CN116249785A - 用于抗原-受体的空间转录组学 - Google Patents
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Abstract
本文提供了用于检测生物样品内免疫细胞克隆型和免疫细胞分析物的方法、组合物和试剂盒。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年6月2日提交的美国临时专利申请号63/033,568的优先权。该申请的内容通过引用整体并入本文。
背景技术
由于不同细胞内不同的分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)，故组织内的细胞在细胞形态和/或功能上具有差异。细胞在组织内的具体位置(例如，细胞相对于相邻细胞的位置或细胞相对于组织微环境的位置)可影响例如细胞的形态、分化、命运、活力、增殖、行为、信号传导以及与组织中的其他细胞的串扰。
先前研究空间异质性使用的技术通常提供完整组织或组织的一部分(例如，组织切片)的背景下少数几个分析物的数据，或提供单个单细胞的大量分析物数据，但未能提供关于单细胞在原始生物样品(例如，组织)中的位置的信息。
了解完整生物样品或其一部分内免疫细胞克隆型(例如，T-细胞受体、B-细胞受体)的背景下的空间异质性可深入了解哪些细胞或细胞类型特异性T-细胞或B-细胞克隆型可能在相互作用。单细胞方法可鉴定克隆型群体，但无法将生物样品内免疫细胞克隆型的空间组织联系起来。
发明内容
需要对生物样品内T-细胞受体(TCR)和B-细胞受体(BCR)克隆型的空间异质性有基本的了解，以了解TCR或BCR可能与哪些细胞相互作用、给定生物样品中TCR和/或BCR克隆型的身份、或在不同的自身免疫病症中具有自体反应性的TCR和/或BCR克隆型的身份。众多的单细胞测序方法可从生物样品鉴定TCR和BCR克隆型，然而，目前需要将TCR和BCR序列与生物样品内的空间位置联系起来的方法。另外，鉴定克隆区，即由可变(V)、多样化(D)和接合(J)区段接合形成互补决定区(包括CDR1、CDR2和CDR3，其为TCR和/或BCR提供特异性)的位置限定区域，在理解TCR和BCR生物学相互作用方面是重要的。通过将克隆信息与空间信息相结合，可以了解哪些T-细胞和B-细胞克隆型可与生物样品内的给定细胞类型发生特异性相互作用。
本文提供了用于确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型的存在和/或丰度的方法。本文描述的任何方法的一些实施方案包括捕获转录物以鉴定免疫细胞克隆型。本文的任何方法的一些实施方案包括从所捕获的转录物生成核酸文库。本文描述的任何方法的一些实施方案包括富集核酸文库中的目的分析物，包括用以鉴定免疫细胞克隆型的分析物。
本文提供了用于确定生物样品中一定位置处免疫细胞受体的存在和/或丰度的方法。本文描述的任何方法的一些实施方案包括捕获分析物以鉴定免疫细胞受体。本文描述的任何方法的一些实施方案包括从所捕获的分析物生成核酸文库。这里描述的任何方法的一些实施方案包括富集核酸文库中的目的分析物，包括用以鉴定免疫细胞受体的分析物。
因此，本文提供了用于确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型的存在和/或丰度的方法，所述方法包括：(a)使生物样品与包括多个捕获探针的阵列接触，其中所述多个捕获探针的捕获探针包括(i)空间条形码和(ii)与编码免疫细胞克隆型的免疫细胞受体的核酸结合的捕获结构域；和(b)确定(i)空间条形码的全部或部分序列或其补体，和(ii)编码免疫细胞受体的核酸的全部或部分序列或其补体，并使用(i)和(ii)的确定序列来确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型的存在和/或丰度。
在一些实施方案中，免疫细胞克隆型为T细胞克隆型。在一些实施方案中，T细胞克隆型为T细胞受体α链。在一些实施方案中，捕获结构域与编码T细胞受体α链的恒定区的核酸序列结合。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码T细胞受体α链的CDR3的序列。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码T细胞受体α链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码T细胞受体α链的全长可变结构域的序列。
在一些实施方案中，免疫细胞受体为T细胞受体β链。在一些实施方案中，捕获结构域与编码T细胞受体β链的恒定区的核酸序列特异性结合。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码T细胞受体β链的CDR3的序列。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码T细胞受体β链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码T细胞受体β链的全长可变结构域的序列。
在一些实施方案中，免疫细胞克隆型为B细胞克隆型。在一些实施方案中，B细胞克隆型为免疫球蛋白κ轻链。在一些实施方案中，捕获结构域与编码免疫球蛋白κ轻链的恒定区的核酸序列特异性结合。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码免疫球蛋白κ轻链的CDR3的序列。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码免疫球蛋白κ轻链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码免疫球蛋白κ轻链的全长可变结构域的序列。在一些实施方案中，B细胞克隆型为免疫球蛋白λ轻链。在一些实施方案中，捕获结构域与编码免疫球蛋白λ轻链的恒定区的核酸序列特异性结合。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码免疫球蛋白λ轻链的CDR3的序列。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码免疫球蛋白λ轻链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码免疫球蛋白λ轻链的全长可变结构域的序列。在一些实施方案中，B细胞克隆型为免疫球蛋白重链。在一些实施方案中，捕获结构域与编码免疫球蛋白重链的恒定区的核酸序列特异性结合。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码免疫球蛋白重链的CDR3的序列。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码免疫球蛋白重链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码免疫球蛋白重链的全长可变结构域的序列。
在一些实施方案中，捕获结构域与编码免疫细胞克隆型的核酸的poly(A)序列结合。在一些实施方案中，捕获结构域与编码T细胞克隆型的核酸序列结合。在一些实施方案中，T细胞克隆型为T细胞受体α链、T细胞受体β链及其组合。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定：编码T细胞受体α链的CDR3的序列、编码T细胞受体β链的CDR3的序列及其组合。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定：编码T细胞受体α链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列、编码T细胞受体β链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列及其组合。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定：编码T细胞受体α链的全长可变结构域的序列、编码T细胞受体β链的全长可变结构域的序列及其组合。
在一些实施方案中，捕获结构域与编码B细胞克隆型的核酸结合。在一些实施方案中，B细胞克隆型为免疫球蛋白κ轻链、免疫球蛋白λ轻链、免疫球蛋白重链及其组合。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定：编码免疫球蛋白κ轻链的CDR3的序列、编码免疫球蛋白λ轻链的CDR3的序列、编码免疫球蛋白重链的CDR3的序列及其组合。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定：编码免疫球蛋白κ轻链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列、编码免疫球蛋白λ轻链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列、编码免疫球蛋白重链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列及其组合。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定：编码免疫球蛋白κ轻链的全长可变结构域的序列、编码免疫球蛋白λ轻链的全长可变结构域的序列、编码免疫球蛋白重链的全长可变结构域的序列及其组合。
在一些实施方案中，步骤(b)包括捕获探针使用编码免疫细胞受体的核酸作为模板，从而生成延伸的捕获探针。在一些实施方案中，步骤(b)包括延伸捕获探针的3’末端。
在一些实施方案中，步骤(b)包括生成第二核酸链，所述第二核酸链包括(i)与空间条形码的全部或部分互补的序列，和(ii)对应于编码免疫细胞受体的核酸的全部或部分序列的序列。
在一些实施方案中，捕获探针包括切割结构域、功能结构域、唯一分子标识符或其任何组合。在一些实施方案中，捕获探针包括功能结构域。
在一些实施方案中，步骤(b)包括生成第二核酸链，所述第二核酸链包括(i)与功能结构域的全部或部分互补的序列，(ii)与空间条形码的全部或部分互补的序列，和(iii)对应于编码免疫细胞受体的核酸的全部或部分序列的序列。
在一些实施方案中，所述方法包括富集编码免疫细胞克隆型的免疫细胞受体的核酸。
在一些实施方案中，富集包括将多个杂交探针与编码免疫细胞克隆型的免疫细胞受体的核酸杂交，其中杂交探针包括(i)与编码免疫细胞受体的核酸的一部分互补的序列和(ii)与捕获部分相互作用的结合部分。
在一些实施方案中，结合部分包括生物素而捕获部分包括链霉亲和素。
在一些实施方案中，富集编码免疫细胞克隆型的免疫细胞受体的核酸包括一个或多个封闭探针。在一些实施方案中，所述一个或多个封闭探针包括与SEQ ID NO：639具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个封闭探针包括与SEQ ID NO：640具有至少80％同一性的序列。
在一些实施方案中，所述方法包括使用(i)包括功能结构域的全部或部分的第一引物，其中所述功能结构域为空间条形码的5’，和(ii)包括与编码免疫细胞受体的可变区的序列的一部分基本上互补的序列的第二引物，来扩增编码免疫细胞克隆型的免疫细胞受体的核酸或其补体。
在一些实施方案中，所述方法包括使用(i)包括功能结构域的全部或部分的第一引物，其中所述功能结构域为空间条形码的5’，和(ii)包括与编码免疫细胞受体的可变区的核酸序列的一部分基本上互补的序列的第三引物，其中所述第三引物为第二引物的5’，来扩增编码免疫细胞克隆型的免疫细胞受体的核酸或其补体。
在一些实施方案中，生物样品包括组织样品。在一些实施方案中，组织样品为组织切片。在一些实施方案中，组织切片为固定的组织切片。在一些实施方案中，固定的组织切片为福尔马林固定石蜡包埋的组织切片。
在一些实施方案中，组织切片包括肿瘤区域。
在一些实施方案中，编码免疫细胞受体的核酸包括RNA。在一些实施方案中，RNA为mRNA。在一些实施方案中，编码免疫细胞受体的核酸包括DNA。在一些实施方案中，DNA为基因组DNA。
在一些实施方案中，所述方法包括对生物样品成像。
在一些实施方案中，步骤(b)中的确定包括对(i)空间条形码的全部或部分序列或其补体和(ii)编码免疫细胞受体的核酸的全部或部分序列或其补体测序。
在一些实施方案中，步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型的存在。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型的丰度。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型的存在和丰度。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处两种或更多种免疫细胞克隆型的存在。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处两种或更多种免疫细胞克隆型的丰度。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处两种或更多种免疫细胞克隆型的存在和丰度。在一些实施方案中，所述方法包括比较所述两种或更多种免疫细胞克隆型。在一些实施方案中，所述两种或更多种免疫细胞克隆型各自为B细胞克隆型。
在一些实施方案中，所述两种或更多种免疫细胞克隆型各自为T细胞克隆型。在一些实施方案中，所述两种或更多种免疫细胞克隆型包含至少一种T细胞克隆型和至少一种B细胞克隆型。
本文还提供了用于确定生物样品中一定位置处免疫细胞受体的存在和/或丰度的方法，所述方法包括：(a)使生物样品与包括多个捕获探针的阵列接触，其中所述多个捕获探针的捕获探针包括(i)空间条形码和(ii)与编码免疫细胞受体的核酸特异性结合的捕获结构域；和(b)确定(i)空间条形码的全部或部分序列或其补体，和(ii)编码免疫细胞受体的核酸的全部或部分序列或其补体，并使用(i)和(ii)的确定序列来确定生物样品中一定位置处免疫细胞受体的存在和/或丰度。
在一些实施方案中，免疫细胞受体为T细胞受体α链。在一些实施方案中，捕获结构域与编码T细胞受体α链的恒定区的核酸序列特异性结合。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码T细胞受体α链的CDR3的序列。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码T细胞受体α链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码T细胞受体α链的全长可变结构域的序列。在一些实施方案中，免疫细胞受体为T细胞受体β链。在一些实施方案中，捕获结构域与编码T细胞受体β链的恒定区的核酸序列特异性结合。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码T细胞受体β链的CDR3的序列。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码T细胞受体β链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定T细胞受体β链的全长可变结构域。在一些实施方案中，免疫细胞受体为免疫球蛋白κ轻链。在一些实施方案中，捕获结构域与编码免疫球蛋白κ轻链的恒定区的核酸序列特异性结合。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码免疫球蛋白κ轻链的CDR3的序列。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码免疫球蛋白κ轻链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码免疫球蛋白κ轻链的全长可变结构域的序列。在一些实施方案中，免疫细胞受体为免疫球蛋白λ轻链。在一些实施方案中，捕获结构域与编码免疫球蛋白λ轻链的恒定区的核酸序列特异性结合。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码免疫球蛋白λ轻链的CDR3的序列。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码免疫球蛋白λ轻链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码免疫球蛋白λ轻链的全长可变结构域的序列。在一些实施方案中，免疫细胞受体为免疫球蛋白重链。在一些实施方案中，捕获结构域与编码免疫球蛋白重链的恒定区的核酸序列特异性结合。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码免疫球蛋白重链的CDR3的序列。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码免疫球蛋白重链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定编码免疫球蛋白重链的全长可变结构域的序列。
在一些实施方案中，捕获结构域与编码免疫细胞受体的核酸的poly(A)序列结合。在一些实施方案中，免疫细胞受体为T细胞受体α链、T细胞受体β链及其组合。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定：编码T细胞受体α链的CDR3的序列、编码T细胞受体β链的CDR3的序列及其组合。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定：编码T细胞受体α链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列、编码T细胞受体β链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列及其组合。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定：编码T细胞受体α链的全长可变结构域的序列、编码T细胞受体β链的全长可变结构域的序列及其组合。
在一些实施方案中，免疫细胞受体为B细胞受体免疫球蛋白κ轻链、免疫球蛋白λ轻链、免疫球蛋白重链及其组合。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定：编码免疫球蛋白κ轻链的CDR3的序列、编码免疫球蛋白λ轻链的CDR3的序列、编码免疫球蛋白重链的CDR3的序列及其组合。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定：编码免疫球蛋白κ轻链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列、编码免疫球蛋白λ轻链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列、编码免疫球蛋白重链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列及其组合。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定：编码免疫球蛋白κ轻链的全长可变结构域的序列、编码免疫球蛋白λ轻链的全长可变结构域的序列、编码免疫球蛋白重链的全长可变结构域的序列及其组合。
在一些实施方案中，步骤(b)包括使用编码免疫细胞受体的核酸作为模板延伸捕获探针的末端，从而生成延伸的捕获探针。在一些实施方案中，步骤(b)包括延伸捕获探针的3’末端。
在一些实施方案中，步骤(b)包括生成第二核酸链，所述第二核酸链包括(i)与空间条形码的全部或部分互补的序列，和(ii)对应于编码免疫细胞受体的核酸的全部或部分序列的序列。
在一些实施方案中，捕获探针包括切割结构域、功能结构域、唯一分子标识符或其任何组合。在一些实施方案中，捕获探针包括功能结构域。
在一些实施方案中，步骤(b)包括生成第二核酸链，所述第二核酸链包括(i)与功能结构域的全部或部分互补的序列，(ii)与空间条形码的全部或部分互补的序列，和(iii)对应于编码免疫细胞受体的核酸的全部或部分序列的序列。
在一些实施方案中，所述方法包括富集编码免疫细胞受体的核酸。在一些实施方案中，富集包括将多个杂交探针与编码免疫细胞受体的核酸杂交，其中杂交探针包括(i)与编码免疫细胞受体的核酸的一部分互补的序列和(ii)与捕获部分相互作用的结合部分。在一些实施方案中，结合部分包括生物素而捕获部分包括链霉亲和素。在一些实施方案中，富集编码免疫细胞受体的免疫细胞受体的核酸包括一个或多个封闭探针。在一些实施方案中，所述一个或多个封闭探针包括与SEQ ID NO：639具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个封闭探针包括与SEQ ID NO：640具有至少80％同一性的序列。
在一些实施方案中，所述方法包括使用(i)包括功能结构域的全部或部分的第一引物，其中所述功能结构域为第二核酸链中空间条形码的5’，和(ii)包括与编码免疫细胞受体的可变区的序列的一部分基本上互补的序列的第二引物，来扩增编码免疫细胞受体的核酸或其补体。
在一些实施方案中，所述方法包括使用(i)包括功能结构域的全部或部分的第一引物，其中所述功能结构域为空间条形码的5’，和(ii)包括与编码免疫细胞受体的可变区的核酸序列的一部分基本上互补的序列的第三引物，其中所述第三引物为第二引物的5’，来扩增编码免疫细胞受体的核酸或其补体。
在一些实施方案中，生物样品包括组织样品。在一些实施方案中，组织样品为组织切片。在一些实施方案中，组织切片为固定的组织切片。在一些实施方案中，固定的组织切片为福尔马林固定石蜡包埋的组织切片。
在一些实施方案中，组织切片包括肿瘤区域。
在一些实施方案中，编码免疫细胞受体的核酸包括RNA。在一些实施方案中，RNA为mRNA。在一些实施方案中，编码免疫细胞受体的核酸包括DNA。在一些实施方案中，DNA为基因组DNA。
在一些实施方案中，所述方法包括在步骤(b)之前使生物样品与核糖体RNA耗尽探针和线粒体RNA耗尽探针接触。
在一些实施方案中，所述方法包括对生物样品成像。
在一些实施方案中，步骤(b)中的确定包括对(i)空间条形码的全部或部分序列或其补体和(ii)编码免疫细胞受体的核酸的全部或部分序列或其补体测序。
在一些实施方案中，步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处免疫细胞受体的存在。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处免疫细胞受体的丰度。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处免疫细胞受体的存在和丰度。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处两种或更多种免疫细胞受体的存在。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处两种或更多种免疫细胞受体的丰度。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处两种或更多种免疫细胞受体的存在和丰度。在一些实施方案中，所述方法包括比较所述两种或更多种免疫细胞受体。在一些实施方案中，所述两种或更多种免疫细胞克隆型各自为B细胞的免疫细胞受体。在一些实施方案中，所述两种或更多种免疫细胞克隆型各自为T细胞的免疫细胞受体。在一些实施方案中，所述两种或更多种免疫细胞克隆型包含T细胞的至少一种免疫细胞受体和来自B细胞的至少一种免疫细胞受体。
本文还提供了包括多个捕获探针的阵列，其中所述多个捕获探针的捕获探针包括(i)空间条形码和(ii)与编码免疫细胞克隆型的免疫细胞受体的核酸结合的捕获结构域。
在一些实施方案中，免疫细胞克隆型为T细胞克隆型。在一些实施方案中，免疫细胞受体为T细胞受体α链。在一些实施方案中，捕获结构域与编码T细胞受体α链的恒定区的核酸序列特异性结合。在一些实施方案中，免疫细胞受体为T细胞受体β链。在一些实施方案中，捕获结构域与编码T细胞受体β链的恒定区的核酸序列特异性结合。
在一些实施方案中，免疫细胞克隆型为B细胞克隆型。在一些实施方案中，免疫细胞受体为免疫球蛋白κ轻链。在一些实施方案中，捕获结构域与编码免疫球蛋白κ轻链的恒定区的核酸序列特异性结合。在一些实施方案中，免疫细胞受体为免疫球蛋白λ轻链。在一些实施方案中，捕获结构域与编码免疫球蛋白λ轻链的恒定区的核酸序列特异性结合。在一些实施方案中，免疫细胞受体为免疫球蛋白重链。在一些实施方案中，捕获结构域与编码免疫球蛋白重链的恒定区的核酸序列特异性结合。
在一些实施方案中，捕获探针包括切割结构域、功能结构域、唯一分子标识符或其任何组合。
本文还提供了试剂盒，其包括本文描述的阵列中的任何一个；一个或多个杂交探针，其中杂交探针包括(i)与编码免疫细胞受体的核酸基本上互补的序列和(ii)与捕获部分相互作用的结合部分；和一个或多个封闭探针。
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，其引用的程度犹如每个个别出版物、专利、专利申请或信息项被具体地和单独地指出通过引用并入。如果通过引用并入的出版物、专利、专利申请和信息项与本说明书中包含的公开内容相矛盾，则本说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。
在以范围描述值的情况下，应理解，该描述包括公开这样的范围内所有可能的子范围，以及落入这样的范围内的具体数值，而不管明确陈述的是具体数值还是具体子范围。
在提及项目集合而使用时，术语“各”旨在识别集合中的单个项目但不一定是指集合中的每个项目，除非另有明确说明，或除非使用的上下文另有明确指示。
本文描述了本公开的特征的各种实施方案。然而，应理解，这样的实施方案仅作为实例提供，并且本领域技术人员可想到许多变化、改变和取代而不偏离本公开的范围。还应理解，本文描述的具体实施方案的各种替代方案也在本公开的范围内。
附图说明
以下附图示意了本公开的特征和优点的某些实施方案。这些实施方案不旨在以任何方式限制附随的权利要求书的范围。附图中相同的参考符号指示相同的元件。
图1为示出如本文所述的加有条形码的捕获探针的一个实例的示意图。
图2示出了用于抗原-受体的空间转录组学的示例性工作流程。
图3A示出了具有与分析物的恒定区互补的捕获序列的示例性捕获探针。
图3B示出了具有poly(dT)捕获结构域的示例性捕获探针。
图4示出了使用读段1引物和与分析物的可变区互补的一个或多个引物的示例性富集策略。
图5示出了用连接的测序手柄(P5)和与分析物的恒定区的一部分互补的定制测序引物的示例性测序策略。
图6示出了示出从淋巴结(LN)和脾脏(SP)组织检测到的独特克隆型的数目的图。
图7A示出了与poly(dT)捕获探针相比，用靶向捕获探针检测到的独特T-细胞受体A(TRA)和T-细胞受体B(TRB)克隆型的数目的示例性图。
图7B示出了与poly(dT)捕获探针相比，用靶向捕获探针检测到的独特IG重链克隆型(例如，A、G、M和E克隆型)的数目的示例性图。
图8示出了在有或没有富集策略的情况下，与单细胞(SS2)分析相比，在空间阵列(Vis)上在扁桃体组织中检测到的独特IG克隆型的数目的示例性图。
图9示出了在有或没有富集策略的情况下，在空间阵列上在淋巴结(LN)组织中检测到的独特IG克隆型的数目的示例性图。淋巴结和脾脏(SP)非富集样品充当对照。
图10A示出了H&E染色的扁桃体组织。
图10B示出了由图10A中的扁桃体组织生成的基因表达文库。
图11示出了存在于乳腺肿瘤样品中的T-细胞受体和B-细胞受体克隆型的单细胞聚类分析。
图12示出了具有poly(dT)捕获结构域的示例性捕获探针(顶部)，随后是逆转录以生成分析物的cDNA。
图13示出了B-细胞受体(BCR)、T-细胞受体(TCR)或其他分析物的cDNA文库以及具有富集杂交探针的BCR和TCR池。
图14示出了BCR和TCR特异性富集杂交探针与其在cDNA文库中的相应靶标的杂交。
图15示出了靶向存在于cDNA文库中的各种结构域的封闭寡核苷酸的杂交。
图16A示出了重复的扁桃体切片(顶部和底部)以及BCR和TCR克隆型计数(左)及BCR和TCR唯一分子标识符计数(右)的检测。
图16B示出了示出在图16A的重复的扁桃体切片中发现的独特克隆型的总数的图。
图16C示出了示出按在图16A的重复的扁桃体切片中发现的IGH同种型划分的克隆型计数的图。
图17A示出了H&E染色的扁桃体组织(左)、CD20空间表达(中)和CD138表达(对照)。
图17B示出了扁桃体组织中包括IGHM、IGHG1、IGHA1和IGHD的重链IGH恒定基因(顶部)以及包括IGKC和IGLC2的轻链(底部)的空间表达。
图17C示出了扁桃体组织中CD3E、TRBC1、TRABC2和TRAC的T-细胞特异性空间表达。
图18A示出了在重复实验中在扁桃体组织中检测到的局限于约一个B-细胞滤泡的IG克隆表达(IGKC)。
图18B示出了在重复实验中在扁桃体组织中检测到的局限于B-细胞滤泡的IG克隆表达(IGLC)。
图18C示出了在重复实验中在扁桃体组织中检测到的表达不局限于B-细胞滤泡的IG克隆表达(IGLV3-1、IGLJ2、IGLC2/IGLC3)。
图18D示出了在重复实验中在扁桃体组织中检测到的在单个B-细胞滤泡中的IG克隆表达(IGHM)。
图18E示出了在重复实验中在扁桃体组织中检测到的在B-细胞滤泡外的IG克隆表达(IGHA)表达。
图18F示出了在重复实验中在扁桃体组织中分布在B-细胞滤泡外的代表性T-细胞克隆表达(TRB)。
图18G示出了在重复实验中在扁桃体组织中分布在B-细胞滤泡外的代表性T-细胞克隆表达(TRA)。
图19A示出了重复的乳腺肿瘤样品(肿瘤D1、肿瘤D2)中的克隆型分布以及克隆型计数(左)和UMI计数(右)。
图19B为示出图19A中示出的重复的乳腺肿瘤样品的总克隆型计数的图。
图19C为示出按图19A中示出的重复的乳腺肿瘤样品的IGH同种型划分的克隆型计数的图。
图20示出了图19A中示出的重复的乳腺肿瘤样品的代表性IGH克隆型的分布。
图21A示出了乳腺肿瘤组织中成对的IG受体(IGHG2和IGK)的空间模式(左)和单细胞RNA-seq(右)。
图21B示出了乳腺肿瘤组织中成对的IG受体(IGHG1和IGK)的空间模式(左)和单细胞RNA-seq(右)。
图21C示出了乳腺肿瘤组织中成对的IG受体(IGHG2和IGK)的空间模式(左)和单细胞RNA-seq(右)。
图22示出了用于额外TCR富集的示例性巢式PCR策略。
具体实施方式
需要对生物样品内T-细胞受体(TCR)和B-细胞受体(BCR)克隆型的空间异质性有基本的了解，以了解TCR或BCR可能正在与哪些细胞相互作用、给定生物样品中TCR和/或BCR克隆型的身份、或在不同的自身免疫病症中具有自体反应性的TCR和/或BCR克隆型的身份。众多的单细胞测序方法可从生物样品鉴定TCR和BCR克隆型，然而，目前需要将TCR和BCR序列与生物样品内的空间位置联系起来的方法。另外，需要鉴定克隆区，即由可变(V)、多样化(D)和接合(J)区段接合形成互补决定区(包括CDR1、CDR2和CDR3，其为TCR和/或BCR提供特异性)的位置限定区域，以帮助确定生物学相互作用。通过将克隆信息与空间信息相结合，可以了解哪些T-细胞和B-细胞克隆型可与生物样品内的给定细胞类型发生特异性相互作用。
本文提供了用于确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型的存在和/或丰度的方法。本文描述的任何方法的一些实施方案包括捕获转录物以鉴定免疫细胞克隆型。本文的任何方法的一些实施方案包括从所捕获的转录物生成核酸文库。本文描述的任何方法的一些实施方案包括富集核酸文库中的目的分析物，包括用以鉴定免疫细胞克隆型的分析物。
本文提供了用于确定生物样品中一定位置处免疫细胞受体的存在和/或丰度的方法。本文描述的任何方法的一些实施方案包括捕获分析物以鉴定免疫细胞受体。本文描述的任何方法的一些实施方案包括从所捕获的分析物生成核酸文库。这里描述的任何方法的一些实施方案包括富集核酸文库中的目的分析物，包括用以鉴定免疫细胞受体的分析物。
本文描述的空间分析方法和组合物可以高空间分辨率提供生物样品内各种各样的分析物的大量分析物和/或表达数据，同时保留天然空间背景。空间分析方法和组合物可包括例如使用包含空间条形码(例如，提供关于分析物在细胞或组织样品(例如，哺乳动物细胞或哺乳动物组织样品)内的地点或位置的信息的核酸序列)和能够与由细胞产生的和/或存在于细胞中的分析物(例如，蛋白质和/或核酸)结合的捕获结构域的捕获探针。空间分析方法和组合物也可包括使用具有捕获中间剂的捕获结构域的捕获探针以间接检测分析物。例如，中间剂可包括与中间剂相关联的核酸序列(例如，条形码)。中间剂的检测因此指示细胞或组织样品中的分析物。
空间分析方法和组合物的非限制性方面见述于以下中：美国专利号10,774,374、10,724,078、10,480,022、10,059,990、10,041,949、10,002,316、9,879,313、9,783,841、9,727,810、9,593,365、8,951,726、8,604,182、7,709,198；美国专利申请公开号2020/239946、2020/080136、2020/0277663、2020/024641、2019/330617、2019/264268、2020/256867、2020/224244、2019/194709、2019/161796、2019/085383、2019/055594、2018/216161、2018/051322、2018/0245142、2017/241911、2017/089811、2017/067096、2017/029875、2017/0016053、2016/108458、2015/000854、2013/171621；WO 2018/091676、WO2020/176788；Rodriques等人，Science 363(6434)：1463-1467，2019；Lee等人，Nat.Protoc.10(3)：442-458，2015；Trejo等人，PLoS ONE 14(2)：e0212031，2019；Chen等人，Science 348(6233)：aaa6090，2015；Gao等人，BMC Biol.15：50，2017；和Gupta等人，Nature Biotechnol.36：1197-1202，2018；Visium空间基因表达试剂盒用户指南(例如，RevC，日期为2020年6月)和/或Visium空间组织优化试剂盒用户指南(例如，Rev C，日期为2020年7月)，二者均在10x基因组学支持文献网站(10x Genomics Support Documentationwebsite)提供，并可以任何组合在本文中使用。本文描述了空间分析方法和组合物的其他非限制性方面。
可用于本公开中的一些通用术语可见于WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(I)(b)节中。通常，“条形码”为传达或能够传达信息(例如，关于样品、珠和/或捕获探针中的分析物的信息)的标签或标识符。条形码可以是分析物的一部分，也可以独立于分析物。条形码可附接到分析物。特定条形码相对于其他条形码可以是唯一的。出于本公开的目的，“分析物”可包括待分析的任何生物物质、结构、部分或组分。术语“目标”可类似地指目的分析物。
在一些实施方案中，分析物为免疫细胞受体。在一些实施方案中，免疫细胞受体为B细胞受体。在一些实施方案中，B细胞受体为免疫球蛋白κ轻链。在一些实施方案中，分析物的可变区包括免疫球蛋白κ轻链的CDR3区。在一些实施方案中，分析物的可变区包括免疫球蛋白κ轻链的CDR1和CDR2中的一者或两者。在一些实施方案中，分析物的可变区包括免疫球蛋白κ轻链的全长可变结构域。
在一些实施方案中，B细胞受体为免疫球蛋白λ轻链。在一些实施方案中，分析物的可变区包括免疫球蛋白λ轻链的CDR3。在一些实施方案中，分析物的可变区包括免疫球蛋白λ轻链的CDR1和CDR2中的一者或两者。在一些实施方案中，分析物的可变区包括免疫球蛋白λ轻链的全长可变结构域。
在一些实施方案中，B细胞受体为免疫球蛋白重链。在一些实施方案中，分析物的可变区包括免疫球蛋白重链的CDR3。在一些实施方案中，分析物的可变区包括免疫球蛋白重链的CDR1和CDR2中的一者或两者。在一些实施方案中，分析物的可变区包括免疫球蛋白重链的全长可变结构域。
在一些实施方案中，免疫细胞受体为T细胞受体。在一些实施方案中，T细胞受体为T细胞受体α链。在一些实施方案中，分析物的可变区包括T细胞受体α链的CDR3。在一些实施方案中，分析物的可变区包括T细胞受体α链的CDR1和CDR2中的一者或两者。在一些实施方案中，分析物的可变区包括T细胞受体α链的全长可变结构域。
在一些实施方案中，T细胞受体为T细胞受体β链。在一些实施方案中，分析物的可变区包括T细胞受体β链的CDR3。在一些实施方案中，分析物的可变区包括T细胞受体β链的CDR1和CDR2中的一者或两者。在一些实施方案中，分析物的可变区还包括T细胞受体β链的全长可变结构域。
分析物可广义地分为两组的一者：核酸分析物和非核酸分析物。非核酸分析物的实例包括但不限于脂质、碳水化合物、肽、蛋白质、糖蛋白(N-连接或O-连接)、脂蛋白、磷蛋白、蛋白质的特定磷酸化或乙酰化变体、蛋白质的酰胺化变体、蛋白质的羟基化变体、蛋白质的甲基化变体、蛋白质的泛素化变体、蛋白质的硫酸化变体、病毒蛋白(例如，病毒衣壳、病毒包膜、病毒外壳、病毒辅助蛋白、病毒糖蛋白、病毒刺突等)、胞外和胞内蛋白、抗体和抗原结合片段。在一些实施方案中，分析物可位于亚细胞位置，包括例如细胞器，例如线粒体、高尔基体、内质网、叶绿体、胞吞小泡、胞泌小泡、液泡、溶酶体等。在一些实施方案中，分析物可以是肽或蛋白质，包括但不限于抗体和酶。分析物的另外的实例可见于WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(I)(c)节中。在一些实施方案中，可以间接检测分析物，如通过检测中间剂，例如连接产物或分析物捕获剂(例如，寡核苷酸缀合抗体)，如本文描述的那些。
“生物样品”通常从受试者获得，以使用多种技术中的任何一种进行分析，所述多种技术包括但不限于活检、外科手术和激光捕获显微镜法(LCM)，并通常包括来自受试者的细胞和/或其他生物材料。在一些实施方案中，生物样品可以是组织切片。在一些实施方案中，生物样品可以是固定和/或染色的生物样品(例如，固定和/或染色的组织切片)。染色剂的非限制性实例包括组织学染色剂(例如，苏木精和/或曙红)和免疫学染色剂(例如，荧光染色剂)。在一些实施方案中，可对生物样品(例如，固定和/或染色的生物样品)成像。生物样品也见述于WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(I)(d)节中。
在一些实施方案中，生物样品用一种或多种透化试剂透化。例如，生物样品的透化可促进分析物捕获。示例性的透化剂和条件见述于WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(I)(d)(ii)(13)节或示例性实施方案部分中。
基于阵列的空间分析方法涉及将一种或多种分析物从生物样品转移至基底上的特征阵列，其中每个特征与阵列上的唯一空间位置相关联。转移的分析物的后续分析包括确定分析物的身份和分析物在生物样品内的空间位置。分析物在生物样品内的空间位置基于分析物在阵列上结合(例如，直接地或间接地)的特征以及该特征在阵列内的相对空间位置来确定。
“捕获探针”是指能够捕获(直接地或间接地)和/或标记生物样品中的分析物(例如，目的分析物)的任何分子。在一些实施方案中，捕获探针为核酸或多肽。在一些实施方案中，捕获探针包含条形码(例如，空间条形码和/或唯一分子标识符(UMI))和捕获结构域)。在一些实施方案中，捕获探针可包括切割结构域和/或功能结构域(例如，引物结合位点，如用于下一代测序(NGS))。参见例如WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(b)节(例如，第(i)-(vi)小节)。捕获探针的生成可通过任何适宜的方法实现，包括WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(d)(ii)节中描述的那些。
在一些实施方案中，可使用任何适宜的多路复用技术，如WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(IV)节中描述的那些，来检测(例如，同时地或顺序地)来自生物样品的多于一种分析物类型(例如，核酸和蛋白质)。
在一些实施方案中，可使用一种或多种分析物捕获剂来进行一种或多种分析物(例如，蛋白质分析物)的检测。如本文所用，“分析物捕获剂”是指与分析物(例如，生物样品中的分析物)和捕获探针(例如，附接到基底或特征的捕获探针)相互作用以鉴定分析物的试剂。在一些实施方案中，分析物捕获剂包括：(i)分析物结合部分(例如，与分析物结合的部分)，例如抗体或其抗原结合片段；(ii)分析物结合部分条形码；和(iii)分析物捕获序列。如本文所用，术语“分析物结合部分条形码”是指与分析物结合部分相关联或以其他方式识别分析物结合部分的条形码。如本文所用，术语“分析物捕获序列”是指配置为与捕获探针的捕获结构域杂交、结合、联接或以其他方式相互作用的区域或部分。在一些情况下，分析物结合部分条形码(或其一部分)可能够从分析物捕获剂去除(例如，切割)。分析物捕获剂的另外的描述可见于WO 2020/176788的第(II)(b)(ix)节和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(b)(viii)节中。
存在至少两种将空间条形码与一个或多个相邻细胞相关联的方法，使得空间条形码识别所述一个或多个细胞和/或所述一个或多个细胞的内容物，如与特定的空间位置相关联的。一种方法是促进分析物或分析物代替物(例如，中间剂)从细胞中出来并朝向加有空间条形码的阵列(例如，包括加有空间条形码的捕获探针)。另一种方法是从阵列切割加有空间条形码的捕获探针并促进加有空间条形码的捕获探针朝向和/或进入到生物样品中或到生物样品上。
图1为示出如本文所述的一个示例性捕获探针的示意图。如图所示，捕获探针102任选地通过切割结构域103如二硫连接子与特征101联接。捕获探针可包括对后续加工有用的功能序列104。功能序列104可包括测序仪特异性流动池附接序列(例如，P5或P7序列)的全部或部分、测序引物序列的全部或部分(例如，R1引物结合位点、R2引物结合位点)或其组合。捕获探针还可包括空间条形码105。捕获探针还可包括唯一分子标识符(UMI)序列106。虽然图1将空间条形码105示出为位于UMI序列106的上游(5’)，但应理解，其中UMI序列106位于空间条形码105的上游(5’)的捕获探针也适合用于任何本文描述的方法中。捕获探针还可包括捕获结构域107以便于目标分析物的捕获。在一些实施方案中，捕获探针包括一个或多个另外的功能序列，其可位于例如空间条形码105与UMI序列106之间、UMI序列106与捕获结构域107之间或捕获结构域107之后。捕获结构域可具有与核酸分析物的序列互补的序列。捕获结构域可具有与本文描述的连接探针互补的序列。捕获结构域可具有与分析物捕获剂中存在的捕获手柄序列互补的序列。捕获结构域可具有与夹板寡核苷酸互补的序列。除了具有与捕获探针的捕获结构域互补的序列外，这样的夹板寡核苷酸还可具有核酸分析物的序列、与本文描述的连接探针的一部分互补的序列和/或本文描述的捕获手柄序列。
功能序列通常可选择为与多种不同的测序系统例如Ion Torrent Proton或PGM、Illumina测序仪器、PacBio、Oxford Nanopore等中的任一种及其要求相容。在一些实施方案中，功能序列可选择为与非商业化测序系统相容。可使用合适的功能序列的此类测序系统和技术的实例包括(但不限于)Ion Torrent Proton或PGM测序、Illumina测序、PacBioSMRT测序和Oxford Nanopore测序。此外，在一些实施方案中，功能序列可选择为与其他测序系统相容，包括非商业化测序系统。
在一些实施方案中，空间条形码105和功能序列104对于附接到给定特征的所有探针是共有的。在一些实施方案中，附接到给定特征的捕获探针的UMI序列106不同于附接到该给定特征的不同捕获探针的UMI序列。
在一些情况下，捕获探针可以配置为引发、复制和因此从模板(例如，DNA或RNA模板，如分析物或中间剂(例如，连接产物或分析物捕获剂)或其一部分)产生任选地加有条形码的延伸产物或其衍生物(参见例如WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(b)(vii)节关于延伸的捕获探针)。在一些情况下，捕获探针可配置为与模板(例如，DNA或RNA模板，如分析物或中间剂，或其一部分)形成连接产物，从而产生充当模板的代替物的连接产物。
如本文所用，“延伸的捕获探针”是指具有添加到捕获探针的末端(例如，3’或5’末端)从而延长捕获探针的总长度的另外的核苷酸的捕获探针。例如，“延伸的3’末端”指示向捕获探针的最3’核苷酸添加另外的核苷酸以例如通过用于延伸核酸分子的聚合反应延伸捕获探针的长度，所述聚合反应包括由聚合酶(例如，DNA聚合酶或逆转录酶)催化的模板化聚合。在一些实施方案中，延伸捕获探针包括向捕获探针的3’末端添加与和捕获探针的捕获结构域特异性结合的分析物或中间剂的核酸序列互补的核酸序列。在一些实施方案中，使用逆转录延伸捕获探针。在一些实施方案中，使用一种或多种DNA聚合酶延伸捕获探针。延伸的捕获探针包括捕获探针的序列和捕获探针的空间条形码的序列。
在一些实施方案中，延伸的捕获探针被扩增(例如，在本体溶液中或在阵列上)以产生足以供下游分析(例如，经由DNA测序)的量。在一些实施方案中，延伸的捕获探针(例如，DNA分子)充当扩增反应(例如，聚合酶链反应)的模板。
WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(a)节中描述了空间分析方法的其他变体，在一些实施方案中包括成像步骤。WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(g)节中描述了所捕获的分析物(和/或中间剂或其部分)的分析，例如包括样品去除、捕获探针的延伸、测序(例如，被切割的延伸的捕获探针和/或与延伸的捕获探针互补的cDNA分子的测序)、阵列上的测序(例如，使用例如原位杂交或原位连接方法)、时序分析和/或邻近捕获。WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(h)节中描述了一些质量控制措施。
空间信息可提供具有生物学和/或医学重要性的信息。例如，本文描述的方法和组合物可允许：鉴定疾病或病症的一种或多种生物标志物(例如，诊断生物标志物、预后生物标志物和/或用于确定治疗功效的生物标志物)；鉴定用于治疗疾病或病症的候选药物靶标；鉴定(例如，诊断)受试者患有某疾病或病症；鉴定受试者的疾病或病症的阶段和/或预后；鉴定受试者具有增加的发生某疾病或病症的可能性；监测受试者的疾病或病症的进展；确定受试者的疾病或病症的治疗功效；鉴定治疗对于疾病或病症有效的患者亚群；改进患有某疾病或病症的受试者的治疗；选择参与临床试验的受试者；和/或选择针对患有某疾病或病症的受试者的治疗。
空间信息可提供具有生物学重要性的信息。例如，本文描述的方法和组合物可允许：鉴定转录组和/或蛋白质组表达谱(例如，在健康和/或患病组织中)；鉴定紧邻的多种分析物类型(例如，最近邻分析)；确定患病组织中的上调和/或下调基因和/或蛋白质；表征肿瘤微环境；表征肿瘤免疫反应；表征细胞类型及其在组织中的共定位；和鉴定组织内的遗传变体(例如，基于与特定疾病或病症生物标志物相关联的基因和/或蛋白质表达谱)。
通常，对于基于空间阵列的方法，基底起到捕获探针与阵列的特征的直接或间接附接的支撑物的作用。“特征”为充当空间分析中使用的各种分子实体的支撑物或储库的实体。在一些实施方案中，阵列中的一些或全部特征被功能化以便分析物捕获。WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(c)节中描述了示例性的基底。阵列的示例性特征和几何属性可见于WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(d)(i)、(II)(d)(iii)和(II)(d)(iv)节中。
通常，当使生物样品与包括捕获探针的基底(例如，捕获探针嵌入、点状分布、印刷、制造在基底上的基底，或具有包括捕获探针的特征(例如，珠、孔)的基底)接触时，分析物和/或中间剂(或其部分)可被捕获。如本文所用，生物样品与基底“接触(contact/contacted/contacting)”是指任何接触(例如，直接或间接)使得捕获探针可与来自生物样品的分析物相互作用(例如，共价结合或非共价结合(例如，杂交))。捕获可主动地(例如，使用电泳)或被动地(例如，使用扩散)实现。WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(e)节中进一步描述了分析物捕获。
在一些情况下，可通过将具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，肽、脂质或核酸分子)附接和/或引入到生物样品(例如，到生物样品中的细胞)来进行空间分析。在一些实施方案中，将具有多个条形码(例如，多个空间条形码)的多个分子(例如，多个核酸分子)引入到生物样品(例如，到生物样品中的多个细胞)以用于空间分析。在一些实施方案中，在将具有条形码的分子附接和/或引入到生物样品之后，可将生物样品物理地分离(例如，解离)成单个细胞或细胞组以供分析。WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(III)节中描述了一些这样的空间分析方法。
在一些情况下，可通过检测与分析物杂交的多个寡核苷酸来进行空间分析。在一些情况下，例如，可使用RNA模板化连接(RTL)进行空间分析。先前已经描述了RTL的方法。参见例如Credle等人，Nucleic Acids Res.2017 Aug 21；45(14)：e128。通常，RTL包括两个寡核苷酸与分析物(例如，RNA分子，如mRNA分子)上的相邻序列的杂交。在一些情况下，寡核苷酸为DNA分子。在一些情况下，寡核苷酸中的一个在3’末端处包括至少两个核糖核酸碱基和/或另一个寡核苷酸在5’末端处包括磷酸化核苷酸。在一些情况下，两个寡核苷酸中的一个包括捕获结构域(例如，poly(A)序列、非同聚序列)。在与分析物杂交之后，连接酶(例如，SplintR连接酶)将两个寡核苷酸连接在一起，产生连接产物。在一些情况下，两个寡核苷酸与彼此不相邻的序列杂交。例如，两个寡核苷酸的杂交在杂交的寡核苷酸之间产生间隙。在一些情况下，聚合酶(例如，DNA聚合酶)可在连接之前延伸寡核苷酸中的一个。连接后，从分析物释放连接产物。在一些情况下，使用核酸内切酶(例如，RNAse H)释放连接产物。然后，释放的连接产物可被阵列上的捕获探针捕获(例如，而不是直接捕获分析物)，任选地扩增和测序，从而确定生物样品中分析物的位置和任选地丰度。
在空间信息的分析过程中，获得与分析物相关联的空间条形码的序列信息，并且该序列信息可用于提供关于生物样品中分析物的空间分布的信息。可使用各种方法来获得空间信息。在一些实施方案中，特定的捕获探针和它们捕获的分析物与基底上特征的阵列中的特定位置相关联。例如，特定的空间条形码可在阵列制造之前与特定的阵列位置相关联，并且空间条形码的序列可与特定的阵列位置信息一起存储(例如，存储在数据库中)，以便每个空间条形码唯一地映射到一个特定的阵列位置。
或者，特定的空间条形码可在制造期间沉积在特征阵列中的预定位置处，使得在每个位置处仅存在一种类型的空间条形码，以便空间条形码唯一地与阵列的单个特征相关联。必要时，可使用任何本文描述的方法对阵列解码，使得空间条形码唯一地与阵列特征位置相关联，并且可如上所述存储此映射。
当在空间信息的分析期间获得关于捕获探针和/或分析物的序列信息时，可通过参考唯一地关联每个空间条形码与阵列特征位置的存储信息来确定捕获探针和/或分析物的位置。这样，特定的捕获探针和所捕获的分析物与特征的阵列中的特定位置相关联。每个阵列特征位置代表相对于阵列的坐标参考点(例如，阵列位置、基准标记)的位置。因此，每个特征位置在阵列的坐标空间中具有“地址”或位置。
WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的示例性实施方案部分中描述了一些示例性的空间分析工作流程。参见例如WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663中以“在本文描述的工作流程的一些非限制性实例中，可将样品浸入......”开头的示例性实施方案。另外参见例如Visium空间基因表达试剂盒用户指南(例如，Rev C，日期为2020年6月)和/或Visium空间组织优化试剂盒用户指南(例如，Rev C，日期为2020年7月)。
在一些实施方案中，可使用专用硬件和/或软件来进行空间分析，如WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(e)(ii)和/或(V)节中描述的任何系统，或者WO 2020/123320的“用于成像的对照载片，使用对照载片和基底进行成像的方法，使用对照载片和基底进行成像的系统，和/或样品和阵列对准装置及方法，信息标签”部分中描述的装置或方法中的任何一种或多种。
用于进行空间分析的合适系统可包括部件如用于容纳生物样品的腔室(例如，流动池或可密封的、不透流体的腔室)。生物样品可例如安装在生物样品保持器中。一个或多个流体腔室可经由流体导管连接到腔室和/或样品保持器，并且流体可经由流体泵、真空源或联接至流体导管的其他装置递送到腔室和/或样品保持器中，所述其他装置产生压力梯度以驱动流体流。还可将一个或多个阀连接到流体导管以调节试剂从储存器向腔室和/或样品保持器的流动。
系统可任选地包括控制单元(其包括一个或多个电子处理器)、输入接口、输出接口(如显示器)和存储单元(例如，固态存储介质，如但不限于磁性、光学或其他固态、持久性、可写入和/或可重写存储介质)。控制单元可任选地经由网络连接到一个或多个远程装置。控制单元(及其部件)通常可执行任何本文描述的步骤和功能。在系统连接到远程装置的情况下，远程装置(或多个远程装置)可执行任何本文描述的步骤或特征。系统可任选地包括用于捕获图像的一个或多个检测器(例如，CCD、CMOS)。系统还可任选地包括用于照射样品的一个或多个光源(例如，基于LED的、基于二极管的、激光器)、具有特征的基底、捕获在基底上的来自生物样品的分析物以及各种控制和校准介质。
系统可任选地包括编码在一个或多个有形存储介质和硬件部件如专用集成电路中和/或在其中实现的软件指令。当由控制单元(特别地，电子处理器)或集成电路执行时，软件指令可使控制单元、集成电路或执行软件指令的其他部件执行任何本文描述的方法步骤或功能。
在一些情况下，本文描述的系统可检测(例如，配准图像)阵列上的生物样品。PCT申请号2020/061064和/或美国专利申请序列号16/951,854中描述了检测阵列上的生物样品的示例性方法。
在将分析物从生物样品转移到基底上的特征阵列之前，可将生物样品与阵列对准。生物样品与包括捕获探针的特征的阵列的对准可便于空间分析，所述空间分析可用于检测生物样品中不同位置内分析物的存在和/或水平的差异，例如以生成分析物的存在和/或水平的三维地图。PCT申请号2020/053655中描述了生成分析物的存在和/或水平的二维和/或三维地图的示例性方法，WO 2020/061108和/或美国专利申请序列号16/951,864中大体描述了空间分析方法。
在一些情况下，可使用一个或多个基准标记将分析物的存在和/或水平的地图与生物样品的图像对准，例如，放置在成像系统的视场中的物体，其出现在所产生的图像中，如WO 2020/123320、PCT申请号2020/061066和/或美国专利申请序列号16/951,843的“基底属性”部分、“用于成像的对照载片”部分中所述。基准标记可用作对准的参考点或测量标尺(例如，对准样品与阵列，对准两个基底，确定基底上样品或阵列相对于基准标记的位置)和/或用于尺寸和/或距离的定量测量。
用于抗原受体的空间转录组学
需要对生物样品内T-细胞受体(TCR)和B-细胞受体(BCR)克隆型的空间异质性有基本的了解，以了解其功能性的多个方面，包括例如生物样品内特定TCR或BCR可能正在与哪些细胞相互作用、给定生物样品中TCR和/或BCR克隆型的身份、和/或在不同的自身免疫病症中具有自体反应性的TCR和/或BCR克隆型的身份。众多的单细胞测序方法可从生物样品鉴定TCR和BCR克隆型，然而，目前需要将TCR和BCR序列与生物样品内的空间位置联系起来的方法。另外，鉴定克隆区，即由可变(V)、多样化(D)和接合(J)区段接合形成互补决定区(包括CDR1、CDR2和CDR3，其为TCR和/或BCR提供特异性)的位置限定区域，将大大有利于科学技术。通过将克隆信息与空间信息相结合，可以了解哪些T-细胞和B-细胞克隆型可与生物样品内的给定细胞类型发生特异性相互作用。
然而，捕获编码免疫细胞受体的分析物可能会带来独特的挑战。例如，在空间上以足够的效率捕获TCR和BCR基因成分以分析给定组织中的大多数克隆型是困难的。用常规的短读段测序方法捕获编码免疫细胞受体的分析物可能导致距离测序开始的点超过约1kb的测序区域丢失。使用来自含有多个不同细胞的斑点的测序数据将一起形成完全受体的单独的TCR或BCR基因成分联系起来是本文描述的方法所解决的挑战。
本文描述的方法用于分析来自免疫细胞的TCR和BCR的各种序列，例如各种克隆型。在一些实施方案中，所述方法用于分析TCRα链、TCRβ链、TCRδ链、TCRγ链或其任何片段(例如，可变区(包括V(D)J或VJ区)、恒定区、跨膜区、其片段、其组合及其片段的组合)的序列。在一些实施方案中，本文描述的方法可用于分析B细胞受体重链、B细胞受体轻链或其任何片段(例如，可变区(包括V(D)J或VJ区)、恒定区、跨膜区、其片段、其组合及其片段的组合)的序列。
分析物
可从生物样品(例如，本文描述的任何生物样品)捕获存在于核酸文库(例如，由单细胞或由阵列上的生物样品生成的核酸文库)中的分析物序列。在一些实施方案中，生物样品为组织样品。在一些实施方案中，组织样品为组织切片。在一些实施方案中，组织切片为固定的组织切片。在一些实施方案中，固定的组织切片为福尔马林固定石蜡包埋的组织切片。在一些实施方案中，组织切片为新鲜的冷冻组织切片。
待检测的分析物可以是本文描述的分析物中的任何一种。分析物可包括具有编码免疫细胞受体(例如，TCR或BCR)的V(D)J序列的至少一部分的核酸序列的核酸分子。在一些实施方案中，分析物为RNA。在一些实施方案中，RNA为mRNA。在一些实施方案中，分析物为DNA。在一些实施方案中，DNA为基因组DNA。在一些实施方案中，分析物为编码免疫细胞受体的分析物。在一些实施方案中，编码免疫细胞受体的分析物鉴定来自生物样品的克隆型群体。
在一些实施方案中，分析物包括恒定区，如编码免疫细胞受体的分析物中存在的恒定区。在一些实施方案中，分析物包括可变区，如编码免疫细胞受体的分析物。在一些实施方案中，编码免疫细胞受体的分析物鉴定生物样品中存在的克隆型群体。
在一些实施方案中，分析物为免疫细胞受体。在一些实施方案中，免疫细胞受体为B细胞受体。在一些实施方案中，B细胞受体为免疫球蛋白κ轻链。在一些实施方案中，分析物的可变区包括免疫球蛋白κ轻链的CDR3区。在一些实施方案中，分析物的可变区包括免疫球蛋白κ轻链的CDR1和CDR2中的一者或两者。在一些实施方案中，分析物的可变区包括免疫球蛋白κ轻链的全长可变结构域。
在一些实施方案中，B细胞受体为免疫球蛋白λ轻链。在一些实施方案中，分析物的可变区包括免疫球蛋白λ轻链的CDR3。在一些实施方案中，分析物的可变区包括免疫球蛋白λ轻链的CDR1和CDR2中的一者或两者。在一些实施方案中，分析物的可变区包括免疫球蛋白λ轻链的全长可变结构域。
在一些实施方案中，B细胞受体为免疫球蛋白重链。在一些实施方案中，分析物的可变区包括免疫球蛋白重链的CDR3。在一些实施方案中，分析物的可变区包括免疫球蛋白重链的CDR1和CDR2中的一者或两者。在一些实施方案中，分析物的可变区包括免疫球蛋白重链的全长可变结构域。
在一些实施方案中，免疫细胞受体为T细胞受体。在一些实施方案中，T细胞受体为T细胞受体α链。在一些实施方案中，分析物的可变区包括T细胞受体α链的CDR3。在一些实施方案中，分析物的可变区包括T细胞受体α链的CDR1和CDR2中的一者或两者。在一些实施方案中，分析物的可变区包括T细胞受体α链的全长可变结构域。
在一些实施方案中，T细胞受体为T细胞受体β链。在一些实施方案中，分析物的可变区包括T细胞受体β链的CDR3。在一些实施方案中，分析物的可变区包括T细胞受体β链的CDR1和CDR2中的一者或两者。在一些实施方案中，分析物的可变区还包括T细胞受体β链的全长可变结构域。
捕获编码免疫细胞受体的分析物
本文提供了用于确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型的存在和/或丰度的方法，所述方法包括：(a)使生物样品与包括多个捕获探针的阵列接触，其中所述多个捕获探针的捕获探针包括(i)空间条形码和(ii)与编码免疫细胞克隆型的免疫细胞受体的核酸特异性结合的捕获结构域；和(b)确定(i)空间条形码的全部或部分序列或其补体，和(ii)编码免疫细胞受体的核酸的全部或部分序列或其补体，并使用(i)和(ii)的确定序列来确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型的存在和/或丰度。
本文还提供了用于确定生物样品中一定位置处免疫细胞受体的存在和/或丰度的方法，所述方法包括(a)使生物样品与包括多个捕获探针的阵列接触，其中所述多个捕获探针的捕获探针包括(i)空间条形码和(ii)与编码免疫细胞受体的核酸特异性结合的捕获结构域；和(b)确定(i)空间条形码的全部或部分序列或其补体，和(ii)编码免疫细胞受体的核酸的全部或部分序列或其补体，并使用(i)和(ii)的确定序列来确定生物样品中一定位置处免疫细胞受体的存在和/或丰度。
本文还提供了用于确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型的存在和/或丰度的方法，所述方法包括(a)使生物样品与包括多个捕获探针的阵列接触，其中所述多个捕获探针的捕获探针包括(i)空间条形码和(ii)与编码免疫细胞克隆型的免疫细胞受体的核酸结合的捕获结构域；(b)确定(i)空间条形码的全部或部分序列或其补体，和(ii)编码免疫细胞受体的核酸的全部或部分序列或其补体，并使用(i)和(ii)的确定序列来确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型的存在和/或丰度。
本文还提供了用于确定生物样品中一定位置处免疫细胞受体的存在和/或丰度的方法，所述方法包括：(a)使生物样品与包括多个捕获探针的阵列接触，其中所述多个捕获探针的捕获探针包括(i)空间条形码和(ii)与编码免疫细胞受体的核酸结合的捕获结构域；和(b)确定(i)空间条形码的全部或部分序列或其补体，和(ii)编码免疫细胞受体的核酸的全部或部分序列或其补体，并使用(i)和(ii)的确定序列来确定生物样品中一定位置处免疫细胞受体的存在和/或丰度。
在确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型或免疫细胞受体的存在和/或丰度的一些实施方案中，步骤(b)包括使用编码免疫细胞受体的核酸作为模板延伸捕获探针的末端，从而生成延伸的捕获探针。在一些实施方案中，延伸捕获探针的末端包括使用逆转录酶(例如，本文描述的逆转录酶中的任何一种)。在一些实施方案中，步骤(b)包括延伸捕获探针的3’末端。在一些实施方案中，步骤(b)包括生成第二核酸链，所述第二核酸链包括(i)与空间条形码的全部或部分互补的序列，和(ii)对应于编码免疫细胞受体的核酸的全部或部分序列的序列。
在确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型或免疫细胞受体的存在和/或丰度的一些实施方案中，捕获探针包括切割结构域、功能结构域、唯一分子标识符或其任何组合。在一些实施方案中，捕获探针包括功能结构域。在一些实施方案中，捕获结构域包括poly(T)序列。在一些实施方案中，捕获结构域与编码T细胞受体α链的恒定区的核酸序列特异性结合。在一些实施方案中，捕获结构域与编码T细胞受体β链的恒定区的核酸序列特异性结合。在一些实施方案中，捕获结构域与编码免疫球蛋白κ轻链的恒定区的核酸序列特异性结合。在一些实施方案中，捕获结构域与编码免疫球蛋白λ轻链的恒定区的核酸序列特异性结合。在一些实施方案中，捕获探针与编码免疫球蛋白重链的恒定区的核酸序列特异性结合。
可变区引物富集
如实施例中所证实，用设计为特异性结合来自生物样品的特定免疫细胞受体的恒定区的捕获结构域捕获和鉴定编码免疫细胞受体的分析物。然而，这样的策略不会捕获除编码免疫细胞受体的分析物之外的分析物。另外的和替代的方法可包括使用一个或多个可变区(V-区)特异性引物组来扩增编码免疫细胞受体(例如，TCR和/或BCR)的分析物，所述分析物来自从poly(T)捕获的总cDNA文库生成的核酸文库，从而允许从扩增子的5’末端测序到CDR区(例如，CDR3区)。这种方法的优点在于同时检测淋巴细胞克隆性以及全局空间基因表达。一种另外的考虑是捕获完全的IGH复杂性(例如，IGH同种型，例如IGHA1-2、IGHG1-4、IGHM、IGHD和IGHE)而没有通过CDR3区的配对末端测序读段。在整个开发过程中，额外的受体多样性被添加到BCR，并且可能难以与仅使用单个CDR3读段的测序错误区分开来。另外，已知一些编码免疫细胞受体的分析物丰度较低(参见例如Tu，A.A.等人，TCR sequencingpaired with massively parallel 3’RNAseq reveals clonotypic T cell signatures，Nature Immunology,20，1692-1699(2019)；Singh M.等人，High-throughput long-readsingle cell sequencing reveals the clonal and transcriptional landscape oflymphocytes.Nature Communications，10，3120(2019)，两者均通过引用整体并入本文)。因此，例如，可变区引物富集可提供一种替代的方法来从具有包括poly(T)捕获结构域的捕获探针的阵列富集编码免疫细胞受体的分析物，随后是一个或多个扩增反应(例如，PCR)。
在本文描述的任何空间方法的一些实施方案中，步骤(b)还包括生成第二核酸链，所述第二核酸链包括(i)与功能结构域的全部或部分互补的序列，(ii)与空间条形码的全部或部分互补的序列，和(iii)对应于编码免疫细胞受体的核酸的全部或部分序列的序列。在一些实施方案中，步骤(b)还包括使用(i)包括功能结构域的全部或部分的第一引物，其中所述功能结构域为第二核酸链中空间条形码的5’，和(ii)包括与编码免疫细胞受体的可变区的序列的一部分基本上互补的序列的第二引物来扩增第二核酸链。
在一些实施方案中，使用多于一种第二引物，其包括与编码免疫细胞受体的可变区的序列的一部分基本上互补的序列。例如，可使用巢式PCR策略，其中用可变区引物和与空间条形码的功能结构域5’基本上互补的引物生成第一扩增产物，然后使用第一区可变区引物内部(例如，第一可变区引物的5’)的第二、第三或第四可变区引物进行第二、第三或第四轮次扩增(例如，参见图22)。本领域普通技术人员应理解，在随后的扩增轮次中，另外的扩增轮次需要位于内部(例如，5’)的可变区引物。
杂交探针和封闭探针
在一些实施方案中，目的cDNA的靶向富集从由所捕获的分析物(例如，免疫细胞分析物)生成的eDNA衍生文库富集。例如，可以设计针对目的分析物或其补体的杂交探针池。在一些实施方案中，可以设计约10至约500个杂交探针、约25至约450个杂交探针、约50至约400个杂交探针、约75至约350个杂交探针、或约100至300个杂交探针用于与目的分析物或其补体杂交。在一些实施方案中，杂交探针可包括另外的部分，如结合部分(例如，生物素)，其能够结合另一个部分，如捕获部分(例如，链霉亲和素)。因此，在一些实施方案中，一个或多个杂交探针(例如，包括另外的部分，如生物素)与cDNA文库中的目的分析物或其补体杂交，并在例如链霉亲和素珠上处理总的cDNA文库。杂交探针的生物素部分特异性结合链霉亲和素分子，从而富集目的分析物或其补体。杂交探针可设计为与任何分析物或其互补序列互补，包括例如编码免疫细胞分析物的分析物。
在一些实施方案中，富集目的分析物包括使用封闭探针。封闭探针可在杂交探针之前、之后或与杂交探针同时添加到cDNA文库。在一些实施方案中，在富集cDNA文库内的靶标时，封闭探针将减少背景(例如，非特异性结合事件)。在一些实施方案中，封闭探针的长度可为约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约105、约110、约115、约120、约125、约130、约135、约140、约145或约150个核苷酸。在一些实施方案中，封闭探针特别针对cDNA文库的一个或多个成员中存在的结构域设计。在一些实施方案中，将一个封闭探针添加到cDNA文库。在一些实施方案中，两个或更多个封闭探针(例如，不同的封闭探针)。在一些实施方案中，将3、4、5个或更多个不同的封闭探针添加到cDNA文库(例如，具有不同序列的封闭探针)。在一些实施方案中，封闭探针包含SEQ ID NO：639。在一些实施方案中，封闭探针包含SEQ ID NO：640。在一些实施方案中，封闭探针包含与SEQ ID NO：639至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，封闭探针包含与SEQ ID NO：640至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
鉴定免疫细胞受体
在确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型的存在和/或丰度的一些实施方案中，步骤(b)中的确定包括对(i)空间条形码的全部或部分序列或其补体和(ii)编码免疫细胞受体的核酸的全部或部分序列或其补体测序。可使用本文描述的测序方法中的任何一种。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型的存在。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型的丰度。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型的存在和丰度。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处两种或更多种免疫细胞克隆型的存在。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处两种或更多种免疫细胞克隆型的丰度。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处两种或更多种免疫细胞克隆型的存在和丰度。在一些实施方案中，所述方法包括比较所述两种或更多种免疫细胞克隆型。在一些实施方案中，所述两种或更多种免疫细胞克隆型各自为B细胞克隆型。在一些实施方案中，所述两种或更多种免疫细胞克隆型各自为T细胞克隆型。在一些实施方案中，所述两种或更多种免疫细胞克隆型包括至少一种T细胞克隆型和至少一种B细胞克隆型。
在确定生物样品中一定位置处免疫细胞受体的存在和/或丰度的一些实施方案中，步骤(b)中的确定包括对(i)空间条形码的全部或部分序列或其补体和(ii)编码免疫细胞受体的核酸的全部或部分序列或其补体测序。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处免疫细胞受体的存在。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处免疫细胞受体的丰度。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处免疫细胞受体的存在和丰度。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处两种或更多种免疫细胞受体的存在。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处两种或更多种免疫细胞受体的丰度。在一些实施方案中，步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处两种或更多种免疫细胞受体的存在和丰度。在一些实施方案中，所述方法包括比较所述两种或更多种免疫细胞受体。在一些实施方案中，所述两种或更多种免疫细胞克隆型各自为B细胞的免疫细胞受体。在一些实施方案中，两种或更多种免疫细胞克隆型各自为T细胞的免疫细胞受体。在一些实施方案中，两种或更多种免疫细胞克隆型包括T细胞的至少一种免疫细胞受体和来自B细胞的至少一种免疫细胞受体。
在确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型或免疫细胞受体的存在和/或丰度的一些实施方案中，包括在步骤(b)之前使生物样品与核糖体RNA耗尽探针和/或线粒体RNA耗尽探针接触。在一些实施方案中，对生物样品成像。在一些实施方案中，对生物样品染色。
阵列和试剂盒
本文提供了包括多个捕获探针的阵列，其中所述多个捕获探针的捕获探针包括(i)空间条形码和(ii)与编码免疫细胞克隆型的免疫细胞受体的核酸特异性结合的捕获结构域。在一些阵列中，免疫细胞克隆型为T细胞克隆型。在一些阵列中，免疫细胞受体为T细胞受体α链。在一些阵列中，捕获结构域与编码T细胞受体α链的恒定区的核酸序列特异性结合。在一些阵列中，免疫细胞受体为T细胞受体β链。在一些阵列中，捕获结构域与编码T细胞受体β链的恒定区的核酸序列特异性结合。在一些阵列中，免疫细胞克隆型为B细胞克隆型。在一些阵列中，免疫细胞受体为免疫球蛋白κ轻链。在一些阵列中，捕获结构域与编码免疫球蛋白κ轻链的恒定区的核酸序列特异性结合。在一些阵列中，免疫细胞受体为免疫球蛋白λ轻链。在一些阵列中，捕获结构域与编码免疫球蛋白λ轻链的恒定区的核酸序列特异性结合。在一些阵列中，免疫细胞受体为免疫球蛋白重链。在一些阵列中，捕获结构域与编码免疫球蛋白重链的恒定区的核酸序列特异性结合。在一些阵列中，捕获探针包括切割结构域、功能结构域、唯一分子标识符或其任何组合。
本文还提供了试剂盒，其包括阵列(例如，本文描述的阵列中的任何一个)和一个或多个杂交探针，其中杂交探针包括(i)与编码免疫细胞受体的核酸基本上互补的序列和(ii)与捕获部分和一个或多个封闭探针相互作用的结合部分。
本文还提供了试剂盒，其包括本文描述的阵列中的任何一个的阵列以及核糖体RNA耗尽探针和线粒体RNA耗尽探针中的一者或两者。
靶向RNA耗尽允许耗尽或去除一种或多种不期望的RNA分子物种(例如，核糖体RNA和/或线粒体RNA)，从而减少样品中可能会干扰所需目标检测(例如，mRNA的检测)的不期望的RNA分子的池和浓度。为了实现耗尽，设计与一个或多个不期望的RNA分子杂交的一个或多个探针。例如，在一个实施方案中，可将探针施用到生物样品，其选择性地与核糖体RNA(rRNA)杂交，从而减少样品中rRNA的池和浓度。在一个实施方案中，可将探针施用到生物样品，其选择性地与线粒体RNA(mtRNA)杂交，从而减少样品中mtRNA的池和浓度。随后将捕获探针施加到样品可导致由于样品中存在的不期望的RNA(例如，降选(down-selected)的RNA)的减少而改善其他类型的RNA的捕获。
在不期望的RNA耗尽时，样品将含有目的RNA靶标(例如，mRNA靶标)的富集群体。在一些实施方案中，在不期望的RNA的耗尽之后，不期望的RNA占样品中总RNA的小于20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％或其中的任何范围(即，与未经历耗尽步骤的样品相比，小于20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％或其中的任何范围)。因此，目的RNA靶标的富集群体可以占样品中总RNA的至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％或80％或其中的任何范围。
如本文所用，术语“不期望的RNA分子”或“不期望的RNA”是指为从生物样品耗尽的目标的不需要的RNA。在一些实施方案中，不期望的RNA的实例包括但不限于信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、线粒体RNA(mtRNA)、转移RNA(tRNA)、microRNA(miRNA)和病毒RNA。在一些实施方案中，不期望的RNA可以是转录物(例如，存在于组织切片中)。不期望的RNA可以是小的(例如，长度小于200个核酸碱基)或大的(例如，长度大于200个核酸碱基的RNA)。
在一些实施方案中，不期望的RNA分子包括5.8S核糖体RNA(rRNA)、5S rRNA、转移RNA(tRNA)、microRNA(miRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、tRNA衍生的小RNA(tsRNA)和小rDNA衍生的RNA(srRNA)或线粒体RNA(mtRNA)。在一些实施方案中，不期望的RNA分子包括被添加(例如，转染)到样品中的RNA分子(例如，小干扰RNA(siRNA))。不期望的RNA可以是双链RNA或单链RNA。在不期望的RNA为双链的实施方案中，其在耗尽之前被加工成单链RNA。在一些实施方案中，不期望的RNA可以是环状RNA。在一些实施方案中，不期望的RNA可以是细菌rRNA(例如，16s rRNA或23s rRNA)。在一些实施方案中，不期望的RNA来自大肠杆菌。
在一些实施方案中，不期望的RNA分子为rRNA。在一些实施方案中，rRNA为真核rRNA。在一些实施方案中，rRNA为细胞质rRNA。在一些实施方案中，rRNA为线粒体rRNA。细胞质rRNA包括例如28S、5.8S、5S和18SrRNA。线粒体rRNA包括例如12S和16SrRNA。rRNA也可以是原核rRNA，其包括例如5S、16S和23S rRNA。rRNA的序列是本领域技术人员熟知的并可容易地在序列数据库如GenBank中找到或者可以在文献中找到。例如，人18S rRNA的序列可以登录号M10098、人28S rRNA可以登录号M11167在GenBank中找到。
在一些实施方案中，不期望的RNA分子为线粒体RNA。线粒体RNA包括例如12S rRNA(由MT-RNR1编码)和16S rRNA(由MT-RNR2编码)、编码电子传递链蛋白(例如，NADH脱氢酶、辅酶Q-细胞色素c还原酶/细胞色素b、细胞色素c氧化酶、ATP合成酶或humanin)的RNA、和tRNA(由MT-TA、MT-TR、MT-TN、MT-TD、MT-TC、MT-TE、MT-TQ、MT-TG、MT-TH、MT-TI、MT-TL1、MT-TL2、MT-TK、MT-TM、MT-TF、MT-TP、MT-TS1、MT-TS2、MT-TT、MT-TW、MT-TY或MT-TV编码)。
在一些实施方案中，所述一个或多个不期望的RNA耗尽探针为DNA探针。在一些实施方案中，DNA探针包括单链DNA寡核苷酸，其具有与不期望的RNA部分或完全互补并且与不期望的RNA特异性杂交的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个不期望的RNA耗尽探针与一种或多种不期望的RNA分子至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补。在一些实施方案中，所述一个或多个不期望的RNA耗尽探针与一种或多种不期望的RNA分子100％(即，完全)互补。
在一些实施方案中，本文使用的探针已见述于Morlan等人，PLoS One.2012；7(8)：e42882中，此文献通过引用整体并入。在一些实施方案中，本文使用的探针已见述于美国申请公开号2011/0111409中，此文献通过引用整体并入。在一些实施方案中，本文使用的探针已见述于Adiconis等人，Nat Methods.2013 Jul；10(7)：623-9中，此文献通过引用整体并入。
DNA探针可通过本领域已知的技术产生。例如，在一些实施方案中，DNA探针通过化学合成、通过从重组核酸分子体外表达或通过从重组核酸分子体内表达产生。不期望的RNA耗尽探针也可以通过不期望的RNA的扩增例如RT-PCR、不对称PCR或滚环扩增来产生。
实施例
实施例1：分析物捕获和富集策略
图3A和3B示出了两个不同的捕获探针，其具有不同的示例性捕获策略以捕获生物样品中编码免疫细胞受体的分析物。图3A示出了“靶向”捕获，其中捕获结构域与编码待检测的免疫细胞受体的分析物的恒定区基本上互补。靶向捕获增加了在文库制备期间保留可变结构域中的目的部分CDR3的可能性。或者，图3B示出了用poly(T)捕获结构域的poly(A)捕获。poly(T)捕获结构域可捕获其他分析物，包括生物样品内编码免疫细胞受体的分析物。
图4示出了在阵列上捕获分析物之后的示例性分析物富集策略。目的免疫细胞分析物的部分包括V(D)J区的序列。CDR序列也很重要，因为这些序列限定免疫细胞受体的结合特异性。如本文所述，poly(T)捕获探针捕获编码免疫细胞受体的分析物，通过逆转录反应生成延伸的捕获探针，并生成第二链。所得核酸文库可通过图4中示出的示例性方案富集，其中包括与捕获探针的读段1序列互补的读段1引物和与免疫细胞分析物的可变区的一部分互补的引物的扩增反应可经由PCR富集文库。富集的文库可通过与初始可变区引物内部的可变区(例如，5’)的一部分互补的巢式引物进一步富集以进行巢式PCR。
图5示出了用与测序流动池连接序列(例如，P5)特异性互补的引物和与分析物的恒定区的一部分互补的定制测序引物的测序策略。这种测序策略靶向恒定区以获得包括CDR3在内的CDR区的序列，同时对捕获探针的空间条形码(BC)和/或唯一分子标识符(UMI)进行同时或顺序测序。通过捕获空间条形码、UMI和V(D)J区的序列，不仅确定了受体，而且还鉴定了其在细胞或组织内的空间位置和丰度。
实施例2-编码免疫细胞受体的分析物的捕获
图6针对淋巴结组织(LN，黑色)和脾脏组织(SP，灰色)示出了在阵列上对TRA、TRB、IGH、IGK和IGL检测到的独特克隆型的数目。可以设想，所发现的检测到的克隆型的缺乏可能是TRAC/TRBC/IGH转录物捕获效率低下或减少的结果，或者是由于可变区(例如，CDR3区)距测序结构域(例如，读段1测序结构域)的距离而减少其测序的结果。对IGK和IGL检测到了更大丰度的独特克隆型，这可能部分是由于这些克隆型中存在的恒定区相对于TRAC、TRAB和IGH转录物中存在的恒定区较短。
图7A-B示出了对TRA和TRB检测到的独特克隆型的数目(图7A)以及对IGA、IGHG、IGHM和IGHE检测到的独特克隆型的数目(图7B)。数据显示，靶向捕获(灰色条)比poly(T)捕获产生了较高数目的TRA和TRB克隆型(图7A)，如由检测到的克隆型的缺乏所证实。类似地，与poly(T)捕获相比，IGHA、IGHG和IGHM的靶向捕获产生了较高数目的检测到的独特克隆型，如由检测到的克隆型的缺乏所证实。因此，数据证实，编码免疫细胞受体的分析物的靶向捕获对于一些分析物是可能的，但对于编码免疫细胞受体的其他分析物(例如，IGHE)可能是不够的。
如所讨论的，用poly(T)捕获结构域捕获到不可检测水平的T-细胞受体和B-细胞受体转录物，如图7A-B中所示。然而，靶向捕获需要为每种编码免疫细胞受体的分析物定制捕获结构域并且不允许同时捕获编码免疫细胞受体的靶向分析物以外的分析物。
研究了一种检测编码免疫细胞受体的分析物是否被捕获的策略，并包括与对来自包括淋巴结组织和扁桃体组织在内的若干不同来源的全长cDNA进行的PCR扩增相结合使用poly(T)捕获序列(表1)。
表1.
扁桃体SS2样品源自与扁桃体空间文库相同的扁桃体并按Picelli等人，Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2，9，171-181，Nature (2014)改造，并用作阳性对照且不进行PCR富集。
首先，对每个样品和PCR反应(TRB、IGHG和IGHM)以一式三份试验0.5ng表1中的每个文库作为输入材料，一个LN(#9)和扁桃体SS2本体样品除外，它们分别以一式两份和一式一份试验。PCR引物靶向：a)TRB、IGHG或IGHM的恒定区(表2)，和b)TRB(Balazs，A.B.等人，Isolation of unknown rearranged T-cell receptors from single cells WO 2011/008502，其通过引用整体并入本文)和IGH(Vázquez，B.等人，High-Quality LibraryPreparation for NGS-Based Immunoglobulin Germline Gene Inference andRepertoire Expression Analysis，Frontiers Immunol，10，660(2019)，其通过引用整体并入本文)的可变区段。基于其与CDR3区的接近度来选择恒定引物并在PCR优化实验中进行每个靶标的各种引物的测试。用允许随后的Truseq索引化以便进行Illumina测序的部分P5和P7结构域标记正向引物和反向引物两者。根据制造商的说明，使用KAPA HiFi Hotstartready mix进行30个扩增循环的PCR。
表2.
恒定引物序列
TRB SEQ ID NO：1TCTGATGGCTCAAACACAGC
IGHG SEQ ID NO：2GCCAGGGGGAAGACCGATGGG
IGHM SEQ ID NO：3CACGCTGCTCGTATCCGA
表3.
可变区引物
在PCR富集后，在PCR索引化反应之前纯化PCR产物。Quant-iT(ThermoFisherScientific)分析测量了每个样品的DNA浓度，该浓度也按PCR索引化反应中的输入材料归一化(1.25ng/反应)。如先前所述(
P.L.等人，Visualization and analysis ofgene expression in tissue sections by spatial transcriptomics，Science，353(6294)，78-82，(2016))进行索引化PCR。总共使用24个唯一索引，每个cDNA文库接收一个唯一索引(来自同一cDNA文库的TRB、IGHG和IGHM产物接受相同的索引化，因为TCR和BCR克隆型可使用恒定引物序列以生物信息学方式彼此区分)。纯化后，汇集PCR反应。在凝胶上试验汇集的PCR文库，并将切除的约500bp的大条带凝胶纯化并测序(NovaSeq，2x 150bp)。对所得数据多路分配并使用MiXCR分析FastQ文件(Bolotin，D.A.等人，MiXCR：software forcomprehensive adaptive immune profiling，Nature Methods，12，380-381(2015)，其通过引用整体并入本文)。
在PCR可变区引物富集后，检测到所有制备文库中的许多TRB和IGH克隆型。对于TRB，在从扁桃体组织制备的空间文库中检测到约10,000个独特的克隆型(数据未示出)并在从淋巴结制备的空间文库中检测到约12,000至约25,000个独特的克隆型(数据未示出)。阳性对照(PCR富集后SmartSeq2RNAseq)产生约35,000个独特的克隆型。Smartseq2文库的可变区引物富集使TRB独特克隆型计数增加超过35倍，然而，SmartSeq2文库含有从两个扁桃体切片提取的RNA，而空间样品仅使用单个组织切片。
对IGH检测观察到类似的结果，其中从由扁桃体制备的空间文库检测到约10,000个独特的克隆型(图8)并从由淋巴结制备的空间文库检测到约12,000至约25,000个独特的克隆型(图9)。图8和9还示出了在非富集样品(最右侧)中发现的独特克隆型的数目，数据显示所发现的独特克隆型的数目小于V引物富集样品。检测到比IGHM克隆型高大约10倍的IGHG克隆型，这与SmartSeq2 RNAseq文库的先前结果(数据未示出)类似。
可变区引物富集还导致单细胞SmartSeq2文库检测到的克隆型增加4倍。在PCR可变引物富集后观察到的TRB相对于IGH的克隆型增加与cDNA文库中已知较低的TRB转录物丰度一致。例如，已知每个T-细胞的TRA/TRB转录物表达相对于每个B-细胞的IGH/IGK/IGL表达较少，特别是对于浆细胞而言。观察到在来自扁桃体组织的空间文库中检测到的技术重复之间IGH克隆型有大量但不完全的重叠。类似地，还观察到在来自扁桃体组织的空间文库中检测到的技术重复之间TRB克隆型有大量但不完全的重叠。数据显示，在其他两个技术重复中的至少一个或多个中检测到来自给定技术重复的大约一半的克隆型，这表明在给定技术重复中检测到了许多克隆型，但并非在每个样品中检测到了所有克隆型(数据未示出)。与没有可变区引物富集的靶向捕获相比，使用poly(T)捕获结构域与PCR可变区引物富集相结合检测到克隆型计数大约10-20倍的增加。
总的来说，这些数据显示，由poly(A)捕获结构域捕获的编码免疫细胞受体的分析物的PCR引物富集是可能的。poly(A)捕获结构域的使用允许同时捕获不编码免疫细胞受体的分析物，并且也不需要具有靶向捕获结构域的定制阵列。
图10A示出了空间阵列上的H&E染色扁桃体组织，图10B示出了由扁桃体组织制备的空间文库的大小分布。图10A-B中示出的数据示出了染色的扁桃体组织和该实施例中包括的数据的空间文库的大小分布。在空间阵列上对乳腺肿瘤组织进行类似的H&E染色并还从乳腺肿瘤组织制备空间文库的大小分布(数据未示出)。图11示出了来自此实施例中进行的单细胞分析的B-细胞和T-细胞的聚类。图11显示，在鉴定包括免疫细胞受体的细胞群体时与那些细胞在生物样品内的空间位置无关。图11示出了并非设计为生物样品内免疫细胞的空间表示的单细胞分析。
实施例3-编码免疫细胞受体的分析物的富集
图2示出了在空间阵列上捕获后富集T-细胞受体(TCR)分析物和B-细胞受体(BCR)分析物的示例性工作流程。在捕获分析物(例如，TCR和BCR分析物)之后，合成cDNA，随后是靶标富集以及文库制备和测序或经由TCR分析物的半巢式PCR进行的进一步的靶标富集，随后是Illumina测序和最终分析。
Visium空间基因表达文库的制备
将新鲜冷冻的乳腺肿瘤和扁桃体组织的切片切至10μm厚度并安装到来自Visium空间基因表达载片和试剂试剂盒(10X Genomics)的载片上。按制造商的操作规程(文件编号CG000239Rev A，10x Genomics)制备测序文库。在成像之前，根据操作规程的任选步骤“盖片施加和移除”在载片上安装盖片。使用Metafer Slide Scanning平台(MetaSystems)以20x放大率获取组织图像并用VSlide软件(MetaSystems)拼接原始图像。对操作规程进行调整，将苏木精和曙红(H&E)染色时间减至4分钟并且组织透化进行12分钟。
Visium空间基因表达文库的测序和数据处理
在具有28-10-10-150设置的NextSeq2000(Illumina)(扁桃体)或具有28-10-10-120设置的NovaSeq6000(Illumina)(乳腺肿瘤)上对最终的测序文库测序。172M和93M原始读段对分别从扁桃体-1和扁桃体-2获得，而215M和244M分别从乳腺肿瘤1和乳腺肿瘤2获得。
在bcl文件的多路分配之后，使用Cutadapt(Martin，M.，Cutadapt removesadapter sequences from high-throughput sequencing reads，EMBnet Journal，17(1)(2011))修剪读段2fastq文件以从5’末端(例如，读段2的开始)移除全长或截短的模板转换寡核苷酸(TSO)序列和从3’末端(例如，读段2的末端)移除poly(A)同聚物。使用TSO序列(SEQ ID NO：114)(AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGG)作为具有最小重叠为5的非内部5’衔接子，这意味着从5’末端移除部分匹配(最多5个碱基对)或完整的TSO序列。TSO修剪的容错设置为0.1以允许最多3个错误。对于3’末端同聚物修剪，使用10As的序列作为常规3’衔接子以移除潜在的polyA尾产物而不管其在读段中的位置如何，并还具有5个碱基对的最小重叠。使用SpaceRanger管道(10X Genomics)版本1.2.1(扁桃体)和版本1.0.0(BC)处理修剪后的数据并映射到GRCH38 v93基因组组件。
用杂交捕获进行靶标富集
使用IDT xGen杂交和洗涤试剂盒(#1080584)进行TCR和BCR靶标富集，对BCR和TCR转录物各使用一个富集探针池(IDT)(IG和TCR池，表3)。定制封闭寡核苷酸(IDT，表3)设计为与cDNA文库的衔接子序列杂交并防止脱靶片段与BCR/TCR转录物结合而污染富集文库。分别以比率1∶3和1∶12混合IG和TCR富集探针池并使用两个设置富集每个样品。
遵循“DNA文库的xGen杂交捕获”版本4(IDT)操作规程，每个反应的输入为10μlVisium cDNA，对应于约45-130ng，并且杂交富集反应进行过夜。
在每次PCR反应后，使用25μl 2xKAPA mix、7.5μl cDNA引物(10XGenomics)和17.5μl样品在MQ水中用AMPure珠洗涤将富集且纯化的文库扩增两次。对于PCR使用以下设置：1.98℃ 3分钟；2. 98℃ 15秒；3. 63℃ 30秒；4. 72℃ 2分钟；5.将步骤2-5重复6次总共7个循环(第1 PCR)和重复4次总共5个循环(第2 PCR)；6.72℃ 1分钟
文库制备和测序
使用来自杂交富集捕获方法的所得产物作为SMRTbell文库制备方案(PacBio)的输入。通过AMPure珠纯化(0.8x)浓缩DNA，在6μl洗脱缓冲液中洗脱，使用1μl进行Qubit测量。每个文库使用至少1μg的输入并且每个测序试验中总共使用多路复用的8个样品。PacBio Barcoded Overhand Adapters被用于多路复用并按照制造商的说明进行文库制备。汇集的文库具有11.4ng/μl的浓度(50μl总洗脱体积)。使用SMRT酶清理试剂盒移除线性和单链DNA。最终文库在国家基因组学基础设施(NGI)/Uppsala基因组中心在Sequel II上以270万长的读段序列(168-422K读段/样品)进行测序。
测序数据分析
用于分析的输入为从PacBio测序获得的多路分配共有读段并用Python编程语言进行。将fastq文件解析为具有读段ID、序列和质量列的数据帧。在数据中搜索Truseq衔接子序列和TSO序列以锚定每个读段的末端，并弃去缺乏这些序列的读段。鉴定从读段或其反向补体的前七个碱基开始的Truseq衔接子的一部分。如果任何位置以为1或更小的汉明距离与序列匹配，则对它们予以标记。对TSO序列的一部分执行相同的操作。根据需要对序列进行反向补充，使得所有读段在开始处具有Truseq衔接子(SEQ ID NO：115)并在结束处具有TSO(SEQ ID NO：114)。鉴定空间条形码和UMI。在TruSeq衔接子之后获得前16个碱基以确定空间条形码，随后的碱基确定了唯一分子标识符(UMI)。另外，在UMI的序列之后，至少4个碱基被鉴定为均为胸腺嘧啶(例如，poly(dT)捕获结构域)并从该间隔内具有任何其他碱基的读段中过滤掉。移除具有鉴定为poly(dT)序列的UMI的任何读段。poly(dT)区的末端被定义为模式‘[^T]T{0，2}[^T]T{0，2}[^T]’的第一匹配位置。
克隆性分析和可视化
为了运行MIXCR(版本3.0.3)，修剪了poly(dT)和TSO序列并将读段写入新的fastq文件。用MIXCR和以下命令分析读段：
‘mixcr analyze shotgun-s hsa--align-OsaveOriginalReads＝true--starting-material rna<TrimmedFastq><SampleName>’
执行以下MIXCR命令以报告每个读段的比对：
‘mixcr exportAlignments-f-cloneIdWithMappingType-cloneId-readIds-descrsR1<SampleName>.clna<ReportFile>’
使用所得表格文件来将读段归属于MIXCR输出中的克隆型。过滤掉未映射到任何克隆的任何读段(克隆ID＝＝-1)，然后将读段按空间条形码和UMI分组在表中，并计算存在多少读段数以及有多少克隆与每个UMI相关联。过滤掉被归属于多于一种克隆型的UMI，因为它们很可能是由于PCR或测序错误造成的。
随后将所得克隆型计数矩阵加载到R中(R Core Team，A language andenvironment for statistical computing，R Foundation for Statistical Computing，(2017))。还加载了通过Visium平台和SpaceRanger管道获得的组织图像、空间坐标和总基因表达计数，并使用STutility包(
等人，Seamless integration of imageand molecular analysis for spatial transcriptomics workflows，BMC Genomics，21(1)，(2020))产生每个样品类型(扁桃体和乳腺肿瘤肿瘤)的一个Seurat对象(Stuart等人，Comprehensive Integration of Single-Cell Data，Cell，177(7)(2019))。通过添加存在于总基因表达计数矩阵中的任何缺失的空间条形码来扩展克隆型计数矩阵，并对所有添加的条形码填充零计数。将新的扩展矩阵作为新的测定加载到Seurat对象中，其中使用STUtility包的内置功能将基因和克隆型可视化在组织图像上。
单细胞RNA测序的细胞处理
使用人肿瘤解离试剂盒(Miltenyi Biotec，130-095-929)和gentleMACS解离器(Miltenyi Biotec)，通过酶促组织解离来制备来自五个乳腺肿瘤区域(肿瘤A-E)的单细胞悬浮液。细胞悬浮液在室温下用Zombie Aqua Fixable viability染料(Biolegend，423101)染色20分钟，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。将细胞与Human TruStain Fcblock(Biolegend，422302)一起孵育10分钟以限制非特异性抗体结合，然后用抗-EPCAM(1∶40，Biolegend，324206)和抗-CD45(1∶40，Biolegend，304021)在FACS缓冲液(PBS+0.5％牛血清白蛋白)中染色20分钟。随后洗涤细胞并将其重悬浮于FACS缓冲液中。使用influx流式细胞仪(BD Biosciences)进行荧光激活细胞分选(FACS)以分选活的EPCAM+CD45+单细胞，并使用Eppendorf管进行10x Genomics Chromium单细胞基因表达分析。使用单染色对照(例如，细胞和珠)和含有除所测量的那种以外小图中的所有荧光染料的荧光减一对照(FMO)来设定电压和定义适当的门控策略。
10x Genomics Chromium单细胞文库制备和测序
按照制造商的说明，使用10x Genomics Chromium单细胞5′测定法从EPCAM-CD45+细胞生成单细胞基因表达和VDJ克隆型文库。使用Bioanalyzer高灵敏度DNA试剂盒(Agilent Technologies)和Qubit高灵敏度试剂盒(Thermo Fischer Scientific)对文库进行分析和定量。由国家基因组学基础设施SciLifeLab在NovaSeq 6000 SP流动池(Illumina，150-8-8-150读段设置)上对最终的单细胞基因表达文库进行了测序(目标是每个细胞至少30,000个读段)。
单细胞基因表达和VDJ数据处理
测序输出由Cell Ranger(版本5.0，10X Genomics)处理。使用Seurat包(版本4.0，Satija Lab)分析基因-条形码计数矩阵。这里引入了两个过滤步骤。首先，通过VDJ输出中的条形码列表将原始基因表达矩阵分成子集，包括T细胞子集和B细胞子集。基于原始基因表达矩阵及其子集的UMI计数、基因计数和线粒体百分比，选择每个阈值以保持高质量细胞的最大计数并避免丢失具有VDJ测序输出的T和B细胞。其次，通过Seurat中的HTODemux()函数检测并过滤每个样品中的双联体。由Seurat将所有样品整合并按比例绘制到一个计数矩阵中。由Seurat对合并的数据集进行降维、UMAP生成和聚类。合并的数据集按0.2至2的分辨率梯度聚类。最终分辨率由每个聚类中最上面列出的差异表达基因的显著性决定。通过差异表达的基因及其标记基因表达水平来注释细胞类型。将所有降维和注释结果以及VDJ输出文件都导入到Loupe Browser(版本5.0，10X Genomics)和Loupe VDJ Browser(版本4.0，10X Genomics)中进行交互式分析。
半巢式PCR
在杂交捕获和捕获后PCR扩增(14个循环)之后，使用以下引物进行半巢式PCR反应：靶向TRAV或TRBV基因的V引物，CDR3区的5’(即，“外部”TRAV或TRBV引物，序列参见表3)和靶向Visium cDNA文库中转录物上存在的通用部分读段1序列的引物(‘partRead1’，参见表3)。PartRead1也与TruSeq索引兼容以允许样品的多路复用以便测序。对于半巢式PCR实验，在杂交捕获之前进一步预扩增Visium cDNA以生成测试所需的更多输入。外部V引物PCR输入为来自两个乳腺肿瘤组织Visium文库(复制，邻近切片)的1-5ng杂交捕获cDNA并且反应使用KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X)(KAPA Biosystems)运行。所有引物均稀释40倍，最终浓度为2.5μM(Integrated DNA Technologies)。在以下条件下运行PCR，持续15个循环：1. 98℃ 5分钟；2. 98℃ 20秒；3. 65℃ 30秒；4. 72℃ 1:30分钟；5.将步骤2-5重复14次，总共15个循环；和6.72℃7分钟。
进行定量实时PCR(qPCR)以确定适当的循环数(以避免指数式扩增)。使用AMPure珠(0.6x)纯化外部V引物PCR产物，随后进行两次80％的EtOH洗涤。在37℃下孵育15分钟后，在EB缓冲液中洗脱外部V引物PCR产物。使用Qubit和BioAnalyzer(Agilent)对清理后的PCR产物进行定量。使用3-5ng的每种PCR产物作为后续内部V引物PCR的输入。
使用以下引物进行内部V引物PCR：靶向TRAV或TRBV基因的V引物，靠近/邻近CDR3区(例如，‘内部’V引物)和与针对外部V引物PCR所描述(‘partRead1’)相同的通用部分读段1引物。这些内部V引物具有与TruSeq索引化兼容的手柄。引物浓度和试剂为如针对外部V引物PCR所述。使用qPCR来确定最佳循环数(7)。使用以下条件进行PCR反应：7. 98℃ 5分钟；8. 98℃ 20秒；9. 72℃ 30秒；10. 72℃1:30分钟；11.将步骤2-5重复14次，总共15个循环；12. 72℃ 7分钟。
如上所述进行相同的AMPure珠清理和乙醇洗涤。使用Qubit和BioAnalyzer(Agilent)对最终洗脱的PCR产物进行定量。使用TruSeq索引对样品进行PCR索引化(5个循环)并使用短读段1和较长读段2在Novaseq测序仪上测序以捕获整个CDR3区和5’末端的部分恒定区。
用TCR和BCR序列的杂交捕获进行靶标富集
如上文所讨论，可使用PCR从poly(dT)捕获的cDNA文库例如Visium(10XGenomics)扩增BCR(IGH、IGK、IGL)和TCR(TRA、TRB)克隆。在一些情况下，获得的扩增子缺少空间条形码。因此，为了在保留空间条形码和CDR3克隆信息的同时富集TCR和BCR序列，测试了使用杂交探针(IDT技术)的靶标富集策略。按照制造商的说明，根据上述方法作了一些小的改动。使用来自两个扁桃体切片(例如，来自同一扁桃体，间隔150μM)的Visium cDNA作为输入材料。图12示出了用poly(T)捕获结构域的poly(A)捕获。poly(T)捕获结构域可从组织捕获其他mRNA分析物，包括编码免疫细胞受体的mRNA分析物，然而，使用杂交富集探针策略富集免疫细胞分析物。BCR杂交探针(n＝174)设计为跨越所有BCR恒定基因(例如，IGH、IGL、IGK)，参见表3。类似地，TCR杂交探针(n＝20)设计为靶向TCR恒定基因(例如，TRA、TRB)，参见表3。图13示出了将包括BCR、TCR、其他分析物以及对BCR和TCR分析物特异的杂交探针池的示例性cDNA文库。将Visium cDNA样品与杂交富集捕获探针杂交并在如图15中所示封闭寡核苷酸的存在下进行杂交反应过夜(图14)，所述封闭寡核苷酸靶向存在于cDNA文库中的转录物上的读段1、Poly(dT)VN和TSO序列。在一系列洗涤后，进行捕获后PCR反应，其扩增所捕获的分析物池的全部或一部分。制备索引化的PacBio文库用于从洗脱的PCR产物进行长读段测序。为了避免不必要的PCR循环——这会引入伪影、错误和嵌合片段，进行加有条形码的突出衔接子连接以向每个样品添加独特的样品索引。然后对富集的文库测序、多路分配并分析。
克隆型数目
从捕获的免疫细胞mRNA分析物制备的cDNA经由如上所述的杂交捕获方法富集并与PacBio长读段测序相结合。得到的数据从扁桃体Visium文库成功地鉴定出加有空间条形码的BCR和TCR克隆(图16A-C)。基于MIXCR分析(先前描述)(Bolotin等人，(2015))，克隆被定义为具有VDJ基因片段和CDR3区的独特组合的单链。图16A示出了来自同一扁桃体的间隔150μm的两个扁桃体切片的克隆型(左)和UMI(右)计数的分布。每个斑点的克隆型数目在0至300之间。对于每个扁桃体样品，鉴定出大约10,000个IGH、IGK和IGL克隆(BCR)(图16B)。对于TCR，平均捕获了3,437个TRB克隆型和687个TRA克隆型。TRA克隆的捕获低大约五倍很可能是由于TRAC在每个细胞上的表达较低，这与之前的结果一致。数据表明更成功地捕获了BCR克隆(相对于TCR克隆)，不希望受理论束缚，这可能归因于多种原因，包括B细胞谱系细胞(特别是浆细胞)的更高受体表达和每个B细胞克隆的更高细胞数目。此外，除了由非常罕见的IgE阳性B细胞谱系细胞表达的IGHE之外，发现了所有的IGH同种型(图16C)。少数IGH克隆未被归属恒定基因。正如预期的，表达IGHG和IGHA的细胞占主导地位，其次是IGHM。BCR轻链(IGK和IGL)的表达量相当。
总的来说，数据表明，用杂交探针从Visium cDNA mRNA文库进行靶标富集成功地从富含淋巴细胞的组织富集了BCR和TCR克隆。
扁桃体中B细胞和T细胞的空间分隔
预计对于扁桃体和类似组织，例如淋巴结，B细胞克隆将主要分隔在滤泡或生发中心中，其中发生B细胞克隆选择和扩张。在Visium基因表达数据中，编码CD20(一种B细胞特异性基因)的MS4A1以簇样模式表达，该簇样模式对应于如通过H&E染色而可视化的增加的细胞密度，其是B细胞滤泡的提示(“B细胞滤泡”)(图17A，箭头)。相比之下，编码CD138并被认为是可靠的浆细胞富集基因的SDC1主要在组织的边界处和B细胞滤泡的周围表达，正如从浆细胞所预期的(图17A)。这种细胞类型分布也得到IGH恒定基因(图17B，顶部)IGHM的空间表达的支持，IGHM在类别转换为其他同种型之前由B细胞表达并且大部分富集在与MS4A1相同的B细胞滤泡样区域中。类似地，IGHD，尽管表达更稀疏，但也富集在B细胞滤泡区域中。对于其他IGH同种型(图17A，顶部)和轻链(图17B，底部)，最高基因表达主要在B细胞滤泡外，提示浆细胞的表达增加。基于CD3E和TCR恒定基因(例如，TRAC、TRBC1、TRBC2)表达，T细胞很可能位于B细胞滤泡外或周围，这与淋巴组织中已知的所谓“T细胞区”的存在非常吻合(图17C)。
扁桃体中的克隆型分布
数据确定所捕获的克隆是否相对于观察到的B和T细胞分隔在扁桃体组织中空间分隔(图17A-C和图18A-G)。最丰富的克隆IGKC几乎完全在单个B细胞滤泡中高度表达，如由隔开150μM的两个扁桃体切片所捕获(图18A)。对许多克隆也观察到类似的表达模式；例如，在图18B中，第二代表性克隆IGLC局限于另一个B细胞滤泡。不希望受理论的束缚，这些轻链可以由B细胞正在进行的选择表达并因此以较高的浓度存在。还发现了其表达不局限于B细胞滤泡的大克隆(参见例如图18C)。这些结果表明，可在组织切片内以明显的空间分隔捕获克隆。根据IGHM基因表达，还在单滤泡中发现了IGHM克隆(代表性实例参见例如图18D)。相比之下，表达IGHA的克隆倾向于沿着扁桃体组织的边界表达(图18E)，这与空间IGHA基因表达一致(图18B)。TCR克隆倾向于位于B细胞滤泡的边界处(TRB和TRA克隆的代表性实例分别参见例如图18F和图18G)。与BCR克隆相比，TCR克隆还倾向于平均每个克隆具有较低的UMI计数，这再次证实TCR转录物在扁桃体Visium cDNA文库中以及随后在富集的文库中丰度较低。
乳腺肿瘤组织中淋巴细胞受体的靶标富集
还对乳腺肿瘤组织测试了如本文所述的靶标富集策略。由于乳腺肿瘤组织中肿瘤细胞和基质细胞的高频率，因此预期与扁桃体组织相比，淋巴细胞相关转录物的丰度较低。从来自乳腺肿瘤组织的两个连续切片生成Visium文库，所述切片从HER2+乳腺肿瘤患者分离。图19A示出了两个乳腺肿瘤切片的克隆型(左)和UMI(右)计数的分布。每个斑点的克隆型数目在0至300之间。对于每个扁桃体样品，我们鉴定出大约10,000个IGH、IGK和IGL克隆(BCR)(图19B)。使用相同的方法，捕获来自每个乳腺肿瘤切片的大约1000个IGH、IGK和IGL克隆以及20-100个TCR克隆(图19B和19C)。相对于扁桃体组织，预期乳腺肿瘤样品中B细胞和T细胞克隆较少，然而，相对于B细胞克隆，T细胞克隆远更少。不希望受理论的束缚，制备了来自同一肿瘤的单细胞基因表达和VDJ文库并从单细胞数据获得了比B细胞谱系细胞多10倍的T细胞(数据未示出)。因此，本文描述的空间方法在捕获B细胞表达和指示血浆的基因表达方面可能比单细胞方法更有效，而单细胞技术在捕获T细胞方面可能优于用于抗原受体的空间转录组学。
发现乳腺肿瘤组织内IGH克隆(例如，IGHV4-28、IGHD3-3、IGHD3-9、IGHJ4、IGHG1/IGHG3)的空间分隔在两个相邻的切片之间是一致的(代表性实例参见图20)。此外，由于来自同一肿瘤样品的相关单细胞VDJ数据是可用的，故还进行了空间克隆型数据中成对克隆的检测。虽然单细胞数据是从比用于空间转录组学分析的10μM组织切片大得多的组织切片处理的，但预期两个样品中都将呈现大克隆。通过比较用于抗原受体克隆型列表的空间转录组学与单细胞VDJ数据，在两个数据集中共发现了6组成对的BCR受体。图21A-C中示出了三个这样的对的空间基因表达。证实了每个克隆的两条链的相似空间分布以及与总的相应IGH恒定基因表达的一致性。对于TCR克隆，仅发现两组成对的受体，UMI计数稀少(数据未示出)。数据示出了使用用于抗原受体的空间转录组学检测成对的受体并且这些成对的受体以空间一致的方式表达。
使用半巢式PCR进行TCR的靶标富集
如上所述，杂交探针方法在捕获BCR克隆型方面更有效，最可能是由于每个细胞的表达高于TCR克隆型。为了改善TCR捕获，引入了第二靶标富集步骤以增加T细胞克隆型产率和制备与Illumina测序兼容的文库。在杂交探针捕获和随后的PCR扩增之后，使用半巢式PCR方法富集TCR分析物，如图22中所示。该PCR为两步PCR，其中将分别靶向TRAV和TRBV基因的两组V(例如，可变结构域区“V”的引物)引物(例如，“外部”和“内部”)与靶向存在于Visium cDNA文库中的转录物上的部分读段1的通用引物组合。“外部”引物可称为第二引物，而“内部”引物可称为第三引物。外部引物靶向远离CDR3起点的基因区域(例如，距编码V区段的末端约200-270bp之间)，而内部引物靶向更靠近CDR3的基因区段(距编码V区段的末端约20-25bp之间)。
结果显示使用半巢式PCR方法从乳腺肿瘤Visium文库扩增TRA和TRB转录物两者并且这些文库具有预期的大小(数据未示出)。
总的来说，数据证实用于抗原受体的空间转录组学可以从扁桃体和乳腺肿瘤组织分离出大量的BCR和TCR克隆型。这些克隆以与其生物学和细胞类型基因表达模式一致的特征方式在组织中分隔。
实施方案
实施方案1为一种确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型的存在和/或丰度的方法，所述方法包括：(a)使生物样品与包括多个捕获探针的阵列接触，其中所述多个捕获探针的捕获探针包括(i)空间条形码和(ii)与编码免疫细胞克隆型的免疫细胞受体的核酸特异性结合的捕获结构域；和(b)确定(i)空间条形码的全部或部分序列或其补体，和(ii)编码免疫细胞受体的核酸的全部或部分序列或其补体，并使用(i)和(ii)的确定序列来确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型的存在和/或丰度。
实施方案2为实施方案1的方法，其中所述免疫细胞克隆型为T细胞克隆型。
实施方案3.实施方案2的方法，其中所述免疫细胞受体为T细胞受体α链。
实施方案4为实施方案3的方法，其中所述捕获结构域与编码T细胞受体α链的恒定区的核酸序列特异性结合。
实施方案5为实施方案3或4的方法，其中步骤(b)包括确定编码T细胞受体α链的CDR3的序列。
实施方案6为实施方案5的方法，其中步骤(b)还包括确定编码T细胞受体α链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。
实施方案7为实施方案5的方法，其中步骤(b)还包括确定编码T细胞受体α链的全长可变结构域的序列。
实施方案8为实施方案2的方法，其中所述免疫细胞受体为T细胞受体β链。
实施方案9为实施方案8的方法，其中所述捕获结构域与编码T细胞受体β链的恒定区的核酸序列特异性结合。
实施方案10为实施方案8或9的方法，其中步骤(b)包括确定编码T细胞受体β链的CDR3的序列。
实施方案11为实施方案10的方法，其中步骤(b)还包括确定编码T细胞受体β链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。
实施方案12为实施方案10的方法，其中步骤(b)还包括确定T细胞受体β链的全长可变结构域。
实施方案13为实施方案1的方法，其中所述免疫细胞克隆型为B细胞克隆型。
实施方案14为实施方案13的方法，其中所述免疫细胞受体为免疫球蛋白κ轻链。
实施方案15为实施方案14的方法，其中所述捕获结构域与编码免疫球蛋白κ轻链的恒定区的核酸序列特异性结合。
实施方案16为实施方案14或15的方法，其中步骤(b)包括确定编码免疫球蛋白κ轻链的CDR3的序列。
实施方案17为实施方案16的方法，其中步骤(b)还包括确定编码免疫球蛋白κ轻链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。
实施方案18为实施方案16的方法，其中步骤(b)还包括确定编码免疫球蛋白κ轻链的全长可变结构域的序列。
实施方案19为实施方案13的方法，其中所述免疫细胞受体为免疫球蛋白λ轻链。
实施方案20为实施方案19的方法，其中所述捕获结构域与编码免疫球蛋白λ轻链的恒定区的核酸序列特异性结合。
实施方案21为实施方案19或20的方法，其中步骤(b)包括确定编码免疫球蛋白λ轻链的CDR3的序列。
实施方案22为实施方案21的方法，其中步骤(b)还包括确定编码免疫球蛋白λ轻链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。
实施方案23为实施方案21的方法，其中步骤(b)还包括确定编码免疫球蛋白λ轻链的全长可变结构域的序列。
实施方案24为实施方案13的方法，其中所述免疫细胞受体为免疫球蛋白重链。
实施方案25为实施方案24的方法，其中所述捕获结构域与编码免疫球蛋白重链的恒定区的核酸序列特异性结合。
实施方案26为实施方案24或25的方法，其中步骤(b)包括确定编码免疫球蛋白重链的CDR3的序列。
实施方案27为实施方案26的方法，其中步骤(b)还包括确定编码免疫球蛋白重链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。
实施方案28为实施方案26的方法，其中步骤(b)还包括确定编码免疫球蛋白重链的全长可变结构域的序列。
实施方案29为实施方案1-28中任一项的方法，其中步骤(b)包括捕获探针使用编码免疫细胞受体的核酸作为模板，从而生成延伸的捕获探针。
实施方案30为实施方案29的方法，其中步骤(b)包括延伸捕获探针的3’末端。
实施方案31为实施方案29或30的方法，其中步骤(b)还包括生成第二核酸链，所述第二核酸链包括(i)与空间条形码的全部或部分互补的序列，和(ii)对应于编码免疫细胞受体的核酸的全部或部分序列的序列。
实施方案32为实施方案1-31中任一项的方法，其中所述捕获探针还包含切割结构域、功能结构域、唯一分子标识符或其任何组合。
实施方案33为实施方案1-30中任一项的方法，其中所述捕获探针还包含功能结构域。
实施方案34为实施方案33的方法，其中步骤(b)还包括生成第二核酸链，所述第二核酸链包括(i)与功能结构域的全部或部分互补的序列，(ii)与空间条形码的全部或部分互补的序列，和(iii)对应于编码免疫细胞受体的核酸的全部或部分序列的序列。
实施方案35为实施方案34的方法，其中步骤(b)还包括使用(i)包含功能结构域的全部或部分的第一引物，其中所述功能结构域为第二核酸链中空间条形码的5’，和(ii)包含与编码免疫细胞受体的可变区的序列的一部分基本上互补的序列的第二引物来扩增第二核酸链。
实施方案36为实施方案1-35中任一项的方法，其中所述生物样品包含组织样品。
实施方案37为实施方案36的方法，其中所述组织样品为组织切片。
实施方案38为实施方案37的方法，其中所述组织切片为固定的组织切片。
实施方案39为实施方案38的方法，其中所述固定的组织切片为福尔马林固定石蜡包埋的组织切片。
实施方案40为实施方案37-39中任一项的方法，其中所述组织切片包含肿瘤区域。
实施方案41为实施方案1-40中任一项的方法，其中所述编码免疫细胞受体的核酸包含RNA。
实施方案42为实施方案41的方法，其中所述RNA为mRNA。
实施方案43为实施方案1-40中任一项的方法，其中所述编码免疫细胞受体的核酸包含DNA。
实施方案44为实施方案43的方法，其中所述DNA为基因组DNA。
实施方案45为实施方案1-44中任一项的方法，其中所述方法还包括在步骤(b)之前使生物样品与核糖体RNA耗尽探针和线粒体RNA耗尽探针接触。
实施方案46为实施方案1-45中任一项的方法，其中所述方法还包括对生物样品成像。
实施方案47为实施方案1-46中任一项的方法，其中步骤(b)中的确定包括对(i)空间条形码的全部或部分序列或其补体和(ii)编码免疫细胞受体的核酸的全部或部分序列或其补体测序。
实施方案48为实施方案1-47中任一项的方法，其中步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型的存在。
实施方案49为实施方案1-47中任一项的方法，其中步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型的丰度。
实施方案50为实施方案1-47中任一项的方法，其中步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型的存在和丰度。
实施方案51为实施方案1-47中任一项的方法，其中步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处两种或更多种免疫细胞克隆型的存在。
实施方案52为实施方案1-47中任一项的方法，其中步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处两种或更多种免疫细胞克隆型的丰度。
实施方案53为实施方案1-47中任一项的方法，其中步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处两种或更多种免疫细胞克隆型的存在和丰度。
实施方案54为实施方案51-53中任一项的方法，其中所述方法还包括比较所述两种或更多种免疫细胞克隆型。
实施方案55为实施方案51-54中任一项的方法，其中所述两种或更多种免疫细胞克隆型各自为B细胞克隆型。
实施方案56为实施方案51-54中任一项的方法，其中所述两种或更多种免疫细胞克隆型各自为T细胞克隆型。
实施方案57为实施方案51-54中任一项的方法，其中所述两种或更多种免疫细胞克隆型包含至少一种T细胞克隆型和至少一种B细胞克隆型。
实施方案58为一种确定生物样品中一定位置处免疫细胞受体的存在和/或丰度的方法，所述方法包括：(a)使生物样品与包括多个捕获探针的阵列接触，其中所述多个捕获探针的捕获探针包括(i)空间条形码和(ii)与编码免疫细胞受体的核酸特异性结合的捕获结构域；和(b)确定(i)空间条形码的全部或部分序列或其补体，和(ii)编码免疫细胞受体的核酸的全部或部分序列或其补体，并使用(i)和(ii)的确定序列来确定生物样品中一定位置处免疫细胞受体的存在和/或丰度。
实施方案59为实施方案58的方法，其中所述免疫细胞受体为T细胞受体α链。
实施方案60为实施方案59的方法，其中所述捕获结构域与编码T细胞受体α链的恒定区的核酸序列特异性结合。
实施方案61为实施方案59或60的方法，其中步骤(b)包括确定编码T细胞受体α链的CDR3的序列。
实施方案62为实施方案61的方法，其中步骤(b)还包括确定编码T细胞受体α链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。
实施方案63为实施方案61的方法，其中步骤(b)还包括确定编码T细胞受体α链的全长可变结构域的序列。
实施方案64为实施方案58的方法，其中所述免疫细胞受体为T细胞受体β链。
实施方案65为实施方案64的方法，其中所述捕获结构域与编码T细胞受体β链的恒定区的核酸序列特异性结合。
实施方案66为实施方案64或65的方法，其中步骤(b)包括确定编码T细胞受体β链的CDR3的序列。
实施方案67为实施方案66的方法，其中步骤(b)还包括确定编码T细胞受体β链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。
实施方案68为实施方案66的方法，其中步骤(b)还包括确定T细胞受体β链的全长可变结构域。
实施方案69为实施方案58的方法，其中所述免疫细胞受体为免疫球蛋白κ轻链。
实施方案70为实施方案69的方法，其中所述捕获结构域与编码免疫球蛋白κ轻链的恒定区的核酸序列特异性结合。
实施方案71为实施方案69或70的方法，其中步骤(b)包括确定编码免疫球蛋白κ轻链的CDR3的序列。
实施方案72为实施方案71的方法，其中步骤(b)还包括确定编码免疫球蛋白κ轻链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。
实施方案73为实施方案71的方法，其中步骤(b)还包括确定编码免疫球蛋白κ轻链的全长可变结构域的序列。
实施方案74为实施方案58的方法，其中所述免疫细胞受体为免疫球蛋白λ轻链。
实施方案75为实施方案74的方法，其中所述捕获结构域与编码免疫球蛋白λ轻链的恒定区的核酸序列特异性结合。
实施方案76为实施方案74或75的方法，其中步骤(b)包括确定编码免疫球蛋白λ轻链的CDR3的序列。
实施方案77为实施方案76的方法，其中步骤(b)还包括确定编码免疫球蛋白λ轻链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。
实施方案78为实施方案76的方法，其中步骤(b)还包括确定编码免疫球蛋白λ轻链的全长可变结构域的序列。
实施方案79为实施方案58的方法，其中所述免疫细胞受体为免疫球蛋白重链。
实施方案80为实施方案79的方法，其中所述捕获结构域与编码免疫球蛋白重链的恒定区的核酸序列特异性结合。
实施方案81为实施方案79或80的方法，其中步骤(b)包括确定编码免疫球蛋白重链的CDR3的序列。
实施方案82为实施方案81的方法，其中步骤(b)还包括确定编码免疫球蛋白重链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。
实施方案83为实施方案81的方法，其中步骤(b)还包括确定编码免疫球蛋白重链的全长可变结构域的序列。
实施方案84为实施方案58-83中任一项的方法，其中步骤(b)包括使用编码免疫细胞受体的核酸作为模板延伸捕获探针的末端，从而生成延伸的捕获探针。
实施方案85为实施方案84的方法，其中步骤(b)包括延伸捕获探针的3’末端。
实施方案86为实施方案84或85的方法，其中步骤(b)还包括生成第二核酸链，所述第二核酸链包括(i)与空间条形码的全部或部分互补的序列，和(ii)对应于编码免疫细胞受体的核酸的全部或部分序列的序列。
实施方案87为实施方案58-86中任一项的方法，其中所述捕获探针还包含切割结构域、功能结构域、唯一分子标识符或其任何组合。
实施方案88为实施方案58-85中任一项的方法，其中所述捕获探针还包含功能结构域。
实施方案89为实施方案88的方法，其中步骤(b)还包括生成第二核酸链，所述第二核酸链包括(i)与功能结构域的全部或部分互补的序列，(ii)与空间条形码的全部或部分互补的序列，和(iii)对应于编码免疫细胞受体的核酸的全部或部分序列的序列。
实施方案90为实施方案89的方法，其中步骤(b)还包括使用(i)包含功能结构域的全部或部分的第一引物，其中所述功能结构域为第二核酸链中空间条形码的5’，和(ii)包含与编码免疫细胞受体的可变区的序列的一部分基本上互补的序列的第二引物来扩增第二核酸链。
实施方案91为实施方案58-90中任一项的方法，其中所述生物样品包含组织样品。
实施方案92为实施方案91的方法，其中所述组织样品为组织切片。
实施方案93为实施方案92的方法，其中所述组织切片为固定的组织切片。
实施方案94为实施方案93的方法，其中所述固定的组织切片为福尔马林固定石蜡包埋的组织切片。
实施方案95为实施方案92-94中任一项的方法，其中所述组织切片包含肿瘤区域。
实施方案96为实施方案58-95中任一项的方法，其中所述编码免疫细胞受体的核酸包含RNA。
实施方案97为实施方案96的方法，其中所述RNA为mRNA。
实施方案98为实施方案58-95中任一项的方法，其中所述编码免疫细胞受体的核酸包含DNA。
实施方案99为实施方案98的方法，其中所述DNA为基因组DNA。
实施方案100为实施方案58-99中任一项的方法，其中所述方法还包括在步骤(b)之前使生物样品与核糖体RNA耗尽探针和线粒体RNA耗尽探针接触。
实施方案101为实施方案58-100中任一项的方法，其中所述方法还包括对生物样品成像。
实施方案102为实施方案58-101中任一项的方法，其中步骤(b)中的确定包括对(i)空间条形码的全部或部分序列或其补体和(ii)编码免疫细胞受体的核酸的全部或部分序列或其补体测序。
实施方案103为实施方案58-102中任一项的方法，其中步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处免疫细胞受体的存在。
实施方案104为实施方案58-102中任一项的方法，其中步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处免疫细胞受体的丰度。
实施方案105为实施方案58-102中任一项的方法，其中步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处免疫细胞受体的存在和丰度。
实施方案106为实施方案58-102中任一项的方法，其中步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处两种或更多种免疫细胞受体的存在。
实施方案107为实施方案58-102中任一项的方法，其中步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处两种或更多种免疫细胞受体的丰度。
实施方案108为实施方案58-102中任一项的方法，其中步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处两种或更多种免疫细胞受体的存在和丰度。
实施方案109为实施方案106-108中任一项的方法，其中所述方法还包括比较所述两种或更多种免疫细胞受体。
实施方案110为实施方案106-109中任一项的方法，其中所述两种或更多种免疫细胞克隆型各自为B细胞的免疫细胞受体。
实施方案111为实施方案106-109中任一项的方法，其中所述两种或更多种免疫细胞克隆型各自为T细胞的免疫细胞受体。
实施方案112为实施方案106-109中任一项的方法，其中所述两种或更多种免疫细胞克隆型包含T细胞的至少一种免疫细胞受体和来自B细胞的至少一种免疫细胞受体。
实施方案113为包括多个捕获探针的阵列，其中所述多个捕获探针的捕获探针包括(i)空间条形码和(ii)与编码免疫细胞克隆型的免疫细胞受体的核酸特异性结合的捕获结构域。
实施方案114为实施方案113的阵列，其中所述免疫细胞克隆型为T细胞克隆型。
实施方案115为实施方案114的阵列，其中所述免疫细胞受体为T细胞受体α链。
实施方案116为实施方案115的阵列，其中所述捕获结构域与编码T细胞受体α链的恒定区的核酸序列特异性结合。
实施方案117为实施方案114的阵列，其中所述免疫细胞受体为T细胞受体β链。
实施方案118为实施方案117的阵列，其中所述捕获结构域与编码T细胞受体β链的恒定区的核酸序列特异性结合。
实施方案119为实施方案113的阵列，其中所述免疫细胞克隆型为B细胞克隆型。
实施方案120为实施方案119的阵列，其中所述免疫细胞受体为免疫球蛋白κ轻链。
实施方案121为实施方案120的阵列，其中所述捕获结构域与编码免疫球蛋白κ轻链的恒定区的核酸序列特异性结合。
实施方案122为实施方案119的阵列，其中所述免疫细胞受体为免疫球蛋白λ轻链。
实施方案123为实施方案122的阵列，其中所述捕获结构域与编码免疫球蛋白λ轻链的恒定区的核酸序列特异性结合。
实施方案124为实施方案119的阵列，其中所述免疫细胞受体为免疫球蛋白重链。
实施方案125为实施方案124的阵列，其中所述捕获结构域与编码免疫球蛋白重链的恒定区的核酸序列特异性结合。
实施方案126为实施方案113-125中任一项的阵列，其中所述捕获探针还包含切割结构域、功能结构域、唯一分子标识符或其任何组合。
实施方案127.一种试剂盒，其包括：实施方案113-126中任一项的阵列；和核糖体RNA耗尽探针和线粒体RNA耗尽探针中的一者或两者。
实施方案128为一种确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型的存在和/或丰度的方法，所述方法包括：(a)使生物样品与包括多个捕获探针的阵列接触，其中所述多个捕获探针的捕获探针包括(i)空间条形码和(ii)与编码免疫细胞克隆型的免疫细胞受体的核酸结合的捕获结构域；(b)确定(i)所述空间条形码的全部或部分序列或其补体，和(ii)编码所述免疫细胞受体的所述核酸的全部或部分序列或其补体，并且使用(i)和(ii)的确定序列来确定所述生物样品中一定位置处所述免疫细胞克隆型的存在和/或丰度。
实施方案129为实施方案1的方法，其中步骤(b)包括使用编码免疫细胞受体的核酸作为模板延伸捕获探针，从而生成延伸的捕获探针。
实施方案130为实施方案129的方法，其中步骤(b)包括延伸捕获探针的3’末端。
实施方案131为实施方案129或130的方法，其中步骤(b)还包括生成第二核酸链，所述第二核酸链包括(i)与空间条形码的全部或部分互补的序列，和(ii)对应于编码免疫细胞受体的核酸的全部或部分序列的序列。
实施方案132为实施方案128-131中任一项的方法，其中所述捕获探针还包含切割结构域、功能结构域、唯一分子标识符或其任何组合。
实施方案133为实施方案128-132中任一项的方法，其中所述捕获结构域包含poly(T)序列。
实施方案134为实施方案128-133中任一项的方法，其中所述捕获探针还包含功能结构域。
实施方案135为实施方案134的方法，其中步骤(b)还包括生成第二核酸链，所述第二核酸链包括(i)与功能结构域的全部或部分互补的序列，(ii)与空间条形码的全部或部分互补的序列，和(iii)对应于编码免疫细胞受体的核酸的全部或部分序列的序列。
实施方案136为实施方案135的方法，其中步骤(b)还包括使用(i)包含功能结构域的全部或部分的第一引物，其中所述功能结构域为第二核酸链中空间条形码的5’，和(ii)包含与编码免疫细胞受体的可变区的序列的一部分基本上互补的序列的第二引物来扩增第二核酸链。
实施方案137为实施方案128-136中任一项的方法，其中所述免疫细胞克隆型为T细胞克隆型。
实施方案138为实施方案137的方法，其中所述免疫细胞受体为T细胞受体α链。
实施方案139为实施方案138的方法，其中步骤(b)包括确定编码T细胞受体α链的CDR3的序列。
实施方案140为实施方案139的方法，其中步骤(b)还包括确定编码T细胞受体α链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。
实施方案141为实施方案139的方法，其中步骤(b)还包括确定编码T细胞受体α链的全长可变结构域的序列。
实施方案142为实施方案137的方法，其中所述免疫细胞受体为T细胞受体β链。
实施方案143为实施方案142的方法，其中步骤(b)包括确定编码T细胞受体β链的CDR3的序列。
实施方案144为实施方案143的方法，其中步骤(b)还包括确定编码T细胞受体β链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。
实施方案145为实施方案143的方法，其中步骤(b)还包括确定T细胞受体β链的全长可变结构域。
实施方案146为实施方案128-136中任一项的方法，其中所述免疫细胞克隆型为B细胞克隆型。
实施方案147为实施方案146的方法，其中所述免疫细胞受体为免疫球蛋白κ轻链。
实施方案148为实施方案147的方法，其中步骤(b)包括确定编码免疫球蛋白κ轻链的CDR3的序列。
实施方案149为实施方案148的方法，其中步骤(b)还包括确定编码免疫球蛋白κ轻链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。
实施方案150为实施方案148的方法，其中步骤(b)还包括确定编码免疫球蛋白κ轻链的全长可变结构域的序列。
实施方案151为实施方案146的方法，其中所述免疫细胞受体为免疫球蛋白λ轻链。
实施方案152为实施方案151的方法，其中步骤(b)包括确定编码免疫球蛋白λ轻链的CDR3的序列。
实施方案153为实施方案152的方法，其中步骤(b)还包括确定编码免疫球蛋白λ轻链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。
实施方案154为实施方案152的方法，其中步骤(b)还包括确定编码免疫球蛋白λ轻链的全长可变结构域的序列。
实施方案155为实施方案146的方法，其中所述免疫细胞受体为免疫球蛋白重链。
实施方案156为实施方案155的方法，其中步骤(b)包括确定编码免疫球蛋白重链的CDR3的序列。
实施方案157为实施方案156的方法，其中步骤(b)还包括确定编码免疫球蛋白重链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。
实施方案158为实施方案156的方法，其中步骤(b)还包括确定编码免疫球蛋白重链的全长可变结构域的序列。
实施方案159为实施方案128-158中任一项的方法，其中所述生物样品包含组织样品。
实施方案160为实施方案159的方法，其中所述组织样品为组织切片。
实施方案161为实施方案160的方法，其中所述组织切片为固定的组织切片。
实施方案162为实施方案161的方法，其中所述固定的组织切片为福尔马林固定石蜡包埋的组织切片。
实施方案163为实施方案160-162中任一项的方法，其中所述组织切片包含肿瘤区域。
实施方案164为实施方案128-163中任一项的方法，其中所述编码免疫细胞受体的核酸包含RNA。
实施方案165为实施方案164的方法，其中所述RNA为mRNA。
实施方案166为实施方案128-163中任一项的方法，其中所述编码免疫细胞受体的核酸包含DNA。
实施方案167为实施方案166的方法，其中所述DNA为基因组DNA。
实施方案168为实施方案128-167中任一项的方法，其中所述方法还包括在步骤(b)之前使生物样品与核糖体RNA耗尽探针和线粒体RNA耗尽探针接触。
实施方案169为实施方案128-168中任一项的方法，其中所述方法还包括对生物样品成像。
实施方案170为实施方案128-169中任一项的方法，其中步骤(b)中的确定包括对(i)空间条形码的全部或部分序列或其补体和(ii)编码免疫细胞受体的核酸的全部或部分序列或其补体测序。
实施方案171为实施方案128-170中任一项的方法，其中步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型的存在。
实施方案172为实施方案128-171中任一项的方法，其中步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型的丰度。
实施方案173为实施方案128-172中任一项的方法，其中步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型的存在和丰度。
实施方案174为实施方案128-173中任一项的方法，其中步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处两种或更多种免疫细胞克隆型的存在。
实施方案175为实施方案128-174中任一项的方法，其中步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处两种或更多种免疫细胞克隆型的丰度。
实施方案176为实施方案128-174中任一项的方法，其中步骤(b)包括确定生物样品中一定位置处两种或更多种免疫细胞克隆型的存在和丰度。
实施方案177为实施方案174-176中任一项的方法，其中所述方法还包括比较所述两种或更多种免疫细胞克隆型。
实施方案178为实施方案174-177中任一项的方法，其中所述两种或更多种免疫细胞克隆型各自为B细胞克隆型。
实施方案179为实施方案174-177中任一项的方法，其中所述两种或更多种免疫细胞克隆型各自为T细胞克隆型。
实施方案180为实施方案174-177中任一项的方法，其中所述两种或更多种免疫细胞克隆型包含至少一种T细胞克隆型和至少一种B细胞克隆型。
其他实施方案
应理解，虽然已结合其具体实施方式描述了本发明，但前述描述意在示意而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。另外，章节标题、材料、方法和实例仅是说明性的而不旨在限制。
序列表
<110> 10X基因组学有限公司
<120> 用于抗原-受体的空间转录组学
<130> 47706-0208WO1
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<150> 63/033,568
<151> 2020-06-02
<160> 640
<170> PatentIn 3.5版
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cagtcggtga cccagcttga tggc 24
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<220>
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<220>
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<400> 51
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<220>
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<220>
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<211> 28
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 54
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<210> 55
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<212> DNA
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<220>
<221> 来源
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<400> 55
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<220>
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<220>
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 58
ggagtctccc agacccccag taacaag 27
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<211> 26
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<220>
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<400> 59
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
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<220>
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<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
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<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
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<220>
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<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
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<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 72
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<220>
<221> 来源
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<400> 73
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<211> 25
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<220>
<221> 来源
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<400> 74
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 75
ggagttatcc agtcaccccg gcac 24
<210> 76
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 76
agagtcaccc agacaccaag gcacaag 27
<210> 77
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 77
ggagttactc agttccccag ccacagc 27
<210> 78
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 78
atggtcatcc agaacccaag ataccaggtt 30
<210> 79
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 79
gagcctggag tcagccagac ccc 23
<210> 80
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 80
ggcgtcatgc agaacccaag acac 24
<210> 81
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 81
ggaatcactc agtccccaaa gtacctgttc a 31
<210> 82
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 82
gctgtcgtct ctcaacatcc gagctg 26
<210> 83
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 83
attccagctc actggggctg gatg 24
<210> 84
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 84
aaagtcacac agactccagg acatttggtc a 31
<210> 85
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 85
gatgttaccc agaccccaag gaataggatc 30
<210> 86
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 86
gacatctacc agaccccaag ataccttgtt atagg 35
<210> 87
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 87
gtagttacac aattcccaag acacagaatc attgg 35
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 88
caagtgaccc agaacccaag atacctcatc 30
<210> 89
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 89
ggtggcagca gtcacagatg cctactc 27
<210> 90
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 90
ggtggcagca gccacaggtg cccactc 27
<210> 91
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 91
ggtggcagca gctacaggtg tccagtc 27
<210> 92
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 92
ggtggsagca gcaacargwg cccactc 27
<210> 93
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 93
gctggctgta gctccaggtg ctcactc 27
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 94
cctgctgctg accayccctt cmtgggtctt gtc 33
<210> 95
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 95
cctgctactg actgtcccgt cctgggtctt atc 33
<210> 96
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 96
gggttttcct cgttgctctt ttaagaggtg tccagtg 37
<210> 97
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 97
gggttttcct tgttgctatt ttaaaaggtg tccartg 37
<210> 98
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 98
ggattttcct tgctgctatt ttaaaaggtg tccagtg 37
<210> 99
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 99
gggttttcct tktkgctatw ttagaaggtg tccagtg 37
<210> 100
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 100
ggtggcrgct cccagatggg tcctgtc 27
<210> 101
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 101
ctggctgttc tccaaggagt ctgtg 25
<210> 102
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 102
ggcctcccat ggggtgtcct gtc 23
<210> 103
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 103
ggtggcagca gcaacaggtg cccact 26
<210> 104
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 104
atggaactgg ggctccgctg ggttttcc 28
<210> 105
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 105
atggactgca cctggaggat cctcctc 27
<210> 106
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 106
tggctgagct gggtttycct tgttgc 26
<210> 107
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 107
ggagttkggg ctgmgctggg ttttcc 26
<210> 108
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 108
gcacctgtgg tttttcctcc tgctggtg 28
<210> 109
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 109
cacctgtggt tcttcctcct sctgg 25
<210> 110
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 110
ccaggatggg gtcaaccgcc atcctc 26
<210> 111
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 111
cagaggactc accatggagt ttgggctgag 30
<210> 112
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 112
ggactcacca tggagttggg actgagc 27
<210> 113
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 113
gggctgagct ggctttttct tgtggc 26
<210> 114
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 114
aagcagtggt atcaacgcag agtacatggg 30
<210> 115
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 115
tctgcgttga taccact 17
<210> 116
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 116
gaaggagctc cagatgaaag actctgcctc 30
<210> 117
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 117
gttctcttca tcgctgctca tcctccaggt 30
<210> 118
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 118
cttgtgagcg actccgcttt gtacttctgt 30
<210> 119
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 119
ttatccctgc cgacagaaag tccagcactc 30
<210> 120
<211> 31
<212> DNA
<213> 智人
<400> 120
aaggataaac atctgtctct gcgcattgca g 31
<210> 121
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 121
ttgtttcata tcacagcctc ccagcctgca 30
<210> 122
<211> 31
<212> DNA
<213> 智人
<400> 122
tacattacag ccgtgcagcc tgaagattca g 31
<210> 123
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 123
aatctgagga aaccctctgt gcagtggagt 30
<210> 124
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 124
gaaacctcct tccacctgac gaaaccctca 30
<210> 125
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 125
caatctgagg aaaccctctg tgcattggag 30
<210> 126
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 126
cacctgacga aaccctcagc ccatatgagc 30
<210> 127
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 127
ggaaaccctc agtccatata agcgacacgg 30
<210> 128
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 128
gaggaaacca tcaacccatg tgagtgatgc 30
<210> 129
<211> 32
<212> DNA
<213> 智人
<400> 129
ggaaggaaca aaggttttga agccatgtac cg 32
<210> 130
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 130
tccacttgga gaaaggctca gttcaagtgt 30
<210> 131
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 131
gcagacacaa agcaaagctc tctgcacatc 30
<210> 132
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 132
gccagccagt atatttccct gctcatcaga 30
<210> 133
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 133
gccagccagt atgtttctct gctcatcaga 30
<210> 134
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 134
ggtttacagc acaggtcgat aaatccagca 30
<210> 135
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 135
gccaaacatt tctccctgca catcacagag 30
<210> 136
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 136
tctgcaaatt gcagctactc aacctggaga 30
<210> 137
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 137
gccaaccttg tcatctccgc ttcacaactg 30
<210> 138
<211> 31
<212> DNA
<213> 智人
<400> 138
gaccttaaca aaggcgagac atctttccac c 31
<210> 139
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 139
gtcacgcttg acacttccaa gaaaagcagt 30
<210> 140
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 140
cctatcaaga gtgacagttc cttccacctg 30
<210> 141
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 141
ggaacttcca gaaatccacc agttccttca 30
<210> 142
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人
<400> 142
agaaggaaag ctttctgcac atcacagcc 29
<210> 143
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 143
caagtggaag acttaatgcc tcgctggata 30
<210> 144
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 144
gactgtcgct acggaacgct acagcttatt 30
<210> 145
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 145
tgccaagcag ttctcatcgc atatcatgga 30
<210> 146
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 146
gccactctta ataccaagga gggttacagc 30
<210> 147
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 147
cacatcacag ccacccagac tacagatgta 30
<210> 148
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 148
tcatcacaga agacagaaag tccagcacct 30
<210> 149
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 149
agaaagtcca gtaccttgat cctgcaccgt 30
<210> 150
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 150
gttctctcca catcactgca gcccagactg 30
<210> 151
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 151
aaagtgccaa gcacctctct ctgcacattg 30
<210> 152
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 152
ctgtacctta cggcctccca gctcagttac 30
<210> 153
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 153
gccaagttgg atgagaaaaa gcagcaaagt 30
<210> 154
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 154
gacctcaaat ggaagactga ctgctcagtt 30
<210> 155
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 155
tttcagcatc ctgaacatca cagccaccca 30
<210> 156
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 156
ccttcagtct caagatctca gactcacagc 30
<210> 157
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人
<400> 157
aatggcctca cttgatacca aagcccgtc 29
<210> 158
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 158
ctcccccatt gtgaaatatt cagtccaggt 30
<210> 159
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 159
catacaggaa aagcacagct ccctgcacat 30
<210> 160
<211> 31
<212> DNA
<213> 智人
<400> 160
atatcgcagc ctctcatctg ggagattcag c 31
<210> 161
<211> 31
<212> DNA
<213> 智人
<400> 161
caggagctcc agatgaaaga ctctgcctct t 31
<210> 162
<211> 32
<212> DNA
<213> 智人
<400> 162
acttccttcc acttgaggaa accctcagtc ca 32
<210> 163
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 163
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgaagga gctccagatg aaagactctg 60
cctc 64
<210> 164
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 164
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgttctc ttcatcgctg ctcatcctcc 60
aggt 64
<210> 165
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 165
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcttgtg agcgactccg ctttgtactt 60
ctgt 64
<210> 166
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 166
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttatcc ctgccgacag aaagtccagc 60
actc 64
<210> 167
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 167
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaaggat aaacatctgt ctctgcgcat 60
tgcag 65
<210> 168
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 168
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttgttt catatcacag cctcccagcc 60
tgca 64
<210> 169
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 169
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttacatt acagccgtgc agcctgaaga 60
ttcag 65
<210> 170
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 170
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaatctg aggaaaccct ctgtgcagtg 60
gagt 64
<210> 171
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 171
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgaaacc tccttccacc tgacgaaacc 60
ctca 64
<210> 172
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 172
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcaatct gaggaaaccc tctgtgcatt 60
ggag 64
<210> 173
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 173
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcacctg acgaaaccct cagcccatat 60
gagc 64
<210> 174
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 174
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggaaac cctcagtcca tataagcgac 60
acgg 64
<210> 175
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 175
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgaggaa accatcaacc catgtgagtg 60
atgc 64
<210> 176
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 176
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggaagg aacaaaggtt ttgaagccat 60
gtaccg 66
<210> 177
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 177
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttccact tggagaaagg ctcagttcaa 60
gtgt 64
<210> 178
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 178
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcagac acaaagcaaa gctctctgca 60
catc 64
<210> 179
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 179
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgccagc cagtatattt ccctgctcat 60
caga 64
<210> 180
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 180
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgccagc cagtatgttt ctctgctcat 60
caga 64
<210> 181
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 181
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggttta cagcacaggt cgataaatcc 60
agca 64
<210> 182
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 182
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgccaaa catttctccc tgcacatcac 60
agag 64
<210> 183
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 183
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttctgca aattgcagct actcaacctg 60
gaga 64
<210> 184
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 184
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgccaac cttgtcatct ccgcttcaca 60
actg 64
<210> 185
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 185
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgacctt aacaaaggcg agacatcttt 60
ccacc 65
<210> 186
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 186
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtcacg cttgacactt ccaagaaaag 60
cagt 64
<210> 187
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 187
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcctatc aagagtgaca gttccttcca 60
cctg 64
<210> 188
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 188
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggaact tccagaaatc caccagttcc 60
ttca 64
<210> 189
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 189
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagaagg aaagctttct gcacatcaca 60
gcc 63
<210> 190
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 190
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcaagtg gaagacttaa tgcctcgctg 60
gata 64
<210> 191
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 191
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgactgt cgctacggaa cgctacagct 60
tatt 64
<210> 192
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 192
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgccaa gcagttctca tcgcatatca 60
tgga 64
<210> 193
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 193
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgccact cttaatacca aggagggtta 60
cagc 64
<210> 194
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 194
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcacatc acagccaccc agactacaga 60
tgta 64
<210> 195
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 195
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttcatca cagaagacag aaagtccagc 60
acct 64
<210> 196
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 196
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagaaag tccagtacct tgatcctgca 60
ccgt 64
<210> 197
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 197
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgttctc tccacatcac tgcagcccag 60
actg 64
<210> 198
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 198
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaaagtg ccaagcacct ctctctgcac 60
attg 64
<210> 199
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 199
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctgtac cttacggcct cccagctcag 60
ttac 64
<210> 200
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 200
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgccaag ttggatgaga aaaagcagca 60
aagt 64
<210> 201
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 201
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgacctc aaatggaaga ctgactgctc 60
agtt 64
<210> 202
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 202
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttttcag catcctgaac atcacagcca 60
ccca 64
<210> 203
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 203
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccttca gtctcaagat ctcagactca 60
cagc 64
<210> 204
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 204
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaatggc ctcacttgat accaaagccc 60
gtc 63
<210> 205
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 205
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctcccc cattgtgaaa tattcagtcc 60
aggt 64
<210> 206
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 206
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcataca ggaaaagcac agctccctgc 60
acat 64
<210> 207
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 207
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatatcg cagcctctca tctgggagat 60
tcagc 65
<210> 208
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 208
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcaggag ctccagatga aagactctgc 60
ctctt 65
<210> 209
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 209
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacttcc ttccacttga ggaaaccctc 60
agtcca 66
<210> 210
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 210
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atct 34
<210> 211
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 211
aaaaaccaag tggagcagag tcctcagtcc ctg 33
<210> 212
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 212
aaacaggagg tgacgcagat tcctgcagct c 31
<210> 213
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 213
aaggaccaag tgtttcagcc ttccacagtg gc 32
<210> 214
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 214
acccagcttg acagccaagt ccctgtct 28
<210> 215
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 215
acccagcttg atggccacat cactgtctct 30
<210> 216
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 216
acccagcttg gcagccacgt ctctg 25
<210> 217
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 217
actcaagcgc agactgaaat ttctgtggtg g 31
<210> 218
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 218
agaaggaggt ggagcaggat cctggacca 29
<210> 219
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 219
agaattccga ggctctgaac attcaggagg gtaa 34
<210> 220
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 220
agagagtgac tcagcccgag aagctcctct 30
<210> 221
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 221
agagcccagt cagtgaccca gcctgac 27
<210> 222
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 222
agagcccagt cagtgaccca gcctgac 27
<210> 223
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 223
agctgctgga gcagagccct cagtttc 27
<210> 224
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 224
agtcaacagg gagaagagga tcctcaggcc ttg 33
<210> 225
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 225
agtggagact cggttaccca gacagaaggc c 31
<210> 226
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 226
agtggagcag agtcctccag acctgattct c 31
<210> 227
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 227
agtgtggggc tgcatcttcc taccctga 28
<210> 228
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 228
atactgaacg tggaacaaag tcctcagtca ctgcatg 37
<210> 229
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 229
attcagtgac ccagatggaa gggccagtga 30
<210> 230
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 230
attgatgcta agaccaccca gcccacctc 29
<210> 231
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 231
cagaaggagg tggagcagaa ttctggaccc c 31
<210> 232
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 232
cagcaattca gtcaagcaga cgggccaa 28
<210> 233
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 233
ccaacaacca gtgcagagtc ctcaagccg 29
<210> 234
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 234
cggaaggagg tggagcagga tcctgga 27
<210> 235
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 235
ctacatacgc cggagcagag tccttcattc ctgag 35
<210> 236
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 236
ctcaaaccca accaggaatg ttcgtgcagg a 31
<210> 237
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 237
cttgctaaga ccacccagcc catctccatg gactc 35
<210> 238
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 238
gaaaaccagg tggagcacag ccctcatttt ctg 33
<210> 239
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 239
gaagacaagg tggtacaaag ccctctatct ctggt 35
<210> 240
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 240
gaagaccagg tgacgcagag tcccgag 27
<210> 241
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 241
gaccagcagc aggtgaaaca aagtcctcaa t 31
<210> 242
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 242
gagcagagtc ctcagaacct gactgccc 28
<210> 243
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 243
gatgaccagc aagttaagca aaattcacca tccct 35
<210> 244
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 244
gccaagaact ggagcagagt cctcagtcc 29
<210> 245
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 245
gcccagtcgg tgacccagct tgacag 26
<210> 246
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 246
gcccagtctg tgagccagca taaccaccac 30
<210> 247
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 247
gcctgttcac ttgccttgta accactccac 30
<210> 248
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 248
gctcagtcag tggctcagcc ggaagatcag g 31
<210> 249
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 249
ggacaaaaca ttgaccagcc cactgagatg acagc 35
<210> 250
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 250
ggacaaagcc ttgagcagcc ctctgaagtg ac 32
<210> 251
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 251
ggacaacagg taatgcaaat tcctcagtac cagcatg 37
<210> 252
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 252
ggagagaatg tggagcagca tccttcaacc ctg 33
<210> 253
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 253
ggagaggatg tggagcagag tcttttcctg agtgtc 36
<210> 254
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 254
ggagattcag tggtccagac agaaggccaa gtg 33
<210> 255
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 255
gtctcaacca gagatgtctg tgcaggagg 29
<210> 256
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 256
gtggaacaaa accctctgtt cctgagcatg c 31
<210> 257
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 257
gtggtcaaca gctgaatcag agtcctcaat cta 33
<210> 258
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 258
gttccggcag gatccgggga gaagact 27
<210> 259
<211> 31
<212> DNA
<213> 智人
<400> 259
gcctcctccc agacatctgt atatttctgc g 31
<210> 260
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 260
aatttccccc tcactctgga gtcagctacc 30
<210> 261
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 261
gatttcctcc tcactctgga gtccgctacc 30
<210> 262
<211> 31
<212> DNA
<213> 智人
<400> 262
aggctcaaag gagtagactc cactctcaag a 31
<210> 263
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人
<400> 263
caagatccag cctgcaaagc ttgaggact 29
<210> 264
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 264
tagactccac tctcaagatc cagcctgcag 30
<210> 265
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 265
tggaacccag ggacttgggc ctatatttct 30
<210> 266
<211> 31
<212> DNA
<213> 智人
<400> 266
tcattctcta ctctgaagat ccagcctgca g 31
<210> 267
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 267
cattctccac tctgaagatc cagccctcag 30
<210> 268
<211> 31
<212> DNA
<213> 智人
<400> 268
catcattctc cactctgaag atccagccct c 31
<210> 269
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 269
cagcagagat gcctgatgca actttagcca 30
<210> 270
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人
<400> 270
gaactgaaca tgagctcctt ggagctggg 29
<210> 271
<211> 31
<212> DNA
<213> 智人
<400> 271
ggaggattct ggagtttatt tctgtgccag c 31
<210> 272
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 272
ttctgctttc ttgacatccg ctcaccaggc 30
<210> 273
<211> 31
<212> DNA
<213> 智人
<400> 273
gagatccagg ctacgaagct tgaggattca g 31
<210> 274
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人
<400> 274
aacgtcttcc acgctgaaga tccatccc 28
<210> 275
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 275
aggatccagc aggtagtgcg aggagattcg 30
<210> 276
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 276
acccgacagc tttctatctc tgtgccagta 30
<210> 277
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 277
gtgcccatcc tgaagacagc agcttctaca 30
<210> 278
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人
<400> 278
cacaaagctg gaggactcag ccatgtac 28
<210> 279
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 279
tcaggggaca cagcactgta tttctgtgcc 30
<210> 280
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 280
cacaccagcc aaacagcttt gtacttctgt 30
<210> 281
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人
<400> 281
aatcctgtcc tcagaaccgg gagacacg 28
<210> 282
<211> 31
<212> DNA
<213> 智人
<400> 282
ccaaccagac agctctttac ttctgtgcca c 31
<210> 283
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 283
cacatacctc tcagtacctc tgtgccagca 30
<210> 284
<211> 32
<212> DNA
<213> 智人
<400> 284
ccaaccagac atctgtgtat ctctatgcca gc 32
<210> 285
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 285
accagacctc tctgtacttc tgtgccagca 30
<210> 286
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 286
aaccagacat ctatgtacct ctgtgccagc 30
<210> 287
<211> 32
<212> DNA
<213> 智人
<400> 287
acatgagccc tgaagacagc agcatatatc tc 32
<210> 288
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 288
agcttggtga ctctgctgtg tatttctgtg 30
<210> 289
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 289
cttggtgact ctgctgtgta tttctgtgcc 30
<210> 290
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人
<400> 290
cagccagaag actcagccct gtatctctg 29
<210> 291
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人
<400> 291
gccagaagac tcggccctgt atctctgt 28
<210> 292
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 292
tattccttca cctacacacc ctgcagccag 30
<210> 293
<211> 27
<212> DNA
<213> 智人
<400> 293
agatgaatgt gagcaccttg gagctgg 27
<210> 294
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人
<400> 294
tactgagtca aacacggagc taggggact 29
<210> 295
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 295
gttgctctga gatgaatgtg agtgccttgg 30
<210> 296
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 296
atagctctga gctgaatgtg aacgccttgg 30
<210> 297
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人
<400> 297
gagctgaatg tgaacgcctt gttgctgg 28
<210> 298
<211> 31
<212> DNA
<213> 智人
<400> 298
aactatagct ctgagctgaa tgtgaacgcc t 31
<210> 299
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人
<400> 299
agctgaatgt gaacgccttg ttgctaggg 29
<210> 300
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人
<400> 300
ctgaatgtga acgccttgga gctggagga 29
<210> 301
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人
<400> 301
gctccctccc agacatctgt gtacttct 28
<210> 302
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人
<400> 302
gctgctccct cccaaacatc tgtgtact 28
<210> 303
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 303
gctccctccc aaacatctgt gtacttctgt 30
<210> 304
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人
<400> 304
aacacagatg atttccccct cacgttggc 29
<210> 305
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人
<400> 305
gctgctccct cccagacatc tgtgtactt 29
<210> 306
<211> 27
<212> DNA
<213> 智人
<400> 306
agttggctgc tccctcccag acatctg 27
<210> 307
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 307
tcagctgctc cctctcagac ttctgtttac 30
<210> 308
<211> 31
<212> DNA
<213> 智人
<400> 308
taaacacaga ggatttccca ctcaggctgg t 31
<210> 309
<211> 31
<212> DNA
<213> 智人
<400> 309
agtcagctgc tccctcccag acatctgtat a 31
<210> 310
<211> 27
<212> DNA
<213> 智人
<400> 310
cagcaggggg acttggctgt gtatctc 27
<210> 311
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人
<400> 311
gcaggaggac tcggccgtgt atctc 25
<210> 312
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人
<400> 312
tctactctga agatccagcg cacagagcg 29
<210> 313
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人
<400> 313
cacagagcag ggggactcag ctgtgtat 28
<210> 314
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 314
atctttctcc acctgaagat ccagcgcaca 30
<210> 315
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人
<400> 315
ttctctgcag agaggcctga gggatccat 29
<210> 316
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 316
ctgagggatc cgtctccact ctgaagatcc 30
<210> 317
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 317
ggcctaaggg atctttctcc accttggaga 30
<210> 318
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 318
ttccctcaac cctggagtct actagcacca 30
<210> 319
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人
<400> 319
ttgagcattt ccccaatcct ggcatccac 29
<210> 320
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 320
gggactcagc tttgtatttc tgtgccagca 30
<210> 321
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 321
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcctcc tcccagacat ctgtatattt 60
ctgcg 65
<210> 322
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 322
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaatttc cccctcactc tggagtcagc 60
tacc 64
<210> 323
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 323
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgatttc ctcctcactc tggagtccgc 60
tacc 64
<210> 324
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 324
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaggctc aaaggagtag actccactct 60
caaga 65
<210> 325
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 325
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcaagat ccagcctgca aagcttgagg 60
act 63
<210> 326
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 326
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttagact ccactctcaa gatccagcct 60
gcag 64
<210> 327
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 327
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttggaac ccagggactt gggcctatat 60
ttct 64
<210> 328
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 328
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttcattc tctactctga agatccagcc 60
tgcag 65
<210> 329
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 329
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcattct ccactctgaa gatccagccc 60
tcag 64
<210> 330
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 330
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcatcat tctccactct gaagatccag 60
ccctc 65
<210> 331
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 331
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcagcag agatgcctga tgcaacttta 60
gcca 64
<210> 332
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 332
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgaactg aacatgagct ccttggagct 60
ggg 63
<210> 333
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 333
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggagga ttctggagtt tatttctgtg 60
ccagc 65
<210> 334
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 334
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttctgc tttcttgaca tccgctcacc 60
aggc 64
<210> 335
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 335
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgagatc caggctacga agcttgagga 60
ttcag 65
<210> 336
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 336
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaacgtc ttccacgctg aagatccatc 60
cc 62
<210> 337
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 337
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaggatc cagcaggtag tgcgaggaga 60
ttcg 64
<210> 338
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 338
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacccga cagctttcta tctctgtgcc 60
agta 64
<210> 339
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 339
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgtgccc atcctgaaga cagcagcttc 60
taca 64
<210> 340
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 340
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcacaaa gctggaggac tcagccatgt 60
ac 62
<210> 341
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 341
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttcaggg gacacagcac tgtatttctg 60
tgcc 64
<210> 342
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 342
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcacacc agccaaacag ctttgtactt 60
ctgt 64
<210> 343
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 343
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaatcct gtcctcagaa ccgggagaca 60
cg 62
<210> 344
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 344
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccaacc agacagctct ttacttctgt 60
gccac 65
<210> 345
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 345
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcacata cctctcagta cctctgtgcc 60
agca 64
<210> 346
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 346
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccaacc agacatctgt gtatctctat 60
gccagc 66
<210> 347
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 347
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaccaga cctctctgta cttctgtgcc 60
agca 64
<210> 348
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 348
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaaccag acatctatgt acctctgtgc 60
cagc 64
<210> 349
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 349
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacatga gccctgaaga cagcagcata 60
tatctc 66
<210> 350
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 350
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagcttg gtgactctgc tgtgtatttc 60
tgtg 64
<210> 351
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 351
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcttggt gactctgctg tgtatttctg 60
tgcc 64
<210> 352
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 352
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcagcca gaagactcag ccctgtatct 60
ctg 63
<210> 353
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 353
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgccaga agactcggcc ctgtatctct 60
gt 62
<210> 354
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 354
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttattcc ttcacctaca caccctgcag 60
ccag 64
<210> 355
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 355
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagatga atgtgagcac cttggagctg 60
g 61
<210> 356
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 356
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttactga gtcaaacacg gagctagggg 60
act 63
<210> 357
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 357
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgttgct ctgagatgaa tgtgagtgcc 60
ttgg 64
<210> 358
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 358
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatagct ctgagctgaa tgtgaacgcc 60
ttgg 64
<210> 359
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 359
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgagctg aatgtgaacg ccttgttgct 60
gg 62
<210> 360
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 360
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaactat agctctgagc tgaatgtgaa 60
cgcct 65
<210> 361
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 361
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagctga atgtgaacgc cttgttgcta 60
ggg 63
<210> 362
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 362
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctgaat gtgaacgcct tggagctgga 60
gga 63
<210> 363
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 363
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgctccc tcccagacat ctgtgtactt 60
ct 62
<210> 364
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 364
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgctgct ccctcccaaa catctgtgta 60
ct 62
<210> 365
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 365
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgctccc tcccaaacat ctgtgtactt 60
ctgt 64
<210> 366
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 366
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaacaca gatgatttcc ccctcacgtt 60
ggc 63
<210> 367
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 367
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgctgct ccctcccaga catctgtgta 60
ctt 63
<210> 368
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 368
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagttgg ctgctccctc ccagacatct 60
g 61
<210> 369
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 369
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttcagct gctccctctc agacttctgt 60
ttac 64
<210> 370
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 370
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttaaaca cagaggattt cccactcagg 60
ctggt 65
<210> 371
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 371
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagtcag ctgctccctc ccagacatct 60
gtata 65
<210> 372
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 372
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcagcag ggggacttgg ctgtgtatct 60
c 61
<210> 373
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 373
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcagga ggactcggcc gtgtatctc 59
<210> 374
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 374
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttctact ctgaagatcc agcgcacaga 60
gcg 63
<210> 375
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 375
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcacaga gcagggggac tcagctgtgt 60
at 62
<210> 376
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 376
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctatcttt ctccacctga agatccagcg 60
caca 64
<210> 377
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 377
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttctct gcagagaggc ctgagggatc 60
cat 63
<210> 378
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 378
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctgagg gatccgtctc cactctgaag 60
atcc 64
<210> 379
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 379
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggccta agggatcttt ctccaccttg 60
gaga 64
<210> 380
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 380
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttccct caaccctgga gtctactagc 60
acca 64
<210> 381
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 381
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttgagc atttccccaa tcctggcatc 60
cac 63
<210> 382
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 382
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgggact cagctttgta tttctgtgcc 60
agca 64
<210> 383
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 383
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<210> 384
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 384
cacagagaca ggaaggcagg tgaccttga 29
<210> 385
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 385
gatgctggaa tcacccagag cccaagacac 30
<210> 386
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 386
gccaggctgt ggctttttgg tgtgatccta 30
<210> 387
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 387
ggcagagtgt ggctttttgg tgcaatcct 29
<210> 388
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 388
ggctttttgg tgcaatccta tttctggcca c 31
<210> 389
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 389
gatgctggtg ttatccagtc acccaggcac 30
<210> 390
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 390
gtcacccaag catgaggtga cagaaatggg 30
<210> 391
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 391
atgctggagt tatccagtca ccccgcc 27
<210> 392
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 392
gagttatcca gtcaccccgg cacgaggt 28
<210> 393
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 393
gctagagtca cccagacacc aaggcaca 28
<210> 394
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 394
gctgctggag tcatccagtc cccaaga 27
<210> 395
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 395
gttactcagt tccccagcca cagcgtaat 29
<210> 396
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 396
gttacccagt ttggaaagcc agtgaccct 29
<210> 397
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 397
gaagtcgccc agactccaaa acatcttgtc 30
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 398
cagacacaag gtcaccaaca tgggacagg 29
<210> 399
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 399
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<210> 400
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 400
atgccatgta ctggtaccga caggaccca 29
<210> 401
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 401
gtcgtctctc aacatccgag ctgggttat 29
<210> 402
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 402
gaacctgaag tcacccagac tcccagcca 29
<210> 403
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 403
cacggacacc aaggtcaccc agagacct 28
<210> 404
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 404
agctcactgg ggctggatgg gatgtgac 28
<210> 405
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 405
gccaaagtca cacagactcc aggacattt 29
<210> 406
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 406
gtatcgacaa gacccaggac tgggcctac 29
<210> 407
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 407
gctgacatct accagacccc aagatacct 29
<210> 408
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 408
gtatcgacag gacccaggac ttggactga 29
<210> 409
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 409
agcccaagtg acccagaacc caagatac 28
<210> 410
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 410
ctcgtagatg tgaaagtaac ccagagctcg a 31
<210> 411
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 411
gatatctgtc aacgtggaac ctccctgacg 30
<210> 412
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 412
ggtcacacag atgggaaacg acaagtcca 29
<210> 413
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 413
ccgtttccca gactccaaaa tacctggtc 29
<210> 414
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 414
gaagttaccc agacaccaaa acacctggtc 30
<210> 415
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 415
gagttacgca gacaccaaga cacctggtc 29
<210> 416
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 416
ggagttacgc agacaccaag acacctgg 28
<210> 417
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 417
gtgacactga gctgctcccc tatctctgg 29
<210> 418
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 418
gaatcaccca agctccaaga cacctgatc 29
<210> 419
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 419
ctggagtcac ccaaagtccc acacacc 27
<210> 420
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 420
gactggagtc acccaaagtc ccacacac 28
<210> 421
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 421
gtcccacaca cctgatcaaa acgagagga 29
<210> 422
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 422
tagtggacgc tggagtcacc caaagtcc 28
<210> 423
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 423
ctgatcaaaa cgagaggaca gcacgtgac 29
<210> 424
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 424
gagtcacaca aagtcccaca cacctgatc 29
<210> 425
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 425
gtgaatgctg gtgtcactca gaccccaaa 29
<210> 426
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 426
gaatgctggt gtcactcaga ccccaaaat 29
<210> 427
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 427
gctggtgtca ctcagacccc aaaattccg 29
<210> 428
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 428
gatcacccag gcaccaacat ctcagatcc 29
<210> 429
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 429
gctggtgtca ctcagacccc aaaattcca 29
<210> 430
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 430
gctggtgtca ctcagacccc aaaattccg 29
<210> 431
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 431
gaatgctggt gtcactcaga ccccaaaat 29
<210> 432
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 432
gctggtgtca ctcagacccc aaaattcca 29
<210> 433
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 433
gaatgctggt gtcactcaga ccccaaaat 29
<210> 434
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 434
gtgctggagt ctcccagtcc ctgagaca 28
<210> 435
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 435
gtcccccagt aacaaggtca cagagaagg 29
<210> 436
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 436
gacccccagt aacaaggtca cagagaagg 29
<210> 437
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 437
cagtccccaa ggtacaaagt cgcaaagag 29
<210> 438
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 438
gtctcccagt ccccaaggta cgaagtc 27
<210> 439
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 439
cacaggtgct ggagtctccc agtctc 26
<210> 440
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 440
gtgctggagt ctcccagtcc cctagg 26
<210> 441
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 441
ctggagtctc ccagaacccc agacaca 27
<210> 442
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 442
gaggcaggga tcagccagat accaagat 28
<210> 443
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 443
gatgctggga tcacccagat gccaaga 27
<210> 444
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 444
tggagtcaca caaaccccaa agcacctg 28
<210> 445
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 445
gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg 60
gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt 120
<210> 446
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 446
ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca 60
gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga 120
<210> 447
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 447
ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag agggagaagt gcccccacct 60
gctcctcagt tccagcctga ccccctccca tcctttggcc tctgaccctt tttccacagg 120
<210> 448
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 448
ggacctaccc ctattgcggt cctccagctc atctttcacc tcacccccct cctcctcctt 60
ggctttaatt atgctaatgt tggaggagaa tgaataaata aagtgaatct ttgcacctgt 120
<210> 449
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 449
gtcagcccaa ggccaacccc actgtcactc tgttcccgcc ctcctctgag gagctccaag 60
ccaacaaggc cacactagtg tgtctgatca gtgacttcta cccgggagct gtgacagtgg 120
<210> 450
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 450
gacgcccgag cagtggaagt cccacagaag ctacagctgc caggtcacgc atgaagggag 60
caccgtggag aagacagtgg cccctacaga atgttcatag gttcccaact ctaaccccac 120
<210> 451
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 451
ccacgggagc ctggagctgc aggatcccag gggaggggtc tctctcccca tcccaagtca 60
tccagccctt ctccctgcac tcatgaaacc ccaataaata tcctcattga caaccagaaa 120
<210> 452
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 452
gtcagcccaa ggctgccccc tcggtcactc tgttcccgcc ctcctctgag gagcttcaag 60
ccaacaaggc cacactggtg tgtctcataa gtgacttcta cccgggagcc gtgacagtgg 120
<210> 453
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 453
cgcctgagca gtggaagtcc cacagaagct acagctgcca ggtcacgcat gaagggagca 60
ccgtggagaa gacagtggcc cctacagaat gttcataggt tctcaaccct caccccccac 120
<210> 454
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 454
cacgggagac tagagctgca ggatcccagg ggaggggtct ctcctcccac cccaaggcat 60
caagcccttc tccctgcact caataaaccc tcaataaata ttctcattgt caatcagaaa 120
<210> 455
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 455
gtcagcccaa ggctgccccc tcggtcactc tgttcccacc ctcctctgag gagcttcaag 60
ccaacaaggc cacactggtg tgtctcataa gtgacttcta cccgggagcc gtgacagtgg 120
<210> 456
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 456
cgcctgagca gtggaagtcc cacaaaagct acagctgcca ggtcacgcat gaagggagca 60
ccgtggagaa gacagtggcc cctacagaat gttcataggt tctcatccct caccccccac 120
<210> 457
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 457
cacgggagac tagagctgca ggatcccagg ggaggggtct ctcctcccac cccaaggcat 60
caagcccttc tccctgcact caataaaccc tcaataaata ttctcattgt caatcagaaa 120
<210> 458
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 458
gtcagcccaa ggctgccccc tcggtcactc tgttcccacc ctcctctgag gagcttcaag 60
ccaacaaggc cacactggtg tgtctcgtaa gtgacttcaa cccgggagcc gtgacagtgg 120
<210> 459
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 459
ccagcagcta cctgagcctg acgcccgagc agtggaagtc ccacagaagc tacagctgcc 60
gggtcacgca tgaagggagc accgtggaga agacagtggc ccctgcagaa tgctcttagg 120
<210> 460
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 460
cccccgaccc tcaccccacc cacaggggcc tggagctgca ggttcccagg ggaggggtct 60
ctgcccccat cccaagtcat ccagcccttc tcaataaata tcctcatcgt caacgagaaa 120
<210> 461
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 461
gcatccccga ccagccccaa ggtcttcccg ctgagcctcg acagcacccc ccaagatggg 60
aacgtggtcg tcgcatgcct ggtccagggc ttcttccccc aggagccact cagtgtgacc 120
<210> 462
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 462
tggagcgaaa gcggacagaa cgtgaccgcc agaaacttcc cacctagcca ggatgcctcc 60
ggggacctgt acaccacgag cagccagctg accctgccgg ccacacagtg cccagacggc 120
<210> 463
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 463
aagtccgtga catgccacgt gaagcactac acgaattcca gccaggatgt gactgtgccc 60
tgccgagttc ccccacctcc cccatgctgc cacccccgac tgtcgctgca ccgaccggcc 120
<210> 464
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 464
ctcgaggacc tgctcttagg ttcagaagcg aacctcacgt gcacactgac cggcctgaga 60
gatgcctctg gtgccacctt cacctggacg ccctcaagtg ggaagagcgc tgttcaagga 120
<210> 465
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 465
ccacctgagc gtgacctctg tggctgctac agcgtgtcca gtgtcctgcc tggctgtgcc 60
cagccatgga accatgggga gaccttcacc tgcactgctg cccaccccga gttgaagacc 120
<210> 466
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 466
ccactaaccg ccaacatcac aaaatccgga aacacattcc ggcccgaggt ccacctgctg 60
ccgccgccgt cggaggagct ggccctgaac gagctggtga cgctgacgtg cctggcacgt 120
<210> 467
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 467
ggcttcagcc ccaaggatgt gctggttcgc tggctgcagg ggtcacagga gctgccccgc 60
gagaagtacc tgacttgggc atcccggcag gagcccagcc agggcaccac cacctacgct 120
<210> 468
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 468
gtaaccagca tactgcgcgt ggcagctgag gactggaaga agggggagac cttctcctgc 60
atggtgggcc acgaggccct gccgctggcc ttcacacaga agaccatcga ccgcatggcg 120
<210> 469
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 469
ggctcttgct gtgttgcaga ttggcagatg ccgcctccct atgtggtgct ggacttgccg 60
caggagaccc tggaggagga gacccccggc gccaacctgt ggcccaccac catcaccttc 120
<210> 470
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 470
ctcaccctct tcctgctgag cctgttctat agcacagcac tgaccgtgac cagcgtccgg 60
ggcccatctg gcaagaggga gggcccccag tactgagcgg gagccggcaa ggcacaggga 120
<210> 471
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 471
ggaagtgtgg aggaacctct tggagaagcc agctatgctt gccagaactc agccctttca 60
gacatcaccg acccgccctt actcacgtgg cttccaggtg caataaagtg gccccaagga 120
<210> 472
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 472
gcctccacac agagcccatc cgtcttcccc ttgacccgct gctgcaaaaa cattccctcc 60
aatgccacct ccgtgactct gggctgcctg gccacgggct acttcccgga gccggtgatg 120
<210> 473
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 473
gtgacctggg acacaggctc cctcaacggg acaactatga ccttaccagc caccaccctc 60
acgctctctg gtcactatgc caccatcagc ttgctgaccg tctcgggtgc gtgggccaag 120
<210> 474
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 474
cagatgttca cctgccgtgt ggcacacact ccatcgtcca cagactgggt cgacaacaaa 60
accttcagcg tctgctccag ggacttcacc ccgcccaccg tgaagatctt acagtcgtcc 120
<210> 475
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 475
tgcgacggcg gcgggcactt ccccccgacc atccagctcc tgtgcctcgt ctctgggtac 60
accccaggga ctatcaacat cacctggctg gaggacgggc aggtcatgga cgtggacttg 120
<210> 476
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 476
tccaccgcct ctaccacgca ggagggtgag ctggcctcca cacaaagcga gctcaccctc 60
agccagaagc actggctgtc agaccgcacc tacacctgcc aggtcaccta tcaaggtcac 120
<210> 477
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 477
acctttgagg acagcaccaa gaagtgtgca gattccaacc cgagaggggt gagcgcctac 60
ctaagccggc ccagcccgtt cgacctgttc atccgcaagt cgcccacgat cacctgtctg 120
<210> 478
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 478
tcccgggcca gtgggaagcc tgtgaaccac tccaccagaa aggaggagaa gcagcgcaat 60
ggcacgttaa ccgtcacgtc caccctgccg gtgggcaccc gagactggat cgagggggag 120
<210> 479
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 479
acctaccagt gcagggtgac ccacccccac ctgcccaggg ccctcatgcg gtccacgacc 60
aagaccagcg gcccgcgtgc tgccccggaa gtctatgcgt ttgcgacgcc ggagtggccg 120
<210> 480
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 480
gggagccggg acaagcgcac cctcgcctgc ctgatccaga acttcatgcc tgaggacatc 60
tcggtgcagt ggctgcacaa cgaggtgcag ctcccggacg cccggcacag cacgacgcag 120
<210> 481
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 481
ccccgcaaga ccaagggctc cggcttcttc gtcttcagcc gcctggaggt gaccagggcc 60
gaatgggagc agaaagatga gttcatctgc cgtgcagtcc atgaggcagc aagcccctca 120
<210> 482
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 482
cagaccgtcc agcgagcggt gtctgtaaat cccgagctgg acgtgtgcgt ggaggaggcc 60
gagggcgagg cgccgtggac gtggaccggc ctctgcatct tcgccgcact cttcctgctc 120
<210> 483
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 483
agcgtgagct acagcgccgc catcacgctc ctcatggtgc agcggttcct ctcagccacg 60
cggcagggga ggccccagac ctccctcgac tacaccaacg tcctccagcc ccacgcctag 120
<210> 484
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 484
tcctgcctcc ctccctccca gggctccatc cagctgtgca gtggggagga ctggccagac 60
cttctgtcca ctgttgcaat gaccccagga agctaccccc aataaactgt gcctgctcag 120
<210> 485
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 485
gcttccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60
agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
<210> 486
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 486
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 60
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 120
<210> 487
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 487
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 60
aaatatggtc ccccatgccc atcatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 120
<210> 488
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 488
ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 60
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 120
<210> 489
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 489
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 60
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 120
<210> 490
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 490
tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 60
gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 120
<210> 491
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 491
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 60
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 120
<210> 492
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 492
gacggctcct tcttcctcta cagcaggctc accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 60
aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 120
<210> 493
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 493
ctctccctgt ctctggagct gcaactggag gagagctgtg cggaggcgca ggacggggag 60
ctggacgggc tgtggacgac catcaccatc ttcatcacac tcttcctgct aagcgtgtgc 120
<210> 494
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 494
tacagtgcca ccgtcacctt cttcaaggtg aagtggatct tctcctcagt ggtggacctg 60
aagcagacca tcgtccccga ctacaggaac atgataaggc agggggccta gggccaccct 120
<210> 495
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 495
ccccctgacc tcaccgccct caaccccatg gctctctggc ttcgcagtcg ccctctgagc 60
cctgaaacgc cccccttcca gaccctgtgc atagcaggtc taccccagac ctccgctgct 120
<210> 496
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 496
tggtgcatgc agggcgctga gggccaggtg tcccctcagc aggacgtccc tgccctctgg 60
accaccaggt gctcacacaa aaggaggtaa ccggcatccc aggcccccac tcaggcagga 120
<210> 497
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 497
cctcgccctg gagccaaccc cgtccacgcc agcctcctga acacaggcat ggtttccaga 60
tggtgagtgg gagcatcagt cgccaaggta gggaagccac agcaccatca ggccctgttg 120
<210> 498
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 498
gggaggcttc cgagagctgc gaaggctcac tcagacggcc ttcctcccag cccgcagcca 60
gccagcctcc attccgggca ctcccgtgaa ctcctgacat gaggaatgag gttgttctga 120
<210> 499
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 499
tttcaagcaa agaacgctgc tctctggctc ctgggaacag tctcggtgcc agcaccaccc 60
cttggctgcc tgcccacact gctggattct cgggtggaac tggacccgca gggacagcca 120
<210> 500
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 500
gccccagagt ccgcactggg gagagaaagg gccaggccca ggacactgcc acctaccacc 60
cactccagtc caccgagatc actcggagaa gagcctgggc catgtggccg ctgcaggagc 120
<210> 501
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 501
cccacagtgc aagggtgagg atagcccaag gaagggctgg gcatctgccc agacaggcct 60
cccacagaag gctggtgacc aggtcccagg cgggcaagac tcagccttgg tggggcctga 120
<210> 502
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 502
ggacagagga ggcccaggag catcggggag agaggtggag ggacaccggg agagccagga 60
gcgtggacac agccagaact catcacagag gctggcgtcc agtcccgggt cacgtgcagc 120
<210> 503
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 503
aggaacaagc agccactctg ggggcaccag gtggagaggc aagacgacaa agagggtgcc 60
cgtgttcttg cgaaagcggg gctgctggcc acgagtgctg gacagaggcc cccacgctct 120
<210> 504
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 504
gctgccccca tcacaccgtt ccgtgactgt cacgcagaat ccacagacag gaagggaggc 60
tcgagcggga ctgcggccag cgcctgcctc ggccgtcagg gaggactccc gggctcactc 120
<210> 505
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 505
gaaggaggtg tcaccatttc agctttggct tttcttcttc ttttaaattt tctaaagctc 60
attaattgtc tttgatgttt cttttgtgat gacaataaaa tatccttttt aagtcttgta 120
<210> 506
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 506
agcccccgct ccccgggctc tcggggtcgc gcgaggatgc ttggcacgta ccccgtgtac 60
atacttcccg ggcgcccagc atggaaataa agcacccagc gctgccctgg gcccctgcga 120
<210> 507
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 507
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60
agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
<210> 508
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 508
tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 60
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 120
<210> 509
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 509
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 60
aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 120
<210> 510
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 510
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 60
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 120
<210> 511
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 511
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 60
gtggtcagcg tcctcaccgt cgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 120
<210> 512
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 512
aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 60
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 120
<210> 513
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 513
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatctc cgtggagtgg 60
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 120
<210> 514
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 514
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 60
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc 120
<210> 515
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 515
tccctgtctc cggagctgca actggaggag agctgtgcgg aggcgcagga cggggagctg 60
gacgggctgt ggaccaccat caccatcttc atcacactct tcctgctaag cgtgtgctac 120
<210> 516
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 516
agtgccacca tcaccttctt caaggtgaag tggatcttct cctcagtggt ggacctgaag 60
cagaccatcg tccccgacta caggaacatg atcaggcagg gggcctaggg ccaccctctg 120
<210> 517
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 517
cccccgacct caccgccctc aaccccatgg ctctctggcc tcgcagtcgc cctctgaccc 60
tgacacgccc cccttccaga ccctgtgcat agcaggtcta ccccagacct ccgctgcttg 120
<210> 518
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 518
gtgcatgcag ggcgctgggg gccaagtgtc ccctcagcag gacgtccctg ccctccggcc 60
cgccaggtgc tcacacaaaa ggaggtagtg accagcatcc caggccccca ctcaggcagg 120
<210> 519
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 519
acctcgccct ggagccaacc ctgtccacgc cagcctcctg aacacaggcg tggtttccag 60
atggtgagtg ggagcatcag tcgccaaggt agggaagtca cagcaccatc aggccctgtt 120
<210> 520
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 520
ggggaggctt ccgagagctg cgaaggctca ctcagacggc cttcctccca gcccgcagcc 60
agccagcctc cattccaggc actcccgtga actcctgaca tgaggaatga ggttgttctg 120
<210> 521
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 521
atttcaagca aagaacgctg ctctctggct cctgggaaca gtctcagtgc cagcaccacc 60
ccttggctgc ctgcccacac tgctggattc tcgggtggaa ctcgacccgc agggacagcc 120
<210> 522
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 522
agccccagag tccgcactgg ggagagaagg ggccaggccc aggacactgc cacctaccac 60
ccactccagt ccaccgagat cactcggaga agagcctggg ccatgtggcc gctgcaggag 120
<210> 523
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 523
ccccacggtg caagggtgag gatagcccaa ggaagggctg ggcatctgcc cagacaggcc 60
tcccagagaa ggctggtgac caggtcccag gcgggcaaga ctcagccttg gtggggcctg 120
<210> 524
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 524
aggacagagg aggcccagga gcatcgggga gagaggtgga gggacaccgg gagagccagg 60
agcgtggaca cagccagaac tcatcacaga ggctggcgtc cagccccggg tcacgtgcag 120
<210> 525
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 525
caggaacaag cagccactct gggggcacca ggtggagagg caagacgaca aagagggtgc 60
ccgtgttctt gtgaaagcgg ggctgctggc cacgagtgct ggacagaggc ccccacgctc 120
<210> 526
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 526
tgctgccccc atcacgccgt tccgtgactg tcacgcagaa tccgcagaca gggagactcg 60
agcgggagtg cggccagcgc ctgcctcagc tgtcagggag gactcccggg ctcactcgaa 120
<210> 527
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 527
ggaggtgcca ccatttcagc tttggtagct tttcttcttc ttttaaattt tctaaagctc 60
attaattgtc tttgatgttt cttttgtgat gacaataaaa tatccttttt aagtcttgta 120
<210> 528
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 528
agcccccgct ccccaggctc tcggggtcgc gcgaggatgc ttggcacgta ccccgtctac 60
atacttcccg ggcacccagc atggaaataa agcacccagc gctgccctgg gcccctgcga 120
<210> 529
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 529
gcatccccga ccagccccaa ggtcttcccg ctgagcctct gcagcaccca gccagatggg 60
aacgtggtca tcgcctgcct ggtccagggc ttcttccccc aggagccact cagtgtgacc 120
<210> 530
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 530
tggagcgaaa gcggacaggg cgtgaccgcc agaaacttcc cacccagcca ggatgcctcc 60
ggggacctgt acaccacgag cagccagctg accctgccgg ccacacagtg cctagccggc 120
<210> 531
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 531
aagtccgtga catgccacgt gaagcactac acgaatccca gccaggatgt gactgtgccc 60
tgcccagttc cctcaactcc acctacccca tctccctcaa ctccacctac cccatctccc 120
<210> 532
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 532
tcatgctgcc acccccgact gtcactgcac cgaccggccc tcgaggacct gctcttaggt 60
tcagaagcga acctcacgtg cacactgacc ggcctgagag atgcctcagg tgtcaccttc 120
<210> 533
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 533
acctggacgc cctcaagtgg gaagagcgct gttcaaggac cacctgagcg tgacctctgt 60
ggctgctaca gcgtgtccag tgtcctgccg ggctgtgccg agccatggaa ccatgggaag 120
<210> 534
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 534
ggaggagctg gccctgaacg agctggtgac gctgacgtgc ctggcacgcg gcttcagccc 60
caaggatgtg ctggttcgct ggctgcaggg gtcacaggag ctgccccgcg agaagtacct 120
<210> 535
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 535
gacttgggca tcccggcagg agcccagcca gggcaccacc accttcgctg tgaccagcat 60
actgcgcgtg gcagccgagg actggaagaa gggggacacc ttctcctgca tggtgggcca 120
<210> 536
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 536
cgaggccctg ccgctggcct tcacacagaa gaccatcgac cgcttggcgg attggcagat 60
gccgcctccc tatgtggtgc tggacttgcc gcaggagacc ctggaggagg agacccccgg 120
<210> 537
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 537
cgccaacctg tggcccacca ccatcacctt cctcaccctc ttcctgctga gcctgttcta 60
tagcacagca ctgaccgtga ccagcgtccg gggcccatct ggcaacaggg agggccccca 120
<210> 538
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 538
gtactgagca ggagccggca aggcacaggg aggaagtgtg gaggaacctc ttggagaagc 60
cagctatgct tgccagaact cagccctttc agacatcacc gacccgccct tactcacatg 120
<210> 539
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 539
cttggcgggt aaacccaccc atgtcaatgt gtctgttgtc atggcggagg tggacggcac 60
ctgctactga gccgcccgcc tgtccccacc cctgaataaa ctccatgctc ccccaagcag 120
<210> 540
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 540
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcag ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
<210> 541
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 541
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 60
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 120
<210> 542
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 542
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 60
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 120
<210> 543
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 543
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 60
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 120
<210> 544
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 544
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 60
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 120
<210> 545
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 545
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 60
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 120
<210> 546
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 546
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 60
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 120
<210> 547
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 547
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 60
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca 120
<210> 548
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 548
cagaagagcc tctccctgtc tccggagctg caactggagg agagctgtgc ggaggcgcag 60
gacggggagc tggacgggct gtggacgacc atcaccatct tcatcacact cttcctgtta 120
<210> 549
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 549
agcgtgtgct acagtgccac cgtcaccttc ttcaaggtga agtggatctt ctcctcggtg 60
gtggacctga agcagaccat catccccgac tacaggaaca tgatcggaca gggggcctag 120
<210> 550
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 550
cgccctcaac cccatgactc tctggcctcg cagttgccct ctgaccctga cacacctgac 60
acgcccccct tccagaccct gtgcatagca ggtctacccc agacctccgc tgcttggtgc 120
<210> 551
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 551
atgcagggca ctgggggcca ggtgtcccct cagcaggacg tccttgccct ccggaccaca 60
aggtgctcac acaaaaggag gcagtgaccg gtatcccagg cccccaccca ggcaggacct 120
<210> 552
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 552
cgccctggag ccaaccccgt ccacgccagc ctcctgaaca caggcgtggt ttccagatgg 60
tgagtgggag cgtcagccgc caaggtaggg aagccacagc accatcaggc cctgttgggg 120
<210> 553
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 553
aggcttccga gagctgcgaa ggctcactca gacggccttc ctcccagccc gcagccagcc 60
agcctccatt ccgggcactc ccgtgaactc ctgacatgag gaatgaggtt gttctgattt 120
<210> 554
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 554
caagcaaaga acgctgctct ctggctcctg ggaacagtct cagtgccagc accacccctt 60
ggctgcctgc ccacactgct ggattctcgg gtggaactgg acccgcaggg acagccagcc 120
<210> 555
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 555
ccagagtccg cactggggag agaaggggcc aggcccagga cactgccacc tcccacccac 60
tccagtccac cgagatcact cagagaagag cctgggccat gtggccgctg caggagcccc 120
<210> 556
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 556
acagtgcaag ggtgaggata gcccaaggaa gggctgggca tctgcccaga caggcctccc 60
agagaaggct ggtgaccagg tcccaggcgg gcaagactca gccttggtgg ggcctgagga 120
<210> 557
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 557
cagaggaggc ccaggagcat cggggagaga ggtggaggga caccgggaga gccaggagcg 60
tggacacagc cagaactcat cacagaggct ggcgtccagc cccgggtcac gtgcagcagg 120
<210> 558
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 558
aacaagcagc cactctgggg gcaccaggtg gagaggcaag acgacaaaga gggtgcccgt 60
gttcttgcga aagcagggct gctggccacg agtgctggac agaggccccc acgctctgct 120
<210> 559
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 559
gcccccatca cgccgttccg tgactgtcac gcagaatctg cagacaggaa gggagactcg 60
agcgggagtg cggccagcgc ctgcctcggc cgtcagggag gactcctggg ctcactcgaa 120
<210> 560
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 560
ggaggtgcca ccatttcagc tttggtagct tttcttcttc ttttaaattt tctaaagctc 60
attaattgtc tttgatgttt cttttgtgat gacaataaaa tatccttttt aagtcttgta 120
<210> 561
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 561
aagcccccgc tccccaggct ctcggggtcg cgcgaggatg cttggcacgt accccgtgta 60
catacttccc aggcacccag catggaaata aagcacccag cgcttccctg ggcccctgcg 120
<210> 562
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 562
cttccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcgccctg ctccaggagc acctctgggg 60
gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc agaaccggtg acggtgtcgt 120
<210> 563
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 563
ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 60
gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 120
<210> 564
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 564
acacctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagctca 60
aaaccccact tggtgacaca actcacacat gcccacggtg cccagagccc aaatcttgtg 120
<210> 565
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 565
acacacctcc cccgtgccca cggtgcccag agcccaaatc ttgtgacaca cctcccccat 60
gcccacggtg cccagagccc aaatcttgtg acacacctcc cccgtgccca aggtgcccag 120
<210> 566
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 566
cacctgaact cctgggagga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggataccc 60
ttatgatttc ccggacccct gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc 120
<210> 567
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 567
ccgaggtcca gttcaagtgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc 60
cgcgggagga gcagtacaac agcacgttcc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc 120
<210> 568
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 568
aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc 60
ccatcgagaa aaccatctcc aaaaccaaag gacagccccg agaaccacag gtgtacaccc 120
<210> 569
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 569
tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag 60
gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcag cgggcagccg gagaacaact 120
<210> 570
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 570
acaacaccac gcctcccatg ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca 60
ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acatcttctc atgctccgtg atgcatgagg 120
<210> 571
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 571
ctctgcacaa ccgcttcacg cagaagagcc tctccctgtc tccggagctg caactggagg 60
agagctgtgc ggaggcgcag gacggggagc tggacgggct gtggacgacc atcaccatct 120
<210> 572
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 572
tcatcacact cttcctgtta agcgtgtgct acagtgccac cgtcaccttc ttcaaggtga 60
agtggatctt ctcctcggtg gtggacctga agcagaccat catccccgac tataggaaca 120
<210> 573
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 573
gacctcaccg ccctcaaccc catggctctc tgtctttgca gtcgccctct gagccctgac 60
acgcccccct tccagaccct gtgcatagca ggtctacccc agacctccgc tgcttggtgc 120
<210> 574
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 574
atgcagggag ctggggacca ggtgtcccct cagcaggatg tccctgccct ccagaccgcc 60
agatgctcac acaaaaggag gcagtgacca gcatccgagg cccccaccca ggcaggagct 120
<210> 575
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 575
ggccctggag ccaaccccgt ccacgccagc ctcctgaaca caggcgtggt ttccagatgg 60
tgagtgggag catcagccgc caaggtaggg aagccacagc accatcaggc cctgttgggg 120
<210> 576
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 576
aggcttccga gagctgcgaa ggctcactca gacggccttc ctcccagccc gcagccagcc 60
agcctccatt ccgggcactc ccgtgaactc ctgacatgag gaatgaggtt gttctgattt 120
<210> 577
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 577
caagcaaaga acgctgctct ctggctcctg ggaacagtct cggtgccagc accacccctt 60
ggctgcctgc ctacactgct ggattctcgg gtggaactgg acccgcaggg acagccagcc 120
<210> 578
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 578
ccagagtccg cactggggag agaaggggcc aggcccagga cactgccacc tcccacccac 60
tccagtccac cgagatcact cagagaagag cctgggccat gtggccactg caggagcccc 120
<210> 579
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 579
acagtgcaag agtgaggata gcccaaggaa gggctgggca tctgcccaga caggcctccc 60
agagaaggct ggtgaccagg tcccaggcgg gcaagactca gccttggtgg ggcctgagga 120
<210> 580
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 580
cagaggaggc ccaggagcat cggggagaga ggtggaggga caccgggaga gccaggagcg 60
tggacacagc cagaactcat cacagaggct ggcgtccagc cccgggtcac gtgcagcagg 120
<210> 581
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 581
aacaagcagc cactctgggg gcaccaggtg gagaggcaag atgccaaaga gggtgcccgt 60
gttcttgcga aagcggggct gctggccacg agtgctggac agaggccccc acgctctgct 120
<210> 582
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 582
gcccccatca cgccgttccg tgactgtcac gcagaatccg cagacaggaa gggaggctcg 60
agcgggactg cggccagcgc ctgcctcggc cgtcagggag gactcccggg ctcactcgaa 120
<210> 583
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 583
ggaggtgcca ccatttcagc tttggtagct tttcttcttc ttttaaattt tctaaagctc 60
attaattgtc tttgatgttt cttttgtgat gacaataaaa tatccttttt aagtcttgta 120
<210> 584
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 584
agcccccgct ccccgggctc tcggggtcgc gcgaggatgc ttggcacgta ccccgtgtac 60
atacttcccg ggcacccagc atggaaataa agcacccagc gctgccctgg gcccctgcga 120
<210> 585
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 585
cacccaccaa ggctccggat gtgttcccca tcatatcagg gtgcagacac ccaaaggata 60
acagccctgt ggtcctggca tgcttgataa ctgggtacca cccaacgtcc gtgactgtca 120
<210> 586
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 586
cctggtacat ggggacacag agccagcccc agagaacctt ccctgagata caaagacggg 60
acagctacta catgacaagc agccagctct ccacccccct ccagcagtgg cgccaaggcg 120
<210> 587
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 587
agtacaaatg cgtggtccag cacaccgcca gcaagagtaa gaaggagatc ttccgctggc 60
cagagtctcc aaaggcacag gcctcctcag tgcccactgc acaaccccaa gcagagggca 120
<210> 588
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 588
gcctcgccaa ggcaaccaca gccccagcca ccacccgtaa cacaggaaga ggaggagaag 60
agaagaagaa ggagaaggag aaagaggaac aagaagagag agagacaaag acaccagagt 120
<210> 589
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 589
gtccgagcca cacccagcct cttggcgtct acctgctaac ccctgcagtg caggacctgt 60
ggctccggga caaagccacc ttcacctgct tcgtggtggg cagtgacctg aaggatgctc 120
<210> 590
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 590
acctgacctg ggaggtggct gggaaggtcc ccacaggggg cgtggaggaa gggctgctgg 60
agcggcacag caacggctcc cagagccagc acagccgtct gaccctgccc aggtccttgt 120
<210> 591
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 591
ggcctcgtct gaccctcccg aggcggcctc gtggctcctg tgtgaggtgt ctggcttctc 60
gccccccaac atcctcctga tgtggctgga ggaccagcgt gaggtgaaca cttctgggtt 120
<210> 592
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 592
tgcccccgca cgcccccctc cacagcccag gagcaccacg ttctgggcct ggagtgtgct 60
gcgtgtccca gccccgccca gccctcagcc agccacctac acgtgtgtgg tcagccacga 120
<210> 593
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 593
ggactcccgg actctgctca acgccagccg gagcctagaa gtcagctacc tggccatgac 60
ccccctgatc cctcagagca aggatgagaa cagcgatgac tacacgacct ttgatgatgt 120
<210> 594
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 594
gggcagcctg tggaccaccc tgtccacgtt tgtggccctc ttcatcctca ccctcctcta 60
cagcggcatt gtcactttca tcaaggtgaa gtagccccag aagagcagga cgccctgtac 120
<210> 595
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 595
ctgcagagaa gggaagcagc ctctgtacct catctgtggc taccagagag cagaaaggac 60
ccaccctgga ctcttctgtg tgcaggaaga tgcgccagcc cctgcccccg gctcccctct 120
<210> 596
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 596
gtccgccaca gaacccagtc ttctagacca gggggacggg cacccatcac tccgcaggcg 60
aatcagagcc cccctgcccc ggccctaacc cctgtgcctc cttcccatgc ttccccgaga 120
<210> 597
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 597
gccagctaca cccctgcccc ggccctaacc cccatgcctc cttcctgtgc ttcccccaga 60
gccagctagt cccacctgca gcccgctggc ctccccataa acacactttg gttcatttca 120
<210> 598
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 598
gggagtgcat ccgccccaac ccttttcccc ctcgtctcct gtgagaattc cccgtcggat 60
acgagcagcg tggccgttgg ctgcctcgca caggacttcc ttcccgactc catcactttc 120
<210> 599
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 599
tcctggaaat acaagaacaa ctctgacatc agcagcaccc ggggcttccc atcagtcctg 60
agagggggca agtacgcagc cacctcacag gtgctgctgc cttccaagga cgtcatgcag 120
<210> 600
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 600
ggcacagacg aacacgtggt gtgcaaagtc cagcacccca acggcaacaa agaaaagaac 60
gtgcctcttc cagtgattgc tgagctgcct cccaaagtga gcgtcttcgt cccaccccgc 120
<210> 601
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 601
gacggcttct tcggcaaccc ccgcaagtcc aagctcatct gccaggccac gggtttcagt 60
ccccggcaga ttcaggtgtc ctggctgcgc gaggggaagc aggtggggtc tggcgtcacc 120
<210> 602
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 602
acggaccagg tgcaggctga ggccaaagag tctgggccca cgacctacaa ggtgaccagc 60
acactgacca tcaaagagag cgactggctc ggccagagca tgttcacctg ccgcgtggat 120
<210> 603
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 603
cacaggggcc tgaccttcca gcagaatgcg tcctccatgt gtgtccccga tcaagacaca 60
gccatccggg tcttcgccat ccccccatcc tttgccagca tcttcctcac caagtccacc 120
<210> 604
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 604
aagttgacct gcctggtcac agacctgacc acctatgaca gcgtgaccat ctcctggacc 60
cgccagaatg gcgaagctgt gaaaacccac accaacatct ccgagagcca ccccaatgcc 120
<210> 605
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 605
agcgccgtgg gtgaggccag catctgcgag gatgactgga attccgggga gaggttcacg 60
tgcaccgtga cccacacaga cctgccctcg ccactgaagc agaccatctc ccggcccaag 120
<210> 606
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 606
ggggtggccc tgcacaggcc cgatgtctac ttgctgccac cagcccggga gcagctgaac 60
ctgcgggagt cggccaccat cacgtgcctg gtgacgggct tctctcccgc ggacgtcttc 120
<210> 607
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 607
gtgcagtgga tgcagagggg gcagcccttg tccccggaga agtatgtgac cagcgcccca 60
atgcctgagc cccaggcccc aggccggtac ttcgcccaca gcatcctgac cgtgtccgaa 120
<210> 608
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 608
gaggaatgga acacggggga gacctacacc tgcgtggtgg cccatgaggc cctgcccaac 60
agggtcaccg agaggaccgt ggacaagtcc accgaggggg aggtgagcgc cgacgaggag 120
<210> 609
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 609
ggctttgaga acctgtgggc caccgcctcc accttcatcg tcctcttcct cctgagcctc 60
ttctacagta ccaccgtcac cttgttcaag gtgaaatgat cccaacagaa gaacatcgga 120
<210> 610
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 610
gaccagagag aggaactcaa aggggcgctg cctccgggtc tggggtcctg gcctgcgtgg 60
cctgttggca cgtgtttctc ttccccgccc ggcctccagt tgtgtgctct cacacaggct 120
<210> 611
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 611
tccttctcga ccggcagggg ctggctggct tgcaggccac gaggtgggct ctaccccaca 60
ctgctttgct gtgtatacgc ttgttgccct gaaataaata tgcacatttt atccatgaaa 120
<210> 612
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 612
tgctggcctg cccacaggct cggggcggct ggccgctctg tgtgtgcatg caaactaacc 60
gtgtcaacgg ggtgagatgt tgcatcttat aaaattagaa ataaaaagat ccattcaaaa 120
<210> 613
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 613
gccaccccct tggtcactct gttcccgccc tcctctgagg agctccaagc caacaaggcc 60
atgctggtgt gtctcataaa tgacttctac ccaggagcca tagaaggaaa atggcaccct 120
<210> 614
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 614
atgcggccag cagctacctg agcctgacgc ccgagcagtg gaagtcccac agaagctaca 60
gctgccaggt cacgcacaaa gaaagtacca tggagaagac aatggcccat gcagaatgtt 120
<210> 615
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 615
acaaggccac actggtgtgt ctcatgagtg acttctaccc gagagccatg acagtggcct 60
ggaagataga tggcatcacc atcacccagg gtgtggagac caccacaccc tccaaacaga 120
<210> 616
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 616
tatgcggcca gcagctacct aagactggca cccgacagtg gaagtcccac aacctctaca 60
gctgccaggt cacgcatgaa aggaacactg tggagaagac agtggcccct gcagaatgtt 120
<210> 617
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 617
gtcagcccaa ggctgcccca tcggtcactc tgttcccgcc ctcctctgag gagcttcaag 60
ccaacaaggc cacactggtg tgcctgatca gtgacttcta cccgggagct gtgaaagtgg 120
<210> 618
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 618
gcggccagca gctagctacc tgagcctgac gcctgagcag tggaagtccc acagaagcta 60
cagttgccag gtcacgcatg aagggagcac cgtggagaag acagtggccc ctgcagaatg 120
<210> 619
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 619
aggacctgaa caaggtgttc ccacccgagg tcgctgtgtt tgagccatca gaagcagaga 60
tctcccacac ccaaaaggcc acactggtgt gcctggccac aggcttcttc cctgaccacg 120
<210> 620
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 620
tggagctgag ctggtgggtg aatgggaagg aggtgcacag tggggtcagc acggacccgc 60
agcccctcaa ggagcagccc gccctcaatg actccagata ctgcctgagc agccgcctga 120
<210> 621
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 621
gggtctcggc caccttctgg cagaaccccc gcaaccactt ccgctgtcaa gtccagttct 60
acgggctctc ggagaatgac gagtggaccc aggatagggc caaacccgtc acccagatcg 120
<210> 622
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 622
ctcggtgtcc taccagcaag gggtcctgtc tgccaccatc ctctatgaga tcctgctagg 60
gaaggccacc ctgtatgctg tgctggtcag cgcccttgtg ttgatggcca tggtcaagag 120
<210> 623
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 623
aaaggatttc tgaaggcagc cctggaagtg gagttaggag cttctaaccc gtcatggttt 60
caatacacat tcttcttttg ccagcgcttc tgaagagctg ctctcacctc tctgcatccc 120
<210> 624
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 624
aatagatatc cccctatgtg catgcacacc tgcacactca cggctgaaat ctccctaacc 60
cagggggacc ttagcatgcc taagtgacta aaccaataaa aatgttctgg tctggcctga 120
<210> 625
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 625
aggacctgaa aaacgtgttc ccacccaagg tcgctgtgtt tgagccatca gaagcagaga 60
tctcccacac ccaaaaggcc acactggtgt gcctggccac aggcttctac cccgaccacg 120
<210> 626
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 626
tggagctgag ctggtgggtg aatgggaagg aggtgcacag tggggtcagc acagacccgc 60
agcccctcaa ggagcagccc gccctcaatg actccagata ctgcctgagc agccgcctga 120
<210> 627
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 627
gggtctcggc caccttctgg cagaaccccc gcaaccactt ccgctgtcaa gtccagttct 60
acgggctctc ggagaatgac gagtggaccc aggatagggc caaacctgtc acccagatcg 120
<210> 628
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 628
acctccgagt cttaccagca aggggtcctg tctgccacca tcctctatga gatcttgcta 60
gggaaggcca ccttgtatgc cgtgctggtc agtgccctcg tgctgatggc catggtcaag 120
<210> 629
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 629
agaaaggatt ccagaggcta gctccaaaac catcccaggt cattcttcat cctcacccag 60
gattctcctg tacctgctcc caatctgtgt tcctaaaagt gattctcact ctgcttctca 120
<210> 630
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 630
tctcctactt acatgaatac ttctctcttt tttctgtttc cctgaagatt gagctcccaa 60
cccccaagta cgaaataggc taaaccaata aaaaattgtg tgttgggcct ggttgcattt 120
<210> 631
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 631
atatccagaa ccctgaccct gccgtgtacc agctgagaga ctctaaatcc agtgacaagt 60
ctgtctgcct attcaccgat tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg 120
<210> 632
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 632
atgtgtatat cacagacaaa actgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca 60
gtgctgtggc ctggagcaac aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca 120
<210> 633
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 633
ttattccaga agacaccttc ttccccagcc cagaaagttc ctgtgatgtc aagctggtcg 60
agaaaagctt tgaaacagat acgaacctaa actttcaaaa cctgtcagtg attgggttcc 120
<210> 634
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 634
gaatcctcct cctgaaagtg gccgggttta atctgctcat gacgctgcgg ctgtggtcca 60
gctgagatct gcaagattgt aagacagcct gtgctccctc gctccttcct ctgcattgcc 120
<210> 635
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 635
acagagggaa ctctcctacc cccaaggagg tgaaagctgc taccacctct gtgccccccc 60
ggcaatgcca ccaactggat cctacccgaa tttatgatta agattgctga agagctgcca 120
<210> 636
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 636
aacactgctg ccaccccctc tgttccctta ttgctgcttg tcactgcctg acattcacgg 60
cagaggcaag gctgctgcag cctcccctgg ctgtgcacat tccctcctgc tccccagaga 120
<210> 637
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 637
ctgcctccgc catcccacag atgatggatc ttcagtgggt tctcttgggc tctaggtcct 60
gcagaatgtt gtgaggggtt tatttttttt taatagtgtt cataaagaaa tacatagtat 120
<210> 638
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成多核苷酸”
<400> 638
tcttcttctc aagacgtggg gggaaattat ctcattatcg aggccctgct atgctgtgta 60
tctgggcgtg ttgtatgtcc tgctgccgat gccttcatta aaatgatttg gaagagcaga 120
<210> 639
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (23)..(50)
<223> a、c、t、g、未知或其他
<220>
<221> 经修饰的碱基
<222> (82)..(82)
<223> a、c、t、g、未知或其他
<400> 639
ctacacgacg ctcttccgat ctnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt vn 82
<210> 640
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述：合成寡核苷酸”
<400> 640
cccatgtact ctgcgttgat accactgctt 30
Claims (160)
1.一种用于确定生物样品中一定位置处免疫细胞克隆型的存在和/或丰度的方法，所述方法包括：
(a)使生物样品与包括多个捕获探针的阵列接触，其中所述多个捕获探针的捕获探针包括(i)空间条形码和(ii)与编码所述免疫细胞克隆型的免疫细胞受体的核酸结合的捕获结构域；以及
(b)确定(i)所述空间条形码的全部或部分序列或其补体，和(ii)编码所述免疫细胞受体的所述核酸的全部或部分序列或其补体，并且使用(i)和(ii)的确定序列来确定所述生物样品中一定位置处所述免疫细胞克隆型的存在和/或丰度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫细胞克隆型为T细胞克隆型。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述T细胞克隆型为T细胞受体α链。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述捕获结构域与编码所述T细胞受体α链的恒定区的核酸序列结合。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中步骤(b)包括确定编码所述T细胞受体α链的CDR3的序列。
6.根据权利要求5所述的方法，其中步骤(b)还包括确定编码所述T细胞受体α链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。
7.根据权利要求5所述的方法，其中步骤(b)还包括确定编码所述T细胞受体α链的全长可变结构域的序列。
8.根据权利要求2所述的方法，其中所述免疫细胞受体为T细胞受体β链。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述捕获结构域与编码所述T细胞受体β链的恒定区的核酸序列特异性结合。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中步骤(b)包括确定编码所述T细胞受体β链的CDR3的序列。
11.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(b)还包括确定编码所述T细胞受体β链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。
12.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(b)还包括确定编码所述T细胞受体β链的全长可变结构域的序列。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫细胞克隆型为B细胞克隆型。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述B细胞克隆型为免疫球蛋白κ轻链。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述捕获结构域与编码所述免疫球蛋白κ轻链的恒定区的核酸序列特异性结合。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中步骤(b)包括确定编码所述免疫球蛋白κ轻链的CDR3的序列。
17.根据权利要求16所述的方法，其中步骤(b)还包括确定编码所述免疫球蛋白κ轻链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。
18.根据权利要求16所述的方法，其中步骤(b)还包括确定编码所述免疫球蛋白κ轻链的全长可变结构域的序列。
19.根据权利要求13所述的方法，其中所述B细胞克隆型为免疫球蛋白λ轻链。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述捕获结构域与编码所述免疫球蛋白λ轻链的恒定区的核酸序列特异性结合。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中步骤(b)包括确定编码所述免疫球蛋白λ轻链的CDR3的序列。
22.根据权利要求21所述的方法，其中步骤(b)还包括确定编码所述免疫球蛋白λ轻链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。
23.根据权利要求21所述的方法，其中步骤(b)还包括确定编码所述免疫球蛋白λ轻链的全长可变结构域的序列。
24.根据权利要求13所述的方法，其中所述B细胞克隆型为免疫球蛋白重链。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述捕获结构域与编码所述免疫球蛋白重链的恒定区的核酸序列特异性结合。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中步骤(b)包括确定编码所述免疫球蛋白重链的CDR3的序列。
27.根据权利要求26所述的方法，其中步骤(b)还包括确定编码所述免疫球蛋白重链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。
28.根据权利要求26所述的方法，其中步骤(b)还包括确定编码所述免疫球蛋白重链的全长可变结构域的序列。
29.根据权利要求3或13所述的方法，其中所述捕获结构域与编码免疫细胞克隆型的核酸的poly(A)序列结合。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述捕获结构域与编码T细胞克隆型的核酸序列结合。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述T细胞克隆型为T细胞受体α链、T细胞受体β链及其组合。
32.根据权利要求29或30所述的方法，其中步骤(b)包括确定：编码所述T细胞受体α链的CDR3的序列、编码所述T细胞受体β链的CDR3的序列及其组合。
33.根据权利要求32所述的方法，其中步骤(b)还包括确定：编码所述T细胞受体α链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列、编码所述T细胞受体β链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列及其组合。
34.根据权利要求32所述的方法，其中步骤(b)还包括确定：编码所述T细胞受体α链的全长可变结构域的序列、编码所述T细胞受体β链的全长可变结构域的序列及其组合。
35.根据权利要求29所述的方法，其中所述捕获结构域与编码B细胞克隆型的核酸结合。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述B细胞克隆型为免疫球蛋白κ轻链、免疫球蛋白λ轻链、免疫球蛋白重链及其组合。
37.根据权利要求36所述的方法，其中步骤(b)包括确定：编码所述免疫球蛋白κ轻链的CDR3的序列、编码所述免疫球蛋白λ轻链的CDR3的序列、编码所述免疫球蛋白重链的CDR3的序列及其组合。
38.根据权利要求37所述的方法，其中步骤(b)还包括确定：编码所述免疫球蛋白κ轻链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列、编码所述免疫球蛋白λ轻链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列、编码所述免疫球蛋白重链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列及其组合。
39.根据权利要求37所述的方法，其中步骤(b)还包括确定：编码所述免疫球蛋白κ轻链的全长可变结构域的序列、编码所述免疫球蛋白λ轻链的全长可变结构域的序列、编码所述免疫球蛋白重链的全长可变结构域的序列及其组合。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括所述捕获探针使用编码所述免疫细胞受体的所述核酸作为模板，从而生成延伸的捕获探针。
41.根据权利要求40所述的方法，其中步骤(b)包括延伸所述捕获探针的3’末端。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中步骤(b)还包括生成第二核酸链，所述第二核酸链包括(i)与所述空间条形码的全部或部分互补的序列，和(ii)对应于编码所述免疫细胞受体的所述核酸的全部或部分序列的序列。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述捕获探针还包含切割结构域、功能结构域、唯一分子标识符或其任何组合。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述捕获探针还包含功能结构域。
45.根据权利要求44所述的方法，其中步骤(b)还包括生成第二核酸链，所述第二核酸链包括(i)与所述功能结构域的全部或部分互补的序列，(ii)与所述空间条形码的全部或部分互补的序列，和(iii)对应于编码所述免疫细胞受体的所述核酸的全部或部分序列的序列。
46.根据权利要求1-45中任一项所述的方法，其中所述方法还包括富集编码所述免疫细胞克隆型的所述免疫细胞受体的所述核酸。
47.根据权利要求46所述的方法，其中富集包括将多个杂交探针与编码所述免疫细胞克隆型的所述免疫细胞受体的所述核酸杂交，其中杂交探针包含(i)与编码所述免疫细胞受体的所述核酸的一部分互补的序列和(ii)与捕获部分相互作用的结合部分。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述结合部分包含生物素并且所述捕获部分包含链霉亲和素。
49.根据权利要求46-48中任一项所述的方法，其中富集编码所述免疫细胞克隆型的所述免疫细胞受体的所述核酸还包括一个或多个封闭探针。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述一个或多个封闭探针包含与SEQ ID NO：639具有至少80％同一性的序列。
51.根据权利要求49所述的方法，其中所述一个或多个封闭探针包含与SEQ ID NO：640具有至少80％同一性的序列。
52.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使用(i)包含所述功能结构域的全部或部分的第一引物，其中所述功能结构域为所述空间条形码的5’，和(ii)包含与编码所述免疫细胞受体的可变区的序列的一部分基本上互补的序列的第二引物，来扩增编码所述免疫细胞克隆型的所述免疫细胞受体的所述核酸或其补体。
53.根据权利要求52所述的方法，所述方法还包括使用(i)包含所述功能结构域的全部或部分的所述第一引物，其中所述功能结构域为所述空间条形码的5’，和(ii)包含与编码所述免疫细胞受体的可变区的所述核酸序列的一部分基本上互补的序列的第三引物，其中所述第三引物为所述第二引物的5’，来扩增编码所述免疫细胞克隆型的所述免疫细胞受体的所述核酸或其补体。
54.根据权利要求1-53中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含组织样品。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述组织样品为组织切片。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述组织切片为固定的组织切片。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述固定的组织切片为福尔马林固定石蜡包埋的组织切片。
58.根据权利要求55-57中任一项所述的方法，其中所述组织切片包含肿瘤区域。
59.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，其中编码所述免疫细胞受体的所述核酸包含RNA。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述RNA为mRNA。
61.根据权利要求1-60中任一项所述的方法，其中编码所述免疫细胞受体的所述核酸包含DNA。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述DNA为基因组DNA。
63.根据权利要求1-62中任一项所述的方法，其中所述方法还包括对所述生物样品成像。
64.根据权利要求1-63中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的所述确定包括对(i)所述空间条形码的全部或部分序列或其补体和(ii)编码所述免疫细胞受体的所述核酸的全部或部分序列或其补体测序。
65.根据权利要求1-64中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括确定所述生物样品中一定位置处所述免疫细胞克隆型的存在。
66.根据权利要求1-64中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括确定所述生物样品中一定位置处所述免疫细胞克隆型的丰度。
67.根据权利要求1-64中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括确定所述生物样品中一定位置处所述免疫细胞克隆型的存在和丰度。
68.根据权利要求1-64中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括确定所述生物样品中一定位置处两种或更多种免疫细胞克隆型的存在。
69.根据权利要求1-64中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括确定所述生物样品中一定位置处两种或更多种免疫细胞克隆型的丰度。
70.根据权利要求1-64中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括确定所述生物样品中一定位置处两种或更多种免疫细胞克隆型的存在和丰度。
71.根据权利要求68-70中任一项所述的方法，其中所述方法还包括比较所述两种或更多种免疫细胞克隆型。
72.根据权利要求68-71中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种免疫细胞克隆型各自为B细胞克隆型。
73.根据权利要求68-71中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种免疫细胞克隆型各自为T细胞克隆型。
74.根据权利要求68-7151-54中任—项所述的方法，其中所述两种或更多种免疫细胞克隆型包含至少一种T细胞克隆型和至少一种B细胞克隆型。
75.一种用于确定生物样品中一定位置处免疫细胞受体的存在和/或丰度的方法，所述方法包括：
(a)使生物样品与包括多个捕获探针的阵列接触，其中所述多个捕获探针的捕获探针包括(i)空间条形码和(ii)与编码免疫细胞受体的核酸特异性结合的捕获结构域；以及
(b)确定(i)所述空间条形码的全部或部分序列或其补体，和(ii)编码所述免疫细胞受体的所述核酸的全部或部分序列或其补体，并且使用(i)和(ii)的确定序列来确定所述生物样品中一定位置处所述免疫细胞受体的存在和/或丰度。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述免疫细胞受体为T细胞受体α链。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述捕获结构域与编码所述T细胞受体α链的恒定区的核酸序列特异性结合。
78.根据权利要求76或77所述的方法，其中步骤(b)包括确定编码所述T细胞受体α链的CDR3的序列。
79.根据权利要求78所述的方法，其中步骤(b)还包括确定编码所述T细胞受体α链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。
80.根据权利要求78所述的方法，其中步骤(b)还包括确定编码所述T细胞受体α链的全长可变结构域的序列。
81.根据权利要求75所述的方法，其中所述免疫细胞受体为T细胞受体β链。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述捕获结构域与编码所述T细胞受体β链的恒定区的核酸序列特异性结合。
83.根据权利要求81或82所述的方法，其中步骤(b)包括确定编码所述T细胞受体β链的CDR3的序列。
84.根据权利要求83所述的方法，其中步骤(b)还包括确定编码所述T细胞受体β链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。
85.根据权利要求83所述的方法，其中步骤(b)还包括确定所述T细胞受体β链的全长可变结构域。
86.根据权利要求75所述的方法，其中所述免疫细胞受体为免疫球蛋白κ轻链。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述捕获结构域与编码所述免疫球蛋白κ轻链的恒定区的核酸序列特异性结合。
88.根据权利要求86或87所述的方法，其中步骤(b)包括确定编码所述免疫球蛋白κ轻链的CDR3的序列。
89.根据权利要求88所述的方法，其中步骤(b)还包括确定编码所述免疫球蛋白κ轻链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。
90.根据权利要求88所述的方法，其中步骤(b)还包括确定编码所述免疫球蛋白κ轻链的全长可变结构域的序列。
91.根据权利要求75所述的方法，其中所述免疫细胞受体为免疫球蛋白λ轻链。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述捕获结构域与编码所述免疫球蛋白λ轻链的恒定区的核酸序列特异性结合。
93.根据权利要求91或92所述的方法，其中步骤(b)包括确定编码所述免疫球蛋白λ轻链的CDR3的序列。
94.根据权利要求93所述的方法，其中步骤(b)还包括确定编码所述免疫球蛋白λ轻链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。
95.根据权利要求93所述的方法，其中步骤(b)还包括确定编码所述免疫球蛋白λ轻链的全长可变结构域的序列。
96.根据权利要求75所述的方法，其中所述免疫细胞受体为免疫球蛋白重链。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述捕获结构域与编码所述免疫球蛋白重链的恒定区的核酸序列特异性结合。
98.根据权利要求96或97所述的方法，其中步骤(b)包括确定编码所述免疫球蛋白重链的CDR3的序列。
99.根据权利要求98所述的方法，其中步骤(b)还包括确定编码所述免疫球蛋白重链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列。
100.根据权利要求98所述的方法，其中步骤(b)还包括确定编码所述免疫球蛋白重链的全长可变结构域的序列。
101.根据权利要求75所述的方法，其中所述捕获结构域与编码免疫细胞受体的核酸的poly(A)序列结合。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述免疫细胞受体为T细胞受体α链、T细胞受体β链及其组合。
103.根据权利要求101所述的方法，其中步骤(b)包括确定：编码所述T细胞受体α链的CDR3的序列、编码所述T细胞受体β链的CDR3的序列及其组合。
104.根据权利要求103所述的方法，其中步骤(b)还包括确定：编码所述T细胞受体α链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列、编码所述T细胞受体β链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列及其组合。
105.根据权利要求103所述的方法，其中步骤(b)还包括确定：编码所述T细胞受体α链的全长可变结构域的序列、编码所述T细胞受体β链的全长可变结构域的序列及其组合。
106.根据权利要求101所述的方法，其中所述免疫细胞受体为B细胞受体免疫球蛋白κ轻链、免疫球蛋白λ轻链、免疫球蛋白重链及其组合。
107.根据权利要求106所述的方法，其中步骤(b)包括确定：编码所述免疫球蛋白κ轻链的CDR3的序列、编码所述免疫球蛋白λ轻链的CDR3的序列、编码所述免疫球蛋白重链的CDR3的序列及其组合。
108.根据权利要求107所述的方法，其中步骤(b)还包括确定：编码所述免疫球蛋白κ轻链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列、编码所述免疫球蛋白λ轻链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列、编码所述免疫球蛋白重链的CDR1和CDR2中的一者或两者的序列及其组合。
109.根据权利要求107所述的方法，其中步骤(b)还包括确定：编码所述免疫球蛋白κ轻链的全长可变结构域的序列、编码所述免疫球蛋白λ轻链的全长可变结构域的序列、编码所述免疫球蛋白重链的全长可变结构域的序列及其组合。
110.根据权利要求75-109中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括使用编码所述免疫细胞受体的所述核酸作为模板延伸所述捕获探针的末端，从而生成延伸的捕获探针。
111.根据权利要求110所述的方法，其中步骤(b)包括延伸所述捕获探针的3’末端。
112.根据权利要求110或111所述的方法，其中步骤(b)还包括生成第二核酸链，所述第二核酸链包括(i)与所述空间条形码的全部或部分互补的序列，和(ii)对应于编码所述免疫细胞受体的所述核酸的全部或部分序列的序列。
113.根据权利要求75-112中任一项所述的方法，其中所述捕获探针还包含切割结构域、功能结构域、唯一分子标识符或其任何组合。
114.根据权利要求75-87中任一项所述的方法，其中所述捕获探针还包含功能结构域。
115.根据权利要求114所述的方法，其中步骤(b)还包括生成第二核酸链，所述第二核酸链包括(i)与所述功能结构域的全部或部分互补的序列，(ii)与所述空间条形码的全部或部分互补的序列，和(iii)对应于编码所述免疫细胞受体的所述核酸的全部或部分序列的序列。
116.根据权利要求75-115中任一项所述的方法，其中所述方法还包括富集编码所述免疫细胞受体的所述核酸。
117.根据权利要求116所述的方法，其中富集包括将多个杂交探针与编码所述免疫细胞受体的所述核酸杂交，其中杂交探针包含(i)与编码所述免疫细胞受体的所述核酸的一部分互补的序列和(ii)与捕获部分相互作用的结合部分。
118.根据权利要求117所述的方法，其中所述结合部分包含生物素并且所述捕获部分包含链霉亲和素。
119.根据权利要求116_118中任一项所述的方法，其中富集编码所述免疫细胞受体的所述免疫细胞受体的所述核酸还包括一个或多个封闭探针。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述一个或多个封闭探针包含与SEQ ID NO：639具有至少80％同一性的序列。
121.根据权利要求119所述的方法，其中所述一个或多个封闭探针包含与SEQ ID NO：640具有至少80％同一性的序列。
122.根据权利要求75-121中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使用(i)包含所述功能结构域的全部或部分的第一引物，其中所述功能结构域为所述第二核酸链中所述空间条形码的5’，和(ii)包含与编码所述免疫细胞受体的可变区的序列的一部分基本上互补的序列的第二引物，来扩增编码免疫细胞受体的所述核酸或其补体。
123.根据权利要求122所述的方法，所述方法还包括使用(i)包含所述功能结构域的全部或部分的所述第一引物，其中所述功能结构域为所述空间条形码的5’，和(ii)包含与编码所述免疫细胞受体的可变区的所述核酸序列的一部分基本上互补的序列的第三引物，其中所述第三引物为所述第二引物的5’，来扩增编码所述免疫细胞受体的所述核酸或其补体。
124.根据权利要求75-123中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含组织样品。
125.根据权利要求124所述的方法，其中所述组织样品为组织切片。
126.根据权利要求125所述的方法，其中所述组织切片为固定的组织切片。
127.根据权利要求126所述的方法，其中所述固定的组织切片为福尔马林固定石蜡包埋的组织切片。
128.根据权利要求125-127中任一项所述的方法，其中所述组织切片包含肿瘤区域。
129.根据权利要求75-128中任一项所述的方法，其中编码所述免疫细胞受体的所述核酸包含RNA。
130.根据权利要求129所述的方法，其中所述RNA为mRNA。
131.根据权利要求75-130中任一项所述的方法，其中编码所述免疫细胞受体的所述核酸包含DNA。
132.根据权利要求131所述的方法，其中所述DNA为基因组DNA。
133.根据权利要求75-132中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在步骤(b)之前使所述生物样品与核糖体RNA耗尽探针和线粒体RNA耗尽探针接触。
134.根据权利要求75-133中任一项所述的方法，其中所述方法还包括对所述生物样品成像。
135.根据权利要求75-134中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的所述确定包括对(i)所述空间条形码的全部或部分序列或其补体和(ii)编码所述免疫细胞受体的所述核酸的全部或部分序列或其补体测序。
136.根据权利要求75-135中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括确定所述生物样品中一定位置处所述免疫细胞受体的存在。
137.根据权利要求75-135中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括确定所述生物样品中一定位置处所述免疫细胞受体的丰度。
138.根据权利要求75-135中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括确定所述生物样品中一定位置处所述免疫细胞受体的存在和丰度。
139.根据权利要求75-135中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括确定所述生物样品中一定位置处两种或更多种免疫细胞受体的存在。
140.根据权利要求75-135中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括确定所述生物样品中一定位置处两种或更多种免疫细胞受体的丰度。
141.根据权利要求75-135中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括确定所述生物样品中一定位置处两种或更多种免疫细胞受体的存在和丰度。
142.根据权利要求139-141中任一项所述的方法，其中所述方法还包括比较所述两种或更多种免疫细胞受体。
143.根据权利要求139-142中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种免疫细胞克隆型各自为B细胞的免疫细胞受体。
144.根据权利要求139-142中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种免疫细胞克隆型各自为T细胞的免疫细胞受体。
145.根据权利要求139-142中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种免疫细胞克隆型包含T细胞的至少一种免疫细胞受体和来自B细胞的至少一种免疫细胞受体。
146.一种包括多个捕获探针的阵列，其中所述多个捕获探针的捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)与编码免疫细胞克隆型的免疫细胞受体的核酸结合的捕获结构域。
147.根据权利要求146所述的阵列，其中所述免疫细胞克隆型为T细胞克隆型。
148.根据权利要求147所述的阵列，其中所述免疫细胞受体为T细胞受体α链。
149.根据权利要求148所述的阵列，其中所述捕获结构域与编码所述T细胞受体α链的恒定区的核酸序列特异性结合。
150.根据权利要求147所述的阵列，其中所述免疫细胞受体为T细胞受体β链。
151.根据权利要求150所述的阵列，其中所述捕获结构域与编码所述T细胞受体β链的恒定区的核酸序列特异性结合。
152.根据权利要求146所述的阵列，其中所述免疫细胞克隆型为B细胞克隆型。
153.根据权利要求152所述的阵列，其中所述免疫细胞受体为免疫球蛋白κ轻链。
154.根据权利要求153所述的阵列，其中所述捕获结构域与编码所述免疫球蛋白κ轻链的恒定区的核酸序列特异性结合。
155.根据权利要求152所述的阵列，其中所述免疫细胞受体为免疫球蛋白λ轻链。
156.根据权利要求155所述的阵列，其中所述捕获结构域与编码所述免疫球蛋白λ轻链的恒定区的核酸序列特异性结合。
157.根据权利要求152所述的阵列，其中所述免疫细胞受体为免疫球蛋白重链。
158.根据权利要求157所述的阵列，其中所述捕获结构域与编码所述免疫球蛋白重链的恒定区的核酸序列特异性结合。
159.根据权利要求146-158中任一项所述的阵列，其中所述捕获探针还包含切割结构域、功能结构域、唯一分子标识符或其任何组合。
160.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
根据权利要求146-159中任一项所述的阵列；
一个或多个杂交探针，其中杂交探针包含(i)与编码免疫细胞受体的核酸基本上互补的序列和(ii)与捕获部分相互作用的结合部分；和
一个或多个封闭探针。
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