JP2009171969A - マイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法 - Google Patents

Abstract

【課題】目的試料およびプローブ間のハイブリダイゼーション程度を測定するマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法を提供することである。
【解決手段】マイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法は、複数のプローブが形成されたマイクロアレイを提供して、複数のプローブに目的試料（ｔａｒｇｅｔ ｓａｍｐｌｅ）とランダムな配列から成るランダムプライマーをハイブリダイゼーションして、各プローブの遊離末端（ｆｒｅｅ ｔｅｒｍｉｎａｌ）および前記ランダムプライマーの前記各プローブ側の一端を連結して、前記各プローブとハイブリダイゼーションされた前記目的試料を除去して、残存する前記ランダムプライマーの強度を測定することを含む。
【選択図】図３

Description

本発明は、マイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法に関するものであって、より詳細には、アッセイ効率が向上したマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法に関するものである。

最近、ゲノムプロジェクトの発展につれ、多様な生物のゲノムヌクレオチド配列が明らかになったことによってマイクロアレイに対する関心が高まっている。マイクロアレイは支持体である基板上に複数のプローブを整列したものであり、目的試料がマイクロアレイ上のプローブとハイブリダイゼーションされたのかどうかを観察することで目的試料が所定の塩基配列を含むのかを確認することができる。

一般的に目的試料およびプローブのハイブリダイゼーションの可否をアッセイする時には、目的試料の末端に蛍光物質を連結して、ハイブリダイゼーションされた目的試料の蛍光物質を観察した。しかし、目的試料の非特異的な結合によるアッセイ効率減少が問題となり、目的試料の末端に検出配列（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を形成して、前記検出配列に相補的な配列を含むプライマーを結合して、前記プライマーとプローブをアニリングすることで目的試料の非特異的結合によるアッセイ効率減少を防止しようとする研究が進んでいた。

しかし、目的試料の長さがプローブの長さに比べて相対的に長いため、一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ）である目的試料が安定した立体構造を形成する場合が多かった。このためプライマーが目的試料の末端からプローブとハイブリダイゼーションされた位置まで伸張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）できず、マイクロアレイのハイブリダイゼーションアッセイのアッセイ効率が減少する困難があった。

米国公開特許２００４−１８０３６２号公報（第２９−３４ページ、図４Ａ、４Ｂ） 国際公開第００／２１９６７号パンフレット

本発明が解決しようとする課題は、アッセイ効率が向上したマイクロアレイのハイブリダイゼーションアッセイ方法を提供しようとすることにある。

本発明の課題は以上で言及した課題に制限されず、言及されていないまた他の課題は次の記載から当業者に明確に理解できるであろう。

前記課題を解決するための本発明の一実施形態によるマイクロアレイのハイブリダイゼーションアッセイ方法は、複数のプローブが形成されたマイクロアレイを提供して、前記複数のプローブに目的試料（ｔａｒｇｅｔ ｓａｍｐｌｅ）とランダムな配列から成るランダムプライマーをハイブリダイゼーションして、前記各プローブの遊離末端（ｆｒｅｅ ｔｅｒｍｉｎａｌ）および前記ランダムプライマーの前記各プローブ側の一端を連結して、前記各プローブとハイブリダイゼーションされた前記目的試料を除去して、残存する前記ランダムプライマーの強度を測定することを含む。

前記課題を解決するための本発明の他の実施形態によるマイクロアレイのハイブリダイゼーションアッセイ方法は、目的試料およびランダムな配列から成るランダムプライマーをハイブリダイゼーションされた複数のプローブを含むマイクロアレイを提供して、リガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）を含むライゲーション溶液で前記マイクロアレイを処理して、前記マイクロアレイを洗浄して、前記マイクロアレイのハイブリダイゼーション程度を測定することを含む。

その他実施形態の具体的な事項は詳細な説明および図に含まれている。

本発明の一実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法によれば、マーカーと連結されたランダムプライマーを使用してランダムプライマーがプローブに近接した位置で目的試料と結合するようにすることで、ランダムプライマーの伸張領域の長さを減らすことができる長所がある。

本発明のいくつかの実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法の中間構造物の断面図である。 本発明のいくつかの実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法の中間構造物の断面図である。 本発明の一実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法の中間構造物の断面図である。 本発明の一実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法の中間構造物の断面図である。 本発明の一実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法の中間構造物の断面図である。 本発明の一実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法の中間構造物の断面図である。 本発明の一実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法の中間構造物の断面図である。 本発明の他の実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法の中間構造物の断面図である。 本発明の他の実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法の中間構造物の断面図である。 本発明のまた他の実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法の中間構造物の断面図である。

本発明の利点、特徴、およびそれらを達成する方法は、添付される図面と共に詳細に後述される実施形態を参照すれば明確になるであろう。しかし、本発明は、以下で開示される実施形態に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態で具現されることが可能である。本実施形態は、単に本発明の開示が完全になるように、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者に対して発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであり、本発明は、請求項の範囲によってのみ定義される。なお、明細書全体にかけて、同一の参照符号は同一の構成要素を指すものとする。

本発明の利点および特徴、並びにそれらを達成する方法は、添付される図面と共に、詳細に後述する実施形態を参照すれば明確になる。しかし、本発明の目的は、以下で開示される実施形態に限定されず、互いに異なる多様な形態によって達成可能である。したがって、以下の実施形態は単に、本発明の開示が完全になるように、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者に対して発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものでる。すなわち、本発明の範囲はあくまで、請求項に記載された発明によってのみ規定される。

なお、いくつかの実施形態において、公知の工程、段階、構造および技術は、本発明が不明瞭に解釈されるのを避けるために説明を省略する。

本明細書で使用された用語は、実施形態を説明するためであり、本発明を制限しようとするものではない。本明細書において単数形は、文言で特別に言及しない限り複数形も含む。明細書で使用される、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および／または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、言及した構成要素、段階、動作および／または素子は、一つ以上の他の構成要素、段階、動作および／または素子の存在または追加を排除しない。そして、「および／または」は、言及されたアイテムのそれぞれおよび一つ以上のすべての組合せを含む。

また、本明細書で記述する実施形態は本発明の理想的な例示図である断面図および／または概略図を参照して説明する。製造技術および／または許容誤差などによって例示図の形態が変形されうる。したがって、本発明の実施形態は図示された特定形態に制限されず、製造工程によって生成される形態の変化も含むものである。また、本発明に図示された各図面において各構成要素は、説明の便宜を考慮して多少拡大または縮小して図示されたものである。明細書全体にかけて、同一の参照符号は同一の構成要素を指称する。

本発明のいくつかの実施形態によるマイクロアレイのハイブリダイゼーションアッセイ方法は、生体試料に含まれている生体分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）を分析することで、遺伝子発現分析（ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）、遺伝子型分析（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）のような突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）および多型（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）の検出、蛋白質およびペプチド分析、潜在的な薬のスクリーニング、新薬開発と製造などに用いられうる。また、本発明のいくつかの実施形態に適用可能なマイクロアレイは分析しようとする生体試料の対象に応じてそれに合うプローブを採用することができる。マイクロアレイに採用されうるプローブの例としては、ＤＮＡプローブ、酵素や抗体／抗原、バクテリオロドプシン（ｂａｃｔｅｒｉｏｒｈｏｄｏｐｓｉｎ）などのような蛋白質プローブ、微生物プローブ、神経細胞プローブなどを含む。それぞれ採用されるプローブの種類によってマイクロアレイはＤＮＡチップ、蛋白質チップ、細胞チップ、ニューロンチップなど指称されうる。

本発明のいくつかの実施形態によるマイクロアレイはプローブとしてオリゴマープローブを含み得る。前記オリゴマープローブは、採用されるプローブのモノマー数がオリゴマー水準であることを暗示する。ここで、オリゴマーは共有結合された２つ以上のモノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ）から成るポリマー（ｐｏｌｙｍｅｒ）のうち分子量が概ね１００００以下のものを示す意味で使用され得る。具体的に約２〜５００個のモノマー、好ましくは１０〜８０個のモノマーを含むものでありうる。しかし、オリゴマープローブの意味が前記数値に制限されるものではない。

オリゴマープローブを構成するモノマーは分析対象になる生体試料の種類によって変形が可能であり、例えば、ヌクレオシド、ヌクレオチド、アミノ酸、ペプチドなどでありうる。

ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、公知のプリンおよびピリミジン塩基を含むだけでなく、メチル化されたプリンまたはピリミジン、アシル化されたプリンまたはピリミジンなどを含み得る。また、ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、従来のリボースおよびデオキシリボース糖を含むだけではなく、一つ以上のヒドロキシル基がハロゲン原子または脂肪族に置換されたり、エーテル、アミンなどの官能基が結合した変形された糖を含み得る。

アミノ酸は自然から発見されるアミノ酸のＬ−、Ｄ−、および非キラル（ｎｏｎｃｈｉｒａｌ）型アミノ酸だけでなく修飾アミノ酸（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）、またはアミノ酸類似体（ａｎａｌｏｇ）などでありうる。

ペプチドとは、アミノ酸のカルボキシル基と異なるアミノ酸のアミノ基との間のアミド結合によって生成された化合物をいう。

特別に他に言及がない限り、以下の実施形態で例示的に想定されるプローブはＤＮＡプローブとして、約２０〜３０個のヌクレオチドのモノマーが共有結合されたオリゴマープローブである。しかし、本発明がそれに制限されるものではなく、前述した多様なプローブが適用されうるはもちろんである。

以下、添付される図面を参照して本発明の実施形態について説明する。

図１および図２を参照して本発明のいくつかの実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法について説明する。図１および図２は、本発明のいくつかの実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法を説明するための中間構造物の断面図である。

先ず、図１に示すように、複数のプローブ１３０が形成されたマイクロアレイ１００を提供する。

図面に図示しなかったが、基板１１０上に複数のプローブ１３０を固定してマイクロアレイ１００を形成することができる。

基板１１０は、複数のプローブセル領域（Ｐｒｏｂｅ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｏｎ、Ａ）および非プローブセル領域（Ｎｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｏｎ、Ｂ）を含む。プローブセル領域（Ａ）と非プローブセル領域（Ｂ）を区別する基準は固定されるプローブ１３０の有無による。すなわち、基板１１０のプローブセル領域（Ａ）は、基板上面１１１に複数のプローブが固定される基板１１０の領域を意味し、非プローブセル領域（Ｂ）は、基板上面１１１にプローブが固定されていない基板１１０の領域を意味する。

一つのプローブセル領域（Ａ）の基板上面１１１上には同一な配列のプローブが固定されうる。しかし、互いに異なるプローブセル領域の間では基板上面１１１に固定されるプローブの配列が相異なることもある。

互いに異なるプローブセル領域（Ａ）は非プローブセル領域（Ｂ）によって分離されている。したがって、各プローブセル領域（Ａ）は、非プローブセル領域（Ｂ）によって囲まれた形状で形成されうる。例えば、複数のプローブセル領域（Ａ）は、マトリックス形状で配列されうる。しかし、前記マトリックス形状配列が必ず規則的なピッチ（ｐｉｔｃｈ）を有しなければならないものではない。また、互いに独立的なプローブセル領域（Ａ）とは反対に非プローブセル領域（Ｂ）は一つに連結するように形成することができる。例えば、非プローブセル領域（Ｂ）は格子（ｌａｔｔｉｃｅ）型で形成することができる。

また、基板１１０は、例えば、透明基板または不透明基板でありうる。適用される不透明ウェハの例としてはナイロン、ニトロセルロースなどのメンブレインまたはプラスチックフィルムなどの可撓性基板や半導体ウェハなどのような剛性基板を挙げることができる。特に、半導体ウェハは半導体素子の製造工程においてすでに安定的に確立されて適用される多様な薄膜の製造工程および写真エッチング工程などをそのまま適用することができるという長所がある。透明ウェハの例としてはソーダ石灰ガラスから成る透明ガラスウェハを挙げることができる。

基板１１０は、基板上面１１１を含み得、基板上面１１１にはリンカー１２０が形成されうる。リンカー１２０の一端は基板上面１１１とカップリングされて、リンカー１２０の他端はプローブ１３０とカップリングされうる。リンカー１２０は、例えば、ディッピング（ｄｉｐｐｉｎｇ）工程によって形成されうるが、これに限定されないはもちろんである。

基板１１０が例えば、ガラスなどで成された場合、一端は基板１１０のＳｉＯＨと反応してシロキサン（Ｓｉ−Ｏ）結合を生成できるシリコーン基を含み、他端はプローブ（プローブ用モノマーを含み、以下同様）とカップリングできる官能基を含むリンカー１２０を使用することができる。具体的に、リンカー１２０の物質はＮ−（３−（トリエトキシシリル）−プロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド（Ｎ−（３−（ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌ）−４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｍｉｄｅ）、Ｎ、Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）アミノプロピル−トリエトキシシラン（Ｎ、Ｎ−ｂｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ） ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ−ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、アセトキシプロピル−トリエトキシシラン（Ｓｃｅｔｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（３−Ｇｌｙｃｉｄｏｘｙ ｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、特許文献２で開示されたシリコーン化合物などを例に挙げられ、前記特許文献２の内容は本明細書に充分に開示されるように援用されて統合される。

リンカー１２０は、目的試料との自由な相互作用が可能なように空間的マージン（ｍａｒｇｉｎ）を提供するスペーサを含み得る。仮に、リンカー１２０の長さが空間的マージンを提供できるほど充分長いのであれば図面に例示されたようにスペーサを含まないこともある。

複数のプローブ１３０を基板１１０上に形成する際に、リンカー１２０を介して基板上面１１１に形成することができる。しかし、リンカー１２０を介さないで基板上面１１１に直接形成することもできる。

複数のプローブ１３０は、それぞれ３’末端および５’末端を含む。各プローブ１３０の一端、すなわち３’末端または５’末端のうち何れか一つは基板上面１１１と直接またはリンカー１２０を介して固定される。各プローブ１３０の残り一つの末端は基板１１０に固定されず、したがって遊離末端（ｆｒｅｅ ｔｅｒｍｉｎａｌ）と呼ぶ。具体的に、３’末端が基板１１０上に固定されれば５’末端は遊離末端となり、５’末端が基板上面１１１に固定されれば３’末端が遊離末端になりうる。３’末端および５’末端のうち何れが基板上面１１１に固定されたのかによって、ポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）による伸張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）の方向も変わり、これに関する詳細な説明は後述する。

続いて、図２を参照して複数のプローブ１３０に目的試料（ｔａｒｇｅｔ ｓａｍｐｌｅ：１４０）をハイブリダイゼーションする。

具体的に、複数のプローブ１３０が形成されたマイクロアレイ１００に目的試料１４０を処理することで、目的試料１４０を相補的な塩基配列を有するプローブ１３１とハイブリダイゼーションすることができる。この時、目的試料１４０は、目的試料１４０に相補的な配列を含むプローブ１３１とのみハイブリダイゼーションし、相補的な配列を含まないプローブ１３２とはハイブリダイゼーションしない。したがって、互いに異なる配列を有するプローブ１３１、１３２が固定された互いに異なるプローブセル領域（Ａ：例えば、Ａ_１およびＡ_２）の間にハイブリダイゼーションの可否の差異が発生し得る。また、マイクロアレイ１００上には複数のプローブセル領域が形成され、目的試料１４０も複数のプローブ１３０が含む多様な塩基配列に相補的な塩基配列を重複して含めるため、互いに異なる配列を有する二以上のプローブセル領域（Ａ）上のプローブ１３０とハイブリダイゼーションすることもある。

目的試料１４０は、マイクロアレイ１００上に形成されたプローブ１３０、またはマイクロアレイ１００の用途に応じて多様な物質でありうる。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体／抗原、蛋白質などであり得、これに限定されないはもちろんである。

また、目的試料１４０の長さは後述する目的試料１４０およびランダムプライマーのアニリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）が可能なようにする長さでありうる。例えば、目的試料１４０はプローブ１３０とハイブリダイゼーションされた部分以外の余分の長さが少なくとも約９マー（ｍｅｒｓ）以上、好ましくは１５マー以上の長さを有しうる。最も好ましくは８０から１００マーの長さを有しうる。

複数のプローブ１３０および目的試料１４０をハイブリダイゼーションするための条件、例えば、温度、処理時間などのハイブリダイゼーション条件は、プローブ１３０および目的試料１４０の性質に応じて多様に調節されうる。例えば、温度のパラメータと関連して、一本鎖オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）は相対的にさらに低い温度で、また他の一本鎖オリゴヌクレオチドとさらに高い結合の可能性を有しうる。

以下、図３から図７を参照して本発明の一実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法に対して説明する。図３から図７は、本発明の一実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法を説明するための中間構造物の断面図である。本発明の一実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法は、前述した本発明のいくつかの実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法に従う工程を説明したものであり、図面に図示するように以下では目的試料とハイブリダイゼーションされたプローブを中心に説明する。

図３を参照して目的試料１４０にランダムプライマー１５０をアニリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）する。

具体的に、ランダムプライマー１５０を含むアニリング溶液（ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で基板上面１１１に目的試料１４０とハイブリダイゼーションされたプローブ１３１を処理することで、ランダムプライマー１５０を目的試料１４０にアニリングすることができる。目的試料１４０に対するランダムプライマー１５０のアニリング度を向上させるために、例えば４５℃ の条件で１時間の間、アニリング工程を行うことができる。

図面に図示していないが、前記アニリング溶液の処理を行う前にプローブ１３１とハイブリダイゼーションされていない目的試料を除去する洗浄工程を経ることができる。洗浄工程は、例えば、ＰＢＳＴバッファ溶液（ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２Ｘ ＰＢＳ （ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）などを利用することができる。

ランダムプライマー（ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ、１５０）はランダムな配列から成るショートセグメント（ｓｈｏｒｔ ｓｅｇｍｅｎｔ）を意味し得、例えば、オリゴヌクレオチドともいう一本鎖ＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ）を意味しうる。ランダムプライマー１５０は、複数のヌクレオチドを含み、これらはすべての可能な塩基の組合せを形成することができる。例えば、ランダムプライマー１５０が８ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、すなわち８マー（ｍｅｒｓ）のヌクレオチドからなる場合、４^８ ＝ ６５，５３６種類の多様な組合せのプライマーを形成することができる。

ランダムプライマー１５０が６５，５３６種類の多様な配列を有することができるため、ランダムプライマー１５０は目的試料１４０の任意の位置（ｓｉｔｅ）にアニリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）することができる。さらに具体的に、ランダムプライマー１５０はプローブ１３１に近接した位置で目的試料１４０と結合することができる。ランダムプライマー１５０がプローブ１３１の遊離末端１３１＿ａに近接した位置に結合するほど、目的試料１４０は安定した立体構造を形成できる空間的マージンが不足しうる。これによって、ランダムプライマー１５０およびプローブ１３１がアニリングする可能性が高まり、目的試料１４０とハイブリダイゼーションされたプローブ１３１の存在の可否をさらに正確に検出することができる。すなわち、目的試料１４０がプローブ１３１とハイブリダイゼーションされたがプライマーとアニリングされず、ハイブリダイゼーションアッセイで脱落する場合を減すことができ、目的試料１４０に含まれたランダムな配列が存在するかどうかをさらに正確に検出することができる。したがって、マイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイのアッセイ効率をさらに向上させることができる。

本発明のいくつかの実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法において、プローブ１３１および目的試料１４０との相互関係を始め、ハイブリダイゼーションアッセイの迅速性、正確性などを考慮する時、ランダムプライマー１５０は約４ヌクレオチド以上１０ヌクレオチド以下であり得、さらに具体的には、約８ヌクレオチドでありうる。これに対する詳細な説明は実験例で説明する。

ランダムプライマー１５０は、プローブ１３１側に向かう一端１５０＿ａおよびそれの反対側の他端１５０＿ｂを含む。ランダムプライマー１５０の一端１５０＿ａは後の工程でプローブ１３１の遊離末端１３１＿ａと連結される。

ランダムプライマー１５０の他端１５０＿ｂにはマーカー１６０を連結することができる。マーカー１６０はハイブリダイゼーションアッセイを容易にする物質であって、検出方法に応じて多様な物質を使用することができる。検出方法は、例えば、蛍光検出法、電気化学的検出法、質量変化を利用した検出法、電荷量変化を利用した検出法、または光学的性質の差異を利用した検出法などを含み得る。蛍光検出法を利用する場合、マーカー１６０は、例えば蛍光物質でありうる。蛍光物質は、例えば、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、またはユウロピウム（ｅｕｒｏｐｉｕｍ）などでありうる。しかし、ランダムプライマー１５０にマーカー１６０を連結するのは一つの例示に過ぎず、この他にも本発明の技術分野で広く知られた様々な方法を利用できることはもちろんである。

この時、基板１１０上に形成されたプローブ１３１の３’末端は基板１１０上にカップリングされた固定末端１３１＿ｂであり、５’末端は基板１１０に固定されない遊離末端１３１＿ａである。

続いて、図４を参照してランダムプライマー１５０の一端１５０＿ａをプローブ１３１の遊離末端１３１＿ａ方向に伸張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：２１０）させる。

例えば、ポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を含むライゲーション溶液（ｌｉｇａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）でマイクロアレイを処理して、ランダムプライマー１５０の一端１５０＿ａから目的試料１４０に相補的な塩基を形成することができる。したがって、連結溶液には目的試料１４０に相補的な塩基を形成する塩基材料、例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰを含むデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ：ｄｅｏｘｉＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＴｒｉＰｈｏｓｏｈａｔｅ ｍｉｘｔｕｒｅ）を含み得る。

さらに、前記ライゲーション溶液に含まれる物質、例えば、ポリメラーゼ酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸などを前述したアニリング溶液（図３の説明参照）に含めて使うこともできる。この場合、前述したアニリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）および伸張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）の工程がいくつかのプローブ−目的試料ハイブリダイゼーション構造（ｐｒｏｂｅ−ｔａｒｇｅｔ ｓａｍｐｌｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）で同時多発的に行われうる。

続いて、図５を参照してランダムプライマーの伸張領域１７０の一端１７０＿ａとプローブ１３１の遊離末端１３１＿ａを連結する。

前述したように、ポリメラーゼによってランダムプライマー１５０から伸張した塩基はランダムプライマーの伸張領域１７０を形成する。これと共に、ランダムプライマーの伸張領域１７０の一端１７０＿ａをプローブ１３１の遊離末端１３１＿ａと直接ライゲーションする。ここで、「直接ライゲーションする」ということは追加的な塩基を合成せず、両末端を化学結合、例えば、リン酸エステル結合に連結することを意味しうる。

ランダムプライマーの伸張領域１７０の一端１７０＿ａおよびプローブ１３１の遊離末端１３１＿ａを連結するものは例えば、リガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）を使用することができる。リガーゼはエネルギーを利用して二つの分子を結合させる酵素として、さらに具体的にはリン酸エステル結合を生成するＤＮＡリガーゼを使用することができる。しかし、リガーゼの種類はプローブ１３１および目的試料１４０の種類や目的によって多様でありうるため、前記例に限定されないものであろう。

ランダムプライマーの伸張領域１７０の一端およびプローブ１３１の遊離末端１３１＿ａを連結するためには、適切な条件、例えば、約３７℃の温度、および約１時間の処理時間などの条件下で連結反応を誘導することができる。

続いて、図６を参照してプローブ１３１とハイブリダイゼーションされた目的試料１４０を除去して残存するランダムプライマー１５０の強度を測定する。

プローブ１３１とハイブリダイゼーションされた目的試料１４０を除去することはプローブ１３１と目的試料１４０との間の水素結合を除去することを含み得る。

前述したように、互いに異なる配列を有するプローブ１３１、１３２が固定された相異なるプローブセル領域（Ａ：例えば、Ａ１およびＡ２）の間にはハイブリダイゼーションの可否の差異が生じうるため、任意のプローブセル領域（Ａ１）上のプローブ１３１とのみ目的試料がハイブリダイゼーションされる（図２参照）。したがって、前記の工程、具体的にアニリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、伸張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、およびライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）工程を経た後、目的試料１４０に含まれた配列と相補的な配列を有するプローブ１３１だけがランダムプライマーの伸張領域１７０、およびランダムプライマー１５０と連結されることができる。

これに反して、目的試料がハイブリダイゼーションされないプローブ１３２、言い換えれば目的試料１４０に含まれた配列と相補的な配列を有しないプローブ１３２は目的試料を処理する前である基板上面１１１に固定されたプローブ（図１の１３０参照）状態をそのまま維持する。

続いて、ランダムプライマー１５０と連結されたプローブ１３１の強度を測定することはランダムプライマー１５０の他端１５０＿ｂと連結されたマーカー１６０の強度を測定することを含み得る。その他にもランダムプライマー１５０と連結されたプローブ１３１の強度を測定する多様な方法があって、例えば、蛍光検出法ではマーカー１６０は蛍光物質を含みそれぞれのプローブ１３１と連結された蛍光物質から測定された蛍光強度によって目的試料がランダムな配列を含むかどうかを確認することができる。

または、図７に示すようにランダムプライマー１５０にマーカー（図５の１６０参照）を連結せず、前述したランダムプライマー１５０の伸張工程で使用された連結溶液に蛍光物質を含む塩基材料を含むことで、ランダムプライマー１５０の伸張と共にランダムプライマー蛍光伸張領域１７２を形成することができる。したがって、ランダムプライマー蛍光伸張領域１７２の強度を測定して目的試料１４０およびプローブ１３１のハイブリダイゼーション強度を測定する方法も可能である。その他にも多様なアッセイ方法によってハイブリダイゼーション強度を測定することができる。

本発明の一実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法によれば、マーカーと連結されたランダムプライマーを使用しランダムプライマーがプローブに近接した位置で目的試料と結合するようにすることで、ランダムプライマーの伸張領域の長さを減らせることができる長所がある。すなわち、ランダムプライマーが結合した位置およびプローブの遊離末端の間の長さが短くなり、目的試料の安定した２次構造形成を防止することができる。したがって、ランダムプライマーからプローブまでの伸張が円滑に進行されて目的試料とハイブリダイゼーションされたプローブおよびランダムプライマーの連結が漏れる可能性が低くなるため、マイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイのアッセイ効率がさらに向上されることができる。

以下、図８および図９を参照して本発明の他の実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法を説明する。図８および図９は、本発明の他の実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法の断面図である。本発明の他の実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法は、ランダムプライマーの結合位置において本発明の一実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法と差異がある。

したがって、以下では本発明の他の実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法を、前記差異点を中心に図３以後の工程について説明する。同一な図面符号は実質的に同一な構成要素を指称し、その説明を省略または簡略化する。

先ず、図８を参照して目的試料１４０にランダムプライマー１５０を結合するものの、プローブ１３１の遊離末端１３１＿ａと隣接した位置に結合する。

ここで、隣接した位置とは、ランダムプライマー１５０の一端１５０＿ａおよびプローブ１３１の遊離末端１３１＿ａとの間に追加的な塩基が形成される空間がないが、化学的に連結していない状態を意味し得る。例えば、目的試料１４０の配列が（３’）……Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ａ……（５’）であると仮定すれば、ランダムプライマー１５０およびプローブ１３１の関係は次のようでありうる。

前記の上段は、目的試料１４０であり、下段左側の青色ボックスはランダムプライマー１５０であり、下段右側の赤色ボックスはプローブ１３１である。上段と下段を連結する灰色線は相補的な塩基に対する水素結合を示し、ハイフン（−）は化学的に連結された状態を示す。下段中央の緑色ボックスで示すように、ランダムプライマー１５０の一端１５０＿ａの’Ｃ’とプローブ１３１の遊離末端１３１＿ａである’Ｔ’との間に追加的に形成される塩基が存在しないが、化学的に’Ｃ’と’Ｔ’連結されていない。

続いて、図９を参照してランダムプライマー１５０の一端１５０＿ａとプローブ１３１の遊離末端１３１＿ａを直接連結して、プローブ１３１とハイブリダイゼーションされた目的試料１４０を除去する。

ランダムプライマー１５０の一端１５０＿ａとプローブ１３１の遊離末端１３１＿ａを直接連結することは本発明の一実施形態によるマイクロアレイのハイブリダイゼーションアッセイ方法とは異なり、ポリメラーゼによるランダムプライマー１５０の伸張工程が省略されて、さらに効率的でありうる。また、両者の連結反応においてはリガーゼを使用することができる。ランダムプライマー１５０の一端１５０＿ａおよびプローブ１３１の遊離末端１３１＿ａを連結するために、適切な温度および時間の条件下で、例えば３７度から３０分の間反応させて連結反応を誘導することができる。

この後、プローブ１３１とハイブリダイゼーションされた目的試料１４０を除去し、マーカー１６０の強度を測定することは本発明の一実施形態によるマイクロアレイのハイブリダイゼーションアッセイ方法と実質的に同一であるといえる。

本発明の他の実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法によれば、プローブと隣接した位置でランダムプライマーが目的試料とアニリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）してランダムプライマーの伸張工程が省略される。これで、目的試料の長さが長い場合でもプローブとランダムプライマーが直接ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）されうる。したがって、目的試料にプローブとランダムプライマーがそれぞれ結合する位置の間で目的試料の安定した２次構造が形成できる空間的マージンが不足され、ランダムプライマーおよび目的試料とハイブリダイゼーションされたプローブがさらに容易に連結されうる。結局、目的試料の配列がランダムな配列を含んでいるのかをさらに正確に検出することができる。すなわち、マイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイのアッセイ効率がさらに向上される長所がある。

以下、図１０を参照して本発明のまた他の実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法を説明する。図１０は、本発明のまた他の実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法の断面図である。本発明のまた他の実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法はプローブの遊離末端が５’という点から本発明の一実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法と差異がある。したがって、以下では本発明のまた他の実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法を、前記差異点を中心に図３以後の工程について説明する。

図１０を参照してプローブ１３１の遊離末端１３１＿ａをランダムプライマー１５０の一端１５０＿ａ方向に伸張２２０させる。

図４で説明したように、例えば、ポリメラーゼを含むライゲーション溶液でマイクロアレイを処理してプローブ１３１を伸張２２０させることができる。本発明のまた他の実施形態によるマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法において、プローブ１３１の遊離末端１３１＿ａが３’であるため、ポリメラーゼによる伸張２２０方向は遊離末端１３１＿ａからランダムプライマー１５０の一端１５０＿ａ方向になる。

別途の図面で図示しなかったが、前述したように蛍光物質を含む塩基を塩基材料に用いて、ランダムプライマー１５０の他端１５０＿ｂをマーカー１６０と結合しないこともある。また、図面に図示しなかったが、図８で説明したようにプローブ１３１の遊離末端１３１＿ａが３’末端でありつつ、ランダムプライマー１５０が隣接して形成されれば、ポリメラーゼによる伸張なしでランダムプライマー１５０およびプローブ１３１の直接ライゲーションする実施形態も可能であろう。

以上、添付された図面を参照して本発明の実施形態を説明したが、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者は、本発明のその技術的思想や必須の特徴を変更しない範囲で他の具体的な形態で実施され得るということを理解することができる。したがって、以上で記述した実施形態はすべての面で例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。
＜実施例＞
実験対象になったＳＮＰは９個の人間遺伝子で総１１個のＳＮＰ位置を含むＳＮＰナンバー（ｎｕｍｂｅｒ） １から１１、総２２ ｓｅｑｕｅｎｃｅであった。前記人間遺伝子の塩基配列は次のようである。

目的試料（１００μｌ（０．１ ｎｇ／μｌ））を含んだ目的試料溶液でマイクロアレイを処理して、４５度で１時間の間処理して、目的試料がプローブにハイブリダイゼーションされるようにした。この時、実験１ではＣｏｍｂｉｍａｔｒｉｘ社の特許文献ＵＳ ２００６０２４０４４３に開示された方法によって、５’にＣｙ５表示されたオリゴヌクレオチド検出プライマー（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒ）（最終濃度２μＭ、５’／Ｃｙ５／ＧＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ）を、実験２から４ではそれぞれ４、６、８ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓの５’にＣｙ３表示されたランダムプライマー（最終濃度２μＭ）をハイブリダイゼーション溶液に混ぜてハイブリダイゼーションさせた。続いて、ＰＢＳＴ ｂｕｆｆｅｒで１分間２回、ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒで１分間２回、ｌｉｇａｓｅ ｂｕｆｆｅｒで１分間１回洗浄してマイクロアレイを洗いおとした。

洗浄されたマイクロアレイは３７度で３０分間１００μｌの重合および連結溶液（Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ ８４ μｌ、 １０Ｘ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ １０ μｌ、 １０ｍＭ ｄＮＴＰ ２ μｌ、 ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標） ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、 Ｓｔｏｆｆｅｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ２ μｌ、 ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ （Ｅ． ｃｏｌｉ） ２ μｌ）でそれぞれマイクロアレイを処理してランダムプライマーと目的試料の結合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、伸張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）を誘導した。

続いて、実験１から４の方法で処理されたそれぞれのマイクロアレイのＳＮＰの塩基を調べ、その結果を次の表１に示した。

前記実験１から４ではチップ当たり４個の試料を処理できるカスタマイズマイクロアレイ（ｃｏｍｂｉｍａｔｒｉｘ、ＵＳＡ）を使用した。このマイクロアレイは１１個のＳＮＰ位置に対してそれぞれＡ（Ａｄｅｎｉｎｅ、アデニン）、Ｃ（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ、シトシン）、Ｇ（Ｇｕａｎｉｎｅ、グアニン）、Ｔ（Ｔｈｙｍｉｎｅ、チミン）の四個のスポット（ｓｐｏｔ）をワンセットとし、このようなセットはマイクロアレイ上に互いに異なる位置に２３個ずつ反復的に配置され存在する。そして、遺伝子型の決定は２３個の同一プローブで検出された蛍光信号の中間値と標準偏差を有し統計処理によって一つのＳＮＰ位置に属するＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔスポットを相対比較して計算した。

前記表２で塩基配列分析結果列（ｃｏｌｕｍｎ）は、標準的な遺伝子塩基配列分析法によって知らされた遺伝子型を示すものであって、実験１から実験４までの列は各マイクロアレイ実験結果による遺伝子型を示すものであり、赤い文字は遺伝子型検出に失敗または（ｎｏ ｃａｌｌ）誤った遺伝子型を検出した場合を示すものである。
前記表２を調べれば、実験１が６／１１（５５％）、実験２が０／１１（０％）、実験３が６／１１（５５％）、および実験４が８／１１（７３％）で、それぞれの正確度を示した。ここから、６マーのランダムプライマーを使用する場合には少なくとも既存方法と同等な正確度を示すことができ、さらに８ヌクレオチドｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ長さのランダムプライマーを使用すれば既存方法より正確度を高めることができるということが分かった。

１１０ 基板
１１１ 基板上面
１２０ リンカー
１３０、１３１、１３２ プローブ
１４０ 目的試料
１５０ ランダムプライマー
１６０ マーカー
１７０ ランダムプライマーの伸張領域
１７１ プローブ伸張領域
１７２ ランダムプライマー蛍光伸張領域
２１０、２２０ 伸張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）

Claims (18)

1. 複数のプローブが形成されたマイクロアレイを提供する工程；
   前記複数のプローブに目的試料（ｔａｒｇｅｔ ｓａｍｐｌｅ）とランダムな配列から成るランダムプライマーをハイブリダイゼーションする工程：、
   前記各プローブの遊離末端（ｆｒｅｅ ｔｅｒｍｉｎａｌ）および前記ランダムプライマーの前記各プローブ側の一端をライゲーションする工程；
   前記各プローブとハイブリダイゼーションされた前記目的試料を除去する工程;及び
   残存する前記ランダムプライマーの強度を測定する工程を含む、マイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法。
2. 前記ランダムプライマーは、４ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）以上１０ヌクレオチド長さ以下である、請求項１に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法。
3. 前記ランダムプライマーは、８ヌクレオチド長さである、請求項２に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法。
4. 前記ランダムプライマーの他端はマーカーと連結された、請求項１に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法。
5. 前記マーカーは、蛍光物質である、請求項４に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法。
6. 前記各プローブの遊離末端および前記ランダムプライマーの前記各プローブ側の一端を連結する工程が、
   リガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）を利用して前記各プローブの前記遊離末端に前記ランダムプライマーの一端を直接ライゲーションする工程である、請求項１に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法。
7. 前記各プローブの前記遊離末端は５’末端である、請求項１に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法。
8. ハイブリダイゼーションされた前記各プローブの遊離末端および前記ランダムプライマーの前記各プローブ側の一端を連結する工程が、
   前記ランダムプライマーの一端から前記ランダムプライマーを伸張して、前記目的試料に相補的なランダムプライマーの伸張領域を形成する工程;及び
   リガーゼを利用して前記各プローブの遊離末端と前記ランダムプライマーの伸張領域の一端を連結する工程を含む、請求項７に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法。
9. 前記各プローブの前記遊離末端は、３’末端である、請求項１に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法。
10. ハイブリダイゼーションされた前記各プローブの遊離末端および前記ランダムプライマーの前記各プローブ側の一端を連結する工程が、
    前記各プローブの遊離末端から前記各プローブを伸張して、前記目的試料に相補的なプローブ伸張領域を形成する工程;及び
    リガーゼを利用して前記ランダムプライマーの一端と前記プローブ伸張領域を連結する工程を含む、請求項９に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法。
11. 前記目的試料は、プローブとハイブリダイゼーションされた部分を除いた余分の長さが９マー（ｍｅｒｓ）以上である、請求項１に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法。
12. 目的試料およびランダムな配列から成るランダムプライマーをハイブリダイゼーションされた複数のプローブを含むマイクロアレイに提供する工程;
    リガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）を含む連結溶液で前記マイクロアレイを処理する工程；
    前記マイクロアレイを洗浄する工程;
    前記マイクロアレイのハイブリダイゼーション程度を測定する工程を含む、マイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法。
13. 前記ランダムプライマーは、４ヌクレオチド以上１０ヌクレオチド長さ以下である、請求項１２に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法。
14. 前記ランダムプライマーは、８ヌクレオチド長さである、請求項１３に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法。
15. 前記ランダムプライマーは一端が蛍光物質と連結したものを含み、
    前記蛍光物質と連結された前記ランダムプライマーおよびリガーゼを含むライゲーション溶液で前記マイクロアレイを処理することを含む、請求項１２に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法。
16. 前記連結溶液はポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）をさらに含む、請求項１５に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法。
17. 前記連結溶液は、ポリメラーゼおよび蛍光表示された塩基を含む、請求項１２に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法。
18. 前記目的試料は、プローブとハイブリダイゼーションされた部分を除いた余分の長さが９マー以上である、請求項１２に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ方法。