JP2022528139A - 核酸を解析するための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本特許出願は、発明の名称がMETHODS AND COMPOSITIONS FOR ANALYZING NUCLEIC ACIDであり、発明者としてKelly M. HARKINS KINCAIDらを記名し、代理人整理番号CBS-2002-PVにより指定される、2019年4月5日に出願した米国仮特許出願第62/830,211号の利益を主張するものである。本特許出願は、発明の名称がMETHODS AND COMPOSITIONS FOR ANALYZING NUCLEIC ACIDであり、発明者としてKelly M. HARKINS KINCAIDらを記名し、代理人整理番号CBS-2002-PV2により指定される、2019年6月14日に出願した米国仮特許出願第62/861,594号の利益を主張するものでもある。本特許出願は、発明の名称がMETHODS AND COMPOSITIONS FOR ANALYZING NUCLEIC ACIDであり、発明者としてKelly M. HARKINS KINCAIDらを記名し、代理人整理番号CBS-2002-PV3により指定される、2019年10月23日に出願した米国仮特許出願第62/925,132号の利益を主張するものでもある。上述の出願の全内容は、本文、表および図面すべてを含めて、参照により本明細書に組み込まれる。
本技術は、一部は、核酸を解析するための方法および組成物に関する。一部の態様では、本技術は、一本鎖核酸断片からの核酸ライブラリーを調製するための方法および組成物に関する。
生命体(例えば、動物、植物および微生物)および遺伝情報を複製する他の形態(例えば、ウイルス)の遺伝情報は、核酸(すなわち、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA))にコードされている。遺伝情報は、化学的核酸または仮説的核酸の一次構造に相当するひと続きのヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドである。
一部の態様では、核酸ライブラリーを生成する方法であって、(i)一本鎖核酸(ssNA)を含む核酸組成物と、(ii)第1のオリゴヌクレオチドと、(iii)複数の第1の足場ポリヌクレオチド種とを結合させるステップを含み、(a)複数の第1の足場ポリヌクレオチド種における各ポリヌクレオチドが、ssNAハイブリダイゼーション領域および第1のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含み;(b)核酸組成物、第1のオリゴヌクレオチド、および複数の第1の足場ポリヌクレオチド種が、第1の足場ポリヌクレオチド種の分子が、(i)第1のssNA末端領域および(ii)第1のオリゴヌクレオチドの分子とハイブリダイズされる条件下で結合され、それによって、第1のオリゴヌクレオチドの分子の末端が第1のssNA末端領域の末端に隣接しているハイブリダイゼーション産物が形成される、方法が、提供される。一部の態様では、方法は、結合させるステップの前に、第1のオリゴヌクレオチドおよび/または複数の第1の足場ポリヌクレオチド種と、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、第1のオリゴヌクレオチドおよび/または複数の第1の足場ポリヌクレオチド種が脱リン酸化される条件下で接触させるステップを含み、それによって、脱リン酸化された第1のオリゴヌクレオチドおよび/または脱リン酸化された第1の足場ポリヌクレオチド種が生成される。一部の態様では、方法は、ssNAからライブラリーを生成するための、SSB不使用の方法である。
核酸の解析に有用な方法および組成物が、本明細書で提供される。核酸ライブラリーの生成に有用な方法および組成物も、本明細書で提供される。一本鎖核酸断片の末端の解析に有用な方法および組成物も、本明細書で提供される。ある特定の態様では、方法は、一本鎖核酸断片を含む試料核酸と指定アダプターとを結合させるステップを含む。一部の実施形態では、指定アダプターは、一本鎖核酸の末端とハイブリダイズすることができる足場ポリヌクレオチドを含む。そのようなハイブリダイゼーションの産物は、例えば、核酸ライブラリーの生成に、および/またはさらに解析もしくはプロセシングに、有用であり得る。
本明細書におけるある特定の方法は、ssNAと足場アダプターまたはその成分とを結合させるステップを含む。足場アダプターは、一般に、足場ポリヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを含む。したがって、足場アダプターの「成分」は、足場ポリヌクレオチド、および/もしくはオリゴヌクレオチド、またはその小成分もしくは領域を指すことがある。オリゴヌクレオチドおよび/または足場ポリヌクレオチドは、ピリミジン(C、T、U)および/またはプリン(A、G)ヌクレオチドで構成され得る。さらなる成分または小成分としては、インデックスポリヌクレオチド、固有分子識別子(UMI)、プライマー結合部位(例えば、シーケンシングプライマー結合部位、P5プライマー結合部位、P7プライマー結合部位)、フローセル結合領域などのうちの1つまたは複数、ならびにそれらの成分を挙げることができる。P5プライマー結合部位を含む足場アダプターは、P5アダプターまたはP5足場アダプターと呼ばれることがある。P7プライマー結合部位を含む足場アダプターは、P7アダプターまたはP7足場アダプターと呼ばれることがある。
本明細書における方法は、1つもしくは複数の足場アダプターまたはその成分と、一本鎖核酸(ssNA)を含む組成物とを結合させて、1つまたは複数の複合体を形成するステップを含み得る。足場ポリヌクレオチドは、複合体形成時にオリゴヌクレオチド成分の末端がssNA断片の末端領域の末端に隣接しているような、ssNA断片およびオリゴヌクレオチド成分との同時ハイブリダイゼーションのために、設計される。通常は、複合体形成時にオリゴヌクレオチド成分の5’末端は、ssNAの末端領域の3’末端に隣接しているか、またはオリゴヌクレオチド成分の5’末端は、ssNAの末端領域の3’末端に隣接している。複合体形成時に足場アダプターがssNA断片の両方の末端に結合される事例では、1つのオリゴヌクレオチド成分の5’末端は、ssNAの1つの末端領域の3’末端に隣接しており、第2のオリゴヌクレオチド成分の5’末端は、ssNAの第2の末端領域の3’末端に隣接している。
本明細書における方法は、1つまたは複数の複合体を形成するために、1つもしくは複数の足場アダプターまたはその成分と、一本鎖リボ核酸(ssRNA)または一本鎖相補デオキシリボ核酸(sscDNA)を含む組成物とを結合させるステップを含み得る。足場ポリヌクレオチドは、ssNAについて上記で説明されたように、複合体形成時にオリゴヌクレオチド成分の末端がssRNAもしくはsscDNA断片の末端領域の末端に隣接しているような、ssRNAまたはsscDNA断片およびオリゴヌクレオチド成分との同時ハイブリダイゼーションのために、設計される。
核酸断片(例えば、ssNA断片)を足場アダプターまたはその成分と結合させることによって結合産物を生成する。ssNA断片と足場アダプターまたはその成分とを結合させることは、ハイブリダイゼーションおよび/またはライゲーション(例えば、ハイブリダイゼーション産物のライゲーション)含み得る。結合産物は、ssNA断片の一方または両方の末端で足場アダプターまたはその成分に接続された(例えば、それとハイブリダイズされた、および/またはそれにライゲーションされた)ssNA断片を含み得る。結合産物は、ssNA断片の一方または両方の末端で足場アダプターまたはその成分とハイブリダイズされたssNA断片を含むことがあり、この断片は、ハイブリダイゼーション産物と呼ばれることがある。結合産物は、ssNA断片の一方または両方の末端で足場アダプターまたはその成分にライゲーションされたssNA断片を含むことがあり、この断片は、ライゲーション産物と呼ばれることがある。一部の実施形態では、切断ステップからの産物(すなわち、切断産物)を足場アダプターまたはその成分と結合させることによって結合産物を生成することができる。本明細書におけるある特定の方法は、結合産物のセット(例えば、結合産物の第1のセットおよび結合産物の第2のセット)を生成するステップを含む。一部の実施形態では、結合産物の第1のセットは、足場アダプター、またはその成分の第1のセットからの足場アダプターまたはその成分に接続された(例えば、それとハイブリダイズされた、および/またはそれにライゲーションされた)ssNAを含む。一部の実施形態では、結合産物の第2のセットは、足場アダプター、またはその成分の第2のセットからの足場アダプターまたはその成分に接続された(例えば、それとハイブリダイズされた、および/またはそれにライゲーションされた)結合産物の第1のセットを含む。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、アダプターダイマーを防止する、低減させるまたは消失させるための1または複数の修飾および/またはさらなるステップを含む。アダプターダイマーは、本明細書に記載される方法中に意図せず形成されることがある。アダプターダイマーは、互いにハイブリダイズするかまたはハイブリダイズしてライゲーションする2つもしくはそれより多くの足場アダプター、それらの成分、またはそれらの部分を、一般に指す。ある特定のアダプターダイマー構成の例は、図20に提供されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載される足場アダプターは、2本の鎖を含み、第1の末端に一本鎖足場領域があり、第2の末端に2本の非相補鎖がある。そのような足場アダプターは、Y足場アダプター、Yアダプター、Y形足場アダプター、Y形アダプター、Y二重鎖、Y形二重鎖、Y足場二重鎖、Y形足場二重鎖などと呼ばれることがある。Y形構造を有する足場アダプターは、一般に、二本鎖二重鎖領域を含み、一方の末端に2つの一本鎖「アーム」を、および他方の末端に一本鎖足場領域を含む。
一部の実施形態では、足場アダプターは、一本鎖ループを有するヘアピン構造を形成することができる1本の鎖を含む。一部の実施形態では、足場アダプターは、一本鎖ループを有するヘアピン構造を形成することができる1本の鎖からなる。ヘアピン構造を有する足場アダプターは、一般に、二本鎖「ステム」領域および一本鎖「ループ」領域を含む。一部の実施形態では、足場アダプターは、ヘアピン構造をとることができる1本の鎖(すなわち、1本の連続鎖)を含む。一部の実施形態では、足場アダプターは、ヘアピン構造をとることができる1本の鎖(すなわち、1本の連続鎖)から本質的になる。1本の鎖から本質的になるとは、足場アダプターが、連続鎖の一部でない、核酸の(例えば、足場アダプターとハイブリダイズされたるさらなる鎖を一切含まないことを意味する。したがって、ここでの「から本質的になる」は、足場アダプター中の鎖の数を指し、足場アダプターは、鎖の数に不可欠でない他の特徴を含むことができる(例えば、検出可能な標識を含むことができる;他の領域を含むことができる)。ヘアピン構造を形成することができる1本の鎖を含むまたはそのような1本の鎖から本質的になる足場アダプターは、本明細書では、ヘアピン、ヘアピン足場アダプター、またはヘアピンアダプターと呼ばれることがある。
一部の実施形態では、足場アダプター、またはその成分は、1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドは、修飾塩基と呼ばれることがあり、例えば、結合対のメンバーにコンジュゲートされたヌクレオチド、遮断されたヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、ペプチド核酸(PNA)ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ロックド核酸(LNA)ヌクレオチド、架橋核酸(BNA)ヌクレオチド、グリコール核酸(GNA)ヌクレオチド、トレオース核酸(TNA)ヌクレオチドなど、およびこれらの組合せを含み得る。一部の実施形態では、足場アダプター、またはその成分は、足場アダプターまたはその成分の、二重鎖領域内に、足場領域内に、一方の末端に、または両方の末端に、1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、足場アダプター、またはその成分は、1つまたは複数の不対合修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、足場アダプター、またはその成分は、アダプターの一方の末端に1つまたは複数の不対合修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、足場アダプター、またはその成分は、標的核酸とハイブリダイズする末端(例えば、一本鎖足場領域を含む末端)の反対側のアダプターの末端に、1つまたは複数の不対合修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドは、3’末端を有する鎖の末端に存在することもあり、または5’末端を有する鎖の末端に存在することもある。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、一本鎖核酸(ssNA)を含む核酸組成物と、末端処理活性を有する薬剤とを、一本鎖核酸(ssNA)分子が処理される条件下で接触させるステップを含み、それによって、末端処理されたssNA組成物が生成される。末端処理は、リン酸化、脱リン酸化、メチル化、脱メチル化、酸化、脱酸化、塩基修飾、伸長、重合、およびこれらの組合せを含み得るが、それらに限定されない。末端処理は、酵素を用いて行なうことができ、そのような酵素としては、リガーゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)、ターミナルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、メチラーゼ(例えば、3’メチラーゼ、5’メチラーゼ)、ポリメラーゼ(例えば、ポリAポリメラーゼ)、オキシダーゼ、およびこれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。
一部の実施形態では、ssNA、足場アダプター、および/またはハイブリダイゼーション産物(例えば、ssNAとハイブリダイズされた足場アダプター)は、本明細書に記載される方法の前に、間に、または後に切断またはせん断される。一部の実施形態では、ssNA、足場アダプター、および/またはハイブリダイゼーション産物は、切断部位で切断またはせん断される。一部の実施形態では、足場アダプターおよび/またはハイブリダイゼーション産物は、ヘアピンループ内の切断部位で切断またはせん断される。一部の実施形態では、足場アダプターおよび/またはハイブリダイゼーション産物は、足場アダプターの内部位置の(例えば、足場アダプターの二重鎖領域内の)切断部位で切断またはせん断される。一部の実施形態では、足場アダプターは、足場ポリヌクレオチド上にしか存在せず相補的オリゴヌクレオチド成分上には存在しない内部位置にある切断部位(例えば、ウラシル)で切断される。したがって、一部の実施形態では、足場ポリヌクレオチドは、1つまたは複数ウラシル塩基を含み、オリゴヌクレオチド成分は、ウラシル塩基を含まない。一部の実施形態では、環状ハイブリダイゼーション産物は、本明細書に記載される方法の前に、間に、または後に切断またはせん断される。一部の実施形態では、核酸、例えば、環状核酸および/または大きい断片(例えば、長さが500塩基対より長い)は、本明細書に記載される方法の前に、間に、または後に切断またはせん断される。大きい断片は、高分子量(HMW)核酸、HMW DNAまたはHMW RNAと呼ばれることがある。HMW核酸断片は、約500bp、約600bp、約700bp、約800bp、約900bp、約1000bp、約2000bp、約3000bp、約4000bp、約5000bp、約10,000bpより長い、またはそれより長い断片を含み得る。用語「せん断すること」または「切断」は、核酸分子を2つの(またはそれより多くの)より小さい核酸分子に分断することができる手順または条件を一般に指す。そのようなせん断または切断は、配列特異的、塩基特異的、または非特異的であり得、例えば、化学的、酵素的、および物理的(例えば、物理的断片化)を含む、様々な方法、試薬または条件により果たすことができる。せん断または切断された核酸は、約5~約10,000塩基対、約100~約1,000塩基対、約100~約500塩基対、または約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000もしくは9000塩基対の長さの名目値、代表値または平均値を有し得る。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、ニックシール反応を行うステップ(例えば、DNAリガーゼまたは他の好適な酵素、およびある特定の事例では、核酸を5’リン酸化するように構成されたキナーゼ(例えば、ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)を使用する)を含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、フィルイン反応を行うステップを含む。例えば、骨格アダプターが二重鎖として存在する場合、二重鎖の一部または全ては、ssNAとハイブリダイズする末端の反対側のその二重鎖の末端にオーバーハングを含むことがある。そのような二重鎖オーバーハングが存在する場合、本明細書における方法は、結合させるステップの後に、二重鎖により形成されたオーバーハングをフィルインするステップをさらに含み得る。一部の実施形態では、フィルイン反応は、平滑末端化ハイブリダイゼーション産物を生成するために行われる。フィルイン反応を行うために任意の好適な試薬を使用することができる。フィルイン反応を行うために好適なポリメラーゼとしては、例えば、DNAポリメラーゼI、大きい(クレノウ)断片、Bacillus stearothermophilus(Bst)DNAポリメラーゼなどが挙げられる。一部の実施形態では、鎖置換ポリメラーゼが使用される(例えば、Bst DNAポリメラーゼ)。
一部の実施形態では、核酸(例えば、RNA-DNA二重鎖、ハイブリダイゼーション産物、環状化ハイブリダイゼーション産物)は、エキソヌクレアーゼで処理される。一部の実施形態では、RNA-DNA二重鎖(例えば、第1鎖cDNA合成により生成されたRNA-DNA二重鎖)中のRNAは、エキソヌクレアーゼで処理される。エキソヌクレアーゼは、3’または5’末端のどちらかにおけるホスホジエステル結合を切断する加水分解反応によってポリヌクレオチド鎖の末端から1つずつヌクレオチドを切断することにより作用する酵素である。エキソヌクレアーゼは、例えば、DNAse、RNAse(例えば、RNAseH)、5’→3’エキソヌクレアーゼ(例えば、エキソヌクレアーゼII)、3’→5’エキソヌクレアーゼ(例えば、エキソヌクレアーゼI)、およびポリ(A)特異的3’→5’エキソヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、エキソヌクレアーゼ活性は、逆転写酵素により提供される(例えば、完全機能性RNAseHドメインを有するM-MLV逆転写酵素により提供されるRNAse活性)。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション産物は、例えば、一本鎖オリゴヌクレオチド、核酸断片、またはRNA-DNA二重鎖からのRNAなどの、夾雑核酸を除去するために、エキソヌクレアーゼで処理される。一部の実施形態では、環状化ハイブリダイゼーション産物は、一切の非環状化ハイブリダイゼーション産物、ハイブリダイズされていないオリゴヌクレオチド、ハイブリダイズされていない標的核酸、オリゴヌクレオチドダイマーなど、およびこれらの組合せを除去するために、エキソヌクレアーゼで処理される。
核酸を処理および/または解析するための方法および組成物が、本明細書で提供される。本明細書に記載される方法および組成物において利用される核酸または核酸混合物は、対象(例えば、被検対象)から得た試料から単離することができる。対象は、ヒト、非ヒト動物、植物、細菌、真菌、原生生物または病原体を含むがこれらに限定されない、任意の生命体または非生命体であり得る。任意のヒトまたは非ヒト動物を選択することができ、任意のヒトまたは非ヒト動物としては、例えば、哺乳動物、爬虫類、鳥類、両生類、魚類、有蹄動物、反芻動物、ウシ亜科の動物(例えば、ウシ)、ウマ科の動物(例えば、ウマ)、ヤギ亜科の動物およびヒツジ属の動物(例えば、ヒツジ、ヤギ)、イノシシ属の動物(例えば、ブタ)、ラクダ科の動物(例えば、ラクダ、ラマ、アルパカ)、サル、類人猿(例えば、ゴリラ、チンパンジー)、クマ科の蹠行性肉食動物(例えば、クマ)、家禽、イヌ、ネコ、マウス、ラット、魚類、イルカ、クジラおよびサメを挙げることができる。対象は、雄であってもよく、または雌(例えば、女性、もしくは妊婦)であってもよい。対象は、いかなる年齢(例えば、胚、胎児、乳幼児、小児、成人)であってもよい。対象は、がん患者、がんの罹患が疑われる患者、寛解期の患者、がんの家族歴を有する患者、および/またはがんスクリーニングを受ける対象であり得る。対象は、感染症もしくは感染性疾患に罹患しているまたは病原体(例えば、細菌、ウイルス、真菌、原生動物など)に感染した患者、感染症もしくは感染性疾患の罹患または病原体による感染が疑われる患者、感染症、感染性疾患または病原体感染から回復した患者、感染症歴、感染性疾患歴、病原体感染歴がある患者、および/あるいは感染性疾患または病原体スクリーニングを受ける対象であり得る。対象は、移植レシピエントであり得る。対象は、マイクロバイオーム解析を受けている患者であり得る。一部の実施形態では、被検対象は、雌である。一部の実施形態では、被検対象は、ヒト雌である。一部の実施形態では、被検対象は、雄である。一部の実施形態では、被検対象は、ヒト雄である。
核酸を処理および/または解析するための方法および組成物が、本明細書で提供される。核酸、核酸分子、核酸断片、標的核酸、核酸鋳型、鋳型核酸、核酸標的、標的核酸、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド断片、標的ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド標的などの用語は、本開示を通して同義で使用され得る。これらの用語は、DNA(例えば、相補的DNA(cDNA;目的の任意のRNAまたはDNAから合成されたもの)、ゲノムDNA(gDNA)、ゲノムDNA断片、ミトコンドリアDNA(mtDNA)、組換えDNA(例えば、プラスミドDNA)など)、RNA(例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)、短鎖抑制性RNA(siRNA)、リボソームRNA(rRNA)、転移RNA(tRNA)、マイクロRNA、トランス作用性低分子干渉RNA(ta-siRNA)、天然低分子干渉RNA(nat-siRNA)、核小体低分子RNA(snoRNA)、核内低分子RNA(snRNA)、長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)、ノンコーディングRNA(ncRNA)、トランスファー・メッセンジャーRNA(tmRNA)、前駆体メッセンジャーRNA(pre-mRNA)、低分子カハール体特異的RNA(scaRNA)、piwi結合RNA(piRNA)、エンドリボヌクレアーゼ調製siRNA(esiRNA)、小分子RNA(stRNA)、シグナル認識RNA、テロメアRNA、胎児または胎盤により高度に発現されるRNAなど)、および/またはDNAもしくはRNAアナログ(例えば、塩基アナログ、糖アナログおよび/または非ネイティブ骨格などを含む)、RNA/DNAハイブリッドならびにポリアミド核酸(PNA)であって、すべてが、一本鎖または二本鎖形態であることがあり、別段の限定がない限り、天然に存在するヌクレオチドと同様に機能することができる天然ヌクレオチドの公知のアナログを包含し得る、これらのものなどからの、任意の組成の核酸を指す。核酸は、プラスミド、ファージ、ウイルス、細菌、自己複製配列(ARS)、ミトコンドリア、セントロメア、人工染色体、染色体であってもよく、またはこれらからのものであってもよく、あるいはある特定の実施形態ではin vitroでまたは宿主細胞、細胞、細胞の細胞核もしくは細胞質で複製し得るもしくは複製され得る他の核酸であってもよく、またはそのような他の核酸からのものであってもよい。一部の実施形態での鋳型核酸は、単一の染色体からのものであり得る(例えば、核酸試料は、二倍体生物から得られた試料の1つの染色体からのものであることがある)。特に制限がない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される、天然ヌクレオチドの公知アナログを含む、核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列は、明確に示される配列ばかりでなく、その保存的に修飾されたバリアント(例えば、縮重コドン置換)、対立遺伝子、オルソログ、一塩基多型(SNP)および相補配列も暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択された(またはすべての)コドンの第3の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生じさせることにより果たすことができる。核酸という用語は、遺伝子座、遺伝子、遺伝子によりコードされているcDNAおよびmRNAと同義で使用される。この用語は、ヌクレオチドアナログ、一本鎖(「センス」または「アンチセンス」、「プラス」鎖または「マイナス」鎖、「フォワード」リーディングフレームまたは「リバース」リーディングフレーム)および二本鎖ポリヌクレオチドから合成されたRNAまたはDNAの誘導体、バリアントおよびアナログも、同意義のものとして含み得る。用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するDNAの一区画を指し;遺伝子産物の転写/翻訳におよび転写/翻訳の調節に関与するコード領域(リーダーおよびトレーラー)に先行するおよび続く領域、ならびに個々のコード領域(エクソン)間の介在配列(イントロン)を一般に含む。ヌクレオチドまたは塩基は、核酸のプリンおよびピリミジン分子単位(例えば、アデニン(A)、チミン(T)、グアニン(G)およびシトシン(C))を一般に指す。RNAについては、塩基チミンが、ウラシルに置き換えられる。核酸長またはサイズを、塩基の数で表すことができる。
専用アダプター(例えば、シーケンシングライブラリーを生成するための)を使用して一本鎖核酸(ssNA)を捕捉するための方法および組成物が、本明細書で提供される。一本鎖核酸またはssNAは、それらの長さの70%またはそれより高い%にわたって一本鎖状態である(すなわち、分子間ハイブリダイゼーションも分子内ハイブリダイゼーションもしていない)ポリヌクレオチドの一群を一般に指す。一部の実施形態では、ssNAは、ポリヌクレオチドの長さの75%もしくはそれより高い%、80%もしくはそれより高い%、85%もしくはそれより高い%、90%もしくはそれより高い%、95%もしくはそれより高い%、または99%もしくはそれより高い%にわたって一本鎖状態である。ある特定の態様では、ssNAは、ポリヌクレオチドの全長にわたって一本鎖状体である。一本鎖核酸は、本明細書では標的核酸と呼ばれることがある。
一部の実施形態では、核酸(例えば、細胞外核酸)は、核酸の部分集団または種について濃縮または相対的に濃縮される。核酸部分集団は、例えば、胎児核酸、母体核酸、がん核酸、腫瘍核酸、患者核酸、宿主核酸、病原体核酸、移植片核酸、マイクロバイオーム核酸、特定の長さもしくは長さの範囲の断片を含む核酸、または特定のゲノム領域(例えば、単一の染色体、染色体のセット、および/もしくはある特定の染色体領域)からの核酸を含むことができる。そのような濃縮された試料を、本明細書で提供される方法とともに使用することができる。したがって、ある特定の実施形態では、本技術の方法は、試料中の核酸の部分集団について濃縮するさらなるステップを含む。ある特定の実施形態では、正常組織(例えば、非がん細胞、宿主細胞)からの核酸は、試料から選択的に(部分的に、実質的に、ほぼ完全に、または完全に)除去される。ある特定の実施形態では、母体核酸は、試料から選択的に(部分的に、実質的に、ほぼ完全に、または完全に)除去される。ある特定の実施形態では、特定の低コピー数種核酸(例えば、がん、腫瘍、胎児、病原体、移植片、マイクロバイオーム核酸)についての濃縮は、定量感度を改善することができる。試料を核酸の特定の種について濃縮する方法は、例えば、米国特許第6,927,028号、国際特許出願公開番号WO2007/140417、国際特許出願公開番号WO2007/147063、国際特許出願公開番号WO2009/032779、国際特許出願公開番号WO2009/032781、国際特許出願公開番号WO2010/033639、国際特許出願公開番号WO2011/034631、国際特許出願公開番号WO2006/056480、および国際特許出願公開番号WO2011/143659に記載されており、各々の全内容は、本文、表、式および図面すべてを含めて、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、断片長に従って標的核酸(例えば、ssNA)を分離するステップを含む。例えば、標的核酸(例えば、ssNA)を、1つまたは複数の長さに基づく分離方法を使用して、特定の閾値またはカットオフ未満のまたはそれを超える、特定の核酸断片長(単数)、長さの範囲、または長さ(複数)について濃縮することができる。核酸断片長は、通常は、断片中のヌクレオチドの数を指す。核酸断片長はまた、核酸断片サイズと呼ばれることもある。一部の実施形態では、長さに基づく分離方法は、個々の断片の長さを測定せずに行われる。一部の実施形態では、長さに基づく分離方法は、個々の断片の長さを決定する方法と併せて行われる。一部の実施形態では、長さに基づく分離は、分画されたプールのすべてまたは一部を単離(例えば、保持)および/または解析することができる、サイズ分画手順を指す。サイズ分画手順は、当技術分野において公知である(例えば、アレイでの分離、モレキュラーシーブによる分離、ゲル電気泳動による分離、カラムクロマトグラフィー(例えば、サイズ排除カラム)による分離、およびマイクロフルイディクスに基づくアプローチ)。一部の実施形態では、長さに基づく分離アプローチは、例えば、断片環状化、化学的処理(例えば、ホルムアルデヒド、ポリエチレングリコール(PEG))、質量分析および/またはサイズ特異的核酸増幅を含み得る。一部の実施形態では、長さに基づく分離は、固相可逆的固定法(SPRI)ビーズを使用して行われる。
本明細書における方法は、核酸ライブラリーを調製するステップ、および/または核酸ライブラリーために核酸を修飾するステップを含み得る。一部の実施形態では、核酸断片の末端は、断片またはそれらの増幅産物を核酸ライブラリーに組み込むことができるように修飾される。一般に、核酸ライブラリーは、その非限定的な例が、固相(例えば、固体支持体、フローセル、ビーズ)上への固定化、濃縮、増幅、クローニング、検出を含む、特異的プロセスのために、および/または核酸シーケンシングのために、調製される、組み立てられる、および/または修飾される、複数のポリヌクレオチド分子(例えば、核酸の試料)を指す。ある特定の実施形態では、核酸ライブラリーは、シーケンシングプロセスの前にまたはシーケンシングプロセス中に調製される。核酸ライブラリー(例えば、シーケンシングライブラリー)は、当技術分野において公知であるような好適な方法により調製することができる。核酸ライブラリーは、標的化または非標的化調製プロセスにより調製することができる。
一部の実施形態では、核酸(例えば、核酸断片、試料核酸、無細胞核酸、一本鎖核酸、一本鎖DNA、一本鎖RNA)は、シーケンシングされる。一部の実施形態では、本明細書で提供される足場アダプターとハイブリダイズされたssNA(「ハイブリダイゼーション産物」)は、シーケンシングプロセスによりシーケンシングされる。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド成分とハイブリダイズされたssNA(「一本鎖ライゲーション産物」)は、シーケンシングプロセスによりシーケンシングされる。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション産物および/または一本鎖ライゲーション産物は、増幅プロセスにより増幅され、増幅産物は、シーケンシングプロセスによりシーケンシングされる。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション産物および/または一本鎖ライゲーション産物は、増幅プロセスにより増幅されず、ハイブリダイゼーション産物および/または一本鎖ライゲーション産物は、事前の増幅なしにシーケンシングプロセスによりシーケンシングされる。一部の実施形態では、シーケンシングプロセスは、配列リード(またはシーケンシングリード)を生成する。一部の実施形態では、本明細書における方法は、配列リードに基づいて一本鎖核酸分子の配列を決定するステップを含む。
配列リードをマッピングすることができ、指定核酸領域(例えば、染色体またはその一部分)にマッピングするリードの数は、カウントと呼ばれる。任意の好適なマッピング方法(例えば、プロセス、アルゴリズム、プログラム、ソフトウェア、モジュールなど、またはこれらの組合せ)を使用することができる。マッピングプロセスのある特定の態様が、以下に説明される。
選択された特徴または変数に基づいてマッピングまたは分割される配列リードを定量化して、1つまたは複数の部分(例えば、参照ゲノムの部分)にマッピングされるリードの量または数を決定することができる。ある特定の実施形態では、部分またはセグメントにマッピングされる配列リードの量は、カウントまたはリード密度と呼ばれる。
本明細書に記載される方法は、上記の試料または供給源の1つまたは複数の特性を示すアウトカムを提供することができる。本明細書に記載される方法は、被検試料(例えば、医学的状態の存在もしくは非存在および/または表現型を決定するアウトカムを提供するもの)についての表現型および/または医学的状態の存在もしくは非存在を示すアウトカムを提供することもある。アウトカムは、分類プロセスの一部であることが多く、分類(例えば、試料もしくは供給源の1つもしくは複数の特性、ならびに/または被検試料についての遺伝子型、表現型、遺伝的変異および/もしくは医学的状態の存在もしくは非存在の分類)は、アウトカムに基づくこともあり、および/またはアウトカムを含むこともある。アウトカムおよび/または分類は、分類プロセス(例えば、統計値)において試料および/もしくは供給源の1つもしくは複数の特性ならびに/または遺伝子型、表現型、遺伝的変異、遺伝的変更および/もしくは医学的状態の存在もしくは非存在の判定を容易にする、被検試料についてのデータ処理の結果に基づくこともあり、および/またはそのような結果を含むこともある。アウトカムおよび/または分類は、試料もしくは供給源の1つもしくは複数の特性、ならびに/または遺伝子型、表現型、遺伝的変異、遺伝的変更および/もしくは医学的状態の存在もしくは非存在を決定するスコアをあるいはそのような特性ならびに/または存在もしくは非存在のコールを含むこともあり、またはそのようなスコアもしくはコールに基づくこともある。ある特定の実施形態では、アウトカムおよび/または分類は、分類プロセスにおいて試料もしくは供給源の1つもしくは複数の特性をならびに/または遺伝子型、表現型、遺伝的変異、遺伝的変更および/もしくは医学的状態の存在もしくは非存在を予測および/または判定する、結論を含む。
本明細書に記載されるある特定のプロセスおよび方法(例えば、配列リードのサブセットを選択するプロセスおよび方法、配列リードプロファイルを生成するプロセスおよび方法、配列リードデータを処理するプロセスおよび方法、配列リード定量化を処理するプロセスおよび方法、配列リードデータまたは配列リードプロファイルに基づいて試料の1つまたは複数の特性を判定するプロセスおよび方法)は、多くの場合、頭の中で行なうには複雑すぎ、コンピュータ、マイクロプロセッサー、ソフトウェア、モジュールまたは他の機械なしでは遂行することができない。本明細書に記載される方法は、コンピュータ実装方法であり得、方法の1つまたは複数の部分は、1つまたは複数のプロセッサー(例えば、マイクロプロセッサー)、コンピュータ、システム、装置または機械(例えば、マイクロプロセッサー制御型機械)により遂行されることもある。
核酸を解析するための方法が、本明細書で提供される。
ある特定の実施形態では、キットが提供される。キットは、本明細書に記載される方法のいずれかを行なうために有用な、本明細書に記載される任意の成分および組成物(例えば、足場アダプターおよびそれらの成分/小成分、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド成分/領域、足場ポリヌクレオチド、足場ポリヌクレオチド成分/領域、核酸、一本鎖核酸、プライマー、一本鎖結合タンパク質、酵素)を、任意の好適な組合せで含むことができる。キットは、本明細書に記載される方法のいずれかを行うのに有用な任意の試薬、緩衝剤または他の成分をさらに含むことができる。例えば、キットは、複数の足場アダプター種もしくは複数の足場ポリヌクレオチド種および対応するオリゴヌクレオチド成分、核酸を5’リン酸化するように構成されたキナーゼ(例えば、ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK))、DNAリガーゼ、ならびにこれらの任意の組合せのうちの1つまたは複数を含むことができる。
無細胞DNA(cfDNA)の一本鎖特異的ライブラリー調製
この実施例では、一本鎖DNA(ssDNA)ライブラリー調製方法およびその改良を説明する。下で説明するssDNAライブラリー調製方法は、アダプターライゲーションの前にすべてのDNA一本鎖を作製することにより二本鎖(dsDNA)およびssDNA分子両方を捕捉する。
1)DNAを熱安定性一本鎖DNA結合タンパク質(SSB)の存在下で3分間、95℃に加熱することによりssDNAを作出して維持し、次いで、氷を用いてチューブを急速冷却する。
2)足場アダプターの適切な希釈物を調製し、a)6×過剰のP5およびP7足場アダプター両方の組合せとb)リン酸化/ライゲーションマスターミックスとを添加して、80μlの反応体積中、最終濃度18.5%PEG 8000、最終1mMのATP、最終11mMのDTT、最終10mMのMgCl2、50mMのTris-HCl pH7.5、2,000単位のT4 DNAリガーゼ、および10単位のPNKを得る。
3)1時間、37℃でインキュベートする。
4)Qiagen MINELUTE PCR Purification Kitを使用してカラム精製クリーンを行なう。
5)インデックスPCRを行なう。
上記の基本プロトコールの様々な改良を下で説明する。ある特定の改良は、例えば、より良好なライブラリー品質、収量の増加、より速いライブラリー生成、より少ない用量またはより低用量の試薬、より少ないステップおよびこれらに類するものなどの、プロトコールの改善をもたらした。
800単位~2000単位のT4 DNAリガーゼ投入量を試験した。結果は、2000単位と同様の結果を生じさせるために800単位で十分過ぎるほどであることを示した。
様々なインキュベーション時間を試験した。試験した反応時間は、5分~60分であった。
種々の精製方法を試験した。結果は、精製方法が重要でないことを示した。固相可逆的固定法(SPRI)磁気ビーズ精製は、カラム精製と同様の効果を発揮した。複数のSPRIビーズ製造業者を試験し、すべてが良好な効果を発揮した。精製ステップなしでライゲーション/リン酸化反応から直接インデックスPCRに進むことも試験した。精製なしの方法は効果を発揮したが、インデックスPCR後に、より低い収率およびより問題のあるDNAサイズプロファイルを生じさせた。
この方法は、一本鎖結合タンパク質(SSB)を用いておよび用いずに行なった。結果は、オリゴプールなどの複雑度の低い混合物の場合でさえ、SSBがプロトコールに必要でないことを示した。結果は、SSBの非存在下であっても、DNAが熱変成および急速冷却後に十分一本鎖状態を維持することを示した。SSB滴定および様々な供給業者からのSSBを試験し、試験したいずれの条件もSSBなし対照との間に差は認められなかった。解析したパラメーターは、アダプターダイマー%、DNAライブラリー収量、30~130塩基対(bp)間の断片%、マッピング率%、重複率%、リードパスフィルター%、パスフィルターリードのマッピング率、およびライブラリー産物サイズ分布を含んだ。SSBのSSBなしに対する試験結果を図2A、2B、3Aおよび3Bに示す。
様々な足場アダプターの基質DNAに対する比を試験した。結果は、足場アダプターの基質DNAに対する理想的な比がおよそ30×であることを示した。結果は、基本プロトコールでの6×比が低すぎることも示した。
ssDNAライゲーション/リン酸化反応を行なう前のホスファターゼでの足場アダプターの前処理は、結果を改善し、収量を増加させ、アダプターダイマーを減少させた。これらの改善を図4に示す。
アダプターライゲーション/リン酸化反応の成分を事前に作製し、使用しやすいように一緒に保管した。マスターミックスは、tris緩衝液pH8、DTT、MgCl2、ATP、PEG 8000、T4 DNAリガーゼ、およびT4 PNKを含んだ。
ライゲーション/リン酸化反応のリン酸化(例えば、PNK)部分は、品質ライブラリーの生成には必要でなかった。PNKをプロトコールから完全に削除するかまたはライゲーションステップの上流に配置し、品質ライブラリーをどちらかの方法で生成した。また、PNKをライゲーションステップの上流に含めるのであれば、またはPNKがライゲーションステップと同時に存在することになるのであれば、基質DNAを脱リン酸化することができる。
様々な高忠実度熱安定性ポリメラーゼを用いて品質ライブラリーを生成した。最終0.2μM~4μMの間の範囲のプライマー濃度を用いて品質ライブラリーを生成した。1μMを最終プライマー濃度として選択した。
シーケンサー互換性に必要なすべての必須DNA配列を含有する足場アダプター(「完全長アダプター」と呼ぶ)を合成すれば、インデックスPCRを用いずに品質ライブラリーを構築することができるだろう。図5Aおよび5Bを参照されたい。図5Aでは、足場アダプターの足場ポリヌクレオチド(下の鎖)およびオリゴヌクレオチド(上の鎖)各々が、フローセル結合領域を含む。図5Bでは、足場アダプターのオリゴヌクレオチド(上の鎖)はフローセル結合領域を含み、足場アダプターの足場ポリヌクレオチド(下の鎖)は、フローセル結合領域を含まない。
ライゲーション/リン酸化反応中に0~30%の最終PEG 8000濃度を試験し、結果は、18.5%が含めるのに理想的な量であることを示した。
上で説明した一本鎖DNAプロトコールに関する1つの問題は、このプロトコールがアダプターダイマーの高いパーセントを生じさせ得ることであり、この原因は、足場アダプターの構造にある可能性が最も高い。アダプターダイマー形成に対抗するために、いくつかの異なる技法を開発し、試験したが、これらの成功レベルにはばらつきがあった。1つの技法は、ssDNAライゲーション/リン酸化反応を行なう前にホスファターゼで足場アダプターを前処理すること(上で説明した)であった。別の技法は、ライゲーション/リン酸化反応の定量滴定を行なうこと(下で説明する)であった。試験した他の技法を下で説明する。
ライゲーション/リン酸化反応について定量滴定を行なった。結果は、全反応体積を低下させると、収量が増加され、アダプターダイマー形成が抑制されることを示した。理論により制限されるものではないが、これは、18.5%PEGの存在下での単位体積当たりのアダプター/足場分子に対するDNA分子末端の比の結果である可能性がある。最良の挿入物分布および最小のアダプターダイマー形成を伴う、cfDNAから最高品質ライブラリーを生成する比は、基質DNA末端が、18.5%PEG 8000の存在下で0.4フェムトモル毎マイクロリットル(fmol/μl)であり、各足場アダプターが10fmol/μlであるときに存在した。この比を任意の体積で達成することができ、必要に応じて体積または投入DNA質量を増加させることにより制約を克服することができる。この比は、多くの異なる方法および単位で表すことができる。例えば、1つのプロトコールは、25μlの最終反応体積、1ngの無細胞DNA投入量、および1.6ピコモルの各足場アダプターの添加を含む。
5ng~100pgの投入DNA量を試験した。ライブラリーをすべての投入量から作製したが、250pg未満では品質が低下した。
16℃~37℃の反応温度を試験した。最良の温度は37℃であり、温度が低下するにつれて、DNA収量が減少し、アダプターダイマー%がより高くなった。
UMIポリヌクレオチドを含むように足場アダプターを修飾した。UMIを足場アダプターに組み込むために少数の構成を設計した。例えば、UMIを、Nまたはイノシンをランダム塩基として使用して挿入物に直接隣接する短いアダプターで付加させたか、または完全長アダプター内のインデックス付加バーコードの隣に配置した(図6Aまたは6Bを参照されたい)。図6Bに示す構成では、完全長P5およびP7アダプターが反応中にライゲーションされる。UMIは、ユニバーサル塩基、ランダム塩基、または既知の塩基を含み得る。UMIは、長さ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10塩基であり得、またはそれより長いこともある。ある特定の構成では、PCR増幅中に短いP5/P7をライゲーションしてアダプターを完全長にした。P7アダプター内のインデックスの隣にランダムN塩基のUMIを配置する方法が、良好な効果を発揮した。
アダプターダイマーの形成を低減させるために、足場アダプターのヘアピン構造を設計した(図8を参照されたい)。ヘアピンアダプターを使用する方法は効果を発揮したが、元のアダプター設計ほどは良好に機能しない。
図9、10および11は、代替的な操作順序、酵素もしくは他の試薬の添加遅延、末端DNA修飾、および/または他のリガーゼタイプを含む、足場アダプターへの修飾を記載する。
RNAの一本鎖特異的ライブラリー調製
実施例1で説明した一本鎖DNAライブラリー調製方法を、RNA分子のシーケンシングライブラリーへの変換用に改良した。1つの構成では、rRNAが枯渇されたまたはmRNAが濃縮された全RNAから生成される第1鎖DNA合成産物を、本明細書に記載する一本鎖DNAライブラリー調製方法に組み込む。別の構成では、rRNAが枯渇されたまたはmRNAが濃縮された全RNAを、本明細書に記載する一本鎖DNAライブラリー調製方法に直接組込み、その後、第1鎖DNA合成を行なう。より少ない酵素的ステップ、時間の節約および試薬の節約に加えて、RNAへの一本鎖DNAライブラリー調製方法の応用には、既存の技術を超えるいくつかの生物学的利益もある。例えば、本明細書に記載する技術の一本鎖性のため、第2鎖合成を完全に省くことができる。得られたRNAシーケンシングライブラリーは、鎖RNAシーケンシングライブラリーを生成することができ、その結果、転写物マッピングがより正確になる。
定方向RNA-Seqライブラリー調製NGSアッセイ(RNAのssPrep)
RNA-Seqは、遺伝子発現プロファイリングおよび全トランスクリプトーム解析に使用される、次世代シーケンシング(NGS)ワークフローである。本明細書に記載し、図21に示す、RNAの一本鎖ライブラリー調製(ssPrep)は、定方向RNA-Seqライブラリー調製方法であり、この方法は、固有のNGSアダプターを使用して第1鎖cDNAから直接ライブラリーを生成し、したがって第2鎖合成およびDNA末端修復をなくす。それ故、費用および時間の大幅な削減によってライブラリー品質が向上されることになる。
この実施例では、RNAのssPrepのプロトコールを用いて作製したRNA-Seqライブラリーについての品質メトリクスの改善を実証する。RNAのssPrep方法についてのメトリクスを、市販の二本鎖(dsPrep)方法(すなわち、NEBNEXT ULTRA II Directionalライブラリー調製方法)のものと比較した。スパイクインmRNA対照を使用したとき、RNAのssPrepは、反復実験間の高度な一致を有し、ライブラリーの鎖の数を保持し、かつ真のmRNA GC組成を捕捉する、ライブラリーを生成した。
RNAのssPrepの性能を、第2鎖合成を必要とする市販二本鎖調製(dsPrep)キット(すなわち、NEBNEXT ULTRA II Directionalキット)の性能と比較した。第2鎖合成ステップは、dUTPを相補鎖に組み込み、その後、dAテール付加、末端充填およびアダプターライゲーションを行う。dUTPを含有する鎖のその後の酵素的消化は、元の鎖情報を維持する。従来のRNAseq方法とは異なり、RNAのssPrepは、第1鎖cDNAを用いて直接行なわれ、したがって、転写物の方向性を自然に維持する。
無細胞DNAおよび一本鎖オリゴの解析のためのNGSライブラリー調製への一本鎖アプローチ
この実施例では、鋳型分子のネイティブ末端に変更を加えることなく、少ない投入量のcfDNAから複雑なライブラリーを生成するように設計した、単純かつ効率的な、ライゲーションに基づくssDNAライブラリー調製を提示する。ssPrepと呼ぶこともあるこの方法は、1ステップ複合リン酸化/ライゲーション反応で動作する。ssPrep方法は、特殊設計された次世代シーケンシング(NGS)足場-アダプターをライゲーションする、末端ポリッシングを伴わないライゲーションのための鋳型DNA分子を調製する。ssPrep方法は、プロトコール時間およびシーケンシング結果が、最も効率のよい二本鎖ライブラリー調製DNA方法に匹敵する、迅速かつ効率的な一本鎖ライブラリー方法である。合成オリゴの2つの独立した群を使用してssPrepのネイティブ末端保持の有用性を実証し、一本鎖オリゴを純度についてアッセイするssPrepの能力を明らかに示す。最後に、ssPrepから生じたcfDNA次世代シーケンシングデータを使用して健康な個体からのヌクレオソームの位置取りおよび転写因子結合部位を解析することができることを実証する。したがって、ssPrepは、cfDNA断片のような断片化されたDNA分子を、本来の長さおよびネイティブ末端を保持するシーケンシングライブラリーに変換するための、迅速かつ用途の広いツールである。
以下の方法をこの実施例では使用した。
匿名化されたドナーからの全血をin vitro研究使用のためにPalo Alto、CAのスタンフォード献血センター(Stanford Blood Center)から入手した。採血チューブを1800gで10分間、4℃で回転させることにより、全血から血漿を抽出した。細胞層を乱すことなく、上清の2mlアリコートを無菌条件下で微量遠心チューブに移し、16000gで10分間、4℃で再び回転させて、細胞デブリを除去した。
循環無細胞DNAキット(Qiagen Technologies)を製造業者のプロトコールに従って使用して、4mlの血漿からcfDNAを調製した。精製された無細胞DNA(cfDNA)の濃度を、QUANT-IT高感度dsDNA Assay KitおよびQubit蛍光光度計(ThermoFisher Scientific)を使用して測定した。TapeStationおよび付随するD5000またはD1000高感度製品を使用して、cfDNAサイズ分布を解析した(Agilent;図33Aおよび33B)。
ランダム配列生成装置を使用して50%GC含有量で二本鎖合成オリゴ(下記表1に示す)を設計し、公開データベースの任意の公知生物とマッチする配列を除去した。各dsDNAオリゴ(n=12)は、1つの平滑末端と、ランダム配列、長さ1~6ヌクレオチド、の1つの3プライムまたは5プライム一本鎖オーバーハングとを有する、二本鎖DNAの固有の50nt配列であった。オリゴは、Integrated DNA Technologies(IDT)により標準的な脱塩精製を使用して合成され、二重鎖化されたものであり、すべてのランダムヌクレオチドを、合成の偏りを低減させるために「手で混合」した。一本鎖ライブラリー調製(ssPrep)のために、対照オリゴを等モル比で一緒にプールした。
フォワード(P5)ssPrepアダプターおよびリバース(P7)ssPrepアダプターは、両方とも二本鎖足場アダプターであった。フォワードssPrepアダプターは、アダプターの足場部分に5プライムオーバーハング、およびライゲーション末端に遊離3プライムOH末端を含有し、すべての他の末端は、ライゲーションおよび伸長を遮断する修飾を有した。リバースssPrepアダプターは、アダプターの足場部分に3プライムオーバーハング、およびライゲーション末端にリン酸化5プライム末端を含有し、すべての他の末端は、ライゲーションおよび伸長を遮断する修飾を有した(下記の表3)。ssPrepアダプターは、Integrated DNA Technologies(IDT)により標準的な脱塩精製を使用して合成され、二重鎖化されたものであった。アダプターの作業用ストックを、TE+50mM NaClでアダプターを希釈することにより製造した。
22μl変性反応では、QUANT-ITにより測定して1ngの精製cfDNAまたは5ngの合成したオリゴを、10mM Tris pH8.0および8ngのET SSB(New England Biolabs)と、氷上で併せた。95℃に予熱したサーモサイクラー内に反応物を配置し、3分間インキュベートした後、直ちに、少なくとも2分間、氷上に戻した。1pmolのフォワードおよび1pmolのリバースssPrepアダプターを氷上の変性反応物に添加し、PEG-8000、T4 DNAリガーゼ緩衝剤、T4 PNK、およびT4 DNAリガーゼ(すべてNew England Biolabs)も添加して最終体積50μlにした。PEG-8000を18.5% v/vの最終濃度まで添加した。T4 DNAリガーゼ緩衝剤を1×の最終濃度まで添加した。T4 PNKおよびT4 DNAリガーゼをそれぞれ10単位および800単位の最終濃度まで添加した。このライゲーション反応物を37℃で1時間インキュベートし、MINELUTE PCR Purification Kit(Qiagen)および製造業者の使用説明書を次の変更を加えて使用して精製した:初期結合スピンは、卓上遠心分離機を用いて6000rpmで行なった。洗浄スピンは、洗浄スピンを合計2回反復し、両方の洗浄を6000rpmで行なった。DNAを15μlの10mM Tris pH8.0で溶出した。
QUANT-ITにより測定して、1ngの精製cfDNAまたは5ngの合成オリゴを、供給された試薬、推奨AMPUREクリーンアップ比、および推奨インデックスPCRサイクルを使用する、NEBNEXT ULTRA IIマニュアルに概要が示されている通りのライブラリー調製(末端ポリッシング、アダプターライゲーション、インデックスPCR)によって、得た。
すべてのcfDNAライブラリーは、Fulgent GeneticsによりILLUMINA HISEQXを用いて2×151リード長でシーケンシングされたものであった。すべての合成オリゴライブラリーは、社内ILLUMINA MISEQ卓上シーケンサーを製造業者の使用説明書に従って2×151bpのリード長でシーケンシングした。
シーケンシングデータを、先ず、bwa memを使用してデフォルトパラメーターでPhiXゲノムとアライメントした。PhiX(samtools fastq-f 12)にマッピングしなかった抽出リードを、下流の解析に使用した。次に、アダプター配列の除去とリードのマージを同時に行なった。このプロセスは、配列類似性に基づいてフォワードリードとリバースリードを折り畳んで単一の配列にすること、その一方で、SeqPrep(github.com/jstjohn/SeqPrep)を使用して公知ILLUMINAアダプター配列とマッチするリードの末端をトリミングすることを含んだ。フィルタリング後に残存した、マージしたリードを、UCSCゲノムブラウザからダウンロードしたhg19ヒト参照ゲノム(下記の表4および5)、または合成したオリゴ配列(表1)に対応するカスタムfastaファイルのどちらかと、アライメントした。デフォルトパラメーターでbwa alnおよびbwa sampeをアライメントおよびマッピングに使用した。ヒトライブラリーについてのマッピング率を、samtools flagstatから決定した。次いで、samtools rmdupを使用して、重複リードを除去した。
大部分の解析について、解析の前にsamtools mergeを使用して、同じ調製方法および同じcfDNA抽出物の個々のライブラリーからのbamファイルを試料特異的およびライブラリー特異的bamファイルにマージした。同じ調製方法およびcfDNA抽出物についての、マージしたリードの挿入物長分布について、samtools view -q20 -f66を使用して生成した、個々のライブラリーのbamファイルから、挿入物長の情報を解析し、連結コマンドを使用して結合させた。長さ当たりのリードの頻度を計算し、全ライブラリーに対するリードのパーセントとしてプロットした。全ライブラリーが同じカバレッジを有するように、samtools view-sを使用して、マージし、重複を除去し、ダウンサンプリングしたbamファイルから、正規化したゲノムカバレッジを抽出した。ダウンサンプリングしたbamファイルをsamtools view -q20 -bからbedtools genomecovにピッピング(pipping)することにより、データを得た。ダウンサンプリングの前にライブラリー調製方法ごとにNEBNEXT ULTRA IIよりもcfDNA抽出物当たりのライブラリー数が多いssPrepの複雑性を人工的に増大させないように各cfDNA入力試料について3つだけのライブラリーを組み合わせることにより、preseq複雑性推定値を得た。ssPrep試料Aについて組み合わせたライブラリーは、A1、A2、A3であった。ssPrep試料Bについて組み合わせたライブラリーは、B6、B7、B8であった。試料Aおよび試料BについてのNEBNEXT ULTRA IIの組み合わせたライブラリーは、それぞれ、ds1A~ds3Aおよびds4A~ds6Aであった。組み合わせてダウンサンプリングした後に、preseq lcextractを使用して複雑性推定および外挿を行なった。Picard Tools(Broad Institute)CollectGCBiasMetricsを用いて、マージし、重複を除去し、ダウンサンプリングしたbamファイルからGCカバレッジを得た。ライブラリータイプごとに、断片の両方のリードに基づいて-2~+34塩基にわたる領域のあらゆる位置での各塩基の比率、すなわち塩基組成、を計算することによって断片末端ヌクレオチド解析を行なった。位置ごとの塩基組成を、領域の長さに沿ってその塩基の最頻値を用いて正規化し、log-2変換した。正規化され、log変換された比率を、両方のリードの両方のライブラリータイプについて計算し、プロットした。すべてのプロットを、ggplot2を用いてRで生成した。
カスタムスクリプトakinをsamtools depthに用いて、オリゴ中の各位置における二本鎖合成オリゴシーケンシングカバレッジを決定し、Rでggplot2を用いて0ベース座標でオリゴの長さにわたってのパーセントの関数としてプロットした。
ジヌクレオチド出現頻度計算のために、各ライブラリー調製方法についての試料Aおよび試料Bの組み合わせたライブラリーからのマージされたbamファイルを、samtools view -bh -F 0X10 -m -M -q 20を使用して構文解析して、特異的挿入物長:167bp(クロマトソームに巻き付いたDNA長)、144bp(コア粒子に巻き付いたDNA長)、および83bp(図29、パネルAにピークとして存在する、より短いDNA長)の、フォワードリードを抽出した。各挿入物長については、5プライムおよび3プライム断片化点の両方に100bpまたは11bpのゲノムコンテキストをそれぞれ追加した100bpまたは11bpウインドウどちらかについての16すべての2-mer組合せのカスタムpythonスクリプトを使用して、両方の断片化点の周辺のジヌクレオチドカウントを推定した。両末端の100bp隣接ウインドウを用いて生成したデータについて、オーバーラップしている領域(当然のこととして、同じカウントを有する)を除去した。中央値フィルターを使用してデータを正規化し、ジヌクレオチド出現頻度を、挿入物の中央がゼロになり、断片化点の上流の領域が負の値を有し、下流が正の値を有するように、弱いジヌクレオチド(AA/AT/TA/TT)相互作用について強いジヌクレオチド(CC/CG/GC/GG)相互作用に対してプロットした。11bp隣接ウインドウに関して生成されたデータについて、中央値フィルターを用いてデータを正規化し、弱いジヌクレオチドの強いジヌクレオチドに対するジヌクレオチド出現頻度を、Rを使用して5プライムおよび3プライム末端についてプロットした。
cfDNA:無細胞DNA;NGS:次世代シーケンシング;ssDNA:一本鎖DNA;dsDNA:二本鎖DNA;bp:塩基対;nt:ヌクレオチド;SSB:一本鎖結合タンパク質;FFPE:ホルマリン固定パラフィン包埋;ctDNA:循環腫瘍DNA;WPS:ウインドウ保護スコア。
この実施例で説明するssPrep方法は、断片化されたまたは分解された鋳型DNAからILLUMINAシーケンシングライブラリーを作出する(図28)。dsDNAと、ssDNAと、ニックの入ったdsDNAとの複合混合物であり得る鋳型DNAを、先ず、熱変性させ、次いで直ちにコールドショックを与えてすべての鋳型DNA分子を均一な一本鎖状にする。熱安定性一本鎖結合タンパク質(SSB)を含めることにより、ライゲーション反応を通してDNAを一本鎖状態として維持する。次に、今や均一な一本鎖状であり、SSBで被覆されている、鋳型DNAを、(リン酸化/一本鎖オーバーハングを含有する方向性のあるdsDNA NGSアダプターとのライゲーション)の二重反応に供する。
ssPrepにより生成されたデータの品質および量を評価するために、ssPrepおよび鎖末端ポリッシングdsDNAライブラリーキット(New England Biolabs NEBNEXT ULTRA II;市販キットまたはdsPrepとも呼ぶ)の両方を使用して、2名の健康なヒト個体から得た2つの血清cfDNA抽出物(試料Aおよび試料B)からいくつかのシーケンシングライブラリーを生成した。ライブラリー調製および定量化(図33Aおよび33B)後、ILLUMINA HISEQ X(2×150bp)を用いてライブラリーをcfDNA抽出物当たりおよそ400,000,000リードペアまでペアエンドシーケンシングした。同じcfDNA抽出物およびライブラリー調製方法から生成したライブラリーからのシーケンシングデータを解析のために組み合わせた。フォワード配列リードとリバース配列リードを、これらのリードがオーバーラップしている場合にはマージして、元のDNA断片を表す単一のリードを生成した。cfDNAからの配列リードの大多数は約167bp長であるので、マージしたリード(リード1およびリード2が少なくとも30bpの相補性によりオーバーラップしていた)のみを、下流の解析に使用した(上記の表4および表5)。生成されたデータによって、cfDNA抽出物ごとにssPrep試料とdsPrep試料の両方についてヒトゲノムの約15倍のカバレッジを得た。
5プライムおよび3プライムオーバーハング
5プライムおよび3プライム末端におけるcfDNAの塩基組成の相違を考えて、ssPrep方法、およびNEBNEXT ULTRA IIのようなdsDNAライブラリー調製方法が、投入DNA断片を変えることになる(または変えることにならない)のかどうかを試験するための実験を設計した。特定の長さおよびタイプの(5プライムまたは3プライム)オーバーハングを各々が有する、12の合成二重鎖オリゴのプールを等モル濃度で構築した。各二重鎖は、各オーバーハングタイプに固有の、50ヌクレオチド(nt)コア配列を含有し、一方の側に平滑末端および他方の側に特定の長さのランダム配列(1~6nt)の5プライムまたは3プライムオーバーハングという、共通の構造を有した(図30、パネルA;表1)。
定義された範囲の投入DNA鋳型長でのssPrepの効率を試験するために、10nt長間隔で20~120ヌクレオチドの範囲の長さの11の一本鎖オリゴ(標準的な脱塩精製)1セット(表2)を設計した。等モル濃度の各々を使用してプールを作製し、このプールからssPrepライブラリーを生成した。これらのライブラリーのシーケンシングからの鋳型長の比率の解析は、ssPrepプロトコールがこの長さ範囲にわたってssDNAライブラリーを生成することを示した(図31、パネルA)。対照として、一本鎖オリゴのこのプールからdsPrepライブラリーを生成することを試みた。このプロトコールは、排他的に一本鎖投入DNAの鋳型を使用してライブラリーを生成することが全くできなかった(ライブラリーは、アダプターダイマーを含有したが、予想されたサイズ分布で検出可能な収量を有さなかった)。
cfDNA断片の大多数は、ヌクレオソームの周りに巻き付いているDNA(細胞死中にヌクレアーゼ分解からのDNAを保護する構成)に由来する。したがって、cfDNA断片のこのゲノムマップ位置を使用して、cfDNA分子の集団を生じさせた組織内のヒストンおよび他のDNA結合タンパク質の位置を推測することができる。この実施例で説明するssPrepのような、一本鎖DNAライブラリー方法は、これらのタンパク質がDNAをエンドヌクレアーゼ活性から保護するので、cfDNA断片のネイティブ末端を保持し、したがって、ヒストンおよび他のDNA結合タンパク質の位置の推測に最大限に有用である。2名の健康な個体(試料Aおよび試料B)からのssPrepデータを組み合わせて30倍のゲノムカバレッジ代表値を得た。これらのデータから、ヌクレオソームおよび他のDNA結合タンパク質の位置取りの態様を明らかにするssPrepライブラリーの能力を調査した。
無細胞DNA用のssPrepキット
この実施例では、一本鎖無細胞DNAからNGSライブラリーを調製するためのキットを説明する。ssPrepキットのワークフローの例を図36に示す。
インデックス後のライブラリー収量は、ライブラリー成功の測度であり、総合的変換性能の間接的測定値である。ssPrepは、高いDNA収量を戻して、シーケンシングおよびシーケンシング前の下流の濃縮に関するユーザーの自由度を大幅に改善する(図39)。
ssPrep cfDNAライブラリーのマッピング性能は、市場に出ている最良の市販キットと比肩する。ssPrepは、短い挿入物(30~100bp)に関するリードのより高いパーセンテージを捕捉して研究者が短いcfDNA断片にコードされた価値のある生物学を利用するのに役立つ点で、他の市販キット以上の働きをする(図40および41を参照されたい)。
ssPrepライブラリーは、約167bpにおけるヒストン単量体を中心とする顕著な断片長分布と、ヌクレオソーム結合DNAの露出した副溝のDNase Iによる切断の結果である可能性が高い10.4bpの周期性を明示するのこぎり歯パターンとを明らかに示す、標準cfDNA分子長プロファイルを生じさせる。ssPrepは、それ自体がdsDNA調製とは(1)比率が増したヌクレオソーム未満のサイズの断片を捕捉し、短いDNA断片を保持するその能力の点、および(2)DNA末端ポリッシングステップを省略してネイティブDNA末端を回復させ、その結果、dsDNA対応物よりわずかに短い副ピークにより実証されるような真の断片長プロファイルを明らかにする点で、区別される(図42A)。ssPrepまたはdsDNA方法とは異なり、Swift Accel NGS 1S Plusデータは、その調製プロセス中に非鋳型ヌクレオチドを加えることに起因して、マッピングの前にリードのトリミングを必要とする。これは、生体シグナル(のこぎり歯パターンなし)を消滅させもし、人工的に挿入物分布をより小さくシフトさせもする(図42B)。
ssPrepは、ライブラリー複雑性を犠牲にすることなくネイティブ末端を保持する。ssPrepは、末端ポリッシングを必要とすることなく、市場に出ている最良の市販キットと比肩する複雑なライブラリーを1ngの投入量から生成する(図43を参照されたい)。
ライブラリー品質のもう1つの測度は、GCスペクトルにわたってのカバレッジである。ssPrepは、NEBNext Ultra IIキットのものと同様の比での低GCリッチ領域におけるゲノムカバレッジ、ヒトゲノムGC含有量ビンの大部分にわたってのほぼ均一なカバレッジ、および他のキットと比較して高いGC含有量を有するエリアのカバレッジ向上を示す(図44を参照されたい)。
無細胞DNAは、原発組織調査、発現相関関係、およびがんの進化などの、多数の生体シグナルを活用するために利用することができる、ヌクレオソーム位置取り情報を含有する。第12染色体からよい位置にあるヌクレオソームの強力に保存される領域についてのssPrep cfDNAライブラリーからの正規化されたウインドウ保護スコア(WPS)を図45に示す。この正弦曲線は、順序付けられたヌクレオソーム位置取りを示し、ピークは、cfDNA断片のヌクレオソーム保護が最も強い位置にある。
核酸断片サイズ濃縮
上記のある特定の実施例で説明した一本鎖ライブラリー調製方法の一部の変形形態では、ライゲーション産物(例えば、本明細書に記載する足場アダプター(またはその成分)にライゲーションした一本鎖試料断片)を、SPRI精製を使用して増幅の前に精製する。この実施例で説明する一部の変形形態では、SPRI精製の前に、ある特定の量の溶出用緩衝液(EB;すなわち、10mM Tris緩衝液)を使用してライゲーション産物の体積を増加させる。一部の変形形態では、緩衝液の体積をイソプロパノールで置き換えて、より小さい断片の保持を増加させた。精製ステップのこの部分でイソプロパノールを添加することにより、アダプターアーチファクト(例えば、アダプターダイマー)の排除について妥協することなく、分解DNA(例えば、分解ヒトDNA)サイズ分布の下端でのきめの細かいカットオフが可能になる。最小のヒト断片を回収しようとしてさほど厳密でないSPRI精製を行なえば、より多くのアダプターアーチファクトが回収される。イソプロパノールの様々な増加量(例えば、2μl、5μl)を使用して、所望のサイズ分布に合わせることができる。
1)50μlのEBを各反応物に添加するか、またはEB体積の一部分をイソプロパノールで置き換える(より高い比率の小さい断片の保持するために)
2)72.6μlの18%PEG SPRIビーズ溶液(すなわち、50μlの試料については、18%SPRIビーズの試料に対する1.2×比)を添加し、SPRI精製を行なう
3)20μlのEBで溶出する
1)50μlのEBを各反応物に添加するか、またはEB体積の一部分をイソプロパノールで置き換える(より高い比率の小さい断片を保持するために)
2)72.6μlの18%PEG SPRIビーズ溶液を添加し、SPRI精製を行なう
3)20μlのEBで溶出する
1)各反応について75μlの総体積のために様々な量のイソプロパノールおよびEBを25μlの試料に添加する
2)72.6μlの18%PEG SPRIビーズ溶液を添加し、SPRI精製を行なう
3)20μlのEBで溶出する
実施形態の例
A1.核酸ライブラリーを生成する方法であって、
(i)一本鎖核酸(ssNA)を含む核酸組成物と、(ii)第1のオリゴヌクレオチドと、(iii)複数の第1の足場ポリヌクレオチド種とを結合させるステップを含み、
(a)複数の第1の足場ポリヌクレオチド種における各ポリヌクレオチドが、ssNAハイブリダイゼーション領域および第1のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含み;
(b)核酸組成物、第1のオリゴヌクレオチド、および複数の第1の足場ポリヌクレオチド種が、第1の足場ポリヌクレオチド種の分子が(i)第1のssNA末端領域および(ii)第1のオリゴヌクレオチドの分子とハイブリダイズされる条件下で結合され、それによって、第1のオリゴヌクレオチドの分子の末端が第1のssNA末端領域の末端に隣接しているハイブリダイゼーション産物が形成される、方法。
(c)複数の第2の足場ポリヌクレオチド種における各ポリヌクレオチドが、ssNAハイブリダイゼーション領域および第2のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含み;
(d)核酸組成物、第2のオリゴヌクレオチド、および複数の第2の足場ポリヌクレオチド種が、第2の足場ポリヌクレオチド種の分子が(i)第2のssNA末端領域および(ii)第2のオリゴヌクレオチドの分子とハイブリダイズされる条件下で結合され、それによって、第2のオリゴヌクレオチドの分子の末端が第2のssNA末端領域の末端に隣接しているハイブリダイゼーション産物が形成される、実施形態A1からA8のいずれか一つの方法。
第1のオリゴヌクレオチドと、
ssNAハイブリダイゼーション領域および第1のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を各々が含む複数の第1の足場ポリヌクレオチド種と
を含む、組成物。
ssNAハイブリダイゼーション領域および第2のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を各々が含む複数の第2の足場ポリヌクレオチド種と
をさらに含む、実施形態B1の組成物。
ssNAハイブリダイゼーション領域および第1のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を各々が含む複数の第1の足場ポリヌクレオチド種と、
第1のオリゴヌクレオチドおよび複数の第1の足場ポリヌクレオチド種を使用して核酸ライブラリーを生成するための使用説明書と
を含む、キット。
ssNAハイブリダイゼーション領域および第2のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を各々が含む複数の第2の足場ポリヌクレオチド種と
をさらに含み、使用説明書が、第1のオリゴヌクレオチド、複数の第1の足場ポリヌクレオチド種、第2のオリゴヌクレオチド、および複数の第2の足場ポリヌクレオチド種を使用して核酸ライブラリーを生成するためのものである、実施形態C1のキット。
(i)一本鎖核酸リボ核酸(ssRNA)または一本鎖相補デオキシリボ核酸(sscDNA)を含む核酸組成物と、(ii)第1のオリゴヌクレオチドと、(iii)複数の第1の足場ポリヌクレオチド種とを結合させるステップを含み、
(a)複数の第1の足場ポリヌクレオチド種における各ポリヌクレオチドが、ssRNAまたはsscDNAハイブリダイゼーション領域、および第1のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含み;および
(b)核酸組成物、第1のオリゴヌクレオチド、および複数の第1の足場ポリヌクレオチド種が、第1の足場ポリヌクレオチド種の分子が(i)第1のssRNAまたはsscDNA末端領域および(ii)第1のオリゴヌクレオチドの分子とハイブリダイズされる条件下で結合され、それによって、第1のオリゴヌクレオチドの分子の末端が第1のssRNAまたはsscDNA末端領域の末端に隣接しているハイブリダイゼーション産物が形成される、方法。
(c)複数の第2の足場ポリヌクレオチド種における各ポリヌクレオチドが、ssRNAまたはsscDNAハイブリダイゼーション領域および第2のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含み;
(d)核酸組成物、第2のオリゴヌクレオチド、および複数の第2の足場ポリヌクレオチド種が、第2の足場ポリヌクレオチド種の分子が(i)第2のssRNAまたはsscDNA末端領域および(ii)第2のオリゴヌクレオチドの分子とハイブリダイズされる条件下で結合され、それによって、第2のオリゴヌクレオチドの分子の末端が第2のssRNAまたはsscDNA末端領域の末端に隣接しているハイブリダイゼーション産物が形成される、実施形態D1からD27のいずれか一つの方法。
第1のオリゴヌクレオチドと、
ssRNAまたはsscDNAハイブリダイゼーション領域および第1のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を各々が含む複数の第1の足場ポリヌクレオチド種と
を含む、組成物。
ssRNAまたはsscDNAハイブリダイゼーション領域および第2のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を各々が含む複数の第2の足場ポリヌクレオチド種と
をさらに含む、実施形態E1の組成物。
ssRNAまたはsscDNAハイブリダイゼーション領域および第1のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を各々が含む複数の第1の足場ポリヌクレオチド種と、
第1のオリゴヌクレオチドおよび複数の第1の足場ポリヌクレオチド種を使用してssRNAまたはsscDNAから核酸ライブラリーを生成するための使用説明書と
を含む、キット。
ssRNAまたはsscDNAハイブリダイゼーション領域および第2のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を各々が含む複数の第2の足場ポリヌクレオチド種と
をさらに含み、使用説明書が、第1のオリゴヌクレオチド、複数の第1の足場ポリヌクレオチド種、第2のオリゴヌクレオチド、および複数の第2の足場ポリヌクレオチド種を使用して核酸ライブラリーを生成するためのものである、実施形態F1のキット。
* * *
Claims (88)
- 核酸ライブラリーを生成する方法であって、
(i)一本鎖核酸(ssNA)を含む核酸組成物と、(ii)第1のオリゴヌクレオチドと、(iii)複数の第1の足場ポリヌクレオチド種とを結合させるステップを含み、
(a)前記複数の第1の足場ポリヌクレオチド種における各ポリヌクレオチドが、ssNAハイブリダイゼーション領域および第1のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含み;
(b)前記核酸組成物、前記第1のオリゴヌクレオチド、および前記複数の第1の足場ポリヌクレオチド種が、前記第1の足場ポリヌクレオチド種の分子が(i)第1のssNA末端領域および(ii)前記第1のオリゴヌクレオチドの分子とハイブリダイズされる条件下で結合され、それによって、前記第1のオリゴヌクレオチドの前記分子の末端が前記第1のssNA末端領域の末端に隣接しているハイブリダイゼーション産物が形成され;
(c)前記ssNAが、前記結合させるステップの前または前記結合させるステップ中に一本鎖核酸結合タンパク質(SSB)と結合されない、方法。 - 前記結合させるステップの前に、前記第1のオリゴヌクレオチドおよび/または前記複数の第1の足場ポリヌクレオチド種と、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、前記第1のオリゴヌクレオチドおよび/または前記複数の第1の足場ポリヌクレオチド種が脱リン酸化される条件下で接触させるステップをさらに含み、それによって、脱リン酸化された第1のオリゴヌクレオチドおよび/または脱リン酸化された第1の足場ポリヌクレオチド種が生成される、請求項1に記載の方法。
- 核酸ライブラリーを生成する方法であって、
第1のオリゴヌクレオチドおよび複数の第1の足場ポリヌクレオチド種と、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記複数の第1の足場ポリヌクレオチド種が脱リン酸化される条件下で接触させるステップであって、それによって、脱リン酸化された第1のオリゴヌクレオチドおよび複数の脱リン酸化された第1の足場ポリヌクレオチド種が生成される、ステップ;および
(i)一本鎖核酸(ssNA)を含む核酸組成物と、(ii)前記脱リン酸化された第1のオリゴヌクレオチドと、(iii)前記複数の脱リン酸化された第1の足場ポリヌクレオチド種とを結合させるステップ
を含み、
(a)前記複数の第1の足場ポリヌクレオチド種における各ポリヌクレオチドが、ssNAハイブリダイゼーション領域および第1のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含み;
(b)前記核酸組成物と、前記脱リン酸化された第1のオリゴヌクレオチドと、前記脱リン酸化された複数の第1の足場ポリヌクレオチド種とが、前記第1の足場ポリヌクレオチド種の分子が(i)第1のssNA末端領域および(ii)前記第1のオリゴヌクレオチドの分子とハイブリダイズされる条件下で結合され、それによって、前記第1のオリゴヌクレオチドの前記分子の末端が前記第1のssNA末端領域の末端に隣接しているハイブリダイゼーション産物が形成される、方法。 - 前記ssNAが、前記結合させるステップの前または前記結合させるステップ中に、一本鎖核酸結合タンパク質(SSB)と結合されない、請求項3に記載の方法。
- 前記結合させるステップの前に、
前記ssNAと、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、前記ssNAが脱リン酸化される条件下で接触させるステップであって、それによって、脱リン酸化ssNAが生成されるステップ;および
第2のオリゴヌクレオチドを前記ssNAの5’末端に共有結合で連結させるステップ
をさらに含み、(i)前記第2のオリゴヌクレオチドが、3’末端にリン酸を含み、(ii)前記第2のオリゴヌクレオチドを共有結合で連結させるステップが、前記ssNAおよび前記第2のオリゴヌクレオチドと、一本鎖リガーゼ活性を有する薬剤とを、前記ssNAの5’末端が前記第2のオリゴヌクレオチドの3’末端に共有結合で連結される条件下で、接触させることを含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。 - 前記核酸組成物と、(iv)第2のオリゴヌクレオチドおよび(v)複数の第2の足場ポリヌクレオチド種とを結合させるステップをさらに含み、
(c)前記複数の第2の足場ポリヌクレオチド種における各ポリヌクレオチドが、ssNAハイブリダイゼーション領域および第2のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含み;
(d)前記核酸組成物、前記第2のオリゴヌクレオチド、および前記複数の第2の足場ポリヌクレオチド種が、前記第2の足場ポリヌクレオチド種の分子が(i)第2のssNA末端領域および(ii)前記第2のオリゴヌクレオチドの分子とハイブリダイズされる条件下で結合され、それによって、前記第2のオリゴヌクレオチドの前記分子の末端が前記第2のssNA末端領域の末端に隣接しているハイブリダイゼーション産物が形成される、
請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。 - 前記結合させるステップの前に、前記第2のオリゴヌクレオチドおよび/または前記複数の第2の足場ポリヌクレオチド種と、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、前記第2のオリゴヌクレオチドおよび/または前記複数の第2の足場ポリヌクレオチド種が脱リン酸化される条件下で接触させるステップをさらに含み、それによって、脱リン酸化された第2のオリゴヌクレオチドおよび/または脱リン酸化された第2の足場ポリヌクレオチド種が生成される、請求項6に記載の方法。
- 前記結合させるステップの前に、前記第1の足場ポリヌクレオチド種の各々が、第1のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされて複数の第1の足場二重鎖種を形成し、前記第2の足場ポリヌクレオチド種の各々が、第2のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされて複数の第2の足場二重鎖種を形成する、請求項6または7に記載の方法。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第1のssNA末端領域の隣接している末端を共有結合で連結させるステップ、ならびに前記第2のオリゴヌクレオチドおよび前記第2のssNA末端領域の隣接している末端を共有結合で連結させるステップをさらに含み、それによって共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物を生成する、請求項6から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記共有結合で連結させるステップが、前記ハイブリダイゼーション産物と、リガーゼ活性を有する薬剤とを、前記第1のssNA末端領域の末端が前記第1のオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結され、かつ前記第2のssNA末端領域の末端が前記第2のオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で、接触させることを含む、請求項9に記載の方法。
- 前記複数の第1の足場二重鎖種における二重鎖の一部またはすべてが、前記第1のオリゴヌクレオチドの5’末端にアデニル化修飾を含み、前記複数の第1の足場二重鎖種が、ATPの非存在下で前記ssNAと結合され、前記ssNAに共有結合で連結され、それによって、共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物中間体が形成される、請求項8に記載の方法。
- 前記共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物中間体が、前記複数の第2の足場二重鎖種およびATPと結合され、前記複数の第2の足場二重鎖種およびATPに共有結合で連結され、それによって共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物が形成される、請求項11に記載の方法。
- 前記結合させるステップおよび前記共有結合で連結させるステップが、30分またはそれ未満で行なわれる、請求項9から12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合させるステップおよび前記共有結合で連結させるステップが、単一容器内で行なわれる、請求項9から13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のポリヌクレオチド種の各々についての前記ssNAハイブリダイゼーション領域が、前記複数の第1のポリヌクレオチド種の中の他の第1のポリヌクレオチド種におけるssNAハイブリダイゼーション領域とは異なる、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のポリヌクレオチド種の各々についての前記ssNAハイブリダイゼーション領域が、前記複数の第2のポリヌクレオチド種の中の他の第2のポリヌクレオチド種におけるssNAハイブリダイゼーション領域とは異なる、請求項6から15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ssNAハイブリダイゼーション領域が、ランダム配列を含む、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ssNAハイブリダイゼーション領域が、1つまたは複数のユニバーサル塩基を含む、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- a)前記第1のオリゴヌクレオチドが、
(i)第1のプライマー結合ドメイン、
(ii)第1のシーケンシングアダプター、もしくはその一部、
(iii)固有分子識別子(UMI)、および
(iv)インデックス
のうちの1つまたは複数を含み、
b)前記第1のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、
(i)前記第1のプライマー結合ドメインに相補的なポリヌクレオチド、
(ii)前記第1のシーケンシングアダプター、もしくはその一部、に相補的なポリヌクレオチド、
(iii)前記固有分子識別子(UMI)に相補的なポリヌクレオチド、および
(iv)前記インデックスに相補的なポリヌクレオチド
のうちの1つまたは複数を含む、
請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。 - a)前記第2のオリゴヌクレオチドが、
(i)第2のプライマー結合ドメイン、
(ii)第2のシーケンシングアダプター、もしくはその一部、
(iii)固有分子識別子(UMI)、および
(iv)インデックス
のうちの1つまたは複数を含み、
b)前記第2のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、
(i)前記第2のプライマー結合ドメインに相補的なポリヌクレオチド、
(ii)前記第2のシーケンシングアダプター、もしくはその一部、に相補的なポリヌクレオチド、
(iii)前記固有分子識別子(UMI)に相補的なポリヌクレオチド、および
(iv)前記インデックスに相補的なポリヌクレオチド
のうちの1つまたは複数を含む、
請求項6から19のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第1のオリゴヌクレオチドが、1つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含むか、前記第1の足場ポリヌクレオチド種の一部もしくはすべてが、1つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含むか、または前記第1のオリゴヌクレオチドが、1つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含み、かつ前記第1の足場ポリヌクレオチド種の一部もしくはすべてが、1つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のオリゴヌクレオチドが、1つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含むか、前記第2の足場ポリヌクレオチド種の一部もしくはすべてが、1つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含むか、または前記第2のオリゴヌクレオチドが、1つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含み、かつ前記第2の足場ポリヌクレオチド種の一部もしくはすべてが、1つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項6から21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、別のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸分子への前記オリゴヌクレオチドの共有結合性連結を遮断することができる、請求項21または22に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、前記ssNAに隣接していない末端に前記1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項21、22または23に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、別のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸分子への前記足場ポリヌクレオチドの共有結合性連結を遮断することができる、請求項21から24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記足場ポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドの一方または両方の末端に前記1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項21から25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、ライゲーションを遮断する修飾を含む、請求項21から26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物を変性させるステップをさらに含み、それによって一本鎖ライゲーション産物が生成される、請求項9から27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記一本鎖ライゲーション産物と、第3のオリゴヌクレオチドとを、前記第3のオリゴヌクレオチドが、前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第2のオリゴヌクレオチドのダイマーとハイブリダイズされる条件下で結合させるステップをさらに含み、それによって、オリゴヌクレオチドダイマーハイブリダイゼーション産物が形成される、請求項28に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドダイマーハイブリダイゼーション産物が、切断部位を含む、請求項29に記載の方法。
- 前記切断部位が、制限酵素認識部位である、請求項30に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドダイマーハイブリダイゼーション産物と切断剤とを接触させるステップをさらに含む、請求項29から31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の足場ポリヌクレオチド種および/または前記第2の足場ポリヌクレオチド種が、DNAを含む、請求項6から32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の足場ポリヌクレオチド種および/または前記第2の足場ポリヌクレオチド種が、RNAを含む、請求項6から32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドおよび/または前記第2のオリゴヌクレオチドが、DNAを含む、請求項6から34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドおよび/または前記第2のオリゴヌクレオチドが、RNAを含む、請求項6から34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合させるステップの前に、前記核酸組成物とヌクレアーゼとを接触させるステップを含む、請求項1から36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが、二本鎖特異的ヌクレアーゼである、請求項37に記載の方法。
- 前記核酸組成物が、一本鎖DNA(ssDNA)を含むか、一本鎖RNA(ssRNA)を含むか、またはssDNAおよびssRNAを含む、請求項1から38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ssNAが、前記結合させるステップの前に修飾されない、請求項1から39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ssNAが前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記複数の第1の足場ポリヌクレオチド種と結合されたとき、前記ssNAの一方または両方のネイティブ末端が存在する、請求項1から40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ssNAが、無細胞核酸からのものである、請求項1から41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸組成物が、ssNAから本質的になる、請求項1から42のいずれか一項に記載の方法。
- 第1のオリゴヌクレオチドと、
ssNAハイブリダイゼーション領域および第1のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を各々が含む複数の第1の足場ポリヌクレオチド種と
を含む、SSB不含組成物。 - 前記第1のオリゴヌクレオチドおよび/または前記複数の第1の足場ポリヌクレオチド種が、脱リン酸化されている、請求項44に記載の組成物。
- 脱リン酸化された第1のオリゴヌクレオチドと、
ssNAハイブリダイゼーション領域および第1のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を各々が含む複数の脱リン酸化された第1の足場ポリヌクレオチド種と
を含む、組成物。 - SSB不含一本鎖核酸(ssNA)を含む核酸組成物をさらに含む、請求項44、45または46に記載の組成物。
- 第2のオリゴヌクレオチドと、
ssNAハイブリダイゼーション領域および第2のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を各々が含む複数の第2の足場ポリヌクレオチド種と
をさらに含む、請求項44から47のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記第2のオリゴヌクレオチドおよび/または前記複数の第2の足場ポリヌクレオチド種が、脱リン酸化されている、請求項48に記載の組成物。
- 前記第1の足場ポリヌクレオチド種の各々が第1のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされている、複数の第1の足場二重鎖種と、前記第2の足場ポリヌクレオチド種の各々が第2のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされている、複数の第2の足場二重鎖種とを含む、請求項48または49に記載の組成物。
- オリゴヌクレオチドの末端をssNA末端領域の末端に共有結合で連結させるための薬剤をさらに含む、請求項44から50のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記薬剤が、リガーゼである、請求項51に記載の組成物。
- 前記リガーゼが、T4リガーゼである、請求項52に記載の組成物。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドまたは前記第2のオリゴヌクレオチドが、3’リン酸を含む、請求項44から53のいずれか一項に記載の組成物。
- ssNA末端領域の5’末端を、前記3’リン酸を含む前記第1のオリゴヌクレオチドまたは前記3’リン酸を含む前記第2のオリゴヌクレオチドの3’末端に、共有結合で連結させるための薬剤をさらに含む、請求項54に記載の組成物。
- 前記薬剤が、一本鎖リガーゼである、請求項55に記載の組成物。
- 前記リガーゼが、RtcBリガーゼである、請求項56に記載の組成物。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドまたは前記第2のオリゴヌクレオチドが、5’末端にアデニル化修飾を含む、請求項44から53のいずれか一項に記載の組成物。
- ATP不含である、請求項58に記載の組成物。
- 前記第1の足場ポリヌクレオチド種の各々についての前記ssNAハイブリダイゼーション領域が、前記複数の第1の足場ポリヌクレオチド種の中の他の第1の足場ポリヌクレオチド種におけるssNAハイブリダイゼーション領域とは異なる、請求項44から59のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第2の足場ポリヌクレオチド種の各々についての前記ssNAハイブリダイゼーション領域が、前記複数の第2の足場ポリヌクレオチド種の中の他の第2の足場ポリヌクレオチド種におけるssNAハイブリダイゼーション領域とは異なる、請求項48から60のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ssNAハイブリダイゼーション領域が、ランダム配列を含む、実施形態44から61のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ssNAハイブリダイゼーション領域が、1つまたは複数のユニバーサル塩基を含む、実施形態44から62のいずれか一項に記載の組成物。
- a)前記第1のオリゴヌクレオチドが、
(i)第1のプライマー結合ドメイン、
(ii)第1のシーケンシングアダプター、もしくはその一部、
(iii)固有分子識別子(UMI)、および
(iv)インデックス
のうちの1つまたは複数を含み、
b)前記第1のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、
(i)前記第1のプライマー結合ドメインに相補的なポリヌクレオチド、
(ii)前記第1のシーケンシングアダプター、もしくはその一部、に相補的なポリヌクレオチド、
(iii)前記固有分子識別子(UMI)に相補的なポリヌクレオチド、および
(iv)前記インデックスに相補的なポリヌクレオチド
のうちの1つまたは複数を含む、
請求項44から63のいずれか一項に記載の組成物。 - a)前記第2のオリゴヌクレオチドが、
(i)第2のプライマー結合ドメイン、
(ii)第2のシーケンシングアダプター、もしくはその一部、
(iii)固有分子識別子(UMI)、および
(iv)インデックス
のうちの1つまたは複数を含み、
b)前記第2のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、
(i)前記第2のプライマー結合ドメインに相補的なポリヌクレオチド、
(ii)前記第2のシーケンシングアダプター、もしくはその一部、に相補的なポリヌクレオチド、
(iii)前記固有分子識別子(UMI)に相補的なポリヌクレオチド、および
(iv)前記インデックスに相補的なポリヌクレオチド
のうちの1つまたは複数を含む、
請求項48から64のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第1のオリゴヌクレオチドが、1つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含むか、前記第1の足場ポリヌクレオチド種の一部もしくはすべてが、1つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含むか、または前記第1のオリゴヌクレオチドが、1つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含み、かつ前記第1の足場ポリヌクレオチド種の一部もしくはすべてが、1つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項44から65のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第2のオリゴヌクレオチドが、1つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含むか、前記第2の足場ポリヌクレオチド種の一部もしくはすべてが、1つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含むか、または前記第2のオリゴヌクレオチドが、1つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含み、かつ前記第2の足場ポリヌクレオチド種の一部もしくはすべてが、1つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項48から66のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記1つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、別のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸分子への前記オリゴヌクレオチドの共有結合性連結を遮断することができる、請求項66または67に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが、ssNA末端領域に隣接することにならない末端に前記1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項66、67または68に記載の組成物。
- 前記1つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、別のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸分子への前記足場ポリヌクレオチドの共有結合性連結を遮断することができる、請求項66から69のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記足場ポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドの一方または両方の末端に前記1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項66から70のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記1つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、ライゲーションを遮断する修飾を含む、請求項66から71のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第2のオリゴヌクレオチドのダイマーとハイブリダイズすることができる、第3のオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項48から72のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第3のオリゴヌクレオチドが、前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第2のオリゴヌクレオチドのダイマーとハイブリダイズされたときに切断部位を形成する配列を含む、請求項73に記載の組成物。
- 前記切断部位が、制限酵素認識部位である、請求項74に記載の組成物。
- 切断剤をさらに含む、請求項73から75のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1の足場ポリヌクレオチド種および/または前記第2の足場ポリヌクレオチド種が、DNAを含む、請求項48から76のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1の足場ポリヌクレオチド種および/または前記第2の足場ポリヌクレオチド種が、RNAを含む、請求項48から76のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドおよび/または前記第2のオリゴヌクレオチドが、DNAを含む、請求項48から78のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドおよび/または前記第2のオリゴヌクレオチドが、RNAを含む、請求項48から78のいずれか一項に記載の組成物。
- ヌクレアーゼをさらに含む、請求項44から80のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ヌクレアーゼが、二本鎖特異的ヌクレアーゼである、請求項81に記載の組成物。
- 前記核酸組成物が、一本鎖DNA(ssDNA)を含むか、一本鎖RNA(ssRNA)を含むか、またはssDNAおよびssRNAを含む、請求項44から82のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ssNAが、未修飾ssNAである、請求項44から83のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ssNAが、一方の末端または両方の末端にネイティブ末端を含む、請求項44から84のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ssNAが、無細胞核酸からのものである、請求項44から85のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記核酸組成物が、ssNAから本質的になる、請求項44から86のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項44から87のいずれか一項に記載の組成物と使用説明書とを含むキット。
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