JP4250554B2 - Ｄｎａプローブ設計装置及びｄｎａプローブ設計のための情報処理方法 - Google Patents

Ｄｎａプローブ設計装置及びｄｎａプローブ設計のための情報処理方法 Download PDF

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Description

本発明はいわゆるＤＮＡマイクロアレイ等を用いた核酸配列解析システムに好適なオリゴヌクレオチドプローブの設計技術に関するものである。
従来より、特許文献１または特許文献２にあるように、ＤＮＡマイクロアレイを用いて遺伝子の発現やシークエンスを決定するシステムが知られている。これらの特許文献に開示されたシステムは、ｃＤＮＡをスポットして作成されるＤＮＡマイクロアレイとは異なり、試料とハイブリダイズさせるためのプローブをあらかじめ設計する必要がある。うまく適切なプローブを設計できれば、非常に高い確率で試料の中に存在する塩基配列の断片に対する情報が得られる。
このシステムにおいて、プローブとして用いられる塩基配列の長さは、長くても１００ベース以上になることは珍しく、短いものでは数個の塩基配列からなるものまである。すなわち、上記特許文献で開示されたシステムでは、ｃＤＮＡに比べて非常に短い塩基配列のプローブを用いて特定の塩基配列を捕らえることになる。このため、ＤＮＡ中のプローブとして用いる部分の塩基配列の特異性が非常に高い必要がある。
上記のような特異性の高い部分を選び出すための従来の選択方法では、一般的な配列に対する特異性評価が行われる。例えば、人間のゲノム由来のＤＮＡを対象としたＤＮＡマイクロアレイを作成しようとした場合、人間の全ゲノム塩基配列に対する特異性を調べて、特異性の高い部分をプローブ塩基配列として選んでいた。
特開平１０−２７２０００号公報 特開平１１−１８７９００号公報
しかしながら、従来の選択方法では、非常に似ている塩基配列が検体の中に入っていて、かつ、それら類似した塩基配列があるグループに属する塩基配列と別のグループに属する塩基配列を含む場合、各塩基配列がそのグループに属するかを判定することは非常に困難であるという問題が存在していた。より具体的には、感染症などの判定を行う際に、同種の菌の別種類の株のＤＮＡ塩基配列には同じようなハイブリ強度を示し、かつ、別の種の菌のＤＮＡ塩基配列には異なるハイブリ強度を示すようなプローブを見つけ出すことが非常に困難であるという問題があった。
また、従来の方法では、非常に似ている塩基配列の中で、生物種に特異的な場所、かつ、多型には共通な場所を探そうとする場合、マルチプルアラインメントなどの方法を用いて、対象としている生物種の全ての多型の塩基配列を揃えて表示し、人間が目で見て妥当な部分を選んでいた。この従来法では、人間のミスが混入したり、人によるバラツキが生じていた。
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、正確かつ、再現性のあるプローブ設計を可能とすることを目的とする。
上記の目的を達成するための本発明によるＤＮＡプローブ設計のための情報処理方法は以下の工程を備える。即ち、
情報処理装置によるＤＮＡプローブ設計のための情報処理方法であって、
第１カウント手段が、ターゲットの塩基配列データを含む第１の塩基配列データ群について、設定された塩基数の部分塩基配列を前記ターゲットの塩基配列データの一端から他端まで順次に取り出すことにより前記第１の塩基配列データ群における複数の部分塩基配列を取得し、前記複数の部分塩基配列の各々の出現数をカウントすることにより得られた第１の頻度情報をメモリに記憶する第１カウント工程と、
第２カウント手段が、前記第１の塩基配列データ群とは区別されるべき第２の塩基配列データ群について、前記複数の部分塩基配列の各々の出現数をカウントすることにより得られた第２の頻度情報をメモリに記憶する第２カウント工程と、
表示手段が、前記第１及び第２カウント工程によってメモリに記憶された前記第１及び第２の頻度情報に基づいて、各部分塩基配列の頻度を前記ターゲットの塩基配列の順に並べてそれぞれをグラフ表示する表示工程と、
出力手段が、前記複数の部分塩基配列の少なくとも一つを指示するユーザの指示操作に応じて、指示された部分塩基配列の情報を出力する出力工程とを備える。
また、上記の目的を達成するための本発明の態様によるＤＮＡプローブ設計のための情報処理方法は、
情報処理装置によるＤＮＡプローブ設計のための情報処理方法であって、
第１カウント手段が、ターゲットの塩基配列データを含む第１の塩基配列データ群について、設定された塩基数の部分塩基配列を前記ターゲットの塩基配列データの一端から他端まで順次に取り出すことにより前記第１の塩基配列データ群における複数の部分塩基配列を取得し、前記複数の部分塩基配列の各々の出現数をカウントすることにより得られた第１の頻度情報をメモリに記憶する第１カウント工程と、
第２カウント手段が、前記第１の塩基配列群とは区別されるべき第２の塩基配列データ群について、前記複数の部分塩基配列の各々の出現数をカウントすることにより得られた第２の頻度情報をメモリに記憶する第２カウント工程と、
出力手段が、前記第１カウント工程で得られた前記第１の頻度情報と前記第２カウント工程で得られた前記第２の頻度情報とに基づいて部分塩基配列を抽出し、抽出された部分塩基配列に基づいてプローブ候補の塩基配列を決定し、前記第１および第２の頻度情報とともに、各部分塩基配列の頻度を前記ターゲットの塩基配列の順に並べた時の該プローブ候補に対応する部分塩基配列に隣接する部分塩基配列の第１及び第２の頻度情報を出力し、更に該プローブ候補に対応する部分塩基配列の前記ターゲット塩基配列上の位置情報及び配列情報を出力する、出力工程とを備える。
本発明によれば、正確かつ、再現性のあるプローブ設計が可能となる。
以下、添付の図面に基づいて本発明の好適な実施形態を説明する。
＜第１実施形態＞
［プローブ設計方法の説明］
図２は第１実施形態によるプローブ設計方法が適用される情報処理装置の構成を示すブロック図である。本実施形態のプローブ設計方法は、外部記憶装置２０１、中央処理装置（ＣＰＵ）２０２、メモリ２０３、入出力装置２０４から構成される装置に実装される。すなわち、一般的なパーソナルコンピュータ、ワークステーション等に実装可能である。
図２において、外部記憶装置２０１は、本実施形態のプローブ設計方法を実現するプログラムや、各種塩基配列データ及びパラメータ（ＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）プローブ長や融解温度等）を保持する。また、本実施形態によって選択されたプローブ配列そのものを保持する機能を持つ。中央処理装置（ＣＰＵ）２０２はプローブ設計のプログラムを実行したり、すべての装置の制御を行なったりする。メモリ２０３は中央処理装置（ＣＰＵ）２０２が使用するプログラム、及びサブルーチンやデータを一時的に記憶する。入出力装置２０４は、ディスプレイ、キーボード、ポインティングデバイス等を含み、ユーザとのインタラクションを行う。多くの場合、本実施形態のプローブ設計方法を実現するプログラム実行のトリガはこの入出力装置を介してユーザが出す。また、ユーザが結果を見たり、プログラムのパラメータ制御をこの入出力装置を介して行う。
図１は、第１実施形態によるプローブ設計方法の処理手順を説明するフローチャートである。１０１は自己塩基配列データであり、例えばターゲット塩基配列１０７がある特定の菌の特定株の塩基配列であった場合、ターゲット塩基配列１０７と同種の菌の種々の株が有する塩基配列のデータからなる。１０２は自己頻度テーブル作成ステップであり、自己塩基配列データ１０１に含まれる部分塩基配列の頻度をカウントして自己頻度テーブルを作成する。１０３はターゲット塩基配列と競合する競合塩基配列データであり、自己塩基配列データ１０１の菌種とは異なる種々の菌種の種々の株が有する塩基配列のデータからなる。１０４は競合頻度テーブル作成ステップであり、競合塩基配列データ１０３に含まれる部分塩基配列の頻度をカウントして競合頻度テーブルを作成するステップである。
１０８はプローブ評価ステップであり、自己頻度テーブル１０５と競合頻度テーブル１０６を用いて、ターゲット塩基配列１０７からプローブ候補を導き出す。１０９はプローブセット選択ステップであり、プローブ評価ステップ１０８の結果得られたプローブ候補から、より適切なプローブ候補のセットを選択する。なお、プローブセット選択ステップ１１０におけるプローブ候補の選別方法については後述するが、例えば、（１）塩基配列長、（２）融解温度、（３）２次構造の生成可能性、（４）塩基配列の類似性を利用して選別される。１１０は最終的に得られた最適プローブを示す。なお、
図１に示すプローブ設計処理において、入力はターゲット塩基配列１０７であり、出力は最適プローブ１１０である。
図１の各データ及び処理について詳述する前に、本発明のバックグラウンドとなる知識を説明する。図３はＤＮＡマイクロアレイ上のハイブリダイゼーション（以降、ハイブリと略す場合がある）の様子を示した図である。生体内でほとんどの場合、ＤＮＡ塩基列は２重らせん構造をしていて、その２本鎖の間の結合は塩基間の水素結合で実現されている。一方、ＲＮＡ塩基列は１本で存在する場合が多い。塩基の種類はＤＮＡの場合はＡＣＧＴの４種類、ＲＮＡの場合はＡＣＧＵの４種類であり、それぞれ水素結合ができる塩基対はＡ−Ｔ（Ｕ）、Ｇ−Ｃのペアとなっている。ハイブリダイゼーションとは、１本鎖状態の核酸分子同士がある部分の塩基配列を介して部分的に結合する状態をいい、本実施形態で想定している反応は、図３の上側の基板にくっついた核酸分子（プローブ）の方が下側の資料中にある核酸分子より短い。よって、資料中に存在する核酸分子がプローブ塩基配列を含む場合は、このハイブリダイゼーション反応はうまくいき、試料中のターゲット核酸分子はトラップされることとなる。
次に、図４を用いて感染症の菌を特定するＤＮＡマイクロアレイの原理を説明する。図４で示したＤＮＡマイクロアレイは、例えば、黄色ブドウ球菌を特定する目的で作られていると仮定する。図４の左側は、黄色ブドウ球菌野生株由来の処理系列であり、右側は大腸菌野生株由来の処理系列である。例えば、左側は黄色ブドウ球菌に感染した患者の血液を処理する流れで、右側は大腸菌に感染した患者の血液を処理する流れだと考えてよい。
どちらも基本的には同じ処理を行う。つまり、まず初めに例えば菌感染患者の血液や、痰などからＤＮＡを抽出する（４０１、４１１）。この際に、一般的には、患者の体細胞由来の人間のＤＮＡも含まれる可能性がある。抽出されたＤＮＡが少ない場合、ＰＣＲなどの方法で増幅を行う。この際に蛍光物質もしくは蛍光物質を結合させることができる物質を標識として混入させるのが一般的である（４０２、４１２）。
増幅をしない場合は、抽出されたＤＮＡを用いて、相補鎖を作りながら蛍光物質もしくは蛍光物質を結合させることができる物質を標識として混入させる、または、そのまま直接抽出されたＤＮＡに蛍光物質もしくは蛍光物質を結合させることができる物質を標識として付加させる（４０３、４１３）。
通常、ＰＣＲ増幅を行う場合、感染症の菌特定が目的であれば、いわゆる16sといわれるリボゾームＲＮＡ（16s rRNA）を構成する塩基配列の部分を増幅するのが一般的である。この場合、図４の左側の黄色ブドウ球菌のＰＣＲプライマーと右側の大腸菌のＰＣＲプライマーはほとんど同じものを使うこととなる。より具体的には、どんな菌の16s rRNAをコーディングしている部分でも増幅させることができるプライマーセットを用いて、マルチプレックスＰＣＲを行うことが好ましい。この場合、結果的に、図４における右と左のどちらのハイブリ溶液（４０４、４１４）も複数の種類の塩基配列を含むものとなる。この理由は図５を参照して詳しく述べる。
これに対して、より詳しい塩基配列解析を行いたい場合は、例えば、黄色ブドウ球菌用のＰＣＲプライマーセット、大腸菌用のＰＣＲプライマーセットを別々に設定する。この場合、仮に菌のゲノムの特定部分だけを選択的に増幅するようにプライマーを設定すれば、ハイブリ溶液に含まれる塩基配列の種類は非常に限定される。それでも通常、自然界に存在する菌の株は数種類に及ぶので、ハイブリ溶液に存在する塩基配列の種類が１種類となることは稀である。
ここで黄色ブドウ球菌を判定する目的のために設計されたＤＮＡマイクロアレイが正しく動作するならば、ハイブリ溶液４０４ではスポットがポジティブに反応し（４０５）、右側のハイブリ溶液４１４では、スポットがネガティブに反応する（４１５）。
これと全く同じように、大腸菌の存在を判定する目的のために設計されたＤＮＡマイクロアレイが正しく動作するならば、ハイブリ溶液４０４ではスポットがネガティブに反応し、ハイブリ溶液４１４ではスポットがポジティブに反応する。もちろん、いろんな菌に対してそれぞれ特異的に反応する数種類のスポットを同時に並べたＤＮＡマイクロアレイを用いて、感染菌の判定を行ってもかわまない。
次に、図５を用いて、図４のハイブリ溶液に複数の種類の塩基配列が存在する理由を説明する。通常、自然界に存在する菌は、突然変異を頻繁に起こす。その結果、淘汰を経て生き残った主要な数種類の株が同時に存在することがある。例えば、院内感染などで問題を起こす菌株は、通常は薬剤耐性がないはずの菌が、突然変異を起こすことによって薬剤耐性を獲得することで出現する。薬剤耐性を獲得した結果、殺菌努力を行っている衛生的な環境でも旺盛な繁殖力を持つ菌が出現したりする。このように、自然界に存在する同一の菌の塩基配列は、数種類のバリエーションをもつと考えるのが妥当である。
図５に示したのは、黄色ブドウ球菌にMu50とMW2の２種類の株のゲノム構造である。それぞれの株のゲノムの総塩基数はそれぞれ2,878,040と2,820,462と異なっている。なお、図５では、左から右への方向を５’末端から３’末端方向とし、これを順方向として塩基配列が示されている。更に16sのリボゾームＲＮＡ（16s rRNA）をコーディングしている部位は、Mu50の場合は順方向２箇所、逆方向３箇所の合計５箇所であるのに対して、MW2では順方向３箇所、逆方向３箇所の合計６箇所存在する。これらの16s rRNAの各部位の塩基配列はそれぞれ非常に似ているが、全く同じではない。つまり、調べようとている菌感染患者の体の中に存在する菌の株の種類がたとえ１種類であったとしても、図４のような一般的な処理でハイブリ溶液を調製すると複数種類の塩基配列がハイブリ溶液の中に存在することになる。この複数の塩基配列に対して同じようなハイブリ強度を示すプローブを設計することが本実施形態のプローブ設計方法の目的である。
この目的を達成するために本実施形態のプローブ設計方法は、図１に示した通り、ターゲット塩基配列と同じグループに属する塩基配列のセット（自己塩基配列データ１０１）と、そのグループに競合するグループに属する塩基配列のセット（競合塩基配列データ１０３）から別々に頻度テーブルを作成する。図４の例で言うと、例えば黄色ブドウ球菌の色々な株の色々な部位の16s rRNAの塩基配列の集合が自己塩基配列データ１０１となり、黄色ブドウ球菌以外の例えば大腸菌や、インフルエンザ菌などの種々の菌の色々な株の色々な部位の16s rRNAの塩基配列の集合が競合塩基配列データ１０３となる。
これらの塩基配列データから頻度テーブルを作成する様子を図６に示す。頻度テーブルの作成においては、塩基配列データに含まれる長さｎ（図６ではｎ＝９）の部分配列の出現回数をカウントする。長さｎの塩基配列のバリエーションは４のｎ乗なので、図６において、行の数は４nとなる。なお、図６において出現頻度が低いほど、その部分配列の特異性は高くなるので、例えば頻度にマイナス１をかけた数を特異性とする。
すなわち、自己頻度テーブル作成ステップ１０２は検出対象の菌種の種々の株の16s rRNAの塩基配列を記憶する自己塩基配列データ１０１を参照して、長さｎの全ての部分塩基配列について出現回数をカウントし、その結果を図６の如くテーブル化し、自己頻度テーブル１０５とする。同様に、競合頻度テーブル作成ステップ１０４は検出対象の菌種以外の菌種（検出対象から区別されるべき菌種）の種々の株の16s rRNAの塩基配列を記憶する競合塩基配列データ１０１を参照して、長さｎの全ての部分塩基配列について出現回数をカウントし、その結果を図６の如くテーブル化し、競合頻度テーブル１０６とする。
次に、図１のターゲット塩基配列１０７に対する部分列（ｎ個の塩基からなる塩基配列）の頻度または特異性を上記頻度テーブルを用いて求める。この様子を示したのが図７である。このターゲット塩基配列１０７は、例えば、図５におけるMu50株の黄色ブドウ球菌の一番左の16s rRNAコーディング部位（配列Ｘ）などとなる。プローブ評価ステップ１０８では、自己頻度テーブル１０５及び競合頻度テーブル１０６を参照して、ターゲット塩基配列１０７から順次得られる部分列の頻度（特異性）を取得し、評価する。この様子をグラフに示したのが図８である。
図８の横軸はターゲット塩基配列の部分配列の位置であり、例えば16s rRNAの部分を調べたいとすれば、その長さは約１５００程度となる。縦軸は、その位置における部分配列の特異性であり、例えば頻度テーブルの値にマイナス１をかけた数である。図８において、上段に示したグラフが図１における競合頻度テーブル１０６を元に導いた特異性を表し、下段に示したグラフが図１における自己頻度テーブル１０５を元に導いた特異性を表す。
例えば、図８のグラフの場合、配列の先頭から約２／３の部分、つまり約１０００ベースぐらいの位置で、このターゲット塩基配列の特異性の高い部分が存在する。例えば、このターゲット塩基配列が図５のMu50株の最初の16s部分（配列Ｘ）だったとすると、この配列Ｘの1000ベースあたりの位置で、この配列に特有の塩基配列が存在し、それは、Mu50株のその他の16sの部位、または、黄色ブドウ球菌のMu50株以外の株の16s rRNA部位とは異なる配列であることを意味する。よって、この部分からプローブ候補を選択することは、好ましくない。また、上段のグラフにおいて特異性の低い部分は、他の種の菌との識別ができないことを意味しており、その部分からプローブ候補を選択することも好ましくない。
したがって、上段のグラフで山となっており（異種菌間で特異性が高い）、かつ下段のグラフで山となっていない部分（同種菌の異種株間で特異性が低い）よりプローブ候補を選択する。このことで、判定するべき菌とは異なる菌種に対しては特異性が高く（＝頻度が低く）、判定するべき菌の色々な変異体に対しては特異性が低い（頻度が高い）プローブを選ぶことができる。すなわち、図８のように、各特異性を複数の部分塩基配列を基準に対比可能に表示することにより、ユーザは容易に適切なプローブ候補を選択できる。
この結果、同じ菌であれば、どのような株のどのような部位の16s rRNAコーディング配列がハイブリ溶液に含まれていても強いハイブリ反応を示し、かつ、他の菌のどのような株のどのような部位の16s rRNAコーディング配列がハイブリ溶液に含まれていても弱いハイブリ反応を示すプローブが選ばれることとなる。
なお、本発明のプローブ設計方法は、感染症の判別にのみ適用できるものではなく、一般的に同一と判断するべき塩基配列の対象の中に若干のバリエーションが存在するものなら何でも適用できる。例えば人間の個体判別によく用いられるＭＨＣなどの判定などにも適用できる。
次に、図１のプローブセット選択ステップ１０９について説明する。図１のプローブ評価ステップ１０８で高い評価を得たプローブの中で、長さを揃えてプローブセットとするのが一番単純なプローブセット選択の方法である。しかしながら、ハイブリダイゼーション反応はプローブ塩基配列の長さよりも、その融解温度で決まる場合が一般的である。よって、例えば標準プローブ長ｎ（本例ではｎ＝２４とする）を設定しておいて、その長さの前後数塩基の許容範囲（本例では±２とする）より得られる各プローブについて融解温度を求め、出来るだけ融解温度を一定にするように採用すべきプローブを決定することによって、より高い品質のプローブセットが得られる。
なお、塩基配列の融解温度は、その配列の塩基の混入率で求める方法や、いわゆるNearest Neighbor法と呼ばれる連続する２つの塩基配列の並び方から求める方法などが知られており、これらの方法を用いて融解温度を算出することができる。
また、塩基配列の長さが２０を超えてくると、２次構造を形成して、プローブとして適切でない場合が発生する。これを防ぐために、例えばMichael Zuker氏の考案した“Calculating nucleic acid secondary structure.” (Current Opinion in Structural Biology, 10, 303-310, (2000)) に記載の方法などを用いて２次構造形成の可能性を計算し、２次構造を形成しやすいプローブは排除するようにしてもよい。
また、図１のプローブ評価ステップで説明した頻度テーブルを用いる方法は、あくまで特異性の目安としてプローブ候補を選ぶ方法であるので、実際に選ばれたプローブ群が似かよったものとなる可能性がある。したがって、プローブ候補がどの程度お互いに似ているかを、お互いのマッチングを取ることで調べ、似かよったプローブ候補を排除することが好ましい。例えば、Ｎ個のプローブ候補からプローブセットを選択するとすると、Ｎ（Ｎ−１）／２個のマッチングを取り、プローブ同士の塩基配列がお互いにどれぐらい異なっているかを評価して、異なる塩基数がより多いプローブセットを選ぶようにする。このことによって、より高い品質のプローブセットを選択することができる。なお、この方法は、いわゆるクロスハイブリダイゼーションを防ぐ方法と呼ばれる。
［プローブ設計装置のより詳細な説明］
図９〜図１１を用いて第１実施形態のプローブ設計プログラムの動きを説明する。プローブ設計プログラムの動作はまずターゲット生物グループの選定（９０１）から始まる。例えば、感染症の原因菌特定のためのプローブを設計しようとしたとすると、ターゲット生物グループが、菌やウィルス、真菌などのゲノム情報が塩基配列データベース９０６から選ばれる。図９において、塩基配列データベース９０６は、ＮＣＢＩなどの公共のデータベースや、自社のイントラネット上に構築された塩基配列データベースなどで、現在入手可能な最大量のデータが蓄積されたものを意味する。一方、ターゲット塩基配列データベース９０７は、ターゲット生物グループの選定（９０１）で選ばれた生物種のゲノム情報しか含まない。例えば、本プログラムを人間の体質判定のためのプローブ設計に適用した場合は、ターゲット塩基配列データベース９０７に格納される塩基配列は、例えばＭＨＣのＤＲＢ１の部分の全アレルの情報などとなる。
次に、ターゲット生物種の選定を行う（９０２）。ターゲット生物種を選定すると、ターゲット塩基配列データベース９０７に含まれる塩基配列が自己塩基配列データと競合塩基配列データに分けられる。すなわち、ターゲット塩基配列データベース９０７に含まれる情報から、ターゲット生物種の複数の多型、複数のゲノム部位に対応する自己塩基配列データ９０８が抽出されるとともに、ターゲット塩基配列データベース９０７に含まれる、ターゲット生物種以外の生物種の複数の多型、複数のゲノム部位に対応する競合塩基配列データ９０９が抽出される。
次に、選ばれたターゲット生物種を元に自己頻度テーブル９１０（図１の自己頻度テーブル１０５に相当）と競合頻度テーブル９１１（図１の競合頻度テーブル１０６に相当）を作成する（９０３）。この頻度テープルの作成（９０３）のとき、通常は、ターゲットとするゲノム領域も設定する。例えば菌種の判別を行うプローブを設計する場合には、16s rRNAの部分が選ばれたりする。
より具体的に述べると、図４で述べたとおり、通常、ＤＮＡマイクロアレイを用いた実験を行う場合、ＰＣＲでターゲットとなる核酸を増幅する。この時、ＰＣＲプライマーで挟んだ領域のみが増幅されるので、ターゲット塩基配列データベース９０７の中のＰＣＲで増幅される部分のみを用いて頻度テーブルを作成する。本プログラムを人間の体質判定のためのプローブ設計に適用した場合は、例えばターゲットとするＤＮＡ領域もＭＨＣのＤＲＢ１の部分などに予め設定されるので、このＤＮＡ領域を設定する必要はない。また、例えばＭＨＣのＤＲＢ１の解析であれば、たんぱく質発現に差を示さない３桁までのアレルを同一種として扱う。なお、ターゲットとする核酸領域、またはＰＣＲ増幅領域の指定は、通常、プログラムのプロパティとして設定し、ＵＩ（ユーザインターフェース）を使ってその都度設定することはない。
次にターゲット塩基配列の選定を行い（９０４）、そのターゲット塩基配列の部分列群の特異性を自己頻度テーブル９１０と競合頻度テーブル９１１を用いて評価し、プローブを選定する（９０５）。
図１０は、ターゲット生物種の選定（９０２）からターゲット塩基配列の選定（９０４）までを行うユーザインターフェースの例を示したものである。まず、ターゲット菌種欄１００１にターゲット菌種としての菌の一覧が表示される。ここで、例えば黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）を選ぶと、株表示欄１００２に黄色ブドウ球菌の色々な株の色々な部位の16s rRNAを示す一覧が表示される。ここまでのインタラクションで、図９の９０２、９０３（ターゲット生物種の選定と頻度テーブルの作成）が実行される。株表示欄１００２に示されている多型としての複数の株は、図５に示した株である。例えば、図１０のように、株の名前、ゲノム上の位置、方向を示すことによって、それぞれの塩基配列の識別ができるようにする。
株表示欄１００２の一覧の中で１つの配列を選ぶと、ターゲット塩基配列の選定（９０４）が実行される。図１０に示したように黄色ブドウ球菌Mu50株の先頭の16s rRNAを選んだとすると、ターゲット塩基配列として図５の配列Ｘが選ばれたことになる。そして、デザインボタン１００３を押すと、プローブ評価ステップ１０８に処理が移行し、デザイン画面が表示される。
図１１は実際のデザイン画面の例を示した図である。１１０１から１１０４はグラフを示し、横軸は、例えば図１０のようなＵＩで選ばれたターゲット塩基配列の位置を意味し、それぞれのグラフはそのターゲット塩基配列のそれぞれの位置の部分塩基配列に対する値をグラフ化したものである。グラフ１１０２とグラフ１１０３は、それぞれ図８の上段下段のグラフに対応しており、グラフ１１０２はそれぞれの位置の部分配列の競合塩基配列データに対する特異性をグラフ化したもの、グラフ１１０３はそれぞれの位置の部分配列の自己塩基配列データに対する特異性をグラフ化したものとなる。また、グラフ１１０１はそれぞれの位置の部分配列の人間のゲノムに対する特異性を示す。グラフ１１０４はそれぞれの位置の部分配列を先頭とする所定個数の塩基配列（本例では２４個の塩基からなる塩基配列（２４ベースの塩基配列））の融解温度を示す。
図８で説明したように、グラフ１１０２で山になっていて、グラフ１１０３で谷になっている場所でプローブを設定するのがよい。１１０５は情報欄であり、現在のターゲット生物種や各種のパラメータなどを表示する。なお、本実施形態ではデフォルトの塩基長として２４が設定されており、これを基準にグラフ１１０４の融解温度が計算されている。１１０６は、設計したプローブのリストで、その位置は、ライン１１０７（点線）で表示される。１１０８の実線は“カレント”位置を示し、現在注目している位置で、その位置に対応する部分塩基配列（２４ベースの塩基配列）は１１０９に表示され、その直前の部分の塩基配列は１１１０、その直後の部分の塩基配列は１１１１に表示される。本実施形態では前後１０個の塩基からなる配列が示される。
また、図１１のＵＩでは、１１１２に示すように、ターゲット塩基配列の中で塩基配列を検索する機能を持っている。
また、例えば、感染症の原因菌を特定するプローブを設計する場合は、人間のゲノムも含まれてくるので、例えばグラフ１１０１に示すように、人間のゲノムに対するターゲット塩基配列の部分配列の特異性を表示してもよい。また、プローブを設定するために実施例１で説明したように融解温度（Ｔｍ）を選択したプローブ間で出来るだけ似通った温度にする方がいい。これを実現するために、例えばグラフ１１０４では、その位置の部分塩基配列のＴｍをグラフとして表示する。
プローブ評価ステップ１０８では、グラフ１１０１〜１１０４を参照してユーザが指示した実線１１０８の移動に応じてプローブ候補の評価を行なう。このとき、例えば、実線１１０８を移動させていく間に指定可能な位置（グラフ１１０３において特異性がある第１の閾値よりも低く、グラフ１１０２において特異性がある第２の閾値よりも高い部分）に入った際にこれをユーザに報知する（例えば、実線１１０８の色を変える等）ように構成する。このようにすれば、ユーザはより容易に適切な部分塩基配列を見つけることができる。そして、実線１１０８が上記指定可能な位置にある間に、不図示の確定ボタンを押すことにより、当該位置に対応した部分塩基配列がプローブ候補として設定される。こうして設定されたプローブ候補はさらにプローブセット選択ステップ１０９でさらに絞り込まれ、適切なプローブセットが決定される。
なお、上記プローブ評価ステップ１０８において、グラフ１１０３で特異性が低く、グラフ１１０２で特異性が高い部分を自動的に抽出してユーザに提示するようにしてもよい。例えば、グラフ１１０３において特異性がある第１の閾値よりも低く、グラフ１１０２において特異性がある第２の閾値よりも高い部分を抽出してユーザに提示する。なお、上記で設計された塩基配列の相補的な配列も同様にプローブとして用いることができるので、これらを併せて表示する、或いは設計結果として提示するようにしてもよい。
＜第２実施形態＞
第１実施形態では、図１１のように頻度情報を表示して、ユーザに適切な位置を選択させている。このように頻度情報を用いることで、ユーザは容易に適切なプローブ候補を選択できるのであるが、一般にマイクロアレイに設定するプローブの数は数百から数千と膨大である。よって、このような全てのプローブを頻度情報を元にしてユーザが設定していくのは、大変な時間と手間がかかることにもなりうる。また、第１実施形態で述べたように、単純に特異性の値を閾値と比較することにより自動的に部分塩基配列を抽出することもできる。しかしながら、この場合、（１）塩基長の全体に渡ってサーチとは多大な計算時間が必要となる、（２）類似した塩基配列が数多く抽出される可能性がある、（３）よって、塩基長の全体に渡って、適度に分散した位置から部分塩基配列を抽出することが困難である、といった課題がある。
そこで、第２実施形態においては、上記の課題を解決するプローブ設計の自動化方法について説明する。
第２実施形態によるプローブ設計方法が適用される情報処理装置の構成は第１実施形態（図２）と同様である。
図１２は、第２実施形態によるプローブ設計方法の処理手順を説明するフローチャートである。第１実施形態（図１）と同様のステップ及びデータには同一の参照番号を付してある。
１２０１は全塩基配列データであり、実際には自己塩基配列データ１０１と競合塩基配列データ１０３の集合である。１２０２は共通配列データ作成ステップであり、全塩基配列データ１２０１に含まれる全ての塩基配列において共通する部分塩基配列を抽出し、共通領域データ１２０３を作成する。なお、共通する部分塩基配列は所定数以上の塩基からなる塩基配列（例えば２０ベース以上の塩基長）であって、全ての塩基配列中に含まれるものを検索することにより得られたものとする。また、このよう共通領域は、例えば、マルチプルアライメント処理により得ることができる。
１２１１はプローブ評価ステップであり、自己頻度テーブル１０５と競合頻度テーブル１０６と共通領域データ１２０３を用いて、ターゲット塩基配列１０７からプローブ候補を導き出すステップである。プローブセット選択ステップ１２１２は、プローブ評価ステップ１２１１の結果得られたプローブ候補より最適なプローブセットを選択する。１２１３は最終的に得られた最適プローブを示す。なお、図１２に示すプローブ設計処理において、入力はターゲット塩基配列１０７であり、出力は最適プローブ１２１３である。
ここで、本実施形態による自動プローブ設計について概要を説明する。プローブ設計の自動化のために、本実施形態では共通領域データ１２０３を利用する。共通領域データ１２０３は、共通領域データ作成ステップ１２０２により作成される。
共通領域データ作成ステップ１２０２では、自己塩基配列データ１０１と競合塩基配列データ１０３を合わせた全塩基配列データ１２０１を対象に、全塩基配列において共通に存在する部分配列を探し、その配列における位置と長さとを共通領域データ１２０３として保持する。例えば、細菌の16s rRNAにおいては、共通に存在する部分配列が似通った位置に存在することが分かっている。
ターゲット塩基配列１０７について共通領域データ１２０３を参照すると、図１３のように、ターゲット塩基配列を意味する１３０１上では、共通領域１３０２、１３０３…１３０６…、とそれらの共通領域に挟まれた領域１３１２、１３１３、…、１３１５…とを区別することが可能になる。この共通領域に挟まれた各領域において、自己頻度テーブル１０５と競合頻度テーブル１０６とを参照することで、同種菌の異種株間での特異性が低くかつ異種菌間で特異性の高くなる位置を一箇所選択する。ターゲット塩基配列１３０１上には、共通領域は複数箇所あり、よって共通領域に挟まれている領域も複数存在するため、共通領域に挟まれている領域のある限り、同様の処理を機械的に繰り返すことで、ターゲット塩基配列１３０１の全長に渡ってプローブを設定することが可能となる。以上の処理については、複数の菌種に渡って多数のターゲット塩基配列１０７がある場合でも機械的に処理することが可能であり、よってコンピュータによる自動化が可能である。
なお、本実施形態のプローブ設計方法は、第１実施形態と同様に、感染症の判別にのみ適用できるものではなく、一般的に同一と判断するべき塩基配列の対象の中に若干のバリエーションが存在するものなら何でも適用できる。例えば人間の個体判別によく用いられるＭＨＣなどの判定などにも適用できる。
また、共通領域データ作成ステップ１０６を通して作成された共通領域データ１０９は、多種の遺伝子を共通して増幅させることができるＰＣＲ用のユニバーサルプライマとしての利用も可能である。
［プローブ設計装置のより詳細な説明］
図１４〜図１６を用いて第２実施形態のプローブ設計プログラムの動きを説明する。１４において第１実施形態（図９）と同様の処理及びデータについては同一の参照番号を付してある。図９に関して上述したように、ターゲット生物グループの選定（９０１）では、設計しようとするプローブに応じて選定されたターゲット生物グループに属する、菌やウィルス、真菌などのゲノム情報が塩基配列データベース９０６から選ばれ、ターゲット塩基配列データベース９０７に格納される。
次に、ターゲット生物種の選定（９０２）により、ターゲット塩基配列データベース９０７に含まれる塩基配列が自己塩基配列データと競合塩基配列データに分けられる。すなわち、ターゲット塩基配列データベース９０７に含まれる情報から、ターゲット生物種の複数の多型、複数のゲノム部位に対応する自己塩基配列データ９０８が抽出されるとともに、ターゲット塩基配列データベース９０７に含まれる、ターゲット生物種以外の生物種の複数の多型、複数のゲノム部位に対応する競合塩基配列データ９０９が抽出される。
次に、選ばれたターゲット生物種を元に自己頻度テーブル９１０と競合頻度テーブル９１１を作成する（９０３）。この頻度テープルの作成（９０３）のとき、通常は、ターゲットとするゲノム領域も設定する。例えば菌種の判別を行うプローブを設計する場合には、16s rRNAの部分が選ばれたりする。
頻度テーブルの作成（９０３）とともに、共通領域データ９１３（図１２の共通領域データ１２０３に相当）を作成する（９２１）。即ち、ターゲット塩基配列データベース９０７に保持されている全ての塩基配列（９１２）に共通する部分配列の情報が共通領域データ９１３に格納される。頻度テーブルの作成については第１実施形態で詳述したとおりである。次にターゲット塩基配列の選定を行い（９２２）、そのターゲット塩基配列の部分列群の特異性を自己頻度テーブル９１０と競合頻度テーブル９１１と共通領域データ９１３を用いて評価し、プローブを選定する（９２３）。
図１５は、ターゲット生物種の選定（９０２）からターゲット塩基配列の選定（９２２）までを行なうユーザインタフェースの例を示したものである。まず、ターゲット菌種欄１５０１にターゲット菌種としての菌の一覧が表示される。ここで、例えば黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）を選ぶと、塩基配列の表示欄である１５０２に黄色ブドウ球菌の種々の株の色々な部位の16S rRNAの塩基配列が一覧として表示される。ユーザはこの１５０２の表示欄から所望の株の所望の部位を選択できる。ここまでのインタラクションで、図１４の９０２、９０３、９２１（ターゲット生物種の選定と頻度テーブル及び共通領域データの作成）が実行される。
例えば黄色ブドウ球菌であっても、図５に示すように、株ごとに複数の部位に16S rRNA領域があることから、任意の株における任意の位置の16S rRNA領域を選択可能にするために、表示欄１５０２にて選択された塩基配列に関する情報を表示欄１５０３に表示する。表示欄１５０３のように株名称、ゲノム上の位置の情報などを示すことにより、それぞれの塩基配列の識別が可能である。また、表示欄１５０３には、GIやACCESSION番号のような公共データベースにおいて一意に定められている識別番号を表示したり、同時にその識別番号から公共データベースの情報を表示できるような仕組を備えても良い。
塩基配列表示欄である１５０２は、複数の塩基配列の位置を調製して（例えば、マルチプルアライメント処理）して、表示しても良い。また、塩基配列表示欄である１５０２は、各塩基配列における共通領域に相当する部分を、色やフォントなどを変更することによって強調表示してもよい。
塩基配列を表示する表示欄１５０２の一覧の中で一つの配列を選ぶと、ターゲット塩基配列の選定（９２２）が実行される。図１５に示したように黄色ブドウ球菌Mu50株の先頭の16s rRNAを選んだとすると、ターゲット塩基配列として図５の配列Ｘが選ばれたことになる。そして、デザインボタン１００４を押すと、図１６に示すようなデザイン画面が表示される。
図１６は本実施形態によるデザイン画面の例を示した図である。インターフェースの構成は第１実施形態（図１１）とほぼ同様であり、同様の構成要素には同一の参照番号を付してある。
１１０１から１１０４はグラフを示し、横軸は、例えば図１５のようなＵＩで選ばれたターゲット塩基配列の位置を意味する。図１１で上述したように、グラフ１１０２はそれぞれの位置の部分配列の競合塩基配列データに対する特異性をグラフ化したもの、グラフ１１０３はそれぞれの位置の部分配列の自己塩基配列データに対する特異性をグラフ化したものである。また、グラフ１１０１はそれぞれの位置の部分配列の人間のゲノムに対する特異性を示す。グラフ１１０４はそれぞれの位置の部分配列を先頭とする所定個数の塩基配列（本例では２４個の塩基からなる塩基配列（２４ベースの塩基配列））の融解温度を示す。
先に記したように、図１５のようなＵＩにてターゲット塩基配列を選択した時点で、自己頻度テーブル９１０と競合頻度テーブル９１１と共通領域データ９１３を用いて、プローブの自動設計を行なうことも可能である。その場合は、図１６のデザイン画面には既に作成されているプローブが表示されることとなる。また、作業者によりプローブ位置の編集（追加・削除も含む）も可能である。
グラフ１１０１、１１０２、１１０３に記されているポイント１６０１は、図１４における共通領域データ９１２より導かれる共通領域データ９１３の位置を示している。共通領域の位置を示すポイント１１１４に挟まれているそれぞれの領域内において、グラフ１１０２で山になっていてグラフ１１０３で谷になっている場所を自動的に選択していくことにより、プローブが自動で設定される。なお、ユーザが操作して手動でプローブを設定（部分塩基配列を指定）するマニュアルモードを設けてもよいことは明らかである。このマニュアルモードにおいては、第１実施形態（図８或いは図１１）でも説明したように、グラフ１１０２で山になっていて、グラフ１１０３で谷になっている場所でプローブを設定するのがよい。なお、この場合、ポイント１６０１として表示されている共通領域では部分塩基配列の先頭位置を指定できないように構成してもよい。
１１０５は情報欄であり、現在のターゲット生物種や各種のパラメータなどを表示する。なお、本実施形態ではデフォルトの塩基長として２４が設定されており、これを基準にグラフ１１０４の融解温度が計算されている。１１０６は、設計したプローブのリストで、その位置は、ライン１１０７（点線）で表示される。１１０８の実線は“カレント”位置を示し、現在注目している位置で、その位置に対応する部分塩基配列（２４ベースの塩基配列）は１１０９に表示され、その直前の部分の塩基配列は１１１０、その直後の部分の塩基配列は１１１１に表示される。本実施形態では前後１０個の塩基からなる配列が示される。
なお、上記で設計された塩基配列の相補的な配列も同様にプローブとして用いることができるので、これらを併せて表示する、或いは設計結果として提示するようにしてもよいことはいうまでもない。
サーチボタン１１１２が押されると、ターゲット塩基配列よりプローブに適した部分塩基配列を抽出するべく、探索を開始する。上述しているように、第２実施形態では、自己頻度情報・競合頻度情報・共通領域情報を用いて部分塩基配列を検索し、プローブの自動設計を行う。以下、本実施形態のプローブ自動設計方法について図１７を用いて、さらに詳細に説明する。図１７は、感染症起炎菌用のプローブを、プローブ長を２４±２、融解温度を５０±１度という条件で作成する例である。
ターゲット塩基配列１４０１上に、１４０２〜１４０６までの５箇所の共通領域があるとした場合、まず共通領域１４０２と１４０３の間の領域１４０７でプローブ作成を試みる。共通領域１４０２と１４０３の間の領域１４０７においてプローブ作成に成功しようとしまいと、次の共通領域間の領域（共通領域１４０３と１４０４の間の領域）で同様にプローブ作成を試みる。そして、その次は共通領域１４０４と１４０５の間で、さらにその次は共通領域１４０５と１４０６の間で、というように順番に全ての共通領域に挟まれている間の領域でのプローブ作成を試みる。
プローブ作成の試みの手順は次のとおりである。領域１４０７内で、競合頻度グラフ１４０８から得られる他の菌種の塩基配列に対する特異性を示す指標が高く、かつ、自己頻度グラフ１４０９から得られる同一の菌種の塩基配列に対する特異性を示す指標が低い位置１４１０を抽出する。そして、その位置１４１０を基準に融解温度を調べるための候補となる部分配列群１４１１を作成する。本実施形態では、他の菌種の塩基配列に対する特異性を示す指標が最大の位置を検出し、この位置において同一の菌種の塩基配列に対する特異性を示す指標が所定値よりも低い場合に、候補位置の抽出に成功したものとする。候補位置の抽出に失敗した場合は、次の領域へ処理を移す。そして、ターゲット塩基配列１４０１より、候補位置１４１０を先頭に２４塩基長の部分配列を取り出す。
次に、候補配列作成１４１１において、候補位置１４１０を先頭に取り出した２４塩基長の部分配列に対して、先頭或いは末尾或いは両方に１〜２塩基を追加したり、削除したりすることにより、開始位置、終了位置、塩基長にバリエーションを持つ複数の候補部分塩基配列を作成する。そして、１４１２において、１４１１で得られた複数の候補配列のそれぞれについて融解温度を計算する。そして、１４１３において、想定している温度条件（本例では５０±１度）の範囲内にあり、かつ、想定している温度（本例では５０度）に最も近い融解温度を持つ配列を抽出する。このようにして、共通領域１４０２と共通領域１４０３の間の領域１４０７において、プローブ１４１４を求めることができる。なお、融解温度を計算した結果、１４１１で得られた複数の部分配列の全てについて、設定された条件に合う融解温度とならないことが判明した場合は、共通領域１４０２と共通領域１４０３の間でプローブを作成することをあきらめ、次の共通領域１４０３と共通領域１４０４に挟まれた領域におけるプローブ作成を試みる。
以上、図１７にて説明したプローブの自動設計処理について、図１８のフローチャートを参照してさらに説明する。
図１８は、ターゲット遺伝子の核酸配列を選択後に、その核酸配列からプローブを自動的に選択する手順を示すフローチャートである。図１５に示したフローチャートを、感染症の原因菌の16S rRNAを対象に、２４塩基±２塩基の長さで、融解温度を５０度±１度と設定する例により、以下、説明する。
まず、ターゲット遺伝子の核酸配列の５’側末端から３’側末端に向けて共通領域を探す（ステップＳ１５０１）。共通領域が存在すれば（ステップＳ１５０２）、ターゲット遺伝子の５’側末端から共通領域までの間を、１塩基ずつずらしながら競合頻度テーブルを参照し、競合朱に対して最も特異性の高くなる部分配列の位置を見つけだす（ステップＳ１５０３）。次に、この位置について自己頻度テーブルを参照し同種の塩基配列に対する特異性を調べ（ステップＳ１５０４）、同種の塩基配列に対する特異性が十分に低いと判断される値であるかどうかを判断する（ステップＳ１５０５）。十分に低いと判断する基準は、例えば自己頻度テーブルの各値の平均値より低いかどうか、あるいは、あらかじめ規定する任意の閾値より低いかどうか、等、状況に応じて決めておく。
同一種に対しても特異性の高い部分であると判断される場合は、ステップＳ１５０１に戻り、現在の位置の次にある共通領域より３’側に共通領域があるかどうかを確認する。ステップＳ１５０５にて、自己頻度テーブルから得られる特異性の値が十分に低いと判断された場合は、現在位置を基準に前後に塩基を追加或いは削除して２２〜２６塩基長となる部分配列を作成し（図１７の１４１１）、作成されたそれぞれの部分配列について融解温度を計算する（ステップＳ１５０６）。そして、融解温度が５０度に最も近くなる塩基配列を選び、その融解温度が４９度から５１度の間であればその塩基配列をプローブとする（ステップＳ１５０７〜Ｓ１５０９）。一方、選択した塩基配列の融解温度が４９度〜５１度の範囲に無い場合は、ステップＳ１５０１に戻り、現在の位置の次にある共通領域の、より３’側に共通領域があるかどうかを確認する。
このように、ターゲット塩基配列全体に対して、共通領域で区切った部分ごとに、その中での特異性を計算し、融解温度を計算することで、ターゲット塩基配列全体に分布するプローブセットを作成することができる。
［プローブセットの設計例及び実験例］
次に図１９を用いて、上記実施形態のプローブ設計方法を用いて設計されたプローブを用いたＤＮＡマイクロアレイの実験手順について説明する。
１２０１の“サンプル”とは対象としている核酸が含まれているはずの液体や個体である。例えば感染症の原因菌の特定をする場合、ヒト、家畜等の動物由来の血液、喀痰、胃液、膣分泌物、口腔内粘液等の体液、尿及び糞便のような排出物等細菌が存在すると思われるあらゆる物がサンプルとなる。また、食中毒、汚染の対象となる食品、飲料水及び温泉水のような環境中の水、空気清浄機や浄水器等のフィルタ等、細菌による汚染が引き起こされる可能性のある媒体がサンプルとして用いられることもある。さらに、輸出入時における検疫等の動植物も検体としてその対象となる。
次に、“生化学的増幅”方法を用いてサンプル１２０１を増幅する（１２０２）。例えば感染症の原因菌の特定をする場合、16s rRNA検出用に設計されたＰＣＲ反応用プライマーを用いてＰＣＲ法によって対象核酸を増幅したり、或いはＰＣＲ増幅物を元にさらにＰＣＲ反応等を行なって調製したりする。また、ＰＣＲ以外のＬＡＭＰ法などの増幅方法により調製してもよい。
その後で、生化学的増幅１２０２により増幅されたサンプル、またはサンプル１２０１そのものに、可視化のために各種標識法により標識する（ラベル混入１２０３）。この標識物質としては、通常Cy3, Cy5, Rodaminなどの蛍光物質が用いられる。また、生化学的増幅１２０２において標識分子を混入することもある。
こうして標識分子が付加された核酸は、ＤＮＡマイクロアレイ１２０４とハイブリダイゼーション反応（１２０５）を行う。この様子は、図３に示した通りである。例えば感染症の原因菌の特定をする場合、ＤＮＡマイクロアレイ１２０４は菌に特異的なプローブを基板に固定したものとなる。ここで、各菌に対応したプローブの設計は、例えば16s rRNAをコーディングしているゲノム部分より、上記で説明した方法で行う。なお、ＤＮＡマイクロアレイ１２０４のプローブを固定する担体（基板）は、ガラス基板、プラスチック基板、シリコンウェハー等の平面基板が考えられる。また、凹凸のある三次元構造体、ビーズのような球状のもの、棒状、紐状、糸状のもの等を用いても、本発明の実現形態、効果には影響ない。
通常、基板の表面はプローブＤＮＡの固定化が可能なように処理したものが使用される。特に、表面に化学反応が可能となるように官能基を導入した物は、ハイブリダイゼーション反応の過程でプローブが安定に結合している為に、再現性の点で好ましい形態である。本実施形態で用いられる固定化方法は、例えば、マレイミド基とチオール（−ＳＨ）基との組合わせを用いる例が挙げられる。即ち核酸プローブの末端にチオール（−ＳＨ）基を結合させておき、固相表面がマレイミド基を有するように処理しておくことで、固相表面に供給された核酸プローブのチオール基と固相表面のマレイミド基とが反応して核酸プローブを固定化する。マレイミド基の導入方法としては、まず、ガラス基板にアミノシランカップリング剤を反応させ、次にそのアミノ基とＥＭＣＳ試薬（N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide :Ｄｏｊｉｎ社製）との反応によりマレイミド基を導入する。ＤＮＡへのＳＨ基の導入は、ＤＮＡ自動合成機でＤＮＡを合成する際に5'-Thiol-ModifierC6（Glen Research社製）を用いることにより行なうことができる。固定化に利用する官能基の組合わせとしては、上記したチオール基とマレイミド基の組合わせ以外にも、例えばエポキシ基（固相上）とアミノ基（核酸プローブ末端）の組合わせ等が挙げられる。また、各種シランカップリング剤による表面処理も有効であり、該シランカップリング剤により導入された官能基と反応可能な官能基を導入したオリゴヌクレオチドが用いられる。さらに、官能基を有する樹脂をコーティングする方法も利用可能である。
ハイブリダイゼーション反応１２０５を行った後、ＤＮＡマイクロアレイ１２０４の表面を洗浄し、プローブと結合していない核酸を剥がした後で、（通常は）乾燥し、１２０５の蛍光量を測定する。ここでは、ＤＮＡマイクロアレイ１２０４の基板に励起光を照射し、蛍光強度を測定した画像を得る（１２０６、１２０７）。
以下、図１９を用いて説明した実験の流れを感染症の原因菌特定の目的を想定した具体的実験操作として説明する。なお、本発明にかかわる生物種類判定方法は、以下に述べる感染症の原因菌特定に限ったものではなく、ＭＨＣなどの人間の体質判定や、癌などの疾病に関わるＤＮＡ、ＲＮＡの解析に用いてもよい。
＜１．プローブＤＮＡの準備＞
Enterobacter cloacae株検出用Probeとして配列番号５９〜６５に示す核酸配列（Ｉ−ｎ）（ｎは数字）を設計した。具体的には、16s rRNAをコーディングしているゲノム部分より、上記第１実施形態或いは第２実施形態で説明したい方法を用いて設計した。なお、データベースは、ＮＣＢＩデータベースを利用した。
配列番号５９〜６５（相補鎖配列は配列番号１３７〜１４３）に示したプローブは、ＤＮＡマイクロアレイに固定するための官能基として、合成後、定法に従って核酸の5'末端にチオール基を導入した。官能基の導入後、精製し、凍結乾燥した。凍結乾燥したプローブは、-30℃の冷凍庫に保存した。
黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、セラチア菌、肺炎連鎖球菌、インフルエンザ菌、及びエンテロコッカス・フェカリス菌についても同様な手法により以下に示すプローブセットを設計した。
黄色ブドウ球菌：配列番号１〜９（相補鎖配列は配列番号７９〜８７）、
表皮ブドウ球菌：配列番号１０〜１６（相補鎖配列は配列番号８８〜９４）、
大腸菌：配列番号１７〜２３（相補鎖配列は配列番号９５〜１０１）、
肺炎桿菌：配列番号２４〜２９（相補鎖配列は配列番号１０２〜１０７）、
緑膿菌：配列番号３０〜３７（相補鎖配列は配列番号１０８〜１１５）、
セラチア菌：配列番号３８〜４３（相補鎖配列は配列番号１１６〜１２１）、
肺炎連鎖球菌：配列番号４４〜５０（相補鎖配列は配列番号１２２〜１２８）、
インフルエンザ菌：配列番号５１〜５８（相補鎖配列は配列番号１２９〜１３６）、
エンテロコッカス・フェカリス菌：配列番号６６〜７２（相補鎖配列は配列番号１４４〜１５０）。
＜２．検体増幅用PCR Primer の準備＞
起炎菌検出用の為の16s rＲＮＡ核酸（標的核酸）増幅用PCR Primerとして表２に示す核酸配列を設計した。
具体的には、16s rＲＮＡをコーディングしているゲノム部分を特異的に増幅するプローブセット、つまり約1500塩基長の16s rRNAコーディング領域の両端部分で、特異的な融解温度をできるだけ揃えたプライマーを設計した。なお、変異株や、ゲノム上に複数存在する16s rRNAコーディング領域も同時に増幅できるように複数種類のプライマーを設計した。
Figure 0004250554
表中に示したPrimerは、合成後、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により精製し、Forward Primerを３種、Reverse Primerを３種混合し、それぞれのPrimer濃度が、最終濃度10 pmol/μl となるようにTE緩衝液に溶解した。
＜３．Enterobacter_cloacae Genome DNA（モデル検体）の抽出＞
〈３−１．微生物の培養 ＆ Genome DNA 抽出の前処理〉
まず、Enterobacter cloacae 標準株を、定法に従って培養した。この微生物培養液を1.5ml容量のマイクロチューブに1.0ml（OD600=0.7）採取し、遠心分離で菌体を回収した（8500rpm、5min、4℃）。上精を捨てた後、Enzyme Buffer（50mM Tris-HCl：p.H. 8.0、25mM EDTA）300μlを加え、ミキサーを用いて再縣濁した。再縣濁した菌液は、再度、遠心分離で菌体を回収した（8500rpm、5min、4℃）。上精を捨てた後、回収された菌体に、以下の酵素溶液を加え、ミキサーを用いて再縣濁した。
Lysozyme 50μl （20 mg/ml in Enzyme Buffer）
N-Acetylmuramidase SG 50μl （0.2 mg/ml in Enzyme Buffer）。
次に、酵素溶液を加え再縣濁した菌液を、37℃のインキュベーター内で30分間静置し、細胞壁の溶解処理を行った。
〈３−２．Genome抽出〉
以下に示す微生物のGenome DNA抽出は、核酸精製キット（MagExtractor -Genome-：TOYOBO社製）を用いて行った。
具体的には、まず、前処理した微生物縣濁液に溶解・吸着液750μlと磁性ビーズ40μlを加え、チューブミキサーを用いて、10分間激しく攪拌した（ステップ１）。
次に、分離用スタンド（Magical Trapper）にマイクロチューブをセットし、30秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を捨てた（ステップ２）。
次に、洗浄液 900 μl を加え、ミキサーで5sec程度攪拌して再縣濁を行った（ステップ３）。
次に、分離用スタンド（Magical Trapper）にマイクロチューブをセットし、30秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を捨てた（ステップ４）。
ステップ３、４を繰り返して2度目の洗浄（ステップ５）を行った後、70％エタノール 900 μl を加え、ミキサーで5sec程度攪拌して再縣濁した（ステップ６）。
次に、分離用スタンド（Magical Trapper）にマイクロチューブをセットし、30秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を捨てた（ステップ７）。
ステップ６、７を繰り返して70％エタノールによる2度目の洗浄（ステップ８）を行った後、回収された磁性粒子に純水 100 μl を加え、チューブミキサーで10分間攪拌を行った。
次に分離用スタンド（Magical Trapper）にマイクロチューブをセットし、30秒間静置して磁性粒子をチューブ壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を新しいチューブに回収した。
〈３−３．回収したGenome DNAの検査〉
回収された微生物（Enterobacter cloacae 株）のGenome DNAは、定法に従って、アガロース電気泳動と260/280nmの吸光度測定を行い、その品質（低分子核酸の混入量、分解の程度）と回収量を検定した。
本実験操作では、約10μgのGenome DNA が回収され、Genome DNAのデグラデーションやrRNAの混入は認められなかった。回収したGenome DNAは、最終濃度50ng/μｌとなるようにTE緩衝液に溶解し、以下の実験操作に使用した。
＜４．ＤＮＡマイクロアレイの作製＞
〈４−１．ガラス基板の洗浄〉
合成石英のガラス基板（サイズ：25mmｘ75mmｘ1mm、飯山特殊ガラス社製）を耐熱、耐アルカリ のラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩洗浄液中で浸した後、20分間超音波洗浄を行った。続いて基板を取り出し、軽く純水ですすいだ後、超純水中で20分超音波洗浄をおこなった。次に80℃に加熱した１N水酸化ナトリウム水溶液中に10分間基板を浸した。再び純水洗浄と超純水洗浄を行い、ＤＮＡチップ用の石英ガラス基板を用意した。
〈４−２．表面処理〉
シランカップリング剤KBM-603(信越シリコーン社製)を、１%の濃度となるように純水中に溶解させ、２時間室温で攪拌した。続いて、先に洗浄したガラス基板をシランカップリング剤水溶液に浸し、２０分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に乾燥した基板を１２０℃に加熱したオーブン中で1時間ベークし、カップリング剤処理を完結させ、基板表面にアミノ基を導入した。次いで同仁化学研究所社製のN-マレイミドカプロイロキシスクシイミド(N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido)（以下EMCSと略す）を、ジメチルスルホキシドとエタノールの1:1混合溶媒中に最終濃度が0.3mg/mlとなるように溶解したEMCS溶液を用意した。ベークの終了したガラス基板を放冷し、調製したEMCS溶液中に室温で２時間浸した。この処理により、シランカップリング剤によって表面に導入されたアミノ基とEMCSのスクシイミド基が反応し、ガラス基板表面にマレイミド基が導入された。EMCS溶液から引き上げたガラス基板を、先述のMCSを溶解した混合溶媒を用いて洗浄し、さらにエタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。
〈４−３．プローブＤＮＡ〉
実験操作１で作製した微生物検出用プローブを純水に溶解し、それぞれ、最終濃度（インク溶解時）10μMとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。
〈４−４．BJプリンターによるＤＮＡ吐出、および基板への結合〉
グリセリン7.5wt%、チオジグリコール7.5wt%、尿素7.5wt%、アセチレノールEH(川研ファインケミカル社製)1.0wt%を含む水溶液を用意した。続いて、先に用意した7種類のプローブ（表1）を上記の混合溶媒に規定濃度なるように溶解した。得られたＤＮＡ溶液をバブルジェット（登録商標）プリンター（商品名：BJF-850 キヤノン社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。
なおここで用いたバブルジェット（登録商標）プリンターは平板への印刷が可能なように改造を施したものである。またこのバブルジェット（登録商標）プリンターは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約5ピコリットルのＤＮＡ溶液を約120マイクロメートルピッチでスポッティングすることが可能となっている。
続いて、この改造バブルジェット（登録商標）プリンターを用いて、1枚のガラス基板に対して、印字操作を行い、アレイを作製した。印字が確実に行われていることを確認した後、30分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基と核酸プローブ末端のチオール基とを反応させた。
〈４−５．洗浄〉
30分間の反応後、100mMのNaClを含む10mMのリン酸緩衝液(pH7.0)により表面に残ったＤＮＡ溶液を洗い流し、ガラス基板表面に一本鎖ＤＮＡが固定したＤＮＡマイクロアレイを得た。
＜５．検体の増幅と標識化（PCR増幅＆蛍光標識の取り込み）＞
検体となる微生物ＤＮＡの増幅、および、標識化反応を以下に示す。
Figure 0004250554
上記組成の反応液を以下のプロトコールに従って、市販のサーマルサイクラーで増幅反応を行った。
Figure 0004250554
反応終了後、精製用カラム（QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit）を用いてPrimerを除去した後、増幅産物の定量を行い、標識化検体とした。
＜６．ハイブリダイゼーション＞
＜４．ＤＮＡマイクロアレイの作製＞で作製したＤＮＡマイクロアレイと＜５．検体の増幅と標識化（PCR増幅＆蛍光標識の取り込み）＞で作製した標識化検体を用いて検出反応を行った。
〈６−１．ＤＮＡマイクロアレイのブロッキング〉
BSA（牛血清アルブミンFraction V：Sigma社製）を1wt％となるように100mM NaCl / 10mM Phosphate Bufferに溶解し、この溶液に＜ＤＮＡマイクロアレイの作製＞で作製したＤＮＡマイクロアレイを室温で2時間浸し、ブロッキングを行った。ブロッキング終了後、0.1wt％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む２ｘSSC溶液（NaCl 300mM 、Sodium Citrate (trisodium citrate dihydrate, C6H5Na3・2H2O) 30mM、p.H. 7.0）で洗浄を行った後、純水でリンスしてからスピンドライ装置で水切りを行った。
〈６−２．ハイブリダイゼーション〉
水切りしたＤＮＡマイクロアレイをハイブリダイゼーション装置（Genomic Solutions Inc. Hybridization Station）にセットし、以下に示すハイブリダイゼーション溶液、条件でハイブリダイゼーション反応を行った。
・ハイブリダイゼーション溶液
6 x SSPE / 10% Form amide / Target (2nd PCR Products 全量)
(6xSSPE: NaCl 900mM、NaH2PO4・H2O 60mM、EDTA 6mM、p.H. 7.4)
・ハイブリダイゼーション条件
65 ℃ 3min → 92℃ 2min → 45℃ 3hr → Wash 2ｘSSC / 0.1% SDS at 25℃ → Wash 2 x SSC at 20℃ → (Rinse with H2O : Manual) → Spin dry（65℃で3分、92度で2分、45℃で3時間ハイブリダイゼーション反応させた後、2ｘSSC / 0.1% SDS、25℃で洗浄、2xSSC、20℃で洗浄後、純水でリンスしスピンドライした）。
＜７．微生物の検出（蛍光測定）＞
ハイブリダイゼーション反応終了後のＤＮＡマイクロアレイをＤＮＡマイクロアレイ用蛍光検出装置（Axon社製、GenePix 4000B）を用いで蛍光測定を行った。夫々のプローブで良好な判別結果が得られた。
以上説明したように、本実施形態によれば、ＤＮＡマイクロアレイシステムに最適なオリゴヌクレオチドプローブの設計が実現できる。このことにより、より確かな生物種、個体識別情報が得られるという効果がある。
＜他の実施形態＞
なお、本発明の目的は、前述した実施形態の機能を実現するソフトウェアのプログラムコードを記録した記憶媒体を、システムあるいは装置に供給し、そのシステムあるいは装置のコンピュータ（またはＣＰＵやＭＰＵ）が記憶媒体に格納されたプログラムコードを読出し実行することによっても、達成されることは言うまでもない。
この場合、記憶媒体から読出されたプログラムコード自体が前述した実施形態の機能を実現することになり、そのプログラムコードを記憶した記憶媒体は本発明を構成することになる。
プログラムコードを供給するための記憶媒体としては、例えば、フレキシブルディスク，ハードディスク，光ディスク，光磁気ディスク，ＣＤ−ＲＯＭ，ＣＤ−Ｒ，磁気テープ，不揮発性のメモリカード，ＲＯＭなどを用いることができる。
また、コンピュータが読出したプログラムコードを実行することにより、前述した実施形態の機能が実現されるだけでなく、そのプログラムコードの指示に基づき、コンピュータ上で稼働しているＯＳ（オペレーティングシステム）などが実際の処理の一部または全部を行い、その処理によって前述した実施形態の機能が実現される場合も含まれることは言うまでもない。
さらに、記憶媒体から読出されたプログラムコードが、コンピュータに挿入された機能拡張ボードやコンピュータに接続された機能拡張ユニットに備わるメモリに書込まれた後、そのプログラムコードの指示に基づき、その機能拡張ボードや機能拡張ユニットに備わるＣＰＵなどが実際の処理の一部または全部を行い、その処理によって前述した実施形態の機能が実現される場合も含まれることは言うまでもない。
第１実施形態によるプローブ設計方法の概要を説明する図である。 第１実施形態によるプローブ設計方法が適用可能な情報処理装置の構成を示すブロック図である。 ハイブリダイゼーション反応を説明する図である。 感染症の判定用ＤＮＡマイクロアレイの実験手順を説明する図である。 黄色ブドウ球菌の異なる株のゲノム構造を説明する図である。 実施形態による頻度テーブルの例を示す図である。 ターゲット塩基配列の特異性をスキャンした例を示す図である。 競合頻度テーブルと自己頻度テーブルの値をグラフ化した図である。 第１実施形態によるプローブ設計方法を説明するフローチャートである。 第１実施形態によるプローブ設計方法におけるユーザインターフェースを示す図である。 第１実施形態によるプローブ設計方法におけるユーザインターフェースを示す図である。 第２実施形態によるプローブ設計方法の概要を説明する図である。 ターゲット塩基配列に存在する共通領域と、その共通領域に挟まれた部分を表す図である。 第２実施形態によるプローブ設計方法を説明するフローチャートである。 第２実施形態によるプローブ設計方法におけるユーザインターフェースを示す図である。 第２実施形態によるプローブ設計方法におけるユーザインターフェースを示す図である。 第２実施形態によるプローブの自動設計方法を説明する図である。 第２実施形態によるプローブの自動設計方法を説明するフローチャートである。 実施形態のプローブ設計方法で設計したプローブを用いて核酸解析を行う手順を説明する図である。

Claims (22)

  1. 情報処理装置によるＤＮＡプローブ設計のための情報処理方法であって、
    第１カウント手段が、ターゲットの塩基配列データを含む第１の塩基配列データ群について、設定された塩基数の部分塩基配列を前記ターゲットの塩基配列データの一端から他端まで順次に取り出すことにより前記第１の塩基配列データ群における複数の部分塩基配列を取得し、前記複数の部分塩基配列の各々の出現数をカウントすることにより得られた第１の頻度情報をメモリに記憶する第１カウント工程と、
    第２カウント手段が、前記第１の塩基配列データ群とは区別されるべき第２の塩基配列データ群について、前記複数の部分塩基配列の各々の出現数をカウントすることにより得られた第２の頻度情報をメモリに記憶する第２カウント工程と、
    表示手段が、前記第１及び第２カウント工程によってメモリに記憶された前記第１及び第２の頻度情報に基づいて、各部分塩基配列の頻度を前記ターゲットの塩基配列の順に並べてそれぞれをグラフ表示する表示工程と、
    出力手段が、前記複数の部分塩基配列の少なくとも一つを指示するユーザの指示操作に応じて、指示された部分塩基配列の情報を出力する出力工程とを備えることを特徴とするＤＮＡプローブ設計のための情報処理方法。
  2. 前記表示工程では、前記第１及び第２カウント工程によってメモリに保持された前記第１及び第２の頻度情報を、前記ターゲットの塩基配列を１つの軸とするグラフで表示し、
    前記指示操作は、前記グラフ上の所望の位置を指示することによりなされることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡプローブ設計のための情報処理方法。
  3. 前記第１の塩基配列データ群と前記第２の塩基配列データ群に含まれる全ての塩基配列データに共通して存在する共通配列を抽出する抽出工程をさらに備え、
    前記表示工程は、前記グラフ上に、前記抽出工程で抽出された共通配列領域を示すことを特徴とする請求項２に記載のＤＮＡプローブ設計のための情報処理方法。
  4. 前記出力工程において、前記共通配列領域ではユーザによる部分塩基配列の指示を受け付けないようにすることを特徴とする請求項３に記載のＤＮＡプローブ設計のための情報処理方法。
  5. 情報処理装置によるＤＮＡプローブ設計のための情報処理方法であって、
    第１カウント手段が、ターゲットの塩基配列データを含む第１の塩基配列データ群について、設定された塩基数の部分塩基配列を前記ターゲットの塩基配列データの一端から他端まで順次に取り出すことにより前記第１の塩基配列データ群における複数の部分塩基配列を取得し、前記複数の部分塩基配列の各々の出現数をカウントすることにより得られた第１の頻度情報をメモリに記憶する第１カウント工程と、
    第２カウント手段が、前記第１の塩基配列群とは区別されるべき第２の塩基配列データ群について、前記複数の部分塩基配列の各々の出現数をカウントすることにより得られた第２の頻度情報をメモリに記憶する第２カウント工程と、
    出力手段が、前記第１カウント工程で得られた前記第１の頻度情報と前記第２カウント工程で得られた前記第２の頻度情報とに基づいて部分塩基配列を抽出し、抽出された部分塩基配列に基づいてプローブ候補の塩基配列を決定し、前記第１および第２の頻度情報とともに、各部分塩基配列の頻度を前記ターゲットの塩基配列の順に並べた時の該プローブ候補に対応する部分塩基配列に隣接する部分塩基配列の第１及び第２の頻度情報を出力し、更に該プローブ候補に対応する部分塩基配列の前記ターゲット塩基配列上の位置情報及び配列情報を出力する、出力工程とを備えることを特徴とするＤＮＡプローブ設計のための情報処理方法。
  6. 前記出力工程では、前記第１カウント工程による頻度が第１所定値を超え、前記第２カウント工程による頻度が第２所定値を下まわる部分塩基配列を前記ターゲットの塩基配列より抽出することを特徴とする請求項５に記載のＤＮＡプローブ設計のための情報処理方法。
  7. 前記第１の塩基配列データ群と前記第２の塩基配列データ群に含まれる全ての塩基配列データに共通して存在する共通配列を抽出する抽出工程をさらに備え、
    前記出力工程では、前記ターゲットの塩基配列の、前記抽出工程で抽出された共通配列からなる領域を除く領域より部分塩基配列を抽出することを特徴とする請求項５に記載のＤＮＡプローブ設計のための情報処理方法。
  8. 前記出力工程では、前記抽出された部分塩基配列について融解温度を算出し、算出された融解温度に基づいて前記プローブ候補としての部分塩基配列を決定することを特徴とする請求項５乃至７のいずれか１項に記載のプローブ設計のための情報処理方法。
  9. 前記出力工程では、前記抽出された部分塩基配列について、その前後に所定数の塩基を追加、削除することにより複数の部分塩基配列を派生し、該抽出及び派生された部分塩基配列の中から前記プローブ候補としての部分塩基配列を決定することを特徴とする請求項５乃至８のいずれか１項に記載のＤＮＡプローブ設計のための情報処理方法。
  10. 前記出力工程では、前記抽出された部分塩基配列について２次構造が形成される可能性を算出し、その算出結果に基づいて前記プローブ候補としての部分塩基配列を決定することを特徴とする請求項５乃至９のいずれか１項に記載のプローブ設計のための情報処理方法。
  11. 前記出力工程では、前記抽出された部分塩基配列の相互のマッチング度を計算し、類似する部分塩基配列を排除することにより前記プローブ候補としての部分塩基配列を決定することを特徴とする請求項５乃至１０のいずれか１項に記載のＤＮＡプローブ設計のための情報処理方法。
  12. 前記出力工程は、前記ターゲットの塩基配列における、前記共通配列からなる領域によって区切られた部分領域を単位として、繰り返されることを特徴とする請求項７に記載のＤＮＡプローブ設計のための情報処理方法。
  13. 前記出力工程では、前記共通配列からなる領域によって区切られた複数の部分領域の各々から１つ以下の部分塩基配列を抽出することを特徴とする請求項１２に記載のＤＮＡプローブ設計のための情報処理方法。
  14. 前記出力工程では、前記複数の部分領域の各々より、前記第１カウント工程による頻度が最大であり、かつ、前記第２カウント工程による頻度が所定値以下となっている部分塩基配列を抽出することを特徴とする請求項１３に記載のＤＮＡプローブ設計のための情報処理方法。
  15. 前記出力工程では、前記複数の部分領域の各々より、前記第１カウント工程による頻度が所定値以上であり、かつ、前記第２カウント工程による頻度が所定値以下の部分塩基配列を抽出することを特徴とする請求項１２に記載のＤＮＡプローブ設計のための情報処理方法。
  16. 前記第１グループの塩基配列データ群はターゲットとする生物種の複数の多型を含む塩基配列データであり、前記第２グループの塩基配列データは前記ターゲットとする生物種以外の生物種の複数の多型を含む塩基配列データであることを特徴とする請求項１乃至１５のいずれか１項に記載のＤＮＡプローブ設計のための情報処理方法。
  17. ターゲットの塩基配列データを含む第１の塩基配列データ群について、設定された塩基数の部分塩基配列を前記ターゲットの塩基配列データの一端から他端まで順次に取り出すことにより前記第１の塩基配列データ群における複数の部分塩基配列を取得し、前記複数の部分塩基配列の各々の出現数をカウントして得られる第１の頻度情報をメモリに記憶する第１カウント手段と、
    前記第１の塩基配列データ群とは区別されるべき第２の塩基配列データ群について、前記複数の部分塩基配列の各々の出現数をカウントすることにより得られた第２の頻度情報をメモリに記憶する第２カウント手段と、
    前記第１及び第２カウント手段によってメモリに記憶された前記第１および第２の頻度情報に基づいて、各部分塩基配列の頻度を前記ターゲットの塩基配列の順に並べてそれぞれをグラフ表示する表示手段と、
    前記複数の部分塩基配列の少なくとも一つを指示するユーザの指示操作に応じて、指示された部分塩基配列の情報を出力する出力手段とを備えることを特徴とするＤＮＡプローブ設計装置。
  18. 前記第１の塩基配列データ群と前記第２の塩基配列データ群に含まれる全ての塩基配列データに共通して存在する共通配列を抽出する抽出手段をさらに備え、
    前記表示手段は前記第１及び第２カウント手段によってメモリに保持された前記第１および第２の頻度情報を前記ターゲットの塩基配列を１つの軸とするグラフで表示するとともに、該グラフ上に前記抽出手段で抽出された共通配列の位置を示すことを特徴とする請求項１７に記載のＤＮＡプローブ設計装置。
  19. ターゲットの塩基配列データを含む第１の塩基配列データ群について、設定された塩基数の部分塩基配列を前記ターゲットの塩基配列データの一端から他端まで順次に取り出すことにより前記第１の塩基配列データ群における複数の部分塩基配列を取得し、前記複数の部分塩基配列の各々の出現数をカウントすることにより得られた第１の頻度情報をメモリに記憶する第１カウント手段と、
    前記第１の塩基配列群とは区別されるべき第２の塩基配列データ群について、前記複数の部分塩基配列の各々の出現数をカウントすることにより得られた第２の頻度情報をメモリに記憶する第２カウント手段と、
    前記第１カウント手段で得られた前記第１の頻度情報と前記第２カウント手段で得られた前記第２の頻度情報とに基づいて部分塩基配列抽出し、抽出された部分塩基配列に基づいてプローブ候補の塩基配列を決定し、前記第１および第２の頻度情報とともに、各部分塩基配列の頻度を前記ターゲットの塩基配列の順に並べた時の該プローブ候補に対応する部分塩基配列に隣接する部分塩基配列の第１及び第２の頻度情報を出力し、更に該プローブ候補に対応する部分塩基配列の前記ターゲット塩基配列上の位置情報及び配列情報を出力する、出力手段とを備えることを特徴とするＤＮＡプローブ設計装置。
  20. 前記第１の塩基配列データ群と前記第２の塩基配列データ群に含まれる全ての塩基配列データに共通して存在する共通配列を抽出する抽出手段をさらに備え、
    前記出力手段は、前記ターゲットの塩基配列にける、前記抽出手段で抽出された共通配列からなる領域を除く領域より部分塩基配列を抽出することを特徴とする請求項１９に記載のＤＮＡプローブ設計装置。
  21. 請求項１乃至１６のいずれか１項に記載のプローブ設計のための情報処理方法をコンピュータに実行させるための制御プログラム。
  22. 請求項１乃至１６のいずれか１項に記載のプローブ設計のための情報処理方法をコンピュータに実行させるための制御プログラムを格納した記憶媒体。
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