CN102634586A - 一种两核苷酸实时合成dna解码测序方法 - Google Patents

Abstract

一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法，单个测序反应由X、Y两个不同的核苷酸同时进行，依据合成核苷酸数目与实时产生的检测分子数的定量关系，得到一个碱基序列片段编码XYⁿ。整个测序包括对同一模板进行二组测序反应：每组测序由包含四个核苷酸dATP、dCTP、dGTP、dTTP，按照每个核苷酸在一个循环中只使用一次的方式，进行由两个不同核苷酸同时合成测序反应的循环，若干次测序反应后得到由一组按照测序顺序排列的若干XYⁿ信息；当该组测序反应完成后，变性将测序引物延伸链清除，重新杂交测序引物，进行第二组测序反应，得到第二测序反应排列的若干XYⁿ信息，最后通过解码二组按照测序顺序排列的若干XYⁿ信息，组装出待测核酸片段的具体碱基序列。

Description

一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，是一种实现核酸序列高通量测定的方法，具体涉及一种两核苷酸实时合成DNA测序方法及其应用。

背景技术

随着人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成，使人类步入了后基因时代，对当代的生物学研究和医学研究产生了巨大的影响，分子生物学相关学科得到了迅猛的发展。从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。大幅度降低DNA测序的成本将会大大推动生命科学和医学的研究，甚至会带来革命性的变化。目前，全基因组DNA测序技术已经成为国际上一个竞争十分激烈的研究领域。如Roche公司基于乳液PCR产物的高通量并行焦测序技术；Illumina公司的桥式扩增-DNA芯片延伸测序技术；以及Applied Biosestems公司基于乳液PCR产物的杂交-酶连接-酶切割的SOLiD平台、pH敏感场效应管阵列芯片的Ion Torrent平台等高通量测序技术都有成熟的商品化仪器上市。

聚合酶链式反应(PCR)表明合成延伸反应理论上合成测序方法可以测定数千甚至上万个碱基，这无疑代表高通量核酸测序的巨大潜力。然而现有的合成测序要么是简单地每次只加一种核苷酸的方法通过确定每次合成的碱基的个数，或者通过可逆封闭核苷酸单体3端羟基的特殊单体一次只延伸一个核苷酸的方法确定每次合成的碱基种类的来实现的。前者需要四个独立的反应来完成所有模板的一个碱基的测定而增加测序时间，而后者由于在测定下一个碱基前需要将3端羟基的保护基团脱出，而每增加一步反应将导致反应效率的降低，最终导致测序长度的下降。以前，我们提出过基于标记核苷酸单体的“两核苷酸同时合成DNA测序方法及其应用”(中国发明专利申请号：201110321795.2)实施高通量DNA测序的方法来提高测序长度。然而，一方面，标记核苷酸单体、尤其是具有特定被切割性能的标记核苷酸单体其价格是商品化非标记天然核苷酸单体的数百倍以上，且引入切割反应、改变天然核苷酸结构均会对测序长度造成影响。另一方面，荧光强度不仅依赖于核苷酸合成的数目，而且也与具体的序列密切相关。例如，在最简单的两核苷酸合成片段AC与CA中，原理上它们应该给出相同的荧光比值，然而，在具体的测序操作中，当荧光标记单体以一定比例掺入后(如1/5)，在合成标记物核苷酸后面紧接着合成标记物的可能性非常少，所以第二个标记核苷酸掺入的数值则为4/5×1/5＝4/25。因此，在合成片段AC中，荧光强度(A/C)＝1/5/4/25＝1.25；而在合成片段CA中，荧光强度(A/C)＝4/25/1/5＝0.8；两者相差1.56倍。因此定量关系实际上是相当复杂的，需要对大量的不同序列进行预先的统计分析以给每种特定的序列确定一个相关系数，而这些在序列测定前又往往事先不知道。利用检测天然核苷酸单体合成反应实时产生的焦磷酸盐、氢离子而发展的454高通量测序技术(Margulies，et al.Nature，2005.437(7057)：376-380)、Ion Torrent测序技术(Rothberg，et al.Nature，475348-352)允许原始DNA的合成，核苷酸被合成后无需进行任何处理步骤。因此，测序过程相当快、准确率高，且序列阅读长度要比标记核苷酸单体的合成测序方法高数倍，目前的水平接近传统的Sanger技术。

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的就是利用价格便宜的天然核苷酸单体为测序原料，通过一种两核苷酸实时合成DNA测序方法，实现待测核酸序列的高通量检测。整个测序包括对同一模板进行二组测序反应：每组测序由包含四个核苷酸dATP、dCTP、dGTP、dTTP，按照每个核苷酸在一个循环中只使用一次的方式，进行由两个不同核苷酸同时合成测序反应的循环，若干次测序反应后得到由一组按照测序顺序排列的若干XYⁿ信息；当该组测序反应完成后，变性将测序引物延伸链清除，重新杂交测序引物，进行第二组测序反应，得到第二组测序反应排列的若干XYⁿ信息，最后通过解码二组排列的若干XYⁿ信息组装出待测核酸序列的具体碱基信息。该方法采用价格便宜的天然核苷酸单体为测序原料，只涉及简单的合成反应、无需要对合成的核苷酸进行后续处理，且为天然核苷酸结构对后续的测序反应无任何副作用，因此测序阅读长度比荧光修饰单体的将会有明显的增加。另一方面，由于所有核苷酸合成产生的检测分子均相同，合成核苷酸的数目与产生的检测分子数量间存在简单严格的定量关系，与具体序列无关。

技术方案：一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法，单个测序反应由X、Y两个不同的核苷酸同时进行，依据合成核苷酸数目与实时产生的检测分子数的定量关系，得到一个碱基序列片段编码XYⁿ。整个测序包括对同一模板进行二组测序反应：每组测序由包含四个核苷酸dATP、dCTP、dGTP、dTTP，按照每个核苷酸在一个循环中只使用一次的方式，进行由两个不同核苷酸同时合成测序反应的循环，若干次测序反应后得到由一组按照测序顺序排列的若干XYⁿ信息；当该组测序反应完成后，变性将测序引物延伸链清除，重新杂交测序引物，进行第二组测序反应，得到第二测序反应排列的若干XYⁿ信息，最后通过解码二组按照测序顺序排列的若干XYⁿ信息，组装出待测核酸片段的具体碱基序列。

单个测序反应由X、Y两个不同的核苷酸是指由(dATP+dCTP)、(dATP+dGTP)、(dATP+dTTP)、(dCTP+dGTP)、(dCTP+dTTP)、(dGTP+dTTP)六种组合中任一种两核苷酸同时进行的合成测序反应。

整个测序包括对同一模板进行二组测序反应是指(dATP+dCTP)/(dGTP+dTTP)，(dATP+dGTP)/(dCTP+dTTP)，(dATP+dTTP)/(dCTP+dGTP)三组中任意两组两核苷酸合成循环对同一模板的测序。

单个两核苷酸测序反应得到一个碱基序列片段编码XYⁿ信息包括该测序反应参与的核苷酸种类X、Y，以及碱基序列片段包括的碱基数目n；一个编码XYⁿ对应包括唯一的正确序列片段在内的2ⁿ个碱基序列片段。

核苷酸是未加任何修饰的dNTPs，或者三磷酸上标记可供检测的分子(如荧光基团，化学发光底物或者量子点等)的dNTPs。

dNTPs合成实时产生的检测分子相同的，其检测分子可以是化学发光检测的焦磷酸盐，电化学检测的氢离子或者光学检测的荧光分子等。

高通量DNA测序中，待测核酸序列是指单分子，或者以单分子为模板扩增的相同序列产物。

不同待测核酸序列的并行(高通量)测序中，每个模板需要独立的微反应池，避免不同模板间因合成反应产生相同检测分子的污染。

解码是指从XYⁿ对应的2ⁿ个碱基序列片段中找出唯一的正确序列片段的过程。

待测核酸序列的具体碱基信息是通过解码二组碱基片段编码信息而得到的。

对于有参考序列的基因组测序的再测序，两组核苷酸实时合成DNA测序得到的编码即可以直接用于基因组参考序列的比对，而不需要对编码进行解码，而实现对基因组序列的再测序。

一个已知可能的多模板序列的准确测定可以通过选定的一组核苷酸实时合成DNA测序得到的特定编码排列来确定具体序列。

一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法，步骤为：

a：全基因组模板制备：将目标基因组用超声破碎成大小为100-1000bp碱基的片段，并在连接酶的作用下将这些片段化核酸序列用一对序列已知道的通用连接子(如：连接子1的序列为：CTGCTGTAC CGTACAGCC TTGGCC G；连接子2的序列为：CGC TTT CCT CTCTAT GGG CAG TCG GTGA T)进行连接，并进行预扩增10个循环；然后凝胶电泳切割200-800bp DNA片段，并纯化。将这些200-800bp DNA片段与固定其中一个连接子互补序列的微珠进行乳液并行PCR反应，扩增片段化的大肠杆菌基因组片段，并变性得到大肠杆菌基因组测序DNA模板，最后，将这些扩增双链DNA模板的微珠放置到具有反应池的芯片上，每个反应池最多容纳一个微珠；

b.测序引物杂交：将5’端固定的模板与能和3’端连接子互补的引物杂交，杂交引物作为所有大肠杆菌基因组DNA模板的测序引物(为了保证每个模板每次均能发生合成反应，我们将测定连接子上的一个已知碱基序列，并在每组测序反应中的第一次两核苷酸测序反应中包含其互补碱基，如在该实例中连接子中已知碱基为T，每组测序反应中的第一次两核苷酸测序反应中均包标记的dATP)；

c.测序

第一组测序反应：将5’端固定的模板与能和3’端连接子互补的引物杂交，杂交引物作为所有大肠杆菌基因组DNA模板的测序引物(为了保证每个模板每次均能发生合成反应，我们将测定连接子上的一个已知碱基序列，并在每组测序反应中的第一次两核苷酸测序反应中包含其互补碱基，如在该实例中连接子中已知碱基为T，每组测序反应中的第一次两核苷酸测序反应中均包标记的dATP)；

按照循环加入(dATP/dGTP)、(dCTP/dTTP)的方法进行循环测序反应，得到由按照先后顺序排列的单个测序反应的碱基片段编码信息；

第二组测序反应：用8M尿素在65℃下处理5分钟(2次)，将第一组测序反应中的测序引物、及其测序引物合成链清除，重新得到单链DNA模板，然后与测序引物进行杂交；

按照循环加入(dATP/dCTP)、(dTTP/dGTP)的方法进行循环焦测序反应，得到由按照先后顺序排列的单个测序反应的碱基片段编码信息；

d.解码

利用每个模板两组测序中得到的碱基片段编码信息，解码组装出相应的碱基序列信息；

e.序列组装

利用所有模板的碱基序列信息，组装成大肠杆菌基因组序列；

表1

表1是本发明一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法的一种分组方法。将核苷酸A、G、C、T分成两组，即第一组为碱基A、G，碱基C、T分别进行两核苷酸同时合成测序反应的循环；第二组为碱基A、C，碱基G、T分别进行两核苷酸同时合成测序反应的循环。

表2

编码	片段长度	片段序列	片段总数
				XY0	0	-	0
XY1	1	X，Y	21
				XY2	2	XX，XY，YX，YY	22
XY3	3	XXX，XXY，XYX，YXX，YYX，YXY，XYY，YYY，	23
				...	...	...	...
XYn	n	XXX...XXX，...，YYY...YYY	2n

表2是本发明一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法中单个测序反应得到的编码包含的核酸片段信息。

表3

表3为本发明一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法按照表1所述的分组，表2所述的碱基片段编码方法、对图2包含的具体序列(3’-TAATCAGGTCCCATTTTGGCCTA-5’)进行的两组合成测序反应测序中每次具体测序反应所获得的编码信息。其中第一、二组表示同一引物对模板DNA的两次独立测序反应；AG/TC，AC/TG表示第一、二组独立测序反应中分别由两核苷酸同时合成测序反应的循环；编码信息包含碱基种类、以及核酸片段的碱基数目参见表2。

有益效果：

本发明应用非标记核苷酸A、G、C、T分成两组对同一模板进行两次测序，每组测序由包含四个标记的核苷酸A、G、C、T，按照每个核苷酸在一个循环中只使用一次的方式，进行两次由两个不同标记核苷酸同时合成测序反应的循环，每进行一次测序反应得到由核苷酸(碱基)片段构成的一个编码，若干次测序反应后得到由一组若干编码构成的核酸序列信息；当该组测序反应完成后，通过变性将测序引物延伸链清除，重新杂交测序引物，进行下一组测序反应，最后将两组测序反应获得的两组编码信息，通过解码转化成对应的两核苷酸(碱基)片段信息，并通过两组核苷酸(碱基)信息组装出待测核酸序列的具体碱基信息。

1.本发明的最大优点是可以直接采用商品化、非标记的天然核苷酸进行合成测序，可以大大提高序列测定的长度，同时大大降低了测序成本。

2.本发明按照核苷酸分成组的形式进行得到核酸片段构成编码，解码容易。

3.本发明适用面广。可以用于单分子模板、(单分子)多拷贝DNA模板的测序，也可以在现有测序仪器上实现。

4.本发明方法简单，所涉及的方法均能够通过现有成熟技术来实现。

5.本发明方法与现有“两核苷酸同时合成DNA测序方法及其应用”相比，由于所有核苷酸合成产生的检测分子均相同，合成核苷酸的数目与产生的检测分子数量间存在简单严格的定量关系，与具体序列无关。

附图说明

以下将结合附图对本发明作进一步说明。

图1是本发明两核苷酸实时合成DNA解码测序方法按照表1所述的分组方法，对同一DNA模板进行两组测序的流程。其中，(1)为待测序DNA模板，(1-1)和(1-2)分别为连接在待测序DNA模板两端的序列已知的连接子，(2)为载体，(3)为测序引物。测定反应包括两组：

第一组测序反应：待测序DNA模板(1)的5’端固定在载体(2)上，测序引物(3)与固定的DNA模板(1)杂交(a)，按照dATP/dGTP＝1比例将两核苷酸加入，在聚合酶作用下反应(b)，同时对核苷酸合成后产生的特定分子浓度(如焦磷酸盐，氢离子或者光学检测的荧光分子等)通过转化为光、电等信号进行实时检测(c)，得到该次测序反应测定的包含碱基种类和个数信息的碱基片段编码XYⁿ；按照dCTP/dTTP＝1比例将两核苷酸加入，在聚合酶作用下反应(d)，同时对核苷酸合成后产生的特定分子浓度转化为光、电等信号进行实时检测(e)；然后按照上述方式进行循环测序反应(f)，每增加一次循环便多产生2个相应的编码，最后得到该组反应由若干碱基片段编码构成的序列信息。

然后变性，将第一组测序反应中的测序引物、及其测序引物合成链清除，重新得到单链DNA模板。

第二组测序反应：重新杂交(a)测序引物(3)于固定的DNA模板(1)上，更换两核苷酸组合(即dATP/dCTP；dTTPdGTP)，按照第一组测序反应的方式进行，得到该组反应由若干碱基片段编码构成的序列信息。

图2是本发明一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法按照表1所述的分组方法、表2所述的编码方式，对包含3’-TAATCAGGTCCCATTTTGGCCTA-5’的待测核酸序列的测序，其中模板(1)固定在载体(2)上，测序引物(3)与模板(1)完全互补杂交，测序反应从测序引物的5’端向3’合成。

图3是本发明一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法按照表1所述的分组方法、表2所述的编码方式，对包含3’-TAATCAGGTCCCATT TTGGCCTA-5’片段的人工合成模板中3’-TAATCAGGTCCCATTTTGGCCTA-5’序列的两组焦测序图谱。其中，图3(1)为循环加入(dATP/dGTP)、(dCTP/dTTP)进行10个单步焦测序反应的焦测序图谱；图3(2)为循环加入(dATP/dCTP)、(dTTPdGTP)进行10个单步焦测序反应的焦测序图谱。

图4是本发明一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法对氧化低密度脂蛋白受体I基因(OLR-1)的14417位点的SNP分型结果。第一个峰值用来确定SNP的分型，而第二个峰值用来确定PCR是否成功。图4(1)该样本为“G/C”杂合型；(2)该样本为“G”纯合型；(3)该样本为“C”纯合型。

具体实施方式

实施例1：

两核苷酸实时合成DNA解码测序方法测定包含3’-TAATCAGGTCCCATT TTGGCCTA-5’片段的人工合成模板中3’-TAATCAGGTCCCATTTTGGCCTA-5’序列。

1.模板制备：将5’修饰生物素的人工合成模板用亲合素修饰的磁珠固定，然后将磁珠与液体分离，磁珠固定的人工合成模板用于与测序引物杂交。

2.测序引物杂交：将设计的测序引物与磁珠固定的模板在75℃下保温5分钟，然后自然冷却至室温，然后将磁珠与液体分离，磁珠固定的模板用于两核苷酸实时合成DNA测序。

3.将磁珠固定的模板放置于焦测序仪中进行测序：

第一组测序反应：将(dATP/dGTP)、(dCTP/dTTP)分别放置于试剂瓶中，测序之前先用试剂将管路中原有的试剂替换，然后按照循环加入(dATP/dGTP)、(dCTP/dTTP)的方法进行10个单步的焦测序反应，得到焦测序图谱(图3(1))。

第二组测序反应：将第一组测序反应完成后的磁珠固定的模板用0.1M NaOH处理5分钟，然后洗涤磁珠3次，然后磁珠固定的模板与测序引物进行杂交，并放置于焦测序仪中进行测序。

将(dATP/dCTP)、(dTTP/dGTP)分别放置于试剂瓶中，测序之前先用试剂将管路中原有的试剂替换，然后按照循环加入(dATP/dCTP)、(dTTP/dGTP)的方法进行10个单步的焦测序反应，得到焦测序图谱(图3(2))。

4.最后将两组测序反应得到的焦测序图谱中的各个测序信号转化为单个测序反应的碱基片段编码(如表3)。

5.根据两组测序中相同位置碱基相同的原则，由两组测序反应得到的碱基片段编码信息(表3)组装测序片段的具体序列：

从表3中知道：

i)第一、二组的第一个反应均的编码分别AG¹、AC¹，且只有A才能满足其两个反应的测序信号，因此第1个碱基是A；

ii)第一、二组的第二个反应的编码分别TC²、TG²，由第一个反应推知第二个碱基不可能为C、G，那么接下来的第2个碱基是T；

iii)当第2个碱基确定后，由第一、二组的第二个反应的编码TC²、TG²推出第3个碱基的编码为分别为TC、TG，那么第3个碱基是T；

iv)第一、二组的第三个反应的编码分别为AG²、AC，那么推出第4个碱基是A；

v)当第4个碱基确定是A后，由第一的第三个反应的编码AG²可以知道第5碱基的编码为AG。而第二组的第四个反应的编码TG²，可以推出第5个碱基是G；

vi)当第5个碱基确定是G后，由第二的第四个反应的编码TG²可以知道第6碱基的编码为TG。而第一组第四个反应的编码为TC³，可以推出第6个碱基是T；

vii)当第6个碱基确定是T后，由第一组第四个反应的编码TC³可以知道第7、8碱基的编码为TC²，第二组第五个反应是AC³，可以推出第7、8个碱基均是C；

viii)当第7、8个碱基确定是C后，由第二组第五个反应的编码是AC³可以知道第9的编码为AC，而由第一组第五个反应的编码AG⁴，可以推出第9个碱基是A；

ix)当第9个碱基确定是A后，由第一组第五个反应的编码AG⁴，可以推出第10-12个碱基的编码为是AG³，而由第二组第六个反应的编码TG⁴，可以推出第11-12个碱基均是G；

x)当第10-12个碱基确定是均是G后，由第二组第六个反应的编码TG⁴，可以推出第13个碱基的编码为是TG，而由第一组第六个反应的编码TC，可以推出第13个碱基是T；

xi)第一、二组的第七个反应编码分别为AG⁴、AC⁶，可以推出第14-17个碱基均是A；

xii)当第14-17个碱基确定均是A后，由第二组的第七个反应编码为AC⁶，可以推出第18-19个碱基的编码为是AC²，而由第一组第八个反应的编码TC²，可以推出第18-19个碱基均是C；

xiii)第一组九个反应的编码AG³、第二组第八个反应的编码TG²，可以推出第20-21个碱基均是G；

xiv)当第20-21个碱基确定均是G后，由第一组九个反应的编码AG³推出第22个碱基的编码是AG，第二组第九个反应的编码AC，可以推出第22个碱基均是A；

xv)第一、二组的第十个反应的编码分别是TC¹、TG¹，可以推出第23个碱基是T；

xvi)最后组装出序列为：3’-TAATCAGGTCCCATTTTGGCCTA-5’。

实施例2：大肠杆菌基因组的两核苷酸实时合成DNA解码测序

1.全基因组模板制备：将大肠杆菌基因组用超声破碎成大小为100-1000bp碱基的片段，并在连接酶的作用下将这些片段化核酸序列用一对序列已知道的通用连接子(如：连接子1的序列为：CTG CTG TAC CGT ACA GCC TTG GCC G；连接子2的序列为：CGC TTT CCTCTC TAT GGG CAG TCG GTGA T)进行连接，并进行预扩增10个循环；然后凝胶电泳切割200-800bp DNA片段，并纯化。将这些200-800bp DNA片段与固定其中一个连接子互补序列的微珠进行乳液并行PCR反应，扩增片段化的大肠杆菌基因组片段，并变性得到大肠杆菌基因组测序DNA模板，最后，将这些扩增双链DNA模板的微珠放置到具有反应池的芯片上，每个反应池最多容纳一个微珠。

2.测序引物杂交：将5’端固定的模板与能和3’端连接子互补的引物杂交，杂交引物作为所有大肠杆菌基因组DNA模板的测序引物(为了保证每个模板每次均能发生合成反应，我们将测定连接子上的一个已知碱基序列，并在每组测序反应中的第一次两核苷酸测序反应中包含其互补碱基，如在该实例中连接子中已知碱基为T，每组测序反应中的第一次两核苷酸测序反应中均包标记的dATP)。

3.测序

利用天然核苷酸单体合成反应实时产生的焦磷酸盐、或者氢离子可以分别采用454高通量测序平台、或者Ion Torrent高通量测序平台进行序列测定。

第一组测序反应：将5’端固定的模板与能和3’端连接子互补的引物杂交，杂交引物作为所有大肠杆菌基因组DNA模板的测序引物(为了保证每个模板每次均能发生合成反应，我们将测定连接子上的一个已知碱基序列，并在每组测序反应中的第一次两核苷酸测序反应中包含其互补碱基，如在该实例中连接子中已知碱基为T，每组测序反应中的第一次两核苷酸测序反应中均包标记的dATP)。

按照循环加入(dATP/dGTP)、(dCTP/dTTP)的方法进行循环测序反应，得到由按照先后顺序排列的单个测序反应的碱基片段编码信息。

第二组测序反应：用8M尿素在65℃下处理5分钟(2次)，将第一组测序反应中的测序引物、及其测序引物合成链清除，重新得到单链DNA模板，然后与测序引物进行杂交。

按照循环加入(dATP/dCTP)、(dTTPdGTP)的方法进行循环焦测序反应，得到由按照先后顺序排列的单个测序反应的碱基片段编码信息。

4.解码

利用每个模板两组测序中得到的碱基片段编码信息，解码组装出相应的碱基序列信息。

5.序列组装

利用所有模板的碱基序列信息，组装成大肠杆菌基因组序列。

实施例3：氧化低密度脂蛋白受体I基因(OLR-1)的14417位点的SNP分型

1.样本册处理：所有血样采用传统的蛋白激酶K与苯酚/氯仿抽提法提取外周血中的基因组DNA。

2.PCR扩增：5′-biotin-TACTATCCTTCCCAGCTCCT；5′-TTTTCAGCAACTTGGCAT-3′。50uL的PCR扩增体系中含50ng基因组DNA，1×PCR缓冲液，3mM MgCl2，250uM dNTPs，20pmol两种引物，2U Taq DNA聚合酶。扩增条件为：5min 94℃的预变性；35个30s 94℃变性，30s48℃复性和30s 72℃延伸循环；最后为7min 72℃的最后延伸。PCR产物中修饰引物延伸的单链为135碱基的片段大小，其序列为：5′-biotin-tacta tccttcccag ctcctt gtcc gcaagactgg atctggcatggagaaaactg ttacctattt tcctcgggct catttaactg ggaaaaSagc caagagaagt gcttgtcttt ggatgccaag ttgctgaaaa，其中序列中S表示G或C，为14417位点的SNP变化情况。

3.焦测序模板的制备：将3μL生物素修饰的磁珠转移到含有PCR产物的Eppendorf管中，在室温下混匀10分钟，使得生物素修饰的磁珠与生物素修饰的PCR产物结合，最后在0.1MNaOH作用下将未固定的PCR产物，PCR引物等清除，并清洗磁珠。

4.测序引物杂交：在含有固定PCR产物磁珠的Eppendorf管中加入45μL含有0.3μM测序引物(5’-gacaagcacttctcttggct)，经80℃5min，然后自然冷却至室温。

5.焦测序：将样本置于96孔板中，按照PSQ 96MA焦测序仪的使用加入各种测序试剂，其中两个单体瓶中加入(dGTP+dTTP)的混合物、dCTP，然后按照仪器的使用方法按照先(dGTP+dTTP)、后dCTP的顺序将单体分别加入到相应样本进行测序。

5.1：如果样本(dGTP+dTTP)对应的测序峰数为2.5个碱基延伸的峰高，而dCTP对应的测序峰数为2个碱基延伸的峰高(图4(1))，则该样本为“G/C”杂合型；

5.2：如果样本(dGTP+dTTP)对应的测序峰数为0个碱基延伸的峰高(只有背景信号)，而dCTP对应的测序峰数为1个碱基延伸的峰高(图4(2))，则该样本为“G”纯合型；

5.3：如果样本(dGTP+dTTP)对应的测序峰数为5个碱基延伸的峰高，而dCTP对应的测序峰数为3个碱基延伸的峰高(图4(3))，则该样本为“C”纯合型。

                         序列表

 

<110>  东南大学

 

<120>  一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法

 

<130> 

 

<160>  7    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

taatcaggtc ccattttggc cta                                             23

 

 

<210>  2

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

ctgctgtacc gtacagcctt ggccg                                           25

 

 

<210>  3

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

cgctttcctc tctatgggca gtcggtgat                                       29

 

 

<210>  4

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)..(1)

<223>  n is biotin

 

<400>  4

ntactatcct tcccagctcc t                                               21

 

 

<210>  5

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

ttttcagcaa cttggcat                                                   18

 

 

<210>  6

<211>  136

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)..(1)

<223>  n is biotin

 

<400>  6

ntactatcct tcccagctcc ttgtccgcaa gactggatct ggcatggaga aaactgttac     60

 

ctattttcct cgggctcatt taactgggaa aasagccaag agaagtgctt gtctttggat    120

 

gccaagttgc tgaaaa                                                    136

 

 

<210>  7

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

gacaagcact tctcttggct                                                 20

 

 

Claims (10)

1.一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法，其特征在于单个测序反应由X、Y两个不同的核苷酸同时进行，依据合成核苷酸数目与实时产生的检测分子数的定量关系，得到一个碱基序列片段编码XYⁿ；所述XYⁿ信息包括该测序反应参与的核苷酸种类X、Y，以及碱基序列片段包括的碱基数目n；一个编码XYⁿ对应包括唯一的正确序列片段在内的2ⁿ个碱基序列片段；整个测序包括对同一模板进行二组测序反应：每组测序由包含四个核苷酸dATP、dCTP、dGTP、dTTP，按照每个核苷酸在一个循环中只使用一次的方式，进行由两个不同核苷酸同时合成测序反应的循环，若干次测序反应后得到由一组按照测序顺序排列的若干XYⁿ信息；当该组测序反应完成后，变性将测序引物延伸链清除，重新杂交测序引物，进行第二组测序反应，得到第二测序反应排列的若干XYⁿ信息，最后通过解码二组按照测序顺序排列的若干XYⁿ信息，组装出待测核酸片段的具体碱基序列。

2.根据权利要求1所述的两核苷酸实时合成DNA解码测序方法，其特征在于单个测序反应由X、Y两个不同的核苷酸是指由(dATP+dCTP)、(dATP+dGTP)、(dATP+dTTP)、(dCTP+dGTP)、(dCTP+dTTP)、(dGTP+dTTP)六种组合中任一种两核苷酸同时进行的合成测序反应。

3.根据权利要求1所述的一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法，其特征在于整个测序包括对同一模板进行二组测序反应是指(dATP+dCTP)/(dGTP+dTTP)，(dATP+dGTP)/(dCTP+dTTP)，(dATP+dTTP)/(dCTP+dGTP)三组中任意两组两核苷酸合成循环对同一模板的测序。

4.根据权利要求1所述的一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法，其特征在于所述核苷酸是未加任何修饰的dNTPs，或者三磷酸上标记可供检测的分子的dNTPs，所述标记为荧光基团，化学发光底物或者量子点。

5.根据权利要求1所述的一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法，其特征在于dNTPs合成实时产生的检测分子相同的，其检测分子是化学发光检测的焦磷酸盐，电化学检测的氢离子或者光学检测的荧光分子。

6.根据权利要求1所述的一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法，其特征在于待测核酸片段是指单分子，或者以单分子为模板扩增的相同序列产物。

7.根据权利要求1所述的一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法，其特征在于不同待测核酸序列的并行测序中，每个模板需要独立的微反应池。

8.根据权利要求1所述的一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法，其特征在于解码是指从XYⁿ对应的2ⁿ个碱基序列片段中找出唯一的正确序列片段的过程。

9.根据权利要求1所述的一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法，其特征在于待测核酸片段的具体碱基信息是通过解码二组碱基片段编码信息而得到的。

10.根据权利要求1所述的一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法，其特征在于步骤为：

a：全基因组模板制备：将目标基因组用超声破碎成大小为100-1000bp碱基的片段，并在连接酶的作用下将这些片段化核酸序列用一对序列已知道的通用连接子进行连接，其中连接子1的序列为：CTG CTG TAC CGT ACA GCC TTG GCC G，连接子2的序列为：CGC TTT CCTCTC TAT GGG CAG TCG GTGA T；并进行预扩增10个循环；然后凝胶电泳切割200-800bpDNA片段，并纯化；将这些200-800bp DNA片段与固定其中一个连接子互补序列的微珠进行乳液并行PCR反应，扩增片段化的大肠杆菌基因组片段，并变性得到大肠杆菌基因组测序DNA模板，最后，将这些扩增双链DNA模板的微珠放置到具有反应池的芯片上，每个反应池最多容纳一个微珠；

b.测序引物杂交：将5’端固定的模板与能和3’端连接子互补的引物杂交，杂交引物作为所有大肠杆菌基因组DNA模板的测序引物；

c.测序

第一组测序反应：将5’端固定的模板与能和3’端连接子互补的引物杂交，杂交引物作为所有大肠杆菌基因组DNA模板的测序引物；

按照循环加入dATP/dGTP、dCTP/dTTP的方法进行循环测序反应，得到由按照先后顺序排列的单个测序反应的碱基片段编码信息；

第二组测序反应：用8M尿素在65℃下处理5分钟共2次，将第一组测序反应中的测序引物、及其测序引物合成链清除，重新得到单链DNA模板，然后与测序引物进行杂交；

按照循环加入dATP/dCTP、dTTP/dGTP的方法进行循环焦测序反应，得到由按照先后顺序排列的单个测序反应的碱基片段编码信息；

d.解码

利用每个模板两组测序中得到的碱基片段编码信息，解码组装出相应的碱基序列信息；

e.序列组装

利用所有模板的碱基序列信息，组装成大肠杆菌基因组序列。

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