CN1834261A - 基因分型芯片及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基因分型芯片及其制备方法与应用。其目的是提供一种基因分型芯片及其制备方法与其在对基因多态性位点进行基因型检测中的应用。该芯片包括一套来自待测样品的核酸片段及另一套来自多个参考样品的核酸片段；所述核酸片段均是在完全相同的条件下，分别扩增待测样品与参考样品中含有多态性位点的基因片段得到的；核酸片段固定于芯片表面，且每个参考样品都含有一个已知基因型的多态性位点。本发明将在未知样品的基因多态性位点的基因分型中发挥重要作用。

Description

基因分型芯片及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物芯片及其制备方法与应用，特别是涉及一种基因分型芯片及其制备方法与其在对基因多态性位点进行基因型检测中的应用。
背景技术
生物芯片(也叫微阵列)技术最近几年得到飞速发展(Fodor et al.，Science251：767-773(1991)；Marshall et al.，Nat.Biotechnol.16：27-31(1998))。应用生物芯片检测基因表达信息的最主要优势之一就是高通量。例如，广泛使用的cDNA芯片，能够同时检测一个样品多个基因的表达情况。当多个探针被固定在芯片表面，用于检测某一样品中某些特定的靶分子时，这种芯片称为反向杂交芯片。另一方面，芯片也能用于同时检测不同样品中相同的靶分子。当被检测的多个样品被固定在芯片表面，用一个或多个探针检测多个样品中某些特定的靶分子时，这种芯片称为正向杂交芯片。
阳性对照和阴性对照的正确选择对于正向杂交的成功非常关键。通常情况下，为了获得想要的信息，一个典型的正向杂交反应需要多种检测探针。这就给芯片的设计及其实验结果的正确分析带来了困难。此外，由于用于正向杂交的靶分子通常是核酸样品通过传统PCR方法扩增获得的产物，所以正向杂交的敏感性有时会受到传统PCR方法扩增效率的限制。
“多态性位点”或“多形性位点”，是指基因座位上特定的核酸位点，这些位点的核酸在不同群体当中可以不同。核酸序列的多态性也有多种形式。例如，单个或多个碱基的置换或多形性，碱基的缺失或插入。“基因分型”或“基因型检测”，是指鉴定或检测在多态性位点上的明确变化(如核酸序列的改变)。
“扩增”是指能够优先增加样品中含多态性位点的那一段核酸序列的任意一种方式。核酸“扩增”指的是能导致核酸片段一个或多个拷贝形成的方法，这种方法最好是能使核酸片段呈指数倍增加。已知的此类方法有DNA特定序列的酶催化扩增反应，其中之一就是普遍应用的聚合酶链式反应(PCR)(Saiki et al.，1986，Science230：1350-1354.)。
不对称PCR是一种快速扩增单链核酸的方法。不对称PCR与普通PCR不同，普通PCR反应中所用的一对引物浓度相同，而不对称PCR中一条引物浓度被升高到另一引物浓度的几倍乃至几十倍。这样低浓度引物首先被耗尽，后续的PCR反应依靠剩余的高浓度引物进行，继而产生大量的对应于高浓度引物的DNA链。与此类似，在通过温度控制的不对称PCR(其代表另一种特定类型的不对称PCR)中，一对Tm值差异至少10℃的引物被使用。其最初的PCR反应在Tm值低的引物也能进行退火的条件下进行，后面的PCR反应在仅Tm值高的引物才能进行退火的条件下进行。不对称PCR导致仅互补链中的一条链被大量扩增。
PCR反应中用到的引物可以是10-50bp不同长度的核酸片段，通常为至少15个核苷酸，从而保证扩增的特异性。一般情况下，杂交引物与特定核酸序列互补的部分(或引物结合位点)需要占到引物核酸序列的90％，最好是95％或100％。通常寡核苷酸引物杂交部分的核酸序列至少为10个核苷酸，理想的最少是15个核苷酸，或20-50个核苷酸，从而尽可能的减少随机、非特异性杂交反应的发生。此外，引物5’末端的核酸序列可以含有不与样品或参考样品发生互补杂交的序列，其长度可以是1-60、5-30，或8-30个核苷酸。因为这些序列对所有PCR扩增产物来说是相同的，它们可以作为对杂交信号进行归一化处理的靶点。
位于人6号染色体短臂的HLA(人白细胞抗原)基因复合体是主要组织相容性复合物(MHC)的一部分。这些基因编码调节细胞间免疫应答的细胞表面蛋白。多种多样的I类HLA座位编码HLA抗原，即44000道尔顿的多肽，其与细胞表面β2微球蛋白相连接。这些I类HLA分子参与细胞毒素T淋巴细胞介导的靶细胞识别过程。II类HLA座位编码细胞表面异源二聚体，分别由29000及34000道尔顿的蛋白组成。这些II类HLA分子参与辅助T淋巴细胞介导的靶细胞识别过程。
I类HLA基因中的HLA-A，HLA-B，HLA-C座位以及II类HLA基因中的HLA-DRB，HLA-DQB，HLA-DQA，HLA-DPB及HLA-DPA座位具有高度多态性。世界卫生组织HLA体系命名委员会认定了25个HLA-A等位基因(HLA-A-0101，A-0201等)、32个HLA-B等位基因、11个HLA-C等位基因、43个HLA-DRB等位基因、13个HLA-DQB等位基因、8个HLA-DQA等位基因、4个HLA-DPA等位基因及19个HLA-DPB等位基因(Marsh andBodmer，Immun.Genetics，31：131(1990))。这种高度多态性被认为与HLA分子的功能有关。HLA基因分型在人组织器官移植、疾病诊断治疗、司法鉴定、免疫学和遗传性研究方面具有重要作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种对多个核酸样品的基因多态性位点的基因型进行检测的生物芯片。
本发明所提供的基因分型芯片，包括一套来自待测样品的核酸片段及另一套来自多个参考样品的核酸片段；所述核酸片段均是在完全相同的条件下，分别扩增待测样品与参考样品中含有多态性位点的基因片段得到的；核酸片段固定于芯片表面，且每个参考样品都含有一个已知基因型的多态性位点。
上述基因分型芯片每个参考样品都含有一个已知基因型的多态性位点，以其作为阳性对照来检测样品的基因型。并且每个参考样品所含有的已知基因型的多态性位点各不相同，因而该芯片能为多种不同的探针提供阳性对照。本发明的芯片尤其适用于使用多个不同探针对具有不同基因型、不同多态性位点的多个样品的检测。
所述样品是指预测含有目的核酸序列的材料。待测样品可以是多种多样的，包括生物流体，如血、血清、血浆、唾液、淋巴液、精液、阴道液、粪便、尿液、脊髓等；生物组织，如头发、皮肤等；以及细胞培养类、植物、食品和法医样品等其它样品。必要时，可对样品用常规方法进行预处理，即用试剂溶解样品及/或将其中的核酸释放出来。此外，所用样品也可未经处理直接从目的材料中获得，这些材料包括细菌、病毒、植物、哺乳动物(如人、灵长类动物、牛、马、犬、猫、猪、绵羊等)等。
核酸可以是复杂混合物(如生物样品)的一小部分，也可以是从生物样品中分离或通过纯化获得的。“分离”或“纯化”核酸分子，是指将自然条件下存在于生物体内的核酸分子游离出来，使其呈完全自由的状态存在。所述完全自由状态指分子中至少有50％，优选为70％、80％或90％呈游离状态存在。
所述“核酸”等同于“多聚核苷酸”，是指任意核酸，无论是由脱氧核苷还是由核苷组成，无论这些核酸之间是通过磷酸二酯连接还是通过修饰过的分子(如磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸盐、羧甲基、乙酰酸盐、氨基甲酸盐、硫醚、桥氨基磷酸酯、桥甲基磷酸酯、磷酸硫酸盐、甲基磷酸盐、二硫代磷酸盐、桥磷酸硫酸盐或磺基等)连接都可；此外，还可为经至少一个糖基修饰过的，所述糖基可以是阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖或己糖等。所述核酸可以是DNA、RNA、cDNA、DNA-RNA、肽核酸(PNA)、杂合子或混合物，并可以以双链、单链或部分双链的形式存在。
所述芯片能够检测多个样品基因多态性位点的基因型，如至少可用于检测2、3、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500或1000份样品中任意一份样品的基因型。
所述来自样品的核酸片段只要包括能用于基因分型的多态性位点即可，其长度是任意的，如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000bp等。所述核酸片段还可包括有多个多态性位点，如2个、3个、4个、5个或6个等。
所述芯片包含来自样品的至少10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个核酸片段。这些核酸片段大部分各不相同，如来自不同样品或同一样品不同区域的核酸片段。其中一些核酸片段可能是相同的，如来自同一样品的同一区域的扩增产物被固定在芯片上不同的(如2、3、4或5个等)位点上，从而增加检测的精确度。
所述固定在芯片表面的核酸片段可通过传统PCR(即对称PCR)、套式PCR或不对称PCR的方法扩增得到，优选为不对称PCR的方法。通过传统或套式PCR扩增得到的核酸片段为典型的双链核酸片段，这些核酸片段在被固定到芯片表面前，需通过变性步骤(如热变性)使其形成部分单链。而采用不对称PCR的方法，能够获得较高浓度的单链核酸产物，而高浓度的单链核酸产物在芯片杂交时能产生更强的杂交信号和更高的杂交效率，特别适用于基因多态性位点的基因型检测。
本发明的芯片可用于I类或II类HLA(人白细胞抗原)基因多态性位点基因型的检测。所述HLA基因包括：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB、HLA-DQB、HLA-DQA、HLA-DPB及HLA-DPA。包含上述HLA基因中任一基因的核酸片段可用上述方法制备。
为检测样品中目标核酸的基因型，可将目标核酸与对照核酸相比较。“对照”指已知其多态性位点基因型的已知样品。对照(参考样品)可以是自然存在的样品，也可以是自然存在样品的人工修饰产物。例如，对照可以是以本发明描述的方法或其它目前已知的方法已经作过基因分型的样品。
作为本发明的一个方面，所述生物芯片包括来源于多个参考样品的第二套核酸片段。其典型特征是，第二套核酸片段与部分或全部来源于多个样品的第一套核酸片段相关。如果核酸片段是同样的，或不能确定两序列间(如多态性位点)的差异，则核酸片段间可以是相关的。
第二套核酸片段用参考样品制备得到，并采用与制备待测样品核酸片段相同的扩增方法及条件。例如，相同的引物可用于待测样品和参考样品的扩增反应中。扩增反应也可以采用相同的热循环。由于第二套核酸片段的制备方法与第一套核酸片段制备方法相同，由整个环境导致的不同样品间的变化可以降到最低。因而参考样品，特别是来源于参考样品的核酸片段，能够作为待测样品的很好的阳性对照。此外，对于每一个用于检测特定基因型的探针，除了特定基因型的参考样品(特别是来源于参考样品的核酸片段)，包含已知基因型的参考样品(特别是来源于参考样品的核酸片段)也能够很好地作为检测的阴性对照。这样，所有参考样品能够整体地作为一个很好的指示器来监测生物芯片体系是否以预期的方式在起作用。
来源于参考样品的核酸片段只要包括已知基因型所在的多态性位点即可，其长度是任意的，如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000bp等。通常情况下，参考样品的核酸片段仅包含一个多态性位点，但也可包括有多个多态性位点，如2个、3个、4个、5个或6个等。
所述芯片可包含来源于参考样品的至少10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000种核酸片段。这些核酸片段大部分各不相同，如来自不同参考样品或同一参考样品不同区域的核酸片段。其中一些核酸片段可能是相同的，如来自同一参考样品的同一区域的扩增产物被固定在芯片上不同的(如2、3、4或5个等)位点上，从而增加检测的精确度。这些核酸片段可以是双链或单链的。
所述芯片还可包含来源于多个参考样品的核酸片段，参考样品的最少数目可为：10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100。
当本发明的芯片用于I类或II类HLA(人白细胞抗原)基因多态性位点基因型的检测时，参考样品为不同的HLA标准样品。多种多样的HLA标准样品为目前所知的标准样品。例如，国际HLA数据库(http：//www.ebi.ac.uk/imgt/hla)提供了多种HLA标准样品的信息。
本发明的第二个目的是提供一种上述基因分型芯片的制备方法。
本发明所提供的制备方法，包括以下步骤：
1)用PCR方法扩增待测样品和参考样品中含有多态性位点的特定区域，得到一套核酸片段；
2)将步骤1)获得的核酸片段固定在微阵列基片上，得到基因分型芯片。
所述PCR方法优选为不对称PCR方法。不对称PCR扩增所用的上游引物及下游引物的摩尔比率可为1∶12.5-100，优选的摩尔比率为1∶12.5。不对称PCR扩增的循环数至少为30个，优选的循环数为30-40个。
本发明的芯片可用于HLA(人白细胞抗原)基因多态性位点基因型的检测，包括I类或II类HLA基因多态性位点的基因型检测。所述HLA基因包括：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB、HLA-DQB、HLA-DQA、HLA-DPB及HLA-DPA。当检测HLA-DRB基因多态性位点的基因型时，芯片上固定的核酸片段是HLA基因复合体中的HLA-DRB基因片段，该核酸片段可由下述引物对(序列表中的SEQ ID №：1和SEQ ID №：2)扩增得到：
上游引物(PMH_0303047a)：5’-GATCCTTCGTGTCCCCACAGCAC-3’
下游引物(PMH_0303048d)：5’-CGCTGCACTGTGAAGCTCTCAC-3’。
本发明所提供的芯片还可包括更多的对照。例如，当样品是核酸样品时，芯片上可以包括杂交反应的阳性对照。其杂交反应的阳性对照可以是包含探针所对应目标位点的任意核酸。由阳性对照位点产生的阳性信号将显示出杂交反应是成功的。在这点上，杂交反应的阳性对照不同于来源于对照样品的核酸片段。因为，来源于对照样品的核酸片段典型地相关于来源于样品的核酸片段，而杂交反应的阳性对照可以是任意不相关的分子，只要其能够被探针识别即可。芯片还可以包括空白对照，如空白缓冲液等，以及针对于固定步骤的质量对照，如将一种经标记的寡核苷酸探针固定于芯片表面，此探针信号可以作为固定质量的指示器。
本发明的生物芯片可以是目前所知的任一种生物芯片，其形式包括膜生物芯片(如硝化纤维膜，尼龙膜)、过滤器生物芯片、针生物芯片和微珠生物芯片(如在一液体的浆状物中)等。本质上而言，能够经受特定表达分析试验所需的试剂及反应条件的任意固相支持物都可以被采用。例如，职能化玻璃、硅、二氧化硅、修饰硅、玻璃、石英玻璃、塑料、陶瓷、橡胶、金属、任意种类聚合体，如(聚)四氟乙烯、偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、或其中的联合体都可以作为固相芯片的基质。
可采用目前已知的多种方法将样品及对照样品固定于芯片表面，如可利用化学反应基团或者生物分子将前述的核酸片段固定于芯片基质表面。所述化学反应基团，如-CHO、-NH2、-SH、-S-S-、环氧基和甲苯磺酰基等；生物分子如生物素、链霉亲和素、亲和素、his-tag、strept-tag、组氨酸以及蛋白A等。较为典型的方法是，将核酸样品与二甲基亚砜等量混合并放入多孔微量滴定板中，滴定板可放置于Gen III芯片点样仪中并在表面硅烷化的光学玻璃基片上点样，然后将基片空气干燥，再经紫外线照射即可。用此方法制备的芯片可以立即使用，也可干燥储存待用。
本发明的另一个目的是提供一种应用上述基因分型芯片对多个样品的基因多态性位点进行基因型检测的方法。
本发明所提供的检测方法，可包括以下步骤：
1)制备探针，所述探针至少能够检测一个参考样品多态性位点的已知基因型；
2)将一条经标记的探针与上述基因分型芯片杂交；
3)将每个待测样品的杂交信号与至少一个参考样品的杂交信号进行比较，确定每个待测样品在某个多态性位点的基因型。
在上述检测方法中，通过将待测样品的杂交信号与参考样品的杂交信号进行比较确定每个样品多态性位点某种基因型的存在与否。例如，如果探针能检测出已知基因型的参考样品的核酸片段，同时又检测出一个待测样品的核酸片段，那么就可以确定待测样品与参考样品具有同样的基因型。来源于每个待测样品的核酸片段的杂交信号与至少一个参考样品核酸片段的检测信号相比较，通过总体的比较结果确定样品的基因型。
所述探针可以是能够检测多态性位点基因型的任何分子。这些探针可包括能够识别多态性位点的人工合成寡核苷酸、cDNA、RNA、PNA、蛋白或抗体。通常情况下，待测样品为核酸时，所述探针可为一段单链核酸，包含有互补于具有特定基因型的多态性位点的序列。探针长度可以是适于检测的任意长度，例如当探针是核酸时，其长度可为10-100bp。
探针被能够产生可检测信号的可检测基团以直接或间接的方式标记。信号在检测前也可以用现有已知方法进行放大。可检测信号的出现显示出样品中相应靶标的存在。对探针进行标记的方式是多种多样的，如放射标记、化学标记、酶学标记、发光标记、胶体金标记加银染放大、磁珠标记、荧光共振能量转移标记等。杂交信号在检测前也可以进行进一步的放大。检测方法为现有已知方法，例如，芯片可以被芯片扫描仪扫描，如被博奥生物公司的LuxScan 10K芯片扫描仪扫描。
当进行不同基因型的检测时，多个探针(如2、3、4、5、6、7、8、9或10个等)可与芯片同时作用(如在几分钟内)，此时，不同的探针可以被不同的检测基团直接或间接地标记，从而实现同时检测；此外，多个探针还可与芯片作用于不同时间(如几分钟、几天、几周、几月的时间间隔)，芯片可以被重复利用数次，即先以一个或一组特定的探针检测靶标，经清洗、裸露、干燥后，再以另外一个或一组探针检测靶标。
上述检测方法可用于检测单核苷酸多态性(“SNP”)。HLA-B座位一个多态性位点的基因序列如图7所示，其中一个单核苷酸序列差异可用上述方法检测出来。这些序列也可用作探针以检测其它多态性位点。
本发明提供了一种基因分型芯片。可用本发明的芯片对多个未知样品的基因多态性位点进行简单、精确的基因分型。该芯片制备方法简便，具有工业化生产的可行性。本发明将在未知样品的基因多态性位点的基因分型中发挥重要作用。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
附图说明
图1为玻璃基片上HLA样品(图中未标记)、HLA标准品(S1-S52)、QC(Hex)、PC和BC的排布样式
图2为根据探针序列和HLA标准品的基因型得出的理论杂交图谱
图3为真实的杂交图谱
图4为不对称PCR的反应原理图
图5A为对称PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果
图5B为不对称PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果
图5C为套式PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果
图6为三种不同PCR反应产物的杂交信号柱形图
图7为HLA-B座位一个多态性位点的基因序列
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物及核酸序列均由上海博亚生物技术公司合成。
实施例1、对多个HLA样品进行基因分型的芯片的制备及其检测
用酚-氯仿的方法从血样抽提，得到85份待测DNA样品。52份标准HLA样品是从国际分型组织(也称国际组织相容性工作组，IHWG)得到的，所述标准HLA样品如表1所示：
                                                        表1标准HLA样品
国际分型组织SSOP质控板 HLA等位基因
  Ref.Cell No. WS No. Designation Con-sang？ HLA-A HLA-B HLA-C HLA-DRB1
  S1   9215   M7   N   0202；03011   3501；5301   0401   03011；0701
  S2   9273   LADA   N   02011；8001   0702；5703   0702；0802   09012；1201
  S3   9263   G085   N   0101；2901   4006；52011   12022；1502   1404；15021
  S4   9373   FH1   N   0205；6802   1402；5801   0701；0802   1302；0102
  S5   9030   JHAF   Y   31012   51011   1502   0407
  S6   9035   JBush   Y   3201   3801   1203   1101
  S7   9045   TUBO   N   0216；03011   51011   0704；1502   1201；1104
  S8   9220   XLI-ND   N   0210；3001   1302；4006   0602；0801   0701；09012
  S9   9077   T7527   N   0207；02011   4601   0102   09012；12021
  S10   9085   EJ32B   N   3002   1801   0501   03011
  S11   9103   KT14   N   2402；2602   4006；51011   0801；1402   09012
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  S13   9375   FH3   N   3301；31011   1402；3502   04011；0802   11011；11041
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  S15   9371   ISH4   N   0218；1101   1501；4601   0102；04011   0406；08032
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  S17   9367   LCK   N   0203；1102   38021；4601   0702；1202   0901
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  S19   9048   LBUF   Y   3001   1302   0602   07011
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  S22   9253   THAI742   N   2403；3303   1512；4601   0102；03031   0406；12021
  S23   9369   ISH3   N   2402   1526N   04011   0406
S24 9380 FH6 N 2402；2901 2702；0705/6 02022；1505 1001；1601
  S25   9376   FH4   N   01011   2703；2705   02022   07011；11012
  S26   9266   PAR   N   11011；2402   2706；4801   03041；0801   15021；11011
  S27   9377   FH5   N   2902；02011   2709；44031   0102；1601   14011；07011
  S28   9068   BM9   Y   02011   3501   0401   0801
  S29   9056   KOSE   N   02011   3503   12031   1302；1401
  S30   9009   KAS011   N   0101   3701   0602   1601
  S31   9381   FH7   N   0206；3002   3908；1801   0702；0501   0315；04071
  S32   9385   FH11   N   03011；2902   4404；07021   0702；1601   0101；1101
  S33   9047   PLH   Y   03011   4701   0602   0701
  S34   9392   GN00218   N   03011；29029   4703；5802   0602；07011/12   07011；08041
  S35   9040   BM15   Y   0101   4901   0701   1102
  S36   9092   BM92   Y   2501   51011   0102   0404
  S37   9370   230699   N   0206；2402   5103；07021   0702；1402   0101；04051
  S38   9372   ISH5   N   2402   5401；4801   0803；0102   0901；1405
  S39   9052   DBB   Y   02011   5701   0602   0701
  S40   9067   LE023   N   6601；3201   7301；51011   0102；15051   1301；1302
  S41   9382   FH8   N   11011；3402   8201；27052   0102；0302   07011；1503
  S42   9366   Daudi   N   0102；6601   5801；5802   0302；0602   1301；1302
  S43   9014   MGAR   Unk   2601   0801   0701   1501
  S44   9053   HOR   N   3303   44031   1403   1302
  S45   9021   RSH   N   3001；6802   4201   1701   03021
  S46   9024   KT17   N   0206；1101   15011；3501   0303；0401   0406
  S47   9016   RML   Y   0204   51011   1502   1602
  S48   9297   HAG   Y   02011   4102   1701   1303
  S49   9386   FH12   N   02011；1101   4402；27052   0501；02022   1201；0404
  S50   9387   FH13   N   3402；6802   44031；1510   0401；03042   1503；0301
  S51   9398   FH18   N   7401；3601   5301；5703   0401；0701   0804；1303
S52 9415 FH34 N 3401 1521；1532/35 0702/3/10；0403 0405；0803
用于扩增含有HLA-A位点的目的基因片段的引物序列如下：
HLA-AF(上游引物)：5’-GGCCTCCCCAGACGCCGAGGATGGC-3’
HLA-AR(下游引物)：5’-CGGGTCCCGTGGCCCCTGGTACCC-3’。
然后，分别以待测样品和标准HLA样品为模板，在上述引物的引导下，进行常规不对称PCR扩增。反应结束后，回收并纯化PCR扩增产物，将其固定在表面硅烷化的光学玻璃基片上。此外，点在玻璃基片上的核酸片段还有用于对固定化过程进行质量控制的质控探针(QC)，其序列为：5’-TTTTTTTTTTTGTCTTCCACCAGGAGTCAGCAG-3’(HEX)，用于对杂交过程进行质控的阳性质控探针(PC)，其序列为：
5’-TTTTTTTTTTAAAGTTAAAGCAGACCGAAGTGGATTGCGAGTATTTGAAAAGATGTGTTGAGAAATTAACGGAAGAGAA-3’，空白阴性对照(BC)，其成分是50％DMSO。玻璃基片上HLA样品(图中未标记)、HLA标准品(S1-S52)、QC(Hex)、PC和BC的排布样式如图1所示。
将一条oligo探针(浓度20nM)和上述制备的芯片进行杂交，探针序列为(A07601)：5’-CCGAGCGAACCTGGGGACC-3’，根据探针序列和HLA标准品的基因型得出的理论杂交图谱如图2所示，真实的杂交图谱如图3所示，所有QC、PC、BC和HLA标准品的真实杂交图谱都和理论预期的完全一致。另外，在未知样品中有些样品显示出了阳性信号，表明它们和显示阳性信号的标准HLA样品含有相同的一段基因序列，基因型相同。
实施例2、对多个HLA样品的HLA-DRB1位点进行基因分型的芯片的制备及检测不同PCR方法对检测结果的影响
本实施例主要检测对称PCR、不对称PCR和套式PCR三种不同的PCR方法对本发明芯片检测结果的影响。所用标准HLA样品购自国际分型组织(IHWG)。分别用对称PCR、不对称PCR和套式PCR扩增标准HLA样品的含有HLA-DRB1位点的核酸片段，三种PCR所用的引物序列如下：
对称PCR引物：
PMH-DF(上游引物)：5’-GATCCTTCGTGTCCCCACAGCAC-3’
PMH-DR(下游引物)：5’-CGCTGCACTGTGAAGCTCTCAC-3’；
不对称PCR引物：
PMH_0303047a(上游引物)：5’-GATCCTTCGTGTCCCCACAGCAC-3’
PMH_0303048d(下游引物)：5’-CGCTGCACTGTGAAGCTCTCAC-3’；
套式PCR(NP-PCR)引物：
PMH-HLA-DF(上游引物)：5’-CCGGATCCTTCGTGTCCCCACAGCACG-3’
PMH-HLA-DRU(下游引物)：5’-TCACTTGCTTCCGTTGAGGCCGCTGCACTGTGAAGCTCT-3’；
通用引物：
PMH-HLA-U1：5’-TCACTTGCTTCCGTTGAGG-3’。
以标准HLA样品为模板，并分别在上述不同引物对的引导下，进行PCR扩增。对称PCR反应体系为(100μl)：10×PCR缓冲液10μl，2.5mM dNTP 8μl，10μM上、下游引物各4μl，5U/μl Taq 1μl，模板DNA 1μl，ddH2O 72μl。对称PCR反应条件为：先96℃3分钟，96℃25秒，66℃30秒，72℃30秒，共30个循环；然后72℃5分钟；最后4℃保温。不对称PCR反应体系为(100μl)：10×PCR缓冲液10μl，2.5mM dNTP 8μl，50μM上游引物4μl，1μM下游引物16μl，5U/μl Taq 1μl，模板DNA 1μl，ddH2O 60μl。不对称PCR反应条件为：先96℃3分钟，96℃25秒，66℃30秒，72℃30秒，共40个循环；然后72℃5分钟；最后4℃保温。套式PCR反应体系为(100μl)：10×PCR缓冲液10μl，2.5mM dNTP 8μl，10μM上、下游引物各3μl，50μM通用引物2μl，5U/μl Taq 1μl，模板DNA 1μl，ddH2O 72μl。套式PCR反应条件为：先96℃3分钟，96℃25秒，66℃30秒，72℃30秒，共25个循环；然后96℃25秒，50℃30秒，72℃30秒，共15个循环；最后72℃5分钟，4℃保温。不对称PCR的反应原理图如图4所示，在不对称PCR反应的前20-25个循环中，上、下游引物(引物A和引物B)产生双链DNA。单链DNA一般在25个循环后的反应中产生，此时限制性的引物B已经基本消耗完毕，体系中只剩下引物A，使得单链DNA(ssDNA)呈线性快速积累。本实施例不对称PCR反应中的上、下游引物比例是200pmol∶16pmol，经过35-40个循环有2-6pmol的单链DNA产物产生。反应结束后，回收三种PCR反应的扩增产物，并用PCR产物纯化试剂盒(编号03010，Millipore，马萨诸塞州)进行纯化，对纯化产物进行的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图5A-图5C所示(泳道M表示DL2000 DNA marker(Takara，Bio Inc Dalian，China)；图5A和图5C中的泳道N表示空白对照；图5A中的泳道Sym表示对称PCR扩增产物；图5B中的泳道4-1，4-2，4-3，4-4表示不对称扩增的四次重复，泳道4-N表示空白对照；图5C中的泳道Tao-1和Tao-2表示套式PCR扩增的两次重复)，检测结果表明不对称PCR能显著提高PCR产物中的单链分子的量。将纯化的三种PCR产物溶解于50％DMSO中，然后将其固定在氨基修饰的玻片(AminoSlideTM，博奥公司，北京)表面，每种PCR产物分别按100ng/ul、150ng/ul和200ng/ul的浓度进行固定，固定化是通过紫外交联仪(Bio-Rad)进行的。然后将一条探针(浓度50nM)和上述制备的芯片进行杂交，探针序列如下：
通用探针Cy5：5’-CGACAGCGACGTGGGGGA-3’；
特异性探针TAMRA：5’-AGaGGAGGCGGGCCGCCGAGG-3’
探针在与基因芯片杂交前用荧光素TAMRA和Cy5进行标记(由上海博亚生物技术公司合成)，杂交后的芯片经过洗涤后用芯片扫描仪(GSI Lumonics)进行检测，检测结果如图6所示(每一种PCR反应柱形图中的3条柱分别代表固定在芯片上的三种不同浓度的PCR产物，分别为100ng/ul、150ng/ul和200ng/ul)，表明不对称PCR产物的杂交信号显著高于传统PCR和套式PCR方法得到的PCR产物，故将不对称PCR定为制备本发明芯片时优选的核酸片段的扩增方式。
                               序列表
<160>2
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
gatccttcgt gtccccacag cac                                              23
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
cgctgcactg tgaagctctc ac                                               22

Claims (31)

1、一种基因分型芯片，包括一套来自待测样品的核酸片段及另一套来自多个参考样品的核酸片段；所述核酸片段均是在完全相同的条件下，分别扩增待测样品与参考样品中含有多态性位点的基因片段得到的；核酸片段固定于芯片表面，且每个参考样品都含有一个已知基因型的多态性位点。
2、根据权利要求1所述的基因分型芯片，其特征在于：所述参考样品为双链或单链核酸。
3、根据权利要求1所述的基因分型芯片，其特征在于：所述参考样品中至少有一个是自然存在的样品。
4、根据权利要求1所述的基因分型芯片，其特征在于：所述参考样品中至少有一个是自然存在样品的人工修饰产物。
5、根据权利要求1所述的基因分型芯片，其特征在于：所述另一套来自多个参考样品的核酸片段至少来自于10个参考样品。
6、根据权利要求5所述的基因分型芯片，其特征在于：所述另一套来自多个参考样品的核酸片段至少来自于30个参考样品。
7、根据权利要求6所述的基因分型芯片，其特征在于：所述另一套来自多个参考样品的核酸片段至少来自于50个参考样品。
8、根据权利要求1所述的基因分型芯片，其特征在于：所述来自待测样品的核酸片段及另一套来自多个参考样品的核酸片段均为包含某个HLA基因的多态性位点的核酸片段。
9、根据权利要求8所述的基因分型芯片，其特征在于：所述HLA基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB、HLA-DQB、HLA-DQA、HLA-DPB和HLA-DPA。
10、根据权利要求8或9所述的基因分型芯片，其特征在于：所述参考样品为HLA的标准样品。
11、根据权利要求1所述的基因分型芯片，其特征在于：所述来自多个参考样品的核酸片段中至少有两个来自于同一个参考样品。
12、根据权利要求1所述的基因分型芯片，其特征在于：所述基因分型芯片中的核酸片段是用不对称PCR方法扩增的。
13、一种权利要求1所述的基因分型芯片的制备方法，包括以下步骤：
1)用PCR方法扩增待测样品和参考样品中含有多态性位点的特定区域，得到一套核酸片段；
2)将步骤1)获得的核酸片段固定在微阵列基片上，得到基因分型芯片。
14、根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于：所述固定在微阵列基片上的核酸片段还包括一个或多个来自杂交反应阳性对照、杂交反应阴性对照和固定化质控对照的核酸片段。
15、根据权利要求13或14所述的制备方法，其特征在于：所述核酸片段是用不对称PCR方法扩增得到的。
16、根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于：所述不对称PCR扩增所用的上游引物及下游引物的摩尔比率为1∶12.5-100。
17、根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于：所述不对称PCR扩增所用的上游引物及下游引物的摩尔比率为1∶12.5。
18、根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于：所述不对称PCR扩增的循环数为30-40个。
19、根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于：所述来自待测样品的核酸片段及来自多个参考样品的核酸片段为包含某个HLA基因的多态性位点的核酸片段。
20、根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于：所述HLA基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB、HLA-DQB、HLA-DQA、HLA-DPB和HLA-DPA。
21、根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于：所述HLA基因为HLA-A基因。
22、根据权利要求21所述的制备方法，其特征在于：所述用于扩增待测样品和参考样品包含HLA-A基因的多态性位点的核酸片段的引物为序列表中的SEQ ID №：1和SEQ ID №：2。
23、一种用权利要求1所述的基因分型芯片对多个样品的基因多态性位点进行基因型检测的方法，包括以下步骤：
1)制备探针，所述探针至少能够检测一个参考样品多态性位点的已知基因型；
2)将一条经标记的探针与上述基因分型芯片杂交；
3)将每个待测样品的杂交信号与至少一个参考样品的杂交信号进行比较，确定每个待测样品在某个多态性位点的基因型。
24、根据权利要求23所述的检测方法，其特征在于：所述探针的数目至少为2个。
25、根据权利要求24所述的检测方法，其特征在于：所述多个探针同时和芯片进行杂交。
26、根据权利要求24所述的检测方法，其特征在于：所述多个探针先后连续地和芯片进行杂交。
27、根据权利要求23所述的检测方法，其特征在于：所述探针为单链核酸。
28、根据权利要求23所述的检测方法，其特征在于：所述探针是用不对称PCR方法扩增得到的。
29、根据权利要求28所述的检测方法，其特征在于：所述不对称PCR扩增所用的上游引物及下游引物的摩尔比率为1∶12.5-100。
30、根据权利要求29所述的检测方法，其特征在于：所述不对称PCR扩增所用的上游引物及下游引物的摩尔比率为1∶12.5。
31、根据权利要求28或29或30所述的检测方法，其特征在于：所述不对称PCR扩增的循环数为30-40个。
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