CN100552041C - 循环杂交延伸dna测序方法 - Google Patents

Abstract

循环杂交延伸DNA测序方法是一种实现了延伸标记物的清除方法，涉及一种循环杂交-延伸DNA测序方法，其步骤为：步骤1)当测序引物与固定的未知DNA模板杂交后，通过在测序引物上每次延伸一个标记单体、并检测后来确定不同位置的未知DNA模板在该次延伸中的碱基信息；步骤2)将延伸标记单体的测序引物从DNA模板中变性分离，并重新将测序引物与DNA模板杂交，用未标记的单体的延伸至已经确定的碱基序列，然后改用标记的单体延伸继续测序，该方法实现了延伸标记物的清除方法，每次杂交测序引物只延伸测定一小段的序列，错误延伸的效应不严重，重新杂交后的延伸按照流行的分子生物学方法进行，能够始终维持DNA模板和测序引物的量重新杂交后的延伸按照流行的分子生物学方法进行，没有标记物量的累积效应，能够始终维持DNA模板和测序引物的量。

Description

循环杂交延伸DNA测序方法

技术领域

本发明是一种实现了延伸标记物的清除方法，涉及一种循环杂交-延伸DNA测序方法，属于生物技术领域。

技术背景

随着基因组研究的深入，从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。虽然导致疾病发生的因素众多，但基因突变(单核苷酸多态性、甲基化等)被广泛认为是一个重要的内在因素。在基础研究方面，基因突变位点有助于基因组的精确定位，研究疾病基因的遗传规律，克隆致病基因；在应用方面，直接寻找疾病的易感基因突变位点：大多数复杂疾病，如癌症、糖尿病、心血管疾病、抑郁症、哮喘等，是受众多基因以及环境因子共同作用，通过对于大量某一特定疾病的基因组样本中突变基因型进行大规模鉴定和检测，可以获得有关与该疾病相关基因型的信息。更为重要的是，通过筛查药物敏感的基因突变位点，为今后实现个体化用药提供依据。通过发现疾病易感性的基因突变位点，可以使人们及早地预防疾病，达到避免疾病的发生的目的。因此，人类基因组草图刚刚绘制完成后，寻找人类基因组中基因突变位点立即成为人类基因组计划的主要任务之一。目前有许多关于突变和单核苷酸多态性检测的方法，如DNA测序、限制性酶切长度多态性、单链构象多态性、焦磷酸测序和等位基因特异的寡聚核苷酸杂交等。这些技术虽在某种程度上能完成对突变或核苷酸多态性的检测，但均不能同时对目标片段进行全方位的序列确定。能够全方位进行序列检测的方法，即全基因组测序列。然而全基因组序列测定费用太高，对第一个人类基因组序列测定的费用大约为10亿美元，目前这一费用已经降低到大约2千万美元。因此，功能基因组的研究进展仍然受限于DNA测序技术，大幅度降低DNA测序的成本将会大大推动生命科学和医学的研究，甚至会带来革命性的变化。除了对现有的基于电泳的测序技术进行改进外，当前正在发展的新型测序技术主要集中在非电泳的手段上。这类技术从总体上来看可以分成四大类：第一类是合成测序，在碱基加入到正在延伸的DNA链的过程当中进行检测；第二类技术则是杂交测序法，通过制备一组高密度寡核苷酸微阵列芯片的杂交信号，进行目标基因的序列鉴定。第三类为分子影像一系列可以在单分子的水平上进行测序的技术；最后一类技术是诱导DNA分子蜿蜒通过非常细微的小孔，在这个过程当中借助于电子学或者光学的方法对碱基进行读出，也称作纳米孔测序。实际上，目前只有合成测序方法有希望用于全基因组测序，而目前的延伸合成测序方法，当标记物的量达到不能确定延伸碱基的信息时，采用将标记物破坏或者切割的方法清除标记物，以进行下面的延伸测序。由于标记物与单体的连接均为稳定的化学键，因此在采用化学或者光照方法将标记物破坏或者切割标记物时，无疑将造成对DNA模板和测序引物的破坏，减少模板数和增加错误延伸的信息；标记物破坏或者切割不彻底将导致标记物量的累结，给后续标记物量的确定带来困难，影响测序的长度和正确性。本发明的目的就是不通过标记物被破坏或者标记物被切割的方法清除，建立快速，准确，便宜的基因组序列测定方法。

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种循环杂交延伸DNA测序方法，该方法实现了延伸标记物的清除方法，每次杂交引物延伸只测定一小段的序列，错误延伸的累积效应不严重，序列的测定准确；重新杂交后的延伸按照流行的分子生物学方法进行，能够始终维持DNA模板和测序引物的量，序列的测定正确可靠，不存在测序长度的限制。

技术方案：本发明是一种循环杂交-延伸DNA测序方法，其DNA序列确定是通过“杂交-延伸测序”步骤来实现的：

步骤1)当测序引物与固定的未知DNA模板杂交后，通过在测序引物上每次延伸一个标记单体、并检测后来确定不同位置的未知DNA模板在该次延伸中的碱基信息，当测序引物随着标记单体的不断延伸而导致标记物的量的变化不能反应延伸的实际情况时，停止该次杂交的延伸测序，此时未知的DNA模板中的一小段几个碱基序列已经确定；

步骤2)将延伸标记单体的测序引物从DNA模板中变性分离，并重新将测序引物与DNA模板杂交，用未标记的单体的延伸至已经确定的碱基序列，然后改用标记的单体，完全按照步骤1)的方法，在已经确定的碱基序列上，继续延伸并测定下一小段碱基的序列；循环上述“杂交-延伸”过程，直到未知DNA模板的序列确定。

固定的未知DNA模板是指待测序的DNA片断通过常规的PCR，滚环扩增、固相扩增以及桥式扩增等增加基因组中感兴趣的目的序列量的方法，扩增可以是单重的，即一次扩增一个目的片断，也可以是多重的，即一次扩增多个目的片断；未知DNA模板通过化学或者物理方法可以固定在平面基片上，也可以固定在“96、384孔板”或者各种修饰的珠子等载体上，还可以同时固定多个DNA模板，也包括单个DNA模板的固定。所述的测序引物是指能和且只能和所有DNA模板一段通用特定序列杂交的寡核酸片段；在DNA模板制备过程中，通过连接或者在扩增过程中引入与测序引物互补的一段通用序列，其中引入的该段通用序列应与模板中任何一段序列片段有区别，即模板中只有该段通用序列能够与测序引物实现杂交。

所述的标记单体，是指单体(A，G，C，T)上包含可以直接或者间接检测到的基团或者粒子，如修饰荧光基团，生物素和量子点，或者不修饰的单体在反应中产生的光信号。所述的标记单体可以是单色的，即四种单体均标记相同的标记物，也可以是多色的，即四种单体标记不相同或者不完全相同的标记物。所述的标记单体的延伸反应可以是全部标记的单体延伸反应，也可以是标记单体和相同未标记单体的混合物延伸的延伸反应；标记单体和相同未标记单体的混合物的比例也可以在不同延伸条件下不同。

所述的未知DNA模板中的碱基信息是通过检测延伸是否有标记物和标记物的量来确定测序引物是否发生该次碱基的延伸或者几个连续碱基延伸，最后通过碱基互补原理确定未知DNA模板否有对应的碱基或者对应几个连续的碱基信息。作为一种特殊情况，延伸单个碱基可以用来检测DNA序列中单碱基变化，包括单碱基多态性，甲基化和单碱基缺。

所述的检测是与单体标记物定的性质相适应，检测的可以是荧光、化学发光，或者同位素。当采用化学发光等方法时，由于检测的是反应体系产生的光信号，所以单体是不需要标记的，标记物检测可以通过单色或者多色的累加实现碱基的连续测定，如在激光激发的荧光标记基团时，光电倍增可以分为95％，80％，60％等多个检测区间，同时每个光电倍增下可以将荧光增加量分为3000，6000，1000等多个荧光强度段。

所述的用未标记的单体的延伸至已经确定的碱基序列，可以通过重复标记单体单个碱基延伸的步骤，也可以采用2-4个碱基组合延伸的步骤进行。

有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优点：

1.本发明的最大优点是实现了延伸标记物的清除方法。在传统的延伸合成测序方法中，当标记物的量达到不能确定延伸碱基的信息时，一般采用将标记物破坏或者切割的方法清除标记物，以进行下面的延伸测序。由于标记物与单体的连接均为稳定的化学键，因此在采用化学或者光照方法将标记物破坏或者切割标记物时，无疑将造成对DNA模板和测序引物的破坏，减少模板数和增加错误延伸的信息，给测序的长度和正确性造成影响。

2.本发明的每次标记单体延伸测序，测定一小段的序列，错误延伸的累积效应不严重，序列的测定准确；重新杂交后的延伸按照流行的分子生物学方法进行，能够始终维持DNA模板和测序引物的量，序列的测定正确可靠，不存在测序长度的限制。

附图说明

以下将结合附图对本发明作进一步说明。

图1是本发明循环杂交-延伸DNA测序方法的示意图。图中有：未知序列的DNA模板1，固相载体2，通用测序引物3、反相DNA模板4、Cy3-ddATP(或者Cy3-dATP)5、Cy5-ddGTP(或者Cy5-dGTP)6。

DNA模板杂交反应a，标记单体A的延伸反应b，标记单体C的延伸反应c，标记单体G的延伸反应d，标记单体T的延伸反应e，未标记单体A的延伸反应g，未标记单体C的延伸反应h，未标记单体G的延伸反应i，未标记单体T的延伸反应j，变性f，标记单体A^*，C^*，G^*，T^*和未标记的单体A C，G，T，单碱基多态性“T”纯合型m，单碱基多态性“T+G”杂合型n，单碱基多态性“G”纯合型o。

图2是本发明循环杂交-延伸DNA测序方法延伸一个碱基检测分析DNA单碱基变化的示意图。

具体实施方式

将测序引物与固定的未知DNA模板杂交后，通过在测序引物上每次延伸一个标记单体来测定未知DNA模板的在该位置或者后续几个碱基的信息，当测序引物随着标记单体的不断延伸而导致标记物的量的变化会不能反应延伸的实际情况时，停止该次杂交的延伸测序，此时未知的DNA模板中的几个碱基(一小段)序列已经确定，然后将延伸标记单体的测序引物从DNA模板中变性分离，并重新将测序引物与DNA模板杂交，用未标记的单体延伸至已经确定的碱基序列，然后改用标记的单体，完全按照聚合标记单体的方法延伸、并检测下一小段碱基的序列。循环“杂交-延伸”步骤，直到未知DNA模板的序列确定。该方法由于不需要将标记物破坏，因而保证了DNA模板和测序列引物不会遭到破坏，同时由于每次标记单体延伸测序时，只测定一小段的序列，错误延伸的累积效应不严重，序列的测定准确；重新杂交后的延伸按照流行的分子生物学方法进行，能够始终维持DNA模板和测序引物的量，序列的测定正确可靠，不存在测序长度的限制。

图1是本发明循环杂交-延伸DNA测序方法的示意图，未知序列的DNA模板1固定到固相载体2上，通用测序引物3与DNA模板杂交反应a，加入标记的单体A，在聚合酶的作用下通用测序引物3发生标记单体A的延伸反应b，通过检测可以知道本次延伸中不同位置上未知DNA模板否有碱基T或者几个连续的碱基T的信息；加入标记单体C，在聚合酶的作用下发生标记单体C的延伸反应c，通过检测可以知道标记单体C聚合延伸中不同位置上未知DNA模板否有碱基G或者几个连续的碱基G的信息；加入标记的单体G，在聚合酶的作用下发生标记单体G的延伸反应d，通过检测可以知道标记单体G延伸中不同位置上未知DNA模板否有碱基C或者几个连续的碱基C的信息；加入标记的单体T，在聚合酶的作用下发生标记碱基T的延伸反应e，通过检测可以知道标记碱基T延伸中不同位置上未知DNA模板否有碱基A或者几个连续的碱基A的信息。通过变性f清除延伸的测序引物，并用通用测序引物3重新对已经测定一小段序列的DNA模板杂交反应a，加入未标记的单体A，发生未标记的单体A的延伸反应g；加入未标记的单体G，发生未标记的单体G的延伸反应h；加入标记的单体C，在发生未标记的单体C的延伸反应i；加入标记的单体T，发生未标记单体T的延伸反应j。通过变性f，依次完成延伸标记碱基A的延伸反应b、标记碱基C的延伸反应c、标记碱基G的延伸反应d、标记碱基T的延伸反应e，将实现下一小段DNA模板序列的测定。循环杂交-延伸反应，可以将模板DNA序列测定完成。为了减少测序的操作步骤，在使用未标记的单体进行重新延伸时，可以将原来四个步骤g、h、i、j组合进行达到所需要的延伸长度。

图2中，基因组目的片断通过DNA扩增后固定在玻璃平面固相载体2上构成DNA芯片，DNA芯片依次通过变性f、清除未固定DNA片段和其他PCR产物中的杂质后，得到固定在玻璃片表面的DNA模板，用与检测单碱基变化前的一段互补测序引物与固定的DNA模板杂交反应a。加入Cy3-ddATP(或者Cy3-dATP)和Cy5-ddGTP(或者Cy5-dGTP)于延伸反应体系中并完成延伸反应k。延伸反应完成后，通过将未参与延伸的标记分子有效清除，扫描分析可以知道那些阵点发生了那些碱基的延伸，从而确定单碱基多态性(SNP)的类型，如(图2m)中阵点为“T”纯合型；(图2n)阵点“T+G”杂合型；(图2o)阵点“G”纯合型。

实例1：循环杂交-荧光延伸测序法测定包含人基因组中SNP位点编号为rs11053646一段DNA片断，

参照附图1，设计一对PCR引物，其中一条引物修饰了丙烯酰胺基团。用PCR引物扩增人样本(如血、唾液等)中包含SNP位点编号为rs 11053646一段DNA序列片断。用聚合方法将PCR产物固定在玻璃片上，采用变性、电泳方法将未固定的另一条PCR链和其他杂质清除，得到一条纯净的DNA链。将未修饰的一条引物与固定的DNA模板杂交。

在延伸反应条件下，按照A、G、C、T的次序，每次加入一个碱基分别加入荧光标记的单体为一轮，直到荧光的变化量每次加入标记单体并完成聚合延伸后，用扫描仪记录该次延伸中荧光的有无和强度，并判断是否发生该碱基的延伸和延伸的个数，从而推知DNA模板的序第一轮为AAG；第二轮为：ACT；第三轮为：GG；则这一小片段的序列成为已知，即为AAG ACT GG。到此时，如果再延伸带荧光的单体，可能不能反应时荧光的变化量与延伸碱基的个数即停止继续荧光单体的延伸。

因此将延伸上述8个带荧光单体的测序引物变性掉，并重新杂交测序引物，第一次加入未标记荧光的单体A、G、C，则重新杂交测序引物将延伸AAGAC5个碱基；第二次加入未标记的荧光单体T，第三次加入未标记的荧光单体G，到此，上次测序的8个碱基序列(已知序列)全部完成延伸。再按照A、G、C、T的次序分别加入荧光标记标记的单体进行测序：每轮的序列分别为：AT；C；TGG；C；AT；到此时，荧光的变化量与不能反应延伸碱基的个数，即停止本次杂交的测序。但此时，又一小片段的序列成成为已知，此时模板DNA已知序列为AAG ACT GGATCT GGC AT。

循环上述杂交-延伸过程，直到序列测定到需要的位置。

实例2：循环杂交-焦测序法测定包含人基因组中SNP位点编号为rs11053646一段DNA片断。

参照附图1，按照实例1的方法制备测序模板，并与测序引物完成杂交。

按照A、G、C、T的次序，每次加入一个碱基分别加入未标记的单体，根据延伸反应条件下，焦测序体系中是否产生光和和光强度判断是否发生该碱基的延伸和延伸的个数，从而推知本次杂交中测定的DNA模板序列为AAG ACT GGA TCTGGC ATG GAG AAA ACT G。当光的的变化量不能反应延伸碱基的个数时，即停止本次杂交的焦测序。

将延伸上述延伸28个碱基的测序引物变性掉，并重新杂交测序引物，将测序引物延伸至上次杂交-焦测测定的28个碱基位置。即第一次加入未标记的单体A、G、C，则重新杂交测序引物将延伸AAGAC 5个碱基；第二次加入未标记的单体T、个T、G、A，测序引物继续延伸TGGAT 5个碱基；第三次加入未标记的单体C、T、G，测序引物将延伸CTGGC 5个碱基；第四次加入未标记的单体A、T、G，测序引物将延伸ATGGAGAAAA 10个碱基；第五次加入未标记的单体C，测序引物将延伸一个C碱基；第六次加入未标记的单体T，测序引物将延伸一个T碱基；第Q七次加入未标记的单体G，测序引物将延伸一个G碱基；到此，第一次杂交-焦测序测序的28个碱基序列(已知序列)全部完成延伸。再按照A、G、C、T的次序，进行焦测序测定本次杂交的测序序列为TTA CCT ATT TTC CTC GGG CTCA。当光的的变化量不能反应延伸碱基的个数时，即停止本次杂交的焦测序。

循环上述杂交-延伸过程，直到序列测定到需要的位置。

Claims (9)

1、一种循环杂交-延伸DNA测序方法，其特征在于DNA序列确定是通过“杂交-延伸测序”步骤来实现的：

步骤1)当测序引物与固定的未知DNA模板杂交后，通过在测序引物上每次延伸一个标记单体、并检测后来确定不同位置的未知DNA模板在该次延伸中的碱基信息，当测序引物随着标记单体的不断延伸而导致标记物的量的变化不能反应延伸的实际情况时，停止该次杂交的延伸测序，此时未知的DNA模板中的一小段几个碱基序列已经确定；

步骤2)将延伸标记单体的测序引物从DNA模板中变性分离，并重新将测序引物与DNA模板杂交，用未标记的单体的延伸至已经确定的碱基序列，然后改用标记的单体，完全按照步骤1)的方法，在已经确定的碱基序列上，继续延伸并测定下一小段碱基的序列；循环上述“杂交-延伸”过程，直到未知DNA模板的序列确定。

2、根据权利要求1所述的循环杂交-延伸DNA测序方法，其特征在于固定的未知DNA模板是指待测序的DNA片断通过常规的PCR，滚环扩增、固相扩增以及桥式扩增增加基因组中感兴趣的目的序列量的方法，扩增是单重的，即一次扩增一个目的片断，或是多重的，即一次扩增多个目的片断；未知DNA模板通过化学或者物理方法固定在平面基片上，或固定在“96、384孔板”或者各种修饰的珠子载体上，或同时固定多个DNA模板，也包括单个DNA模板的固定。

3、根据权利要求1所述的循环杂交-延伸DNA测序方法，其特征在于所述的标记单体，是指单体A，G，C，T上包含直接或者间接检测到的基团或者粒子。

4、根据权利要求1或3所述的循环杂交-延伸DNA测序方法，其特征在于所述的标记单体是单色的，即四种单体均标记相同的标记物，或是多色的，即四种单体标记不相同或者不完全相同的标记物。

5、根据权利要求1所述的循环杂交-延伸DNA测序方法，其特征在于所述的标记单体的延伸反应是全部标记的单体延伸反应，或是标记单体和相同未标记单体的混合物延伸的延伸反应；标记单体和相同未标记单体的混合物的比例在不同延伸条件下不同。

6、根据权利要求1所述的循环杂交-延伸DNA测序方法，其特征在于所述的测序引物是指能和且只能和所有DNA模板一段通用特定序列杂交的寡核酸片段；在DNA模板制备过程中，通过连接或者在扩增过程中引入与测序引物互补的一段通用序列，其中引入的该段通用序列应与模板中任何一段序列片段有区别，即模板中只有该段通用序列能够与测序引物实现杂交。

7、根据权利要求1所述的循环杂交-延伸DNA测序方法，其特征在于所述的未知DNA模板中的碱基信息是通过检测是否有标记和标记物的量来确定测序引物是否发生碱基的延伸或者几个连续碱基延伸，最后通过碱基互补原理确定未知DNA模板是否有对应的碱基或者对应几个连续碱基的信息。

8、根据权利要求1所述的循环杂交-延伸DNA测序方法，其特征在于所述的检测是与单体标记物的性质相适应，检测的是荧光、化学发光，或者同位素。

9、根据权利要求1所述的循环杂交-延伸DNA测序方法，其特征在于所述的用未标记的单体的延伸至已经确定的碱基序列，通过重复标记单体单个碱基延伸的步骤，或采用2-4个碱基组合延伸的步骤进行。

Images