JP2022528139A - 核酸を解析するための方法および組成物 - Google Patents

核酸を解析するための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

本技術は、一部は、核酸を解析するための方法および組成物に関する。一部の態様では、本技術は、一本鎖核酸断片から核酸ライブラリーを調製するための方法および組成物に関する。上記方法は、（ｉ）一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を含む核酸組成物と、（ｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドと、（ｉｉｉ）複数の第１の足場ポリヌクレオチド種とを結合させるステップを含み、（ａ）前記複数の第１の足場ポリヌクレオチド種における各ポリヌクレオチドが、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含み得る。

Description

関連特許出願
本特許出願は、発明の名称がMETHODS AND COMPOSITIONS FOR ANALYZING NUCLEIC ACIDであり、発明者としてKelly M. HARKINS KINCAIDらを記名し、代理人整理番号ＣＢＳ－２００２－ＰＶにより指定される、２０１９年４月５日に出願した米国仮特許出願第６２／８３０，２１１号の利益を主張するものである。本特許出願は、発明の名称がMETHODS AND COMPOSITIONS FOR ANALYZING NUCLEIC ACIDであり、発明者としてKelly M. HARKINS KINCAIDらを記名し、代理人整理番号ＣＢＳ－２００２－ＰＶ２により指定される、２０１９年６月１４日に出願した米国仮特許出願第６２／８６１，５９４号の利益を主張するものでもある。本特許出願は、発明の名称がMETHODS AND COMPOSITIONS FOR ANALYZING NUCLEIC ACIDであり、発明者としてKelly M. HARKINS KINCAIDらを記名し、代理人整理番号ＣＢＳ－２００２－ＰＶ３により指定される、２０１９年１０月２３日に出願した米国仮特許出願第６２／９２５，１３２号の利益を主張するものでもある。上述の出願の全内容は、本文、表および図面すべてを含めて、参照により本明細書に組み込まれる。
分野
本技術は、一部は、核酸を解析するための方法および組成物に関する。一部の態様では、本技術は、一本鎖核酸断片からの核酸ライブラリーを調製するための方法および組成物に関する。
背景
生命体（例えば、動物、植物および微生物）および遺伝情報を複製する他の形態（例えば、ウイルス）の遺伝情報は、核酸（すなわち、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ））にコードされている。遺伝情報は、化学的核酸または仮説的核酸の一次構造に相当するひと続きのヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドである。
様々なハイスループットシーケンシングプラットフォームが、核酸を解析するために使用される。例えば、ＩＬＬＵＭＩＮＡプラットフォームは、アダプターがライゲーションされたＤＮＡ断片のクローン増幅を含む。別のプラットフォームは、核酸分子または個々のヌクレオチドが小さいチャネルを通って移行することに依拠する、ナノポアに基づくシーケンシングである。ある特定のシーケンシングプラットフォームのライブラリー調製は、ＤＮＡの断片化、断片末端の修飾、およびアダプターのライゲーションを含むことが多く、核酸断片の増幅（例えば、ＰＣＲ増幅）を含むことがある。
特定のタイプの核酸解析のための適切なシーケンシングプラットフォームの選択は、誤りの原因、誤り率、ならびにシーケンシングの速度およびコストを含む、利用可能な技術についての詳細な理解を必要とする。シーケンシングコストは低下してきたが、ライブラリー調製のスループットおよびコストは、制限要因であり得る。ライブラリー調製の一態様は、核酸断片の末端を、それらが特定のシーケンシングプラットフォームに好適であるように、修飾することを含む。核酸末端は、有用な情報を含有し得る。したがって、核酸末端に含有されている情報を保存しつつ、核酸末端を（例えば、ライブラリー調製のために）修飾する方法は、核酸の処理および解析に有用であると予想される。
ライブラリー調製の別の態様は、一本鎖核酸断片を捕捉することを含む。ある特定の事例では、一本鎖ライブラリー調製方法は、旧来の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）調製方法と比較してより良好でより複雑なライブラリーを生成することができる。
一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリーの生成の欠点としては、労力集約的で費用がかかり、かつ時間がかかるプロトコール、および新奇のまたは特別注文の試薬の要件が挙げられる。したがって、労力集約的で費用がかかり、かつ時間がかかるプロトコールおよび／または新奇のもしくは特別注文の試薬を必要とすることなく、一本鎖核酸を（例えば、ライブラリー調製のために）捕捉する方法は、核酸（例えば、一本鎖核酸、変性された二本鎖核酸、または一本鎖核酸を含有する混合物）の処理および解析に有用であると予想される。
ライブラリー調製の別の態様は、一本鎖ＲＮＡ断片を捕捉することを含む。一般に、既存のＲＮＡライブラリー調製方法は、逆転写酵素を使用するＲＮＡからの第１鎖ＤＮＡ合成のみならず、下流の二本鎖シーケンシングアダプターライゲーションに適合するｃＤＮＡ分子を作製するための第２鎖合成も必要とする。多くの場合、転写物が転写されることになるゲノムＤＮＡ鎖について正確な評定を行なうことができるように鎖ＲＮＡシーケンシングライブラリーを生成することが望ましい。鎖ＲＮＡシーケンシングライブラリーを作出するために、方法は、シーケンシングアダプターライゲーション後に第２のＤＮＡ鎖を分解するステップを含み得る。しかし、ＲＮＡの事前分解前に第２鎖ＤＮＡ合成を行なうことは、結果として得られるＲＮＡシーケンシングデータを畳み込んでライブラリーの鎖の数を部分的に分かりにくくする第３およびときには第４鎖合成副産物を作出し得る点で、問題が多い。したがって、第２鎖合成を必要することなく一本鎖ＲＮＡを（例えば、ライブラリー調製のために）捕捉する方法は、ＲＮＡを含有する核酸の処理および解析に有用であると予想される。
要旨
一部の態様では、核酸ライブラリーを生成する方法であって、（ｉ）一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を含む核酸組成物と、（ｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドと、（ｉｉｉ）複数の第１の足場ポリヌクレオチド種とを結合させるステップを含み、（ａ）複数の第１の足場ポリヌクレオチド種における各ポリヌクレオチドが、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含み；（ｂ）核酸組成物、第１のオリゴヌクレオチド、および複数の第１の足場ポリヌクレオチド種が、第１の足場ポリヌクレオチド種の分子が、（ｉ）第１のｓｓＮＡ末端領域および（ｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドの分子とハイブリダイズされる条件下で結合され、それによって、第１のオリゴヌクレオチドの分子の末端が第１のｓｓＮＡ末端領域の末端に隣接しているハイブリダイゼーション産物が形成される、方法が、提供される。一部の態様では、方法は、結合させるステップの前に、第１のオリゴヌクレオチドおよび／または複数の第１の足場ポリヌクレオチド種と、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、第１のオリゴヌクレオチドおよび／または複数の第１の足場ポリヌクレオチド種が脱リン酸化される条件下で接触させるステップを含み、それによって、脱リン酸化された第１のオリゴヌクレオチドおよび／または脱リン酸化された第１の足場ポリヌクレオチド種が生成される。一部の態様では、方法は、ｓｓＮＡからライブラリーを生成するための、ＳＳＢ不使用の方法である。
一部の態様では、一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を含む核酸組成物と、第１のオリゴヌクレオチドと、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を各々が含む複数の第１の足場ポリヌクレオチド種とを含む、組成物も提供される。
一部の態様では、第１のオリゴヌクレオチドと、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を各々が含む複数の第１の足場ポリヌクレオチド種と、第１のオリゴヌクレオチドおよび複数の第１の足場ポリヌクレオチド種を使用して核酸ライブラリーを生成するための使用説明書とを含む、キットも提供される。
一部の態様では、核酸ライブラリーを生成するための方法であって、（ｉ）一本鎖リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）または一本鎖相補デオキシリボ核酸（ｓｓｃＤＮＡ）を含む核酸組成物と、（ｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドと、（ｉｉｉ）複数の第１の足場ポリヌクレオチド種とを結合させるステップを含み、（ａ）複数の第１の足場ポリヌクレオチド種における各ポリヌクレオチドが、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域、および第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含み；（ｂ）核酸組成物、第１のオリゴヌクレオチド、および複数の第１の足場ポリヌクレオチド種が、第１の足場ポリヌクレオチド種の分子が（ｉ）第１のｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡ末端領域および（ｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドの分子とハイブリダイズされる条件下で結合され、それによって、第１のオリゴヌクレオチドの分子の末端が第１のｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡ末端領域の末端に隣接しているハイブリダイゼーション産物が形成される、方法が提供される。一部の態様では、方法は、結合させるステップの前に、第１のオリゴヌクレオチドおよび／または複数の第１の足場ポリヌクレオチド種と、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、第１のオリゴヌクレオチドおよび／または複数の第１の足場ポリヌクレオチド種が脱リン酸化される条件下で接触させるステップを含み、それによって、脱リン酸化された第１のオリゴヌクレオチドおよび／または脱リン酸化された第１の足場ポリヌクレオチド種が生成される。一部の態様では、方法は、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡからライブラリーを生成するための、ＳＳＢ不使用の方法である。
一部の態様では、一本鎖リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）または一本鎖相補デオキシリボ核酸（ｓｓｃＤＮＡ）を含む核酸組成物と、第１のオリゴヌクレオチドと、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を各々が含む複数の第１の足場ポリヌクレオチド種とを含む、組成物も提供される。
一部の態様では、第１のオリゴヌクレオチドと、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を各々が含む複数の第１の足場ポリヌクレオチド種と、第１のオリゴヌクレオチドおよび複数の第１の足場ポリヌクレオチド種を使用してｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡから核酸ライブラリーを生成するための使用説明書とを含む、キットも提供される。
ある特定の実施形態は、下記の説明、実施例、特許請求の範囲および図面でさらに説明される。
図面は、本技術のある特定の実施形態の説明に役立つものであり、限定するものではない。説明を明確かつ容易にするために、図面は、正確な縮尺で作成されたものではなく、一部の事例では、様々な態様が、特定の実施形態の理解を助長するために、誇張または拡大して示されることがある。
図１は、本明細書に記載されるある特定のライブラリー調製方法についての一般的なワークフローを示す。Ｐ５アダプターの末端における、Ｐ７アダプターの末端における、およびＰ５／Ｐ７足場ポリヌクレオチドの末端における黒塗りの山形は、遮断する修飾を表す。
図２Ａは、超熱安定性一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＥＴ ＳＳＢ）を使用してまたは使用せずに作製されたｓｓＤＮＡライブラリーについての分子ＱＣメトリクスを示す。 図２Ｂは、ＥＴ ＳＳＢを使用してまたは使用せずに生成されたｓｓＤＮＡライブラリーについてのＩＬＬＵＭＩＮＡ ＨＩＳＥＱシーケンシングメトリクスを示す。２つの試料等分散ｔ検定は、シーケンシングメトリクスの有意な差がないことを示した。
図３Ａは、ＳＳＢの存在を用いて（上）および用いずに（下）生成された、１ｎｇの無細胞ＤＮＡからのｓｓＤＮＡ最終ライブラリー産物サイズ分布を示す。 図３Ｂは、２つのｃｆＤＮＡライブラリー（ＳＳＢを用いてまたは用いずに生成された）のシーケンシングデータから推測された挿入物長分布のオーバーラップを示す。
図４は、迅速エビアルカリホスファターゼ（ｒＳＡＰ）を使用するＰ５／Ｐ７アダプターの脱リン酸化前処理の後の、Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計により測定したライブラリー収量（上）、およびアダプターダイマー％（下）を示す。ｒＳＡＰ処理後、ライブラリー収量は増加し、アダプターダイマーに起因するアーチファクトの量は減少する。
図５Ａおよび図５Ｂは、ｓｓＤＮＡライブラリーライゲーションステップ中の完全インデックス付加シーケンシングアダプターと足場のライゲーションを含む、ＰＣＲ不使用のアプローチを示す。このようなアダプターは、固有分子識別子（ＵＭＩ）を含有することもあり、またはしないこともある。 図５Ａおよび図５Ｂは、ｓｓＤＮＡライブラリーライゲーションステップ中の完全インデックス付加シーケンシングアダプターと足場のライゲーションを含む、ＰＣＲ不使用のアプローチを示す。このようなアダプターは、固有分子識別子（ＵＭＩ）を含有することもあり、またはしないこともある。
図６Ａおよび図６Ｂは、固有分子識別子（ＵＭＩ）を有する足場アダプター構成を示す。図６Ａは、ＵＭＩが鋳型に隣接している構成を示す。図６Ｂは、ＵＭＩがインデックスポリヌクレオチドに隣接している構成を示す。 図６Ａおよび図６Ｂは、固有分子識別子（ＵＭＩ）を有する足場アダプター構成を示す。図６Ａは、ＵＭＩが鋳型に隣接している構成を示す。図６Ｂは、ＵＭＩがインデックスポリヌクレオチドに隣接している構成を示す。
図７は、単一プライマー伸長を使用するインデックスＰＣＲの前の足場アダプターライゲーション後の固有分子識別子（ＵＭＩ）およびＰ７インデックス付加アダプターの組込みの例を示す。
図８は、ヘアピン足場アダプター設計の例を示す。
図９は、段階的なライゲーションおよび酵素遅延を伴うワークフローの例を示す。Ｘ、遮断する修飾。５’Ｐ、５’リン酸。５’ＯＨ、５’ヒドロキシル。３’ＯＨ、３’ヒドロキシル。Ｎ、任意のヌクレオチド。
図１０は、５’Ａｐｐ修飾とＡＴＰ遅延とを有するＰ７足場アダプターを使用する段階的なライゲーションを用いるワークフローの例を示す。Ｘ、遮断する修飾。５’Ａｐｐ、５’－アデニル化ＤＮＡ。５’Ｐ、５’リン酸。３’ＯＨ、３’ヒドロキシル。Ｎ、任意のヌクレオチド。
図１１は、３’リン鎖を有する一本鎖Ｐ５アダプターを使用する段階的なライゲーションを用いるワークフローの例を示す。Ｘ、遮断する修飾。３’Ｐ、３’リン酸。５’Ｐ、５’リン酸。３’ＯＨ、３’ヒドロキシル。５’ＯＨ、５’ヒドロキシル。Ｎ、任意のヌクレオチド。
図１２は、ランダムヘキサマー、オクタマーおよびアンカー型ポリＴプライマーならびにＭｕ－ＭＬＶ逆転写酵素（社内プロトコール）、またはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＲＮＡ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ合成モジュール（市販プロトコール）を使用して合成された第１鎖ｃＤＮＡから生成された４つのｓｓＤＮＡライブラリーのｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎトレースを示す。ｉおよびｉｉは、社内プロトコールの技術的反復実験であり、ｉｉｉおよびｉｖは、市販プロトコールの技術的反復実験である。
図１３は、ランダムヘキサマー、オクタマーおよびアンカー型ポリＴプライマーならびにＭｕ－ＭＬＶ逆転写酵素（社内プロトコール）、またはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＲＮＡ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ合成モジュール（市販のプロトコール）を使用して合成された第１鎖ｃＤＮＡから生成された４つのｓｓＤＮＡライブラリーの分子メトリクスを示す。上のパネル：最終ＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリーのゲル画像。下のパネル：ライブラリー収量（ｎｇ／μｌ）およびサイズ（ｂｐ）を示す表。ｉおよびｉｉは、社内プロトコールの技術的反復実験であり、ｉｉｉおよびｉｖは、市販プロトコールの技術的反復実験である。
図１４は、社内プロトコール（ランダムヘキサマー、オクタマーおよびアンカー型ポリＴプライマーならびにＭｕ－ＭＬＶ逆転写酵素）、または市販プロトコール（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＲＮＡ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ合成モジュール）を使用して合成された第１鎖ｃＤＮＡから生成されたｓｓＤＮＡライブラリーについての、ＳＴＡＲアライナーを使用して生成されたシーケンシングメトリクスを示す表を提供する。高品質ライブラリーの典型的なＲＮＡ－Ｓｅｑメトリクスは、ａ）ライブラリーの７０～９０％についての一意的にマッピングされたリード、およびｂ）約５の複数の遺伝子座にマッピングされたリード％（そのようなメトリクスが灰色で示されている）を含み得る。表に与えられているデータは、ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリー生成の成功を示す。
図１５は、ＲＮＡ－Ｓｅｑの一本鎖調製のための方法の全体像、ならびに第１鎖ｃＤＮＡ合成後の一本鎖足場アダプターライゲーション技術の詳細を示す概略図を示す。
図１６は、ＲＮＡ－Ｓｅｑの一本鎖調製のための方法の全体像、ならびにＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを作出する一本鎖足場アダプターライゲーション技術、続いてのｃＤＮＡ第１鎖合成の詳細を示す概略図を示す。
図１７は、本明細書に記載されるｓｓＤＮＡ／ｓｓＲＮＡライゲーション反応の前または後に行なうことができる様々なワークフローを示す。
図１８は、アダプターダイマーのパーセンテージが高い試料についての連続的１．２×固相可逆的固定法（ＳＰＲＩ）クリーンの結果を示す。
図１９は、逐次的０．６×ＳＰＲＩ＋０．６×ＳＰＲＩクリーンの結果を示す。
図２０は、推定アダプターダイマー形成、一本鎖形態のアダプターダイマー、およびそのような一本鎖アダプターダイマーにのみアニールするオリゴの付加の例を示す。一例では、二本鎖ハイブリダイゼーション産物が形成されるときにＸｂａＩ認識部位が形成する。
図２１は、定方向ＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリー調製ＮＧＳアッセイについてのワークフローの例を示す。
図２２は、本明細書に記載されるＲＮＡの一本鎖ライブラリー調製（ｓｓＰｒｅｐ）についての１～２０ｎｇのｍＲＮＡ投入物からのライブラリー収量を示す。投入物濃度ごとに反復実験の代表値が示されている。１ｎｇの投入物（１１ＰＣＲサイクルで増幅した）を除いて、すべてのライブラリーを９サイクルで増幅した。ＱＵＡＮＴ－ＩＴ ｄｓＤＮＡ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙキットを使用してライブラリーを定量化した。
図２３は、本明細書に記載されるＲＮＡの一本鎖ライブラリー調製（ｓｓＰｒｅｐ）と、３つの市販の二本鎖ライブラリー調製（ｄｓＰｒｅｐ）キット（すなわち、ＮＥＢＮＥＸＴ ＵＬＴＲＡ ＩＩ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＲＮＡ－Ｓｅｑキット；ＮＵＧＥＮ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｍＲＮＡライブラリーキット；およびＴＲＵＳＥＱ ｍＲＮＡ Ｓｔｒａｎｄｅｄライブラリーキット）との比較を示す表を提供する。投入量範囲、ワークフロー時間、およびＰＣＲサイクルの比較が示されている。
図２４は、本明細書に記載されるＲＮＡの一本鎖ライブラリー調製（ｓｓＰｒｅｐ）または市販の二本鎖ライブラリー調製（ｄｓＰｒｅｐ）キット（すなわち、ＮＥＢＮＥＸＴ ＵＬＴＲＡ ＩＩ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＲＮＡ－Ｓｅｑキット）から生成されたヒトリードについての収量およびマッピングメトリクスの比較を示す表を提供する。ｓｓＰｒｅｐおよびｄｓＰｒｅｐの複製ライブラリーからのシーケンシングデータを、ヒト参照ゲノム（ｈｇ１９）にマッピングした。ｓｓＰｒｅｐライブラリーのほうが、末端ポリッシングの欠如に恐らく起因して、マッピングされた長さが短かった。
図２５は、市販の二本鎖ライブラリー調製（ｄｓＰｒｅｐ）キット（すなわち、ＮＥＢＮＥＸＴ ＵＬＴＲＡ ＩＩ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＲＮＡ－Ｓｅｑキット）に対する、本明細書に記載されるＲＮＡの一本鎖ライブラリー調製（ｓｓＰｒｅｐ）についての、性能メトリクスを示す。上のパネル：両方の方法により生成された複製ライブラリーについてのマッピングメトリクス代表値。両方のライブラリーが、約９０％の一意的にマッピングされたリード、および約５％のリボソームリードを有した。リードの約９３％は、正しい鎖にマッピングした。下のパネル：ρ約０．９５のスピアマン相関係数が、両方の方法についてのおよび互いの反復実験の正規化されたリードカウント（ヒト）間で観察された。ペアワイズ相関係数が、四角の中に提供されている。
図２６は、市販の二本鎖ライブラリー調製（ｄｓＰｒｅｐ）キット（すなわち、ＮＥＢＮＥＸＴ ＵＬＴＲＡ ＩＩ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＲＮＡ－Ｓｅｑキット）に対して本明細書に記載されるＲＮＡの一本鎖ライブラリー調製（ｓｓＰｒｅｐ）を比較するデータを示す。上のパネル：Ｐｉｃａｒｄ Ｔｏｏｌｓ ＣｏｌｌｅｃｔＲＮＡＳｅｑＭｅｔｒｉｃｓを使用してＧｅｎｅ ｂｏｄｙカバレッジを計算した；転写物の全長にわたっての正規化されたカバレッジが、ｓｓＰｒｅｐおよびｄｓＰｒｅｐの複製ライブラリーについて示されている。中央パネル：Ｐｉｃａｒｄ Ｔｏｏｌｓ ＣｏｌｌｅｃｔＲＮＡＳｅｑＭｅｔｒｉｃｓを使用してリードのゲノム分布を計算し、コード領域、非翻訳（ＵＴＲ）領域、イントロン領域および遺伝子間領域の平均的組成をプロットした。両方の方法が最小の遺伝子間領域を捕捉した。ｓｓＰｒｅｐは、より均一なＧｅｎｅ ｂｏｄｙカバレッジのため、より多くの非翻訳領域を捕捉した。下のパネル：２つの方法により捕捉された差次的ＧＣ組成。外部ＲＮＡ標準コンソーシアム（ＥＲＣＣ）スパイクイン対照のＧＣ分布が挿入図に示されている。パーセンテージは、各ライブラリーについての実測ＧＣ組成を示す。
図２７は、本明細書に記載されるＲＮＡの一本鎖ライブラリー調製（ｓｓＰｒｅｐ）または市販の二本鎖ライブラリー調製（ｄｓＰｒｅｐ）キット（すなわち、ＮＥＢＮＥＸＴ ＵＬＴＲＡ ＩＩ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＲＮＡ－Ｓｅｑキット）を使用して生成されたライブラリーについての、ＥＲＣＣ参照ゲノムにマッピングするリードの数および正しい鎖へのマッピングパーセントを示す表を提供する。両方のタイプのライブラリーが、＞３００，０００の対照リード、正しい鎖にマッピングされた＞９９％のリードを有した。
図２８は、一本鎖ライブラリー調製（ｓｓＰｒｅｐ）方法の模式的全体像を示す。多様な鋳型分子のＤＮＡ投入物プールが、熱で変性され、急冷、および熱安定性一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）の使用によって、一本鎖分子として維持される。鋳型ＤＮＡは、リン酸化され、ランダム化された７ｂｐ一本鎖足場オーバーハングとライゲーションを遮断する修飾とをすべての末端に有するｓｓＰｒｅｐ足場アダプターが、正しく配向されたライブラリー分子を助長するものを除いて、複合リン酸化／ライゲーション反応でライゲーションされる。クリーンアップ後、分子は、インデックスＰＣＲの準備が整った状態である。
図２９は、健康なヒトのｃｆＤＮＡ抽出物（Ａ、試料Ａ；Ｂ、試料Ｂ）からの一本鎖ライブラリー調製（ｓｓＰｒｅｐ）および市販キット（ｄｓＰｒｅｐ；すなわち、ＮＥＢＮＥＸＴ ＵＬＴＲＡ ＩＩ）ライブラリーからのマージされたリードについての標準的なＮＧＳメトリクスを示す。別段の記述がない限り、各方法についてのすべてのライブラリーを解析の前にｃｆＤＮＡ抽出物ごとに組み合わせ、ＰＣＲ重複、およびｑ２０に等しいかまたはそれより大きい品質スコアについてフィルタリングした。パネルＡ：ｃｆＤＮＡ抽出物ＡおよびＢそれぞれについての挿入物分布プロット。パネルＢ：ｃｆＤＮＡ抽出物ごとのｓｓＰｒｅｐおよび市販キットについてのヒトゲノム（ｈｇ１９）にわたっての塩基パーセントによるカバレッジ倍数。組み合わせたライブラリーをカバレッジ倍数計算の前に同様のリード深度についてサブサンプリングした。サブサンプリングした深度を、ｓｓＰｒｅｐ－Ｂについてのシーケンシングされるリードの限界である２９５Ｍリードに設定した。パネルＣ：ｃｆＤＮＡ抽出物ごとのｓｓＰｒｅｐおよび市販のキットについてのヒトゲノムにわたっての１００ｂｐスライディングスケールによるＧＣ含有量の関数としての正規化されたカバレッジ。網掛けヒストグラムは、１００ｂｐスライディングウインドウにわたってのヒトゲノムＧＣを表す。パネルＤ：ｃｆＤＮＡ抽出物ごとのｓｓＰｒｅｐおよび市販キットについてのＰｒｅｓｅｑ複雑性推定。可能な最も正確なｐｒｅｓｅｑ推定値を得るために、同等のシーケンシング深度の３つのライブラリーを方法ごとに組み合わせた。より多くのライブラリーが、市販キットよりもｓｓＰｒｅｐによって作製されたからである。ＰＣＲ重複リードを含有するファイルを使用して、複雑性推定を助長した。パネルＥ：リード開始部位の２ｂｐ上流で開始して３４ｂｐ下流に及ぶ、リード末端の各位置における正規化され、ｌｏｇ変換された塩基組成。挿入物長にかかわらず、すべてのリードを考慮した。
図３０は、一本鎖ライブラリー調製（ｓｓＰｒｅｐ）および市販キット（ｄｓＰｒｅｐ；すなわち、ＮＥＢＮＥＸＴ ＵＬＴＲＡ ＩＩ）についての一本鎖オーバーハングを含有する二重鎖オリゴのカバレッジを示す。パネルＡ：二重鎖合成オリゴ－１つの平滑末端、識別可能な５０ｎｔ相補領域、ならびに特定の長さおよびタイプのオーバーハング－の略画概略図。パネルＢ：ｓｓＰｒｅｐおよび市販キット方法の両方の０ベース座標における３回の技術的反復実験についてのすべての二重鎖オリゴの長さにわたっての塩基ごとのカバレッジの代表値。技術的反復実験は、互いに統計的に差がなかった（スチューデントｔ検定：ｓｓＰｒｅｐ ｐ＝０．７１４、市販キットｐ＝０．９８５）。シーケンシングした各オリゴ＞５，０００リード。
図３１は、一本鎖オリゴ解析をｓｓＰｒｅｐごとに示す。灰色および黒色の線および点は、技術的反復実験を表す。パネルＡ：等モルのプールされた一本鎖オリゴライブラリーの挿入物分布。１０ｎｔ間隔で合成した２０～１２０ｎｔのオリゴを標準的脱塩により精製した。フィルタリングされていない生シーケンシングデータ。パネルＢ：オリゴごとに分けられた技術的反復実験についてのマッピングされたシーケンシングデータ。オリゴ長の関数として表されている。黒色の縦棒ならびに付随する黒色および灰色の数字は、完全長産物のパーセントをライブラリープール内に存在するオリゴ長ごとに示す。各ライブラリーを約１００，０００リードペア（２０および３０ｎｔ長を除いて、オリゴ当たり１０，０００リードペア）の深度までシーケンシングした。パネルＣ：６０ｎｔの合成されたオリゴのオリゴ長の関数としてのオリゴ純度に対する様々な精製方法の効果。付随する黒色および灰色の数字は、オリゴ当たりの完全長産物のパーセントを示す。パネルＢから取り出した標準的な脱塩６０ｎｔ合成オリゴについてのデータ。
図３２は、ｃｆＤＮＡ解析を示す。パネルＡ：１００ｂｐ±（リードがマッピングされた座標）を含む、３つの別個の断片長のｓｓＰｒｅｐデータについてのリード長の関数としての正規化されたゲノムジヌクレオチド出現頻度。リード中点は、ゼロを中心とする。負の数は、中点の上流（５プライム）のゲノム領域を示し、正の数は、中点の下流（３プライム）のゲノム領域を示す。入力データは、組み合わせた試料Ａおよび試料Ｂ ｓｓＰｒｅｐデータセットからのものである。パネルＢ：リードの中への９ｂｐ領域（正の数）およびリードから外への１０ｂｐ（負の数）を含む、３つの別個の断片長の末端のｓｓＰｒｅｐデータについてのリード長の関数としての正規化されたゲノムジヌクレオチド出現頻度。リード開始および終了座標は、０を中心とする。入力データは、組み合わせた試料Ａおよび試料Ｂ ｓｓＰｒｅｐデータセットからのものである。パネルＣ：市販キットデータを除いて、パネルＡと同じ。パネルＤ：市販キットデータを除いて、パネルＢと同じ。パネルＥ：最初にＷＰＳをはっきりと示すために使用された第１２染色体上の同じ動原体周辺遺伝子座にある試料ＣＨ０１と比較したｓｓＰｒｅｐデータについての正規化されたＷＰＳ値（１２０ｂｐウインドウ；１２０～１８０ｂｐ断片）。パネルＦ：試料ＣＨ０１と比較したｓｓＰｒｅｐデータの長い断片長のビニング処理されたデータ（１２０ｂｐウインドウ；１２０～１８０ｂｐ断片）および短い断片長のビニング処理されたデータ（１６ｂｐウインドウ；３５～８０ｂｐ断片）についてのアノテーション付きＣＴＣＦ結合部位の±１ｋｂ以内の正規化されたＷＰＳスコア代表値。
図３３Ａおよび３３Ｂは、投入ｃｆＤＮＡならびに代表的なｓｓＰｒｅｐおよびｄｓＰｒｅｐライブラリーを示す。図３３Ａ、上のパネル：血漿抽出／精製後かつＮＧＳライブラリー調製前の無細胞ＤＮＡ抽出物（試料Ａ）。Ｄ５０００ ＨＳテープおよび付随するＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎ ４２００（Ａｇｉｌｅｎｔ）を製造業者の使用説明書に従って用いて解析した。ゲル画像および電気泳動図を示す。図３３Ａ、下のパネル：血漿抽出／精製後かつＮＧＳライブラリー調製前の無細胞ＤＮＡ抽出物（試料Ｂ）。Ｄ１０００ ＨＳテープおよび付随するＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎ ４２００（Ａｇｉｌｅｎｔ）を製造業者の使用説明書に従って用いて解析した。ゲル画像および電気泳動図を示す。図３３Ｂ、上のパネル：Ｄ１０００ ＨＳテープおよび付随するＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎ ４２００（Ａｇｉｌｅｎｔ）を製造業者の使用説明書に従って用いてインデックスＰＣＲ後に解析した、ｃｆＤＮＡ抽出物からの１つの代表的なｓｓＰｒｅｐライブラリー（試料Ａ、ライブラリーＩＤ：Ａ’）およびｃｆＤＮＡ抽出物からの１つの代表的なｓｓＰｒｅｐライブラリー（試料Ｂ、ライブラリーＩＤ：Ｂ’）。ゲル画像および電気泳動図を示す。図３３Ｂ、下のパネル：Ｄ１０００ ＨＳテープおよび付随するＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎ ４２００（Ａｇｉｌｅｎｔ）を製造業者の使用説明書に従って用いてインデックスＰＣＲ後に解析した、ｃｆＤＮＡ抽出物からの１つの代表的なｄｓＰｒｅｐ（すなわち、ＮＥＢＮＥＸＴ ＵＬＴＲＡ ＩＩ）ライブラリー（試料Ａ、ライブラリーＩＤ：Ａ”）およびｃｆＤＮＡ抽出物からの１つの代表的なｄｓＰｒｅｐ（すなわち、ＮＥＢＮＥＸＴ ＵＬＴＲＡ ＩＩ）ライブラリー（試料Ｂ、ライブラリーＩＤ：Ｂ”）。ゲル画像および電気泳動図を示す。 図３３Ａおよび３３Ｂは、投入ｃｆＤＮＡならびに代表的なｓｓＰｒｅｐおよびｄｓＰｒｅｐライブラリーを示す。図３３Ａ、上のパネル：血漿抽出／精製後かつＮＧＳライブラリー調製前の無細胞ＤＮＡ抽出物（試料Ａ）。Ｄ５０００ ＨＳテープおよび付随するＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎ ４２００（Ａｇｉｌｅｎｔ）を製造業者の使用説明書に従って用いて解析した。ゲル画像および電気泳動図を示す。図３３Ａ、下のパネル：血漿抽出／精製後かつＮＧＳライブラリー調製前の無細胞ＤＮＡ抽出物（試料Ｂ）。Ｄ１０００ ＨＳテープおよび付随するＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎ ４２００（Ａｇｉｌｅｎｔ）を製造業者の使用説明書に従って用いて解析した。ゲル画像および電気泳動図を示す。図３３Ｂ、上のパネル：Ｄ１０００ ＨＳテープおよび付随するＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎ ４２００（Ａｇｉｌｅｎｔ）を製造業者の使用説明書に従って用いてインデックスＰＣＲ後に解析した、ｃｆＤＮＡ抽出物からの１つの代表的なｓｓＰｒｅｐライブラリー（試料Ａ、ライブラリーＩＤ：Ａ’）およびｃｆＤＮＡ抽出物からの１つの代表的なｓｓＰｒｅｐライブラリー（試料Ｂ、ライブラリーＩＤ：Ｂ’）。ゲル画像および電気泳動図を示す。図３３Ｂ、下のパネル：Ｄ１０００ ＨＳテープおよび付随するＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎ ４２００（Ａｇｉｌｅｎｔ）を製造業者の使用説明書に従って用いてインデックスＰＣＲ後に解析した、ｃｆＤＮＡ抽出物からの１つの代表的なｄｓＰｒｅｐ（すなわち、ＮＥＢＮＥＸＴ ＵＬＴＲＡ ＩＩ）ライブラリー（試料Ａ、ライブラリーＩＤ：Ａ”）およびｃｆＤＮＡ抽出物からの１つの代表的なｄｓＰｒｅｐ（すなわち、ＮＥＢＮＥＸＴ ＵＬＴＲＡ ＩＩ）ライブラリー（試料Ｂ、ライブラリーＩＤ：Ｂ”）。ゲル画像および電気泳動図を示す。
図３４は、試料Ａおよび試料Ｂの複製ライブラリーについての挿入物分布を示す。パネルＡ：試料Ａ ｃｆＤＮＡ抽出物について製造されたすべてのライブラリーについての挿入物分布。パネルＢ：試料Ｂ ｃｆＤＮＡ抽出物について製造されたすべてのライブラリーについての挿入物分布。各説明文に列挙されているライブラリーＩＤの順序は、説明文に示されているトレースの順序に対応する。
図３５は、断片長保持に対するインデックスＰＣＲ後ＤＮＡ精製の効果を示す。１．２×または１．５×ＤＮＡ精製ビーズ体積：インデックスＰＣＲ反応体積比のどちらかを使用して、ｃｆＤＮＡ（試料Ａ）のｓｓＰｒｅｐライブラリーを精製した。＜１００ｂｐ断片の回収率は、より低い比からより高い比について９．３％から１４．７％へと変化した。
図３６は、一本鎖ＤＮＡライブラリー調製（ｓｓＰｒｅｐ）についてのワークフローの例を示す。ｓｓＰｒｅｐは、末端ポリッシング（すなわち、末端修復）を伴わないライゲーションのための鋳型ＤＮＡ分子の調製と、本明細書に記載される足場アダプターを利用することによるＩＬＬＵＭＩＮＡアダプターのライゲーションとを同時に行なう、１ステップ複合リン酸化／ライゲーションステップで動作する。
図３７は、ｃｆＤＮＡ保護モデルの説明図を示す。
図３８は、ライブラリー調製キットおよび投入ｃｆＤＮＡの概要を示す、表を提供する。ｓｓＰｒｅｐと、２つの市販の末端ポリッシング型ｄｓＤＮＡライブラリー調製キットと、市販のｓｓＤＮＡキットとを利用して、２名の健康な個体のｃｆＤＮＡ抽出物（試料１および試料２）からシーケンシングライブラリーを生成した。ライブラリーをＩＬＬＵＭＩＮＡ ＨＩＳＥＱ Ｘで２×１５１ｂｐシーケンシングした。市販キット１、ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ ＩＩ（商標）；市販キット２、タカラバイオ株式会社ＴｈｒｕＰＬＥＸ（登録商標）Ｐｌａｓｍａ－Ｓｅｑ；市販キット３、Ｓｗｉｆｔ Ａｃｃｅｌ－ＮＧＳ（登録商標）１Ｓ Ｐｌｕｓ。
図３９は、インデックスＰＣＲ後の収量を示す。Ｑｕｂｉｔ ３．０を使用し、インデックスＰＣＲ後の２μｌの最終精製ライブラリーを用いて、ライブラリーを定量化した。キット付属のポリメラーゼマスターミックスおよびプライマーを使用して１０サイクルのＰＣＲでインデックスが付加されたすべてのライブラリー。Ｐｒｅｐキットが各ヒストグラムの中に左から右へ示されている：ｓｓＰｒｅｐ、Ｓｗｉｆｔ、タカラバイオ株式会社、ＮＥＢ。
図４０は、マッピングおよび短い挿入物ビンデータを示す。ＳｅｑＰｒｅｐ２．０を使用してライブラリーをトリミング／マージし、マージされたリード＜３０ｂｐを廃棄した。残りのリードは、ＢＷＡ ａｌｎでヒト参照ゲノムｈｇ１９にマッピングした。カスタムスクリプトを用いてサイズビニングを行なった。Ｐｒｅｐキットが各ヒストグラムの中に左から右に示されている：ｓｓＰｒｅｐ、Ｓｗｉｆｔ（Ｓｗｉｆｔ Ａｃｃｅｌ－ＮＧＳ（登録商標）１Ｓ Ｐｌｕｓ）、タカラバイオ株式会社（Ｓｗｉｆｔ Ａｃｃｅｌ－ＮＧＳ（登録商標）１Ｓ Ｐｌｕｓ）、ＮＥＢ（ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ ＩＩ（商標））。
図４１は、インデックスＰＣＲ後の収量およびマッピング状態を示す表を提供する。＊ライブラリー調製中に生じたテーリングアーチファクトに起因して、市販キット３は、マッピングの前にフォワードおよびリバースリードから１０ｂｐトリミングすることを推奨している。それに基づいて、３０～１００ｂｐのビンサイズの上限を１００ｂｐではなく９０ｂｐに低下させた。市販キット１、ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ ＩＩ（商標）；市販キット２、タカラバイオ株式会社ＴｈｒｕＰＬＥＸ（登録商標）Ｐｌａｓｍａ－Ｓｅｑ；市販キット３、Ｓｗｉｆｔ Ａｃｃｅｌ－ＮＧＳ（登録商標）１Ｓ Ｐｌｕｓ。
図４２Ａおよび４２Ｂは、マッピングされた挿入物長分布を示す。図４２Ａは、ｓｓＰｒｅｐをｄｓＤＮＡ調製に対して示す。キット２、タカラバイオ株式会社ＴｈｒｕＰＬＥＸ（登録商標）Ｐｌａｓｍａ－Ｓｅｑ；キット１、ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ ＩＩ（商標）。図４２Ｂは、ｓｓＰｒｅｐを市販ｓｓＤＮＡ調製キット（Ｓｗｉｆｔ Ａｃｃｅｌ－ＮＧＳ（登録商標）１Ｓ Ｐｌｕｓ）に対して示す。各ライブラリーに含有されているすべての分子についてのリード長を、正しくマッピングされ、ソートされたｂａｍファイルから抽出し、次いでプロットした。 図４２Ａおよび４２Ｂは、マッピングされた挿入物長分布を示す。図４２Ａは、ｓｓＰｒｅｐをｄｓＤＮＡ調製に対して示す。キット２、タカラバイオ株式会社ＴｈｒｕＰＬＥＸ（登録商標）Ｐｌａｓｍａ－Ｓｅｑ；キット１、ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ ＩＩ（商標）。図４２Ｂは、ｓｓＰｒｅｐを市販ｓｓＤＮＡ調製キット（Ｓｗｉｆｔ Ａｃｃｅｌ－ＮＧＳ（登録商標）１Ｓ Ｐｌｕｓ）に対して示す。各ライブラリーに含有されているすべての分子についてのリード長を、正しくマッピングされ、ソートされたｂａｍファイルから抽出し、次いでプロットした。
図４３は、複雑性推定値を示す。ライブラリー調製キットの複雑性推定値出力は、Ｐｒｅｓｅｑアルゴリズムからであった。図４１における表からのリードを入力データとして使用し、固有分子の数を３００Ｍリードペアに外挿した。
図４４は、各ｃｆＤＮＡ抽出物についてのライブラリーの正規化されたカバレッジとしてのＧＣカバレッジを、ヒト参照ゲノムの（ｈｇ１９）ＧＣ含有量の関数として、１００ｂｐスライディングウインドウに対して示す。左側のＹ軸は、ｃｆＤＮＡ（線）を指す。右側の軸は、参照ゲノムを指す（灰色のヒストグラム）。Ｐｉｃａｒｄ Ｔｏｏｌｓ ＣｏｌｌｅｃｔＧｃＢｉａｓＭｅｔｒｉｃｓから取り出したデータ。
図４５は、ヌクレオソーム占有率を示す。ＷＰＳ計算を生成し、ｃｈｒ１２でアルファサテライトアレイ小領域についての最高ＷＰＳ絶対値に対して正規化した。ＷＰＳ計算の前に、健康なｃｆＤＮＡ試料１および２についてのｓｓＰｒｅｐ ｂａｍファイルを組み合わせ、ヌクレオソーム関連挿入物に関するリードをフィルタリングすることにより、ｃｆＤＮＡデータを得た。
図４６は、ジヌクレオチド出現頻度を示す。ＡＴおよびＣＧ含有ジヌクレオチドについてのジヌクレオチド出現頻度を、１６５７ｂｐにおける試料１の主ヒストン単量体ピークに相当するすべてのリードの５’および３’末端についてプロットした。
図４７は、損傷したＤＮＡについてのライブラリー調製方法の比較を示す。
図４８Ａ～図４８Ｄは、様々な精製条件下での断片－足場アダプターライゲーション産物のＳＰＲＩ精製後に回収された断片長およびアダプターダイマーパーセントの比較を示す。図４８Ａは、５０μｌのＴｒｉｓ緩衝液の添加を伴う（すなわち、２５μｌのライゲーション産物を添加した）１８％ＰＥＧ ＳＰＲＩ精製を使用して精製された断片－足場アダプターライゲーション産物についての、アダプターダイマーおよび断片長ピークを示す。図４８Ｂは、２５μｌのイソプロパノールおよび２５μｌのＴｒｉｓ緩衝液の添加を伴う１８％ＰＥＧ ＳＰＲＩ精製を使用して精製された断片－足場アダプターライゲーション産物についての、アダプターダイマーおよび断片長ピークを示す。図４８Ｃは、５０μｌのイソプロパノールの添加を伴う１８％ＰＥＧ ＳＰＲＩ精製を使用して精製された断片－足場アダプターライゲーション産物についての、アダプターダイマーおよび断片長ピークを示す。図４８Ｄは、３８％ＰＥＧを含有するＳＰＲＩビーズ溶解緩衝液を使用して精製された断片－足場アダプターライゲーション産物についての、アダプターダイマーおよび断片長ピークを示す。 図４８Ａ～図４８Ｄは、様々な精製条件下での断片－足場アダプターライゲーション産物のＳＰＲＩ精製後に回収された断片長およびアダプターダイマーパーセントの比較を示す。図４８Ａは、５０μｌのＴｒｉｓ緩衝液の添加を伴う（すなわち、２５μｌのライゲーション産物を添加した）１８％ＰＥＧ ＳＰＲＩ精製を使用して精製された断片－足場アダプターライゲーション産物についての、アダプターダイマーおよび断片長ピークを示す。図４８Ｂは、２５μｌのイソプロパノールおよび２５μｌのＴｒｉｓ緩衝液の添加を伴う１８％ＰＥＧ ＳＰＲＩ精製を使用して精製された断片－足場アダプターライゲーション産物についての、アダプターダイマーおよび断片長ピークを示す。図４８Ｃは、５０μｌのイソプロパノールの添加を伴う１８％ＰＥＧ ＳＰＲＩ精製を使用して精製された断片－足場アダプターライゲーション産物についての、アダプターダイマーおよび断片長ピークを示す。図４８Ｄは、３８％ＰＥＧを含有するＳＰＲＩビーズ溶解緩衝液を使用して精製された断片－足場アダプターライゲーション産物についての、アダプターダイマーおよび断片長ピークを示す。
図４９Ａ～図４９Ｅは、様々な精製条件下での断片－足場アダプターライゲーション産物の精製後に回収された断片長およびアダプターダイマーパーセントの比較を示す。図４９Ａは、５０μｌのＴｒｉｓ緩衝液の添加を伴う１８％ＰＥＧ ＳＰＲＩ精製を使用して精製された断片－足場アダプターライゲーション産物についての、アダプターダイマーおよび断片長ピークを示す。図４９Ｂは、カラム精製を使用して精製された断片－足場アダプターライゲーション産物についての、アダプターダイマーおよび断片長ピークを示す。図４９Ｃは、５μｌのイソプロパノールおよび４５μｌのＴｒｉｓ緩衝液の添加を伴う１８％ＰＥＧ ＳＰＲＩ精製を使用して精製された断片－足場アダプターライゲーション産物についての、アダプターダイマーおよび断片長ピークを示す。図４９Ｄは、１０μｌのイソプロパノールおよび４０μｌのＴｒｉｓ緩衝液の添加を伴う１８％ＰＥＧ ＳＰＲＩ精製を使用して精製された断片－足場アダプターライゲーション産物についての、アダプターダイマーおよび断片長ピークを示す。図４９Ｅは、２０μｌのイソプロパノールおよび３０μｌのＴｒｉｓ緩衝液の添加を伴う１８％ＰＥＧ ＳＰＲＩ精製を使用して精製された断片－足場アダプターライゲーション産物についての、アダプターダイマーおよび断片長ピークを示す。 図４９Ａ～図４９Ｅは、様々な精製条件下での断片－足場アダプターライゲーション産物の精製後に回収された断片長およびアダプターダイマーパーセントの比較を示す。図４９Ａは、５０μｌのＴｒｉｓ緩衝液の添加を伴う１８％ＰＥＧ ＳＰＲＩ精製を使用して精製された断片－足場アダプターライゲーション産物についての、アダプターダイマーおよび断片長ピークを示す。図４９Ｂは、カラム精製を使用して精製された断片－足場アダプターライゲーション産物についての、アダプターダイマーおよび断片長ピークを示す。図４９Ｃは、５μｌのイソプロパノールおよび４５μｌのＴｒｉｓ緩衝液の添加を伴う１８％ＰＥＧ ＳＰＲＩ精製を使用して精製された断片－足場アダプターライゲーション産物についての、アダプターダイマーおよび断片長ピークを示す。図４９Ｄは、１０μｌのイソプロパノールおよび４０μｌのＴｒｉｓ緩衝液の添加を伴う１８％ＰＥＧ ＳＰＲＩ精製を使用して精製された断片－足場アダプターライゲーション産物についての、アダプターダイマーおよび断片長ピークを示す。図４９Ｅは、２０μｌのイソプロパノールおよび３０μｌのＴｒｉｓ緩衝液の添加を伴う１８％ＰＥＧ ＳＰＲＩ精製を使用して精製された断片－足場アダプターライゲーション産物についての、アダプターダイマーおよび断片長ピークを示す。
図５０は、一本鎖ＲＮＡからシーケンシングライブラリーを生成するためのワークフローの例を示す。
図５１は、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域内の塩基の一部またはすべてが定義された塩基であるかまたは既知の塩基である、足場アダプター設計の例を示す。
図５２Ａ～図５２Ｄは、修飾された核酸の濃縮についてのワークフローの例を示す。修飾された核酸の濃縮をｄｓＤＮＡの変性の前（図５２Ａ、５２Ｂ）または後（図５２Ｃ、５２Ｄ）に行なうことができる。 図５２Ａ～図５２Ｄは、修飾された核酸の濃縮についてのワークフローの例を示す。修飾された核酸の濃縮をｄｓＤＮＡの変性の前（図５２Ａ、５２Ｂ）または後（図５２Ｃ、５２Ｄ）に行なうことができる。 図５２Ａ～図５２Ｄは、修飾された核酸の濃縮についてのワークフローの例を示す。修飾された核酸の濃縮をｄｓＤＮＡの変性の前（図５２Ａ、５２Ｂ）または後（図５２Ｃ、５２Ｄ）に行なうことができる。 図５２Ａ～図５２Ｄは、修飾された核酸の濃縮についてのワークフローの例を示す。修飾された核酸の濃縮をｄｓＤＮＡの変性の前（図５２Ａ、５２Ｂ）または後（図５２Ｃ、５２Ｄ）に行なうことができる。
図５３Ａおよび図５３Ｂは、ニックの入ったＤＮＡからライブラリーを生成するためのワークフローの例を示す。 図５３Ａおよび図５３Ｂは、ニックの入ったＤＮＡからライブラリーを生成するためのワークフローの例を示す。
図５４は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組合せを含む、足場アダプター構成の例を示す。
図５５は、病原体ＲＮＡを含有する試料からシーケンシングライブラリーを生成するためのワークフローの例を示す。
詳細な説明
核酸の解析に有用な方法および組成物が、本明細書で提供される。核酸ライブラリーの生成に有用な方法および組成物も、本明細書で提供される。一本鎖核酸断片の末端の解析に有用な方法および組成物も、本明細書で提供される。ある特定の態様では、方法は、一本鎖核酸断片を含む試料核酸と指定アダプターとを結合させるステップを含む。一部の実施形態では、指定アダプターは、一本鎖核酸の末端とハイブリダイズすることができる足場ポリヌクレオチドを含む。そのようなハイブリダイゼーションの産物は、例えば、核酸ライブラリーの生成に、および／またはさらに解析もしくはプロセシングに、有用であり得る。
足場アダプター
本明細書におけるある特定の方法は、ｓｓＮＡと足場アダプターまたはその成分とを結合させるステップを含む。足場アダプターは、一般に、足場ポリヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを含む。したがって、足場アダプターの「成分」は、足場ポリヌクレオチド、および／もしくはオリゴヌクレオチド、またはその小成分もしくは領域を指すことがある。オリゴヌクレオチドおよび／または足場ポリヌクレオチドは、ピリミジン（Ｃ、Ｔ、Ｕ）および／またはプリン（Ａ、Ｇ）ヌクレオチドで構成され得る。さらなる成分または小成分としては、インデックスポリヌクレオチド、固有分子識別子（ＵＭＩ）、プライマー結合部位（例えば、シーケンシングプライマー結合部位、Ｐ５プライマー結合部位、Ｐ７プライマー結合部位）、フローセル結合領域などのうちの１つまたは複数、ならびにそれらの成分を挙げることができる。Ｐ５プライマー結合部位を含む足場アダプターは、Ｐ５アダプターまたはＰ５足場アダプターと呼ばれることがある。Ｐ７プライマー結合部位を含む足場アダプターは、Ｐ７アダプターまたはＰ７足場アダプターと呼ばれることがある。
足場ポリヌクレオチドは、足場アダプターの一本鎖成分である。本明細書におけるポリヌクレオチドは、一般に、５～５００ヌクレオチド、例えば５～１００ヌクレオチドの、ヌクレオチドの一本鎖マルチマーを指す。ポリヌクレオチドは、合成のものであることもあり、または酵素的に作製されることもあり、一部の実施形態では、長さ約５～５０ヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドモノマー（すなわち、ポリリボヌクレオチドまたは「ＲＮＡポリヌクレオチド」であり得る）、デオキシリボヌクレオチドモノマー（すなわち、ポリデオキシリボヌクレオチドまたは「ＤＮＡポリヌクレオチド」であり得る）、またはこれらの組合せを含有することがある。ポリヌクレオチドは、例えば、長さ１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～１００、１００～１５０、１５０～２００ヌクレオチド、または５００ヌクレオチド以下であり得る。用語ポリヌクレオチドをおよびオリゴヌクレオチドは、本明細書では同義で使用され得る。
足場ポリヌクレオチドは、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域（足場、足場領域、一本鎖足場、一本鎖足場領域とも呼ばれる）およびオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含み得る。ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域およびオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域は、足場ポリヌクレオチドの小成分と呼ばれることがある。ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、通常は、ｓｓＮＡ末端領域にハイブリダイズする、またはハイブリダイズすることができる、ポリヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域は、足場アダプターのオリゴヌクレオチド成分のすべてまたは一部分にハイブリダイズする、またはハイブリダイズすることができる、ポリヌクレオチドを通常は含む。
足場ポリヌクレオチドのｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、ｓｓＮＡ末端領域に相補的または実質的に相補的である、ポリヌクレオチドを含み得る。一部実施形態では、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、ランダム配列を含む。一部の実施形態では、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、目的のｓｓＮＡ末端領域配列（例えば、標的配列）に相補的な配列を含む。ある特定の実施形態では、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、ｓｓＮＡ中の塩基との非特異的塩基対合が可能である、１つまたは複数のヌクレオチドを含む。非特異的塩基対合が可能なヌクレオチドは、ユニバーサル塩基と呼ばれることがある。ユニバーサル塩基は、４つの標準ヌクレオチド塩基：Ａ、Ｃ、ＧおよびＴの各々と無差別に塩基対合することができる塩基である。ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域に組み込むことができるユニバーサル塩基としては、イノシン、デオキシイノシン、２’－デオキシイノシン（ｄＩ、ｄＩｎｏｓｉｎｅ）、ニトロインドール、５－ニトロインドール、および３－ニトロピロールが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、４つの典型的な塩基のうちの２つまたは３つ（しかしすべてではない）（例えば、非天然塩基ＰおよびＫ）を置き換えることができる１つまたは複数の縮重／ゆらぎ塩基を含む。
足場ポリヌクレオチドのｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、任意の好適な長さおよび配列を有し得る。一部の実施形態では、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域の長さは、１０ヌクレオチドまたはそれ未満である。ある特定の態様では、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、長さ４～１００ヌクレオチド、例えば、長さ約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ヌクレオチドである。ある特定の態様では、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、長さ４～２０ヌクレオチド、例えば、長さ５～１５、５～１０、５～９、５～８、または５～７（例えば、６または７）ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、長さ７ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、ランダムヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、したがって、様々なランダムｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を有する複数の不均一足場ポリヌクレオチドが用いられる場合、その一群が、ｓｓＮＡの末端領域の配列に関係なくｓｓＮＡの不均一集団のための足場ポリヌクレオチドとして作用することができる。固有のｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域配列を有する各足場ポリヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチド種と呼ばれることがあり、複数の足場ポリヌクレオチド種の一群は、複数の足場ポリヌクレオチド種と呼ばれることがある（例えば、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域内に７つのランダム塩基を有するように設計された足場ポリヌクレオチドの場合、複数の足場ポリヌクレオチド種は、４７の固有のｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域配列を含むことになる）。したがって、固有の足場ポリヌクレオチドを有する（すなわち、固有のｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域配列を含む）各足場アダプターは、足場アダプター種と呼ばれることもあり、複数の足場アダプター種の一群は、複数の足場アダプター種と呼ばれることがある。足場ポリヌクレオチドの種は、他の足場ポリヌクレオチド種に対して固有である特徴を一般に有する。例えば、足場ポリヌクレオチド種は、固有の配列特徴を有することができる。固有の配列特徴としては、固有の配列長、固有のヌクレオチド配列（例えば、固有のランダム配列、固有の標的配列）、または固有の配列長とヌクレオチド配列の組合せを挙げることができる。
足場ポリヌクレオチドは、インデックスポリヌクレオチド、固有分子識別子（ＵＭＩ）、プライマー結合部位（例えば、Ｐ５プライマー結合部位、Ｐ７プライマー結合部位）、フローセル結合領域など、またはその相補ポリヌクレオチドを含む、１つもしくは複数のさらなる小成分を含むことがある。足場ポリヌクレオチドは、プライマー結合部位（またはプライマー結合部位に相補的なポリヌクレオチド）を含むこともある。Ｐ５プライマー結合部位を含む足場ポリヌクレオチド（またはその相補体）は、Ｐ５足場またはＰ５足場ポリヌクレオチドと呼ばれることがある。Ｐ７プライマー結合部位を含む足場ポリヌクレオチド（またはその相補体）は、Ｐ７足場またはＰ７足場ポリヌクレオチドと呼ばれることがある。
オリゴヌクレオチドは、足場アダプターのさらなる一本鎖成分であり得る。本明細書におけるオリゴヌクレオチドは、一般に、５～５００ヌクレオチド、例えば５～１００ヌクレオチドの、ヌクレオチドの一本鎖マルチマーを指す。オリゴヌクレオチドは、合成のものであることもあり、または酵素的に作製されることもあり、一部の実施形態では、長さ５～５０ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドモノマー（すなわち、オリゴリボヌクレオチドもしくは「ＲＮＡオリゴヌクレオチド」であり得る）、デオキシリボヌクレオチドモノマー（すなわち、オリゴデオキシリボヌクレオチドもしくは「ＤＮＡオリゴヌクレオチド」であり得る）、またはこれらの組合せを含有することがある。オリゴヌクレオチドは、例えば、長さ１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～１００、１００～１５０、１５０～２００ヌクレオチド、または５００ヌクレオチド以下であり得る。用語オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、本明細書では同義で使用され得る。
足場アダプターのオリゴヌクレオチド成分は、一般に、足場ポリヌクレオチドのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域に相補的または実質的に相補的である核酸配列を含む。足場アダプターのオリゴヌクレオチド成分は、例えば、ｓｓＮＡ断片またはその誘導体のＰＣＲ増幅、ｓｓＮＡまたはその誘導体のシーケンシングなどのような、１つまたは複数の下流の応用に有用な、１つまたは複数の小成分を含み得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの小成分は、シーケンシングアダプターである。シーケンシングアダプターは、目的のシーケンシングプラットフォーム、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）により提供されているシーケンシングプラットフォーム（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）および／もしくはＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）シーケンシングシステム）；Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより提供されているシーケンシングプラットフォーム（例えば、ＭｉｎＩＯＮ（商標）シーケンシングシステム）；Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）により提供されているシーケンシングプラットフォーム（例えば、Ｉｏｎ ＰＧＭ（商標）および／もしくはＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）シーケンシングシステム）；Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより提供されているシーケンシングプラットフォーム（例えば、ＳｅｑｕｅｌもしくはＰＡＣＢＩＯ ＲＳ ＩＩシーケンシングシステム）；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）により提供されているシーケンシングプラットフォーム（例えば、ＳＯＬｉＤ（商標）シーケンシングシステム）；Ｒｏｃｈｅにより提供されているシーケンシングプラットフォーム（例えば、４５４ ＧＳ ＦＬＸ＋および／もしくはＧＳ Ｊｕｎｉｏｒシーケンシングシステム）；Ｇｅｎａｐｓｙｓにより提供されているシーケンシングプラットフォーム；ＢＧＩにより提供されているシーケンシングプラットフォーム；または目的の任意のシーケンシングプラットフォームによって用いられる、ヌクレオチド配列（またはその相補体）の少なくとも一部分を含む、１つまたは複数の核酸ドメインを一般に指す。
一部の実施形態では、足場アダプターのオリゴヌクレオチド成分は、表面結合シーケンシングプラットフォームオリゴヌクレオチド（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシングシステム内のフローセルの表面に結合されたＰ５もしくはＰ７オリゴヌクレオチド）に特異的に結合するドメイン（例えば、「キャプチャー部位」もしくは「キャプチャー配列」）；シーケンシングプライマー結合ドメイン（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）プラットフォームのＲｅａｄ １もしくはＲｅａｄ ２プライマーが結合し得るドメイン）；固有識別子もしくはインデックス（例えば、特異的バーコードもしくは「タグ」で所与の試料からのあらゆる分子にマークを付けることにより試料多重化を可能にするためにシーケンシングされることになるｓｓＮＡの試料源を一意的に識別する、バーコードもしくは他のドメイン）；バーコードシーケンシングプライマー結合ドメイン（バーコードをシーケンシングするために使用されるプライマーが結合するドメイン）；目的の分子に、例えば、シーケンシングされる固有のタグのインスタンスの数に基づいて発現レベルを決定するために、一意的にマークを付けるための、分子識別ドメインもしくは固有分子識別子（ＵＭＩ）（例えば、４、６、もしくは他のヌクレオチド数のランダム化されたタグなどの、分子インデックスタグ）；任意のそのようなドメインの成分；またはこれらの任意の組合せから選択される、核酸ドメインであるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、バーコードドメイン（例えば、試料インデックスタグ）および分子識別ドメイン（例えば、分子インデックスタグ；ＵＭＩ）を同じ核酸に含めることができる。シーケンシングプラットフォームオリゴヌクレオチド、シーケンシングプライマー、およびそれらの対応する結合ドメインを、本明細書で論じられるものを含むがそれらに限定されない様々な利用可能なシーケンシングプラットフォームおよび技術に適合するように設計することができる。
足場アダプターのオリゴヌクレオチド成分が、シーケンシングアダプターの１つまたは一部分を含む場合、様々なアプローチを使用して１つもしくは複数のさらなるシーケンシングアダプターおよび／またはそのシーケンシングアダプターの残存部分を付加させることができる。例えば、さらなるシーケンシングアダプターおよび／またはシーケンシングアダプターの残存部分を、ライゲーション、逆転写、ＰＣＲ増幅などのうちのいずれか１つにより付加させることができる。ＰＣＲの場合、３’ハイブリダイゼーション領域（例えば、オリゴヌクレオチドのアダプター領域とハイブリダイズするための）とさらなるシーケンシングアダプターおよび／またはシーケンシングアダプターの残存部分を含む５’領域とを含む第１の増幅プライマー、ならびに３’ハイブリダイゼーション領域（例えば、ｓｓＮＡ分子の反対側の末端に付加された第２のオリゴヌクレオチドのアダプター領域とハイブリダイズするための）と、必要に応じて、さらなるシーケンシングアダプターおよび／またはシーケンシングアダプターの残存部分を含む５’領域とを含む第２の増幅プライマーを含む、増幅プライマー対を利用することができる。
足場アダプターのオリゴヌクレオチド成分は、インデックスポリヌクレオチド、固有分子識別子（ＵＭＩ）、プライマー結合部位（例えば、Ｐ５プライマー結合部位、Ｐ７プライマー結合部位）、フローセル結合領域もしくはシーケンシングアダプターなど、またはそれらの相補ポリヌクレオチドを含む、１つもしくは複数のさらなる小成分を含み得る。オリゴヌクレオチドは、プライマー結合部位（またはプライマー結合部位に相補的なポリヌクレオチド）を含むこともある。Ｐ５プライマー結合部位を含むオリゴヌクレオチド（またはその相補体）は、Ｐ５オリゴまたはＰ５オリゴヌクレオチドと呼ばれることがある。Ｐ７プライマー結合部位を含むオリゴヌクレオチド（またはその相補体）は、Ｐ７オリゴまたはＰ７オリゴヌクレオチドと呼ばれることがある。
足場ポリヌクレオチドをオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせて、足場アダプター内に二重鎖を形成することができる。したがって、足場アダプターは、足場二重鎖、二重鎖アダプター、二重鎖オリゴヌクレオチド、または二重鎖ポリヌクレオチドと呼ばれることがある。固有の足場ポリヌクレオチドを有する（すなわち、固有のｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域配列を含む）各足場二重鎖は、足場二重鎖種と呼ばれることがあり、複数の足場二重鎖種の一群は、複数の足場二重鎖種と呼ばれることがある。一部の実施形態では、足場ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、別々のＤＮＡ鎖上にある。一部の実施形態では、足場ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、単一のＤＮＡ鎖（例えば、ヘアピン構造を形成することができる単一のＤＮＡ鎖）上にある。
足場アダプターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組合せを含むことができる。足場アダプターは、ＤＮＡ足場ポリヌクレオチドとＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ足場ポリヌクレオチドとＲＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡ足場ポリヌクレオチドとＤＮＡオリゴヌクレオチド、またはＲＮＡ足場ポリヌクレオチドとＲＮＡオリゴヌクレオチドを含むことができる。足場アダプター組成物および設計の例は、図５４に示されている（縦線の陰影はＲＮＡを示し、斜線の陰影はＤＮＡを示す）。図５４、上部は、ＲＮＡ試料核酸に伴う、ＤＮＡ足場ポリヌクレオチドとＤＮＡオリゴヌクレオチドとを含む足場アダプターを示し、そのようなアダプターとともに使用するためのリガーゼの例としては、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２およびＴ４ ＤＮＡリガーゼが挙げられる。図５４、中央部は、ＲＮＡ試料核酸に伴う、ＤＮＡ足場ポリヌクレオチドとＲＮＡオリゴヌクレオチドとを含む足場アダプターを示し、そのようなアダプターとともに使用するためのリガーゼの例としては、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１が挙げられる。図５４、下部は、ＲＮＡ試料核酸に伴う、ＲＮＡ足場ポリヌクレオチドとＲＮＡオリゴヌクレオチドとを含む足場アダプターを示し、そのようなアダプターとともに使用するためのリガーゼの例としては、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１が挙げられる。一部の事例では、アダプターヌクレオチド組成物は、試料核酸と足場アダプター核酸間の均一性をもたらすように（例えば、少なくともオリゴヌクレオチドが試料核酸と均一であるように）選択される。一部の事例では、アダプターヌクレオチド組成物は、オリゴヌクレオチドと試料核酸間の均一性、および足場ポリヌクレオチドと試料核酸間の不均一性をも生じさせるように、選択される。
足場アダプターまたはその成分とｓｓＮＡとの結合
本明細書における方法は、１つもしくは複数の足場アダプターまたはその成分と、一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を含む組成物とを結合させて、１つまたは複数の複合体を形成するステップを含み得る。足場ポリヌクレオチドは、複合体形成時にオリゴヌクレオチド成分の末端がｓｓＮＡ断片の末端領域の末端に隣接しているような、ｓｓＮＡ断片およびオリゴヌクレオチド成分との同時ハイブリダイゼーションのために、設計される。通常は、複合体形成時にオリゴヌクレオチド成分の５’末端は、ｓｓＮＡの末端領域の３’末端に隣接しているか、またはオリゴヌクレオチド成分の５’末端は、ｓｓＮＡの末端領域の３’末端に隣接している。複合体形成時に足場アダプターがｓｓＮＡ断片の両方の末端に結合される事例では、１つのオリゴヌクレオチド成分の５’末端は、ｓｓＮＡの１つの末端領域の３’末端に隣接しており、第２のオリゴヌクレオチド成分の５’末端は、ｓｓＮＡの第２の末端領域の３’末端に隣接している。
一部の実施形態では、方法は、ｓｓＮＡ組成物と、オリゴヌクレオチドと、不確定配列の末端領域を有するｓｓＮＡの不均一集団のための足場として作用することができる様々なランダムｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を有する複数の不均一足場ポリヌクレオチドとを結合させることにより、複合体を形成するステップを含む。
一部の実施形態では、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、既知配列のｓｓＮＡ末端領域とハイブリダイズするように設計された既知配列を含む。一部の実施形態では、既知配列の異なるｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を有する２つまたはそれより多くの不均一足場ポリヌクレオチドは、既知配列のそれぞれのｓｓＮＡ末端領域とハイブリダイズするように設計される。ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が既知配列を有する実施形態は、例えば、既知配列の末端領域を有するｓｓＮＡのサブセットからの核酸ライブラリーの生成に、有用であり得る。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書における方法は、ｓｓＮＡ組成物と、オリゴヌクレオチドと、既知配列の１つまたは複数の末端領域を有する１つまたは複数のｓｓＮＡのための足場として作用することができる既知配列の１つまたは複数の異なるｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を有する１つまたは複数の不均一足場ポリヌクレオチドとを結合させることにより、複合体を形成するステップを含む。
ｓｓＮＡ断片、オリゴヌクレオチドおよび足場ポリヌクレオチドを、様々な方法で結合させることができる。一部の構成では、結合させることは、１）オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域によってオリゴヌクレオチド成分にハイブリダイズされた足場ポリヌクレオチドを含む複合体と、２）ｓｓＮＡ断片とを結合させることを含む。別の構成では、結合させることは、１）ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域によってｓｓＮＡ断片にハイブリダイズされた足場ポリヌクレオチドを含む複合体と、２）オリゴヌクレオチド成分とを結合させることを含む。別の構成では、結合させることは、１）ｓｓＮＡ断片と、２）オリゴヌクレオチドと、３）足場ポリヌクレオチドとを結合させることを含み、この場合、３成分のいずれも、結合させる前に別の成分と、事前に複合体を形成されず、ハイブリダイズもされない。
結合させることは、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域によってｓｓＮＡ断片の末端領域とハイブリダイズされた足場ポリヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域によってオリゴヌクレオチド成分とハイブリダイズされた足場ポリヌクレオチドとを含む複合体が形成されるようなハイブリダイゼーション条件下で、行なうことができる。特異的ハイブリダイゼーションが起こるかどうかは、足場ポリヌクレオチド、ｓｓＮＡ断片の末端領域およびオリゴヌクレオチド成分の、ハイブリダイゼーション領域間の相補性度、ならびにそれらの長さ、塩濃度、およびハイブリダイゼーションが起こる温度などの要因によって判定することができ、ハイブリダイゼーションが起こる温度は、関連領域の融解温度（Ｔｍ）から情報を得るこができる。
複合体を、オリゴヌクレオチド成分の末端がｓｓＮＡ断片の末端領域の末端に隣接しているように形成することができる。～に隣接しているとは、オリゴヌクレオチドの末端の末端ヌクレオチドと、ｓｓＮＡ断片の末端領域の末端ヌクレオチド末端とが、これらの末端ヌクレオチドを、例えば、化学的ライゲーション、酵素的ライゲーションなどにより、共有結合で連結することができるほど十分に、互いに近接していることを指す。一部の実施形態では、末端は、オリゴヌクレオチドの末端の末端ヌクレオチドとｓｓＮＡの末端領域の末端ヌクレオチド末端が足場ポリヌクレオチドの隣接ヌクレオチドにハイブリダイズされていることによって、互いに隣接している。足場ポリヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドの末端がｓｓＮＡ断片の末端領域の末端に確実に隣接しているように設計することができる。
足場ポリヌクレオチドを、チミンの代わりに１つまたは複数のウラシル塩基を用いて設計することができる。一部の実施形態では、足場アダプター二重鎖における鎖の一方を、例えばウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼを使用することによって、ウラシル塩基の位置に複数の切断部位を生成することにより、分解することができる。
足場アダプター、オリゴヌクレオチド成分、および足場ポリヌクレオチドは、本明細書では、第１の足場アダプター（もしくは第１の足場二重鎖）、第１のオリゴヌクレオチド成分（もしくは第１のオリゴヌクレオチド）、および第１の足場ポリヌクレオチド；または第２の足場アダプター（もしくは第２の足場二重鎖）、第２のオリゴヌクレオチド成分（もしくは第２のオリゴヌクレオチド）、および第２の足場ポリヌクレオチドと、呼ばれることがある。第１のおよび第２のという用語は、ｓｓＮＡ断片末端の第１の末端および第２の末端（すなわち、５’末端および３’末端）とハイブリダイズしている、ならびに／またはこれらに共有結合で連結されている、足場アダプターまたはその成分を、一般に指す。第１の末端および第２の末端という用語は、ｓｓＮＡ断片の特定の方向性を必ずしも指すとは限らない。したがって、ｓｓＮＡ末端の第１の末端は、５’末端であることもあり、または３’末端であることもあり、ｓｓＮＡ末端の第２の末端は、５’末端であることもあり、または３’末端であることもある。第１の足場アダプター、またはその成分は、Ｐ５アダプター、もしくはその成分、またはＰ７アダプター、もしくはその成分を指すことがある。第２の足場アダプター、またはその成分は、Ｐ５アダプター、もしくはその成分、またはＰ７アダプター、もしくはその成分を指すことがある。
一部の事例では、足場アダプターまたはその成分と、ｓｓＮＡを含む核酸試料とを結合させる前に、核酸試料をヌクレアーゼで処理して望ましくない核酸を除去することができる。例えば、本明細書で開示されるように、二本鎖特異的ヌクレアーゼ（例えば、Ｔ７ヌクレアーゼ）を使用して一部のまたはすべての二本鎖ＤＮＡを消化することができ、次いで、足場用アダプターを使用して残存核酸のシーケンシングライブラリーを調製することができる。ある例では、二本鎖特異的ヌクレアーゼは、試料中の二本鎖核酸を消化するために使用され、宿主生物および／または細菌からの二本鎖ＤＮＡを消化するが、一本鎖ＤＮＡウイルス、一本鎖ＲＮＡウイルスおよび一本鎖ＤＮＡ（例えば、損傷したＤＮＡ）からのものなどの無傷一本鎖核酸を残す。
足場アダプターまたはその成分とｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡとの結合
本明細書における方法は、１つまたは複数の複合体を形成するために、１つもしくは複数の足場アダプターまたはその成分と、一本鎖リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）または一本鎖相補デオキシリボ核酸（ｓｓｃＤＮＡ）を含む組成物とを結合させるステップを含み得る。足場ポリヌクレオチドは、ｓｓＮＡについて上記で説明されたように、複合体形成時にオリゴヌクレオチド成分の末端がｓｓＲＮＡもしくはｓｓｃＤＮＡ断片の末端領域の末端に隣接しているような、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡ断片およびオリゴヌクレオチド成分との同時ハイブリダイゼーションのために、設計される。
一部の実施形態では、核酸組成物は、ｓｓｃＤＮＡを含む。一部の実施形態では、方法は、結合させるステップの前に、ｓｓｃＤＮＡを一本鎖リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）から生成するステップを含む。通常は、核酸組成物がｓｓｃＤＮＡを含む場合、本明細書における方法は、第１鎖ｃＤＮＡを使用し、第２鎖ｃＤＮＡの生成を必要としない。したがって、一部の実施形態では、核酸組成物は、第１鎖ｓｓｃＤＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸組成物は、第１鎖ｓｓｃＤＮＡから本質的になる。第１鎖ｓｓｃＤＮＡ「から本質的になる」核酸組成物は、一般に、第１鎖ｓｓｃＤＮＡを含み、さらなるタンパク質も核酸成分も含まない。第１鎖ｓｓｃＤＮＡから本質的になる核酸組成物は、一般に、第２鎖ｓｓｃＤＮＡを含まない。加えて、例えば、第１鎖ｓｓｃＤＮＡ「から本質的になる」核酸組成物は、二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓｃＤＮＡ）を含まないこともあり、または低いパーセンテージのｄｓｃＤＮＡ（例えば、１０％未満のｄｓｃＤＮＡ、５％未満のｄｓｃＤＮＡ、１％未満のｄｓｃＤＮＡ）を含むこともある。第１鎖ｓｓｃＤＮＡ「から本質的になる」核酸組成物は、タンパク質を含まないこともある。例えば、第１鎖ｓｓｃＤＮＡ「から本質的になる」核酸組成物は、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）も、第１鎖ｓｓｃＤＮＡの安定化に有用な他のタンパク質も含まないことがある。第１鎖ｓｓｃＤＮＡ「から本質的になる」核酸組成物は、核酸組成物中に通常は存在する化学成分、例えば、緩衝剤、塩、アルコール、クラウディング剤（例えば、ＰＥＧ）などを含むことがあり、核酸源（例えば、試料）からの、核酸抽出からの、またはｃＤＮＡ合成からの残留成分（例えば、核酸（例えば、残留ＲＮＡ）、タンパク質、細胞膜成分）を含むこともある。第１鎖ｓｓｃＤＮＡ「から本質的になる」核酸組成物は、１つまたは複数のリン酸（例えば、末端リン酸、５’末端リン酸）を有する第１鎖ｓｓｃＤＮＡ断片を含むことがある。第１鎖ｓｓｃＤＮＡ「から本質的になる」核酸組成物は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む第１鎖ｓｓｃＤＮＡ断片を含むこともある。
一部の実施形態では、ｓｓｃＤＮＡを生成するステップは、ｓｓＲＮＡと、プライマー、および逆転写酵素活性を有する薬剤とを接触させることによって、ＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖を生成することを含む。一部の実施形態では、ｓｓｃＤＮＡを生成するステップは、ＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖と、ＲＮＡｓｅ活性を有する薬剤とを接触させることによって、ＲＮＡを消化し、ｓｓｃＤＮＡ産物を生成することをさらに含むことがある。一部の実施形態では、逆転写酵素活性を有する薬剤は、ＲＮＡｓｅ活性も有する。したがって、一部の実施形態では、逆転写およびＲＮＡｓｅ消化は、１ステップに組み合わせられる。一部の実施形態では、逆転写酵素活性およびＲＮＡｓｅ活性を有する薬剤は、Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写酵素（Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素とも呼ばれる）である。プライマー（単数または複数）は、逆転写酵素とともに使用するのに好適な任意のプライマー（単数または複数）であり得る。プライマー（単数または複数）は、ランダムプライマー（例えば、ランダムヘキサマープライマー、ランダムオクタマープライマー）、およびポリ（Ｔ）プライマーのうちの１つまたは複数から選択することができる。ｓｓｃＤＮＡ産物を、好適な精製または洗浄方法、例えば、本明細書に記載される精製または洗浄方法により、精製することができる。
一部の実施形態では、核酸組成物は、ｓｓＲＮＡを含む。そのような実施形態では、足場アダプターは、ｓｓＲＮＡ断片に直接ハイブリダイズされ、オリゴヌクレオチド成分は、ｓｓＲＮＡの末端のうちの１つまたは複数の末端に共有結合で連結され、それによって、１つまたは複数の足場アダプターとｓｓＲＮＡ断片とを含有するハイブリダイゼーション産物が形成される。一部の実施形態では、方法は、一本鎖ライゲーション産物をハイブリダイゼーション産物から（例えば、ハイブリダイゼーション産物を変性させることにより）生成するステップをさらに含む。そのような実施形態では、一本鎖ライゲーション産物は、１つまたは複数のオリゴヌクレオチド成分に共有結合で連結されたｓｓＲＮＡ断片を含む。一部の実施形態では、方法は、一本鎖ライゲーション産物と、プライマー、および逆転写酵素活性を有する薬剤とを接触させることによって、ＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖を生成するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖と、ＲＮＡｓｅ活性を有する薬剤とを接触させることによって、ＲＮＡを消化し、一本鎖ｃＤＮＡ（ｓｓｃＤＮＡ）産物を生成するステップをさらに含む。一部の実施形態では、逆転写酵素活性を有する薬剤は、ＲＮＡｓｅ活性も有する。したがって、一部の実施形態では、逆転写およびＲＮＡｓｅ消化は、１ステップに組み合わせられる。一部の実施形態では、逆転写酵素活性およびＲＮＡｓｅ活性を有する薬剤は、Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写酵素（Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素とも呼ばれる）である。プライマーは、逆転写酵素とともに使用するのに好適な任意のプライマーであり得る。一部の実施形態では、プライマーは、オリゴヌクレオチド成分（すなわち、ｓｓＲＮＡ断片に共有結合で連結されたオリゴヌクレオチド成分）中の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。ｓｓｃＤＮＡ産物を、好適な精製または洗浄方法、例えば、本明細書に記載される精製または洗浄方法により、精製することができる。
一部の実施形態では、ｓｓｃＤＮＡ産物は、増幅される。ｓｓｃＤＮＡ産物を、好適な増幅方法、例えば、本明細書に記載される増幅方法により、増幅することができる。一部の実施形態では、ｓｓｃＤＮＡ産物を増幅させるステップを、ＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖を生成するステップおよび／またはｓｓｃＤＮＡ産物を生成するステップと同時に行なう（例えば、単一のステップ、反応、容器および／または体積で同時に行なう）ことができる。したがって、ＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖を生成するための試薬（例えば、逆転写酵素活性を有する１つまたは複数の薬剤）、ｓｓｃＤＮＡ産物を生成するための試薬（例えば、ＲＮＡｓｅ活性を有する１つまたは複数の薬剤）およびｓｓｃＤＮＡ産物を増幅させるための試薬（例えば、プライマー、ポリメラーゼ活性を有する薬剤）を単一のステップ、反応、容器および／または体積で使用するために組み合わせることができる。一部の実施形態では、ｓｓｃＤＮＡ産物を増幅させるための試薬は、本明細書に記載される足場アダプターの成分（例えば、第１のオリゴヌクレオチド）とハイブリダイズする増幅プライマーを含む。増幅プライマーは、ポリメラーゼとともに使用するのに好適な任意のプライマーであり得る。一部の実施形態では、各プライマーは、オリゴヌクレオチド成分（すなわち、ｓｓＲＮＡ断片に共有結合で連結されたオリゴヌクレオチド成分）に対応するｓｓｃＤＮＡ産物中の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。増幅されたｓｓｃＤＮＡ産物を、好適な精製または洗浄方法、例えば、本明細書に記載される精製または洗浄方法により、精製することができる。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、ｓｓＲＮＡと足場アダプターもしくはその成分とを結合させるステップの前に、またはｓｓｃＤＮＡを生成するステップの前に、ｓｓＲＮＡを断片化することによってｓｓＲＮＡ断片を生成するステップを含む。例えば、本明細書に記載される断片化方法などの、任意の好適な断片化方法を使用することができる。一部の実施形態では、本明細書における方法は、ｓｓＲＮＡと足場アダプターもしくはその成分とを結合させるステップの前に、またはｓｓｃＤＮＡを生成するステップの前に、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を枯渇させるステップおよび／またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を濃縮するステップを含む。例えば、本明細書に記載されるｒＲＮＡ枯渇方法および／またはｍＲＮＡ濃縮方法などの、任意の好適なｒＲＮＡ枯渇方法および／またはｍＲＮＡ濃縮方法を使用することができる。
ハイブリダイゼーションおよびライゲーション
核酸断片（例えば、ｓｓＮＡ断片）を足場アダプターまたはその成分と結合させることによって結合産物を生成する。ｓｓＮＡ断片と足場アダプターまたはその成分とを結合させることは、ハイブリダイゼーションおよび／またはライゲーション（例えば、ハイブリダイゼーション産物のライゲーション）含み得る。結合産物は、ｓｓＮＡ断片の一方または両方の末端で足場アダプターまたはその成分に接続された（例えば、それとハイブリダイズされた、および／またはそれにライゲーションされた）ｓｓＮＡ断片を含み得る。結合産物は、ｓｓＮＡ断片の一方または両方の末端で足場アダプターまたはその成分とハイブリダイズされたｓｓＮＡ断片を含むことがあり、この断片は、ハイブリダイゼーション産物と呼ばれることがある。結合産物は、ｓｓＮＡ断片の一方または両方の末端で足場アダプターまたはその成分にライゲーションされたｓｓＮＡ断片を含むことがあり、この断片は、ライゲーション産物と呼ばれることがある。一部の実施形態では、切断ステップからの産物（すなわち、切断産物）を足場アダプターまたはその成分と結合させることによって結合産物を生成することができる。本明細書におけるある特定の方法は、結合産物のセット（例えば、結合産物の第１のセットおよび結合産物の第２のセット）を生成するステップを含む。一部の実施形態では、結合産物の第１のセットは、足場アダプター、またはその成分の第１のセットからの足場アダプターまたはその成分に接続された（例えば、それとハイブリダイズされた、および／またはそれにライゲーションされた）ｓｓＮＡを含む。一部の実施形態では、結合産物の第２のセットは、足場アダプター、またはその成分の第２のセットからの足場アダプターまたはその成分に接続された（例えば、それとハイブリダイズされた、および／またはそれにライゲーションされた）結合産物の第１のセットを含む。
ｓｓＮＡを足場アダプターまたはその成分とハイブリダイゼーション条件下で結合させることによってハイブリダイゼーション産物を生成することができる。一部の実施形態では、足場アダプターは、事前にハイブリダイズされた産物として提供され、ハイブリダイゼーションステップは、足場アダプターをｓｓＮＡとハイブリダイズさせることを含む。一部の実施形態では、足場アダプター成分（すなわち、オリゴヌクレオチドおよび足場ポリヌクレオチド）は、個々の成分として提供され、ハイブリダイゼーションステップは、足場アダプター成分を１）互いに、および２）ｓｓＮＡと、ハイブリダイズさせることを含む。一部の実施形態では、足場アダプター成分（すなわち、オリゴヌクレオチドおよび足場ポリヌクレオチド）は、個々の成分として逐次的に提供され、ハイブリダイゼーションステップは、１）足場ポリヌクレオチドをｓｓＮＡとハイブリダイズさせること、次いで、２）オリゴヌクレオチドを足場ポリヌクレオチドのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域とハイブリダイズさせることを含む。結合させるステップ中の条件は、足場アダプター、またはその成分（例えば、一本鎖足場領域）が、一本鎖足場領域に対して配列が相補的である末端領域（単数または複数）を有するｓｓＮＡと、特異的にハイブリダイズする条件である。結合させるステップ中の条件は、足場アダプターの成分（例えば、オリゴヌクレオチド、および足場ポリヌクレオチド中のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域）が互いに特異的にハイブリダイズするまたはハイブリダイズした状態のままである条件も含み得る。
特異的ハイブリダイゼーションは、一本鎖足場領域とｓｓＮＡ末端領域とのまたはオリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域との相補性度、それらの長さ、およびハイブリダイゼーションが起こる温度などの要因による影響を被るまたは影響を受ける可能性があり、ハイブリダイゼーションが起こる温度は、一本鎖足場領域の融解温度（Ｔｍ）から情報を得ることができる。融解温度は、一本鎖足場領域／ｓｓＮＡ末端領域の半分がハイブリダイズした状態のままであり、一本鎖足場領域／ｓｓＮＡ末端領域の半分が解離して一本鎖になる、温度を一般に指す。二重鎖のＴｍは、実験により決定することができ、または式Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（分率Ｇ＋Ｃ）－（６０／Ｎ）（式中、Ｎは、鎖長であり、［Ｎａ＋］は、１Ｍ未満である）を使用して予測することができる。様々なパラメーターに依存するさらなるモデルを使用して、様々なハイブリダイゼーション条件に依存する関連領域のＴｍを予測することができる。具体的な核酸ハイブリダイゼーションを達成するためのアプローチは、例えば、Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, part I, chapter 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," Elsevier (1993)に記載されている。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、ｓｓＮＡの末端が、それがハイブリダイズされる足場アダプターの末端に結合される条件に、ハイブリダイゼーション産物を曝露するステップを含む。詳細には、本明細書における方法は、ｓｓＮＡの末端が、それがハイブリダイズされる足場アダプターのオリゴヌクレオチド成分の末端に結合される条件に、ハイブリダイゼーション産物を曝露するステップを含み得る。結合は、ｓｓＮＡの、それがハイブリダイズされる足場アダプターおよび／または足場アダプターのオリゴヌクレオチド成分への共有結合を可能にする、任意の好適なアプローチにより果たすことができる。ｓｓＮＡの一方の末端が、それがハイブリダイズされる足場アダプターおよび／または足場アダプターのオリゴヌクレオチド成分の末端に結合されるとき、通常は、次の２つの結合事象の一方が行なわれる：１）足場アダプターのオリゴヌクレオチド成分の５’末端へのｓｓＮＡの３’末端の結合事象、または２）足場アダプターのオリゴヌクレオチド成分の３’末端へのｓｓＮＡの５’末端の結合事象。ｓｓＮＡの両方の末端が、それがハイブリダイズされる足場アダプターおよび／または足場アダプターのオリゴヌクレオチド成分の末端に各々結合されるとき、通常は、次の２つの結合事象が行なわれる：１）第１の足場アダプターのオリゴヌクレオチド成分の５’末端へのｓｓＮＡの３’末端の結合事象、および２）第２の足場アダプターのオリゴヌクレオチド成分の３’末端へのｓｓＮＡの５’末端の結合事象。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、ハイブリダイゼーション産物と、リガーゼ活性を有する薬剤とを、ｓｓＮＡの末端が、標的核酸（ｓｓＮＡ）がハイブリダイズされる足場アダプターおよび／または足場アダプターのオリゴヌクレオチド成分の末端に共有結合で連結される条件下で、接触させるステップを含む。リガーゼ活性は、例えば、平滑末端リガーゼ活性、ニックシーリングリガーゼ活性、突出末端リガーゼ活性、環状化リガーゼ活性、付着末端リガーゼ活性、ＤＮＡリガーゼ活性、ＲＮＡリガーゼ活性、一本鎖リガーゼ活性、および二本鎖リガーゼ活性を含み得る。リガーゼ活性は、１つのポリヌクレオチドの５’リン酸化末端を別のポリヌクレオチドの３’ＯＨ末端に（５’Ｐを３’ＯＨに）ライゲーションすることを含み得る。リガーゼ活性は、１つのポリヌクレオチドの３’リン酸化末端を別のポリヌクレオチドの５’ＯＨ末端に（３’Ｐを５’ＯＨに）ライゲーションすることを含むことがある。リガーゼ活性は、ｓｓＮＡの５’末端を、それとハイブリダイズされる足場アダプターおよび／またはそれとハイブリダイズされる足場アダプターのオリゴヌクレオチド成分の３’末端に、ライゲーション反応でライゲーションすることを含むことがある。リガーゼ活性は、ｓｓＮＡの３’末端を、それとハイブリダイズされる足場アダプターおよび／またはそれとハイブリダイズされる足場アダプターのオリゴヌクレオチド成分の５’末端に、ライゲーション反応でライゲーションすることを含み得る。ライゲーション反応を行うための好適な試薬（例えば、リガーゼ）およびキットは、公知であり、入手可能である。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から入手可能なＩｎｓｔａｎｔ Ｓｔｉｃｋｙ－ｅｎｄ Ｌｉｇａｓｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用することができる。使用することができるリガーゼとしては、例えば、Ｔ３リガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（例えば、低または高濃度で）、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｌｉｇａｓｅ（登録商標）、ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２、ＳｐｌｉｎｔＲ（登録商標）リガーゼ、ＲｔｃＢリガーゼ、Ｔａｑリガーゼなど、およびこれらの組合せを挙げることができるが、それらに限定されない。必要とされる場合、例えばＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）などの、好適なキナーゼを使用して、リン酸基をオリゴヌクレオチド成分またはｓｓＮＡ断片の５’末端に付加させることができる。そのようなキナーゼ、および５’末端をリン酸化するためにそのようなキナーゼを使用するためのガイダンスは、例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から入手可能である。
一部の実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチド成分およびｓｓＮＡ末端領域の隣接している末端を共有結合で連結させるステップを含み、それによって、共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物が生成される。一部の実施形態では、共有結合で連結させるステップは、ハイブリダイゼーション産物（例えば、本明細書における少なくとも１つの足場アダプターとハイブリダイズされたｓｓＮＡ断片）と、リガーゼ活性を有する薬剤とを、ｓｓＮＡ末端領域の末端がオリゴヌクレオチド成分の末端に共有結合で連結される条件下で接触させることを含む。一部の実施形態では、方法は、第１のオリゴヌクレオチド成分および第１のｓｓＮＡ末端領域の隣接している末端を共有結合で連結させるステップと、第２のオリゴヌクレオチド成分および第２のｓｓＮＡ末端領域の隣接している末端を共有結合で連結させるステップとを含み、それによって共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物が生成される。一部の実施形態では、共有結合で連結させるステップは、ハイブリダイゼーション産物（例えば、本明細書における２つの足場アダプターと各々がハイブリダイズするｓｓＮＡ断片）と、リガーゼ活性を有する薬剤とを、第１のｓｓＮＡ末端領域の末端が第１のオリゴヌクレオチド成分の末端に共有結合で連結され、第２のｓｓＮＡ末端領域の末端が第２のオリゴヌクレオチド成分の末端に共有結合で連結される条件下で、接触させることを含む。一部の実施形態では、リガーゼ活性を有する薬剤は、Ｔ４ ＤＮＡリガーセである。一部の実施形態では、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは、約１単位／μｌ～約５０単位／μｌの間の量で使用される。一部の実施形態では、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは、約５単位／μｌ～約３０単位／μｌの間の量で使用される。一部の実施形態では、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは、約５単位／μｌ～約１５単位／μｌの間の量で使用される。一部の実施形態では、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは、約１０単位／μｌで使用される。一部の実施形態では、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは、２５単位／μｌ未満の量で使用される。一部の実施形態では、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは、２０単位／μｌ未満の量で使用される。一部の実施形態では、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは、１５単位／μｌ未満の量で使用される。一部の実施形態では、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは、１０単位／μｌ未満の量で使用される。
一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション産物は、第１のリガーゼ活性を有する第１の薬剤、および第１のリガーゼ活性とは異なる第２のリガーゼ活性を有する第２の薬剤と接触される。例えば、第１のリガーゼ活性および第２のリガーゼ活性は、平滑末端リガーゼ活性、ニックシーリングリガーゼ活性、突出末端リガーゼ活性、環状化リガーゼ活性、および付着末端リガーゼ活性、二本鎖リガーゼ活性、一本鎖リガーゼ活性、５’Ｐの３’ＯＨに対するリガーゼ活性、および３’Ｐの５’ＯＨに対するリガーゼ活性から独立して選択することができる。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、ｓｓＮＡを、足場アダプターおよび／または足場アダプターのオリゴヌクレオチド成分に、生体適合性結合によって結合させるステップを含む。方法は、例えば、生体分子を結合させるのに有用な生体適合性反応を含む、クリックケミストリーまたはタグ付けを含み得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド成分の各々についての末端は、第１の化学反応性部分を含み、ｓｓＮＡの各々についての末端は、第２の化学反応性部分を含む。そのような実施形態では、第１の化学反応性部分は、通常は、第２の化学反応性部分と反応することができ、足場アダプターのオリゴヌクレオチド成分と、足場アダプターがハイブリダイズされるｓｓＮＡとの間に、共有結合を形成することができる。一部の実施形態では、本明細書における方法は、ｓｓＮＡと、１つまたは複数の化学剤とを、第２の化学反応性部分がｓｓＮＡ断片の各々についての末端に組み込まれる条件下で、接触させるステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、第１の化学反応性部分が第２の化学反応性部分と反応して、オリゴヌクレオチド成分と足場アダプターがハイブリダイズされるｓｓＮＡとの間に共有結合を形成する条件に、ハイブリダイゼーション産物を曝露するステップを含む。一部の実施形態では、第１の化学反応性部分は、第２の化学反応性部分と反応して、オリゴヌクレオチド成分と、足場アダプターがハイブリダイズされるｓｓＮＡとの間に１，２，３－トリアゾールを形成することができる。一部の実施形態では、第１の化学反応性部分は、銅を含む条件下で、第２の化学反応性部分と反応することができる。第１および第２の化学反応性部分は、任意の好適な対合を含み得る。例えば、第１の化学反応性部分は、アジド含有部分および５－オクタジイニルデオキシウラシルから選択することができ、第２の化学反応性部分は、独立して、アジド含有部分、ヘキシニルおよび５－オクタジイニルデオキシウラシルから選択することができる。一部の実施形態では、アジド含有部分は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル－アジドである。
オリゴヌクレオチドおよびｓｓＮＡ断片の隣接している末端を共有結合で連結させると、共有結合で連結された産物が生成され、この産物は、ライゲーション産物と呼ばれることがある。足場ポリヌクレオチドとハイブリダイズした状態のままである、オリゴヌクレオチド成分に共有結合で連結されたｓｓＮＡ断片を含む、共有結合で連結された産物は、共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物と呼ばれることがある。共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物を変性させて（例えば、熱変性させて）、足場ポリヌクレオチドからのオリゴヌクレオチド成分に共有結合で連結されたｓｓＮＡ断片を分離することができる。足場ポリヌクレオチドともはやハイブリダイズしていない（変性後の）、オリゴヌクレオチド成分に共有結合で連結されたｓｓＮＡ断片を含む、共有結合で連結された産物は、一本鎖ライゲーション産物と呼ばれることがある。一部の事例では、足場ポリヌクレオチドの部分を、例えば、足場ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のウラシル塩基に対してウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼまたはエンドヌクレアーゼを使用することにより、切断することおよび／または変性させることができる。
共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物および／または一本鎖ライゲーション産物を、目的の下流の応用（例えば、増幅；シーケンシング）で投入物として使用する前に精製することができる。例えば、共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物および／または一本鎖ライゲーション産物を、結合させるステップ、ハイブリダイゼーションステップおよび／または共有結合で連結させる（ライゲーション）ステップ中に存在するある特定の成分から（例えば、固相可逆的固定法（ＳＰＲＩ）、カラム精製、および／またはこれらに類することにより）精製することができる。
一部の実施形態では、本明細書における方法が、ｓｓＮＡ組成物と本明細書における足場アダプターまたはその成分とを結合させるステップ、ならびにオリゴヌクレオチド成分およびｓｓＮＡ断片の隣接している末端を共有結合で連結させるステップを含む場合、結合させるステップおよび共有結合で連結させるステップの全継続時間は、４時間もしくはそれ未満、３時間もしくはそれ未満、２時間もしくはそれ未満、または１時間もしくはそれ未満であり得る。一部の実施形態では、結合させるステップおよび共有結合で連結させるステップの全継続時間は、１時間未満である。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、マイクロ流体デバイスを含むがこれに限定されない、単一容器、単一チャンバおよび／または単一体積（すなわち、連続体積）で行なわれる。一部の実施形態では、ｓｓＮＡ組成物と本明細書における足場アダプターまたはその成分とを結合させるステップ、ならびにオリゴヌクレオチド成分およびｓｓＮＡ断片の隣接している末端を共有結合で連結させるステップは、マイクロ流体デバイスを含むがこれに限定されない、単一容器、単一チャンバおよび／または単一体積（すなわち、連続体積）で行なわれる。一部の実施形態では、本明細書における方法は、マイクロ流体デバイスを含むがこれに限定されない、一連のウェル、液滴、エマルジョン、区画または他の反応体積で行なわれる。一部の実施形態では、ｓｓＮＡ組成物と本明細書における足場アダプターまたはその成分とを結合させるステップ、ならびにオリゴヌクレオチド成分およびｓｓＮＡ断片の隣接している末端を共有結合で連結させるステップは、マイクロ流体デバイスを含むがこれに限定されない、一連のウェル、液滴、エマルジョン、区画または他の反応体積で行なわれる。一部の事例では、一連の反応体積は、反応体積の大部分またはすべてが、多くても１つのｓｓＮＡしか含まないように、調製される。一部の事例では、一連の反応体積は、反応体積の大部分またはすべてが、多くても２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００またはそれより多くのｓｓＮＡしか含まないように、調製される。反応体積への１つまたは限られた数のｓｓＮＡの分配は、試料核酸の希少種のライブラリー変換を増加させることなどの、好ましい反応動態をもたらすことができる。
アダプターダイマー
一部の実施形態では、本明細書における方法は、アダプターダイマーを防止する、低減させるまたは消失させるための１または複数の修飾および／またはさらなるステップを含む。アダプターダイマーは、本明細書に記載される方法中に意図せず形成されることがある。アダプターダイマーは、互いにハイブリダイズするかまたはハイブリダイズしてライゲーションする２つもしくはそれより多くの足場アダプター、それらの成分、またはそれらの部分を、一般に指す。ある特定のアダプターダイマー構成の例は、図２０に提供されている。
ある特定の実施形態では、足場アダプター、またはその成分は、アダプターダイマー形成を防止するように修飾される。足場アダプターの修飾の例としては、足場アダプター、オリゴヌクレオチド成分または足場ポリヌクレオチドの、別のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸分子（例えば、別の足場アダプター、オリゴヌクレオチド成分および／または足場ポリヌクレオチド）への、共有結合性連結を遮断することができる修飾ヌクレオチドが、挙げられる。修飾ヌクレオチドの例は、下で説明される。足場アダプターの他の／さらなる修飾は、Ｙ構成またはヘアピン構成などの構成を含み、これらの構成は、下でさらに詳細に説明される。一部の実施形態では、足場アダプター、オリゴヌクレオチド成分は、および／または足場ポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格修飾（例えば、鎖上の最後の２ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合）を含むことがある。
一部の実施形態では、方法は、アダプターダイマー形成を防止または低減させるための脱リン酸化ステップを含む。一部の実施形態では、方法は、足場アダプターまたはその成分をｓｓＮＡと結合させるステップの前に、足場アダプター、オリゴヌクレオチド成分および／または足場ポリヌクレオチドと、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、足場アダプター、オリゴヌクレオチド成分および／または足場ポリヌクレオチドが脱リン酸化される条件下で接触させるステップを含み、それによって、脱リン酸化された足場アダプター、脱リン酸化されたオリゴヌクレオチド成分、および／または脱リン酸化された足場ポリヌクレオチドが生成される。
一部の実施形態では、方法は、アダプターダイマー形成を防止または低減させるための１つまたは複数の段階的なライゲーションアプローチを含む。一部の実施形態では、方法は、ホスホリル転移活性を有する薬剤の付加を（例えば、ハイブリダイゼーション産物が形成し終えるまで）遅延させること、および／または第２の足場アダプターもしくはその成分の付加を遅延させることを含む、段階的なライゲーションを含む（図９を参照されたい）。例えば、方法は、ハイブリダイゼーション産物を形成するステップの後、かつオリゴヌクレオチド成分をｓｓＮＡ末端領域に共有結合で連結させるステップの前に、オリゴヌクレオチド成分と、ホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸がオリゴヌクレオチド成分の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含み得る。別の例では、方法は、足場アダプターの第１のセットをｓｓＮＡと結合させるステップを含み得る。足場アダプターの第１のセットは、３’ＯＨを有するオリゴヌクレオチド成分を含み得る。足場アダプターの第１のセットは、ｓｓＮＡにハイブリダイズされ、オリゴヌクレオチド成分の３’ＯＨは、ｓｓＮＡ末端領域の５’末端（例えば、５’リン酸化末端）に共有結合で連結される。ハイブリダイゼーションおよび共有結合性連結のこのような第１のラウンドの産物は、共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物中間体と呼ばれることがある。共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物中間体は、次いで、足場アダプターの第２のセットと結合される。足場アダプターの第２のセットは、本明細書に記載されるようにリン酸化され得る５’末端を有するオリゴヌクレオチド成分を含み得る。足場アダプターの第２のセットは、共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物中間体にハイブリダイズされ、オリゴヌクレオチド成分の５’リン酸化末端は、ｓｓＮＡ末端領域の３’末端に共有結合で連結される。
一部の実施形態では、方法は、アデニル化修飾を有する足場アダプターまたはその成分の使用を含む、段階的なライゲーションを含む（図１０を参照されたい）。例えば、足場アダプターの第１のセットは、オリゴヌクレオチド成分の５’末端のアデニル化修飾（５’Ａｐｐ）を含むことがある。足場アダプターの第１のセットは、ｓｓＮＡにハイブリダイズされ、オリゴヌクレオチド成分の５’Ａｐｐは、ｓｓＮＡ末端領域の３’末端に共有結合で連結される。共有結合性連結は、ＡＴＰの非存在下で行なわれることもある。ハイブリダイゼーションおよび共有結合性連結のこのような第１のラウンドの産物は、共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物中間体と呼ばれることがある。共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物中間体は、次いで、足場アダプターの第２のセットと結合される。足場アダプターの第２のセットは、３’ＯＨ末端を有するオリゴヌクレオチド成分を含み得る。足場アダプターの第２のセットは、共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物中間体にハイブリダイズされ、オリゴヌクレオチド成分の３’ＯＨ末端は、ｓｓＮＡ末端領域の５’末端（例えば、５’リン酸化末端）に（ＡＴＰの付加によって）共有結合で連結される。１つの変形形態では、足場アダプターの第１のセットおよび足場アダプターの第２のセットは、ＡＴＰの非存在下で同時にｓｓＮＡと結合される。足場アダプターの第１のセットのライゲーションは、ＡＴＰの非存在下で進行することができ、足場アダプターの第２のセットのライゲーションは、ＡＴＰが付加されるまでしか進行することができない。
一部の実施形態では、方法は、３’リン酸化末端を有するオリゴヌクレオチド（すなわち、一本鎖オリゴヌクレオチド）の使用を含む、段階的なライゲーションを含む（図１１を参照されたい）。３’リン酸化末端を有するオリゴヌクレオチドは、足場アダプターのオリゴヌクレオチド成分についての本明細書に記載される小成分（例えば、プライマー結合部位、インデックス、ＵＭＩ、フローセルアダプターなど）のいずれかを含み得る。３’リン酸化末端を有するオリゴヌクレオチドは、一般に、一本鎖状であり、足場ポリヌクレオチドとハイブリダイズされていない。一例では、方法は、足場アダプターまたはその成分とｓｓＮＡとを結合させるステップの前に、ｓｓＮＡと、３’末端にリン酸を含むオリゴヌクレオチドとを結合させるステップ、およびオリゴヌクレオチドの３’リン酸化末端をｓｓＮＡ末端領域の５’末端（例えば、５’非リン酸化末端）に共有結合で連結させるステップを含み得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドをｓｓＮＡに共有結合で連結させるステップの前に、ｓｓＮＡは、ホスファターゼ活性を有する薬剤と、ｓｓＮＡが脱リン酸化される条件下で接触され、それによって脱リン酸化されたｓｓＮＡが生成される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドをｓｓＮＡに共有結合で連結させるステップは、ｓｓＮＡおよびオリゴヌクレオチドと、一本鎖リガーゼ活性を有する薬剤とを、ｓｓＮＡの５’末端がオリゴヌクレオチドの３’末端に共有結合で連結される条件下で接触させることを含む。一部の実施形態では、リガーゼ活性を有する薬剤は、ＲｔｃＢリガーセである。そのような共有結合で連結させるステップの産物は、共有結合で連結された産物中間体と呼ばれることがある。共有結合で連結された産物中間体は、次いで、足場アダプターのセットと結合される。足場アダプターのセットは、５’リン酸化末端を有するオリゴヌクレオチド成分を含むことがある。足場アダプターのセットは、共有結合で連結された産物中間体にハイブリダイズされ、オリゴヌクレオチド成分の５’リン酸化末端は、ｓｓＮＡ末端領域の３’末端に共有結合で連結される。
一部の実施形態では、方法は、アダプターダイマーを低減または消失させるための、オリゴヌクレオチドダイマー産物とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドの使用（図２０を参照されたい）を含む。オリゴヌクレオチドダイマー産物は、足場アダプターダイマーの成分であり、第２の足場アダプターからのオリゴヌクレオチド成分に共有結合で連結された第１の足場アダプターからのオリゴヌクレオチド成分を含有し得る。本明細書における方法は、足場アダプターダイマーからオリゴヌクレオチドダイマー産物を放出させることができる変性ステップを含み得る。オリゴヌクレオチドダイマー産物は、オリゴヌクレオチドダイマー産物、またはその一部、に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができ、それによってオリゴヌクレオチドダイマーハイブリダイゼーション産物が形成される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドダイマーハイブリダイゼーション産物は、切断部位を含む。一部の実施形態では、切断部位は、制限酵素認識部位である。一部の実施形態では、本明細書における方法は、オリゴヌクレオチドダイマーハイブリダイゼーション産物と切断剤（例えば、制限酵素、レアカッター制限酵素）とを接触させるステップをさらに含む。
一部の実施形態では、方法は、アダプターダイマーを低減または消失させるためにライブラリー調製の様々な段階で核酸産物を精製または洗浄するステップを含む。一部の事例では、核酸産物を精製または洗浄するステップは、アダプターダイマーを低減または消失させることができる。例えば、共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物（すなわち、足場アダプターとハイブリダイズされ、オリゴヌクレオチド成分に共有結合で連結された、ｓｓＮＡ）、一本鎖ライゲーション産物（すなわち、変性された、共有結合で連結された、ハイブリダイゼーション産物；オリゴヌクレオチド成分に共有結合で連結されており、もはや足場ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができない、ｓｓＮＡ）、またはこれらの増幅産物を、任意の好適な精製または洗浄方法により精製または洗浄することができる。一部の実施形態では、精製または洗浄するステップは、固相可逆的固定法（ＳＰＲＩ）の使用を含む。例えば、約２．５Ｍ～約５Ｍ ＮａＣｌ、約０．１ｍＭ～約１Ｍ ＥＤＴＡ、約１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、約０．０１％～約０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０、および約８％～約３８％の間のＰＥＧ－８０００を含有する、ＤＮＡ結合緩衝液に、ＳＰＲＩビーズを懸濁させることができる。例えば、１ｍｌのＳＰＲＩビーズ懸濁液を、２．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０および２０％ＰＥＧ－８０００と併せることができる。一部の実施形態では、ＳＰＲＩは、連続的ＳＰＲＩ（連続して行なわれる洗浄）およびまたは逐次的ＳＰＲＩ（逐次的なＳＰＲＩビーズの添加およびインキュベーションを含む洗浄）を含む。連続的ＳＰＲＩは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回またはそれより多くの連続的洗浄を含み得る、複数の連続的（連続した）洗浄を含み得る。逐次的ＳＰＲＩは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回またはそれより多くのＳＰＲＩビーズの逐次的添加を含み得る、ＳＰＲＩビーズの複数の逐次的添加（インキュベーションが介在する）を含み得る。一部の実施形態では、ＳＰＲＩ精製に使用されるＳＰＲＩビーズの量は、０．１×～３×ＳＰＲＩビーズの間の量を含み得る（×は、ビーズの核酸に対する（例えば、ビーズ体積の反応体積に対する）比である）。例えば、ＳＰＲＩ精製において使用されるＳＰＲＩビーズの量は、約０．１×、０．２×、０．３×、０．４×、０．５×、０．６×、０．７×、０．８×、０．９×、１．０×、１．１×、１．２×、１．３×、１．４×、１．５×、１．６×、１．７×、１．８×、１．９×、２．０×、２．１×、２．２×、２．３×、２．４×、２．５×、２．６×、２．７×、２．８×、２．９×、または３．０×ＳＰＲＩビーズを含み得る。一部の実施形態では、ＳＰＲＩ精製において使用されるＳＰＲＩビーズの量は、１．２×である。一部の実施形態では、ＳＰＲＩ精製において使用されるＳＰＲＩビーズの量は、１．５×である。一部の実施形態では、精製または洗浄するステップは、カラム精製（例えば、カラムクロマトグラフィー）を含む。一部の実施形態では、精製または洗浄するステップは、カラム精製（例えば、カラムクロマトグラフィー）を含まない。一部の実施形態では、共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物、一本鎖ライゲーション産物、および／またはそれらの増幅産物は、精製も洗浄もされない。
ＳＰＲＩ精製は、通常は、緩衝液の存在下で行なわれる。任意の好適な緩衝液、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液、同様のｐＨのものである水などを、使用することができる。ＳＰＲＩ精製ビーズを、試料溶液（例えば、共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物（ライゲーション産物）またはそれらの増幅された産物を含有する、試料溶液）に直接添加することができる。ある特定の事例では、緩衝液を添加して反応の体積を増加させることができ、したがってさらなるビーズを添加することができる。一部の実施形態では、ＳＰＲＩビーズ溶液は、水、ＮａＣｌ、ＴｒｉｓおよびＥＤＴＡに溶解されたＰＥＧ ８０００に添加された、カルボキシル化磁気ビーズで構成されている。通常は、ＰＥＧの量によってＳＰＲＩビーズ溶液のＰＥＧパーセンテージが決まる。例えば、５０ｍｌ ＳＰＲＩビーズ溶液中９ｇのＰＥＧ ８０００の添加は、「１８％ＳＰＲＩ」と呼ばれることがある。別の例では、５０ｍｌ ＳＰＲＩ溶液中１９ｇのＰＥＧ ８０００の添加は、「３８％ＳＰＲＩ」と呼ばれることがある。一般に、ＰＥＧの比率が高いほど、保持されるＤＮＡ断片のサイズは小さい。
一部の実施形態では、精製プロセスは、共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物（ライゲーション産物）と、固相可逆的固定法（ＳＰＲＩ）ビーズおよび緩衝液とを接触させるステップを含む。一部の実施形態では、一部またはすべてのＳＰＲＩ緩衝液がイソプロパノールで置き換えられる。一部の実施形態では、ＳＰＲＩ緩衝液は、イソプロパノールを含む。一部の実施形態では、ＳＰＲＩ緩衝液は、イソプロパノールで完全に置き換えられる。一部の実施形態では、ＳＰＲＩ緩衝液は、約５％体積／体積（ｖ／ｖ）イソプロパノール～約５０％ ｖ／ｖイソプロパノールを含む。一部の実施形態では、ＳＰＲＩ緩衝液は、約１０％ ｖ／ｖ イソプロパノール～約４０％ ｖ／ｖ イソプロパノールを含む。例えば、ＳＰＲＩ緩衝液は、約１０％ ｖ／ｖイソプロパノール、１５％ ｖ／ｖイソプロパノール、２０％ ｖ／ｖイソプロパノール、２５％ ｖ／ｖイソプロパノール、３０％ ｖ／ｖイソプロパノール、３５％ ｖ／ｖイソプロパノール、または４０％ ｖ／ｖイソプロパノールを含み得る。一部の実施形態では、ＳＰＲＩ緩衝液は、約２０％ ｖ／ｖ イソプロパノールを含む。
一部の実施形態では、精製または洗浄するステップは、特定の長さまたは長さの範囲を有する核酸断片またはそれらの増幅産物を濃縮することができる。一部の実施形態では、ＳＰＲＩ精製は、特定の長さまたは長さの範囲を有する核酸断片またはそれらの増幅産物を濃縮することができる。一部の実施形態では、ＳＰＲＩ精製において使用されるＳＰＲＩビーズ溶液中のＰＥＧ ８０００の量は、濃縮される断片の長さまたは長さの範囲に影響を与え得る。例えば、１．５× ｖ／ｖ比でのＳＰＲＩ精製は、＜１００塩基の範囲において１．２×でのＳＰＲＩ精製より多くの断片を回収することができる。なぜなら、ＰＥＧ ８０００の最終濃度が１．２×でよりも１．５×でのほうが高いからである。一部の実施形態では、本明細書における方法は、所望の断片長または長さの範囲を濃縮するようにＳＰＲＩ比を調整するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、所望の断片長または長さの範囲を濃縮するようにＳＰＲＩ精製におけるイソプロパノールの量を調整するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、望ましくないアーチファクト（例えば、アダプターダイマー）の量を最小限に抑えつつ所望の断片長または長さの範囲を濃縮するように、ＳＰＲＩ精製におけるイソプロパノールの量を調整するステップを含む。例えば、本明細書における方法は、所望の断片長または長さの範囲を濃縮するようにＳＰＲＩ精製におけるイソプロパノールの量を調整するステップであって、回収されるアダプターダイマーの量が、回収される全核酸の約１０％未満である、ステップを含む。別の例では、本明細書における方法は、所望の断片長または長さの範囲を濃縮するようにＳＰＲＩ精製におけるイソプロパノールの量を調整するステップであって、回収されるアダプターダイマーの量が、回収される全核酸の約５％未満である、ステップを含む。
一部の実施形態では、本明細書における方法（例えば、ｓｓＮＡと足場アダプターまたはその成分とを結合させるステップ、ハイブリダイゼーション、および共有結合で連結させステップ）を、好適な反応体積で、ならびに／またはｓｓＮＡの好適な量および／もしくはｓｓＮＡの足場アダプター（もしくはその成分）に対する好適な比を用いて、行なうことができる。好適な反応体積、および／またはｓｓＮＡの好適な量、および／またはｓｓＮＡの足場アダプター（もしくはその成分）に対する好適な比は、アダプターダイマー形成を低減させるまたは防止する反応体積、ｓｓＮＡの量、および／またはｓｓＮＡと足場アダプターの比を含み得る。一部の実施形態では、ｓｓＮＡの好適な量は、ｓｓＮＡ約２５０ｐｇ～約５ｎｇの範囲であり得る。例えば、ｓｓＮＡの好適な量は、約２５０ｐｇ、５００ｐｇ、７５０ｐｇ、１ｎｇ、１．５ｎｇ、２ｎｇ、２．５ｎｇ、３ｎｇ、３．５ｎｇ、４ｎｇ、４．５ｎｇ、または５ｎｇであり得る。一部の実施形態では、ｓｓＮＡの好適な量は、ｓｓＮＡ約１ｎｇであり得る。一部の実施形態では、２５μｌの最終反応体積の場合は、１ｎｇのｓｓＮＡを、約１．０～２．０ピコモルの間の各足場アダプター（すなわち、ｓｓＮＡ末端領域の５’末端とハイブリダイズする約１．０～２．０ピコモルの足場アダプター（複数の足場アダプター種を含有する足場アダプターのプール）、およびｓｓＮＡ末端領域の３’末端とハイブリダイズする約１．０～２．０ピコモルの足場アダプター（複数の足場アダプター種を含有する足場アダプターのプール））と結合させることができる。例えば、２５μｌの最終反応体積の場合は、１ｎｇのｓｓＮＡを、約１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２．０ピコモルの各足場アダプターと結合させることができる。一部の実施形態では、２５μｌの最終反応体積の場合は、１ｎｇのｓｓＮＡは、約１．６ピコモルの各足場アダプター（すなわち、ｓｓＮＡ末端領域の５’末端とハイブリダイズする約１．６ピコモルの足場アダプター、およびｓｓＮＡ末端領域の３’末端とハイブリダイズする約１．６ピコモルの足場アダプター）と結合される。より大きい反応体積の場合、ｓｓＮＡおよび足場アダプターの量を、相対量が保存されることを条件に、規模拡大することができる。より小さい反応体積の場合、ｓｓＮＡおよび足場アダプターの量を、相対量が保存されることを条件に、規模縮小することができる。一部の実施形態では、本明細書における足場アダプターは、ｓｓＮＡと、約５：１（足場アダプター対ｓｓＮＡ）～約５０：１（足場アダプター対ｓｓＮＡ）の間のモル比で結合される。例えば、足場アダプターを、ｓｓＮＡと、約５：１（足場アダプター対ｓｓＮＡ）、約１０：１（足場アダプター対ｓｓＮＡ）、約１５：１（足場アダプター対ｓｓＮＡ）、約２０：１（足場アダプター対ｓｓＮＡ）、約２５：１（足場アダプター対ｓｓＮＡ）、約３０：１（足場アダプター対ｓｓＮＡ）、約３５：１（足場アダプター対ｓｓＮＡ）、約４０：１（足場アダプター対ｓｓＮＡ）、約４５：１（足場アダプター対ｓｓＮＡ）、または約５０：１（足場アダプター対ｓｓＮＡ）のモル比で結合させることができる。一部の実施形態では、足場アダプターは、ｓｓＮＡと、約１５：１（足場アダプター対ｓｓＮＡ）のモル比で結合される。一部の実施形態では、足場アダプターは、ｓｓＮＡと、約３０：１（足場アダプター対ｓｓＮＡ）のモル比で結合される。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、クラウディング剤の使用を含む。好適な量のクラウディング剤を使用してアダプターダイマー形成を低減させることまたは防止することができる。クラウディング剤としては、例えば、フィコール７０、デキストラン７０、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２０００、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００を挙げることができる。一部の実施形態では、本明細書における方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００の使用を含む。ＰＥＧを、例えば、約１５％～約２０％の間の量で使用することができ、このパーセンテージは、ライゲーション反応におけるＰＥＧの最終濃度を指す。例えば、ＰＥＧを、約１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％または２０％で使用することができる。一部の実施形態では、１８．５％ＰＥＧが使用される。一部の実施形態では、１８％ＰＥＧが使用される。
精製中にＳＰＲＩビーズ溶液を試料溶液に添加することができ、多くの場合、ｖ／ｖ比についての指示がある。例えば、１．２×１８％ＳＰＲＩは、５０μｌ試料を入れる場合に６０μｌ（５０×１．２）の１８％ＳＰＲＩビーズを添加することを意味する。このｖ／ｖ比は、試料溶液中にＰＥＧがないことを仮定すると、９．８％のＰＥＧの最終濃度に至る。しかし、多くの場合、ライゲーション後に、試料溶液（すなわち、ライゲーション産物）中に存在するＰＥＧの既存量がある。したがって、ユーザーは、添加するＳＰＲＩビーズの量を、所望の最終ＰＥＧ濃度に達するように調整することができる。所望の最終ＰＥＧ濃度は、約５％最終ＰＥＧ～約１５％最終ＰＥＧの範囲であり得る。例えば、所望の最終ＰＥＧ濃度は、約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％であり得る。一部の実施形態では、所望の最終ＰＥＧ濃度は、約１０％（例えば、毛髪試料およびｃｆＤＮＡ試料について）である。一部の実施形態では、所望の最終ＰＥＧ濃度は、約１２％（例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料、および大きい鋳型断片を有する試料について）である。
Ｙアダプター
一部の実施形態では、本明細書に記載される足場アダプターは、２本の鎖を含み、第１の末端に一本鎖足場領域があり、第２の末端に２本の非相補鎖がある。そのような足場アダプターは、Ｙ足場アダプター、Ｙアダプター、Ｙ形足場アダプター、Ｙ形アダプター、Ｙ二重鎖、Ｙ形二重鎖、Ｙ足場二重鎖、Ｙ形足場二重鎖などと呼ばれることがある。Ｙ形構造を有する足場アダプターは、一般に、二本鎖二重鎖領域を含み、一方の末端に２つの一本鎖「アーム」を、および他方の末端に一本鎖足場領域を含む。
Ｙ足場アダプターは、複数の核酸成分および小成分を含み得る。一部の実施形態では、Ｙ足場アダプターは、第１の核酸鎖および第２の核酸鎖を含む。一部の実施形態では、第１の核酸鎖は、第２の核酸鎖に相補的である。一部の実施形態では、第１の核酸鎖の一部分は、第２の核酸鎖の一部分に相補的である。一部の実施形態では、第１の核酸鎖は、第２の核酸鎖中の第１の領域に相補的である第１の領域を含み、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチド中の第２の領域に相補的でない第２の領域を含む。相補的な領域は、Ｙ足場アダプターの二重鎖領域を形成することが多く、非相補的な領域は、Ｙ足場アダプターのアームまたはそれらの部分を形成することが多い。第１および第２の核酸鎖は、小成分（例えば、足場ポリヌクレオチドの小成分、オリゴヌクレオチドの小成分、ならびに本明細書に記載されるシーケンシングアダプターの小成分、例えば、増幅プライミング部位および／または個別のシーケンシングアダプター（例えば、Ｐ５、Ｐ７アダプター）など）を含むことがある。一部の実施形態では、第１および第２の核酸鎖は、本明細書に記載されるシーケンシングアダプターのある特定の小成分、例えば、増幅プライミング部位および／または個別のシーケンシングアダプター（例えば、Ｐ５、Ｐ７アダプター）などを含まない。
一部の実施形態では、Ｙ足場アダプターは、一本鎖足場領域（ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域）を含む。Ｙ足場アダプターの一本鎖足場領域は、二本鎖二重鎖部分に隣接して、非相補鎖（または「アーム」）部分の反対側の末端に、通常は位置する。Ｙ足場アダプターの一本鎖足場領域は、通常は、標的核酸の末端領域（例えば、一本鎖核酸の末端領域）に相補的である。
ヘアピン
一部の実施形態では、足場アダプターは、一本鎖ループを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含む。一部の実施形態では、足場アダプターは、一本鎖ループを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖からなる。ヘアピン構造を有する足場アダプターは、一般に、二本鎖「ステム」領域および一本鎖「ループ」領域を含む。一部の実施形態では、足場アダプターは、ヘアピン構造をとることができる１本の鎖（すなわち、１本の連続鎖）を含む。一部の実施形態では、足場アダプターは、ヘアピン構造をとることができる１本の鎖（すなわち、１本の連続鎖）から本質的になる。１本の鎖から本質的になるとは、足場アダプターが、連続鎖の一部でない、核酸の（例えば、足場アダプターとハイブリダイズされたるさらなる鎖を一切含まないことを意味する。したがって、ここでの「から本質的になる」は、足場アダプター中の鎖の数を指し、足場アダプターは、鎖の数に不可欠でない他の特徴を含むことができる（例えば、検出可能な標識を含むことができる；他の領域を含むことができる）。ヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含むまたはそのような１本の鎖から本質的になる足場アダプターは、本明細書では、ヘアピン、ヘアピン足場アダプター、またはヘアピンアダプターと呼ばれることがある。
ヘアピン足場アダプターは、１本の鎖の中に複数の核酸成分および小成分を含むことがある。一部の実施形態では、ヘアピン足場アダプターは、オリゴヌクレオチドおよび足場ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチド中のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域に相補的である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの一部分は、足場ポリヌクレオチド中のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域の一部分に相補的である。一部の実施形態では、ヘアピン足場アダプターは、相補領域および非相補領域を含む。相補領域は、ヘアピンアダプターのステムを形成することが多く、非相補領域は、ヘアピン足場アダプターのループまたはその一部を形成することが多い。オリゴヌクレオチドおよび足場ポリヌクレオチドは、小成分（例えば、足場ポリヌクレオチドの小成分、オリゴヌクレオチドの小成分、ならびに本明細書に記載されるシーケンシングアダプターの小成分、例えば、増幅プライミング部位および／または個別のシーケンシングアダプター（例えば、Ｐ５、Ｐ７アダプター）など）を含むことがある。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドおよび足場ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるシーケンシングアダプターのある特定の小成分、例えば、増幅プライミング部位および個別のシーケンシングアダプター（例えば、Ｐ５、Ｐ７アダプター）などを含まない。
ヘアピン足場アダプターは、切断条件下で切断され得る１つまたは複数の切断部位を含むことがある。一部の実施形態では、切断部位は、オリゴヌクレオチドと足場ポリヌクレオチドの間に位置する。切断部位での切断は、ヘアピン足場アダプターから２本の別々の鎖を生成することが多い。一部の実施形態では、切断部位での切断は、「Ｙ」構造を形成する２つの不対合鎖を有する部分的に二本鎖の足場アダプターを生成する。切断部位は、例えば、本明細書に記載される切断部位などの、任意の好適な切断部位を含み得る。一部の実施形態では、切断部位は、ＲＮＡヌクレオチドを含み、例えばＲＮＡｓｅを使用して切断され得る。一部の実施形態では、切断部位は、ウラシルおよび／またはデオキシウリジンを含み、例えば、ＤＮＡグリコシラーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅなど、およびこれらの組合せを使用して切断され得る。一部の実施形態では、切断部位は、ウラシルおよび／またはデオキシウリジンを含まない。一部の実施形態では、本明細書における方法は、ヘアピン足場アダプターと一本鎖核酸とを結合させるステップの後、１つまたは複数の切断部位を切断条件に曝露するステップを含み、それによって足場アダプターが切断される。
一部の実施形態では、ヘアピン足場アダプターは、一本鎖足場領域（ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域）を含む。ヘアピン足場アダプターの一本鎖足場領域は、通常は、二本鎖ステム部分に隣接して、ループ部分の反対側の末端に位置する。ヘアピン足場アダプターの一本鎖足場領域は、通常は、標的核酸の末端領域（例えば、一本鎖核酸の末端領域）に相補的である。
一部の実施形態では、ヘアピン足場アダプターは、５’から３’の方向に、オリゴヌクレオチド；１つまたは複数の切断部位；およびオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域と足場領域（ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域）とを含む足場ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ヘアピンオリゴヌクレオチドは、５’から３’の方向に、足場領域（ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域）とオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域とを含む足場ポリヌクレオチド；１つまたは複数の切断部位；およびオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、複数のヘアピン足場アダプター、またはヘアピン足場アダプターのプールは、１）５’から３’の方向に、オリゴヌクレオチド；１つまたは複数の切断部位；およびオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域と足場領域（ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域）とを含む足場ポリヌクレオチドを含む、ヘアピン足場アダプターと、２）５’から３’の方向に、足場領域（ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域）とオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域とを含む足場ポリヌクレオチド；１つまたは複数の切断部位；およびオリゴヌクレオチドを含む、ヘアピン足場アダプターとの、混合物を含む。
修飾ヌクレオチド
一部の実施形態では、足場アダプター、またはその成分は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドは、修飾塩基と呼ばれることがあり、例えば、結合対のメンバーにコンジュゲートされたヌクレオチド、遮断されたヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、架橋核酸（ＢＮＡ）ヌクレオチド、グリコール核酸（ＧＮＡ）ヌクレオチド、トレオース核酸（ＴＮＡ）ヌクレオチドなど、およびこれらの組合せを含み得る。一部の実施形態では、足場アダプター、またはその成分は、足場アダプターまたはその成分の、二重鎖領域内に、足場領域内に、一方の末端に、または両方の末端に、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、足場アダプター、またはその成分は、１つまたは複数の不対合修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、足場アダプター、またはその成分は、アダプターの一方の末端に１つまたは複数の不対合修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、足場アダプター、またはその成分は、標的核酸とハイブリダイズする末端（例えば、一本鎖足場領域を含む末端）の反対側のアダプターの末端に、１つまたは複数の不対合修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドは、３’末端を有する鎖の末端に存在することもあり、または５’末端を有する鎖の末端に存在することもある。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド成分は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、別のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸分子へのオリゴヌクレオチド成分の共有結合性連結を遮断することができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド成分は、ｓｓＮＡに隣接していない末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、足場ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、別のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸分子への足場ポリヌクレオチドの共有結合性連結を遮断することができる。足場ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの一方または両方の末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むことがある。一部の実施形態では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、ライゲーションを遮断する修飾を含む。
一部の実施形態では、足場アダプター、またはその成分は、１つまたは複数の遮断されたヌクレオチドを含む。一例では、足場アダプター、またはその成分は、別の足場アダプターまたはその成分中のヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを遮断することができる１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むことがある。一部の事例では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、別の足場アダプターまたはその成分中のヌクレオチドへのライゲーションを遮断することができる。別の例では、足場アダプター、またはその成分は、標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）中のヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを遮断することができる１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むことがある。一部の事例では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、標的核酸中のヌクレオチドへのライゲーションを遮断することができる。一部の実施形態では、足場ポリヌクレオチドの一方または両方の末端は、遮断する修飾を含み、および／またはｓｓＮＡ断片に隣接していないオリゴヌクレオチド成分の末端は、遮断する修飾を含むことがある。遮断する修飾は、オリゴヌクレオチド成分およびｓｓＮＡ断片の隣接している末端を共有結合で連結させるために用いられるアプローチを使用して別の核酸成分の末端に連結させることができない、修飾された末端を指す。ある特定の実施形態では、遮断する修飾は、ライゲーションを遮断する修飾である。足場ポリヌクレオチドの一方もしくは両方の末端および／またはｓｓＮＡに隣接していないオリゴヌクレオチド成分の末端に含まれることがある、遮断する修飾の例としては、３’ＯＨの非存在、および接近不可能な３’ＯＨが挙げられる。末端が接近不可能な３’ＯＨを有する、遮断する修飾の非限定的な例としては、アミノ修飾因子、アミノリンカー、スペーサー、イソデオキシ塩基、ジデオキシ塩基、逆方向ジデオキシ塩基、３’リン酸などが挙げられる。一部の実施形態では、足場アダプター、またはその成分は、天然ヌクレオチドに結合することができない１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、イソデオキシ－塩基を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、イソデオキシ－グアニン（イソ－ｄＧ）を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、イソデオキシ－シトシン（イソ－ｄＣ）を含む。イソ－ｄＣおよびイソ－ｄＧは、それぞれ、シトシンおよびグアニンの化学的バリアントである。イソ－ｄＣは、イソ－ｄＧと水素結合することができるが、未修飾グアニン（天然グアニン）とはできない。イソ－ｄＧは、イソ－ｄＣと塩基対合することができるが、未修飾シトシン（天然シトシン）とはできない。イソ－ｄＣを含有する骨格アダプターまたはその成分を、イソ－ｄＧを含有する相補的オリゴとハイブリダイズするが、天然に存在するいずれの核酸配列ともハイブリダイズすることができないように、設計することができる。
一部の実施形態では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、メチル化、ヒドロキシメチル化およびカルボキシル化を含むがこれらに限定されない、エピジェネティクス関連修飾を含む。エピジェネティクス関連修飾の例としては、カルボキシシトシン、５－メチルシトシン（５ｍＣ）およびその酸化誘導体（例えば、５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）、５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）、および５－カルボニルシトシン（arboxylcytosine）（５ｃａＣ））、Ｎ（６）－メチルアデニン（６ｍＡ）、Ｎ４－メチルシトシン（４ｍＣ）、Ｎ（６）－メチルアデノシン（ｍ（６）Ａ）、プソイドウリジン（Ψ）、５－メチルシチジン（ｍ（５）Ｃ）、ヒドロキシメチルウラシル、３’末端の２’－Ｏ－メチル化、ｔＲＮＡ修飾、ｍｉＲＮＡ修飾、およびｓｎＲＮＡ修飾が、挙げられる。
一部の実施形態では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、ジデオキシ－塩基を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、ジデオキシ－シトシンを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、逆方向ジデオキシ－塩基を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、逆方向ジデオキシ－チミンを含む。例えば、配列の５’末端に位置する逆方向ジデオキシ－チミンは、望ましくない５’ライゲーションを防止することができる。
一部の実施形態では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、スペーサーを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、Ｃ３スペーサーを含む。Ｃ３スペーサーホスホロアミダイトをオリゴヌクレオチドの内部にまたは５’末端に組み込むことができる。複数のＣ３スペーサーを骨格アダプターまたはその成分のどちらかの末端に付加させて、長い親水性スペーサーアームを（例えば、フルオロフォアまたは他のペンダント基の結合のために）導入することができる。他のスペーサーとしては、例えば、光切断性（ＰＣ）スペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、１’，２’－ジデオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）などが挙げられる。
一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、アミノリンカーまたはアミノ遮断剤を含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、アミノリンカーＣ６（例えば、５’アミノリンカーＣ６または３’アミノリンカーＣ６）を含む。一例では、アミノリンカーＣ６を使用して、活性一級アミノ基をオリゴヌクレオチドの５’末端に組み込むことができる。次いで、これをリガンドにコンジュゲートすることができる。すると、アミノ基は、５’末端リガンドに内在化される。アミノ基は、アミノ基とオリゴとの立体相互作用を低減させるように６炭素スペーサーアームによって５’末端ヌクレオチド塩基から離隔される。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、アミノリンカーＣ１２（例えば、５’アミノリンカーＣ１２または３’アミノリンカーＣ１２）を含む。一例では、アミノリンカーＣ１２を使用して、活性一級アミノ基をオリゴヌクレオチドの５’末端に組み込むことができる。アミノ基は、アミノ基とオリゴとの立体相互作用を最小にするように１２炭素スペーサーアームによって５’末端ヌクレオチド塩基から離隔される。
一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、結合対のメンバーを含む。結合対は、例えば、抗体／抗原、抗体／抗体、抗体／抗体断片、抗体／抗体受容体、抗体／プロテインＡもしくはプロテインＧ、ハプテン／抗ハプテン、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、葉酸／葉酸結合タンパク質、ビタミンＢ１２／内因子、化学反応性基／相補的化学反応性基、ジゴキシゲニン部分／抗ジゴキシゲニン抗体、フルオレセイン部分／抗フルオレセイン抗体、ステロイド／ステロイド結合タンパク質、オペレーター／リプレッサー、ヌクレアーゼ／ヌクレオチド、レクチン／多糖、活性化合物／活性化合物受容体、ホルモン／ホルモン受容体、酵素／基質、オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド／その対応する補体など、またはこれらの組合せを含み得る。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ビオチンを含む。
一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、結合対の第１のメンバー（例えば、ビオチン）を含み、結合対の第２のメンバー（例えば、ストレプトアビジン）は、固体支持体または基板にコンジュゲートされている。固体支持体または基板は、マイクロアレイおよびウェルにより提供される表面、ならびに粒子、例えば、ビーズ（例えば、常磁性ビーズ、磁気ビーズ、マイクロビーズ、ナノビーズ）、微小粒子およびナノ粒子を含むがこれらに限定されない、結合対のメンバーを直接または間接的に結合することができる任意の物理的に分離可能な固体であり得る。固体支持体は、例えば、チップ、カラム、光ファイバー、拭き取り繊維、フィルター（例えば、平面フィルター）、１つもしくは複数のキャピラリー、ガラスおよび改質もしくは機能化ガラス（例えば、細孔制御ガラス（ＣＰＧ））、石英、雲母、ジアゾ化膜（紙もしくはナイロン）、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、紙、セラミックス、金属、半金属、半導体材料、量子ドット、被覆ビーズもしくは粒子、他のクロマトグラフ材料、磁気粒子；プラスチック（アクリル樹脂、ポリスチレン、スチレンもしくは他の材料のコポリマー、ポリブチレン、ポリウレタン、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）などを含む）、多糖、ナイロンもしくはニトロセルロース、樹脂、シリカ、もしくはシリコン、シリカゲルおよび変性シリコンを含む、シリカに基づく材料、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、炭素、金属（例えば、鋼、金、銀、アルミニウム、ケイ素および銅）、無機ガラス、導電性ポリマー（ポリピロールおよびポリインドールなどのポリマーを含む）；マイクロもしくはナノ構造化表面、例えば、核酸タイリングアレイ、ナノチューブ、ナノワイヤ、もしくはナノ粒子装飾表面；または多孔質表面、またはゲル、例えば、メタクリレート、アクリルアミド、糖ポリマー、セルロース、シリケート、または他の繊維状もしくは鎖状ポリマーも含み得る。一部の実施形態では、固体支持体または基板は、デキストラン、アクリルアミド、ゼラチンまたはアガロースなどの、ポリマーを含む、任意の数の材料を用いた不動態または化学的誘導体化コーティングを使用して、被覆することができる。ビーズおよび／または粒子は、ばらばらの状態であることもあり、または互いにつながっている（例えば、焼結されている）こともある。一部の実施形態では、固体支持体は、粒子の集合体であることができる。一部の実施形態では、粒子は、シリカを含むことができ、シリカは、二酸化ケイ素を含み得る。一部の実施形態では、シリカは、多孔質であることができ、ある特定の実施形態では、シリカは、無孔質であることができる。一部の実施形態では、粒子は、粒子に常磁性特性を付与する薬剤をさらに含む。ある特定の実施形態では、薬剤は、金属を含み、ある特定の実施形態では、薬剤は、酸化鉄（例えば、鉄または酸化鉄、ここでの酸化鉄は、Ｆｅ２＋とＦｅ３＋の混合物を含有する）である。結合対のメンバーを共有結合によりまたは非共有結合性相互作用により固体支持体に連結させることができ、直接または間接的に（例えば、スペーサー分子もしくはビオチンなどの仲介物質によって）固体支持体に連結させることができる。
一部の実施形態では、足場ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド成分、または両方は、ヌクレオチドアナログとも呼ばれる、１つまたは複数の非天然ヌクレオチドを含む。足場ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド成分、または両方に含まれることがある、非天然ヌクレオチドの非限定的な例としては、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＦＡＮＡ（２’－デオキシ－２’－フルオロアラビノヌクレオチド）、ＧＮＡ（グリコール核酸）、ＴＮＡ（トレオース核酸）、２’－Ｏ－Ｍｅ ＲＮＡ、２’－フルオロＲＮＡ、モルホリノヌクレオチド、およびこれらの任意の組合せが挙げられる。
末端処理
一部の実施形態では、本明細書における方法は、一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を含む核酸組成物と、末端処理活性を有する薬剤とを、一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）分子が処理される条件下で接触させるステップを含み、それによって、末端処理されたｓｓＮＡ組成物が生成される。末端処理は、リン酸化、脱リン酸化、メチル化、脱メチル化、酸化、脱酸化、塩基修飾、伸長、重合、およびこれらの組合せを含み得るが、それらに限定されない。末端処理は、酵素を用いて行なうことができ、そのような酵素としては、リガーゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）、ターミナルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、メチラーゼ（例えば、３’メチラーゼ、５’メチラーゼ）、ポリメラーゼ（例えば、ポリＡポリメラーゼ）、オキシダーゼ、およびこれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を含む核酸組成物と、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）分子が脱リン酸化される条件下で接触させるステップを含み、それによって、脱リン酸化されたｓｓＮＡ組成物が生成される。一部の実施形態では、本明細書における方法は、足場アダプターまたはその成分と、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、足場アダプターまたはその成分が脱リン酸化される条件下で接触させるステップを含み、それによって、脱リン酸化された足場アダプターまたはその成分（例えば、脱リン酸化されたオリゴヌクレオチド；脱リン酸化された足場ポリヌクレオチド）が生成される。一般に、ｓｓＮＡ組成物、および／または足場アダプターもしくはそれらの成分は、結合させるステップの前に（すなわち、ハイブリダイゼーションの前に）脱リン酸化される。ｓｓＮＡは、結合させるステップの前に（すなわち、ハイブリダイゼーションの前に）、脱リン酸化され、次いでその後にリン酸化されることがある。足場アダプター、またはそれらの成分は、結合させるステップの前に（すなわち、ハイブリダイゼーションの前に）、脱リン酸化され、次いでその後にリン酸化されることがある。足場アダプター、またはそれらの成分は、結合させるステップの前に（すなわち、ハイブリダイゼーションの前に）、脱リン酸化され、次いでリン酸化されないことがある。足場アダプター、またはそれらの成分は、結合させるステップの前に（すなわち、ハイブリダイゼーションの前に）、脱リン酸化され、リン酸化されず、次いで、結合させるステップの後（すなわち、ハイブリダイゼーションの後）かつライゲーションステップの前またはライゲーションステップ中にリン酸化されることがある。核酸の脱リン酸化を行うための試薬およびキットは、公知であり、入手可能である。例えば、標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）および／または足場アダプターもしくはそれらの成分を、ホスファターゼ（すなわち、水を使用してリン酸モノエステルを切断してリン酸イオンとアルコールにする酵素）で処理することができる。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を含む核酸組成物と、ホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸がｓｓＮＡの５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、脱リン酸化されたｓｓＮＡ組成物と、ホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸がｓｓＮＡの５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、足場アダプターまたはその成分と、リン酸転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸が足場アダプターまたはその成分の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、脱リン酸化された足場アダプターまたはその成分と、ホスホリル酸転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸が足場アダプターまたはその成分の５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む。ある特定の事例では、ｓｓＮＡ組成物、および／または足場アダプターもしくはそれらの成分は、結合させるステップの前に（すなわち、ハイブリダイゼーションの前に）リン酸化される。核酸の５’リン酸化を様々な手法で行うことができる。例えば、ＡＴＰのγ位からポリヌクレオチド（二本鎖および一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ）の５’－ヒドロキシル末端およびヌクレオシド３’一リン酸へのＰｉの転移および交換を触媒するポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）（例えば、Ｔ４ ＰＮＫ）で、ｓｓＮＡ組成物、および／または足場アダプターもしくはそれらの成分を処理することができる。好適な反応条件としては、例えば、核酸と、ＰＮＫの、１×ＰＮＫ反応緩衝剤（例えば、７０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．６）中、３０分間、３７℃でのインキュベーション；および核酸と、ＰＮＫの、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝剤（例えば、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．５）中、３０分間、３７℃でのインキュベーションが挙げられる。必要に応じて、リン酸化反応後に、ＰＮＫを、例えば６５℃で２０分間、熱不活性化してもよい。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、ホスホリル転移活性を有する薬剤の使用を含まない。一部の実施形態では、方法は、核酸試料からのｓｓＮＡの５’末端をリン酸化することにより５’リン酸化されたｓｓＮＡを生成するステップを含まない。ある特定の事例は、核酸試料は、自然にリン酸化された５’末端を有するｓｓＮＡを含む。一部の実施形態では、方法は、足場アダプターまたはそれらの成分の５’末端をリン酸化することにより５’リン酸化された足場アダプターまたはそれらの成分を生成するステップを含まない。
切断
一部の実施形態では、ｓｓＮＡ、足場アダプター、および／またはハイブリダイゼーション産物（例えば、ｓｓＮＡとハイブリダイズされた足場アダプター）は、本明細書に記載される方法の前に、間に、または後に切断またはせん断される。一部の実施形態では、ｓｓＮＡ、足場アダプター、および／またはハイブリダイゼーション産物は、切断部位で切断またはせん断される。一部の実施形態では、足場アダプターおよび／またはハイブリダイゼーション産物は、ヘアピンループ内の切断部位で切断またはせん断される。一部の実施形態では、足場アダプターおよび／またはハイブリダイゼーション産物は、足場アダプターの内部位置の（例えば、足場アダプターの二重鎖領域内の）切断部位で切断またはせん断される。一部の実施形態では、足場アダプターは、足場ポリヌクレオチド上にしか存在せず相補的オリゴヌクレオチド成分上には存在しない内部位置にある切断部位（例えば、ウラシル）で切断される。したがって、一部の実施形態では、足場ポリヌクレオチドは、１つまたは複数ウラシル塩基を含み、オリゴヌクレオチド成分は、ウラシル塩基を含まない。一部の実施形態では、環状ハイブリダイゼーション産物は、本明細書に記載される方法の前に、間に、または後に切断またはせん断される。一部の実施形態では、核酸、例えば、環状核酸および／または大きい断片（例えば、長さが５００塩基対より長い）は、本明細書に記載される方法の前に、間に、または後に切断またはせん断される。大きい断片は、高分子量（ＨＭＷ）核酸、ＨＭＷ ＤＮＡまたはＨＭＷ ＲＮＡと呼ばれることがある。ＨＭＷ核酸断片は、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約２０００ｂｐ、約３０００ｂｐ、約４０００ｂｐ、約５０００ｂｐ、約１０，０００ｂｐより長い、またはそれより長い断片を含み得る。用語「せん断すること」または「切断」は、核酸分子を２つの（またはそれより多くの）より小さい核酸分子に分断することができる手順または条件を一般に指す。そのようなせん断または切断は、配列特異的、塩基特異的、または非特異的であり得、例えば、化学的、酵素的、および物理的（例えば、物理的断片化）を含む、様々な方法、試薬または条件により果たすことができる。せん断または切断された核酸は、約５～約１０，０００塩基対、約１００～約１，０００塩基対、約１００～約５００塩基対、または約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００もしくは９０００塩基対の長さの名目値、代表値または平均値を有し得る。
せん断または切断された核酸を好適な方法により生成することができ、そのような方法の非限定的な例としては、物理的方法（例えば、せん断、例えば、音波処理、超音波処理、フレンチプレス、熱、ＵＶ照射など）、酵素的プロセス（例えば、酵素的切断作用因子（例えば、好適なヌクレアーゼ、好適な制限酵素）、化学的方法（例えば、アルキル化、ＤＭＳ、ピペリジン、酸加水分解、塩基加水分解、熱など、もしくはこれらの組合せ）、紫外（ＵＶ）線（例えば、光切断性部位（例えば、光切断性スペーサーを含む））など、またはこれらの組合せが挙げられる。結果として得られる核酸断片の長さ代表値、平均値または名目値は、適切な断片生成方法を選択することにより制御することができる。
用語「切断作用因子」は、一般に、核酸を１つまたは複数の特異的または非特異的部位で切断することができる薬剤、ときには、化学物質または酵素を指す。特異的切断作用因子は、特定のヌクレオチド配列に従って特定の部位で特異的に切断することが多く、特定の部位は、切断部位と呼ばれることがある。切断作用因子は、酵素的切断作用因子、化学的切断作用因子、および光（例えば、紫外（ＵＶ）線）を含み得る。
酵素的切断作用因子の例としては、限定ではないが、エンドヌクレアーゼ；デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ；例えば、ＤＮａｓｅ Ｉ、ＩＩ）；リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ；例えば、ＲＮＡｓｅ Ａ、ＲＮＡｓｅ Ｅ、ＲＮＡｓｅ Ｆ、ＲＮＡｓｅ Ｈ、ＲＮＡｓｅ ＩＩＩ、ＲＮＡｓｅ Ｌ、ＲＮＡｓｅ Ｐ、ＲＮＡｓｅ ＰｈｙＭ、ＲＮＡｓｅ Ｔ１、ＲＮＡｓｅ Ｔ２、ＲＮＡｓｅ Ｕ２、およびＲＮＡｓｅ Ｖ）；エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ；ＣＬＥＡＶＡＳＥ酵素；ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ；真核生物の構造特異的エンドヌクレアーゼ；マウスＦＥＮ－１エンドヌクレアーゼ；ニッキング酵素；Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ（すなわち、制限酵素）、例えば、Ａｃｃ Ｉ、ＡｃｉＩ、Ａｆｌ ＩＩＩ、Ａｌｕ Ｉ、Ａｌｗ４４ Ｉ、Ａｐａ Ｉ、Ａｓｎ Ｉ、Ａｖａ Ｉ、Ａｖａ ＩＩ、ＢａｍＨ Ｉ、Ｂａｎ ＩＩ、Ｂｃｌ Ｉ、Ｂｇｌ Ｉ． Ｂｇｌ ＩＩ、Ｂｌｎ Ｉ、Ｂｓｍ Ｉ、ＢｓｓＨ ＩＩ、ＢｓｔＥ ＩＩ、ＢｓｔＵＩ、Ｃｆｏ Ｉ、ＣＩａ Ｉ、Ｄｄｅ Ｉ、Ｄｐｎ Ｉ、Ｄｒａ Ｉ、ＥｃＩＸ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、ＥｃｏＲ ＩＩ、ＥｃｏＲ Ｖ、Ｈａｅ ＩＩ、Ｈａｅ ＩＩ、ＨｈａＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｈｐａ Ｉ、Ｈｐａ ＩＩ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｋｓｐ Ｉ、ＭａｅＩＩ、ＭｃｒＢＣ、Ｍｌｕ Ｉ、ＭＩｕＮ Ｉ、Ｍｓｐ Ｉ、Ｎｃｉ Ｉ、Ｎｃｏ Ｉ、Ｎｄｅ Ｉ、Ｎｄｅ ＩＩ、Ｎｈｅ Ｉ、Ｎｏｔ Ｉ、Ｎｒｕ Ｉ、Ｎｓｉ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｐｖｕ Ｉ、Ｐｖｕ ＩＩ、Ｒｓａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ、Ｓａｕ３Ａ Ｉ、Ｓｃａ Ｉ、ＳｃｒＦ Ｉ、Ｓｆｉ Ｉ、Ｓｍａ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ｓｐｈ Ｉ、Ｓｓｐ Ｉ、Ｓｔｕ Ｉ、Ｓｔｙ Ｉ、Ｓｗａ Ｉ、Ｔａｑ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ；グリコシラーゼ（例えば、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、３－メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ、３－メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼＩＩ、ピリミジンヒドレート－ＤＮＡグリコシラーゼ、ＦａＰｙ－ＤＮＡグリコシラーゼ、チミンミスマッチ－ＤＮＡグリコシラーゼ（例えば、ヒポキサンチン－ＤＮＡグリコシラーゼ、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、５－ヒドロキシメチルウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＨｍＵＤＧ）、５－ヒドロキシメチルシトシンＤＮＡグリコシラーゼ、または１，Ｎ６－エテノ－アデニンＤＮＡグリコシラーゼ）；エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＩＶ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ）；５’→３’エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩ）；３’→５’エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩ）；ポリ（Ａ）特異的３’→５’エキソヌクレアーゼ；リボザイム；ＤＮＡザイム；など、およびこれらの組合せが挙げられる。
一部の実施形態では、切断部位は、制限酵素認識部位を含む。一部の実施形態では、切断作用因子は、制限酵素を含む。一部の実施形態では、切断部位は、レアカッター制限酵素認識部位（例えば、ＮｏｔＩ認識配列）を含む。一部の実施形態では、切断作用因子は、レアカッター酵素（例えば、レアカッター制限酵素）を含む。レアカッター酵素は、ゲノム（例えば、ヒトゲノム）に極めてまれに存在する認識配列を有する制限酵素を一般に指す。一例は、５’－ＧＣＧＧＣＣＧＣ－３’配列の最初のＧＣの後で切断するＮｏｔＩである。７および８塩基対認識配列を有する制限酵素は、多くの場合、レアカッター酵素と考えられる。
ＤＮＡを特異的部位で切断するための切断方法および制限酵素を選択するための手順は、当業者に周知である。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｐｒｏ－Ｍｅｇａ Ｂｉｏｃｈｅｍｓ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ－Ｍａｎｎｈｅｉｍなどを含む、多くの制限酵素供給業者は、特異的制限酵素により切断されるＤＮＡ配列の条件およびタイプに関する情報を提供している。酵素は、約９５％～１００％の効率で、好ましくは約９８％～１００％の効率で、ＤＮＡの切断を可能にすることになる条件下で使用されることが多い。
一部の実施形態では、切断部位は、１つまたは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む一本鎖部分を含む。一部の実施形態では、一本鎖部分は、二重鎖部分と隣接している。一部の実施形態では、一本鎖部分は、ヘアピンループである。一部の実施形態では、切断部位は、１つのＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、２つのＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、３つのＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、４つのＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、５つのＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、５つより多くのＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）から選択される１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）から選択される１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、ウラシル（Ｕ）を含まない。一部の実施形態では、切断部位は、グアニン（Ｇ）を含む１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、グアニン（Ｇ）からなる１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、シトシン（Ｃ）を含む１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、シトシン（Ｃ）からなる１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、アデニン（Ａ）を含む１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、アデニン（Ａ）からなる１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）からなる１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、を、アデニン（Ａ）およびシトシン（Ｃ）からなる１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）からなる１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断部位は、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）からなる１つまたは複数のＲＮＡヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、切断作用因子は、リボヌクレアーゼ（ＲＮＡｓｅ）を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅは、エンドリボヌクレアーゼである。ＲＮＡｓｅは、ＲＮＡｓｅ Ａ、ＲＮＡｓｅ Ｅ、ＲＮＡｓｅ Ｆ、ＲＮＡｓｅ Ｈ、ＲＮＡｓｅ ＩＩＩ、ＲＮＡｓｅ Ｌ、ＲＮＡｓｅ Ｐ、ＲＮＡｓｅ ＰｈｙＭ、ＲＮＡｓｅ Ｔ１、ＲＮＡｓｅ Ｔ２、ＲＮＡｓｅ Ｕ２、およびＲＮＡｓｅ Ｖのうちの１つまたは複数から選択することができる。
一部の実施形態では、切断部位は、光切断性スペーサーまたは光切断性修飾を含む。光切断性修飾は、例えば、特異的波長（例えば、３００～３５０ｎｍ）の紫外（ＵＶ）線により切断可能である光解離性官能基を含み得る。光切断性スペーサーの例（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能；製品番号１７０７）は、適切なスペクトル範囲内のＵＶ線に曝露されたときにのみ切断され得る、１０原子リンカーアームである。光切断性スペーサーを含むオリゴヌクレオチドは、後のリガーゼ反応に利用可能である５’リン酸基を有することができる。光切断性スペーサーを、ＤＮＡ塩基間に配置することができ、またはオリゴと末端修飾（例えばフルオロフォア）の間に配置することができる。そのような実施形態では、紫外（ＵＶ）線を切断作用因子と考えることができる。
一部の実施形態では、切断部位は、ジオールを含む。例えば、切断部位は、５’と５’の連結で組み込まれた隣接ジオールを含むことがある。ジオールを含む切断部位は、例えば過ヨウ素酸塩を使用して、化学的に切断することができる。一部の実施形態では、切断部位は、平滑末端制限酵素認識部位を含む。平滑末端制限酵素認識部位を含む切断部位は、平滑末端制限酵素により切断することができる。
ニックシールおよびフィルイン
一部の実施形態では、本明細書における方法は、ニックシール反応を行うステップ（例えば、ＤＮＡリガーゼまたは他の好適な酵素、およびある特定の事例では、核酸を５’リン酸化するように構成されたキナーゼ（例えば、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）を使用する）を含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、フィルイン反応を行うステップを含む。例えば、骨格アダプターが二重鎖として存在する場合、二重鎖の一部または全ては、ｓｓＮＡとハイブリダイズする末端の反対側のその二重鎖の末端にオーバーハングを含むことがある。そのような二重鎖オーバーハングが存在する場合、本明細書における方法は、結合させるステップの後に、二重鎖により形成されたオーバーハングをフィルインするステップをさらに含み得る。一部の実施形態では、フィルイン反応は、平滑末端化ハイブリダイゼーション産物を生成するために行われる。フィルイン反応を行うために任意の好適な試薬を使用することができる。フィルイン反応を行うために好適なポリメラーゼとしては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ、大きい（クレノウ）断片、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。一部の実施形態では、鎖置換ポリメラーゼが使用される（例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ）。
エキソヌクレアーゼ処理
一部の実施形態では、核酸（例えば、ＲＮＡ－ＤＮＡ二重鎖、ハイブリダイゼーション産物、環状化ハイブリダイゼーション産物）は、エキソヌクレアーゼで処理される。一部の実施形態では、ＲＮＡ－ＤＮＡ二重鎖（例えば、第１鎖ｃＤＮＡ合成により生成されたＲＮＡ－ＤＮＡ二重鎖）中のＲＮＡは、エキソヌクレアーゼで処理される。エキソヌクレアーゼは、３’または５’末端のどちらかにおけるホスホジエステル結合を切断する加水分解反応によってポリヌクレオチド鎖の末端から１つずつヌクレオチドを切断することにより作用する酵素である。エキソヌクレアーゼは、例えば、ＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅ（例えば、ＲＮＡｓｅＨ）、５’→３’エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩ）、３’→５’エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩ）、およびポリ（Ａ）特異的３’→５’エキソヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、エキソヌクレアーゼ活性は、逆転写酵素により提供される（例えば、完全機能性ＲＮＡｓｅＨドメインを有するＭ－ＭＬＶ逆転写酵素により提供されるＲＮＡｓｅ活性）。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション産物は、例えば、一本鎖オリゴヌクレオチド、核酸断片、またはＲＮＡ－ＤＮＡ二重鎖からのＲＮＡなどの、夾雑核酸を除去するために、エキソヌクレアーゼで処理される。一部の実施形態では、環状化ハイブリダイゼーション産物は、一切の非環状化ハイブリダイゼーション産物、ハイブリダイズされていないオリゴヌクレオチド、ハイブリダイズされていない標的核酸、オリゴヌクレオチドダイマーなど、およびこれらの組合せを除去するために、エキソヌクレアーゼで処理される。
試料
核酸を処理および／または解析するための方法および組成物が、本明細書で提供される。本明細書に記載される方法および組成物において利用される核酸または核酸混合物は、対象（例えば、被検対象）から得た試料から単離することができる。対象は、ヒト、非ヒト動物、植物、細菌、真菌、原生生物または病原体を含むがこれらに限定されない、任意の生命体または非生命体であり得る。任意のヒトまたは非ヒト動物を選択することができ、任意のヒトまたは非ヒト動物としては、例えば、哺乳動物、爬虫類、鳥類、両生類、魚類、有蹄動物、反芻動物、ウシ亜科の動物（例えば、ウシ）、ウマ科の動物（例えば、ウマ）、ヤギ亜科の動物およびヒツジ属の動物（例えば、ヒツジ、ヤギ）、イノシシ属の動物（例えば、ブタ）、ラクダ科の動物（例えば、ラクダ、ラマ、アルパカ）、サル、類人猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー）、クマ科の蹠行性肉食動物（例えば、クマ）、家禽、イヌ、ネコ、マウス、ラット、魚類、イルカ、クジラおよびサメを挙げることができる。対象は、雄であってもよく、または雌（例えば、女性、もしくは妊婦）であってもよい。対象は、いかなる年齢（例えば、胚、胎児、乳幼児、小児、成人）であってもよい。対象は、がん患者、がんの罹患が疑われる患者、寛解期の患者、がんの家族歴を有する患者、および／またはがんスクリーニングを受ける対象であり得る。対象は、感染症もしくは感染性疾患に罹患しているまたは病原体（例えば、細菌、ウイルス、真菌、原生動物など）に感染した患者、感染症もしくは感染性疾患の罹患または病原体による感染が疑われる患者、感染症、感染性疾患または病原体感染から回復した患者、感染症歴、感染性疾患歴、病原体感染歴がある患者、および／あるいは感染性疾患または病原体スクリーニングを受ける対象であり得る。対象は、移植レシピエントであり得る。対象は、マイクロバイオーム解析を受けている患者であり得る。一部の実施形態では、被検対象は、雌である。一部の実施形態では、被検対象は、ヒト雌である。一部の実施形態では、被検対象は、雄である。一部の実施形態では、被検対象は、ヒト雄である。
核酸試料を、任意のタイプの好適な生物検体または試料（例えば、被検試料）から単離することまたは得ることができる。核酸試料を、単一細胞、複数の細胞（例えば、培養細胞）、細胞培養培地、馴化培地、組織、臓器、または生物（例えば、細菌、酵母など）から単離することまたは得ることができる。一部の実施形態では、核酸試料は、動物（例えば、動物対象）の細胞、組織、臓器および／またはこれらに類するものから単離されるかまたは得られる。一部の実施形態では、核酸試料は、細菌、酵母、昆虫（例えば、ショウジョウバエ）、哺乳動物、両生類（例えば、カエル（例えば、ツメガエル））、ウイルス、植物、または任意の他の哺乳動物もしくは非哺乳動物の核酸試料源などの、供給源から単離されるかまたは得られる。
核酸試料を、現存生物または動物から単離することまたは得ることができる。一部の事例では、核酸試料を、絶滅した（または「古代」）生物または動物（例えば、絶滅した哺乳動物；ヒト属からの絶滅した哺乳動物）から単離することまたは得ることができる。一部の事例では、核酸試料を、診断分析の一部として得ることができる。
一部の事例では、核酸試料を、法医学分析の一部として得ることができる。一部の実施形態では、本明細書に記載される一本鎖核酸ライブラリー調製（ｓｓＰｒｅｐ）方法は、法医学試料または検体に適用される。法医学試料または検体は、核酸を含有するあらゆる生物学的物質を含み得る。例えば、法医学試料または検体は、血液、精液、毛髪、皮膚、汗、唾液、分解された組織、骨、指の爪の擦過物、舐められた切手／封筒、剥離物、タッチＤＮＡ、カミソリ残留物などを含み得る。
試料または被検試料は、対象またはその一部（例えば、ヒト対象、妊娠している雌、がん患者、感染症または感染性疾患に罹患している患者、移植レシピエント、胎児、腫瘍、感染臓器または組織、移植臓器または組織、マイクロバイオーム）から単離されるまたは得られ任意の検体であり得る。試料は、任意の妊娠期（例えば、ヒト対象については妊娠初期、妊娠中期または妊娠後期）の胎児を宿している妊娠している雌対象からのものであることもあり、出産後の対象からのものであることもある。試料は、すべての染色体が正倍数性である胎児を宿している妊娠している対象からのものであることもあり、染色体異数性（例えば、染色体の１、３（すなわち、トリソミー（例えば、Ｔ２１、Ｔ１８、Ｔ１３））もしくは４つのコピー）または他の遺伝的変異を有する胎児を宿している妊娠している対象からのものであることもある。検体の非限定的な例としては、血液もしくは血液製剤（例えば、血清、血漿など）、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、脳脊髄液、脊髄液、洗浄液（例えば、気管支肺胞、胃、腹膜、管、耳、関節鏡視下）、生検試料（例えば、着床前胚；がん生検からのもの）、体腔穿刺試料、細胞（血液細胞、胎盤細胞、胚もしくは胎児細胞、胎児有核細胞もしくは胎児細胞遺残物、正常細胞、異常細胞（例えば、がん細胞））またはそれらの部分（例えば、ミトコンドリアのもの、核、抽出物など）、雌生殖管の洗液、尿、糞便、痰、唾液、鼻粘膜、前立腺液、洗浄、精液、リンパ液、胆汁、涙、汗、母乳、乳汁など、またはそれらの組合せを限定ではないが含む、対象からの体液または組織が挙げられる。一部の実施形態では、生体試料は、対象からの子宮頸部スワブである。核酸が抽出される体液または組織試料は、無細胞性（例えば、無細胞）であることがある。一部の実施形態では、体液または組織試料は、細胞要素または細胞遺残物を含有することがある。一部の実施形態では、胎児細胞またはがん細胞が試料に含まれていることがある。
試料は、液体試料であることがある。液体試料は、細胞外核酸（例えば、循環無細胞ＤＮＡ）を含むことがある。液体試料の例としては、血液もしくは血液製剤（例えば、血清、血漿など）、尿、脳脊髄液、唾液、痰、生検試料（例えば、がんの検出のための液体生検）、上記の液体試料など、またはこれの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、試料は、液体生検であり、液体生検は、疾患の存在、非存在、悪化または寛解についての対象からの液体試料の評定を一般に指す。液体生検を、固体生検（例えば、腫瘍生検）とともに、または固体生検（例えば、腫瘍生検）の代替法として、使用することができる。ある特定の事例では、細胞外核酸は、液体生検で解析される。
一部の実施形態では、生体試料は、血液、血漿または血清であることがある。用語「血液」は、従来どおりの定義の、全血、血液製剤、または血液の任意の画分、例えば、血清、血漿、バフィーコートなどを包含する。血液またはその画分は、ヌクレオソームを含むことが多い。ヌクレオソームは、核酸を含み、無細胞であることもあり、または細胞内にあることもある。血液は、バフィーコートも含む。バフィーコートは、フィコール勾配を利用することにより単離されることもある。バフィーコートは、白血球（例えば、白血球細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、血小板など）を含むことができる。血漿は、抗凝固薬で処理された血液の遠心分離の結果として得られる、全血の画分を指す。血清は、血液試料が凝固した後に残存する流体の水様部分を指す。体液または組織試料は、病院または診療所が一般に準拠する標準プロトコールに従って採取されることが多い。血液の場合、末梢血の適切な量（例えば、３～４０ミリリットルの間、５～５０ミリリットルの間）が採取されることが多く、調製前または後に標準的な手順に従って保管され得る。
対象の血液中で見つかった核酸の解析を、例えば、全血、血清または血漿を使用して、行うことができる。例えば、母体血中で見つかった胎児ＤＮＡの解析を、例えば、全血、血清または血漿を使用して、行うことができる。例えば、患者の血液中で見つかった腫瘍またはがんＤＮＡの解析を、例えば、全血、血清または血漿を使用して、行うことができる。例えば、患者の血液中で見つかった病原体ＤＮＡの解析を、例えば、全血、血清または血漿を使用して、行うことができる。例えば、移植レシピエントの血液中で見つかった移植ＤＮＡの解析を、例えば、全血、血清または血漿を使用して、行うことができる。対象（例えば、母体対象；患者；がん患者）から得た血液から血清または血漿を調製する方法は、公知である。例えば、対象の血液（例えば、妊婦の血液；患者の血液；がん患者の血液）を、ＥＤＴＡを含有するチューブまたは専用市販製品、例えば、Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ ＢＣＴ（Ｓｔｒｅｃｋ，Ｏｍａｈａ，ＮＥ）またはＶａｃｕｔａｉｎｅｒ ＳＳＴ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、Ｎ．Ｊ．）に入れて、血液凝固を防止することができ、次いで、血漿を全血から遠心分離によって得ることができる。血清は、血液凝固後の遠心分離を行ってまたは行わずに得ることができる。遠心分離が使用される場合には、遠心分離は、排他的にではないが、通常は、適切な速度、例えば、１，５００～３，０００回ｇで行われる。血漿または血清は、核酸抽出のために未使用のチューブに移す前に追加の遠心分離ステップに付されることがある。全血の無細胞性部分に加えて、細胞画分から、対象からの全血試料の遠心分離および血漿の除去後に得ることができるバフィーコート部分に多く含まれている核酸を回収することもできる。
試料は、腫瘍核酸試料（すなわち、腫瘍から単離された核酸試料）であることがある。用語「腫瘍」は、悪性であるか良性であるかを問わず、新生物細胞成長および増殖を一般に指し、前がん性およびがん性細胞および組織を含み得る。用語「がん」および「がん性（の）」は、非調節細胞成長／増殖によって通常は特徴付けられる哺乳動物の生理的状態を一般に指す。がんの例としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、白血病、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜がん、肝細胞がん、消化管がん、膵臓がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝癌、様々なタイプの頭頸部がんなどが挙げられるが、これらに限定されない。
試料は、不均一であることがある。例えば、試料は、１つより多くの細胞型および／または１つもしくは複数の核酸種を含むことがある。一部の事例では、試料は、（ｉ）胎児細胞と母体細胞、（ｉｉ）がん細胞と非がん細胞、および／または（ｉｉｉ）病原性細胞と宿主細胞を含むことがある。一部の事例では、試料は、（ｉ）がん核酸と非がん核酸、（ｉｉ）病原体核酸と宿主核酸、（ｉｉｉ）胎児由来核酸と母体由来核酸、および／またはより一般的には、（ｉｖ）突然変異した核酸と野生型核酸を含むことがある。一部の事例では、試料は、下でさらに詳細に説明されるような、少数派核酸種と多数派核酸種を含むことがある。一部の事例では、試料は、単一の対象からの細胞および／もしくは核酸を含むこともあり、または複数の対象からの細胞および／もしくは核酸を含むこともある。
核酸
核酸を処理および／または解析するための方法および組成物が、本明細書で提供される。核酸、核酸分子、核酸断片、標的核酸、核酸鋳型、鋳型核酸、核酸標的、標的核酸、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド断片、標的ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド標的などの用語は、本開示を通して同義で使用され得る。これらの用語は、ＤＮＡ（例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ；目的の任意のＲＮＡまたはＤＮＡから合成されたもの）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ断片、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、組換えＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡ）など）、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、短鎖抑制性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、トランス作用性低分子干渉ＲＮＡ（ｔａ－ｓｉＲＮＡ）、天然低分子干渉ＲＮＡ（ｎａｔ－ｓｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、トランスファー・メッセンジャーＲＮＡ（ｔｍＲＮＡ）、前駆体メッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）、低分子カハール体特異的ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、エンドリボヌクレアーゼ調製ｓｉＲＮＡ（ｅｓｉＲＮＡ）、小分子ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、シグナル認識ＲＮＡ、テロメアＲＮＡ、胎児または胎盤により高度に発現されるＲＮＡなど）、および／またはＤＮＡもしくはＲＮＡアナログ（例えば、塩基アナログ、糖アナログおよび／または非ネイティブ骨格などを含む）、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドならびにポリアミド核酸（ＰＮＡ）であって、すべてが、一本鎖または二本鎖形態であることがあり、別段の限定がない限り、天然に存在するヌクレオチドと同様に機能することができる天然ヌクレオチドの公知のアナログを包含し得る、これらのものなどからの、任意の組成の核酸を指す。核酸は、プラスミド、ファージ、ウイルス、細菌、自己複製配列（ＡＲＳ）、ミトコンドリア、セントロメア、人工染色体、染色体であってもよく、またはこれらからのものであってもよく、あるいはある特定の実施形態ではｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは宿主細胞、細胞、細胞の細胞核もしくは細胞質で複製し得るもしくは複製され得る他の核酸であってもよく、またはそのような他の核酸からのものであってもよい。一部の実施形態での鋳型核酸は、単一の染色体からのものであり得る（例えば、核酸試料は、二倍体生物から得られた試料の１つの染色体からのものであることがある）。特に制限がない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される、天然ヌクレオチドの公知アナログを含む、核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列は、明確に示される配列ばかりでなく、その保存的に修飾されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、一塩基多型（ＳＮＰ）および相補配列も暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生じさせることにより果たすことができる。核酸という用語は、遺伝子座、遺伝子、遺伝子によりコードされているｃＤＮＡおよびｍＲＮＡと同義で使用される。この用語は、ヌクレオチドアナログ、一本鎖（「センス」または「アンチセンス」、「プラス」鎖または「マイナス」鎖、「フォワード」リーディングフレームまたは「リバース」リーディングフレーム）および二本鎖ポリヌクレオチドから合成されたＲＮＡまたはＤＮＡの誘導体、バリアントおよびアナログも、同意義のものとして含み得る。用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡの一区画を指し；遺伝子産物の転写／翻訳におよび転写／翻訳の調節に関与するコード領域（リーダーおよびトレーラー）に先行するおよび続く領域、ならびに個々のコード領域（エクソン）間の介在配列（イントロン）を一般に含む。ヌクレオチドまたは塩基は、核酸のプリンおよびピリミジン分子単位（例えば、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ））を一般に指す。ＲＮＡについては、塩基チミンが、ウラシルに置き換えられる。核酸長またはサイズを、塩基の数で表すことができる。
標的核酸は、目的の任意の核酸であり得る。核酸は、デオキシリボヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡ塩基）、リボヌクレオチド（すなわち、ＲＮＡ塩基）、またはこれらの組合せで構成されている任意の長さの、例えば、１０塩基のまたはそれより長い、２０塩基のまたはそれより長い、５０塩基のまたはそれより長い、１００塩基のまたはそれより長い、２００塩基のまたはそれより長い、３００塩基のまたはそれより長い、４００塩基のまたはそれより長い、５００塩基のまたはそれより長い、１０００塩基のまたはそれより長い、２０００塩基のまたはそれより長い、３０００塩基のまたはそれより長い、４０００塩基のまたはそれより長い、５０００塩基のまたはそれより長いポリマーであり得る。ある特定の態様では、核酸は、デオキシリボヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡ塩基）、リボヌクレオチド（すなわち、ＲＮＡ塩基）、またはこれらの組合せ、例えば、１０塩基もしくはそれ未満、２０塩基もしくはそれ未満、５０塩基もしくはそれ未満、１００塩基もしくはそれ未満、２００塩基もしくはそれ未満、３００塩基もしくはそれ未満、４００塩基もしくはそれ未満、５００塩基もしくはそれ未満、１０００塩基もしくはそれ未満、２０００塩基もしくはそれ未満、３０００塩基もしくはそれ未満、４０００塩基もしくはそれ未満、または５０００塩基もしくはそれ未満で構成されている、ポリマーである。
核酸は、一本鎖状であってもよく、または二本鎖状であってもよい。例えば、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）は、例えば、加熱によりまたはアルカリでの処理により二本鎖ＤＮＡを変性させることによって生成することができる。したがって、一部の実施形態では、ｓｓＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に由来する。一部の実施形態では、本明細書における方法は、ｄｓＤＮＡを含む核酸組成物と、本明細書における足場アダプターまたはその成分とを結合させるステップの前に、ｄｓＤＮＡを変性させるステップを含み、それによってｓｓＤＮＡが生成される。
ある特定の実施形態では、核酸は、オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ様分子、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）、による二重鎖ＤＮＡ分子に対する鎖侵入によって形成される、Ｄ－ループ構造で存在する。例えば、当技術分野において公知の方法を使用する、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＲｅｃＡタンパク質の付加によりおよび／または塩濃度の変更により、Ｄループ形成を助長することができる。
核酸（例えば、核酸標的、一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）、オリゴヌクレオチド、オーバーハング、足場ポリヌクレオチドおよびそれらのハイブリダイゼーション領域（例えば、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域））は、別の核酸に相補的であると、相補性領域を有すると、別の核酸とハイブリダイズすることができると、またはハイブリダイゼーション領域を有すると、本明細書に記載されることがある。用語「相補的」または「相補性」または「ハイブリダイゼーション」は、核酸の領域への非共有結合により塩基対合するヌクレオチド配列（例えば、ｓｓＮＡ断片の末端領域とハイブリダイズするｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域のヌクレオチド配列、および足場アダプターのオリゴヌクレオチド成分とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域のヌクレオチド配列）を、一般に指す。標準ワトソン・クリック塩基対合では、ＤＮＡの場合、アデニン（Ａ）は、チミン（Ｔ）と塩基対合を形成し、グアニン（Ｇ）は、シトシン（Ｃ）と対合する。ＲＮＡの場合、チミン（Ｔ）は、ウラシル（Ｕ）により置き換えられる。しかるが故に、Ａは、Ｔに相補的であり、Ｇは、Ｃに相補的である。ＲＮＡの場合、Ａは、Ｕに相補的であり、逆もまた同様である。ＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖の場合、Ａ（ＤＮＡ鎖中の）は、Ｕ（ＲＮＡ鎖中の）に相補的である。一部の実施形態では、１つまたは複数のチミン（Ｔ）塩基は、足場アダプターまたはその成分中のウラシル（Ｕ）により置き換えられ、アデニン（Ａ）に相補的である。通常は、「相補的」または「相補性」または「ハイブリダイズすることができる」は、少なくとも部分的に相補的であるヌクレオチド配列を指す。これらの用語は、完全に相補的であり、したがって、一方の鎖内のあらゆるヌクレオチドが、他方の鎖の対応する位置のあらゆるヌクレオチドと相補的であるかまたはハイブリダイズする、二重鎖も包含し得る。
ある特定の事例では、ヌクレオチド配列は、標的に部分的に相補的であることがあり、この場合、すべてのヌクレオチドが、標的核酸中のすべての対応する位置のあらゆるヌクレオチドと相補的であるとは限らない。例えば、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、標的ｓｓＮＡ末端領域に完璧に（すなわち、１００％）相補的であることもあり、またはｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域は、完璧とまではいかない（例えば、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９９％である）ある程度の相補性を共有することもある。別の例では、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域は、オリゴヌクレオチドに完璧に（すなわち、１００％）相補的であることもあり、またはオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域は、完璧とまではいかない（例えば、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９９％である）ある程度の相補性を共有することもある。
２つのヌクレオチド配列の同一性パーセントは、最適な比較を目的として配列をアライメントすることにより決定することができる（例えば、最適なアライメントのために第１の配列の配列にギャップを導入することができる）。その場合、対応する位置のヌクレオチドが比較され、２配列間の同一性パーセントは、それらの配列により共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。１つの配列内の位置が、他の配列内の対応する位置と同じヌクレオチドにより占有されている場合には、それらの分子は、その位置で同一である。
一部の実施形態では、核酸の混合物中の核酸が解析される。核酸の混合物は、同じもしくは異なるヌクレオチド配列、異なる長さ、異なる起源（例えば、ゲノム起源、胎児対母体起源、細胞もしくは組織起源、がん対非がん起源、腫瘍対非腫瘍起源、宿主対病原体、宿主対移植片、宿主対マイクロバイオーム、試料起源、対象起源など）、異なるオーバーハング長、異なるオーバーハングタイプ（例えば、５’オーバーハング、３’オーバーハング、オーバーハングなし）、またはこれらの組合せを有する、２つまたはそれより多くの核酸種を含むことができる。一部の実施形態では、核酸の混合物は、一本鎖核酸および二本鎖核酸を含む。一部の実施形態では、核酸の混合物は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸の混合物は、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。本明細書に記載されるプロセスに供される核酸は、１つの試料からの、または２つもしくはそれより多くの試料からの（例えば、１つもしくは複数、２つもしくはそれより多くの、３つもしくはそれより多くの、４つもしくはそれより多くの、５つもしくはそれより多くの、６つもしくはそれより多くの、７つもしくはそれより多くの、８つもしくはそれより多くの、９つもしくはそれより多くの、１０もしくはそれより多くの、１１もしくはそれより多くの、１２もしくはそれより多くの、１３もしくはそれより多くの、１４もしくはそれより多くの、１５もしくはそれより多くの、１６もしくはそれより多くの、１７もしくはそれより多くの、１８もしくはそれより多くの、１９もしくはそれより多くの、または２０もしくはそれより多くの試料からの）核酸を含有することがある。
一部の実施形態では、標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）は、分解されたＤＮＡを含む。分解されたＤＮＡは、低品質ＤＮＡまたは高度に分解されたＤＮＡと呼ばれることがある。分解されたＤＮＡは、高度に断片化されていることがあり、損傷部をミスコードしやすいおよび／または分子間架橋しやすい塩基アナログおよび脱塩基部位などの損傷を含むことがある。例えば、シトシン残基の脱アミノ化の結果として生じるシーケンシングの誤りは、分解されたＤＮＡから得られるある特定の配列中に存在することがある（例えば、ＣをＴとおよびＧをＡとミスコードすること）。一部の実施形態では、標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）は、ニックの入った二本鎖核酸断片に由来する。ニックの入った二本鎖核酸断片を変性（例えば、熱変性）させてｓｓＮＡ断片を生成することができる。
核酸を当技術分野において公知の方法により１つまたは複数の供給源（例えば、生体試料、血液、細胞、血清、血漿、バフィーコート、尿、リンパ液、皮膚、毛髪、土壌など）から得ることができる。任意の好適な方法を、生体試料から（例えば、血液または血液製剤から）のＤＮＡの単離、抽出および／または精製に使用することができ、この方法の非限定的な例としては、ＤＮＡ調製方法（例えば、Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d ed., 2001に記載されている）、様々な市販の試薬もしくはキット、例えば、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、Ｍｄ）によるＤＮｅａｓｙ（登録商標）、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）およびＱＩＡａｍｐ（登録商標）（例えば、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ、ＱｉａＡｍｐ（登録商標）ＤＮＡ Ｍｉｎｉ ＫｉｔまたはＱｉａＡｍｐ（登録商標）ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）核酸単離／精製キット；ＧｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐ（商標）Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）；ＧＦＸ（商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によるＤＮＡｚｏｌ（登録商標）、ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ（登録商標）、Ｐｕｒｅｌｉｎｋ（登録商標）、ＧｅｎｅＣａｔｃｈｅｒ（登録商標）核酸単離／精製キット；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によるＮｕｃｌｅｏＭａｇ（登録商標）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）およびＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）核酸単離／精製キット；など、またはこれらの組合せが挙げられる。ある特定の態様では、核酸は、固定された生体試料、例えば、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から、単離される。ＦＦＰＥ組織からのゲノムＤＮＡは、市販のキット－例えば、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、Ｍｄ）によるＡｌｌＰｒｅｐ（登録商標）ＤＮＡ／ＲＮＡ ＦＦＰＥキット、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によるＦＦＰＥ用ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（登録商標）Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット、およびＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によるＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＦＦＰＥキット－を使用して単離することができる。
一部の実施形態では、核酸は、細胞溶解手順を使用して細胞から抽出される。細胞溶解手順および試薬は、当技術分野において公知であり、一般に、化学的方法（例えば、界面活性剤、低張溶液、酵素的手順など、もしくはこれらの組合せ）、物理的方法（例えば、フレンチプレス、音波処理など）、または電解溶解法により行われ得る。任意の好適な溶解手順を利用することができる。例えば、化学的方法は、一般に、溶解剤を利用して細胞を破壊し、細胞から核酸を抽出し、その後、カオトロピック塩で処理する。物理的方法、例えば、凍結／解凍、続いての粉砕、細胞プレスの使用なども、有用である。一部の事例では、高塩および／またはアルカリ溶解手順が利用されることがある。一部の事例では、溶解手順は、ＥＤＴＡ／プロテイナーゼＫでの溶解ステップ、大量の塩（例えば、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）、酢酸ナトリウム）およびイソプロパノールを用いる結合緩衝ステップ、およびこの溶液中のＤＮＡをシリカに基づくカラムに結合させるステップを含み得る。一部の事例では、溶解プロトコールは、Dabney et al., Proceedings of the National Academy of Sciences 110, no. 39 (2013): 15758-15763に記載されている、ある特定の手順を含む。
核酸は、ある特定の実施形態では細胞外核酸を含むことができる。用語「細胞外核酸」は、本明細書で使用される場合、実質的に細胞を有さない供給源から単離された核酸を指すことができ、「無細胞」核酸（無細胞ＤＮＡ、無細胞ＲＮＡ、または両方）、「循環無細胞核酸」（例えば、ＣＣＦ断片、ｃｃｆ ＤＮＡ）および／または「無細胞循環胞核酸」とも呼ばれる。細胞外核酸は、血液中に存在することができ、細胞外核酸を血液から（例えば、ヒト対象の血液から）得ることができる。細胞外核酸は、多くの場合、検出可能な細胞を含まず、細胞要素または細胞遺残物を含有し得る。細胞外核酸の無細胞性供給源の非限定的な例は、血液、血漿、血清および尿である。ある特定の態様では、無細胞核酸は、全血、血漿、血清、羊水、唾液、尿、胸膜滲出液、気管支洗浄、気管支吸引物、母乳、初乳、涙、精液、腹水、胸膜滲出液、および便から選択される体液試料から得られる。本明細書で使用される場合、用語「無細胞循環試料核酸を得る」は、試料を直接得ること（例えば、試料、例えば被検試料、を採取すること）、または試料を採取した別の者から試料を得ることを含む。細胞外核酸は、細胞の分泌および／または核酸放出（例えば、ＤＮＡ放出）の産物であることがある。細胞外核酸は、例えば、任意の形態の死細胞の産物であることがある。一部の事例では、細胞外核酸は、有糸分裂性、膨化性、毒性、虚血性のものなど、およびこれらの組合せを含む、任意の形態のＩ型またはＩＩ型細胞死の産物である。理論により制限されるものではないが、細胞外核酸は、細胞アポトーシスおよび細胞破壊の産物であることがあり、これは、スペクトル（例えば「ラダー」）にわたって一連の長さを有することが多い細胞外核酸の基礎を提供する。一部の事例では、細胞外核酸は、細胞壊死、ネクロプトーシス（necropoptosis）、膨化死、エントーシス、ピロトーシス（pyrotosis）など、およびこれらの組合せの産物である。一部の実施形態では、被検対象からの試料核酸は、循環無細胞核酸である。一部の実施形態では、循環無細胞核酸は、被検対象からの血漿または血清からのものである。一部の態様では、無細胞核酸は、分解されている。一部の実施形態では、無細胞核酸は、無細胞胎児核酸（例えば、無細胞胎児ＤＮＡ）を含む。ある特定の態様では、無細胞核酸は、循環がん核酸（例えば、がんＤＮＡ）を含む。ある特定の態様では、無細胞核酸は、循環腫瘍核酸（例えば、腫瘍ＤＮＡ）を含む。一部の実施形態では、無細胞核酸は、感染性因子核酸（例えば、病原体ＤＮＡ）を含む。一部の実施形態では、無細胞核酸は、移植片からの核酸（例えば、ＤＮＡ）を含む。一部の実施形態では、無細胞核酸は、マイクロバイオーム（例えば、腸のマイクロバイオーム、血液のマイクロバイオーム、口腔のマイクロバイオーム、脊髄液のマイクロバイオーム、糞便のマイクロバイオーム）からの核酸（例えば、ＤＮＡ）を含む。
無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、分解された供給源に由来することがあり、多くの場合、抽出されたときにわずかな量のＤＮＡしか提供しない。一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリーを生成するための本明細書に記載される方法は、ｃｆＤＮＡから大量の短いＤＮＡ断片を捕捉することができる。例えば、がん試料からのｃｆＤＮＡは、短い断片のより高度な集団を有する傾向がある。ある特定の事例では、ｃｆＤＮＡ中の短い断片を、ヌクレオソームではなく転写因子によって生じる断片について濃縮することができる。
細胞外核酸は、異なる核酸種を含むことがあり、したがって、ある一定の実施形態では「不均一」と本明細書では呼ばれる。例えば、腫瘍またはがんに罹患している人物からの血清または血漿は、腫瘍細胞またはがん細胞（例えば、新生物）からの核酸と、非腫瘍細胞または非がん細胞からの核酸とを含み得る。別の例では、妊娠している雌からの血清または血漿は、母体核酸と胎児核酸を含み得る。別の例では、感染症または感染性疾患に罹患している患者からの血清または血漿は、宿主核酸と感染因子または病原体核酸とを含み得る。別の例では、移植を受けたことがある対象からの試料は、宿主核酸とドナー臓器または組織からの核酸とを含み得る。一部の事例では、がん核酸、腫瘍核酸、胎児核酸、病原体核酸、または移植片核酸は、全核酸の約５％～約５０％であることもある（例えば、全核酸の約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９％が、がん、腫瘍、胎児、病原体、移植片またはマイクロバイオーム核酸である）。別の例では、不均一核酸は、２またはそれより多くの対象（例えば、犯行現場からの試料）からの核酸を含み得る。
少なくとも２つの異なる核酸種が、細胞外核酸中に異なる量で存在することがあり、これらの核酸種は、少数派種および多数派種と呼ばれることがある。ある特定の事例では、核酸の少数派種は、罹患細胞型（例えば、がん細胞、消耗細胞、免疫系による攻撃を受けた細胞）からのものである。ある特定の実施形態では、遺伝的変異または遺伝的変更（例えば、コピー数変更、コピー数変異、一塩基変更、一塩基変異、染色体変更、および／または転座）が、少数派核酸種について判定される。ある特定の実施形態では、遺伝的変異または遺伝的変更が、多数派核酸種について判定される。一般に、用語「少数派」または「多数派」は、いかなる点についても厳格に定義されることを意図したものでない。一態様では、例えば、「少数派」と考えられる核酸は、試料中の全核酸の少なくとも約０．１％から試料中の全核酸の５０％未満までの存在量を有することができる。一部の実施形態では、少数派核酸は、試料中の全核酸の少なくとも約１％から試料中の全核酸の約４０％までの存在量を有することができる。一部の実施形態では、少数派核酸は、試料中の全核酸の少なくとも約２％から試料中の全核酸の約３０％までの存在量を有することができる。一部の実施形態では、少数派核酸は、試料中の全核酸の少なくとも約３％から試料中の全核酸の約２５％までの存在量を有することができる。例えば、少数派核酸は、試料中の全核酸の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％または３０％の存在量を有することができる。一部の事例では、細胞外核酸の少数派種は、全核酸の約１％～約４０％であることもある（例えば、核酸の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％または４０％が、少数派種核酸である）。一部の実施形態では、少数派核酸は、細胞外ＤＮＡである。一部の実施形態では、少数派核酸は、アポトーシス組織からの細胞外ＤＮＡである。一部の実施形態では、少数派核酸は、内部の一部の細胞がアポトーシスを遂げた組織からの細胞外ＤＮＡである。一部の実施形態では、少数派核酸は、壊死組織からの細胞外ＤＮＡである。一部の実施形態では、少数派核酸は、内部の一部の細胞が壊死を遂げた組織からの細胞外ＤＮＡである。壊死は、ある特定の事例では、細胞死の後の死後プロセスを指すことがある。一部の実施形態では、少数派核酸は、細胞増殖性障害（例えば、がん）に罹患した組織からの細胞外ＤＮＡである。一部の実施形態では、少数派核酸は、腫瘍細胞からの細胞外ＤＮＡである。一部の実施形態では、少数派核酸は、細胞外胎児ＤＮＡである。一部の実施形態では、少数派核酸は、病原体からの細胞外ＤＮＡである。一部の実施形態では、少数派核酸は、移植片からの細胞外ＤＮＡである。一部の実施形態では、少数派核酸は、マイクロバイオームからの細胞外ＤＮＡである。
別の態様では、例えば、「多数派」と考えられる核酸は、試料中の全核酸の５０％を超える存在量から試料中の全核酸の約９９．９％までの存在量を有することができる。一部の実施形態では、多数派核酸は、試料中の全核酸の少なくとも約６０％から試料中の全核酸の約９９％までの存在量を有することができる。一部の実施形態では、多数派核酸は、試料中の全核酸の少なくとも約７０％から試料中の全核酸の約９８％までの存在量を有することができる。一部の実施形態では、多数派核酸は、試料中の全核酸の少なくとも約７５％から試料中の全核酸の約９７％までの存在量を有することができる。例えば、多数派核酸は、試料中の全核酸の少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の存在量を有することができる。一部の実施形態では、多数派核酸は、細胞外ＤＮＡである。一部の実施形態では、多数派核酸は、細胞外母体ＤＮＡである。一部の実施形態では、多数派核酸は、健康な組織からのＤＮＡである。一部の実施形態では、多数派核酸は、非腫瘍細胞からのＤＮＡである。一部の実施形態では、多数派核酸は、宿主細胞からのＤＮＡである。
一部の実施形態では、細胞外核酸の少数派種は、約５００塩基対またはそれ未満の長さのものである（例えば、少数派種核酸の約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％は、約５００塩基対またはそれ未満の長さのものである）。一部の実施形態では、細胞外核酸の少数派種は、約３００塩基対またはそれ未満の長さのものである（例えば、少数派種核酸の約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％は、約３００塩基対またはそれ未満の長さのものである）。一部の実施形態では、細胞外核酸の少数派種は、約２５０塩基対またはそれ未満の長さのものである（例えば、少数派種核酸の約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％は、約２５０塩基対またはそれ未満の長さのものである）。一部の実施形態では、細胞外核酸の少数派種は、約２００塩基対またはそれ未満の長さのものである（例えば、少数派種核酸の約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％は、約２００塩基対またはそれ未満の長さのものである）。一部の実施形態では、細胞外核酸の少数派種は、約１５０塩基対またはそれ未満の長さのものである（例えば、少数派種核酸の約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％は、約１５０塩基対またはそれ未満の長さのものである）。一部の実施形態では、細胞外核酸の少数派種は、約１００塩基対またはそれ未満の長さのものである（例えば、少数派種核酸の約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％は、約１００塩基対またはそれ未満の長さのものである）。一部の実施形態では、細胞外核酸の少数派種は、約５０塩基対またはそれ未満の長さのものである（例えば、少数派種核酸の約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％は、約５０塩基対またはそれ未満の長さのものである）。
核酸は、核酸を含有する試料の処理の有無にかかわらず、本明細書に記載される方法の実施に供することができる。一部の実施形態では、核酸は、核酸を含有する試料の処理後に、本明細書に記載される方法の実施に供される。例えば、核酸を試料から抽出、単離、精製、部分的に精製、または増幅することができる。用語「単離された」は、本明細書で使用される場合、その元の環境（例えば、それが天然に存在する場合には天然環境、または外因的に発現される場合には宿主細胞）から除去された核酸を指し、したがって、その元の環境からヒトの介入により（例えば、「人間の手により」）変更されている。用語「単離された核酸」は、本明細書で使用される場合、対象（例えば、ヒト対象）から除去された核酸を指すことができる。供給源試料に存在する成分の量より少ない非核酸成分（例えば、タンパク質、脂質）を有する、単離された核酸を提供することができる。単離された核酸を含む組成物は、約５０％～９９％を超える％非核酸成分不含であり得る。単離された核酸を含む組成物は、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％を超える％非核酸成分不含であり得る。用語「精製された」は、本明細書で使用される場合、核酸を精製手順に付す前に存在する非核酸成分の量より少ない非核酸成分（例えば、タンパク質、脂質、炭水化物）を含有する、提供される核酸を指すことができる。精製された核酸を含む組成物は、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％を超える％他の非核酸成分不含であり得る。用語「精製された」は、本明細書で使用される場合、核酸が由来する試料源中より少ない核酸種を含有する、提供される核酸を指すことができる。精製された核酸を含む組成物は、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％を超える％他の核酸種不含であり得る。例えば、胎児核酸を、母体核酸と胎児核酸とを含む混合物から精製することができる。ある特定の例では、核酸の小さい断片（例えば、３０～５００ｂｐ断片）を、異なる長さの核酸断片を含む混合物から精製または部分的に精製することができる。ある特定の例では、核酸のより小さい断片を含むヌクレオソームを、核酸のより大きい断片を含むより大きいヌクレオソーム複合体の混合物から精製することができる。ある特定の例では、核酸のより大きい断片を含むより大きいヌクレオソーム複合体を、核酸のより小さい断片を含むヌクレオソームから精製することができる。ある特定の例では、胎児核酸の小さい断片（例えば、３０～５００ｂｐ断片）を、胎児核酸断片と母体核酸断片の両方を含む混合物から精製または部分的に精製することができる。ある特定の例では、胎児核酸のより小さい断片を含むヌクレオソームを、母体核酸のより大きい断片を含むより大きいヌクレオソーム複合体の混合物から精製することができる。ある特定の例では、がん細胞核酸を、がん細胞核酸と非がん細胞核酸とを含む混合物から精製することができる。ある特定の例では、がん細胞核酸のより小さい断片を含むヌクレオソームを、非がん核酸のより大きい断片を含むより大きいヌクレオソーム複合体の混合物から精製することができる。一部の実施形態では、核酸は、核酸を含有する試料の事前の処理なしで、本明細書に記載される方法の実施に供される。例えば、事前の抽出、精製、部分的精製、および／または増幅なしで、試料から直接核酸を解析することができる。
核酸を増幅条件下で増幅することができる。用語「増幅される」または「増幅」または「増幅条件」は、本明細書で使用される場合、標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）またはその一部と同じまたは実質的に同じヌクレオチド配列を有するアンプリコン核酸を直線的にまたは指数関数的に生成するプロセスに試料中の標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）または本明細書中の方法により生成された核酸産物を付すことを指す。ある特定の実施形態では、用語「増幅される」または「増幅」または「増幅条件」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む方法を指す。ある特定の事例では、増幅産物は、核酸鋳型配列の増幅ヌクレオチド領域より１つまたは複数多いヌクレオチドを含有することができる（例えば、プライマーは、核酸鋳型遺伝子分子に相補的なヌクレオチドに加えて転写開始配列などの「余分な」ヌクレオチドを含有することができ、その結果、増幅産物は、核酸鋳型遺伝子分子の増幅ヌクレオチド領域に対応しない「余分な」ヌクレオチドまたはヌクレオチドを含有することになる）。
核酸は、本明細書に記載される方法に核酸を供する前に、核酸中のある特定のヌクレオチドを修飾するプロセスに曝露され得る。例えば、内部のヌクレオチドのメチル化状態に基づいて核酸を選択的に修飾するプロセスを核酸に適用することができる。加えて、高温、紫外線照射、Ｘ線照射などの条件は、核酸分子の配列の変化を誘導することができる。核酸を、配列解析を行うのに有用な任意の好適な形態で提供することができる。
一部の実施形態では、標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）は、本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分と結合させるステップの前に、修飾されない。一部の実施形態では、標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）は、本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分と結合させるステップの前に、長さに関して修飾されない。この文脈での「修飾されない」は、標的核酸が試料から単離され、次いで、標的核酸の長さも組成も修飾することなく、足場アダプターまたはそれらの成分と結合されることを意味する。例えば、標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）は、短縮されないこともあり（例えば、それらは、制限酵素とも、ヌクレアーゼとも、長さを低減させる物理的条件（例えば、せん断条件、切断条件）とも接触されない）、長さが１つまたは複数のヌクレオチドだけ増加されないこともある（例えば、末端は、オーバーハング位置でフィルインされない；ヌクレオチドが末端に付加されない）。標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）の一方または両方の末端へのリン酸基または化学反応性基の付加は、一般に、核酸の修飾とも、核酸の長さの修飾とも見なされない。ｓｓＮＡ断片を生成するための二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）断片の変性は、一般に、核酸の修飾とも、核酸の長さの修飾とも見なされない。
一部の実施形態では、標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）の一方または両方のネイティブ末端は、ｓｓＮＡが本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分と結合されるときに存在する。ネイティブ末端は、一般に、核酸断片の未修飾断片を指す。一部の実施形態では、標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）のネイティブ末端は、本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分と結合させるステップの前に、長さに関して修飾されない。この文脈での「修飾されない」は、標的核酸が試料から単離され、次いで、標的核酸のネイティブ末端の長さを修飾せずに足場アダプターまたはそれらの成分と結合されることを意味する。例えば、標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）は、長さが１ヌクレオチドも複数ヌクレオチドも短縮されず（例えば、それらは、非ネイティブ末端を生成するために、制限酵素とも、ヌクレアーゼとも、長さを低減する物理的条件（例えば、せん断条件、切断条件）とも接触されず）かつ増加されない（例えば、ネイティブ末端は、オーバーハングでフィルインされない；ヌクレオチドがネイティブ末端に付加されない）。標的核酸のネイティブ末端の一方または両方へのリン酸基または化学反応性基の付加は、一般に、核酸の長さの修飾と見なされない。
一部の実施形態では、標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）は、本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分と結合させるステップの前に、切断剤（例えば、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、制限酵素）および／またはポリメラーゼと接触していない。一部の実施形態では、標的核酸は、本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分と結合させるステップの前に、機械的せん断（例えば、超音波処理（例えば、ＣｏｖａｒｉｓによるＡｄａｐｔｉｖｅ Ｆｏｃｕｓｅｄ Ａｃｏｕｓｔｉｃｓ（商標）（ＡＦＡ）プロセス））に付されない。一部の実施形態では、標的核酸は、本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分と結合させるステップの前にエキソヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡｓｅ）と接触していない。一部の実施形態では、標的核酸は、本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分と結合させるステップの前に増幅されない。一部の実施形態では、標的核酸は、本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分と結合させるステップの前に固体支持体に結合されない。一部の実施形態では、標的核酸は、本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分と結合させるステップの前に別の分子にコンジュゲートされない。一部の実施形態では、標的核酸は、本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分と結合させるステップの前にベクターにクローニングされない。一部の実施形態では、標的核酸は、本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分と結合させるステップの前に脱リン酸化に付されることがある。一部の実施形態では、標的核酸は、本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分と結合させるステップの前にリン酸化に付されることがある。
一部の実施形態では、標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）と本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分とを結合させるステップは、標的核酸を単離すること、および単離された標的核酸と本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分とを結合させることを含む。一部の実施形態では、標的核酸と本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分とを結合させるステップは、標的核酸を単離すること、単離された標的核酸をリン酸化すること、およびリン酸化された標的核酸と本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分とを結合させることを含む。一部の実施形態では、標的核酸と本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分とを結合させるステップは、標的核酸を単離すること、本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分を脱リン酸化すること、および単離された標的核酸と脱リン酸化された本明細書における足場アダプターまたはそれらの脱リン酸化された成分とを結合させることを含む。一部の実施形態では、標的核酸と本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分とを結合させるステップは、標的核酸を単離すること、単離された標的核酸を脱リン酸化すること、脱リン酸化された標的核酸をリン酸化すること、およびリン酸化された標的核酸と本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分とを結合させることを含む。一部の実施形態では、標的核酸と本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分とを結合させるステップは、標的核酸を単離すること、単離された標的核酸を脱リン酸化すること、脱リン酸化された標的核酸をリン酸化すること、足場アダプターまたはそれらの成分を脱リン酸化すること、およびリン酸化された標的核酸と脱リン酸化された本明細書における足場アダプターまたはそれらの脱リン酸化された成分とを結合させることを含む。
一部の実施形態では、標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）と本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分とを結合させるステップは、標的核酸を単離すること、および単離された標的核酸と本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分とを結合させることからなる。一部の実施形態では、標的核酸と本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分とを結合させるステップは、標的核酸を単離すること、単離された標的核酸をリン酸化すること、およびリン酸化された標的核酸と本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分とを結合させることからなる。一部の実施形態では、標的核酸と本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分とを結合させるステップは、標的核酸を単離すること、足場アダプターまたはそれらの成分を脱リン酸化すること、および単離された標的核酸と脱リン酸化された本明細書における足場アダプターまたはそれらの脱リン酸化された成分とを結合させることからなる。一部の実施形態では、標的核酸と本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分とを結合させるステップは、標的核酸を単離すること、単離された標的核酸を脱リン酸化すること、脱リン酸化された標的核酸をリン酸化すること、およびリン酸化された標的核酸と本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分とを結合させることからなる。一部の実施形態では、標的核酸と本明細書における足場アダプターまたはそれらの成分とを結合させるステップは、標的核酸を単離すること、単離された標的核酸を脱リン酸化すること、脱リン酸化された標的核酸をリン酸化すること、足場アダプターまたはそれらの成分を脱リン酸化すること、およびリン酸化された標的核酸と脱リン酸化された本明細書における足場アダプターまたはそれらの脱リン酸化された成分とを結合させることからなる。
一本鎖核酸
専用アダプター（例えば、シーケンシングライブラリーを生成するための）を使用して一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を捕捉するための方法および組成物が、本明細書で提供される。一本鎖核酸またはｓｓＮＡは、それらの長さの７０％またはそれより高い％にわたって一本鎖状態である（すなわち、分子間ハイブリダイゼーションも分子内ハイブリダイゼーションもしていない）ポリヌクレオチドの一群を一般に指す。一部の実施形態では、ｓｓＮＡは、ポリヌクレオチドの長さの７５％もしくはそれより高い％、８０％もしくはそれより高い％、８５％もしくはそれより高い％、９０％もしくはそれより高い％、９５％もしくはそれより高い％、または９９％もしくはそれより高い％にわたって一本鎖状態である。ある特定の態様では、ｓｓＮＡは、ポリヌクレオチドの全長にわたって一本鎖状体である。一本鎖核酸は、本明細書では標的核酸と呼ばれることがある。
ｓｓＮＡは、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）を含み得る。一部の実施形態では、ｓｓＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に由来するｓｓＤＮＡを含むが、これに限定されない。例えば、ｓｓＤＮＡは、ｓｓＤＮＡを生成するように変性される（例えば、熱変成される、および／または化学的に変性される）二本鎖ＤＮＡから得られる。一部の実施形態では、本明細書における方法は、ｓｓＤＮＡと本明細書に記載される足場アダプターまたはそれらの成分とを結合させるステップの前に、ｄｓＤＮＡを変性させることによりｓｓＤＮＡを生成するステップを含む。
一部の実施形態では、ｓｓＮＡは、一本鎖リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）を含む。ＲＮＡは、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランス作用性低分子干渉ＲＮＡ（ｔａ－ｓｉＲＮＡ）、天然低分子干渉ＲＮＡ（ｎａｔ－ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、トランスファー・メッセンジャーＲＮＡ（ｔｍＲＮＡ）、前駆体メッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）、低分子カハール体特異的ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、エンドリボヌクレアーゼ調製（endoribonucleaseprepared）ｓｉＲＮＡ（ｅｓｉＲＮＡ）、小分子ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、シグナル認識ＲＮＡ、テロメアＲＮＡ、リボザイム、またはこれらの組合せを含み得る。一部の実施形態では、ｓｓＮＡが、ｓｓＲＮＡである場合、ｓｓＲＮＡは、ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、ｓｓＮＡは、一本鎖相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含む。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、ｓｓＮＡと一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）とを接触させてＳＳＢ結合ｓｓＮＡを生成するステップを含む。ＳＳＢは、一般に、共同的にｓｓＮＡに結合し、通常は二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）にはあまり結合しない。ｓｓＤＮＡに結合すると、ＳＳＢは、ヘリックス二重鎖を不安定化する。ＳＳＢは、原核生物ＳＳＢ（例えば、細菌もしくは古細菌ＳＳＢ）であることもあり、または真核生物ＳＳＢであることもある。ＳＳＢの例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＳＢ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲｅｃＡ、高度熱安定性一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＥＴ ＳＳＢ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＲｅｃＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、複製プロテインＡ（ＲＰＡ－真核生物ＳＳＢ）などを挙げることができる。ＥＴ ＳＳＢ、Ｔｔｈ ＲｅｃＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲｅｃＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、さらに、そのようなＳＳＢを使用してＳＳＢ結合ｓｓＮＡを調製するための緩衝剤および詳細なプロトコールは、市販されている（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ））。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、ｓｓＮＡと一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）とを接触させてＳＳＢ結合ｓｓＮＡを生成するステップを含まない。したがって、本明細書における方法は、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡを生成するステップを省略することができる。例えば、本明細書における方法は、ｓｓＮＡとＳＳＢとを接触させることなく、ｓｓＮＡと、本明細書に記載される足場アダプターまたはそれらの成分とを結合させるステップを含むことがある。そのような事例では、本明細書における方法は、核酸ライブラリーを生成するための「ＳＳＢ不使用の」方法と呼ばれることがある。本明細書に記載されるある特定のＳＳＢ不使用の方法は、図面に示され、実施例で論じられるように、ＳＳＢを使用して調製されるライブラリーのパラメーターと同様のパラメーターを有するライブラリーを生成することができる。一部の実施形態では、本明細書における方法は、ｓｓＮＡと、ＳＳＢ以外の一本鎖核酸結合剤とを接触させるステップを含む。そのような一本鎖核酸結合剤は、一本鎖核酸に安定的に結合することができ、核酸二重鎖の形成を防止することまたは低減させることができ、結合された核酸のライゲーションまたは別の方法での末端修飾をなお可能にすることができ、熱安定性であることができる。一本鎖核酸結合剤の例としては、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、これらのドメイン、およびこれらのドメインを含む融合タンパク質が挙げられるが、それらに限定されない。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を含む核酸組成物と、本明細書に記載される足場アダプターまたはそれらの成分とを結合させるステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）からなる核酸組成物と、本明細書に記載される足場アダプターまたはそれらの成分とを結合させるステップを含む。一部の実施形態では、本明細書における方法は、一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）から本質的になる核酸組成物と、本明細書に記載される足場アダプターまたはそれらの成分とを結合させるステップを含む。一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）「から本質的になる」核酸組成物は、一般に、ｓｓＮＡを含み、さらなるタンパク質も核酸成分も含まない。例えば、一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）「から本質的になる」核酸組成物は、二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）を含まないこともあり、または低いパーセンテージのｄｓＮＡ（例えば、１０％未満のｄｓＮＡ、５％未満のｄｓＮＡ、１％未満のｄｓＮＡ）を含むこともある。一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）「から本質的になる」核酸組成物は、タンパク質を含まないことがある。例えば、一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）「から本質的になる」核酸組成物は、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）も、ｓｓＮＡの安定化に有用な他のタンパク質も含まないことがある。一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）「から本質的になる」核酸組成物は、核酸組成物中に通常は存在する化学成分、例えば、緩衝剤、塩、アルコール、クラウディング剤（例えば、ＰＥＧ）などを含むことがあり、核酸源（例えば、試料）または核酸抽出からの残留成分（例えば、核酸、タンパク質、細胞膜成分）を含むこともある。一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）「から本質的になる」核酸組成物は、１つまたは複数のリン酸（例えば、末端リン酸、５’末端リン酸）を有するｓｓＮＡ断片を含むことがある。一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）「から本質的になる」核酸組成物は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むｓｓＮＡ断片を含むこともある。
核酸の濃縮
一部の実施形態では、核酸（例えば、細胞外核酸）は、核酸の部分集団または種について濃縮または相対的に濃縮される。核酸部分集団は、例えば、胎児核酸、母体核酸、がん核酸、腫瘍核酸、患者核酸、宿主核酸、病原体核酸、移植片核酸、マイクロバイオーム核酸、特定の長さもしくは長さの範囲の断片を含む核酸、または特定のゲノム領域（例えば、単一の染色体、染色体のセット、および／もしくはある特定の染色体領域）からの核酸を含むことができる。そのような濃縮された試料を、本明細書で提供される方法とともに使用することができる。したがって、ある特定の実施形態では、本技術の方法は、試料中の核酸の部分集団について濃縮するさらなるステップを含む。ある特定の実施形態では、正常組織（例えば、非がん細胞、宿主細胞）からの核酸は、試料から選択的に（部分的に、実質的に、ほぼ完全に、または完全に）除去される。ある特定の実施形態では、母体核酸は、試料から選択的に（部分的に、実質的に、ほぼ完全に、または完全に）除去される。ある特定の実施形態では、特定の低コピー数種核酸（例えば、がん、腫瘍、胎児、病原体、移植片、マイクロバイオーム核酸）についての濃縮は、定量感度を改善することができる。試料を核酸の特定の種について濃縮する方法は、例えば、米国特許第６，９２７，０２８号、国際特許出願公開番号ＷＯ２００７／１４０４１７、国際特許出願公開番号ＷＯ２００７／１４７０６３、国際特許出願公開番号ＷＯ２００９／０３２７７９、国際特許出願公開番号ＷＯ２００９／０３２７８１、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１０／０３３６３９、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１１／０３４６３１、国際特許出願公開番号ＷＯ２００６／０５６４８０、および国際特許出願公開番号ＷＯ２０１１／１４３６５９に記載されており、各々の全内容は、本文、表、式および図面すべてを含めて、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、核酸は、ある特定の標的断片種および／または参照断片種について濃縮される。ある特定の実施形態では、核酸は、下で説明される、１つまたは複数の長さに基づく分離方法を使用して、特異的核酸断片長または断片長範囲について濃縮される。ある特定の実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるおよび／または当技術分野において公知の、１つまたは複数の配列に基づく分離方法を使用して、選択ゲノム領域（例えば、染色体）からの断片について濃縮される。
試料中の核酸部分集団について濃縮する方法の非限定的な例としては、核酸種間のエピジェネティックな差を利用する方法（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０１０５０４９号に記載されている、メチル化に基づく胎児核酸濃縮方法）；制限エンドヌクレアーゼにより多型配列を増強するアプローチ（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／０３１７８１８号に記載されている方法など）；選択的酵素的消化アプローチ；大規模並列シグネチャーシーケンシング（ＭＰＳＳ）アプローチ；増幅（例えば、ＰＣＲ）に基づくアプローチ（例えば、遺伝子座特異的増幅法、マルチプレックスＳＮＰ対立遺伝子ＰＣＲアプローチ；ユニバーサル増幅法）；プルダウンアプローチ（例えば、ビオチン化ウルトラマープルダウン法）；伸長およびライゲーションに基づく方法（例えば、分子反転プローブ（ＭＩＰ）伸長およびライゲーション）；およびこれらの組合せが挙げられる。
一部の実施形態では、修飾された核酸を濃縮することができる。核酸修飾としては、カルボキシシトシン、５－メチルシトシン（５ｍＣ）およびその酸化誘導体（例えば、５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）、５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）、および５－カルボニルシトシン（arboxylcytosine）（５ｃａＣ））、Ｎ（６）－メチルアデニン（６ｍＡ）、Ｎ４－メチルシトシン（４ｍＣ）、Ｎ（６）－メチルアデノシン（ｍ（６）Ａ）、プソイドウリジン（Ψ）、５－メチルシチジン（ｍ（５）Ｃ）、ヒドロキシメチルウラシル、３’末端の２’－Ｏ－メチル化、ｔＲＮＡ修飾、ｍｉＲＮＡ修飾、およびｓｎＲＮＡ修飾が挙げられるが、これらに限定されない。１つまたは複数の修飾を含む核酸を、抗体に基づくプルダウンを含むがこれに限定されない様々な方法により、濃縮することができる。修飾された核酸の濃縮をｄｓＤＮＡの変性の前（図５２Ａ～Ｂ）または後（図５２Ｃ～Ｄ）に行なうことができる。変性前の濃縮は、修飾を欠いていることがある相補鎖の濃縮ももたらすことがあるが、変性後の濃縮は、修飾を欠いている相補鎖を濃縮しない。
一部の実施形態では、核酸は、本明細書に記載される１つまたは複数の配列に基づく分離方法を使用して、選択ゲノム領域（例えば、染色体）からの断片について濃縮される。配列に基づく分離は、目的の断片（例えば、標的および／または参照断片）に存在するが、試料の他の断片には実質的に存在しないかまたは他の断片のごくわずかな量（例えば、５％またはそれ未満）に存在する、ヌクレオチド配列に一般に基づく。一部の実施形態では、配列に基づく分離は、分離された標的断片および／または分離された参照断片を生じさせることができる。分離された標的断片および／または分離された参照断片は、核酸試料中に残存する断片から単離されることが多い。ある特定の実施形態では、分離された標的断片および分離された参照断片はまた、互いから単離される（例えば、別々のアッセイ区画で単離される）。ある特定の実施形態では、分離された標的断片および分離された参照断片は、一緒に単離される（例えば、同じアッセイ区画で単離される）。一部の実施形態では、未結合断片を別個に除去または分解または消化することができる。
一部の実施形態では、足場アダプターは、標的核酸を濃縮するために使用される。例えば、図５１に示されているように、足場アダプターを、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域内の塩基の一部またはすべてが定義されたまたは既知の塩基であるように、設計することができる。これらの足場アダプターは、足場アダプターｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域の定義されたまたは既知の塩基に相補的な配列を有する標的核酸と優先的にハイブリダイズすることができ、それによって、得られるライブラリー内の標的核酸が濃縮される。例えば、図５１に示されているように、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域へのＧＣジヌクレオチドの組み入れを使用して、末端ＣＧ（ＣｐＧとも呼ばれる）ジヌクレオチドを有する標的核酸を濃縮することができる。足場アダプターｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域の長さの一部またはすべてを使用して、ヌクレアーゼ切断部位、遺伝子プロモーター領域、病原体配列、腫瘍関連配列および他のモチーフを含むがこれらに限定されない、任意の他の定義された配列を、同様に標的とすることができる。ある例では、ライブラリーは、非濃縮性の足場アダプターおよびＣＧジヌクレオチド濃縮性の足場アダプターを使用して調製された。濃縮を用いずに調製されたライブラリーの場合、リードの１．７％がＣＧで開始し、リードの１．１％がＣＧで終了した。濃縮を用いて調製されたライブラリーの場合、リードの５．２％がＣＧで開始し、リードの１９．６％がＣＧで終了した。図５５に示されている、別の例では、ＲＮＡ（例えば、宿主および病原体ＲＮＡ）を含む試料は、目的の病原体ＲＮＡに特異的なプライマーを用いて逆転写されてｃＤＮＡを生成し、次いで、ｃＤＮＡは、精製され、そして標準的な足場アダプター、または逆転写プライマーにより濃縮された領域に標的化されたｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を有する足場アダプター、どちらかを用い、本明細書で論じられるような一本鎖ライブラリー調製方法を用いて調製される。病原体ＤＮＡを同様に濃縮することができる。
一部の事例では、５’または３’核酸末端における標的核酸配列は、定義されるかまたは既知である。他の事例では、足場アダプターを使用して、５’または３’核酸末端における目的の新規標的を識別することができる。目的の核酸配列またはパターンを、濃縮を用いてまたは用いずに足場アダプターライブラリー出力から特徴付けることができる。一部の事例では、５’、３’または両方の核酸末端における特異的配列または配列パターンを、特定の状態と関連付けることができる。そのような状態としては、病状、メチル化状態、および発現状態が挙げられるが、これらに限定されない。足場アダプターを使用して、試料と対照の間、例えば、がん患者からの無細胞ＤＮＡと健康な対照の間の、核酸末端における既知または新規標的配列の存在または相対存在量を定量化することができる。これらのデータを使用して、ＤＮＡ末端における配列情報と所与の状態との間の関係を学習することができる。患者試料および健康な試料の十分に特徴付けられたデータセットを用いて訓練することにより、一例では、解析方法またはアルゴリズムを使用して、状態、または状態による移行を予測することができる。例えば、本発明者らは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する患者からのｃｆＤＮＡに、非ＡＭＬ患者試料と比較して、５’および３’ＤＮＡ末端におけるＡＴジヌクレオチドの増加およびＣｐＧジヌクレオチドの低減を認めた。この例では、分析ツールをｃｆＤＮＡ末端配列情報に関して使用して、ＡＭＬを発症する患者のリスクを予測することができる。
一部の実施形態では、標的および／または参照断片を核酸試料から分離するために、選択的核酸捕捉プロセスが使用される。市販の核酸捕捉システムとしては、例えば、Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ配列捕捉システム（Ｒｏｃｈｅ ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）；ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＢＥＡＤＡＲＲＡＹプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰプラットフォーム（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）；Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）；および関連プラットフォームが挙げられる。そのような方法は、キャプチャーオリゴヌクレオチドと標的または参照断片のヌクレオチド配列の一部またはすべてとのハイブリダイゼーションを通常は含み、固相（例えば、固相アレイ）および／または溶液に基づくプラットフォームの使用を含み得る。キャプチャーオリゴヌクレオチド（「ベイト」と呼ばれることもある）を、それらが、選択されたゲノム領域もしくは遺伝子座からの核酸断片と、または核酸標的中の特定の配列と、優先的にハイブリダイズするように、選択または設計することができる。ある特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションに基づく方法（例えば、オリゴヌクレオチドアレイを使用するもの）を使用して、ある特定の核酸配列を含有する断片について濃縮することができる。したがって、一部の実施形態では、核酸試料は、例えば、試料核酸中の選択された配列に相補的なキャプチャーオリゴヌクレオチドを使用して断片のサブセットを捕捉することにより、必要に応じて濃縮される。ある特定の事例では、捕捉された断片が増幅される。例えば、アダプターを含有する捕捉された断片を、アダプター配列に相補的なプライマーを使用して増幅して、アダプター配列に従ってインデックスが付加された、増幅された断片の一群を形成することができる。一部の実施形態では、核酸は、目的の領域を含有する断片の配列またはそれらの部分に相補的なオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＲプライマ－）を使用する目的の１つまたは複数の領域の増幅により、選択ゲノム領域（例えば、染色体、遺伝子）からの断片について濃縮される。
一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数の長さに基づく分離方法を使用して、特定の閾値またはカットオフ未満のまたはそれを超える、特定の核酸断片長（単数）、長さの範囲、または長さ（複数）について濃縮される。核酸断片長は、通常は、断片中のヌクレオチドの数を指す。核酸断片長はまた、核酸断片サイズと呼ばれることもある。一部の実施形態では、長さに基づく分離方法は、個々の断片の長さを測定せずに行われる。一部の実施形態では、長さに基づく分離方法は、個々の断片の長さを決定する方法とともに行われる。一部の実施形態では、長さに基づく分離は、分画されたプールのすべてまたは一部を単離（例えば、保持）および／または解析することができる、サイズ分画手順を指す。サイズ分画手順は、当技術分野において公知である（例えば、アレイでの分離、モレキュラーシーブによる分離、ゲル電気泳動による分離、カラムクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除カラム）による分離、およびマイクロフルイディクスに基づくアプローチ）。ある特定の事例では、長さに基づく分離アプローチは、例えば、選択的配列タグ付けアプローチ、断片環状化、化学的処理（例えば、ホルムアルデヒド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿）、質量分析および／またはサイズ特異的核酸増幅を含み得る。
一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数の核酸結合タンパク質に関連する断片が濃縮される。濃縮方法の例としては、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）、架橋ＣｈＩＰ（ＸＣＨＩＰ）、ネイティブＣｈＩＰ（ＮＣｈＩＰ）、ビーズ不使用のＣｈＩＰ、キャリアＣｈＩＰ（ＣＣｈＩＰ）、高速ＣｈＩＰ（ｑＣｈＩＰ）、迅速かつ定量的ＣｈＩＰ（Ｑ２ＣｈＩＰ）、マイクロチップ（μＣｈＩＰ）、マトリックスＣｈＩＰ、病原体－ＣｈＩＰ（ＰＡＴ－ＣｈＩＰ）、ＣｈＩＰ－エキソ、ＣｈＩＰ・オン・チップ、ＲＩＰ－ＣｈＩＰ、ＨｉＣｈＩＰ、ＣｈＩＡ－ＰＥＴ、およびＨｉＣｈＩＲＰが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、本明細書における方法は、ＲＮＡ種の混合物中のＲＮＡ種を濃縮するステップを含む。例えば、本明細書における方法は、ｍＲＮＡとリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の混合物中に存在するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を濃縮するステップを含み得る。任意の好適なｍＲＮＡ濃縮方法を使用することができ、そのような方法としては、ｒＲＮＡ枯渇および／またはｍＲＮＡ濃縮方法、例えば、磁気ビーズでのｒＲＮＡ枯渇（例えば、試料からｒＲＮＡを枯渇させる、したがってｍＲＮＡを濃縮する、ために磁気ビーズと組み合わせてｒＲＮＡ枯渇プローブを使用する、Ｒｉｂｏ－ｚｅｒｏ（商標）、Ｒｉｂｏｍｉｎｕｓ（商標）およびＭＩＣＲＯＢＥｘｐｒｅｓｓ（商標））、オリゴ（ｄＴ）に基づくポリ（Ａ）濃縮（例えば、ＢｉｏＭａｇ（登録商標）Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０）、ヌクレアーゼに基づくｒＲＮＡ枯渇（例えば、Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）５’－リン酸依存性エキソヌクレアーゼの消化）ならびにこれらの組合せが挙げられる。
濃縮戦略は、標的核酸の相対存在量を（例えば、シーケンシングリードのパーセントにより評定して）少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、１１００％、１２００％、１３００％、１４００％、１５００％、１６００％、１７００％、１８００％、１９００％、２０００％、３０００％、４０００％、５０００％、６０００％、７０００％、８０００％、９０００％、１００００％、またはそれより大きく増加させることができる。
長さに基づく分離
一部の実施形態では、本明細書における方法は、断片長に従って標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）を分離するステップを含む。例えば、標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）を、１つまたは複数の長さに基づく分離方法を使用して、特定の閾値またはカットオフ未満のまたはそれを超える、特定の核酸断片長（単数）、長さの範囲、または長さ（複数）について濃縮することができる。核酸断片長は、通常は、断片中のヌクレオチドの数を指す。核酸断片長はまた、核酸断片サイズと呼ばれることもある。一部の実施形態では、長さに基づく分離方法は、個々の断片の長さを測定せずに行われる。一部の実施形態では、長さに基づく分離方法は、個々の断片の長さを決定する方法と併せて行われる。一部の実施形態では、長さに基づく分離は、分画されたプールのすべてまたは一部を単離（例えば、保持）および／または解析することができる、サイズ分画手順を指す。サイズ分画手順は、当技術分野において公知である（例えば、アレイでの分離、モレキュラーシーブによる分離、ゲル電気泳動による分離、カラムクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除カラム）による分離、およびマイクロフルイディクスに基づくアプローチ）。一部の実施形態では、長さに基づく分離アプローチは、例えば、断片環状化、化学的処理（例えば、ホルムアルデヒド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、質量分析および／またはサイズ特異的核酸増幅を含み得る。一部の実施形態では、長さに基づく分離は、固相可逆的固定法（ＳＰＲＩ）ビーズを使用して行われる。
一部の実施形態では、特定の閾値またはカットオフ未満のまたはそれを超える、ある特定の長さ（単数）、長さ範囲、または長さ（複数）の核酸断片が、試料から分離される。一部の実施形態では、特定の閾値またはカットオフ（例えば、５００ｂｐ、４００ｂｐ、３００ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１００ｂｐ）未満の長さを有する断片は、「短い」断片と呼ばれ、特定の閾値またはカットオフ（例えば、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ）を超える長さを有する断片は、「長い」断片、大きい断片、および／または高分子量（ＨＭＷ）断片と呼ばれる。一部の実施形態では、特定の閾値またはカットオフ未満のまたはそれを超える、ある特定の長さ（単数）、長さ範囲、または長さ（複数）の断片は、解析のために保持され、その一方で、閾値またはカットオフを超えるまたはそれ未満の、異なる長さ（単数）、または長さ範囲、または長さ（複数）の断片は、解析のために保持されない。一部の実施形態では、約５００ｂｐ未満である断片は、保持される。一部の実施形態では、約４００ｂｐ未満である断片は、保持される。一部の実施形態では、約３００ｂｐ未満である断片は、保持される。一部の実施形態では、約２００ｂｐ未満である断片は、保持される。一部の実施形態では、約１５０ｂｐ未満である断片は、保持される。例えば、約１９０ｂｐ、１８０ｂｐ、１７０ｂｐ、１６０ｂｐ、１５０ｂｐ、１４０ｂｐ、１３０ｂｐ、１２０ｂｐ、１１０ｂｐまたは１００ｂｐ未満である断片は、保持される。一部の実施形態では、約１００ｂｐ～約２００ｂｐである断片は、保持される。例えば、約１９０ｂｐ、１８０ｂｐ、１７０ｂｐ、１６０ｂｐ、１５０ｂｐ、１４０ｂｐ、１３０ｂｐ、１２０ｂｐ、または１１０ｂｐである断片は、保持される。一部の実施形態では、約１００ｂｐ～約２００ｂｐの範囲内である断片は、保持される。例えば、約１１０ｂｐ～約１９０ｂｐ、１３０ｂｐ～約１８０ｂｐ、１４０ｂｐ～約１７０ｂｐ、１４０ｂｐ～約１５０ｂｐ、１５０ｂｐ～約１６０ｂｐ、または１４５ｂｐ～約１５５ｂｐの範囲内である断片は、保持される。
一部の実施形態では、約１０００ｂｐ未満の断片長を有する標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）は、本明細書に記載される、複数の足場アダプター種、または足場アダプター種のプール、または足場アダプター種の成分と結合される。一部の実施形態では、約５００ｂｐ未満の断片長を有する標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）は、本明細書に記載される、複数の足場アダプター種、または足場アダプター種のプール、または足場アダプター種の成分と結合される。一部の実施形態では、約４００ｂｐ未満の断片長を有する標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）は、本明細書に記載される、複数の足場アダプター種、または足場アダプター種のプール、または足場アダプター種の成分と結合される。一部の実施形態では、約３００ｂｐ未満の断片長を有する標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）は、本明細書に記載される、複数の足場アダプター種、または足場アダプター種のプール、または足場アダプター種の成分と結合される。一部の実施形態では、約２００ｂｐ未満の断片長を有する標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）は、本明細書に記載される、複数の足場アダプター種、または足場アダプター種のプール、または足場アダプター種の成分と結合される。一部の実施形態では、約１００ｂｐ未満の断片長を有する標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）は、本明細書に記載される、複数の足場アダプター種、または足場アダプター種のプール、または足場アダプター種の成分と結合される。
一部の実施形態では、約１００ｂｐのまたはそれより大きい断片長を有する標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）は、本明細書に記載される、複数の足場アダプター種、または足場アダプター種のプール、または足場アダプター種の成分と結合される。一部の実施形態では、約２００ｂｐのまたはそれより大きい断片長を有する標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）は、本明細書に記載される、複数の足場アダプター種、または足場アダプター種のプール、または足場アダプター種の成分と結合される。一部の実施形態では、約３００ｂｐのまたはそれより大きい断片長を有する標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）は、本明細書に記載される、複数の足場アダプター種、または足場アダプター種のプール、または足場アダプター種の成分と結合される。一部の実施形態では、約４００ｂｐのまたはそれより大きい断片長を有する標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）は、本明細書に記載される、複数の足場アダプター種、または足場アダプター種のプール、または足場アダプター種の成分と結合される。一部の実施形態では、約５００ｂｐのまたはそれより大きい断片長を有する標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）は、本明細書に記載される、複数の足場アダプター種、または足場アダプター種のプール、または足場アダプター種の成分と結合される。一部の実施形態では、約１０００ｂｐのまたはそれより大きい断片長を有する標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）は、本明細書に記載される、複数の足場アダプター種、または足場アダプター種のプール、または足場アダプター種の成分と結合される。
一部の実施形態では、任意の断片長または断片長の組合せを有する標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）は、本明細書に記載される、複数の足場アダプター種、または足場アダプター種のプール、または足場アダプター種の成分と結合される。例えば、５００ｂｐ未満の断片長および５００ｂｐのまたはそれより長い断片長を有する標的核酸（例えば、ｓｓＮＡ）を、本明細書に記載される、複数の足場アダプター種、または足場アダプター種のプール、または足場アダプター種の成分と、結合させることができる。
本明細書に記載される方法とともに使用することができる、長さに基づくある特定の分離方法は、例えば、選択的配列タグ付けアプローチを利用する。そのような方法では、長い核酸と短い核酸とを含む試料中の核酸の断片サイズ種（例えば、短い断片）に、選択的にタグ付けすることができる。そのような方法は、内部プライマーと外部プライマーとを含む１セットのネステッドプライマーを使用して核酸増幅反応を行うステップを通常は含む。一部の実施形態では、内部のものの一方または両方にタグ付けして、それによって標的増幅産物上にタグを導入することができる。外部プライマーは、（内部）標的配列を有する短い断片に一般にアニールしない。内部プライマーは、短い断片にアニールし、タグと標的配列とを有する増幅産物を生成することができる。通常は、長い断片のタグ付けは、例えば、外部プライマーの事前のアニーリングおよび伸長による内部プライマーの伸長遮断を含む、機構の組合せによって阻害される。タグ付き断片の濃縮は、例えば、一本鎖核酸のエキソヌクレアーゼ消化、および少なくとも１つのタグに特異的な増幅プライマーを使用するタグ付き断片の増幅を含む、様々な方法のいずれかにより果たすことができる。
本明細書に記載される方法とともに使用することができる、長さに基づく別の分離方法は、核酸試料をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿に付すステップを含む。方法の例としては、国際特許出願公開番号ＷＯ２００７／１４０４１７およびＷＯ２０１０／１１５０１６に記載されているものが挙げられる。この方法は、小さい（例えば、３００ヌクレオチド未満の）核酸を実質的に沈殿させずに大きい核酸を実質的に沈殿させるのに十分な条件下、１つまたは複数の一価の塩の存在下で、核酸試料とＰＥＧを接触させるステップを一般に必要とする。
本明細書に記載される方法とともに使用することができる、長さに基づく別の濃縮方法は、例えばｃｉｒｃｌｉｇａｓｅを使用する、ライゲーションによる環状化を含む。通常は、短い核酸断片を長い断片より高い効率で環状化することができる。環状化されていない配列を環状化された配列から分離することができ、濃縮された短い断片をさらなる解析に使用することができる。
核酸ライブラリー
本明細書における方法は、核酸ライブラリーを調製するステップ、および／または核酸ライブラリーために核酸を修飾するステップを含み得る。一部の実施形態では、核酸断片の末端は、断片またはそれらの増幅産物を核酸ライブラリーに組み込むことができるように修飾される。一般に、核酸ライブラリーは、その非限定的な例が、固相（例えば、固体支持体、フローセル、ビーズ）上への固定化、濃縮、増幅、クローニング、検出を含む、特異的プロセスのために、および／または核酸シーケンシングのために、調製される、組み立てられる、および／または修飾される、複数のポリヌクレオチド分子（例えば、核酸の試料）を指す。ある特定の実施形態では、核酸ライブラリーは、シーケンシングプロセスの前にまたはシーケンシングプロセス中に調製される。核酸ライブラリー（例えば、シーケンシングライブラリー）は、当技術分野において公知であるような好適な方法により調製することができる。核酸ライブラリーは、標的化または非標的化調製プロセスにより調製することができる。
一部の実施形態では、核酸のライブラリーは、固体支持体への核酸の固定化のために構成される化学的部分（例えば、官能基）を含むように修飾される。一部の実施形態では、核酸ライブラリーは、固体支持体へのライブラリーの固定化のために構成される、生体分子（例えば、官能基）および／または結合対のメンバーを含むように修飾され、生体分子および結合対の非限定的な例としては、チロキシン結合グロブリン、ステロイド結合タンパク質、抗体、抗原、ハプテン、酵素、レクチン、核酸、リプレッサー、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、補体成分Ｃ１ｑ、核酸結合タンパク質、受容体、炭水化物、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、相補的核酸配列など、およびこれらの組合せが挙げられる。特異的結合対の一部の例としては、限定ではないが、アビジン部分とビオチン部分；抗原エピトープと抗体またはその免疫反応性断片；抗体とハプテン；ジゴキシゲニン部分と抗ジゴキシゲニン抗体；フルオレセイン部分と抗フルオレセイン抗体；オペレーターとリプレッサー；ヌクレアーゼとヌクレオチド；レクチンと多糖；ステロイドとステロイド結合タンパク質；活性化合物と活性化合物受容体；ホルモンとホルモン受容体；酵素と基質；免疫グロブリンとプロテインＡ；オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとその対応する補体；など、またはこれらの組合せが挙げられる。
一部の実施形態では、核酸のライブラリーは、既知組成の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むように修飾され、ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、識別子（例えば、タグ、インデックス付加用タグ）、キャプチャー配列、標識、アダプター、制限酵素部位、プロモーター、エンハンサー、複製起点、ステムループ、相補配列（例えば、プライマー結合部位、アニーリング部位）、好適な組み込み部位（例えば、トランスポゾン、ウイルス組み込み部位）、修飾ヌクレオチド、本明細書に記載される固有分子識別子（ＵＭＩ）、本明細書に記載されるパリンドローム配列など、またはこれらの組合せが挙げられる。既知配列のポリヌクレオチドを、好適な位置に、例えば、５’末端、３’末端にまたは核酸配列内に、付加させることができる。既知配列のポリヌクレオチドは、同じ配列であることもあり、または異なる配列であることもある。一部の実施形態では、既知配列のポリヌクレオチドは、表面（例えば、フローセルの表面）に固定化された１つまたは複数のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように構成される。例えば、５’既知配列を含む核酸分子は、第１の複数のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができ、その一方で、３’既知配列は、第２の複数のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができる。一部の実施形態では、核酸のライブラリーは、染色体特異的タグ、キャプチャー配列、標識および／またはアダプター（例えば、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドアダプター）を含み得る。一部の実施形態では、核酸のライブラリーは、１つまたは複数の検出可能な標識を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の検出可能な標識を、核酸ライブラリーの５’末端に、３’末端に、および／またはライブラリー内の核酸内の任意のヌクレオチド位置に組み込むことができる。一部の実施形態では、核酸のライブラリーは、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは、標識されたプローブである。一部の実施形態では、核酸のライブラリーは、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブを固相への固定化の前に含む。
一部の実施形態では、既知配列のポリヌクレオチドは、ユニバーサル配列を含む。ユニバーサル配列は、２つもしくはそれより多くの核酸分子にまたは核酸分子の２つもしくはそれより多くのサブセットに組み込まれる特異的ヌクレオチド配列であり、ユニバーサル配列は、それが組み込まれるすべての分子または分子のサブセットについて同じである。ユニバーサル配列は、ユニバーサル配列に相補的である単一のユニバーサルプライマーを使用して、複数の異なる配列とハイブリダイズするように、および／または複数の異なる配列を増幅するように、設計されることが多い。一部の実施形態では、２つ（例えば、一対）またはそれより多くのユニバーサル配列および／またはユニバーサルプライマーが使用される。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサル配列を含むことが多い。一部の実施形態では、アダプター（例えば、ユニバーサルアダプター）は、ユニバーサル配列を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のユニバーサル配列が、核酸の複数の種またはサブセットを捕捉、識別および／または検出するために使用される。
核酸ライブラリーの調製についてのある特定の実施形態では、（例えば、ある特定の一塩基合成法手順では）、核酸は、数百塩基対またはそれ未満の長さに（例えば、ライブラリー生成のための調製において）サイズ選択および／または断片化される。一部の実施形態では、ライブラリー調製は、断片化なしで行われる（例えば、無細胞ＤＮＡを使用する場合）。
ある特定の実施形態では、ライゲーションに基づくライブラリー調製方法が使用される（例えば、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＴＲＵＳＥＱ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。ライゲーションに基づくライブラリー調製方法は、インデックス配列（例えば、核酸配列についての試料起源を識別するための試料インデックス配列）を最初のライゲーションステップで組み込むことができ、多くの場合、シングルリードシーケンシング、ペアエンドシーケンシングおよび多重化シーケンシングのための試料の調製に使用され得る、アダプター（例えば、メチル化アダプター）設計を使用することが多い。例えば、核酸（例えば、断片化された核酸または無細胞ＤＮＡ）を、フィルイン反応、エキソヌクレアーゼ反応またはこれらの組合せにより、末端修復することができる。一部の実施形態では、次いで、結果として生じた平滑末端修復核酸を、アダプター／プライマーの３’末端の単一のヌクレオチドオーバーハングと相補的である単一のヌクレオチドにより伸長することができる。任意のヌクレオチドを伸長／オーバーハングヌクレオチドに使用することができる。一部の実施形態では、末端修復が省略され、骨格アダプター（例えば、本明細書に記載される骨格アダプター）は、核酸（例えば、一本鎖核酸、断片化された核酸および／または無細胞ＤＮＡ）のネイティブ末端に直接ライゲーションされる。
一部の実施形態では、核酸ライブラリー調製は、本明細書に記載される足場アダプターなどの、足場アダプターまたはその成分を（例えば、試料核酸に、試料核酸断片に、鋳型核酸に、標的核酸に、ｓｓＮＡに）ライゲーションするステップを含む。足場アダプター、またはそれらの成分は、フローセルアンカーに相補的である配列を含むことができ、例えばフローセルの内部表面などの、固体支持体に核酸ライブラリーを固定化するために利用されることもある。一部の実施形態では、足場アダプター、またはその成分は、識別子、１つもしくは複数シーケンシングプライマーハイブリダイゼーション部位（例えば、ユニバーサルシーケンシングプライマー、シングルエンドシーケンシングプライマー、ペアエンドシーケンシングプライマー、多重化シーケンシングプライマーなどに相補的な配列）、またはこれらの組合せ（例えば、アダプター／シーケンシング、アダプター／識別子、アダプター／識別子／シーケンシング）を含む。一部の実施形態では、足場アダプター、またはその成分は、本明細書ではプライミング配列またはプライマー結合ドメインとも呼ばれる、プライマーアニーリングポリヌクレオチド（例えば、フローセル結合オリゴヌクレオチドへの、および／または遊離増幅プライマーへの、アニーリングのためのもの）、インデックスポリヌクレオチド（例えば、異なる試料からの核酸を追跡するための試料インデックス配列；試料ＩＤとも呼ばれる）、バーコードポリヌクレオチド（例えば、シーケンシングの前に増幅される試料核酸の個々の分子を追跡するための単一分子バーコード（ＳＭＢ）；分子バーコードまたは固有分子識別子（ＵＭＩ）とも呼ばれる）のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、足場アダプターまたはその成分の、プライマーアニーリング成分（またはプライミング配列またはプライマー結合ドメイン）は、１つまたは複数のユニバーサル配列（例えば、１つまたは複数の増幅プライマーに相補的な配列）を含む。一部の実施形態では、インデックスポリヌクレオチド（例えば、試料インデックス；試料ＩＤ）は、足場アダプターまたはその成分の、成分である。一部の実施形態では、インデックスポリヌクレオチド（例えば、試料インデックス；試料ＩＤ）は、ユニバーサル増幅プライマー配列の成分である。
一部の実施形態では、足場アダプター、またはその成分は、増幅プライマー（例えば、ユニバーサル増幅プライマー）と組み合わせて使用される場合、ユニバーサル配列、分子バーコード、試料ＩＤ配列、スペーサー配列、および試料核酸配列（例えば、ｓｓＮＡ配列）のうちの１つまたは複数を含むライブラリー構築物を生成するように設計される。一部の実施形態では、足場アダプター、またはその成分は、ユニバーサル増幅プライマーと組み合わせて使用される場合、ユニバーサル配列、分子バーコード、試料ＩＤ配列、スペーサー配列、および試料核酸配列（例えば、ｓｓＮＡ配列）のうちの１つまたは複数の順序付けられた組合せを含むライブラリー構築物を生成するように設計される。例えば、ライブラリー構築物は、第１のユニバーサル配列、続いて第２のユニバーサル配列、続いて第１の分子バーコード、続いてスペーサー配列、続いて鋳型配列（例えば、試料核酸配列；ｓｓＮＡ配列）、続いてスペーサー配列、続いて第２の分子バーコード、続いて第３のユニバーサル配列、続いて試料ＩＤ、続いて第４のユニバーサル配列を含み得る。一部の実施形態では、足場アダプター、またはそれらの成分は、増幅プライマー（例えば、ユニバーサル増幅プライマー）と組み合わせて使用される場合、鋳型分子（例えば、試料核酸分子；ｓｓＮＡ分子）の鎖ごとにライブラリー構築物を生成するように設計される。一部の実施形態では、足場アダプターは、二重鎖アダプターである。
識別子は、識別子を含む核酸の検出および／または識別を可能にする、核酸（例えば、ポリヌクレオチド）に組み込まれたまたは結合された好適な検出可能な標識であり得る。一部の実施形態では、識別子は、シーケンシング方法の間に（例えば、ポリメラーゼにより）核酸に組み込まれるかまたは結合される。一部の実施形態では、識別子は、シーケンシング方法の前に（例えば、伸長反応により、増幅反応により、ライゲーション反応により）核酸に組み込まれるかまたは結合される。識別子の非限定的な例としては、核酸タグ、核酸インデックスもしくはバーコード、放射標識（例えば、同位体）、金属標識、蛍光標識、化学発光標識、リン光標識、フルオロフォアクエンチャー、色素、タンパク質（例えば、酵素、抗体もしくはその一部、リンカー、結合対のメンバー）など、またはこれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、識別子（例えば、核酸インデックスまたはバーコード）は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の固有の、既知のおよび／または識別可能な配列である。一部の実施形態では、識別子は、連続する６またはそれを超えるヌクレオチドである。様々な異なる励起および発光スペクトルを有する多数のフルオロフォアが、利用可能である。任意の好適なタイプおよび／または数のフルオロフォアを、識別子として使用することができる。一部の実施形態では、１つもしくは複数、２つもしくはそれより多くの、３つもしくはそれより多くの、４つもしくはそれより多くの、５つもしくはそれより多くの、６つもしくはそれより多くの、７つもしくはそれより多くの、８つもしくはそれより多くの、９つもしくはそれより多くの、１０もしくはそれより多くの、２０もしくはそれより多くの、３０もしくはそれより多くの、または５０もしくはそれより多くの異なる識別子が、本明細書に記載される方法（例えば、核酸検出および／またはシーケンシング方法）において利用される。一部の実施形態では、１つまたは２つのタイプの識別子（例えば、蛍光標識）が、ライブラリー内の各核酸に連結される。識別子の検出および／または定量化は、好適な方法、装置または機械により行うことができ、そのような方法、装置または機械の非限定的な例としては、フローサイトメトリー、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ゲル電気泳動、ルミノメーター、蛍光光度計、分光光度計、好適な遺伝子チップまたはマイクロアレイ解析、ウエスタンブロット、質量分析、クロマトグラフィー、細胞蛍光分析、蛍光顕微鏡法、好適な蛍光またはデジタルイメージング法、共焦点レーザー走査顕微鏡法、レーザー走査型サイトメトリー、親和性クロマトグラフィー、マニュアルバッチモード分離、電界懸架、好適な核酸シーケンシング方法および／または核酸シーケンシング装置など、ならびにこれらの組合せが挙げられる。
一部の実施形態では、識別子、シーケンシング特異的インデックス／バーコード、およびシーケンサー特異的フローセル結合プライマー部位は、単一プライマー伸長により（例えば、鎖置換ポリメラーゼにより）核酸ライブラリーに組み込まれる。
一部の実施形態では、核酸ライブラリーまたはその一部は、増幅条件下で増幅される（例えば、ＰＣＲに基づく方法により増幅される）。一部の実施形態では、シーケンシング方法は、核酸ライブラリーの増幅を含む。核酸ライブラリーを、固体支持体（例えば、フローセル内の固体支持体）への固定化の前または後に増幅することができる。核酸増幅は、（例えば、核酸ライブラリー内に）存在する核酸鋳型のおよび／またはその補体の数を、鋳型および／またはその補体の１つまたは複数のコピーを生成することにより、増幅するまたは増加させるプロセスを含む。増幅は、好適な方法により行うことができる。核酸ライブラリーを、サーモサイクリング法によりまたは等温増幅法により増幅することができる。一部の実施形態では、ローリングサークル増幅法が使用される。一部の実施形態では、増幅は、核酸ライブラリーまたはその一部分が固定化されている固体支持体（例えば、フローセル内のもの）上で行われる。ある特定のシーケンシング方法では、核酸ライブラリーは、フローセルに添加され、好適な条件下でのアンカーへのハイブリダイゼーションにより固定化される。このタイプの核酸増幅は、固相増幅と呼ばれることが多い。固相増幅の一部の実施形態では、増幅産物のすべてまたは一部分は、固定化されたプライマーから開始する伸長により合成される。固相増幅反応は、増幅オリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）の少なくとも１つが固体支持体に固定化されることを除き、標準的な液相増幅に類似している。一部の実施形態では、修飾核酸（例えば、アダプターの付加により修飾された核酸）が増幅される。
一部の実施形態では、固相増幅は、表面に固定化されたオリゴヌクレオチドプライマーの１つの種のみを含む核酸増幅反応を含む。ある特定の実施形態では、固相増幅は、複数の異なる固定化されたオリゴヌクレオチドプライマー種を含む。一部の実施形態では、固相増幅は、固体表面に固定化されたオリゴヌクレオチドプライマーの１つの種と溶液中の第２の異なるオリゴヌクレオチドプライマー種とを含む核酸増幅反応を含み得る。固定化されたプライマーまたは溶液系プライマーの複数の異なる種を使用することができる。固相核酸増幅反応の非限定的な例としては、界面増幅、架橋増幅、エマルジョンＰＣＲ、ＷｉｌｄＦｉｒｅ増幅（例えば、米国特許出願公開第２０１３／００１２３９９号）などまたはこれらの組合せが挙げられる。
核酸シーケンシング
一部の実施形態では、核酸（例えば、核酸断片、試料核酸、無細胞核酸、一本鎖核酸、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ）は、シーケンシングされる。一部の実施形態では、本明細書で提供される足場アダプターとハイブリダイズされたｓｓＮＡ（「ハイブリダイゼーション産物」）は、シーケンシングプロセスによりシーケンシングされる。一部の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド成分とハイブリダイズされたｓｓＮＡ（「一本鎖ライゲーション産物」）は、シーケンシングプロセスによりシーケンシングされる。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション産物および／または一本鎖ライゲーション産物は、増幅プロセスにより増幅され、増幅産物は、シーケンシングプロセスによりシーケンシングされる。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション産物および／または一本鎖ライゲーション産物は、増幅プロセスにより増幅されず、ハイブリダイゼーション産物および／または一本鎖ライゲーション産物は、事前の増幅なしにシーケンシングプロセスによりシーケンシングされる。一部の実施形態では、シーケンシングプロセスは、配列リード（またはシーケンシングリード）を生成する。一部の実施形態では、本明細書における方法は、配列リードに基づいて一本鎖核酸分子の配列を決定するステップを含む。
ある特定のシーケンシングプラットフォーム（例えば、ペアエンドシーケンシング）の場合、配列リードを生成するステップは、フォワード配列リードを生成すること、およびリバース配列リードを生成することを含み得る。例えば、ある特定のペアエンドシーケンシングプラットフォームを使用するシーケンシングは、各核酸断片を両方の方向からシーケンシングし、一般に、その結果、フォワード方向の第１のリード（フォワードリード）および逆相補的方向の第２のリード（リバースリード）を含む２つのリードが、核酸断片ごとに得られる。ある特定のプラットフォームの場合、フォワードリードは、シーケンシングアダプター内の特定のプライマー（例えば、ＩＬＬＵＭＩＮＡアダプター、Ｐ５プライマー）から生成され、リバースリードは、シーケンシングアダプター内の異なるプライマー（例えば、ＩＬＬＵＭＩＮＡアダプター、Ｐ７プライマー）から生成される。
核酸は、サンガーシーケンシングプラットフォーム、ハイスループットもしくは大規模並列シーケンシング（次世代シーケンシング（ＮＧＳ））プラットフォームなど、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）により提供されているシーケンシングプラットフォーム（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）および／もしくはＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）シーケンシングシステム）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより提供されているシーケンシングプラットフォーム（例えば、ＭｉｎＩＯＮシーケンシングシステム）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）により提供されているシーケンシングプラットフォーム（例えば、Ｉｏｎ ＰＧＭ（商標）および／もしくはＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）シーケンシングシステム）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより提供されているシーケンシングプラットフォーム（例えば、ＰＡＣＢＩＯ ＲＳ ＩＩシーケンシングシステム）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）により提供されているシーケンシングプラットフォーム（例えば、ＳＯＬｉＤシーケンシングシステム）、Ｒｏｃｈｅにより提供されるシーケンシングプラットフォーム（例えば、４５４ ＧＳ ＦＬＸ＋および／もしくはＧＳ Ｊｕｎｉｏｒシーケンシングシステム）、または任意の他の好適なシーケンシングプラットフォームなどを含む、任意の好適なシーケンシングプラットフォームを使用してシーケンシングすることができる。一部の実施形態では、シーケンシングプロセスは、高多重化シーケンシングプロセスである。ある特定の事例では、完全または実質的に完全な配列が得られ、部分的配列が得られることもある。核酸シーケンシングは、一般に、配列リードの一群を生成する。本明細書で使用される場合、「リード」（複数）（例えば、「リード」（単数）、「配列リード」（単数））は、本明細書に記載されるまたは当技術分野において公知の任意のシーケンシングプロセスにより生成されたオリゴヌクレオチドの短い配列である。リードは、核酸断片の一方の末端から生成され得（シングルエンドリード）、核酸断片の両方の末端から生成されることもある（例えば、ペアエンドリード、ダブルエンドリード）。一部の実施形態では、シーケンシングプロセスは、短いシーケンシングリードまたは「短いリード」を生成する。一部の実施形態では、短いリードの長さの名目値、代表値、平均値または絶対値は、連続する約１０ヌクレオチドから、連続する約２５０またはそれを超えるヌクレオチドまでであることもある。一部の実施形態では、短いリードの長さの名目値、代表値、平均値または絶対値は、連続する約５０ヌクレオチドから、連続する約１５０またはそれを超えるヌクレオチドまでである。
配列リードの長さは、利用される特定のシーケンシング技術に関連することが多い。例えば、ハイスループット法は、サイズに数十から数百塩基対（ｂｐ）までの幅があり得る、配列リードを生じさせる。例えば、ナノポアシーケンシングは、サイズに数十から数百そして数千塩基対までの幅があり得る、配列リードを生じさせ得る。一部の実施形態では、配列リードは、約１５ｂｐ～約９００ｂｐ長の長さ平均値、中央値、代表値または絶対値を有する。ある特定の実施形態では、配列リードは、約１０００ｂｐのまたはそれを超える、長さ平均値、中央値、代表値または絶対値を有する。一部の実施形態では、配列リードは、約１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００もしくは５０００ｂｐのまたはそれを超える、長さ平均値、中央値、代表値または絶対値を有する。一部の実施形態では、配列リードは、約１００ｂｐ～約２００ｂｐの長さ平均値、中央値、代表値または絶対値を有する。
一部の実施形態では、シングルエンドリードの長さの名目値、代表値、平均値または絶対値は、連続する約１０ヌクレオチドから連続する約２５０またはそれを超えるヌクレオチドまで、連続する約１５ヌクレオチドから連続する約２００またはそれを超えるヌクレオチドまで、連続する約１５ヌクレオチドから連続する約１５０またはそれを超えるヌクレオチドまで、連続する約１５ヌクレオチドから連続する約１２５またはそれを超えるヌクレオチドまで、連続する約１５ヌクレオチドから連続する約１００またはそれを超えるヌクレオチドまで、連続する約１５ヌクレオチドから連続する約７５またはそれを超えるヌクレオチドまで、連続する約１５ヌクレオチドから連続する約６０またはそれを超えるヌクレオチドまで、連続する１５ヌクレオチドから連続する約５０またはそれを超えるヌクレオチドまで、連続する約１５ヌクレオチドから連続する約４０またはそれを超えるヌクレオチドまでであることもあり、連続する約１５ヌクレオチド、または連続する約３６もしくはそれを超えるヌクレオチドであることもある。ある特定の実施形態では、シングルエンドリードの長さの名目値、代表値、平均値または絶対値は、長さ約２０～約３０塩基、または約２４～約２８塩基である。ある特定の実施形態では、シングルエンドリードの長さの名目値、代表値、平均値または絶対値は、長さ約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または約２９塩基もしくはそれを超える。ある特定の実施形態では、シングルエンドリードの長さの名目値、代表値、平均値または絶対値は、長さ約２０～約２００塩基、約１００～約２００塩基、または約１４０～約１６０塩基である。ある特定の実施形態では、シングルエンドリードの長さの名目値、代表値、平均値または絶対値は、長さ約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または約２００塩基もしくはそれを超える。ある特定の実施形態では、ペアエンドリードの長さの名目値、代表値、平均値または絶対値は、連続する約１０ヌクレオチドから連続する約２５ヌクレオチドまたはそれを超えるヌクレオチド数まで（例えば、長さ約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５ヌクレオチド、またはそれを超えるヌクレオチド数）、連続する約１５ヌクレオチドから連続する約２０ヌクレオチドまたはそれを超えるヌクレオチド数までであることもあり、連続する約１７ヌクレオチドまたは連続する約１８ヌクレオチドであることもある。ある特定の実施形態では、ペアエンドリードの長さの名目値、代表値、平均値または絶対値は、連続する約２５ヌクレオチドから連続する約４００ヌクレオチドまたはそれを超えるヌクレオチド数まで（例えば、長さ約２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０もしくは４００ヌクレオチド、またはそれを超えるヌクレオチド数）、連続する約５０ヌクレオチドから連続する約３５０ヌクレオチドまたはそれを超えるヌクレオチド数まで、連続する約１００ヌクレオチドから連続する約３２５ヌクレオチドまで、連続する約１５０ヌクレオチドから連続する約３２５ヌクレオチドまで、連続する約２００ヌクレオチドから連続する約３２５ヌクレオチドまで、連続する約２７５ヌクレオチドから連続する約３１０ヌクレオチドまで、連続する約１００ヌクレオチドから連続する約２００ヌクレオチドまで、連続する約１００ヌクレオチドから連続する約１７５ヌクレオチドまで、連続する約１２５ヌクレオチドから連続する約１７５ヌクレオチドまでであることもあり、連続する約１４０ヌクレオチドから連続する約１６０ヌクレオチドまでであることもある。ある特定の実施形態では、ペアエンドリードの長さの名目値、代表値、平均値または絶対値は、連続する約１５０ヌクレオチドであり、連続する１５０ヌクレオチドであることもある。
リードは、一般に、物理的核酸中のヌクレオチド配列の表現である。例えば、配列のＡＴＧＣ描写を含有するリードの場合、物理的核酸中の、「Ａ」は、アデニンヌクレオチドを表し、「Ｔ」は、チミンヌクレオチドを表し、「Ｇ」は、グアニンヌクレオチドを表し、「Ｃ」は、シトシンヌクレオチドを表す。対象からの試料から得られる配列リードは、少数派核酸と多数派核酸の混合物からのリードであることがある。例えば、がん患者の血液から得られる配列リードは、がん核酸と非がん核酸の混合物からのリードであることがある。別の例では、妊娠している雌の血液から得られる配列リードは、胎児核酸と母体核酸の混合物からのリードであることがある。別の例では、感染症または感染性疾患に罹患している患者の血液から得られる配列リードは、宿主核酸と病原体核酸の混合物からのリードであることがある。別の例では、移植レシピエントの血液から得られる配列リードは、宿主核酸と移植片核酸の混合物からのリードであることがある。別の例では、試料から得られる配列リードは、対象のマイクロバイオーム（例えば、腸のマイクロバイオーム、血液のマイクロバイオーム、口腔のマイクロバイオーム、脊髄液のマイクロバイオーム、糞便のマイクロバイオーム）を集団で構成する微生物からの核酸の混合物からのリードであることがある。別の例では、試料から得られる配列リードは、マイクロバイオーム（例えば、腸のマイクロバイオーム、血液のマイクロバイオーム、口腔のマイクロバイオーム、脊髄液のマイクロバイオーム、糞便のマイクロバイオーム）を集団で構成する微生物からの核酸と宿主対象からの核酸との混合物からのリードであることがある。比較的短いリードの混合物を、本明細書に記載されるプロセスにより、対象内に存在するゲノム核酸の表現に、および／または腫瘍、胎児、病原体、移植片もしくはマイクロバイオームに存在するゲノム核酸の表現に、変換することができる。
ある特定の実施形態では、対象から試料の核酸配列リードを「得ること」、および／または１名もしくは複数名の参照人物から生物検体の核酸配列リードを「得ること」は、配列情報を得るために核酸を直接シーケンシングすることを含むことができる。一部の実施形態では、「得ること」は、別の者により核酸から直接得られた配列情報を受け取ることを含むことができる。
一部の実施形態では、試料中の一部またはすべての核酸は、シーケンシング前または中に（例えば、非特異的に、例えば、ＰＣＲに基づく方法により）濃縮および／または増幅される。ある特定の実施形態では、試料中の特異的核酸種またはサブセットは、シーケンシング前または中に濃縮および／または増幅される。一部の実施形態では、核酸のあらかじめ選択されたプールの種またはサブセットは、ランダムにシーケンシングされる。一部の実施形態では、試料中の核酸は、シーケンシング前または中に濃縮および／または増幅されない。
一部の実施形態では、ゲノムの代表的画分は、シーケンシングされ、「カバレッジ」または「カバレッジ倍数」と呼ばれることもある。例えば、１倍のカバレッジは、ゲノムのヌクレオチド配列のおよそ１００％がリードにより表されることを示す。一部の事例では、カバレッジ倍数は、「シーケンシング深度」と呼ばれる（およびそれに正比例する）。一部の実施形態では、「カバレッジ倍数」は、参照として以前のシーケンシング実験を参照する相対的用語である。例えば、第２のシーケンシング実験は、第１のシーケンシング実験の２分の１のカバレッジを有することがある。一部の実施形態では、ゲノムは、ゲノムの所与の領域が、２つもしくはそれより多くのリードまたはオーバーラップしているリードによりカバーされ得る（例えば、１を超える「カバレッジ倍数」、例えば、２倍のカバレッジ）冗長性で、シーケンシングされる。一部の実施形態では、ゲノム（例えば、全ゲノム）は、約０．０１倍～約１００倍のカバレッジ、約０．１倍～約２０倍のカバレッジ、または約０．１倍～約１倍のカバレッジ（例えば、約０．０１５倍、０．０２倍、０．０３倍、０．０４倍、０．０５倍、０．０６倍、０．０７倍、０．０８倍、０．０９倍、０．１倍、０．２倍、０．３倍、０．４倍、０．５倍、０．６倍、０．７倍、０．８倍、０．９倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍またはそれを超えるカバレッジ）で、シーケンシングされる。一部の実施形態では、ゲノムの特異的部分（例えば、標的化された方法からのゲノム部分）がシーケンシングされ、カバレッジ倍数値は、シーケンシングされる特異的ゲノム部分の画分を一般に指す（すなわち、カバレッジ倍数値は、全ゲノムを指さない）。一部の事例では、特異的ゲノム部分は、１０００倍のカバレッジまたはそれを超えるカバレッジでシーケンシングされる。例えば、特異的ゲノム部分を、２０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、３０，０００倍、４０，０００倍または５０，０００倍のカバレッジでシーケンシングすることができる。一部の実施形態では、シーケンシングは、約１，０００倍～約１００，０００倍のカバレッジでのものである。一部の実施形態では、シーケンシングは、約１０，０００倍～約７０，０００倍のカバレッジでのものである。一部の実施形態では、シーケンシングは、約２０，０００倍～約６０，０００倍のカバレッジでのものである。一部の実施形態では、シーケンシングは、約３０，０００倍～約５０，０００倍のカバレッジでのものである。
一部の実施形態では、１個体からの１つの核酸試料がシーケンシングされる。ある特定の実施形態では、２つまたはそれより多くの試料であって、１個体からのものであるかまたは異なる個体からのものである試料の各々からの核酸が、シーケンシングされる。ある特定の実施形態では、各生体試料が１個体または２もしくはそれより多くの個体からのものである、２つまたはそれより多くの生体試料からの核酸試料が、プールされ、そのプールがシーケンシングされる。後者の実施形態では、各生体試料からの核酸試料は、１つまたは複数の固有識別子により識別されることが多い。
一部の実施形態では、シーケンシング方法は、シーケンシングプロセスにおいて配列反応の多重化を可能にする識別を利用する。固有識別子の数が多いほど、例えば、シーケンシングプロセスで多重化することができる、検出用の試料および／または染色体の数が多い。シーケンシングプロセスは、任意の好適な数（例えば、４、８、１２、２４、４８、９６またはそれより多く）の固有識別子を使用して、行うことができる。
シーケンシングプロセスは、固相を使用することもあり、固相は、ライブラリーからの核酸を結合させることができるフローセスであって、試薬を流動させ、結合した核酸と接触させることができるフローセルを、含むこともある。フローセルは、フローセルレーンを含むこともあり、識別子の使用は、各レーンでのいくつかの試料の解析を容易にすることができる。フローセルは、結合された分析物を保持し、および／またはその上を試薬溶液が順序だって通過することを可能にするように、構成することができる固体支持体であることが多い。フローセルは、多くの場合、平面形状であり、光学的に透明であり、一般に、ミリメートルまたはミリメートル未満の規模であり、分析物／試薬相互作用が起こるチャネルまたはレーンを有することが多い。一部の実施形態では、所与のフローセルレーンで解析される試料の数は、ライブラリー調製および／またはプローブ設計中に利用される固有識別子の数に依存する。例えば、１２の識別子を使用する多重化により、８レーンフローセルで（例えば、９６ウェルマイクロウェルプレートにおけるウェルの数に等しい）９６の試料の同時解析が可能になる。同様に、例えば４８の識別子を使用する多重化により、８レーンフローセルで（例えば、３８４ウェルマイクロウェルプレートにおけるウェルの数に等しい）３８４の試料の同時解析が可能になる。市販のマルチプレックスシーケンシングキットの非限定的な例としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａのｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｔおよびｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ＰｈｉＸ ｃｏｎｔｒｏｌ ｋｉｔ（例えば、それぞれ、Ｉｌｌｕｍｉｎａのカタログ番号ＰＥ－４００－１００１およびＰＥ－４００－１００２）が挙げられる。
任意の好適な核酸シーケンシング方法を使用することができ、そのような方法の非限定的な例としては、マクサム・ギルバート法（Maxim & Gilbert）、連鎖停止法、一塩基合成法、ライゲーションによるシーケンシング、質量分析によるシーケンシング、顕微鏡法に基づく手法など、またはこれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、例えば、マイクロ流体サンガーシーケンシングを含む、自動化サンガーシーケンシング法を含むサンガーシーケンシング法などの、第１世代技術を、本明細書で提供される方法において使用することができる。一部の実施形態では、核酸イメージング技術（例えば、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）および原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ））の使用を含むシーケンシング技術を使用することができる。一部の実施形態では、ハイスループットシーケンシング法が使用される。ハイスループットシーケンシング法は、大規模並列方式で、ときにはフローセル内で、シーケンシングされる、クローン増幅されたＤＮＡ鋳型または単一のＤＮＡ分子を一般に含む。大規模並列方式でＤＮＡをシーケンシングすることができる次世代（例えば、第２および第３世代）シーケンシング手法を本明細書に記載される方法に使用することができ、そのような手法は、本明細書では「大規模並列シーケンシング」（ＭＰＳ）と総称される。一部の実施形態では、ＭＰＳシーケンシング法は、目的の特異的染色体、遺伝子または領域がシーケンシングされる、標的化アプローチを利用する。ある特定の実施形態では、試料中の大半のまたはすべての核酸がランダムにシーケンシング、増幅および／または捕捉される、非標的化アプローチが、使用される。
一部の実施形態では、標的化された濃縮、増幅および／またはシーケンシングアプローチが使用される。標的化アプローチは、配列特異的オリゴヌクレオチドの使用によるさらなる処理のために試料中の核酸のサブセットを単離、選択および／または濃縮することが多い。一部の実施形態では、配列特異的オリゴヌクレオチドのライブラリーは、試料中の核酸の１つまたは複数のセットを標的とする（例えば、そのようなセットとハイブリダイズする）ために利用される。配列特異的オリゴヌクレオチドおよび／またはプライマーは、目的の１つまたは複数の染色体、遺伝子、エクソン、イントロンおよび／または調節領域に存在する特定の配列（例えば、固有核酸配列）に対して選択的であることが多い。任意の好適な方法または方法の組合せを、標的核酸の１つまたは複数のサブセットの濃縮、増幅および／またはシーケンシングに使用することができる。一部の実施形態では、標的配列は、１つまたは複数の配列特異的アンカーを使用する固相（例えば、フローセル、ビーズ）への捕捉により単離および／または濃縮される。一部の実施形態では、標的配列は、配列特異的プライマーおよび／またはプライマーセットを使用するポリメラーゼに基づく方法（例えば、任意の好適なポリメラーゼに基づく伸長による、ＰＣＲに基づく方法）により濃縮および／または増幅される。配列特異的アンカーを、多くの場合、配列特異的プライマーとして使用することができる。
ＭＰＳシーケンシングは、一塩基合成法およびある特定のイメージングプロセスを使用することもある。本明細書に記載される方法において使用することができる核酸シーケンシング技術は、一塩基合成法および可逆的ターミネーターに基づくシーケンシング（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩ；ＨＩＳＥＱ ２０００；ＨＩＳＥＱ ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ））である。この技術を用いて、何百万もの核酸（例えば、ＤＮＡ）断片を並行してシーケンシングすることができる。このタイプのシーケンシング技術の一例では、光学的に透明なスライドであって、その表面の８つの個別のレーンにオリゴヌクレオチドアンカー（例えば、アダプタープライマー）が結合されている、スライドを含有する、フローセルが使用される。
一塩基合成法は、一般に、鋳型により方向付けられる様式でプライマーまたは既存の核酸鎖にヌクレオチドを（共有結合性付加により）反復的に付加させることにより行われる。ヌクレオチドの反復的付加各々が検出され、核酸鎖の配列が得られるまでこのプロセスが何度も繰り返される。得られる配列の長さは、一部には、行われる付加および検出ステップの数に依存する。一塩基合成法の一部の実施形態では、ヌクレオチド付加の１ラウンドで、同じタイプの１つ、２つ、３つまたはそれより多くのヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）が、付加され、検出される。ヌクレオチドを任意の好適な方法により（例えば、酵素的にまたは化学的に）付加させることができる。例えば、一部の実施形態では、ポリメラーゼまたはリガーゼは、ヌクレオチドをプライマーに、または既存の核酸鎖に、鋳型により方向付けられる様式で付加させる。一塩基合成法の一部の実施形態では、異なるタイプのヌクレオチド、ヌクレオチド類似体および／または識別子が使用される。一部の実施形態では、可逆的ターミネーターおよび／または除去可能な（例えば、切断可能な）識別子が使用される。一部の実施形態では、蛍光標識されたヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体が使用される。ある特定の実施形態では、一塩基合成法は、切断（例えば、識別子の切断および除去）および／または洗浄ステップを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドの付加は、本明細書に記載されるまたは当技術分野において公知の好適な方法により検出され、そのような方法の非限定的な例としては、任意の好適なイメージング装置、好適なカメラ、デジタルカメラ、ＣＣＤ（電荷結合素子）に基づくイメージング装置（例えば、ＣＣＤカメラ）、ＣＭＯＳ（相補型金属酸化物シリコン）に基づくイメージング装置（例えば、ＣＭＯＳカメラ）、光ダイオード（例えば、光電子増倍チューブ）、電子顕微鏡法、電界効果トランジスタ（例えば、ＤＮＡ電界効果トランジスタ）、ＩＳＦＥＴイオンセンサー（例えば、ＣＨＥＭＦＥＴセンサー）など、またはこれらの組合せが挙げられる。
本明細書に記載される方法を行うための任意の好適なＭＰＳ法、システムまたは技術プラットフォームを使用して、核酸配列リードを得ることができる。ＭＰＳプラットフォームの非限定的な例としては、ＩＬＬＵＭＩＮＡ／ＳＯＬＥＸ／ＨＩＳＥＱ（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩ；ＨＩＳＥＱ ２０００；ＨＩＳＥＱ）、ＳＯＬｉＤ、Ｒｏｃｈｅ／４５４、ＰＡＣＢＩＯおよび／もしくはＳＭＲＴ、Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｔｒｕｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、Ｉｏｎ ＴｏｒｒｅｎｔおよびＩｏｎ半導体に基づくシーケンシング（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより開発されたようなもの）、ＷｉｌｄＦｉｒｅ、５５００、５５００ｘｌ Ｗおよび／もしくは５５００ｘｌ Ｗ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒに基づく技術（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより開発され、販売されているようなもの；米国特許出願公開第２０１３／００１２３９９号）；Ｐｏｌｏｎｙシーケンシング、パイロシーケンシング、大規模並列シグネチャーシーケンシング（ＭＰＳＳ）、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）シーケンシング、ＬａｓｅｒＧｅｎシステムおよび方法、ナノポアに基づくプラットフォーム、化学物質感受性電界効果トランジスタ（ＣＨＥＭＦＥＴ）アレイ、電子顕微鏡法に基づくシーケンシング（例えば、ＺＳ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｈａｌｃｙｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒにより開発されたようなもの）、ナノボールシーケンシングなど、またはこれらの組合せが挙げられる。本明細書における方法を行うために使用することができる他のシーケンシング方法としては、デジタルＰＣＲ、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ナノポアシーケンシング、染色体特異的シーケンシング（例えば、ＤＡＮＳＲ（選択された領域のデジタル解析））技術が挙げられる。
一部の実施形態では、核酸は、シーケンシングされ、シーケンシング産物（例えば、配列リードの一群）は、シーケンシングされた核酸の解析前にまたは解析と同時に処理される。例えば、配列リードは、アライメント、マッピング、フィルタリング、計数、正規化、重み付け、プロファイルの生成などのうちの１つまたは複数、およびこれらの組合せに従って、処理され得る。ある特定の処理ステップをいずれの順序で行ってもよく、ある特定の処理ステップを繰り返してもよい。
本開示の方法を使用して、シーケンシング誤り率を低下させることができる。一部の実施形態では、最初の変性させるステップの前に、二本鎖分子をバーコードで標識することができ、その結果、後続の変性、一本鎖ライブラリー調製、およびシーケンシング後に、元々互いに対合していた核酸分子からの配列を関連付けることができる。一部の実施形態では、足場アダプターの最初のライゲーション後、インデックスプライマーのプールが、インデックスＰＣＲを行なうために使用され、その結果、元の試料核酸分子と最初のＰＣＲ第１鎖合成からの核酸の両方のコピーが生成され、これらの両方が、同じバーコードまたはＵＭＩ（またはその相補体）を含む。元々ハイブリダイズされていた（それ故、相補配列を有する）鎖を関連付けるこれらのまたは他の手段により、両方の鎖についてのシーケンシングリード情報を比較することができ、それらの情報を使用してシーケンシング誤り率を低下させることができる。
リードのマッピング
配列リードをマッピングすることができ、指定核酸領域（例えば、染色体またはその一部分）にマッピングするリードの数は、カウントと呼ばれる。任意の好適なマッピング方法（例えば、プロセス、アルゴリズム、プログラム、ソフトウェア、モジュールなど、またはこれらの組合せ）を使用することができる。マッピングプロセスのある特定の態様が、以下に説明される。
ヌクレオチド配列リード（すなわち、物理的なゲノム位置が不明である断片からの配列情報）のマッピングは、いくつかの方法で行うことができ、多くの場合、得られた配列リードと参照ゲノム内のマッチする配列とのアライメントを含む。そのようなアライメントでは、配列リードは、一般に、参照配列とアライメントされ、アライメントしているものは、「マッピングされている」と、「マッピングされた配列リード」と、または「マッピングされたリード」と言われる。ある特定の実施形態では、マッピングされた配列リードは、「ヒット」または「カウント」と呼ばれる。一部の実施形態では、マッピングされた配列リードは、様々なパラメーターに従ってまとめられ、下でさらに詳細に論じられる特定のゲノム部分に割り当てられる。
用語「アライメントされた」、「アライメント」または「アライメントすること」は、マッチ（例えば、同一性１００％）または部分的マッチとして識別され得る、２つまたはそれより多くの核酸配列を一般に指す。アライメントを手作業で行うことができ、またはコンピュータ（例えば、ソフトウェア、プログラム、モジュールもしくはアルゴリズム）により行うことができ、この非限定的な例としては、ＩＬＬＵＭＩＮＡ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｉｐｅｌｉｎｅの一部として配給されているＥｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄａｔａ（ＥＬＡＮＤ）コンピュータプログラムが挙げられる。配列リードのアライメントは、１００％配列マッチであり得る。一部の事例でには、アライメントは、１００％未満の配列マッチ（すなわち、非完璧マッチ、部分的マッチ、部分的アライメント）である。一部の実施形態では、アライメントは、約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％または７５％マッチである。一部の実施形態では、アライメントは、ミスマッチを含む。一部の実施形態では、アライメントは、１、２、３、４または５つのミスマッチを含む。２つまたはそれより多くの配列を、どちらかの鎖（例えば、センスまたはアンチセンス鎖）を使用してアライメントすることができる。ある特定の実施形態では、核酸配列は、別の核酸配列の逆相補鎖とアライメントされる。
様々な計算論的方法を使用して、各配列リードを一部分にマッピングすることができる。配列をアライメントするために使用することができるコンピュータアルゴリズムの非限定的な例としては、限定ではないが、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＩＴＺ、ＦＡＳＴＡ、ＢＯＷＴＩＥ １、ＢＯＷＴＩＥ ２、ＥＬＡＮＤ、ＭＡＱ、ＰＲＯＢＥＭＡＴＣＨ、ＳＯＡＰ、ＢＷＡもしくはＳＥＱＭＡＰ、またはその変形形態、またはそれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、配列リードを参照ゲノム内の配列とアライメントすることができる。一部の実施形態では、配列リードを、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ｄｂＥＳＴ、ｄｂＳＴＳ、ＥＭＢＬ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）およびＤＤＢＪ（日本ＤＮＡデータバンク）を含む、当技術分野において公知の核酸データベースにおいて見つけることができ、および／またはそのようなデータベース内の配列とアライメントすることができる。ＢＬＡＳＴまたは類似のツールを使用して、識別された配列を配列データベースに対して検索することができる。次いで、検索ヒットを使用して、例えば、識別された配列を適切な部分にソートすることができる（以下に説明される）。
一部の実施形態では、リードは、参照ゲノム内の部分に一意的にマッピングすることもあり、または非一意的にマッピングすることもある。リードは、それが参照ゲノム内の単一の配列とアライメントした場合、「一意的にマッピングされた」と考えられる。リードは、それが参照ゲノム内の２つまたはそれより多くの配列とアライメントした場合、「非一意的にマッピングされた」と考えられる。一部の実施形態では、非一意的にマッピングされたリードは、さらなる解析（例えば、定量化）から除外される。ある特定の実施形態では、参照ゲノムとマッピングされた個々の試料からのリードとの間に存在し得る一塩基多型を考慮するために、ある特定の少しのミスマッチ（０～１）が許可され得る。一部の実施形態では、いかなる程度のミスマッチも、参照配列へのリードのマッピングに許可されない。
本明細書で使用される場合、用語「参照ゲノム」は、対象からの識別された配列を参照するために使用することができる任意の生物またはウイルスについての任意の特定の既知のシーケンシングまたは特徴付けされたゲノムを指し、これは、部分的なものか完全なものかを問わない。例えば、ヒト対象にはもちろん多くの他の生物にも使用される参照ゲノムは、ワールドワイドウェブＵＲＬ ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎで見つけることができる。「ゲノム」は、核酸配列で表される、生物またはウイルスの完全遺伝情報を指す。本明細書で使用される場合、参照配列または参照ゲノムは、多くの場合、１個体または複数の個体からの組み立てられたまたは部分的に組み立てられたゲノム配列である。一部の実施形態では、参照ゲノムは、１名または複数名のヒト個体からの組み立てられたまたは部分的に組み立てられたゲノム配列である。一部の実施形態では、参照ゲノムは、染色体に割り当てられた配列を含む。
ある特定の実施形態では、マッピング能力は、ゲノム領域（例えば、部分、ゲノム部分）について評定される。マッピング能力は、ヌクレオチド配列リードを参照ゲノムの一部分と明確にアライメントする能力であり、通常は、例えば０、１、２またはそれより多くのミスマッチを含む、指定数までのミスマッチである。所与のゲノム領域についての予想マッピング能力は、あらかじめ設定されたリード長についてスライディングウインドウアプローチを使用すること、および結果として得られるリードレベルのマッピング能力の値を平均することにより、推定することができる。固有ヌクレオチド配列の伸長部を含むゲノム領域が高いマッピング能力値を有することもある。
ペアエンドシーケンシングの場合、好適なマッピングおよび／またはアライメントプログラムまたはアルゴリズムの使用によりリードを参照ゲノムにマッピングすることができ、そのようなプログラムの非限定的な例としては、ＢＷＡ（Li H. and Durbin R. (2009)Bioinformatics 25, 1754-60）、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ［Novocraft (2010)］、Ｂｏｗｔｉｅ（Langmead B, et al., (2009) Genome Biol. 10:R25）、ＳＯＡＰ２（Li R, et al., (2009) Bioinformatics 25, 1966-67）、ＢＦＡＳＴ（Homer N, et al., (2009) PLoS ONE 4, e7767）、ＧＡＳＳＳＴ（Rizk, G. and Lavenier, D. (2010) Bioinformatics 26, 2534-2540）、およびＭＰｓｃａｎ（Rivals E., et al. (2009) Lecture Notes in Computer Science 5724, 246-260）などが挙げられる。好適なトリミングおよび／またはマージングプログラムまたはアルゴリズムを使用することによりリードをトリミングおよび／またはマージすることができ、そのようなプログラムまたはアルゴリズムの非限定的な例としては、Ｃｕｔａｄａｐｔ、ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ、ＳｅｑＰｒｅｐ、およびｕｓｅａｒｃｈが挙げられる。シーケンシングリード長より短い核酸鋳型からのものなどの一部の対合末端リードは、フォワードリードとリバースリードの両方によりシーケンシングされた部分を有することができ、そのような事例では、フォワードリードとリバースリード間のオーバーラップを使用してフォワードリードとリバースリードを単一のリードにマージすることができる。オーバーラップしていないリード、または十分にオーバーラップしていないリードは、マージしていない状態のままであることもあり、対合リードとしてマッピングされることもある。ペアエンドリードは、好適なショートリードアライメントプログラムまたはアルゴリズムを使用して、マッピングおよび／またはアライメントすることができる。ショートリードアライメントプログラムの非限定的な例としては、ＢａｒｒａＣＵＤＡ、ＢＦＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＴ、Ｂｏｗｔｉｅ、ＢＷＡ、ＣＡＳＨＸ、ＣＵＤＡ－ＥＣ、ＣＵＳＨＡＷ、ＣＵＳＨＡＷ２、ｄｒＦＡＳＴ、ＥＬＡＮＤ、ＥＲＮＥ、ＧＮＵＭＡＰ、ＧＥＭ、ＧｅｎｓｅａｒｃｈＮＧＳ、ＧＭＡＰ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ、ｉＳＡＡＣ、ＬＡＳＴ、ＭＡＱ、ｍｒＦＡＳＴ、ｍｒｓＦＡＳＴ、ＭＯＳＡＩＫ、ＭＰｓｃａｎ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ、ＮｏｖｏａｌｉｇｎＣＳ、Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ、ＮｅｘｔＧＥＮｅ、Ｏｍｉｘｏｎ、ＰＡＬＭａｐｐｅｒ、Ｐａｒｔｅｋ、ＰＡＳＳ、ＰｅｒＭ、ＱＰａｌｍａ、ＲａｚｅｒＳ、ＲＥＡＬ、ｃＲＥＡＬ、ＲＭＡＰ、ｒＮＡ、ＲＴＧ、Ｓｅｇｅｍｅｈｌ、ＳｅｑＭａｐ、Ｓｈｒｅｃ、ＳＨＲｉＭＰ、ＳＬＩＤＥＲ、ＳＯＡＰ、ＳＯＡＰ２、ＳＯＡＰ３、ＳＯＣＳ、ＳＳＡＨＡ、ＳＳＡＨＡ２、Ｓｔａｍｐｙ、ＳＴｏＲＭ、Ｓｕｂｒｅａｄ、Ｓｕｂｊｕｎｃ、Ｔａｉｐａｎ、ＵＧＥＮＥ、ＶｅｌｏｃｉＭａｐｐｅｒ、ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ、ＸｐｒｅｓｓＡｌｉｇｎ、ＺＯＯＭなど、またはこれらの組合せが挙げられる。ペアエンドリードは、参照ゲノムに従って、同じポリヌクレオチド断片の反対側の末端にマッピングされることが多い。一部の実施形態では、リードメイトが独立してマッピングされる。一部の実施形態では、両方の配列リードからの（すなわち、各末端からの）情報は、マッピングプロセスで因数分解される。参照ゲノムは、ペアエンドリードメイト間に位置する核酸の配列を決定および／または推測するために使用されることが多い。用語「不一致リードペア」は、本明細書で使用される場合、リードメイトの一方または両方が、一つには、連続するヌクレオチドのセグメントにより定義される、参照ゲノムの同じ領域に明確にマッピングすることができないリードメイトのペアを含む、ペアエンドリードを指す。一部の実施形態では、不一致リードペアは、参照ゲノムの予想外の位置にマッピングする、ペアエンドリードメイトである。参照ゲノムの予想外の位置の非限定的な例としては、（ｉ）２つの異なる染色体、（ｉｉ）所定の断片サイズより大きい（例えば、３００ｂｐより大きい、５００ｂｐより大きい、１０００ｂｐより大きい、５０００ｂｐより大きい、もしくは１０，０００ｂｐより大きい）断片サイズによって隔てられている位置、（ｉｉｉ）参照配列と合致しない方向（すなわち、反対方向）など、またはこれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、不一致リードメイトは、試料中の鋳型ポリヌクレオチド断片の長さ（例えば、長さ代表値、所定の断片サイズ）または予想長に従って識別される。例えば、試料中のポリヌクレオチド断片の長さ代表値または予想長を超える長さによって隔てられている位置にマッピングするリードメイトは、不一致リードペアとして識別されることもある。反対方向にマッピングするリードペアは、リードのうちの一方の逆相補鎖を使うこと、および参照配列の同じ鎖を使用して両方のリードのアライメントを比較することにより、決定されることもある。不一致リードペアは、当技術分野において公知のまたは本明細書に記載される任意の好適な方法および／またはアルゴリズム（例えば、ＳＶＤｅｔｅｃｔ、Ｌｕｍｐｙ、ＢｒｅａｋＤａｎｃｅｒ、ＢｒｅａｋＤａｎｃｅｒＭａｘ、ＣＲＥＳＴ、ＤＥＬＬＹなど、またはこれらの組合せ）により識別することができる。
配列リード定量化
選択された特徴または変数に基づいてマッピングまたは分割される配列リードを定量化して、１つまたは複数の部分（例えば、参照ゲノムの部分）にマッピングされるリードの量または数を決定することができる。ある特定の実施形態では、部分またはセグメントにマッピングされる配列リードの量は、カウントまたはリード密度と呼ばれる。
カウントは、多くの場合、ゲノム部分と関連付けられる。一部の実施形態では、カウントは、部分にマッピングされた（すなわち、部分と関連付けられた）配列リードの一部またはすべてから決定される。ある特定の実施形態では、カウントは、部分の群（例えば、セグメントまたは領域内の部分）にマッピングされた配列リードの一部またはすべてから決定される。
カウントは、好適な方法、操作または数学的プロセスにより決定することができる。カウントは、セグメントに対応するゲノム部分もしくはゲノム部分の群にマッピングされた、ゲノムの小領域（例えば、コピー数変異領域、コピー数変更領域、コピー数重複領域、コピー数欠失領域、微細重複領域、微細欠失領域、染色体領域、常染色体領域、性染色体領域）に対応する部分の群にマッピングされた、および／または、ときには、ゲノムに対応する部分の群にマッピングされた、すべての配列リードの直和であることもある。リード定量化は、比であることもあり、領域ａ内の部分についての定量化の領域ｂ内の部分についての定量化に対する比であることもある。領域ａは、１つの部分、セグメント領域、コピー数変異領域、コピー数変更領域、コピー数重複領域、コピー数欠失領域、微細重複領域、微細欠失領域、染色体領域、常染色体領域および／または性染色体領域であることもある。領域ｂは、独立して、１つの部分、セグメント領域、コピー数変異領域、コピー数変更領域、コピー数重複領域、コピー数欠失領域、微細重複領域、微細欠失領域、染色体領域、常染色体領域、性染色体領域、すべての常染色体を含む領域、性染色体を含む領域、および／またはすべての染色体を含む領域であることもある。
一部の実施形態では、カウントは、生配列リードおよび／またはフィルタリングされた配列リードから導出される。ある特定の実施形態では、カウントは、ゲノム部分にまたはゲノム部分の群（例えば、領域内のゲノム部分）にマッピングされた配列リードの代表値、平均値または合計である。一部の実施形態では、カウントは、不確定値に関連付けられる。カウントは、調整されることもある。カウントは、重み付けされた、除去された、フィルタリングされた、正規化された、調整された、平均された、平均値として導出された、中央値として導出された、加算された、またはこれらの組合せが施された、ゲノム部分または部分の群に関連付けられた配列リードに従って、調整することができる。
配列リード定量化は、リード密度であることもある。リード密度を、ゲノムの１つまたは複数のセグメントについて決定および／または生成することができる。ある特定の事例では、リード密度を、１つまたは複数の染色体について決定および／または生成することができる。一部の実施形態では、リード密度は、参照ゲノムのセグメントまたは一部分にマッピングされた配列リードのカウントの定量的測度を含む。リード密度を、好適なプロセスにより決定することができる。一部の実施形態では、リード密度は、好適な分布および／または好適な分布関数により決定される。分布関数の非限定的な例としては、確率関数、確率分布関数、確率密度関数（ＰＤＦ）、カーネル密度関数（カーネル密度推定）、累積分布関数、確率質量関数、離散確率分布、絶対連続単変量分布など、任意の好適な分布、またはこれらの組合せが挙げられる。リード密度は、好適な確率密度関数から導出される密度推定であり得る。密度推定は、基礎をなす確率密度関数の推定値を実測データに基づいて構築することである。一部の実施形態では、リード密度は、密度推定（例えば、確率密度推定、カーネル密度推定）を含む。各々の部分が配列リードのカウントを構成する、ゲノムの１つまたは複数の部分の各々についての密度推定を生成することを含むプロセスに従って、リード密度を生成することができる。部分またはセグメントにマッピングされた、正規化および／または重み付けされたカウントについて、リード密度を生成することができる。一部の事例では、部分またはセグメントにマッピングされた各リードは、リード密度に寄与することができ、値（例えば、カウント）は、本明細書に記載される正規化プロセスから得られるその重みに等しくなる。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分またはセグメントについてのリード密度が調整される。リード密度を、好適な方法により調整することができる。例えば、１つまたは複数の部分についてのリード密度に重み付けすることができ、および／またはリード密度を正規化することができる。
所与の部分またはセグメントについて定量化されたリードは、１つの供給源からのものであることもあり、または異なる供給源からのものであることもある。一例では、がんに罹患しているまたはがんの罹患が疑われる対象からの核酸から、リードを得ることができる。そのような状況では、１つまたは複数の部分にマッピングされたリードは、健康な細胞（すなわち、非がん細胞）とがん細胞（例えば、腫瘍細胞）の両方を代表するリードであることが多い。ある特定の実施形態では、ある部分にマッピングされたリードの一部は、がん細胞核酸からのものであり、同じ部分にマッピングされたリードの一部は、非がん細胞核酸からのものである。別の例では、胎児を宿している妊娠している雌からの核酸試料から、リードを得ることができる。そのような状況では、１つまたは複数の部分にマッピングされたリードは、胎児と胎児の母（例えば、妊娠している雌対象）の両方を代表するリードであることが多い。ある特定の実施形態では、ある部分にマッピングされたリードの一部は、胎児ゲノムからのものであり、同じ部分にマッピングされたリードの一部は、母体ゲノムからのものである。
分類およびそれらの使用
本明細書に記載される方法は、上記の試料または供給源の１つまたは複数の特性を示すアウトカムを提供することができる。本明細書に記載される方法は、被検試料（例えば、医学的状態の存在もしくは非存在および／または表現型を決定するアウトカムを提供するもの）についての表現型および／または医学的状態の存在もしくは非存在を示すアウトカムを提供することもある。アウトカムは、分類プロセスの一部であることが多く、分類（例えば、試料もしくは供給源の１つもしくは複数の特性、ならびに／または被検試料についての遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／もしくは医学的状態の存在もしくは非存在の分類）は、アウトカムに基づくこともあり、および／またはアウトカムを含むこともある。アウトカムおよび／または分類は、分類プロセス（例えば、統計値）において試料および／もしくは供給源の１つもしくは複数の特性ならびに／または遺伝子型、表現型、遺伝的変異、遺伝的変更および／もしくは医学的状態の存在もしくは非存在の判定を容易にする、被検試料についてのデータ処理の結果に基づくこともあり、および／またはそのような結果を含むこともある。アウトカムおよび／または分類は、試料もしくは供給源の１つもしくは複数の特性、ならびに／または遺伝子型、表現型、遺伝的変異、遺伝的変更および／もしくは医学的状態の存在もしくは非存在を決定するスコアをあるいはそのような特性ならびに／または存在もしくは非存在のコールを含むこともあり、またはそのようなスコアもしくはコールに基づくこともある。ある特定の実施形態では、アウトカムおよび／または分類は、分類プロセスにおいて試料もしくは供給源の１つもしくは複数の特性をならびに／または遺伝子型、表現型、遺伝的変異、遺伝的変更および／もしくは医学的状態の存在もしくは非存在を予測および／または判定する、結論を含む。
アウトカムおよび／または分類の任意の好適な表現を提供することができる。アウトカムおよび／または分類は、確率の１つまたは複数の考察に関連して本明細書に記載される処理方法を使用して生成された１つまたは複数の数値に基づくこともあり、および／またはそのような数値を含むこともある。利用することができる値の非限定的な例としては、感度、特異度、標準偏差、中央絶対偏差（ＭＡＤ）、確実性の測度、信頼度の測度、被検試料について得られた値が特定の値範囲内または外にある確実性または信頼度の測度、不確実性の測度、被検試料について得られた値が特定の値範囲内または外にある不確実性の測度、変動係数（ＣＶ）、信頼レベル、信頼区間（例えば、約９５％信頼区間）、標準スコア（例えば、ｚスコア）、カイ値、パイ値、ｔ検定の結果、ｐ値、倍数性値、適合した少数派種の分率、面積比、中央値レベルなど、またはこれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、アウトカムおよび／または分類は、リード密度、リード密度プロファイルおよび／またはプロット（例えば、プロファイルプロット）を含む。ある特定の実施形態では、複数の値が、ときにはそのような値についてのプロファイル（例えば、ｚスコアプロファイル、ｐ値プロファイル、カイ値プロファイル、パイ値プロファイル、ｔ検定の結果、値のプロファイルなど、またはこれらの組合せ）に関して、一緒に解析される。確率の考察は、試料または供給源の１つもしくは複数の特性の判定、ならびに／または対象が、遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／もしくは医学的状態を有するリスクがあるか、もしくは有しているかの判定を容易にすることができ、前述のことを決定するアウトカムおよび／または分類が、そのような考察を含むこともある。
ある特定の実施形態では、アウトカムおよび／または分類は、被検試料について遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／もしくは医学的状態の存在もしくは非存在のリスクもしくは確率を予測および／または判定する結論に基づく、ならびに／またはそのような結論を含む。結論は、本明細書に記載されるデータ解析方法から決定された値（例えば、確率、確実性および／または不確実性を示す統計値（例えば、標準偏差、中央絶対偏差（ＭＡＤ）、確実性の測度、信頼度の測度、被検試料について得られた値が特定の値範囲内または外にある確実性または信頼度の測度、不確実性の測度、被検試料について得られた値が特定の値範囲内または外にある不確実性の測度、変動係数（ＣＶ）、信頼レベル、信頼区間（例えば、約９５％信頼区間）、標準スコア（例えば、ｚスコア）、カイ値、パイ値、ｔ検定の結果、ｐ値、感度、特異度など、またはこれらの組合せ）に基づくこともある。アウトカムおよび／または分類は、特定の被検試料についての検査室検査レポートに、遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／または医学的状態の存在または非存在に関連する確率（例えば、オッズ比、ｐ値）、尤度またはリスク因子として表示されることもある。被検試料についてのアウトカムおよび／または分類は、特定の遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／または医学的状態に関して「陽性」または「陰性」として提供されることもある。例えば、アウトカムおよび／または分類は、特定の被検試料について、遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／または医学的状態の存在が判定された場合、検査室検査レポートに「陽性」と表示されることもあり、ときには、アウトカムおよび／または分類は、特定の被検試料について、遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／または医学的状態の非存在が判定された場合、検査室検査レポートに「陽性」と表示される。アウトカムおよび／または分類は、データ処理で判定されることもあり、データ処理で使用される仮説を含むこともある。
分類プロセスで生成される分類について、真陽性、偽陽性、真陰性および偽陰性という４つのタイプが概して存在する。用語「真陽性」は、本明細書で使用される場合、被検試料について正しく判定された遺伝子型、表現型、遺伝的変異、または医学的状態の存在を指す。用語「偽陽性」は、本明細書で使用される場合、被検試料について誤って判定された遺伝子型、表現型、遺伝的変異、または医学的状態の存在を指す。用語「真陰性」は、本明細書で使用される場合、被検試料について正しく判定された遺伝子型、表現型、遺伝的変異、または医学的状態の非存在を指す。用語「偽陰性」は、本明細書で使用される場合、被検試料について誤って判定された遺伝子型、表現型、遺伝的変異、または医学的状態の非存在を指す。分類プロセスについて性能の次の２つの測度：（ｉ）一般に、陽性であると正しく識別される予測陽性の分率である、感度値；および（ｉｉ）一般に、陰性であると正しく識別される予測陽性の分率である、特異度値を、これらの存在比に基づいて算出することができる。
ある特定の実施形態では、分類プロセスについて生成される検査室検査レポートは、検査性能の測度（例えば、感度および／または特異度）、および／または信頼度の測度（例えば、信頼レベル、信頼区間）を含む。検査性能および／または信頼度の測度は、被検試料についての検査室検査を行う前に行われる臨床検証研究から得られることもある。ある特定の実施形態では、感度、特異度および／または信頼度のうちの１つまたは複数は、パーセンテージとして表される。一部の実施形態では、感度、特異度または信頼レベルの各々について独立して表されるパーセンテージは、約９０％より高い（例えば、約９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％であるか、または９９％より高い（例えば、約９９．５％であるかそれより高い、約９９．９％であるかそれより高い、約９９．９５％であるかそれより高い、約９９．９９％であるかそれより高い））。特定の信頼レベル（例えば、約９０％～約９９．９％（例えば約９５％）の信頼レベル）について表される信頼区間を値の範囲として表すことができ、そのような信頼区間は、特定の信頼レベルについての感度および／または特異度の範囲として表されることもある。一部の実施形態での変動係数（ＣＶ）は、パーセンテージとして表され、パーセンテージは、約１０％またはそれ未満（例えば、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１％、または１％未満（例えば、約０．５％もしくはそれ未満、約０．１％もしくはそれ未満、約０．０５％もしくはそれ未満、約０．０１％もしくはそれ未満））であることもある。ある特定の実施形態での（例えば、特定のアウトカムおよび／または分類が偶然によるものでない）確率は、標準スコア（例えば、ｚスコア）、ｐ値、またはｔ検定の結果として表される。一部の実施形態では、アウトカムおよび／または分類についての測定分散、信頼レベル、信頼区間、感度、特異度など（例えば、信頼度パラメーターと総称される）は、本明細書に記載される１つまたは複数のデータ処理操作を使用して生成することができる。
被検試料についてのアウトカムおよび／または分類は、医療専門家または他の有資格者（例えば、医師もしくは助手）により発注されることが多く、彼らに提供されることが多く、彼らが、アウトカムおよび／または分類を、被検試料が採取される対象に伝送する。ある特定の実施形態では、アウトカムおよび／または分類は、好適な視覚媒体（例えば、機械の周辺機器またはコンポーネント、例えば、プリンターまたはディスプレイ）を使用して提供される。分類および／またはアウトカムは、医療専門家または有資格者にレポートの形態で提供されることが多い。レポートは、アウトカムおよび／または分類（例えば、値、試料もしくは供給源の１つもしくは複数の特性、または遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／もしくは医学的状態の存在もしくは非存在の評定もしくは確率）の表示を通常は含み、関連信頼度パラメーターを含むこともあり、アウトカムおよび／または分類を生成するために使用された検査についての性能の測度を含むこともある。レポートは、追跡調査手順（例えば、アウトカムまたは分類を確認する手順）の助言を含むこともある。レポートは、染色体またはその一部分の視覚表示（例えば、染色体イディオグラムまたはカリオグラム）を含むこともあり、被検試料について識別された染色体の重複および／または欠失領域の視覚化（例えば、染色体欠失または重複についての全染色体の視覚化；欠失し領域または重複領域が示されている全染色体の視覚化；重複または欠失した染色体の部分の視覚化；染色体の部分の欠失イベントにおいて残存する染色体の部分の視覚化）を示すこともある。
レポートを、医療従事者または他の有資格者による遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／または医学的状態の存在または非存在の判定を容易にする好適な形式で表示することができる。レポートの作成に使用するために好適な形式の非限定的な例としては、デジタルデータ、グラフ、２Ｄグラフ、３Ｄグラフおよび４Ｄグラフ、画像（例えば、ｊｐｇ、ビットマップ（例えば、ｂｍｐ）、ｐｄｆ、ｔｉｆｆ、ｇｉｆ、ｒａｗ、ｐｎｇなど、もしくは好適な形式）、統計図表、チャート、表、棒グラフ、円グラフ、図、フローチャート、散布図、マップ、ヒストグラム、密度チャート、関数グラフ、回路図、ブロック図、バブルマップ、信号空間ダイヤグラム、コンター図、統計地図、クモの巣グラフ、ベン図、計算図表など、または前述のものの組合せが挙げられる。
レポートを、コンピュータにより、および／またはヒトによるデータ入力により、作成してもよく、好適な電子媒体を使用して（例えば、インターネット経由で、コンピュータ経由で、ファクシミリ経由で、同じもしくは異なる物理的位置で１つのネットワークの場所から別の場所に）、またはデータを送信もしくは受信する別の方法（例えば、メールサービス、クーリエサービスなど）により、伝送および通信することができる。レポートを伝送するための通信媒体の非限定的な例としては、聴覚ファイル、コンピュータ可読ファイル（例えば、ｐｄｆファイル）、紙のファイル、検査室ファイル、診療記録ファイル、または前の段落に記載の任意の他の媒体が挙げられる。検査室ファイルまたは診療記録ファイルは、ある実施形態では、有形形態であってもよく、または電子形態（例えば、コンピュータ可読形態）であってもよい。レポートが作成され、伝送された後、アウトカムおよび／または分類を含む書面による表示および／またはグラフィック表示を好適な通信媒体経由で得ることによりレポートを受け取ることができ、これを見直すことによって、医療専門家または他の有資格者は、試料または供給源の１つもしくは複数の特性、または被検試料についての遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／もしくは医学的状態の存在もしくは非存在について判定することができる。
アウトカムおよび／または分類は、検査室により提供されることがあり、検査室から得られる（例えば、検査室ファイルから得られる）ことがある。検査室ファイルは、試料もしくは供給源の１つもしくは複数の特性および／または被検試料についての遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／もしくは医学的状態の存在もしくは非存在を判定するための１つまたは複数の検査を行う検査室により、作成され得る。検査室職員（例えば、主席研究員）は、アウトカムおよび／または分類の根拠となる被検試料に関連する情報（例えば、検査プロファイル、参照プロファイル、検査値、参照値、逸脱レベル、患者情報）を解析することができる。近いまたは疑わしい遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／または医学的状態の存在または非存在に関するコールについては、検査室職員は、被検対象からの同じ（例えば、同じ試料のアリコート）または異なる被検試料を使用して同じ手順を再実行することができる。検査室は、検査室ファイルからの遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／または医学的状態の存在または非存在を評定する職員と同じ場所にあってもよく、または異なる場所（例えば、別の国）にあってもよい。例えば、検査室ファイルをある場所で作成し、別の場所に伝送することができ、そこで、そのファイル内の被検試料についての情報が、医療専門家または他の有資格者により評定され、必要に応じて、被検試料が採取された対象に伝送される。検査室が、被検試料についてのゲノム不安定性、遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／または医学的状態の存在または非存在についての分類を含む検査室レポートを作成および／または伝送することもある。検査室検査レポートを作成する検査室は、認定された検査室であることもあり、臨床検査室改善法（ＣＬＩＡ）のもとで認定された検査室であることもある。
アウトカムおよび／または分類は、対象の診断の構成要素であることもあり、ときには、アウトカムおよび／または分類は、被検試料についての診断を下すことの一部として利用および／または評定される。例えば、医療専門家または他の有資格者は、アウトカムおよび／または分類を解析し、そのアウトカムおよび／もしくは分類に基づいて、または一部は基づいて、診断を下すことができる。一部の実施形態では、医学的状態、疾患、症状または異常の判定、検出または診断は、遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／または医学的状態の存在または非存在を決定するアウトカムおよび／または分類の使用を含む。したがって、本明細書に記載される方法により生成されたアウトカムまたは分類に従って、ならびに必要に応じて、被検試料についての遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／または医学的状態の存在または非存在についての分類を含む検査室レポートの作成および伝送に従って、被検試料についての遺伝子型、表現型、遺伝的変異および／または医学的状態の存在または非存在を診断する方法が、本明細書で提供される。
機械、ソフトウェアおよびインターフェース
本明細書に記載されるある特定のプロセスおよび方法（例えば、配列リードのサブセットを選択するプロセスおよび方法、配列リードプロファイルを生成するプロセスおよび方法、配列リードデータを処理するプロセスおよび方法、配列リード定量化を処理するプロセスおよび方法、配列リードデータまたは配列リードプロファイルに基づいて試料の１つまたは複数の特性を判定するプロセスおよび方法）は、多くの場合、頭の中で行なうには複雑すぎ、コンピュータ、マイクロプロセッサー、ソフトウェア、モジュールまたは他の機械なしでは遂行することができない。本明細書に記載される方法は、コンピュータ実装方法であり得、方法の１つまたは複数の部分は、１つまたは複数のプロセッサー（例えば、マイクロプロセッサー）、コンピュータ、システム、装置または機械（例えば、マイクロプロセッサー制御型機械）により遂行されることもある。
使用に好適なコンピュータ、システム、装置、機械およびコンピュータプログラム製品は、多くの場合、コンピュータ可読記憶媒体を含み、またはコンピュータ可読記憶媒体とともに利用される。コンピュータ可読記憶媒体の非限定的な例としては、メモリー、ハードディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、フラッシュメモリーデバイスなどが挙げられる。コンピュータ可読記憶媒体は、一般に、コンピュータハードウェアであり、多くの場合、非一過性コンピュータ可読記憶媒体である。コンピュータ可読記憶媒体は、コンピュータ可読伝送媒体ではなく、後者のコンピュータ可読伝送媒体は、それ自体が伝送信号である。
実行可能プログラムが記憶されているコンピュータ可読記憶媒体であって、プログラムが、マイクロプロセッサーに、本明細書に記載される方法を遂行するように命令する、コンピュータ可読記憶媒体が、本明細書で提供される。実行可能プログラムモジュールが記憶されているコンピュータ可読記憶媒体であって、プログラムモジュールが、マイクロプロセッサーに、本明細書に記載される方法の一部を遂行するように命令する、コンピュータ可読記憶媒体も、提供される。実行可能プログラムが記憶されているコンピュータ可読記憶媒体を含む、システム、機械、装置およびコンピュータプログラム製品であって、プログラムが、マイクロプロセッサーに、本明細書に記載される方法を遂行するように命令する、システム、機械、装置およびコンピュータプログラム製品も、本明細書で提供される。実行可能プログラムモジュールが記憶されているコンピュータ可読記憶媒体を含む、システム、機械および装置であって、プログラムモジュールが、マイクロプロセッサーに、本明細書に記載される方法の一部を遂行するように命令する、システム、機械および装置も、提供される。
コンピュータプログラム製品も提供される。コンピュータプログラム製品は、内部で実施されるコンピュータ可読プログラムコードを含む、コンピュータ使用可能媒体であって、コンピュータ可読プログラムコードが、本明細書に記載される方法または方法の一部を実行するための命令を受けるように構成されている、コンピュータ使用可能媒体を、多くの場合、含む。コンピュータ使用可能媒体および可読プログラムコードは、伝送媒体（すなわち、それ自体が伝送信号）ではない。コンピュータ可読プログラムコードは、プロセッサー、コンピュータ、システム、装置または機械により実行されるように構成されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法（例えば、配列リードのサブセットを選択する方法、配列リードプロファイルを生成する方法、配列リードデータを処理する方法、配列リード定量化を処理する方法、配列リードデータまたは配列リードプロファイルに基づいて試料の１つまたは複数の特性を判定する方法）は、自動化法により遂行される。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法の１つまたは複数のステップは、マイクロプロセッサーおよび／もしくはコンピュータにより行われ、ならびに／またはメモリーと連動して行われる。一部の実施形態では、自動化法は、本明細書に記載される方法を遂行する、ソフトウェア、モジュール、マイクロプロセッサー、同様のものを含む周辺機器、および／または機械で、実施される。本明細書で使用される場合、ソフトウェアは、マイクロプロセッサーにより実行されたときに本明細書に記載のコンピュータ操作を遂行する、コンピュータ可読プログラム命令を指す。
機械、ソフトウェアおよびインターフェースを使用して、本明細書に記載される方法を行うことができる。機械、ソフトウェアおよびインターフェースを使用して、ユーザーは、特定の情報、プログラムまたはプロセスを使用する（例えば、配列リードデータを処理する、配列リード定量化を処理する、および／またはアウトカムを提供する）ための選択肢の入力、リクエスト、クエリまたは決定を行うことができ、これは、例えば、統計解析アルゴリズム、統計的有意性アルゴリズム、統計アルゴリズム、反復ステップ、検証アルゴリズム、およびグラフィック表示の実行を伴い得る。一部の実施形態では、データセットは、ユーザーにより入力情報として入力されることがあり、ユーザーは、好適なハードウェア媒体（例えば、フラッシュドライブ）により１つもしくは複数のデータセットをダウンロードすることができ、ならびに／またはユーザーは、アウトカムのその後の処理および／もしくは提供のためにデータセットをあるシステムから別のシステムに送信する（例えば、配列リード処理のためにシーケンサーからコンピュータシステムに配列リードデータを送信する；処理された配列リードデータを、アウトカムおよび／もしくはレポートをさらに処理するおよび／もしくは生じさせるために、コンピュータシステムに送信する）ことができる。
システムは、通常は、１つまたは複数の機械を含む。各機械は、メモリー、１つまたは複数のマイクロプロセッサー、および命令のうちの１つまたは複数を含む。システムが、２つまたはそれより多くの機械を含む場合、機械の一部もしくはすべてが、同じ場所に位置してもよく、機械の一部もしくはすべてが、異なる場所に位置してもよく、機械のすべてが、一カ所に位置してもよく、および／または機械のすべてが、異なる場所に位置してもよい。システムが、２つまたはそれより多くの機械を含む場合、機械の一部もしくはすべてが、ユーザーと同じ場所に位置してもよく、機械の一部もしくはすべてが、ユーザーとは異なる場所に位置してもよく、機械のすべてが、ユーザーと同じ場所に位置してもよく、および／または機械のすべてが、ユーザーとは異なる１つもしくは複数の場所に位置してもよい。
システムは、計算機と、シーケンシング装置またはシーケンシング機とを含むことがあり、この場合、シーケンシング装置またはシーケンシング機は、物理的核酸を受け取り、配列リードを生成するように構成されており、計算装置は、シーケンシング装置またはシーケンシング機からのリードを処理するように構成されている。計算機は、配列リードからアウトカム（例えば、試料の特性）を判定するように構成されていることもある。
ユーザーは、例えば、ソフトウェアに対してクエリを行うことができ、その結果、インターネットアクセス経由でデータセットを獲得することができ、ある特定の実施形態では、プログラム可能マイクロプロセッサーを、所与のパラメーターに基づいて好適なデータセットを獲得するように促すことができる。プログラム可能マイクロプロセッサーにより、ユーザーが、所与のパラメーターに基づいてマイクロプロセッサーにより選択された１つまたは複数のデータセット選択肢を選択するように促されることもある。プログラム可能マイクロプロセッサーは、ユーザーに、インターネット経由で見つかった情報、他の内部または外部情報などに基づいてマイクロプロセッサーにより選択された１つまたは複数のデータセット選択肢を選択するように促すことができる。選択肢は、方法、機械、装置、コンピュータプログラム、または実行可能プログラムが記憶されている非一過性コンピュータ可読記憶媒体の、１つまたは複数のデータ特徴選択、１つまたは複数の統計アルゴリズム、１つまたは複数の統計解析アルゴリズム、１つまたは複数の統計的有意性アルゴリズム、反復ステップ、１つまたは複数の検証アルゴリズム、および１つまたは複数のグラフィック表示を選択するために、選択され得る。
本明細書で取り扱われるシステムは、例えば、ネットワークサービス、ラップトップシステム、デスクトップシステム、携帯型システム、携帯情報端末、コンピューティングキオスクなどのような、コンピュータシステムの一般的コンポーネントを含み得る。コンピュータシステムは、ユーザーによるシステムへのデータの入力を可能にする、キーボード、タッチスクリーン、マウス、音声認識または他の手段などの、１つまたは複数の入力手段を含み得る。システムは、ディスプレイスクリーン（例えば、ＣＲＴもしくはＬＣＤ）、スピーカー、ＦＡＸ機、プリンター（例えば、レーザー、インクジェット、インパクト、白黒もしくはカラープリンター）、または情報（例えば、アウトカムおよび／もしくはレポート）の視覚的、聴覚的および／もしくはハードコピー出力の提供に有用な他の出力要素を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の出力要素をさらに含み得る。
システム内で、入力および出力コンポーネントを中央処理ユニットに接続することができ、この中央処理ユニットは、数あるコンポーネントの中でも特に、プログラム命令を実行するためのマイクロプロセッサーと、プログラムコードおよびデータを記憶するためのメモリーとを含み得る。一部の実施形態では、プロセスを、単一の地理的位置に位置するシングルユーザーシステムとして実行することができる。ある特定の実施形態では、プロセスを、マルチユーザーシステムとして実行することができる。マルチユーザーインプリメンテーションの場合、複数の中央処理ユニットをネットワークによって接続することができる。ネットワークは、建物の一カ所にある単一の部署を包含する、ローカルなものであることもあり、建物全体であることもあり、複数の建物にわたることもあり、地域にわたることもあり、国全体にわたることもあり、または世界中であることもある。ネットワークは、プロバイダーにより所有され、制御される、プライベートなものであることもあり、またはユーザーがウェブページにアクセスして入り、情報を取り出す、インターネットに基づくサービスとして実行されることもある。したがって、ある特定の実施形態では、システムは、ユーザーを基準にしてローカルであることもあり、または遠隔であることもある、１つまたは複数の機械を含む。１つの場所または複数の場所の１つより多くの機械にユーザーはアクセスすることができ、順次および／または並行してデータをマッピングおよび／または処理することができる。したがって、複数の機械を、例えば、ローカルネットワーク、遠隔ネットワーク、および／または「クラウド」コンピュータプラットフォームで使用して、データをマッピングおよび／または処理するために、好適な構成および制御を利用することができる。
システムは、一部の実施形態では、通信用インターフェースを含むことができる。通信用インターフェースは、コンピュータシステムと１つまたは複数の外部デバイスとの間のソフトウェアおよびデータの転送を可能にする。通信用インターフェースの非限定的な例としては、モデム、ネットワークインターフェース（例えば、イーサネット（登録商標）カード）、通信ポート、ＰＣＭＣＩＡスロットおよびカードなどが挙げられる。通信用インターフェース経由で転送されるソフトウェアおよびデータは、一般に、通信用インターフェースによって受信され得る電子、電磁、光および／または他の信号であり得る、信号の形態である。信号は、チャネルを介して通信用インターフェースに提供されることが多い。チャネルは、多くの場合、信号を伝達し、ワイヤもしくはケーブル、光ファイバー、電話線、携帯電話リンク、ＲＦリンクおよび／または他の通信チャネルを使用して、チャネルを実装することができる。したがって、一例では、通信用インターフェースを使用して、信号検出モジュールにより検出され得る信号情報を受信することができる。
データは、手動入力デバイスまたは直接データ入力デバイス（ＤＤＥ）を含むがこれらに限定されない、好適なデバイスおよび／または方法により、入力することができる。手動デバイスの非限定的な例としては、キーボード、コンセプトキーボード、タッチ式スクリーン、ライトペン、マウス、トラッカーボール、ジョイスティック、グラフィックタブレット、スキャナー、デジタルカメラ、ビデオデジタイザーおよび音声認識デバイスが挙げられる。ＤＤＥの非限定的な例としては、バーコードリーダー、磁気ストライプコード、スマートカード、磁気インク文字認識、光学式文字認識、光学式マーク認識、およびターンアラウンドドキュメントが、挙げられる。
一部の実施形態では、シーケンシング装置またはシーケンシング機からの出力は、入力デバイスによって入力することができるデータとして役立ち得る。ある特定の実施形態では、配列リード情報は、入力デバイスによって入力することができるデータとして役立ち得る。ある特定の実施形態では、マッピングされた配列リードは、入力デバイスによって入力することができるデータとして役立ち得る。ある特定の実施形態では、核酸断片サイズ（例えば、長さ）は、入力デバイスによって入力することができるデータとして役立ち得る。ある特定の実施形態では、核酸捕捉プロセスからの出力（例えば、ゲノム領域由来のデータ）は、入力デバイスによって入力することができるデータとして役立ち得る。ある特定の実施形態では、核酸断片サイズ（例えば、長さ）と核酸捕捉プロセスからの出力（例えば、ゲノム領域由来のデータ）との組合せは、入力デバイスによって入力することができるデータとして役立ち得る。ある特定の実施形態では、模擬データは、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏプロセスにより生成され、模擬データは、入力デバイスによって入力することができるデータとして役立ち得る。用語「ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ」は、コンピュータを使用して遂行される研究および実験を指す。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏプロセスとしては、本明細書に記載されるプロセスに従って配列リードをマッピングすることおよびマッピングされた配列リードを処理することが挙げられるが、これらに限定されない。
システムは、本明細書に記載されるプロセスまたはプロセスの一部の遂行に有用なソフトウェアを含むことがあり、ソフトウェアは、そのようなプロセスを遂行するための１つまたは複数のモジュール（例えば、シーケンシングモジュール、論理処理モジュール、データ表示構成モジュール）を含むことができる。用語「ソフトウェア」は、コンピュータにより実行されたときにコンピュータ操作を遂行する、コンピュータ可読プログラム命令を指す。１つまたは複数のマイクロプロセッサーにより実行可能な命令が、実行コードとして提供されることもあり、実行コードは、実行されたとき、本明細書に記載される方法を１つまたは複数のマイクロプロセッサーに実行させることができる。本明細書に記載されるモジュールは、ソフトウェアとして存在することができ、ソフトウェアで実施される命令（例えば、プロセス、ルーチン、サブルーチン）がマイクロプロセッサーにより実行または遂行され得る。例えば、モジュール（例えば、ソフトウェアモジュール）は、特定のプロセスまたはタスクを遂行するプログラムの一部であり得る。用語「モジュール」は、より大型の機械またはソフトウェアシステムで使用され得る自己完結型機能ユニットを指す。モジュールは、モジュールの機能を行うための一連の命令を含むことができる。モジュールは、データおよび／または情報を変換することができる。データおよび／または情報は、適切な形態であり得る。例えば、データおよび／または情報は、デジタルまたはアナログであり得る。ある特定の実施形態では、データおよび／または情報は、ときにはパケット、バイト、文字またはビットであり得る。一部の実施形態では、データおよび／または情報は、任意の収集された、整理された、または使用可能なデータまたは情報であり得る。データおよび／または情報の非限定的な例としては、好適な媒体、画像、ビデオ、音（例えば、周波数、可聴のまたは非可聴の）、数、定数、値、オブジェクト、時間、関数、命令、マップ、参照、配列、リード、マッピングされたリード、レベル、範囲、閾値、シグナル、これらの表示、表現または変形が挙げられる。モジュールは、データおよび／または情報を受け入れ、または受信し、データおよび／または情報を二次形態に変換し、二次形態を機械、周辺機器、コンポーネントまたは別のモジュールに提供または転送することができる。マイクロプロセッサーは、ある特定の実施形態では、モジュールで命令を実行することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数のマイクロプロセッサーは、モジュールまたはモジュール群で命令を実行するために必要とされる。モジュールは、データおよび／または情報を別のモジュール、機械または供給源に提供することができ、データおよび／または情報を別のモジュール、機械または供給源から受信することができる。
コンピュータプログラム製品は、有形コンピュータ可読媒体で実施されることもあり、非一過性コンピュータ可読媒体で明白に実施されることもある。モジュールは、コンピュータ可読媒体（例えば、ディスク、ドライブ）に記憶されていることもあり、またはメモリー（例えば、ランダムアクセスメモリー）に記憶されていることもある。モジュール、およびモジュールからの命令を実行することができるマイクロプロセッサーは、機械内または異なる機械内に位置することができる。モジュール、および／またはモジュールの命令を実行することができるマイクロプロセッサーは、ユーザーと同じ場所に位置することができ（例えば、ローカルネットワーク）、またはユーザーとは異なる場所に位置することができる（例えば、遠隔ネットワーク、クラウドシステム）。方法が２つまたはそれより多くのモジュールと連動して行われる実施形態では、モジュールは、同じ機械内に位置することができ、１つまたは複数のモジュールは、同じ物理的な場所の異なる機械内に位置することができ、１つまたは複数のモジュールは、異なる物理的な場所の異なる機械内に位置することができる。
機械は、一部の実施形態では、モジュールで命令を行うための少なくとも１つのマイクロプロセッサーを含む。配列リード定量化（例えば、カウント）は、本明細書に記載される方法を行うように構成された命令を実行するマイクロプロセッサーによりアクセスされることもある。マイクロプロセッサーによりアクセスされる配列リード定量化は、システムのメモリー内にあることができ、配列リードカウントにアクセスし、それらを得た後、それらをシステムのメモリーに入れることができる。一部の実施形態では、機械は、マイクロプロセッサー（例えば、１つまたは複数のマイクロプロセッサー）を含み、このマイクロプロセッサーは、モジュールからの１つまたは複数の命令（例えば、プロセス、ルーチンおよび／またはサブルーチン）を遂行および／または実行することができる。一部の実施形態では、機械は、複数のマイクロプロセッサー、例えば、連係しており、並行して働くマイクロプロセッサーを含む。一部の実施形態では、機械は、１つまたは複数の外部マイクロプロセッサー（例えば、内部または外部ネットワーク、サーバー、記憶デバイスおよび／または記憶ネットワーク（例えば、クラウド））で動作する。一部の実施形態では、機械は、モジュール（例えば、１つまたは複数のモジュール）を含む。モジュールを含む機械は、多くの場合、他のモジュールへ、および他のモジュールから、データおよび／または情報の１つまたは複数を受信および転送することができる。
ある特定の実施形態では、機械は、周辺機器および／またはコンポーネントを含む。ある特定の実施形態では、機械は、他のモジュール、周辺機器および／またはコンポーネントへ、ならびに他のモジュール、周辺機器および／またはコンポーネントから、データおよび／または情報を転送することができる、１つまたは複数の周辺機器またはコンポーネントを含むことができる。ある特定の実施形態では、機械は、データおよび／または情報を提供する周辺機器および／またはコンポーネントと交信する。ある特定の実施形態では、周辺機器およびコンポーネントは、機械による機能の実行またはモジュールとの直接交信を支援する。周辺機器および／またはコンポーネントの非限定的な例としては、スキャナー、プリンター、ディスプレイ（例えば、モニター、ＬＥＤ、ＬＣＴもしくはＣＲＴ）、カメラ、マイクロホン、パッド（例えば、ｉｐａｄ、タブレット）、タッチスクリーン、スマートフォン、携帯電話、ＵＳＢ Ｉ／Ｏデバイス、ＵＳＢ大容量記憶デバイス、キーボード、コンピュータマウス、デジタルペン、モデム、ハードドライブ、ジャンプドライブ、フラッシュドライブ、マイクロプロセッサー、サーバー、ＣＤ、ＤＶＤ、グラフィックカード、専用Ｉ／Ｏデバイス（例えば、シーケンサー、光電池、光電子増倍チューブ、光学式読み取り装置、センサーなど）、１つまたは複数のフローセル、流体操作コンポーネント、ネットワークインターフェスコントローラー、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ワイヤレス転送法およびデバイス（ブルートゥース（登録商標）、ＷｉＦｉなど）、ワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）、インターネット、コンピュータおよび／または他のモジュールを含むがこれらに限定されない、好適なコンピュータ周辺機器、Ｉ／Ｏまたは記憶方法またはデバイスが挙げられる。
ソフトウェアは、コンピュータ可読媒体に記録されたプログラム命令を含むプログラム製品で提供されることが多く、コンピュータ可読媒体としては、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスクおよび磁気テープを含む、磁気媒体；ならびにＣＤ－ＲＯＭディスク、ＤＶＤディスクを含む、光媒体；光磁気ディスク、フラッシュメモリ－デバイス（例えば、フラッシュドライブ）、ＲＡＭ、フロッピー（登録商標）ディスクなど、ならびにプログラム命令を記録することができる他のそのような媒体が挙げられるが、これらに限定されない。オンラインインプリメンテーションの場合、団体により維持されているサーバーおよびウェブサイトは、遠隔ユーザーにソフトウェアダウンロードを提供するように構成されていることがあり、または遠隔ユーザーは、団体により維持されている遠隔システムにアクセスして、ソフトウェアに遠隔アクセスすることができる。ソフトウェアは、入力情報を得るまたは受信することができる。ソフトウェアは、データを特異的に得るまたは受信するモジュール（例えば、配列リードデータおよび／またはマッピングされたリードデータを受信するデータ受信モジュール）を含むことができ、データを特異的に処理するモジュール（例えば、受信したデータを処理する（例えば、アウトカムおよび／またはレポートをフィルタリングする、正規化する、提供する）処理モジュール）を含むことができる。入力情報を「得ること」および「受信すること」という用語は、データ（例えば、配列リード、マッピングされたリード）を、ローカルもしくは遠隔サイトからコンピュータ通信手段により、人間によるデータ入力により、または任意の他のデータ受信方法により、受信することを指す。入力情報を、それを受信する場所と同じ場所で作成することができ、またはそれを異なる場所で作成し、受信場所に伝送することができる。一部の実施形態では、入力情報は、処理される前に修正される（例えば、処理に適用可能な形式にされる（例えば、表形式にされる））。
ソフトウェアは、ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアルゴリズムを含むことができる。アルゴリズムは、命令の有限数列に従ってデータを処理するおよび／またはアウトカムもしくはレポートを提供するために、使用され得る。アルゴリズムは、多くの場合、タスクを完了するための定義済み命令のリストである。初期状態から開始して、命令は、定義された一連の連続状態を経て最終的に最終終了状態で終了する計算を記述することができる。ある状態から次の状態への移行は、必ずしも確定的ではない（例えば、一部のアルゴリズムは、乱数性を取り入れている）。例として、限定ではなく、アルゴリズムは、検索アルゴリズム、ソートアルゴリズム、マージアルゴリズム、数値アルゴリズム、グラフアルゴリズム、文字列アルゴリズム、モデリングアルゴリズム、計算幾何アルゴリズム、組合せアルゴリズム、機械学習アルゴリズム、暗号学アルゴリズム、データ圧縮アルゴリズム、構文解析アルゴリズムなどであり得る。アルゴリズムは、１つのアルゴリズム、または組合せで働く２つもしくはそれより多くのアルゴリズムを含み得る。アルゴリズムは、任意の好適な複雑性クラスおよび／またはパラメーター化された複雑性のものであり得る。アルゴリズムは、演算および／またはデータ処理に使用することができ、一部の実施形態では、決定論的または確率論的／予測アプローチで使用することができる。アルゴリズムを好適なプログラミング言語の使用によりコンピュータ環境で実行することができ、そのようなプログラミング言語の非限定的な例は、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｐｅｒｌ、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｆｏｒｔｒａｎなどである。一部の実施形態では、アルゴリズムを、許容誤差、統計解析、統計的有意性、および／または他の情報もしくはデータセットとの比較（例えば、ニューラルネットもしくはクラスタリングアルゴリズムを使用する場合に適用可能）を含むように、構成または修正することができる。
ある特定の実施形態では、いくつかのアルゴリズムをソフトウェアでの使用のために実装することができる。これらのアルゴリズムを、一部の実施形態では、生データで訓練することができる。新たな生データ試料ごとに、訓練されたアルゴリズムが、代表処理データセットまたはアウトカムを生成し得る。処理データセットは、処理された親データセットと比較して複雑性が低下したものであることもある。処理セットに基づいて訓練されたアルゴリズムの性能を、一部の実施形態では、感度および特異度に基づいて評定することができる。ある特定の実施形態では、感度および／または特異度が最も高いアルゴリズムを識別し、利用することができる。
ある特定の実施形態では、模擬（またはシミュレーション）データは、例えば、アルゴリズムを訓練することまたはアルゴリズムを検査することにより、データ処理を補助することができる。一部の実施形態では、模擬データは、配列リードの異なるグループ分けについての仮定的な様々な抽出試料を含む。模擬データは、現実の集団から予想され得るものに基づくこともあり、またはアルゴリズムを検査するおよび／もしくは正しい分類を割り当てるための偏ったものであることもある。模擬データは、本明細書では「仮想」データとも呼ばれる。ある特定の実施形態では、コンピュータプログラムによりシミュレーションを行うことができる。模擬データセットを使用する場合の可能性のある１つのステップは、識別された結果の信頼度、例えば、ランダム抽出試料が、どれ程、元データとよくマッチするか、または元データを最良に表すのかを、評価することである。１つのアプローチは、選択された試料より良好なスコアを有するランダム試料の確率を推定する、確率値（ｐ値）を算出することである。一部の実施形態では、少なくとも１つの試料が参照試料と（分解変動の有無にかかわらず）マッチすることが仮定される、経験的モデルを評定することができる。一部の実施形態では、例えばポアソン分布などの、別の分布を使用して、確率分布を定義することができる。
システムは、ある特定の実施形態では、１つまたは複数のマイクロプロセッサーを含むことがある。マイクロプロセッサーを通信バスに接続することができる。コンピュータシステムは、メインメモリー、多くの場合、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）を含むことがあり、二次メモリーを含むこともできる。一部の実施形態でのメモリーは、非一過性コンピュータ可読記憶媒体を含む。二次メモリーは、例えば、ハードディスクドライブおよび／またはリムーバブル記憶ドライブを含むことができ、リムーバブル記憶ドライブは、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光ディスクドライブ、メモリーカードなどを意味する。リムーバブル記憶ドライブは、多くの場合、リムーバブル記憶ユニットから読み取る、および／またはリムーバブル記憶ユニットに書き込む。リムーバブル記憶ユニットの非限定的な例としては、例えば、リムーバブル記憶ドライブによって読み取られ得る、かつリムーバブル記憶ドライブに書き込まれ得る、フロッピー（登録商標）ディスク、磁気テープ、光ディスクなどが挙げられる。リムーバブル記憶ユニットは、コンピュータソフトウェアおよび／またはデータが内部に記憶されているコンピュータ使用可能記憶媒体を含むことができる。
マイクロプロセッサーは、システム内のソフトウェアを実行することができる。一部の実施形態では、マイクロプロセッサーを、ユーザーが行うことができる本明細書に記載されるタスクを自動的に遂行するようにプログラムすることができる。したがって、マイクロプロセッサー、またはそのようなマイクロプロセッサーにより実行されるアルゴリズムは、ユーザーによる監視も入力も殆どないしは全く必要とするはずがない（例えば、ソフトウェアを、自動的に機能を実行するようにプログラムすることができる）。一部の実施形態では、プロセスの複雑性が非常に高いので、１名の人物、または人物群が、試料の１つまたは複数の特性を判定するのに十分短い時間枠ではプロセスを遂行することができない。
一部の実施形態では、二次メモリーは、コンピュータシステムへのコンピュータプログラムまたは他の命令のローディングを可能にするための他の同様の手段を含むことがある。例えば、システムは、リムーバブル記憶ユニットおよびインターフェースデバイスを含むことができる。そのようなシステムの非限定的な例としては、プログラムカートリッジおよびカートリッジインターフェース（例えば、ビデオゲームデバイスに見られるもの）、リムーバブルメモリーチップ（例えば、ＥＰＲＯＭまたはＰＲＯＭ）および付随するソケット、ならびにソフトウェアおよびでデータをリムーバブル記憶ユニットからコンピュータシステムに転送することを可能にする他のリムーバブル記憶ユニットおよびインターフェースが、挙げられる。
核酸を解析するための方法
核酸を解析するための方法が、本明細書で提供される。
核酸の純度および／または品質を評定するための方法が、本明細書で提供される。本明細書に記載される一本鎖ライブラリー調製方法を使用して、核酸の純度および／または品質を評定することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される一本鎖ライブラリー調製方法を使用して、一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）の純度および／または品質を評定することができる。ｓｓＮＡは、単一ｓｓＮＡ種（例えば、同じ配列および長さを有するｓｓＮＡ）を含むこともあり、またはｓｓＮＡ種のプール（例えば、異なる配列および／または長さを有するｓｓＮＡ）を含むこともある。一部の実施形態では、ｓｓＮＡは、一本鎖オリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、商業生産される。一部の実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、ユーザーにより生成される。一部の実施形態では、ｓｓＮＡは、一本鎖プローブを含む。一部の実施形態では、一本鎖プローブは、商業生産される。一部の実施形態では、一本鎖プローブは、ユーザーにより生成される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される一本鎖ライブラリー調製方法を使用して、一本鎖リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）の純度および／または品質を評定することができる。ｓｓＲＮＡは、単一ｓｓＲＮＡ種（例えば、同じ配列および長さを有するｓｓＲＮＡ）を含むこともあり、またはｓｓＲＮＡ種のプール（例えば、異なる配列および／または長さを有するｓｓＲＮＡ）を含むこともある。一部の実施形態では、ｓｓＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、商業生産される。一部の実施形態では、一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ユーザーにより生成される。一部の実施形態では、ｓｓＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡプローブを含む。一部の実施形態では、一本鎖ＲＮＡプローブは、商業生産される。一部の実施形態では、一本鎖ＲＮＡプローブは、ユーザーにより生成される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される一本鎖ライブラリー調製方法を使用して、一本鎖相補デオキシリボ核酸（ｓｓｃＤＮＡ）の純度および／または品質を評定することができる。ｓｓｃＤＮＡは、単一ｓｓｃＤＮＡ種（例えば、同じ配列および長さを有するｓｓｃＤＮＡ）を含むこともあり、またはｓｓｃＤＮＡ種のプール（例えば、異なる配列および／または長さを有するｓｓｃＤＮＡ）を含むこともある。一部の実施形態では、ｓｓｃＤＮＡは、一本鎖ｃＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、一本鎖ｃＤＮＡオリゴヌクレオチドは、商業生産される。一部の実施形態では、一本鎖ｃＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ユーザーにより生成される。一部の実施形態では、ｓｓｃＤＮＡは、一本鎖ｃＤＮＡプローブを含む。一部の実施形態では、一本鎖ｃＤＮＡプローブは、商業生産される。一部の実施形態では、一本鎖ｃＤＮＡプローブは、ユーザーにより生成される。
ｓｓＮＡ、ｓｓＲＮＡおよび／またはｓｓｃＤＮＡの純度および／または品質を、断片長の評定に従って評定することができる。断片長を決定するための任意の好適な方法を使用して、断片長を決定することができる。一部の実施形態では、断片長は、シングルエンドシーケンシングリードの長さ（例えば、このリード長は、断片全体の長さをカバーする）に従って決定される。一部の実施形態では、断片長は、ペアエンドシーケンシングリードのマッピングされた部分に従って決定される。一部の実施形態では、ｓｓＮＡ、ｓｓＲＮＡおよび／またはｓｓｃＤＮＡの純度および／または品質は、断片長プロファイルに従って評定される。断片長プロファイルは、特定の長さを有する断片の定量化を含み得る。断片長プロファイルの例は、図３１に提供される。一部の実施形態では、ｓｓＮＡ、ｓｓＲＮＡおよび／またはｓｓｃＤＮＡの純度および／または品質は、断片長プロファイルにおける主要なｓｓＮＡ、ｓｓＲＮＡおよび／またはｓｓｃＤＮＡ種の量ならびに副次的なｓｓＮＡ、ｓｓＲＮＡおよび／またはｓｓｃＤＮＡ種の量に従って評定される。主要な種は、一般に、試料中の最も存在量が多い断片長を指す。主要な種は、評定されることになるｓｓＮＡ、ｓｓＲＮＡおよび／またはｓｓｃＤＮＡの所期または予想断片長を指すこともある。例えば、正確に５０ヌクレオチドを含むように設計されたオリゴヌクレオチドについて、そのオリゴヌクレオチドの純度および／または品質の評定により、５０ヌクレオチドという主要な種の長さが得られることがある。副次的な種は、一般に、主要な種ではない残りの断片長を指す。副次的な種は、評定されることになるｓｓＮＡ、ｓｓＲＮＡおよび／またはｓｓｃＤＮＡの意図せぬまたは予想外の断片長を指す。例えば、正確に５０ヌクレオチドを含むように設計されたオリゴヌクレオチドについての、そのオリゴヌクレオチドの純度および／または品質の評定により、５０ヌクレオチドを超える、および／または５０ヌクレオチド未満の、しかし正確に５０ヌクレオチドではない長さを有する、副次的な種が得られることもある。ｓｓＮＡ、ｓｓＲＮＡおよび／またはｓｓｃＤＮＡの純度および／または品質を、比またはパーセンテージとして表すことができる。例えば、試料中のオリゴヌクレオチドの９０％が主要な種の断片長のものであり、試料中のオリゴヌクレオチドの（集合的に）１０％が副次的な種の断片長のものであった場合、オリゴヌクレオチドを主要な種について純度９０％と見なすことができる。
試料中のニックの入ったＤＮＡの量を推定または測定することができる。例えば、シーケンシングライブラリーをニック修復の前および後に試料から調製することができる。２つのライブラリーについてのシーケンシング結果を比較することができ、ニックの入ったＤＮＡの量を推定または測定することができる。ニックの入ったＤＮＡは、例えば、アポトーシスを遂げ、その後、血流中にある細胞内のゲノムＤＮＡに対するエンドおよびエキソヌクレアーゼ活性に起因して生成される、ｃｆＤＮＡであり得る。初期ヌクレアーゼ活性は、ヌクレオソーム間のエンドヌクレアーゼ活性、またはヌクレオソームに対するＤＮａｓｅＩのニッキング活性を含み得る。ニッキングされやすい核酸領域を理解することにより、ヌクレオソーム占有率の情報を得ることができる。ニックの入ったＤＮＡの他の供給源としては、ＦＦＰＥ試料、毛髪、分解された試料、およびニッカーゼ酵素のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験が挙げられるが、これらに限定されない。一本鎖ライブラリー調製方法、例えば本開示のものは、ニックの入った断片を捕捉することができる。加えて、本開示の方法は、ニッキングから生じた末端を保持する。ニックの入った分子を直接用いて本開示の方法を行なうと、異なる長さの３本の鎖－１つの長いおよび２つのより短い分子－が生成されることになる（例えば、図５３Ｂ）。ニックシーリング酵素（例えば、ＨｉＦｉ Ｔａｑリガーゼ）での処理は、ニックの入った２本の鎖をライゲーションすることになり、その後、これらのシールされたｄｓＤＮＡを用いて本開示の方法を行なうことにより、ニックで生じる末端の可視性がなくても同様の長さの２本の鎖が得られることになる（例えば、図５３Ａ）。２つのライブラリーから得られる配列（および断片末端）の比較は、ニックがシールされたライブラリーでのほうが、短い断片が少なく、ニックの入った領域に隣接する配列を有するリードが少ないことを示すであろう。
ある例では、５’ＧＡＧＴＣＮＮＮＮ＾Ｎ３’でニックを生成するＮ．ＢｓｔＮＢＩを使用して、ｇＤＮＡに既知ニックを生じさせた。ニックの入ったｇＤＮＡ試料の一部分は、ＨｉＦｉ Ｔａｑリガーゼでニックをシールし、一部分はしなかった。両方を用いて本明細書での論述の通り一本鎖ライブラリー調製を行い、ライブラリーをシーケンシングし、比較した。全くニックが入っていない対照ｇＤＮＡは、配列リードの０．０７％がＧＡＧＴＣＮＮＮＮで終わることを示し、シールされなかったニックの入ったＤＮＡは、配列リードの１５．７４％がＧＡＧＴＣＮＮＮＮで終わることを示し、ニックが入り、ニックがシールされたＤＮＡは、配列リードの１０．６７％が、ＧＡＧＴＣＮＮＮＮで終わることを示した。
核酸（例えば、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチドプローブ）のプールを、核酸が、それらの特性に影響を与え得るプライマー結合部位などの隣接領域を含む必要なく、シーケンシングすることができる。本開示の一本鎖ライブラリー調製方法によって、所与の目的のための核酸のプールを生成し、所望の特性についての１または複数ラウンドの選択に付し、シーケンシングすることができる。例えば、アプタマーまたはｓｉＲＮＡのランダムプールを生成し、１または複数ラウンドの正および／または負の選択（例えば、所望の標的への結合についての正の選択、オフターゲット結合についての負の選択）に付すことができ、成功した候補を、ランダムアプタマーまたはｓｉＲＮＡがシーケンシングのために隣接領域を含む必要なく、本開示の方法によってシーケンシングすることができる。そのような隣接領域の存在は、アプタマーまたはｓｉＲＮＡ性能に影響を及ぼす可能性がある。
ある例では、化学合成または合成されたＤＮＡからの転写によって核酸のランダムプール（例えば、合成される（例えば、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチドプローブ）。次いで、ランダムプールは、１もしくは複数ラウンドの正の選択および／または１もしくは複数ラウンドの負の選択に付される。正の選択は、次第にストリンジェントになる結合条件下での所望の結合標的とのインキュベーションを含み得る。負の選択は、次第に有利になる結合条件下でのオフターゲット結合基質とのインキュベーションを含み得る。結合条件としては、温度、塩濃度、ｐＨ、磁場、クラウディング剤、競合結合剤、阻害剤、および他の条件を挙げることができるが、これらに限定されない。プールおよびその変化についてのバイオインフォマティック解析のために、本開示の方法によるシーケンシングを、選択の前に、選択ラウンド間に、および／または選択が完了した後に行なうことができる。ＵＭＩまたは他のバーコードを使用して、プール内の核酸種の相対量の数値もしくは絶対カウントを得ることができる。例えば、各々の結合されたプールを用いてシーケンシングを行なって、結合された配列プールが異なる選択ストリンジェンシーに伴ってどのように変化するのかを別々にモニターしながら、所望の結合標的の存在下で、正の選択をｎラウンド行うことができる。核酸配列の異なるクラスターを、異なる選択ラウンド中に見つけることができる。一部の事例では、各々の正の選択ラウンドからの結合された核酸は、核酸配列の異なるクラスターを異なる選択ラウンド中に見つけることができるので、結合された核酸プールが異なる選択ストリンジェンシーに伴ってどのように変化するのかを別々にモニターするために残りの選択およびライブラリー調製プロセスを経ることもある。
キット
ある特定の実施形態では、キットが提供される。キットは、本明細書に記載される方法のいずれかを行なうために有用な、本明細書に記載される任意の成分および組成物（例えば、足場アダプターおよびそれらの成分／小成分、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド成分／領域、足場ポリヌクレオチド、足場ポリヌクレオチド成分／領域、核酸、一本鎖核酸、プライマー、一本鎖結合タンパク質、酵素）を、任意の好適な組合せで含むことができる。キットは、本明細書に記載される方法のいずれかを行うのに有用な任意の試薬、緩衝剤または他の成分をさらに含むことができる。例えば、キットは、複数の足場アダプター種もしくは複数の足場ポリヌクレオチド種および対応するオリゴヌクレオチド成分、核酸を５’リン酸化するように構成されたキナーゼ（例えば、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ））、ＤＮＡリガーゼ、ならびにこれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数を含むことができる。
キットは、一本鎖ＤＮＡおよび／または一本鎖ＲＮＡを捕捉するための成分を含むことができる。一本鎖ＤＮＡを捕捉するためのキットを、ユーザーが二本鎖または一本鎖ＤＮＡを生じさせるように構成することができる。一本鎖ＲＮＡを捕捉するためのキットを、ユーザーがｃＤＮＡ（一本鎖もしくは二本鎖のどちらか）を生じさせるように、またはＲＮＡ（例えば、全ＲＮＡもしくはｒＲＮＡ枯渇ＲＮＡ）を生じさせるように構成することができる。一本鎖ＲＮＡを捕捉するためのキットは、ｒＲＮＡ枯渇試薬、ｍＲＮＡ濃縮試薬、断片化試薬、ｃＤＮＡ合成試薬、および／またはＲＮＡ消化試薬を含むことができる。
キットの成分は、別々の容器内に存在することもあり、または複数の成分が、単一の容器内に存在することもある。好適な容器としては、単一のチューブ（例えば、バイアル）、プレート（例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートなど）の１つまたは複数ウェルなどが挙げられる。
キットは、本明細書に記載される１つもしくは複数の方法を行うための使用説明書、および／または本明細書に記載される１つもしくは複数の成分の説明書きも含むことがある。例えば、キットは、一本鎖核酸断片を捕捉するために、および／または核酸ライブラリーを生成するために、本明細書に記載される骨格アダプターまたはその成分を使用するための使用説明書を含むことがある。使用説明書および／または説明書きは、印刷された形態であることもあり、キット添付文書に含まれることもある。一部の実施形態では、使用説明書および／または説明書きは、好適なコンピュータ可読記憶媒体、例えば、携帯フラッシュドライブ、ＤＶＤ、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケットなど、に存在する電子記憶データファイルとして提供される。キットは、そのような使用説明書または説明書きを提供するインターネットの場所についての書面での説明書きを含むこともある。
下記の実施例は、ある特定の実施形態を説明するものであり、本技術を限定するものではない。
（実施例１）
無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の一本鎖特異的ライブラリー調製
この実施例では、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリー調製方法およびその改良を説明する。下で説明するｓｓＤＮＡライブラリー調製方法は、アダプターライゲーションの前にすべてのＤＮＡ一本鎖を作製することにより二本鎖（ｄｓＤＮＡ）およびｓｓＤＮＡ分子両方を捕捉する。
基本プロトコール
１）ＤＮＡを熱安定性一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）の存在下で３分間、９５℃に加熱することによりｓｓＤＮＡを作出して維持し、次いで、氷を用いてチューブを急速冷却する。
２）足場アダプターの適切な希釈物を調製し、ａ）６×過剰のＰ５およびＰ７足場アダプター両方の組合せとｂ）リン酸化／ライゲーションマスターミックスとを添加して、８０μｌの反応体積中、最終濃度１８．５％ＰＥＧ ８０００、最終１ｍＭのＡＴＰ、最終１１ｍＭのＤＴＴ、最終１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、２，０００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ、および１０単位のＰＮＫを得る。
３）１時間、３７℃でインキュベートする。
４）Ｑｉａｇｅｎ ＭＩＮＥＬＵＴＥ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してカラム精製クリーンを行なう。
５）インデックスＰＣＲを行なう。
基本プロトコールの改良および改善
上記の基本プロトコールの様々な改良を下で説明する。ある特定の改良は、例えば、より良好なライブラリー品質、収量の増加、より速いライブラリー生成、より少ない用量またはより低用量の試薬、より少ないステップおよびこれらに類するものなどの、プロトコールの改善をもたらした。
リガーゼ
８００単位～２０００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ投入量を試験した。結果は、２０００単位と同様の結果を生じさせるために８００単位で十分過ぎるほどであることを示した。
インキュベーション時間
様々なインキュベーション時間を試験した。試験した反応時間は、５分～６０分であった。
適切なライブラリーが、５分ほども短いインキュベーション時間で生成された。インキュベーション時間を６０分に増加させるとＤＮＡ収量が増加したが、３０分から６０分への増加は、ごく軽度であった。
ｓｓＤＮＡアダプターライゲーション／リン酸化反応後の精製
種々の精製方法を試験した。結果は、精製方法が重要でないことを示した。固相可逆的固定法（ＳＰＲＩ）磁気ビーズ精製は、カラム精製と同様の効果を発揮した。複数のＳＰＲＩビーズ製造業者を試験し、すべてが良好な効果を発揮した。精製ステップなしでライゲーション／リン酸化反応から直接インデックスＰＣＲに進むことも試験した。精製なしの方法は効果を発揮したが、インデックスＰＣＲ後に、より低い収率およびより問題のあるＤＮＡサイズプロファイルを生じさせた。
ｓｓＤＮＡの維持
この方法は、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）を用いておよび用いずに行なった。結果は、オリゴプールなどの複雑度の低い混合物の場合でさえ、ＳＳＢがプロトコールに必要でないことを示した。結果は、ＳＳＢの非存在下であっても、ＤＮＡが熱変成および急速冷却後に十分一本鎖状態を維持することを示した。ＳＳＢ滴定および様々な供給業者からのＳＳＢを試験し、試験したいずれの条件もＳＳＢなし対照との間に差は認められなかった。解析したパラメーターは、アダプターダイマー％、ＤＮＡライブラリー収量、３０～１３０塩基対（ｂｐ）間の断片％、マッピング率％、重複率％、リードパスフィルター％、パスフィルターリードのマッピング率、およびライブラリー産物サイズ分布を含んだ。ＳＳＢのＳＳＢなしに対する試験結果を図２Ａ、２Ｂ、３Ａおよび３Ｂに示す。
足場アダプター：基質ＤＮＡ比
様々な足場アダプターの基質ＤＮＡに対する比を試験した。結果は、足場アダプターの基質ＤＮＡに対する理想的な比がおよそ３０×であることを示した。結果は、基本プロトコールでの６×比が低すぎることも示した。
足場アダプター修飾
ｓｓＤＮＡライゲーション／リン酸化反応を行なう前のホスファターゼでの足場アダプターの前処理は、結果を改善し、収量を増加させ、アダプターダイマーを減少させた。これらの改善を図４に示す。
足場アダプターの末端に対する様々なライゲーション／伸長遮断修飾も試験した。試験したすべての修飾は、同等の効果を発揮した。
ライゲーション／リン酸化マスターミックス
アダプターライゲーション／リン酸化反応の成分を事前に作製し、使用しやすいように一緒に保管した。マスターミックスは、ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８、ＤＴＴ、ＭｇＣｌ２、ＡＴＰ、ＰＥＧ ８０００、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、およびＴ４ ＰＮＫを含んだ。
リン酸化
ライゲーション／リン酸化反応のリン酸化（例えば、ＰＮＫ）部分は、品質ライブラリーの生成には必要でなかった。ＰＮＫをプロトコールから完全に削除するかまたはライゲーションステップの上流に配置し、品質ライブラリーをどちらかの方法で生成した。また、ＰＮＫをライゲーションステップの上流に含めるのであれば、またはＰＮＫがライゲーションステップと同時に存在することになるのであれば、基質ＤＮＡを脱リン酸化することができる。
インデックスＰＣＲ
様々な高忠実度熱安定性ポリメラーゼを用いて品質ライブラリーを生成した。最終０．２μＭ～４μＭの間の範囲のプライマー濃度を用いて品質ライブラリーを生成した。１μＭを最終プライマー濃度として選択した。
ＰＣＲ不使用のｓｓＤＮＡライブラリー
シーケンサー互換性に必要なすべての必須ＤＮＡ配列を含有する足場アダプター（「完全長アダプター」と呼ぶ）を合成すれば、インデックスＰＣＲを用いずに品質ライブラリーを構築することができるだろう。図５Ａおよび５Ｂを参照されたい。図５Ａでは、足場アダプターの足場ポリヌクレオチド（下の鎖）およびオリゴヌクレオチド（上の鎖）各々が、フローセル結合領域を含む。図５Ｂでは、足場アダプターのオリゴヌクレオチド（上の鎖）はフローセル結合領域を含み、足場アダプターの足場ポリヌクレオチド（下の鎖）は、フローセル結合領域を含まない。
ＰＥＧ濃度
ライゲーション／リン酸化反応中に０～３０％の最終ＰＥＧ ８０００濃度を試験し、結果は、１８．５％が含めるのに理想的な量であることを示した。
アダプターダイマーの低減
上で説明した一本鎖ＤＮＡプロトコールに関する１つの問題は、このプロトコールがアダプターダイマーの高いパーセントを生じさせ得ることであり、この原因は、足場アダプターの構造にある可能性が最も高い。アダプターダイマー形成に対抗するために、いくつかの異なる技法を開発し、試験したが、これらの成功レベルにはばらつきがあった。１つの技法は、ｓｓＤＮＡライゲーション／リン酸化反応を行なう前にホスファターゼで足場アダプターを前処理すること（上で説明した）であった。別の技法は、ライゲーション／リン酸化反応の定量滴定を行なうこと（下で説明する）であった。試験した他の技法を下で説明する。
インデックスＰＣＲ後のＳＰＲＩ（例えば、１８％ＰＥＧ ８０００）滴定、ならびに連続的および逐次的ＳＰＲＩクリーンを行なった。例えば、連続して行なった２回またはそれより多くの連続的１．２×ＳＰＲＩは、アダプターダイマー％を低下させ、ライブラリーのアダプターダイマーに対する相対量を増加させた。図１８は、４回の連続的１．２×ＳＰＲＩクリーンの各々の後のダイマーの低減を実証するゲル画像および表を示す。配列データに対する連続的ＳＰＲＩの効果は、アダプターアーチファクトに起因して廃棄されるリードの数を低減させることによって、使用可能なデータの量を増加させ、ヒトゲノムへのマッピング能力を増大させた。最小断片長カテゴリー（すなわち、＜１００ｂｐ）のわずかな減少があった。試料を０．６×ＳＰＲＩビーズとともに数分間インキュベートすること、その後、０．６×ビーズを１．２×ＳＰＲＩの最終量までもう一度添加することを含む、逐次的ＳＰＲＩも、ダイマーを低減させ、目的のライブラリーサイズを増加させた。図１９は、ｃｆＤＮＡに関する逐次的ＳＰＲＩのゲルおよびＡｇｉｌｅｎｔ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎトレースを示し、このトレースは、アダプターダイマーサイズの分子に対するライブラリーサイズの分子の不均衡な回収率を示す。
別のアプローチは、ダイマーを、インデックスＰＣＲ前にそれらのダイマーに相補的なオリゴと併せて差別的に消化し、インデックスＰＣＲ後に相補的オリゴとともにまたはなしで差別的に消化する選択的制限酵素の使用を用いるアプローチである。この実施例では、推定アダプターダイマーにのみ相補的である短いオリゴを添加し、インキュベートし、ハイブリダイゼーションおよびライゲーション後、二本鎖ＤＮＡ断片が形成されることになり、その後、ヌクレアーゼＸｂａＩを添加し、このヌクレアーゼによって、二本鎖アダプターダイマーＤＮＡ中に存在するＴ＊ＣＴＡＧＡ認識部位が切断される。図２０は、推定アダプターダイマー形成、一本鎖形態のアダプターダイマー（またはオリゴダイマー）、および一本鎖ダイマーにのみアニールするオリゴの付加の例を示す。この実施例では、二本鎖ハイブリダイゼーション産物が作出されたときにＸｂａＩ認識部位が形成した。ＰＣＲ中に、アダプターダイマーは二本鎖状になる。この理由から、ＸｂａＩ処理を上記オリゴなしでＰＣＲ後に行なうことができる。アダプターダイマーの低減は、オリゴがあってもなくてもＸｂａＩの使用後に見られるが、このアプローチの１つのリスクまたは妥協点は、目的のゲノムＤＮＡ中のＸｂａＩ部位の枯渇である。ＸｂａＩ処理前に試料を変性させ、リアニールすることにより、ＸｂａＩ部位の保持を増すことができる。ゲノムＤＮＡの高度な複雑性は、目的のｇＤＮＡのリアニーリングを妨げる可能性があり、その一方で、アダプターダイマーの低い複雑性は、より高速のリアニーリングを生じさせ、ヌクレアーゼによる標的化のためにアダプターダイマーを成熟させる可能性がある。
ある特定の構成では、足場アダプターの構造を、ヘアピンを形成するように修飾して（図８を参照されたい）またはホスホロチオエート結合を付加させることにより修飾して、足場アダプターの剛性を増大させ、ヌクレアーゼ分解の防止を助長した。
ライゲーション／リン酸化反応体積
ライゲーション／リン酸化反応について定量滴定を行なった。結果は、全反応体積を低下させると、収量が増加され、アダプターダイマー形成が抑制されることを示した。理論により制限されるものではないが、これは、１８．５％ＰＥＧの存在下での単位体積当たりのアダプター／足場分子に対するＤＮＡ分子末端の比の結果である可能性がある。最良の挿入物分布および最小のアダプターダイマー形成を伴う、ｃｆＤＮＡから最高品質ライブラリーを生成する比は、基質ＤＮＡ末端が、１８．５％ＰＥＧ ８０００の存在下で０．４フェムトモル毎マイクロリットル（ｆｍｏｌ／μｌ）であり、各足場アダプターが１０ｆｍｏｌ／μｌであるときに存在した。この比を任意の体積で達成することができ、必要に応じて体積または投入ＤＮＡ質量を増加させることにより制約を克服することができる。この比は、多くの異なる方法および単位で表すことができる。例えば、１つのプロトコールは、２５μｌの最終反応体積、１ｎｇの無細胞ＤＮＡ投入量、および１．６ピコモルの各足場アダプターの添加を含む。
投入（基質）ＤＮＡ滴定
５ｎｇ～１００ｐｇの投入ＤＮＡ量を試験した。ライブラリーをすべての投入量から作製したが、２５０ｐｇ未満では品質が低下した。
ライゲーション／リン酸化反応温度
１６℃～３７℃の反応温度を試験した。最良の温度は３７℃であり、温度が低下するにつれて、ＤＮＡ収量が減少し、アダプターダイマー％がより高くなった。
固有分子識別子（ＵＭＩ）
ＵＭＩポリヌクレオチドを含むように足場アダプターを修飾した。ＵＭＩを足場アダプターに組み込むために少数の構成を設計した。例えば、ＵＭＩを、Ｎまたはイノシンをランダム塩基として使用して挿入物に直接隣接する短いアダプターで付加させたか、または完全長アダプター内のインデックス付加バーコードの隣に配置した（図６Ａまたは６Ｂを参照されたい）。図６Ｂに示す構成では、完全長Ｐ５およびＰ７アダプターが反応中にライゲーションされる。ＵＭＩは、ユニバーサル塩基、ランダム塩基、または既知の塩基を含み得る。ＵＭＩは、長さ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０塩基であり得、またはそれより長いこともある。ある特定の構成では、ＰＣＲ増幅中に短いＰ５／Ｐ７をライゲーションしてアダプターを完全長にした。Ｐ７アダプター内のインデックスの隣にランダムＮ塩基のＵＭＩを配置する方法が、良好な効果を発揮した。
インデックスＰＣＲの前に、単一プライマー伸長方法および鎖置換ポリメラーゼ、例えばＢｓｔポリメラーゼを使用して、ＵＭＩポリヌクレオチドを一本鎖ライゲーション産物またはライブラリーに組み込むことができる。プライマーは各々、ｓｓＮＡの３’に位置する足場アダプターの一部分にアニールし、そこからプライミングする配列と、ＵＭＩポリヌクレオチドとを含有することができる。一部の事例では、プライマーは、シーケンシングインデックスまたはバーコード配列およびフローセル結合部位も含む（図７を参照されたい）。プライマーは、５’末端に遮断する修飾を含むこともあり、または含まないこともある。ワークフローの一例では、ｓｓＮＡ－足場アダプターライゲーション産物を変性させて、足場ポリヌクレオチドを放出させ、その結果、一本鎖ライゲーション産物（足場アダプターのオリゴヌクレオチド成分にライゲーションしたｓｓＮＡ）を得ることができる。遊離足場ポリヌクレオチドおよび一本鎖ライゲーション産物は各々、遮断する修飾を有するため、伸長され得ない。ＵＭＩまたはインデックス含有プライマーを鎖置換ポリメラーゼで伸長して（ｓｓＮＡライゲーション産物が鋳型としての役割を果たす）、分子のＰ７側にのみ完全なライブラリー鎖を作出することができる。伸長後、ＳＰＲＩ精製を行なうことができる。インデックスが付加された完全なライブラリー分子を完成するために、ＩＳ４または他のバージョンのＰ５インデックスプライマーと、フローセル結合部位に相補的なプライマーとを使用して、ＰＣＲを行なうことができる（図７を参照されたい）。ワークフローの一変形形態では、変性中にｓｓＮＡライゲーション産物から放出される、デオキシウリジン切断部位を有する過剰な足場ポリヌクレオチドを、ＤＮＡ－ウラシルグリコシラーゼで分解して、それらがアニーリングするのを防止する。
ヘアピンアダプター
アダプターダイマーの形成を低減させるために、足場アダプターのヘアピン構造を設計した（図８を参照されたい）。ヘアピンアダプターを使用する方法は効果を発揮したが、元のアダプター設計ほどは良好に機能しない。
代替的アダプター設計
図９、１０および１１は、代替的な操作順序、酵素もしくは他の試薬の添加遅延、末端ＤＮＡ修飾、および／または他のリガーゼタイプを含む、足場アダプターへの修飾を記載する。
１つのアダプター構成およびワークフローは、段階的なライゲーション、および酵素遅延を含む（図９）。非リン酸化または脱リン酸化Ｐ５およびＰ７足場アダプターを一本鎖ＤＮＡ鋳型と結合させる。ＰＮＫを含まないライゲーションマスターミックスをアダプター／鋳型結合体に添加し、室温で５分間インキュベートする。Ｐ５アダプターが、５’リン酸を有するＤＮＡ鋳型にライゲーションする。Ｐ５ライゲーション後、ＰＮＫを反応物に添加し、温度を３７℃にする。Ｐ７アダプターがＰＮＫによりリン酸化され、Ｐ７アダプターの５’リン酸化末端が、ＤＮＡ鋳型の３’末端にライゲーションする。このワークフローを行ない、ダイマーを半減させ、収量をＳＯＰと比較しておおよそ倍増させた。このワークフローの１つの変形形態は、Ｐ５アダプターがＤＮＡ鋳型にライゲーションし終えるまでＰ７アダプターの添加を遅延させること、またはＰ７アダプターがＤＮＡ鋳型にライゲーションし終えるまでＰ５アダプターの添加を遅延させることを含む。このワークフローの１つの変形形態は、リン酸化Ｐ７を最初に添加するが、Ｐ５およびＰＮＫの添加を２０分遅延させることを含む。このワークフローも行ない、ダイマーを半減させ、収量をＳＯＰと比較しておおよそ倍増させた。
別のアダプター構成およびワークフローは、段階的なライゲーション、５’Ａｐｐ Ｐ７アダプター、およびＡＴＰ遅延を含む（図１０）。５’Ａｐｐ Ｐ７足場アダプターを一本鎖ＤＮＡ鋳型と結合させる。ＡＴＰを含まないライゲーションマスターミックスをアダプター／鋳型結合体に添加し、室温で５分間インキュベートする。Ｐ７アダプターの５’Ａｐｐ末端が、ＡＴＰなしでＤＮＡ鋳型の３’末端にライゲーションする。Ｐ７ライゲーション後、非リン酸化または脱リン酸化Ｐ５足場アダプターおよびＡＴＰを反応物に添加する。Ｐ５アダプターが、５’リン酸を有するＤＮＡ鋳型にライゲーションする。
別のアダプター構成およびワークフローは、段階的なライゲーション、および３’リン酸を有する一本鎖Ｐ５アダプターを含む（図１１）。鋳型ＤＮＡを脱リン酸化し、３’リン酸を有する一本鎖Ｐ５アダプターと結合させる。ＤＮＡ３’リン酸末端を５’ＯＨ末端にライゲーションすることができ、かつ好んで一本鎖をライゲーションする、リガーゼ（例えば、ＲｔｃＢ）を、アダプター／鋳型結合体に添加する。Ｐ５アダプターの３’リン酸末端が、ＤＮＡ鋳型の５’ＯＨ末端にライゲーションする。次いで、５’リン酸化Ｐ７足場アダプターおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼを反応物に添加し、Ｐ７アダプターの５’リン酸化末端が、ＤＮＡ鋳型の３’末端にライゲーションする。このワークフローの１つの変形形態は、５’リン酸化Ｐ７足場アダプターとＤＮＡ鋳型を結合させることを含み、この場合は一本鎖Ｐ５アダプターを添加する。
（実施例２）
ＲＮＡの一本鎖特異的ライブラリー調製
実施例１で説明した一本鎖ＤＮＡライブラリー調製方法を、ＲＮＡ分子のシーケンシングライブラリーへの変換用に改良した。１つの構成では、ｒＲＮＡが枯渇されたまたはｍＲＮＡが濃縮された全ＲＮＡから生成される第１鎖ＤＮＡ合成産物を、本明細書に記載する一本鎖ＤＮＡライブラリー調製方法に組み込む。別の構成では、ｒＲＮＡが枯渇されたまたはｍＲＮＡが濃縮された全ＲＮＡを、本明細書に記載する一本鎖ＤＮＡライブラリー調製方法に直接組込み、その後、第１鎖ＤＮＡ合成を行なう。より少ない酵素的ステップ、時間の節約および試薬の節約に加えて、ＲＮＡへの一本鎖ＤＮＡライブラリー調製方法の応用には、既存の技術を超えるいくつかの生物学的利益もある。例えば、本明細書に記載する技術の一本鎖性のため、第２鎖合成を完全に省くことができる。得られたＲＮＡシーケンシングライブラリーは、鎖ＲＮＡシーケンシングライブラリーを生成することができ、その結果、転写物マッピングがより正確になる。
１つの構成の一般的ワークフローを図１５に示し、このワークフローは以下を含む。ｒＲＮＡ枯渇キットまたはｍＲＮＡ濃縮キットによって全ＲＮＡを抽出し、全ＲＮＡがそのキットの過程を経る。次いで、ＲＮＡを断片化し、ランダムプライマーおよび逆転写酵素を使用して第１鎖合成ｃＤＮＡを作出する。ＲＮａｓｅＨ消化を行なって、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを確実に除去する。少し改良を加えた一本鎖ＤＮＡライブラリー調製キットに第１鎖ｃＤＮＡを供給する。多くの場合、ｃＤＮＡを変性させて二次構造を除去する。一本鎖結合タンパク質を含めてもよいが、一般にはその必要はない。本明細書に記載する足場アダプターをＰＮＫの存在下で第１鎖ｃＤＮＡにライゲーションして、ＤＮＡ末端をリン酸化する。リン酸化以外に、ネイティブ末端に変更を加えない。ライゲーション産物をクリーンアップおよび精製に付し、その後、ＰＣＲ（例えば、インデックスＰＣＲ）により増幅させる。次いで、増幅産物をクリーンアップおよび精製に付す。
上で説明したワークフローの具体的な例では、ｒＲＮＡ枯渇キットまたはｍＲＮＡ濃縮キットによって全ＲＮＡを抽出し、全ＲＮＡがそのキットの過程を経る。次いで、ＲＮＡを断片化し、熱変性させ（９４℃、１５分間）、ランダムヘキサマー／ランダムオクタマー／ポリＴプライマーまたは市販ランダムプライマー、およびＭ－ＭＬＶ逆転写酵素を使用して、第１鎖合成ｃＤＮＡを作出する。ＲＮａｓｅＨ消化を行なって（３７℃で３０分間）、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを確実に除去する。ｃＤＮＡを熱変性させて二次構造を除去し、次いで急速冷却する。本明細書に記載する足場アダプターをＰＮＫの存在下で第１鎖ｃＤＮＡにライゲーションして、ＤＮＡ末端をリン酸化する。ライゲーション産物をクリーンアップおよび精製に付し、その後、インデックスＰＣＲにより増幅させる。この方法を行ない、ライブラリーの構築に成功した。ライブラリーの解析結果を図１２、１３および１４で提供する。
上記プロトコールは、１つまたは複数の変形形態を含み得る。例えば、足場アダプターを、ｒＲＮＡ枯渇（またはｍＲＮＡ濃縮）およびＲＮＡ断片化後に、ＲＮＡに直接ライゲーションすることができる。その場合、第１鎖合成は、一本鎖アダプター特異的プライマーを使用することができる。この代替的プロトコールも、第２鎖合成をなくすが、ｃＤＮＡ作出の上流に追加のＲＮＡ処理（断片化）を必要とする（図１６のワークフローを参照されたい）。この方法の１つの変形形態を行い、ライブラリーの構築に成功した（図５０に示すワークフローを参照されたい）。このワークフローでは、全ＲＮＡ投入量が、ｍＲＮＡ濃縮および／またはｒＲＮＡ枯渇を経、ＲＮＡをせん断し（例えば、ＢＩＯＲＵＰＴＯＲまたは他の断片化方法）、ＲＮＡ断片を、本明細書に記載するＤＮＡ足場アダプターにライゲーションし、ＳＰＲＩ精製し、逆転写酵素とＰＣＲ増幅を組み合わせたステップを行なう。この組み合わせたステップにおいて、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドライゲーション産物を逆転写酵素（例えば、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素）によりｃＤＮＡに変換し、ｃＤＮＡ分子をＰＣＲ（例えば、ＮＥＢのＯＮＥＴＡＱ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ、およびｓｓＰｒｅｐ Ｉｌｌｕｍｉｎａ互換性アダプターからプライミングするＰＣＲプラマーを使用する）により増幅する。
この実施例で説明するプロトコールの他の変形形態は、１）ｍＲＮＡ濃縮、断片化およびｃＤＮＡ合成が、ランダムプライマーカクテル中のリボソームＲＮＡ結合オリゴを除去することにより１ステップで行なわれる、ｒＲＮＡ枯渇（ｍＲＮＡ濃縮）を用いるまたは用いない方法を行なうこと；２）ＲＮＡ断片化を用いるまたは用いない方法を行なうこと（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ以外のシーケンサーを使用する場合）；３）ＲＮａｓｅＨ消化を用いるまたは用いない方法を行なうこと；４）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を用いるまたは用いない方法を行なうこと；５）ｒＳＡＰ処理アダプターまたは非ｒＳＡＰ処理アダプターを使用する方法を行なうこと；６）ＰＮＫ処理が切り離され、上流に配置されるかまたはされない、方法を行なうこと；７）ＰＣＲの前に任意のタイプのクリーンアップを使用するかまたはクリーンアップを用いない方法を行なうこと；および８）様々なＲＮＡ投入量を用いる方法を行なうことを含み得る。他の変形形態は、ワークフロー内のある特定のステップを組み合わせることを含む。例えば、図１７は、ワークフロー内のある特定のステップを組み合わせる、修飾形態Ａ、ＢおよびＣを示す。図５０は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドライゲーション産物の逆転写とｃＤＮＡ産物の増幅とが単一のステップに組み合わされた、例示的なワークフローを示す。
（実施例３）
定方向ＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリー調製ＮＧＳアッセイ（ＲＮＡのｓｓＰｒｅｐ）
ＲＮＡ－Ｓｅｑは、遺伝子発現プロファイリングおよび全トランスクリプトーム解析に使用される、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）ワークフローである。本明細書に記載し、図２１に示す、ＲＮＡの一本鎖ライブラリー調製（ｓｓＰｒｅｐ）は、定方向ＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリー調製方法であり、この方法は、固有のＮＧＳアダプターを使用して第１鎖ｃＤＮＡから直接ライブラリーを生成し、したがって第２鎖合成およびＤＮＡ末端修復をなくす。それ故、費用および時間の大幅な削減によってライブラリー品質が向上されることになる。
ＲＮＡのｓｓＰｒｅｐの特徴は、以下のことを含む：約２時間での、直接、第１鎖ｃＤＮＡからＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシング対応ライブラリーへの、ワークフロー；ユーザーが選択した第１鎖ｃＤＮＡ合成プロトコールを使用することができる；キットが、アダプターライゲーションのための試薬、インデックス付加ＰＣＲのための試薬、および磁気精製ステップのための磁気ビーズを含有する；１０ｎｇのｍＲＮＡ、最少の実践時間、ならびに非常に少ないＰＣＲサイクルおよび低減された偏りで生成されるシーケンシング対応ライブラリーのために、最適化されている。ＲＮＡのｓｓＰｒｅｐは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）プラットフォームで、末端ポリッシングを伴わないライゲーションのための鋳型第１鎖ｃＤＮＡ分子の調製と、シーケンシングのための足場アダプター（すなわち、本明細書に記載する足場アダプター）のライゲーションとを同時に行う、１ステップ反応で動作する。下流の応用としては、例えば、遺伝子発現プロファイリング、アイソフォーム解析、およびスプライスバリアント発見を挙げることができる。
ｍＲＮＡ投入量範囲
この実施例では、ＲＮＡのｓｓＰｒｅｐのプロトコールを用いて作製したＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリーについての品質メトリクスの改善を実証する。ＲＮＡのｓｓＰｒｅｐ方法についてのメトリクスを、市販の二本鎖（ｄｓＰｒｅｐ）方法（すなわち、ＮＥＢＮＥＸＴ ＵＬＴＲＡ ＩＩ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌライブラリー調製方法）のものと比較した。スパイクインｍＲＮＡ対照を使用したとき、ＲＮＡのｓｓＰｒｅｐは、反復実験間の高度な一致を有し、ライブラリーの鎖の数を保持し、かつ真のｍＲＮＡ ＧＣ組成を捕捉する、ライブラリーを生成した。
Ｑｉａｇｅｎ Ａｌｌ Ｐｒｅｐ ＤＮＡ，ＲＮＡ，Ｐｒｏｔｅｉｎキットを使用して、全ＲＮＡを肺がん細胞系Ｈ２１２６から抽出した。ｍＲＮＡを、ＮＥＢＮＥＸＴ ＰｏｌｙＡ磁気ｍＲＮＡ単離モジュールで単離した。ＮＥＢＮＥＸＴ ＵＬＴＲＡ ＩＩ第１鎖合成モジュールを使用する第１鎖ｃＤＮＡ合成のための投入物として、１～２０ｎｇのｍＲＮＡを使用した。ビーズ精製後、ライブラリーを、ＲＮＡのｓｓＰｒｅｐのプロトコールに従ってインデックスＰＣＲ反応で増幅させ、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＭＩＳＥＱでシーケンシングした。ｍＲＮＡから出発して、シーケンシング対応ライブラリーを１～２０ｎｇの投入物から約４時間で生成した（収量を図２２に示す）。第１鎖ｃＤＮＡ合成およびクリーンアップ後、プロトコールは、約２時間かかった。ＲＮＡのｓｓＰｒｅｐは、他の市販ＲＮＡ－Ｓｅｑキットと比較して、シーケンシング対応ライブラリーを生成するために必要とするＰＣＲサイクルの回数が少なかった（図２３）。
市販二本鎖調製（ｄｓＰｒｅｐ）キットとの比較
ＲＮＡのｓｓＰｒｅｐの性能を、第２鎖合成を必要とする市販二本鎖調製（ｄｓＰｒｅｐ）キット（すなわち、ＮＥＢＮＥＸＴ ＵＬＴＲＡ ＩＩ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌキット）の性能と比較した。第２鎖合成ステップは、ｄＵＴＰを相補鎖に組み込み、その後、ｄＡテール付加、末端充填およびアダプターライゲーションを行う。ｄＵＴＰを含有する鎖のその後の酵素的消化は、元の鎖情報を維持する。従来のＲＮＡｓｅｑ方法とは異なり、ＲＮＡのｓｓＰｒｅｐは、第１鎖ｃＤＮＡを用いて直接行なわれ、したがって、転写物の方向性を自然に維持する。
第１鎖合成（ＮＥＢＮＥＸＴ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｍｏｄｕｌｅ）後、各ライブラリーを製造業者のプロトコールに従って完成させた。ＲＮＡのｓｓＰｒｅｐについての相対的性能を評価するために、外部ＲＮＡ標準コンソーシアム（ＥＲＣＣ）から入手可能なスパイクイン対照を使用した（複製ｍＲＮＡ試料１０ｎｇ当たり対照１０００ａｍｏｌ）。この対照は、真核生物ｍＲＮＡによく似ているがヒトゲノムにマッピングしない、濃度、長さおよび配列が既知の９２転写物の混合物である。予想したトランスクリプトームの複雑性からの偏差を評価するためにＥＲＣＣ対照を設計した。
各ライブラリーを深度＞１０，０００，０００リードまでシーケンシングした（ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＭＩＳＥＱ ２×７６ｂｐ）。ＳＴＡＲ ｖ２．６．１ｄを使用して、リードをヒトまたはＥＲＣＣ対照参照ゲノムにマッピングした。両方のライブラリー方法が、同等のマッピングメトリクスを示した：＞９０％の一意的にマッピングされたリード、最少のリボソームリード、および鎖の数の維持（図２５の上のパネル）。正規化されたリードカウントを、ヒトリードとＥＲＣＣリードの両方について決定した。高い一致が、ヒトリード（図２５、下のパネル）とＥＲＣＣリード（図示なし）の両方について反復実験および２つの方法の間で観察された。
さらなる解析により、ＲＮＡのｓｓＰｒｅｐは、配列をＧｅｎｅ ｂｏｄｙにわたって均一に捕捉したが、市販キットライブラリーには、軽度の５’偏りがあることが示された（図２６、上のパネル）。この偏りは、トランスクリプトームのゲノム組成にも反映され、非翻訳領域のより高い回収％として観察された（図２６、中央パネル）。２つの方法により生成したライブラリーは、わずかに異なるヒトＤＮＡ ＧＣ組成を有したが、スパイクイン対照についての実測対予想（４４．５％）ＧＣ組成の比較により、ＲＮＡのｓｓＰｒｅｐは市販のキットよりもその予測値に厳密にマッチすることが明らかになった（図２６、下のパネル、挿入図）。スパイクイン対照解析により、マッピングされたＥＲＣＣリードのほぼ１００％が両方のライブラリーについて正しい鎖から生じることも明らかになった（図２７）。
（実施例４）
無細胞ＤＮＡおよび一本鎖オリゴの解析のためのＮＧＳライブラリー調製への一本鎖アプローチ
この実施例では、鋳型分子のネイティブ末端に変更を加えることなく、少ない投入量のｃｆＤＮＡから複雑なライブラリーを生成するように設計した、単純かつ効率的な、ライゲーションに基づくｓｓＤＮＡライブラリー調製を提示する。ｓｓＰｒｅｐと呼ぶこともあるこの方法は、１ステップ複合リン酸化／ライゲーション反応で動作する。ｓｓＰｒｅｐ方法は、特殊設計された次世代シーケンシング（ＮＧＳ）足場－アダプターをライゲーションする、末端ポリッシングを伴わないライゲーションのための鋳型ＤＮＡ分子を調製する。ｓｓＰｒｅｐ方法は、プロトコール時間およびシーケンシング結果が、最も効率のよい二本鎖ライブラリー調製ＤＮＡ方法に匹敵する、迅速かつ効率的な一本鎖ライブラリー方法である。合成オリゴの２つの独立した群を使用してｓｓＰｒｅｐのネイティブ末端保持の有用性を実証し、一本鎖オリゴを純度についてアッセイするｓｓＰｒｅｐの能力を明らかに示す。最後に、ｓｓＰｒｅｐから生じたｃｆＤＮＡ次世代シーケンシングデータを使用して健康な個体からのヌクレオソームの位置取りおよび転写因子結合部位を解析することができることを実証する。したがって、ｓｓＰｒｅｐは、ｃｆＤＮＡ断片のような断片化されたＤＮＡ分子を、本来の長さおよびネイティブ末端を保持するシーケンシングライブラリーに変換するための、迅速かつ用途の広いツールである。
鋳型分子のネイティブ末端を変更することなく、１ナノグラム（ｎｇ）のＤＮＡから複雑なＮＧＳライブラリーを生成するように設計した、迅速、単純、かつ効率的な、ライゲーションに基づく一本鎖ＤＮＡライブラリー調製方法（ｓｓＰｒｅｐ）を、この実施例で説明する。ｓｓＰｒｅｐ方法は、新奇な試薬を必要とせず、２．５時間で完了することができ、ＩＬＬＵＭＩＮＡアダプターをライゲーションしているときに、末端ポリッシングを伴わないライゲーションのための鋳型ＤＮＡ分子を同時に調製する、１ステップ複合リン酸化／ライゲーション反応で動作する。
健康なヒトｃｆＤＮＡドナーから作製したｓｓＰｒｅｐライブラリーにより生成した標準シーケンシングメトリクスを提示し、旧来の末端ポリッシング型ｄｓＤＮＡライブラリー方法からの結果と比較する。ｓｓＰｒｅｐを使用して生成したｓｓＤＮＡライブラリーを、合成二重鎖オリゴヌクレオチドを使用するｄｓＤＮＡ調製と比較する。次に、長さが短いｓｓＤＮＡ断片を捕捉するｓｓＰｒｅｐの能力を実証し、長さが様々であり配列が既知である一本鎖合成オリゴを使用してオリゴヌクレオチドの純度をアッセイする能力を実証する。最後に、ｓｓＰｒｅｐライブラリーが、広範なＤＮＡ断片長を捕捉することによってそれらのネイティブ５プライムおよび３プライム末端を変更することなくｃｆＤＮＡデータの改善された解析をできるようにする方法を、実証する。その効率および使用の容易さを考えると、ｓｓＰｒｅｐは、多くの応用についてｓｓＤＮＡライブラリー調製方法およびｄｓＤＮＡライブラリー調製方法の両方に取って代わることができる。
方法
以下の方法をこの実施例では使用した。
ヒト無細胞ＤＮＡ調製
匿名化されたドナーからの全血をｉｎ ｖｉｔｒｏ研究使用のためにＰａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡのスタンフォード献血センター（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ）から入手した。採血チューブを１８００ｇで１０分間、４℃で回転させることにより、全血から血漿を抽出した。細胞層を乱すことなく、上清の２ｍｌアリコートを無菌条件下で微量遠心チューブに移し、１６０００ｇで１０分間、４℃で再び回転させて、細胞デブリを除去した。
循環無細胞ＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者のプロトコールに従って使用して、４ｍｌの血漿からｃｆＤＮＡを調製した。精製された無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の濃度を、ＱＵＡＮＴ－ＩＴ高感度ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ ＫｉｔおよびＱｕｂｉｔ蛍光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎおよび付随するＤ５０００またはＤ１０００高感度製品を使用して、ｃｆＤＮＡサイズ分布を解析した（Ａｇｉｌｅｎｔ；図３３Ａおよび３３Ｂ）。
合成オリゴ調製
ランダム配列生成装置を使用して５０％ＧＣ含有量で二本鎖合成オリゴ（下記表１に示す）を設計し、公開データベースの任意の公知生物とマッチする配列を除去した。各ｄｓＤＮＡオリゴ（ｎ＝１２）は、１つの平滑末端と、ランダム配列、長さ１～６ヌクレオチド、の１つの３プライムまたは５プライム一本鎖オーバーハングとを有する、二本鎖ＤＮＡの固有の５０ｎｔ配列であった。オリゴは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）により標準的な脱塩精製を使用して合成され、二重鎖化されたものであり、すべてのランダムヌクレオチドを、合成の偏りを低減させるために「手で混合」した。一本鎖ライブラリー調製（ｓｓＰｒｅｐ）のために、対照オリゴを等モル比で一緒にプールした。
Figure 2022528139000002
一本鎖合成オリゴ（下記の表２に示す）を、二本鎖対照オリゴと同じ方法で生成した。別段の断り書きがない限り、オリゴは、長さ２０～８０ｎｔのｓｓＤＮＡオリゴについては標準的な脱塩精製、および長さ９０～１２０ｎｔのｓｓＤＮＡオリゴについてはＵｌｔｒａｍｅｒ精製を使用して合成した。
Figure 2022528139000003
ｓｓＰｒｅｐアダプター調製
フォワード（Ｐ５）ｓｓＰｒｅｐアダプターおよびリバース（Ｐ７）ｓｓＰｒｅｐアダプターは、両方とも二本鎖足場アダプターであった。フォワードｓｓＰｒｅｐアダプターは、アダプターの足場部分に５プライムオーバーハング、およびライゲーション末端に遊離３プライムＯＨ末端を含有し、すべての他の末端は、ライゲーションおよび伸長を遮断する修飾を有した。リバースｓｓＰｒｅｐアダプターは、アダプターの足場部分に３プライムオーバーハング、およびライゲーション末端にリン酸化５プライム末端を含有し、すべての他の末端は、ライゲーションおよび伸長を遮断する修飾を有した（下記の表３）。ｓｓＰｒｅｐアダプターは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）により標準的な脱塩精製を使用して合成され、二重鎖化されたものであった。アダプターの作業用ストックを、ＴＥ＋５０ｍＭ ＮａＣｌでアダプターを希釈することにより製造した。
Figure 2022528139000004
ｓｓＰｒｅｐライブラリー調製
２２μｌ変性反応では、ＱＵＡＮＴ－ＩＴにより測定して１ｎｇの精製ｃｆＤＮＡまたは５ｎｇの合成したオリゴを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０および８ｎｇのＥＴ ＳＳＢ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と、氷上で併せた。９５℃に予熱したサーモサイクラー内に反応物を配置し、３分間インキュベートした後、直ちに、少なくとも２分間、氷上に戻した。１ｐｍｏｌのフォワードおよび１ｐｍｏｌのリバースｓｓＰｒｅｐアダプターを氷上の変性反応物に添加し、ＰＥＧ－８０００、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝剤、Ｔ４ ＰＮＫ、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（すべてＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）も添加して最終体積５０μｌにした。ＰＥＧ－８０００を１８．５％ ｖ／ｖの最終濃度まで添加した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝剤を１×の最終濃度まで添加した。Ｔ４ ＰＮＫおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼをそれぞれ１０単位および８００単位の最終濃度まで添加した。このライゲーション反応物を３７℃で１時間インキュベートし、ＭＩＮＥＬＵＴＥ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）および製造業者の使用説明書を次の変更を加えて使用して精製した：初期結合スピンは、卓上遠心分離機を用いて６０００ｒｐｍで行なった。洗浄スピンは、洗浄スピンを合計２回反復し、両方の洗浄を６０００ｒｐｍで行なった。ＤＮＡを１５μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０で溶出した。
ライゲーションされ、精製されたＤＮＡを、５０μｌ反応で、１×ＫＡＰＡ ＨＩＦＩ ＨＯＴＳＴＡＲＴ ＲＥＡＤＹＭＩＸ（Ｒｏｃｈｅ）および最終濃度２ｍＭのユニバーサルプライマーおよび最終濃度２ｍＭのインデックスプライマーと併せ、次の熱サイクル条件：初期変性のために９８℃で３分間、続いて、９８℃で２０秒間、６８℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を１０サイクル、最後に７２℃で１分間の伸長ステップ、を使用して増幅させることにより、ｓｓＰｒｅｐライブラリーにインデックスを付加させた。インデックスＰＣＲ後、ｓｓＰｒｅｐライブラリーを、１．２×ＡＭＰＵＲＥクリーン（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で精製し、２０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０で溶出した。断片長分布およびｄｓＤＮＡ濃度（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ ４２００およびＱｕｂｉｔ蛍光定量ユニット）を使用して、最終モル濃度推定値を計算した。
二本鎖ＤＮＡライブラリー調製
ＱＵＡＮＴ－ＩＴにより測定して、１ｎｇの精製ｃｆＤＮＡまたは５ｎｇの合成オリゴを、供給された試薬、推奨ＡＭＰＵＲＥクリーンアップ比、および推奨インデックスＰＣＲサイクルを使用する、ＮＥＢＮＥＸＴ ＵＬＴＲＡ ＩＩマニュアルに概要が示されている通りのライブラリー調製（末端ポリッシング、アダプターライゲーション、インデックスＰＣＲ）によって、得た。
シーケンシング
すべてのｃｆＤＮＡライブラリーは、Ｆｕｌｇｅｎｔ ＧｅｎｅｔｉｃｓによりＩＬＬＵＭＩＮＡ ＨＩＳＥＱＸを用いて２×１５１リード長でシーケンシングされたものであった。すべての合成オリゴライブラリーは、社内ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＭＩＳＥＱ卓上シーケンサーを製造業者の使用説明書に従って２×１５１ｂｐのリード長でシーケンシングした。
リード処理
シーケンシングデータを、先ず、ｂｗａ ｍｅｍを使用してデフォルトパラメーターでＰｈｉＸゲノムとアライメントした。ＰｈｉＸ（ｓａｍｔｏｏｌｓ ｆａｓｔｑ－ｆ １２）にマッピングしなかった抽出リードを、下流の解析に使用した。次に、アダプター配列の除去とリードのマージを同時に行なった。このプロセスは、配列類似性に基づいてフォワードリードとリバースリードを折り畳んで単一の配列にすること、その一方で、ＳｅｑＰｒｅｐ（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｊｓｔｊｏｈｎ／ＳｅｑＰｒｅｐ）を使用して公知ＩＬＬＵＭＩＮＡアダプター配列とマッチするリードの末端をトリミングすることを含んだ。フィルタリング後に残存した、マージしたリードを、ＵＣＳＣゲノムブラウザからダウンロードしたｈｇ１９ヒト参照ゲノム（下記の表４および５）、または合成したオリゴ配列（表１）に対応するカスタムｆａｓｔａファイルのどちらかと、アライメントした。デフォルトパラメーターでｂｗａ ａｌｎおよびｂｗａ ｓａｍｐｅをアライメントおよびマッピングに使用した。ヒトライブラリーについてのマッピング率を、ｓａｍｔｏｏｌｓ ｆｌａｇｓｔａｔから決定した。次いで、ｓａｍｔｏｏｌｓ ｒｍｄｕｐを使用して、重複リードを除去した。
Figure 2022528139000005
Figure 2022528139000006
Figure 2022528139000007
Figure 2022528139000008
ＱＣメトリクス
大部分の解析について、解析の前にｓａｍｔｏｏｌｓ ｍｅｒｇｅを使用して、同じ調製方法および同じｃｆＤＮＡ抽出物の個々のライブラリーからのｂａｍファイルを試料特異的およびライブラリー特異的ｂａｍファイルにマージした。同じ調製方法およびｃｆＤＮＡ抽出物についての、マージしたリードの挿入物長分布について、ｓａｍｔｏｏｌｓ ｖｉｅｗ －ｑ２０ －ｆ６６を使用して生成した、個々のライブラリーのｂａｍファイルから、挿入物長の情報を解析し、連結コマンドを使用して結合させた。長さ当たりのリードの頻度を計算し、全ライブラリーに対するリードのパーセントとしてプロットした。全ライブラリーが同じカバレッジを有するように、ｓａｍｔｏｏｌｓ ｖｉｅｗ－ｓを使用して、マージし、重複を除去し、ダウンサンプリングしたｂａｍファイルから、正規化したゲノムカバレッジを抽出した。ダウンサンプリングしたｂａｍファイルをｓａｍｔｏｏｌｓ ｖｉｅｗ －ｑ２０ －ｂからｂｅｄｔｏｏｌｓ ｇｅｎｏｍｅｃｏｖにピッピング（pipping）することにより、データを得た。ダウンサンプリングの前にライブラリー調製方法ごとにＮＥＢＮＥＸＴ ＵＬＴＲＡ ＩＩよりもｃｆＤＮＡ抽出物当たりのライブラリー数が多いｓｓＰｒｅｐの複雑性を人工的に増大させないように各ｃｆＤＮＡ入力試料について３つだけのライブラリーを組み合わせることにより、ｐｒｅｓｅｑ複雑性推定値を得た。ｓｓＰｒｅｐ試料Ａについて組み合わせたライブラリーは、Ａ１、Ａ２、Ａ３であった。ｓｓＰｒｅｐ試料Ｂについて組み合わせたライブラリーは、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８であった。試料Ａおよび試料ＢについてのＮＥＢＮＥＸＴ ＵＬＴＲＡ ＩＩの組み合わせたライブラリーは、それぞれ、ｄｓ１Ａ～ｄｓ３Ａおよびｄｓ４Ａ～ｄｓ６Ａであった。組み合わせてダウンサンプリングした後に、ｐｒｅｓｅｑ ｌｃｅｘｔｒａｃｔを使用して複雑性推定および外挿を行なった。Ｐｉｃａｒｄ Ｔｏｏｌｓ（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）ＣｏｌｌｅｃｔＧＣＢｉａｓＭｅｔｒｉｃｓを用いて、マージし、重複を除去し、ダウンサンプリングしたｂａｍファイルからＧＣカバレッジを得た。ライブラリータイプごとに、断片の両方のリードに基づいて－２～＋３４塩基にわたる領域のあらゆる位置での各塩基の比率、すなわち塩基組成、を計算することによって断片末端ヌクレオチド解析を行なった。位置ごとの塩基組成を、領域の長さに沿ってその塩基の最頻値を用いて正規化し、ｌｏｇ－２変換した。正規化され、ｌｏｇ変換された比率を、両方のリードの両方のライブラリータイプについて計算し、プロットした。すべてのプロットを、ｇｇｐｌｏｔ２を用いてＲで生成した。
合成オリゴ解析
カスタムスクリプトａｋｉｎをｓａｍｔｏｏｌｓ ｄｅｐｔｈに用いて、オリゴ中の各位置における二本鎖合成オリゴシーケンシングカバレッジを決定し、Ｒでｇｇｐｌｏｔ２を用いて０ベース座標でオリゴの長さにわたってのパーセントの関数としてプロットした。
ｃｆＤＮＡについてのものに類似した、一本鎖合成オリゴの断片長解析を行った。
ｃｆＤＮＡの生物学的解析
ジヌクレオチド出現頻度計算のために、各ライブラリー調製方法についての試料Ａおよび試料Ｂの組み合わせたライブラリーからのマージされたｂａｍファイルを、ｓａｍｔｏｏｌｓ ｖｉｅｗ －ｂｈ －Ｆ ０Ｘ１０ －ｍ －Ｍ －ｑ ２０を使用して構文解析して、特異的挿入物長：１６７ｂｐ（クロマトソームに巻き付いたＤＮＡ長）、１４４ｂｐ（コア粒子に巻き付いたＤＮＡ長）、および８３ｂｐ（図２９、パネルＡにピークとして存在する、より短いＤＮＡ長）の、フォワードリードを抽出した。各挿入物長については、５プライムおよび３プライム断片化点の両方に１００ｂｐまたは１１ｂｐのゲノムコンテキストをそれぞれ追加した１００ｂｐまたは１１ｂｐウインドウどちらかについての１６すべての２－ｍｅｒ組合せのカスタムｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用して、両方の断片化点の周辺のジヌクレオチドカウントを推定した。両末端の１００ｂｐ隣接ウインドウを用いて生成したデータについて、オーバーラップしている領域（当然のこととして、同じカウントを有する）を除去した。中央値フィルターを使用してデータを正規化し、ジヌクレオチド出現頻度を、挿入物の中央がゼロになり、断片化点の上流の領域が負の値を有し、下流が正の値を有するように、弱いジヌクレオチド（ＡＡ／ＡＴ／ＴＡ／ＴＴ）相互作用について強いジヌクレオチド（ＣＣ／ＣＧ／ＧＣ／ＧＧ）相互作用に対してプロットした。１１ｂｐ隣接ウインドウに関して生成されたデータについて、中央値フィルターを用いてデータを正規化し、弱いジヌクレオチドの強いジヌクレオチドに対するジヌクレオチド出現頻度を、Ｒを使用して５プライムおよび３プライム末端についてプロットした。
ゲノム内の各位置についてのＷＰＳスコアを、大きい断片の解析の場合は１２０ｂｐ、短い断片の解析の場合は３５ｂｐである、その位置の周辺のウインドウ内でアライメントするリードを収集することにより（Snyder et al., Cell 164, 57-68 (2016)に記載されているように）決定した。スコアは、次のように計算した：挿入物がそのウインドウ内で始まるかまたは終わるたびに、スコアから１を引く。挿入物がそのウインドウ内で始まりも終わりもしないが、それにもかかわらずそれにアライメントする場合、スコアに１を加える。オーバーラップしていない１０００ｂｐセグメントを用いてＷＰＳスコアを得、中央値ＷＰＳスコアを引くことによりゼロの中央値スコアに合わせることによって、正規化されたＷＰＳスコアを計算した。次いで、スコアを、Ｓａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙフィルターにより平滑化した：二次多項式を、２１ｂｐウインドウにわたって各位置における中央値調整スコアにあてはめた。平滑化されたスコアが、その位置でのその多項式の値である。等しい長さの領域のセットを用いて、位置１がセット内の各領域の第１のヌクレオチドであり、位置２が各領域内の第２のヌクレオチドであるなどである、セット内の領域の各々における各位置にわたるＷＰＳスコアの平均値を計算することにより、ＷＰＳスコア代表値を計算した。ＣＴＣＦ部位は、Snyder et al., Cell 164, 57-68 (2016)に記載されているように選択した。推定的ＴＦ結合部位のリストを含有するｂｅｄファイルを、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ Ｔａｂｌｅ ＢｒｏｗｓｅｒからのＪＡＳＰＡＲ２０１８表（ｈｕｂ＿１８６８７５＿ＪａｓｐａｒＴＦＢＳ）からｂｅｄファイルにダウンロードし、ＣＴＣＦ部位のみを含むようにフィルタリングした。これらの部位を、１９の細胞系からのＣＴＣＦ Ｃｈｉｐｓｅｑデータと比較した。１９の細胞系すべてにおいてｃｈｉｐｓｅｑピークがオーバーラップしている推定的結合部位をさらなる解析に使用した。
略号
ｃｆＤＮＡ：無細胞ＤＮＡ；ＮＧＳ：次世代シーケンシング；ｓｓＤＮＡ：一本鎖ＤＮＡ；ｄｓＤＮＡ：二本鎖ＤＮＡ；ｂｐ：塩基対；ｎｔ：ヌクレオチド；ＳＳＢ：一本鎖結合タンパク質；ＦＦＰＥ：ホルマリン固定パラフィン包埋；ｃｔＤＮＡ：循環腫瘍ＤＮＡ；ＷＰＳ：ウインドウ保護スコア。
ライブラリー構築
この実施例で説明するｓｓＰｒｅｐ方法は、断片化されたまたは分解された鋳型ＤＮＡからＩＬＬＵＭＩＮＡシーケンシングライブラリーを作出する（図２８）。ｄｓＤＮＡと、ｓｓＤＮＡと、ニックの入ったｄｓＤＮＡとの複合混合物であり得る鋳型ＤＮＡを、先ず、熱変性させ、次いで直ちにコールドショックを与えてすべての鋳型ＤＮＡ分子を均一な一本鎖状にする。熱安定性一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）を含めることにより、ライゲーション反応を通してＤＮＡを一本鎖状態として維持する。次に、今や均一な一本鎖状であり、ＳＳＢで被覆されている、鋳型ＤＮＡを、（リン酸化／一本鎖オーバーハングを含有する方向性のあるｄｓＤＮＡ ＮＧＳアダプターとのライゲーション）の二重反応に供する。
フォワードシーケンシングアダプターとリバースシーケンシングアダプターの両方は、同様の構造を共有するが、末端が適切なライゲーションを容易にするために遮断されていない点で異なる。両方のシーケンシングアダプターは、フォワードアダプターのボトム鎖の３プライム末端およびリバースアダプターのボトム鎖の５プライム末端に存在するランダム７塩基対（ｂｐ）一本鎖足場オーバーハングを除いて、ｄｓＤＮＡである。このようにして、フォワード（Ｐ５）ＩＬＬＵＭＩＮＡアダプターを常に鋳型分子の５プライム末端に供給し、リバース（Ｐ７）ＩＬＬＵＭＩＮＡアダプターを常に鋳型分子の３プライム末端に供給する。
二重リン酸化／ライゲーション反応中に、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）は、５プライム末端をリン酸化することおよび３プライム末端を脱リン酸化することにより、ライゲーションのための鋳型ＤＮＡ末端を調製する。Ｔ４ ＰＮＫは、ｓｓＤＮＡ分子とｄｓＤＮＡ分子の両方に効果を発揮し、リン酸化状態のタンパク質に対する活性を持たない。同時に、足場アダプターのランダム塩基が一本鎖鋳型分子にアニールする。これは、短い局在ｄｓＤＮＡ分子を生じさせ、その結果、二本鎖ＤＮＡ鋳型に対するライゲーション効率が高いがｓｓＤＮＡに対する低いライゲーション効率が低いＴ４ ＤＮＡリガーゼでのアダプターへの鋳型のライゲーションが可能になる。単一リン酸化／ライゲーション反応が完了した後、ライブラリーＤＮＡを精製し、単一インデックスプライマーと二重インデックスプライマーの両方に適合する標準的なＮＧＳインデックス付加ＰＣＲに、直接、供する。
ｓｓＰｒｅｐプロトコールの性能
ｓｓＰｒｅｐにより生成されたデータの品質および量を評価するために、ｓｓＰｒｅｐおよび鎖末端ポリッシングｄｓＤＮＡライブラリーキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＮＥＢＮＥＸＴ ＵＬＴＲＡ ＩＩ；市販キットまたはｄｓＰｒｅｐとも呼ぶ）の両方を使用して、２名の健康なヒト個体から得た２つの血清ｃｆＤＮＡ抽出物（試料Ａおよび試料Ｂ）からいくつかのシーケンシングライブラリーを生成した。ライブラリー調製および定量化（図３３Ａおよび３３Ｂ）後、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＨＩＳＥＱ Ｘ（２×１５０ｂｐ）を用いてライブラリーをｃｆＤＮＡ抽出物当たりおよそ４００，０００，０００リードペアまでペアエンドシーケンシングした。同じｃｆＤＮＡ抽出物およびライブラリー調製方法から生成したライブラリーからのシーケンシングデータを解析のために組み合わせた。フォワード配列リードとリバース配列リードを、これらのリードがオーバーラップしている場合にはマージして、元のＤＮＡ断片を表す単一のリードを生成した。ｃｆＤＮＡからの配列リードの大多数は約１６７ｂｐ長であるので、マージしたリード（リード１およびリード２が少なくとも３０ｂｐの相補性によりオーバーラップしていた）のみを、下流の解析に使用した（上記の表４および表５）。生成されたデータによって、ｃｆＤＮＡ抽出物ごとにｓｓＰｒｅｐ試料とｄｓＰｒｅｐ試料の両方についてヒトゲノムの約１５倍のカバレッジを得た。
ｓｓＰｒｅｐおよびｄｓＰｒｅｐ（市販キット）ｃｆＤＮＡにより生成されたライブラリーは、ｃｆＤＮＡ断片に特有の長さ分布特徴を有した。それらは両方とも、１６７ｂｐのクロマトソーム長を中心とする断片長分布を示した。それらは両方とも、より短い断片では、１０．４ｂｐの周期性でヌクレオソーム結合ＤＮＡの露出した副溝のＤＮａｓｅ Ｉによる切断の結果であるのこぎり歯パターンを示した（図２９、パネルＡ；図３４）。しかし、図２９、パネルＡ、およびその挿入図に示すように、２つの調製方法には、異なる断片長で捕捉されたリードの比率はもちろん、のこぎり歯パターンで存在するサブピークの長さ分布にも差があった。ｓｓＰｒｅｐライブラリーには、ｄｓＰｒｅｐに対して、より短い、すなわちヌクレオソーム未満の長さの、リードの存在量がより多く、のこぎり歯パターンでのより短いサブピークがあった。ヌクレオソーム未満のサイズのリードの比率の増加は、短いおよび／またはニックの入ったＤＮＡ断片を配列ライブラリー分子に変換するｓｓＤＮＡ方法の能力の増大を反映していた。理論により制限されるものではないが、ヌクレオソーム未満のピークサイズの差は、ｄｓＤＮＡ方法と比較してネイティブ末端を保持するｓｓＰｒｅｐの能力に起因する可能性が高い。ｄｓＤＮＡライブラリー方法では、５プライムオーバーハングが充填され、３プライムオーバーハングは除去される。したがって、所与のＤＮＡ分子の実測長は、いかなるタイプのオーバーハングが存在するのかに依存することになる。この情報は、ｄｓＤＮＡライブラリー調製に必要とされる末端ポリッシングステップ中に失われる。
ｄｓＰｒｅｐ（市販キット）ライブラリーに対するｓｓＰｒｅｐライブラリーのリードカバレッジ、ＧＣ含有量、および複雑性（ライブラリー内の固有分子の数）を、両方のｃｆＤＮＡ抽出物について比較した。図２９、パネルＢは、ｓｓＰｒｅｐが、ｄｓＰｒｅｐキットのものと同様のカバレッジ倍数を生じさせること、および両方の方法が、比較的均一なゲノムカバレッジを生じさせることを示す。図２９、パネルＣは、ｓｓＰｒｅｐライブラリーのＧＣ含有量が、ヒトゲノム参照（灰色でプロットされたヒストグラム）のものを反映するｄｓＰｒｅｐキットのものと同様であることを示す。低いＧＣ含有量の領域で示される、ｓｓＰｒｅｐとｄｓＰｒｅｐ間の差は、インデックスＰＣＲ中に使用したポリメラーゼ（ＮＥＢ Ｑ５対ＫＡＰＡ ＨＩＦＩ ＨＳ ＲＭ）の相違の結果であり得るか、またはｓｓＰｒｅｐ足場アダプターのランダム部分の合成におけるＧＣリッチの偏りの結果であり得る。図２９、パネルＤは、３００，０００，０００リードのシーケンシング深度、またはおよそ１のＨＩＳＥＱシーケンシングレーンで、ｓｓＰｒｅｐライブラリーがｄｓＰｒｅｐライブラリーよりも高度な分子複雑性を有すると推定されることを示す。理論により制限されるものではないが、この差は、旧来のｄｓＤＮＡライブラリー調製により失われるニックの入った鎖およびｓｓＤＮＡ鎖を回復させるｓｓＰｒｅｐの能力の現れであり得る。
この実施例で使用するｄｓＰｒｅｐキットを含む大部分のｄｓＤＮＡライブラリー調製は、投入ＤＮＡ分子に対して末端ポリッシングを行なう。ｓｓＰｒｅｐ方法は、ＤＮＡ断片のネイティブ末端にシーケンシングアダプターを供給するため、各ＤＮＡ断片の正確な５プライムおよび３プライム末端のならびにその周辺の塩基組成を、単一ヌクレオチド分解能で調査することができる。末端ポリッシング手順が、分子のネイティブ５プライム末端を保持することに留意されたい。しかし、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼの５プライムオーバーハング「フィルイン」および３プライムオーバーハングエキソヌクレアーゼ活性は、どちらかのタイプのオーバーハングが存在する場合、元の分子に代表的なものではない３プライム末端を生じさせる。このように、末端ポリッシング手順は、相補鎖の５プライム末端に存在するものをすべての３プライム末端に反映させることが期待される。
ＤＮＡ末端情報の差を試験するために、出発座標にわたって位置ごとの塩基組成を、ｓｓＰｒｅｐおよびｄｓＰｒｅｐ両方のｃｆＤＮＡライブラリーの、マージしたリードデータセットから推測した、フォワードリード（リード１）およびリバースリード（リード２）の両方について比較した（図２９、パネルＥ）。４つの注目に値する発見があった。第１に、ｓｓＰｒｅｐとｄｓＰｒｅｐの両方について、各リードの開始時および生物学的断片化箇所の上流に平均的塩基組成からの有意な逸脱があった。第２に、ｄｓＤＮＡライブラリーデータとは異なり、ｓｓＰｒｅｐライブラリーではフォワードリードの開始およびリバースリードの開始の平均的塩基組成が異なる。これは、ｃｆＤＮＡ断片が、ｄｓＤＮＡライブラリー調製の末端ポリッシングステップ中に改変されるオーバーハングを含有することが多いことを示す。第３に、ｄｓＰｒｅｐライブラリーにおけるフォワードリードの開始の平均的塩基組成は、リバースリードの開始の平均的塩基組成のまさに逆補体であった（ｄｓＰｒｅｐは、末端ポリッシングの副産物である一様に平滑末端化されている分子を生成する）。最後に、ｓｓＰｒｅｐライブラリーにおけるフォワードリードの開始の平均的塩基組成は、ｄｓＰｒｅｐライブラリーとほぼ同一であった（末端ポリッシングは、ｓｓＰｒｅｐ直接ライゲーション手順のようにネイティブ５プライム末端を保持する）。
ｓｓＰｒｅｐの特徴の評定
５プライムおよび３プライムオーバーハング
５プライムおよび３プライム末端におけるｃｆＤＮＡの塩基組成の相違を考えて、ｓｓＰｒｅｐ方法、およびＮＥＢＮＥＸＴ ＵＬＴＲＡ ＩＩのようなｄｓＤＮＡライブラリー調製方法が、投入ＤＮＡ断片を変えることになる（または変えることにならない）のかどうかを試験するための実験を設計した。特定の長さおよびタイプの（５プライムまたは３プライム）オーバーハングを各々が有する、１２の合成二重鎖オリゴのプールを等モル濃度で構築した。各二重鎖は、各オーバーハングタイプに固有の、５０ヌクレオチド（ｎｔ）コア配列を含有し、一方の側に平滑末端および他方の側に特定の長さのランダム配列（１～６ｎｔ）の５プライムまたは３プライムオーバーハングという、共通の構造を有した（図３０、パネルＡ；表１）。
オリゴのこのプールをｃｆＤＮＡ抽出物にスパイクすることにより、ｓｓＰｒｅｐおよびｄｓＰｒｅｐライブラリーを生成した。シーケンシングデータから、各オリゴの既知の固有の５０ｎｔコア配列を含有する参照ファイルにライブラリーをマッピングすることにより、オリゴプールに由来するリードを特定した。オーバーハングを含む、プール内の各オリゴについて、あらゆる位置におけるカバレッジの深度を計算した。結果（図３０、パネルＢ）は、ｓｓＰｒｅｐが、オーバーハング領域にわたって合成オリゴの二本鎖領域と比較して低減されたカバレッジを生じさせたことを示し、これは、この方法が、投入ＤＮＡを正確に特徴付ける鎖データを生じさせることができることを例証する。対照的に、ｄｓＰｒｅｐにより生成されたライブラリーは、末端ポリッシングの結果を実証した。５プライムオーバーハングをフィルインし、その結果、既知５プライムオーバーハングを有する分子の相補鎖についてほぼ完全なカバレッジを得た。その一方で、３プライムエキソヌクレアーゼ活性は、３プライムオーバーハング配列の、それが存在した場合、ほぼ完全な喪失を引き起こした。
一本鎖オリゴライブラリー
定義された範囲の投入ＤＮＡ鋳型長でのｓｓＰｒｅｐの効率を試験するために、１０ｎｔ長間隔で２０～１２０ヌクレオチドの範囲の長さの１１の一本鎖オリゴ（標準的な脱塩精製）１セット（表２）を設計した。等モル濃度の各々を使用してプールを作製し、このプールからｓｓＰｒｅｐライブラリーを生成した。これらのライブラリーのシーケンシングからの鋳型長の比率の解析は、ｓｓＰｒｅｐプロトコールがこの長さ範囲にわたってｓｓＤＮＡライブラリーを生成することを示した（図３１、パネルＡ）。対照として、一本鎖オリゴのこのプールからｄｓＰｒｅｐライブラリーを生成することを試みた。このプロトコールは、排他的に一本鎖投入ＤＮＡの鋳型を使用してライブラリーを生成することが全くできなかった（ライブラリーは、アダプターダイマーを含有したが、予想されたサイズ分布で検出可能な収量を有さなかった）。
ｓｓＰｒｅｐデータ解析からいくつかの特筆すべき観察結果があった。第１に、最も短い被検オリゴ（２０ｎｔおよび３０ｎｔ長）は、ライブラリー内で十分提示されなかった。これは、このサイズ範囲のＤＮＡオリゴに対する長さの偏りがある、ライゲーション後のビーズクリーンアップステップに起因する可能性が高かった。第２に、より長い（＞＝４０ｎｔ）被検オリゴ間にライブラリー変換効率の多少のばらつきがあった。このばらつきは、各長さについて単一の固定された配列である被検オリゴにおけるわずかな偏りに起因する可能性が高い。最後に、投入オリゴ長に対応しないオリゴ長の連続バックグラウンド部分が観察され、２０～１２０の間のあらゆる長さの少なくともいくつかのリードが観察された。
予想外の長さのこれらのリードが、短縮され、不完全なオリゴの合成に起因するのか、またはより長い一本鎖オリゴの不安定な破断に起因するのかを試験するために、ｓｓＰｒｅｐライブラリーにおけるすべてのリードをそれらのそれぞれのオリゴ参照にマッピングした（図３１、パネルＢ；下記表６）。短縮産物は、オリゴごとに存在した。これらの短縮化ＤＮＡ断片は、オリゴ長にわたってほぼ均一に分布している長さを有した。各オリゴにマッピングする正しい完全長リードの分率が、オリゴ長に応じて減少した。このような観察は、オリゴ合成のホスホロアミダイト方法の限界を示す。これらの観察は、ヌクレオチド組込みが化学的な塩基付加サイクル各々における効率が１００％に満たないモデルと一致する。
Figure 2022528139000009
ｓｓＰｒｅｐが、様々な精製方法に付したオリゴの純度を評定することができるかどうかを試験するために、標準的な脱塩、ＨＰＬＣおよびＰＡＧＥ精製という３つの一般的スキームを使用して６０ｎｔオリゴを精製した。３つすべての精製方法からの６０ｎｔオリゴを使用して、２重反復でｓｓＰｒｅｐライブラリーを構築した。６０ｎｔ参照配列への配列データのマッピング（図３１、パネルＣ）は、標準的な脱塩オリゴから生成されたライブラリーと比較して、予想完全長配列に起因すると考えられるリードの比率がＨＰＬＣ精製オリゴライブラリーにおいてもＰＡＧＥ精製オリゴライブラリーにおいても増加し、その一方で、長さが６０ｎｔ未満のリードと定義した短縮産物が減少することを示した。これらの結果は、ホスホロアミダイト合成に基づく各精製方法の予測品質（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ）と一致し、ｓｓＰｒｅｐを、化学合成されたＤＮＡオリゴの純度を判定するための単純かつ高感度のアッセイとして使用することができることを示す。
ｓｓＰｒｅｐ ｃｆＤＮＡライブラリーの解析
ｃｆＤＮＡ断片の大多数は、ヌクレオソームの周りに巻き付いているＤＮＡ（細胞死中にヌクレアーゼ分解からのＤＮＡを保護する構成）に由来する。したがって、ｃｆＤＮＡ断片のこのゲノムマップ位置を使用して、ｃｆＤＮＡ分子の集団を生じさせた組織内のヒストンおよび他のＤＮＡ結合タンパク質の位置を推測することができる。この実施例で説明するｓｓＰｒｅｐのような、一本鎖ＤＮＡライブラリー方法は、これらのタンパク質がＤＮＡをエンドヌクレアーゼ活性から保護するので、ｃｆＤＮＡ断片のネイティブ末端を保持し、したがって、ヒストンおよび他のＤＮＡ結合タンパク質の位置の推測に最大限に有用である。２名の健康な個体（試料Ａおよび試料Ｂ）からのｓｓＰｒｅｐデータを組み合わせて３０倍のゲノムカバレッジ代表値を得た。これらのデータから、ヌクレオソームおよび他のＤＮＡ結合タンパク質の位置取りの態様を明らかにするｓｓＰｒｅｐライブラリーの能力を調査した。
ヌクレオソーム位置取りは、ゲノムにより少なくとも部分的にコードされる。ヒストンに結合しているＤＮＡの場合、Ａ／Ｔジヌクレオチドは、一般に、副溝がヒストンの方を向いているときに有利であり、Ｇ／Ｃジヌクレオチドは、一般に、副溝が外側に向いているときに有利である。したがって全体として解析した場合、ヌクレオソームにより保護されたＤＮＡに由来するＤＮＡ断片は、周囲のゲノム領域と比較して、捕捉された断片内にＡ／ＴリッチおよびＧ／Ｃ枯渇領域、その直後に続くＧ／ＣリッチおよびＡ／Ｔ枯渇領域という、周期変動パターンを有するはずである。この周期変動パターンがｓｓＰｒｅｐデータに存在するかどうかを試験するために、３つの断片長１６７、１４４および８３ｂｐの分子におけるＡ／ＴおよびＧ／Ｃゲノムジヌクレオチドを、これら３つのリード長の各々についての上流および下流の塩基１００ｎｔを含めて、調査した（図３２、パネルＡ）。各々が配列の中点を中心とするものであった。述べたように、１６７ｂｐは、ヌクレオソームコア粒子の周りに巻き付いているＤＮＡと付随するリンカー領域の長さに相当し、１４４ｂｐは、ヌクレオソームコア粒子の周りに巻き付いているＤＮＡの長さのみを表し、８３ｂｐは、ヌクレオソーム関連ＤＮＡに由来する分解産物を表し得る。
周囲のゲノム領域と比較して、シーケンシングした分子長の中にＡ／ＴおよびＧ／Ｃジヌクレオチドの周期変動濃縮が観察された。８３ｂｐ断片長の上流約５５ｂｐの強い周期変動シグナルも観察され、これは、これらの分子が、分解したヌクレオソーム関連ＤＮＡに由来する可能性が高いことを示していた。ｄｓＰｒｅｐ方法の定義された断片長の中でのこのジヌクレオチドの周期変動も観察された（図３２、パネルＣ）。しかし、ｄｓＰｒｅｐデータについては８３ｂｐ断片長における上流の周期変動シグナルが観察されなかった。これは、ｄｓＤＮＡ調製方法における短い断片の低い回収率、または断片化されたもしくはニックの入ったＤＮＡをシーケンシングライブラリーに変換するｄｓＤＮＡ調製の能力の他の相違に起因し得る。
ジヌクレオチド媒介ヒストン巻き付きのさらなる特徴は、副溝に到達可能である場合にＤＮａｓｅ Ｉ媒介ニッキングが起こることである。この現象は、ヌクレオソーム関連断片の末端におけるＧ／Ｃジヌクレオチドの特異的濃縮をもたらす（図３２、パネルＡ～Ｄ）。ｄｓＤＮＡ末端ポリッシングステップに起因して、ｄｓＰｒｅｐデータの５プライムおよび３プライム末端の末端プロファイルは、互いの鏡像であった（図３２、パネルＤ）。ｓｓＰｒｅｐとｄｓＰｒｅｐ間に相当な差がある３プライム末端におけるジヌクレオチド出現頻度は、多様なオーバーハングのかなりの集団が、ヌクレオソーム関連ｃｆＤＮＡ断片の集団内に存在することを示す（図３２、パネルＢおよびＤ）。
次に、ヌクレオソームの位置取りを、ウインドウ保護スコア（ＷＰＳ）を使用して調査した。ＷＰＳは、ゲノム内の位置が、エンドヌクレアーゼ活性から保護される傾向があるのか、またはエンドヌクレアーゼ活性が強化される傾向があるのかについての測度である。ＷＰＳは、所与の位置に及ぶ（それ故、切断されなかった）リードの数の、その位置で始まるまたは終わる（それ故、切断された）リードの数に対する関数である。正規化されたＷＰＳを、第１２染色体上のよい位置にあるヌクレオソームから構成される領域におけるｓｓＰｒｅｐデータを使用して計算した。代替的ｓｓＤＮＡライブラリープロトコールを使用する以前の結果とＷＰＳ結果を比較すると、ピークおよびトラフの位置に関して良好な一致が観察された（図３２、パネルＥ；包括的ピアソン相関（Overall Pearons Correlation）：ｒ＝０．８０、ｐ＜０．０００１）。
転写因子ＣＴＣＦについての実験により決定した結合部位の上流１ｋｂまたは下流１ｋｂ以内のロングサイズのビン（１２０～１８０ｂｐ、ヒストン保護に由来すると考えられる断片長の範囲）およびショートサイズのビン（３５～８０ｂｐ、他のＤＮＡ結合タンパク質により保護された断片を多く含むと考えられる）に長さが分類される断片について正規化されたＷＰＳを計算することにより、ｓｓＰｒｅｐデータの第２のＷＰＳ検証を行なった（図３２、パネルＦ）。ＣＴＣＦは、結合されるヒストンを遮蔽し、上流および下流に位置するヒストンを編成する、ＤＮＡ結合タンパク質である。長い断片ＷＰＳは、推定的ＣＴＣＦ結合部位（０位）を中心とするくぼみと、よい位置にあるヌクレオソームを示す、約１８０ｂｐの周期性での外側に両方向に広がる周期変動パターンとを示した。短い断片結果は、エンドヌクレアーゼ活性からのＣＴＣＦ保護に恐らく起因する、推定的ＣＴＣＦ結合部位を中心とする強いピークを示した。上流および下流の、より小さい振幅の周期変動は、ヌクレオソーム以外のＤＮＡ結合タンパク質の非存在と一致した。
（実施例５）
無細胞ＤＮＡ用のｓｓＰｒｅｐキット
この実施例では、一本鎖無細胞ＤＮＡからＮＧＳライブラリーを調製するためのキットを説明する。ｓｓＰｒｅｐキットのワークフローの例を図３６に示す。
無細胞ＤＮＡ用のｓｓＰｒｅｐキットの特徴としては、以下のことが挙げられる：二重鎖ＤＮＡ回復ならびに鎖調製によって失われる一本鎖およびニックの入った二重鎖ＤＮＡ；１ｎｇの低い投入量によって複雑なライブラリーが生成され、貴重な試料が節約される；単一の反応によって、過失に起因する失敗が低減され、ベンチタイムが短縮される；末端ポリッシングがないことにより、すべてのＤＮＡ断片の天然末端が保存される；短い断片長のより優れた回収率；下流のデータトリミングがないことにより、パイプライン互換性が保証される；３時間足らずでＤＮＡからシーケンシング対応Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ライブラリーへ；各キットが、ライブラリー調製、インデックス付加ＰＣＲおよびビーズ精製のための試薬を提供する；単一および二重インデックス付加、ならびに固有分子識別子（ＵＭＩ）組込みに利用可能な選択肢；５０ｐｇ／μｌほども低い投入濃度での１ｎｇの無細胞ＤＮＡ向けに最適化されている；ならびに最適化されたマスターミックスおよび最小限のピペット操作ステップによって予定の時間でのわずかな労力が保証される。ｓｓＰｒｅｐキットの下流の応用としては、エキソームシーケンシング、パネル濃縮、ヌクレオソーム位置取り、ＳＮＰコーリング、および新規発見が挙げられる。ｓｓＰｒｅｐキットが役立つ分野としては、液体生検、腫瘍学、出生前検査、および移植医療が挙げられる。
血漿および他の体液中での循環が見られる無細胞ＤＮＡは、大量の臨床的に意義のある生体情報を含有し、低侵襲手順によって回収することができる。ｃｆＤＮＡから得られるＮＧＳデータは、細胞生物学のいくつかの態様、例えば、出生前の健康状態、臓器移植受入れまたは拒絶、がん検出および進行、ならびに多数の他の疾患を明らかにすることができる。
血漿ｃｆＤＮＡから抽出されたＤＮＡ断片の大多数は、長さおよそ１６７塩基対（ｂｐ）を中心とするものであり、多くの場合、ヌクレアーゼ分解から保護されるヒストン単量体結合ＤＮＡの結果である。加えて、血漿に由来するｃｆＤＮＡは、転写因子のフットプリントを保有する有益な少数のショートサイズの長さのＤＮＡ断片（３０～１００ｂｐ）、他のＤＮＡ結合タンパク質、ミトコンドリアＤＮＡ、および微生物由来のＤＮＡを含有し、これらのすべてが、ｃｆＤＮＡ配列データに詳細を加える（図３７）。
一本鎖ライブラリー調製方法の恩恵は、ｄｓＤＮＡ調製よりも（１）短い、大きく損傷した断片および（２）多様なＤＮＡ分子を、二重鎖ＤＮＡ鎖を喪失することなく、捕捉する能力を含む。しかし、これらの有利な点にもかかわらず、ＮＧＳコミュニティーによる幅広い利用は、旧来のｄｓＤＮＡ方法よりも時間がかかり、新奇または単一源酵素を必要とし、一部の事例ではシーケンシングアーチファクトを生じさせる、既存の一本鎖ＤＮＡライブラリー調製方法およびキットにより妨げられてきた。
この実施例で説明するｓｓＰｒｅｐキットは、鋳型分子のネイティブ末端に変更を加えることなく、１ｎｇの投入ｃｆＤＮＡから複雑なライブラリーを生成するように設計されている、単純かつ効率的な、ライゲーションに基づく、一本鎖ＤＮＡライブラリー調製方法である。ｓｓＰｒｅｐは、旧来のｄｓＤＮＡキットの収量、複雑性および調製時間に匹敵するものであるが、ｄｓＤＮＡキットが提供できない追加情報、例えば、短い断片のカバレッジ向上およびネイティブ末端の保持を、すべて単一の反応で提供する（図３８）。
ｓｓＰｒｅｐライブラリーは高いＤＮＡ収量をもたらす
インデックス後のライブラリー収量は、ライブラリー成功の測度であり、総合的変換性能の間接的測定値である。ｓｓＰｒｅｐは、高いＤＮＡ収量を戻して、シーケンシングおよびシーケンシング前の下流の濃縮に関するユーザーの自由度を大幅に改善する（図３９）。
ｓｓＰｒｅｐライブラリーマッピング率および短い断片の保持
ｓｓＰｒｅｐ ｃｆＤＮＡライブラリーのマッピング性能は、市場に出ている最良の市販キットと比肩する。ｓｓＰｒｅｐは、短い挿入物（３０～１００ｂｐ）に関するリードのより高いパーセンテージを捕捉して研究者が短いｃｆＤＮＡ断片にコードされた価値のある生物学を利用するのに役立つ点で、他の市販キット以上の働きをする（図４０および４１を参照されたい）。
ｓｓＰｒｅｐライブラリー、マッピングされる挿入物の長さの詳細、生体シグナル
ｓｓＰｒｅｐライブラリーは、約１６７ｂｐにおけるヒストン単量体を中心とする顕著な断片長分布と、ヌクレオソーム結合ＤＮＡの露出した副溝のＤＮａｓｅ Ｉによる切断の結果である可能性が高い１０．４ｂｐの周期性を明示するのこぎり歯パターンとを明らかに示す、標準ｃｆＤＮＡ分子長プロファイルを生じさせる。ｓｓＰｒｅｐは、それ自体がｄｓＤＮＡ調製とは（１）比率が増したヌクレオソーム未満のサイズの断片を捕捉し、短いＤＮＡ断片を保持するその能力の点、および（２）ＤＮＡ末端ポリッシングステップを省略してネイティブＤＮＡ末端を回復させ、その結果、ｄｓＤＮＡ対応物よりわずかに短い副ピークにより実証されるような真の断片長プロファイルを明らかにする点で、区別される（図４２Ａ）。ｓｓＰｒｅｐまたはｄｓＤＮＡ方法とは異なり、Ｓｗｉｆｔ Ａｃｃｅｌ ＮＧＳ １Ｓ Ｐｌｕｓデータは、その調製プロセス中に非鋳型ヌクレオチドを加えることに起因して、マッピングの前にリードのトリミングを必要とする。これは、生体シグナル（のこぎり歯パターンなし）を消滅させもし、人工的に挿入物分布をより小さくシフトさせもする（図４２Ｂ）。
ｓｓＰｒｅｐは複雑なライブラリーを生成する
ｓｓＰｒｅｐは、ライブラリー複雑性を犠牲にすることなくネイティブ末端を保持する。ｓｓＰｒｅｐは、末端ポリッシングを必要とすることなく、市場に出ている最良の市販キットと比肩する複雑なライブラリーを１ｎｇの投入量から生成する（図４３を参照されたい）。
ｓｓＰｒｅｐライブラリーは均一ＧＣカバレッジをもたらす
ライブラリー品質のもう１つの測度は、ＧＣスペクトルにわたってのカバレッジである。ｓｓＰｒｅｐは、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩキットのものと同様の比での低ＧＣリッチ領域におけるゲノムカバレッジ、ヒトゲノムＧＣ含有量ビンの大部分にわたってのほぼ均一なカバレッジ、および他のキットと比較して高いＧＣ含有量を有するエリアのカバレッジ向上を示す（図４４を参照されたい）。
ｓｓＰｒｅｐはｃｆＤＮＡの生物学的発見を助長する
無細胞ＤＮＡは、原発組織調査、発現相関関係、およびがんの進化などの、多数の生体シグナルを活用するために利用することができる、ヌクレオソーム位置取り情報を含有する。第１２染色体からよい位置にあるヌクレオソームの強力に保存される領域についてのｓｓＰｒｅｐ ｃｆＤＮＡライブラリーからの正規化されたウインドウ保護スコア（ＷＰＳ）を図４５に示す。この正弦曲線は、順序付けられたヌクレオソーム位置取りを示し、ピークは、ｃｆＤＮＡ断片のヌクレオソーム保護が最も強い位置にある。
局在ジヌクレオチド組成は、ヌクレオソームの回転の位置取りに重要である。Ｇ／ＣジヌクレオチドとＡ／Ｔジヌクレオチドの間の定期的周期変動は、ＤＮＡによるヒストン巻き付きを助長する。さらに、ＤＮａｓｅ ＩによるＤＮＡニッキングは、副溝が、外側に向いており、Ｄｎａｓｅ Ｉに到達可能である場合に存在するので、Ｇ／Ｃリッチジヌクレオチド領域で発生する。ｓｓＰｒｅｐライブラリーは、図４６におけるリード長の中での周期変動頻度および断片終端点でのＧ／Ｃ二分染色体の濃縮から分かるように、ヌクレオソーム位置取りのこれらの特徴を保存する。
（実施例６）
核酸断片サイズ濃縮
上記のある特定の実施例で説明した一本鎖ライブラリー調製方法の一部の変形形態では、ライゲーション産物（例えば、本明細書に記載する足場アダプター（またはその成分）にライゲーションした一本鎖試料断片）を、ＳＰＲＩ精製を使用して増幅の前に精製する。この実施例で説明する一部の変形形態では、ＳＰＲＩ精製の前に、ある特定の量の溶出用緩衝液（ＥＢ；すなわち、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液）を使用してライゲーション産物の体積を増加させる。一部の変形形態では、緩衝液の体積をイソプロパノールで置き換えて、より小さい断片の保持を増加させた。精製ステップのこの部分でイソプロパノールを添加することにより、アダプターアーチファクト（例えば、アダプターダイマー）の排除について妥協することなく、分解ＤＮＡ（例えば、分解ヒトＤＮＡ）サイズ分布の下端でのきめの細かいカットオフが可能になる。最小のヒト断片を回収しようとしてさほど厳密でないＳＰＲＩ精製を行なえば、より多くのアダプターアーチファクトが回収される。イソプロパノールの様々な増加量（例えば、２μｌ、５μｌ）を使用して、所望のサイズ分布に合わせることができる。
２５歳の毛髪の分解試料から得た１５０ｐｇのＤＮＡからライブラリーを生成した。ライゲーション後のＳＰＲＩビーズ精製ステップ中に、次のプロトコールに従って、イソプロパノールを、ある特定の緩衝液－試料混合物に添加した：
１）５０μｌのＥＢを各反応物に添加するか、またはＥＢ体積の一部分をイソプロパノールで置き換える（より高い比率の小さい断片の保持するために）
２）７２．６μｌの１８％ＰＥＧ ＳＰＲＩビーズ溶液（すなわち、５０μｌの試料については、１８％ＳＰＲＩビーズの試料に対する１．２×比）を添加し、ＳＰＲＩ精製を行なう
３）２０μｌのＥＢで溶出する
精製されたライゲーション産物を、５０μｌのＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤを使用するＰＣＲにより増幅させ、増幅産物を、１．２×でのＳＰＲＩビーズ精製を使用して精製した。ＰＣＲ後の精製は、１８％ＳＰＲＩビーズ（ＳＰＲＩ溶液中１８％ＰＥＧ）を使用する１．２×での精製であった。ライゲーション後の精製は、１．０１× ｖ／ｖ比での精製であった（７２．６ｕｌの１８％ＳＰＲＩによって７５ｕｌの最終反応体積を得た）。一般に、ライゲーション後の精製におけるＰＥＧの最終濃度は、ライゲーション産物が既にＰＥＧを含有していたので、この実施例では約１２％であった。
図４８Ａ～図４８Ｄは、ＰＣＲ増幅および１．２×１８％ＳＰＲＩ精製の後のＤＮＡライブラリーのトレースを示す。各トレースは、増幅の前に使用したライゲーション後のＳＰＲＩ条件に基づいて異なる。図４８Ａ～図４８Ｄおよび図４９Ａ～図４９Ｅに示されている断片サイズ分布は、ＥＢ（すなわち、Ｔｒｉｓ緩衝液）にスパイクした異なる体積のイソプロパノールで保持された断片に関するシフトを示す。詳細には、１００～１４８ｂｐの間のピークは、イソプロパノールの増加に伴って比例的に高く維持されるが、１４８～３５０のピークは、比例的に減少し、断片サイズ代表値を低下させる。１つの観察結果は、ある特定の条件下でのアダプターダイマー保持の増加である。例えば、図４８Ａは、２５μｌのライゲーション産物に添加した５０μｌのＴｒｉｓ緩衝液でのライゲーション後ＳＰＲＩ精製（７２．６μｌの１８％ＳＰＲＩ）の後の、１４．８％アダプターダイマーと、２０６ｂｐの断片長代表値と、６０．７ｎｍｏｌ／μｌの増幅されたライゲーション産物（アダプターダイマーを含まない）濃度とを有する、増幅されたＤＮＡライブラリーを示す。図４８Ｂは、２５μｌのライゲーション産物に添加した２５μｌのイソプロパノールおよび２５μｌのＴｒｉｓ緩衝液でのライゲーション後ＳＰＲＩ精製（７２．６μｌの１８％ＳＰＲＩ）の後の、２６．４％アダプターダイマー、１９７ｂｐの断片長代表値、および２８．５ｎｍｏｌ／μｌの増幅されたライゲーション産物濃度を示す。図４８Ｃは、２５ｕｌのライゲーション産物に添加した５０μｌのイソプロパノールでのライゲーション後ＳＰＲＩ精製（７２．６μｌの１８％ＳＰＲＩ）の後の、２６．９％アダプターダイマー、１９３ｂｐの断片長代表値、および２７．８ｎｍｏｌ／μｌの増幅されたライゲーション産物濃度を示す。図４８Ｄは、２５μｌのライゲーション産物に添加した５０μｌのＴｒｉｓ緩衝液でのＳＰＲＩ精製（７２．６μｌの３８％ＰＥＧ）を使用して精製したライゲーション産物についての、２７．８％アダプターダイマー、１９２ｂｐの断片長代表値、および３２．８ｎｍｏｌ／μｌを示す。
別の実験では、新鮮な毛髪試料から得た１５０ｐｇのＤＮＡからライブラリーを生成した。この実験についてのある特定のパラメーターは、アダプターＨｙｂ＝１：１．４（Ａｄ：Ｓｐ）；Ｐ５＝１．６ｐ ｒＳＡＰ；Ｐ７＝０．４ｐホスホ、ｒＳＡＰなし；ＳＳＢ＝６４ｎｇを含んだ。二本鎖アダプターの調製中に、Ｐ５アダプターのトップ鎖をＰ５アダプターの足場鎖に１：１．４の比でアニールし（すなわち、より多くの足場鎖をアニーリング中に付加させる）、Ｐ７アダプターのトップ鎖をＰ７アダプターの足場鎖に１：１．４の比でアニールした。１．６ｐｍｏｌの非リン酸化Ｐ５アダプターおよび０．４ｐｍｏｌのリン酸化Ｐ７アダプターを添加した。アダプターライゲーションステップの前に、ＤＮＡ鋳型を６４ｎｇのＳＳＢと併せた。ライゲーション後のＳＰＲＩビーズ精製ステップ中に、次のプロトコールに従って、イソプロパノールを、ある特定の緩衝液－試料混合物に添加した：
１）５０μｌのＥＢを各反応物に添加するか、またはＥＢ体積の一部分をイソプロパノールで置き換える（より高い比率の小さい断片を保持するために）
２）７２．６μｌの１８％ＰＥＧ ＳＰＲＩビーズ溶液を添加し、ＳＰＲＩ精製を行なう
３）２０μｌのＥＢで溶出する
精製されたライゲーション産物を、１００μｌのＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤを使用するＰＣＲ（１６サイクル）により増幅させ、増幅産物を、１．２×での１８％ＰＥＧ ＳＰＲＩビーズ精製を使用して精製した。ＰＣＲ後の精製は、１８％ＳＰＲＩビーズ（ＳＰＲＩ溶液中１８％ＰＥＧ）を使用する１．２×での精製であった。ライゲーション後の精製は、１．０１× ｖ／ｖ比での精製であった（７２．６ｕｌの１８％ＳＰＲＩによって７５ｕｌの最終反応体積を得た）。一般に、ライゲーション後の精製におけるＰＥＧの最終濃度は、ライゲーション産物が既にＰＥＧを含有していたので、この実施例では約１２％であった。
図４９Ａ～図４９Ｅは、ＰＣＲ増幅および１．２×１８％ＳＰＲＩ精製の後のＤＮＡライブラリーのトレースを示す。各トレースは、増幅の前に使用したライゲーション後のＳＰＲＩ条件に基づいて異なる。図４９Ａ～図４９Ｅに示されている断片サイズ分布は、ＥＢ（すなわち、Ｔｒｉｓ緩衝液）にスパイクした異なる体積のイソプロパノールで保持された断片に関するシフトを示す。図４９Ａは、２５ｕｌのライゲーション産物に添加した５０μｌのＴｒｉｓ緩衝液でのＳＰＲＩ精製（７２．６μｌの１８％ＳＰＲＩ）を使用して精製したライゲーション産物についての、１．１６％アダプターダイマーおよび２６３ｂｐの断片長代表値を示す。図４９Ｂは、カラム精製を使用して精製したライゲーション産物についての６．１３％アダプターダイマーおよび２３２ｂｐの断片長代表値を示す。図４９Ｃは、２５ｕｌのライゲーション産物に添加した５μｌのイソプロパノールおよび４５μｌのＴｒｉｓ緩衝液でのＳＰＲＩ精製（７２．６μｌの１８％ＳＰＲＩ）を使用して精製したライゲーション産物についての、１．２６％アダプターダイマーおよび２５６ｂｐの断片長代表値を示す。図４９Ｄは、２５ｕｌのライゲーション産物に添加した１０μｌのイソプロパノールおよび４０μｌのＴｒｉｓ緩衝液でのＳＰＲＩ精製（７２．６μｌの１８％ＳＰＲＩ）を使用して精製したライゲーション産物についての、１．６６％アダプターダイマーおよび２３６ｂｐの断片長代表値を示す。図４９Ｅは、２５ｕｌのライゲーション産物に添加した２０μｌのイソプロパノールおよび３０μｌのＴｒｉｓ緩衝液でのＳＰＲＩ精製（７２．６μｌの１８％ＳＰＲＩ）を使用して精製したライゲーション産物についての、７．５３％アダプターダイマーおよび２２７ｂｐの断片長代表値を示す。
この実験についての断片長代表値、アダプターダイマーパーセント、および増幅後の収量（濃度）を下の表７に提供する。
Figure 2022528139000010
さらなる実験では、新鮮な毛髪試料から得た１５０ｐｇのＤＮＡからライブラリーを生成した。この実験についてのある特定のパラメーターは、アダプターＨｙｂ＝１：１．４（Ａｄ：Ｓｐ）；Ｐ５＝１．６ｐ ｒＳＡＰ；Ｐ７＝０．４ｐホスホ、ｒＳＡＰなし；ＳＳＢ＝６４ｎｇを含んだ。二本鎖アダプターの調製中に、Ｐ５アダプターのトップ鎖をＰ５アダプターの足場鎖に１：１．４の比でアニールし（すなわち、より多くの足場鎖をアニーリング中に付加させる）、Ｐ７アダプターのトップ鎖をＰ７アダプターの足場鎖に１：１．４の比でアニールした。１．６ｐｍｏｌの非リン酸化Ｐ５アダプターおよび０．４ｐｍｏｌのリン酸化Ｐ７アダプターを添加した。アダプターライゲーションステップの前に、ＤＮＡ鋳型を６４ｎｇのＳＳＢと併せた。ライゲーション後のＳＰＲＩビーズ精製ステップ中に、次のプロトコールに従って、イソプロパノールを緩衝液－試料混合物に添加した：
１）各反応について７５μｌの総体積のために様々な量のイソプロパノールおよびＥＢを２５μｌの試料に添加する
２）７２．６μｌの１８％ＰＥＧ ＳＰＲＩビーズ溶液を添加し、ＳＰＲＩ精製を行なう
３）２０μｌのＥＢで溶出する
精製されたライゲーション産物を、１００μｌのＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤを使用するＰＣＲ（１５サイクル）により増幅させ、増幅産物を、１．２×での１８％ＰＥＧ ＳＰＲＩビーズ精製を使用して精製した。ＰＣＲ後の精製は、１８％ＳＰＲＩビーズ（ＳＰＲＩ溶液中１８％ＰＥＧ）使用する１．２×での精製であった。ライゲーション後の精製は、１．０１× ｖ／ｖ比での精製であった（７２．６ｕｌの１８％ＳＰＲＩによって７５ｕｌの最終反応体積を得た）。一般に、ライゲーション後の精製におけるＰＥＧの最終濃度は、ライゲーション産物が既にＰＥＧを含有していたので、この実施例では約１２％であった。
この実験についての断片長代表値、アダプターダイマーパーセント、および増幅後の収量（濃度）を下の表８に提供する。
Figure 2022528139000011
（実施例７）
実施形態の例
Ａ１．核酸ライブラリーを生成する方法であって、
（ｉ）一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を含む核酸組成物と、（ｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドと、（ｉｉｉ）複数の第１の足場ポリヌクレオチド種とを結合させるステップを含み、
（ａ）複数の第１の足場ポリヌクレオチド種における各ポリヌクレオチドが、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含み；
（ｂ）核酸組成物、第１のオリゴヌクレオチド、および複数の第１の足場ポリヌクレオチド種が、第１の足場ポリヌクレオチド種の分子が（ｉ）第１のｓｓＮＡ末端領域および（ｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドの分子とハイブリダイズされる条件下で結合され、それによって、第１のオリゴヌクレオチドの分子の末端が第１のｓｓＮＡ末端領域の末端に隣接しているハイブリダイゼーション産物が形成される、方法。
Ａ１．１ 結合させるステップの前に、第１のオリゴヌクレオチドおよび／または複数の第１の足場ポリヌクレオチド種と、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、第１のオリゴヌクレオチドおよび／または複数の第１の足場ポリヌクレオチド種が脱リン酸化される条件下で接触させるステップをさらに含み、それによって、脱リン酸化された第１のオリゴヌクレオチドおよび／または脱リン酸化された第１の足場ポリヌクレオチド種が生成される、実施形態Ａ１の方法。
Ａ２．結合させるステップの前に、第１の足場ポリヌクレオチド種の各々が、第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされて複数の第１の足場二重鎖種を形成する、実施形態Ａ１またはＡ１．１の方法。
Ａ３．複数の第１の足場二重鎖種が、ｓｓＮＡと、約３０：１の（第１の足場二重鎖種のｓｓＮＡに対する）モル比で結合される、実施形態Ａ２の方法。
Ａ３．１ 複数の第１の足場二重鎖種が、ｓｓＮＡと、約１５：１の（第１の足場二重鎖種のｓｓＮＡに対する）モル比で結合される、実施形態Ａ２の方法。
Ａ４．結合させるステップの前に、複数の第１の足場二重鎖種と、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、第１の足場二重鎖種が脱リン酸化される条件下で接触させるステップを含み、それによって、脱リン酸化された第１の足場二重鎖種が生成される、実施形態Ａ２～Ａ３．１のいずれか１つの方法。
Ａ５．結合させるステップの前に、第１の足場ポリヌクレオチド種の各々が、第１のｓｓＮＡ末端領域とハイブリダイズされて複数の第１の足場－ｓｓＮＡ複合体を形成する、実施形態Ａ１の方法。
Ａ６．結合させるステップの前に、複数の第１の足場－ｓｓＮＡ複合体と、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、第１の足場－ｓｓＮＡ複合体が脱リン酸化される条件下で接触させるステップを含み、それによって、脱リン酸化された第１の足場－ｓｓＮＡ複合体が生成される、実施形態Ａ５の方法。
Ａ７．第１のオリゴヌクレオチドおよび第１のｓｓＮＡ末端領域の隣接している末端を共有結合で連結させるステップをさらに含み、それによって共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物が生成される、実施形態Ａ１～Ａ６のいずれか１つの方法。
Ａ８．共有結合で連結させるステップが、ハイブリダイゼーション産物と、リガーゼ活性を有する薬剤とを、第１のｓｓＮＡ末端領域の末端が第１のオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で接触させることを含む、実施形態Ａ７の方法。
Ａ９．結合させるステップの前に、第２のオリゴヌクレオチドをｓｓＮＡの５’末端に共有結合で連結させるステップを含む、実施形態Ａ１～Ａ８のいずれか１つの方法。
Ａ１０．第２のオリゴヌクレオチドを共有結合で連結させるステップの前に、ｓｓＮＡと、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、ｓｓＮＡが脱リン酸化される条件下で接触させるステップを含み、それによって、脱リン酸化されたｓｓＮＡが生成される、実施形態Ａ９の方法。
Ａ１１．第２のオリゴヌクレオチドが、３’末端にリン酸を含む、実施形態Ａ９またはＡ１０の方法。
Ａ１２．第２のオリゴヌクレオチドを共有結合で連結させるステップが、ｓｓＮＡおよび第２のオリゴヌクレオチドと、一本鎖リガーゼ活性を有する薬剤とを、ｓｓＮＡの５’末端が第２のオリゴヌクレオチドの３’末端に共有結合で連結される条件下で、接触させることを含む、実施形態Ａ１１の方法。
Ａ１３．リガーゼ活性を有する薬剤が、ＲｔｃＢリガーゼである、実施形態Ａ１２の方法。
Ａ１４．核酸組成物と、（ｉｖ）第２のオリゴヌクレオチドおよび（ｖ）複数の第２の足場ポリヌクレオチド種とを結合させるステップをさらに含み、
（ｃ）複数の第２の足場ポリヌクレオチド種における各ポリヌクレオチドが、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含み；
（ｄ）核酸組成物、第２のオリゴヌクレオチド、および複数の第２の足場ポリヌクレオチド種が、第２の足場ポリヌクレオチド種の分子が（ｉ）第２のｓｓＮＡ末端領域および（ｉｉ）第２のオリゴヌクレオチドの分子とハイブリダイズされる条件下で結合され、それによって、第２のオリゴヌクレオチドの分子の末端が第２のｓｓＮＡ末端領域の末端に隣接しているハイブリダイゼーション産物が形成される、実施形態Ａ１からＡ８のいずれか一つの方法。
Ａ１４．１ 結合させるステップの前に、第２のオリゴヌクレオチドおよび／または複数の第２の足場ポリヌクレオチド種と、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、第２のオリゴヌクレオチドおよび／または複数の第２の足場ポリヌクレオチド種が脱リン酸化される条件下で接触させるステップをさらに含み、それによって、脱リン酸化された第２のオリゴヌクレオチドおよび／または脱リン酸化された第２の足場ポリヌクレオチド種が生成される、実施形態Ａ１４の方法。
Ａ１５．結合させるステップの前に、第２の足場ポリヌクレオチド種の各々が、第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされて複数の第２の足場二重鎖種を形成する、実施形態Ａ１４またはＡ１４．１の方法。
Ａ１６．複数の第１の足場二重鎖種が、ｓｓＮＡと結合され、ｓｓＮＡに共有結合で連結され、それによって共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物中間体が形成される、実施形態Ａ１５の方法。
Ａ１７．共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物中間体が、複数の第２の足場二重鎖種と結合され、複数の第２の足場二重鎖種に共有結合で連結され、それによって共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物が形成される、実施形態Ａ１６の方法。
Ａ１８．複数の第１の足場二重鎖種の中の二重鎖の一部またはすべてが、第１のオリゴヌクレオチドの５’末端にアデニル化修飾を含む、実施形態Ａ１５の方法。
Ａ１９．複数の第１の足場二重鎖種が、ＡＴＰの非存在下でｓｓＮＡと結合され、ｓｓＮＡに共有結合で連結され、それによって共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物中間体が形成される、実施形態Ａ１８の方法。
Ａ２０．共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物中間体が、複数の第２の足場二重鎖種およびＡＴＰと結合され、複数の第２の足場二重鎖種およびＡＴＰに共有結合で連結され、それによって共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物が形成される、実施形態Ａ１９の方法。
Ａ２１．複数の第２の足場二重鎖種が、ｓｓＮＡと、約３０：１の（第２の足場二重鎖種のｓｓＮＡに対する）モル比で結合される、実施形態Ａ１５～Ａ２０のいずれか１つの方法。
Ａ２１．１ 複数の第２の足場二重鎖種が、ｓｓＮＡと、約１５：１の（第２の足場二重鎖種のｓｓＮＡに対する）モル比で結合される、実施形態Ａ１５～Ａ２０のいずれか１つの方法。
Ａ２２．結合させるステップの前に、複数の第２の足場二重鎖種と、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、第２の足場二重鎖種が脱リン酸化される条件下で接触させるステップを含み、それによって脱リン酸化された第２の足場二重鎖種が生成される、実施形態Ａ１５～Ａ２１．１のいずれか１つの方法。
Ａ２３．結合させるステップの前に、第２の足場ポリヌクレオチド種の各々が、第２のｓｓＮＡ末端領域とハイブリダイズされて複数の第２の足場－ｓｓＮＡ複合体を形成する、実施形態Ａ１４の方法。
Ａ２４．結合させるステップの前に、複数の第２の足場－ｓｓＮＡ複合体と、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、第２の足場－ｓｓＮＡ複合体が脱リン酸化される条件下で接触させるステップを含み、それによって脱リン酸化された第２の足場－ｓｓＮＡ複合体が生成される、実施形態Ａ２３の方法。
Ａ２５．第１のオリゴヌクレオチドおよび第１のｓｓＮＡ末端領域の隣接している末端を共有結合で連結させるステップ、ならびに第２のオリゴヌクレオチドおよび第２のｓｓＮＡ末端領域の隣接している末端を共有結合で連結させるステップをさらに含み、それによって共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物を生成する、実施形態Ａ１４～Ａ２４のいずれか１つの方法。
Ａ２６．共有結合で連結させるステップが、ハイブリダイゼーション産物と、リガーゼ活性を有する薬剤とを、第１のｓｓＮＡ末端領域の末端が第１のオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結され、かつ第２のｓｓＮＡ末端領域の末端が第２のオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で、接触させることを含む、実施形態Ａ２５の方法。
Ａ２７．リガーゼ活性を有する薬剤が、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼである、実施形態Ａ８またはＡ２６の方法。
Ａ２８．Ｔ４ ＤＮＡリガーゼが、２５単位／μｌ未満の量で使用される、実施形態Ａ２７の方法。
Ａ２９．Ｔ４ ＤＮＡリガーゼが、約１０単位／μｌで使用される、実施形態Ａ２８の方法。
Ａ３０．結合させるステップおよび共有結合で連結させるステップが、１時間またはそれ未満で行なわれる、実施形態Ａ７～Ａ２９のいずれか１つの方法。
Ａ３１．結合させるステップおよび共有結合で連結させるステップが、３０分またはそれ未満で行なわれる、実施形態Ａ７～Ａ２９のいずれか１つの方法。
Ａ３２．結合させるステップおよび共有結合で連結させるステップが、約５分で行なわれる、実施形態Ａ７～Ａ２９のいずれか１つの方法。
Ａ３３．結合させるステップおよびライゲーションするステップが、単一容器内で行なわれる、実施形態Ａ７～Ａ３２のいずれか１つの方法。
Ａ３４．結合させるステップおよびライゲーションするステップが、約２５μｌの反応体積で行なわれる、実施形態Ａ７～Ａ３３のいずれか１つの方法。
Ａ３５．結合させるステップの前またはステップ中に、ｓｓＮＡと、ホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸がｓｓＮＡの５’末端に付加される条件下で接触させることを含む、実施形態Ａ１～Ａ３４のいずれか１つの方法。
Ａ３６．ハイブリダイゼーション産物を形成するステップの後、かつ共有結合で連結させるステップの前に、ｓｓＮＡと、ホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸がｓｓＮＡの５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ａ７～Ａ３４のいずれか１つの方法。
Ａ３７．結合させるステップの前またはステップ中に、第１のオリゴヌクレオチドと、ホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸が第１のオリゴヌクレオチドの５’末端に付加される条件下で接触させることを含む、実施形態Ａ１～Ａ３６のいずれか１つの方法。
Ａ３８．結合させるステップの前またはステップ中に、第２のオリゴヌクレオチドと、ホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸が第２のオリゴヌクレオチドの５’末端に付加される条件下で接触させることを含む、実施形態Ａ１４～Ａ３６のいずれか１つの方法。
Ａ３９．ハイブリダイゼーション産物を形成するステップの後、かつ共有結合で連結させるステップの前に、第１のオリゴヌクレオチドと、ホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸が第１のオリゴヌクレオチドの５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ａ７～Ａ３６のいずれか１つの方法。
Ａ４０．ハイブリダイゼーション産物を形成するステップの後、かつ共有結合で連結させるステップの前に、第２のオリゴヌクレオチドと、ホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸が第２のオリゴヌクレオチドの５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ａ１４～Ａ３６のいずれか１つの方法。
Ａ４１．ホスホリル転移活性を有する薬剤の使用を含まない、実施形態Ａ１～Ａ３４のいずれか１つの方法。
Ａ４２．結合させるステップおよび共有結合で連結させるステップの後に、共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物を精製するステップをさらに含む、実施形態Ａ７～Ａ４１のいずれか１つの方法。
Ａ４３．共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物が、固相可逆的固定法を含む精製プロセスにより精製される、実施形態Ａ４２の方法。
Ａ４３．１ 精製プロセスが、共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物と固相可逆的固定法ビーズおよび緩衝液とを接触させるステップを含む、実施形態Ａ４３の方法。
Ａ４３．２ 緩衝液が、イソプロパノールを含む、実施形態Ａ４３．１の方法。
Ａ４３．３ 緩衝液が、約１０％ ｖ／ｖイソプロパノール～約４０％ ｖ／ｖイソプロパノールを含む、実施形態Ａ４３．２の方法。
Ａ４３．４ 緩衝液が、約２０％ ｖ／ｖイソプロパノールを含む、実施形態Ａ４３．２の方法。
Ａ４３．５ 共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物が、連続的固相可逆的固定法を含む精製プロセスにより精製される、実施形態にＡ４３～Ａ４３．４のいずれか１つの方法。
Ａ４３．６ 共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物が、逐次的固相可逆的固定法を含む精製プロセスにより精製される、実施形態Ａ４３～Ａ４３．４のいずれか１つの方法。
Ａ４４．共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物が、カラム精製を含まない精製プロセスにより精製される、実施形態Ａ４２～Ａ４３．２のいずれか１つの方法。
Ａ４５．共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物が、結合させるステップおよび共有結合で連結させるステップの後に精製されない、実施形態Ａ７～Ａ４１のいずれか１つの方法。
Ａ４６．第１のポリヌクレオチド種の各々についてのｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、複数の第１のポリヌクレオチド種の中の他の第１のポリヌクレオチド種におけるｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域とは異なる、実施形態Ａ１からＡ４５のいずれか１つの方法。
Ａ４７．第２のポリヌクレオチド種の各々についてのｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、複数の第２のポリヌクレオチド種の中の他の第２のポリヌクレオチド種におけるｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域とは異なる、実施形態Ａ１４からＡ４６のいずれか１つの方法。
Ａ４８．ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、ランダム配列を含む、実施形態Ａ１からＡ４７のいずれか１つの方法。
Ａ４９．ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、１つまたは複数のユニバーサル塩基を含む、実施形態Ａ１からＡ４７のいずれか１つの方法。
Ａ５０．ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、約１０またはそれ未満の塩基を含む、実施形態Ａ１～Ａ４９のいずれか１つの方法。
Ａ５１．第１のオリゴヌクレオチドが、第１のプライマー結合ドメインを含む、実施形態Ａ１～Ａ５０のいずれか１つの方法。
Ａ５２．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第１のプライマー結合ドメインに相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ５１の方法。
Ａ５３．第２のオリゴヌクレオチドが、第２のプライマー結合ドメインを含む、実施形態Ａ１４～Ａ５２のいずれか１つの方法。
Ａ５４．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第２のプライマー結合ドメインに相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ５３の方法。
Ａ５５．第１のオリゴヌクレオチドが、第１のシーケンシングアダプターまたはその一部を含む、実施形態Ａ１～Ａ５４のいずれか１つの方法。
Ａ５６．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第１のシーケンシングアダプター、またはその一部、に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ５５の方法。
Ａ５７．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第１のシーケンシングアダプター、またはその一部、に相補的なポリヌクレオチドを含まない、実施形態Ａ５５の方法。
Ａ５８．第２のオリゴヌクレオチドが、第２のシーケンシングアダプターまたはその一部を含む、実施形態Ａ１４～Ａ５７のいずれか１つの方法。
Ａ５９．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第２のシーケンシングアダプター、またはその一部、に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ５８の方法。
Ａ６０．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第２のシーケンシングアダプター、またはその一部、に相補的なポリヌクレオチドを含まない、実施形態Ａ５８の方法。
Ａ６１．第１のオリゴヌクレオチドが、固有分子識別子（ＵＭＩ）を含む、実施形態Ａ１～Ａ６０のいずれか１つの方法。
Ａ６２．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、固有分子識別子（ＵＭＩ）に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ６１の方法。
Ａ６３．第２のオリゴヌクレオチドが、固有分子識別子（ＵＭＩ）を含む、実施形態Ａ１４～Ａ６２のいずれか１つの方法。
Ａ６４．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、固有分子識別子（ＵＭＩ）に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ６３の方法。
Ａ６５．第１のオリゴヌクレオチドが、インデックスを含む、実施形態Ａ１～Ａ６４のいずれか１つの方法。
Ａ６６．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、インデックスに相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ６５の方法。
Ａ６７．第２のオリゴヌクレオチドが、インデックスを含む、実施形態Ａ１４～Ａ６６のいずれか１つの方法。
Ａ６８．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、インデックスに相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ６７の方法。
Ａ６９．第１のオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１～Ａ６８のいずれか１つの方法。
Ａ７０．第２のオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１４～Ａ６９のいずれか１つの方法。
Ａ７１．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、別のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸分子へのオリゴヌクレオチドの共有結合性連結を遮断することができる、実施形態Ａ６９またはＡ７０の方法。
Ａ７２．オリゴヌクレオチドが、ｓｓＮＡに隣接していない末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ａ６９、Ａ７０またはＡ７１に記載の方法。
Ａ７３．第１の足場ポリヌクレオチド種の一部またはすべてが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１～Ａ７２のいずれか１つの方法。
Ａ７４．第２の足場ポリヌクレオチド種の一部またはすべてが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１４～Ａ７３のいずれか１つの方法。
Ａ７５．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、別のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸分子への足場ポリヌクレオチドの共有結合性連結を遮断することができる、実施形態Ａ７３またはＡ７４の方法。
Ａ７６．足場ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの一方または両方の末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ａ７３からＡ７５のいずれか１つの方法。
Ａ７７．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、ライゲーションを遮断する修飾を含む、実施形態Ａ６９からＡ７６のいずれか１つの方法。
Ａ７８．核酸組成物が、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む、実施形態Ａ１～Ａ７７のいずれか１つの方法。
Ａ７９．ｓｓＤＮＡが、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に由来する、実施形態Ａ７８の方法。
Ａ８０．結合させるステップの前に、ｄｓＤＮＡを変性させるステップを含み、それによってｓｓＤＮＡが生成される、実施形態Ａ７９の方法。
Ａ８１．核酸組成物が、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を含む、実施形態Ａ１～Ａ７７のいずれか１つの方法。
Ａ８２．ｓｓＮＡが、結合させるステップの前に修飾されない、実施形態Ａ１～Ａ８１のいずれか１つの方法。
Ａ８３．ｓｓＮＡが、結合させるステップの前または結合させるステップ中に、一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）と結合されない、実施形態Ａ１～Ａ８２のいずれか１つの方法。
Ａ８４．結合させるステップの前に、ｓｓＮＡと一本鎖核酸結合剤とを接触させるステップを含む、実施形態Ａ１～Ａ８２のいずれか１つの方法。
Ａ８４．１ 結合させるステップの前に、ｓｓＮＡと一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）とを接触させて、ＳＳＢ結合ｓｓＮＡを生成するステップを含む、実施形態Ａ１～Ａ８２のいずれか１つの方法。
Ａ８５．ｓｓＮＡが第１のオリゴヌクレオチドおよび複数の第１の足場ポリヌクレオチド種と結合されたとき、ｓｓＮＡの一方または両方のネイティブ末端が存在する、実施形態Ａ１～Ａ８４．１のいずれか１つの方法。
Ａ８６．ｓｓＮＡが、無細胞核酸からのものである、実施形態Ａ１～Ａ８５のいずれか１つの方法。
Ａ８７．核酸組成物が、約２５０ｐｇ～約５ｎｇのｓｓＮＡを含む、実施形態Ａ１～Ａ８６のいずれか１つの方法。
Ａ８８．核酸組成物が、約１ｎｇのｓｓＮＡを含む、実施形態Ａ１～Ａ８７のいずれか１つの方法。
Ａ８９．核酸組成物が、ｓｓＮＡから本質的になる、実施形態Ａ１～Ａ８８のいずれか１つの方法。
Ａ９０．共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物を変性させるステップをさらに含み、それによって一本鎖ライゲーション産物が生成される、実施形態Ａ７～Ａ８９のいずれか１つの方法。
Ａ９１．一本鎖ライゲーション産物を増幅させるステップをさらに含み、それによって増幅ライゲーション産物が生成される、実施形態Ａ９０の方法。
Ａ９２．増幅ライゲーション産物を精製するステップをさらに含む、実施形態Ａ９１の方法。
Ａ９３．増幅ライゲーション産物が、固相可逆的固定法を含む精製プロセスにより精製される、実施形態Ａ９２の方法。
Ａ９４．増幅ライゲーション産物が、連続的固相可逆的固定法を含む精製プロセスにより精製される、実施形態Ａ９３の方法。
Ａ９５．増幅ライゲーション産物が、逐次的固相可逆的固定法を含む精製プロセスにより精製される、実施形態Ａ９３の方法。
Ａ９６．増幅ライゲーション産物が、カラム精製を含まない精製プロセスにより精製される、実施形態Ａ９２～Ａ９５のいずれか１つの方法。
Ａ９７．増幅ライゲーション産物が、増幅させるステップの後に精製されない、実施形態Ａ９１の方法。
Ａ９８．増幅ライゲーション産物をシーケンシングするステップをさらに含む、実施形態Ａ９１～Ａ９７のいずれか１つの方法。
Ａ９９．一本鎖ライゲーション産物が、増幅されない、実施形態Ａ９０の方法。
Ａ１００．ライゲーション産物をシーケンシングするステップをさらに含む、実施形態Ａ９９の方法。
Ａ１０１．第１の足場二重鎖種が、（１）２本の鎖とオーバーハングとを第１の末端に、および２本の非相補鎖を第２の末端に含むか、または（２）一本鎖ループとオーバーハングとを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含む、実施形態Ａ２～Ａ１００のいずれか１つの方法。
Ａ１０２．第２の足場二重鎖種が、（１）２本の鎖とオーバーハングとを第１の末端に、および２本の非相補鎖を第２の末端に含むか、または（２）一本鎖ループとオーバーハングとを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含む、実施形態Ａ１５～Ａ１０１のいずれか１つの方法。
Ａ１０３．オーバーハングが、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を含む、実施形態Ａ１０１またはＡ１０２の方法。
Ａ１０４．第１の足場二重鎖種、第１のオリゴヌクレオチド、および／または複数の第１の足場ポリヌクレオチド種が、１つまたは複数のホスホロチオエート骨格修飾を含む、実施形態Ａ２～Ａ１０３のいずれか１つの方法。
Ａ１０５．第２の足場二重鎖種、第２のオリゴヌクレオチド、および／または複数の第２の足場ポリヌクレオチド種が、１つまたは複数のホスホロチオエート骨格修飾を含む、実施形態Ａ１５～Ａ１０４のいずれか１つの方法。
Ａ１０６．一本鎖ライゲーション産物と、第３のオリゴヌクレオチドとを、第３のオリゴヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドのダイマーとハイブリダイズされる条件下で結合させるステップをさらに含み、それによって、オリゴヌクレオチドダイマーハイブリダイゼーション産物が形成される、実施形態Ａ９０からＡ１０５のいずれか１つの方法。
Ａ１０７．オリゴヌクレオチドダイマーハイブリダイゼーション産物が、切断部位を含む、実施形態Ａ１０６の方法。
Ａ１０８．切断部位が、制限酵素認識部位である、実施形態Ａ１０７の方法。
Ａ１０９．オリゴヌクレオチドダイマーハイブリダイゼーション産物と切断剤とを接触させるステップをさらに含む、実施形態Ａ１０６からＡ１０８のいずれか１つの方法。
Ａ１１０．複数の第１の足場ポリヌクレオチド種の中の１つまたは複数の足場ポリヌクレオチドが、１つまたは複数のデオキシウリジン塩基を含む、実施形態Ａ１～Ａ１０９のいずれか１つの方法。
Ａ１１１．複数の第２の足場ポリヌクレオチド種の中の１つまたは複数の足場ポリヌクレオチドが、１つまたは複数のデオキシウリジン塩基を含む、実施形態Ａ１４～Ａ１１０のいずれか１つの方法。
Ａ１１２．第１のオリゴヌクレオチドが、デオキシウリジン塩基を含まない、実施形態Ａ１～Ａ１１１のいずれか１つの方法。
Ａ１１３．第２のオリゴヌクレオチドが、デオキシウリジン塩基を含まない、実施形態Ａ１４～Ａ１１０のいずれか１つの方法。
Ａ１１４．共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物とウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼとを接触させるステップをさらに含む、実施形態Ａ１１０～Ａ１１３のいずれか１つの方法。
Ａ１１５．一本鎖ライゲーション産物と、シーケンシングアダプター、ＵＭＩおよびインデックスのうちの１つまたは複数を含む伸長プライマーとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させるステップをさらに含み、それによって、伸長プライマーとハイブリダイズされた一本鎖ライゲーション産物が生成される、実施形態Ａ９０～Ａ１１４のいずれか１つの方法。
Ａ１１６．伸長プライマーにハイブリダイズされた一本鎖ライゲーション産物を伸長させるステップをさらに含み、それによって伸長産物が生成される、実施形態Ａ１１５の方法。
Ａ１１７．伸長産物を増幅させるステップをさらに含み、それによって増幅伸長産物が生成される、実施形態Ａ１１６の方法。
Ａ１１８．増幅伸長産物をシーケンシングするステップをさらに含む、実施形態Ａ１１７の方法。
Ａ１１９．第１の足場ポリヌクレオチド種および／または第２の足場ポリヌクレオチド種が、ＤＮＡを含む、実施形態Ａ１～Ａ１１８のいずれか１つの方法。
Ａ１２０．第１の足場ポリヌクレオチド種および／または第２の足場ポリヌクレオチド種が、ＲＮＡを含む、実施形態Ａ１～Ａ１１８のいずれか１つの方法。
Ａ１２１．第１のオリゴヌクレオチドおよび／または第２のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡを含む、実施形態Ａ１からＡ１２０のいずれか１つの方法。
Ａ１２２．第１のオリゴヌクレオチドおよび／または第２のオリゴヌクレオチドが、ＲＮＡを含む、実施形態Ａ１からＡ１２０のいずれか１つの方法。
Ａ１２３．結合させるステップの前に、核酸組成物とヌクレアーゼとを接触させるステップを含む、実施形態Ａ１～Ａ１２２のいずれか１つの方法。
Ａ１２４．ヌクレアーゼが、二本鎖特異的ヌクレアーゼである、実施形態Ａ１２３の方法。
Ｂ１．一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を含む核酸組成物と、
第１のオリゴヌクレオチドと、
ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を各々が含む複数の第１の足場ポリヌクレオチド種と
を含む、組成物。
Ｂ２．第２のオリゴヌクレオチドと、
ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を各々が含む複数の第２の足場ポリヌクレオチド種と
をさらに含む、実施形態Ｂ１の組成物。
Ｂ３．第１の足場ポリヌクレオチド種の各々が第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされている、複数の第１の足場二重鎖種を含む、実施形態Ｂ１またはＢ２の組成物。
Ｂ４．第２の足場ポリヌクレオチド種の各々が第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされている、複数の第２の足場二重鎖種を含む、実施形態Ｂ２またはＢ３の組成物。
Ｂ５．複数の第１の足場二重鎖種およびｓｓＮＡが、約３０：１の（第１の足場二重鎖種のｓｓＮＡに対する）モル比で存在する、実施形態Ｂ３またはＢ４の組成物。
Ｂ６．複数の第１の足場二重鎖種およびｓｓＮＡが、約１５：１の（第１の足場二重鎖種のｓｓＮＡに対する）モル比で存在する、実施形態Ｂ３またはＢ４の組成物。
Ｂ７．複数の第２の足場二重鎖種およびｓｓＮＡが、約３０：１の（第２の足場二重鎖種のｓｓＮＡに対する）モル比で存在する、実施形態Ｂ４、Ｂ５またはＢ６の組成物。
Ｂ８．複数の第２の足場二重鎖種およびｓｓＮＡが、約１５：１の（第２の足場二重鎖種のｓｓＮＡに対する）モル比で存在する、実施形態Ｂ３またはＢ４の組成物。
Ｂ９．第１のオリゴヌクレオチド、複数の第１の足場ポリヌクレオチド種、および／または複数の第１の足場二重鎖種が、脱リン酸化されている、実施形態Ｂ３～Ｂ８のいずれか１つの組成物。
Ｂ１０．第２のオリゴヌクレオチド、複数の第２の足場ポリヌクレオチド種、および／または複数の第２の足場二重鎖種が、脱リン酸化されている、実施形態Ｂ４～Ｂ９のいずれか１つの組成物。
Ｂ１１．オリゴヌクレオチドの末端をｓｓＮＡ末端領域の末端に共有結合で連結させるための薬剤をさらに含む、実施形態Ｂ１～Ｂ１０のいずれか１つの組成物。
Ｂ１２．薬剤が、リガーゼである、実施形態Ｂ１１の組成物。
Ｂ１３．リガーゼが、Ｔ４リガーゼである、実施形態Ｂ１２の組成物。
Ｂ１４．Ｔ４リガーゼが、２５単位／μｌ未満の量で存在する、実施形態Ｂ１３の組成物。
Ｂ１５．Ｔ４リガーゼが、約１０単位／μｌで存在する、実施形態Ｂ１４の組成物。
Ｂ１６．ｓｓＮＡが、５’末端においてリン酸化されている、実施形態Ｂ１～Ｂ１５のいずれか１つの組成物。
Ｂ１６．１ ｓｓＮＡが脱リン酸化されている、実施形態Ｂ１～Ｂ１５のいずれか１つの組成物。
Ｂ１７．第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、３’リン酸を含む、実施形態Ｂ１～Ｂ１６．１のいずれか１つの組成物。
Ｂ１８．ｓｓＮＡ末端領域の５’末端を、３’リン酸を含む第１のオリゴヌクレオチドまたは３’リン酸を含む第２のオリゴヌクレオチドの３’末端に、共有結合で連結させるための薬剤をさらに含む、実施形態Ｂ１７の組成物。
Ｂ１９．薬剤が、一本鎖リガーゼである、実施形態Ｂ１８の組成物。
Ｂ２０．リガーゼが、ＲｔｃＢリガーゼである、実施形態Ｂ１９の組成物。
Ｂ２１．第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、５’末端にアデニル化修飾を含む、実施形態Ｂ１～Ｂ１７のいずれか１つの組成物。
Ｂ２２．ＡＴＰ不含である、実施形態Ｂ２１の組成物。
Ｂ２３．ホスホリル転移活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｂ１～Ｂ２２のいずれか１つの組成物。
Ｂ２４．ホスホリル転移活性を有する薬剤を含まない、実施形態Ｂ１～Ｂ２２のいずれか１つの組成物。
Ｂ２５．第１の足場ポリヌクレオチド種の各々についてのｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、複数の第１の足場ポリヌクレオチド種の中の他の第１の足場ポリヌクレオチド種におけるｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域とは異なる、実施形態Ｂ１からＢ２４のいずれか１つの組成物。
Ｂ２６．第２の足場ポリヌクレオチド種の各々についてのｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、複数の第２の足場ポリヌクレオチド種の中の他の第２の足場ポリヌクレオチド種におけるｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域とは異なる、実施形態Ｂ２からＢ２５のいずれか１つの組成物。
Ｂ２７．ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、ランダム配列を含む、実施形態Ｂ１からＢ２６のいずれか１つの組成物。
Ｂ２８．ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、１つまたは複数のユニバーサル塩基を含む、実施形態Ｂ１からＢ２６のいずれか１つの組成物。
Ｂ２９．ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、約１０またはそれ未満の塩基を含む、実施形態Ｂ１～Ｂ２８のいずれか１つの組成物。
Ｂ３０．第１のオリゴヌクレオチドが、第１のプライマー結合ドメインを含む、実施形態Ｂ１～Ｂ２９のいずれか１つの組成物。
Ｂ３１．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第１のプライマー結合ドメインに相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ３０の組成物。
Ｂ３２．第２のオリゴヌクレオチドが、第２のプライマー結合ドメインを含む、実施形態Ｂ２～Ｂ３１のいずれか１つの組成物。
Ｂ３３．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第２のプライマー結合ドメインに相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ３２の組成物。
Ｂ３４．第１のオリゴヌクレオチドが、第１のシーケンシングアダプターまたはその一部を含む、実施形態Ｂ１～Ｂ３３のいずれか１つの組成物。
Ｂ３５．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第１のシーケンシングアダプター、またはその一部、に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ３４の組成物。
Ｂ３６．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第１のシーケンシングアダプター、またはその一部、に相補的なポリヌクレオチドを含まない、実施形態Ｂ３４の組成物。
Ｂ３７．第２のオリゴヌクレオチドが、第２のシーケンシングアダプターまたはその一部を含む、実施形態Ｂ２～Ｂ３６のいずれか１つの組成物。
Ｂ３８．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第２のシーケンシングアダプター、またはその一部、に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ３７の組成物。
Ｂ３９．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第２のシーケンシングアダプター、またはその一部、に相補的なポリヌクレオチドを含まない、実施形態Ｂ３７の組成物。
Ｂ４０．第１のオリゴヌクレオチドが、固有分子識別子（ＵＭＩ）を含む、実施形態Ｂ１～Ｂ３９のいずれか１つの組成物。
Ｂ４１．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、固有分子識別子（ＵＭＩ）に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ４０の組成物。
Ｂ４２．第２のオリゴヌクレオチドが、固有分子識別子（ＵＭＩ）を含む、実施形態Ｂ２～Ｂ４１のいずれか１つの組成物。
Ｂ４３．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、固有分子識別子（ＵＭＩ）に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ４２の組成物。
Ｂ４４．第１のオリゴヌクレオチドが、インデックスを含む、実施形態Ｂ１～Ｂ４３のいずれか１つの組成物。
Ｂ４５．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、インデックスに相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ４４の組成物。
Ｂ４６．第２のオリゴヌクレオチドが、インデックスを含む、実施形態Ｂ２～Ｂ４５のいずれか１つの組成物。
Ｂ４７．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、インデックスに相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ４６の組成物。
Ｂ４８．第１のオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１～Ｂ４７のいずれか１つの組成物。
Ｂ４９．第２のオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ２～Ｂ４８のいずれか１つの組成物。
Ｂ５０．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、別のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸分子へのオリゴヌクレオチドの共有結合性連結を遮断することができる、実施形態Ｂ４８またはＢ４９の組成物。
Ｂ５１．オリゴヌクレオチドが、ｓｓＮＡ末端領域に隣接することにならない末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ４８、Ｂ４９またはＢ５０に記載の組成物。
Ｂ５２．第１の足場ポリヌクレオチド種の一部またはすべてが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１～Ｂ５１のいずれか１つの組成物。
Ｂ５３．第２の足場ポリヌクレオチド種の一部またはすべてが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ２～Ｂ５２のいずれか１つの組成物。
Ｂ５４．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、別のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸分子への足場ポリヌクレオチドの共有結合性連結を遮断することができる、実施形態Ｂ５２またはＢ５３の組成物。
Ｂ５５．足場ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの一方または両方の末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ５２からＢ５４のいずれか１つの組成物。
Ｂ５６．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、ライゲーションを遮断する修飾を含む、実施形態Ｂ４８からＢ５５のいずれか１つの組成物。
Ｂ５７．核酸組成物が、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む、実施形態Ｂ１～Ｂ５６のいずれか１つの組成物。
Ｂ５８．ｓｓＤＮＡが、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に由来する、実施形態Ｂ５７の組成物。
Ｂ５９．核酸組成物が、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を含む、実施形態Ｂ１～Ｂ５６のいずれか１つの組成物。
Ｂ６０．一本鎖核酸結合剤をさらに含む、実施形態Ｂ１～Ｂ５９のいずれか１つの組成物。
Ｂ６０．１ 一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）をさらに含む、実施形態Ｂ１～Ｂ５９のいずれか１つの組成物。
Ｂ６１．ＳＳＢ不含である、実施形態Ｂ１～Ｂ６０のいずれか１つの組成物。
Ｂ６２．核酸組成物が、ｓｓＮＡから本質的になる、実施形態Ｂ１～Ｂ５９およびＢ６１のいずれか１つの組成物。
Ｂ６３．ｓｓＮＡが、未修飾ｓｓＮＡである、実施形態Ｂ１～Ｂ６２のいずれか１つの組成物。
Ｂ６４．ｓｓＮＡが、一方の末端または両方の末端にネイティブ末端を含む、実施形態Ｂ１～Ｂ６３のいずれか１つの組成物。
Ｂ６５．ｓｓＮＡが、無細胞核酸からのものである、実施形態Ｂ１～Ｂ６４のいずれか１つの組成物。
Ｂ６６．約２５０ｐｇ～約５ｎｇのｓｓＮＡを含む、実施形態Ｂ１～Ｂ６５のいずれか１つの組成物。
Ｂ６７．約１ｎｇのｓｓＮＡを含む、実施形態Ｂ１～Ｂ６６のいずれか１つの組成物。
Ｂ６８．第１の足場二重鎖種が、（１）２本の鎖とオーバーハングとを第１の末端に、および２本の非相補鎖を第２の末端に含むか、または（２）一本鎖ループとオーバーハングとを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含む、実施形態Ｂ３～Ｂ６７のいずれか１つの組成物。
Ｂ６９．第２の足場二重鎖種が、（１）２本の鎖とオーバーハングとを第１の末端に、および２本の非相補鎖を第２の末端に含むか、または（２）一本鎖ループとオーバーハングとを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含む、実施形態Ｂ４～Ｂ６８のいずれか１つの組成物。
Ｂ７０．オーバーハングが、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を含む、実施形態Ｂ６８またはＢ６９の組成物。
Ｂ７１．第１の足場二重鎖種、第１のオリゴヌクレオチド、および／または複数の第１の足場ポリヌクレオチド種が、１つまたは複数のホスホロチオエート骨格修飾を含む、実施形態Ｂ３～Ｂ７０のいずれか１つの組成物。
Ｂ７２．第２の足場二重鎖種、第２のオリゴヌクレオチド、および／または複数の第２の足場ポリヌクレオチド種が、１つまたは複数のホスホロチオエート骨格修飾を含む、実施形態Ｂ４～Ｂ７１のいずれか１つの組成物。
Ｂ７３．第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドのダイマーとハイブリダイズすることができる、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含む、実施形態Ｂ２～Ｂ７２のいずれか１つの組成物。
Ｂ７４．第３のオリゴヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドのダイマーとハイブリダイズされたときに切断部位を形成する配列を含む、実施形態Ｂ７３の組成物。
Ｂ７５．切断部位が、制限酵素認識部位である、実施形態Ｂ７４の組成物。
Ｂ７６．切断剤をさらに含む、実施形態Ｂ７３～Ｂ７５のいずれか１つの組成物。
Ｂ７７．約２５μｌの体積の水溶液中に存在する、実施形態Ｂ１～Ｂ７６のいずれか１つの組成物。
Ｂ７８．複数の第１の足場ポリヌクレオチド種の中の１つまたは複数の足場ポリヌクレオチドが、１つまたは複数のデオキシウリジン塩基を含む、実施形態Ｂ１～Ｂ７７のいずれか１つの組成物。
Ｂ７９．複数の第２の足場ポリヌクレオチド種の中の１つまたは複数の足場ポリヌクレオチドが、１つまたは複数のデオキシウリジン塩基を含む、実施形態Ｂ２～Ｂ７８のいずれか１つの組成物。
Ｂ８０．第１のオリゴヌクレオチドが、デオキシウリジン塩基を含まない、実施形態Ｂ１～Ｂ７９のいずれか１つの組成物。
Ｂ８１．第２のオリゴヌクレオチドが、デオキシウリジン塩基を含まない、実施形態Ｂ２～Ｂ８０のいずれか１つの組成物。
Ｂ８２．第１の足場ポリヌクレオチド種および／または第２の足場ポリヌクレオチド種が、ＤＮＡを含む、実施形態Ｂ１～Ｂ８１のいずれか１つの組成物。
Ｂ８３．第１の足場ポリヌクレオチド種および／または第２の足場ポリヌクレオチド種が、ＲＮＡを含む、実施形態Ｂ１～Ｂ８１のいずれか１つの組成物。
Ｂ８４．第１のオリゴヌクレオチドおよび／または第２のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡを含む、実施形態Ｂ１からＢ８３のいずれか１つの組成物。
Ｂ８５．第１のオリゴヌクレオチドおよび／または第２のオリゴヌクレオチドが、ＲＮＡを含む、実施形態Ｂ１からＢ８３のいずれか１つの組成物。
Ｂ８６．ヌクレアーゼをさらに含む、実施形態Ｂ１～Ｂ８５のいずれか１つの組成物。
Ｂ８７．ヌクレアーゼが、二本鎖特異的ヌクレアーゼである、実施形態Ｂ８６の組成物。
Ｃ１．第１のオリゴヌクレオチドと、
ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を各々が含む複数の第１の足場ポリヌクレオチド種と、
第１のオリゴヌクレオチドおよび複数の第１の足場ポリヌクレオチド種を使用して核酸ライブラリーを生成するための使用説明書と
を含む、キット。
Ｃ２．第２のオリゴヌクレオチドと、
ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を各々が含む複数の第２の足場ポリヌクレオチド種と
をさらに含み、使用説明書が、第１のオリゴヌクレオチド、複数の第１の足場ポリヌクレオチド種、第２のオリゴヌクレオチド、および複数の第２の足場ポリヌクレオチド種を使用して核酸ライブラリーを生成するためのものである、実施形態Ｃ１のキット。
Ｃ３．第１の足場ポリヌクレオチド種の各々が第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされている、複数の第１の足場二重鎖種を含む、実施形態Ｃ１またはＣ２のキット。
Ｃ４．第２の足場ポリヌクレオチド種の各々が第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされている、複数の第２の足場二重鎖種を含む、実施形態Ｃ２またはＣ３のキット。
Ｃ５．使用説明書が、複数の第１の足場二重鎖種およびｓｓＮＡを、約３０：１の（第１の足場二重鎖種のｓｓＮＡに対する）モル比で合わせることを含む、実施形態Ｃ３またはＣ４のキット。
Ｃ６．使用説明書が、複数の第１の足場二重鎖種およびｓｓＮＡを、約１５：１の（第１の足場二重鎖種のｓｓＮＡに対する）モル比で合わせることを含む、実施形態Ｃ３またはＣ４のキット。
Ｃ７．使用説明書が、複数の第２の足場二重鎖種およびｓｓＮＡを、約３０：１の（第２の足場二重鎖種のｓｓＮＡに対する）モル比で合わせることを含む、実施形態Ｃ４、Ｃ５またはＣ６のキット。
Ｃ８．使用説明書が、複数の第２の足場二重鎖種およびｓｓＮＡを、約１５：１の（第２の足場二重鎖種のｓｓＮＡに対する）モル比で合わせることを含む、実施形態Ｃ３またはＣ４のキット。
Ｃ９．第１のオリゴヌクレオチド、複数の第１の足場ポリヌクレオチド種、および／または複数の第１の足場二重鎖種が、脱リン酸化されている、実施形態Ｃ３～Ｃ８のいずれか１つのキット。
Ｃ１０．第２のオリゴヌクレオチド、複数の第２の足場ポリヌクレオチド種、および／または複数の第２の足場二重鎖種が、脱リン酸化されている、実施形態Ｃ４～Ｃ９のいずれか１つのキット。
Ｃ１１．オリゴヌクレオチドの末端をｓｓＮＡ末端領域の末端に共有結合で連結させるための薬剤をさらに含む、実施形態Ｃ１～Ｃ１０のいずれか１つのキット。
Ｃ１２．薬剤が、リガーゼである、実施形態Ｃ１１のキット。
Ｃ１３．リガーゼが、Ｔ４リガーゼである、実施形態Ｃ１２のキット。
Ｃ１４．Ｔ４リガーゼが、２５単位／μｌ未満の量で存在する、実施形態Ｃ１３のキット。
Ｃ１５．Ｔ４リガーゼが、約１０単位／μｌで存在する、実施形態Ｃ１４のキット。
Ｃ１６．ホスファターゼをさらに含む、実施形態Ｃ１～Ｃ１５のいずれか１つのキット。
Ｃ１７．第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、３’リン酸を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ１６のいずれか１つのキット。
Ｃ１８．ｓｓＮＡ末端領域の５’末端を、３’リン酸を含む第１のオリゴヌクレオチドまたは３’リン酸を含む第２のオリゴヌクレオチドの３’末端に、共有結合で連結させるための薬剤をさらに含む、実施形態Ｃ１７のキット。
Ｃ１９．薬剤が、一本鎖リガーゼである、実施形態Ｃ１８のキット。
Ｃ２０．リガーゼが、ＲｔｃＢリガーゼである、実施形態Ｃ１９のキット。
Ｃ２１．第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、５’末端にアデニル化修飾を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ１７のいずれか１つのキット。
Ｃ２２．ＡＴＰ不含である、実施形態Ｃ２１のキット。
Ｃ２３．ホスホリル転移活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｃ１～Ｃ２２のいずれか１つのキット。
Ｃ２４．ホスホリル転移活性を有する薬剤を含まない、実施形態Ｃ１～Ｃ２２のいずれか１つのキット。
Ｃ２５．第１の足場ポリヌクレオチド種の各々についてのｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、複数の第１の足場ポリヌクレオチド種の中の他の第１の足場ポリヌクレオチド種におけるｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域とは異なる、実施形態Ｃ１からＣ２４のいずれか１つのキット。
Ｃ２６．第２の足場ポリヌクレオチド種の各々についてのｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、複数の第２の足場ポリヌクレオチド種の中の他の第２の足場ポリヌクレオチド種におけるｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域とは異なる、実施形態Ｃ２からＣ２５のいずれか１つのキット。
Ｃ２７．ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、ランダム配列を含む、実施形態Ｃ１からＣ２６のいずれか１つのキット。
Ｃ２８．ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、１つまたは複数のユニバーサル塩基を含む、実施形態Ｃ１からＣ２６のいずれか１つのキット。
Ｃ２９．ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、約１０またはそれ未満の塩基を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ２８のいずれか１つのキット。
Ｃ３０．第１のオリゴヌクレオチドが、第１のプライマー結合ドメインを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ２９のいずれか１つのキット。
Ｃ３１．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第１のプライマー結合ドメインに相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｃ３０のキット。
Ｃ３２．第２のオリゴヌクレオチドが、第２のプライマー結合ドメインを含む、実施形態Ｃ２～Ｃ３１のいずれか１つのキット。
Ｃ３３．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第２のプライマー結合ドメインに相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｃ３２のキット。
Ｃ３４．第１のオリゴヌクレオチドが、第１のシーケンシングアダプターまたはその一部を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ３３のいずれか１つのキット。
Ｃ３５．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第１のシーケンシングアダプター、またはその一部、に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｃ３４のキット。
Ｃ３６．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第１のシーケンシングアダプター、またはその一部、に相補的なポリヌクレオチドを含まない、実施形態Ｃ３４のキット。
Ｃ３７．第２のオリゴヌクレオチドが、第２のシーケンシングアダプターまたはその一部を含む、実施形態Ｃ２～Ｃ３６のいずれか１つのキット。
Ｃ３８．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第２のシーケンシングアダプター、またはその一部、に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｃ３７のキット。
Ｃ３９．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第２のシーケンシングアダプター、またはその一部、に相補的なポリヌクレオチドを含まない、実施形態Ｃ３７のキット。
Ｃ４０．第１のオリゴヌクレオチドが、固有分子識別子（ＵＭＩ）を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ３９のいずれか１つのキット。
Ｃ４１．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、固有分子識別子（ＵＭＩ）に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｃ４０のキット。
Ｃ４２．第２のオリゴヌクレオチドが、固有分子識別子（ＵＭＩ）を含む、実施形態Ｃ２～Ｃ４１のいずれか１つのキット。
Ｃ４３．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、固有分子識別子（ＵＭＩ）に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｃ４２のキット。
Ｃ４４．第１のオリゴヌクレオチドが、インデックスを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ４３のいずれか１つのキット。
Ｃ４５．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、インデックスに相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｃ４４のキット。
Ｃ４６．第２のオリゴヌクレオチドが、インデックスを含む、実施形態Ｃ２～Ｃ４５のいずれか１つのキット。
Ｃ４７．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、インデックスに相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｃ４６のキット。
Ｃ４８．第１のオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ４７のいずれか１つのキット。
Ｃ４９．第２のオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｃ２～Ｃ４８のいずれか１つのキット。
Ｃ５０．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、別のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸分子へのオリゴヌクレオチドの共有結合性連結を遮断することができる、実施形態Ｃ４８またはＣ４９のキット。
Ｃ５１．オリゴヌクレオチドが、ｓｓＮＡ末端領域に隣接することにならない末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｃ４８、Ｃ４９またはＣ５０に記載のキット。
Ｃ５２．第１の足場ポリヌクレオチド種の一部またはすべてが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ５１のいずれか１つのキット。
Ｃ５３．第２の足場ポリヌクレオチド種の一部またはすべてが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｃ２～Ｃ５２のいずれか１つのキット。
Ｃ５４．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、別のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸分子への足場ポリヌクレオチドの共有結合性連結を遮断することができる、実施形態Ｃ５２またはＣ５３のキット。
Ｃ５５．足場ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの一方または両方の末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｃ５２からＣ５４のいずれか１つのキット。
Ｃ５６．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、ライゲーションを遮断する修飾を含む、実施形態Ｃ４８からＣ５５のいずれか１つのキット。
Ｃ５７．使用説明書が、第１のオリゴヌクレオチドおよび複数の第１のポリヌクレオチド種と、一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を含む核酸組成物とを結合させることを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ５６のいずれか１つのキット。
Ｃ５８．ｓｓＮＡが、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む、実施形態Ｃ５７のキット。
Ｃ５９．ｓｓＮＡが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を含む、実施形態Ｃ５７のキット。
Ｃ６０．一本鎖核酸結合剤をさらに含む、実施形態Ｃ１～Ｃ５９のいずれか１つのキット。
Ｃ６０．１ 一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）をさらに含む、実施形態Ｃ１～Ｃ５９のいずれか１つのキット。
Ｃ６１．ＳＳＢ不含である、実施形態Ｃ１～Ｃ６０のいずれか１つのキット。
Ｃ６２．核酸組成物が、ｓｓＮＡから本質的になる、実施形態Ｃ５７～Ｃ５９およびＣ６１のいずれか１つのキット。
Ｃ６３．ｓｓＮＡが、未修飾ｓｓＮＡである、実施形態Ｃ５７～Ｃ６２のいずれか１つのキット。
Ｃ６４．ｓｓＮＡが、一方の末端または両方の末端にネイティブ末端を含む、実施形態Ｃ５７～Ｃ６３のいずれか１つのキット。
Ｃ６５．ｓｓＮＡが、無細胞核酸からのものである、実施形態Ｃ５７～Ｃ６４のいずれか１つのキット。
Ｃ６６．使用説明書が、第１のオリゴヌクレオチドおよび複数の第１のポリヌクレオチド種と、約２５０ｐｇ～約５ｎｇのｓｓＮＡを含む核酸組成物とを結合させることを含む、実施形態Ｃ５７～Ｃ６５のいずれか１つのキット。
Ｃ６７．使用説明書が、第１のオリゴヌクレオチドおよび複数の第１のポリヌクレオチド種と、約１ｎｇのｓｓＮＡを含む核酸組成物とを結合させることを含む、実施形態Ｃ５７～Ｃ６６のいずれか１つのキット。
Ｃ６８．第１の足場二重鎖種が、（１）２本の鎖とオーバーハングとを第１の末端に、および２本の非相補鎖を第２の末端に含むか、または（２）一本鎖ループとオーバーハングとを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含む、実施形態Ｃ３～Ｃ６７のいずれか１つのキット。
Ｃ６９．第２の足場二重鎖種が、（１）２本の鎖とオーバーハングとを第１の末端に、および２本の非相補鎖を第２の末端に含むか、または（２）一本鎖ループとオーバーハングとを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含む、実施形態Ｃ４～Ｃ６８のいずれか１つのキット。
Ｃ７０．オーバーハングが、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域を含む、実施形態Ｃ６８またはＣ６９のキット。
Ｃ７１．第１の足場二重鎖種、第１のオリゴヌクレオチド、および／または複数の第１の足場ポリヌクレオチド種が、１つまたは複数のホスホロチオエート骨格修飾を含む、実施形態Ｃ３～Ｃ７０のいずれか１つのキット。
Ｃ７２．第２の足場二重鎖種、第２のオリゴヌクレオチド、および／または複数の第２の足場ポリヌクレオチド種が、１つまたは複数のホスホロチオエート骨格修飾を含む、実施形態Ｃ４～Ｃ７１のいずれか１つのキット。
Ｃ７３．第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドのダイマーとハイブリダイズすることができる、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含む、実施形態Ｃ２～Ｃ７２のいずれか１つのキット。
Ｃ７４．第３のオリゴヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドのダイマーとハイブリダイズされたときに切断部位を形成する配列を含む、実施形態Ｃ７３のキット。
Ｃ７５．切断部位が、制限酵素認識部位である、実施形態Ｃ７４のキット。
Ｃ７６．切断剤をさらに含む、実施形態Ｃ７３～Ｃ７５のいずれか１つのキット。
Ｃ７７．核酸を精製するための試薬をさらに含む、実施形態Ｃ１～Ｃ７６のいずれか１つのキット。
Ｃ７７．１ 核酸を精製するための試薬が、固相可逆的固定法ビーズおよび緩衝液を含む、実施形態Ｃ７７のキット。
Ｃ７７．２ 緩衝液が、イソプロパノールを含む、実施形態Ｃ７７．１のキット。
Ｃ７７．３ 緩衝液が、約１０％ ｖ／ｖイソプロパノール～約４０％ ｖ／ｖイソプロパノールを含む、実施形態Ｃ７７．２のキット。
Ｃ７７．４ 緩衝液が、約２０％ ｖ／ｖイソプロパノールを含む、実施形態Ｃ７７．２のキット。
Ｃ７８．核酸を増幅するための試薬をさらに含む、実施形態Ｃ１～Ｃ７７．４のいずれか１つのキット。
Ｃ７９．複数の第１の足場ポリヌクレオチド種の中の１つまたは複数の足場ポリヌクレオチドが、１つまたは複数のデオキシウリジン塩基を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ７８のいずれか１つのキット。
Ｃ８０．複数の第２の足場ポリヌクレオチド種の中の１つまたは複数の足場ポリヌクレオチドが、１つまたは複数のデオキシウリジン塩基を含む、実施形態Ｃ２～Ｃ７９のいずれか１つのキット。
Ｃ８１．第１のオリゴヌクレオチドが、デオキシウリジン塩基を含まない、実施形態Ｃ１～Ｃ８０のいずれか１つのキット。
Ｃ８２．第２のオリゴヌクレオチドが、デオキシウリジン塩基を含まない、実施形態Ｃ２～Ｃ８１のいずれか１つのキット。
Ｃ８３．ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼをさらに含む、実施形態Ｃ７８～Ｃ８２のいずれか１つのキット。
Ｃ８４．第１の足場ポリヌクレオチド種および／または第２の足場ポリヌクレオチド種が、ＤＮＡを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ８３のいずれか１つのキット。
Ｃ８５．第１の足場ポリヌクレオチド種および／または第２の足場ポリヌクレオチド種が、ＲＮＡを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ８３のいずれか１つのキット。
Ｃ８６．第１のオリゴヌクレオチドおよび／または第２のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡを含む、実施形態Ｃ１からＣ８５のいずれか１つのキット。
Ｃ８７．第１のオリゴヌクレオチドおよび／または第２のオリゴヌクレオチドが、ＲＮＡを含む、実施形態Ｃ１からＣ８５のいずれか１つのキット。
Ｃ８８．ヌクレアーゼをさらに含む、実施形態Ｃ１～Ｃ８７のいずれか１つのキット。
Ｃ８９．ヌクレアーゼが、二本鎖特異的ヌクレアーゼである、実施形態Ｃ８８のキット。
Ｄ１．核酸ライブラリーを生成する方法であって、
（ｉ）一本鎖核酸リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）または一本鎖相補デオキシリボ核酸（ｓｓｃＤＮＡ）を含む核酸組成物と、（ｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドと、（ｉｉｉ）複数の第１の足場ポリヌクレオチド種とを結合させるステップを含み、
（ａ）複数の第１の足場ポリヌクレオチド種における各ポリヌクレオチドが、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域、および第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含み；および
（ｂ）核酸組成物、第１のオリゴヌクレオチド、および複数の第１の足場ポリヌクレオチド種が、第１の足場ポリヌクレオチド種の分子が（ｉ）第１のｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡ末端領域および（ｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドの分子とハイブリダイズされる条件下で結合され、それによって、第１のオリゴヌクレオチドの分子の末端が第１のｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡ末端領域の末端に隣接しているハイブリダイゼーション産物が形成される、方法。
Ｄ１．１ 結合させるステップの前に、第１のオリゴヌクレオチドおよび／または複数の第１の足場ポリヌクレオチド種と、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、第１のオリゴヌクレオチドおよび／または複数の第１の足場ポリヌクレオチド種が脱リン酸化される条件下で接触させるステップをさらに含み、それによって、脱リン酸化された第１のオリゴヌクレオチドおよび／または脱リン酸化された第１の足場ポリヌクレオチド種が生成される、実施形態Ｄ１の方法。
Ｄ２．核酸組成物が、ｓｓｃＤＮＡを含む、実施形態Ｄ１またはＤ１．１の方法。
Ｄ３．結合させるステップの前に、ｓｓｃＤＮＡを一本鎖リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）から生成するステップを含む、実施形態Ｄ２の方法。
Ｄ４．ｓｓｃＤＮＡを生成するステップが、ｓｓＲＮＡと、プライマー、および逆転写酵素活性を有する薬剤とを接触させることによって、ＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖を生成することを含む、実施形態Ｄ３の方法。
Ｄ５．ｓｓｃＤＮＡを生成するステップが、ＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖と、ＲＮＡｓｅ活性を有する薬剤とを接触させることによって、ＲＮＡを消化し、ｓｓｃＤＮＡ産物を生成することを含む、実施形態Ｄ４の方法。
Ｄ６．ｓｓｃＤＮＡ産物を精製するステップをさらに含む、実施形態Ｄ５の方法。
Ｄ７．逆転写酵素活性を有する薬剤が、ＲＮＡｓｅ活性も有する、実施形態Ｄ５またはＤ６の方法。
Ｄ８．薬剤が、Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写酵素である、実施形態Ｄ７の方法。
Ｄ９．プライマーが、ランダムヘキサマープライマー、ランダムオクタマープライマー、およびポリ（Ｔ）プライマーのうちの１つまたは複数から選択される、実施形態Ｄ４～Ｄ８のいずれか１つの方法。
Ｄ１０．核酸組成物が、ｓｓＲＮＡを含む、実施形態Ｄ１の方法。
Ｄ１１．一本鎖ライゲーション産物をハイブリダイゼーション産物から生成するステップをさらに含む、実施形態Ｄ１０の方法。
Ｄ１２．一本鎖ライゲーション産物と、プライマー、および逆転写酵素活性を有する薬剤とを接触させることによって、ＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖を生成するステップをさらに含む、実施形態Ｄ１１の方法。
Ｄ１３．ＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖と、ＲＮＡｓｅ活性を有する薬剤とを接触させることによって、ＲＮＡを消化し、一本鎖ｃＤＮＡ（ｓｓｃＤＮＡ）産物を生成するステップをさらに含む、実施形態Ｄ１２の方法。
Ｄ１４．ｓｓｃＤＮＡ産物を精製するステップをさらに含む、実施形態Ｄ１３の方法。
Ｄ１５．逆転写酵素活性を有する薬剤が、ＲＮＡｓｅ活性も有する、実施形態Ｄ１３またはＤ１４の方法。
Ｄ１６．薬剤が、Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写酵素である、実施形態Ｄ１５の方法。
Ｄ１７．プライマーが、第１のオリゴヌクレオチド中の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｄ１２～Ｄ１６のいずれか１つの方法。
Ｄ１７．１ ｓｓｃＤＮＡ産物を増幅させることによって、増幅ｓｓｃＤＮＡ産物を生成するステップをさらに含む、実施形態Ｄ１３～Ｄ１６のいずれか１つの方法。
Ｄ１７．２ ＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖を生成するステップ、ｓｓｃＤＮＡ産物を生成するステップ、および増幅ｓｓｃＤＮＡ産物を生成するステップが、単一容器内でおよび／または単一体積で行なわれる、実施形態Ｄ１７．１の方法。
Ｄ１８．結合させるステップの前に、ｓｓＲＮＡを断片化することによって、ｓｓＲＮＡ断片を生成するステップを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ１７．２のいずれか１つの方法。
Ｄ１９．結合させるステップの前に、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を枯渇させるおよび／またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を濃縮するステップを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ１８のいずれか１つの方法。
Ｄ２０．結合させるステップの前に、第１の足場ポリヌクレオチド種の各々が、第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされて複数の第１の足場二重鎖種を形成する、実施形態Ｄ１～Ｄ１９のいずれか１つの方法。
Ｄ２１．複数の第１の足場二重鎖種が、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡと、約３０：１の（第１の足場二重鎖種のｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡに対する）モル比で結合される、実施形態Ｄ２０の方法。
Ｄ２２ 複数の第１の足場二重鎖種が、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡと、約１５：１の（第１の足場二重鎖種のｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡに対する）モル比で結合される、実施形態Ｄ２０の方法。
Ｄ２３．結合させるステップの前に、複数の第１の足場二重鎖種と、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、第１の足場二重鎖種が脱リン酸化される条件下で接触させるステップを含み、それによって、脱リン酸化された第１の足場二重鎖種が生成される、実施形態Ｄ１～Ｄ２２のいずれか１つの方法。
Ｄ２４．結合させるステップの前に、第１の足場ポリヌクレオチド種の各々が、第１のｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡ末端領域とハイブリダイズされて複数の第１の足場－ｓｓＲＮＡまたは第１の足場－ｓｓｃＤＮＡ複合体を形成する、実施形態Ｄ１～Ｄ１９のいずれか１つの方法。
Ｄ２５．結合させるステップの前に、複数の第１の足場－ｓｓＲＮＡ複合体または第１の足場－ｓｓｃＤＮＡ複合体と、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、第１の足場－ｓｓＲＮＡ複合体または第１の足場－ｓｓｃＤＮＡ複合体が脱リン酸化される条件下で接触させるステップを含み、それによって、脱リン酸化された第１の足場－ｓｓＲＮＡ複合体または第１の足場－ｓｓｃＤＮＡ複合体が生成される、実施形態Ｄ２４の方法。
Ｄ２６．第１のオリゴヌクレオチドおよび第１のｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡ末端領域の隣接している末端を共有結合で連結させるステップをさらに含み、それによって共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物が生成される、実施形態Ｄ１～Ｄ２５のいずれか１つの方法。
Ｄ２７．共有結合で連結させるステップが、ハイブリダイゼーション産物と、リガーゼ活性を有する薬剤とを、第１のｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡ末端領域の末端が第１のオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で接触させることを含む、実施形態Ｄ２６の方法。
Ｄ２８．結合させるステップの前に、第２のオリゴヌクレオチドをｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡの５’末端に共有結合で連結させるステップを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ２７のいずれか１つの方法。
Ｄ２９．第２のオリゴヌクレオチドを共有結合で連結させるステップの前に、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡと、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡが脱リン酸化される条件下で接触させるステップを含み、それによって、脱リン酸化されたｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡが生成される、実施形態Ｄ２８の方法。
Ｄ３０．第２のオリゴヌクレオチドが、３’末端にリン酸を含む、実施形態Ｄ２８またはＤ２９の方法。
Ｄ３１．第２のオリゴヌクレオチドを共有結合で連結させるステップが、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡおよび第２のオリゴヌクレオチドと、一本鎖リガーゼ活性を有する薬剤とを、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡの５’末端が第２のオリゴヌクレオチドの３’末端に共有結合で連結される条件下で、接触させることを含む、実施形態Ｄ３０の方法。
Ｄ３２．リガーゼ活性を有する薬剤が、ＲｔｃＢリガーゼである、実施形態Ｄ３１の方法。
Ｄ３３．核酸組成物と、（ｉｖ）第２のオリゴヌクレオチドおよび（ｖ）複数の第２の足場ポリヌクレオチド種とを結合させるステップをさらに含み、
（ｃ）複数の第２の足場ポリヌクレオチド種における各ポリヌクレオチドが、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含み；
（ｄ）核酸組成物、第２のオリゴヌクレオチド、および複数の第２の足場ポリヌクレオチド種が、第２の足場ポリヌクレオチド種の分子が（ｉ）第２のｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡ末端領域および（ｉｉ）第２のオリゴヌクレオチドの分子とハイブリダイズされる条件下で結合され、それによって、第２のオリゴヌクレオチドの分子の末端が第２のｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡ末端領域の末端に隣接しているハイブリダイゼーション産物が形成される、実施形態Ｄ１からＤ２７のいずれか一つの方法。
Ｄ３３．１ 結合させるステップの前に、第２のオリゴヌクレオチドおよび／または複数の第２の足場ポリヌクレオチド種と、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、第２のオリゴヌクレオチドおよび／または複数の第２の足場ポリヌクレオチド種が脱リン酸化される条件下で接触させるステップをさらに含み、それによって、脱リン酸化された第２のオリゴヌクレオチドおよび／または脱リン酸化された第２の足場ポリヌクレオチド種が生成される、実施形態Ｄ３３の方法。
Ｄ３３．２ 実施形態Ｄ１７のプライマーが、第２のオリゴヌクレオチド中の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｄ３３またはＤ３３．１の方法。
Ｄ３４．結合させるステップの前に、第２の足場ポリヌクレオチド種の各々が、第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされて複数の第２の足場二重鎖種を形成する、実施形態Ｄ３３、Ｄ３３．１またはＤ３３．２のいずれか一つの方法。
Ｄ３５．複数の第１の足場二重鎖種が、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡと結合され、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡに共有結合で連結され、それによって共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物中間体が形成される、実施形態Ｄ３４の方法。
Ｄ３６．共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物中間体が、複数の第２の足場二重鎖種と結合され、複数の第２の足場二重鎖種に共有結合で連結され、それによって共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物が形成される、実施形態Ｄ３５の方法。
Ｄ３７．複数の第１の足場二重鎖種の中の二重鎖の一部またはすべてが、第１のオリゴヌクレオチドの５’末端にアデニル化修飾を含む、実施形態Ｄ３４の方法。
Ｄ３８．複数の第１の足場二重鎖種が、ＡＴＰの非存在下でｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡと結合され、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡに共有結合で連結され、それによって共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物中間体が形成される、実施形態Ｄ３７の方法。
Ｄ３９．共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物中間体が、複数の第２の足場二重鎖種およびＡＴＰと結合され、複数の第２の足場二重鎖種およびＡＴＰに共有結合で連結され、それによって共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物が形成される、実施形態Ｄ３８の方法。
Ｄ４０．複数の第２の足場二重鎖種が、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡと、約３０：１の（第２の足場二重鎖種のｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡに対する）モル比で結合される、実施形態Ｄ３４～Ｄ３９のいずれか１つの方法。
Ｄ４１ 複数の第２の足場二重鎖種が、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡと、約１５：１の（第２の足場二重鎖種のｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡに対する）モル比で結合される、実施形態Ｄ３４～Ｄ３９のいずれか１つの方法。
Ｄ４２．結合させるステップの前に、複数の第２の足場二重鎖種と、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、第２の足場二重鎖種が脱リン酸化される条件下で接触させるステップを含み、それによって脱リン酸化された第２の足場二重鎖種が生成される、実施形態Ｄ３４～Ｄ４１のいずれか１つの方法。
Ｄ４３．結合させるステップの前に、第２の足場ポリヌクレオチド種の各々が、第２のｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡ末端領域とハイブリダイズされて複数の第２の足場－ｓｓＲＮＡまたは第２の足場－ｓｓｃＤＮＡ複合体を形成する、実施形態Ｄ３３の方法。
Ｄ４４．結合させるステップの前に、複数の第２の足場－ｓｓＲＮＡ複合体または第２の足場－ｓｓｃＤＮＡ複合体と、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、第２の足場－ｓｓＲＮＡ複合体または第２の足場－ｓｓｃＤＮＡ複合体が脱リン酸化される条件下で接触させるステップを含み、それによって脱リン酸化された第２の足場－ｓｓＲＮＡ複合体または第２の足場－ｓｓｃＤＮＡ複合体が生成される、実施形態Ｄ４３の方法。
Ｄ４５．第１のオリゴヌクレオチドおよび第１のｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡ末端領域の隣接している末端を共有結合で連結させるステップ、ならびに第２のオリゴヌクレオチドおよび第２のｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡ末端領域の隣接している末端を共有結合で連結させるステップをさらに含み、それによって共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物を生成する、実施形態Ｄ３３～Ｄ４４のいずれか１つの方法。
Ｄ４６．共有結合で連結させるステップが、ハイブリダイゼーション産物と、リガーゼ活性を有する薬剤とを、第１のｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡ末端領域の末端が第１のオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結され、かつ第２のｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡ末端領域の末端が第２のオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で、接触させることを含む、実施形態Ｄ４５の方法。
Ｄ４７．リガーゼ活性を有する薬剤が、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼである、実施形態Ｄ２７またはＤ４６の方法。
Ｄ４８．Ｔ４ ＤＮＡリガーゼが、２５単位／μｌ未満の量で使用される、実施形態Ｄ４７の方法。
Ｄ４９．Ｔ４ ＤＮＡリガーゼが、約１０単位／μｌで使用される、実施形態Ｄ４８の方法。
Ｄ５０．結合させるステップおよび共有結合で連結させるステップが、１時間またはそれ未満で行なわれる、実施形態Ｄ２６～Ｄ４９のいずれか１つの方法。
Ｄ５１．結合させるステップおよび共有結合で連結させるステップが、３０分またはそれ未満で行なわれる、実施形態Ｄ２６～Ｄ４９のいずれか１つの方法。
Ｄ５２．結合させるステップおよび共有結合で連結させるステップが、約５分で行なわれる、実施形態Ｄ２６～Ｄ４９のいずれか１つの方法。
Ｄ５３．結合させるステップおよびライゲーションするステップが、単一容器内で行なわれる、実施形態Ｄ２６～Ｄ５２のいずれか１つの方法。
Ｄ５４．結合させるステップおよびライゲーションするステップが、約２５μｌの反応体積で行なわれる、実施形態Ｄ２６～Ｄ５３のいずれか１つの方法。
Ｄ５５．結合させるステップの前またはステップ中に、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡと、ホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸がｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡの５’末端に付加される条件下で接触させることを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ５４のいずれか１つの方法。
Ｄ５６．ハイブリダイゼーション産物を形成するステップの後、かつ共有結合で連結させるステップの前に、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡと、ホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸がｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡの５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ｄ２６～Ｄ５４のいずれか１つの方法。
Ｄ５７．結合させるステップの前またはステップ中に、第１のオリゴヌクレオチドと、ホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸が第１のオリゴヌクレオチドの５’末端に付加される条件下で接触させることを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ５６のいずれか１つの方法。
Ｄ５８．結合させるステップの前またはステップ中に、第２のオリゴヌクレオチドと、ホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸が第２のオリゴヌクレオチドの５’末端に付加される条件下で接触させることを含む、実施形態Ｄ３３～Ｄ５６のいずれか１つの方法。
Ｄ５９．ハイブリダイゼーション産物を形成するステップの後、かつ共有結合で連結させるステップの前に、第１のオリゴヌクレオチドと、ホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸が第１のオリゴヌクレオチドの５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ｄ２６～Ｄ５６のいずれか１つの方法。
Ｄ６０．ハイブリダイゼーション産物を形成するステップの後、かつ共有結合で連結させるステップの前に、第２のオリゴヌクレオチドと、ホスホリル転移活性を有する薬剤とを、５’リン酸が第２のオリゴヌクレオチドの５’末端に付加される条件下で接触させるステップを含む、実施形態Ｄ３３～Ｄ５６のいずれか１つの方法。
Ｄ６１．ホスホリル転移活性を有する薬剤の使用を含まない、実施形態Ｄ１～Ｄ５４のいずれか１つの方法。
Ｄ６２．結合させるステップおよび共有結合で連結させるステップの後に、共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物を精製するステップをさらに含む、実施形態Ｄ２６～Ｄ６１のいずれか１つの方法。
Ｄ６３．共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物が、固相可逆的固定法を含む精製プロセスにより精製される、実施形態Ｄ６２の方法。
Ｄ６３．１ 精製プロセスが、共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物と固相可逆的固定法ビーズおよび緩衝液とを接触させるステップを含む、実施形態Ｄ６３の方法。
Ｄ６３．２ 緩衝液が、イソプロパノールを含む、実施形態Ｄ６３．１の方法。
Ｄ６３．３ 緩衝液が、約１０％ ｖ／ｖイソプロパノール～約４０％ ｖ／ｖイソプロパノールを含む、実施形態Ｄ６３．２の方法。
Ｄ６３．４ 緩衝液が、約２０％ ｖ／ｖイソプロパノールを含む、実施形態Ｄ６３．２の方法。
Ｄ６４ 共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物が、連続的固相可逆的固定法を含む精製プロセスにより精製される、実施形態にＤ６３～Ｄ６３．４のいずれか１つの方法。
Ｄ６５ 共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物が、逐次的固相可逆的固定法を含む精製プロセスにより精製される、実施形態Ｄ６３～Ｄ６３．４のいずれか１つの方法。
Ｄ６６．共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物が、カラム精製を含まない精製プロセスにより精製される、実施形態Ｄ６２～Ｄ６５のいずれか１つの方法。
Ｄ６７．共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物が、結合させるステップおよび共有結合で連結させるステップの後に精製されない、実施形態Ｄ２６～Ｄ６１のいずれか１つの方法。
Ｄ６８．第１のポリヌクレオチド種の各々についてのｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域が、複数の第１のポリヌクレオチド種の中の他の第１のポリヌクレオチド種におけるｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域とは異なる、実施形態Ｄ１からＤ６７のいずれか１つの方法。
Ｄ６９．第２のポリヌクレオチド種の各々についてのｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域が、複数の第２のポリヌクレオチド種の中の他の第２のポリヌクレオチド種におけるｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域とは異なる、実施形態Ｄ３３からＤ６８のいずれか１つの方法。
Ｄ７０．ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域が、ランダム配列を含む、実施形態Ｄ１からＤ６９のいずれか１つの方法。
Ｄ７１．ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域が、１つまたは複数のユニバーサル塩基を含む、実施形態Ｄ１からＤ６９のいずれか１つの方法。
Ｄ７２．ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域が、約１０またはそれ未満の塩基を含む、実施形態Ｄ１～Ｄ７１のいずれか１つの方法。
Ｄ７３．第１のオリゴヌクレオチドが、第１のプライマー結合ドメインを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ７２のいずれか１つの方法。
Ｄ７４．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第１のプライマー結合ドメインに相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｄ７３の方法。
Ｄ７５．第２のオリゴヌクレオチドが、第２のプライマー結合ドメインを含む、実施形態Ｄ３３～Ｄ７４のいずれか１つの方法。
Ｄ７６．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第２のプライマー結合ドメインに相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｄ７５の方法。
Ｄ７７．第１のオリゴヌクレオチドが、第１のシーケンシングアダプターまたはその一部を含む、実施形態Ｄ１～Ｄ７６のいずれか１つの方法。
Ｄ７８．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第１のシーケンシングアダプター、またはその一部、に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｄ７７の方法。
Ｄ７９．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第１のシーケンシングアダプター、またはその一部、に相補的なポリヌクレオチドを含まない、実施形態Ｄ７７の方法。
Ｄ８０．第２のオリゴヌクレオチドが、第２のシーケンシングアダプターまたはその一部を含む、実施形態Ｄ３３～Ｄ７９のいずれか１つの方法。
Ｄ８１．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第２のシーケンシングアダプター、またはその一部、に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｄ８０の方法。
Ｄ８２．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第２のシーケンシングアダプター、またはその一部、に相補的なポリヌクレオチドを含まない、実施形態Ｄ８０の方法。
Ｄ８３．第１のオリゴヌクレオチドが、固有分子識別子（ＵＭＩ）を含む、実施形態Ｄ１～Ｄ８２のいずれか１つの方法。
Ｄ８４．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、固有分子識別子（ＵＭＩ）に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｄ８３の方法。
Ｄ８５．第２のオリゴヌクレオチドが、固有分子識別子（ＵＭＩ）を含む、実施形態Ｄ３３～Ｄ８４のいずれか１つの方法。
Ｄ８６．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、固有分子識別子（ＵＭＩ）に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｄ８５の方法。
Ｄ８７．第１のオリゴヌクレオチドが、インデックスを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ８６のいずれか１つの方法。
Ｄ８８．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、インデックスに相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｄ８７の方法。
Ｄ８９．第２のオリゴヌクレオチドが、インデックスを含む、実施形態Ｄ３３～Ｄ８８のいずれか１つの方法。
Ｄ９０．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、インデックスに相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｄ８９の方法。
Ｄ９１．第１のオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ９０のいずれか１つの方法。
Ｄ９２．第２のオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｄ３３～Ｄ９１のいずれか１つの方法。
Ｄ９３．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、別のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸分子へのオリゴヌクレオチドの共有結合性連結を遮断することができる、実施形態Ｄ９１またはＤ９２の方法。
Ｄ９４．オリゴヌクレオチドが、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡに隣接していない末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｄ９１、Ｄ９２またはＤ９３に記載の方法。
Ｄ９５．第１の足場ポリヌクレオチド種の一部またはすべてが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ９４のいずれか１つの方法。
Ｄ９６．第２の足場ポリヌクレオチド種の一部またはすべてが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｄ３３～Ｄ９５のいずれか１つの方法。
Ｄ９７．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、別のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸分子への足場ポリヌクレオチドの共有結合性連結を遮断することができる、実施形態Ｄ９５またはＤ９６の方法。
Ｄ９８．足場ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの一方または両方の末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｄ９５からＤ９７のいずれか１つの方法。
Ｄ９９．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、ライゲーションを遮断する修飾を含む、実施形態Ｄ９１からＤ９８のいずれか１つの方法。
Ｄ１００．ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡが、結合させるステップの前に修飾されない、実施形態Ｄ１～Ｄ９９のいずれか１つの方法。
Ｄ１０１．ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡが、結合させるステップの前または結合させるステップ中に、一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）と結合されない、実施形態Ｄ１～Ｄ１００のいずれか１つの方法。
Ｄ１０２．結合させるステップの前に、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡと一本鎖核酸結合剤とを接触させるステップを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ１００のいずれか１つの方法。
Ｄ１０２．１ 結合させるステップの前に、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡと一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）とを接触させて、ＳＳＢ結合ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡを生成するステップを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ１００のいずれか１つの方法。
Ｄ１０３．ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡが第１のオリゴヌクレオチドおよび複数の第１の足場ポリヌクレオチド種と結合されたとき、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡの一方または両方のネイティブ末端が存在する、実施形態Ｄ１～Ｄ１０２．１のいずれか１つの方法。
Ｄ１０４．核酸組成物が、約２５０ｐｇ～約５ｎｇのｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ１０３のいずれか１つの方法。
Ｄ１０５．核酸組成物が、約１ｎｇのｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ１０４のいずれか１つの方法。
Ｄ１０６．核酸組成物が、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡから本質的になる、実施形態Ｄ１～Ｄ１０５のいずれか１つの方法。
Ｄ１０７．共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物を変性させるステップをさらに含み、それによって一本鎖ライゲーション産物が生成される、実施形態Ｄ２６～Ｄ１０６のいずれか１つの方法。
Ｄ１０８．一本鎖ライゲーション産物を増幅させるステップをさらに含み、それによって増幅ライゲーション産物が生成される、実施形態Ｄ１０７の方法。
Ｄ１０９．増幅ライゲーション産物を精製するステップをさらに含む、実施形態Ｄ１０８の方法。
Ｄ１１０．増幅ライゲーション産物が、固相可逆的固定法を含む精製プロセスにより精製される、実施形態Ｄ１０９の方法。
Ｄ１１１．増幅ライゲーション産物が、連続的固相可逆的固定法を含む精製プロセスにより精製される、実施形態Ｄ１１０の方法。
Ｄ１１２．増幅ライゲーション産物が、逐次的固相可逆的固定法を含む精製プロセスにより精製される、実施形態Ｄ１１０の方法。
Ｄ１１３．増幅ライゲーション産物が、カラム精製を含まない精製プロセスにより精製される、実施形態Ｄ１０９～Ｄ１１２のいずれか１つの方法。
Ｄ１１４．増幅ライゲーション産物が、増幅させるステップの後に精製されない、実施形態Ｄ１０８の方法。
Ｄ１１５．増幅ライゲーション産物をシーケンシングするステップをさらに含む、実施形態Ｄ１０８～Ｄ１１４のいずれか１つの方法。
Ｄ１１６．一本鎖ライゲーション産物が、増幅されない、実施形態Ｄ１０７の方法。
Ｄ１１７．ライゲーション産物をシーケンシングするステップをさらに含む、実施形態Ｄ１１６の方法。
Ｄ１１８．第１の足場二重鎖種が、（１）２本の鎖とオーバーハングとを第１の末端に、および２本の非相補鎖を第２の末端に含むか、または（２）一本鎖ループとオーバーハングとを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含む、実施形態Ｄ２０～Ｄ１１７のいずれか１つの方法。
Ｄ１１９．第２の足場二重鎖種が、（１）２本の鎖とオーバーハングとを第１の末端に、および２本の非相補鎖を第２の末端に含むか、または（２）一本鎖ループとオーバーハングとを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含む、実施形態Ｄ３４～Ｄ１１８のいずれか１つの方法。
Ｄ１２０．オーバーハングが、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域を含む、実施形態Ｄ１１８またはＤ１１９の方法。
Ｄ１２１．第１の足場二重鎖種、第１のオリゴヌクレオチド、および／または複数の第１の足場ポリヌクレオチド種が、１つまたは複数のホスホロチオエート骨格修飾を含む、実施形態Ｄ２０～Ｄ１２０のいずれか１つの方法。
Ｄ１２２．第２の足場二重鎖種、第２のオリゴヌクレオチド、および／または複数の第２の足場ポリヌクレオチド種が、１つまたは複数のホスホロチオエート骨格修飾を含む、実施形態Ｄ３４～Ｄ１２１のいずれか１つの方法。
Ｄ１２３．一本鎖ライゲーション産物と、第３のオリゴヌクレオチドとを、第３のオリゴヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドのダイマーとハイブリダイズされる条件下で結合させるステップをさらに含み、それによって、オリゴヌクレオチドダイマーハイブリダイゼーション産物が形成される、実施形態Ｄ１０７からＤ１２２のいずれか１つの方法。
Ｄ１２４．オリゴヌクレオチドダイマーハイブリダイゼーション産物が、切断部位を含む、実施形態Ｄ１２３の方法。
Ｄ１２５．切断部位が、制限酵素認識部位である、実施形態Ｄ１２４の方法。
Ｄ１２６．オリゴヌクレオチドダイマーハイブリダイゼーション産物と切断剤とを接触させるステップをさらに含む、実施形態Ｄ１２３からＤ１２５のいずれか１つの方法。
Ｄ１２７．複数の第１の足場ポリヌクレオチド種の中の１つまたは複数の足場ポリヌクレオチドが、１つまたは複数のデオキシウリジン塩基を含む、実施形態Ｄ１～Ｄ１２６のいずれか１つの方法。
Ｄ１２８．複数の第２の足場ポリヌクレオチド種の中の１つまたは複数の足場ポリヌクレオチドが、１つまたは複数のデオキシウリジン塩基を含む、実施形態Ｄ３３～Ｄ１２７のいずれか１つの方法。
Ｄ１２９．第１のオリゴヌクレオチドが、デオキシウリジン塩基を含まない、実施形態Ｄ１～Ｄ１２８のいずれか１つの方法。
Ｄ１３０．第２のオリゴヌクレオチドが、デオキシウリジン塩基を含まない、実施形態Ｄ３３～Ｄ１２９のいずれか１つの方法。
Ｄ１３１．共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物とウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼとを接触させるステップをさらに含む、実施形態Ｄ１２７～Ｄ１３０のいずれか１つの方法。
Ｄ１３２．第１の足場ポリヌクレオチド種および／または第２の足場ポリヌクレオチド種が、ＤＮＡを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ１３１のいずれか１つの方法。
Ｄ１３３．第１の足場ポリヌクレオチド種および／または第２の足場ポリヌクレオチド種が、ＲＮＡを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ１３１のいずれか１つの方法。
Ｄ１３４．第１のオリゴヌクレオチドおよび／または第２のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡを含む、実施形態Ｄ１からＤ１３３のいずれか１つの方法。
Ｄ１３５．第１のオリゴヌクレオチドおよび／または第２のオリゴヌクレオチドが、ＲＮＡを含む、実施形態Ｄ１からＤ１３３のいずれか１つの方法。
Ｄ１３６．結合させるステップの前に、核酸組成物とヌクレアーゼとを接触させるステップを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ１３５のいずれか１つの方法。
Ｄ１３７．ヌクレアーゼが、二本鎖特異的ヌクレアーゼである、実施形態Ｄ１３６の方法。
Ｅ１．一本鎖リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）または一本鎖相補デオキシリボ核酸（ｓｓｃＤＮＡ）を含む核酸組成物と、
第１のオリゴヌクレオチドと、
ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を各々が含む複数の第１の足場ポリヌクレオチド種と
を含む、組成物。
Ｅ２．第２のオリゴヌクレオチドと、
ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を各々が含む複数の第２の足場ポリヌクレオチド種と
をさらに含む、実施形態Ｅ１の組成物。
Ｅ３．第１の足場ポリヌクレオチド種の各々が第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされている、複数の第１の足場二重鎖種を含む、実施形態Ｅ１またはＥ２の組成物。
Ｅ４．第２の足場ポリヌクレオチド種の各々が第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされている、複数の第２の足場二重鎖種を含む、実施形態Ｅ２またはＥ３の組成物。
Ｅ５．複数の第１の足場二重鎖種およびｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡが、約３０：１の（第１の足場二重鎖種のｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡに対する）モル比で存在する、実施形態Ｅ３またはＥ４の組成物。
Ｅ６．複数の第１の足場二重鎖種およびｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡが、約１５：１の（第１の足場二重鎖種のｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡに対する）モル比で存在する、実施形態Ｅ３またはＥ４の組成物。
Ｅ７．複数の第２の足場二重鎖種およびｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡが、約３０：１の（第２の足場二重鎖種のｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡに対する）モル比で存在する、実施形態Ｅ４、Ｅ５またはＥ６の組成物。
Ｅ８．複数の第２の足場二重鎖種およびｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡが、約１５：１の（第２の足場二重鎖種のｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡに対する）モル比で存在する、実施形態Ｅ３またはＥ４の組成物。
Ｅ９．第１のオリゴヌクレオチド、複数の第１の足場ポリヌクレオチド種、および／または複数の第１の足場二重鎖種が、脱リン酸化されている、実施形態Ｅ３～Ｅ８のいずれか１つの組成物。
Ｅ１０．第２のオリゴヌクレオチド、複数の第２の足場ポリヌクレオチド種、および／または複数の第２の足場二重鎖種が、脱リン酸化されている、実施形態Ｅ４～Ｅ９のいずれか１つの組成物。
Ｅ１１．オリゴヌクレオチドの末端をｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡ末端領域の末端に共有結合で連結させるための薬剤をさらに含む、実施形態Ｅ１～Ｅ１０のいずれか１つの組成物。
Ｅ１２．薬剤が、リガーゼである、実施形態Ｅ１１の組成物。
Ｅ１３．リガーゼが、Ｔ４リガーゼである、実施形態Ｅ１２の組成物。
Ｅ１４．Ｔ４リガーゼが、２５単位／μｌ未満の量で存在する、実施形態Ｅ１３の組成物。
Ｅ１５．Ｔ４リガーゼが、約１０単位／μｌで存在する、実施形態Ｅ１４の組成物。
Ｅ１６．ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡが、５’末端においてリン酸化されている、実施形態Ｅ１～Ｅ１５のいずれか１つの組成物。
Ｅ１６．１ ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡが脱リン酸化されている、実施形態Ｅ１～Ｅ１５のいずれか１つの組成物。
Ｅ１７．第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、３’リン酸を含む、実施形態Ｅ１～Ｅ１６．１のいずれか１つの組成物。
Ｅ１８．ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡ末端領域の５’末端を、３’リン酸を含む第１のオリゴヌクレオチドまたは３’リン酸を含む第２のオリゴヌクレオチドの３’末端に、共有結合で連結させるための薬剤をさらに含む、実施形態Ｅ１７の組成物。
Ｅ１９．薬剤が、一本鎖リガーゼである、実施形態Ｅ１８の組成物。
Ｅ２０．リガーゼが、ＲｔｃＢリガーゼである、実施形態Ｅ１９の組成物。
Ｅ２１．第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、５’末端にアデニル化修飾を含む、実施形態Ｅ１～Ｅ１７のいずれか１つの組成物。
Ｅ２２．ＡＴＰ不含である、実施形態Ｅ２１の組成物。
Ｅ２３．ホスホリル転移活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｅ１～Ｅ２２のいずれか１つの組成物。
Ｅ２４．ホスホリル転移活性を有する薬剤を含まない、実施形態Ｅ１～Ｅ２２のいずれか１つの組成物。
Ｅ２５．第１の足場ポリヌクレオチド種の各々についてのｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域が、複数の第１の足場ポリヌクレオチド種の中の他の第１の足場ポリヌクレオチド種におけるｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域とは異なる、実施形態Ｅ１からＥ２４のいずれか１つの組成物。
Ｅ２６．第２の足場ポリヌクレオチド種の各々についてのｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域が、複数の第２の足場ポリヌクレオチド種の中の他の第２の足場ポリヌクレオチド種におけるｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域とは異なる、実施形態Ｅ２からＥ２５のいずれか１つの組成物。
Ｅ２７．ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域が、ランダム配列を含む、実施形態Ｅ１からＥ２６のいずれか１つの組成物。
Ｅ２８．ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域が、１つまたは複数のユニバーサル塩基を含む、実施形態Ｅ１からＥ２６のいずれか１つの組成物。
Ｅ２９．ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域が、約１０またはそれ未満の塩基を含む、実施形態Ｅ１～Ｅ２８のいずれか１つの組成物。
Ｅ３０．第１のオリゴヌクレオチドが、第１のプライマー結合ドメインを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ２９のいずれか１つの組成物。
Ｅ３１．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第１のプライマー結合ドメインに相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ３０の組成物。
Ｅ３２．第２のオリゴヌクレオチドが、第２のプライマー結合ドメインを含む、実施形態Ｅ２～Ｅ３１のいずれか１つの組成物。
Ｅ３３．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第２のプライマー結合ドメインに相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ３２の組成物。
Ｅ３４．第１のオリゴヌクレオチドが、第１のシーケンシングアダプターまたはその一部を含む、実施形態Ｅ１～Ｅ３３のいずれか１つの組成物。
Ｅ３５．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第１のシーケンシングアダプター、またはその一部、に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ３４の組成物。
Ｅ３６．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第１のシーケンシングアダプター、またはその一部、に相補的なポリヌクレオチドを含まない、実施形態Ｅ３４の組成物。
Ｅ３７．第２のオリゴヌクレオチドが、第２のシーケンシングアダプターまたはその一部を含む、実施形態Ｅ２～Ｅ３６のいずれか１つの組成物。
Ｅ３８．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第２のシーケンシングアダプター、またはその一部、に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ３７の組成物。
Ｅ３９．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第２のシーケンシングアダプター、またはその一部、に相補的なポリヌクレオチドを含まない、実施形態Ｅ３７の組成物。
Ｅ４０．第１のオリゴヌクレオチドが、固有分子識別子（ＵＭＩ）を含む、実施形態Ｅ１～Ｅ３９のいずれか１つの組成物。
Ｅ４１．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、固有分子識別子（ＵＭＩ）に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ４０の組成物。
Ｅ４２．第２のオリゴヌクレオチドが、固有分子識別子（ＵＭＩ）を含む、実施形態Ｅ２～Ｅ４１のいずれか１つの組成物。
Ｅ４３．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、固有分子識別子（ＵＭＩ）に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ４２の組成物。
Ｅ４４．第１のオリゴヌクレオチドが、インデックスを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ４３のいずれか１つの組成物。
Ｅ４５．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、インデックスに相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ４４の組成物。
Ｅ４６．第２のオリゴヌクレオチドが、インデックスを含む、実施形態Ｅ２～Ｅ４５のいずれか１つの組成物。
Ｅ４７．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、インデックスに相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ４６の組成物。
Ｅ４８．第１のオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ４７のいずれか１つの組成物。
Ｅ４９．第２のオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ２～Ｅ４８のいずれか１つの組成物。
Ｅ５０．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、別のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸分子へのオリゴヌクレオチドの共有結合性連結を遮断することができる、実施形態Ｅ４８またはＥ４９の組成物。
Ｅ５１．オリゴヌクレオチドが、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡ末端領域に隣接することにならない末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ４８、Ｅ４９またはＥ５０に記載の組成物。
Ｅ５２．第１の足場ポリヌクレオチド種の一部またはすべてが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ５１のいずれか１つの組成物。
Ｅ５３．第２の足場ポリヌクレオチド種の一部またはすべてが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ２～Ｅ５２のいずれか１つの組成物。
Ｅ５４．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、別のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸分子への足場ポリヌクレオチドの共有結合性連結を遮断することができる、実施形態Ｅ５２またはＥ５３の組成物。
Ｅ５５．足場ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの一方または両方の末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ５２からＥ５４のいずれか１つの組成物。
Ｅ５６．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、ライゲーションを遮断する修飾を含む、実施形態Ｅ４８からＥ５５のいずれか１つの組成物。
Ｅ５７．一本鎖核酸結合剤をさらに含む、実施形態Ｅ１～Ｅ５６のいずれか１つの組成物。
Ｅ５７．１ 一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）をさらに含む、実施形態Ｅ１～Ｅ５６のいずれか１つの組成物。
Ｅ５８．ＳＳＢ不含である、実施形態Ｅ１～Ｅ５７のいずれか１つの組成物。
Ｅ５９．核酸組成物が、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡから本質的になる、実施形態Ｅ１～Ｅ５６およびＥ５８のいずれか１つの組成物。
Ｅ６０．ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡが、未修飾ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡである、実施形態Ｅ１～Ｅ５９のいずれか１つの組成物。
Ｅ６１．ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡが、一方の末端または両方の末端にネイティブ末端を含む、実施形態Ｅ１～Ｅ６０のいずれか１つの組成物。
Ｅ６２．約２５０ｐｇ～約５ｎｇのｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ６１のいずれか１つの組成物。
Ｅ６３．約１ｎｇのｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ６２のいずれか１つの組成物。
Ｅ６４．第１の足場二重鎖種が、（１）２本の鎖とオーバーハングとを第１の末端に、および２本の非相補鎖を第２の末端に含むか、または（２）一本鎖ループとオーバーハングとを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含む、実施形態Ｅ３～Ｅ６３のいずれか１つの組成物。
Ｅ６５．第２の足場二重鎖種が、（１）２本の鎖とオーバーハングとを第１の末端に、および２本の非相補鎖を第２の末端に含むか、または（２）一本鎖ループとオーバーハングとを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含む、実施形態Ｅ４～Ｅ６４のいずれか１つの組成物。
Ｅ６６．オーバーハングが、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域を含む、実施形態Ｅ６４またはＥ６５の組成物。
Ｅ６７．第１の足場二重鎖種、第１のオリゴヌクレオチド、および／または複数の第１の足場ポリヌクレオチド種が、１つまたは複数のホスホロチオエート骨格修飾を含む、実施形態Ｅ３～Ｅ６６のいずれか１つの組成物。
Ｅ６８．第２の足場二重鎖種、第２のオリゴヌクレオチド、および／または複数の第２の足場ポリヌクレオチド種が、１つまたは複数のホスホロチオエート骨格修飾を含む、実施形態Ｅ４～Ｅ６７のいずれか１つの組成物。
Ｅ６９．第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドのダイマーとハイブリダイズすることができる、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含む、実施形態Ｅ２～Ｅ６８のいずれか１つの組成物。
Ｅ７０．第３のオリゴヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドのダイマーとハイブリダイズされたときに切断部位を形成する配列を含む、実施形態Ｅ６９の組成物。
Ｅ７１．切断部位が、制限酵素認識部位である、実施形態Ｅ７０の組成物。
Ｅ７２．切断剤をさらに含む、実施形態Ｅ６９～Ｅ７１のいずれか１つの組成物。
Ｅ７３．約２５μｌの体積の水溶液中に存在する、実施形態Ｅ１～Ｅ７２のいずれか１つの組成物。
Ｅ７４．核酸組成物が、ｓｓｃＤＮＡを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ７３のいずれか１つの組成物。
Ｅ７５．核酸組成物が、ｓｓＲＮＡを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ７３のいずれか１つの組成物。
Ｅ７６．逆転写酵素活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｅ１～Ｅ７５のいずれか１つの組成物。
Ｅ７７．ＲＮＡｓｅ活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｅ１～Ｅ７６のいずれか１つの組成物。
Ｅ７８．逆転写酵素活性およびＲＮＡｓｅ活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｅ１～Ｅ７７のいずれか１つの組成物。
Ｅ７９．薬剤が、Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写酵素である、実施形態Ｅ７８の組成物。
Ｅ８０．プライマーをさらに含む、実施形態Ｅ１～Ｅ７９のいずれか１つの組成物。
Ｅ８１．プライマーが、ランダムヘキサマープライマー、ランダムオクタマープライマー、およびポリ（Ｔ）プライマーのうちの１つまたは複数から選択される、実施形態Ｅ８０の組成物。
Ｅ８２．プライマーが、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチド中の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｅ８０の組成物。
Ｅ８３．複数の第１の足場ポリヌクレオチド種の中の１つまたは複数の足場ポリヌクレオチドが、１つまたは複数のデオキシウリジン塩基を含む、実施形態Ｅ１～Ｅ８２のいずれか１つの組成物。
Ｅ８４．複数の第２の足場ポリヌクレオチド種の中の１つまたは複数の足場ポリヌクレオチドが、１つまたは複数のデオキシウリジン塩基を含む、実施形態Ｅ２～Ｅ８３のいずれか１つの組成物。
Ｅ８５．第１のオリゴヌクレオチドが、デオキシウリジン塩基を含まない、実施形態Ｅ１～Ｅ８４のいずれか１つの組成物。
Ｅ８６．第２のオリゴヌクレオチドが、デオキシウリジン塩基を含まない、実施形態Ｅ２～Ｅ８５のいずれか１つの組成物。
Ｅ８７．第１の足場ポリヌクレオチド種および／または第２の足場ポリヌクレオチド種が、ＤＮＡを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ８６のいずれか１つの組成物。
Ｅ８８．第１の足場ポリヌクレオチド種および／または第２の足場ポリヌクレオチド種が、ＲＮＡを含む、実施形態Ｅ１～Ｅ８６のいずれか１つの組成物。
Ｅ８９．第１のオリゴヌクレオチドおよび／または第２のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡを含む、実施形態Ｅ１からＥ８７のいずれか１つの組成物。
Ｅ９０．第１のオリゴヌクレオチドおよび／または第２のオリゴヌクレオチドが、ＲＮＡを含む、実施形態Ｅ１からＥ８７のいずれか１つの組成物。
Ｅ９１．ヌクレアーゼをさらに含む、実施形態Ｅ１～Ｅ９０のいずれか１つの組成物。
Ｅ９２．ヌクレアーゼが、二本鎖特異的ヌクレアーゼである、実施形態Ｅ９１の組成物。
Ｆ１．第１のオリゴヌクレオチドと、
ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を各々が含む複数の第１の足場ポリヌクレオチド種と、
第１のオリゴヌクレオチドおよび複数の第１の足場ポリヌクレオチド種を使用してｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡから核酸ライブラリーを生成するための使用説明書と
を含む、キット。
Ｆ２．第２のオリゴヌクレオチドと、
ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を各々が含む複数の第２の足場ポリヌクレオチド種と
をさらに含み、使用説明書が、第１のオリゴヌクレオチド、複数の第１の足場ポリヌクレオチド種、第２のオリゴヌクレオチド、および複数の第２の足場ポリヌクレオチド種を使用して核酸ライブラリーを生成するためのものである、実施形態Ｆ１のキット。
Ｆ３．第１の足場ポリヌクレオチド種の各々が第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされている、複数の第１の足場二重鎖種を含む、実施形態Ｆ１またはＦ２のキット。
Ｆ４．第２の足場ポリヌクレオチド種の各々が第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされている、複数の第２の足場二重鎖種を含む、実施形態Ｆ２またはＦ３のキット。
Ｆ５．使用説明書が、複数の第１の足場二重鎖種およびｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡを、約３０：１の（第１の足場二重鎖種のｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡに対する）モル比で合わせることを含む、実施形態Ｆ３またはＦ４のキット。
Ｆ６．使用説明書が、複数の第１の足場二重鎖種およびｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡを、約１５：１の（第１の足場二重鎖種のｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡに対する）モル比で合わせることを含む、実施形態Ｆ３またはＦ４のキット。
Ｆ７．使用説明書が、複数の第２の足場二重鎖種およびｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡを、約３０：１の（第２の足場二重鎖種のｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡに対する）モル比で合わせることを含む、実施形態Ｆ４、Ｆ５またはＦ６のキット。
Ｆ８．使用説明書が、複数の第２の足場二重鎖種およびｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡを、約１５：１の（第２の足場二重鎖種のｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡに対する）モル比で合わせることを含む、実施形態Ｆ３またはＦ４のキット。
Ｆ９．第１のオリゴヌクレオチド、複数の第１の足場ポリヌクレオチド種、および／または複数の第１の足場二重鎖種が、脱リン酸化されている、実施形態Ｆ３～Ｆ８のいずれか１つのキット。
Ｆ１０．第２のオリゴヌクレオチド、複数の第２の足場ポリヌクレオチド種、および／または複数の第２の足場二重鎖種が、脱リン酸化されている、実施形態Ｆ４～Ｆ９のいずれか１つのキット。
Ｆ１１．オリゴヌクレオチドの末端をｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡ末端領域の末端に共有結合で連結させるための薬剤をさらに含む、実施形態Ｆ１～Ｆ１０のいずれか１つのキット。
Ｆ１２．薬剤が、リガーゼである、実施形態Ｆ１１のキット。
Ｆ１３．リガーゼが、Ｔ４リガーゼである、実施形態Ｆ１２のキット。
Ｆ１４．Ｔ４リガーゼが、２５単位／μｌ未満の量で存在する、実施形態Ｆ１３のキット。
Ｆ１５．Ｔ４リガーゼが、約１０単位／μｌで存在する、実施形態Ｆ１４のキット。
Ｆ１６．ホスファターゼをさらに含む、実施形態Ｆ１～Ｆ１５のいずれか１つのキット。
Ｆ１７．第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、３’リン酸を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ１６のいずれか１つのキット。
Ｆ１８．ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡ末端領域の５’末端を、３’リン酸を含む第１のオリゴヌクレオチドまたは３’リン酸を含む第２のオリゴヌクレオチドの３’末端に、共有結合で連結させるための薬剤をさらに含む、実施形態Ｆ１７のキット。
Ｆ１９．薬剤が、一本鎖リガーゼである、実施形態Ｆ１８のキット。
Ｆ２０．リガーゼが、ＲｔｃＢリガーゼである、実施形態Ｆ１９のキット。
Ｆ２１．第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、５’末端にアデニル化修飾を含む、実施形態Ｆ１～Ｆ１７のいずれか１つのキット。
Ｆ２２．ＡＴＰ不含である、実施形態Ｆ２１のキット。
Ｆ２３．ホスホリル転移活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｆ１～Ｆ２２のいずれか１つのキット。
Ｆ２４．ホスホリル転移活性を有する薬剤を含まない、実施形態Ｆ１～Ｆ２２のいずれか１つのキット。
Ｆ２５．第１の足場ポリヌクレオチド種の各々についてのｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域が、複数の第１の足場ポリヌクレオチド種の中の他の第１の足場ポリヌクレオチド種におけるｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域とは異なる、実施形態Ｆ１からＦ２４のいずれか１つのキット。
Ｆ２６．第２の足場ポリヌクレオチド種の各々についてのｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域が、複数の第２の足場ポリヌクレオチド種の中の他の第２の足場ポリヌクレオチド種におけるｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域とは異なる、実施形態Ｆ２からＦ２５のいずれか１つのキット。
Ｆ２７．ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域が、ランダム配列を含む、実施形態Ｆ１からＦ２６のいずれか１つのキット。
Ｆ２８．ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域が、１つまたは複数のユニバーサル塩基を含む、実施形態Ｆ１からＦ２６のいずれか１つのキット。
Ｆ２９．ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域が、約１０またはそれ未満の塩基を含む、実施形態Ｆ１～Ｆ２８のいずれか１つのキット。
Ｆ３０．第１のオリゴヌクレオチドが、第１のプライマー結合ドメインを含む、実施形態Ｆ１～Ｆ２９のいずれか１つのキット。
Ｆ３１．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第１のプライマー結合ドメインに相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｆ３０のキット。
Ｆ３２．第２のオリゴヌクレオチドが、第２のプライマー結合ドメインを含む、実施形態Ｆ２～Ｆ３１のいずれか１つのキット。
Ｆ３３．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第２のプライマー結合ドメインに相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｆ３２のキット。
Ｆ３４．第１のオリゴヌクレオチドが、第１のシーケンシングアダプターまたはその一部を含む、実施形態Ｆ１～Ｆ３３のいずれか１つのキット。
Ｆ３５．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第１のシーケンシングアダプター、またはその一部、に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｆ３４のキット。
Ｆ３６．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第１のシーケンシングアダプター、またはその一部、に相補的なポリヌクレオチドを含まない、実施形態Ｆ３４のキット。
Ｆ３７．第２のオリゴヌクレオチドが、第２のシーケンシングアダプターまたはその一部を含む、実施形態Ｆ２～Ｆ３６のいずれか１つのキット。
Ｆ３８．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第２のシーケンシングアダプター、またはその一部、に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｆ３７のキット。
Ｆ３９．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、第２のシーケンシングアダプター、またはその一部、に相補的なポリヌクレオチドを含まない、実施形態Ｆ３７のキット。
Ｆ４０．第１のオリゴヌクレオチドが、固有分子識別子（ＵＭＩ）を含む、実施形態Ｆ１～Ｆ３９のいずれか１つのキット。
Ｆ４１．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、固有分子識別子（ＵＭＩ）に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｆ４０のキット。
Ｆ４２．第２のオリゴヌクレオチドが、固有分子識別子（ＵＭＩ）を含む、実施形態Ｆ２～Ｆ４１のいずれか１つのキット。
Ｆ４３．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、固有分子識別子（ＵＭＩ）に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｆ４２のキット。
Ｆ４４．第１のオリゴヌクレオチドが、インデックスを含む、実施形態Ｆ１～Ｆ４３のいずれか１つのキット。
Ｆ４５．第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、インデックスに相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｆ４４のキット。
Ｆ４６．第２のオリゴヌクレオチドが、インデックスを含む、実施形態Ｆ２～Ｆ４５のいずれか１つのキット。
Ｆ４７．第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、インデックスに相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｆ４６のキット。
Ｆ４８．第１のオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｆ１～Ｆ４７のいずれか１つのキット。
Ｆ４９．第２のオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｆ２～Ｆ４８のいずれか１つのキット。
Ｆ５０．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、別のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸分子へのオリゴヌクレオチドの共有結合性連結を遮断することができる、実施形態Ｆ４８またはＦ４９のキット。
Ｆ５１．オリゴヌクレオチドが、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡ末端領域に隣接することにならない末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｆ４８、Ｆ４９またはＦ５０に記載のキット。
Ｆ５２．第１の足場ポリヌクレオチド種の一部またはすべてが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｆ１～Ｆ５１のいずれか１つのキット。
Ｆ５３．第２の足場ポリヌクレオチド種の一部またはすべてが、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｆ２～Ｆ５２のいずれか１つのキット。
Ｆ５４．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、別のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸分子への足場ポリヌクレオチドの共有結合性連結を遮断することができる、実施形態Ｆ５２またはＦ５３のキット。
Ｆ５５．足場ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの一方または両方の末端に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｆ５２からＦ５４のいずれか１つのキット。
Ｆ５６．１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、ライゲーションを遮断する修飾を含む、実施形態Ｆ４８からＦ５５のいずれか１つのキット。
Ｆ５７．使用説明書が、第１のオリゴヌクレオチドおよび複数の第１のポリヌクレオチド種と、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡを含む核酸組成物とを結合させることを含む、実施形態Ｆ１～Ｆ５６のいずれか１つのキット。
Ｆ５８．ｓｓＮＡが、ｓｓＲＮＡを含む、実施形態Ｆ５７のキット。
Ｆ５９．ｓｓＮＡが、ｓｓＲＮＡを含む、実施形態Ｆ５７のキット。
Ｆ６０．一本鎖核酸結合剤をさらに含む、実施形態Ｆ１～Ｆ５９のいずれか１つのキット。
Ｆ６０．１ 一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）をさらに含む、実施形態Ｆ１～Ｆ５９のいずれか１つのキット。
Ｆ６１．ＳＳＢ不含である、実施形態Ｆ１～Ｆ６０のいずれか１つのキット。
Ｆ６２．核酸組成物が、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡから本質的になる、実施形態Ｆ５７～Ｆ５９およびＦ６１のいずれか１つのキット。
Ｆ６３．ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡが、未修飾ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡである、実施形態Ｆ５７～Ｆ６２のいずれか１つのキット。
Ｆ６４．ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡが、一方の末端にネイティブ末端を含む、実施形態Ｆ５７～Ｆ６３のいずれか１つのキット。
Ｆ６５．ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡが、両方の末端にネイティブ末端を含む、実施形態Ｆ５７～Ｆ６３のいずれか１つのキット。
Ｆ６６．使用説明書が、第１のオリゴヌクレオチドおよび複数の第１のポリヌクレオチド種と、約２５０ｐｇ～約５ｎｇのｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡを含む核酸組成物とを結合させることを含む、実施形態Ｆ５７～Ｆ６５のいずれか１つのキット。
Ｆ６７．使用説明書が、第１のオリゴヌクレオチドおよび複数の第１のポリヌクレオチド種と、約１ｎｇのｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡを含む核酸組成物とを結合させることを含む、実施形態Ｆ５７～Ｆ６６のいずれか１つのキット。
Ｆ６８．第１の足場二重鎖種が、（１）２本の鎖とオーバーハングとを第１の末端に、および２本の非相補鎖を第２の末端に含むか、または（２）一本鎖ループとオーバーハングとを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含む、実施形態Ｆ３～Ｆ６７のいずれか１つのキット。
Ｆ６９．第２の足場二重鎖種が、（１）２本の鎖とオーバーハングとを第１の末端に、および２本の非相補鎖を第２の末端に含むか、または（２）一本鎖ループとオーバーハングとを有するヘアピン構造を形成することができる１本の鎖を含む、実施形態Ｆ４～Ｆ６８のいずれか１つのキット。
Ｆ７０．オーバーハングが、ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡハイブリダイゼーション領域を含む、実施形態Ｆ６８またはＦ６９のキット。
Ｆ７１．第１の足場二重鎖種、第１のオリゴヌクレオチド、および／または複数の第１の足場ポリヌクレオチド種が、１つまたは複数のホスホロチオエート骨格修飾を含む、実施形態Ｆ３～Ｆ７０のいずれか１つのキット。
Ｆ７２．第２の足場二重鎖種、第２のオリゴヌクレオチド、および／または複数の第２の足場ポリヌクレオチド種が、１つまたは複数のホスホロチオエート骨格修飾を含む、実施形態Ｆ４～Ｆ７１のいずれか１つのキット。
Ｆ７３．第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドのダイマーとハイブリダイズすることができる、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含む、実施形態Ｆ２～Ｆ７２のいずれか１つのキット。
Ｆ７４．第３のオリゴヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドのダイマーとハイブリダイズされたときに切断部位を形成する配列を含む、実施形態Ｆ７３のキット。
Ｆ７５．切断部位が、制限酵素認識部位である、実施形態Ｆ７４のキット。
Ｆ７６．切断剤をさらに含む、実施形態Ｆ７３～Ｆ７５のいずれか１つのキット。
Ｆ７７．逆転写酵素活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｆ１～Ｆ７６のいずれか１つのキット。
Ｆ７８．ＲＮＡｓｅ活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｆ１～Ｆ７７のいずれか１つのキット。
Ｆ７９．逆転写酵素活性およびＲＮＡｓｅ活性を有する薬剤をさらに含む、実施形態Ｆ１～Ｆ７８のいずれか１つのキット。
Ｆ８０．薬剤が、Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写酵素である、実施形態Ｆ７９のキット。
Ｆ８１．プライマーをさらに含む、実施形態Ｆ１～Ｆ８０のいずれか１つのキット。
Ｆ８２．プライマーが、ランダムヘキサマープライマー、ランダムオクタマープライマー、およびポリ（Ｔ）プライマーのうちの１つまたは複数から選択される、実施形態Ｆ８１のキット。
Ｆ８３．プライマーが、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチド中の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｆ８１のキット。
Ｆ８４．核酸を精製するための試薬をさらに含む、実施形態Ｆ１～Ｆ８３のいずれか１つのキット。
Ｆ８４．１ 核酸を精製するための試薬が、固相可逆的固定法ビーズおよび緩衝液を含む、実施形態Ｆ８４のキット。
Ｆ８４．２ 緩衝液が、イソプロパノールを含む、実施形態Ｆ８４．１のキット。
Ｆ８４．３ 緩衝液が、約１０％ ｖ／ｖイソプロパノール～約４０％ ｖ／ｖイソプロパノールを含む、実施形態Ｆ８４．２のキット。
Ｆ８４．４ 緩衝液が、約２０％ ｖ／ｖイソプロパノールを含む、実施形態Ｆ８４．２のキット。
Ｆ８５．核酸を増幅するための試薬をさらに含む、実施形態Ｆ１～Ｆ８４．４のいずれか１つのキット。
Ｆ８６．ｍＲＮＡを濃縮するおよび／またはｒＲＮＡを枯渇させるための試薬をさらに含む、実施形態Ｆ１～Ｆ８５のいずれか１つのキット。
Ｆ８７．ｓｓＲＮＡを断片化するための試薬をさらに含む、実施形態Ｆ１～Ｆ８６のいずれか１つのキット。
Ｆ８８．複数の第１の足場ポリヌクレオチド種の中の１つまたは複数の足場ポリヌクレオチドが、１つまたは複数のデオキシウリジン塩基を含む、実施形態Ｆ１～Ｆ８７のいずれか１つのキット。
Ｆ８９．複数の第２の足場ポリヌクレオチド種の中の１つまたは複数の足場ポリヌクレオチドが、１つまたは複数のデオキシウリジン塩基を含む、実施形態Ｆ２～Ｆ８８のいずれか１つのキット。
Ｆ９０．第１のオリゴヌクレオチドが、デオキシウリジン塩基を含まない、実施形態Ｆ１～Ｆ８９のいずれか１つのキット。
Ｆ９１．第２のオリゴヌクレオチドが、デオキシウリジン塩基を含まない、実施形態Ｆ２～Ｆ９０のいずれか１つのキット。
Ｆ９２．ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼをさらに含む、実施形態Ｆ８８～Ｆ９１のいずれか１つのキット。
Ｆ９３．第１の足場ポリヌクレオチド種および／または第２の足場ポリヌクレオチド種が、ＤＮＡを含む、実施形態Ｆ１～Ｆ９２のいずれか１つのキット。
Ｆ９４．第１の足場ポリヌクレオチド種および／または第２の足場ポリヌクレオチド種が、ＲＮＡを含む、実施形態Ｆ１～Ｆ９２のいずれか１つのキット。
Ｆ９５．第１のオリゴヌクレオチドおよび／または第２のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡを含む、実施形態Ｆ１からＦ９４のいずれか１つのキット。
Ｆ９６．第１のオリゴヌクレオチドおよび／または第２のオリゴヌクレオチドが、ＲＮＡを含む、実施形態Ｆ１からＦ９４のいずれか１つのキット。
Ｆ９７．ヌクレアーゼをさらに含む、実施形態Ｆ１～Ｆ９６のいずれか１つのキット。
Ｆ９８．ヌクレアーゼが、二本鎖特異的ヌクレアーゼである、実施形態Ｆ９７のキット。
Ｇ１．一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）の純度および／または品質の評定に使用するための、実施形態Ａ１～Ａ１２４のいずれか１つの方法。
Ｇ２．ｓｓＮＡが、一本鎖オリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｇ１の方法。
Ｇ３．一本鎖オリゴヌクレオチドが、商業生産される、実施形態Ｇ２の方法。
Ｇ４．ｓｓＮＡが、一本鎖プローブを含む、実施形態Ｇ１の方法。
Ｇ５．一本鎖プローブが、商業生産される、実施形態Ｇ４の方法。
Ｇ６．ｓｓＮＡの純度および／または品質が、断片長プロファイルに従って評定される、実施形態Ｇ１～Ｇ５のいずれか１つの方法。
Ｇ７．ｓｓＮＡの純度および／または品質が、断片長プロファイルにおける主要なｓｓＮＡ種の量および副次的なｓｓＮＡ種の量に従って評定される、実施形態Ｇ６の方法。
Ｈ１．一本鎖リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）または一本鎖相補デオキシリボ核酸（ｓｓｃＤＮＡ）の純度および／または品質の評定に使用するための、実施形態Ｄ１～Ｄ１３７のいずれか１つの方法。
Ｈ２．ｓｓＲＮＡが、一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｈ１の方法。
Ｈ３．一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、商業生産される、実施形態Ｈ２の方法。
Ｈ４．ｓｓＲＮＡが、一本鎖ＲＮＡプローブを含む、実施形態Ｈ１の方法。
Ｈ５．一本鎖ＲＮＡプローブが、商業生産される、実施形態Ｈ４の方法。
Ｈ６．ｓｓｃＤＮＡが、一本鎖ｃＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｈ１の方法。
Ｈ７．一本鎖ｃＤＮＡオリゴヌクレオチドが、商業生産される、実施形態Ｈ６の方法。
Ｈ８．ｓｓｃＤＮＡが、一本鎖ｃＤＮＡプローブを含む、実施形態Ｈ１の方法。
Ｈ９．一本鎖ｃＤＮＡプローブが、商業生産される、実施形態Ｈ８の方法。
Ｈ１０．ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡの純度および／または品質が、断片長プロファイルに従って評定される、実施形態Ｈ１～Ｈ９のいずれか１つの方法。
Ｈ１１．ｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡの純度および／または品質が、断片長プロファイルにおける主要なｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡ種の量および副次的なｓｓＲＮＡまたはｓｓｃＤＮＡ種の量に従って評定される、実施形態Ｈ１０の方法。
Ｉ１．ニッキングされたＤＮＡを含む試料の評定に使用するための、実施形態Ａ１～Ａ１２４のいずれか１つの方法。
Ｊ１．核酸試料中の標的核酸の濃縮に使用するための、実施形態Ａ１～Ａ１２４のいずれか１つの方法。
* * *
本明細書で参照される各特許、特許出願、公報および文献の全体が、参照により組み込まれる。上記特許、特許出願、公報および文献の引用は、上述のもののいずれかが関連先行技術であることの承認ではなく、これらの公報および文献の内容または日付についてのいかなる承認にも相当しない。それらの引用は、関連する開示の検索の指示ではない。これらの文献の日付または内容に関するすべての記載は、入手可能な情報に基づくものであり、それらの正確さについて承認するものでも、それらの正当性について承認するものでもない。
本技術の基本態様から逸脱することなく、上述の事物に修飾を加えることができる。本技術を１つまたは複数の特定の実施形態に関してかなり詳細に説明したが、当業者には、本願で具体的に開示される実施形態に変更を加えることができ、それでもこれらの修飾形態および改善形態が、本技術の範囲および趣旨の範囲内であることは、認識されると予想される。
本明細書で例証して説明した本技術は、本明細書で具体的に開示していない、いずれかの要素の非存在下で好適に実施されることがある。したがって、例えば、本明細書での各事例では、用語「含む」、「から本質的になる」、および「からなる」のいずれかを、他の２つの用語のどちらかで置き換えることができる。用いた用語および表現は、説明用語として使用しており、限定用語として使用しておらず、そのような用語および表現の使用は、示されているおよび説明されている特徴またはそれらの部分のいかなる均等物も除外せず、様々な修飾形態が請求項記載の本技術の範囲内で可能である。用語「ａ」または「ａｎ」は、この用語が修飾する要素の１つまたは複数の要素を、要素の１つが記載されているのか、または要素の１つより多くが記載されているのかが、文脈上明白である場合を除き、指すことができる（例えば、「試薬（ａ ｒｅａｇｅｎｔ）」は、１つまたは複数の試薬を意味することができる）。用語「約」は、本明細書で使用される場合、基礎をなすパラメーターの１０％以内の値（すなわち、プラスまたはマイナス１０％）を指し、一連の値の始めに用語「約」を使用することにより、値の各々が修飾される（すなわち、「約１、２および３」は、約１、約２および約３を指す）。例えば、「約１００グラム」の重量は、９０グラム～１１０グラムの間の重量を含み得る。さらに、値のリスト（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％または８６％）が本明細書に記載されている場合、このリストは、それらのすべての中間値および分数値（例えば、５４％、８５．４％）を含む。したがって、本技術を代表実施形態および必要に応じた特徴により具体的に開示したが、本明細書で開示した概念の修飾形態および変形形態を当業者は用いることができること、ならびにそのような修飾形態および変形形態が本技術の範囲内で考えられることは、理解されるはずである。
本技術のある特定の実施形態を後続の特許請求の範囲で示す。

Claims (88)

  1. 核酸ライブラリーを生成する方法であって、
    （ｉ）一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を含む核酸組成物と、（ｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドと、（ｉｉｉ）複数の第１の足場ポリヌクレオチド種とを結合させるステップを含み、
    （ａ）前記複数の第１の足場ポリヌクレオチド種における各ポリヌクレオチドが、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含み；
    （ｂ）前記核酸組成物、前記第１のオリゴヌクレオチド、および前記複数の第１の足場ポリヌクレオチド種が、前記第１の足場ポリヌクレオチド種の分子が（ｉ）第１のｓｓＮＡ末端領域および（ｉｉ）前記第１のオリゴヌクレオチドの分子とハイブリダイズされる条件下で結合され、それによって、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記分子の末端が前記第１のｓｓＮＡ末端領域の末端に隣接しているハイブリダイゼーション産物が形成され；
    （ｃ）前記ｓｓＮＡが、前記結合させるステップの前または前記結合させるステップ中に一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）と結合されない、方法。
  2. 前記結合させるステップの前に、前記第１のオリゴヌクレオチドおよび／または前記複数の第１の足場ポリヌクレオチド種と、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、前記第１のオリゴヌクレオチドおよび／または前記複数の第１の足場ポリヌクレオチド種が脱リン酸化される条件下で接触させるステップをさらに含み、それによって、脱リン酸化された第１のオリゴヌクレオチドおよび／または脱リン酸化された第１の足場ポリヌクレオチド種が生成される、請求項１に記載の方法。
  3. 核酸ライブラリーを生成する方法であって、
    第１のオリゴヌクレオチドおよび複数の第１の足場ポリヌクレオチド種と、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記複数の第１の足場ポリヌクレオチド種が脱リン酸化される条件下で接触させるステップであって、それによって、脱リン酸化された第１のオリゴヌクレオチドおよび複数の脱リン酸化された第１の足場ポリヌクレオチド種が生成される、ステップ；および
    （ｉ）一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を含む核酸組成物と、（ｉｉ）前記脱リン酸化された第１のオリゴヌクレオチドと、（ｉｉｉ）前記複数の脱リン酸化された第１の足場ポリヌクレオチド種とを結合させるステップ
    を含み、
    （ａ）前記複数の第１の足場ポリヌクレオチド種における各ポリヌクレオチドが、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含み；
    （ｂ）前記核酸組成物と、前記脱リン酸化された第１のオリゴヌクレオチドと、前記脱リン酸化された複数の第１の足場ポリヌクレオチド種とが、前記第１の足場ポリヌクレオチド種の分子が（ｉ）第１のｓｓＮＡ末端領域および（ｉｉ）前記第１のオリゴヌクレオチドの分子とハイブリダイズされる条件下で結合され、それによって、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記分子の末端が前記第１のｓｓＮＡ末端領域の末端に隣接しているハイブリダイゼーション産物が形成される、方法。
  4. 前記ｓｓＮＡが、前記結合させるステップの前または前記結合させるステップ中に、一本鎖核酸結合タンパク質（ＳＳＢ）と結合されない、請求項３に記載の方法。
  5. 前記結合させるステップの前に、
    前記ｓｓＮＡと、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、前記ｓｓＮＡが脱リン酸化される条件下で接触させるステップであって、それによって、脱リン酸化ｓｓＮＡが生成されるステップ；および
    第２のオリゴヌクレオチドを前記ｓｓＮＡの５’末端に共有結合で連結させるステップ
    をさらに含み、（ｉ）前記第２のオリゴヌクレオチドが、３’末端にリン酸を含み、（ｉｉ）前記第２のオリゴヌクレオチドを共有結合で連結させるステップが、前記ｓｓＮＡおよび前記第２のオリゴヌクレオチドと、一本鎖リガーゼ活性を有する薬剤とを、前記ｓｓＮＡの５’末端が前記第２のオリゴヌクレオチドの３’末端に共有結合で連結される条件下で、接触させることを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記核酸組成物と、（ｉｖ）第２のオリゴヌクレオチドおよび（ｖ）複数の第２の足場ポリヌクレオチド種とを結合させるステップをさらに含み、
    （ｃ）前記複数の第２の足場ポリヌクレオチド種における各ポリヌクレオチドが、ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を含み；
    （ｄ）前記核酸組成物、前記第２のオリゴヌクレオチド、および前記複数の第２の足場ポリヌクレオチド種が、前記第２の足場ポリヌクレオチド種の分子が（ｉ）第２のｓｓＮＡ末端領域および（ｉｉ）前記第２のオリゴヌクレオチドの分子とハイブリダイズされる条件下で結合され、それによって、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記分子の末端が前記第２のｓｓＮＡ末端領域の末端に隣接しているハイブリダイゼーション産物が形成される、
    請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記結合させるステップの前に、前記第２のオリゴヌクレオチドおよび／または前記複数の第２の足場ポリヌクレオチド種と、ホスファターゼ活性を有する薬剤とを、前記第２のオリゴヌクレオチドおよび／または前記複数の第２の足場ポリヌクレオチド種が脱リン酸化される条件下で接触させるステップをさらに含み、それによって、脱リン酸化された第２のオリゴヌクレオチドおよび／または脱リン酸化された第２の足場ポリヌクレオチド種が生成される、請求項６に記載の方法。
  8. 前記結合させるステップの前に、前記第１の足場ポリヌクレオチド種の各々が、第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされて複数の第１の足場二重鎖種を形成し、前記第２の足場ポリヌクレオチド種の各々が、第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされて複数の第２の足場二重鎖種を形成する、請求項６または７に記載の方法。
  9. 前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第１のｓｓＮＡ末端領域の隣接している末端を共有結合で連結させるステップ、ならびに前記第２のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のｓｓＮＡ末端領域の隣接している末端を共有結合で連結させるステップをさらに含み、それによって共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物を生成する、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記共有結合で連結させるステップが、前記ハイブリダイゼーション産物と、リガーゼ活性を有する薬剤とを、前記第１のｓｓＮＡ末端領域の末端が前記第１のオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結され、かつ前記第２のｓｓＮＡ末端領域の末端が前記第２のオリゴヌクレオチドの末端に共有結合で連結される条件下で、接触させることを含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記複数の第１の足場二重鎖種における二重鎖の一部またはすべてが、前記第１のオリゴヌクレオチドの５’末端にアデニル化修飾を含み、前記複数の第１の足場二重鎖種が、ＡＴＰの非存在下で前記ｓｓＮＡと結合され、前記ｓｓＮＡに共有結合で連結され、それによって、共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物中間体が形成される、請求項８に記載の方法。
  12. 前記共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物中間体が、前記複数の第２の足場二重鎖種およびＡＴＰと結合され、前記複数の第２の足場二重鎖種およびＡＴＰに共有結合で連結され、それによって共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物が形成される、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記結合させるステップおよび前記共有結合で連結させるステップが、３０分またはそれ未満で行なわれる、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記結合させるステップおよび前記共有結合で連結させるステップが、単一容器内で行なわれる、請求項９から１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記第１のポリヌクレオチド種の各々についての前記ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、前記複数の第１のポリヌクレオチド種の中の他の第１のポリヌクレオチド種におけるｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域とは異なる、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記第２のポリヌクレオチド種の各々についての前記ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、前記複数の第２のポリヌクレオチド種の中の他の第２のポリヌクレオチド種におけるｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域とは異なる、請求項６から１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、ランダム配列を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、１つまたは複数のユニバーサル塩基を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. ａ）前記第１のオリゴヌクレオチドが、
    （ｉ）第１のプライマー結合ドメイン、
    （ｉｉ）第１のシーケンシングアダプター、もしくはその一部、
    （ｉｉｉ）固有分子識別子（ＵＭＩ）、および
    （ｉｖ）インデックス
    のうちの１つまたは複数を含み、
    ｂ）前記第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、
    （ｉ）前記第１のプライマー結合ドメインに相補的なポリヌクレオチド、
    （ｉｉ）前記第１のシーケンシングアダプター、もしくはその一部、に相補的なポリヌクレオチド、
    （ｉｉｉ）前記固有分子識別子（ＵＭＩ）に相補的なポリヌクレオチド、および
    （ｉｖ）前記インデックスに相補的なポリヌクレオチド
    のうちの１つまたは複数を含む、
    請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. ａ）前記第２のオリゴヌクレオチドが、
    （ｉ）第２のプライマー結合ドメイン、
    （ｉｉ）第２のシーケンシングアダプター、もしくはその一部、
    （ｉｉｉ）固有分子識別子（ＵＭＩ）、および
    （ｉｖ）インデックス
    のうちの１つまたは複数を含み、
    ｂ）前記第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、
    （ｉ）前記第２のプライマー結合ドメインに相補的なポリヌクレオチド、
    （ｉｉ）前記第２のシーケンシングアダプター、もしくはその一部、に相補的なポリヌクレオチド、
    （ｉｉｉ）前記固有分子識別子（ＵＭＩ）に相補的なポリヌクレオチド、および
    （ｉｖ）前記インデックスに相補的なポリヌクレオチド
    のうちの１つまたは複数を含む、
    請求項６から１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記第１のオリゴヌクレオチドが、１つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含むか、前記第１の足場ポリヌクレオチド種の一部もしくはすべてが、１つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含むか、または前記第１のオリゴヌクレオチドが、１つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含み、かつ前記第１の足場ポリヌクレオチド種の一部もしくはすべてが、１つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記第２のオリゴヌクレオチドが、１つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含むか、前記第２の足場ポリヌクレオチド種の一部もしくはすべてが、１つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含むか、または前記第２のオリゴヌクレオチドが、１つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含み、かつ前記第２の足場ポリヌクレオチド種の一部もしくはすべてが、１つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項６から２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、別のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸分子への前記オリゴヌクレオチドの共有結合性連結を遮断することができる、請求項２１または２２に記載の方法。
  24. 前記オリゴヌクレオチドが、前記ｓｓＮＡに隣接していない末端に前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項２１、２２または２３に記載の方法。
  25. 前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、別のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸分子への前記足場ポリヌクレオチドの共有結合性連結を遮断することができる、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記足場ポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドの一方または両方の末端に前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項２１から２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、ライゲーションを遮断する修飾を含む、請求項２１から２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記共有結合で連結されたハイブリダイゼーション産物を変性させるステップをさらに含み、それによって一本鎖ライゲーション産物が生成される、請求項９から２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記一本鎖ライゲーション産物と、第３のオリゴヌクレオチドとを、前記第３のオリゴヌクレオチドが、前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドのダイマーとハイブリダイズされる条件下で結合させるステップをさらに含み、それによって、オリゴヌクレオチドダイマーハイブリダイゼーション産物が形成される、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記オリゴヌクレオチドダイマーハイブリダイゼーション産物が、切断部位を含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記切断部位が、制限酵素認識部位である、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記オリゴヌクレオチドダイマーハイブリダイゼーション産物と切断剤とを接触させるステップをさらに含む、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記第１の足場ポリヌクレオチド種および／または前記第２の足場ポリヌクレオチド種が、ＤＮＡを含む、請求項６から３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記第１の足場ポリヌクレオチド種および／または前記第２の足場ポリヌクレオチド種が、ＲＮＡを含む、請求項６から３２のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記第１のオリゴヌクレオチドおよび／または前記第２のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡを含む、請求項６から３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記第１のオリゴヌクレオチドおよび／または前記第２のオリゴヌクレオチドが、ＲＮＡを含む、請求項６から３４のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記結合させるステップの前に、前記核酸組成物とヌクレアーゼとを接触させるステップを含む、請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記ヌクレアーゼが、二本鎖特異的ヌクレアーゼである、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記核酸組成物が、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含むか、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を含むか、またはｓｓＤＮＡおよびｓｓＲＮＡを含む、請求項１から３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記ｓｓＮＡが、前記結合させるステップの前に修飾されない、請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記ｓｓＮＡが前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記複数の第１の足場ポリヌクレオチド種と結合されたとき、前記ｓｓＮＡの一方または両方のネイティブ末端が存在する、請求項１から４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記ｓｓＮＡが、無細胞核酸からのものである、請求項１から４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記核酸組成物が、ｓｓＮＡから本質的になる、請求項１から４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 第１のオリゴヌクレオチドと、
    ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を各々が含む複数の第１の足場ポリヌクレオチド種と
    を含む、ＳＳＢ不含組成物。
  45. 前記第１のオリゴヌクレオチドおよび／または前記複数の第１の足場ポリヌクレオチド種が、脱リン酸化されている、請求項４４に記載の組成物。
  46. 脱リン酸化された第１のオリゴヌクレオチドと、
    ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を各々が含む複数の脱リン酸化された第１の足場ポリヌクレオチド種と
    を含む、組成物。
  47. ＳＳＢ不含一本鎖核酸（ｓｓＮＡ）を含む核酸組成物をさらに含む、請求項４４、４５または４６に記載の組成物。
  48. 第２のオリゴヌクレオチドと、
    ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域および第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域を各々が含む複数の第２の足場ポリヌクレオチド種と
    をさらに含む、請求項４４から４７のいずれか一項に記載の組成物。
  49. 前記第２のオリゴヌクレオチドおよび／または前記複数の第２の足場ポリヌクレオチド種が、脱リン酸化されている、請求項４８に記載の組成物。
  50. 前記第１の足場ポリヌクレオチド種の各々が第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされている、複数の第１の足場二重鎖種と、前記第２の足場ポリヌクレオチド種の各々が第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされている、複数の第２の足場二重鎖種とを含む、請求項４８または４９に記載の組成物。
  51. オリゴヌクレオチドの末端をｓｓＮＡ末端領域の末端に共有結合で連結させるための薬剤をさらに含む、請求項４４から５０のいずれか一項に記載の組成物。
  52. 前記薬剤が、リガーゼである、請求項５１に記載の組成物。
  53. 前記リガーゼが、Ｔ４リガーゼである、請求項５２に記載の組成物。
  54. 前記第１のオリゴヌクレオチドまたは前記第２のオリゴヌクレオチドが、３’リン酸を含む、請求項４４から５３のいずれか一項に記載の組成物。
  55. ｓｓＮＡ末端領域の５’末端を、前記３’リン酸を含む前記第１のオリゴヌクレオチドまたは前記３’リン酸を含む前記第２のオリゴヌクレオチドの３’末端に、共有結合で連結させるための薬剤をさらに含む、請求項５４に記載の組成物。
  56. 前記薬剤が、一本鎖リガーゼである、請求項５５に記載の組成物。
  57. 前記リガーゼが、ＲｔｃＢリガーゼである、請求項５６に記載の組成物。
  58. 前記第１のオリゴヌクレオチドまたは前記第２のオリゴヌクレオチドが、５’末端にアデニル化修飾を含む、請求項４４から５３のいずれか一項に記載の組成物。
  59. ＡＴＰ不含である、請求項５８に記載の組成物。
  60. 前記第１の足場ポリヌクレオチド種の各々についての前記ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、前記複数の第１の足場ポリヌクレオチド種の中の他の第１の足場ポリヌクレオチド種におけるｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域とは異なる、請求項４４から５９のいずれか一項に記載の組成物。
  61. 前記第２の足場ポリヌクレオチド種の各々についての前記ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、前記複数の第２の足場ポリヌクレオチド種の中の他の第２の足場ポリヌクレオチド種におけるｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域とは異なる、請求項４８から６０のいずれか一項に記載の組成物。
  62. 前記ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、ランダム配列を含む、実施形態４４から６１のいずれか一項に記載の組成物。
  63. 前記ｓｓＮＡハイブリダイゼーション領域が、１つまたは複数のユニバーサル塩基を含む、実施形態４４から６２のいずれか一項に記載の組成物。
  64. ａ）前記第１のオリゴヌクレオチドが、
    （ｉ）第１のプライマー結合ドメイン、
    （ｉｉ）第１のシーケンシングアダプター、もしくはその一部、
    （ｉｉｉ）固有分子識別子（ＵＭＩ）、および
    （ｉｖ）インデックス
    のうちの１つまたは複数を含み、
    ｂ）前記第１のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、
    （ｉ）前記第１のプライマー結合ドメインに相補的なポリヌクレオチド、
    （ｉｉ）前記第１のシーケンシングアダプター、もしくはその一部、に相補的なポリヌクレオチド、
    （ｉｉｉ）前記固有分子識別子（ＵＭＩ）に相補的なポリヌクレオチド、および
    （ｉｖ）前記インデックスに相補的なポリヌクレオチド
    のうちの１つまたは複数を含む、
    請求項４４から６３のいずれか一項に記載の組成物。
  65. ａ）前記第２のオリゴヌクレオチドが、
    （ｉ）第２のプライマー結合ドメイン、
    （ｉｉ）第２のシーケンシングアダプター、もしくはその一部、
    （ｉｉｉ）固有分子識別子（ＵＭＩ）、および
    （ｉｖ）インデックス
    のうちの１つまたは複数を含み、
    ｂ）前記第２のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション領域が、
    （ｉ）前記第２のプライマー結合ドメインに相補的なポリヌクレオチド、
    （ｉｉ）前記第２のシーケンシングアダプター、もしくはその一部、に相補的なポリヌクレオチド、
    （ｉｉｉ）前記固有分子識別子（ＵＭＩ）に相補的なポリヌクレオチド、および
    （ｉｖ）前記インデックスに相補的なポリヌクレオチド
    のうちの１つまたは複数を含む、
    請求項４８から６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記第１のオリゴヌクレオチドが、１つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含むか、前記第１の足場ポリヌクレオチド種の一部もしくはすべてが、１つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含むか、または前記第１のオリゴヌクレオチドが、１つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含み、かつ前記第１の足場ポリヌクレオチド種の一部もしくはすべてが、１つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項４４から６５のいずれか一項に記載の組成物。
  67. 前記第２のオリゴヌクレオチドが、１つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含むか、前記第２の足場ポリヌクレオチド種の一部もしくはすべてが、１つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含むか、または前記第２のオリゴヌクレオチドが、１つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含み、かつ前記第２の足場ポリヌクレオチド種の一部もしくはすべてが、１つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項４８から６６のいずれか一項に記載の組成物。
  68. 前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、別のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸分子への前記オリゴヌクレオチドの共有結合性連結を遮断することができる、請求項６６または６７に記載の組成物。
  69. 前記オリゴヌクレオチドが、ｓｓＮＡ末端領域に隣接することにならない末端に前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項６６、６７または６８に記載の組成物。
  70. 前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、別のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸分子への前記足場ポリヌクレオチドの共有結合性連結を遮断することができる、請求項６６から６９のいずれか一項に記載の組成物。
  71. 前記足場ポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドの一方または両方の末端に前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項６６から７０のいずれか一項に記載の組成物。
  72. 前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、ライゲーションを遮断する修飾を含む、請求項６６から７１のいずれか一項に記載の組成物。
  73. 前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドのダイマーとハイブリダイズすることができる、第３のオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項４８から７２のいずれか一項に記載の組成物。
  74. 前記第３のオリゴヌクレオチドが、前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドのダイマーとハイブリダイズされたときに切断部位を形成する配列を含む、請求項７３に記載の組成物。
  75. 前記切断部位が、制限酵素認識部位である、請求項７４に記載の組成物。
  76. 切断剤をさらに含む、請求項７３から７５のいずれか一項に記載の組成物。
  77. 前記第１の足場ポリヌクレオチド種および／または前記第２の足場ポリヌクレオチド種が、ＤＮＡを含む、請求項４８から７６のいずれか一項に記載の組成物。
  78. 前記第１の足場ポリヌクレオチド種および／または前記第２の足場ポリヌクレオチド種が、ＲＮＡを含む、請求項４８から７６のいずれか一項に記載の組成物。
  79. 前記第１のオリゴヌクレオチドおよび／または前記第２のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡを含む、請求項４８から７８のいずれか一項に記載の組成物。
  80. 前記第１のオリゴヌクレオチドおよび／または前記第２のオリゴヌクレオチドが、ＲＮＡを含む、請求項４８から７８のいずれか一項に記載の組成物。
  81. ヌクレアーゼをさらに含む、請求項４４から８０のいずれか一項に記載の組成物。
  82. 前記ヌクレアーゼが、二本鎖特異的ヌクレアーゼである、請求項８１に記載の組成物。
  83. 前記核酸組成物が、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含むか、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を含むか、またはｓｓＤＮＡおよびｓｓＲＮＡを含む、請求項４４から８２のいずれか一項に記載の組成物。
  84. 前記ｓｓＮＡが、未修飾ｓｓＮＡである、請求項４４から８３のいずれか一項に記載の組成物。
  85. 前記ｓｓＮＡが、一方の末端または両方の末端にネイティブ末端を含む、請求項４４から８４のいずれか一項に記載の組成物。
  86. 前記ｓｓＮＡが、無細胞核酸からのものである、請求項４４から８５のいずれか一項に記載の組成物。
  87. 前記核酸組成物が、ｓｓＮＡから本質的になる、請求項４４から８６のいずれか一項に記載の組成物。
  88. 請求項４４から８７のいずれか一項に記載の組成物と使用説明書とを含むキット。
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