CN105441429A

CN105441429A - 一种制备腺苷酰化接头的方法及腺苷酰化接头

Info

Publication number: CN105441429A
Application number: CN201410391721.XA
Authority: CN
Inventors: 祝珍珍; 张春燕; 耿春雨; 章文蔚; 蒋慧
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Hua Made Dazhi Technology Co Ltd
Priority date: 2014-08-08
Filing date: 2014-08-08
Publication date: 2016-03-30
Also published as: HK1218311A1

Abstract

本申请公开了一种制备腺苷酰化接头的方法，包括：(1)先合成一段寡核苷酸，寡核苷酸5’端磷酸化修饰，3’端进行氨基修饰、双脱氧胞嘧啶、磷酸修饰、荧光标记修饰、倒转碱基修饰或生物素标记修饰中的一种；(2)将步骤(1)的寡核苷酸在非截短型的T4RNA连接酶1催化下与ATP反应，获得腺苷酰化接头。本申请的制备方法，打破传统化学合成腺苷酰化接头的思维限制，先合成寡核苷酸，T4RNA连接酶1将ATP分解成AMP，AMP转移到磷酸上，形成腺苷酰化，由于3’端修饰，寡核苷酸保持在腺苷酰化中间态，从而制备出腺苷酰化接头。本申请的制备方法成本低、效率高，能满足使用需求，有效的降低了RNA高通量测序的成本。

Description

一种制备腺苷酰化接头的方法及腺苷酰化接头

技术领域

本申请涉及人工合成寡核苷酸接头领域，特别是涉及一种制备腺苷酰化接头的方法，以及制备的腺苷酰化接头。

背景技术

随着二代测序技术在高通量测序领域的广泛应用和高速发展，包括边合成边测序(SBS)、结合探针锚定连接测序法(cPAL)等，RNA的高通量测序技术也日趋成熟。技术的成熟必将伴随着成本的降低，首先就是文库构建成本的降低。

目前在常见的RNA文库构建过程中，特别是小RNA文库的构建中，需要用到一种特殊修饰的3’端接头，即腺苷酰化接头。这种腺苷酰化接头能够被截短型的T4RNA连接酶2特异性识别，在没有ATP存在的条件下将腺苷酰化接头5’端有腺苷酰化修饰的磷酸与RNA的3’端的羟基连接，形成3,5-磷酸二酯键。这种截短型的连接酶不能识别没有腺苷酰化修饰的5’端磷酸，因此，只能将腺苷酰化接头的5’端与RNA的3’端连接，而不能将一个RNA的5’端与另一个RNA的3’端连接，从而避免了RNA分子间的自连，减少了文库中RNA嵌合体的存在，如图1所示。目前使用的腺苷酰化接头都是在商业公司合成的，国内的引物合成公司暂时还不能做这种修饰的接头，只能从国外的引物合成公司，如IntegratedDNATechnologies(IDT)合成。这样就导致了接头合成的价格昂贵，每条腺苷酰化接头价格都上万元，且到货周期长；从而增加了高通量测序RNA文库构建的成本。而国外的引物合成公司合成腺苷酰化接头的方法，通常是先采用化学合成的方法合成腺苷酰化核苷酸的单体，然后再用这个单体与普通单体合成寡核苷酸，即获得腺苷酰化接头，具体方法可参考Unrau,P.J.andBartel,D.P.(1998)RNA-catalysednucleotidesynthesis.Nature,395,260-263。这种化学合成的方法虽然能够得到满足使用要求的腺苷酰化接头，但是产率很低并且成本高。

发明内容

本申请的目的是提供一种新思路的腺苷酰化接头的制备方法，及其制备的腺苷酰化接头。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请公开了一种制备腺苷酰化接头的方法，包括：

(1)首先合成一段寡核苷酸，寡核苷酸的5’端进行磷酸化修饰，3’端进行氨基修饰、双脱氧胞嘧啶、磷酸修饰、荧光标记修饰、倒转碱基修饰或生物素标记修饰中的一种；

(2)将步骤(1)的寡核苷酸在非截短型的T4RNA连接酶1的催化下与ATP反应，T4RNA连接酶1将ATP分解成AMP和焦磷酸，并将AMP转移到寡核苷酸5’端的磷酸上，即获得腺苷酰化接头。

需要说明的是，寡核苷酸作为接头，可以是任何序列，但是，可以理解，在用于RNA文库构建时，寡核苷酸接头的序列是不能与待测样品的片段相同的。此外，还需要说明的是，寡核苷酸5’端的磷酸化修饰是为了与AMP反应，获得5’端腺苷酰化的寡核苷酸接头；而3’端的修饰则是为了避免腺苷酰化的5’端与3’端的羟基反应，即避免寡核苷酸自连，保障了制备的5’端腺苷酰化修饰的寡核苷酸接头的质量，因此，3’端的修饰只要能够使得腺苷酰化的5’端不与3’端的羟基反应即可。

进一步的，本申请的方法还包括步骤(3)，即将步骤(2)的反应产物纯化，获得纯化的腺苷酰化接头。可以理解，制备的腺苷酰化接头是需要经过纯化才能使用的，而腺苷酰化接头的纯化实际上就是寡核苷酸的纯化，因此，凡是可以用于寡核苷酸纯化的方法，只要在不影响腺苷酰化的情况下，都可以用于本申请。

优选的，本申请中纯化包括但不仅限于磁珠纯化、柱式纯化、PAGE切胶纯化和乙醇沉淀纯化中的至少一种。更优选的，本申请采用乙醇沉淀纯化获得纯化的腺苷酰化接头。

本申请中，寡核苷酸为DNA或RNA。可以理解，作为接头的寡核苷酸，只要其5’端具有腺苷酰化修饰都可以使用；因此，可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。

优选的，寡核苷酸为DNA。需要说明的是，在实践中DNA和RNA作为接头的效果差不多，在没有特殊要求的情况下，两者都是可以的，但是，相对来说，DNA合成成本较低，因此优选使用DNA。

优选的，寡核苷酸的长度小于或等于100nt。需要说明的是，通常作为接头的寡核苷酸长度都不能太长，太长会存在连接效率低的问题，本申请中不超过100nt都可以满足使用需求。

优选的，步骤(2)的反应条件为，将配制好的反应液在22-28℃下，过夜反应。需要说明的是，正常情况下，只需要在室温下过夜处理即可，考虑到反应效率，本申请优选在22-28℃下进行；而过夜反应的时间通常在8-16小时都可以。

本申请的另一面还公开了采用本申请的制备方法制备的腺苷酰化接头。

优选的，腺苷酰化接头中含有分子标签，分子标签的长度为6-10nt。需要说明的是，分子标签是一系列的特殊序列，优选在6-10nt长度，不同分子标签的接头加到不同样品上就可以根据这个分子标签把样品区分开；可以理解，分子标签的具体序列可以根据不同的样品而定，正常情况下，只要不能与样品的片段相同即可。

本申请的再一面还公开了本申请的腺苷酰化接头在RNA文库构建中的应用。需要说明的是，本申请的腺苷酰化接头及其制备是针对RNA的高通量测序技术中构建RNA文库用的，特别适合用于小RNA文库构建使用，可以理解，其它需要进行腺苷酰化修饰的或者需要修饰的腺苷酰化寡核苷酸的都可以采用本申请的方法，或者采用本申请的腺苷酰化接头。

由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：

本申请的腺苷酰化接头的制备方法，打破传统的化学合成腺苷酰化核苷酸单体制备腺苷酰化接头的思维限制，率先合成一段寡核苷酸，创造性的利用T4RNA连接酶1将ATP分解成AMP和焦磷酸，并将AMP转移到寡核苷酸5’端的磷酸上，形成腺苷酰化，并且对寡核苷酸的3’端进行修饰，使得寡核苷酸保持在腺苷酰化这个中间产物的状态，从而制备出腺苷酰化的寡核苷酸接头。本申请的制备方法成本低、生产效率高，且作为接头的效果与传统方法合成的接头效果相当，能够满足使用需求，有效的降低了RNA高通量测序的成本。

附图说明

图1：是本申请中截短型的T4RNA连接酶2将腺苷酰化接头和RNA连接的示意图；

图2：是本申请实施例中寡核苷酸接头和与该接头对应的未进行腺苷酰化处理的寡核苷酸的电泳结果图；

图3：是本申请实施例中寡核苷酸接头和与该接头对应的未进行腺苷酰化处理的寡核苷酸分别与RNA连接的结果图；

图4：是本申请实施例中自制腺苷酰化接头和商购腺苷酰化接头分别与RNA连接的结果图；

图5：是本申请实施例中自制腺苷酰化接头连接条件优化的结果图。

具体实施方式

传统的腺苷酰化接头的制备方法，是先采用化学合成的方法合成腺苷酰化核苷酸的单体，然后再用这个单体与普通单体合成寡核苷酸，从而获得腺苷酰化接头。其中，寡核苷酸是由若干个核苷酸单体合成的小片段的核酸；合成腺苷酰化核苷酸的单体就是指，采用化学方法，对核苷酸单体进行处理，制成腺苷酰化的核苷酸单体；传统方法就是，将该腺苷酰化的核苷酸单体与普通的没有腺苷酰化的核苷酸单体一起合成寡核苷酸，从而得到腺苷酰化接头。而本申请的制备方法思路完全不同，是先合成一段寡核苷酸，然后对寡核苷酸的两端进行修饰和酶反应，获得腺苷酰化的寡核苷酸接头。

需要说明的是，在本申请的制备方法中分别对5’端和3’端进行了修饰，这些修饰方法都是比较成熟的，与传统合成腺苷酰化接头相比，成本也较低。还需要说明的是，非截短型的T4RNA连接酶1和截短型的T4RNA连接酶2是两种酶。非截短型的T4RNA连接酶1需要在ATP的存在下才能将单链核苷酸的5’-P末端与3’-OH末端连接，实现两条单链寡核苷酸的连接，或者线性寡核苷酸的环化。截短型的T4RNA连接酶2则无需ATP，但是，截短型的T4RNA连接酶2只能将腺苷酰化的5’末端与3’-OH末端连接，实现两条单链寡核苷酸的连接，或者线性寡核苷酸的环化，不能将5’-P末端与3’-OH末端连接。构建RNA文库过程中的3’端接头，即腺苷酰化接头的原理就是，利用截短型的T4RNA连接酶2将腺苷酰化的接头与RNA的3’端连接起来，而对于没有腺苷酰化的RNA分子间则不会自连；其中3’端接头是指与RNA的3’端连接的接头，因此是对作为接头的寡核苷酸的5’端进行腺苷酰化修饰。非截短型的T4RNA连接酶1在ATP存在下，将单链核苷酸的5’-P末端与3’-OH末端连接的过程中包括三步反应；第一步，T4RNA连接酶1将ATP分解成AMP和焦磷酸；第二步，将AMP转移到寡核苷酸5’端的磷酸上，形成腺苷酰化的中间产物状态；第三步，腺苷酰化5’端与3’-OH端连接；本申请的发明构思就是，对3’-OH端进行修饰，使得第三步的腺苷酰化的5’端与3’-OH端连接无法进行，从而使得寡核苷酸的5’端保持腺苷酰化修饰的中间产物状态；该中间产物就是作为接头的5’末端腺苷酰化修饰的寡核苷酸接头，即本申请的腺苷酰化接头。

下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

一、腺苷酰化接头的合成

本例合成腺苷酰化接头的方法包括：

(1)合成有5’磷酸和3’氨基修饰的DNA寡核苷酸，本例的带修饰的寡核苷酸分别订购自上海生工或者英骏公司，将合成的寡核苷酸用无RNA酶水溶解成浓度为100uM的储存液，保存于-20℃。

(2)取10ul100uM的寡核苷酸，加入10ul10xT4RNAligasebuffer，40ul50％PEG8000，10ul10mMATP和5ul非截短型的T4RNA连接酶1，用25ul无RNA酶水补总体积为100ul；混匀反应混合物，室温22-28℃反应过夜。在酶反应的过程中，RNA连接酶1将ATP分解成AMP和焦磷酸，并将AMP转移到寡核苷酸的5’磷酸上，使之腺苷酰化从而能够与3’羟基连接；但是由于我们的寡核苷酸的3’端有氨基修饰，他们不能进行连接，因此寡核苷酸就保持着腺苷酰化这种中间产物的状态；即我们所需要的腺苷酰化修饰。

(3)反应完成的腺苷酰化寡核苷酸需要从酶反应液中纯化出来才能使用。本例采用乙醇沉淀的方法进行纯化：在步骤(2)的酶反应产物中加入80ul无RNA酶水，20ul3M醋酸钠(pH5.5)和2.5ul糖原，混匀后再加入400-600ul的无水乙醇，颠倒混匀后放置在-80℃沉淀1小时，然后取出低温离心，4℃，13500rpm离心半小时，弃去上清，管底的白色沉淀用80％的乙醇清洗沉淀一次，移去上清，晾干白色沉淀，用30-40ul的无RNA酶水溶解沉淀，即得到纯化的腺苷酰化的接头。

为了便于使用，本例还对纯化的腺苷酰化接头进行了浓度测试，本例采用紫外分光光度法进行定量(nanoDrop)：取1ul腺苷酰化的接头在仪器上选择ssDNA进行定量，测得的浓度是质量浓度，按照公式一换算成摩尔浓度，使用时稀释到10uM的工作液浓度即可直接使用。

公式一：C_m＝C_q/(0.33*L)

其中，C_m是摩尔浓度，C_q是质量浓度，L是寡核苷酸的长度。若溶解的体积为30ul，则需要补水30*(C_m/10-1)ul稀释寡核苷酸至10uM。

取少量制备好的腺苷酰化的寡核苷酸和未腺苷酰化的寡核苷酸(母体)进行电泳检测，可以看到腺苷酰化的寡核苷酸的迁移率会比其母体稍慢，位置偏上一点，见图1B，其中1是腺苷酰化的寡核苷酸，2是其母体。

二、腺苷酰化接头的测试

本例按照前述方法制备了四条腺苷酰化接头，并合成了一段28nt的RNA片段用于连接试验；同时，从IDT购买了一条35nt的腺苷酰化接头，该购买的接头即采用传统的方法合成的腺苷酰化接头；四条用于制备腺苷酰化接头的寡核苷酸和RNA片段的具体序列如表1所示。

表1用于制备腺苷酰化接头的寡核苷酸序列和RNA片段序列

编号	序列和修饰(5’→3’)	Seq ID No.
			oligo1	PO₃-GTCTCCAGTCGAAGCCCGATC-AmMO	1
oligo2	PO₃-ACTGCTGACGTACTG-AmMO	2
			oligo3	PO₃-GTCTCCAGTCGAAGCCCGATCATTTATGACAGAGCTTGTCT-AmMO	3
oligo4	PO₃-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCAAG-AmMO	4
			oligo5	PO₃-UCCUAAGACCGCUUGGCCUCCGACUCUU	5
oligo6	App-GTCGAGAACGTCTCGTGCTTGTCATAAATCAGTAC	6

在上海生工或者英骏公司合成表1中的oligo1-oligo5五条序列，其中oligo5即RNA片段，仅5’端进行磷酸化修饰，用于与腺苷酰化接头连接；oligo1-oligo4四条寡核苷酸分别作为母体，5’端磷酸化修饰，3’端氨基修饰，按照本例提供的方法制备腺苷酰化接头，并测定浓度，配制成10uM的工作浓度。oligo6是从IDT购买的腺苷酰化接头。其中，母体是指用于制备腺苷酰化接头的寡核苷酸。oligo1-oligo3三条寡核苷酸合成的腺苷酰化接头的浓度测定如表2所示。

表2腺苷酰化接头浓度测定

编号	长度	质量浓度Cq	摩尔浓度Cm	稀释至10um补水
					oligo1	21nt	211ng/ul	30.3um	61ul
oligo2	15nt	150ng/ul	30.4um	60ul
					oligo3	41nt	399ng/ul	29.5um	58ul

(1)寡核苷酸母体与腺苷酰化接头的电泳试验

本例取少量制备好的腺苷酰化的寡核苷酸接头和未进行腺苷酰化处理的寡核苷酸进行电泳检测，部分结果如图2所示，图2中，1是腺苷酰化的寡核苷酸即腺苷酰化接头，2是与腺苷酰化接头对应的没有腺苷酰化的寡核苷酸，结果显示，腺苷酰化的寡核苷酸的迁移率会比其母体的没有腺苷酰化的寡核苷酸稍慢，位置偏上一点。

(2)寡核苷酸母体与腺苷酰化接头的连接试验

本例分别取等量oligo1-4的寡核苷酸母体和由oligo1-4的寡核苷酸制备的腺苷酰化接头，分别与oligo5的RNA片段连接。按如下条件配制反应混合液：1ulRNA，1ul寡核苷酸母体或腺苷酰化接头，2ul10xT4RNAligasebuffer，5ul50％PEG8000，0.5ulRNaseinhibitor，1ul截短型的T4RNA连接酶2和9.5ul无RNA酶水。混匀后PCR仪中25℃连接1小时。反应结束后用尿素-PAGE胶电泳检测连接效果。部分结果如图3所示，图中1和2分别是oligo1寡核苷酸母体和oligo1寡核苷酸制备的腺苷酰化接头的连接结果，3和4分别是oligo2寡核苷酸母体及其制备的腺苷酰化接头的连接结果，可见，1和3的接头不能被截短型T4RNA连接酶2所识别，故无法连接，即没有腺苷酰化的寡核苷酸不能与RNA连接，2和4则能在相应位置看到连接的条带，从而说明我们的腺苷酰化接头是制备成功的，能被截短型T4RNA连接酶2特异性识别。

(3)自制腺苷酰化接头与商购腺苷酰化接头的对比试验

本例分别取等量oligo1-4的寡核苷酸制备的腺苷酰化接头和oligo6所示的购买的商业合成的腺苷酰化接头，分别与oligo5的RNA片段连接。反应液配置、反应条件以及检测方式与前述连接试验相同。部分结果如图4所示，图中1是oligo4寡核苷酸制备的腺苷酰化接头的连接结果，2是oligo6所示的IDT合成的腺苷酰化接头的连接结果，L是LowRangessRNAladder；可见，本例制备的腺苷酰化接头能够得到商业购买的腺苷酰化接头相同的效果。

(4)腺苷酰化接头连接条件优化

本例使用腺苷酰化的oligo3进行了不同连接反应条件的测试，包括PEG8000的浓度、连接酶的用量和连接时间的优化，测试反应液和反应条件如表3所示，其余条件和检测方式与前述连接试验相同。

表3连接条件优化

表中，ligase用量即截短型T4RNA连接酶2的用量。检测结果如图5所示，分别测试PEG8000的终浓度为5％、10％和15％，结果如图5的泳道1、2和3所示，从图上可以看到PEG8000的浓度越高，连接的效率越高，连接产物的亮度越大；但是PEG8000浓度太高会导致反应液太粘稠，不便于操作，因此确定反应时PEG8000浓度为10％-15％之间，其浓度可以根据RNA的体积进行调整。泳道2、4、5测试了不同单位用量的截短型T4RNA连接酶2，分别对应100U、200U和150U，从图5中看出泳道2的连接产物亮带要弱于4和5，而后两者的连接产物亮带相近，所以使用100U的酶会使连接效率降低，150U和200U酶的连接效率近似，优选采用150U的截短型T4RNA连接酶2。同时本例还做了连接时间的测试，图5中的泳道6和7是分别在相同的反应条件下连接2小时和1小时的结果，可见，2小时的连接产物明显多于1小时的，所以连接时间定为2小时。图5中泳道8是采用优化后的反应条件进行的连接测试：PEG8000浓度为12.5％，截短型T4RNA连接酶2的用量为150U，连接时间为2小时；可见在优化条件下连接产物的亮带很强，连接效率较高，能够满足使用需求。

此外，本例还将制备的腺苷酰化接头用于RNA的高通量测序中的RNA文库构建，结果显示，本例的腺苷酰化接头能够满足RNA的高通量测序的需求，测序结果与购买的商业化的腺苷酰化接头结果相同。进一步的，本例还在不同的腺苷酰化接头上设计不同的标签，在RNA文库构建的过程中，不同的样品连接带有不同标签的接头，然后把不同标签的样品混合起来进行文库构建，从而进一步使得单个样品的文库构建成本大大降低。

本例制备的腺苷酰化接头与购买的商业化的腺苷酰化接头具有相同的连接效果，并且，本例的腺苷酰化接头制备方法简单，生产效率高，成本低，能够满足RNA高通量测序中的RNA文库构建的使用需求，有效的降低RNA高通量测序的成本。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

Claims

1.一种制备腺苷酰化接头的方法，包括：

(1)首先合成一段寡核苷酸，所述寡核苷酸的5’端进行磷酸化修饰，3’端进行氨基修饰、双脱氧胞嘧啶、磷酸修饰、荧光标记修饰、倒转碱基修饰或生物素标记修饰中的一种；

(2)将步骤(1)的寡核苷酸在非截短型的T4RNA连接酶1的催化下与ATP反应，T4RNA连接酶1将ATP分解成AMP和焦磷酸，并将AMP转移到所述寡核苷酸5’端的磷酸上，即获得所述腺苷酰化接头。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：还包括步骤(3)，将步骤(2)的反应产物纯化，即获得纯化的腺苷酰化接头。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述纯化包括但不仅限于磁珠纯化、柱式纯化、PAGE切胶纯化和乙醇沉淀纯化中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述寡核苷酸为DNA或RNA。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述寡核苷酸为DNA。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述寡核苷酸的长度小于或等于100nt。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)的反应条件为，将配制好的反应液在22-28℃下，过夜反应。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法制备的腺苷酰化接头。

9.根据权利要求8所述的腺苷酰化接头，其特征在于：所述腺苷酰化接头中含有分子标签，所述分子标签的长度为6-10nt。

10.根据权利要求8或9所述的腺苷酰化接头在RNA文库构建中的应用。