CN113366311A - 使用可加载的检测分子的高通量表位鉴定和t细胞受体特异性测定 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗原肽和诸如T细胞受体(TCR)和抗原肽反应性T细胞之类的结合伴侣之间相互作用的检测。特别地，本发明涉及提供具有无肽MHC分子的可加载的检测分子用于高通量表位鉴定和TCR特异性测定。至少一个抗原肽中的每个均由至少两个不同的可检测标记或至少一个可检测标记(核酸标记)表示。可以确定T细胞受体(TCR)或抗原肽反应性T细胞与抗原肽库之间的相互作用。无T肽MHC I类分子包含重链，所述重链包含经二硫键连接的α‑1结构域和α‑2结构域，突变型半胱氨酸残基位于α‑1结构域的氨基酸残基84或85处和突变型半胱氨酸残基位于α‑2结构域的氨基酸残基139处。还要求保护包含至少两个可加载的检测分子或至少三个可加载的检测分子的组合物，各可加载的检测分子包含不同的可检测标记。

Description

使用可加载的检测分子的高通量表位鉴定和T细胞受体特异 性测定

技术领域

本发明涉及抗原肽和结合伴侣(如T细胞受体(TCR)和抗原肽反应性T细胞)之间相互作用的检测。特别地，本发明涉及提供具有无肽MHC分子的可加载的检测分子，用于高通量表位鉴定和TCR特异性测定。

背景技术

主要的组织相容性复合体I类(MHC-1)蛋白在细胞表面以小肽片段形式显示细胞蛋白质组，以介导T细胞免疫监视，这对于抵抗细胞异常(例如病毒感染和癌症)至关重要。抗原特异性T细胞的鉴定和表征对于治疗发展和对受免疫影响的疾病的机理研究具有重要意义。使用大型pMHC分子库筛选T细胞特异性适合于可能在全基因组水平的T细胞识别分析，而不是限于选择模型抗原的选择。这种策略为疾病发展和对免疫疗法的反应所涉及的免疫特异性提供了新颖的见解，并扩展了与T细胞识别模式和TCR交叉识别有关的基础知识。

先前的方案试图扩大基于MHC多聚体的检测技术的能力，以促进在有限的生物材料中大规模表位的发现和免疫监测。

Hadrup等人(2009)和WO 2010/060439 A1描述了在基于荧光标志物的MHC多聚体的组合编码的方法。在这种方法中，为每个不同的pMHC多聚体分配了唯一的双色码，然后将其用于识别与该特定pMHC分子结合的T细胞。当使用唯一的双色代码时，任何与预定颜色组合不匹配的T细胞都会被记录为背景事件。与基于常规荧光标志物的MHC多聚体的检测方法相比，这种组合编码方法产生了低检测限，并能够提高通量，因为八个荧光团的组合产生28种唯一双色代码。

Bentzen等人(2016)和WO 2015/188839 A2描述了另一种方法，其中附接到MHC多聚体的DNA条形码形成每个pMHC表位的特异性标签。DNA条形码可设计为高达10¹⁰个不同的唯一序列的复杂度，并因此使用该技术的抗原反应性T细胞的检测不受可用标记数量的限制。

因此，基于MHC多聚体的T细胞检测方法已经从每个样品检测几个抗原特异性T细胞群体发展到并行鉴定超过1000种特异性。然而，限制这些先进T细胞检测平台的灵活性、快速性和质量保证的主要限制因素是生成了不同肽-MHC复合物(pMHC)的大型库，这些库通常为100-1000种不同的pMHC。为了克服这一挑战，已开发出肽交换技术以促进从给定的HLA或H-2分子的条件配体MHC-1的单储备中生成多种pMHC。这些策略包括使用二肽作为肽交换的催化剂，广泛使用的紫外线介导的肽交换技术以及最近开发的温度诱导的交换技术。遗憾的是，除了需要额外的肽交换过程步骤之外，交换技术还具有缺点，包括HLA特定的设计和优化，低亲和力进入肽的肽交换效率不足，仅在肽交换后才能够进行多聚化的能力以及延长的交换时间。

当前基于多聚体的T细胞检测方法的又另一个限制是主要组织相容性复合物的固有不稳定性，已知该复合物具有抗原肽依赖性寿命。pMHC的不稳定性限制了pMHC保持完整功能并因此可用于T细胞检测的窗口。pMHC复合物的不稳定性也限制了MHC-多聚体可以保持完全功能并能够有效且抗原特异性地鉴定T细胞的时间。

US 9,494,588描述了提供可以在没有抗原肽的情况下产生的突变的MHC I类分子。这种空的MHC I类分子可能潜在地用于生成高通量基于MHC的T细胞检测所需的不同肽-MHC复合物(pMHC)的大型库。然而，此方法是否适用于这种设置纯粹是推测性的而没有公开。例如，它们与具有与wt MHC分子相似的抗原特异性相互作用特性的T细胞相互作用的能力尚未得到证实。此外，尚不清楚所引入的突变是否会在结构上或功能上影响TCR-pMHC相互作用，可能导致不可靠的结果，该结果不能反映抗原肽与TCRs或抗原肽反应性T细胞之间的天然相互作用。

此外，在检测抗原肽与TCRs或抗原肽反应性T细胞之间稀有和弱相互作用时，用于基于MHC的T细胞检测测定法的所有现有技术都不一致。例如，通过流式细胞术检测组合编码技术的基于荧光的读数，因此与给定pMHC相关的信号强度是区分那些与MHC多聚体特异性相互作用的T细胞和那些不与MHC多聚体特异性相互作用的T细胞的唯一方法。因此，必不可少的是给定的T细胞结合许多MHC多聚体，以获得足够的荧光强度，从而能够进行其特异性的明确鉴定。因此，随着相互作用变弱并且较不频繁发生时，准确分辨和发现任何抗原肽相互作用变得越来越困难。这可能会导致不一致的结果。因此，检测稀有和弱相互作用的能力目前不足，这对于发现与癌症相关的抗原和突变源性的新表位尤其重要。更重要的是，对自身抗原的识别通常以低亲和力相互作用和小的T细胞群体为特征。为了检测仍然可能有助于疾病发展的这种稀有种群，需要改进的检测技术。

因此，用于高通量表位鉴定和TCR特异性确定的改进方法将是有利的。特别是，有利的是一种更灵活、灵敏且更快的方法，其中最终用户按需可以轻松生成大型抗原肽库以筛选并可靠地发现更稀有和弱相互作用，例如与癌症相关的抗原和突变源性的新表位。

发明内容

因此，本发明的目的涉及提供可以用于高通量表位鉴定和TCR特异性确定的改进的检测分子。

特别地，本发明的一个目的是提供一种方法，该方法通过产生大的抗原肽-MHC复合物(pMHC)库来解决现有技术的上述问题以及检测稀有和弱相互作用的灵敏度不足的问题。

因此，本发明的一个方面涉及用于检测样品中一个或多个抗原肽反应性T细胞的方法，该方法包括以下步骤：

i.提供可加载的检测分子，其包含至少一个无肽MHC I类分子和至少一个可检测标记，

ii.提供至少一个抗原肽，

iii.使可加载的检测分子与至少一个抗原肽接触以提供包含至少一种肽-MHC(pMHC)I类分子的加载的检测分子，

iv.使加载的检测分子与样品接触，和

v.检测加载的检测分子与一个或多个抗原肽反应性T细胞的结合，

其中至少一个抗原肽中的每一个都由以下表示：

-至少两个不同的可检测标记，或

-至少一个作为核酸标记的可检测标记。

本发明的另一方面涉及可加载的检测分子，其包含至少一个无肽MHC I类分子和核酸标记。

本发明的又另一方面是提供用于在样品中检测一个或多个抗原肽反应性T细胞的组合物，该组合物包括：

(a)至少两个可加载的检测分子，其包含至少一个无肽MHC I类分子和一个核酸标记，或

(b)至少三个可加载的检测分子，其包含至少一个无肽MHC I类分子和至少一个可检测标记，其中每个可加载的检测分子包括不同的可检测标记。

本发明的再另一方面涉及包含至少一个无肽MHC I类分子和核酸标记的可加载的检测分子或本文所述的组合物用于在样品中检测一种或多种抗原肽反应性T细胞的用途。

本发明的另一方面是提供用于在样品中检测一个或多个抗原肽反应性T细胞的试剂盒，该试剂盒包括：

i.可加载的检测分子，其包含至少一个无肽MHC I类分子和核酸标记，或本文所述的组合物，

ii.至少一个抗原肽，和

iii.任选的，使用说明书。

本发明的另一方面涉及确定T细胞受体(TCR)或抗原肽反应性T细胞与抗原肽库之间相互作用的方法，该方法包括以下步骤：

i.提供可加载的检测分子，其包含至少一个无肽MHC I类分子和核酸标记，

ii.提供抗原肽库，

iii.使可加载的检测分子与抗原肽库接触，以提供包含肽-MHC I类(pMHC)分子的加载的检测分子库，

iv.使T细胞受体(TCR)或抗原肽反应性T细胞与加载的检测分子库接触，和

v.用加载的检测分子库检测T细胞受体(TCR)或抗原肽反应性T细胞的结合。

本发明的再另一方面涉及包含至少一个无肽MHC I类分子和核酸标记的可加载的检测分子在确定T细胞受体(TCR)或抗原肽反应性T细胞和抗原肽库之间的相互作用的用途。

附图说明

图1：(A)使用来自健康供体PBMC的Cys突变型MHC和野生型MHC检测分子(PE标记的)的HLA-A*02：01(A2)限制性NLVPMVATV特异性T细胞检测的流式细胞仪分析的比较点图。2x10⁶ PBMC用对A2-NLVPMVATV病毒源性的抗原特异的Cys突变型A2检测分子或野生型A2检测分子染色。观察到可比较的抗原特异性T细胞频率(点图上的数目占总CD8+细胞的百分比)，但使用Cys突变型MHC检测分子可分离得更明亮更好。(B)比较Cys突变型MHC和野生型MHC检测分子对NLVPMVATV特异性T细胞检测的染色指数，见图1A的图。染色指数计算为(正中位数-负中位数)/(负SD*2)。Cys突变型MHC检测分子检测到的染色指数高出三倍。

图2：(A)使用来自两个不同健康供体PBMC的Cys突变型MHC和野生型MHC检测分子(APC标签)对A2-NLVPMVATV特异性T细胞进行检测的流式细胞术比较点图。2x10⁶ PBMC用对A2-NLVPMVATV病毒源性的抗原特异的Cys突变型A2检测分子或野生型A2检测分子染色。观察到可比较的抗原特异性T细胞频率(点图上的数目占总CD8+细胞的百分比)，但再次使用标记有APC荧光团的Cys突变型MHC检测分子有更明亮更好的分离。(B)比较Cys突变型MHC和野生型MHC检测分子对NLVPMVATV特异性T细胞检测的染色指数，见图2A的图。染色指数计算为(正中位数-负中位数)/(负SD*2)。与两个供体样品中的野生型MHC检测分子相比，用APC标记的Cys突变型MHC检测分子检测到的染色指数高出六至八倍。

图3：(A)使用来自健康供体PBMC的Cys突变型MHC和野生型MHC型MHC检测分子(APC标记的)检测HLA-A*02：01(A2)限制性YVLDHLIVV(EBV BRLF1)和VLEETSVML(CMV IE1)特异性T细胞的流式细胞仪分析的比较点图。Cys突变型MHC检测分子检测到与野生型MHC检测分子可比较的低频(A2-YVLDHLIVV)和高频(A2-VLEETSVML)CD8+T细胞(点图中的数目占总CD8+细胞的百分比)和更好的分离。(B)比较Cys突变型MHC和野生型MHC检测分子对A2-YVLDHLIVV和A2-VLEETSVML特异性T细胞检测的染色指数，见图3A中的图。与两种抗原特异性T细胞中的野生型MHC检测分子相比，用APC标记的Cys突变型MHC检测分子检测到的染色指数高得多。

图4：(A)使用组合编码检测的抗原特异性T细胞的流式细胞仪图。点图代表检测到的抗原特异性CD8+T细胞，灰色点代表pMHC检测分子阴性或单一颜色阳性细胞，而黑色点代表双色检测分子阳性细胞。点图比较了并行使用Cys突变型MHC和野生型MHC检测分子检测到的T细胞。将2x10⁶ PBMC健康供体PBMC用具有不同抗原特异性的两个颜色组合检测分子进行染色。在图中显示了鉴定出的两个颜色检测分子阳性的CD8细胞，并在X和Y轴上绘制了各自的颜色组合。在Cys突变型MHC和野生型MHC检测分子之间观察到了抗原特异性T细胞检测的比较频率(点图上的数目占总CD8+细胞的百分比)。(B)染色指数的倍数变化，比较用于图4A中检测到的给定抗原特异性T细胞群的每种颜色标记的Cys突变型MHC和野生型MHC检测分子。与野生型MHC检测分子相比，在所有三个抗原特异性T细胞中，Cys突变型MHC的染色指数观察到更高的倍数变化。

图5：(A)表示使用来自黑素瘤患者的扩增的TIL的Cys突变型MHC和野生型MHC检测分子检测到的黑素瘤相关抗原特异性T细胞的点图。使用组合编码方法筛选了12种黑色素瘤相关抗原肽的库。点图显示了黑色素瘤患者样品中两个已识别的具有各自的颜色组合的T细胞群，并比较了两种类型的T细胞检测分子之间的识别频率(点图上的数目占总CD8+细胞的百分比)。(B)黑色素瘤相关抗原特异性T细胞的染色指数的倍数变化，如图5A的点图所示。点图上的数目表示pMHC多聚体阳性细胞占总CD8+T细胞的百分比。对于两种类型的抗原特异性T细胞，与野生型MHC检测分子相比，Cys突变型MHC的染色指数观察到更高的倍数变化。

图6：(A)使用Cys突变型MHC I分子组装的可加载的检测分子的示意图。可加载的Cys突变型检测分子存储在-20℃并按需加载肽。(B)可加载的多聚体的肽加载时间和肽浓度优化。将FLU MP GILGFVFTL抗原肽以四种不同的抗原浓度(0.1、1、10和100μM)在不同的时间点加载到Cys突变型A2检测分子上。在每种给定肽浓度的时间点后，通过染色2x10⁶细胞，从健康供体PBMC中检测到GILGFVFTL特异性T细胞。对于每种测试的肽浓度，将检测为检测分子阳性的CD8+T细胞的频率针对孵育时间作图。只需一分钟，即可从可加载的Cys突变型MHC检测分子转换功能性抗原特异性加载的检测分子。

图7：使用可加载的Cys突变型MHC检测分子通过组合编码策略鉴定的黑色素瘤TIL中的新抗原特异性T细胞。产生了用于43个A2限制肽(新抗原)的pMHC Cys突变型检测分子，每种均以两种颜色组合。将可加载的Cys突变型A2检测分子与100μM肽孵育15分钟，然后对2x10⁶黑色素瘤患者的TIL进行染色。点图显示了在该患者样品中鉴定出的三个新抗原特异性T细胞群；每个都显示有指示的荧光染料和肽序列。下划线并加粗了新抗原的突变氨基酸位置。点图上的数目表示pMHC多聚体阳性细胞占总CD8+T细胞的百分比。

图8：在用Cys突变型A2分子(图8A)或野生型MHC A2分子(图8B)制备的检测分子之间比较了抗原肽-MHC稳定性(pMHC)。A2-GILGGFVFTL(FLU MP)特异性检测分子是使用野生型A2或半胱氨酸突变A2(使用可加载的多聚体)制备的。在制备pMHC多聚体后，使用分子量截留旋转柱去除多余的肽，并将多聚体在三个不同的温度下孵育指定的时间点，然后从健康供体PBMC中测量T细胞的检测效率。以T细胞检测效率衡量的肽解离速率证明了Cys突变型MHC分子的优异稳定性。在37℃时，用野生型MHC A2制备的检测分子从12小时开始显示出降低的T细胞检测效率，而Cys突变型A2检测分子在37℃下直至48小时的时间点仍具有相同的检测效率。

图9：在高通量条形码方法中用于抗原特异性T细胞检测的Cys突变型A2分子。筛选了175种抗原(167种与癌症相关的抗原和8种病毒源性的抗原)的库，以鉴定来自健康供体PBMC的抗原特异性T细胞。使用Cys突变型A2或野生型A2分子组装检测分子。每个抗原特异性检测分子都标记有唯一的DNA条形码。用5x10⁶健康供体PBMC对175个抗原特异性检测分子的合并库进行染色。由Cys突变型A2分子和野生型A2分子制成的检测分子对所有175个pMHC特异性(x轴)的比较结果显示在图上。y轴上绘制的数据是DNA条形码检测分子的-log10(P)对于pMHC相关的DNA条形码)。x＝3处的虚线(-log10(.001)代表所选阈值，在此之上的所有读数均被认为对已鉴定的抗原特异性T细胞很重要。

图10：使用Cys突变型A2分子以高通量条形码方法鉴定的癌症相关抗原特异性CD8T细胞。筛选了175个抗原(167个与癌症相关的抗原和8个病毒源性的抗原)的库，以鉴定两个黑色素瘤患者TIL中的抗原特异性T细胞。使用Cys突变型A2分子或野生型A2分子组装检测分子。每个抗原特异性检测分子都标记有唯一的DNA条形码。用3-5x10⁶黑色素瘤患者TIL对175个抗原特异性T细胞检测分子的合并库进行染色。由Cys突变型A2分子和野生型A2分子制成的检测分子对所有175个pMHC特异性(x轴)的比较结果显示在图上。y轴上绘制的数据是DNA条形码检测分子的-log10(P)(相对于pMHC相关的DNA条形码)。x＝3处的虚线(-log10(0.001))代表所选阈值，在此之上的所有读数均被认为对已鉴定的抗原特异性T细胞很重要。在两个黑色素瘤患者样品中，只有Cys突变型MHC检测分子(三角形)才能识别与癌症相关的抗原特异性T细胞。

图11：Cys突变型A2分子和野生型A2分子的TCR识别图谱的比较。香农徽标(shannon logos)显示了在肽的每个位置用于pMHC-TCR相互作用的氨基酸需求。使用具有192个肽-A2多聚体的DNA条形码标记的库生成TCR识别图谱，该库具有原始KLLEIAPNY肽的氨基酸变异。使用从Cys突变型A2分子或从野生型A2分子制备的pMHC右旋体，对两个T细胞克隆进行用于这些肽变异中每个的TCR识别，该两个T细胞识别默克尔细胞多瘤病毒源性的(Merkel Cell Polyomavirus-derived)抗原决定簇A2-KLLEIAPNY的。描绘了使用Cys突变型A2分子或野生型A2来显示两个T细胞克隆的TCR指纹的香农徽标。

现在将在下面更详细地描述本发明。

具体实施方式

定义

在进一步详细讨论本发明之前，将首先定义以下术语和约定：

检测分子

在本语境中，术语“检测分子”是指可用于检测抗原肽与T细胞受体(TCR)或抗原肽反应性T细胞之间的相互作用的实体。

如本文所述的检测分子以两种形式存在；(i)包含一种或多种未结合任何抗原肽的MHC I类分子的可加载形式(即无肽/空MHC分子)，以及(ii)包含一种或多种I类肽-MHC(pMHC)的可加载形式分子。

检测分子还包含一种或多种可检测标记，其允许检测由检测分子提供的抗原肽与TCR或抗原肽反应性T细胞之间的相互作用。因此，检测分子可以例如，用于筛选(i)T细胞群中一种或多种抗原肽反应性T细胞和(ii)通过筛选大型抗原特异性检测分子库的TCR-pMHC相互作用来进行TCR指纹分析。

检测分子可包含连接分子和/或支架分子，其上附接有一个或多个无肽MHC I类分子和可检测标记。如果检测分子包含一个以上的MHC分子，则可以将其指定为多聚体。

在检测分子的一种变体中，连接分子是链霉亲和素，其附接有四个的MHC分子，从而形成四聚体。备选地，检测分子也可包含多糖支架，MHC分子直接或通过连接分子附接至该多糖支架。多糖可以是葡聚糖。

MHC和Cys突变型MHC

在本语境中，术语“MHC”是指主要的组织相容性复合物，其是一种蛋白质复合物，主要功能是结合源自病原体的抗原肽并将其展示在细胞表面上以被适当的T细胞识别。

MHC分子有两大类，MHC I类分子和IMHC I类分子。在本文中，“MHC”是指MHC I类分子。MHC I类分子由MHC基因产生的α链(重链)和β2微糖蛋白基因产生的β链(轻链或β2微糖蛋白)组成。

重链包含三个结构域，分别表示为α-1，α-2和α-3。α-1结构域位于非共价结合的β2-微球蛋白附近。α-3结构域是跨膜结构域，其将MHC I类分子锚定在细胞膜中。α-1和α-2结构域一起形成异二聚体，该异二聚体含有结合特定抗原肽的肽结合槽。肽结合槽的氨基酸序列是关于哪种特异性抗原肽结合至MHC I类分子的决定因素。

自然地，MHC I类分子的重链含有四个保守的半胱氨酸残基，导致形成两个二硫键。在MHC I类分子正确折叠的构象中，一个二硫键位于Cys101和Cys164之间的α-2结构域内，另一个二硫键位于Cys203和Cys259之间的α-3结构域内，其中氨基酸编号参考不含信号肽的HLA-A。

在本发明中，通过重组引入两个半胱氨酸残基而在α-1结构域和α-2结构域之间引入了另外的二硫键。因此，本文中使用术语“Cys突变型MHC”，是指MHC I类分子的二硫键稳定形式，其可以在抗原肽不结合到MHC分子的肽裂口的情况下制备。

因此，“Cys突变型MHC”可以是空的或与抗原肽结合。因此，在本语境中，没有抗原肽的空MHC分子(只能是Cys突变型MHC)和pMHC分子是有区别的，pMHC分子是指结合了抗原肽的MHC分子(可以是野生型(wt)MHC或Cys-突变型MHC)。

在人类中，MHC复合物由人类白细胞抗原(HLA)基因复合物编码。因此，在本语境中，术语“MHC”也涵盖“HLA”。HLA存在三种主要类型，因此，在本语境中，MHC包括但不限于在HLA-A，HLA-B和HLA-C的基因位点中编码的HLA等位基因。类似地，MHC包括但不限于MHC I类分子，例如HLA-E，HLA-F，HLA-G，HLA-H，MIC A，MIC B，CD1d，ULBP-1，ULBP-2和ULBP-3。

无肽MHC I类分子

在本语境中，术语“无肽MHC I类分子”是指未结合抗原肽的MHC I类分子。术语“无肽MHC I类分子”，“空MHC I类分子”和“肽接收形MHC I类分子”在本文可互换使用。

pMHC

在本语境中，术语“pMHC”是指与抗原肽结合的如上定义的MHC分子。术语“pMHC”可以指抗原肽与其结合的wt MHC或Cys突变型MHC。

突变型半胱氨酸残基

在本语境中，术语“突变型半胱氨酸残基”是指已人工引入MHC I类分子的重链中的半胱氨酸残基。因此，突变型半胱氨酸残基不存在于相应的野生型MHC I类分子的重链中。

突变型半胱氨酸残基可通过本领域技术人员已知的诱变技术，例如定点诱变引入。

抗原肽

在本语境中，术语“抗原肽”是指能够结合主要组织相容性复合物(MHC)分子以形成肽-MHC(pMHC)复合物的肽。pMHC复合物可以将抗原肽呈递给免疫细胞，以诱导T细胞受体依赖性免疫反应。MHC分子可以是MHC I类分子。

在本语境中，短语“不同的抗原肽”是指具有不同氨基酸序列的抗原肽。

在本语境中，术语“靶抗原肽”是指作为药物候选物靶标的抗原肽。因此，药物候选物可以是但不限于TCR，抗原肽反应性T细胞，小分子药物或天然化合物。为了鉴定任何潜在的脱靶问题，可以产生基于靶抗原肽的单位置突变的抗原肽库，并筛选与药物候选物的任何意外相互作用。药物候选物的这些指纹可用于评估不良反应的风险。

靶抗原肽可以是但不限于癌症相关表位，病毒表位，自身表位或其他临床相关靶标。

表位

在本语境中，术语“表位”意指由T细胞的TCR或另一种结合伴侣例如药物候选物的TCR识别的抗原决定簇。pMHC呈现的表位对任何外源物质都具有高度特异性，并且与TCR的相互作用确保了以肽-MHC导向的方式对特定T细胞的有效扩展和功能刺激。

库

在本语境中，术语“库”是指多个实体。因此，库可以是多个(或集合)不同的抗原肽或核酸标记。

可检测标记

在本语境中，术语“可检测标记”是指可通过光谱，光化学，生物化学，免疫化学或化学方式检测的部分。可检测标记可产生可测量的信号，例如荧光，放射性或生色信号，其可以用于定量样品中结合的可检测部分的量。可检测标记也可以是分子编码的标记，，例如核酸标记，其可以通过测序来解密。

可检测标记可以通过MHC分子或连接分子共价或通过离子，范德华或氢键附接到检测分子。可检测标记的例子包括但不限于荧光标志物，核酸标记，放射性同位素，磁性标记物和金属标记。

在本语境中，短语“不同的可检测标记”是指产生不同读数的可检测标记，例如不同波长的荧光发射或不同序列的核酸。不同的可检测标记可以属于同一类别的标记，例如两个不同的荧光团，或者可以属于两个不同类别的标记，例如放射性同位素和核酸标记。

样品

在本语境中，术语“样品”是指包含T细胞群的任何溶液或固体部分。T细胞群可以包含具有不同特异性的T细胞。

样品不限于任何特定来源，而可以是外周血单核细胞，肿瘤，组织，骨髓，活组织检查，血清，血液，血浆，唾液，淋巴液，胸膜液，脊柱液和滑液。样品可以从受试者中提取。从个体提取的样品可以进行本文所述的方法以鉴定和评估癌症和疾病期间或免疫疗法之后的免疫应答。

连接分子

在本语境中，术语“连接分子”是指作为检测分子的一部分并且附接有一个或多个MHC分子的分子实体。连接分子可以非共价结合至位于MHC分子上的亲和标签。

连接分子的实例包括但不限于链霉亲和素，抗生物素蛋白，金属离子螯合物，抗体等。

连接分子也可以附接到支架分子上，例如多糖，如右旋糖酐。从而，检测分子可包含附接至支架分子的一个以上的连接分子，例如至少五个连接分子，例如至少10个连接分子，例如至少15个连接分子。

亲和标签

在本语境中，术语“亲和标签”是指位于MHC分子上的部分。亲和标签通过非共价相互作用高度特异性地与连接分子结合。亲和标签的实例包括但不限于生物素，抗体表位，His标签，链霉亲和素(streptavidin)，链霉亲和素(strep-tactin)，聚组氨酸，肽，半抗原和金属离子螯合物等。

非共价相互作用

在本语境中，术语“非共价相互作用”是指通过除共价键以外的其他相互作用的任何键。非共价键可以通过例如氢键，疏水相互作用，亲水相互作用，离子相互作用，范德华力，氢键及其组合形成。

条形码区域

在本语境中，术语“条形码区域”是指形成核酸标记的一部分的区域。条形码区域包含多个连续的核酸，其用作可用于在扩增和/或测序时识别核酸标记所附接的检测分子的代码。

核酸标记库中的每个成员均包含具有唯一核苷酸序列的唯一条形码区域，该序列允许识别核酸标记库中的每个单个成员以及与其附接的检测分子。唯一条形码区域能够监控检测分子与它们结合的靶标(例如T CR或抗原肽反应性T细胞)之间的相互作用。

条形码区域的长度可以根据核酸标记库的大小而变化。因此，条形码区域不限于任何特定的长度，而是可以包含5-100个核苷酸，优选5-30个核苷酸。

条形码区域可以通过PCR扩增。为此，条形码区域可侧接能够扩增条形码区域的引物区域(正向和反向)。引物区域位于核酸标记的3'末端和5'末端，条形码区域位于引物区域之间。

唯一分子识别码(UMI)区

在本语境中，术语“唯一分子识别码(UMI)区”是指核酸标记的区域，其可用于确定扩增后特定序列的寡核苷酸源的初始数目。UMI区是核苷酸的随机序列，其可包含2-4、4-6、6-8或8-10个核苷酸碱基。对于非常大的库，UMI区可还含有10个以上的核苷酸碱基。

固体基质

在本语境中，术语“固体基质”是指检测分子可以附接于其上的任何类型的不溶材料。检测分子可以共价或可逆地附接在固体基质上。附接在固体基质上的检测分子可以容易地从过量的试剂或溶剂分离(例如通过过滤，色谱，离心等)。

固体基质包括但不限于微阵列，载玻片，珠子，孔板，颗粒，过滤器，凝胶，试管和培养皿。

包含固定化的可加载检测分子的固体基质可用于快速生成阵列的抗原肽库，以用于指纹识别药物候选物，例如TCR或抗原肽反应性T细胞。

序列同一性

在本语境中，术语“序列同一性”在本文中定义为分别在核苷酸，碱基或氨基酸水平上基因或蛋白质之间的序列同一性。具体地，如果DNA和RNA序列的转录物可以被转录成相同的RNA序列，则认为该DNA和RNA序列是相同的。

因此，在本语境中，“序列同一性”是蛋白质之间在氨基酸水平上的同一性的度量，以及核酸之间在核苷酸水平上的同一性的度量。当序列比对时，可以通过比较每个序列中给定位置的氨基酸序列来确定蛋白质序列同一性。类似地，当序列比对时，可以通过比较每个序列中给定位置的核苷酸序列来确定核酸序列同一性。

为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分比，将序列进行比对以达到最佳比较目的(例如，可以在第一氨基酸或核酸序列的序列中引入空位以与第二个氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比是该序列共享的相同位置数的函数(即，％同一性＝相同位置数/位置总数(例如，重叠位置)×100)。在一个实施方式中，两个序列的长度相同。

在另一个实施方式中，两个序列具有不同的长度，并且空位被视为不同的位置。可以手动比对序列并计算相同氨基酸的数量。备选地，可以使用数学算法来完成用于确定同一性百分比的两个序列的比对。这种算法被并入(Altschul等人，1990)的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序进行，得分＝100，字长＝12，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序进行，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。

为了获得用于比较目的的空位比对，可以利用Gapped BLAST。备选地，可以使用PSI-Blast执行迭代搜索，该搜索可以检测分子之间的远距离关系。当使用NBLAST，XBLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。备选地，可以在序列比对后，例如在序列比对后，计算序列同一性。通过EMBL数据库(www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST)中的BLAST程序进行。通常，相对于例如的默认设置，可以使用“得分矩阵”和“空位罚分”进行比对。在本发明的语境中，BLASTN和PSI BLAST默认设置可以是有利的。

可以使用与上述类似的技术在允许或不允许空位的情况下确定两个序列之间的同一性百分比。在计算同一性百分比时，仅计算完全匹配项。因此，本发明的实施方式涉及具有一定程度的序列变异的本发明的序列。

灵活，快速，灵敏地筛选抗原肽与TCR或抗原肽反应性T细胞相互作用的方法

T细胞介导的肽主要组织相容性复合物(pMHC)I类和II类分子的识别对于控制细胞内病原体和癌症，以及刺激和维持有效的细胞毒性反应至关重要。这种相互作用也可能在自身免疫性疾病的发展中起作用。对这种机制的新颖见解对于理解疾病的发展和建立新的治疗策略至关重要。自Altman等人(1996)的首次报道显示I类pMHC分子的四聚化为T细胞受体(TCR)-pMHC相互作用提供了足够的稳定性，从而允许使用流式细胞仪检测结合MHC多聚体的T细胞，MHC多聚体已被用于检测抗原反应性T细胞。已经开发了许多方法，目的是提供用于筛选pMHC-TCR相互作用的快速可靠的平台。已经探索了基于MHC多聚体并包含不同类型标记的检测分子。

然而，将基于MHC抗原呈递的技术开发到具有高灵敏度的真正高通量平台的持续挑战仍然存在。这是因为在没有抗原肽的情况下不可能重折叠MHC分子，因此其生产是复杂且昂贵的。对于每种要筛选的抗原肽，不仅存在数千种MHC I类同种异型，而且还必须产生新的个性化pMHC多聚体。产生不带有抗原肽的MHC分子，而是在组装检测分子之前根据需要添加抗原肽，将更加有效和灵活。产生包含MHC分子而没有抗原肽的完全组装的检测分子，并根据需要添加抗原肽将是更加有利的。

因此，为了提供用于T细胞检测的高通量方法，本发明的检测分子可提供有空的MHC I类分子，在产生检测分子之后可以向其中添加抗原肽。可以通过人工引入连接重链的α-1和α-2结构域的二硫键来稳定MHC I类分子，从而产生Cys突变型MHC变体。二硫键位于C端肽结合袋远端的肽结合槽之外。MHC I类分子的这种结构变化模仿了结合的特异性抗原肽的构象和动态作用，从而稳定了MHC I类分子。

天然的MHC I类分子以特异性亲和力结合各种序列的肽。这是通过在形成肽结合槽的口袋(其促进肽结合，通常是MHC结合槽的A和F口袋)的末端使用保守的氨基酸来来实现的。这些结合口袋决定了抗原肽结合的一组要求，通常被称为锚定基序(通常位置2或3，以及肽的c端位置)。尽管天然的MHC I类分子通过锚定基序的识别结合许多不同的抗原肽，但是每个等位基因仅以高亲和力结合所有可用抗原肽的一个独特(distinct)子集。然而，由于Cys突变型MHC分子的人工引入的二硫键模拟了所结合的特异性抗原肽的构象和动态作用，因此本文所述的检测分子可以用能够结合多种抗原肽的无肽MHC I类分子产生。这些即用型可加载的检测分子，可以通过一步添加肽而转化为包含抗原特异性I类pMHC分子的加载的检测分子，与最新的抗原特异性T-细胞检测平台完美匹配，该平台需要快速生成大型MHC多聚体阵列。

此外，发明人已经发现，包含与Cys突变型MHC分子结合的抗原肽的检测分子在延长的时间段内是稳定的，并且与包含常规pMHC分子的检测分子相比具有更好的性能(即更高的灵敏度)。因此，改进的检测分子对于快速和有效地评估T细胞识别例如用于个性化免疫疗法将具有很大的优势。

本文描述了包含无肽MHC I类分子的检测分子，其可以与抗原肽在一个快速步骤中组装。检测分子可用于改善TCR或T细胞的检测，最终使更稀有和更弱的相互作用的鉴定成为可能。因此，本发明的第一方面涉及用于在样品中检测一个或多个抗原肽反应性T细胞的方法，该方法包括以下步骤：

i.提供可加载的检测分子，其包含至少一个无肽MHC I类分子和至少一个可检测标记，

ii.提供至少一个抗原肽，

iii.使可加载的检测分子与至少一个抗原肽接触以提供包含至少一个肽-MHC(pMHC)I类分子的加载的检测分子，

iv.使加载的检测分子与样品接触，和

v.检测加载的检测分子与一个或多个抗原肽反应性T细胞的结合，

其中至少一个抗原肽中的每一个都由以下表示：

-至少两个不同的可检测标记，或

-至少一个作为核酸标记的可检测标记。

可以通过人工引入跨越MHC I类分子重链内的α-1结构域和α-2结构域的二硫键来稳定无肽MHC I类分子。因此，本发明的优选实施方式涉及本文所述的方法，其中无肽MHC I类分子包含重链，该重链包含通过二硫键连接的α-1结构域和α-2结构域。

这样的修饰可以通过本领域技术人员已知的诱变技术，例如定点诱变来进行。具体地，在重链的氨基酸序列中引入两个突变型半胱氨酸残基以使得能够在α-1和α-2结构域之间形成二硫键。因此，本发明的一个实施方式涉及如本文所述的方法，其中在位于α-1结构域中的突变型半胱氨酸残基与位于α-2结构域中的突变型半胱氨酸残基之间形成二硫键。

优选地，选择诱变的位置，以使得置于α-1和α-2结构域中的所得突变型半胱氨酸残基彼此之间处于一空间距离内，该空间距离在正常蛋白质折叠条件下将能够形成二硫键。因此，本发明的实施方式涉及本文所述的方法，其中位于α-1结构域中的突变型半胱氨酸残基与位于α-2结构域中的突变型半胱氨酸残基之间的空间距离为2至10埃，例如在2至8埃之间，优选在2至5埃之间。

本发明的另一个实施方式涉及本文所述的方法，其中该重链包含选自以下的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：1，或

(b)与(a)中的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，和

其中氨基酸序列包含位于α-1结构域中的突变型半胱氨酸残基和位于α-2结构域中的突变型半胱氨酸残基。

本发明的另一个实施方式涉及本文所述的方法，其中该重链包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：

(a)SEQ ID NO：1，或

(b)与(a)中的序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，例如与(a)中的序列具有至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性，和

其中所述氨基酸序列包含位于α-1结构域中的突变型半胱氨酸残基和位于α-2结构域中的突变型半胱氨酸残基。

两个半胱氨酸残基的优选突变包括对139位氨基酸和84或85位氨基酸的修饰。139位氨基酸位于重链的α-2结构域，且在许多情况下是丙氨酸残基。84或85位的氨基酸位于重链的α-1结构域，且在许多情况下是酪氨酸残基。半胱氨酸突变可通过使用标准遗传工程通过重链基因序列的修饰以氨基酸置换来引入。因此，本发明的优选实施方式涉及如本文所述的方法，其中α-1结构域中的突变型半胱氨酸残基位于氨基酸残基84或85处，而位于α-2结构域中的突变型半胱氨酸残基位于氨基酸残基139处。

在折叠MHC I类分子时，在Cys-84或Cys-85与Cys-139之间形成二硫键。新形成的二硫键稳定MHC I类分子，因此在不存在抗原肽的情况下仍可在溶液中保持稳定。半胱氨酸突变残基的引入可以应用于任何类型的MHC I类分子。因此，本发明的一个实施方式涉及本文所述的方法，其中该至少一个无肽MHC I类分子是无脊椎动物的无肽MHC I类分子，例如人，鼠，大鼠，猪，牛或禽类分子。本发明的另一个实施方式涉及本文所述的方法，其中无肽MHC I类分子是人分子。本发明的另一个实施方式涉及本文所述的方法，其中无肽MHC I类分子基于选自以下构成的群组中的MCH分子：HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-E，HLA-F，HLA-G，HLA-H，MIC A，MIC B，CD1d，ULBP-1，ULBP-2和ULBP-3。

本文所述的方法也适用于与源自小鼠的无肽MHC分子一起使用。该小鼠MHC分子被称为H-2复合物。因此，本发明的一个实施方式涉及如本文所述的方法，其中重链是H-2分子，例如H-2Kb或H-2Db。本发明的另一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述重链包含选自以下的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13中的任何一个，或

(b)与(a)中任一序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

无肽MHC I类分子的优选变体包括HLA-A，HLA-B和H-2，每个均包含两个突变型半胱氨酸残基。因此，本发明的一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述重链包含选自以下的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：2-13中的任何一个，或

(b)与(a)中任一序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，和

其中氨基酸序列包含位于α-1结构域中的突变型半胱氨酸残基和位于α-2结构域中的突变型半胱氨酸残基。

本发明的另一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述重链包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：

(a)SEQ ID NO：2-13中的任何一个，或

(b)与(a)中任何一个序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，例如与(a)中任一序列至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性，和

其中氨基酸序列包含位于α-1结构域中的突变型半胱氨酸残基和位于α-2结构域中的突变型半胱氨酸残基。

注意，措辞“SEQ ID NO：2-13”应理解为“SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13”。

本发明的另一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述重链包含选自以下的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：2-11中的任何一个，或

(b)与(a)中任一序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

本发明的又一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述重链包含选自以下的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：2-6中的任何一个，或

(b)与(a)中任一序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

用于T细胞检测的HLA等位基因被广泛利用的是HLA-A 02:01等位基因。因此，本发明的优选实施方式涉及本文所述的方法，其中重链包含选自以下的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：2，或

(b)与(a)中的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

本发明的另一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述重链包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：

(a)SEQ ID NO：2，或

(b)与(a)中的序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，例如与(a)中的序列具有至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性。

自然地，重链与β2-微球蛋白分子(B2M)缔合形成MHC I类分子。具体而言，重链的α-3结构域与B2M相邻定位。因此，本发明的一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述至少一个无肽MHC I类分子包含β2-微球蛋白分子。

本发明的另一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述β2-微球蛋白分子包含选自以下的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：15，或

(b)与(a)中的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

无肽MHC I类分子也可以作为最终的融合蛋白提供，其中B2M通过接头连接至重链。接头优选是肽接头。因此，本发明的一个实施方式涉及如本文所述的方法，其中所述至少一个无肽MHC I类分子包含选自以下的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：16，或

(b)与(a)中的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

本发明的检测分子可以以复杂分子的形式提供，其还包含适合于组装的连接分子，例如单个检测分子中的若干无肽MHC I类分子。因此，本发明的一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述可加载的检测分子包含至少一个连接分子，至少一个无肽MHC I类分子和至少一个可检测标记。本发明的另一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述至少一个无肽MHC I类分子连接至连接分子。

连接分子提供了灵活的模板，可以以模块化的方式将无亲和标签的无肽MHC I类分子固定在该模板上。亲和标签是通过但不限于非共价相互作用与结合分子特异性结合的分子种类。通过将亲和标签附接到每个无肽MHC I类分子上，因此很容易组装定制的可附载的检测分子。因此，本发明的优选实施方式涉及本文所述的方法，其中无肽MHC I类分子包含亲和标签。

本发明的另一个实施方式涉及如本文所述的方法，其中无肽MHC I类分子通过连接分子与无肽MHC I类上的亲和标签之间的非共价相互作用而附接至连接分子。

许多已知的亲和标签和连接分子的兼容对可用于本发明，包括但不限于生物素/链霉亲和素，生物素/亲和素，生物素/中性亲和素，生物素/链霉亲和素，聚组氨酸/金属离子螯合物，肽/抗体，谷胱甘肽-S-转移酶/谷胱甘肽，表位/抗体，麦芽糖结合蛋白/淀粉酶和麦芽糖结合蛋白/麦芽糖。其他已知的亲和标签和连接分子的兼容对也可用于本发明。本发明的一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述亲和标签选自有生物素，抗体表位，His标签，链霉亲和素，链霉亲和素，聚组氨酸，肽，半抗原和金属离子螯合物构成的群组。本发明的另一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述连接分子选自由链霉亲和素，抗生物素蛋白，金属离子螯合物和抗体构成的群组。本发明的一个优选实施方式涉及本文所述的方法，其中连接分子是链霉亲和素，并且亲和标签是生物素。

亲和标签(例如生物素)被置于MHC I类分子上。生物素与重链的附接可以通过包含用于重链生物素化的手柄(例如Avi标签)来实现。因此，本发明的一个实施方式涉及本文所述的方法，其中重链包含Avi标签。本发明的另一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述重链包含选自以下的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：14，或

(b)与(a)中的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

在本发明的一个变体中，检测分子包括支架分子，连接分子或无肽MHC I类分子可以结合到该支架分子上。通常，在该变体中，无肽MHC I类分子将附接于连接分子，其继而附接于支架分子。这些附接可以是共价或非共价连接，优选为非共价连接。支架分子可以是但不限于多糖，例如葡聚糖。因此，本发明的一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述可加载的检测分子包括支架分子，所述支架分子上附接有至少一个连接分子，所述至少一个连接分子包含至少一个无肽MHC I类分子和至少一个可检测标记。本发明的另一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述支架分子是葡聚糖，所述连接分子是链霉亲和素。

其他合适的支架分子的实例包括但不限于多糖，合成多糖，乙烯基聚合物，聚乙二醇，聚丙二醇，源性的纤维素，链霉亲和素和聚链霉亲和素。

可以向可加载的检测分子提供多于一个的无肽MHC I类分子，以确保检测分子与样品中的抗原肽反应性T细胞充分结合。MHC多聚体已被广泛使用了近二十年，尤其是MHC四聚体被认为是T细胞检测技术中的最新技术。因此，本发明的一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述可加载的检测分子包含至少两个无肽MHC I类分子，例如至少三个无肽MHCI类分子，优选四个无肽MHC I类类分子。本发明的一个优选实施方式涉及本文所述的方法，其中所述可加载的检测分子包含通过链霉亲和素和每种无肽MHC I类分子上的生物素标签之间的非共价相互作用而附接到链霉亲和素的四个无肽MHC I类分子。

可加载的检测分子包含至少一个可检测标记，其可以附接到连接分子，无肽MHC I类分子或支架分子。优选地，可检测标记附接于连接分子。因此，本发明的一个实施方式涉及如本文所述的方法，其中所述至少一个可检测标记附接于所述连接分子。可检测标记的附接可以是共价的或非共价的。

每个检测分子的可检测标记的数量可以根据检测方式而变化。对于其中至少一个抗原肽中的每一个由至少两个不同的可检测标记代表的检测，每个检测分子可仅包含单个可检测标记，例如荧光标志物或放射性同位素。因此，本发明的一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述检测分子包含单个可检测标记。对于其中至少一个抗原肽中的每一个均由至少一个可检测标记(其是核酸标记)代表的检测，除所述核酸标记外，每个检测分子还可包含另外的可检测标记。因此，本发明的一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述检测分子包含核酸标记和至少一个可检测标记。本发明的一个优选实施方式涉及本文所述的方法，其中所述检测分子包含核酸标记和至少一种荧光标志物，优选一个荧光标志物。

由于可加载的检测分子是在未结合抗原肽的情况下组装的，因此非常适合在使用前立即按需快速生成大型库。根据筛选设置，在测定中可能需要不同数量的抗原肽。在一些测定中，可能优选仅筛选少量非常特定类型的T细胞，而其他测定可能旨在平行鉴定大量选择的不同T细胞。因此，本发明的一个实施方式涉及本文所述的方法，其中在步骤ii)中提供了至少两个不同的抗原肽，例如至少三个，例如至少四个，例如至少五个，例如至少六个，例如至少七个，例如至少八个，例如至少九个，例如至少十个，例如至少十五个，例如至少二十个，例如至少二十五个，例如至少十个，例如至少十个，例如至少二十个，例如至少二十个，例如至少五十个，例如至少一百个不同的抗原肽。然而，利用可加载的检测分子的方法也适用于较大的库。因此，本发明的另一个实施方式涉及本文所述的方法，其中在步骤ii)中提供了至少1.000个不同的抗原肽，例如10.000，例如100.000，例如1.000.000个不同的抗原肽。

为了同时对许多不同的抗原肽进行高通量筛选的目的，应当理解，产生了许多不同的加载的检测分子并与样品接触。因此，本发明的一个实施方式涉及本文所述的方法，其中提供了多个可加载的检测分子。本发明的另一个实施方式涉及本文所述的方法，其中使样品与多个或不同的加载的检测分子的库接触。

pMHC分子呈递的抗原肽最终决定了将通过本文所述的方法鉴定出哪种类型的T细胞。适用于根据本发明的aAPC支架的抗原肽可以基本上来自任何来源。抗原源可以包括但不限于人，病毒，细菌，寄生虫，植物，真菌或肿瘤。因此，本发明的实施方式涉及如本文所述的方法，其中pMHC分子的抗原肽源自选自由人，病毒，细菌，寄生虫，植物，真菌和肿瘤构成的群组的来源。

抗原肽可以是例如，病毒或肿瘤细胞的已知的免疫原性表位，因此能够检测到对该抗原有反应的T细胞的存在，并随后诊断出病毒感染或癌症。抗原肽也可以是未知的表位，对该表位有反应的T细胞的检测表明该肽中存在免疫原性氨基酸序列，从而使得能够鉴定例如在多肽中的免疫原性区域或表位。

在本文描述的方法的一种变型中，遵循组合编码方法，向可加载的检测分子提供至少一个可检测标记，并且抗原由至少两个不同标记的检测分子表示或编码。因此，每个单独的抗原肽被加载在至少两个不同的检测分子上，每个分子都包含不同的可检测标记，例如不同的荧光标志物或放射性同位素。

可加载的检测分子可以具有至少两个不同的可检测标记，例如三个，四个，五个，六个，七个或八个不同的可检测标记。因此，抗原肽可以由一个多重标记的检测分子表示。在该方法的该变体中，将每个抗原肽加载到包含两个不同的可检测标记(例如不同的荧光标志物)的不同检测分子上。

因此，本发明的一个实施方式涉及如本文所述的方法，其中所述至少一个抗原肽由至少两个不同的可检测标记表示，并且加载的检测分子与一种或多种抗原肽反应性T细胞的结合是通过检测经由加载的检测分子结合到抗原反应性T细胞的至少两个不同的可检测标记的存在来检测。本发明的一个优选实施方式涉及如本文所述的方法，其中每个单独的抗原肽被加载在至少两个不同的检测分子上，每个分子包含不同的可检测标记。本发明的另一个优选实施方式涉及如本文所述的方法，其中每个抗原肽被加载到包含两个不同可检测标记的不同检测分子上。

检测分子与抗原肽反应性T细胞之间的相互作用是通过可检测标记产生的读数进行检测。原则上，该方法可以使用任何类型的可检测标记。因此，本文描述的方法可以单独使用或彼此组合地使用不同类型的可检测标记的选择来应用。因此，本发明的实施方式涉及本文所述的方法，其中所述至少两个不同的可检测标记选自由荧光标志物，放射性同位素，磁性标记物和金属标记构成的群组。这可以例如是两个不同的荧光标志物或荧光标志物与金属标记结合。

由于荧光标志物的广泛可用性以及在大多数实验室中对荧光测量的广泛熟悉，荧光标志物是特别优选的可检测标记。因此，本发明的一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述至少两个不同的可检测标记是荧光标志物。该方法的实际重要性在于可以通过常见流式细胞仪中发现的激光线激发荧光标志物。因此，优选可以被UV激光(355nm)，紫激光(405nm)，蓝激光(488nm)，黄/绿激光(561nm)或红激光(640nm)激发的荧光标志物。因此，本发明的实施方式涉及本文所述的方法，其中所述荧光标志物是在选自由355nm，405nm，488nm，561nm和640nm构成的群组的波长下激发的一种或多种荧光标志物。合适的荧光标志物的实例包括但不限于PE，BV421，BUV395，APC-Cy^TM7，APC，BV510，BV480，PE-Cy^TM5，PE-CF594，PE-Cy^TM7，PerCP-Cy^TM5.5，PerCP，FITC，BV605，BUV737，BV650，V500，BV786，BUV496，BUV805，V450，APC-R700，BUV563，BV711，BB515和BUV661。

替代的荧光标志物，例如量子点(QDots)也可以用于本文所述的方法。

另一组优选的可检测标记是金属标记，它构成一组熟悉且有利的标记。质谱分析法是基于感应耦合等离子体质谱法和飞行时间质谱法的质谱技术，用于确定细胞的特性(细胞计数法)。在这种方法中，将抗体和检测分子(例如MHC四聚体)与同位素纯金属元素缀合，并将这些抗体和MHC四聚体用于标记例如T细胞上的细胞蛋白。雾化细胞并使其通过氩等离子体，该等离子体使缀合了金属的抗体和四聚体电离。然后，通过飞行时间质谱仪分析金属信号。该方法通过利用离散同位素作为报告系统，而不是可能具有宽发射光谱的传统荧光团，克服了流式细胞术中光谱重叠的潜在限制。

CyTOF(通过飞行时间的细胞计数法)已经商业化，并且可以使用多种常用的金属抗体缀合物。优势是金属信号中的重叠最小，并且该仪器理论上能够检测每个单元100个以上的参数。然而，当前基于单一金属标记的方法将细胞仪的使用限制为每个细胞约40个参数。在检测分子(例如MHC四聚体)上结合两个或多个金属标记，会大大增加可在样品中进行分析的T细胞特异性的数量。因此，本发明的一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述至少两个不同的可检测标记是金属标记。

为了使用组合编码方法检测更大的不同TCR或抗原肽反应性T细胞库，有必要在该方法中引入越来越多的不同的可检测标记。因此，本发明的一个实施方式涉及本文所述的方法，其中不同的可检测标记的数目为至少三个，例如至少四个，例如至少五个，例如至少六个，例如至少七个，例如至少八个，例如至少九个，例如至少十个，例如至少十五个，例如至少二十个，例如至少五十个。

增加可以并行检测的抗原肽反应性T细胞数量的另一种方法是使每个抗原肽由两个以上不同的可检测标记表示。因此，本发明的一个实施方式涉及本文所述的方法，其中每种抗原肽由至少三个或至少四个不同的标记代表。本发明的另一个实施方式涉及本文所述的方法，其中每个检测分子包含至少三个或至少四个不同的标记。

根据本文所述方法的检测方式取决于可检测标记的选择。本领域技术人员通常将知道哪种检测手段与给定的可检测标记配对。本发明的一个实施方式涉及如本文所述的方法，其中检测包括选自由流式细胞术，荧光光谱法和质量细胞术构成的群组的一种或多种方法。本发明的优选实施方式涉及本文所述的方法，其中所述可检测标记是荧光标志物，并且检测方式是流式细胞术。

每个等位基因产物(针对人类白细胞抗原(HLA)-A和HLA-B位点)估计表达100,000-750,000pMHC I类复合物，每个人携带约10⁷个不同的TCR，每个TCR检测给定的多达10⁶个变异肽序列。因此，本文所述方法的另一个变型遵循条形码方法，以扩大抗原肽的可评估库的大小并增加可检测TCR或抗原肽反应性T细胞的分析范围。

条形码是可以唯一标识其所附接的实体的标记。核酸是条形码的首选构建基块，因为其优越的组合可能性可生成大量具有唯一标记的库(reservoir)。核酸标记可以包括允许识别标记的连续核苷酸的唯一区域(条形码区域)和允许扩增标记的引物区域。此外，核酸标记可包含可用于估计特定序列的寡核苷酸源的初始数目的区域。因此，本发明的一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述至少一个可检测标记是核酸标记，其包含：

i.5′第一引物区域(正向)，条形码区域和3′第二引物区域(反向)，以及

ii.随机核苷酸碱基的唯一分子标识符(UMI)区域

其中条形码区域是用作检测分子的识别标签的唯一条形码。

本发明的另一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述核酸标记选自DNA标记，RNA标记和人工核酸标记构成的群组。本发明的一个优选实施方式涉及本文所述的方法，其中所述核酸标记是DNA标记。

定量扩增的寡核苷酸材料时，重要的考虑因素是寡核苷酸材料的最终生成量是来自单个寡核苷酸源还是来自多个相同的寡核苷酸源。为了克服这个问题，可以将称为唯一分子标识符(UMI)的小区域添加到寡核苷酸材料中。这些UMI区是随机序列，其在扩增之后可以用于确定特定序列的寡核苷酸源的初始数目。因此，本发明的一个实施方式涉及如本文所述的方法，其中所述核酸标记包含随机核苷酸碱基的唯一分子标识符(UMI)区域。这样的UMI区可含有2-4、4-6、6-8或8-10个核苷酸碱基。对于非常大的库，UMI区可还含有10个以上的核苷酸碱基。因此，本发明的一个实施方式涉及本文所述的方法，其中UMI区含有6-8个随机核苷酸碱基。

核酸标记的设计可以通过添加一种或多种其他元件来进一步修改。因此，本发明的一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述核酸标记还包含选自由接头分子，用于测序的衔接子和退火区域构成的群组中的一种或多种。其中，优选两种设计；单寡核苷酸标记和双寡核酸标记。单寡核苷酸标记包括正向引物，条形码区域，反向引物和UMI区。双寡核苷酸核酸标记由两个序列组成，第一个包含正向引物区，UMI区，第一条形码区和退火区域，第二个包含互补退火区，第二条形码区和UMI区和反向引物区。双寡核苷酸标记的第一序列可以被生物素化。在实施例6中，第一序列称为寡核苷酸A，第二序列称为寡核苷酸B，第一条形码称为条形码A，第二条形码称为条形码B。在第一序列与第二序列退火后并且在检测分子附接之前，将第一和第二序列拉长以获得其双链形式。分离结合检测分子的T细胞后，通过PCR扩增DNA条形码，并通过测序进行分析。因此，本发明的一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述核酸标记包含两个序列，第一个包含正向引物区，UMI区，条形码区和退火区，而第二个包含互补退火区，条形码区，UMI区和反向引物区。

可以首先使用荧光标志物对与T细胞结合的条形码标记的检测分子进行分选。因此，本发明的一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述可加载的检测分子包含核酸标记和荧光标志物。结合T细胞的检测分子因此可以被荧光分选，例如。通过荧光激活细胞分选(FACS)，随后可以通过核酸扩增和高通量测序来检索相关核酸标记的组成。

核酸标记适合于识别大型检测分子库中的单个成员。因此，本发明的一个实施方式涉及本文所述的方法，其中在步骤ii中提供了至少25种不同的抗原肽，例如至少50种，例如至少100种，例如至少500种，例如在至少1.000，例如至少10.000，例如至少100.000，例如至少1.000.000。本发明的另一个实施方式涉及本文所述的方法，其中检测包括选自由标记的扩增，标记的测序，DNA测序，质谱，凝胶电泳，凝胶过滤，PAGE的，色谱柱分馏，PCR和QPCR构成的群组中的一种或多种方法。优选地，通过DNA测序进行包含DNA标记的检测分子的检测。

本文所述的方法可以包括一个或多个附加步骤以改善性能。因此，本发明的一个实施方式涉及如本文所述的方法，其中该方法包括选自由孵育，洗涤，纯化和分离构成的群组的一个或多个附加步骤。可以将附加步骤应用于组合编码方法或条形码方法之后的方法。本发明的优选实施方式涉及本文所述的方法，其中分离步骤包括选自由流式细胞术，FACS分选，洗涤，离心，沉淀，过滤，亲和柱和固定化构成的群组中的一种或多种方法。

该方法不限于特定类型的样品，而是可以应用于包括一组T细胞的任何溶液或固体部分。T细胞群体可含有具有不同特异性的T细胞。样品的来源不限于任何特定物种，但优选人类样品。本发明的一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述样品选自由外周血单核细胞，肿瘤，组织，骨髓，活组织检查，血清，血液，血浆，唾液，淋巴液，胸膜液，脊髓液和滑液构成的群组。本发明的另一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述T细胞选自由CD8T细胞，CD4T细胞，调节性T细胞，天然杀伤性T(NKT)细胞，γ-δT细胞，NK细胞和与黏膜相关的固有T(MAIT)细胞构成的群组。

Cys突变型MHC I类分子可以加载任何类型的抗原肽，因此该方法不限于抗原肽的任何特定类型或变体。然而，由于其潜在的治疗或诊断应用，某些抗原肽组比其他组更受关注。在癌症免疫疗法中，对了解T细胞对癌症相关表位以及源自突变的新表位的认识以及探索这些疗法用于治疗策略的潜力非常感兴趣。在大多数情况下，对于新表位识别的综合评估，必须筛选大型pMHC库。应用可加载的检测分子的能力将简化生成如此大的pMHC库的过程。因此，本发明的一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述抗原肽选自癌症相关表位，病毒表位，自身表位及其变体。本发明的另一个实施方式涉及本文所述的方法，其中与癌症相关的表位是与病毒诱导的癌症相关的病毒表位。本发明的优选实施方式涉及本文所述的方法，其中病毒表位选自由人乳头瘤病毒(HPV)，默克尔细胞多瘤病毒(MCV)，巨细胞病毒(CMV)，爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)，人类T淋巴病毒(HTLV)，乙型肝炎病毒(HBV)，丙型肝炎病毒(HCV)和流感病毒构成的群组。本发明的另一个实施方式涉及本文所述的方法，其中所述抗原肽是新表位。

如本文所述的Cys突变型MHC I类分子是产生质量保证的试剂(例如检测分子)的有效工具，所述试剂用于免疫监测，诊断和治疗应用，例如抗原特异性T细胞的分离或特异性刺激，用于免疫疗法中的适应性T细胞转移。如本文所证明，就柔韧性，稳定性和敏感性而言，包含Cys突变型MHC I类分子的检测分子提供了优于包含wt MHC I类分子的检测分子的升级。与包含wt MHC I类分子的检测分子相比，包含Cys突变型MHC I类分子的检测分子显示出更高的荧光强度和更好的与检测分子阴性T细胞的分离，从而增加了染色指数。不受理论的束缚，包含Cys突变型MHC I类分子的加载的检测分子的增强的稳定性可影响染色能力。因此，本发明的一个实施方式涉及本文所述的方法，其中与包含wt MHC I类分子的检测分子相比，包含至少一个无肽MHC I类分子的可加载的检测分子增加了染色指数。根据检测期间的荧光输出，将染色指数计算为(正中位数-负中位数)/(负SD*2)。

本发明的另一方面涉及用于在样品中检测一个或多个抗原肽反应性T细胞的方法，该方法包括以下步骤：

i.提供可加载的检测分子，其包含至少一个无肽MHC I类分子和至少一个可检测标记，

ii.提供至少一个抗原肽，

iii.使可加载的检测分子与至少一个抗原肽接触以提供包含至少一个肽-MHC(pMHC)I类分子的加载的检测分子，

iv.使加载的检测分子与样品接触，和

v.检测加载的检测分子与一个或多个抗原肽反应性T细胞的结合，

其中至少一个抗原肽的每一个由至少两个不同的可检测标记代表。在任何其他方面的语境中描述的所有实施例和特征也适用于该特定方面。

本发明的另一个实施方式涉及本文所述的方法，其中通过检测至少两个不同的可检测标记来检测检测分子与一个或多个抗原肽反应性T细胞的结合。

本发明的另一方面涉及在样品中检测一个或多个抗原肽反应性T细胞的方法，该方法包括以下步骤：

i.提供可加载的检测分子，其包含至少一个无肽MHC I类分子和至少一种核酸标记，

ii.提供至少一个抗原肽，

iii.使可加载的检测分子与至少一个抗原肽接触以提供包含至少一种个肽-MHC(pMHC)I类分子的加载的检测分子，

iv.使加载的检测分子与样品接触，和

v.检测加载的检测分子与一个或多个抗原肽反应性T细胞的结合。

在任何其他方面的语境中描述的所有实施例和特征也适用于该特定方面。

本发明的一个优选实施方式涉及本文所述的方法，其中该方法包括确定至少一个pMHC I类分子的身份的附加步骤(vi)。更明确地，本发明的一个实施方式涉及用于检测样品中一个或多个抗原肽反应性T细胞的方法，该方法包括以下步骤：

i.提供可加载的检测分子，其包含至少一个无肽MHC I类分子和至少一种核酸标记，

ii.提供至少一个抗原肽，

iii.使可加载的检测分子与至少一个抗原肽接触以提供包含至少一种肽-MHC(pMHC)I类分子的加载的检测分子，

iv.使加载的检测分子与样品接触，

v.检测加载的检测分子与一个或多个抗原肽反应性T细胞的结合，和

vi.确定至少一个pMHC I类分子的身份。

包含至少一个无肽MHC I类分子和核酸标记的可加载的检测分子可用于检测样品中的T细胞或用于测量基于亲和力的TCR-pMHC相互作用，从而提供TCR的识别偏好。因此，本发明的另一个方面涉及一种可加载的检测分子，其包含至少一个无肽MHC I类分子和核酸标记。在任何其他方面的语境中描述的所有实施例和特征也适用于该特定方面。

本发明的一个实施方式涉及如本文所述的可加载的检测分子，其中无肽MHC I类分子如本文所定义。本发明的另一个实施方式涉及本文所述的可加载的检测分子，其中所述无肽MHC I类分子包含重链，所述重链包含通过二硫键连接的α-1结构域和α-2结构域。

本发明的一个优选实施方式涉及如本文所述的可加载的检测分子，其中所述重链包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：

(a)SEQ ID NO：1，或

(b)与(a)中的序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，例如与(a)中的序列具有至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性，并且

其中所述氨基酸序列包含位于α-1结构域中的突变型半胱氨酸残基和位于α-2结构域中的突变型半胱氨酸残基。

本发明的另一个实施方式涉及如本文所述的可加载的检测分子，其中在α-1结构域中的突变型半胱氨酸残基在氨基酸残基84或85处，并且在α-2结构域中定位的突变型半胱氨酸残基在氨基酸残基139处。

本发明的另一个实施方式涉及如本文所述的可加载的检测分子，其中所述重链包含选自以下的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：2-13中的任何一个，或

(b)与(a)中的序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，例如与(a)中的序列具有至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性，并且

其中氨基酸序列包含位于α-1结构域中的突变型半胱氨酸残基和位于α-2结构域中的突变型半胱氨酸残基。

可加载的检测分子的核酸标记可以如本文先前所定义。本发明的一个实施方式涉及如本文所述的可加载的检测分子，其中所述核酸标记如本文所述。本发明的一个优选的实施方式涉及包含至少一个无肽MHC I类分子和核酸标记的可加载的检测分子，其中所述至少一个可检测标记是核酸标记，其包含：

i.5′第一引物区域(正向)，条形码区域和3′第二引物区域(反向)，以及

ii.随机核苷酸碱基的唯一分子标识符(UMI)区域

其中条形码区域是用作检测分子的识别标签的唯一条形码。

可加载的检测分子可以包含连接分子，例如链霉亲和素和/或支架分子，例如葡聚糖，其上附接有一个或多个无肽MHC I类分子和可检测标记。本发明的一个优选实施方式涉及如本文所述的可加载的检测分子，其中所述可加载的检测分子包含通过链霉亲和素和在每个无肽MHC I类分子上的生物素标签之间的非共价相互作用附接到链霉亲和素的四个无肽MHC I类分子。

可加载的检测分子可以以溶液形式存在或固定在固体基质上。通过将检测分子固定在固相支持物上，可以轻松地在洗涤程序等过程中将与TCR或抗原肽反应性T细胞结合的加载检测分子与任何残留和未结合的试剂和/或交换缓冲液分离。此外，通过在固体基质上以预定图案散布(spot)可加载的检测分子，可以提供具有已知坐标的先进阵列用于筛选目的。因此，本发明的一个实施方式涉及本文所述的可加载的检测分子，其中所述可加载的检测分子固定在固体基质上。

取决于要使用可加载的检测分子的设置，固体基质可以是多种材料。可加载的检测分子的微阵列对于筛选大型库可能是有利的，而固定在珠子上的可加载的检测分子在纯化方案中可能是有利的。因此，本发明的实施方式涉及如本文所述的可加载的检测分子，其中固体基质选自由微阵列，载玻片，珠子，孔板，颗粒，过滤器，凝胶，管和培养皿构成的群组。本发明的一个优选实施方式涉及如本文所述的可加载的检测分子，其中所述固体基质是微阵列。

本发明的另一方面涉及包含至少一个无肽MHC I类分子的固体基质。无肽MHC I类分子可以如本文所定义，例如包含重链，该重链包含通过二硫键连接的α-1结构域和α-2结构域。

可加载的检测分子也可以作为适合与本文所述的组合编码方法或条形码方法一起使用的组合物提供。因此，本发明的一个方面涉及用于检测样品中一个或多个抗原肽反应性T细胞的组合物，该组合物包含：

(a)至少两个如本文所述的可加载的检测分子，或

(b)至少三个可加载的检测分子，其包含至少一个本文所定义的无肽MHC I类分子和至少一个可检测标记，其中每个可加载的检测分子包含不同的可检测标记。

本发明的另一方面涉及如本文所述的可加载的检测分子或如本文所述的组合物用于在样品中检测一个或多个抗原肽反应性T细胞的用途。

可加载的检测分子或其组合物可以以即用包装/试剂盒的形式提供，其包含可加载的检测分子和感兴趣的抗原肽，以容易且快速地按需形成加载的检测分子。试剂盒可以提供各种大小的抗原肽库，其跨越例如从对给定疾病重要的几种非常特异的抗原肽到人肽组的抗原肽库。因此，本发明的另一方面涉及用于检测样品中一个或多个抗原肽反应性T细胞的试剂盒，该试剂盒包括：

i.如本文所述的可加载的检测分子或如本文所述的组合物，

ii.至少一个抗原肽，和

iii.任选的，使用说明书。

本发明的一个实施方式涉及如本文所述的试剂盒，其中所述检测分子已经预加载有抗原肽。在该实施方式中，试剂盒不包含其他抗原肽。本发明的另一个实施方式涉及本文所述的试剂盒，其中所述可加载的检测分子固定在固体基质例如微阵列上。

T细胞受体(TCR)的混杂特性对于识别多种病原体的能力至关重要。然而，此功能使其难以理解和控制T细胞识别。现有技术提供了有关T细胞识别的关键要求以及TCR交叉识别结构相关元素的能力的有限信息。本文所述的检测分子充当“一锅(one-pot)”策略，以建立控制pMHC的TCR识别的模式。如本文所述的检测分子可以用于确定TCR与加载有肽变体的MHC的相互作用的基于亲和力的层次，并应用该知识来理解识别基序，本文称为TCR指纹。可加载的检测分子是一种灵活的解决方案，非常适合快速制备高质量TCR指纹图谱所需的大型抗原肽库。确定TCR指纹是了解T细胞相互作用和评估在选择用于临床开发的TCR之前潜在的交叉识别的有价值的策略。因此，本发明的一个方面涉及确定T细胞受体(TCR)或抗原肽反应性T细胞与抗原肽库之间相互作用的方法，该方法包括以下步骤：

i.提供本文所述的可加载的检测分子，

ii.提供抗原肽库，

iii.使可加载的检测分子与抗原肽库接触，以提供包含肽-MHC(pMHC)I类分子的加载的检测分子库，

iv.使T细胞受体(TCR)或抗原肽反应性T细胞与加载的检测分子库接触，和

v.用加载的检测分子库检测T细胞受体(TCR)或抗原肽反应性T细胞的结合。

该方法也可以被称为“用于获得TCR指纹的方法”。因此，本发明的实施方式涉及获得TCR指纹的方法，其中抗原肽库包含至少25种不同的抗原肽，例如至少50种，例如至少100种，例如至少500种，例如至少1.000，例如至少10.000不同的抗原肽。本发明的另一个实施方式涉及获得TCR指纹的方法，其中抗原肽库包含至少100.000种不同的抗原肽，例如至少1.000.000种不同的抗原肽。

考虑到由本文所述的方法和可加载的检测分子提供的用于快速生成各种抗原肽库的灵活平台，有可能以简单的按需方式针对大型复杂和/或多样的抗原肽库建立详细的TCR指纹。因此，本发明的实施方式涉及获得TCR指纹的方法，其中抗原肽库包含人肽组。本发明的另一个实施方式涉及获得TCR指纹的方法，其中抗原肽库由靶抗原肽和所述靶抗原肽的单位置变化产生。本发明的另一个实施方式涉及获得TCR指纹的方法，其中抗原肽的库选自天然存在的肽。

适用于获得TCR指纹的方法的抗原肽包括但不限于已知或怀疑是致病性的抗原肽。因此，本发明的实施方式涉及获得TCR指纹的方法，其中靶抗原肽选自癌症相关表位，病毒表位和自身表位。本发明的另一个实施方式涉及获得TCR指纹的方法，其中所述癌症相关表位是与病毒诱导的癌症相关的病毒表位。本发明的另一个实施方式涉及获得TCR指纹的方法，其中所述病毒表位选自由人乳头瘤病毒(HPV)，默克尔细胞多瘤病毒(MCV)，巨细胞病毒(CMV)，爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)，人T淋巴细胞病毒(HTLV)，乙型肝炎病毒(HBV)，丙型肝炎病毒(HCV)和流感病毒构成的群组。

本发明的另一方面涉及如本文所述的可加载的检测分子在确定T细胞受体(TCR)或抗原肽反应性T细胞与抗原肽库之间的相互作用中的用途。

应当注意，在本发明的一个方面的语境中描述的实施例和特征也适用于本发明的其他方面。

本申请中引用的所有专利和非专利参考文献均通过引用全文并入本文。

现在将在以下非限制性实施例中更详细地描述本发明。

实施例

实施例1：Cys突变型MHC分子的产生和用于抗原特异性T细胞检测的检测分子的组 装

这里描述了如何产生wt(野生型)MHC I类分子和Cys突变型MHC I类分子以及根据本发明的制备检测分子的方法。在该实施例中，制备wt MHC以及二硫键稳定的Cys-突变型MHC，并将其用于检测分子的组装。

在该实施例中，检测分子是使用荧光团标记的抗生蛋白链菌素分子制备的，该分子可从例如BD Biosciences购买，并带有一系列荧光团，例如抗生蛋白链菌素-藻红蛋白(PE)，抗生蛋白链菌素-别藻蓝蛋白(APC)等。

wt MHC和Cys-突变型MHC都是通过经典的大肠杆菌表达产生的，此处分别以wtHLA-A(SEQ ID NO：1)的重链和Cys-突变型HLA-A的重链(SEQ ID NO：2)为例。简言之，使用pET系列质粒在大肠杆菌中生产wt MHC和MHC Cys突变型蛋白以及轻链β-2微球蛋白(B2M)蛋白。通过超声处理，在裂解缓冲液(Tris Cl 50mM，pH 8.0，1mM EDTA，25％蔗糖)中裂解大肠杆菌细胞，收获包含大肠杆菌产生的蛋白质的包涵体。通过在去污剂缓冲液(Tris-Cl20mM，pH 7.5，200mM NaCl，2mM EDTA，NP40 1％，脱氧胆酸1％)和洗涤缓冲液(0.5％TritonX-100，1mM EDTA)中洗涤从包涵体中收获变性蛋白的可溶性级分，然后在4℃下于再溶解缓冲液(HEPES 50mM，pH 6.5，8M尿素，0.1mMβ-巯基乙醇)中孵育48小时，并储存在-80℃中直至用于MHC I类单体生产。

Cys-突变型MHC单体是通过在存在辅助分子，例如二肽/三肽/小分子的条件下，Cys-突变型MHC蛋白和B2M，体外折叠(折叠缓冲液：100mM Tris-Cl，pH 8.0、400mM L-精氨酸，2mM EDTA和蛋白酶抑制剂混合物)而制成的。除了不包括辅助分子外，wt MHC类似于Cys-突变型MHC单体制备。相反，wt MHC分子在对紫外线不稳定的肽KILGFVF-XV(SEQ IDNO：17)存在下重新折叠，其中X表示对紫外线敏感的氨基酸3-氨基-2-(2-硝基苯基)丙酸，其在暴露于紫外线下会破坏全长肽。所得切割的肽片段与MHC分子的结合亲和力降低，使得能够结合进入的交换抗原肽。

MHC单体通过常规尺寸排阻色谱法纯化。备选地，可以使用其他标准蛋白质纯化方法。通过尺寸排阻色谱法进行Cys突变型MHC单体的纯化可以使用带有或不带有MHC单体稳定辅助分子的缓冲液。

pMHC通过标准的化学方法和酶促方法进行生物素化。在这些实施例中，根据Avidity Inc.的方案，通过在MHC重链中包含生物素化共有肽序列，使pMHC酶促生物素化，从而能够在纯化过程中使用BirA酶(可从Avidity Inc.获得)和游离生物素进行位点特异性生物素化。

在本文所述的实施例中，wt和Cys突变型MHC的抗原特异性MHC检测分子或Cys突变型MHC的可加载检测分子通过链霉亲和素-生物素相互作用组装。简言之，根据以下实施例，将生物素化分子和荧光团结合的链霉亲和素以相对化学计量(100μg/mL MHC分子与18μg/mL链霉亲和素-荧光团结合物混合)在水性缓冲液(例如PBS)中混合，并在冰上孵育30分钟。组装好的检测分子可以在4℃下保存至少一周，而在-20℃下可以保存更长的时间。在此温度下，检测分子在功能上至少稳定六个月。

如以下实施例中详述的，使用这些检测分子从人PBMC或TIL中检测抗原特异性T细胞。将2-5x10⁶个细胞与检测分子一起孵育，并在37℃孵育15分钟，然后在4℃对细胞表面标志物抗体染色30分钟。然后将细胞用FACS缓冲液(含2％FCS的PBS)洗涤两次，并通过在流式细胞仪上采集染色的细胞来分析抗原特异性CD8+T细胞的存在。

实施例2：用Cys突变型MHC分子制备的检测分子提供了优异和改进的抗原特异性T 细胞检测

该实施例详述了使用检测分子从健康供体PBMC中检测抗原特异性CD8+T细胞的过程，其中检测分子是用Cys突变型MHC分子制备的。与从wt MHC单体制备的用于所有检测的抗原特异性T细胞特异性的检测分子相比，用Cys突变型MHC分子制备的检测分子可提供明显更亮的染色(以染色指数计算)。这也在不同颜色的荧光团中一致性地发现。在图1中，流式细胞仪数据用于比较分别用wt和Cys突变型MHC单体制备的检测分子，以检测健康供体PBMC样品中的抗原特异性T细胞。

对健康供体PBMC样品进行检测分子检测，以检测CMV pp65 NLVPMVATV(SEQ IDNO：18，CMV pp65 NLV)抗原特异性CD8+T细胞。使用wt和Cys突变型A2分子制备HLA A*02:01(A2)特异的CMV pp65 NLVPMVATV检测分子，并比较T细胞的检测效率。wt和Cys突变型A2分子的制备和纯化如实施例1所述。为了制备CMV pp65 NLVPMVATV抗原特异性检测分子，将2μM的wt A2分子与100μM CMV pp65 NLVPMVATV肽在紫外灯(365nm)下孵育1小时以促进紫外线介导的肽交换而制备A2 CMV pp65 NLVPMVATV单体(因为wt A2分子携带在折叠过程中添加的紫外线不稳定肽，并且这些分子需要稳定，因此需要紫外线介导的交换过程)。

对于Cys突变型MHC分子，将100μM CMV pp65 NLVPMVATV与2μM Cys突变型A2分子直接在4℃孵育1小时。Cys突变型MHC分子不需要任何交换过程，因为这些分子折叠后在无肽构象下是稳定的，从而无需选择任何交换过程即可直接加载所选的肽。因此，Cys突变型MHC分子非常适合直接，轻松，快速地加载抗原肽，用于T细胞检测。

然后，通过将2μM A2 CMV pp65 NLVPMVATV与18μg/mL荧光团缀合的链霉亲和素在4℃孵育30分钟，将wt和Cys-突变型A2 CMV pp65 NLVPMVATV单体转化为MHC检测分子。使用这些wt和Cys突变型A2 CMV pp65 NLVPMVATV特异性检测分子对来自健康供体的PBMC进行染色。代表性的点状图如图1A所示，显示了A2 CMV pp65 NLVPMVATV特异的CD8+T细胞。

通过计算染色指数可以验证Cys突变型MHC检测分子对A2 CMV pp65 NLVPMVATV特异性T细胞检测到的更亮的染色，即从背景信号中更好地分离检测分子阳性(抗原特异性)T细胞。相对于wt检测分子，观察到近三倍高的Cys突变型检测分子的染色指数(图1B)。从Cys突变型MHC分子制备的检测分子的优越性在另外两个具有不同荧光团标签的健康供体样品中得到了检测(图2A)。无论使用哪种荧光团标记的检测分子，在两个测试的健康供体样品中，使用染色指数计算确定，Cys突变型A2 CMV pp65 NLVPMVATV特异性检测分子的性能均优于wt MHC检测分子(图2B)。

在若干抗原特异性中发现了Cys突变型T细胞检测分子染色指数的优越性，如通过检测健康供体PBMC中另外两种病毒特异性抗原的抗原特异性T细胞所显示的。如本实施例中先前所述，使用wt A2或Cys-突变型A2组装的A2 YVLDHLIVV(SEQ ID NO：19，EBV BRLF1YVL)和A2 VLEETSVML(SEQ ID NO：20，CMV IE1 VLE)抗原特异性检测分子。将健康供体PBMC与检测分子一起孵育，并比较wt和Cys突变型检测分子的染色指数。Cys突变型MHC检测分子为两种类型的抗原特异性CD8 T细胞(A2 YVLDHLIVV和A2 VLEETSVML)提供了更高的染色指数(高4-5倍)(图3A，B)。

结论：该实验证实了使用由Cys突变型MHC分子制备的检测分子检测抗原特异性T细胞的可行性(图1)。发现Cys突变型MHC检测分子的T细胞检测效率与wt检测分子相当。

由于Cys突变型和wt MHC检测分子之间的T细胞检测效率相当，因此Cys突变型MHC分子的优势是抗原肽的加载速度更快。Cys突变型MHC分子被折叠成空的，并且不需要全长肽即可保持稳定。因此，Cys突变型MHC分子是肽受体，并且可以如wt MHC分子所需要的那样，在不使用肽交换技术或不对每个pMHC特异性进行单独折叠和纯化的情况下，用任何抗原肽加载。

另外，Cys突变型检测分子的另一个优势来自于更好的T细胞检测效率，如经由染色指数所示(图1B，2B和3B)。在三个不同的供体样品(BC60、89、90)并使用两种不同的颜色(PE和APC)，三种不同抗原(A2-NLVPMVATV，A2 YVLDHLIVV和A2 VLEETSVML)的Cys-突变型A2检测分子显示出比wt A2检测分子高三到八倍的染色指数。这些数据为使用Cys突变型MHC检测分子的MHC检测分子在抗原特异性T细胞检测方面取得了进展，与现有方法相比，在T细胞检测中提供了更好的区分。

图3A展示了使用Cys突变型MHC分子在T细胞检测中这种进展的优势。在健康供体PBMC中检测到的低频A2 YVLDHLIVV(EBV BRLF1)特异性T细胞由于使用了明亮的染色(即更好的染色指数)而在使用Cys突变型检测分子时被清楚地区分并与检测分子阴性群体良好分离。相反，用于检测相同抗原特异性T细胞的wt A2检测分子提供差的检测分子阳性细胞分离，这很难区分以至于几乎无法检测到这一群体。因此，更明亮的分离(提高的染色指数)对于鉴定低频和低亲和力的抗原特异性T细胞很重要，这正通过使用Cys突变型MHC分子来促进，从而比现有方法有了明显的进步。

实施例3：由Cys突变型MHC分子制成的组合编码检测分子为检测抗原特异性T细胞 提供了显著的改进。

在该实施例中，展示了将检测分子的组合设置(称为组合编码)用于样品中多个T细胞特异性检测的优势。与常规的wt MHC检测分子相比，对Cys突变型MHC检测分子而言，组合编码特别有利。证实了在组合设置中，其中一个荧光团标签用于检测若干抗原，而第二个荧光团标签仅对一种抗原具有特异性，从而对每种抗原特异性形成唯一的两种颜色组合，观察到Cys突变型/wt检测分子的更好的染色指数比率。当通过组合编码检测分子的清晰分离来筛选大型肽库时，阳性T细胞有助于从大量细胞中更好地鉴定抗原特异性T细胞，特别是当它们稀少且对给定的抗原肽MHC组合具有低亲和力时。组合编码技术先前已经由Hadrup等人(2009)和在WO 2010/060439 A1中描述。

在组合编码的示例中，比较了wt和Cys突变型A2检测分子对三种不同抗原A2-FLUMP GILGFVFTL(SEQ ID NO：21，FLU MP GIL)，A2-EBV BMF1 GLCTLVAML(SEQ ID NO：22，EBVBMF1 GLC)和A2 EBV LMP2 FLYALALLL(SEQ ID NO：23，EBV LMP2 FLY)的T细胞检测效率。所有三种抗原特异性检测分子的制备均与实施例2中所述的过程类似。简言之，将200μM的每种抗原肽与2μM wt或Cys-突变型A2分子在紫外灯下(用于wt A2交换反应)或直接在4℃(Cys-突变体A2)孵育一小时。一小时后，将每种抗原特异性单体分成两个反应，并将每个与不同颜色的荧光团缀合的链霉亲和素孵育30分钟。对于所有三种抗原特异性，APC用作第一色和第二色BUV395(对于A2-FLU MP GILGFVFTL)，BUV737(对于A2-EBV BMF1 GLCTLVAML)和PE(A2 EBV LMP2 FLYALALLL)。因此，这种双色方法为每个抗原特异性检测分子提供了唯一的颜色组合。用于A2-FLU MP GILGFVFTL的APC-BUV395，用于A2-EBV BMF1 GLCTLVAML的APC-BUV737和用于A2 EBV LMP2 FLYALALLL的APC-PE。

在对细胞染色之前，将所有三种抗原的每种抗原特异性的双色组合编码检测分子以等量(1μL/颜色/特异性)合并。然后将合并的检测分子与2-5x10⁶细胞在37℃孵育15分钟，在4℃与细胞表面标记抗体孵育30分钟。然后洗涤细胞，并在流式细胞仪上采集CD8+抗原特异性T细胞。图4A；点图表明wt和Cys突变型A2检测分子的比较的抗原特异性T细胞检测效率。计算给定组合中对于两种颜色的每种检测到的抗原特异性T细胞图的染色指数(图4B)。点图和染色指数条形图(倍数变化的Cys-突变型/wt A2检测分子)表明了与wt检测分子相比，使用Cys-突变型检测分子的检测效果得到了改善。

Cys突变型MHC检测分子在组合编码设置中从黑素瘤患者样品中鉴定与癌症相关的抗原特异性T细胞也是有利的(图5)。分析12种黑色素瘤相关癌症抗原(HLA A*02：01限制性的)库，以鉴定黑色素瘤患者TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)中的CD8+T细胞。如本实施例所述，产生了覆盖12种抗原的一组组合编码检测分子，其中每个pMHC组合被两个颜色检测分子标记。染色之前，将1μl两种颜色组合的每种pMHC检测分子合并在一个试管中，并与2x10⁶黑色素瘤患者TIL混合，并在37℃孵育15分钟。与细胞表面抗体在4℃孵育30分钟后，然后在流式细胞仪上采集细胞。图5点图证实了针对两种癌症相关抗原(ITDQVPFSV(SEQ ID NO：24，gp100 ITD)和AMLGTHTMEV(SEQ ID NO：25，gp100 AML))特异性鉴定的CD8+T细胞，并提供了Cys-突变型和wt A2检测分子。Cys突变型检测分子始终为所有已鉴定的抗原特异性T细胞特异性提供优异的染色指数，进一步验证了Cys突变型MHC检测分子在组合编码中的优势。

结论：本实施例证实了用Cys突变型MHC分子制备的检测分子对通过组合编码鉴定和检测抗原特异性CD8 T细胞的有用性。Cys突变型MHC检测分子的强度在于更好的染色指数，因此产生了与阴性T细胞群体更好的分离。该特征对于组合编码非常重要，因为单个荧光团标签可以由多个抗原特异性检测分子表示，因此在最终的流式细胞仪读数中，单个有色检测分子阳性T细胞群体可以代表一个以上的抗原特异性T细胞。这些细胞只能通过识别检测分子对的第二种颜色来分离。因此，如Cys突变型检测分子所示，更好的分离和更高的染色指数给出确定的优势。

Cys突变型MHC检测分子提供的优势通过黑色素瘤患者样品中癌症相关抗原的鉴定和检测得到证实(图5)。需要高通量的方法，例如基于MHC检测分子的组合编码，以筛选大型肽库来鉴定患者样品中与癌症相关的抗原特异性T细胞，用于免疫治疗的发展。Cys突变型MHC检测分子更适合这种方法，因为当需要筛选大的肽库时，它们可以更快地加载，并且它们还为癌症相关抗原提供了改进的染色指数。由于广泛的可能的pMHC和T细胞受体相互作用，因此癌症相关的抗原的染色指数的改善也具有很大的优势。

实施例4：用Cys突变型MHC分子制备的可加载的检测分子提供了通过组合编码产 生用于抗原特异性T细胞检测的抗原特异性检测分子的快速方法。

该实施例证实了使用Cys突变型MHC筛选大型抗原库以鉴定抗原特异性CD8 T细胞的快速检测分子的方法。与wt MHC分子不同，由于Cys突变型MHC分子高度稳定且易于接受肽，因此这些空单体可以迅速转化为现成的检测分子(图6A)。此过程包括生成可加载的检测分子，该分子可以存储在-20℃。这些可加载的检测分子可以通过一步孵育来加载抗原肽的选择。本实施例证实了该过程可在短至一分钟内完成，并且这种抗原肽特异性检测分子在T细胞检测中是有功能活性的。

如实施例1中所述制备Cys突变型A2单体。然后将Cys突变型MHC单体(100μg/mL)与荧光团标记的抗生蛋白链菌素(18μg/mL)在4℃孵育30分钟以产生可加载的检测分子。将可加载的检测分子存储在-20℃，直到用于在存储缓冲液(0.5％BSA，5％甘油)中制备抗原特异性检测分子。

为了测试肽的加载效率并为可加载的A2检测分子进行功能验证，通过在4摄氏度下在不同的孵育时间(1、5、15、15、30和60分钟)中孵育不同浓度的肽(0.1、1、10、100μM)，将可加载的MHC检测分子(APC标记的)转换为pMHC检测分子。在此实施例中(图6B)，A2GILGFVFTL(FLU MP)抗原用于检测抗原特异性T细胞。将来自每种肽上样加载条件的A2GILGFVFTL Cys突变型检测分子与健康供体PBMC(2x10⁶细胞/染色)一起孵育。图6B证实了通过每种肽加载条件在供体样品中检测到的A2 GILGFVFTL特异性T细胞。数据显示，加载一分钟的肽足以制成可检测其限制性T细胞的抗原特异性检测分子。

在该实施例中，进一步证实了可加载的检测分子在组合编码中鉴定黑素瘤患者样品中新抗原反应性CD8 T细胞的应用。新抗原源自癌症特异性突变，因此有可能在各种免疫治疗方法中找到用途。鉴定新抗原特异性T细胞需要筛选针对个别患者的大型肽库。因此，要筛选出如此大的肽库，高通量系统将需要快速制备检测分子。在该实施例中，证实了由Cys突变型MHC分子制成的可加载的检测分子对于这种方法是理想的。这可以通过在组合编码设置中生成由43种肽抗原(HLA-A2限制性的)的黑色素瘤患者特异性新抗原库来举例说明。将可加载的检测分子(两种颜色组合)与100μM新抗原孵育，孵育15分钟并且立即合并，与黑色素瘤TIL孵育。如前所述对细胞进行染色，并通过流式细胞仪进行采集。通过与可加载的检测分子组合编码，三种新抗原(RLMVAVEEA(SEQ ID NO：26，VANGL1 RLM)，RLMVAVEEAFI(SEQ ID NO：27，VANGL1(2)RLM)和LLLFLTIFI(SEQ ID NO：28，DYSF LLL))被识别(图7)。

结论：在该实施例中证实了使用Cys突变型MHC检测分子在组合编码中鉴定新抗原特异性T细胞的优势。现有技术中的其他现有方法需要交换方法以在制备检测分子之前加载任何目的肽，从而使得该方法效率低下并且非常耗时，尤其是当需要分析大型患者特异性肽库时。可以在单个步骤中转变为抗原特异性检测分子的可加载的检测分子为现有解决方案中存在问题的方法提供了一种有利的快速解决方案。在此实施例中，使用鉴定的新抗原特异性T细胞仅在15分钟内即可使用可快速转变的可加载A2检测分子转变为抗原特异性检测分子，这相对于任何现有的基于检测分子的T细胞检测方法都是一项重大改进。

实施例5：与用野生型MHC制备的检测分子相比，用Cys突变型MHC分子制备的检测 分子是高度稳定的

该实施例表明，与wt MHC检测分子相比，Cys突变型MHC检测分子是高度稳定的。抗原特异性MHC检测分子的更高稳定性改善了T细胞检测，特别是对于使用用于T细胞检测的组合编码和条形码方法的低亲和力抗原而言。

在该实施例中，通过肽解离测量证实了Cys突变体抗原特异性检测分子的改进的稳定性，并与wt抗原特异性检测分子进行了比较。如实施例4中所述，从Cys突变型A2 MHC分子制备可加载的检测分子(APC标记)。将10μM的GILGFVFTL(FLU MP)肽与可加载的A2检测分子在4℃孵育15分钟，以产生A2-GILGFVFTL抗原特异性检测分子。Wt A2-GILGFVFTL抗原特异性检测分子是通过在200μM GILGFVFTL肽存在下于紫外线灯(365nm)下与wt A2单体孵育1小时，然后与链霉亲和素APC在4℃孵育30分钟而产生的。制备抗原特异性检测分子后，使用分子量截止滤膜(可商购)去除wt和Cys突变型检测分子的多余肽。将得到的A2-GILGFVFTL特异性检测分子在4℃，室温和37℃孵育1小时，12小时，48小时和168小时，以确定pMHC复合物的稳定性。将这些复合物在每个时间点和孵育温度后的稳定性作为功能性读数进行测量，以检测来自健康供体PBMC的A2 GILGFVFTL抗原特异性T细胞。如先前实施例中所述进行T细胞染色。

发现使用Cys突变型A2分子制备的A2-GILGFVFTL检测分子比具有相同特异性的wt检测分子明显更稳定。在37℃孵育12小时或更长时间后，对于检测分子观察到明显的区别，其中wt分子检测分子的A2-GILGFVFTL特异性T细胞检测效率显著降低。相反，在37℃孵育长达48小时的Cys突变型检测分子仍然能够检测A2 GILGFVFTL特异性T细胞(图8A，B)。

结论：Cys突变型检测分子是高度稳定的，如使用肽解离速率测定。即使在37℃孵育48小时后，Cys突变型检测分子的功能仍稳定，并可以有效检测抗原特异性T细胞。Cys突变型pMHC复合物的较高稳定性使其在高通量T细胞检测平台中比wt pMHC复合物具有明显的优势，例如通过检测分子的组合编码和条形码，因为低亲和力pMHC-TCR(T细胞受体)相互作用更可能使用更稳定的pMHC复合物进行检测。

实施例6：使用Cys突变型MHC分子制备的检测分子在基于条形码的高通量T细胞检 测方法中具有明显的优势

该实施例描述了使用条形码化的Cys突变型MHC分子和wt MHC分子检测分子对抗原特异性T细胞的检测。条形码方法利用独特的短核酸序列作为附接在每种类型的pMHC检测分子上的条形码。该方法允许使用核酸条形码的T细胞检测分子在单个罐中进行数千种抗原肽的筛选。该技术先前已经由Bentzen等人(2016)和在WO 2015/188839 A2中描述。

在该实施例中，在健康供体(图9)和黑素瘤患者样品中检测了对癌症相关抗原具有特异性的T细胞(图10)。为167种A2限制性癌症抗原和8种A2限制性病毒衍生抗原制备了DNA条形码检测分子(wt和Cys-突变型)。

DNA条形码是由含有不同的25mer核苷酸序列的寡核苷酸产生的。除了不同的25mer区域外，每个寡核苷酸还包含与IonTorrent测序兼容的引物区域以及6xN随机核苷酸唯一分子识别码(UMI)区域。将经过5'生物素标签修饰的寡核苷酸(A条形码)与未修饰的部分互补的寡核苷酸(B条形码)连接，以生成175个独特的双链Ax-By DNA条形码(5个代表性的A条形码(SEQ ID NO：32-36))和B条形码(SEQ ID NO：37-41)序列并且它们编码的抗原肽在表1中列出，“N”表示随机核苷酸)。将A和B寡核苷酸(各一种)的组合与5x Sequenase反应缓冲液混合物(PN 70702，Affymetrix)混合，最终浓度分别为26μM(Oligo A)和52μM(OligoB)；加热至65℃，持续2min；然后在15-30min内将其缓慢冷却至<35℃，使其退火。通过添加Sequenase聚合酶(70775Y，Affymetrix)，20μM DTT和800μM或72μM dNTP，将退火的寡核苷酸As和Bs拉长以产生双链AxBy DNA条形码，然后在室温下孵育5-10min。伸长的AxBy条形码在无核酸酶的水+0.1％吐温中稀释至2.17μM(相对于A寡核苷酸)，并保存在-20℃。将5'生物素化的AxBy DNA条形码以2：1的化学计量比连接到PE和链霉亲和素缀合的葡聚糖上。通过与葡聚糖-缀合物混合而附接DNA条形码，然后在4℃孵育30min。

通过将这些抗原加载至A2分子，可以为175种抗原中的每一种制备单独的pMHC组合。对于wt A2分子，使用UV介导的肽交换过程加载抗原，其中将100μg/mL wt A2单体与200μM肽在UV光(365nm)下孵育一小时。通过将100μM肽抗原仅孵育15分钟而无需任何交换过程，即可将Cys突变型A2分子加载抗原。

然后将组装的pMHC特异性抗体与抗生蛋白链菌素缀合的右旋异构体(标记有DNA条形码)在4℃孵育30分钟，以获得DNA条形码的抗原特异性检测分子。然后将所有175种不同的pMHC特异性条形码化T细胞检测分子全部集中在单个试管(每种特异性1.5μL)中，并与健康供体PBMC或黑色素瘤患者的TIL样品(2-5x10⁶个细胞)在37℃孵育15分钟。如前所述，用细胞表面抗体对细胞进行染色，并在细胞分选仪上进行采集，以分离用于检测分子的抗原特异性T细胞阳性。使用IonTorrent兼容的正向A-Key 2OS-F1-xxx和反向PCR引物P1R2(单个正向引物A-Key 2OS-F1-233(SEQ ID NO：42)和反向引物P1R2(SEQ ID NO：43)在表1中示例)从这些分选的细胞中扩增DNA条形码。基本上按照Bentzen等人(2016)的描述，纯化PCR扩增的DNA条形码并通过IonTorrent测序进行测序，以鉴定与各个DNA条形码相关的抗原特异性T细胞。

与使用wt A2分子组装的检测分子相比，用Cys突变型A2分子组装的条形码检测分子总体上检测更高数量的抗原特异性CD8 T细胞。在健康供体中，wt A2和Cys-突变型A2pMHC都检测到相似数量的病毒源性的抗原特异T细胞，但是Cys-突变型检测分子在该样品中鉴定出了另外几种与癌症相关的抗原特异T细胞(图9)，证实了Cys突变型MHC分子的敏感性。值得注意的是，在两个黑色素瘤患者样品中，wt A2检测分子均未鉴定出任何抗原特异性T细胞，而Cys突变型MHC检测分子在第二个黑色素瘤患者样品中在黑色素瘤患者1和2中鉴定出癌抗原特异性T细胞(VLYRYGSFSV)SEQ ID NO：29，MEL VLY)和KASEKIFYV(SEQ IDNO：30，MEL KAS))(图10)。

结论：该实施例(图9和10)证实，具有Cys突变型MHC分子的条形码检测分子为高通量T细胞检测提供了有吸引力的平台。癌症抗原特异的T细胞很难检测，可能是由于pMHC或TCR之间的低频率或低亲和力。对于高通量T细胞检测，Cys突变型MHC分子优于wt MHC检测分子，因为只有Cys突变T细胞检测分子足够灵敏，可以检测黑色素瘤患者样品中罕见的癌症相关抗原特异性T细胞。

实施例7：使用Cys突变型MHC分子制备的DNA条形码检测分子以确定TCR指纹

此实施例描述了使用Cys突变型MHC分子来确定T细胞受体(TCR)指纹的方法。TCR指纹图谱提供了TCR-pMHC相互作用的细节以及每个残基在T细胞识别中的重要性。该实施例表明，Cys突变型MHC分子鉴定的TCR指纹与使用wt MHC分子鉴定的TCR指纹是可比的。

为了确定TCR指纹，使用检测分子的条形码来表征由Merkel细胞多瘤病毒源性的抗原决定簇A2-KLLEIAPNY(SEQ ID NO：31，MCV KLL)产生的192个肽段，方法是将每个氨基酸位置依次替换为20个天然发生的氨基酸。这些肽变体中的每一个均被加载到Cys突变型A2空单体上，或替换为wt A2中可被UV裂解的配体。然后，按照实施例6所述，使用192个独特的DNA条形码生成MHC多聚体并加标签。将所有pMHC多聚体组合的混合物用于染色T细胞克隆(特异于A2-KLLEIAPNY)，从而允许对基于亲和力的TCR-pMHC相互作用进行测量，并因此提供TCR的识别优选项。基于与MHC多聚体相关的DNA条形码的测序确定TCR指纹，并将结果以logFc的形式提供给输入的pMHC库。LogFc转换为香农徽标，以更好地说明TCR pMHC相互作用所需的氨基酸(图11)。基于TCR指纹，对于A2-KLLEIAPNY特异的两个测试的TCR克隆，Cys突变体和wt A2均显示出可比的TCR指纹模式。

结论：本实施例描述了Cys突变型MHC分子在TCR指纹分析中的应用。它证实了Cys突变型MHC分子可以准确地重现TCR指纹，并且更适合此类分析，因为它们可以在单个步骤中快速加载所需的抗原肽。在需要筛选大型肽库的这种高通量条形码方法中，这是明显的优势。

参考文献

·Hadrup et al.(2009),Nat.Methods.6,520-526

·WO 2010/060439 A1

·Bentzen et al.(2016),Nat.Biotechnol.34,1037-1045

·WO 2015/188839 A2

·Altman et al.(1996),Science,274,94-96

序列表

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辛·雷克·哈德鲁普

瑟伦·尼布罗·雅各布森

苏尼尔·库马尔·萨尼

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35 40 45

Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gln Glu Thr

50 55 60

Arg Asn Val Lys Ala Gln Ser Gln Thr Asp Arg Val Asp Leu Gly Thr

65 70 75 80

Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Asp Gly Ser His Thr Ile Gln

85 90 95

Ile Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Pro Asp Gly Arg Phe Leu Arg Gly

100 105 110

Tyr Arg Gln Asp Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu

115 120 125

Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Cys Ala Gln Ile Thr Lys

130 135 140

Arg Lys Trp Glu Ala Ala His Ala Ala Glu Gln Gln Arg Ala Tyr Leu

145 150 155 160

Glu Gly Arg Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys

165 170 175

Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Pro Pro Lys Thr His Met Thr His His

180 185 190

Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe

195 200 205

Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln

210 215 220

Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr

225 230 235 240

Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg

245 250 255

Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu

260 265 270

Arg Trp

<210> 6

<211> 274

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> Cys突变型 HLA-A 2402 重链 w/o TM 结构域

<222> (1)..(1)

<400> 6

Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly

1 5 10 15

Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln

20 25 30

Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg

35 40 45

Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Glu Glu Thr

50 55 60

Gly Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr Asp Arg Glu Asn Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ala Leu Arg Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln

85 90 95

Met Met Phe Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Gly Arg Phe Leu Arg Gly

100 105 110

Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu

115 120 125

Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Cys Ala Gln Ile Thr Lys

130 135 140

Arg Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Gln Arg Ala Tyr Leu

145 150 155 160

Glu Gly Thr Cys Val Asp Gly Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys

165 170 175

Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Pro Pro Lys Thr His Met Thr His His

180 185 190

Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe

195 200 205

Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln

210 215 220

Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr

225 230 235 240

Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg

245 250 255

Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu

260 265 270

Arg Trp

<210> 7

<211> 274

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> Cys突变型 HLA-B 0702 重链 w/o TM 结构域

<222> (1)..(1)

<400> 7

Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Tyr Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly

1 5 10 15

Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ser Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln

20 25 30

Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Pro Arg Glu Glu Pro Arg

35 40 45

Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Asn Thr

50 55 60

Gln Ile Tyr Lys Ala Gln Ala Gln Thr Asp Arg Glu Ser Leu Arg Asn

65 70 75 80

Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln

85 90 95

Ser Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Pro Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly

100 105 110

His Asp Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu

115 120 125

Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Cys Ala Gln Ile Thr Gln

130 135 140

Arg Lys Trp Glu Ala Ala Arg Glu Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu

145 150 155 160

Glu Gly Glu Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys

165 170 175

Asp Lys Leu Glu Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His

180 185 190

Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe

195 200 205

Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln

210 215 220

Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Arg Thr

225 230 235 240

Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg

245 250 255

Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu

260 265 270

Arg Trp

<210> 8

<211> 274

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> Cys突变型 HLA-B 0801 重链 w/o TM 结构域

<222> (1)..(1)

<400> 8

Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Asp Thr Ala Met Ser Arg Pro Gly

1 5 10 15

Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ser Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln

20 25 30

Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Pro Arg Glu Glu Pro Arg

35 40 45

Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Asn Thr

50 55 60

Gln Ile Phe Lys Thr Asn Thr Gln Thr Asp Arg Glu Ser Leu Arg Asn

65 70 75 80

Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln

85 90 95

Ser Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Pro Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly

100 105 110

His Asn Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu

115 120 125

Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Cys Ala Gln Ile Thr Gln

130 135 140

Arg Lys Trp Glu Ala Ala Arg Val Ala Glu Gln Asp Arg Ala Tyr Leu

145 150 155 160

Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys

165 170 175

Asp Thr Leu Glu Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His

180 185 190

Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe

195 200 205

Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln

210 215 220

Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Arg Thr

225 230 235 240

Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg

245 250 255

Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu

260 265 270

Arg Trp

<210> 9

<211> 274

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> Cys突变型 HLA-B 1501 重链 w/o TM 结构域

<222> (1)..(1)

<400> 9

Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Tyr Thr Ala Met Ser Arg Pro Gly

1 5 10 15

Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln

20 25 30

Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Pro Arg Met Ala Pro Arg

35 40 45

Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Glu Thr

50 55 60

Gln Ile Ser Lys Thr Asn Thr Gln Thr Tyr Arg Glu Ser Leu Arg Asn

65 70 75 80

Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln

85 90 95

Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Pro Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly

100 105 110

His Asp Gln Ser Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu

115 120 125

Asp Leu Ser Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Cys Ala Gln Ile Thr Gln

130 135 140

Arg Lys Trp Glu Ala Ala Arg Glu Ala Glu Gln Trp Arg Ala Tyr Leu

145 150 155 160

Glu Gly Leu Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys

165 170 175

Glu Thr Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His

180 185 190

Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe

195 200 205

Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln

210 215 220

Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Arg Thr

225 230 235 240

Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg

245 250 255

Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu

260 265 270

Arg Trp

<210> 10

<211> 274

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> Cys突变型 HLA-B 3501 重链 w/o TM 结构域

<222> (1)..(1)

<400> 10

Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Tyr Thr Ala Met Ser Arg Pro Gly

1 5 10 15

Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln

20 25 30

Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Pro Arg Thr Glu Pro Arg

35 40 45

Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Asn Thr

50 55 60

Gln Ile Phe Lys Thr Asn Thr Gln Thr Tyr Arg Glu Ser Leu Arg Asn

65 70 75 80

Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Ile Ile Gln

85 90 95

Arg Met Tyr Gly Cys Asp Leu Gly Pro Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly

100 105 110

His Asp Gln Ser Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu

115 120 125

Asp Leu Ser Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Cys Ala Gln Ile Thr Gln

130 135 140

Arg Lys Trp Glu Ala Ala Arg Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu

145 150 155 160

Glu Gly Leu Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys

165 170 175

Glu Thr Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His

180 185 190

Pro Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe

195 200 205

Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln

210 215 220

Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Arg Thr

225 230 235 240

Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg

245 250 255

Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu

260 265 270

Arg Trp

<210> 11

<211> 274

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> Cys突变型 HLA-B 4402 重链 w/o TM 结构域

<222> (1)..(1)

<400> 11

Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Tyr Thr Ala Met Ser Arg Pro Gly

1 5 10 15

Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Thr Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Leu

20 25 30

Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Thr Ser Pro Arg Lys Glu Pro Arg

35 40 45

Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Glu Thr

50 55 60

Gln Ile Ser Lys Thr Asn Thr Gln Thr Tyr Arg Glu Asn Leu Arg Thr

65 70 75 80

Ala Leu Arg Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Ile Ile Gln

85 90 95

Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Pro Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly

100 105 110

Tyr Asp Gln Asp Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu

115 120 125

Asp Leu Ser Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Cys Ala Gln Ile Thr Gln

130 135 140

Arg Lys Trp Glu Ala Ala Arg Val Ala Glu Gln Asp Arg Ala Tyr Leu

145 150 155 160

Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys

165 170 175

Glu Thr Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His

180 185 190

Pro Ile Ser Asp His Glu Val Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe

195 200 205

Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln

210 215 220

Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Arg Thr

225 230 235 240

Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg

245 250 255

Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu

260 265 270

Arg Trp

<210> 12

<211> 274

<212> PRT

<213> 小鼠

<220>

<221> Cys突变型 H-2Kb 重链 w/o TM 结构域

<222> (1)..(1)

<400> 12

Gly Pro His Ser Leu Arg Tyr Phe Val Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly

1 5 10 15

Leu Gly Glu Pro Arg Tyr Met Glu Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Glu

20 25 30

Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Glu Asn Pro Arg Tyr Glu Pro Arg

35 40 45

Ala Arg Trp Met Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Arg Glu Thr

50 55 60

Gln Lys Ala Lys Gly Asn Glu Gln Ser Phe Arg Val Asp Leu Arg Thr

65 70 75 80

Leu Leu Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Lys Gly Gly Ser His Thr Ile Gln

85 90 95

Val Ile Ser Gly Cys Glu Val Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly

100 105 110

Tyr Gln Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Cys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu

115 120 125

Asp Leu Lys Thr Trp Thr Ala Ala Asp Met Cys Ala Leu Ile Thr Lys

130 135 140

His Lys Trp Glu Gln Ala Gly Glu Ala Glu Arg Leu Arg Ala Tyr Leu

145 150 155 160

Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Lys Asn Gly Asn

165 170 175

Ala Thr Leu Leu Arg Thr Asp Ser Pro Lys Ala His Val Thr His His

180 185 190

Ser Arg Pro Glu Asp Lys Val Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe

195 200 205

Tyr Pro Ala Asp Ile Thr Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Glu Leu

210 215 220

Ile Gln Asp Met Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr

225 230 235 240

Phe Gln Lys Trp Ala Ser Val Val Val Pro Leu Gly Lys Glu Gln Tyr

245 250 255

Tyr Thr Cys His Val Tyr His Gln Gly Leu Pro Glu Pro Leu Thr Leu

260 265 270

Arg Trp

<210> 13

<211> 274

<212> PRT

<213> 小鼠

<220>

<221> Cys突变型 H-2Db 重链 w/o TM 结构域

<222> (1)..(1)

<400> 13

Gly Pro His Ser Met Arg Tyr Phe Glu Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly

1 5 10 15

Leu Glu Glu Pro Arg Tyr Ile Ser Val Gly Tyr Val Asp Asn Lys Glu

20 25 30

Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Glu Asn Pro Arg Tyr Glu Pro Arg

35 40 45

Ala Pro Trp Met Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Arg Glu Thr

50 55 60

Gln Lys Ala Lys Gly Gln Glu Gln Trp Phe Arg Val Ser Leu Arg Asn

65 70 75 80

Leu Leu Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Ala Gly Gly Ser His Thr Leu Gln

85 90 95

Gln Met Ser Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Trp Arg Leu Leu Arg Gly

100 105 110

Tyr Leu Gln Phe Ala Tyr Glu Gly Arg Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu

115 120 125

Asp Leu Lys Thr Trp Thr Ala Ala Asp Met Cys Ala Gln Ile Thr Arg

130 135 140

Arg Lys Trp Glu Gln Ser Gly Ala Ala Glu His Tyr Lys Ala Tyr Leu

145 150 155 160

Glu Gly Glu Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Lys Asn Gly Asn

165 170 175

Ala Thr Leu Leu Arg Thr Asp Ser Pro Lys Ala His Val Thr His His

180 185 190

Pro Arg Ser Lys Gly Glu Val Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe

195 200 205

Tyr Pro Ala Asp Ile Thr Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Glu Leu

210 215 220

Thr Gln Asp Met Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr

225 230 235 240

Phe Gln Lys Trp Ala Ser Val Val Val Pro Leu Gly Lys Glu Gln Asn

245 250 255

Tyr Thr Cys Arg Val Tyr His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Thr Leu

260 265 270

Arg Trp

<210> 14

<211> 291

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> Cys突变型 HLA-A 0201 重链 + Avi-tag w/o TM 结构域

<222> (1)..(1)

<400> 14

Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly

1 5 10 15

Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln

20 25 30

Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg

35 40 45

Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr

50 55 60

Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr

65 70 75 80

Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln

85 90 95

Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly

100 105 110

Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu

115 120 125

Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Cys Ala Gln Thr Thr Lys

130 135 140

His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu

145 150 155 160

Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys

165 170 175

Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His

180 185 190

Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe

195 200 205

Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln

210 215 220

Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr

225 230 235 240

Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg

245 250 255

Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu

260 265 270

Arg Trp Ala Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu

275 280 285

Trp His Glu

290

<210> 15

<211> 98

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> Beta-2 微球蛋白(B2M)

<222> (1)..(1)

<400> 15

Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn

1 5 10 15

Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser

20 25 30

Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val

35 40 45

Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu

50 55 60

Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg

65 70 75 80

Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg

85 90 95

Asp Met

<210> 16

<211> 387

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> Cys突变型 HLA-A 0201 B2M + 接头+ 重链融合 w/o TM

结构域

<222> (1)..(1)

<400> 16

Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn

1 5 10 15

Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser

20 25 30

Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val

35 40 45

Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu

50 55 60

Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg

65 70 75 80

Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg

85 90 95

Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro

115 120 125

Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr

130 135 140

Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro

145 150 155 160

Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu

165 170 175

Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly

180 185 190

Thr Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val

195 200 205

Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg

210 215 220

Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys

225 230 235 240

Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Cys Ala Gln Thr Thr

245 250 255

Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr

260 265 270

Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly

275 280 285

Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His

290 295 300

His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser

305 310 315 320

Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp

325 330 335

Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly

340 345 350

Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln

355 360 365

Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr

370 375 380

Leu Arg Trp

385

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对紫外线不稳定的肽

<220>

<221> 对紫外线不稳定的肽

<222> (1)..(1)

<223> Xaa 指对紫外线敏感的氨基酸, 3-氨基-2-(2-硝基苯基)

丙酸

<400> 17

Lys Ile Leu Gly Phe Val Phe Xaa Val

1 5

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> 巨细胞病毒

<220>

<221> CMV pp65 NLV

<222> (1)..(1)

<400> 18

Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val

1 5

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 爱泼斯坦-巴尔病毒

<220>

<221> EBV BRLF1 YVL

<222> (1)..(1)

<400> 19

Tyr Val Leu Asp His Leu Ile Val Val

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 巨细胞病毒

<220>

<221> CMV IE1 VLE

<222> (1)..(1)

<400> 20

Val Leu Glu Glu Thr Ser Val Met Leu

1 5

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> 流感病毒

<220>

<221> FLU MP GIL

<222> (1)..(1)

<400> 21

Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> 爱泼斯坦-巴尔病毒

<220>

<221> EBV BMF1 GLC

<222> (1)..(1)

<400> 22

Gly Leu Cys Thr Leu Val Ala Met Leu

1 5

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> 爱泼斯坦-巴尔病毒

<220>

<221> EBV LMP2 FLY

<222> (1)..(1)

<400> 23

Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu

1 5

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> gp100 ITD

<222> (1)..(1)

<400> 24

Ile Thr Asp Gln Val Pro Phe Ser Val

1 5

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> gp100 AML

<222> (1)..(1)

<400> 25

Ala Met Leu Gly Thr His Thr Met Glu Val

1 5 10

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> VANGL1 RLM

<222> (1)..(1)

<400> 26

Arg Leu Met Val Ala Val Glu Glu Ala

1 5

<210> 27

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> VANGL1(2) RLM

<222> (1)..(1)

<400> 27

Arg Leu Met Val Ala Val Glu Glu Ala Phe Ile

1 5 10

<210> 28

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> DYSF LLL

<222> (1)..(1)

<400> 28

Leu Leu Leu Phe Leu Thr Ile Phe Ile

1 5

<210> 29

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MEL VLY

<222> (1)..(1)

<400> 29

Val Leu Tyr Arg Tyr Gly Ser Phe Ser Val

1 5 10

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MEL KAS

<222> (1)..(1)

<400> 30

Lys Ala Ser Glu Lys Ile Phe Tyr Val

1 5

<210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> 默克尔细胞多瘤病毒

<220>

<221> MCV KLL

<222> (1)..(1)

<400> 31

Lys Leu Leu Glu Ile Ala Pro Asn Tyr

1 5

<210> 32

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A22-B63 A-条形码

<220>

<221> X' 5

<222> (1)..(1)

<223> X = 生物素-C6-

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(31)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 32

gaagttccag ccagcgtcac agtttnnnnn ntaatacgcc tgaggtgttg ggttgcggtc 60

agcatcattt cc 72

<210> 33

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A22-B64 A-条形码

<220>

<221> X' 5

<222> (1)..(1)

<223> X = 生物素-C6-

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(31)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 33

gaagttccag ccagcgtcac agtttnnnnn ntaatacgcc tgaggtgttg ggttgcggtc 60

agcatcattt cc 72

<210> 34

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A22-B65 A-条形码

<220>

<221> X' 5

<222> (1)..(1)

<223> X = 生物素-C6-

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(31)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 34

gaagttccag ccagcgtcac agtttnnnnn ntaatacgcc tgaggtgttg ggttgcggtc 60

agcatcattt cc 72

<210> 35

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A22-B71 A-条形码

<220>

<221> X' 5

<222> (1)..(1)

<223> X = 生物素-C6-

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(31)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 35

gaagttccag ccagcgtcac agtttnnnnn ntaatacgcc tgaggtgttg ggttgcggtc 60

agcatcattt cc 72

<210> 36

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A22-B75 A-条形码

<220>

<221> X' 5

<222> (1)..(1)

<223> X = 生物素-C6-

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(31)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 36

gaagttccag ccagcgtcac agtttnnnnn ntaatacgcc tgaggtgttg ggttgcggtc 60

agcatcattt cc 72

<210> 37

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A22-B63 B-条形码

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(29)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 37

gttatcggct cgttcacact cgannnnnnc cggttttata ccctcgttcc ccgaggaaat 60

gatgctgacc 70

<210> 38

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A22-B64 B-条形码

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(29)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 38

gttatcggct cgttcacact cgannnnnnc agaactacag gctggcatgg atgcggaaat 60

gatgctgacc 70

<210> 39

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A22-B65 B-条形码

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(29)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 39

gttatcggct cgttcacact cgannnnnna ttctgatggg tagaaaccgt tcccggaaat 60

gatgctgacc 70

<210> 40

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A22-B71 B-条形码

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(29)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 40

gttatcggct cgttcacact cgannnnnnt ttccttgttc ggatcggtcg agaaggaaat 60

gatgctgacc 70

<210> 41

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A22-B75 B-条形码

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(29)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 41

gttatcggct cgttcacact cgannnnnnc atatggattt gttgcatcct gatgggaaat 60

gatgctgacc 70

<210> 42

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物 (A-Key 2OS-F1-233)

<400> 42

ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag tgacaggttg gaagttccag ccagcgtc 58

<210> 43

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物 (P1R2)

<400> 43

gttatcggct cgttcacact cga 23

Claims (20)

1.一种在样品中检测一个或多个抗原肽反应性T细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

i.提供可加载的检测分子，所述可加载的检测分子包含至少一个无肽MHC I类分子和至少一个可检测标记，

ii.提供至少一个抗原肽，

iii.使可加载的所述检测分子与所述至少一个抗原肽接触以提供包含至少一种肽-MHC(pMHC)I类分子的加载的检测分子，

iv.使加载的所述检测分子与所述样品接触，和

v.检测加载的所述检测分子与所述一个或多个抗原肽反应性T细胞的结合，

其中所述至少一个抗原肽中的每一个都由以下表示：

-至少两个不同的可检测标记，或

-至少一个作为核酸标记的可检测标记，

其中所述无肽MHC I类分子包含重链，所述重链包含通过二硫键连接的α-1结构域和α-2结构域，所述重链包含选自以下的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：1，或

(b)与(a)中的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，

其中突变型半胱氨酸残基位于α-1结构域中氨基酸残基84或85处，突变型半胱氨酸残基位于α-2结构域中氨基酸残基139处。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述无肽MHC I类分子通过连接分子与所述无肽MHC I类分子上的亲和标签之间的非共价相互作用而附接到所述连接分子。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述连接分子是链霉亲和素，并且所述亲和标签是生物素。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可加载的检测分子包含至少两个无肽MHC I类分子，例如至少三个无肽MHC I类分子，优选四个无肽MHC I类分子。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可加载的检测分子包含通过链霉亲和素和每个无肽MHC I类分子上的生物素标签之间的非共价相互作用而附接到所述链霉亲和素的四个无肽MHC I类分子。

6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中所述至少一个可检测标记附接于所述连接分子。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤ii)中提供至少两个不同的抗原肽，例如至少三个，例如至少四个，例如至少五个，例如至少六个，例如至少七个，例如至少八个，例如至少九个，例如至少十个，例如至少十五个，例如至少二十个，例如至少二十五个，例如至少五十个，例如至少一百个不同的抗原肽。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一个抗原肽由至少两个不同的可检测标记表示，并且通过以下方法检测加载的所述检测分子与所述一个或多个抗原肽反应性T细胞的结合：通过加载的所述检测分子检测结合至抗原反应性T细胞的至少两个不同的可检测标记的存在。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述至少两个不同的可检测标记选自由荧光标志物，放射性同位素，磁性标记物和金属标记构成的群组。

10.根据权利要求8或9中任一项所述的方法，其中所述至少两个不同的可检测标记是荧光标志物。

11.根据权利要求8或9中任一项所述的方法，其中所述至少两个不同的可检测标记是金属标记。

12.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述至少一个可检测标记是核酸标记，所述核酸标记包含：

i.5′第一引物区域(正向)，条形码区域和3′第二引物区域(反向)，和

ii.随机核苷酸碱基的唯一分子标识符(UMI)区域

其中，所述条形码区域是用作所述检测分子的识别标签的唯一条形码。

13.一种可加载的检测分子，包含至少一个无肽MHC I类分子和核酸标记，

其中所述无肽MHC I类分子包含重链，该重链包含通过二硫键连接的α-1结构域和α-2结构域，所述重链包含选自以下的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：1，或

(b)与(a)中的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，

其中突变型半胱氨酸残基位于α-1结构域中的氨基酸残基84或85处，突变型半胱氨酸残基位于α-2结构域中的氨基酸残基139处。

14.根据权利要求13所述的可加载的检测分子，其中所述核酸标记如权利要求12中所限定。

15.根据权利要求13或14中任一项所述的可加载的检测分子，其中所述可加载的检测分子包含通过链霉亲和素和每个无肽MHC I类分子上的生物素标签之间的非共价相互作用而附接到所述链霉亲和素的四个无肽MHC I类分子。

16.一种在样品中检测一个或多个抗原肽反应性T细胞的组合物，所述组合物包含：

(a)至少两个根据权利要求13至15中任一项所述的可加载的检测分子，或

(b)至少三个可加载的检测分子，每个包含至少一个无肽MHC I类分子和至少一个可检测标记，其中每个可加载的检测分子包含不同的可检测标记，

其中所述无肽MHC I类分子包含重链，所述重链包含通过二硫键连接的α-1结构域和α-2结构域，所述重链包含选自以下的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：1，或

(b)与(a)中的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，

其中突变型半胱氨酸残基位于α-1结构域中的氨基酸残基84或85处，突变型半胱氨酸残基位于α-2结构域中的氨基酸残基139处。

17.根据权利要求13至15中任一项所述的可加载的检测分子或根据权利要求16的组合物在样品中检测一种或多种抗原肽反应性T细胞中的用途。

18.一种在样品中检测一个或多个抗原肽反应性T细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：

i.根据权利要求13至15中任一项所述的可加载的检测分子或根据权利要求16所述的组合物，

ii.至少一个抗原肽，和

iii.任选地，使用说明书。

19.一种确定T细胞受体(TCR)或抗原肽反应性T细胞与抗原肽库之间相互作用的方法，所述方法包括以下步骤：

i.提供根据权利要求13至15中任一项所述的可加载的检测分子，

ii.提供抗原肽库，

iii.使可加载的检测分子与所述抗原肽库接触，以提供包含肽-MHC(pMHC)I类分子的加载的检测分子库，

iv.使T细胞受体(TCR)或抗原肽反应性T细胞与加载的检测分子库接触，和

v.用加载的检测分子库检测所述T细胞受体(TCR)或抗原肽反应性T细胞的结合。

20.根据权利要求13至15中任一项所述的可加载的检测分子在确定T细胞受体(TCR)或抗原肽反应性T细胞与抗原肽库之间的相互作用中的用途。

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