promedio del ácido nucleico fetal puede ser de aproximadamente 100 bases a aproximadamente 500 bases de longitud. La anomalía cromosómica puede ser una aneuploidia, tal como la trisomía 21. El ácido nucleico diana puede ser al menos una porción de un cromosoma que puede ser anómalo y el ácido nucleico de control puede ser al menos una porción de un cromosoma que muy raramente es anómalo. Por ejemplo, cuando el ácido nucleico diana procede del cromosoma 21, el ácido nucleico de control procede de un cromosoma distinto del cromosoma 21, preferentemente otro autosoma. El agente de unión puede ser una proteína de unión específica de metilación, tal como MBD-Fc. También se amplifica y/o cuantifica el ácido nucleico enriquecido o eluido mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Se puede cuantificar ADN fetal usando un procedimiento que no requiera el uso de una secuencia polimórfica. Por ejemplo, no se usa una proporción alélica para cuantificar el ADN fetal. El procedimiento para cuantificar la cantidad de ADN fetal puede no requerir el tratamiento de ADN con bisulfito para convertir los residuos de citosina en uracilo.
Los procedimientos descritos en el presente documento pueden incluir la etapa adicional de determinar la cantidad de una o más secuencias específicas del cromosoma Y en una muestra. Se puede comparar la cantidad de ácido nucleico fetal en una muestra determinada usando los procedimientos basados en metilación de la tecnología con la cantidad de ácido nucleico del cromosoma Y presente.
Los procedimientos para diferenciar ácido nucleico basándose en el estado de metilación incluyen, pero no se limitan a, captura sensible a metilación, por ejemplo, usando fragmento MBD2-Fc; procedimientos de conversión con bisulfito, por ejemplo, MSP (PCR sensible a metilación), COBRA, extensión del cebador de nucleótido único sensible a metilación (Ms-SNuPE) o tecnología MassCLEAVE™ de Sequenom; y el uso de enzimas de restricción sensibles a metilación. Excepto cuando se indique explícitamente, se puede usar cualquier procedimiento para diferenciar ácido nucleico basado en el estado de metilación con las composiciones y procedimientos de la tecnología.
Los procedimientos de la tecnología descritos en el presente documento pueden comprender adicionalmente una etapa de amplificación. Se puede llevar a cabo la etapa de amplificación mediante PCR, tal como PCR específica de metilación. Se puede llevar a cabo la reacción de amplificación en moléculas únicas, por ejemplo, mediante PCR digital, que se describe adicionalmente en la patente de EE. UU. n.os 6,143,496 y 6,440,706. El procedimiento puede no requerir amplificación. Por ejemplo, se puede determinar la cantidad de ADN fetal enriquecido contando el ADN fetal (o marcadores de secuencia unidos al mismo) con un citómetro de flujo o mediante medios de secuenciación que no requieren amplificación. Se puede determinar la cantidad de ADN fetal mediante una reacción de amplificación que genera amplicones más grandes que el ácido nucleico materno digerido, enriqueciendo así adicionalmente el ácido nucleico fetal.
Para los procedimientos que requieren análisis de secuencia, se puede usar una cualquiera de las siguientes tecnologías de secuenciación: un procedimiento de extensión del cebador (por ejemplo, iPLEX®; Sequenom, Inc.), secuenciación directa de ADN, polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (análisis RFLP), análisis de oligonucleótido especifico de alelo (ASO), PCR específica de metilación (MSPCR), análisis por pirosecuenciación, análisis por acycloprime, inmunotransferencia por puntos inversa, micromatrices GeneChip, hibridación dinámica específica de alelo (DASH), sondas de ácido péptidonucleico (APN) y ácido nucleico bloqueado (ANB), TaqMan, balizas moleculares, tinte intercalante, cebadores de FRET, dNTP/ddNTP marcados con fluorescencia, AlphaScreen, SNPstream, análisis de bits genéticos (GBA), minisecuenciación multiplex, SNaPshot, ensayo GOOD, minisec. de micromatrices, extensión del cebador fijado a matriz (APEX), extensión del cebador sobre micromatrices, matrices de marcadores, microesferas codificadas, incorporación dirigida por molde (TDI), polarización por fluorescencia, ensayo de unión de oligonucleótidos (OLA) colorimétrico, OLA codificado de secuencia, unión de micromatrices, reacción en cadena de la ligasa, sondas candado, ensayo Invader™, hibridación que usa al menos una sonda, hibridación que usa al menos una sonda marcada con fluorescencia, electroforesis, clonación y secuenciación, por ejemplo, llevadas a cabo en la plataforma 454 (Roche) (Margulies, M. et al. 2005 Nature 437, 376-380), analizador genómico de Illumina (o plataforma Solexa) o sistema SOLiD (Applied Biosystems) o la tecnología de secuenciación de molécula de ADN única real de Helicos (Harris T D et al. 2008 Science, 320,106-109), la tecnología de molécula única en tiempo real (SMRT.TM.) de Pacific Biosciences o secuenciación basada en nanoporos (Soni GV and Meller A. 2007 Clin Chem 53:1996-2001) y combinaciones de los mismos. Los procedimientos basados en nanoporos pueden incluir la secuenciación de ácidos nucleicos usando un nanoporo o el recuento de moléculas de ácido nucleico usando un nanoporo, por ejemplo, basándose en el tamaño en el que la información de secuencia no está determinada.
Se puede determinar el número de copias absoluto de uno o más ácidos nucleicos, por ejemplo, usando espectrometría de masas, un sistema que usa un enfoque de PCR competitiva para las mediciones del número de copias absoluto. Véase, por ejemplo, Ding C, Cantor CR (2003), A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS. Proc Natl Acad Sci U S A 100:3059-3064, y la solicitud de patente de EE. UU. n.º 10/655762, que se publicó como la publicación de patente de EE. UU. n.º 20040081993.
La cantidad de la secuencia genómica se puede comparar con un control estándar, en el que un incremento o disminución del control estándar indica la presencia o evolución de un trastorno asociado con el embarazo. Por ejemplo, la cantidad de ácido nucleico fetal se puede comparar con la cantidad total de ADN presente en la muestra.
O, al detectar la presencia o ausencia de aneuploidia fetal, la cantidad de ácido nucleico fetal del cromosoma diana se puede comparar con la cantidad de ácido nucleico fetal de un cromosoma de referencia. Preferentemente el cromosoma de referencia es otro autosoma que tiene una baja tasa de aneuploidia. La proporción de ácido nucleico fetal diana para hacer referencia a ácido nucleico fetal se puede comparar a la misma proporción de un embarazo euploide normal. Por ejemplo, se puede determinar una proporción de control a partir de una muestra de ADN obtenida de una mujer que porta un feto sano que no tiene ninguna anomalía cromosómica. Preferentemente, se usa un panel de muestras de control. Si se conocen determinadas anomalías cromosómicas, también se pueden tener estándares que sean indicativos de una enfermedad o afección específica. De esta manera, por ejemplo, para cribar tres aneuploidias cromosómicas diferentes en un plasma materno de una mujer embarazada, se usa preferentemente un panel de ADN de control que se han aislado de madres que se sabe que portan un feto, por ejemplo, con trisomía del cromosoma 13, 18 o 21 y una madre que está embarazada de un feto que no tiene una anomalía cromosómica.
En el presente documento también se describe un procedimiento en el que los alelos del ácido nucleico diana y el ácido nucleico de control se diferencian mediante variación de secuencia. La variación de secuencia puede ser un polimorfismo mononucleotídico (SNP) o un polimorfismo de inserción/deleción. El ácido nucleico fetal puede comprender al menos un polimorfismo heterocigótico de alta frecuencia (por ejemplo, de aproximadamente un 2 %, 3 %, 4 %, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11 %, 12%, 13 %, 14 %, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20 %, 25% o más de la tasa de frecuencia), que permite la determinación de la proporción alélica del ácido nucleico a fin de evaluar la presencia o ausencia de la anomalía cromosómica. En la tabla 2 se proporciona una lista de SNP ejemplares, sin embargo, esta no representa una lista completa de los alelos polimórficos que se pueden usar como parte de la tecnología. También se puede considerar cualquier SNP que satisfaga los siguientes criterios: (a) el SNP tiene una frecuencia de heterocigosis mayor de aproximadamente un 2 % (preferentemente en un intervalo de poblaciones diferentes), (b) el SNP es un locus heterocigótico; y (c) (i) el SNP está en una secuencia de ácido nucleico descrita en el presente documento, o (c) (iii) el SNP está en aproximadamente de 5 a aproximadamente 2000 pares de bases de un SNP descrito en el presente documento (por ejemplo, en aproximadamente 5,10,15, 20, 25, 30,40, 50, 60,70, 80, 90,100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900,1000,1250,1500,1750 o 2000 pares de bases de un SNP descrito en el presente documento).
La variación de secuencia puede ser un polimorfismo de repeticiones cortas en tándem (STR). La variación de secuencia se puede encontrar en un sitio de restricción, con lo que un alelo es susceptible a la digestión mediante una enzima de restricción y uno o más de los demás alelos no lo son. La variación de secuencia puede ser un sitio de metilación.
Llevar a cabo un análisis de la proporción alélica puede comprender determinar la proporción de alelos del ácido nucleico diana y ácido nucleico de control del feto de una mujer embarazada obteniendo una muestra biológica que contiene ácido nucleico de la mujer embarazada, en el que la muestra biológica contiene ácido nucleico fetal, separar parcial o totalmente el ácido nucleico fetal del ácido nucleico materno basándose en la metilación diferencial, discriminar los alelos del ácido nucleico diana y el ácido nucleico de control, seguido de la determinación de la proporción de los alelos, y detectar la presencia o ausencia de un trastorno cromosómico en el feto basándose en la proporción de alelos, en el que una proporción por encima o por debajo de una proporción euploide normal es indicativa de un trastorno cromosómico. El ácido nucleico diana puede proceder de un supuesto cromosoma aneuploide (por ejemplo, cromosoma 21) y el ácido nucleico de control puede proceder de un cromosoma euploide del mismo feto.
La presente tecnología se puede combinar con otros marcadores fetales para detectar la presencia o ausencia de múltiples anomalías cromosómicas, en las que las anomalías cromosómicas se seleccionan de las siguientes: trisomía 21, trisomía 18 y trisomía 13, o combinaciones de las mismas. El trastorno cromosómico puede implicar el cromosoma X o el cromosoma Y.
Las composiciones o procedimientos se pueden multiplexar en una reacción única. Por ejemplo, se puede determinar la cantidad de ácido nucleico fetal en múltiples locus en el genoma. O, al detectar la presencia o ausencia de aneuploidia fetal, la cantidad de ácido nucleico fetal se puede determinar en múltiples locus en uno o más cromosomas diana (por ejemplo, los cromosomas 13, 18 o 21) y en uno o más cromosomas de referencia. Si se está usando una proporción alélica, uno o más alelos de la tabla 2 se puede detectar y discriminar simultáneamente. Al determinar las proporciones alélicas, los procedimientos de multiplexación son particularmente importantes cuando no se conoce el genotipo en un locus polimórfico. En algunos casos, por ejemplo, cuando la madre y el niño son homocigóticos en el locus polimórfico, el ensayo puede no ser informativo. Se enriquecen, separan y/o examinan secuencias polinucleotídicas mayores de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 200, 300 o 500, y cualquier nivel intermedio, de la tecnología de acuerdo con los procedimientos de la tecnología. Al detectar una anomalía cromosómica analizando el número de copias de ácido nucleico diana y ácido nucleico de control, se puede necesitar analizar menos de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11,12,13 o 14 secuencias polinucleotídicas para detectar con precisión la presencia o ausencia de una anomalía cromosómica. Se pueden usar las composiciones o procedimientos de la tecnología para evaluar muestras que se han dividido en 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18, 19, 20, 25,30, 35, 40, 50,100 o más duplicados, o en equivalentes de molécula única. Se proporcionan procedimientos para analizar ácidos nucleicos fetales de una muestra materna en duplicados, incluyendo los análisis de molécula única, en la solicitud de EE. UU. n.º 11/364,294, que se publicó como la publicación de patente de EE. UU. n.º US 2007-0207466 A1.
En el presente documento también se describe un procedimiento en el que una etapa de comparación muestra un riesgo incrementado de que un feto tenga un trastorno cromosómico si la proporción de los alelos o el número de copias absoluto del ácido nucleico diana es más alto o más bajo en 1 desviación estándar de la secuencia de control estándar. La etapa de comparación puede mostrar un riesgo incrementado de que un feto tenga un trastorno cromosómico si la proporción de los alelos o el número de copias absoluto del ácido nucleico diana es más alto o más bajo en 2 desviaciones estándar de la secuencia de control estándar. La etapa de comparación puede mostrar un riesgo incrementado de que un feto tenga un trastorno cromosómico si la proporción de los alelos o el número de copias absoluto del ácido nucleico diana es más alto o más bajo en 3 desviaciones estándar de la secuencia de control estándar. La c de comparación muestra un riesgo incrementado de que un feto tenga un trastorno cromosómico si la proporción de los alelos o el número de copias absoluto del ácido nucleico diana es más alto o más bajo que una desviación estándar estadísticamente significativa del control. El control estándar puede ser una referencia materna, y, de manera alternativa, el control estándar puede ser un cromosoma de referencia fetal (por ejemplo, autosoma no trisómico).
Los procedimientos de la tecnología se pueden combinar con otros procedimientos para diagnosticar una anomalía cromosómica. Por ejemplo, un procedimiento de diagnóstico no invasivo puede requerir la confirmación de la presencia o ausencia de ácido nucleico fetal, tal como una prueba de sexo para un feto de sexo femenino o para confirmar un feto de sexo femenino RhD negativo en una madre Rh negativa. Se pueden usar las composiciones y procedimientos de la tecnología para determinar el porcentaje de ácido nucleico fetal en una muestra materna a fin de posibilitar otro procedimiento de diagnóstico que requiere que se conozca el porcentaje de ácido nucleico fetal. Por ejemplo, ¿satisface una muestra determinados requisitos de concentración umbral? Al determinar una proporción alélica para diagnosticar una aneuploidia fetal de una muestra materna, se puede requerir la cantidad o concentración de ácido nucleico fetal para hacer un diagnóstico con una sensibilidad y especificidad dadas. Las composiciones y procedimientos de la tecnología para detectar una anomalía cromosómica se pueden combinar con otros procedimientos conocidos, mejorando así la sensibilidad y especificidad globales del procedimiento de detección. Por ejemplo, los modelos matemáticos han sugerido que un programa de cribado del primer trimestre combinado que utiliza la edad materna (EM), espesor de translucidez nucal (TN), beta hCG libre de suero y PAPP-A en suero detecta más de un 80 % de los fetos con síndrome de Down para una tasa de pruebas invasivas de un 5 % (Wald and Hackshaw, Prenat Diagn 17(9):921-9 (1997). Sin embargo, la combinación de procedimientos de detección de aneuploidia comúnmente usados combinados con los procedimientos basados en ácido nucleico fetal libre no invasivos descritos en el presente documento pueden ofrecer precisión mejorada con una tasa de falsos positivos más baja. Se proporcionan ejemplos de procedimientos de diagnóstico combinados en la publicación PCT número WO2008157264A2 (asignada al solicitante). Los procedimientos de la tecnología se pueden combinar con procedimientos basados en células, en los que las células fetales se consiguen no invasiva o invasivamente.
Un riesgo incrementado de una anomalía cromosómica se puede basar en la consecuencia o resultado(s) producido(s) a partir de las composiciones o procedimientos proporcionados en el presente documento. Un ejemplo de un resultado es una desviación del número de copias absoluto euploide o proporción alélica, que indica la presencia de aneuploidia cromosómica. Este incremento o disminución en el número de copias absoluto o la proporción del control estándar indica un riesgo incrementado de tener un feto con una anomalía cromosómica (por ejemplo, trisomía 21). La información que hace referencia a un procedimiento descrito en el presente documento, tal como una consecuencia, resultado o riesgo de trisomía o aneuploidia, por ejemplo, se puede transmitir, interpretar, registrar y/o presentar en cualquier medio adecuado. Por ejemplo, se puede transmitir un resultado en un medio para guardar, almacenar, compartir, comunicar o de otro modo analizar el resultado. Un medio puede ser tangible (por ejemplo, papel) o intangible (por ejemplo, un medio electrónico) y los ejemplos de medios incluyen, pero no están limitados a, bases de datos/medios informáticos, diagramas, historias clínicas, registros, registros del paciente, gráficos y tablas y cualquier otro medio de expresión. La información a veces se almacena y/o interpreta en forma legible por ordenador y a veces se almacena y se organiza en una base de datos. La información se puede transferir de una ubicación a otra usando un medio físico (por ejemplo, papel) o un medio legible por ordenador (por ejemplo, un medio de transmisión o almacenamiento magnético y/u óptico, disquete, disco duro, memoria de acceso aleatorio, unidad de procesamiento informático, señal de fax, señal de satélite, transmisión a través de Internet o transmisión a través de la red informática mundial).
En algunos casos, se puede usar una isla CpG como la secuencia genómica que contiene CpG, mientras que en otros casos la secuencia genómica que contiene CpG puede no ser una isla CpG. En el presente documento también se describe un kit para llevar a cabo los procedimientos de la tecnología. Un componente del kit es un agente de unión sensible a metilación.
[BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS]
FIGURA 1: muestra el diseño de la proteína MBD-Fc recombinante usada para separar ADN diferencialmente metilado.
FIGURA 2: muestra que la proteína similar a anticuerpo de unión a metil-CpG tiene una afinidad alta y avidez alta por su "antígeno", que es preferentemente ADN que está metilado en dinucleótidos CpG.
FIGURA 3: muestra que el dominio de unión a metilo de MBD-FC se une a moléculas de ADN independientemente de
su estado de metilación. La fuerza de esta interacción proteína/ADN se define mediante el nivel de metilación del ADN. Después de la unión a ADN genómico, se pueden usar soluciones de eluato de concentraciones de sal en incremento para fraccionar ADN metilado y no metilado, lo que permite una separación controlada.
FIGURA 4: muestra el experimento usado para identificar ADN diferencialmente metilado de un feto y la madre usando la proteína MBD-Fc recombinante y una micromatriz.
FIGURA 5: muestra los resultados típicos generados mediante el procedimiento EpiTYPER™ de Sequenom® que se usó para validar los resultados generados del experimento ilustrado en la figura 4.
FIGURA 6: muestra la correlación entre las proporciones en escala logarítmica derivadas de análisis por micromatrices (eje x) y las diferencias de metilación obtenidas mediante el análisis EpiTYPER (eje y). Cada punto de datos representa el promedio para una región en todas las muestras medidas. El análisis por micromatrices es de naturaleza comparativa porque la fracción altamente metilada del ADN materno se hibrida junto con la fracción altamente metilada de ADN placentario. Los valores positivos indican metilación más alta de las muestras placentarias. En la espectrometría de masas, cada muestra se mide individualmente. En primer lugar, se calculó la diferencia en la metilación restando los valores de metilación materna del valor metilación de la placenta. Para comparar los resultados con los datos de micromatrices, se calculó el promedio de las diferencias para todos los pares de ADN materno/placentario.
FIGURA 8: se muestra la correlación entre el número de moléculas de ADNg que se esperaban y el número de moléculas medidas mediante PCR competitiva en combinación con análisis de espectrometría de masas. En este experimento, se usó ADN derivado de sangre entera (signos más en negrita) y ADN completamente metilado (cruces en rojo) disponible comercialmente en una proporción de 90 a 10. Se usó la proteína de fusión MBD-FC para separar la fracción metilada y no la metilada de ADN. Cada fracción se sometió a análisis por PCR competitiva con lectura de espectrometría de masas. El procedimiento se ha descrito anteriormente para el análisis de variaciones del número de copias y está disponible comercialmente para el análisis de expresión génica. El enfoque permite la cuantificación absoluta de moléculas de ADN con la ayuda de unos oligonucleótidos sintéticos de concentración conocida. En este experimento, se seleccionó como diana el locus MGMT, que no se metiló en la muestra de sangre entera usada en el presente documento. Al usar una entrada de 300 copias de ADNg totales se espera observar 270 copias de ADN no metilado y 30 copias de ADN metilado. Los números de copias medidas están en gran medida de acuerdo con los valores esperados. El punto de datos a 600 copias de ADN de entrada indica un sesgo en la reacción y muestra que este experimento demostrativo preliminar inicial se necesita seguir con más trabajo de desarrollo antes de que se pueda usar el ensayo. Sin embargo, estos datos iniciales indican la viabilidad del enfoque para capturar y cuantificar unas cuantas copias de ADN metilado en presencia de un exceso de especies de ADN no metilado.
FIGURA 9A-9C: se muestran representaciones en gráficos de barras de las diferencias de metilación obtenidas a partir del análisis por micromatrices (barras oscuras) y el análisis de espectrometría de masas (barras en gris claro) con respecto a su ubicación genómica. Se proporciona una representación individual para cada una de las 85 regiones que se identificó que estaban diferencialmente metiladas mediante micromatrices. El eje x para cada representación muestra la posición cromosómica de la región. El eje y representa la proporción en escala logarítmica (en el caso de las micromatrices) y las diferencias de metilación (en el caso de los resultados de espectrometría de masas). Para las micromatrices, cada sonda de hibridación en el área se muestra como una única barra en negro (o en gris oscuro). Para los resultados de espectrometría de masas, cada sitio CpG se muestra como una barra en gris claro. Las barras que muestran valores mayores que cero indican metilación del ADN más alta en las muestras placentarias en comparación con el ADN materno. Para algunos genes, las diferencias son pequeñas (es decir, RBI o DSCR6), pero todavía estadísticamente significativas. Esas regiones serían menos adecuadas para una estrategia de enriquecimiento de ADN fetal.
FIGURA 10: muestra un ejemplo del procedimiento cuantificador fetal. El ácido nucleico materno se digiere selectivamente y el ácido nucleico fetal restante se cuantifica usando un competidor de concentración conocida. En este esquema, el analito se separa y cuantifica mediante un espectrómetro de masas.
FIGURA 11: muestra un ejemplo del procedimiento de diagnóstico fetal basado en metilación. El ácido nucleico materno se digiere selectivamente y el ácido nucleico fetal restante se cuantifica para tres cromosomas diferentes (13, 18 y 21). Las partes 2 y 3 de la figura ilustran la distribución de tamaños del ácido nucleico en la muestra antes y después de la digestión. Las reacciones de amplificación pueden ser específicas de tamaño (por ejemplo, mayor de amplicones de 100 pares de bases) de tal manera que favorezcan al ácido nucleico fetal no digerido más largo frente al ácido nucleico materno digerido, enriqueciendo así el ácido nucleico fetal. Los espectros en la parte inferior de la figura muestran una cantidad incrementada de ácido nucleico fetal del cromosoma 21 indicativo de la trisomía 21.
FIGURA 12: muestra el número total de copias genómicas amplificables de cuatro muestras de ADN diferentes aisladas de la sangre de mujeres no embarazadas. Se diluyó cada muestra para que contuviera aproximadamente 2500, 1250, 625 o 313 copias por reacción. Se obtuvo cada medición tomando la proporción de ADN/competidor media obtenida de dos ensayos del número de copias total (ALB y ARNasaP en la tabla X). Como muestra la figura 12, el número de copias total es preciso y estable en las diferentes muestras, validando de esta manera la utilidad del enfoque basado en competidores.
FIGURAS 13A y B: se creó un sistema modelo que contenía un número constante de ADN no metilado materno con cantidades variables de ADN metilado placentario de feto de sexo masculino agregado. A las muestras se agregaron cantidades placentarias de feto de sexo masculino que variaban desde aproximadamente un 0 a un 25 % con respecto al ADN no metilado materno. Se calculó la fracción de ADN placentario usando las proporciones obtenidas de los ensayos de metilación (figura 13A) y el marcador del cromosoma Y (figura 13B) en comparación con el ensayo del número de copias total. En la tabla X, se proporcionan los marcadores de metilación y del cromosoma Y.
FIGURAS 14 A y B: muestran los resultados del ensayo del número de copias total de muestras de plasma. En la figura 14A, se muestra el número de copias para cada muestra. Dos muestras (n.º 25 y 26) tienen un número de copias total significativamente más alto que todas las demás muestras. Se obtuvo una media de aproximadamente 1300 copias amplificables/ml de plasma (intervalo de 766-2055). La figura 14B muestra una representación de cajas y bigotes de los valores dados, que resume los resultados.
FIGURAS 15A y B: se representa la cantidad (o número de copias) de ácido nucleico fetal de 33 muestras de plasma diferentes tomadas de mujeres embarazadas con fetos de sexo masculino. Los números de copias obtenidos se calcularon usando los marcadores de metilación y los marcadores específicos del cromosoma Y usando los ensayos proporcionados en la tabla X. Como se puede ver en la figura 15B, la representación de cajas y bigotes de los valores dados indicó una diferencia mínima entre las dos mediciones diferentes, validando de esta manera la precisión y estabilidad del procedimiento.
FIGURA 16: muestra una correlación de pares entre los resultados obtenidos usando los marcadores de metilación frente al marcador del cromosoma Y de la figura 15A.
FIGURA 17: muestra la eficiencia de digestión de las enzimas de restricción usando la proporción de digestión para el control frente al competidor y comparando este valor con los ensayos del número de copias total medio. Aparte de la muestra 26, todas las reacciones indican que la eficiencia está por encima de aproximadamente un 99 %.
FIGURA 18: proporciona un procedimiento específico para calcular la fracción (o concentración) de ADN fetal en una muestra usando los marcadores específicos del cromosoma Y para embarazos de sexo masculino y la media de la fracción metilada para todos los embarazos (independientemente del sexo fetal).
FIGURA 19: proporciona un procedimiento específico para calcular la fracción (o concentración) de ADN fetal en una muestra sin los marcadores específicos del cromosoma Y. En cambio, únicamente se usaron los ensayos para la cuantificación de la metilación para determinar la concentración de ADN fetal.
FIGURA 20: muestra una prueba de la t con cálculo de potencia para un diagnóstico de trisomía 21 simulado usando los procedimientos de la tecnología. La figura muestra la relación entre el coeficiente de variación (CV) en el eje x y la potencia para discriminar las poblaciones de ensayo usando una prueba de la t simple (eje y). Los datos indican que en un 99 % de todos los casos, se pueden discriminar las dos poblaciones (euploide frente a aneuploide) en un nivel de significación de 0,001 siempre que el CV sea de un 5 % o menos.
DEFINICIONES
El término "trastorno asociado con el embarazo", como se usa en esta solicitud, se refiere a cualquier afección o enfermedad que pueda afectar a una mujer embarazada, el feto, o tanto a la mujer como al feto. Dicha afección o enfermedad puede manifestar sus síntomas durante un periodo de tiempo limitado, por ejemplo, durante el embarazo
o el parto, o puede durar toda la vida del feto después de su nacimiento. Algunos ejemplos de un trastorno asociado con el embarazo incluyen embarazo ectópico, preeclampsia, parto prematuro, incompatibilidad RhD, anomalías cromosómicas fetales, tales como trisomía 21, y trastornos fetales heredados genéticamente, tales como fibrosis quística, talasemia beta u otros trastornos monogénicos. La capacidad de enriquecer ácido nucleico fetal de una muestra materna puede demostrar ser particularmente útil para el diagnóstico prenatal no invasivo de enfermedades autosómicas recesivas, tales como el caso cuando una madre y un padre comparten una enfermedad idéntica que provoca mutación, un caso previamente percibido como un desafío para el diagnóstico prenatal de no trisomía basado en plasma.
El término "anomalía cromosómica" o "aneuploidia" como se usa en el presente documento se refiere a una desviación entre la estructura del cromosoma objeto y un cromosoma homólogo normal. El término "normal" se refiere al cariotipo predominante o patrón en bandas encontrado en personas sanas de una especie particular, por ejemplo, un genoma euploide (en seres humanos, 46XX o 46XY). Una anomalía cromosómica puede ser numérica o estructural, e incluye, pero no se limita a, aneuploidia, poliploidia, inversión, una trisomía, una monosomía, duplicación, deleción, deleción de una parte de un cromosoma, adición, adición de una parte del cromosoma, inserción, un fragmento de un cromosoma, una región de un cromosoma, reordenamiento cromosómico y translocación. La anomalía cromosómica también se puede referir a un estado de anomalía cromosómica donde una porción de uno o más cromosomas no es un múltiplo exacto del número haploide habitual, por ejemplo, debido a translocación cromosómica. La translocación cromosómica (por ejemplo, translocación entre el cromosoma 21 y 14, donde alguno del cromosoma 14 se reemplaza por el cromosoma 21 extra) puede provocar trisomía 21 parcial. Una anomalía cromosómica se puede correlacionar con la presencia de un trastorno patológico o con una predisposición a desarrollar un trastorno patológico. Se puede detectar una anomalía cromosómica mediante análisis cuantitativo de
ácido nucleico.
Los términos "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" se pueden usar indistintamente por toda la divulgación. Los términos se refieren a ácidos nucleicos de cualquier composición de, tales como ADN (por ejemplo, ADN complementario (ADNc), ADN genómico (ADNg) y similares), ARN (por ejemplo, ARN mensajero (ARNm), ARN inhibidor corto (ARNic), ARN ribosómico (ARNr), ARNt, microARN, ARN altamente expresado por el feto o placenta y similares) y/o análogos de ADN o ARN (por ejemplo, que contienen análogos de bases, análogos de azúcares y/o un esqueleto no nativo y similares), híbridos de ARN/ADN y ácidos nucleicos de poliamida (APN), todos los cuales pueden estar en forma monocatenaria o bicatenaria, y a menos que se limite de otro modo, pueden abarcar análogos conocidos de nucleótidos naturales que pueden funcionar de manera similar a los nucleótidos naturales. Por ejemplo, los ácidos nucleicos proporcionados en las SEQ ID NO: 1-89 (véase la tabla 4) pueden estar en cualquier forma útil para realizar los procedimientos en el presente documento (por ejemplo, lineal, circular, superenrollada, monocatenaria, bicatenaria y similares) o pueden incluir variaciones (por ejemplo, inserciones, deleciones o sustituciones) que no alteren su utilidad como parte de la presente tecnología. Un ácido nucleico puede ser, o puede proceder de, un plásmido, fago, secuencia de replicación autónoma (SRA), centrómero, cromosoma artificial, cromosoma u otro ácido nucleico que se pueda replicar o replicarse in vitro o en una célula huésped, una célula, un núcleo celular o citoplasma de una célula. Un ácido nucleico molde puede proceder de un único cromosoma (por ejemplo, una muestra de ácido nucleico puede proceder de un cromosoma de una muestra obtenida de un organismo diploide). A menos que se limite específicamente, el término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia y se metabolizan de una manera similar a los nucleótidos naturales. A menos que se indique de otro modo, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente variantes modificadas de manera conservadora de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones redundantes), alelos, ortólogos, polimorfismos mononucleotídicos (SNP) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, se pueden lograr sustituciones de codones redundantes generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuos de desoxiiosina y/o bases mixtas (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); y Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). El término ácido nucleico se usa indistintamente con locus, gen, ADNc y ARNm codificados por un gen. El término también puede incluir, como equivalentes, derivados, variantes y análogos de ARN o ADN sintetizado a partir de análogos de nucleótidos, polinucleótidos monocatenarios ("sentido" o "antisentido", "hebra codificante" o "hebra no codificante", marco de lectura "directo" o marco de lectura "inverso") y bicatenarios. Los desoxirribonucleótidos incluyen desoxiadenosina, desoxicitidina, desoxiguanosina y desoxitimidina. Para el ARN, la base citosina se reemplaza por uracilo. Un ácido nucleico molde se puede preparar usando un ácido nucleico obtenido de un sujeto como molde.
Un "ácido nucleico que comprende uno o más sitios CpG" o una "secuencia genómica que contiene CpG" como se usa en el presente documento se refiere a un segmento de secuencia de ADN en una ubicación definida en el genoma de una persona, tal como un feto humano o una mujer embarazada. Típicamente, una "secuencia genómica que contiene CpG" es de al menos 15 nucleótidos de longitud y contiene al menos una citosina. Preferentemente, puede ser de al menos 30, 50, 80,100,150, 200, 250 o 300 nucleótidos de longitud y contiene al menos 2, 5,10,15, 20, 25 o 30 citosinas. Para una “secuencia genómica que contiene CpG” cualquiera en una ubicación dada, por ejemplo, en una región centrada alrededor de un locus genético dado (véase la tabla 1), pueden existir variaciones de secuencia nucleotídica de persona a persona y de alelo a alelo incluso para la misma persona. Típicamente, dicha región centrada alrededor de un locus genético definido (por ejemplo, una isla CpG) contiene el locus, así como secuencias en dirección 5′ y/o en dirección 3′. Cada una de las secuencias en dirección 5′ o en dirección 3′ (contando desde el límite 5’ o 3' del locus genético, respectivamente) puede ser tan larga como de 10 kb, en otros casos pueden ser tan larga como de 5 kb, 2 kb, 1 kb, 500 pb, 200 pb o 100 pb. Además, una "secuencia genómica que contiene CpG" puede abarcar una secuencia nucleotídica transcrita o no transcrita para la producción de proteínas, y la secuencia nucleotídica puede ser una secuencia intergénica, secuencia intragénica, secuencia codificante de proteínas, una secuencia no codificante de proteínas (tal como un promotor de la transcripción) o una combinación de las mismas.
Como se usa en el presente documento, un "nucleótido metilado" o una "base nucleotídica metilada" se refiere a la presencia de un de resto metilo en una base nucleotídica, donde el resto metilo no está presente en una base nucleotídica típica reconocida. Por ejemplo, citosina no contiene un resto metilo en su anillo de pirimidina, pero 5-metilcitosina contiene un resto metilo en la posición 5 de su anillo de pirimidina. Por lo tanto, citosina no es un nucleótido metilado y 5-metilcitosina es un nucleótido metilado. En otro ejemplo, timina contiene un resto metilo en la posición 5 de su anillo de pirimidina, sin embargo, para los propósitos del presente documento, no se considera a la timina un nucleótido metilado cuando está presente en el ADN, puesto que timina es una base nucleotídica típica del ADN. Las bases de nucleósidos típicas para el ADN son timina, adenina, citosina y guanina. Las bases típicas para el ARN son uracilo, adenina, citosina y guanina. De manera correspondiente, un "sitio de metilación" es la ubicación en la región del ácido nucleico del gen diana donde la metilación tiene, o tiene la posibilidad de producirse. Por ejemplo, una ubicación que contiene CpG es un sitio de metilación en el que la citosina puede o puede no estar metilada.
Como se usa en el presente documento, un "sitio CpG" o "sitio de metilación" es un nucleótido en un ácido nucleico que es susceptible a la metilación bien mediante acontecimientos naturales in vivo o mediante un acontecimiento iniciado para metilar químicamente el nucleótido in vitro.
Como se usa en el presente documento, una "molécula de ácido nucleico metilado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que contiene uno o más nucleótidos metilados que se metila(n).
Una "isla CpG" como se usa en el presente documento describe un segmento de secuencia de ADN que comprende una densidad de CpG funcional o estructuralmente desviada. Por ejemplo, Yamada et al. (Genome Research 14:247-266, 2004) han descrito un conjunto de normas para determinar una isla CpG: debe ser al menos de 400 nucleótidos de longitud, tiene un contenido de GC mayor de un 50 % y una proporción OCF/ECF mayor de 0,6. Otros (Takai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:3740-3745, 2002) han definido una isla CpG de manera menos estricta como una secuencia de al menos 200 nucleótidos de longitud, que tiene un contenido de GC mayor de un 50 % y una proporción OCF/ECF mayor de 0,6.
El término "estado epigenético" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier característica estructural a un nivel molecular de un ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) distinto de la secuencia nucleotídica primaria. Por ejemplo, el estado epigenético de un ADN genómico puede incluir su estructura secundaria o terciaria determinada o influenciada, por ejemplo, por su patrón de metilación o su asociación con las proteínas celulares.
El término "perfil de metilación" o "estado de metilación" se usa en el presente documento para describir el estado de metilación de una secuencia genómica, se refiere a las características de un segmento de ADN en un locus genómico particular pertinente a la metilación. Dichas características incluyen, pero no se limitan a, si cualquiera de los residuos de citosina (C) en esta secuencia de ADN está metilado, ubicación del/de los residuo(s) de C metilado(s), porcentaje de C metilada en cualquier tramo particular de residuos y diferencias alélicas en la metilación debidas, por ejemplo, a la diferencia en el origen de los alelos. El término "perfil de metilación" o "estado de metilación" también se refiere a la concentración relativa o absoluta de C metilada o C no metilada en cualquier tramo particular de residuos en una muestra biológica. Por ejemplo, si el/los residuo(s) de citosina (C) en una secuencia de ADN están metilados, se puede denominar "hipermetilada"; mientras que si el/los residuo(s) de citosina (C) en una secuencia de ADN no están metilados, se puede denominar "hipometilada". Asimismo, si el/los residuo(s) de citosina (C) en una secuencia de ADN (por ejemplo, ácido nucleico fetal) está(n) metilado(s) en comparación con otra secuencia de una región diferente o de una persona diferente (por ejemplo, con respecto al ácido nucleico materno), esa secuencia se considera hipermetilada en comparación con la otra secuencia. De manera alternativa, si el/los residuo(s) de citosina
(C) en una secuencia de ADN no está(n) metilado(s) en comparación con otra secuencia de una región diferente o de una persona diferente (por ejemplo, la madre), esa secuencia se considera hipometilada en comparación con la otra secuencia. Se afirma que estas secuencias están "diferencialmente metiladas", y más específicamente, cuando el estado de metilación difiere entre la madre y el feto, las secuencias se consideran "ácido nucleico materno y fetal diferencialmente metilados".
El término "agente que se une a nucleótidos metilados" como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que se puede unir al ácido nucleico metilado. El agente puede ser natural o sintético, y puede estar modificado o no modificado. El agente puede permitir la separación de diferentes especies de ácido nucleico de acuerdo con sus estados de metilación respectivos. En el documento WO06056480A2 se describe un ejemplo de un agente que se une a nucleótidos metilados. El agente descrito es un polipéptido bifuncional que comprende el dominio de unión a ADN de una proteína que pertenece a la familia de las proteínas de unión a metil-CpG (MBD) y una porción Fc de un anticuerpo. (véase la figura 1). La proteína similar a anticuerpo de unión a metil-CpG recombinante se puede unir preferentemente a ADN metilado en CpG de una manera similar a anticuerpo. Eso significa que la proteína similar a anticuerpo de unión a metil-CpG tiene una afinidad alta y avidez alta por su "antígeno", que es preferentemente ADN que está metilado en dinucleótidos CpG. El agente también puede ser una MBD multivalente (véase la figura 2).
El término "polimorfismo" como se usa en el presente documento se refiere a una variación de secuencia en diferentes alelos de la misma secuencia genómica. Una secuencia que contiene un polimorfismo se considera "secuencia polimórfica". La detección de uno o más polimorfismos permite la diferenciación de diferentes alelos de una secuencia genómica única o entre dos o más personas. Como se usa en el presente documento, el término "marcador polimórfico" o "secuencia polimórfica" se refiere a segmentos de ADN genómico que muestran variación hereditaria en una secuencia de ADN entre personas. Dichos marcadores incluyen, pero no se limitan a, polimorfismos mononucleotídicos (SNP), polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), repeticiones cortas en tándem, tales como repeticiones de di, tri o tetranucleótidos (STR) y similares. Se pueden usar marcadores polimórficos de acuerdo con la presente tecnología para diferenciar específicamente entre un alelo materno y paterno en la muestra de ácido nucleico fetal enriquecido.
Los términos "polimorfismo mononucleotídico" o "SNP" como se usa en el presente documento se refieren a la variación de secuencia polinucleotídica presente en un residuo nucleotídico único en los diferentes alelos de la misma secuencia genómica. Se puede producir esta variación en la región codificante o región no codificante (es decir, en la región intrónica o promotora) de una secuencia genómica, si la secuencia genómica se transcribe durante la producción de proteínas. La detección de uno o más SNP permite la diferenciación de diferentes alelos de una secuencia genómica única o entre dos o más personas.
El término "alelo" como se usa en el presente documento es una de varias formas alternativas de un gen o regiones no codificantes del ADN que ocupan la misma posición en un cromosoma. Se puede usar el término alelo para
describir ADN de cualquier organismo incluyendo, pero no limitado a, bacterias, virus, hongos, protozoos, mohos, levaduras, plantas, seres humanos, seres no humanos, animales y arqueobacterias.
Los términos "proporción de los alelos" o "proporción alélica" como se usa en el presente documento se refiere a la proporción de la población de un alelo y la población del otro alelo en una muestra. En algunos casos trisómicos, es posible que un feto pueda ser trialélico para un locus particular. En dichos casos, el término "proporción de los alelos" se refiere a la proporción de la población un alelo cualquiera frente a uno de los demás alelos, o un alelo cualquiera frente a los otros dos alelos.
El término "procedimiento cuantitativo no basado en polimorfismo" como se usa en el presente documento se refiere a un procedimiento para determinar la cantidad de un analito (por ejemplo, ácido nucleico total, ácido nucleico del cromosoma Y o ácido nucleico fetal) que no requiere el uso de una secuencia o marcador polimórfico. Aunque puede estar presente un polimorfismo en la secuencia, no se requiere dicho polimorfismo para cuantificar la secuencia. Los ejemplos de procedimientos cuantitativos no basados en polimorfismo incluyen, pero no se limitan a, RT-PCR, PCR digital, procedimientos basados en matrices, procedimientos de secuenciación, procedimientos basados en nanoporos, procedimientos de recuento basados en microesferas unidas a ácidos nucleicos y procedimientos basados en competidores en los que se introducen uno o más competidores a una concentración/concentraciones conocida(s) para determinar la cantidad de uno o más analitos. Puede que se necesiten modificar o diseñar activamente algunos de los procedimientos ejemplares anteriores (por ejemplo, secuenciación) de tal manera que no se averigüen uno o más polimorfismos.
Los términos "cantidad absoluta" o "número de copias" como se usa en el presente documento se refieren a la cantidad de un analito (por ejemplo, ácido nucleico total o ácido nucleico fetal). La presente tecnología proporciona composiciones y procedimientos para determinar la cantidad absoluta de ácido nucleico fetal en una muestra materna mixta. La cantidad absoluta o número de copias representa el número de moléculas disponibles para la detección y se puede expresar como los equivalentes genómicos por unidad. El término "concentración" se refiere a la cantidad o proporción de una sustancia en una mezcla o solución (por ejemplo, la cantidad de ácido nucleico fetal en una muestra materna que comprende una mezcla de ácido nucleico materno y fetal). La concentración se puede expresar como un porcentaje, que se usa para expresar cuán grande/pequeña es una cantidad, con respecto a otra cantidad como una fracción de 100. Las plataformas para determinar la cantidad de un analito (por ejemplo, ácido nucleico diana) incluyen, pero no se limitan a, espectrometría de masas, PCR digital, secuenciación mediante plataformas de síntesis (por ejemplo, pirosecuenciación), espectroscopia de fluorescencia y citometría de flujo.
El término "muestra" como se usa en el presente documento se refiere a un espécimen que contiene ácido nucleico. Los ejemplos de muestras incluyen, pero no se limitan a, tejido, fluido corporal (por ejemplo, sangre, suero, plasma, saliva, orina, lágrimas, líquido peritoneal, líquido ascítico, secreción vaginal, fluido de mama, leche materna, líquido linfático, líquido cefalorraquídeo o secreción mucosa), sangre de cordón umbilical, vellosidades coriónicas, líquido amniótico,
líquido linfático, líquido cefalorraquídeo, secreción mucosa u otro exudado corporal, heces, una célula individual o extracto de dichas fuentes que contienen el ácido nucleico de las mismas, y estructuras subcelulares, tales como mitocondrias, usando protocolos bien establecidos en la técnica.
Se puede obtener ADN fetal de fuentes que incluyen, pero no limitadas a, sangre materna, suero materno, plasma materno, células fetales, sangre de cordón umbilical, vellosidades coriónicas, líquido amniótico, orina, saliva, lavado pulmonar, células o tejidos.
El término "sangre" como se usa en el presente documento se refiere a una preparación o muestra de sangre de una mujer embarazada o una mujer que está siendo sometida a prueba frente a un posible embarazo. El término abarca sangre entera o cualquier fracción de sangre, tal como suero y plasma como se definen convencionalmente.
El término "bisulfito" como se usa en el presente documento abarca cualquier tipo adecuado de bisulfitos, tales como bisulfito de sodio, que pueden convertir químicamente una citosina (C) en un uracilo (U) sin modificar químicamente una citosina metilada y, por lo tanto, se pueden usar para modificar diferencialmente una secuencia de ADN basándose en el estado de metilación del ADN.
Como se usa en el presente documento, un reactivo que "modifica diferencialmente" ADN metilado o no metilado abarca cualquier reactivo que modifica ADN metilado y/o no metilado en un procedimiento a través del cual los productos distinguibles resultan de ADN metilado y no metilado, permitiendo así la identificación del estado de metilación del ADN. Dichos procedimientos pueden incluir, pero no se limitan a, reacciones químicas (tales como una conversión C.fwdarw.U mediante bisulfito) y tratamiento enzimático (tal como escisión mediante una endonucleasa dependiente de la metilación). De esta manera, una enzima que preferentemente escinde o digiere ADN metilado es una que puede escindir o digerir una molécula de ADN con una eficiencia mucho más alta cuando el ADN está metilado, mientras que una enzima que preferentemente escinde o digiere ADN no metilado muestra una eficiencia significativamente más alta cuando el ADN no está metilado.
Los términos "procedimiento no basado en bisulfito" y "procedimiento cuantitativo no basado en bisulfito" como se usan en el presente documento se refieren a cualquier procedimiento para cuantificar ácido nucleico metilado o no
metilado que no requiera el uso de bisulfito. Los términos también se refieren a procedimientos para preparar un ácido nucleico que se va a cuantificar que no requieren tratamiento con bisulfito. Los ejemplos de procedimientos no basados en bisulfito incluyen, pero no se limitan a, procedimientos para digerir ácido nucleico usando una o más enzimas sensibles a metilación y procedimientos para separar ácido nucleico usando agentes que se unen a ácido nucleico basándose en el estado de metilación.
Los términos "enzimas sensibles a metilo" y "enzimas de restricción sensibles a metilación" son endonucleasas de restricción de ADN que son dependientes del estado de metilación de su sitio de reconocimiento de ADN para su actividad. Por ejemplo, hay enzimas sensibles a metilo que únicamente escinden o digieren en su secuencia de reconocimiento de ADN si este no está metilado. De esta manera, una muestra de ADN no metilado se corta en fragmentos más pequeños que una muestra de ADN metilado. Del mismo modo, una muestra de ADN hipermetilado no se escinde. Por el contrario, hay enzimas sensibles a metilo que únicamente escinden en su secuencia de reconocimiento de ADN si este está metilado. Como se usa en el presente documento, los términos "escindir", "cortar" y "digerir" se usan indistintamente.
El término "ácido nucleico diana" como se usa en el presente documento se refiere a un ácido nucleico examinado usando los procedimientos divulgados en el presente documento para determinar si el ácido nucleico es parte de un trastorno relacionado con el embarazo o anomalía cromosómica. Por ejemplo, se podría examinar un ácido nucleico diana del cromosoma 21 usando los procedimientos de la tecnología para detectar el síndrome de Down.
El término "ácido nucleico de control" como se usa en el presente documento se refiere a un ácido nucleico usado como ácido nucleico de referencia de acuerdo con los procedimientos divulgados en el presente documento para determinar si el ácido nucleico es parte de una anomalía cromosómica. Por ejemplo, un ácido nucleico de control de un cromosoma distinto del cromosoma 21 (en el presente documento denominado "cromosoma de referencia") podría ser como una secuencia de referencia para detectar el síndrome de Down. La secuencia de control puede tener una cantidad conocida o predeterminada.
El término "específico de secuencia" o "procedimiento específico de locus" como se usa en el presente documento se refiere a un procedimiento que averigua (por ejemplo, cuantifica) el ácido nucleico en una ubicación específica (o locus) en el genoma basándose en la composición de la secuencia. Los procedimientos específicos de secuencia o específicos de locus permiten la cuantificación de cromosomas o regiones específicas.
El término "gen" significa el segmento de ADN implicado en la producción de una cadena polipeptídica; incluye regiones que preceden y siguen a la región codificante (líder y remolque) implicadas en la transcripción/traducción del producto génico y la regulación de la transcripción/traducción, así como secuencias intercaladas (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones).
En la presente solicitud, los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se usan indistintamente en el presente documento para hacer referencia a un polímero de residuos aminoacídicos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos aminoacídicos es un mimético químico artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos naturales y polímeros de aminoácidos no naturales. Como se usa en el presente documento, los términos abarcan cadenas aminoacídicas de cualquier longitud, incluyendo proteínas de longitud completa (es decir, antígenos), en las que los residuos aminoacídicos están unidos mediante enlaces peptídicos covalentes.
El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos naturales y sintéticos, así como análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de una manera similar a los aminoácidos naturales. Los aminoácidos naturales son los codificados por el código genético, así como los aminoácidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato y O-fosfoserina.
Se puede hacer referencia a los aminoácidos en el presente documento bien mediante cualquiera de los símbolos de tres letras comúnmente conocidos o mediante los símbolos de una letra recomendados por la Comisión UIQPA-IUB sobre nomenclatura bioquímica. Igualmente, se puede hacer referencia a los nucleótidos mediante sus códigos de una única letra comúnmente aceptados.
Los "cebadores" como se usan en el presente documento se refieren a oligonucleótidos que se pueden usar en un procedimiento de amplificación, tal como una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para amplificar una secuencia nucleotídica basándose en la secuencia polinucleotídica corresponde a una secuencia genómica particular, por ejemplo, una ubicada en la isla CpG CGI137, PDE9A o CGI009 en el cromosoma 21, en diversos estados de metilación. Al menos uno de los cebadores de PCR para la amplificación de una secuencia polinucleotídica es específico de secuencia para la secuencia.
El término "molde" se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico que se puede usar para la amplificación en la tecnología. Se puede convertir ARN o ADN que no sea bicatenario de manera natural en ADN bicatenario para usarlo como ADN molde. Como ADN molde se puede usar cualquier ADN bicatenario o preparación que contenga múltiples moléculas de ADN bicatenario diferentes para amplificar un locus o varios locus de interés contenidos en el ADN molde.
El término "reacción de amplificación" como se usa en el presente documento se refiere a un procedimiento para copiar ácido nucleico una o más veces. El procedimiento de amplificación puede incluir, pero no se limita a, reacción en cadena de la polimerasa, reacción de secuencia autosostenida, reacción en cadena de la ligasa, amplificación rápida de extremos de ADNc, reacción en cadena de la polimerasa y reacción en cadena de la ligasa, amplificación de fago Q-beta, amplificación por desplazamiento de cadena o reacción en cadena de la polimerasa por extensión solapante mediante empalme. Se puede amplificar una molécula única de ácido nucleico, por ejemplo, mediante PCR digital.
El término "sensibilidad" como se usa en el presente documento se refiere al número de verdaderos positivos dividido por el número de verdaderos positivos más el número de falsos negativos, donde la sensibilidad (sens) puede estar en el intervalo de 0 sens 1. Idealmente, los procedimientos del presente documento tienen un número de falsos negativos que se iguala a cero o próximo a igualarse a cero, de modo que ningún sujeto se identifica erróneamente como no tiene al menos una anomalía cromosómica u otro trastorno genético cuando de hecho tienen al menos una anomalía cromosómica u otro trastorno genético. A la inversa, a menudo se hace una evaluación de la capacidad de un algoritmo de predicción para clasificar correctamente los negativos, una medición complementaria a la sensibilidad. El término "especificidad" como se usa en el presente documento se refiere al número de verdaderos negativos dividido por el número de verdaderos negativos más el número de falsos positivos, donde la sensibilidad (spec) puede estar en el intervalo de 0 spec 1. Idealmente, los procedimientos descritos en el presente documento tienen un número de falsos positivos que se iguala a cero o próximo a igualarse a cero, de modo que no se evalúa ningún sujeto identificado erróneamente como que tiene al menos una anomalía cromosómica u otro trastorno genético cuando no tienen la anomalía cromosómica u otro trastorno genético. De ahí que a veces se seleccione un procedimiento que tenga sensibilidad y especificidad que se iguale a uno, o a un 100 %.
Se pueden usar uno o más algoritmos de predicción para determinar la significación o dar significado a los datos de detección recogidos en condiciones variables que se pueden ponderar dependiente o independientemente uno del otro. El término "variable" como se usa en el presente documento se refiere a un factor, cantidad o función de un algoritmo que tiene un valor o conjunto de valores. Por ejemplo, una variable puede ser el diseño de un conjunto de especies de ácido nucleico amplificadas, el número de conjuntos de especies de ácido nucleico amplificadas, porcentaje de contribución genética fetal sometida a prueba, porcentaje de contribución genética materna sometida a prueba, tipo de anomalía cromosómica sometida a prueba, tipo de trastorno genético sometido a prueba, tipo de anomalías ligadas al sexo sometidas a prueba, la edad de la madre y similares. El término "independiente" como se usa en el presente documento se refiere a no estar influenciado o no estar controlado por otro. El término "dependiente" como se usa en el presente documento se refiere a estar influenciado o controlado por otro. Por ejemplo, un cromosoma particular y un acontecimiento de trisomía que se produce para ese cromosoma particular que da como resultado un ser viable son variables que son dependientes entre sí.
Un experto en la técnica puede usar cualquier tipo de procedimiento o algoritmo de predicción para dar significación a los datos de la presente tecnología en una sensibilidad y/o especificidad aceptable. Por ejemplo, se pueden usar algoritmos de predicción, tales como prueba de la χ2, prueba de la z, prueba de la t, ANOVA (análisis de varianza), análisis de regresión, redes neuronales, lógica difusa, modelos ocultos de Markov, estimación de estado por modelos múltiples y similares. Se pueden determinar uno o más procedimientos o algoritmos de predicción para dar significación a los datos que tienen diferentes variables dependientes y/o independientes de la presente tecnología. Y se pueden determinar uno o más procedimientos o algoritmos de predicción para no dar significación a los datos que tienen diferentes variables dependientes y/o independientes de la presente tecnología. Se pueden diseñar o cambiar los parámetros de las diferentes variables de los procedimientos descritos en el presente documento basándose en los resultados de uno o más algoritmos de predicción (por ejemplo, número de conjuntos analizados, tipos de especies nucleotídicas en cada conjunto). Por ejemplo, la aplicación de la prueba de la χ2 a los datos de detección puede sugerir que los intervalos específicos de la edad materna se correlacionen con una probabilidad más alta de tener un hijo con una anomalía cromosómica específica, de ahí que la variable de la edad materna se pueda ponderar de manera diferente frente a ponderarse igual que otras variables.
Se pueden elegir diversos algoritmos para someter a prueba. Estos algoritmos pueden ser entrenar con datos brutos. Para cada nueva muestra de datos brutos, los algoritmos entrenados asignan una clasificación a esa muestra (es decir, trisomía o normal). Basándose en las clasificaciones de las nuevas muestras de datos brutos, se puede evaluar el rendimiento de los algoritmos entrenados basándose en la sensibilidad y especificidad. Por último, se puede identificar un algoritmo con la sensibilidad y/o especificidad más altas o combinación de las mismas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Introducción
La presencia de ácido nucleico fetal en el plasma materno se notificó por primera vez en 1997 y ofrece la posibilidad de un diagnóstico prenatal no invasivo simplemente a través del análisis de una muestra de sangre materna (Lo et al., Lancet 350:485-487,1997). Hasta la fecha, se han desarrollado numerosas aplicaciones clínicas potenciales. En particular, se ha descubierto que las anomalías cuantitativas de concentraciones de ácido nucleico fetal, por ejemplo, ADN, en el plasma materno están asociadas con una serie de trastornos asociados con el embarazo, incluyendo preeclampsia, parto prematuro, hemorragia prenatal, placentación invasiva, síndrome de Down fetal y otras
aneuploidias cromosómicas fetales. De ahí que el análisis del ácido nucleico fetal en el plasma materno represente un potente mecanismo para la supervisión del bienestar maternofetal.
Sin embargo, el ADN fetal coexiste con ADN materno de fondo en el plasma materno. De ahí que las aplicaciones más notificadas se hayan basado en la detección de las secuencias del cromosoma Y, ya que estas son las más convenientemente distinguibles del ADN materno. Dicho enfoque limita la aplicabilidad de los ensayos existentes a únicamente un 50 % de todos los embarazos, en concreto, aquellos con fetos de sexo masculino. De esta manera, hay mucha necesidad del desarrollo de composiciones independientes del sexo y procedimientos para enriquecer y analizar ácido nucleico fetal de una muestra materna. También los procedimientos que se basan en marcadores polimórficos para cuantificar ácido nucleico fetal pueden ser susceptibles a tasas de heterocigosis variables en diferentes etnias, limitando así su aplicabilidad (por ejemplo, incrementando el número de marcadores que se necesitan).
Se ha demostrado previamente que se pueden distinguir ADN fetal y materno mediante sus diferencias en el estado de metilación (patente de EE. UU. n.º 6,927,028). La metilación es un fenómeno epigenético que se refiere a los procedimientos que alteran un fenotipo sin implicar cambios en la secuencia de ADN. Mediante la explotación de la diferencia en el estado de metilación del ADN entre la madre y el feto, se puede detectar y analizar con éxito ácido nucleico fetal en un fondo de ácido nucleico materno.
Los autores de la presente invención proporcionan polinucleótidos genómicos novedosos que están diferencialmente metilados entre el ADN fetal del feto (por ejemplo, de la placenta) y el ADN materno de la madre, por ejemplo, de células de sangre periférica. De esta manera, este descubrimiento proporciona un nuevo enfoque para distinguir ADN genómico fetal y materno y nuevos procedimientos para cuantificar con precisión ácido nucleico fetal que se pueden usar para el diagnóstico prenatal no invasivo.
Metodología
La práctica de la tecnología utiliza técnicas rutinarias en el campo de la biología molecular. Los textos básicos que divulgan los procedimientos generales de uso en la tecnología incluyen Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3.º ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)).
Para los ácidos nucleicos, los tamaños se dan bien en kilobases (kb) o pares de bases (pb). Estos son estimaciones derivadas de electroforesis en gel de agarosa o acrilamida, de ácidos nucleicos secuenciados o de secuencias de ADN publicadas. Para las proteínas, los tamaños se dan en kilodaltons (kDa) o números de residuos aminoacídicos. Los tamaños de proteína se estiman a partir de electroforesis en gel, de proteínas secuenciadas, de secuencias aminoacídicas derivadas o de secuencias de proteínas publicadas.
Los oligonucleótidos que no están disponibles comercialmente se pueden sintetizar químicamente, por ejemplo, de acuerdo con el procedimiento de triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por primera vez por Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Lett. 222:1859-1862 (1981), usando un sintetizador automatizado, como se describe en Van Devanter et. al., Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168 (1984). La purificación de oligonucleótidos se lleva a cabo usando cualquier estrategia reconocida en la técnica, por ejemplo, electroforesis en gel de acrilamida natural o cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) de intercambio aniónico como se describe en Pearson & Reanier, J. Chrom. 255:137-149 (1983).
Adquisición de muestras de sangre y extracción de ADN
La presente tecnología se refiere a la separación, enriquecimiento y análisis de ADN fetal encontrado en la sangre materna como un medio no invasivo para detectar la presencia y/o para supervisar el progreso de una afección o trastorno asociado con el embarazo. De esta manera, las primeras etapas de la práctica de la tecnología son para obtener una muestra de sangre de una mujer embarazada y extraer el ADN de la muestra.
A. Adquisición de muestras de sangre
Se obtiene una muestra de sangre de una mujer embarazada a una edad gestacional adecuada para someter a prueba el uso de un procedimiento de la presente tecnología. La edad gestacional adecuada puede variar dependiendo del trastorno sometido a prueba, como se analiza a continuación. Se lleva a cabo la extracción de sangre de una mujer de acuerdo con el protocolo estándar que generalmente siguen los hospitales o clínicas. Se extrae una cantidad apropiada de sangre periférica, por ejemplo, típicamente entre 5-50 ml y se puede almacenar de acuerdo con el procedimiento estándar antes de la preparación adicional. Las muestras de sangre se pueden extraer, almacenar o transportar de una manera conocida por el experto en la técnica para minimizar la degradación o la calidad del ácido nucleico presente en la muestra.
B. Preparación de muestras de sangre
Se puede llevar a cabo el análisis del ADN fetal encontrado en la sangre materna de acuerdo con la presente tecnología usando, por ejemplo, la sangre entera, suero o plasma. Los procedimientos para preparar suero o plasma
de sangre materna son bien conocidos entre los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede disponer la sangre de una mujer embarazada en un tubo que contenga EDTA o un producto comercial especializado, tal como Vacutainer SST (Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.), para prevenir la coagulación de la sangre, y entonces se puede obtener plasma de la sangre entera a través de centrifugación. Por otra parte, se puede obtener suero con o sin centrifugación después de la coagulación de la sangre. Si se usa la centrifugación, entonces se realiza típica, aunque no exclusivamente, a una velocidad apropiada, por ejemplo, 1500-3000 veces g. Se puede someter plasma o suero a etapas de centrifugación adicionales antes de transferirse a un nuevo tubo para extracción de ADN.
Además de la porción acelular de la sangre entera, también se puede recuperar ADN de la fracción celular, enriquecido en la porción de la capa leucocitaria, que se puede obtener después de la centrifugación de una muestra de sangre entera de la mujer y eliminación del plasma.
C. Extracción de ADN
Hay numerosos procedimientos conocidos para extraer ADN de una muestra biológica que incluye sangre. Se pueden seguir los procedimientos generales de preparación de ADN (por ejemplo, descritos por Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3.º ed., 2001); también se pueden usar diversos reactivos o kits disponibles comercialmente, como OJAamp Circulating Nucleic Acid Kit de Qiagen, QiaAmp DNA Mini Kit o QiaAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania), kit de aislamiento de ADN de sangre GenomicPrep™ (Promega, Madison, Wis.) y kit de purificación de ADN de sangre genómico GFX™ (Amersham, Piscataway, N.J.) para obtener ADN de una muestra de sangre de una mujer embarazada. También se pueden usar combinaciones de más de uno de estos procedimientos.
En primer lugar, la muestra se puede enriquecer o enriquecer relativamente de ácido nucleico fetal mediante uno o más procedimientos. Por ejemplo, se puede llevar a cabo la discriminación de ADN fetal y materno usando las composiciones y procedimientos de la presente tecnología en solitario o en combinación con otros factores de discriminación. Los ejemplos de estos factores incluyen, pero no se limitan a, diferencias de nucleótido único entre el cromosoma X e Y, secuencias específicas del cromosoma Y, polimorfismos ubicados en otro lugar en el genoma, diferencias de tamaños entre ADN fetal y materno y diferencias en el patrón de metilación entre tejidos maternos y fetales.
Se describen otros procedimientos para enriquecer una muestra de una especie particular de ácido nucleico en la solicitud de patente PCT número PCT/US07/69991, presentada el 30 de mayo de 2007, solicitud de patente PCT número PCT/US2007/071232, presentada el 15 de junio de 2007, solicitud provisional de EE. UU. números 60/968,876 y 60/968,878 (asignadas al solicitante) (solicitud de patente PCT número PCT/EP05/012707, presentada el 28 de noviembre de 2005). Se puede eliminar selectivamente ácido nucleico materno (bien parcialmente, sustancialmente, casi completamente o completamente) de la muestra.
Separación específica de metilación de ácido nucleico
Los procedimientos proporcionados en el presente documento ofrecen un enfoque alternativo para el enriquecimiento de ADN fetal basándose en la separación específica de metilación del ADN diferencialmente metilado. Se ha descubierto recientemente que muchos genes implicados en la regulación del desarrollo se controlan a través de la epigenética en células madre embrionarias. En consecuencia, se puede esperar que múltiples genes muestren metilación del ADN diferencial entre el ácido nucleico de origen fetal y de origen materno. Una vez que se identifican estas regiones, se puede usar una técnica para capturar ADN metilado para enriquecer específicamente ADN fetal. Para la identificación de regiones diferencialmente metiladas, se usó un enfoque novedoso para capturar ADN metilado. Este enfoque usa una proteína en la que se fusiona el dominio de unión a metilo de MBD2 al fragmento Fc de un anticuerpo (MBD-FC) (Gebhard C, Schwarzfischer L, Pham TH, Schilling E, Klug M, Andreesen R, Rehli M (2006) Genomewide profiling of CpG methylation identifies novel targets of aberrant hypermethylation in myeloid leukemia. Cancer Res 66:6118-6128). Esta proteína de fusión tiene varias ventajas sobre los anticuerpos específicos de metilación convencionales. La MBD-FC tiene una afinidad más alta por ADN metilado y se une a ADN bicatenario. Lo más importante es que las dos proteínas difieren en la manera en que se unen al ADN. Los anticuerpos específicos de metilación se unen al ADN de manera estocástica, lo que significa que únicamente se puede obtener una respuesta binaria. Por otra parte, el dominio de unión a metilo de MBD-FC se une a moléculas de ADN independientemente de su estado de metilación. La fuerza de esta interacción proteína-ADN se define por el nivel de metilación del ADN. Después de la unión a ADN genómico, se pueden usar soluciones de eluato de concentraciones de sal en incremento para fraccionar ADN metilado y no metilado que permita una separación más controlada (Gebhard C, Schwarzfischer L, Pham TH, Andreesen R, Mackensen A, Rehli M (2006) Rapid and sensitive detection of CpG-methylation using methyl-binding (MB)-PCR. Nucleic Acids Res 34:e82). En consecuencia, este procedimiento, llamado inmunoprecipitación de metil-CpG (MCIP), no solo puede enriquecer, sino también fraccionar ADN genómico de acuerdo con el nivel de metilación, que es particularmente útil cuando la fracción de ADN no metilado también se debe investigar.
Digestión con enzimas de restricción sensibles a metilación
La tecnología también proporciona composiciones y procedimientos para determinar la cantidad de ácido nucleico
fetal de una muestra materna. La tecnología permite el enriquecimiento de regiones de ácido nucleico fetal en una muestra materna digiriendo selectivamente ácido nucleico de dicha muestra materna con una enzima que digiere selectiva y completa o sustancialmente el ácido nucleico materno para enriquecer la muestra de al menos una región de ácido nucleico fetal. Preferentemente, la eficiencia de digestión es mayor de aproximadamente un 75 %, 76 %, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %. Después del enriquecimiento, se puede determinar la cantidad de ácido nucleico fetal mediante procedimientos cuantitativos que no requieren secuencias polimórficas o tratamiento con bisulfito, ofreciendo así una solución que funciona igualmente bien para fetos de sexo femenino y en diferentes etnias y conserva el ácido nucleico fetal de bajo número de copias presente en la muestra.
Por ejemplo, hay enzimas sensibles a metilo que preferente o sustancialmente escinden o digieren en su secuencia de reconocimiento de ADN si este no está metilado. De esta manera, una muestra de ADN no metilado se corta en fragmentos más pequeños que una muestra de ADN metilado. Del mismo modo, una muestra de ADN hipermetilado no se escinde. Por el contrario, hay enzimas sensibles a metilo que únicamente escinden en su secuencia de reconocimiento de ADN si este está metilado.
Las enzimas sensibles a metilo que digieren ADN no metilado adecuadas para su uso en los procedimientos de la tecnología incluyen, pero no se limitan a, Hpall, Hhal, Maell, BstUI y Acil. Una enzima que se puede usar es HpaII, que únicamente corta la secuencia no metilada CCGG. Otra enzima que se puede usar es HhaI, que únicamente corta la secuencia no metilada GCGC. Ambas enzimas están disponibles de New England BioLabs®, Inc. También se puede usar combinaciones de dos o más enzimas sensibles a metilo que digieren únicamente ADN no metilado. Las enzimas adecuadas que únicamente digieren ADN metilado incluyen, pero no se limitan a, Dpnl, que corta en una secuencia de reconocimiento GATC, y McrBC, que pertenece a la familia de las proteínas AAA.sup.+ y corta ADN que contiene citosinas modificadas y corta en el sitio de reconocimiento 5'... Pu.sup.mC(N.sub.40-3000) Pu.sup.mC ... 3’ (New England BioLabs, Inc., Beverly, Mass.).
Los procedimientos de escisión para enzimas de restricción seleccionadas para cortar el ADN en sitios específicos son bien conocidos para el experto en la técnica. Por ejemplo, muchos proveedores de enzimas de restricción proporcionan información sobre las condiciones y tipos de secuencias de ADN cortadas por enzimas de restricción específicas, incluyendo New England BioLabs, Pro-Mega Biochems, Boehringer-Mannheim y similares. Sambrook et al. (Véase Sambrook et al., Molecular Biology: A laboratory Approach, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989) proporcionan una descripción general de los procedimientos para usar enzimas de restricción y otras enzimas. En procedimientos de la presente tecnología, a menudo se usan enzimas en condiciones que posibilitan la escisión del ADN materno con aproximadamente un 95 %-100 % de eficiencia, preferentemente con aproximadamente un 98 %-100 % de eficiencia.
Otros procedimientos para el análisis de metilación
En la técnica son conocidos diversos procedimientos de análisis de metilación y se pueden usar en conjunción con la presente tecnología. Estos ensayos permiten la determinación del estado de metilación de una o una pluralidad de islas CpG en una secuencia de ADN. Además, se pueden usar los procedimientos para cuantificar ácido nucleico metilado. Dichos ensayos implican, entre otras técnicas, la secuenciación de ADN del ADN tratado con bisulfito, PCR (para amplificación específica de secuencia), análisis de bandas Southern y el uso de enzimas de restricción sensibles a metilación.
La secuenciación genómica es una técnica que se ha simplificado para el análisis de los patrones de metilación del ADN y la distribución de 5-metilcitosina usando tratamiento con bisulfito (Frommer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831,1992). Adicionalmente, se puede usar la digestión con enzimas de restricción de productos de PCR amplificados de ADN convertido con bisulfito, por ejemplo, el procedimiento descrito por Sadri & Hornsby (Nucl. Acids Res. 24:5058-5059,1996) o COBRA (análisis de restricción combinado con bisulfito) (Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534,1997).
El análisis COBRA es un ensayo de metilación cuantitativo útil para determinar los niveles de metilación del ADN en locus de genes específicos en cantidades pequeñas de ADN genómico (Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534,1997). En pocas palabras, se usa digestión con enzimas de restricción para revelar las diferencias de secuencias dependientes de metilación en los productos de PCR de ADN tratado con bisulfito de sodio. En primer lugar, se introducen las diferencias de secuencias dependientes de metilación en el ADN genómico mediante tratamiento con bisulfito estándar de acuerdo con el procedimiento descrito por Frommer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992). Entonces se lleva a cabo la amplificación por PCR del ADN convertido con bisulfito usando cebadores específicos para las islas CpG de interés, seguida de digestión con endonucleasas de restricción, electroforesis en gel y detección usando sondas de hibridación marcadas específicas. Los niveles de metilación en la muestra de ADN original están representados por las cantidades relativas de producto de PCR digerido y no digerido de una forma linealmente cuantitativa en un amplio espectro de niveles de metilación del ADN. Además, esta técnica se puede aplicar de manera fiable a ADN obtenido de muestras de tejidos incluidos en parafina microdisecados. Los reactivos típicos (por ejemplo, como se puede encontrar en un kit basado en COBRA típico) para el análisis COBRA pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para gen específico (o isla CpG o secuencia de ADN alterado por metilación); enzima de restricción y tampón apropiado; oligonucleotidos de hibridación génica; oligonucleotidos de hibridacion de control; kit de marcaje de cinasa para sonda de oligonucleotidos; y nucleótidos radioactivos.
Adicionalmente, los reactivos de conversión con bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; reactivos o kits de recuperación de ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de recuperación de ADN.
El ensayo MethyLight™ es un ensayo de metilación cuantitativo de alto rendimiento que utiliza la tecnología de PCR en tiempo real basada en fluorescencia (TaqMan.RTM.) que no requiere manipulaciones adicionales después de la etapa de PCR (Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306,1999). En pocas palabras, el procedimiento MethyLight.TM. comienza con una muestra mixta de ADN genómico que se convierte, en una reacción con bisulfito de sodio, en un grupo mixto de diferencias de secuencias dependientes de metilación de acuerdo con procedimientos estándar (el procedimiento con bisulfito convierte residuos de citosina no metilados en uracilo). Entonces se lleva a cabo la PCR basada en fluorescencia bien en una reacción PCR "no sesgada" (con cebadores que no solapan sitios de metilación CpG conocidos) o en una reacción "sesgada" (con cebadores de PCR que solapan dinucleótidos CpG conocidos). Se puede producir discriminación de secuencias bien al nivel del procedimiento de amplificación o al nivel del procedimiento de detección por fluorescencia, o ambos.
Se puede usar el ensayo MethyLight como prueba cuantitativa para los patrones de metilación en la muestra de ADN genómico, en la que se produce discriminación de secuencias al nivel de hibridación con sonda. En esta versión cuantitativa, la reacción PCR proporciona amplificación sesgada en presencia de una sonda fluorescente que solapa un presunto sitio de metilación particular. Se proporciona un control sesgado para la cantidad de ADN de entrada mediante una reacción en la que ni los cebadores, ni tampoco la sonda, recubren algún dinucleótido CpG. De manera alternativa, se logra una prueba cualitativa para la metilación genómica mediante sondaje del grupo de PCR sesgada, bien con oligonucleótidos de control que no "cubren" sitios de metilación conocidos (una versión basada en fluorescencia de la técnica "MSP") o con oligonucleótidos que cubren sitios de metilación potenciales.
Se puede usar el procedimiento MethyLight con una sonda “TaqMan” en el procedimiento de amplificación. Por ejemplo, se trata ADN genómico bicatenario con bisulfito de sodio y se somete a uno de dos conjuntos de reacciones PCR usando sondas TaqMan.RTM.; por ejemplo, bien con cebadores sesgados y sonda TaqMan.RTM. o cebadores no sesgados y sonda TaqMan.RTM. La sonda TaqMan.RTM. está doblemente marcada con moléculas "indicadoras" y "extintoras" fluorescentes y está diseñada para que sea específica para una región con un contenido de GC relativamente alto, de modo que se funde a aproximadamente una temperatura más alta de 10 grados C en el ciclo de PCR que los cebadores directos o inversos. Esto permite que la sonda TaqMan.RTM. permanezca completamente hibridada durante la etapa de extensión/hibridación de la PCR. Puesto que la Taq polimerasa sintetiza enzimáticamente una nueva cadena durante la PCR, con el tiempo alcanza la sonda TaqMan.RTM hibridada. Entonces la actividad endonucleasa 5’ a 3’ de la Taq polimerasa desplaza la sonda TaqMan.RTM. digiriéndola para liberar la molécula indicadora fluorescente para la detección cuantitativa de su señal ahora no extinguida usando un sistema de detección fluorescente en tiempo real.
Los reactivos típicos (por ejemplo, como se puede encontrar en un kit basado en MethyLight.TM. típico) para el análisis MethyLight.TM. pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para gen específico (o isla CpG o secuencia de ADN alterado por metilación); sondas TaqMan.RTM.; desoxinucleótidos y tampones de PCR optimizados; y Taq polimerasa.
La técnica Ms-SNuPE es un procedimiento cuantitativo para evaluar las diferencias de metilación en sitios CpG específicos basada en el tratamiento con bisulfito del ADN, seguido de extensión del cebador de nucleótido único (Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531,1997).
En pocas palabras, se hace reaccionar ADN genómico con bisulfito de sodio para convertir citosina no metilada en uracilo, mientras se deja a la 5-metilcitosina sin cambios. Entonces se lleva a cabo la amplificación de la secuencia diana deseada usando cebadores de PCR específicos para ADN convertido con bisulfito y el producto resultante se aísla y se usa como molde para el análisis de metilación en el/los sitio(s) CpG de interés.
Se pueden analizar pequeñas cantidades de ADN (por ejemplo, secciones patológicas microdisecadas) y evita la utilización de enzimas de restricción para determinar el estado de metilación en los sitios CpG.
Los reactivos típicos (por ejemplo, como se puede encontrar en un kit basado en Ms-SNuPE típico) para el análisis Ms-SNuPE pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para gen específico (o isla CpG o secuencia de ADN alterado por metilación); desoxinucleótidos y tampones de PCR optimizados; kit de extracción en gel; cebadores de control positivo; cebadores de Ms-SNuPE para gen específico; tampón de reacción (para la reacción de Ms-SNuPE); y nucleótidos radioactivos.
Adicionalmente, los reactivos de conversión con bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; reactivos o kit de recuperación de ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de recuperación de ADN.
La MSP (PCR específica de metilación) permite evaluar el estado de metilación de virtualmente cualquier grupo de sitios CpG en una isla CpG, independientemente del uso de enzimas de restricción sensibles a metilación (Herman et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93:9821-9826,1996; pat. de EE. UU. n.º 5,786,146). En pocas palabras, se modifica ADN mediante bisulfito de sodio, convirtiendo citosinas no metiladas, pero sin metilar, en uracilo, y posteriormente se
amplifica con cebadores específicos para ADN metilado frente a no metilado. La MSP únicamente requiere pequeñas cantidades de ADN, es sensible a un 0,1 % de alelos metilados de un locus de isla CpG dado, y se puede llevar a cabo en ADN extraído de muestras incluidas en parafina. Los reactivos típicos (por ejemplo, como se puede encontrar en un kit basado en MSP típico) para el análisis MSP pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR metilados y no metilados para gen específico (o isla CpG o secuencia de ADN alterado por metilación), desoxinucleótidos y tampones de PCR optimizados y sondas específicas.
La técnica MCA es un procedimiento que se puede usar para cribar patrones de metilación alterados en el ADN genómico y para aislar secuencias específicas asociadas con estos cambios (Toyota et al., Cancer Res. 59:2307-12,1999). En pocas palabras, se usan enzimas de restricción con diferentes sensibilidades a la metilación de citosina en sus sitios de reconocimiento para digerir los ADN genómicos de tumores primarios, líneas celulares y tejidos normales antes de la amplificación por PCR con cebadores de manera arbitraria. Los fragmentos que muestran metilación diferencial se clonan y secuencian después de la resolución de los productos de PCR en geles de poliacrilamida de alta resolución. Entonces se usan los fragmentos clonados como sondas para el análisis Southern para confirmar la metilación diferencial de estas regiones. Los reactivos típicos (por ejemplo, como se puede encontrar en un kit basado en MCA típico) para el análisis MCA pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para ADN genómico de cebado arbitrario; nucleótidos y tampones de PCR, enzimas de restricción y tampones apropiados; sondas u oligonucleotidos de hibridacion génica; sondas u oligonucleotidos de hibridacion de control.
Otro procedimiento para analizar sitios de metilación es un ensayo de extensión del cebador, que incluye una reacción de amplificación por PCR optimizada que produce dianas amplificadas para el posterior análisis de genotipado de extensión del cebador que usa espectrometría de masas. El ensayo también puede hacer en multiplexación. Este procedimiento (particularmente puesto que se refiere al genotipado de polimorfismos mononucleotídicos) se describe en detalle en la publicación PCT WO05012578A1 y la publicación de EE. UU. US20050079521A1. Para el análisis de metilación, se puede adoptar el ensayo para detectar metilación introducida por bisulfito dependiente de cambios de secuencia de C a T. Estos procedimientos son particularmente útiles para llevar a cabo reacciones de amplificación multiplexadas y reacciones de extensión del cebador multiplexadas (por ejemplo, ensayos de extensión del cebador en masa homogénea multiplexada (hME)) en un único pocillo para incrementar adicionalmente el rendimiento y reducir el coste por reacción para las reacciones de extensión del cebador.
Los cuatro procedimientos adicionales para el análisis de metilación del ADN incluyen exploración genómica por sitios de restricción (RLGS, Costello et al., 2000), análisis de diferencias representativas sensibles a metilación (MS-RDA), AP-PCR específica de metilación (MS-AP-PCR) y separación/columna de dominio de unión a metil-CpG de moléculas parcialmente fundidas (MBD/SPM).
Se describen procedimientos de análisis de metilación adicionales que se pueden usar en conjunción con la presente tecnología en los siguientes documentos: Laird, P.W. Nature Reviews Cancer 3, 253-266 (2003); Biotechniques; Uhlmann, K. et al. Electrophoresis 23:4072-4079 (2002) -PyroMeth; Colella et al. Biotechniques. 2003 Jul;35(l):146-50; Dupont JM, Tost J, Jammes H, and Gut IG. Anal Biochem, Oct 2004; 333(1): 119-27; and Tooke N and Pettersson M. IVDT. Nov 2004; 41.
Determinación y amplificación de secuencias polinucleotídicas
Después de la separación de ácido nucleico de una manera de metilación diferencial, el ácido nucleico se puede someter a análisis basado en secuencia. Además, una vez que se determina que una secuencia genómica particular de origen fetal está hipermetilada o hipometilada en comparación con el equivalente materno, se puede determinar la cantidad de esta secuencia genómica fetal. Posteriormente, se puede comparar esta cantidad con un valor de control estándar y sirve como una indicación para el potencial de un determinado trastorno asociado con el embarazo.
A. Amplificación de secuencias nucleotídicas
En muchos casos, es deseable amplificar una secuencia de ácido nucleico de la tecnología usando cualquiera de varios procedimientos de amplificación de ácido nucleico que son bien conocidos en la técnica (enumerados anteriormente y descritos en mayor detalle a continuación). Específicamente, la amplificación de ácido nucleico es la síntesis enzimática de amplicones de ácido nucleico (copias) que contienen una secuencia que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico que se está amplificando. La amplificación de ácido nucleico es especialmente beneficiosa cuando la cantidad de secuencia diana presente en una muestra es muy baja. Al amplificar las secuencias diana y detectar el amplicón sintetizado, la sensibilidad de un ensayo se puede mejorar enormemente, ya que se necesitan menos secuencias diana al comienzo del ensayo para garantizar mejor la detección de ácido nucleico en la muestra que pertenece al organismo o virus de interés.
Una variedad de procedimientos de amplificación de polinucleótidos están bien establecidos y se usa frecuentemente en investigación. Por ejemplo, los procedimientos generales de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la amplificación de secuencias polinucleotídicas son bien conocidos en la técnica y, de esta manera, no se describen en detalle en el presente documento. Para una revisión de los procedimientos de PCR, protocolos y principios en el
diseño de cebadores, véase, por ejemplo, Innis, et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y., 1990. Los protocolos y reactivos de PCR también están disponibles de distribuidores comerciales, tales como Roche Molecular Systems.
Lo más habitualmente la PCR se lleva a cabo como un procedimiento automatizado con un enzima termoestable. En este procedimiento, la temperatura de la mezcla de reacción se somete automáticamente a un ciclo a través de una región de desnaturalización, una región de hibridación del cebador y una región de reacción de extensión. Las máquinas adaptadas específicamente para este propósito están disponibles comercialmente.
Aunque la amplificación por PCR de una secuencia polinucleotídica se usa típicamente en la práctica de la presente tecnología, un experto en la técnica reconoce que se puede conseguir la amplificación de una secuencia genómica encontrada en una muestra de sangre materna mediante cualquier procedimiento conocido, tal como la reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación mediada por transcripción y replicación de secuencia autosostenida o amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA), cada uno de los cuales proporciona suficiente amplificación. También se puede usar la tecnología de ADN ramificado desarrollada más recientemente para demostrar cualitativamente la presencia de una secuencia genómica particular de la tecnología, que representa un patrón de metilación particular, o para determinar cuantitativamente la cantidad de esta secuencia genómica particular en la sangre materna. Para una revisión de la amplificación de señal mediante ADN ramificado para la cuantificación directa de secuencias de ácido nucleico en muestras clínicas, véase Nolte, Adv. Clin. Chem. 33:201-235,1998.
Las composiciones y procedimientos de la tecnología también son particularmente útiles cuando se ponen en práctica con la PCR digital. La PCR digital fue desarrollada por primera vez por Kalinina y sus compañeros (Kalinina et al., “Nanoliter scale PCR with TaqMan detection.” Nucleic Acids Research. 25; 1999-2004, (1997)) y se desarrolló adicionalmente por Vogelstein y Kinzler (Digital PCR. Proc Natl Acad Sci USA. 96; 9236-41, (1999)). La aplicación de PCR digital para su uso con diagnósticos fetales se describió por primera vez por Cantor et al. (publicación de patente PCT n.º WO05023091A2) y se describió posteriormente por Quake et al. (publicación de patente de EE. UU. n.º US 20070202525). La PCR digital se aprovecha de la amplificación de ácido nucleico (ADN, ADNc o ARN) a un nivel de molécula única y ofrece un procedimiento altamente sensible para cuantificar ácido nucleico de bajo número de copias. Fluidigm® Corporation ofrece sistemas para el análisis digital de ácidos nucleicos.
B. Determinación de secuencias polinucleotídicas
Las técnicas para la determinación de secuencias polinucleotídicas también están bien establecidas y ampliamente puestas en práctica en el campo de investigación pertinente. Por ejemplo, los principios básicos y las técnicas generales para la secuenciación de polinucleótidos se describen en diversos informes de investigación y tratados sobre biología molecular y genética recombinante, tales como Wallace et al., supra; Sambrook and Russell, supra, and Ausubel et al., supra. Se pueden usar procedimientos de secuenciación de ADN puestos en práctica de manera rutinaria en los laboratorios de investigación, bien manuales o automatizados, para poner en práctica la presente tecnología. Los medios adicionales adecuados para detectar cambios en una secuencia polinucleotídica para poner en práctica los procedimientos de la presente tecnología incluyen, pero no se limitan a, espectrometría de masas, extensión del cebador, hibridación de polinucleótidos, PCR en tiempo real y electroforesis.
También se puede aplicar el uso de una reacción de extensión del cebador en procedimientos de la tecnología. Por ejemplo, una reacción de extensión del cebador funciona discriminando los alelos con SNP mediante la incorporación de desoxinucleótidos y/o didesoxinucleótidos a un cebador de extensión del cebador que se hibrida a una región adyacente al sitio del SNP. El cebador se extiende con una polimerasa. Se puede detectar físicamente el SNP del cebador extendido mediante espectrometría de masas o mediante un resto de marcado, tal como biotina. Como el sitio del SNP se extiende únicamente mediante un desoxinucleótido o didesoxinucleótido complementario que bien está marcado mediante un marcador específico o genera un producto de extensión del cebador con una masa específica, se pueden discriminar y cuantificar los alelos con SNP.
Los ácidos nucleicos amplificados y transcritos de manera inversa pueden ser ácidos nucleicos modificados. Los ácidos nucleicos modificados pueden incluir análogos de nucleótidos y pueden incluir un agente de captura y/o un marcador detectable. Los ejemplos de marcadores detectables incluyen, sin limitación, fluoróforos, radioisótopos, agentes colorimétricos, agentes emisores de luz, agentes quimioluminiscentes, agentes de dispersión de luz, enzimas y similares. Los ejemplos de agentes de captura incluyen, sin limitación, un agente de un par de unión seleccionado de los pares anticuerpo/antígeno, anticuerpo/anticuerpo, anticuerpo/fragmento de anticuerpo, anticuerpo/receptor de anticuerpo, anticuerpo/proteína A o proteína G, hapteno/anti-hapteno, biotina/avidina, biotina/estreptavidina, ácido fólico/proteína de unión a folato, vitamina B12/factor intrínseco, grupo químico reactivo/grupo químico reactivo complementario (por ejemplo, sulfhidrilo/maleimida, sulfhidrilo/derivado de haloacetilo, amina/isotriocianato, amina/éster de succinimidilo y amina/haluros de sulfonilo) y similares. Los ácidos nucleicos modificados que tienen un agente de captura se pueden inmovilizar en un soporte sólido en determinados procedimientos.
La espectrometría de masas es un procedimiento particularmente eficaz para la detección de un polinucleótido de la tecnología, por ejemplo, un amplicón de PCR, un producto de extensión del cebador o una sonda detectora que se
escinde de un ácido nucleico diana. La presencia de la secuencia polinucleotídica se verifica comparando la masa de la señal detectada con la masa esperada del polinucleótido de interés. La fuerza de señal relativa, por ejemplo, un pico de masa en un espectro, para una secuencia polinucleotídica particular, indica la población relativa de un alelo específico, posibilitando de esta manera el cálculo de la proporción de los alelos directamente de los datos. Para una revisión de los procedimientos de genotipado que usan el ensayo iPLEX™ estándar de Sequenom® y la tecnología MassARRAY®, véase Jurinke, C, Oeth, P., van den Boom, D., “MALDI-TOF mass spectrometry: a versatile tool for high-performance DNA analysis.” Mol. Biotechnol. 26,147-164 (2004); and Oeth, P. et al., “iPLEX™ Assay: Increased Plexing Efficiency and Flexibility for MassARRAY® System through single base primer extension with mass-modified Terminators.” SEQUENOM Application Note (2005). Para una revisión de la detección y cuantificación de ácido nucleico diana usando sondas detectoras escindibles que se escinden durante el procedimiento de amplificación y se detectan mediante espectrometría de masas, véase la solicitud de patente de EE. UU. número 11/950,395, que fue presentada el 4 de diciembre de 2007.
Las tecnologías de secuenciación están mejorando en términos de rendimiento y coste. Las tecnologías de secuenciación, tales como las que se pueden lograr en la plataforma 454 (Roche) (Margulies, M. et al. 2005 Nature 437, 376-380), analizador genómico de Illumina (o plataforma Solexa) o sistema SOLiD (Applied Biosystems) o la tecnología de secuenciación de molécula de ADN única real de Helicos (Harris T D et al. 2008 Science, 320,106-109), la tecnología de molécula única en tiempo real (SMRT.TM.) de Pacific Biosciences y secuenciación con nanoporos (Soni GV and Meller A. 2007 Clin Chem 53:1996-2001), permiten la secuenciación de muchas moléculas de ácido nucleico aisladas de un espécimen en altos órdenes de multiplexación de una forma paralela (Dear Brief Funct Genomic Proteomic 2003; 1: 397-416).
Cada una de estas plataformas permite la secuenciación de moléculas únicas expandidas de manera clonal o no amplificadas de fragmentos de ácido nucleico. Determinadas plataformas implican, por ejemplo, (i) la secuenciación mediante unión de sondas modificadas con tinte (incluyendo la escisión y la unión cíclica), (ii) pirosecuenciación y (iii) secuenciación de molécula única. Las especies de secuencias nucleotídicas, las especies de ácido nucleico de amplificación y los productos detectables generados a partir de las mismas se pueden considerar un "ácido nucleico de estudio" para los propósitos de analizar una secuencia nucleotídica mediante dichas plataformas de análisis de secuencia.
La secuenciación mediante unión es un procedimiento de secuenciación de ácidos nucleicos que se basa en la sensibilidad de la ADN ligasa con respecto al emparejamiento incorrecto en el apareamiento de bases. La ADN ligasa une entre sí extremos de ADN que son bases apareadas correctamente. Combinar la capacidad de la ADN ligasa para únicamente unir entre sí extremos de ADN de bases apareadas correctamente, con grupos mixtos de cebadores u oligonucleótidos marcados con fluorescencia, posibilita la determinación de secuencias mediante detección por fluorescencia. Se pueden obtener lecturas de secuencias más largas incluyendo cebadores que contienen enlaces escindibles que se pueden escindir después de la identificación del marcador. La escisión en el enlazador elimina el marcador y regenera el fosfato en 5´ en el extremo del cebador unido, preparando el cebador para otra tanda de unión. Se pueden marcar los cebadores con más de un marcador fluorescente (por ejemplo, 1 marcador fluorescente, 2, 3 o 4 marcadores fluorescentes).
Un ejemplo de un sistema que se puede usar por un experto en la técnica basándose en la secuenciación mediante unión generalmente implica las siguientes etapas. Se pueden preparar poblaciones de microesferas clonales en microreactores de emulsión que contienen ácido nucleico de estudio ("molde"), componentes de reacción de amplificación, microesferas y cebadores. Después de la amplificación, se desnaturalizan los moldes y se lleva a cabo el enriquecimiento de microesferas para separar microesferas con moldes extendidos de microesferas no deseadas (por ejemplo, microesferas sin ningún molde extendido). El molde en las microesferas seleccionadas se somete a una modificación en 3’ para permitir la unión covalente al portaobjetos y las microesferas modificadas se pueden depositar sobre un portaobjetos de vidrio. Las cámaras de depósito ofrecen la capacidad de segmentar un portaobjetos en una, cuatro u ocho cámaras durante el procedimiento de carga de microesferas. Para el análisis de secuencia, los cebadores se hibridan a la secuencia adaptadora. Un conjunto de cuatro sondas marcadas con tinte de color de compite por la unión al cebador de secuenciación. Se logra la especificidad de unión a la sonda mediante la averiguación cada 4.º y 5.º bases durante la serie de uniones. De cinco a siete tandas de unión, detección y escisión registran el color en cada 5.º posición con el número de rondas determinadas por el tipo de genoteca usada. Después de cada tanda de unión, se dispone una nueva desviación del cebador complementario en una base en la dirección 5‘ para otra serie de uniones. Se repiten secuencialmente cinco veces las tandas de restablecimiento y unión al cebador (5-7 ciclos de unión por tanda) para generar 25-35 pares de bases de secuencia para un único marcador. Con la secuenciación de apareamiento coincidente, este procedimiento se repite para un segundo marcador. Se puede usar dicho sistema para amplificar exponencialmente productos de amplificación generados mediante un procedimiento descrito en el presente documento, por ejemplo, uniendo un ácido nucleico heterógeno al primer producto de amplificación generado mediante un procedimiento descrito en el presente documento y llevando a cabo la amplificación en emulsión usando el mismo soporte sólido o uno diferente usado originalmente para generar el primer producto de amplificación. También se puede usar dicho sistema para analizar productos de amplificación generados directamente mediante un procedimiento descrito en el presente documento eludiendo un procedimiento de amplificación exponencial y clasificando directamente los soportes sólidos descritos en el presente documento en el portaobjetos de vidrio.
La pirosecuenciación es un procedimiento de secuenciación de ácidos nucleicos basado en la secuenciación mediante síntesis, que se basa en la detección de un pirofosfato liberado en la incorporación de nucleótidos. Generalmente, la secuenciación mediante síntesis implica sintetizar un nucleótido a la vez, una cadena de ADN complementaria a la cadena cuya secuencia se está buscando. Los ácidos nucleicos de estudio se pueden inmovilizar en un soporte sólido, hibridar con un cebador de secuenciación, incubar con ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa, apirasa, 5’ fosfosulfato de adenosina y luciferina. Se añaden secuencialmente soluciones de nucleótidos y se eliminan. La correcta incorporación de un nucleótido libera un pirofosfato que interacciona con ATP sulfurilasa y produce ATP en presencia de 5’ fosfosulfato de adenosina, alimentando la reacción de luciferina, que produce una señal quimioluminiscente que permite la determinación de secuencias.
Un ejemplo de un sistema que se puede usar por un experto en la técnica basado en la pirosecuenciación generalmente implica las siguientes etapas: unir un ácido nucleico adaptador a un ácido nucleico de estudio e hibridar el ácido nucleico de estudio a una microesfera; amplificar una secuencia nucleotídica en el ácido nucleico de estudio en una emulsión; clasificar microesferas usando un soporte sólido de múltiples pocillos en picolitros; y secuenciar las secuencias nucleotídicas amplificadas mediante metodología de pirosecuenciación (por ejemplo, Nakano et al., “Single-molecule PCR using water-in-oil emulsion;” Journal of Biotechnology 102: 117-124 (2003)). Se puede usar dicho sistema para amplificar exponencialmente productos de amplificación generados mediante un procedimiento descrito en el presente documento, por ejemplo, uniendo un ácido nucleico heterógeno al primer producto de amplificación generado mediante un procedimiento descrito en el presente documento.
Determinados procedimientos de secuenciación de molécula única se basan en el principio de la secuenciación mediante síntesis y utilizan transferencia de energía por resonancia de fluorescencia de par único (FRET de par único) como un mecanismo mediante el cual se emiten fotones como resultado una incorporación de nucleótidos con éxito. Los fotones emitidos a menudo se detectan usando dispositivos de carga acoplada de sensibilidad alta o intensificada en conjunción con microscopía de reflexión interna total (TIRM). Los fotones se emiten únicamente cuando la solución de reacción introducida contiene el nucleótido correcto para su incorporación en la cadena de ácido nucleico creciente que se sintetiza como resultado del procedimiento de secuenciación. En la secuenciación de molécula única basada en FRET, la energía se transfiere entre dos tintes fluorescentes, a veces los tintes de polimetina cianina Cy3 y Cy5, a través de interacciones dipolo de largo alcance. El donante se excita a su longitud de onda de excitación específica y la energía del estado excitado se transfiere no radiativamente al tinte aceptor, que, a su vez, se excita. El tinte aceptor finalmente regresa al estado fundamental mediante emisión radiativa de un fotón. Los dos tintes usados en el procedimiento de transferencia de energía representan el "par único" en la FRET de par único. A menudo se usa Cy3 como el fluoróforo donante y a menudo se incorpora como el primer nucleótido marcado. A menudo se usa Cy5 como el fluoróforo aceptor y se usa como el marcador de nucleótidos para sucesivas adiciones de nucleótidos después de la incorporación de un primer nucleótido marcado con Cy3. Los fluoróforos generalmente están en los 10 nanómetros de cada uno para que la transferencia de energía se produzca con éxito.
Un ejemplo de un sistema que se puede usar basado en la secuenciación de molécula única generalmente implica hibridar un cebador con un ácido nucleico de estudio para generar un complejo; asociar el complejo con una fase sólida; extender reiteradamente el cebador mediante un nucleótido marcado con una molécula fluorescente; y capturar una imagen de señales de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia después de cada reiteración (por ejemplo, la patente de EE. UU. n.º 7,169,314; Braslavsky et al., PNAS 100(7): 3960-3964 (2003)). Se puede usar dicho sistema para productos de amplificación de secuencia directamente generados mediante los procedimientos descritos en el presente documento. El producto de amplificación lineal liberado se puede hibridar con un cebador que contiene secuencias complementarias a secuencias de captura inmovilizadas presentes, por ejemplo, en un soporte sólido, una microesfera o portaobjetos de vidrio. La hibridación de los complejos cebador-producto de amplificación lineal liberado con las secuencias de captura inmovilizadas, inmoviliza productos de amplificación lineal liberados en soportes sólidos para la secuenciación basada en FRET de par único mediante síntesis. El cebador a menudo es fluorescente, de modo que se puede generar una imagen de referencia inicial de la superficie del portaobjetos con ácidos nucleicos inmovilizados. La imagen de referencia inicial es útil para determinar las ubicaciones en las que se produce una incorporación de nucleótidos real. Las señales de fluorescencia detectadas en ubicaciones de la matriz no identificadas inicialmente en la imagen de referencia de "cebador único" se descartan como fluorescencia no específica. Después de la inmovilización de los complejos cebador-producto de amplificación lineal liberado, los ácidos nucleicos unidos a menudo se secuencian en paralelo mediante etapas reiteradas de a) extensión por polimerasa en presencia de un nucleótido marcado con fluorescencia, b) detección de la fluorescencia usando un microscopio apropiado, por ejemplo, TIRM, c) eliminación del nucleótido fluorescente y d) retorno a la etapa a con un nucleótido marcado con fluorescencia diferente.
La secuenciación de nucleótidos puede ser mediante procedimientos de secuenciación de nucleótido único en fase sólida. Los procedimientos de secuenciación de nucleótido único en fase sólida implican poner en contacto el ácido nucleico de muestra y el soporte sólido en condiciones en las que una molécula única de ácido nucleico de muestra se hibrida con una molécula única de un soporte sólido. Dichas condiciones pueden incluir disponer las moléculas de soporte sólido y una molécula única de ácido nucleico de muestra en un "microreactor". Dichas condiciones también pueden incluir disponer una mezcla en la que la molécula de ácido nucleico de muestra se pueda hibridar al ácido nucleico en fase sólida en el soporte sólido. Los procedimientos de secuenciación de nucleótido único útiles en los procedimientos descritos en el presente documento se describen en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos con número de serie 61/021,871, presentada el 17 de enero de 2008.
Los procedimientos de detección de secuenciación con nanoporos pueden incluir (a) poner en contacto un ácido nucleico para la secuenciación ("ácido nucleico base", por ejemplo, molécula unida a sonda) con detectores específicos de secuencia, en condiciones en las que los detectores se hibridan específicamente a subsecuencias sustancialmente complementarias del ácido nucleico base; (b) detectar señales de los detectores y (c) determinar la secuencia del ácido nucleico base con respecto a las señales detectadas. Los detectores hibridados con el ácido nucleico base se pueden disociar del ácido nucleico base (por ejemplo, disociar secuencialmente) cuando los detectores interfieren con una estructura de nanoporos a medida que el ácido nucleico base pasa a través de un poro, y se detectan los detectores disociados de la secuencia de base. Un detector disociado de un ácido nucleico base puede emitir una señal detectable y el detector hibridado con el ácido nucleico base puede emitir una señal detectable diferente o ninguna señal detectable. Se pueden sustituir nucleótidos en un ácido nucleico (por ejemplo, molécula unida a sonda) con secuencias nucleotídicas específicas correspondientes a nucleótidos específicos ("representantes nucleotídicos"), dando lugar así a un ácido nucleico expandido (por ejemplo, patente de EE. UU. nº 6,723,513), y los detectores se hibridan con los representantes nucleotídicos en el ácido nucleico expandido, lo que sirve como un ácido nucleico base. Aquí, los representantes nucleotídicos se pueden disponer en una disposición binaria o de orden más alto (por ejemplo, Soni and Meller, Clinical Chemistry 53(11): 1996-2001 (2007)). Un ácido nucleico que no está expandido no puede dar lugar a un ácido nucleico expandido, y puede servir directamente como un ácido nucleico base (por ejemplo, una molécula unida a sonda sirve como un ácido nucleico base no expandido) y los detectores se pueden poner directamente en contacto con el ácido nucleico base. Por ejemplo, un primer detector se puede hibridar con una primera subsecuencia y un segundo detector se puede hibridar con una segunda subsecuencia, donde el primer detector y segundo detector tienen cada uno marcadores detectables que se pueden distinguir entre sí, y donde las señales del primer detector y segundo detector se pueden distinguir entre sí cuando los detectores se disocian del ácido nucleico base. Los detectores pueden incluir una región que se hibrida con el ácido nucleico base (por ejemplo, dos regiones), que puede ser de aproximadamente 3 a aproximadamente 100 nucleótidos de longitud (por ejemplo, de aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19, 20, 25, 30, 35,40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95 nucleótidos de longitud). Un detector también puede incluir una o más regiones de nucleótidos que no se hibridan con el ácido nucleico base. Un detector puede ser una baliza molecular. A menudo un detector comprende uno o más marcadores detectables independientemente seleccionados de los descritos en el presente documento. Cada marcador detectable se puede detectar mediante cualquier procedimiento de detección conveniente que pueda detectar una señal generada por cada marcador (por ejemplo, magnética, eléctrica, química, óptica y similares). Por ejemplo, se puede usar una cámara CD para detectar señales de uno o más puntos cuánticos distinguibles ligados a un detector.
En determinados procedimientos de análisis de secuencia se pueden usar lecturas para construir una secuencia nucleotídica más grande, lo que se puede facilitar identificando secuencias solapantes en diferentes lecturas y usando secuencias de identificación en las lecturas. Dichos procedimientos de análisis de secuencia y programas informáticos para construir secuencias más grandes de las lecturas son conocidos por el experto en la técnica (por ejemplo, Venter et al., Science 291:1304-1351 (2001)). Se pueden comparar lecturas específicas, construcciones de secuencias nucleotídicas parciales y construcciones de secuencias nucleotídicas completas entre secuencias nucleotídicas en un ácido nucleico de muestra (es decir, comparación interna) o se pueden comparar con una secuencia de referencia (es decir, comparación de referencia) en determinados procedimientos de análisis de secuencia. A veces las comparaciones internas se llevan a cabo en situaciones en las que un ácido nucleico de muestra se prepara de múltiples muestras o de una fuente de muestra única que contiene variaciones de secuencia. A veces las comparaciones de referencia se llevan a cabo cuando se conoce una secuencia nucleotídica de referencia y un objetivo es determinar si un ácido nucleico de muestra contiene una secuencia nucleotídica que es sustancialmente similar o la misma, o diferente, que una secuencia nucleotídica de referencia. El análisis de secuencia se facilita mediante un aparato y componentes de análisis de secuencia conocidos por el experto en la técnica.
Los procedimientos proporcionados en el presente documento permiten la detección de alto rendimiento de especies de ácido nucleico en una pluralidad de ácidos nucleicos (por ejemplo, especies de secuencias nucleotídicas, especies de ácido nucleico amplificadas y productos detectables generados de lo anterior). La multiplexación se refiere a la detección simultánea de más de una especie de ácido nucleico. Se conocen procedimientos generales para llevar a cabo reacciones multiplexadas en conjunción con espectrometría de masas (véase, por ejemplo, pat. de EE. UU. n.os 6,043,031, 5,547,835 y solicitud PCT internacional n.º WO 97/37041). La multiplexación proporciona la ventaja de que se puede identificar una pluralidad de especies de ácido nucleico (por ejemplo, algunas que tienen diferentes variaciones de secuencia) en tan poco como un único espectro de masas, en comparación con tener que llevar a cabo un análisis de espectrometría de masas por separado para cada especie de ácido nucleico objetivo individual. Los procedimientos proporcionados en el presente documento se pueden prestar a procedimientos altamente automatizados de alto rendimiento para analizar variaciones de secuencia con velocidad y precisión altas. Los procedimientos descritos en el presente documento se pueden multiplexar en niveles altos en una reacción única.
El número de especies de ácido nucleico multiplexadas puede incluir, sin limitación, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 (por ejemplo, aproximadamente 1-3, 3-5, 5-7, 7-9, 9-11,11-13,13-15, 15-17,17-19, 19-21, 21-23, 23-25, 25-27, 27-29, 29-31, 31-33, 33-35, 35-37, 37-39, 39-41, 41-43, 43-45, 45-47, 47-49, 49-51, 51-53, 53-55, 55-57, 57-59, 59-61, 61-63, 63-65, 65-67, 67-69, 69-71, 71-73, 73-75, 75-77, 77-79, 79-81, 81-83, 83-85, 85-87, 87-89, 89-91, 91-93, 93-95, 95-97, 97-101, 101-103,103-105,105-107, 107-109,109-111,111-113, 113-115,
115-117,117-119,121-123,123-125,125-127, 127-129,129-131,131-133,133-135, 135-137,137-139, 139-141, 141-143,143-145, 145-147, 147-149, 149-151, 151-153,153-155,155-157, 157-159,159-161, 161-163, 163-165, 165-167, 167-169,169-171, 171-173, 173-175,175-177,177-179, 179-181, 181-183, 183-185, 185-187, 187-189, 189-191, 191-193, 193-195, 195-197,197-199, 199-201, 201-203, 203-205, 205-207, 207-209, 209-211, 211-213, 213-215, 215-217, 217-219, 219-221, 221-223, 223-225, 225-227, 227-229, 229-231, 231-233, 233-235, 235-237, 237-239, 239-241, 241-243, 243-245, 245-247, 247-249, 249-251, 251-253, 253-255, 255-257, 257-259, 259-261, 261-263, 263-265, 265-267, 267-269, 269-271, 271-273, 273-275, 275-277, 277-279, 279-281, 281-283, 283-285, 285-287, 287-289, 289-291, 291-293, 293-295, 295-297, 297-299, 299-301, 301-303, 303-305, 305-307, 307-309, 309-311, 311-313, 313-315, 315-317, 317-319, 319-321, 321-323, 323-325, 325-327, 327-329, 329-331, 331-333, 333-335, 335-337, 337-339, 339-341, 341-343, 343-345, 345-347, 347-349, 349-351, 351-353, 353-355, 355-357, 357-359, 359-361, 361-363, 363-365, 365-367, 367-369, 369-371, 371-373, 373-375, 375-377, 377-379, 379-381, 381-383, 383-385, 385-387, 387-389, 389-391, 391-393, 393-395, 395-397, 397-401, 401-403, 403-405, 405-407, 407-409, 409-411, 411-413, 413-415, 415-417, 417-419, 419-421, 421-423, 423-425, 425-427, 427-429, 429-431, 431-433, 433-435, 435-437, 437-439, 439-441, 441-443, 443-445, 445-447, 447-449, 449-451, 451-453, 453-455, 455-457, 457-459, 459-461, 461-463, 463-465, 465-467, 467-469, 469-471, 471-473, 473-475, 475-477, 477-479, 479-481, 481-483, 483-485, 485-487, 487-489, 489-491, 491-493, 493-495, 495-497, 497-501).
Los procedimientos de diseño para lograr espectros de masas resueltos con ensayos multiplexados pueden incluir procedimientos de diseño de oligonucleótidos y cebadores y procedimientos de diseño de reacciones. Por ejemplo, véanse los esquemas multiplex proporcionados en las tablas X e Y. Para el diseño de oligonucleótidos y cebadores en ensayos multiplexados, se aplican las mismas pautas generales para el diseño de cebadores para reacciones uniplexedas, tales como evitar el cebado falso y dímeros de cebadores, únicamente están implicados más cebadores para las reacciones múltiplex. Para las aplicaciones de espectrometría de masas, los picos de analito en los espectros de masas para un ensayo se resuelven lo suficiente a partir de un producto de cualquier ensayo con el que se multiplexa ese ensayo, incluyendo los picos de pausa y cualquier otro pico de subproducto. También los picos de analito se encuentran de manera óptima en un margen de masa especificado por el usuario, por ejemplo, en un intervalo de 5.000-8.500 Da. Por ejemplo, el análisis multiplex se puede adaptar a la detección de espectrometría de masas de anomalías cromosómicas. El análisis multiplex se puede adaptar a diversos procedimientos de secuenciación basados en nanoporos o de nucleótido único descritos en el presente documento. Se pueden usar cámaras de microreacción producidas comercialmente o dispositivos o matrices o chips para facilitar el análisis multiplex y están disponibles comercialmente.
Detección de aneuploidia fetal
Para la detección de aneuploidias fetales, algunos procedimientos se basan en la medida de la proporción entre alelos heredados por vía materna y por vía paterna. Sin embargo, la capacidad de cuantificar cambios cromosómicos se ve afectada por la contribución materna de los ácidos nucleicos libres de células, lo que hace necesario quitar ADN materno de la muestra antes de la medición. Los enfoques prometedores se aprovechan de la diferente distribución de tamaños de ADN fetal y materno o miden ARN que se expresa exclusivamente por el feto (por ejemplo, véase la solicitud de patente de EE. UU. n.º 11/384128, que se publicó como US20060252071). Suponiendo que el ADN fetal únicamente representa aproximadamente un 5 % de todo el ADN libre de células en el plasma materno, hay una disminución de la diferencia de proporción de un 1,6 % a únicamente un 1,2 % entre una muestra de trisomía y un control sano. En consecuencia, la detección fiable de los cambios en la proporción de los alelos requiere enriquecer la fracción fetal de ADN libre de células, por ejemplo, usando las composiciones y procedimientos de la presente tecnología.
Algunos procedimientos se basan en la medida de la proporción de los alelos heredados por vía paterna con respecto a los maternos para detectar aneuploidias cromosómicas fetales de plasma materno. Un conjunto diploide produce una proporción de 1:1, mientras que las trisomías se pueden detectar como una proporción de 2:1. La detección de esta diferencia se ve afectada por el muestreo estadístico debido a la baja abundancia de ADN fetal, presencia de ADN materno en exceso en la muestra de plasma y variabilidad de la técnica de medición. Esta última se aborda usando procedimientos con alta precisión de medición, como PCR digital o espectrometría de masas. El enriquecimiento de la fracción fetal de ADN libre de células en una muestra actualmente se logra bien quitando ADN materno a través de exclusión por tamaños o centrándose en los ácidos nucleicos específicos a nivel fetal, como ARN expresado a nivel fetal. Otra característica de diferenciación del ADN fetal es su patrón de metilación del ADN. De esta manera, en el presente documento se proporcionan composiciones y procedimientos novedosos para cuantificar con precisión ácido nucleico fetal basándose en la metilación diferencial entre un feto y la madre. Los procedimientos se basan en el análisis del número de copias absoluto sensible para cuantificar la porción de ácido nucleico fetal en una muestra materna, permitiendo así la detección prenatal de rasgos fetales. Los procedimientos de la tecnología han identificado aproximadamente 3000 regiones ricas en CpG en el genoma que están diferencialmente metiladas entre el ADN materno y fetal. Las regiones seleccionadas mostraron metilación diferencial altamente conservada en todas las muestras medidas. Además, el conjunto de regiones se enriquece de genes importantes en la regulación del desarrollo, lo que indica que la regulación epigenética de estas áreas es un procedimiento biológicamente pertinente y consistente (véase la tabla 3). El enriquecimiento de ADN fetal ahora se puede lograr usando nuestra proteína MBD-FC para capturar ADN libre de células (por ejemplo, sustancialmente todo el ADN libre de células) y entonces eluir la fracción de ADN altamente metilado con altas concentraciones de sal. Al usar fracciones de eluato bajas en sal, la MBD-FC puede enriquecer igualmente ADN fetal no metilado.
La presente tecnología proporciona 63 regiones genómicas confirmadas en los cromosomas 13, 18 y 21 con niveles de metilación materna bajos y fetal altos. Después de la captura de estas regiones, se puede usar SNP para determinar las proporciones de los alelos mencionadas anteriormente. Cuando se usan SNP de alta frecuencia, se tienen que medir alrededor de 10 marcadores para lograr una confianza alta de encontrar al menos un SNP en el que los padres tengan genotipos homocigotos opuestos y el niño tenga un genotipo heterocigoto.
En el presente documento también se describe un procedimiento para la detección de anomalías cromosómicas que utiliza la cuantificación del número de copias absoluto. Un conjunto de cromosomas diploides muestra el mismo número de copias para regiones diferencialmente metiladas en todos los cromosomas, pero, por ejemplo, una muestra con trisomía 21 muestra 1,5 veces más copias para regiones diferencialmente metiladas en el cromosoma
21. Se puede lograr la normalización de las cantidades de ADN genómico para un conjunto de cromosomas diploides usando autosomas no alteradas como referencia (también proporcionados en el presente documento: véase la tabla 1). En comparación con otros enfoques, es menos probable que un único marcador sea suficiente para la detección de esta diferencia, porque que los números de copias globales son bajos. Típicamente hay aproximadamente de 100 a 200 copias de ADN fetal de 1 ml de plasma materno a las de 10 a 12 semanas de gestación. Sin embargo, los procedimientos de la presente tecnología ofrecen una redundancia de marcadores detectables que posibilita la discriminación altamente fiable de conjuntos de cromosomas aneuploides frente a diploides.
Procesamiento de datos e identificación de la presencia o ausencia de una anomalía cromosómica
El término "detección" de una anomalía cromosómica como se usa en el presente documento se refiere a la identificación de un desequilibrio de cromosomas procesando datos que surgen de la detección de conjuntos de especies de ácido nucleico amplificadas, especies de secuencias nucleotídicas o un producto detectable generado de lo anterior (colectivamente "producto detectable"). Se pueden usar cualquier procedimiento y dispositivo de detección adecuados para distinguir uno o más conjuntos de productos detectables, como se aborda en el presente documento. Se puede expresar un resultado que haga referencia a la presencia o ausencia de una anomalía cromosómica en cualquier forma adecuada, incluyendo, sin limitación, probabilidad (por ejemplo, oportunidad relativa, valor de p), posibilidad, porcentaje, valor por encima de un umbral o factor de riesgo, asociada con la presencia de una anomalía cromosómica para un sujeto o muestra. Se puede proporcionar un resultado con uno o más de sensibilidad, especificidad, desviación estándar, coeficiente de variación (CV) y/o nivel de confianza, o combinaciones de los anteriores.
La detección de una anomalía cromosómica basándose en uno o más conjuntos de productos detectables se puede identificar basándose en una o más variables calculadas, incluyendo, pero no limitadas a, sensibilidad, especificidad, desviación estándar, coeficiente de variación (CV), un umbral, nivel de confianza, puntuación, probabilidad y/o una combinación de los mismos, (i) Se pueden determinar completamente o en parte el número de conjuntos seleccionados para un procedimiento de diagnóstico y/o (ii) las especies de secuencias nucleotídicas particulares de cada conjunto seleccionadas para un procedimiento de diagnóstico de acuerdo con una o más de dichas variables calculadas.
Uno o más de sensibilidad, especificidad y/o nivel de confianza se puede expresar como un porcentaje. El porcentaje, independientemente para cada variable, puede ser mayor de aproximadamente un 90 % (por ejemplo, de aproximadamente un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % o mayor de un 99% (por ejemplo, de aproximadamente un 99,5 %, o mayor, de aproximadamente un 99,9 % o mayor, de aproximadamente un 99,95 % o mayor, de aproximadamente un 99,99 % o mayor)). El coeficiente de variación (CV) se puede expresar como un porcentaje, y, a veces, el porcentaje es de aproximadamente un 10 % o menos (por ejemplo, de aproximadamente un 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 %, o menos de un 1 % (por ejemplo, de aproximadamente un 0,5 % o menos, de aproximadamente un 0,1 % o menos, de aproximadamente un 0,05 % o menos, de aproximadamente un 0,01 % o menos)). Una probabilidad (por ejemplo, que un resultado particular determinado mediante un algoritmo no se deba al azar) se puede expresar como un valor de p, y, a veces, el valor de p es aproximadamente 0,05 o menos (por ejemplo, aproximadamente 0,05, 0,04, 0,03, 0,02 o 0,01 o menos de 0,01 (por ejemplo, aproximadamente 0,001 o menos, aproximadamente 0,0001 o menos, aproximadamente 0,00001 o menos, aproximadamente 0,000001 o menos)).
Por ejemplo, puntuar o una puntuación se puede referir a calcular la probabilidad de que una anomalía cromosómica particular esté realmente presente o ausente en un sujeto/muestra. Se puede usar el valor de una puntuación para determinar, por ejemplo, la variación, diferencia o proporción de producto detectable de ácido nucleico amplificado que se puede corresponder con la anomalía cromosómica real. Por ejemplo, el cálculo de una puntuación positiva de productos detectables puede dar lugar a una identificación de una anomalía cromosómica, lo que es particularmente pertinente para el análisis de muestras únicas.
En determinados procedimientos, los datos simulados (o de simulación) pueden ayudar al procesamiento de datos, por ejemplo, entrenando un algoritmo o sometiendo a prueba un algoritmo. Por ejemplo, los datos simulados pueden implicar diversas muestras hipotéticas de diferentes concentraciones de ácido nucleico fetal y materno en suero, plasma y similares. Los datos simulados se pueden basar en lo que se podría esperar de una población real o pueden ser asimétricos para someter a prueba un algoritmo y/o para asignar una clasificación correcta basándose en un conjunto de datos simulados. Los datos simulados también se denominan en el presente documento datos "virtuales". Las contribuciones fetales/maternas en una muestra se pueden simular como una tabla o matriz de números (por
ejemplo, como una lista de picos correspondientes a las señales de masa de productos de escisión de una biomolécula de referencia o secuencia de ácido nucleico amplificado), como un espectro de masas, como un patrón de bandas en un gel o como una representación de cualquier técnica que mida la distribución de masas. Se pueden llevar a cabo simulaciones en la mayoría de los casos mediante un programa informático. Una posible etapa en el uso de un conjunto de datos simulados es evaluar la confianza de los resultados identificados, es decir, cuán bien los positivos/negativos seleccionados se emparejan con la muestra y si hay variaciones adicionales. Un enfoque común es calcular el valor de probabilidad (valor de p) que estima la probabilidad de que una muestra aleatoria tenga una puntuación mejor que la seleccionada. Puesto que los cálculos del valor de p pueden ser prohibitivos en determinadas circunstancias, se puede evaluar un modelo empírico en el que se suponga que al menos una muestra se empareja con una muestra de referencia (con o sin variaciones resueltas). De manera alternativa, se pueden usar otras distribuciones, tales como la distribución de Poisson, para describir la distribución de probabilidades.
Un algoritmo puede asignar un valor de confianza a los verdaderos positivos, verdaderos negativos, falsos positivos y falsos negativos calculados. La asignación de una probabilidad de aparición de una anomalía cromosómica también se puede basar en un determinado modelo de probabilidad.
A menudo se generan datos simulados en un procedimiento informático. Como se usa en el presente documento, el término "informático" se refiere a la investigación y experimentos llevados a cabo usando un ordenador. Los procedimientos informáticos incluyen, pero no se limitan a, estudios de modelado molecular, cariotipado, cálculos genéticos, experimentos de acoplamiento biomolecular y representaciones virtuales de estructuras y/o procedimientos moleculares, tales como interacciones moleculares.
Como se usa en el presente documento, "rutina de procesamiento de datos" se refiere a un procedimiento, que se puede realizar en un programa informático, que determina la significación biológica de datos adquiridos (es decir, los resultados finales de un ensayo). Por ejemplo, una rutina de procesamiento de datos puede determinar la cantidad de cada especie de secuencia nucleotídica basándose en los datos recogidos. Una rutina de procesamiento de datos también puede controlar un instrumento y/o una rutina de recogida de datos basándose en los resultados determinados. A menudo una rutina de procesamiento de datos y una rutina de recogida de datos se integran y proporcionan retroalimentación para establecer la adquisición de datos mediante el instrumento, y, de ahí, proporcionar procedimientos de valoración basados en ensayos proporcionados en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el programa informático se refiere a instrucciones de programa legibles por ordenador que, cuando se ejecutan por un ordenador, llevan a cabo operaciones informáticas. Típicamente el programa informático se proporciona en un producto de programa que contiene instrucciones de programa registradas en un medio legible por ordenador, que incluye, pero no limitado a, medios magnéticos que incluyen disquetes, discos duros y cinta magnética; y medios ópticos que incluyen discos CD-ROM, discos DVD, discos magnetoópticos, y otros de dichos medios en los que se puedan grabar las instrucciones de programa.
Los diferentes procedimientos de predicción de anomalía o normalidad pueden producir diferentes tipos de resultados. Para cualquier predicción dada, hay cuatro tipos posibles de consecuencias: verdadero positivo, verdadero negativo, falso positivo o falso negativo. El término "verdadero positivo" como se usa en el presente documento se refiere a un sujeto diagnosticado correctamente como que tiene una anomalía cromosómica. El término "falso positivo" como se usa en el presente documento se refiere a un sujeto identificado erróneamente como que tiene una anomalía cromosómica. El término "verdadero negativo" como se usa en el presente documento se refiere a un sujeto identificado correctamente como que no tiene una anomalía cromosómica. El término "falso negativo" como se usa en el presente documento se refiere a un sujeto identificado erróneamente como que no tiene una anomalía cromosómica. Se pueden calcular dos medidas de rendimiento para cualquier procedimiento dado basándose en las proporciones de estos casos: (i) un valor de sensibilidad, la fracción de positivos previstos que están identificados correctamente como que son positivos (por ejemplo, la fracción de conjuntos de secuencias nucleotídicas identificados correctamente mediante detección/determinación de comparación de nivel como indicativo de anomalía cromosómica, con respecto a todos los conjuntos de secuencias nucleotídicas identificados como tal, correcta o incorrectamente), reflejando así la precisión de los resultados al detectar la anomalía cromosómica; y (ii) un valor de especificidad, la fracción de negativos previstos identificados correctamente como que son negativos (la fracción de conjuntos de secuencias nucleotídicas identificados correctamente mediante detección/determinación de comparación de nivel como indicativo de normalidad cromosómica, con respecto a todos los conjuntos de secuencias nucleotídicas identificados como tal, correcta o incorrectamente), reflejando así la precisión de los resultados al detectar la anomalía cromosómica.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se proporcionan únicamente a modo de ilustración y no a modo de limitación. Los expertos en la técnica reconocen fácilmente una variedad de parámetros no críticos que se pueden cambiar o modificar para proporcionar esencialmente los mismos resultados o similares.
En el ejemplo 1 a continuación, los solicitantes usaron una nueva proteína de fusión que captura ADN metilado en combinación con una matriz de islas CpG para identificar regiones genómicas que están diferencialmente metiladas entre el tejido placentario fetal y la sangre materna. Se usó un enfoque estadístico estricto para seleccionar
únicamente las regiones que muestran poca variación entre las muestras, y de ahí se sugiere un mecanismo biológico subyacente. Se validaron ochenta y cinco regiones genómicas diferencialmente metiladas predominantemente ubicadas en los cromosomas 13, 18 y 21. Para esta validación, se usó un enfoque basado en espectrometría de masas cuantitativa que averigua 261 amplicones de PCR que cubren estas 85 regiones. Los resultados están en muy buena concordancia (confirmación de un 95 %), lo que demuestra la viabilidad del enfoque.
Luego los solicitantes proporcionan un innovador enfoque para las pruebas de aneuploidia, que se basa en la medición de los números de copias absolutos en lugar de en las proporciones de los alelos.
Ejemplo 1
En el ejemplo a continuación, se usaron diez muestras apareadas de ADN materno y placentario para identificar regiones diferencialmente metiladas. Se validaron estos resultados usando un ensayo de metilación cuantitativo basado en espectrometría de masas. En primer lugar, se extrajo ADN genómico de la capa leucocitaria materna y tejido placentario correspondiente. Luego se usó la MBD-FC para capturar la fracción metilada de cada muestra de ADN. Véanse las figuras 1-3. Las dos fracciones de tejido se marcaron con diferentes tintes fluorescentes y se hibridaron con una micromatriz de islas CpG Agilent®. Véase la figura 4. Esto se hizo para identificar regiones diferencialmente metiladas que se podrían utilizar para diagnósticos prenatales. Por lo tanto, se emplearon dos criterios para seleccionar regiones genómicas como marcadores de enriquecimiento potenciales: la diferencia de metilación observada tenía que estar presente en todos los pares de muestras sometidas a prueba, y la región tenía que ser de más de 200 pb de longitud.
Preparación y fragmentación de ADN
Se preparó ADN genómico (ADNg) de la capa leucocitaria materna y tejido placentario usando el QIAamp DNA Mini Kit™ y QIAamp DNA Blood Mini Kit™, respectivamente, de Qiagen® (Hilden, Alemania). Para MCLP, se cuantificó ADNg usando el espectrofotómetro NanoDrop ND 1000™ (Thermo Fisher®, Waltham, MA,EE. UU.). Se llevaron a cabo ultrasonidos de 2,5 g de ADN en 500 l de tampón TE a un tamaño de fragmento medio de 300-500 pb con el Branson Digital Sonifier 450™ (Danbury, CT, EE. UU.) usando la siguiente configuración: amplitud de un 20 %, tiempo de ultrasonidos 110 segundos, tiempo pulso encendido/pulso apagado 1,4/0,6 segundos. Se supervisó el intervalo de fragmentos usando electroforesis en gel.
Inmunoprecipitación de metil-CpG
Por muestra, se hicieron rotar 56 g proteína MBD-Fc purificada y 150 l de microesferas de proteína A sefarosa 4 de flujo rápido (Amersham Biosciences®, Piscataway, NJ, EE. UU.) en 15 ml de TBS durante la noche a 4 °C. Entonces, las microesferas de MBD-Fc (150 l/ensayo) se transfirieron y dispersaron en 2 ml de dispositivos de filtro centrífugos Ultrafree-CL (Millipore®, Billerica, MA, EE. UU.) y se lavaron por centrifugación tres veces con tampón A (HCl-Tris 20 mM, pH 8,0, MgCl2 2 mM, EDTA 0,5 mM, NaCl 300 mM, NP-40 al 0,1 %). Se añadió ADN sometido a ultrasonidos (2 µg) a las microesferas de MBD-Fc lavadas en 2 ml de tampón A y se hizo rotar durante 3 horas a 4 °C. Se centrifugaron las microesferas para recuperar fragmentos de ADN no unido (fracción 300 mM) y posteriormente se lavaron dos veces con 600 l de tampones que contenían concentraciones en incremento de NaCl (400, 500, 550, 600, and 1000 mM). Se recogió el flujo a través de cada etapa de lavado en tubos separados y se desaló usando un MinElute PCR Purification Kit™ (Qiagen®). En paralelo, se procesaron 200 ng de ADN de entrada sometido a ultrasonidos como un control con el MinElute PCR Purification Kit™ (Qiagen®).
Manipulación de micromatrices y análisis
Para generar ADN marcado con fluorescencia para la hibridación de micromatrices, se combinaron las fracciones de NaCl 600 mM y 1 M (ADN metilado enriquecido) para cada muestra y se marcaron bien con Alexa Fluor 555–aha– dCTP (materno) o Alexa Fluor 647-aha-dCTP (placentario) usando el BioPrime Total Genomic Labeling System™ (Invitrogen®, Carlsbad, CA, EE. UU.). La reacción de marcaje se llevó a cabo de acuerdo con el manual del fabricante. Los fragmentos de ADN genómico marcados de pares maternos/placentarios emparejados se combinaron hasta un volumen final de 80 l, complementado con 50 ng de Cot-1 DNA (Invitrogen®), 52 l de reactivo bloqueante Agilent 10X (Agilent Technologies®, Santa Clara, CA, EE. UU.), 78 l de formamida desionizada, y 260 µl de tampón de hibridación Agilent 2X. Se calentaron las muestras a 95 °C durante 3 min, se mezclaron y posteriormente se incubaron a 37 °C durante 30 min. Entonces se llevó a cabo la hibridación en el Agilent CpG Island Microarray Kit™ a 67 °C durante 40 horas usando una cámara Agilent SureHyb™ y un horno de hibridación Agilent. Los portaobjetos se lavaron en lavado I (6X SSPE, N-lauroilsarcosina al 0,005 %) a temperatura ambiente durante 5 min y en lavado II (0,06X SSPE) a 37 °C durante 5 min adicionales. Luego se sumergieron los portaobjetos en acetonitrilo y Agilent Ozone Protection Solution™, respectivamente, durante 30 segundos. Las imágenes se escanearon inmediatamente y se analizaron usando un Agilent DNA Microarray Scanner™. Se procesaron las imágenes de micromatriz usando el programa informático Feature Extraction v9.5 y el protocolo CGH estándar.
Tratamiento con bisulfito
La conversión con bisulfito de sodio de ADN genómico se llevó a cabo usando el EZ-96 DNA Methylation Kit™
(ZymoResearch, Orange County, CA). Se siguió el protocolo del fabricante usando 1 µg de ADN genómico y el protocolo de conversión alternativo (una desnaturalización de ADN a dos temperaturas).
Análisis de metilación cuantitativo
Se usó el MassARRAY® de Sequenom para llevar a cabo el análisis de metilación cuantitativo. Este sistema utiliza espectroscopía de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz de tiempo de vuelo (MALDI-TOF) en combinación con escisión específica de base de ARN (Sequenom® MassCLEAVE™). Entonces, se analiza un patrón detectable para determinar el estado de metilación. Los cebadores de PCR se diseñaron usando Sequenom® EpiDESIGNER™ (www.epidesigner.com). Se usaron un total de 261 amplicones, que cubrían 85 regiones diana para la validación (mediana de longitud de amplificación = 367 pb, min = 108, máx = 500; mediana del número de CpG por amplicón =23, min = 4, máx = 65). Para cada cebador inverso, se añadió un marcador de promotor T7 adicional para la transcripción in vivo, así como un marcador 10-mero en el cebador directo para ajustar las diferencias de temperatura de fusión. La bioquímica de MassCLEAVE(tm) se llevó a cabo como se describe previamente (Ehrich M, et al. (2005) Quantitative high-throughput analysis of DNA methylation patterns by base specific cleavage and mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A 102:15785-15790). Se adquirieron los espectros de masas usando MassARRAY™ Compact MALDI-TOF (Sequenom®, San Diego) y se generaron las proporciones de metilación mediante el programa informático EpiTYPER™ v1.0 (Sequenom®, San Diego).
Análisis estadístico
Todos los cálculos estadísticos se llevaron a cabo usando el paquete de programa informático estadístico R (www.r-proiect.org). En primer lugar, las sondas de matrices se agruparon basándose en su ubicación genómica. Se agruparon entre sí las sondas posteriores que tenían menos de 1000 pb de diferencia. Para identificar las regiones diferencialmente metiladas, se usó como referencia una muestra de control. En la muestra de control, la fracción metilada de un ADN de control derivado de la sangre se hibridó frente a sí mismo. Idealmente esta muestra debería mostrar proporciones en escala logarítmica de los dos canales de color alrededor de 0. Sin embargo, debido a la variabilidad en el comportamiento de la hibridación, las sondas muestran una proporción en escala logarítmica media de 0,02 y una desviación estándar de 0,18. Luego las proporciones en escala logarítmica observadas en nuestras muestras se compararon con la muestra de control. Se usó una prueba de la t para datos apareados bidireccional para someter a prueba la hipótesis de nulidad de que los grupos sean idénticos. Se excluyeron del análisis los grupos que contenían menos de 4 sondas. Para los grupos que incluían cuatro o cinco sondas, se usaron todas las sondas en una prueba de la t para datos apareados. Para los grupos con seis o más sondas, se usó una prueba de ventana deslizante que consistía en cinco sondas a la vez, con lo que se movió la ventana mediante incrementos de una sonda. Se comparó cada muestra de prueba con la muestra de control y se registraron los valores de p. Se seleccionaron las regiones genómicas como que estaban diferencialmente metiladas si ocho de diez muestras mostraban un valor de p < 0,01, o si seis de diez muestras mostraban un valor de p < 0,001. Las regiones genómicas se clasificaron como que no estaban diferencialmente metiladas cuando el grupo mostró menos de ocho muestras con un valor de p < 0,01 y menos de seis muestras con un valor de p < 0,001. Las muestras que no se encontraban en ninguna categoría se excluyeron del análisis. Para un subconjunto de regiones genómicas que se han identificado como diferencialmente metiladas, los resultados se confirmaron usando el análisis de metilación cuantitativo.
El análisis Go se llevó a cabo usando la herramienta en línea GOstat (http://gostat.wehi.edu.au/cgibin/-goStat.pl). Se calcularon los valores de p usando la prueba exacta de Fisher.
Resultados del descubrimiento con marcador basado en micromatrices
Para identificar regiones diferencialmente metiladas se usó una muestra estándar, en la que se hibridó la fracción de ADN metilado de monocitos frente a sí mismo. Este estándar proporcionó una referencia para determinar la variabilidad de mediciones fluorescentes en una región genómica. Entonces se identificaron las regiones diferencialmente metiladas comparando las proporciones en escala logarítmica de cada una de las diez muestras placentarias/maternas frente a este estándar. Debido a que el cometido de este estudio era identificar marcadores que permiten la separación fiable de ADN materno y fetal, la selección de dianas se limitó a genes que mostraban una diferencia de metilación estable y consistente sobre un tramo contiguo de ADN genómico. Este se centró en el análisis en regiones genómicas en las que múltiples sondas indicaron metilación diferencial. En la selección también se limitó a regiones diana en las que todas las muestras mostraron metilación diferencial, excluyendo aquellas con fuertes diferencias interindividuales. Dos de las muestras mostraron proporciones en escala logarítmica generalmente inferiores en el análisis por micromatrices. Debido a que se usó una prueba para datos apareados para la selección dianas, esto no afectó negativamente a los resultados.
Basándose en estos criterios de selección, se identificaron 3043 regiones genómicas que estaban diferencialmente metiladas entre el ADN materno y fetal. 21778 regiones no mostraron una diferencia de metilación. No se observó ningún sesgo intercromosómico en la distribución de regiones diferencialmente metiladas. Las regiones diferencialmente metiladas se ubicaron adyacentes a o en 2159 genes conocidos. La mayoría de las regiones diferencialmente metiladas se ubican en el área del promotor (18 %) y en el interior de la región codificante (68 %), mientras que únicamente algunas regiones se ubican en dirección 3′ del gen (7 %) o en la transición del promotor a la región codificante (7 %). Las regiones que no mostraron metilación diferencial mostraron una distribución similar para
el promotor (13 %) y ubicaciones en dirección 3′ (5 %), pero la fracción de regiones ubicadas en la transición del promotor a la región codificante fue más alta (39 %) y la fracción en el interior de la región codificante fue más baja (43 %).
Se ha demostrado que en las células madre embrionarias (ES) los genes seleccionados como diana por el complejo represor polycomb x2 (PRC2) se enriquecen de genes que regulan el desarrollo (Lee Tl, et al. (2006) Control of developmental regulators by Polycomb in human embryonic stem cells. Cell 125:301-313). También se ha demostrado que los genes diferencialmente metilados se enriquecen de genes seleccionados como diana por PRC2 en muchos tipos de cánceres (Ehrich M, et al. (2008) Cytosine methylation profiling of cancer cell lines. Proc Natl Acad Sci USA 105:4844-48). El conjunto de genes identificados como diferencialmente metilados en este estudio también se enriquece de genes seleccionados como diana por PRC2 (valor de p <0,001, oportunidad relativa = 3,6, un 95 % de IC para oportunidad relativa = 3,1 a 4,2). Un análisis GO del conjunto de genes diferencialmente metilados revela que este conjunto se enriquece considerablemente de funciones importantes durante el desarrollo. Seis de las diez funciones más enriquecidas incluyen procedimientos de desarrollo o morfogénicos [morfogénesis de estructura anatómica (GO:0009653, valor de p = 0), procedimiento de desarrollo (GO:0032502, valor de p = 0), desarrollo de organismos pluricelulares (GO:0007275, valor de p = 0), desarrollo de un órgano (GO:0048513, valor de p = 0), desarrollo de sistemas (GO:0048731, valor de p = 0) y desarrollo de una estructura anatómica (GO:0048856, valor de p = 0)].
Validación usando EpiTYPER™ de Sequenom®
Para validar los hallazgos de micromatrices, se seleccionaron 63 regiones de los cromosomas 13, 18 y 21 y unas 26 regiones adicionales de otros autosomas para la confirmación mediante una tecnología diferente. Se usó la tecnología EpiTYPER™ de Sequenom para medir cuantitativamente la metilación del ADN en muestras maternas y placentarias. Para una explicación de los procedimientos de EpiTYPER™, véase Ehrich M, Nelson MR, Stanssens P, Zabeau M, Liloglou T, Xinarianos G, Cantor CR, Field JK, van den Boom D (2005) Quantitative high-throughput analysis of DNA methylation patterns by base specific cleavage and mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A 102:15785-15790). Para cada sitio CpG individual en una región diana se calculó el valor de metilación promedio en todas las muestras de ADN materno y en todas las muestras placentarias. Entonces se comparó la diferencia entre la metilación materna y placentaria promedio con los resultados de las micromatrices. Los resultados de las dos tecnologías estaban en buena concordancia (véase la figura 7). Para 85 regiones diana, los resultados cuantitativos confirman los resultados de las micromatrices (un 95 % de tasa de confirmación). Para 4 regiones diana, todas ubicadas en el cromosoma 18, no se pudieron confirmar los resultados. La razón de esta discrepancia actualmente no está clara.
A diferencia de las micromatrices, que se centran en la identificación de diferencias de metilación, la medición cuantitativa de la metilación del ADN permitió el análisis de valores de metilación absolutos. En el conjunto de validación de 85 regiones diferencialmente metiladas confirmadas, un subconjunto de 26 regiones está más metilado en la muestra de ADN materno y 59 regiones están más metiladas en la muestra placentaria (véase la tabla 1). Curiosamente, los genes que están hipometilados en las muestras placentarias tienden a mostrar diferencias de metilación más grandes que los genes que están hipermetilados en la muestra placentaria (mediana de diferencia de metilación para genes hipometilados = 39 %, para genes hipermetilados = 20 %).
Ejemplo 2
El ejemplo 2 describe un enfoque no invasivo para detectar la cantidad de ácido nucleico fetal presente en una muestra materna (en el presente documento denominado el "procedimiento cuantificador fetal"), que se puede usar para detectar o confirmar rasgos fetales (por ejemplo, sexo fetal de compatibilidad RhD) o diagnosticar anomalías cromosómicas, tales como la trisomía 21 (ambos de los cuales se denominan en el presente documento el "procedimiento de diagnóstico fetal basado en metilación"). La figura 10 muestra un ejemplo del procedimiento cuantificador fetal y la figura 11 muestra un ejemplo del procedimiento de diagnóstico fetal basado en metilación. Ambos procedimientos usan ADN fetal obtenido de una muestra materna. La muestra comprende ácido nucleico materno y fetal que está diferencialmente metilado. Por ejemplo, la muestra puede ser plasma o suero materno. El ADN fetal comprende aproximadamente un 2-30 % del ADN total en el plasma materno. La cantidad real de contribución fetal al ácido nucleico total presente en una muestra varía de embarazo a embarazo y se puede cambiar basándose en una serie de factores, incluyendo, pero no limitados a, edad gestacional, la salud de la madre y la salud del feto.
Como se describe en el presente documento, el desafío técnico planteado por el análisis del ADN fetal en el plasma materno radica en la necesidad de ser capaz de discriminar el ADN fetal del ADN materno de fondo coexistente. Los procedimientos de la presente tecnología explotan dichas diferencias, por ejemplo, la metilación diferencial que se observa entre el ADN fetal y materno, como un medio para enriquecer el porcentaje relativamente pequeño de ADN fetal presente en una muestra de la madre. La naturaleza no invasiva del enfoque proporciona una ventaja importante sobre los procedimientos convencionales de diagnóstico prenatal, tales como amniocentesis, biopsia de vellosidades coriónicas y cordocentesis, que se asocian con un pequeño, pero limitado, riesgo de muerte fetal. También, puesto que el procedimiento no depende de las células fetales que están en cualquier fase celular particular, el procedimiento proporciona un medio de detección rápida para determinar la presencia y también la naturaleza de la
anomalía cromosómica. Además, el enfoque es el independiente del sexo (es decir, no requiere la presencia de un cromosoma Y) e independiente de polimorfismos (es decir, no se determina una proporción alélica). De esta manera, las composiciones y procedimientos de la tecnología representan enfoques no invasivos mejorados y universales para determinar con precisión la cantidad de ácido nucleico fetal presente en una muestra materna.
5 Diseño del ensayo y ventajas
Hay una necesidad de obtener una detección y cuantificación precisas de ADN fetal aislado de manera no invasiva de una muestra materna. La presente tecnología se aprovecha de la presencia de ácido nucleico fetal libre de células en circulación (ccfDNA) en el plasma o suero materno. A fin de ser comercialmente y clínicamente prácticos, los procedimientos de la tecnología únicamente deben consumir una pequeña porción del ADN fetal disponible de
10 manera limitada. Por ejemplo, menos de un 50 %, 40 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 % o menos de la muestra. Además, el enfoque de se debe desarrollar preferentemente en un formato de ensayo multiplex en el que se incluyen uno o más (preferentemente todos) de los siguientes ensayos:
● Ensayos para la detección de la cantidad total de equivalentes genómicos presentes en la muestra, es decir, ensayos que reconocen ambas especies de ADN materno y fetal;
15 ● Ensayos para la detección de ADN fetal aislado de un embarazo de sexo masculino, es decir, secuencias específicas para el cromosoma Y;
●
Ensayos específicos para regiones identificadas como diferencialmente metiladas entre el feto y la madre; o
●
Ensayos específicos para regiones que se sabe que están hipometiladas en todos los tejidos que se van a investigar, que pueden servir de control para la eficiencia de restricción.
20 Otras características del ensayo pueden incluir uno o más de los siguientes:
● Para cada ensayo, un oligonucleótido competidor específico de diana que es idéntico, o sustancialmente idéntico, a la secuencia diana aparte de una característica distinguible del competidor, tal como una diferencia en uno o más nucleótidos con respecto a la secuencia diana. Este oligonucleótido, cuando se añade en la reacción PCR, se coamplifica con la diana y una proporción obtenida entre estos dos amplicones de PCR indica
25 el número de secuencias de ADN específicas diana (por ejemplo, ADN fetal de un locus específico) presentes en la muestra materna.
● Las longitudes de amplicones deben ser preferentemente de longitud similar a fin de no distorsionar la amplificación hacia los fragmentos más cortos. Sin embargo, siempre que la eficiencia de amplificación sea aproximadamente igual, se pueden usar diferentes longitudes.
30 ● Se pueden seleccionar dianas diferencialmente metiladas de la tabla 1 o de cualquier otra diana conocida por estar diferencialmente metilada entre la madre y el feto. Estas dianas pueden estar hipometiladas en el ADN aislado de mujeres no embarazadas y hipermetiladas en muestras obtenidas de muestras fetales. Estos ensayos sirven como controles para la eficiencia de restricción.
● Los resultados obtenidos de los diferentes ensayos se pueden usar para cuantificar uno o más de los siguientes:
35 ○ Número total de genomas amplificables presentes en la muestra (cantidad total de equivalentes genómicos);
○
La fracción fetal de los genomas amplificables (porcentaje o concentración fetal); o
○
Las diferencias en el número de copias entre las secuencias de ADN derivadas del feto (por ejemplo, entre el cromosoma fetal 21 y un cromosoma de referencia, tal como el cromosoma 3).
Ejemplos de ensayos usados en la prueba
40 A continuación, se muestra un resumen de las etapas de reacción usadas para llevar a cabo un procedimiento de la tecnología, por ejemplo, como se proporciona en la figura 10. Este resumen no pretende limitar el alcance de la tecnología. Más bien proporciona un ejemplo de la tecnología que usa la tecnología MassARRAY® de Sequenom®.
1) Aislamiento de ADN a partir de muestras de plasma.
2) Digestión de las dianas de ADN usando enzimas de restricción sensibles a metilación (por ejemplo, Hhal y 45 Hpall).
Para cada reacción, el ADN disponible se mezcló con agua hasta un volumen final de 25 ul.
Se añadieron 10 ul de una mezcla de reacción que consistía en 10 unidades de HhaI, 10 unidades de HpaII y un tampón de reacción. La muestra se incubó a una temperatura óptima para las enzimas de restricción. HhaI y HpaII digieren ADN no metilado (y no digieren ADN hemi o completamente metilado). Después de la
50 digestión, las enzimas se desnaturalizaron mediante una etapa de calentamiento.
3) Se llevó a cabo amplificación genómica por PCR en un volumen total de 50 ul añadiendo reactivos de PCR (tampón, dNTP, cebadores y polimerasa). La PCR y los cebadores de extensión ejemplares se proporcionan a continuación. Además, se añadió oligonucleótido competidor sintético en concentraciones conocidas.
4) Replicados (opcional): después de la PCR, se dividió la reacción de 50 ul en reacciones paralelas (replicados) de 5 ul a fin de minimizar la variación introducida durante las etapas de PCR posteriores de la prueba. Las etapas de PCR posteriores incluyen SAP, extensión del cebador (tecnología MassEXTEND®), tratamiento con resinas, disposición de spectrochip y MassARRAY.
5) Se usó la tecnología MassARRAY® de Sequenom de genomas amplificables para determinar la cantidad de producto de amplificación para cada ensayo. Después de la PCR, se usó un ensayo de extensión de base única para averiguar las regiones amplificadas (incluyendo los oligonucleótidos competidores introducidos en la etapa 3). Se introdujeron cebadores de extensión específicos para hibridarse directamente adyacentes al sitio de interés. Véanse los cebadores de extensión proporcionados a continuación. Estos oligonucleótidos de ADN se denominan cebadores de iPLEX® MassEXTEND®. En la reacción de extensión, los cebadores de iPLEX se hibridaron con los moldes de ADN complementario y se extendieron con una ADN polimerasa. Las mezclas de terminación especiales que contienen diferentes combinaciones de desoxi y didesoxinucleótidos trifosfato junto con la enzima y tampón, limitaron directamente la extensión de los cebadores de iPLEX. La extensión del cebador se produce hasta que se incorpora un didesoxinucleótido complementario.
La reacción de extensión generó productos de cebador de longitud variable, cada uno con un peso molecular único. Como resultado, los productos de extensión del cebador se pueden separar simultáneamente y detectar usando espectroscopía de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz de tiempo de vuelo (MALDI-TOF) en el MassARRAY® Analyzer Compact. Después de esta separación y detección, el programa informático registrado de SEQUENOM analiza automáticamente los datos.
6) Calcular la cantidad y concentración de ácido nucleico fetal. Los procedimientos para calcular la cantidad total de equivalentes genómicos presentes en la muestra, la cantidad (y concentración) de ácido nucleico fetal aislado de un embarazo de sexo masculino y la cantidad (y concentración) de nucleico fetal basándose en dianas diferencialmente metiladas se proporcionan a continuación y en las figuras 18 y 19.
Se puede usar el protocolo anterior para llevar a cabo uno o más de los ensayos descritos a continuación. Además de las secuencias proporcionadas inmediatamente a continuación, se proporciona un esquema multiplex que averigua de manera múltiple en la tabla X a continuación.
1) Ensayo para la cuantificación del número total de equivalentes genómicos amplificables en la muestra.
Se seleccionaron dianas en los genes constitutivos no ubicados en los cromosomas 13, 18, 21, X o Y. Las dianas deben estar en una copia génica única y no contener ningún sitio de reconocimiento para las enzimas de restricción sensibles a metilación.
Las secuencias subrayadas son sitios de cebadores de PCR, en cursiva son el sitio para el cebador de extensión de base única y la letra en negrita (C) es el nucleótido extendido en ADN humano
Cromosoma 19 de ApoE: secuencia de diana de ADN 45409835-45409922 con el nucleótido averiguado C en negrita. Todas las posiciones cromosómicas proporcionadas en esta sección proceden de UCSC Genome Build de febrero de 2009.
GATTGACAGTTTCTCCTTCCCCAGACTGGCCAATCACAGGCAGGAAGATGTTGGTTCTGTGGGCTGCGTTGCTG GTCACATTCCTGGC
Cebador directo de ApoE: 5’-ACGTTGGATG-TTGACAGTTTCTCCTTCCCC (el cebador contiene un MassTag de 10 pb en 5’ separado por un guión)
Cebador inverso de ApoE: 5’-ACGTTGGATG-GAATGTGACCAGCAACGCAG (el cebador contiene un MassTag de 10 pb en 5’ separado por un guión)
Cebador de extensión de ApoE: 5’-GCAGGAAGATGAAGGTT [C/T] El cebador extiende C en dianas de ADN humano y T en dianas de ADN sintético
Oligonucleótido competidor sintético de ApoE: 5’-
GATTGACAGTTTCTCCTTCCCCAGACTGGCCAATCACAGGCAGGAAGATGAAGGTTTTGTGGGCTGCGTTGCTG GTCACATTCCTGGC (T en negrita en la posición 57 es diferente de ADN humano)
2) Ensayo para la cuantificación del número total de secuencias del cromosoma Y en la muestra.
Se seleccionaron dianas específicas para el cromosoma Y sin secuencias parálogas o similares en otro lugar en el genoma. Las dianas deben estar preferentemente en un gen de copia única y no contener ningún sitio de
reconocimiento para la(s) enzima(s) de restricción sensible(s) a metilación.
Las secuencias subrayadas son sitios de cebadores de PCR y el/los nucleótido(s) en cursiva son el sitio para el cebador de extensión de base única y la letra en negrita (C) es el nucleótido extendido en ADN humano SRY en croY:2655628-2655717 (complemento inverso) GAGTTTTGGATAGTAAAATAAGTTTCGAACTCTGGCACCTTTCAATTTTGTCGCACTCTCCTTGTTTTTGACAATG
CAATCATATGCTTC
Cebador directo de SRY: 5’-ACG-TGGATAGTAAAATAAGTTTCGAACTCTG (el cebador contiene un MassTag de 3 pb en 5’ separado por un guión) Cebador inverso de SRY: 5’-GAAGCATATGATTGCATTGTCAAAAAC Cebador de extensión de SRY: 5’-aTTTCAATTTTGTCGCACT [C/T] El cebador extiende C en dianas de ADN
humano y T en dianas de ADN sintético. "a" en letra minúscula en 5´es un nucleótido no complementario Oligonucleótido competidor sintético de SRY: 5’-GAGTTTTGGATAGTAAAATAAGTTTCGAACTCTGGCACCTTTCAATTTTGTCGCACTTTCCTTGTTTTTGACAATGC
AATCATATGCTTC
3) Ensayo para la cuantificación de secuencias de ADN metilado fetal presentes en la muestra.
Se seleccionaron las dianas en regiones conocidas por estar diferencialmente metiladas entre ADN materno y fetal. Se seleccionaron secuencias que contuvieran varios sitios de restricción para enzimas sensibles a metilación. Para este estudio se usaron las enzimas Hhal (GCGC) y Hpall (CCGG).
Las secuencias subrayadas son sitios de cebadores de PCR, en cursiva son el sitio para el cebador de extensión de base única y la letra en negrita (C) es el nucleótido extendido en ADN humano, la letra minúscula son sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción sensibles a metilación.
TBX3 en cro12:115124905-115125001
GAACTCCTCTTTGTCTCTGCGTGCccggcgcgcCCCCCTCccggTGGGTGATAAACCCACTCTGgcgccggCCATgcgcT GGGTGATTAATTTGCGA
Cebador directo de TBX3: 5’-ACGTTGGATG-TCTTTGTCTCTGCGTGCCC (el cebador contiene un MassTag de 10 pb en 5’ separado por un guión)
Cebador inverso de TBX3: 5’-ACGTTGGATG-TTAATCACCCAGCGCATGGC (el cebador contiene un MassTag de 10 pb en 5’ separado por un guión)
Cebador de extensión de TBX3: 5’-CCCCTCCCGGTGGGTGATAAA [C/T] El cebador extiende C en dianas de ADN humano y T en dianas de ADN sintético. "a" en letra minúscula en 5´es un nucleótido no complementario
Oligonucleótido competidor sintético de TBX3: 5’-
GAACTCCTCTTTGTCTCTGCGTGCCCGGCGCGCCCCCCTCCCGGTGGGTGATAAATCCACTCTGGCGCCGGCC ATGCGCTGGGTGATTAATTTGCGA
4) Ensayo de control para la eficiencia de restricción con enzimas.
Se seleccionaron las dianas en regiones conocidas por no estar metiladas en ningún tejido que se iba a investigar Se seleccionaron secuencias que contuvieran no más de un sitio para cada enzima de restricción que se iba a usar.
Las secuencias subrayadas son sitios de cebadores de PCR, el/los nucleótido(s) en cursiva representan el sitio para el cebador de extensión de base única y la letra en negrita (G) es el nucleótido inverso extendido en ADN humano, la letra minúscula son sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción sensibles a metilación.
Cro17 de CACNA1G:48637892-48637977 (complemento inverso)
CCATTGGCCGTCCGCCGTGGCAGTGCGGGCGGGAgcgcAGGGAGAGAACCACAGCTGGAATCCGATTCCCACC CCAAAACCCAGGA
Cebador directo de Hhal: 5’-ACGTTGGATG-CCATTGGCCGTCCGCCGTG (el cebador contiene un MassTag de 10 pb en 5’ separado por un guión)
Cebador inverso de Hhal: 5’-ACGTTGGATG-TCCTGGGTTTTGGGGTGGGAA (el cebador contiene un MassTag de
10 pb en 5’ separado por un guión) Cebador de extensión HhaI: 5’-TTCCAGCTGTGGTTCTCTC Oligonucleótido competidor sintético de Hhal : 5’-CCATTGGCCGTCCGCCGTGGCAGTGCGGGCGGGAGCGCAGAGAGAGAACCACAGCTGGAATCCGATTCCCAC
5 CCCAAAACCCAGGA
Experimentos de validación
La sensibilidad y precisión de la presente tecnología se midió usando tanto un sistema modelo y muestras clínicas. En las diferentes muestras, se ejecutó un ensayo multiplex que contenía 2 ensayos para la cuantificación del número de copias total, 3 ensayos para la cuantificación de la metilación, 1 ensayo específico para el cromosoma Y y
10 1 ensayo de control de la digestión. Véanse las tablas X1 y X2. Otro esquema multiplex con ensayos adicionales se proporciona en las tablas Y1 e Y2.

TABLA X1: Cebadores de PCR y cebadores de extensión
ID de gen
* Primer cebador Segundo cebador Cebador de extensión
SOX14
M
Hhal_CTRL
D
TBX3
M
SRY
Y
ALB
T
EDG6
M
ARNasaP
T
TABLA X2: Secuencia de oligonucleótido competidor
ID de gen
* Secuencia de oligonucleótido competidor
SOX14
M
Hhal_CTRL
D
TBX3
M
SRY
Y
ALB
T
EDG6
M
ARNasaP
T

TABLA Y1: Cebadores de PCR y cebadores de extensión
ID de gen
* Primer cebador Segundo cebador Cebador de extensión
EDG6
M
ARNasaP
T
ApoE
T
SOX14
M
ID de gen
* Primer cebador Segundo cebador Cebador de extensión
SRY n.º 2
Y
SRY n.º 1
Y
TBX3
M
CACNA1G digCTRL 1
D
DAPK1 dig CTRL 2
D
ALB
T

TABLA Y2: Secuencia de oligonucleótido competidor
ID de gen
* Competidor
EDG6
M
ARNasaP
T
ApoE
T
SOX14
M
SRY n.º 2
Y
SRY n.º 1
Y
TBX3
M
CACNA1G digCTRL 1
D
DAPK1 dig CTRL 2
D
ALB
T
T=Ensayo para la cantidad total; M= Ensayo para la cuantificación de la metilación; Y= Ensayo específico para el cromosoma Y;D= Control de la digestión
Sistema modelo usando ADN genómico
A fin de determinar la sensibilidad y precisón del procedimiento al determinar el número total de copias genómicas amplificables en una muestra, se sometió a prueba un subconjunto de diferentes muestras de ADN aisladas de la sangre de mujeres no embarazadas. Se diluyó cada muestra para que contuviera aproximadamente 2500,1250, 625
o 313 copias por reacción. Se obtuvo el número total de copias genómicas amplificables tomando la proporción de ADN/competidor media obtenida de los tres ensayos del número de copias total. Los resultados de las cuatro muestras diferentes se muestran en la figura 12.
Para optimizar la reacción, se desarrolló un sistema modelo para simular muestras de ADN aisladas de plasma. Estas muestras contenían un número constante de ADN no metilado materno y se les agregaron diferentes cantidades de ADN metilado placentario con feto de sexo masculino. A las muestras se les agregaron cantidades que variaban de aproximadamente un 0 a un 25 % con respecto al ADN no metilado materno. Los resultados se muestran en las figuras 13A y B. Se calculó la fracción de ADN placentario usando las proporciones obtenidas de los ensayos de metilación (figura 13A), los marcadores de SRY (figura 13B) y los ensayos del número de copias total. Anteriormente se proporcionan las secuencias de cebadores para los ensayos de metilación (TBX), ensayos para el cromosoma Y (SRY) y número de copias total (APOE). El sistema modelo demostró que el procedimiento basado en metilación obtuvo resultados iguales al procedimiento para el cromosoma Y (marcadores de SRY), validando de esta manera el procedimiento basado en metilación como un cuantificador fetal independiente del sexo.
Muestras de plasma
Para investigar la sensibilidad y precisión de los procedimientos en muestras clínicas, se investigaron 33 muestras de plasma obtenidas de mujeres embarazadas con un feto de sexo masculino usando el esquema multiplex de la tabla
X. Para cada reacción, se usó una cuarta parte del ADN obtenido de una extracción de 4 ml a fin de satisfacer el importante requisito de que únicamente se use una porción de la muestra total.
Cuantificación del número de copias total
Los resultados de la cuantificación del número de copias total se pueden ver en las figuras 14A y B. En la figura 14A, se muestra el número de copias para cada muestra. Dos muestras (n.os 25 y 26) tienen un número de copias total significativamente más alto que las demás muestras. En general, se obtuvo una media de aproximadamente 1300 copias amplificables/ml de plasma (intervalo 766-2055). La figura 14B muestra una representación de cajas y bigotes de los valores dados, que resume los resultados.
Correlación entre los resultados obtenidos de los marcadores de metilación y el marcador del cromosoma Y
En las figuras 15A y B, se representan los números de copias fetales para cada muestra. Como todas las muestras, procedían de embarazos de sexo masculino. Los números de copias obtenidos se pueden calcular usando bien los marcadores específicos del cromosoma Y o de metilación. Como se puede ver en la figura 15B, la representación de cajas y bigotes de los valores dados indicó una diferencia mínima entre las dos mediciones diferentes.
Los resultados que muestran la correlación entre los resultados obtenidos de los marcadores de metilación y el marcador del cromosoma Y (SRY) se muestran en la figura 16. De nuevo, el procedimiento basado en metilación obtuvo resultados iguales al procedimiento para el cromosoma Y (marcadores de SRY), validando de esta manera el procedimiento basado en metilación como un cuantificador fetal independiente de polimorfismos e independiente del sexo. Se usaron los ensayos multiplexados divulgados en la tabla X para determinar la cantidad de ácido nucleico fetal.
Por último, la eficiencia de digestión se determinó usando la proporción de digestión para el control frente al competidor y comparando este valor con los ensayos del número de copias total medio. Véase la figura 17. Aparte de la muestra 26, todas las reacciones indican que la eficiencia está por encima de un 99 %.
Análisis de los datos
Se hizo el análisis de los espectros de masas usando Typer4 (un producto informático de Sequenom). Se determinó la altura del pico (señal sobre ruido) para cada ensayo de competidor y analito de ADN individual y se exportó para análisis posteriores.
El número total de moléculas presentes para cada amplicón se calculó dividiendo el pico específico de ADN entre el pico específico de competidor para dar una proporción. (Se puede considerar el pico de "ADN" en las figuras 18 y 19 como el pico de analito para un ensayo dado). Puesto que se conoce el número de moléculas de competidor añadidas a la reacción, el número total de moléculas de ADN se puede determinar multiplicando la proporción por el número de moléculas de competidor añadidas.
La fracción ADN fetal (o concentración) en cada muestra se calculó usando los marcadores específicos del cromosoma Y para embarazos de sexo masculino y la media de la fracción metilada para todos los embarazos. En pocas palabras, para el cromosoma Y, se obtuvo la proporción dividiendo el pico de analito (ADN) entre el pico de
competidor y multiplicando esta proporción por el número de moléculas de competidor añadidas en la reacción. Este valor se dividió entre una proporción similar obtenida del número total de la determinación de equivalentes genómicos amplificables (usando el/los ensayo(s) para la cantidad total). Véase la figura 18. Puesto que la cantidad total de ácido nucleico presente en una muestra es una suma del ácido nucleico materno y fetal, la contribución fetal se puede considerar como una fracción de la contribución materna de fondo más grande. Por lo tanto, al traducir esto a la ecuación mostrada en la figura 18, la fracción fetal (k) del ácido nucleico total presente en la muestra es igual a la ecuación: k=2xR/(1-2R), en la que R es la proporción entre la cantidad de cromosoma Y y la cantidad total. Puesto que el cromosoma Y es haploide y los ensayos para la cantidad total se determinan usando dianas diploides, este cálculo se limita a una fracción fetal más pequeña que un 50 % de la fracción materna.
En la figura 19, se muestra un cálculo similar para la concentración fetal usando los marcadores específicos de metilación (véanse los ensayos para la cuantificación de la metilación). A diferencia de los marcadores específicos del cromosoma Y, estos marcadores proceden de dianas diploides, por lo tanto, se omiten las limitaciones establecidas para el ensayo específico para el cromosoma Y. De esta manera, se puede determinar la fracción fetal (k) usando la ecuación: k=R(1-R), en la que R es la proporción entre el ensayo de metilación y el ensayo total.
Simulación
Se llevó a cabo un primer simple cálculo de potencia que supone que un sistema de medición que usa 20 marcadores del cromosoma 21, y 20 marcadores de uno o más de otros autosomas. A partir de 100 copias de ADN fetal, una desviación estándar de medición de 25 copias y la probabilidad de que un error de tipo I sea más bajo de 0,001, se descubrió que los procedimientos de la tecnología pueden diferenciar un diploide de un conjunto de cromosomas triploides en un 99,5 % de todos los casos. Por ejemplo, la implementación práctica de dicho enfoque se puede lograr usando espectrometría de masas, un sistema que usa un enfoque de PCR competitiva para las mediciones del número de copias absoluto. El procedimiento puede ejecutar 20 ensayos en una única reacción y ha demostrado que tiene una desviación estándar en mediciones repetidas de alrededor de un 3 a un 5 %. Este procedimiento se usó en combinación con procedimientos conocidos para diferenciar ácido nucleico metilado y no metilado, por ejemplo, usando agentes de unión a metilo para separar ácido nucleico o usando enzimas sensibles a metilación para digerir ácido nucleico materno. La figura 8 muestra la eficacia de la proteína MBD-FC (un agente de unión metilo) para capturar y así separar ADN metilado en presencia de un exceso de ADN no metilado (véase la figura 8).
Se llevó a cabo un segundo análisis de potencia estadística para evaluar la potencia predictiva de un ejemplo del procedimiento de diagnóstico fetal basado en metilación descrito en el presente documento. La simulación se diseñó para demostrar la probabilidad de diferenciar un grupo de marcadores específicos del cromosoma 21 trisómico de un grupo de marcadores de referencia (por ejemplo, autosomas que excluyen el cromosoma 21). Muchos parámetros influyen en la capacidad de discriminar de manera fiable las dos poblaciones de marcadores. Para la presente simulación, los valores se eligieron para cada parámetro que ha demostrado para ser el más probable que se produzca basándose en la experimentación. Se usaron los siguientes parámetros y valores respectivos:
Números de copias
Números de copias maternas = 2000
Números de copias fetales para cromosomas distintos a 21, X e Y = 200
Números de copias fetales para el cromosoma 21 en caso de feto euploide = 200
Números de copias fetales para el cromosoma 21 en caso de feto T21 aneuploide = 300
Porcentaje de ADN fetal (antes del enriquecimiento basado en metilación) = 10 % (véase anteriormente)
Frecuencia de metilación
Porcentaje de metilación promedio en una región diana para ADN materno = 10 %
Porcentaje de metilación promedio en una región diana para ADN fetal = 80 %
Porcentaje promedio de ADN materno no metilado y no digerido (es decir, una función de la eficiencia de restricción (entre otras cosas) = 5 %
Número de ensayos que seleccionan como diana el cromosoma 21 = 10
Número de ensayos que seleccionan como diana cromosomas distintos de 21, X e Y = 10
Los resultados se presentan en la figura 20. Se muestra la relación entre el coeficiente de variación (CV) en el eje x y la potencia para discriminar las poblaciones de ensayo usando una prueba de la t simple (eje y). Los datos indican que en un 99 % de todos los casos, se pueden discriminar las dos poblaciones (euploide frente a aneuploide) en un nivel de significación de 0,001 siempre que el CV sea de un 5 % o menos. Basándose en esta simulación, el procedimiento representa un potente procedimiento de diagnóstico no invasivo para la detección prenatal de
aneuploidia fetal que es independiente del sexo y funciona en todos las etnias (es decir, sesgo no alélico).
NOMBRE DELGEN
CROM INICIO FIN ISLA CpG PROPORCIÓN ENESCALALOGARÍTMICAMEDIAMICROMATRIZ METILACIÓNMATERNAMEDIAEPITYPER METILACIÓNPLACENTARIAMEDIA EPITYPER DIFERENCIA DEMETILACIÓNPLACENTARIA-MATERNA METILACIÓN RELATIVAPLACENTARIA CONRESPECTO A MATERNA
cro13grupo00016
cro13 19773745 19774050 cro13:1977351819774214 0,19 0,22 0,32 0,1 HIPERMETILACIÓN
cro13grupo00005
cro13 19290394 19290768 : -0,89 0,94 0,35 -0,59 HIPOMETILACIÓN
CRYL1
cro13 19887090 19887336 cro13:1988700719887836 -0,63 0,74 0,21 -0,53 HIPOMETILACIÓN
IL17D
cro13 20193675 20193897 cro13:2019361120194438 -1,01 0,53 0,13 -0,39 HIPOMETILACIÓN
CENPJ
cro13 24404023 24404359 : 0,57 0,17 0,49 0,32 HIPERMETILACIÓN
ATP8A2
cro13 25484475 25484614 cro13:2548428725484761 0,81 0,16 0,43 0,27 HIPERMETILACIÓN
GSH1
cro13 27265542 27265834 cro13:2726454927266505 0,57 0,13 0,19 0,05 HIPERMETILACIÓN
PDX1
cro13 27393789 27393979 cro13:2739200127394099 0,55 0,06 0,2 0,14 HIPERMETILACIÓN
PDX1
cro13 27400459 27401165 cro13:2740036227400744;cro13:2740105727401374 0,73 0,12 0,26 0,14 HIPERMETILACIÓN
MAB21L1
cro13 34947737 34948062 cro13:3494757034948159 0,66 0,11 0,17 0,06 HIPERMETILACIÓN
RB1
cro13 47790983 47791646 cro13:4779063647791858 0,18 0,45 0,48 0,03 HIPERMETILACIÓN
PCDH17
cro13 57104856 57106841 cro13:5710452757106931 0,46 0,15 0,21 0,06 HIPERMETILACIÓN
KLHL1
cro13 69579933 69580146 cro13:6957973369580220 0,79 0,09 0,28 0,2 HIPERMETILACIÓN
POU4F1
cro13 78079515 78081073 cro13:7807932878079615;cro13:7808086078081881 0,66 0,12 0,23 0,11 HIPERMETILACIÓN
GPC6
cro13 92677402 92678666 cro13:9267724692678878 0,66 0,06 0,19 0,13 HIPERMETILACIÓN
TABLA 1
NOMBREDEL GEN
CROM INICIO FIN ISLA CpG PROPORCIÓNEN ESCALALOGARÍTMICAMEDIAMICROMATRIZ METILACIÓNMATERNAMEDIAEPITYPER METILACIÓNPLACENTARIAMEDIAEPITYPER DIFERENCIA DEMETILACIÓNPLACENTARIA-MATERNA METILACIÓN RELATIVAPLACENTARIA CONRESPECTO A MATERNA
SOX21
cro13 94152286 94153047 cro13:94152190-94153185 0,94 0,16 0,4 0,25 HIPERMETILACIÓN
ZIC2
cro13 99439660 99440858 cro13:99439335-99440189; cro13:99440775-99441095 0,89 0,13 0,35 0,22 HIPERMETILACIÓN
IRS2
cro13 109232856 109235065 cro13:109232467-09238181 -0,17 0,73 0,38 -0,35 HIPOMETILACIÓN
cro13grupo00350
cro13 109716455 109716604 cro13:109716325-109716726 -0,37 0,77 0,41 -0,36 HIPOMETILACIÓN
cro13grupo00385
cro13 111595578 111595955 cro13:111595459-111596131 0,87 0,06 0,2 0,14 HIPERMETILACIÓN
cro13grupo00390
cro13 111756337 111756593 cro13:111755805-111756697 0,71 0,12 0,34 0,22 HIPERMETILACIÓN
cro13grupo00391
cro13 111759856 111760045 cro13:111757885-111760666 0,86 0,11 0,36 0,25 HIPERMETILACIÓN
cro13grupo00395
cro13 111808255 111808962 cro13:111806599-111808492; cro13:111808866-111809114 0,96 0,13 0,35 0,22 HIPERMETILACIÓN
Cro13grupo00399
cro13 112033503 112033685 cro13:112032967-112033734 0,38 0,26 0,43 0,18 HIPERMETILACIÓN
MCF2L
cro13 112724910 112725742 cro13:112724782-112725121; cro13:112725628-112725837 -0,47 0,91 0,33 -0,58 HIPOMETILACIÓN
F7
cro13 112799123 112799379 cro13:112798487-112799566 -0,05 0,97 0,55 -0,41 HIPOMETILACIÓN
PROZ
cro13 112855566 112855745 cro13:112855289-112855866 0,29 0,15 0,3 0,16 HIPERMETILACIÓN
cro18grupo00039
cro18 6919797 6919981 cro18:6919450-6920088 -0,38 0,88 0,39 -0,49 HIPOMETILACIÓN
CIDEA
cro18 12244327 12244696 cro18:12244147-12245089 0,23 0,14 0,23 0,1 HIPERMETILACIÓN
cro18grupo00091
cro18 12901467 12901643 cro18:12901024-12902704 0,16 0,15 0,43 0,29 HIPERMETILACIÓN
cro18grupo00094
cro18 13126819 13126986 cro18:13126596-13127564 0,41 0,07 0,34 0,27 HIPERMETILACIÓN
NOMBRE DELGEN
CROM INICIO FIN ISLA CpG PROPORCIÓNEN ESCALALOGARÍTMICAMEDIAMICROMATRIZ METILACIÓNMATERNAMEDIAEPITYPER METILACIÓNPLACENTARIAMEDIAEPITYPER DIFERENCIA DEMETILACIÓNPLACENTARIA-MATERNA METILACIÓN RELATIVA PLACENTARIA CONRESPECTO A MATERNA
C18orf1
cro18 13377536 13377654 cro18:13377385-13377686 -0,12 0,95 0,69 -0,26 HIPOMETILACIÓN
KLHL14
cro18 28603978 28605183 cro18:28603688-28606300 0,83 0,07 0,19 0,12 HIPERMETILACIÓN
CD33L3
cro18 41671477 41673011 cro18:41671386-41673101 -0,34 0,49 0,44 -0,05 HIPOMETILACIÓN
ST8SIA3
cro18 53171265 53171309 cro18:53170705-53172603 1,02 0,09 0,25 0,16 HIPERMETILACIÓN
ONECUT2
cro18 53254808 53259810 cro18:53254152-53259851 0,74 0,09 0,23 0,14 HIPERMETILACIÓN
RAX
cro18 55086286 55086436 cro18:55085813-55087807 0,88 0,11 0,26 0,16 HIPERMETILACIÓN
cro18grupo00277
cro18 57151972 57152311 cro18:57151663-57152672 0,58 0,08 0,21 0,13 HIPERMETILACIÓN
TNFRSF11A
cro18 58203013 58203282 cro18:58202849-58203367 -0,33 0,88 0,28 -0,6 HIPOMETILACIÓN
NET01
cro18 68685099 68687060 cro18:68684945-68687851 0,65 0,09 0,22 0,13 HIPERMETILACIÓN
cro18grupo00304
cro18 70133945 70134397 cro18:70133732-70134724 0,12 0,93 0,92 -0,01 NO CONFIRMADA
TSHZ1
cro18 71128742 71128974 cro18:71128638-71129076 0,23 0,95 0,92 -0,03 NO CONFIRMADA
ZNF236
cro18 72664454 72664736 cro18:72662797-72664893 -0,62 0,17 0,1 -0,07 HIPOMETILACIÓN
MBP
cro18 72953150 72953464 cro18:72953137-72953402 0,6 0,44 0,72 0,28 HIPERMETILACIÓN
cro18grupo00342
cro18 74170347 74170489 cro18:74170210-74170687 -0,2 0,78 0,48 -0,3 HIPOMETILACIÓN
NFATC1
cro18 75385424 75386008 cro18:75385279-75386532 0,23 0,14 0,84 0,7 HIPERMETILACIÓN
CTDP1
cro18 75596358 75596579 cro18:75596009-75596899 0,07 0,97 0,96 -0,01 NO CONFIRMADA
cro18grupo00430
cro18 75653272 75653621 : 0,52 0,24 0,62 0,39 HIPERMETILACIÓN
KCNG2
cro18 75760343 75760820 cro18:75759900-75760988 0,01 0,84 0,75 -0,09 NO CONFIRMADA
NOMBRE DELGEN
CROM INICIO FIN ISLA CpG PROPORCIÓN ENESCALALOGARÍTMICAMEDIAMICROMATRIZ METILACIÓNMATERNAMEDIAEPITYPER METILACIÓNPLACENTARIAMEDIAEPITYPER DIFERENCIA DEMETILACIÓNPLACENTARIA-MATERNA METILACIÓN RELATIVAPLACENTARIA CONRESPECTO A MATERNA
OLIG2
cro21 33317673 33321183 cro21:33316998-33322115 0,66 0,11 0,2 0,09 HIPERMETILACIÓN
OLIG2
cro21 33327593 33328334 cro21:33327447-33328408 -0,75 0,77 0,28 -0,49 HIPOMETILACIÓN
RUNX1
cro21 35180938 35185436 cro21:35180822-35181342; cro21:35182320-35185557 -0,68 0,14 0,07 -0,07 HIPOMETILACIÓN
SIM2
cro21 36994965 36995298 cro21:36990063-36995761 0,83 0,08 0,26 0,18 HIPERMETILACIÓN
SIM2
cro21 36999025 36999410 cro21:36998632-36999555 0,87 0,06 0,24 0,18 HIPERMETILACIÓN
DSCR6
cro21 37300407 37300512 cro21:37299807-37301307 0,22 0,04 0,14 0,11 HIPERMETILACIÓN
DSCAM
cro21 41135559 41135706 cro21:41135380-41135816 1,03 0,06 0,29 0,23 HIPERMETILACIÓN
cro21grupo00165
cro21 43643421 43643786 cro21:43643322-43643874 1,14 0,16 0,81 0,65 HIPERMETILACIÓN
AIRE
cro21 44529935 44530388 cro21:44529856-44530472 -0,55 0,62 0,27 -0,35 HIPOMETILACIÓN
SUM03
cro21 45061293 45061853 cro21:45061154-45063386 -0,41 0,55 0,46 -0,09 HIPOMETILACIÓN
C21orf70
cro21 45202815 45202972 cro21:45202706-45203073 -0,46 0,96 0,51 -0,46 HIPOMETILACIÓN
C21orf123
cro21 45671984 45672098 cro21:45671933-45672201 -0,63 0,92 0,43 -0,49 HIPOMETILACIÓN
COL18A1
cro21 45754383 45754487 cro21:45753653-45754639 -0,18 0,97 0,72 -0,25 HIPOMETILACIÓN
PRMT2
cro21 46911967 46912385 cro21:46911628-46912534 1,08 0,04 0,25 0,21 HIPERMETILACIÓN
SIX2
cro2 45081223 45082129 cro2:45081148-45082287 1,15 0,08 0,36 0,28 HIPERMETILACIÓN
SIX2
cro2 45084851 45085711 cro2:45084715-45084986; cro2:45085285-45086054 1,21 0,07 0,35 0,28 HIPERMETILACIÓN
NOMBRE DELGEN
CROM INICIO FIN ISLA CpG PROPORCIÓNEN ESCALALOGARÍTMICAMEDIAMICROMATRIZ METILACIÓNMATERNAMEDIAEPITYPER METILACIÓNPLACENTARIAMEDIAEPITYPER DIFERENCIA DEMETILACIÓNPLACENTARIA-MATERNA METILACIÓN RELATIVAPLACENTARIA CONRESPECTO A MATERNA
SOX14
cro3 138971870 138972322 cro3:138971738-138972096; cro3:138972281-138973691 1,35 0,08 0,33 0,25 HIPERMETILACIÓN
TLX3
cro5 170674439 170676431 cro5:170674208-170675356; cro5:170675783-170676712 0,91 0,11 0,35 0,24 HIPERMETILACIÓN
FOXP4
cro6 41623666 41624114 cro6:41621630-41624167 1,1 0,07 0,27 0,2 HIPERMETILACIÓN
FOXP4
cro6 41636384 41636779 cro6:41636244-41636878 1,32 0,04 0,33 0,29 HIPERMETILACIÓN
cro7grupo00267
cro7 12576755 12577246 cro7:12576690-12577359 0,94 0,08 0,26 0,17 HIPERMETILACIÓN
NPY
cro7 24290224 24291508 cro7:24290083-24291605 0,93 0,09 0,3 0,21 HIPERMETILACIÓN
SHH
cro7 155291537 155292091 cro7:155288453-155292175 0,98 0,19 0,52 0,33 HIPERMETILACIÓN
OSR2
cro8 100029764 100030536 cro8:100029673-100030614 1,21 0,08 0,43 0,35 HIPERMETILACIÓN
GLIS3
cro9 4288283 4289645 cro9:4287817-4290182 1,24 0,06 0,24 0,18 HIPERMETILACIÓN
PRMT8
cro12 3472714 3473190 cro12:3470227-3473269 0,86 0,07 0,23 0,16 HIPERMETILACIÓN
TBX3
cro12 1,14E+08 1,14E+08 cro12:113609112-113609535 1,45 0,09 0,56 0,48 HIPERMETILACIÓN
cro12grupo00801
cro12 1,19E+08 1,19E+08 cro12:118515877-118517595 1,1 0,06 0,25 0,19 HIPERMETILACIÓN
PAX9
cro14 36201402 36202386 cro14:36200932-36202536 0,89 0,11 0,32 0,21 HIPERMETILACIÓN
SIX1
cro14 60178801 60179346 cro14:60178707-60179539 0,95 0,1 0,33 0,22 HIPERMETILACIÓN
ISL2
cro15 74420013 74421546 cro15:74419317-74422570 1,08 0,08 0,27 0,19 HIPERMETILACIÓN
DLX4
cro17 45397228 45397930 cro17:45396281-45398063 1,25 0,1 0,32 0,22 HIPERMETILACIÓN
CBX4
cro17 75428613 75431793 cro17:75427586-75433676 1 0,07 0,27 0,21 HIPERMETILACIÓN
NOMBRE DEL GEN
CROM INICIO FIN ISLA CpG PROPORCIÓN ENESCALALOGARÍTMICA MEDIAMICROMATRIZ METILACIÓNMATERNAMEDIAEPITYPER METILACIÓNPLACENTARIAMEDIAEPITYPER DIFERENCIA DEMETILACIÓNPLACENTARIA-MATERNA METILACIÓN RELATIVA PLACENTARIA CONRESPECTO A MATERNA
EDG6
cro19 3129836 3130874 cro19:31297413130986 1,35 0,04 0,87 0,83 HIPERMETILACIÓN
PRRT3
cro3 9963364 9964023 cro3:99628959964619 -0,85 0,9 0,09 -0,81 HIPOMETILACIÓN
MGC29506
cro5 138757911 138758724 cro5:138755609138758810 -0,63 0,93 0,17 -0,76 HIPOMETILACIÓN
TEAD3
cro6 35561812 35562252 cro6:3556175435562413 -1,17 0,92 0,13 -0,8 HIPOMETILACIÓN
cro12 grupo00022
cro12 1642456 1642708 cro12:16421951642774 -1,33 0,66 0,09 -0,57 HIPOMETILACIÓN
CENTG1
cro12 56406249 56407788 cro12:5640617656407818 -1,07 0,95 0,19 -0,77 HIPOMETILACIÓN
CENTG1
cro12 56416146 56418794 ch12:5641609556416628;ch12:5641874556419001 -0,94 0,85 0,16 -0,69 HIPOMETILACIÓN
Información basada en la secuencia humana de referencia de marzo de 2006 (NCBI Build 36.1), que fueproducida por el International Human Genome SequencingConsortium.
TABLA 2
NOMBREDEL GEN
CROM INICIO FIN SNP
cro13grupo00016
cro13 19773745 19774050 rs7996310; rs12870878
cro13grupo00005
cro13 19290394 19290768 rs11304938
CENPJ
cro13 24404023 24404359 rs7326661
ATP8A2
cro13 25484475 25484614 rs61947088
PDX1
cro13 27400459 27401165 rs58173592; rs55836809; rs61944011
RB1
cro13 47790983 47791646 rs2804094; rs4151432; rs4151433; rs4151434; rs4151435
PCDH17
cro13 57104856 57106841 rs35287822; rs34642962; rs41292834; rs45500496; rs45571031; rs41292836; rs28374395; rs41292838
KLHL1
cro13 69579933 69580146 rs3751429
POU4F1
cro13 78079515 78081073 rs11620410; rs35794447; rs2765065
GPC6
cro13 92677402 92678666 rs35689696; rs11839555; rs55695812; rs35259892
SOX21
cro13 94152286 94153047 rs41277652; rs41277654; rs35276096; rs5805873; rs35109406
ZIC2
cro13 99439660 99440858 rs9585309; rs35501321; rs9585310; rs7991728; rs1368511
IRS2
cro13 1,09E+08 1,09E+08 rs61747993; rs1805097; rs9583424; rs35927012; rs1056077; rs1056078; rs34889228; rs1056080; rs1056081; rs12853546;rs4773092; rs35223808; rs35894564; rs3742210; rs34412495; rs61962699; rs45545638; rs61743905
Cro13grupo00395
cro13 111808255 111808962 rs930346
MCF2L
cro13 1,13E+08 1,13E+08 rs35661110; rs2993304; rs1320519; rs7320418; rs58416100
F7
cro13 1,13E+08 1,13E+08 rs2480951; rs2476320
CIDEA
cro18 12244327 12244696 rs60132277
cro18grupo00091
cro18 12901467 12901643 rs34568924; rs8094284; rs8094285
C18orf1
cro18 13377536 13377654 rs9957861
KLHL14
cro18 28603978 28605183 rs61737323; rs61737324; rs12960414
CD33L3
cro18 41671477 41673011 rs62095363; rs2919643
ONECUT2
cro18 53254808 53259810 rs35685953; rs61735644; rs8084084; rs35937482; rs35427632; rs7232 930; rs3786486; rs34286480; rs3786485; rs28655657;rs4940717; rs4940719; rs3786484; rs34040569; rs35542747; rs33946478; rs35848049; rs7231349; rs7231354; rs34481218;rs12962172; rs3911641
NOMBREDEL GEN
CROM INICIO FIN SNP
RAX
cro18 55086286 55086436 rs58797899; rs45501496
cro18grupo00277
cro18 57151972 57152311 rs17062547
TNFRSF11A
cro18 58203013 58203282 rs35114461
NET01
cro18 68685099 68687060 rs4433898; rs34497518; rs35135773; rs6566677; rs57425572; rs36026929; rs34666288; rs10627137; rs35943684; rs9964226; rs4892054; rs9964397; rs4606820; rs12966677; rs8095606
cro18grupo00304
cro18 70133945 70134397 rs8086706; rs8086587; rs8090367; rs999332; rs17806420; rs58811193
TSHZ1
cro18 71128742 71128974 rs61732783; rs3744910; rs1802180
cro18grupo00342
cro18 74170347 74170489 rs7226678
NFATC1
cro18 75385424 75386008 rs28446281; rs56384153; rs4531815; rs3894049
cro18grupo00430
cro18 75653272 75653621 rs34967079; rs35465647
KCNG2
cro18 75760343 75760820 rs3744887; rs3744886
OLIG2
cro21 33317673 33321183 rs2236618; rs11908971; rs9975039; rs6517135; rs2009130; rs1005573; rs1122807; rs10653491; rs10653077; rs35086972;rs28588289; rs7509766; rs62216114; rs35561747; rs7509885;rs11547332
OLIG2
cro21 33327593 33328334 rs7276788; rs7275842; rs7275962; rs7276232; rs16990069; rs13051692; rs56231743; rs35931056
RUNX1
cro21 35180938 35185436 rs2843956; rs55941652; rs56020428; rs56251824; rs13051109; rs13051111; rs3833348; rs7510136; rs743289; rs5843690;rs33915227; rs11402829; rs2843723; rs8128138; rs8131386; rs2843957; rs57537540; rs13048584; rs7281361; r s2843965; rs2843958
SIM2
cro21 36994965 36995298 rs2252821
SIM2
cro21 36999025 36999410 rs58347144; rs737380
DSCAM
cro21 41135559 41135706 rs35298822
AIRE
cro21 44529935 44530388 rs35110251; rs751032; rs9978641
SUM03
cro21 45061293 45061853 rs9979741; rs235337; rs7282882
C21orf70
cro21 45202815 45202972 rs61103857; rs9979028; rs881318; rs881317
COL18A1
cro21 45754383 45754487 rs35102708; rs9980939
PRMT2
cro21 46911967 46912385 rs35481242; rs61743122; rs8131044; rs2839379
SIX2
cro2 45081223 45082129 rs62130902
NOMBREDEL GEN
CROM INICIO FIN SNP
SIX2
cro2 45084851 45085711 rs35417092; rs57340219
S0X14
cro3 1,39E+08 1,39E+08 rs57343003
TLX3
cro5 1,71E+08 1,71E+08 rs11134682; rs35704956; rs2964533; rs35601828
F0XP4
cro6 41623666 41624114 rs12203107; rs1325690
F0XP4
cro6 41636384 41636779 rs56835416
cro7grupo00267
cro7 12576755 12577246 rs56752985; rs17149965; rs6948573; rs2240572
NPY
cro7 24290224 24291508 rs2390965; rs2390966; rs2390967; rs2390968; rs3025123; rs16146; rs16145 ; rs16144; rs13235842; rs13235935; rs13235938; rs13235940; rs13235944; rs36083509; rs3025122; rs16143; rs16478; rs16142; rs16141; rs16140; rs16139;rs2229966; rs1042552; rs5571; rs5572
SHH
cro7 1,55E+08 1,55E+08 rs9333622; rs1233554; rs9333620; rs1233555
GLIS3
cro9 4288283 4289645 rs56728573; rs 12340657; rs 12350099; rs35338539; rs 10974444; rs7852293
PRMT8
cro12 3472714 3473190 rs12172776
TBX3
cro12 1,14E+08 1,14E+08 rs60114979
cro12grupo00801
cro12 118516189 118517435 rs966246; rs17407022; rs970095; rs2711748
PAX9
cro14 36201402 36202386 rs17104893; rs12883298; rs17104895; rs35510737; rs12882923; rs12883049; rs28933970; rs28933972; rs28933971;rs28933373; rs61734510
SIX1
cro14 60178801 60179346 rs761555
ISL2
cro15 74420013 74421546 rs34173230; rs11854453
DLX4
cro17 45397228 45397930 rs62059964: rs57481357; rs56888011; rs17638215; rs59056690; rs34601685; rs17551082
CBX4
cro17 75428613 75431793 rs1285243; rs35035500; rs12949177; rs3764374; rs62075212; rs62075213; rs3764373; rs3764372; rs55973291
EDG6
cro19 3129836 3130874 rs34728133; rs34573539; rs3826936; rs34914134; rs61731111; rs34205484
MGC29506
cro5 1,39E+08 1,39E+08 rs11748963; rs7447765; rs35262202
CENTG1
cro12 56406249 56407788 rs61935742; rs12318065; rs238519; rs238520; rs238521; rs808930; rs2640595; rs2640596; rs2640597; rs2640598;rs34772922
CENTG1
cro12 56416146 56418794 rs11830475; rs34482618; rs2650057; rs2518686; rs12829991
TABLA 3
NOMBREDEL GEN
METILACIÓN RELATIVAPLACENTARIA CONRESPECTO A MATERNA DIANA DE PRC2
CRYL1
HIPOMETILACIÓN VERDADERA
IL17D
HIPOMETILACIÓN VERDADERA
GSH1
HIPERMETILACIÓN VERDADERA
MAB21L1
HIPERMETILACIÓN VERDADERA
PCDH17
HIPERMETILACIÓN VERDADERA
KLHL1
HIPERMETILACIÓN VERDADERA
POU4F1
HIPERMETILACIÓN VERDADERA
SOX21
HIPERMETILACIÓN VERDADERA
ZIC2
HIPERMETILACIÓN VERDADERA
CIDEA
HIPERMETILACIÓN VERDADERA
KLHL14
HIPERMETILACIÓN VERDADERA
ONECUT2
HIPERMETILACIÓN VERDADERA
RAX
HIPERMETILACIÓN VERDADERA
TNFRSF11A
HIPOMETILACIÓN VERDADERA
NOMBREDEL GEN
METILACIÓN RELATIVAPLACENTARIA CONRESPECTO A MATERNA DIANA DE PRC2
OLIG2
HIPERMETILACIÓN VERDADERA
OLIG2
HIPOMETILACIÓN VERDADERA
SIM2
HIPERMETILACIÓN VERDADERA
SIM2
HIPERMETILACIÓN VERDADERA
SIX2
HIPERMETILACIÓN VERDADERA
SIX2
HIPERMETILACIÓN VERDADERA
SOX14
HIPERMETILACIÓN VERDADERA
TLX3
HIPERMETILACIÓN VERDADERA
SHH
HIPERMETILACIÓN VERDADERA
OSR2
HIPERMETILACIÓN VERDADERA
TBX3
HIPERMETILACIÓN VERDADERA
PAX9
HIPERMETILACIÓN VERDADERA
SIX1
HIPERMETILACIÓN VERDADERA
ISL2
HIPERMETILACIÓN VERDADERA
DLX4
HIPERMETILACIÓN VERDADERA
CBX4
HIPERMETILACIÓN VERDADERA
CENTG1
HIPOMETILACIÓN VERDADERA
CENTG1
HIPOMETILACIÓN VERDADERA
TABLA 4
SEQID NO
DEL GENNOMBRE SECUENCIA
1
cro13grupo00016
2
CENPJ
3
ATP8A2
4
GSH1
5
PDX1
6
PDX1
7
MAB21L1
8
RB1
SEQ IDNO
DEL GENNOMBRE SECUENCIA
9
PCDH17
10
KLHL1
11
POU4F1
SEQ IDNO
DEL GENNOMBRE SECUENCIA
12
GPC6
13
SOX21
14
ZIC2
SEQ IDNO
DEL GENNOMBRE SECUENCIA
15
cro13grupo00385
16
cro13grupo00390
1718
cro13grupo00391 cro13grupo00395
19
cro13grupo00399
20
PROZ
21
CIDEA
SEQ IDNO
NOMBREDEL GEN SECUENCIA
22
cro18grupo00091
23
cro18grupo00094
24
KLHL14
25
ST8SIA3
26
ONECUT2
SEQ IDNO
DEL GEN NOMBRE SECUENCIA
SEQ IDNO
NOMBREDEL GEN SECUENCIA
27
RAX
28
cro18grupo00277
29
NETO1
SEQ IDNO
DEL GENNOMBRE SECUENCIA
30
MBP
31
NFATC1
32
cro18grupo00430
33
OLIG2
SEQ IDNO
DEL GENNOMBRE SECUENCIA
34
SIM2
35
SIM2
36
DSCR6
SEQ IDNO
NOMBREDEL GEN SECUENCIA
37
DSCAM
38
Crol21grupo00165
39
PRMT2
40
SIX2
41
SIX2
SEQ IDNO
NOMBREDEL GEN SECUENCIA
42
SOX14
43
TLX3
SEQ IDNO
NOMBREDEL GEN SECUENCIA
44
FOXP4
45
FOXP4
46
cro7 grupo00267
SEQ IDNO
NOMBREDEL GEN SECUENCIA
47
NPY
48
SHH
49
OSR2
SEQ IDNO
NOMBREDEL GEN SECUENCIA
50
GLIS3
51
PRMT8
52
TBX3
53
cro12grupo00801
SEQ IDNO
NOMBREDEL GEN SECUENCIA
54
PAX9
55
SIX1
56
1SL2
SEQ IDNO
NOMBREDEL GEN SECUENCIA
57
DLX4
58
CBX4
SEQ IDNO
NOMBREDEL GEN SECUENCIA
59
EDG6
60
cro13grupo00005
61
CRYL1
62
IL17D
SEQ IDNO
NOMBREDEL GEN SECUENCIA
63
IRS2
64
cro13grupo00350
65
MCF2L
SEQ IDNO
NOMBREDEL GEN SECUENCIA
66
F7
67
cro18 grupo00039
68
C18orf 1
69
CD33L3
70
TNFRSF11A
71
ZNF236
SEQ IDNO
NOMBREDEL GEN SECUENCIA
72
cro18 grupo00342
73
OLIG2
74
RUNX1
SEQ IDNO
NOMBREDEL GEN SECUENCIA
75
AIRE
SEQ IDNO
NOMBREDEL GEN SECUENCIA
76
SUMO3
77
C21orf70
78
C21orf123
79
COL18A1
80
PRRT3
81
MGC29506
SEQ IDNO
NOMBREDEL GEN SECUENCIA
82
TEAD3
83
cro12 grupo00022
84
CENTG1
SEQ IDNO
NOMBREDEL GEN SECUENCIA
85
CENTG1
86
cro18 grupo00304
SEQ IDNO
NOMBREDEL GEN SECUENCIA
87
TSHZ1 TCGACCGCTACTATTATGAAAACAGCGACCAGCCCATTGACTTAACCAAGTCCAAGAACAAGCCGCTGGTGTCCAGCGTGGCTGATTCGGTGGCATCACCTCTGCGGGAGAGCGCACTCATGGACATCTCCGACATGGTGAAAAACCTCACAGGCCGCCTGACGCCCAAGTCCTCCACGCCCTCCACAGTTTCAGAGAAGTCCGATGCTGATGGCAGCAGCTTTGAGGAGGC
88
CTDP1
89
KCNG2
La mención de las patentes anteriores, solicitudes de patente, publicaciones y documentos no es una admisión de que cualquiera de los anteriores sea una técnica anterior pertinente, ni tampoco constituye ninguna admisión en cuanto al contenido o fecha de estas publicaciones o documentos.
Se pueden hacer modificaciones a lo anterior sin apartarse de los aspectos básicos de la invención. Aunque la 5 invención se ha descrito en detalle sustancial con referencia a uno o más ejemplos específicos, los expertos en la técnica reconocen que se pueden hacer cambios en los ejemplos divulgados específicamente en esta solicitud.
La invención descrita ilustrativamente en el presente documento se puede poner en práctica adecuadamente en ausencia de cualquier elemento no divulgado específicamente en el presente documento. De esta manera, en cada caso en el presente documento, cualquiera de los términos “que comprende”, “que consiste esencialmente en” y “que 10 consiste en” se puede reemplazar por cualquiera de los otros dos términos. Los términos y expresiones que se han empleado se usan como términos de descripción y no de limitación, y el uso de dichos términos y expresiones no excluye ningún equivalente de las características mostradas y descritas o porciones de las mismas y son posibles diversas modificaciones en el alcance de la invención reivindicada. El término "un" o "una" puede hacer referencia a uno de o a una pluralidad de elementos que modifica (por ejemplo, "un reactivo" puede significar uno o más reactivos) 15 a menos que esté contextualmente claro tanto uno de los elementos o más de uno de los elementos que se describen. El término "aproximadamente" como se usa en el presente documento se refiere a un valor en un 10 % del parámetro subyacente (es decir, más o menos un 10 %), y el uso del término "aproximadamente" al comienzo de una lista de valores modifica cada uno de los valores (es decir, "aproximadamente 1, 2 y 3" se refiere a aproximadamente 1, aproximadamente 2 y aproximadamente 3). Por ejemplo, un peso de "aproximadamente 100 gramos" puede incluir
20 pesos entre 90 gramos y 110 gramos. Además, cuando en el presente documento se describe una enumeración de valores (por ejemplo, aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 % u 86 %) la enumeración incluye todos los valores intermedios y fraccionarios de los mismos (por ejemplo, 54 %, 85,4 %).
La invención se define como se expone en las reivindicaciones que siguen.

Claims (20)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para determinar la cantidad de ácido nucleico fetal en una muestra, que comprende:
    a) poner en contacto ácido nucleico de una mujer embarazada, comprendiendo el ácido nucleico ácido nucleico fetal y ácido nucleico materno, comprendiendo la combinación del ácido nucleico fetal y el ácido nucleico materno el ácido nucleico total en la muestra, con un reactivo que digiere específicamente ácido nucleico no metilado, digiriendo así el ácido nucleico materno y enriquciendo el ácido nucleico fetal; y
    b) determinar la cantidad de ácido nucleico fetal en la muestra analizando la cantidad de ácido nucleico fetal en una pluralidad de locus seleccionados de las SEQ ID NO: 1-59.
  2. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la pluralidad de locus comprende el locus de la SEQ ID NO:
  3. 42.
  4. 3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la pluralidad de locus comprende el locus de la SEQ ID NO:
  5. 52.
  6. 4.
    El procedimiento de la reivindicación 1, 2 o 3, en el que el reactivo que digiere específicamente ácido nucleico no metilado es una enzima de restricción sensible a metilación.
  7. 5.
    El procedimiento de la reivindicación 4, que comprende adicionalmente:
    (i)
    determinar la cantidad de ácido nucleico total presente en la muestra; y
    (ii)
    determinar la eficiencia de digestión del reactivo.
  8. 6.
    El procedimiento de la reivindicación 4, que comprende adicionalmente:
    (i)
    determinar la cantidad de ácido nucleico total presente en la muestra; y
    (ii)
    determinar la presencia o ausencia de ácido nucleico del cromosoma Y en una muestra de la mujer embarazada.
  9. 7.
    El procedimiento de la reivindicación 5 o 6, en el que determinar la cantidad de ácido nucleico fetal en la muestra comprende comparar la cantidad de ácido nucleico fetal en (b) con respecto a la cantidad total de ácido nucleico.
  10. 8.
    El procedimiento de la reivindicación 6 o 7, en el que la cantidad de ácido nucleico del cromosoma Y presente en una muestra de la mujer embarazada se determina para un feto de sexo masculino.
  11. 9.
    El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la cantidad de ácido nucleico fetal se compara con respecto a la cantidad de ácido nucleico del cromosoma Y.
  12. 10.
    El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que determinar la cantidad de ácido nucleico fetal en (b) comprende introducir uno o más competidores en concentraciones conocidas en una reacción de amplificación.
  13. 11.
    El procedimiento de la reivindicación 10, que comprende determinar la cantidad absoluta de ácido nucleico fetal en la muestra.
  14. 12.
    El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que determinar la cantidad de ácido nucleico fetal comprende el uso de uno o más procedimientos seleccionados de procedimientos de espectrometría de masas, RT-PCR, PCR digital, procedimientos basados en matrices, procedimientos de secuenciación, procedimientos basados en nanoporos, procedimientos de recuento basados en microesferas unidas a ácidos nucleicos, procedimientos basados en competidores y procedimientos para separar ácido nucleico usando agentes que se unen a ácido nucleico basándose en el estado de metilación.
  15. 13.
    El procedimiento de la reivindicación 12, en el que determinar la cantidad de ácido nucleico fetal comprende el uso de un procedimiento de espectrometría de masas.
  16. 14.
    El procedimiento de la reivindicación 13, que comprende analizar uno o más picos de masa en un espectro.
  17. 15.
    El procedimiento de la reivindicación 12, en el que determinar la cantidad de ácido nucleico fetal comprende el
    uso de un procedimiento de secuenciación.
  18. 16.
    El procedimiento de la reivindicación 15, en el que el procedimiento de secuenciación comprende secuenciar mediante síntesis.
  19. 17.
    El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que se usa la cantidad de ácido nucleico fetal en conjunción con un procedimiento de diagnóstico para determinar un rasgo fetal, en el que el procedimiento de diagnóstico requiere una cantidad de ácido nucleico fetal para satisfacer determinados requisitos de especificidad o sensibilidad clínica.
  20. 18.
    El procedimiento de la reivindicación 17, en el que el rasgo fetal es una aneuploidia fetal.
    83 84 85
    108 109
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