CN106434866B - 一种3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法,单个测序反应由X、Y两个不同的3端修饰核苷酸同时进行;整个测序包括对同一模板进行的至少二组测序反应:每组测序由包含四个3端修饰核苷酸,按照每个核苷酸在一个循环中只使用一次的方式,进行由两个不同核苷酸同时合成测序反应的循环,若干次测序反应后得到由一组按照测序顺序排列的若干XY信息;当该组测序反应完成后,变性将测序引物延伸链清除,重新杂交测序引物,进行第二组测序反应,得到第二测序反应排列的若干XY信息,最后通过解码二组按照测序顺序排列的若干XY信息,组装出待测核酸片段的具体碱基序列。本发明可以消除现有实时合成测序对同聚物片段的测序错误。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,是一种实现核酸序列高通量测定的方法,具体涉及一种两核苷酸实时合成DNA测序方法及其应用。
背景技术
随着人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成,使人类步入了后基因时代,对当代的生物学研究和医学研究产生了巨大的影响,分子生物学相关学科得到了迅猛的发展。从基因水平上认识生命的差异,疾病发生、发展的规律,以及药物与生命体的相互作用将成为可能。大幅度降低DNA测序的成本将会大大推动生命科学和医学的研究,甚至会带来革命性的变化。目前,全基因组DNA测序技术已经成为国际上一个竞争十分激烈的研究领域。如Roche公司基于乳液PCR产物的高通量并行焦测序技术;Illumina公司的桥式扩增-DNA芯片延伸测序技术;以及Applied Biosestems公司基于乳液PCR产物的杂交-酶连接-酶切割的SOLiD平台、pH敏感场效应管阵列芯片的Ion Torrent平台等高通量测序技术都有成熟的商品化仪器上市。
聚合酶链式反应(PCR)表明合成延伸反应理论上合成测序方法可以测定数千甚至上万个碱基,这无疑代表高通量核酸测序的巨大潜力。然而现有的合成测序要么是简单地每次只加一种核苷酸的方法通过确定每次合成的碱基的个数,或者通过3端羟基可逆封闭的特殊核苷酸单体一次只延伸一个核苷酸的方法确定每次合成的碱基种类的来实现的。前者需要四个独立的反应来完成所有模板的一个碱基的测定而增加测序时间,而后者由于在测定下一个碱基前需要将3端羟基的保护基团脱出,而每增加一步反应将导致反应效率的降低,最终导致测序长度的下降。利用检测天然核苷酸单体合成反应实时产生的焦磷酸盐、氢离子而发展的454高通量测序技术(Margulies,et al.Nature,2005.437(7057):376-380)、Ion Torrent测序技术(Rothberg,et al.Nature,475348–352)允许原始DNA的合成,核苷酸被合成后无需进行任何处理步骤,测序过程相当快、且序列阅读长度要比荧光标记核苷酸单体的合成测序方法高数倍。我们将两核苷酸合成测序技术应用到上述实时合成测序中,并提出“一种两核苷酸实时合成解码测序方法”(中国发明专利:ZL 201210128597.9)可以进一步提高序列测定的长度。然而,这一专利技术仍然存在一些不足,对于同聚物(如AAAAAAAAAA等片段)、或者类准同聚物(如AC/GT循环测序中的AACCAAACAACAA等片段)测序获得的信号强度与碱基个数并不成完全的线性关系,造成测序信息的错误。在现有的荧光标记核苷酸合成测序中,可以通过3’端羟基可逆封闭的特殊核苷酸单体一次只延伸一个核苷酸的方法确定每次合成的碱基种类的来实现序列测定,这样就可以避免同聚物或者类准同聚物的测序错误。诸如同样的道理,如果采用通过3端羟基可逆封闭的特殊核苷酸单体来实施实时合成测序,那么这种测序方法就能够既保持实时合成测序优点的同时,又克服同聚物或者类准同聚物的测序错误。有关3’端羟基可逆封闭的特殊核苷酸单体包括3’-O-烯丙基修饰的核苷酸(PNAS,2006,103,19635-19640),3’-O-氰乙基修饰的核苷酸(Chem.Eur.J.2011,17,2903-2915),3’-O-叠氮甲基修饰的核苷酸((PNAS,2006,105,9145–9150)和3’-O-氨基修饰的核苷酸((PNAS,2010,107,1948–1953),以及3’端虚拟封闭的核苷酸(Nat Methods.2009,6,593–595)等。
发明内容
本发明的目的是利用3’端羟基可逆封闭的特殊核苷酸单体为测序原料,提供一种3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法,实现待测核酸序列的高通量检测。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
一种3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法,其特征在于:单个测序反应由X、Y两个不同的3’端可逆封闭的核苷酸同时进行,每次测序反应最多只能产生一个核苷酸的合成,得到一个碱基序编码信息XY;或者没有发生核苷酸合成反应的信息;
整个测序包括对同一模板进行的至少二组测序反应:每组测序由包含四个3’端可逆封闭的核苷酸,其中,所述的四个3’端可逆封闭的核苷酸用A*、C*、G*、T*表示,按照每个核苷酸在一个循环中只使用一次的方式,进行由两个不同核苷酸同时合成测序反应的循环,若干次测序反应后得到由一组按照测序顺序排列的若干XY信息;当该组测序反应完成后,变性将测序引物延伸链清除,重新杂交测序引物,进行第二组测序反应,得到第二测序反应排列的若干XY信息;最后通过解码二组按照测序顺序排列的若干XY信息,组装出待测核酸片段的具体碱基序列。
所述核苷酸的3’端可逆封闭基团是指在指定反应条件下能够被脱出、并活化出核苷酸的3’端羟基。
所述核苷酸的3‘端羟基是被包括3’-O-烯丙基、3’-O-氰乙基、3’-O-叠氮甲基、3’-O-氨基中的一个或多个基团封闭,形成3‘端修饰的核苷酸;这些3‘端修饰的核苷酸能够参与合成测序反应,且最多只能发生一个核苷酸的合成。
所述的单个测序反应由X、Y两个不同的3’端可逆封闭的核苷酸是指由(A*+C*)、(A*+G*)、(A*+T*)、(C*+G*)、(C*+T*)、(G*+T*)六种组合中任一种两核苷酸同时进行的合成测序反应。
所述的整个测序包括对同一模板进行的至少二组测序反应是指(A*+C*)/(G*+T*),(A*+G*)/(C*+T*),(A*+T*)/(C*+G*)三组中任意两组两核苷酸合成循环对同一模板的测序。
所述核苷酸合成实时产生的检测分子相同的,其检测分子是化学发光检测的焦磷酸盐,电化学检测的氢离子或者光学检测的荧光分子。
所述的待测核酸片段是指单分子,或者以单分子为模板扩增的相同序列产物。
所述待测核酸片段的具体碱基信息是通过解码二组碱基片段编码信息而得到的;对于有参考序列的基因组测序的再测序,两组核苷酸实时合成DNA测序得到的编码直接用于基因组参考序列的比对。
不同待测核酸序列的并行测序中,每个模板需要独立的微反应池。
本发明的具体步骤为:
a:大肠杆菌基因组全基因组模板制备:将目标基因组用超声破碎成大小为100-1000bp碱基的片段,并在连接酶的作用下将这些片段化核酸序列用一对序列已知道的通用连接子进行连接,其中连接子1的序列为:CTG CTG TAC CGT ACA GCC TTG GCC G,连接子2的序列为:CGC TTT CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTGA T;并进行预扩增10个循环;然后凝胶电泳切割200-800bp DNA片段,并纯化;将这些200-800bp DNA片段与固定其中一个连接子互补序列的微珠进行乳液并行PCR反应,扩增片段化的大肠杆菌基因组片段,并变性得到大肠杆菌基因组测序DNA模板,最后,将这些扩增双链DNA模板的微珠放置到具有反应池的芯片上,每个反应池最多容纳一个微珠;
b.测序引物杂交:将5’端固定的模板与能和3’端连接子互补的引物杂交,杂交引物作为所有大肠杆菌基因组DNA模板的测序引物;
c.测序
第一组测序反应:将5’端固定的模板与能和3’端连接子互补的引物杂交,杂交引物作为所有大肠杆菌基因组DNA模板的测序引物;
(1.1)将100uM的3’-O-氨基修饰的核苷酸(A*+C*)和测序体系加入到反应池中进行合成测序反应,记录每个反应池的测序信息,如果一个反应池发生合成反应,则得到一个碱基编码AC;如果一个反应池没有发生合成反应.则不会得到碱基编码;然后用10mM pH=7~8的EDTA缓冲液洗涤;
(1.2)将100uM的3’-O-氨基修饰的核苷酸(G*+T*)和测序体系加入到反应池中进行合成测序反应,记录每个反应池的测序信息,如果一个反应池发生合成反应,则得到一个碱基编码GT;如果一个反应池没有发生合成反应.则不会得到碱基编码;然后用10mM pH=7~8的EDTA缓冲液洗涤;
(1.3)加入亚硝酸钠和醋酸钠混合溶液,常温下反应5分钟;
(1.4)按照上述(1.1)~(1.3)步骤循环进行实时合成测序,得到一组由编码(AC)、(GT)构成的测序信息;然后进行第二组测序反应;
第二组测序反应:用浓度为8M的尿素在65℃下处理5分钟共2次,将第一组测序反应中的测序引物、及其测序引物合成链清除,重新得到单链DNA模板,然后与测序引物进行杂交;
(2.1)将100uM的3’-O-氨基修饰的核苷酸(A*+G*)和测序体系加入到反应池中进行合成测序反应,记录每个反应池的测序信息,如果一个反应池发生合成反应,则得到一个碱基编码AG;如果一个反应池没有发生合成反应.则不会得到碱基编码;然后用10mM pH=7~8的EDTA缓冲液洗涤;
(2.2)将100uM的3’-O-氨基修饰的核苷酸(C*+T*)和测序体系加入到反应池中进行合成测序反应,记录每个反应池的测序信息,如果一个反应池发生合成反应,则得到一个碱基编码CT;如果一个反应池没有发生合成反应.则不会得到碱基编码;然后用10mM pH=7~8的EDTA缓冲液洗涤;
(2.3)加入亚硝酸钠和醋酸钠混合溶液,常温下反应5分钟;
(2.4)按照上述(2.1)~(2.3)步骤循环进行实时合成测序,得到一组由编码(AG)、(CT)构成的测序信息;
d.解码
利用每个模板两组测序中得到的碱基片段编码信息,解码组装出相应的碱基序列信息;
e.序列组装
利用所有模板的碱基序列信息,组装成大肠杆菌基因组序列。
有益效果:本发明应用3’端可逆封闭苷酸A*、G*、C*、T*分成两组对同一模板进行两次测序,每组测序由包含四个核苷酸,按照每个核苷酸在一个循环中只使用一次的方式,进行两次由两个不同核苷酸同时合成测序反应的循环,每进行一次测序反应得到一个两核苷酸的编码,若干次测序反应后得到由一组若干编码构成的核酸序列信息;当该组测序反应完成后,通过变性将测序引物延伸链清除,重新杂交测序引物,进行下一组测序反应,最后将两组测序反应获得的两组编码信息,通过解码转化成对应的两核苷酸(碱基)片段信息,并通过两组核苷酸(碱基)信息组装出待测核酸序列的具体碱基信息。
1.本发明的最大优点是采用3’端可逆封闭苷酸进行实时合成测序,可以消除现有实时合成测序对同聚物片段的测序错误,大大提高序列测定的准确性。本发明方法与现有“两核苷酸实时合成DNA测序方法及其应用”相比,由于合成核苷酸的数目只有1或者0两个简单选项,无需严格的定量关系。
2.与传统单个核苷酸合成测序实时测序相比,本发明的两核苷酸合成测序可以提高序列测定的长度。
3.本发明可以直接采用商品化的3’端可逆封闭苷酸进行合成测序,可以大大降低测序成本。
4.本发明按照核苷酸分成组的形式进行得到核酸片段构成编码,解码容易。
5.本发明适用面广。可以用于单分子模板、(单分子)多拷贝DNA模板的测序,也可以在现有测序仪器上实现。
6.本发明方法简单,所涉及的方法均能够通过现有成熟技术来实现。
附图说明
图1是本发明一种3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法对包含3’-TAATCAGGTCCCATTTTGGCCTA-5’的待测核酸序列的测序信息及其解码结果。
图2是本发明一种3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法的一种具体操作流程;图中,1为待测序DNA模板,1-1,1-2为连接在待测序DNA模板两段的序列已知的连接子,2为载体,3为测序引物。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
实施例1:
大肠杆菌基因组3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成DNA解码测序
1.大肠杆菌基因组模板制备:将目标基因组用超声破碎成大小为100-1000bp碱基的片段,并在连接酶的作用下将这些片段化核酸序列用一对序列已知道的通用连接子进行连接,其中连接子1的序列为:CTG CTG TAC CGT ACA GCC TTG GCC G,连接子2的序列为:CGC TTT CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTGA T;并进行预扩增10个循环;然后凝胶电泳切割200-800bp DNA片段,并纯化;将这些200-800bp DNA片段与固定其中一个连接子互补序列的微珠进行乳液并行PCR反应,扩增片段化的大肠杆菌基因组片段,并变性得到大肠杆菌基因组测序DNA模板,最后,将这些扩增双链DNA模板的微珠放置到具有反应池的芯片上,每个反应池最多容纳一个微珠。
2.测序引物杂交:将5’端固定的模板与能和3’端连接子互补的引物杂交,杂交引物作为所有大肠杆菌基因组DNA模板的测序引物;为了保证每个模板每次均能发生合成反应,我们将测定连接子上的一个已知碱基序列,并在每组测序反应中的第一次两核苷酸测序反应中包含其互补碱基,如在该实例中连接子中已知碱基为T,每组测序反应中的第一次两核苷酸测序反应中均包括核苷酸A*。
3.测序(参见图2)
利用454高通量测序平台、或者Ion Torrent高通量测序平台进行序列测定。
第一组测序反应:将5’端固定的模板与能和3’端连接子互补的引物杂交,杂交引物作为所有大肠杆菌基因组DNA模板的测序引物;为了保证每个模板每次均能发生合成反应,我们将测定连接子上的一个已知碱基序列,并在每组测序反应中的第一次两核苷酸测序反应中包含其互补碱基,如在该实例中连接子中已知碱基为T,每组测序反应中的第一次两核苷酸测序反应中核苷酸A*。
(1.1)将100uM的3’-O-氨基修饰的核苷酸(A*+G*)和测序体系加入到反应池中进行合成测序反应,记录每个反应池的测序信息,如果一个反应池发生合成反应,则得到一个碱基编码AG;如果一个反应池没有发生合成反应.则不会得到碱基编码。然后用10mM pH=7~8的EDTA缓冲液洗涤;
(1.2)将100uM的3’-O-氨基修饰的核苷酸(C*+T*)和测序体系加入到反应池中进行合成测序反应,记录每个反应池的测序信息,如果一个反应池发生合成反应,则得到一个碱基编码CT;如果一个反应池没有发生合成反应.则不会得到碱基编码。然后用10mM pH=7~8的EDTA缓冲液洗涤;
(1.3)加入亚硝酸钠和醋酸钠混合溶液,该混合溶液中,亚硝酸钠的浓度为1M,醋酸钠缓冲溶液的pH=5~6,常温下反应5分钟;
(1.4)按照上述(1.1)~(1.3)步骤循环进行实时合成测序,得到一组由编码(AG)、(CT)构成的测序信息。然后进行第二组测序反应。
第二组测序反应:用浓度为8M的尿素在65℃下处理5分钟,处理2次,将第一组测序反应中的测序引物、及其测序引物合成链清除,重新得到单链DNA模板,然后与测序引物进行杂交。
(2.1)将100uM的3’-O-氨基修饰的核苷酸(A*+C*)和测序体系加入到反应池中进行合成测序反应,记录每个反应池的测序信息,如果一个反应池发生合成反应,则得到一个碱基编码AC;如果一个反应池没有发生合成反应.则不会得到碱基编码。然后用10mM pH=7~8的EDTA缓冲液洗涤;
(2.2)将100uM的3’-O-氨基修饰的核苷酸(G*+T*)和测序体系加入到反应池中进行合成测序反应,记录每个反应池的测序信息,如果一个反应池发生合成反应,则得到一个碱基编码GT;如果一个反应池没有发生合成反应.则不会得到碱基编码。然后用10mM pH=7~8的EDTA缓冲液洗涤;
(2.3)加入亚硝酸钠和醋酸钠混合溶液,该混合溶液中,亚硝酸钠的浓度为1M,醋酸钠缓冲溶液的pH=5~6,常温下反应5分钟;
(2.4)按照上述(2.1)~(2.3)步骤循环进行实时合成测序,得到一组由编码(AC)、(GT)构成的测序信息。
d.解码
利用每个模板两组测序中得到的碱基片段编码信息,解码组装出相应的碱基序列信息;
e.序列组装
利用所有模板的碱基序列信息,组装成大肠杆菌基因组序列。
如图1所示是本发明的一种3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法对包含3’-TAATCAGGTCCCATTTTGGCCTA-5’的待测核酸序列的测序信息及其解码结果。其中,(1)为A*C*/G*T*、A*T*/G*C*两组两核苷酸实时合成测序的信息及其解码结果。其中,第一行为(A*C*/G*T*)测序的信息:在A*C*参与的两核苷酸实时合成测序中,单个测序反应得到一个编码(AC);或者没有发生核苷酸合成反应的信息(在图中没有标出)。在G*T*参与的两核苷酸实时合成测序中,单个测序反应得到一个编码(GT),或者没有发生核苷酸合成反应的信息(在图中没有标出)。第二行为(A*T*/G*C*)测序的信息:在A*T*参与的两核苷酸实时合成测序中,单个测序反应得到一个编码(AT);或者没有发生核苷酸合成反应的信息(在图中没有标出)。在G*C*参与的两核苷酸实时合成测序中,单个测序反应得到一个编码(GC);或者没有发生核苷酸合成反应的信息(在图中没有标出)。第三行为第一、二行编码信息的解码结果:解码即从两组对应编码中选出相同的碱基即可。(2)、(3)与(1)具有类似的意义。
如图2所示是本发明一种3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法的一种具体操作流程。图中,1为待测序DNA模板,1-1,1-2为连接在待测序DNA模板两段的序列已知的连接子,2为载体,3为测序引物。
第一组测序反应:待测序DNA模板(1)的5’端固定在载体(2)上,测序引物(3)与固定的DNA模板(1)杂交(a);将3’-O-氨基修饰的核苷酸(A*+G*)和测序体系加入到反应池中进行合成测序反应(b),记录每个反应池的测序信息,得到有一个碱基编码AG或者没有发生核苷酸合成反应的信息。然后用10mM EDTA缓冲液(pH=7~8)洗涤,清除未参与合成反应的单体(A*+G*);加入亚硝酸钠和醋酸钠混合溶液(亚硝酸钠1M,pH=5~6醋酸钠缓冲溶液),常温下反应5分钟(c)。然后用10mM EDTA缓冲液(pH=7~8)洗涤,清除亚硝酸钠和醋酸钠的混合溶液;将3’-O-氨基修饰的核苷酸(C*+T*)和测序体系加入到反应池中进行合成测序反应(d),记录每个反应池的测序信息,得到有一个碱基编码CT或者没有发生核苷酸合成反应的信息;然后按照上述方式进行循环测序反应(e),每增加一次循环便至少多产生1个相应的编码,最后得到该组反应由若干编码构成的序列信息。
然后变性(g),将第一组测序反应中的测序引物、及其测序引物合成链清除,重新得到单链DNA模板。
第二组测序反应:重新杂交(a)测序引物(3)于固定的DNA模板(1)上,更换两核苷酸组合(即A*+C*,G*+T*),按照第一组测序反应的方式进行,得到该组反应由若干编码构成的序列信息。
最后,按照图1的方式,根据两组编码信息解码出具体的碱基序列信息。
根据需要,也可以将两个单个的测序反应(b)和(d),完成后,再进行3‘羟基的活化反应(c)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法,其特征在于:单个测序反应由X、Y两个不同的3’端可逆封闭的核苷酸同时进行,每次测序反应最多只能产生一个核苷酸的合成,得到一个碱基序编码信息XY;或者没有发生核苷酸合成反应的信息;
整个测序包括对同一模板进行的至少二组测序反应:每组测序由包含四个3’端可逆封闭的核苷酸,其中,所述的四个3’端可逆封闭的核苷酸用A*、C*、G*、T*表示,按照每个核苷酸在一个循环中只使用一次的方式,进行由两个不同核苷酸同时合成测序反应的循环,若干次测序反应后得到由一组按照测序顺序排列的若干XY信息;当该组测序反应完成后,变性将测序引物延伸链清除,重新杂交测序引物,进行第二组测序反应,得到第二测序反应排列的若干XY信息;最后通过解码二组按照测序顺序排列的若干XY信息,组装出待测核酸片段的具体碱基序列;
具体步骤为:
a:大肠杆菌基因组全基因组模板制备:将目标基因组用超声破碎成大小为100-1000bp碱基的片段,并在连接酶的作用下将这些片段化核酸序列用一对序列已知道的通用连接子进行连接,其中连接子1的序列为:CTG CTG TAC CGT ACA GCC TTG GCC G,连接子2的序列为:CGC TTT CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTGA T;并进行预扩增10个循环;然后凝胶电泳切割200-800bp DNA片段,并纯化;将这些200-800 bp DNA片段与固定其中一个连接子互补序列的微珠进行乳液并行PCR反应,扩增片段化的大肠杆菌基因组片段,并变性得到大肠杆菌基因组测序DNA模板,最后,将这些扩增双链DNA模板的微珠放置到具有反应池的芯片上,每个反应池最多容纳一个微珠;
b. 测序引物杂交:将5’端固定的模板与能和3’端连接子互补的引物杂交,杂交引物作为所有大肠杆菌基因组DNA模板的测序引物;
c. 测序
第一组测序反应:将5’端固定的模板与能和3’端连接子互补的引物杂交,杂交引物作为所有大肠杆菌基因组DNA模板的测序引物;
(1.1) 将100uM的3’-O-氨基修饰的核苷酸(A*+C*)和测序体系加入到反应池中进行合成测序反应,记录每个反应池的测序信息,如果一个反应池发生合成反应,则得到一个碱基编码AC;如果一个反应池没有发生合成反应.则不会得到碱基编码;然后用10mM pH=7~8的EDTA缓冲液洗涤;
(1.2) 将100uM的3’-O-氨基修饰的核苷酸(G*+T*)和测序体系加入到反应池中进行合成测序反应,记录每个反应池的测序信息,如果一个反应池发生合成反应,则得到一个碱基编码GT;如果一个反应池没有发生合成反应.则不会得到碱基编码;然后用10mM pH=7~8的EDTA缓冲液洗涤;
(1.3) 加入亚硝酸钠和醋酸钠混合溶液,常温下反应5分钟;
(1.4) 按照上述(1.1) ~(1.3)步骤循环进行实时合成测序,得到一组由编码(AC)、(GT)构成的测序信息;然后进行第二组测序反应;
第二组测序反应:用浓度为8M的尿素在65℃下处理5分钟共2次,将第一组测序反应中的测序引物、及其测序引物合成链清除,重新得到单链DNA模板,然后与测序引物进行杂交;
(2.1) 将100uM的3’-O-氨基修饰的核苷酸(A*+G*)和测序体系加入到反应池中进行合成测序反应,记录每个反应池的测序信息,如果一个反应池发生合成反应,则得到一个碱基编码AG;如果一个反应池没有发生合成反应.则不会得到碱基编码;然后用10mM pH=7~8的EDTA缓冲液洗涤;
(2.2) 将100uM的3’-O-氨基修饰的核苷酸(C*+T*)和测序体系加入到反应池中进行合成测序反应,记录每个反应池的测序信息,如果一个反应池发生合成反应,则得到一个碱基编码CT;如果一个反应池没有发生合成反应.则不会得到碱基编码;然后用10mM pH=7~8的EDTA缓冲液洗涤;
(2.3) 加入亚硝酸钠和醋酸钠混合溶液,常温下反应5分钟;
(2.4) 按照上述(2.1) ~(2.3)步骤循环进行实时合成测序,得到一组由编码(AG)、(CT)构成的测序信息;
d. 解码
利用每个模板两组测序中得到的碱基片段编码信息,解码组装出相应的碱基序列信息;
e. 序列组装
利用所有模板的碱基序列信息,组装成大肠杆菌基因组序列。
2.根据权利要求1所述的3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法,其特征在于:所述核苷酸的3’端可逆封闭基团是指在指定反应条件下能够被脱出、并活化出核苷酸的3’端羟基。
3.根据权利要求2所述的3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法,其特征在于:所述核苷酸的3‘端羟基是被3’-O-烯丙基、3’-O-氰乙基、3’-O-叠氮甲基、3’-O-氨基中的一个或多个基团封闭,形成3‘端修饰的核苷酸;这些3‘端修饰的核苷酸能够参与合成测序反应,且最多只能发生一个核苷酸的合成。
4.根据权利要求1所述的3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法,其特征在于:所述核苷酸合成实时产生的检测分子相同的,其检测分子是化学发光检测的焦磷酸盐,电化学检测的氢离子或者光学检测的荧光分子。
5.根据权利要求1所述的3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法,其特征在于:所述的待测核酸片段是指单分子,或者以单分子为模板扩增的相同序列产物。
6.根据权利要求1或5所述的3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法,其特征在于:所述待测核酸片段的具体碱基信息是通过解码二组碱基片段编码信息而得到的;对于有参考序列的基因组测序的再测序,两组核苷酸实时合成DNA测序得到的编码直接用于基因组参考序列的比对。
7.根据权利要求1所述的3’端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法,其特征在于:不同待测核酸序列的并行测序中,每个模板需要独立的微反应池。
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