KR101953176B1 - 미처리 혈액을 사용한 ｐｃｒ 및 ｈｌａ 타이핑 방법 - Google Patents

미처리 혈액을 사용한 ｐｃｒ 및 ｈｌａ 타이핑 방법 Download PDF

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Abstract

본원에는 탄뎀 PCR 공정을 사용하여 목적 유전자 또는 RNA 또는 이의 세트를 증폭시키는 방법이 제공되어 있다. 제1 PCR 또는 PCR 반응의 세트에서 프라이머는 유전자자리-특이적이다. 제2 PCR 또는 PCR 반응의 세트에서 프라이머는 유전자자리-특이적인 프라이머의 서브-서열에 대해 특이적이며 제2 PCR 증폭 동안에 완전히 소모된다. RNA 증폭의 경우, 제1 PCR은 역전사이고, 수득되는 cDNA(들)은 cRNA 합성, 종점(endpoint) PCR 또는 실시간 PCR에 대한 주형을 제공한다. 또한, 샘플을 포함하는 DNA 또는 RNA에서 탄뎀 PCR을 사용하여 유전자(들)을 증폭시키고, 수득되는 앰플리콘 또는 이의 세트를 유전자-관련된 대립유전자 변이의 서열을 지닌 프로브에 대해 하이브리드화함으로써 유전자 또는 이의 세트를 대립유전자타이핑하는 방법이 제공된다. 하이브리드화를 나타내는 검출가능한 시그날은 유전자의 대립유전자형 또는 유전자 세트에 대한 대립유전자형의 세트에 상응한다.

Description

미처리 혈액을 사용한 ＰＣＲ 및 ＨＬＡ 타이핑 방법{METHODS FOR PCR AND HLA TYPING USING RAW BLOOD}
관련 출원의 전후 참조
본 국제 특허출원은 2009년 11월 16일자로 출원된 미국 가특허출원 번호 제61/281,404호의 §119(e)하의 우선권의 이익을 주장하는, 2010년 9월 24일자로 출원된, 계류중인 미국 비가특허출원 번호 제12/924,301호의 35 U.S.C. 120하에서의 우선권의 이익을 주장하며, 이들 둘다의 전문은 본원에 참조로 인용된다.
발명의 배경
발명의 분야
본 발명은 PCR 및 HLA-타이핑(typing)의 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 현장 또는 진료소 환경에서 개인 또는 집단 규모로 미처리된 생물학적 시료내 DNA 또는 RNA를 증폭시키기 위한 탄뎀(tandem) PCR 공정 및 이의 후속적인 HLA-타이핑을 위한 방법 및 시스템을 기술한다.
관련 기술의 설명
현재의 의약에서 HLA 타이핑의 의학적 중요성에 대한 새롭고 신속한 이해가 증가하고 있다. 예로서 표 1은 HLA-타이핑을 위한 매우 광범위한 진단학적 및 공중보건 적용을 입증한다.
[표 1]
Figure 112012048260063-pct00001
Figure 112012048260063-pct00002
Figure 112012048260063-pct00003
그러나, 현재, HLA 타이핑은 문자 그대로 전체 분자 유전학 실험실의 노력을 필요로 하고 있다. 도입되는 혈액 시료는 우선 스핀 컬럼 또는 자기 비드(magnetic bead)와 같은 방법에 이어 피코 그린 형광측정법(PicoGreen fluorimetry) 또는 UV 흡광도와 같은 정제된 DNA의 정량화와 같은 방법에 의해 정제되어야만 한다. 정량화된 DNA는 이후에 PCR 증폭에 적용되며, PCR 후에, 대량처리(high throught) 재-서열 분석에 의해, 또는 보다 최근에는, 비드 또는 마이크로어레이에 의한 다중 하이브리드화 분석(multiplex hybridization analysis)에 의해 분석된다. 따라서, 수득되는 작업흐름(workflow)은 완전한 분자 유전학 실험실의 노력, 및 최종 HLA-타이핑 데이타를 편집하기 위해 적어도 완전한 1일을 필요로 한다. 이러한 표준 작업흐름의 복잡성은 또한 몇가지 가공 및 분석 작업장소(workstation)를 통한 샘플 유동의 궤도를 유지하기 위한 관리 연속성(chain-of-custody) 및 복잡하고 비용이 많이드는 LIMS 시스템에 대한 요구 및 작업흐름 표준 작동 과정과 관련하여 주요하게 관심을 기울여야 한다.
공정을 간소화하기 위한 노력은 DNA 정제를 배제함을 포함한다. 정제되지 않은 혈액으로부터 PCR 증폭을 수행하기 위한 종전의 시도들은 표준 PCR에 사용된 태크(Taq) 폴리머라제의 변이체의 이용성에서도 문제가 있어 왔다. PCR 기질로서 미처리 혈액의 사용은 근본적인 PCR 반응을 방해할 수 있는 매우 과량의 혈액 용질 중 가능한 샘플-대-샘플 변이 및 혈액의 백혈구 보충에 있어서 극도의 샘플-대-샘플 변이로 인하여 일관된 결과를 수득하지 않아 왔다.
따라서, 당해 분야에는 유전자 증폭 및 HLA 타이핑을 위한 적은 장비 및 소비재 비용성, 대량처리 방법(high-throughput)에 대한 인식된 요구가 존재한다. 구체적으로, 본 발명은 샘플로부터 DNA를 우선 외부적으로 정제할 필요없이 HLA 타이핑의 핸드프리(hand-free) 또는 자동화, 실시간 고-해상도 방법에서는 단점이 있다. 본 발명은 당해 분야의 이러한 오래된 요구 및 바람을 충족시킨다.
발명의 요약
본 발명은 목적 DNA의 증폭 방법에 관한 것이다. 본 방법은 DNA를 포함하는 미처리 샘플을 수득하는 단계, 미처리 샘플에서 제1 PCR을 수행하여 제1 앰플리콘(amplicon)을 생산하는 단계 및 제1 앰플리콘을 희석시키는 단계를 포함한다. 제2 PCR은, 제2 PCR 반응에 사용된 모든 프라이머(primer)가 소모되어 제2 앰플리콘을 생산할 때까지 미처리 샘플상에서 수행됨으로써, 도입 샘플 DNA를, 원래의 샘플을 포함하는 DNA의 양 또는 순도와는 독립된 제2 PCR 반응에서 프라이머 농도에 의해 제한되는 최종의 증폭된 DNA 생성물 농도로 증폭시킨다.
본 발명은, 미처리 샘플에서 제1 PCR을 유전자 표적의 세트에 대하여 동시에 수행하여 제1 앰플리콘 세트를 생산하고 제 1 앰플리콘 세트를 희석시키는 관련된 발명에 관한 것이다. 제2 PCR은, 모든 제2 PCR 프라이머가 소비되어 제2 앰플리콘 세트를 생산할 때까지 제2 PCR 반응에 대한 주형(template)의 세트로서 최초의 앰플리콘 생성물의 전체 세트를 사용하여 제1 세트를 수행함으로써 DNA를 증폭시킨다.
본 발명은 하나 이상의 형광단을 사용하여 제2 PCR 프라이머 쌍을 표지시키는 단계를 추가로 포함하는 또 다른 관련된 방법에 관한 것이다.
본 발명은, DNA가 하나 이상의 목적 유전자를 포함하는 또 다른 관련된 방법에 관한 것이며, 본 방법은 또한 목적 유전자와 관련된 대립유전자 변이의 서열을 갖는 프로브(probe)에 대해 제2 앰플리콘을 하이브리드화시키는 단계, 하이브리드화된 앰플리콘으로부터 형광성 패턴을 검출하는 단계 및 형광성 패턴을 기준으로 하여 대립유전자형을 지정하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 이의 분석을 위해 제2 앰플리콘을 서열분석하는 단계를 추가로 포함하는 여전히 또 다른 관련된 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 목적 RNA를 증폭시키는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 개인로부터 미처리 생물학적 샘플을 수득하는 단계, 미처리 생물학적 샘플에서 제1 역전사 PCR을 수행하여 제1 cDNA 앰플리콘(들)을 생산하는 단계 및 제1 앰플리콘(들)을 희석시키는 단계 및 모든 프라이머가 소비되어 제2 앰플리콘(들)이 생산될 때까지 제2 PCR을 수행함으로써 목적 RNA(들)을 증폭시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 하나 이상의 형광단을 사용하여 제2 PCR 프라이머 쌍을 표지시키는 단계를 추가로 포함하는 관련된 방법에 관한 것이다.
본 발명은 유전자 서열내 목적 부위에 대해 상보성인 서열을 갖는 프로브에 대해 제2 앰플리콘(들)을 하이브리드화하는 단계, 하이브리드화된 앰플리콘으로부터 형광성 패턴을 검출하는 단계 및 형광성 패턴을 기준으로 하여 하나 이상의 유전자(들) 또는 대립유전자형(들)을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 또 다른 관련된 방법에 관한 것이다. 본 발명은 이의 분석을 위해 제2 앰플리콘을 서열분석하는 단계를 추가로 포함하는 또 다른 관련된 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 목적 유전자를 대립유전자타이핑(allelotyping) 시키기 위한 방법에 관한 것이다. 본 방법은 한명 이상의 개인으로부터 미처리 생물학적 샘플을 수득하는 단계, 유전자 자리 또는 유전자 자리의 정의된 세트에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 미처리 생물학적 샘플에서 제1 PCR을 수행함으로써 제1 앰플리콘 또는 앰플리콘의 세트를 생산하는 단계 및 이후에 제1 앰플리콘 또는 제 1 앰플리콘 세트를 희석시키는 단계 및 모든 프라이머가 소비되어 제2 PCR 반응으로부터 앰플리콘 세트가 생산될 때까지 유전자 자리내 엑손 또는 엑손의 세트에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 제2 PCR 반응에 대한 주형으로서 제공되는 이들 앰플리콘을 사용한 제2 PCR을 수행하는 단계를 포함한다. 제2 앰플리콘 세트는 목적 유전자 또는 유전자 세트와 관련된 대립유전자 변이의 서열을 갖는 프로브에 대해 하이브리드화되고, 시그날은 하이브리드화된 앰플리콘 세트로부터 검출되며 대립유전자형(들)은 검출된 하이브리드화 시그날을 기준으로 하여 지정된다.
다른 및 추가의 목적, 특징 및 장점은 설명 목적으로 제공되는, 본 발명의 바람직한 실시양태에 관한 다음 설명으로부터 명백해질 것이다.
[도면의 간단한 설명]
상기 인용한 본 발명의 특징, 장점 및 목적은 물론 명백해질 기타의 것들이 얻어지고 상세히 이해될 수 있는 사항, 위에서 간략하게 요약한 본 발명의 보다 특별한 설명 및 특정 실시양태는 첨부되는 도면에 예시되어 있다. 이들 도면은 본 명세서의 일부를 구성한다. 그러나, 첨부된 도면은 본 발명의 바람직한 실시양태를 나열하는 것이므로 본 발명의 영역을 한정하는 것으로 고려되어서는 안된다는 것에 주목하여야 한다.
도 1a-1b는 10ng의 정제된 DNA로 개시하여, 최종 제2의 PCR 앰플리콘 생성물의 양이 제2 PCR 증폭을 위한 주형으로서 사용된 최초의 PCR 앰플리콘 농도의 범위에 걸쳐 일정함을 나타내는 겔이다.: HLA-A 엑손 세트 2 또는 3 및 HLA-DRB1 엑손 2 (도 1a) 및 HLA-B 엑손 세트 2 또는 3(도 1b).
도 2a-2b는 2μl의 전체 유체 혈액(도 2a) 또는 10ng의 정제된 사람 게놈 DNA(도 2b)로부터 생성된 최초의 및 제2 HLA-A, HLA-B 및 DRB1 PCR 앰플리콘을 나타내는 겔이다. 2% 아가로즈 SFR 겔 전기영동[암레스코(Amresco) 1x TBE 겔] 상에서 분해하였다. #1: HLA-A 유전자자리 특이적인 최초의 PCR 생성물(대략 1,000bp); #2: HLA-A 엑손 2 제2 PCR 생성물(대략 300bp); #3: HLA-A 엑손 3 제2 PCR 생성물(대략 320bp); #4: HLA-B 유전자자리 특이적인 최초의 PCR 생성물(대략 1,000bp); #5: HLA-B 엑손 제2 PCR 생성물(대략 320bp); #6: HLA-B 엑손 3 최초의 PCR 생성물(대략 310bp); #7: DRB1 유전자자리 특이적인 최초의 PCR 생성물(대략 650bp); #8: DRB1 엑손 2 제2 PCR 생성물(대략 310bp); L: 바이오-라드(Bio-Rad) EZ 로드 래더(Load ladder).
도 3a 내지 3c는 HLA-A(도 3a), HLA-B (도 3b), 및 HLA-DRB1(도 3c)에 대한 12개의 정제되지 않은 전혈 주형으로부터 생성된 유전자자리 특이적인 최초의 PCR 생성물을 나타내는 겔이다.
도 4a 내지 4c는 도 3에 나타낸 최초의 PCR 반응 생성물에서 수행된 엑손 특이적인 제2 PCR 반응을 나타내는 겔이다: HLA-A 엑손 세트 2 및 3에 대해 특이적인 PCR 프라이머의 세트를 사용하고, 다중 PCR 생성물로서 동시 수행되고(도 4a), HLA-B 엑손 2 및 3에 대해 특이적인 PCR 프라이머의 세트를 사용하여 다중 PCR 생성물로서 동시 수행되며(도 4b), 및 HLA-DRB1 엑손 2의 모든 관련된 변이체에 대해 특이적인 PCR 프라이머의 세트를 사용하여 다중 PCR 반응으로서 동시 수행되었다(도 4c). 이들 제2 PCR 반응에 대한 주형은 도 3a 내지 3c에 나타낸 12개의 전혈 샘플로부터 직접 증폭되고, 분자 생물학 등급의 물 속에서 1:100으로 희석된 후 상기 나열한 50μL 제2 PCR 반응물내로 각각 2μL로서 적용된, 유전자자리 특이적인 최초의 PCR 생성물이었다. 음성 대조군을 또한 나타낸다.
도 5a 내지 5i는 실시예 5의 프로토콜에 기술된 바와 같이 재-수화된 3mm의 건조된 혈반(중앙)의 재-수화에 의해 유도된 유액에서 수행된 동일한 반응, 및 동일한 혈액 시료(우측)로부터의 10ng의 정제된 DNA에서 수행된 동일한 반응과 비교하여 1μl의 전체 유액 혈액(좌측)으로부터 생성된 HAL-A, HLA-B 및 DRB1 PCR 최초의 PCR 생성물에 이어 제2 PCR 앰플리콘 세트를 나타내는 겔이다. 도 5d 내지 5f는 익명의 자원자로부터 입수한 이들 8개의 고유의 미처리 혈액 샘플에 대한 HLA-A, HLA-B 및 HLA-DRB1에 대해 특이적인 제1 PCR 반응을 나타내는 반면, 도 5g 내지 5i는 동일한 8명의 미처리 혈액 샘플에 대한 HLA-A, HLA-B 및 HLA-DRB1에 대해 특이적인 제2 PCR 반응을 나타낸다. 알 수 있는 바와 같이, 비록 최초의 PCR 생성물의 수율이 8개의 미처리 혈액 샘플의 세트 중에서 고도로 가변성이라고 해도(도 5d 내지 5f), 후속적인 제2 PCR 반응이 8개의 미처리 혈액 시료의 세트 중에서 수율 및 특이성에 있어 거의 동일한 일련의 증폭된 엑손이 생성되었다(도 5g 내지 5i). 겔을 2% 아가로즈 SFR[암레스코, 1x TBE 겔. L: 바이오-라드 EZ 로드 래더에서 분해하였다. HLA-A 및 HLA-B 둘다의 경우, 겔에서 관찰된 제2 PCR 생성물은 동일한 PCR 반응에서 엑손 2 및 엑손 3의 다중(n=2) 증폭으로부터 기원한, 분해되지 않은 밴드의 쌍이다.
도 6a 내지 6g는 재수화된 볼 면봉으로부터 HLA-타이핑을 위한 PCR 반응을 나타낸다. 확인되지 않은 볼 면봉은 현지 기증자로부터 입수하였다. 4개의 면봉을 구강의 사분면 각각당 20회 상하로 격렬하게 닦아서 각각의 참여자로부터 수집하고 15mL의 원뿔 튜브내에 두었다. 전체 구강 면봉을 12명의 개인으로부터 취하였다: A1 내지 A12. 샘플을 라미나 유동 후드(laminar flow hood)하에 건조시켰다. 이후에, 건조된 면봉을 150μl의 재수화 완충액(100mM 붕산염 + 1mM EDTA) 속에 재수화시키고 70℃에서 2 x 시간 동안 가용화시켰다. 이후에, 수득되는 유액 상을 피펫팅으로 혼합하였다. 이후에, 재수화된 면봉을 분석까지 -20℃에서 저장하였다. 이후에 내포된(탄뎀) PCR 반응을 목적 HLA 유전자자리 각각에 대해 수행하였다. 1μl의 미처리 면봉 용출물을 로슈(Roche) 태크 폴리머라제를 사용하는 최초의 25μL PCR 반응을 위해 사용하였다. 이후에, 후속적인(제2) PCR을 2.5μL의 최초의 앰플리콘 생성물에 대해 50μL의 총 PCR 반응 부피로, 또한 로슈 태크 폴리머라제를 사용하여 수행하였다. 완료시, 잔류 샘플(회수된 부피의 1/2 이하)을 QIAamp DNA 블러드 미니 키트(Blood Mini Kit)[제조원: 퀴아젠(Qiagen), 제품 번호: #51104]를 통해 추출하였다. 수득되는 정제된 DNA를 동일한 마이크로어레이 HLA-타이핑 플랫폼 위에서 수행하였다. 정제되지 않은 및 정제된 볼 DNA를 HLA 타이핑을 위해 마이크로어레이 기술을 통해 분석하였다. 볼 면봉으로부터 짝을 이룬, 확인되지 않은 DNA를 미처리되고, 정제되지 않은 샘플 상에서 겔 전기영동을 통해 수득한 HLA 유형과 비교하였다. 2.5μL의 수득되는 2°PCR 반응 생성물 각각을 이후에 표준 아가로즈 겔 위에 로딩하였다. 최초의 유전자자리 특이적인 PCR 생성물 및 제2 엑손 특이적인 반응 세트의 생성물(단일의 다중 반응으로서 수행)을 도 6a(좌측)에 샘플로부터 수득된 10ng의 정제된 DNA로부터 수득된 동일한 반응 생성물(우측)과 함께 나타내었다. 밴드를 암레스코 EZ-비젼(Vision) DNA 염료로 가시화하였다. 알 수 있는 바와 같이, 1μL의 미처리 면봉 용출물로부터 수득한 최종 2° 앰플리콘의 양은 특이성 및 질량 수율에 있어서, 동일한 샘플로부터의 10ng의 정제된 DNA로부터 수득한 증폭된 HLA 생성물과 유사하다. 도 6b 내지 6g는 총 12명의 기증자로부터의 미처리 볼 면봉에서 수행된 탄뎀 PCR 반응의 생성물을 나타낸다. 도 6b 내지 6d는 이들 12개의 미처리 볼 면봉 샘플에 대한 HLA-A, HLA-B 및 HLA-DRB1에 대해 특이적인 최초의 PCR 반응을 나타내는 반면, 도 6e 내지 6g는 샘플 12개의 미처리 볼 면봉 샘플에 대한 HLA-A, HLA-B 및 HLA-DRB1에 대해 특이적인 제2 PCR 반응을 나타낸다. 알 수 있는 바와 같이, 비록 최초의 PCR 생성물의 수율이 12개의 미처리되고, 재-수화된 볼 면봉 샘플의 세트 중에서 고도로 가변성이라고 해도(도 6b 내지 6d), 후속적인 제2 PCR 반응은 12개의 미처리 볼 면봉 표본의 세트 중에서 수율 및 특이성에 있어서 거의 동일한 일련의 증폭된 엑손을 생성하였다(도 6e 내지 6g).
도 7a 내지 7f는 다중 HLA 유전자의 동시 탄뎀 PCR 증폭을 나타낸다 : HLA-A 및 HLA-DRB1. 유전자자리-특이적인 다중 및 엑손 특이적인 다중 HLA-PCR 반응을 HLA 제I 부류에 대해 UCLA 면역학 참조 패널로부터 검색된 5개의 샘플의 세트에서 수행하였다. 도 7a는 최초의 HLA-PCR의 도해이며, 여기서, 유전자 HLA-A 및 HLA-DRB1에 대해 유전자자리-특이적인 프라이머를 최초의 PCR을 다중화하는데 사용하였다. 1:100 희석을 유전자자리-특이적인 PCR의 생성물에서 수행하고 2_1의 희석물을 HLA-A 엑손 2 및 3과 HLA-DRB1 엑손 2에 대해 표적화하는 제2의 내포된(nested) PCR의 세트에서 사용하였다. 제1의 내포된 제2 PCR 반응은 HLA-A 엑손 2 및 3만을 증폭시켰다. 제2 PCR 반응은, HLA-DRB1 엑손 2만이 증폭되는 최초의 다중 PCR의 생성물에서 독립적으로 수행하였다. 제3의 독립된 제2 PCR 반응은 최초의 다중 반응으로부터의 언급된 주형을 사용하였으며 HLA-A의 경우 엑손 2 및 3을 및 HLA-DRB1의 경우 엑손 2를 다중 양식으로 증폭시켰다. 도 7b는 HLA-A 및 HLA-DRB1에 대해 특이적인 최초의 PCR 반응을 나타내며 여기서 2개의 유전자는 10ng의 사람 게놈 정제된 DNA의 5개 샘플에 대해 동시 증폭되었다. 2개의 상이한 크기의 밴드를 1000bp에서 HLA-A 및 대략 650bp에서 HLA-DRB1에 상응하는 겔에서 분해한다. 도 7c 내지 7e는, HLA-A 및 HLA-DRB1의 제1 다중 PCR이 일어난 후 수행된 제2 다중 반응을 나타낸다. 도 7c는 HLA-A 엑손 2 및 3에 대해 엑손-특이적인 HLA-PCR을 나타낸다. 도 7d는 HLA-DRB1 엑손 2에 대해 엑손-특이적인 HLA-PCR을 나타낸다. 최종적으로, 도 7e는 동일한 엑손 특이적인 HLA-PCR에서 HLA-A 엑손 2 및 3과, HLA-DRB1 엑손 2의 동시 증폭을 나타낸다. 당해 밴드는 앰플리콘 크기의 유사성으로 인하여 겔 내에서 차별화될 수 없다. HLA-A 엑손 2 및 3에 대한 단편 크기는 대략 320bp인 반면 HLA-DRB1 엑손 2은 310bp 길이이다. 겔을 2% 아가로즈를 사용하여 분해하고, 암레스코 EZ-비젼 DNA 염료를 사용하여 가시화하였다. 도 7f는 UCLA로 표지된 컬럼에 기재된 바와 같이 공지된 유전형을 지닌 UCLA 면역학 참조패널로부터 선택된 2개의 샘플의 유전형 데이타를 나타낸다. 표에서 녹색은 100% 일치하는 유전형에 상응한다. 청색은 혈청학적 수준에서 GUSA 일치로부터의 유전형 데이타를 나타낸다. 백색 셀은 분석 소프트웨어에서 한계(threshold)의 조절에 적용된 일치하지 않은 유전형 또는 거짓 양성 하이브리드화를 나타낸다.
도 7g 내지 7l은 다중 HLA 유전자의 동시 탄뎀 PCR 증폭을 나타낸다: HLA-A 및 HLA-DRB1. 유전자자리-특이적인 다중 및 엑손 특이적인 다중 HLA-PCR 반응을 HLA 제I 부류에 대해 UCLA 면역학 참조로부터 검색된 5개 샘플의 세트에서 수행하였다. 도 7g는 최초의 HLA-PCR의 도해이며, 여기서 유전자 HLA-B 및 HLA-DRB1에 대한 유전자자리-특이적인 프라이머를 사용하여 최초의 PCR을 다중화하였다. 1:100 희석을 유전자자리-특이적인 PCR의 생성물에서 수행하였으며 2_1의 희석을 HLA-B 엑손 2 및 3과 HLA-DRB1 엑손 2에 대해 표적화하는 제2의 내포된 PCR의 세트에서 사용하였다. 제1의 내포된 제2 PCR 반응은 HLA-B 엑손 2 및 3만을 증폭시켰다. 제2 PCR 반응은 최초의 다중 PCR의 생성물에서 독립적으로 수행하였으며, 여기서 HLA-DRB1 엑손 2만이 증폭되었다. 제3의 독립적인 제2 PCR 반응은 최초의 다중 반응으로부터 언급된 주형을 사용하였으며 다중 양식으로 HLA-B의 경우 엑손 2 및 3을 증폭시키고 HLA-DRB1의 경우 엑손 2를 증폭시켰다. 도 7h는 HLA-B 및 HLA-DRB1에 대해 특이적인 최초의 PCR 반응을 나타내며, 여기서 2개의 유전자가 10ng의 사람 게놈 정제된 DNA의 5개 샘플에 대해 동시 증폭되었다. 2개의 상이한 크기의 밴드를 1000bp에서 HLA-B 및 대략 650bp에서 HLA-DRB1에 상응하는 겔 속에서 분해한다. 도 7i 내지 7k는, HLA-B 및 HLA-DRB1의 최초의 다중 PCR이 일어난 후 수행된 제2의 다중 반응을 나타낸다. 도 7i는 HLA-B 엑손 2 및 3에 대한 엑손-특이적인 HLA-PCR을 나타낸다. 도 7j는 HLA-DRB1 엑손 2에 대한 엑손-특이적인 HLA-PCR을 나타낸다. 최종적으로, 도 7k는 동일한 엑손 특이적인 HLA-PCR에서 HLA-B 엑손 2 및 3과, HLA-DRB1 엑손 2의 동시 증폭을 나타낸다. 밴드는 앰플리콘 크기의 유사성으로 인하여 겔 내에서 차별화될 수 없다. HLA-B 엑손 2 및 3에 대한 단편 크기는 대략 320bp인 반면 HLA-DRB1 엑손 2는 310bp 길이이다. 겔을 2% 아가로즈 겔을 사용하여 분해하고 암레스코 EZ-비젼 DNA 염료를 사용하여 가시화하였다. 도 7l은 UCLA로서 표지된 컬럼에 기재된 바와 같은 공지된 유전형을 지닌 UCLA 면역유전학 참조 패널로부터 선택된 2개의 샘플의 유전형 데이타를 나타낸다. 표에서 녹색은 100% 일치의 유전형에 상응한다. 청색은 혈청학적 수준에서 유전학 USA 일치로부터의 유전형 데이타를 나타낸다. 표에서 백색 셀은 분석 소프트웨어에서 한계의 조절에 적용된 일치되지 않은 유전형 또는 거짓 양성 하이브리드화를 나타낸다.
도 8a 내지 8b는 실시예 5 및 6의 방법을 통해 수득된 미처리 혈액, 건조된 혈반(7a) 및 비처리 볼 면봉 및, 면봉으로부터 정제된 상응하는 DNA(도 7b)에 대한 마이크로어레이 분석을 통해 수득된 HLA-타이핑을 나타내는 표이다. 선택된 항응고제로서 EDTA에서 수집된 7개의 상이한 혈액 샘플의 미처리 혈액, 재-수화된 혈반, 및 정제된 DNA의 분석으로 수득된 유전형 데이타는 승인을 위해 뉴질랜드 혈액원(New Zealand Blood Services)으로부터 제공된 유전형 데이타와 비교하였다. 데이타는 대부분의 예에서 혈청학적 수준에서의 결과와 나머지 샘플에서 고 분해능 사이의 전체적인 일치를 나타낸다(도 8a). 도 8b는 랩 콥스(Lab Corps)에 의해 제공된 일치하는 정제된 DNA 및 독립된 유전형과 비교하여 조(crude) 볼 샘플 용출물의 유전형 데이타를 나타낸다. 당해 데이타는 국소적으로 수집된 11개 샘플의 높은 일치 수준을 입증한다. 녹색은 유전학 USA 유전형과 랩 콥스 사이의 100% 일치를 입증한다. 청색 무늬 데이타 점들은 혈청학적 수준에서 일치를 나타내는 반면, 백색 데이타 점들은 제3 부분에 의해 제공된 유전형과 일치하지 않음을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본원에 사용된 것으로서, 용어 "하나(a)" 또는 "하나(an)"는 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원의 특허청구범위에 사용된 것으로서, 단어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우, 단어 "a" 또는 "an"은 하나가 아닌 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원에 사용된 것으로서 "또 다른" 또는 "다른"은 적어도 2개 이상의 동일하거나 상이한 청구하는 성분 또는 이의 성분들을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 특허청구의 범위에서 용어 "또는"은, 비록 본 기재내용은 대안 및 "및/또는" 만을 언급하는 정의를 뒷받침하고 있다고해도, 대안을 언급하는 것으로 명백하게 지시되지 않는 한, 또는 대안들이 상호 독점적이지 않는 한, "및/또는"을 말한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "개인" 또는 "집단"은 본원에 기술된 증폭 및 HLA-타이핑 방법에서 사용된 생물학적 시료, 예를 들면, 미처리 혈액의 기증자 또는 잠재적인 기증자를 말한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "미처리 샘플" 또는 "미처리 생물학적 샘플"은, 이것이 건조되는 경우 미처리 샘플을 재수화하는데 요구되는 단계들을 제외하고는, 본원에 기술된 바와 같이 제1 증폭에 사용된 가공되지 않거나 정제되지 않은 샘플을 말한다.
본 발명의 하나의 양태에서, DNA를 포함하는 미처리 샘플을 수득하는 단계; 미처리 샘플에서 제1 PCR을 수행하여 제1 앰플리콘을 생산하는 단계; 제1 앰플리콘을 희석시키는 단계; 및 제2 PCR 반응에 사용된 모든 프라이머가 소비되어 제2 앰플리콘을 생산할 때까지 제2 PCR을 수행함으로써 도입 샘플 DNA를 원래의 샘플을 포함하는 DNA의 양 또는 순도와는 별도의 제2 PCR 반응에서의 프라이머 농도에 의해 제한되는 최종의 증폭된 DNA 생성물 농도로 증폭시키는 단계를 포함하는, 목적 DNA를 증폭시키는 방법이 제공된다.
당해 양태에 대해 추가로, 본 방법은 하나 이상의 형광단을 지닌 제2 PCR 프라이머를 표지시킴을 포함할 수 있다. 형광단의 예는 시아닌 염료이다. 또 다른 추가의 양태에서, 당해 방법은 이의 분석을 위해 제2 앰플리콘을 서열분석하는 단계를 포함할 수 있다. 본 추가의 양태에서, 분석은 하나 이상의 동질성, 개인의 부계(paternity), 법의학 정보, 조직 일치, 질병의 발달에 대한 위험 인자, 또는 의약에 대한 반응을 결정할 수 있다.
모든 양태들의 하나의 국면에서, 본 방법은 미처리 샘플에서 제1 PCR을 유전자 표적의 세트에 대하여 동시에 수행하여 제1 앰플리콘 세트를 생산하는 단계; 제1 앰플리콘 세트를 희석시키는 단계; 및 모든 제2 PCR 프라이머가 소비되어 제2 앰플리콘 세트를 생산할 때까지 제2 PCR 반응에 대한 주형의 세트로서 최초의 앰플리콘 생성물의 전체 세트를 사용하여, 이에 대한 제2 PCR을 수행함으로써 DNA를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 국면에서, 5개 미만의 유전자 표적, 10개 미만의 유전자 표적 또는 20개 미만의 유전자 표적이 동시에 증폭될 수 있다. 또한, 유전자 표적은 HLA-DRB1, DQ-A1 및 DQB1일 수 있고, DQ-A1 및 DQ-B1일 수 있거나 HLA-B 및 KIR일 수 있다. 또한, 유전자 표적은 미토콘드리아 복제 개시점 근처의 2개의 초가변성 영역 및 하나 이상의 추가의 미토콘드리아 유전자이다. 또한, 유전자 표적은, 본 방법이 미처리 샘플에서 미생물을 검출하도록 미생물-특이적인 미생물 16S DNA 유전자의 분절일 수 있다.
모든 실시양태들의 다른 국면에서, DNA는 하나 이상의 목적 유전자를 포함하며 본 방법은 또한 제2 앰플리콘을 목적 유전자와 관련된 대립유전자 변이의 서열을 갖는 프로브에 대해 하이브리드화하는 단계; 하이브리드화된 앰플리콘으로부터 형광성 패턴을 검출하는 단계; 및 형광성 패턴을 기준으로 하여 대립유전자형을 지정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 목적 유전자(들)은 HLA-A 유전자, HLA-B 유전자, HLA-DRB1 유전자, HLA-DQA1 유전자, 또는 HLA-DQB1 유전자일 수 있다.
모든 실시양태에서, 제1 PCR에 대한 프라이머는 유전자자리-특이적인 프라이머일 수 있다. 유전자자리-특이적인 프라이머의 예는 서열 번호 1 내지 14에 나타낸 서열을 가질 수 있다. 또한, 모든 실시양태에서, 제2 PCR 반응 표적 DNA 서열에 대한 프라이머는 제1 PCR 반응의 증폭된 생성물내에 함유될 수 있다. 하나의 국면에서, 제2 PCR 반응용 프라이머는 다중 엑손-특이적인 프라이머의 세트일 수 있다. 특히, 엑손-특이적인 프라이머는 서열 번호 15 내지 27에 나타낸 서열을 가질 수 있다. 또한, 미처리 샘플은 신선하거나 재수화될 수 있으며 미가공 혈액 유체, 건조된 미가공 혈액, 신선한 볼 면봉 샘플, 건조된 볼 면봉 샘플, 대변 물질, 질 샘플 또는 생명체 또는 비생명체 표면 또는 대상체를 닦아서 수득한 샘플을 포함한다. 모든 양태에서 여전히 추가로 DNA는 미토콘드리아 DNA일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 개인으로부터 미처리 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 미처리 생물학적 샘플에서 제1 역전사 PCR을 수행하여 제1 cDNA 앰플리콘(들)을 생산하는 단계; 모든 프라이머가 소비되어 제2 앰플리콘(들)을 생산할 때까지 제1 앰플리콘(들)을 희석시키고 이에 대해 제2 PCR을 수행함으로써 목적한 RNA(들)을 증폭시키는 단계를 포함하는, 하나 이상의 목적한 RNA를 증폭시키는 방법이 제공된다.
이러한 실시양태에 대해 추가로, 본 방법은 제2 PCR 프라이머를 하나 이상의 형광단을 사용하여 표지시키는 단계를 포함한다. 형광단의 예는 시아닌 염료이다. 양태들 둘다에서 미처리 생물학적 샘플은 신선하거나 재수화될 수 있으며 혈액, 볼 샘플, 또는 질 샘플 또는 생명체 표면 또는 대상체를 닦아 수득한 다른 샘플을 포함할 수 있다.
이러한 추가의 양태의 하나의 국면에서, 본 방법은 유전자 서열내 목적한 부위에 대해 상보성인 서열을 갖는 프로브에 대해 제2 앰플리콘 또는 앰플리콘의 세트를 하이브리드화하는 단계; 하이브리드화된 앰플리콘으로부터 형광성 패턴을 검출하는 단계; 및 형광성 패턴을 기준으로 하여 하나 이상의 유전자 또는 이의 대립유전자형을 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 유전자의 예는 하나 이상의 HLA-A 유전자, HLA-B 유전자, HLA-DRB1 유전자, HLA DQA1 유전자, HLA DQB1 유전자 또는 KIR 유전자이다. 이러한 실시양태들의 또 다른 국면에서, 본 방법은 이의 분석을 위해 제2 앰플리콘(들)을 서열분석하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 국면에서 분석은 하나 이상의 동질성, 개인의 부계, 법의학적 정보, 조직 일치, 질병의 발달에 대한 위험 인자, 또는 의약에 대한 반응을 측정할 수 있다.
모든 실시양태들에서, 제2 PCR은 선형 PCR일 수 있으며 제2 앰플리콘(들)은 cRNA(들)이다. 또한, 제2 PCR은 실시간 PCR일 수 있으며 프라이머는 제1 cDNA 앰플리콘(들)에 대해 특이적인 엑손이다. 또한, 제1 앰플리콘(들)은 하나 이상의 HLA-A, HLA-B 또는 HLA-DBR1, HLA-DQA1, 또는 HLA-DQ-B1 cDNA(들)이며 엑손-특이적인 프라이머는 서열 번호 15 내지 27에 나타낸 서열을 갖는다. 또한, 미처리 샘플은 상기 기술된 바와 같을 수 있다.
본 발명의 여전히 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 개인으로부터 미처리 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 미처리 생물학적 샘플에서 제1 PCR을 유전자 자리 또는 유전자 자리의 정의된 세트에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 수행함으로써 제1 앰플리콘 또는 제1 앰플리콘 세트를 생산하는 단계; 제1 앰플리콘 또는 제1 앰플리콘 세트를 희석시키는 단계 및 제2 PCR을 제2 PCR 반응에 대한 주형으로서 제공되는 앰플리콘(들)과 함께 유전자 자리내에서 엑손 또는 엑손의 세트에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 모든 프라이머가 소비되어 제2 PCR 반응으로부터 앰플리콘 세트를 생산할 때까지 수행하는 단계; 목적 유전자 또는 유전자 세트와 관련된 대립유전자 변이의 서열을 갖는 프로브에 대해 제2 앰플리콘 또는 앰플리콘 세트를 하이브리드화하는 단계; 하이브리드화된 앰플리콘 또는 앰플리콘 세트로부터 시그날을 검출하는 단계; 및 검출된 하이브리드화 시그날을 기준으로 하여 대립유전자형을 지정하는 단계를 포함하여, 목적 유전자를 대립유전자타이핑시키는 방법이 제공된다. 당해 양태의 하나의 국면에서, 제1 앰플리콘 또는 앰플리콘 세트는 샘플을 포함하는 RNA로부터 증폭된 cDNA일 수 있으며 제2 PCR은 이에 대해 수행된 선형 PCR 또는 실시간 PCR이다.
이러한 실시 양태에서, 검출가능한 시그날은 형광성일 수 있으며, 여기서 제2 PCR 프라이머 쌍은 하나 이상의 형광단으로 표지된다. 형광단의 예는 시아닌 염료이다. 또한, 제1 및 제2 PCR 프라이머 서열, 목적 유전자 및 미처리 생물학적 샘플은 상기 기술된 바와 같을 수 있다. 또한, 개인은 현장 환경에서 집단을 포함할 수 있다.
본원에는 미처리 시료를 사용한 개인 또는 집단-규모 증폭 및 DNA 또는 RNA의 HLA-타이핑을 위한 방법 및 시스템이 제공된다. 예를 들면, 비록 이에 한정되지는 않지만, 미세제작 장치(microfabricated device) 또는 "랩온어칩(Lab-on-a-Chip)"(LoC) 장치는 진단 또는 공중보건에 있어 매우 가치있고, 임상적으로 관련된 적용을 제공한다. 본 발명의 방법 및 시스템의 이행은 장비 및 소비재에 있어서 비용을 유의적으로 저하시키는 DNA 또는 RNA의 신속하고, 소형화된 수집점(point-of-collection) 분석이 가능하도록 한다. 특히, 본원에 제공된 방법 및 시스템은, 사용자가 HLA-타이핑 전에 DNA 정제 및 후속적인 DNA 정량화를 완전히 우회하도록 한다.
따라서, 본 발명은 미처리 생물학적 시료로부터의 DNA 또는 RNA 증폭 방법을 제공한다. 시료는 1명 이상의 개인에서 손가락 찌름 또는 신생아 및 아기에서 뒷발꿈치 찌름에 의해 수득된 것과 같은 혈액일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 시료는 증폭을 위해 점적(droplet) 형태로 즉시 사용될 수 있거나 후속적인 재-수화에 이은 증폭 또는 다른 공정에 의해 카드, 예를 들면, 거트리(Guthrie) 카드 위에 건조시킬 수 있다. 혈액 샘플 또는 점적을 수득하고, 혈액 점적을 건조, 저장 및 재수화하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있고 통상적인 것이다. 증폭에 유용한 미처리 혈액 또는 재수화된 건조된 혈액의 양은 약 1 내지 2 마이크로리터이다. 미처리 혈액 샘플은 1명의 개인으로부터 또는 집단으로부터 수집할 수 있다. 샘플의 수집은 현장에서, 진단 실험실에서 또는 병원 또는 의사 사무실에서 수행될 수 있다. 앰플리콘을 사용한 DNA 증폭 및 후속적인 HLA-타이핑의 수집 시점에 실시간으로 수행할 수 있다.
시료는 또한 한명 이상의 성인 또는 신생아 또는 아기에서 Q-팁을 사용하여 뺨 닦기로 수득된 것과 같은 상피 세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 시료는 증폭용 습윤 면봉으로서 즉시 사용될 수 있거나 후속적인 재-수화에 이어, 증폭 또는 다른 공정에 의해 공기-건조될 수 있다. 면봉 샘플을 수득하고, 면봉 샘플을 건조, 저장 및 재수화시키는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있고 통상적인 것이다. 증폭에 유용한 미처리 습윤 면봉 물질 또는 재수화된 건조 면봉 물질의 양은 약 1 내지 2마이크로리터이다. 미처리 면봉 샘플은 1명의 개인 또는 집단으로부터 수집될 수 있다. 샘플의 수집은 현장에서, 진단 실험실에서 또는 병원 또는 의사의 사무실에서 수행될 수 있다. 앰플리콘을 사용한 DNA 및 후속적인 HLA-타이핑의 증폭은 수집 시점에 또는 지역 실험실로 수송시 실시간으로 수행될 수 있다.
DNA의 PCR 증폭은 DNA를 처음 정제하지 않고 수집된 미처리 시료에서 잘 공지된 표준 방법을 통해 현재 수행되고 있는 것과 같이 고도의 유전자- 또는 유전자자리-특이적인 프라이머를 사용하여 수행한다. 유전자자리 특이적인 프라이머의 예는 서열 번호 1 내지 14에 나타낸 서열을 갖는다. 탄뎀 PCR((PCR #1, PCR #2)은 제1 PCR 반응이 혈액과 같은 미처리 시료에서, 또는 재수화된 건조된 혈반, 재수화된 미처리 면봉 용출물 또는 대변 샘플에서 일어나도록 수행한다. 혈액 또는 면봉 물질에서 PCR 억제제를 사용한 시료의 통제되지 않은 오염으로 인하여, 최초의 PCR 반응의 수율은 매우 유의적으로 변할 수 있다. 이는 시판되는 셋팅에서 이러한 미처리 혈액 또는 미처리 면봉 PCR의 일반적인 실패에 대한 원인이 되어 왔다.
그러나, 본 발명에서, 제2 PCR 반응은 엑손-특이적인 프라이머와 같지만, 이에 한정되지 않는, 유전자자리-특이적인 프라이머의 서브세트 또는 서브-서열을 사용한 제1 PCR 반응의 생성물을 사용하여 일어난다. 엑손 특이적인 프라이머의 예는 서열 번호 15 내지 27에 나타낸 서열을 갖는다. 제2 PCR 반응이 프라이머-한정되도록 셋팅되므로, 즉, 제2 PCR 반응이, 모든 첨가된 PCR 프라이머 올리고뉴클레오타이드가 소모될 때까지 의도적으로 진행되므로, 제2 PCR 반응으로부터 기원한 PCR 생성물의 양은 제1 PCR 반응에서 수득된 생성물의 가변 양과 독립적으로 된다. 결과적으로, 미처리 혈액 시료로부터의 통제되지 않은 오염으로 인하여 제1 PCR 반응의 수율에 있어서 유의적인 변화는 제2 반응의 자가-제한 특성에 인해 교정된다. 또한, 제1 PCR 반응의 생성물은 제2 PCR 반응내로 유의적으로 희석됨으로써 시초에 미처리 시료를 오염시켰던 PCR 억제제의 효과를 최소화시킨다. 전체 결과는 이러한 일련의 2개의 PCR 반응을 사용하여 항상 수득되는 최종 PCR 생성물의 예정된 양이며, 즉, 최종 생성물의 양은 항상 2개의 PCR 반응중 두번째에 사용된 PCR 프라이머의 양에 의해 결정될 것이다. 또한, 최초의 PCR 반응의 제2 PCR 반응으로의 유의적인 희석을 통해, 전체의 탄뎀 PCR 반응은 따라서, 원래의 미처리 샘플내 PCR 억제제 오염에 있어 통제되지 않은 변이와는 실질적으로 독립적이다.
RNA 증폭은 본원에 기술된 탄뎀 PCR 방법을 사용하여 달성할 수 있다. DNA 증폭을 사용함으로써, 신선한 또는 재수화된 건조 샘플인, 미처리 혈액 샘플이 수득되고 역전사(RT) PCR이 수행된 후 PCR, 예를 들면, 실시간 PCR, 종점(endpoint) PCR 또는 선형 cRNA 증폭 또는 합성이 수행된다.
앰플리콘은 증폭된 사람 백혈구 항원 유전자 HLA-A, HLA-B 또는 HLA-DRB1 또는 DQA1 또는 DQB1 유전자 또는 HLA 수용체 KIR일 수 있으나, 이에 한정되지 않는, 단일 뉴클레오타이드 다형(polymorphism)에서와 같이 대립유전자 변이와 같은, 유전자내 하나 이상의 엑손내 목적 부위를 스패닝(spanning)하는 오우버랩핑 프로브의 패널을 포함하는 마이크로어레이 또는 칩에 하이브리드화된다. 엑손-특이적인 프라이머는 검출가능한 시그날을 생산하는 잔기 또는 염료로 표지될 수 있다. 예를 들면, 형광단-표지된 프라이머, 예를 들면, 엑손 특이적인 Cy3 또는 Cy5와 같은 시아닌 염료를 사용하여 표지시킬 수 있다. 따라서, 하이브리드화된 앰플리콘-프로브 쌍은 검출될 수 있으며 하이브리드화 패턴은 대립유전자형과 관련되었다. 대표적인 마이크로어레이 설계는 모두 호간(Hogan) 등에게 허여되고 모두 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제7,354,710호 및 미국 공보 제20070298425호 및 제20090011949호에 기재되어 있다. 또한, 예를 들면, 미국 공보 제20070298425호는 HLA-A, HLA-B 및 HLA-DRB1 유전자 및 부위-특이적인 하이브리드화에 적합한 HLA-A, HLA-B 및 HLA-DRB1 유전자에서 대립유전자 변이를 계산하는 HLA 프로브 서열을 증폭시키기 위한 HLA 프라이머를 기재하고 있다.
대안적으로, 핵산 서열 또는 길이 분석은 피로서열분석과 같지만 이에 한정되지 않는, 표준 및 공지된 과정을 사용하여 제2 DNA 또는 RNA 앰플리콘 상에서 수행할 수 있다. 이러한 분석은 HLA 유형을 수득하거나, 개인의 동질성 및/또는 부계를 수득하는데 유용하다. 예를 들면, 핵산의 길이 의존적 분석은 짧은 말단 반복체(STR)-계 확인인자 반응을 통한 가장 최신의 사람 확인을 위한 기준이다. 또한, 서열 또는 길이 분석은 예를 들면, 범죄 현장에서 수득된 샘플로부터 유용한 법의학적 정보를 제공할 수 있다. 또한, 본원에 기술된 탄뎀 PCR 반응은 사람 확인의 목적을 위해 미토콘드리아 DNA에서 수행될 수 있다. 미토콘드리아 DNA의 사용은, 이의 증가된 카피 수로 인하여, 샘플이 매우 소량 또는 분해된 것과 같이 절충된 경우 특히 유용할 수 있다. 본원에 제공된 탄뎀 PCR 방법은, 샘플 미토콘드리아 DNA가 복제의 미토콘드리아 기원 근처의 2개의 초-가변 영역 및 하나 이상의 추가의 미토콘드리아 유전자를 포함하는 경우 유용하다. 또한, 본원에 기술된 탄뎀 PCR 반응은 HLA 또는 KIR 이외의 유전자 또는 유전자 세트 또는 미토콘드리아 DNA, 특히 질병 위험 또는 의약에 대한 반응을 평가할 목적의 유전자 세트 분석에서 수행할 수 있다. 또한, 탄뎀 PCR 반응은 미생물-특이적인 미생물 16S DNA 유전자의 분절에서 수행될 수 있다. 미생물 16S DNA 유전자는 미생물 중에서 상이하므로, 본원에 기술된 방법은 미처리 샘플, 예를 들면, 대변에 존재하는 미생물을 검출하는데 유용하다.
또한, 본 방법은 샘플 공급원으로서 미처리 혈액에 한정되지 않는다. 보다 특히, 본 방법은 구강 또는 질 부위, 또는 피부 표면 또는 다른 표면 또는 대상체의 내부를 닦아 수득된 DNA- 또는 RNA-함유 시료를 프로세싱하는데 사용할 수 있다. 또한, 닦은 표면 또는 대상체는 비생물일 수 있으며 수득된 샘플은 본 발명의 방법을 통해 프로세싱되어 범죄 현장에서 증거를 수득할 수 있다.
샘플이 구강 또는 볼 면봉으로부터와 같이 유액인 경우, 수득되는 샘플은 DNA 증폭없이 면봉으로부터 유액을 짜내어 직접 사용함으로써 본원에 기술된 바와 같은 탄뎀 PCR 또는 탄뎀 RT-에 이은 PCR을 지지할 수 있다. 샘플을 함유하는 면봉이 건조되거나, 공기-건조 후 건조되어지는 경우, 제지(paper) 카드 상에서 건조된 혈액을 사용하는 경우와 같이, 이는 재수화시킨 후, 수득되는 재-수화된 면봉 샘플을 핵산 정제없이 사용하여 본원에 기술된 본 방법을 지지할 수 있다.
본원에 제공된 PCR 증폭 방법은 랩-온-어-칩(Lab-on-a-Chip: LoC), 예를 들면, HLA를 포함하나, 이에 한정되지 않는 시스템상에서 수행을 위해 설계될 수 있다. HLA-LoC는 현재의 표준 및 잘-공지된 HLA-타이핑 프로토콜에 요구되는 전체 작업 흐름을 작동을 위해 단지 1명의 기술자만을 필요로 하는 단일의 통합된 작업 장소로 대체시킨다. 1명의 기술자는 예비-제작된 칩 및 시약을 작업 장소내로 로딩하고 칩내로 도입 혈액 시료를 피펫팅하는 것만을 필요로 한다. 또한, 경우에 따라, 1명의 기술자는 수개의 스테이션(station)을 병행할 수 있다. 최종 HLA-형에 대해 로딩된 샘플로부터 손을 대지않는(hands-off) 의무 주기는 시료당 1시간 미만이다. HLA-LoC는 개인 기준 또는 집단 중에서 현장의 의사의 사무실에서 사용하기에 적합하다. 또한, 자동화를 사용하여 HLA-Loc는 모든 HLA-타이핑 랩의 표준이 될 수 있음이 고려된다.
따라서, HLA-타이핑 시스템은 PCR 모듈, HLA-LoC 칩, 하이브리드화 데이타를 디지털화하고 분석하기 위한 소프트웨어 및 마이크로어레이 판독기를 포함하는 하이브리드화용 마이크로어레이 플랫폼과 같은 작동중인 탄뎀 PCR을 위한 수단을 포함한다. 당해 시스템은 또한 시스템을 작동시키기에 요구되며 당해 분야에 공지되고 표준인 것으로서 필수적인 프로세서 및 기억 및 저장 성분을 포함한다. 샘플 프로세싱 단계 모두는 단순한 카트리지 양식으로 자동화되어 있음이 고려된다. 특히, 및 이에 제한됨이 없이, 시스템을 포함하는 2개의 분석 장치, 즉, PCR 모듈 및 마이크로어레이 판독기는 모듈러 아키텍쳐(modular architecture) 시도를 사용하여 1개의 저렴한 장치내로 통합된다. 모듈러 시도를 사용하여 당해 시스템을 최적화시켜 의사의 사무실 또는 현장 병원에서 수집점(point-of-collection)에 발생하는 것들 또는, 다른 극도의, ASHI-증명된 조직 타이핑 실험실에서와 같이 일원화된 실험실에서 발생하는 것들로부터 각종 처리량 요건을 충족시킬 수 있다.
HLA 타이핑 또는 다른 유전자의 분석의 본 방법은 랩온어칩 적용에 한정되지 않는다. 본 탄뎀 PCR 방법의 유사한 적용, 또는 탄뎀 RT-에 이은-PCR 방법의 관련된 적용을 통해, 본 방법은 또한, 탄뎀 반응이 96개 반응물의 로트(lot)에서 동시에 수행된 후 이어서, 마이크로어레이에 의해 수득되는 제2 PCR 앰플리콘이 분석되는 경우 수행될 수 있는 배취식 프로세싱(batchwise processing)(칩 방식의 비-실험실에서)을 위한 핵산 정제없이 HLA-타이핑, 또는 동시에 수행될 수 있는 유전적 분석의 다른 방법을 가능하도록 하는데 사용될 수 있다.
PCR #1+PCR #2 방법 및 시스템은 표준 DNA 정제 + DNA 정량화 　+ PCR 단계들을 대체시키기 위한 다른 PCR-계 유전 시험에 사용될 수 있다는 것이 고려된다. 또한, 본원에 제공된 HLA-타이핑의 방법은 다른 의학적 또는 공중보건 적용에 유용함이 고려된다. 예를 들면, HLA-타이핑은 고형 기관 이식 및 골수 및 줄기 세포 이식에 요구된다. 또한, HLA-타이핑의 본 방법은 개인화된 백신 반응성, 감염성 질병 위험에 있어서 HLA-계 변이 및 자가면역병에 대한 HLA-계 민감성과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는, 공중보건 적용에 유용할 수 있다. 또한, 정제 유리된 RNA 분석은 목적한 분석물 세트로서 미처리 혈액 림프구 RNA 발현을 사용하는 약물 부작용(ADR), 또는 조기 단계 패혈증에 대한 진단 도구로서 유용하다.
다음 실시예는 본 발명의 각종 양태들을 나열할 목적으로 제공된 것이며 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한함을 의미하지 않는다. 본 분야의 숙련가들은, 본 발명이 언급된 목적을 수행하고 목표 및 장점, 및 본원에서 고유한 이들 목적들, 목표들 및 장점들을 수득하기 위해 잘 조절됨을 용이하게 인식할 것이다. 특허청구범위의 영역에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 취지 내에 포함되는 이에 대한 변화 및 다른 용도는 본 분야의 숙련가에게 일어날 것이다.
실시예 1
탄뎀 PCR 은 넓은 1°도입량에 걸쳐 일정한 2°생성물을 수득한다.
2μl의 미처리 혈액을 HLA-칩 분석에 요구되는 최초의, 유전자자리-특이적인 HLA PCR 반응을 위한 주형으로 사용하였다. 증폭은 Finnzymes Phusion® 블러드 다이렉트 키트(Blood Direct kit)를 사용하여 수행하였다. 상이한 양의 최초의 유전자자리 특이적인 PCR 생성물을 H2O 속에 희석시키고, 그 후 제2의, 자가 제한되는, 엑손-특이적인 PCR 반응을 위한 주형으로 사용하였다. 이후에, 수득되는 2°PCR 반응 생성물 각각의 1 마이크로리터를 표준 아크릴아미드 겔 위에 로딩하였다. HLA-A 엑손 2 및 3과 HLA-DRB1 엑손 2(도 1a) 및 HLA-B 엑손 2 및 3(도 1b)를 암레스코 EZ-비젼 DNA 염료로 가시화하였다. 겔 상의 양성 대조군은 동일한 탄뎀 HLA PCR 반응의 생성물을 나타내지만, 대신 10ng의 고도로-정제된 로슈 DNA를 원래의 샘플 도입물로 사용한다. 알수 있는 바와 같이, 2μl의 미처리 혈액으로부터 수득된 최종 2° 앰플리콘의 양은, 반응에 사용된 1°앰플리콘의 양과 거의 독립적이며, 10ng의 정제된 로슈 DNA로부터 수득된 증폭된 HLA 생성물과 특이성 및 질량 수율에 있어 유사하다.
실시예 2
HLA 유전자자리-특이적인 앰플리콘의 생성
HLA 유전자자리-특이적인 앰플리콘은 2μl의 전혈 유액(도 2a)으로부터 핀자임스(Finanzymes, 매사츄세츠주 우번 소재)로부터 시판되는 Phusion Blood Direct® 키트를 사용한 PCR 반응을 통해 생성한다. 반응 조건은 다음과 같다: 20μl의 반응 부피 중 1x Phusion® Blood PCR 완충액, 0.8μl Phusion® Blood DNA 폴리머라제, 1.75mM EDTA, 400nM 각각의 프라이머. 반응을 다음 프로토콜을 사용하여 반복한다: 98℃에서 5분 동안 초기 변성에 이어 i) 98℃에서 5초 동안 변성, ii) 70℃에서 5초 동안 어닐링, 및 iii) 72℃에서 30초 동안 연장의 35주기 및, 72℃에서 1분 동안 1회의 최종 연장.
정제된 DNA로부터 HLA 유전자위치를 증폭시키는 경우(도 2b), 10ng의 게놈 DNA를 로슈(스위스 바젤 소재) FastStart 태크(Taq) DNA 폴리머라제를 사용하는 PCR에 대한 주형으로서 다음 조건하에 사용한다: 25μl의 총 반응 부피 중 1x PCR 완충액(Mg++ 부재), 1.5mM MgCl2, 0.16mg/ml BSA (분획 V), 각각의 0.05μM dNTP, 각각의 400nM 프라이머, 및 1 단위의 태크. 이들 반응은 다음 프로토콜을 사용하여 반복한다. 98℃에서 5분 동안 초기 변성에 이어 i) 98℃에서 5초 동안 변성, ii) 70℃에서 1분 동안 어닐링, 및 iii) 72℃에서 30초 동안 연장의 35주기, 그 후 7분 동안 72℃에서 최종 연장.
HLA 유전자자리 특이적인 최초의 PCR 프라이머 서열
HLA-A 유전자자리 최초의 프라이머 쌍:
전방 프라이머 1: 5'- GCC TCT GYG GGG AGA AGC AA -3'(서열 번호 1)
역방 프라이머 1: 5'- GTC CCA ATT GTC TCC CCT CCT T -3'(서열 번호: 2)
HLA-B 유전자자리 최초의 프라이머 쌍 세트:
전방 프라이머 2a: 5'- GGG AGG AGC GAG GGG ACC GCA G -3'(서열 번호 3)
전방 프라이머 2b: 5'- GGG AGG AGA GAG GGG ACC GCA G -3'(서열 번호 4)
전방 프라이머 2c: 5'- GGG AGG AGC AAG GGG ACC GCA G -3'(서열 번호 5)
역방 프라이머 1: 5'- GGA GGC CAT CCC GGG CGA TCT AT -3'(서열 번호 6)
역방 프라이머 3: 5'- GGA GGC CAT CCC CGG CGA CCT AT -3'(서열 번호 7)
역방 프라이머 3a: 5'- TTC TCC ATT CAA CGG AGG GCG ACA -3'(서열 번호 8)
역방 프라이머 3b: 5'- TTC TCC ATT CAA GGG AGG GCG ACA -3'(서열 번호 9)
HLA-DRB1 유전자자리 최초의 프라이머 쌍 세트:
전방 프라이머 1a: 5'- CTT GGA GGT CTC CAG AAC AGG -3'(서열 번호 10)
전방 프라이머 1b: 5'- CTT AGA GGT CTC CAG AAC CGG -3'(서열 번호 11)
역방 프라이머 4-xx: 5'- CAC ACA CAC ACA CAC ACT CAG ATT C -3'(서열 번호 12)
역방 프라이머 4-07: 5'- CAC ACA CAC AAC CAC ACT CAG ATT C -3'(서열 번호 13)
역방 프라이머 4-10: 5'- CAC ACA CAC ACA CAG AGT CAG ATT C -3'(서열 번호 14)
분자 생물학 등급 수(water) 속에 1:100으로 희석된 유전자자리-특이적인 반응으로부터의 생성물(도 3a 내지 3c)을 후속적인 엑손-특이적인 "내포된" PCR 반응을 위한 주형으로 사용하였다(도 4a 내지 4b). PCR 반응을 100μl의 반응 부피 속에서 다음 성분들과 함께 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)(캘리포니아주 포스터 시티 소재) Amplitaq Gold® DNA 포리머라제를 사용하여 수행하였다: 5μl의 1:100 희석된 유전자자리 특이적인 PCR 생성물, 1x PCR 완충액 II, 1.5mM MgCL2, 0.16mg/ml BSA(분획 V), 각각의 0.2mM dNTP, 각각의 400nM 프라이머, 및 4 단위의 Amplitaq Gold® DNA 폴리머라제. 주기 조건은 94℃에서 2분 동안 초기 변성에 이은 (i) 98℃에서 30초 동안 변성, (ii) 68℃에서 30초 동안 어닐링, 및 (iii) 72℃에서 30초 동안 연장의 40 주기, 이어 72℃에서 7분 동안 최종 연장 단계이다. 엑손-특이적인 PCR 프라이머를 시아닌 3 염료로 표지시켜 ProScan Array HT[제조원: 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer), 워싱톤주 왈탐 소재]와 같은 마이크로어레이 스캐너 속에서 레이저 여기/방사에 의해 양성 하이브리드화 현상의 검출을 용이하도록 한다.
엑손 특이적인 제2 PCR 프라이머 서열
HLA -A 엑손 2 제2 프라이머 쌍:
전방 프라이머 2b-24: 5'-(cy3) AGC CTG GTT CAC TSC TCG YCC CCA GGC TC -3' (서열 번호 15)
역방 프라이머 2a-28: 5'-(cy3) TAC TAC AAC CTT GCC TCG CTC TGG TTG TAG TAG C -3'(서열 번호 16)
HLA-A 엑손 3 제2 프라이머 쌍:
전방 프라이머 2b-24: 5'-(cy3) GTG AGA ACT AGT CSG GGC CAG GTT CTC ACA -3'(서열 번호 17)
역방 프라이머 2b-26: 5'-(cy3) GTA CCA GGT TCC CGT GGC CCC YGG TAC C -3'(서열 번호 18)
HLA-B 엑손 2 제2 프라이머 쌍:
전방 프라이머 2c-20: 5'-(cy3) ACC CTC TTG AGC CGC GCC GGK AGG AGG GTC -3'(서열 번호 19)
역방 프라이머 2a-28: 5'-(cy3) TAC TAC AAC CTT GCC TCG CTC TGG TTG TAG TAG C -3'(서열 번호 20)
HLA-B 엑손 3 제2 프라이머 쌍:
전방 프라이머 2a-22: 5'-(cy3) GTG AGA CTT ACC GGG GCC AGG GTC TCA CA -3'(서열 번호 21)
역방 프라이머 2a-26: 5'-(cy3) GTA CCA GGT TCC CAC TGC CCC TGG TAC C -3'(서열 번호 22)
DRB1 엑손 2 제2 프라이머 쌍 세트:
전방 프라이머 3-xx-24: 5'-(cy3) AAC GTG CTT TTT CGT GTC CCC ACA GCA CGT TTC -3'(서열 번호 23)
전방 프라이머 3-04-24: 5'-(cy3) AAC GTG CTT TTT CTT GTC CCC CCA GCA CGT TTC -3'(서열 번호 24)
전방 프라이머 3-07-24: 5'-(cy3) AAC GTG CTT TTT TGT GCC CCC ACA GCA CGT TTC-3'(서열 번호 25)
역방 프라이머 3-xx-20: 5'-(cy3) TGC AGC TTT GCT CAC CTC GCC GCT GCA C -3'(서열 번호 26)
역방 프라이머 3-09-22: 5'-(cy3) TGC AGA GTT GCT TAC CTC GCC TCT GCA C -3'(서열 번호 27)
세트로서 단일 PCR 반응에서 증폭된, 엑손-특이적인 PCR을 다음 과정을 사용하여 자가 조립하는 단일 염기 차별적인 마이크로어레이 하이브리드화에서 표적으로 사용한다. 마이크로어레이 슬라이드를 ddiH2O로 40℃에서 15분 동안 예비-세정한 후 그레이스 바이오-랩스(Grace Bio-Labs)(오레곤주 벤드 소재) 프로플레이트 다중-배열 슬라이드 시스템(ProPlate Multi-Array Slide System)내로 조립한다. 마이크로어레이 슬라이드/포로플레이트 슈퍼구조 상의 16개 웰 각각을 3x SSC[제조원: 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich), 미주리주 세인트 루이스 소재] 및 5x 덴하르트 용액(Denhardt's Solution)[제조원: 암레스코 인크.(Amresco, Inc.) 오하이오주 솔론 소재]으로 이루어진 예비-하이브리드화 완충액 75μl로 평형화한다. 표적 PCR 생성물을 다른 시약과 합하여 3x SSC, 5x 덴하르트 용액, 및 50% 엑손-특이적인 PCR 생성물로 이루어진 하이브리드화 칵테일(cocktail)을 제조한다. 이후에, 당해 칵테일을 5분 동안 99℃에서 변성시킨 후 -20℃에서 3분 동안 스냅-냉각(snap-cooling)시킨 직후 유전형 마이크로어레이에 대해 하이브리드화한다. 변성된 PCR 생성물을 앞서 평형화된 마이크로어레이에 적용시키고 25℃에서 16시간 동안 하이브리드화되도록 한다. 하이브리드화 배열을 각 세척을 웰당 100μl의 0.2x SSC로 15분 동안 2회 세척한다. 배열 카세트를 분해하고 슬라이드를 0.2x SSC를 사용하여 대량 방식(bulk format)으로 간단히 세척한 후 에펜도르프 5810 원심분리기 속에서 60 x g로 원심분리시켜 건조한다. 형광성 데이타를 시아닌3 및 시아닌5 채널 세트를 각각 60% 및 40% PMT 획득에 대해 사용하여 퍼킨-엘머 스캔-배열 라이트 레이저 스캐너 속에서 슬라이드를 스캐닝함으로써 획득한다. 마이크로어레이 슬라이드 상에서 각각의 프로브 특징에 대해 정량적 형광성 측정으로 이루어진, 수득된 데이타 파일을 HLA 유전형 요청을 생성시키기 위해 게노믹스 유에스에이(Genomics USA)에서 개발한 소프트웨어로 분석한다.
실시예 3
랩-온-어-칩 마이크로어레이 플랫폼
LoC 마이크로어레이 플랫폼(In-CheckTM) 시스템은 단일 랩-온-어-칩에서 유전 시험을 위한 PCR 증폭 및 마이크로어레이 검출 공정을 통합한다. 당해 시스템은 HLA-타이핑에서와 같은, 복합체 핵산 분석물의 확인을 위해, 단일의 저-밀도 마이크로어레이 상에서 PCR 증폭 및 하이브리드화를 통합시킴으로써 설계된다. 당해 시스템은 소형화된 규소 랩-온-칩(LoC) 상에서 저-밀도 마이크로어레이로 구성된 하이브리드화 반응기와 유동적으로 연결된 PCR 마이크로-반응기를 모놀리식으로(monolithically) 통합하는 기술을 기초로 한다.
PCR 모듈
PCR 모듈(In-CheckTM)은, PCR 모듈이 고도로 신뢰할만한, 종-점 PCR에 요구되는 신속한 가열 및 냉각 주기를 수행하도록 하는 통합된 규소 가열기, 온도 센서 및 소형화된 25μl 부피를 갖는다. PCR 모듈은 온도 제어 시스템(TCS; In-CheckTM)에 의해 열적으로 구동된다. TCS는, 5개의 상이한 LoC 시험이 동시에 수행되도록 하는 방식으로 신속하고 프로그램 가능한 온도 주기를 허용한다.
랩-온-칩
LoC는 규소-반도체 MEMS 기술을 사용하여 제작되고, 필수적인 기계적, 열적 및 전기적 연결을 제공하는 1"x3" 플라스틱 슬라이드 상에 놓여진 1회용 장치이다. 당해 규소 칩은 1cm2내에 500개 이하의 점의 저 밀도 마이크로어레이을 수용하는 30μl의 하이브리드화 부위를 갖는 25μl PCR 반응기를 모놀리식으로 통합하는 전기적으로 활성인 시스템이다. 정밀한 온도 조절이 3개의 저항 가열기 및 PCR 반응기 위에 위치한 온도 센서를 통해 유지된다.
마이크로어레이 하이브리드화 및 검출
500개 이하의 프로브 점을 LoC 칩의 1cm x 1cm 마이크로어레이 모듈내에 위치시킬 수 있다. 마이크로어레이 모듈을 LOC(In-CheckTM) 상에서 PCR 챔버에 유동적으로 연결시키고 온-칩 온도 조절 시스템에 커플링시킴으로써, 하이브리드화 및 세척 동안 완전한 온도 조절이 되도록 한다. 하이브리드화 후, 마이크로어레이 모듈은 전체 1" x 3" LoC를 마이크로어레이 광학 판독기(OR; In-CheckTM)내로 삽입시켜 판독한다. 요구되는 분해능에 따라서, OR에 의한 스캐닝은 전형적으로 60초 미만에서 수행한 후, 유전자타이핑을 위해 리시머(Ricimer)(GenUSA, www.GenomicsUSA.com)와 같은 추가의 소프트웨어로 직접적인 데이타 이전시킨다. 샘플을 LoC에 통상의 랩 도구와 함께 로딩 스테이션(loading station)을 통해 직접 적용한다. 모든 프로세싱은 단지 통상의 생화학적 훈련을 받은 직원에 의해 수행될 수 있다. 도입 샘플로서 미처리 혈액을 사용하여 50개 정도로 많은 HLA-Loc 시험을 작업 장소(PCR 모듈에서 한번에 5개)당 필수적인 랩 장치로서 단지 수동 피펫팅을 사용하여 하루에 수행할 수 있었던 것으로 예측된다.
실시예 4
마이크로어레이 영상 프로세싱
HLA-칩의 임상 및 역학적 적용을 위해, 미처리 마이크로어레이 영상 데이타를 자동적으로 디지털화한 후, 이들 영상 데이타를 본 발명자들이 앞서 기술한 프로브 하이브리드화와 (국소)대립유전자 구조 사이의 관계에 따라, 대립유전자-특이적인 프로브 요청으로 전환시키는 것이 필수적이다.
자동화된 배열 디지탈화
마이크로어레이 영상의 다수의 분석은 일단 제한된 점내에서 "점 발견(spot finding)" 및 하이브리드화 시그날 강도의 통합을 기초로 한다. 이러한 점 발견 및 통합은 현재 영상기 소프트웨어에서 통상적인 기능성이다. Cy5 표지된 25머(mer) 올리고-dT 올리고뉴클레오타이드의 사용에 의한 자동화된 영상 분석은 배열상에 인쇄된 각각의 프로브 성분내에서 5% 밀도로 검사된다. 이러한 마커를 도입하고 영상기의 표준 광학 채널(마커의 경우 Cy5 및 하이브리드화 시그날의 경우 Cy3) 둘다를 사용함으로써, 다른 것과는 독립적으로 각각의 프로브 점을 국재화시키는 것이 가능하며: 어느 정도, 기준 마커의 수는 하이브리드화 시그날의 것과 동일하여, 중복을 생성한다.
대립유전자-특이적인 프로브 하이브리드화 데이타의 HLA -대립유전자형으로의 자동화된 조립
미가공 데이타, 프로브 맵, 및 관련 유전자에 대한 모든 공지된 대립유전자 서열의 판독 후, 리시머 소프트웨어(Ricimer software)는 인쇄된 프로브로부터의 하이브리드화 시그날의 존재 또는 부재를 기준으로 대립유전자 요청을 측정한다. 이는 제거의 2-단계 공정에 필수적인 것에 의해 달성된다. 제1 단계는 "오프(off)"인 것으로 보고된 각각의 프로브를 시험하고 공지된 대립유전자 서열과 프로브된 서열을 비교함을 포함하는 것을 수반한다. 대립유전자 서열이 하나 이상의 "오프" 프로브의 서열과 일치한 경우, 이후 대립유전자는 샘플 속에 존재하는 대립유전자 쌍 중 하나일 수 없으므로, 후보물로서 제거된다.
당해 제1 단계가 완료되면, 후보물 대립유전자의 세트는 현저히 감소된다. 이 시점에서 남아있는 대립유전자의 모든 가능한 쌍형성(pairing)을 별도록 평가한다. 각각의 대립유전자 쌍을 배열에 의해 보고된 바와 같이 "온(on)" 프로브의 전체 세트와 비교한다. 실험적으로 측정된 "온" 프로브 세트와 대립유전자 서열에 의해 예측된 "온" 프로브 사이에 어떠한 불일치가 존재하는 경우, 이러한 대립형질 쌍은 해법 세트(solution set)에 대한 후보물로 더이상 고려되지 않는다. 이들 2개의 선택 단계(culling step)를 수행한 후, 데이타에 대해 계수될 수 있는 대립유전자의 모든 가능한 쌍형성을 측정하고 사용자에게 보고한다. 전형적으로 쌍형성에 존재하는 대립유전자의 세계적인 집단 빈도를 기준으로 계산된 가능성 값은 또한 결정을 하는데 있어 사용자를 보조하는 것으로 보고되어 있다. 이러한 매우 강력한 대립유전자 요청 통계학적 기능성은 사용자에게 나타내는 그래프적 인터페이스(graphical interphase), 실험적 HLA-유형의 확실성 및 모든 가능한 대안의 대립유전자 요청에 대한 기준이 되었다.
실시예 5
유액 상태의 미처리 혈액 및 거트리 카드( Guthrie card )에서 건조되도록 한 미처리 혈액으로부터 HLA -타이핑을 위한 PCR 반응
미처리된 익명의 미처리 혈액을 미네소타주 미네아폴리스에 소재하는 메모리얼 블러드 랩스(Memorial Blood Labs)로부터 입수하고 필요할 때까지 -20℃에 동결 저장하였다. 해동된 미처리 혈액을 HLA-칩 분석에 요구되는 최초의, 유전자자리-특이적인 HLA PCR 반응에 대한 주형으로 직접 사용하였다. 상응하는 건조된 혈액 샘플을 신선하고, 전혀 동결되지 않은 혈액을 표준 화트만(Whatman)-GE 거트리에 카드에 피펫팅 한후 라미나 유동 후드(laminar flow hood) 속에서 25℃에서 72시간 건조시킨 후 밀봉된 파우치 속에 이후 25℃에서 저장하였다. 거트리에 카드 위의 건조된 혈액의 경우, 2mm 환형 천공(punch)을 혈액 카드로부터 수행하여 이에 100μl의 100mM 붕산 및 1mM EDTA를 pH 7.5에서 첨가하였다. 이후에, 천공물을 2시간 동안 70℃에서 가열하여 혈반을 재수화시키고, 혈반의 내용물을 용액내로 용출시켰다. 이후에, 수득되는 유액 상을 피펫팅에 의해 혼합하였다. 재수화된 천공물을 분석까지 -20℃에서 저장하였다.
미처리 및 재수화되고 건조된 혈액의 경우, 1μl의 샘플을 PCR에 대한 주형으로서 후속적인 정제없이 사용하였다. 제1 PCR 증폭을 Finnzymes Phusion® 블러드 다이렉트 키트(Blood Direct kit)를 통해 수행하였다. 이러한 최초의 유전자자리 특이적인 PCR 생성물 1μl를 이후에 제2의 자가 제한, 엑손-특이적인 PCR 반응용 주형으로 직접 적용시켰다. 1μl의 각각의 수득되는 2° PCR 반응 생성물을 이후에 표준 아크릴아미드 겔에 로딩하였다. HLA-A 엑손 2와 3 및 HLA-DRB1 엑손 2(도 5a) 및 HLA-B 엑손 2와 3(도 5b 및 5c)을 암레스코 EZ-비젼 DNA 염료로 가시화하였다. 겔상의 양성 대조군은 동일한 탄뎀 HLA PCR 반응의 생성물을 나타내지만, 대신에 10ng의 고도로 정제된 로슈 DNA를 원래의 샘플 도입물로서 사용한다. 알 수 있는 바와 같이, 1μl의 미처리 혈액으로부터 수득된 최종 2°앰플리콘의 양은 반응에 사용된 샘플과는 거의 독립적이고, 10ng의 정제된 로슈 DNA로부터 수득된 증폭된 HLA 생성물에 대해 특이성 및 질량 수율에 있어 유사하다.
실시예 6
재수화된 볼 면봉으로부터 HLA -타이핑을 위한 PCR 반응
확인되지 않은 볼 면봉을 현지 기증자로부터 구하였다. 4개의 면봉을 구강의 사분면 각각당 20회 상하로 강하게 닦아서 각각의 참여자로부터 수집하고 15mL의 원추형 튜브 속에 두었다. 전체 구강 면봉을 12명의 개인으로부터 취하였다: A1 내지 A12. 샘플을 72시간 동안 라미나 유동 후드하에 건조시켰다. 이후에, 건조된 면봉을 150μl의 재수화 완충액(100mM 붕산염 + 1mM EDTA) 속에 재수화시키고 70℃에서 2시간 동안 가용화시켰다. 이후에, 수득되는 유동상을 피펫팅하여 혼합하였다. 재수화된 면봉을 이후에 분석할 때까지 -20℃에 저장하였다. 이후에, 내포된(탄뎀) PCR 반응을 목적한 HLA 유전자자리 각각에 대해 수행하였다. 1μl의 미처리 면봉 용출물을 로슈 태크 폴리머라제를 사용하는 최초의 25μL PCR 반응에 사용하였다. 이후에, 후속적인(제2) PCR을 25μL의 총 PCR 반응 부피로 로슈 태크 폴리머라제를 사용하여 2.5 μL의 최초의 앰플리콘 생성물에 수행하였다. 완료시, 잔류 샘플(회수된 부피의 1/2 이하)을 QIAamp DNA 블러드 미니 키트(퀴아젠 제품번호 #51104)를 통해 추출하였다. 수득되는 정제된 DNA를 동일한 마이크로어레이 HLA-타이핑 플랫폼에서 수행하였다. 정제되지 않은 및 정제된 볼 DNA를 HLA 타이핑을 위해 마이크로어레이 기술을 통해 분석하였다. 볼 면봉으로부터 일치된, 확인되지 않은 DNA를 겔 전기영동을 통해 미처리되고, 정제되지 않은 샘플 상에서 수득된 HLA 유형과 비교하였다. 이후에, 1 마이크로리터의 각각의 수득되는 2°PCR 반응 생성물을 표준 아크릴아미드 겔 위에 로딩하였다.
최초의 유전자자리 특이적인 PCR 생성물 및 제2 엑손 특이적인 반응 세트(단일의 다중 반응으로 수행됨)의 생성물을 도 6a(좌측)에 샘플로부터 수득된 10ng의 정제된 DNA(우측)로부터 수득된 동일한 반응 생성물과 함께 나타내었다. 밴드를 암레스코 EZ-비젼 DNA 염료로 가시화하였다. 알 수 있는 바와 같이, 1μL의 미처리 면봉 용출물로부터 수득된 최종 2° 앰플리콘의 양은 동일한 샘플로부터의 10ng의 정제된 DNA로부터 수득된 증폭된 HLA 생성물에 대해 특이성 및 질량 수율에 있어 유사하다. 도 6b 내지 6g는 총 12명의 기증자로부터의 미처리 뺨 면봉에서 수행한 탄뎀 PCR 반응의 생성물을 나타낸다. 도 6b 내지 6d는 이들 12개의 미처리 볼 면봉 샘플에 대한 HLA-A, HLA-B 및 HLA-DRB1에 대해 특이적인 최초의 PCR 반응을 나타내는 반면, 도 6e 내지 6g는 12개의 미처리 볼 면봉 샘플에 대한 HLA-A, HLA-B 및 HLA-DRB1에 대해 특이적인 제2 PCR 반응을 나타낸다. 알 수 있는 바와 같이, 비록 최초의 PCR 생성물의 수율이 12개의 미처리, 재-수화된 볼 면봉 샘플의 세트 중에서 고도로 가변성이라고 해도(도 6b 내지 도6d), 후속적인 제2 PCR 반응은 12개의 미처리 볼 면봉 시료의 세트 중에서 수율 및 특이성에 있어서 거의 동일한 일련의 증폭된 엑손을 생성하였다(도 6e 내지 6g).
실시예 7
동시에 수개의 유전자에 대해, 정제된 DNA 로부터 다중 PCR
HLA-A와 HLA-DRB1, 및 HLA-B 및 HLA-DRB1에 대한 HLA 유전자자리-특이적인 앰플리콘을 1μl의 전혈 유액(도 7a 및 7b, 7g 및 7h)으로부터 PCR 반응을 통해 FastStart 태크 DNA 폴리머라제를 사용하여 다음 조건하에 생성하였다: 총 25μl의 반응 부피 중의 1x PCR 완충액(Mg++ 부재), 1.5mM MgCl2, 0.16mg/ml BSA(분획 V), 0.05μM의 각각의 dNTP, 400nM의 동시에 증폭되는 유전자 각각에 대한 각각의 유전자자리-특이적인 프라이머, 및 1 단위의 태크. 이들 반응을 다음 프로토콜을 사용하여 순환시켰다: 98℃에서 5분 동안 초기 변성에 이어 i)98℃에서 5초 동안 변성, ii) 70℃에서 1분 동안 어닐링, 및 iii) 72℃에서 30초 동안 연장의 35회 주기에 이어, 7분 동안 72℃에서 최종 연장.
분자 생물학 등급 수 속에 1:100으로 희석시킨, 동시에 수행된 HLA-A 및 DRB1 및 또한 동시에 수행된 HLA-B 및 HLA-DRB1의 유전자자리-특이적인 반응으로부터의 생성물(도 7b, 7h)을 후속적인 엑손-특이적인 "내포된" PCR 반응에 대한 주형으로 사용한다(도 7c 내지 7e, 7i 내지 7k). 도 7a 및 7g의 도해에 나타낸 바와 같이, 유전자자리-특이적인 PCR의 희석물을 엑손-특이적인 PCR 반응에 대한 주형으로 사용하였으며, 여기서 HLA-A, HLA-DRB1 또는 HLA-B 엑손만이 증폭되었다. 수행될 수 있는 제2 반응은 HLA-A의 경우 엑손 2 또는 3이거나 HLA-B는 HLA-DRB1으로부터 엑손 2로 동시에 증폭시킬 수 있다. 위에서 언급된 PCR 반응은 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)(캘리포니아주 포스터 시티 소재)의 Amplitaq Gold® DNA 폴리머라제를 사용하여 다음 성분들을 포함하는 100 μl의 반응 부피 속에서 수행하였다: 5μl의 1;100 희석된 유전자자리 특이적인 PCR 생성물, 1 x PCR 완충액 II, 1.5mM의 MgCL2, 0.16mg/ml BSA(분획 V), 0.2mM의 각각의 dNTP, 400nM의 각각의 목적한 프라이머, 및 4 단위의 Amplitaq Gold® DNA 폴리머라제. 주기 조건은 다음과 같다: 94℃에서 2분 동안 초기 변성에 이어 (i) 98℃에서 30초 동안 변성, (ii) 68℃에서 30초 동안 어닐링, 및 (iii) 72℃에서 30초 동안 연장의 40회 주기에 이은 72℃에서 7분 동안 최종 연장 단계. 엑손-특이적인 PCR 프라이머를 시아닌 3 염료로 표지하여 레이저 여기/방사에 의한 양성 하이브리드화 현상의 검출을 프로스캔 어레이(ProScan Array) HT[제조원: 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer), 워싱톤주 왈탐 소재]와 같은 마이크로어레이 스캐너 속에서 촉진하였다. 동시에 증폭된 유전자의 하이브리드화를 수행하며, 여기서 HLA-A 및 HLA-B의 엑손 2 및 3, 및 HLA-DRB1의 엑손 2의 제2 증폭의 생성물을 예비 데이타 수집에 있어서 성공적인 일치 유전형을 수득하는 상응하는 HLA-칩에 대해 하이브리드화할 수 있다(도 7f). 또한, HLA-A 및 HLA-DRB1과 같이 동시에 증폭된 유전자의 제2 PCR의 생성물은 HLA-A 칩 또는 HLA-DRB1 칩에 하이브리드화될 수 있으며, 동일한 것을 HLA-B 및 HLA-DRB1 다중체의 제2 PCR 생성물에 적용한다(도. 7l).
실시예 8
동시에 수개의 유전자에 대하여 미처리의 비정제 대변 물질로부터 DNA 의 다중 PCR
대변의 DNA 보충물의 분석은 대변에서 미생물 다양성, 및 이러한 다양성과 사람 또는 동물 질병 사이의 관계의 임상 및 조사 분석에 매우 중요하게 되어 왔다. 원핵세포 미생물 중에서, 개개 미생물이 이들의 16S 유전자의 서열 및 이로부터 발현된 16S rRNA의 서열내 변이를 기준으로 하여 확인될 수 있다. 16S DNA는 세트로 사용된 경우 진핵세포 16S RNA 유전자 계열의 모든 구성원을 증폭시킬 "보편적인" PCR 프라이머 세트를 사용하여 증폭시킴으로써, 증폭된 DNA가 마이크로어레이에서 서열 분석에 의해 또는 화학적 또는 생화학적 서열분석 방법에 의해 분석될 수 있도록 한다. 이러한 16S DNA 서열 분석이 모든 이러한 방법에 의해 수행되어 시료에서 원핵세포 미생물의 유형의 평가를 수득할 수 있다고 해도, 대변에서 이러한 종류의 분석은 대변 물질로부터의 DNA 정제와 관련된 비용 및 건강 위험으로 인하여, 큰 병원 또는 현장 연구에서 시행하기 어려운 것으로 입증되었다.
통상의 사람 대변의 미생물 함량은 CC당 10+10 내지 10+11개 미생물을 포함함이 잘 공지되어 있으며, 이는 질량당 거의 1%이다. 이러한 매우 높은 세포 밀도를 기준으로 하여, 이들 동일한 샘플 속의 16S 유전자 DNA의 밀도는 따라서, 또한 CC당 10+10 내지 10+11 16S 유전자 분절, 또는 μl당 약 10+7개 카피를 초과할 것이다. 실시예 1 내지 9에 기술된 종류의 탄뎀 PCR 반응은 μl당 약 10ng의 사람 DNA(약 2,000개 카피) 상에서 잘 작용한다. 따라서, 대변내 통상의 미생물 밀도에서, 16S DNA는 미처리 혈액 또는 볼내 면봉에 대해 실시예 1 내지 9에 나타낸 것보다 적어도 1,000배 이상 큰 카피 수 밀도로 나타난다. 따라서, 매우 높은 카피 수를 기준으로 하여, 본원에 기술된 기술을 사용하여 정제되지 않은 대변 물질에 대한 미생물 다양성 분석을 기준으로 한 16S DNA를 수행하는 것도 가능하다.
단계 1. 스틱(stick) 또는 팁(tip)으로 접촉 전달에 의한 대변 약 10μl(약 10mm3) 수득.
단계 2. 약 100μl의 물 속에 대변을 용해.
단계 3. 약 1μl의 희석된 대변 현탁액을 취하여 최초의 16S PCR 반응을 보편적인 16s PCR 프라이머 세트를 사용하여 수행.
단계 4. PCR 반응 #1로부터 최초의 PCR 앰플리콘 생성물 1μl를 취하고 이를 10배 희석한 후, 제1 PCR 반응에 사용된 동일한 보편적인 16S DNA 프라이머 세트, 또는 최초의 반응에서 증폭된 16S PCR 유전자의 서브세트를 표적으로 하는 프라이머 세트를 사용하여 개시할 수 있는 제2 PCR 반응에 대한 주형으로서 희석된 최초의 앰플리콘 혼합물 1 내지 2μl를 적용.
단계 5. 제2 PCR 반응물을 하이브리드화 완충액 속에 희석시키고 원핵세포의 혼합물 속에서 하나의 원핵세포를 구별하는 것으로 알려진 16S 유전자 서열의 변이에 대해 특이적인 프로브를 함유하는 마이크로어레이에 대한 하이브리드화를 통해 분석한다: 결과는 분석 전에 DNA 정제를 우회하는 방식으로 원핵세포 유기체의 세트의 분석을 기준으로 한 16S DNA이다.
본 명세서에서 언급된 어떠한 특허 또는 공보도 본 발명이 속한 당해 분야의 숙련가의 수준을 나타낸다. 또한, 이들 특허 및 공보는, 각각의 개개 공보가 구체적으로 및 개별적으로 참조로 혼입된 경우와 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
당해 분야의 숙련가는, 본 발명이 언급된 목적을 수행하고 목표 및 장점을 수득하기 위해 잘 조정됨을 이식할 것이다. 본원에 기술된 방법, 과정 및 시스템과 함께 본 실시예들은 현재 대표적인 바람직한 양태이며, 예시적이고, 본 발명의 영역을 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 본원의 특허청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 취지 내에 포함되는 본 발명에 대한 변화 및 다른 용도가 본 발명의 숙련가에게 일어날 것이다.
<110> Genomics USA <120> Methods for PCR and HLA Typing Using Raw Blood <130> IPA120534 <150> US 61/281,404 <151> 2009-11-16 <150> US 12/924,301 <151> 2010-09-24 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward HLA-A locus primary primer 1 <400> 1 gcctctgygg ggagaagcaa 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse HLA-A locus primary primer 1 <400> 2 gtcccaattg tctcccctcc tt 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward HLA-B locus primary primer 2a <400> 3 gggaggagcg aggggaccgc ag 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward HLA-B locus primary primer 2b <400> 4 gggaggagag aggggaccgc ag 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward HLA-B locus primary primer 2c <400> 5 gggaggagca aggggaccgc ag 22 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse HLA-B locus primary primer 1 <400> 6 ggaggccatc ccgggcgatc tat 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse HLA-B locus primary primer 3 <400> 7 ggaggccatc cccggcgacc tat 23 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse HLA-B locus primary primer 3a <400> 8 ttctccattc aacggagggc gaca 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse HLA-A locus primary primer 3c <400> 9 ttctccattc aagggagggc gaca 24 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward HLA-DRB1 locus primary primer 1a <400> 10 cttggaggtc tccagaacag g 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward HLA-DRB1 locus primary primer 1b <400> 11 cttagaggtc tccagaaccg g 21 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse HLA-DRB1 locus primary primer 4-xx <400> 12 cacacacaca cacacactca gattc 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> reverse HLA-DRB1 locus primary primer 4-07 <400> 13 cacacacaca accacactca gattc 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> reverse HLA-DRB1 locus primary primer 4-10 <400> 14 cacacacaca cacagagtca gattc 25 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> forward HLA-A exon 2 secondary primer 2b-24 <400> 15 agcctggttc actsctcgyc cccaggctc 29 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> reverse HLA-A exon 2 secondary primer 2a-28 <400> 16 tactacaacc ttgcccgctc tggttgtagt agc 33 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> forward HLA-A exon 3 secondary primer 2b-24 <400> 17 gtgagaacta gtcsgggcca ggttctcaca 30 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> reverse HLA-A exon 3 secondary primer 2b-26 <400> 18 gtaccaggtt cccgtggccc cyggtacc 28 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> forward HLA-B exon 2 secondary primer 2c-20 <400> 19 accctcttga gccgcgccgg kaggagggtc 30 <210> 20 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> reverse HLA-B exon 2 secondary primer 2a-28 <400> 20 tactacaacc ttgcctcgct ctggttgtag tagc 34 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> forward HLA-B exon 3 secondary primer 2a-22 <400> 21 gtgagactta ccggggccag ggtctcaca 29 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> reverse HLA-B exon 3 secondary primer 2a-26 <400> 22 gtaccaggtt cccactgccc ctggtacc 28 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> forward DRB-1 exon 2 secondary primer 3-xx-24 <400> 23 aacgtgcttt ttcgtgtccc cacagcacgt ttc 33 <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> forward DRB-1 exon 2 secondary primer 3-04-24 <400> 24 aacgtgcttt ttcttgtccc cccagcacgt ttc 33 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> forward DRB-1 exon 2 secondary primer 3-07-24 <400> 25 aacgtgcttt tttgtgcccc cacagcacgt ttc 33 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> reverse DRB-1 exon 2 secondary primer 3-xx-20 <400> 26 tgcagctttg ctcacctcgc cgctgcac 28 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> reverse DRB-1 exon 2 secondary primer 3-09-22 <400> 27 tgcagagttg cttacctcgc ctctgcac 28

Claims (40)

  1. DNA를 포함하는 미처리 샘플(raw sample)을 수득하는 단계;
    상기 미처리 샘플에서 제1 PCR을 수행하여 제1 앰플리콘(amplicon)을 생산하는 단계;
    상기 제1 앰플리콘을 희석시키는 단계; 및
    제2 PCR 반응에서 사용된 모든 프라이머가 소모되어 제2 앰플리콘을 생산할 때까지 이에 대한 제2 PCR을 수행함으로써, 미처리 샘플의 목적 DNA를, 원래의 샘플에 포함된 DNA의 양 또는 순도와는 독립적인, 제2 PCR 반응에서의 프라이머 농도에 의해 제한되는 최종의 증폭된 DNA 생성물 농도로 증폭시키는 단계를 포함하는, 목적 DNA를 증폭시키는 방법으로,
    상기 미처리 샘플은 신선하거나 재수화된 것으로, 미가공된 혈액 유체, 건조되고 미가공된 혈액, 신선한 볼 면봉 샘플, 건조된 볼 면봉 샘플, 대변 물질, 질 샘플(vaginal sample) 또는 생명체 또는 비생명체 표면 또는 대상체를 닦아 수득한 샘플을 포함하고,
    상기 프라이머가 서열 번호 15 내지 27로부터의 서열내에 나타낸 서열을 포함하는, 목적 DNA를 증폭시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 미처리 샘플에서 제1 PCR을 유전자 표적의 세트에 대하여 동시에 수행하여 제1 앰플리콘 세트를 생산하는 단계;
    상기 제1 앰플리콘 세트를 희석시키는 단계; 및
    모든 제2 PCR 프라이머가 소비되어 제2 앰플리콘 세트를 생산할 때까지 제2 PCR 반응에 대한 주형의 세트로서 최초의 앰플리콘 생성물의 전체 세트를 사용하여, 이에 대한 제2 PCR을 수행함으로써 DNA를 증폭시키는 단계를 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 5개 미만의 유전자 표적, 10개 미만의 유전자 표적 또는 20개 미만의 유전자 표적이 동시에 증폭되는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 유전자 표적이 HLA-DRB1, HLA-DQA1 및 HLA-DQB1이거나, HLA-DQA1 및 HLA-DQB1이거나, HLA-B 및 KIR인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 유전자 표적이 미토콘드리아 복제 개시점 근처의 2개의 초가변 영역 및 하나 이상의 추가의 미토콘드리아 유전자인 방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기 유전자 표적이 미생물-특이적인 미생물 16S DNA 유전자의 분절이고, 상기 방법이 미처리 샘플 속에서 미생물을 검출하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 하나 이상의 형광단으로 제2 PCR 프라이머를 표지시키는 단계를 추가로 포함하고, 상기 표지는 제2 PCR 반응 전에 프라이머에 대해 수행하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 형광단이 시아닌 염료인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 DNA가 하나 이상의 목적 유전자를 포함하고,
    상기 제2 PCR 반응 후에,
    목적 유전자와 관련된 대립유전자 변이의 서열을 갖는 프로브에 대해 제2 앰플리콘을 하이브리드화하는 단계;
    상기 하이브리드화된 앰플리콘으로부터 형광성 패턴을 검출하는 단계; 및
    상기 형광성 패턴을 기준으로 하여 대립유전자형을 지정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 목적 유전자(들)이 HLA-A 유전자, HLA-B 유전자, HLA-DRB1 유전자, HLA-DQA1 유전자, 또는 HLA-DQB1 유전자인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 제1 PCR용 프라이머가 유전자자리-특이적인 프라이머(locus-specific primer)인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 프라이머가 서열 번호 1 내지 14에 나타낸 서열을 포함하는 방법.
    PCR 반응의 증폭된 생성물내에 함유되어 있는 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제1항에 있어서, 이의 분석을 위한 상기 제2 앰플리콘을 서열분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 분석이 동질성, 개인의 부계, 법의학적 정보, 조직 일치성, 질병 발달에 대한 위험 인자, 또는 의약에 대한 반응 중의 하나 이상을 측정하는 방법.
  18. 삭제
  19. 제1항에 있어서, 상기 DNA가 미토콘드리아 DNA인 방법.
  20. 개인으로부터 미처리 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    상기 미처리 생물학적 샘플에서 제1 역전사 PCR을 수행하여 제1 cDNA 앰플리콘(들)을 생산하는 단계;
    제1 앰플리콘(들)을 희석시키는 단계; 및
    모든 프라이머가 소비되어 제2 앰플리콘(들)이 생산될 때까지 이에 대한 제2 PCR을 수행함으로써 목적 RNA(들)을 증폭시키는 단계를 포함하는, 하나 이상의 목적 RNA를 증폭시키는 방법으로,
    상기 미처리 생물학적 샘플은 신선하거나 재수화된 것으로, 미가공된 혈액 유체, 건조되고 미가공된 혈액, 신선한 볼 면봉 샘플, 건조된 볼 면봉 샘플, 대변 물질, 질 샘플(vaginal sample) 또는 생명체 또는 비생명체 표면 또는 대상체를 닦아 수득한 샘플을 포함하고,
    상기 제1 앰플리콘(들)이 하나 이상의 HLA-A, HLA-B, HLA-DRB1, HLA-DQA1, 또는 HLA-DQB1 cDNA(들)이고, 엑손-특이적인 프라이머가 서열번호 15 내지 27에 나타낸 서열을 포함하는, 하나 이상의 목적 RNA를 증폭시키는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 하나 이상의 형광단을 사용하여 제2 PCR 프라이머를 표지시키는 단계를 추가로 포함하고,
    상기 표지는 제2 PCR 반응 전에 프라이머에 대해 수행하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 형광단이 시아닌 염료인 방법.
  23. 제21항에 있어서, 제2 PCR 반응 후에
    유전자 서열내 목적한 부위에 대해 상보성인 서열을 갖는 프로브에 대해 상기 제2 앰플리콘 또는 앰플리콘(들)의 세트를 하이브리드화하는 단계;
    상기 하이브리드화된 앰플리콘으로부터 형광성 패턴을 검출하는 단계; 및
    형광성 패턴을 기준으로 하여 하나 이상의 유전자(들) 또는 대립유전자형(들)을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 유전자가 하나 이상의 HLA-A 유전자, HLA-B 유전자 또는 HLA-DRB1 유전자, HLA-DQA1 유전자, 또는 HLA-DQB1 유전자 또는 이의 조합인 방법.
  25. 제20항에 있어서, 이의 분석을 위해 상기 제2 앰플리콘(들)을 서열분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 분석이 동질성, 개인의 부계, 법의학적 정보, 조직 일치성, 질병 발달에 대한 위험 인자, 또는 의약에 대한 반응 중의 하나 이상을 측정하는 방법.
  27. 제20항에 있어서, 상기 제2 PCR이 선형 PCR이고, 제2 앰플리콘(들)이 cRNA(들)인 방법.
  28. 제20항에 있어서, 상기 제2 PCR이 실시간 PCR이고, 프라이머가 제1 cDNA 앰플리콘(들)에 대해 특이적인 엑손인 방법.
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 한명 이상의 개인으로부터 미처리 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    유전자 자리 또는 유전자 자리의 정의된 세트에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 상기 미처리 생물학적 샘플에서 제1 PCR을 수행함으로써 제1 앰플리콘 또는 제1 앰플리콘 세트를 생산하는 단계;
    제1 앰플리콘 또는 제1 앰플리콘 세트를 희석시키고 모든 프라이머가 소비되어 제2 PCR 반응으로부터 앰플리콘 세트가 생산될 때까지 유전자 자리내 엑손 또는 엑손들의 세트에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 제2 PCR 반응에 대한 주형으로서 제공되는 앰플리콘(들)을 사용한 제2 PCR을 수행하는 단계로서, 엑손-특이적인 프라이머가 서열 번호 15 내지 27에 나타낸 서열을 포함하는, 제2 PCR을 수행하는 단계;
    상기 제2 PCR 반응으로부터 얻어진 제2 앰플리콘 또는 앰플리콘 세트를 목적 유전자 또는 유전자 세트와 관련된 대립유전자 변이의 서열을 갖는 프로브에 대해 하이브리드화시키는 단계;
    상기 하이브리드화된 앰플리콘 또는 앰플리콘 세트로부터의 시그날을 검출하는 단계; 및
    상기 검출된 하이브리드화 시그날을 기준으로 하여 대립유전자형을 지정하는 단계를 포함하는, 목적 유전자를 대립유전자타이핑(allelotyping)시키는 방법으로,
    상기 미처리 생물학적 샘플은 신선하거나 재수화된 것으로, 미가공된 혈액 유체, 건조되고 미가공된 혈액, 신선한 볼 면봉 샘플, 건조된 볼 면봉 샘플, 대변 물질, 질 샘플(vaginal sample) 또는 생명체 또는 비생명체 표면 또는 대상체를 닦아 수득한 샘플을 포함하는, 목적 유전자를 대립유전자타이핑(allelotyping)시키는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 제1 앰플리콘 또는 앰플리콘 세트가, 샘플을 포함하는 RNA로부터 증폭된 cDNA이고, 제2 PCR이 이에 대해 수행된 선형 PCR 또는 실시간 PCR인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 상기 시그날이 형광성이고, 상기 제2 PCR 프라이머 쌍이 하나 이상의 형광단으로 표지된 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 형광단이 시아닌 염료인 방법.
  35. 제31항에 있어서, 상기 목적 유전자가 하나 이상의 HLA-A 유전자, HLA-B 유전자 또는 HLA-DRB1 유전자, HLA-DQA1 유전자, 또는 HLA-DQB1 유전자 또는 이들의 조합인 방법.
  36. 제31항에 있어서, 상기 유전자자리-특이적인 프라이머가 서열 번호 1 내지 14에 나타낸 서열을 포함하는 방법.
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 제31항에 있어서, 상기 샘플이 현장 환경에서의 집단으로부터의 하나 또는 그 이상의 개체로부터 수집되는 방법.
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