JPWO2003048363A1

JPWO2003048363A1 - 対応付け分子とｃ末端ラベル化蛋白質の複合体および対応付け分子の複合体、ならびにそれらの複合体を利用した蛋白質間相互作用解析方法

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Publication number: JPWO2003048363A1
Application number: JP2003549540A
Authority: JP
Inventors: 宮本　悦子; 悦子宮本; 高嶋　秀昭; 秀昭高嶋; 柳川　弘志; 弘志柳川
Original assignee: Keio University
Current assignee: Keio University
Priority date: 2001-12-07
Filing date: 2002-12-09
Publication date: 2005-04-14
Anticipated expiration: 2022-12-09
Also published as: WO2003048363A1; JP4030019B2; AU2002354116A1

Abstract

遺伝子型と表現型の対応付け分子と、Ｃ末端がピューロマイシン又はその誘導体を含むＣ末端ラベル化剤によりラベル化されたＣ末端ラベル化蛋白質との相互作用によって形成される複合体であって、対応付け分子を構成する蛋白質部分以外の部分および該Ｃ末端ラベル化剤がそれぞれ相互作用解析に必要な修飾を受けている、対応付け分子とＣ末端ラベル化蛋白質の複合体を形成する対応付け分子およびＣ末端ラベル化蛋白質を用いる蛋白質間相互作用の解析方法。複数の、遺伝子型と表現型の対応付け分子を含み、該対応付け分子間の相互作用によって形成される複合体であり、対応付け分子間の相互作用解析に必要な修飾を、対応付け分子を構成する蛋白質部分以外の部分に有することを特徴とする対応付け分子の複合体を形成する対応付け分子を用いる蛋白質間相互作用の解析方法。

Description

技術分野
本発明は、対応付け分子とＣ末端ラベル化蛋白質の複合体および対応付け分子の複合体、ならびにそれらの複合体を利用した蛋白質間相互作用解析方法に関する。
背景技術
現在、ウイルスからヒトまで多様な生物のゲノムの塩基配列が解読されようとしている。ゲノムシーケンスの研究では、第２幕のポストシーケンスの研究として、解読したゲノム情報からその意味を解析する研究、すなわち、遺伝子や蛋白質の機能解析の研究が期待されている（ＳａｅｇｕｓａＡ．Ｊａｐａｎｂｏｏｓｔｓｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓａｎｄｃｅｌｌｂｉｏｌｏｇｙ．．．Ｎａｔｕｒｅ４０１，６７５１（１９９９），ＤａｌｔｏｎＲ，ＡｂｂｏｔｔＡ．Ｃａｎｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓｆｉｎｄｒｅｃｉｐｅｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｃｈｉｐｓ？Ｎａｔｕｒｅ４０２，６７６３（１９９９））。
蛋白質と遺伝子との間の機能解析における大きな違いの１つは、蛋白質の多くが、生体内で複数で関わり合って相互作用しながら機能を果たしていると言う点である。たとえば細胞が外界からホルモンなどの刺激を受けて、レセプターに結合すると、様々な蛋白質が構造を変え、様々な蛋白質と相互作用することで、膜内と細胞質内の一連のシグナル伝達系が動き出し、最終的には核内の転写調節系におよび、特定の遺伝子の発現が制御される。このような様々な蛋白質−蛋白質間相互作用のネットワークである遺伝子ネットワークを解析することが、ポストゲノム機能解析の新しい大きな研究テーマとなっている（宮本悦子、柳川弘志（２０００）シリーズ・ポストシークエンスのゲノム科学３：プロテオミクス，ｐｐ．１３６−１５６；宮本悦子、柳川弘志（２００１）蛋白質・核酸・酵素、４６（２），ｐｐ．１３８−１４７）。このようなポストゲノム機能解析によって、蛋白質間相互作用ネットワーク解析から重要な生体酵素の発見などによる医薬品の創製が期待され、医療、食料、エネルギー、環境など多くの分野の産業で優れたネットワーク解析技術が所望されている。
遺伝子機能の解析技術としては、コンピューターによる大量のゲノムシーケンスデータの中から、蛋白質の構造解析より得た機能モチーフパターンを見つけ出すアルゴリズムなどを駆使して遺伝子機能を解析するバイオインフォマティックス（ＳａｌｉＡ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｉｎｋｓｂｅｔｗｅｅｎｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ４０２，２３（１９９９））、ＤＮＡチップなどによりどの遺伝子がいつ働いているかという生物学的情報を得ることを目的とした遺伝子発現プロファイルを解析するトランスクリプトミクス（ＳｃｈｅｎａＭ，ｅｔａｌ．ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｗｉｔｈａｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＤＮＡｍｉｃｒｏａｒｒａｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０，４６７（１９９５））、そして、二次元ゲル電気泳動によるプロテオームの分離と質量分析計による同定（ＢｌａｃｋｓｔｏｃｋＷ．．Ｐ，ＷｅｉｒＭ．．Ｐ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎｄｐｈｙｓｉｃａｌｍａｐｐｉｎｇｏｆｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３，１２１（１９９９））や、蛋白質チップ（ＤａｌｔｏｎＲ，ＡｂｂｏｔｔＡ．Ｃａｎｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓｆｉｎｄｒｅｃｉｐｅｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｃｈｉｐｓ？Ｎａｔｕｒｅ４０２，６７６３（１９９９））による蛋白質発現プロファイルを解析するプロテオミクスなどがある。これらの研究の中でも、ゲノムに対するプロテオーム（蛋白質の総体）の研究であるプロテオミクスが特に注目されている。
進化分子工学のツールとして誕生した「遺伝子（遺伝子型）と蛋白質（表現型）の対応付け」を応用して、ポストゲノム機能解析における蛋白質間相互作用を網羅的に解析する方法として、ｉｎｖｉｔｒｏウイルス法（Ｍｉｙａｍｏｔｏ−ＳａｔｏＥ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｃｏｎｓｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｖｉｒｕｓｔｙｐｅａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｍｏｌｅｃｕｌｅｉｎｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ＶｉｖａＯｒｉｇｉｎｏ２５，３５（１９９７），ＮｅｍｏｔｏＮ，ｅｔａｌ．Ｉｎｖｉｔｒｏｖｉｒｕｓ：ＢｏｎｄｉｎｇｏｆｍＲＮＡｂｅａｒｉｎｇｐｕｒｏｍｙｃｉｎａｔｔｈｅ３’−ｔｅｒｍｉｎａｌｅｎｄｔｏｔｈｅＣ−ｔｅｒｍｉｎａｌｅｎｄｏｆｉｔｓｅｎｃｏｄｅｄｐｒｏｔｅｉｎｏｎｔｈｅｒｉｂｏｓｏｍｅｉｎｖｉｔｒｏ．ＦＥＢＳＬｅｔｔ．４１４，４０５（１９９７），ＷＯ９８／１６６３６）、ＳＴＡＢＬＥ法（ＤｏｉＮ，ＹａｎａｇａｗａＨ．ＳＴＡＢＬＥ：ｐｒｏｔｅｉｎ−ＤＮＡｆｕｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｆｏｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｐｒｏｔｅｉｎｌｉｂｒａｒｉｅｓｉｎｖｉｔｒｏ．ＦＥＢＳＬｅｔｔ．４５７，２２７（１９９９））、ファージディスプレー法（ＳｍｉｔｈＧ．Ｐ．Ｓｅａｒｃｈｉｎｇｆｏｒｐｅｐｔｉｄｅｌｉｇａｎｄｓｗｉｔｈａｎｅｐｉｔｏｐｅｌｉｂｒａｒｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８，１３１５（１９８５））、リボソーム・ディスプレイ法（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．ｅｔａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１，９０２２−９０２６，Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．＆Ｄｏｗｅｒ，Ｗ．Ｊ．（１９９５）ＷＯ９５／１１９２２））、ｍＲＮＡ−ペプチドフュージョン（ｍＲＮＡディスプレイ）法（ＲｏｂｅｒｔｓＲ．Ｗ，ＳｚｏｓｔａｋＪ．Ｗ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４，１２２９７）などが知られている。
これらの方法は、遺伝子ライブラリーを無細胞翻訳によってその遺伝子がコードしている蛋白質をもつ対応付けライブラリーとすることにより、ある蛋白質（ベイト）と相互作用する蛋白質をもつ対応付け分子の遺伝子群を網羅的に検出（対応付け分子の遺伝子部分を利用してＰＣＲで増幅して検出）するシステムである。このシステムが共通して抱えている問題点は、ライブラリーから網羅的にスクリーニングによって濃縮され絞り込まれた対応付け分子の遺伝子群の詳細な複合体の解析、すなわち、詳細な蛋白質間相互作用解析をいかにハイスループットに行うかである。
蛋白質間の相互作用を解析する方法としては、免疫沈降（Ｘｉｏｎｇｅｔａｌ．１９９３Ｎａｔｕｒｅ３６６，７０１−７０４）、ＧＳＴ融合蛋白質によるプルダウン・アッセイ（Ｋａｅｌｉｎ，ｅｔａｌ．１９９１Ｃｅｌｌ６４，５２１−５３２）、ＴＡＰ法（ＧｕｉｌｌａｕｍｅＲｉｇａｕｔ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１７，１０３０（１９９９））、酵母ツーハイブリッド法（ＦｉｅｌｄｓＳ，ＳｏｎｇＯ．Ａｎｏｖｅｌｇｅｎｅｔｉｃｓｙｓｔｅｍｔｏｄｅｔｅｃｔｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ３４０，２４５（１９８９））などが知られている。免疫沈降法では、基本的に目的蛋白質の抗体がないと検出できない。ＧＳＴ融合蛋白質によるプルダウン・アッセイでは、ベイトをＧＳＴ融合蛋白質として大腸菌などで大量発現させるため、ベイトの準備に手間がかかる。ＴＡＰ法は、細胞で発現した蛋白質の複合体を網羅的にスクリーニングした後、その複合体の蛋白質を質量分析などで解析する必要がある。酵母ツーハイブリッド法では、酵母の細胞内で、あらゆる生物種からの２種類の蛋白質間の相互作用を調べることが出来るが、酵母細胞で発現するものに限られる。また、１組づつ解析していく必要があり、大規模な総当たり解析が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｉｔｏｅｔａｌ．２０００ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９７（３），１１４３−７；Ｕｅｔｚｅｔａｌ．２０００Ｎａｔｕｒｅ４０３（６７７０），６２３−７）、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ（Ｒａｉｎｅｔａｌ．２００１Ｎａｔｕｒｅ４０９，２１１−２１５）、そしてＣ．ｅｌｅｇａｎｓ（Ｗａｌｈｏｕｔｅｔａｌ．２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８７（５４５０），１１６−２２）で報告されているが、そのハイスループット化は容易ではない。また、Ｃ末端ラベル化法（Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．，Ｎｅｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．，Ｙａｎａｇａｗａ，Ｈ．：ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２８：１１７６−１１８２（２０００）、特開平１１−３２２７８１）も提案されてきているが、ラベル化剤の分離や未ラベル化蛋白質の分離などに手間のかかる点で改良の余地がある。
その他、蛋白質間相互作用の測定法として、表面プラズモン共鳴法、蛍光共鳴エネルギー移動法、蛍光偏光解析法、エバネッセント場イメージング法、蛍光相関分光法、蛍光イメージング法などが知られているが、特に、蛍光相関分光法（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＳ）は、測定に必要な試料量が少なく、測定時間も短く、ハイスループットな測定法として期待されている。さらに、二種類の蛍光色素を用いる蛍光相互相関分光法（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＣｒｏｓｓ−ＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎＳｐｅｃｔｒｏ−ｓｃｏｐｙ：ＦＣＣＳ）では、一種類の蛍光色素を用いるＦＣＳでは困難であった同程度の大きさをもつ分子間の相互作用も検出が可能であり、蛋白質間相互作用のハイスループットな測定法として期待される。
発明の開示
本発明の目的は、新規な蛋白質間相互作用解析方法を提供することである。特には、ハイスループットな蛋白質間相互作用解析を実現することである。
ハイスループットな蛋白質間相互作用解析を実現するために解決しなければならない主な問題は、従来のどのような相互作用測定法を利用するにしても、相互作用解析のための蛋白質の準備をなるべく簡単にすることである。すなわち、蛋白質合成、検出や固定のためのタグや蛍光色素などによる蛋白質の修飾、修飾した蛋白質の分離・精製、そして相互作用の形成などの各工程を出来る限り簡略化することである。
本発明者等は上記課題を達成すべく鋭意研究の結果、対応付け分子であるＩＶＶとＣ末端ラベル化法によるＣ末端ラベル化蛋白質の複合体または対応付け分子の複合体を利用することで、蛋白質間の相互作用を解析できることを見出した。また、特定の態様で対応付け分子とＣ末端ラベル化蛋白質を用いること、または、特定の態様の対応付け分子を用いることで、ハイスループットな蛋白質間相互作用解析を実現できることを見いだした。従って、本発明は以下の複合体及びそれを用いる蛋白質相互作用解析方法を提供する。
従って、本発明は、以下のものを提供する。
１．遺伝子型と表現型の対応付け分子と、Ｃ末端がピューロマイシン又はその誘導体を含むＣ末端ラベル化剤によりラベル化されたＣ末端ラベル化蛋白質との相互作用によって形成される複合体であって、対応付け分子を構成する蛋白質部分以外の部分および該Ｃ末端ラベル化剤がそれぞれ相互作用解析に必要な修飾を受けている、対応付け分子とＣ末端ラベル化蛋白質の複合体。
２．一種類の対応付け分子と一種類のＣ末端ラベル化蛋白質から構成され、該対応付け分子が含む蛋白質と該Ｃ末端ラベル化蛋白質が同一あるいは異なる、１記載の複合体。
３．該複合体が一種類の対応付け分子と二種類以上のＣ末端ラベル化蛋白質から構成される、１記載の複合体。
４．対応付け分子が、スペーサーを介して蛋白質とそれをコードするｍＲＮＡを連結した対応付け分子であり、該対応付け分子のスペーサーに対応付け分子間の相互作用解析に必要な修飾を有する、１〜３のいずれか１項に記載の複合体。
５．無細胞翻訳系で、Ｃ末端ラベル化剤の存在下で、該ｍＲＮＡと該Ｃ末端ラベル化蛋白質の蛋白質をコードするｍＲＮＡが翻訳されることにより対応付け分子とＣ末端ラベル化蛋白質が同時に生成し、生成した対応付け分子とＣ末端ラベル化蛋白質との間で相互作用することで形成される複合体であって、無細胞翻訳系におけるＣ末端ラベル化剤の濃度が、該Ｃ末端ラベル化蛋白質のラベル化効率に十分で、かつ該対応付け分子の形成を阻害しない範囲である、４記載の複合体。
６．相互作用解析に必要な修飾が検出用修飾および分離用修飾である４又は５記載の複合体。
７．該対応付け分子がスペーサーに検出用修飾を有する、６記載の複合体。
８．該対応付け分子がスペーサーに分離用修飾を有する、６記載の複合体。
９．該対応付け分子がスペーサーに検出用修飾および分離用修飾を有する、６記載の複合体。
１０．該Ｃ末端ラベル化蛋白質のラベル化剤が検出用修飾を有する、４〜９のいずれか１項に記載の複合体。
１１．該Ｃ末端ラベル化蛋白質のラベル化剤が分離用修飾を有する、４〜９のいずれか１項に記載の複合体。
１２．該Ｃ末端ラベル化蛋白質のラベル化剤が検出用修飾および分離用修飾を有する、４〜９のいずれが１項に記載の複合体。
１３．分離用修飾として蛍光性物質を有する、８記載の複合体。
１４．検出用修飾として固定化物質を有する、９記載の複合体。
１５．検出用修飾として蛍光性物質および分離用修飾として固定化物質を有する、９記載の複合体。
１６．検出用修飾として蛍光性物質を有する、１０記載の複合体。
１７．分離用修飾として固定化物質を有する、１１記載の複合体。
１８．検出用修飾として蛍光性物質および分離用修飾として固定化物質を有する、１２記載の複合体。
１９．対応付け分子がスペーサーにＣｙ５を有する場合は、該Ｃ末端ラベル化蛋白質のラベル化剤がローダミングリーンを有する、１３または１５記載の複合体。
２０．対応付け分子がスペーサーにローダミングリーンを有する場合は、該Ｃ末端ラベル化蛋白質のラベル化剤がＣｙ５を有する、１３または１５記載の複合体。
２１．固定化物質がビオチンである、１４、１５、１７及び１８のいずれか１項に記載の複合体。
２２．対応付け分子からｍＲＮＡが除去されている、４〜２１のいずれか１項に記載の複合体。
２３．１〜２２に記載された複合体を形成する対応付け分子及びＣ末端ラベル化分子を用いる蛋白質間相互作用の解析方法であって、対応付け分子を固定化することを特徴とする、解析方法。
２４．１〜２２に記載された複合体を形成する対応付け分子及びＣ末端ラベル化分子を用いる蛋白質間相互作用の解析方法であって、対応付け分子を固定化しないことを特徴とする蛋白質間相互作用の解析方法。
２５．ＲＩもしくは蛍光イメージングアナライズ法による、またはＤＮＡチップもしくはプロテインチップを用いる、２３記載の解析方法。
２６．蛍光相互相関分析法による、２４記載の解析方法。
２７．複数の、遺伝子型と表現型の対応付け分子を含み、該対応付け分子間の相互作用によって形成される複合体であり、対応付け分子間の相互作用解析に必要な修飾を、対応付け分子を構成する蛋白質部分以外の部分に有することを特徴とする対応付け分子の複合体。
２８．同一あるいは異なる蛋白質を含む２種類の対応付け分子からなる、２７記載の複合体。
２９．同一あるいは異なる蛋白質を含む３種類以上の対応付け分子からなる、２７又は２８記載の複合体。
３０．対応付け分子が、スペーサーを介して蛋白質とそれをコードするｍＲＮＡを連結した対応付け分子であり、かつ該対応付け分子のスペーサーに、対応付け分子間の相互作用解析に必要な修飾を有する、２７〜２９のいずれか１項に記載の複合体。
３１．無細胞翻訳系で複数のｍＲＮＡが翻訳されることにより複数の対応付け分子が同時に生成し、生成した対応付け分子間で相互作用することで形成される、３０記載の複合体。
３２．相互作用解析に必要な修飾が検出用修飾および分離用修飾である、３０又は３１記載の複合体。
３３．対応付け分子の少なくとも一つがスペーサーに検出用修飾を有する、３２記載の複合体。
３４．対応付け分子の少なくとも一つがスペーサーに分離用修飾を有する、３２記載の複合体。
３５．対応付け分子の少なくとも一つがスペーサーに分離用修飾を有し、残りの少なくとも一つがスペーサーに検出用修飾を有する、３２記載の複合体。
３６．検出用修飾として蛍光性物質を有する、３２、３３及び３５のいずれか１項に記載の複合体。
３７．分離用修飾として、固定化物質を有する、３２、３４及び３５のいずれか１項に記載の複合体。
３８．検出用修飾として蛍光性物質、および分離用修飾として固定化物質を有する、３５記載の複合体。
３９．固定化物質がビオチンである、３７又は３８記載の複合体。
４０．対応付け分子の少なくとも一つがスペーサーに検出用修飾としてＣｙ５を有し、残りの対応付け分子が検出用修飾としてローダミングリーンを有する、３６又は３８記載の複合体。
４１．対応付け分子の少なくとも一つがスペーサーに検出用修飾としてローダミングリーンを有し、残りの対応付け分子がスペーサーに検出用修飾としてＣｙ５を有することを特徴とする複合体。
４２．対応付け分子が、ｍＲＮＡが除去された対応付け分子であり、ｍＲＮＡが除去された対応付け分子間の相互作用によって形成される３０〜４１のいずれか１項に記載の複合体。
４３．ｍＲＮＡが除去された対応付け分子のスペーサーに検出用修飾を有する、４２記載の複合体。
４４．ｍＲＮＡが除去された対応付け分子のスペーサーに分離用修飾を有する、４２記載の複合体。
４５．ｍＲＮＡが除去された対応付け分子のスペーサーに分離用修飾および検出用修飾を有する、４２記載の複合体。
４６．２７〜４５のいずれか１項に記載された複合体を形成する対応付け分子を用いる蛋白質間相互作用の解析方法であって、対応付け分子を固定化することを特徴とする、解析方法。
４７．２７〜４５のいずれか１項に記載された複合体を形成する対応付け分子をを用いる蛋白質間相互作用の解析方法であって、対応付け分子を固定化しないことを特徴とする、解析方法。
４８．ＲＩもしくは蛍光イメージングアナライズ法による、またはＤＮＡチップもしくはプロテインチップを用いる、４６記載の解析方法。
４９．蛍光相互相関分析法による、４７記載の解析方法。
５０．スペーサーを介して蛋白質とそれをコードするｍＲＮＡを連結した対応付け分子からｍＲＮＡを除去することにより得られる対応付け分子であって、スペーサーが、蛋白質のＣ末端に結合した、ピューロマイシンあるいはピューロマイシンと少なくとも１残基のＤＮＡあるいは／またはＲＮＡからなるペプチドアクセプター領域、ペプチドアクセプター領域に結合した、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域、及び、ＰＥＧ領域に結合した、少なくとも１残基のＤＮＡあるいは／またはＲＮＡの塩基に機能修飾を施した機能付与ユニットを含む、対応付け分子。
発明を実施するための最良の形態
蛋白質間の相互作用を解析する際に、それら相互作用している蛋白質の複合体を分離し、検出する工程が必要である。これまで、融合蛋白質などにより分離用の修飾を施したものと、ｉｎｖｉｔｒｏウイルスなどの対応付け分子により検出用の修飾（遺伝子型の遺伝子タグのＲＴ−ＰＣＲによる増幅）を施したものとの複合体とそれを利用した蛋白質間の相互作用の解析については早くから提案してきたが（宮本悦子、柳川弘志（２０００）シリーズ・ポストシークエンスのゲノム科学３：プロテオミクス，ｐｐ．１３６−１５６；宮本悦子、柳川弘志（２００１）蛋白質・核酸・酵素、４６（２），ｐｐ．１３８−１４７）、本発明は、ＩＶＶのスペーサーに分離用あるいは検出用の機能を持たせて、ＩＶＶとＣ末端ラベル化蛋白質との相互作用による複合体を利用して蛋白質間の相互作用を解析するもので、これまでそのような発想は皆無であった。その理由としては、対応付け分子の本来の目的である遺伝子型を増幅して表現型を検出する技術を必ずしもここでは利用しないことが挙げられる。すなわち、本発明では、融合蛋白などの設計は全く必要ない。特にＩＶＶを用いた場合には、ＩＶＶの形成時に、同時にＩＶＶのスペーサーに分離用の修飾（ベイトＩＶＶと呼ぶことがある。）あるいは／および検出用の修飾（プレイＩＶＶと呼ぶことがある。）を施すことが可能で、さらに、Ｃ末端ラベル化法によりＣ末端ラベル化蛋白質のＣ末端ラベル化剤に分離用の修飾（ベイトＣ末端ラベル化蛋白質と呼ぶことがある。）あるいは／および検出用の修飾（プレイＣ末端ラベル化蛋白質と呼ぶことがある。）を施すことが可能である。この様な特徴を持つＩＶＶとＣ末端ラベル化蛋白質との相互作用による複合体を利用して蛋白質間の相互作用解析を可能としたものである。また、特にＩＶＶを用いた場合には、ＩＶＶの形成時に、同時にＩＶＶのスペーサーに分離用の修飾（ベイトＩＶＶと呼ぶことがある。）および検出用の修飾（プレイＩＶＶと呼ぶことがある。）を施すことが可能で、さらに、ＩＶＶ間相互作用による複合体を利用して蛋白質間の相互作用解析を可能としたものである。すなわち、ハイスループットなプロテオーム解析法として、対応付け分子であるＩＶＶをこれまでとは異なる方法で利用することで、上記の課題を解決し、蛋白質間相互作用解析を行うことができる。
以上により、従来のｉｎｖｉｔｒｏｖｉｒｕｓ法などによりライブラリーから網羅的にスクリーニングによって濃縮された対応付け分子の遺伝子群の詳細な複合体の解析、すなわち、詳細な蛋白質間相互作用解析をハイスループットに行うことができる。以下、詳細に説明する。
＜１＞本発明の複合体を構成する対応付け分子
本明細書において、対応付け分子とは、表現型と遺伝子型と対応付ける分子を意味する。対応付け分子は、遺伝子型を反映する塩基配列を有する核酸を含む遺伝子型分子と、表現型の発現に関与するタンパク質を含む表現型分子とが結合してなる。遺伝子型分子は、遺伝子型を反映する塩基配列を、その塩基配列が翻訳され得るような形態で有するコード分子と、スペーサー部とが結合してなる。
対応付け分子における、表現型分子に由来する部分、スペーサー分子に由来する部分、及び、コード分子に由来する部分をそれぞれ、デコード部、スペーサー部及びコード部と呼ぶ。また、遺伝子型分子における、スペーサー分子に由来する部分、及び、コード分子に由来する部分をそれぞれ、スペーサー部及びコード部と呼ぶ。
図８に、対応付け分子、スペーサー分子及びコード分子の一例の大まかな構成を示す。この対応付け分子は、ピューロマイシンを含むスペーサー（スペーサー部と呼ぶ）と表現型のコードを反映する塩基配列（コード部と呼ぶ）からなる。この対応付け分子は、コード分子に何らかの方法によってピューロマイシンを含むスペーサー部を結合して遺伝子型分子とし、無細胞翻訳系において、リボソーム上で表現型分子と連結した構成をもつ。スペーサー分子は、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域、少なくともピューロマイシンあるいはピューロマイシンと１残基以上のＤＮＡあるいは／またはＲＮＡからなるＣＣＡ領域、少なくとも１残基以上のＤＮＡあるいは／またはＲＮＡを含むドナー領域、さらに、少なくとも１残基のＤＮＡあるいは／またはＲＮＡの塩基に機能修飾を施した機能付与ユニット（Ｘ）からなる。コード分子は、デコード部の一部の配列からなるＤＮＡあるいは／またはＲＮＡのポリＡ配列を含む３’末端領域、および、ＤＮＡあるいは／またはＲＮＡからなる転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含んだ５’ＵＴＲ、さらに、主として表現型分子の配列からなるＯＲＦ領域から構成される。以下、この例を参照して説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
＜１−１＞スペーサー分子
スペーサー分子は、核酸の３’末端に結合できるドナー領域と、ドナー領域に結合した、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域と、ＰＥＧ領域に結合した、ペプチド転移反応によってペプチドと結合し得る基を含むペプチドアクセプター領域とを含む。
核酸の３’末端に結合できるドナー領域は、通常、１以上のヌクレオチドからなる。ヌクレオチドの数は、通常には１〜１５、好ましくは１〜２である。ヌクレオチドはリボヌクレオチドでもデオキシリボヌクレオチドでもよい。
ドナー領域の５’末端の配列は、ライゲーション効率を左右する。コード部とスペーサー部をライゲーションさせるためには、少なくとも１残基以上を含むことが必要であり、ポリＡ配列をもつアクセプターに対しては、少なくとも１残基のｄＣ（デオキシシチジル酸）あるいは２残基のｄＣｄＣ（ジデオキシシチジル酸）が好ましい。塩基の種類としては、Ｃ＞Ｕ又はＴ＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。
ＰＥＧ領域はポリエチレングリコールを主成分とするものである。ここで、主成分とするとは、ＰＥＧ領域に含まれるヌクレオチドの数の合計が２０ｂｐ以下、又は、ポリエチレングリコールの平均分子量が４００以上であることを意味する。好ましくは、ヌクレオチドの合計の数が１０ｂｐ以下、又は、ポリエチレングリコールの平均分子量が１０００以上であることを意味する。
ＰＥＧ領域のポリエチレングリコールの平均分子量は、通常には、４００〜３０，０００、好ましくは１，０００〜１０，０００、より好ましくは２，０００〜８，０００である。ここで、ポリエチレングリコールの分子量が約４００より低いと、このスペーサー分子に由来するスペーサー部を含む遺伝子型分子を対応付け翻訳したときに、対応付け翻訳の後処理が必要となることがあるが（Ｌｉｕ，Ｒ．，Ｂａｒｒｉｃｋ，Ｅ．，Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ．（２０００）ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３１８，２６８−２９３）、分子量１０００以上、より好ましくは２０００以上のＰＥＧを用いると、対応付け翻訳のみで高効率の対応付けができるため、翻訳の後処理が必要なくなる。また、ポリエチレングリコールの分子量が増えると、遺伝子型分子の安定性が増す傾向があり、特に分子量１０００以上で良好であり、分子量４００以下ではＤＮＡスペーサーと性質がそれほどかわらず不安定となることがある。
ペプチドアクセプター領域は、ペプチドのＣ末端に結合できるものであれば特に限定されないが、例えば、ピューロマイシン、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（３’−Ｎ−Ａｍｉｎｏａｃｙｌｐｕｒｏｍｙｃｉｎａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＰＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として３’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（３’−Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＡＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシドあるいはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシドあるいはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸あるいはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。
ペプチドアクセプター領域は、好ましくは、ピューロマイシンもしくはその誘導体、又は、ピューロマイシンもしくはその誘導体と１残基もしくは２残基のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなることが好ましい。ここで、誘導体とはタンパク質翻訳系においてペプチドのＣ末端に結合できる誘導体を意味する。ピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシン構造を完全に有しているものに限られず、ピューロマイシン構造の一部が欠落しているものも包含する。ピューロマイシン誘導体の具体例としては、ＰＡＮＳ−アミノ酸、ＡＡＮＳ−アミノ酸などが挙げられる。
ペプチドアクセプター領域は、ピューロマイシンのみの構成でもかまわないが、５’側に１残基以上のＤＮＡあるいは／またはＲＮＡからなる塩基配列を持つことが好ましい。配列としては、ｄＣ−ピューロマイシン，ｒＣ−ピューロマイシンなど、より好ましくはｄＣｄＣ−ピューロマイシン，ｒＣｒＣ−ピューロマイシン，ｒＣｄＣ−ピューロマイシン，ｄＣｒＣ−ピューロマイシンなどの配列で、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端を模倣したＣＣＡ配列（Ｐｈｉｌｉｐｐｓ，Ｇ．Ｒ．（１９６９）Ｎａｔｕｒｅ２２３，３７４−３７７）が適当である。塩基の種類としては、Ｃ＞Ｕ又はＴ＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。
スペーサー分子は、ドナー領域とＰＥＧ領域との間に、少なくとも１つの機能付与ユニットを含むことが好ましい。機能付与ユニットは、好ましくは、少なくとも１残基のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの塩基に機能修飾を施したものである。例えば、機能修飾物質として、図９に示した蛍光物質、ビオチン、あるいはＨｉｓ−ｔａｇなど各種分離タグなどを導入したものが可能である。
図９に、スペーサー分子の一例の詳細な構成を示す。スペーサー分子は、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域、ピューロマイシンあるいはピューロマイシンと少なくとも１残基のＤＮＡあるいは／またはＲＮＡからなるＣＣＡ領域、少なくとも１残基以上のＤＮＡあるいは／またはＲＮＡを含むドナー領域、さらに、少なくとも１残基のＤＮＡあるいは／またはＲＮＡの塩基に機能修飾を施した機能付与ユニット（Ｘ）からなる。ここでは、機能付与ユニット（Ｘ）として蛍光物質Ｔ（Ｆｌ）とビオチンＴ（Ｂｉｏ）が用いられている。
＜１−２＞コード分子
コード分子は、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む５’非翻訳領域と、５’非翻訳領域の３’側に結合した、タンパク質をコードするＯＲＦ領域と、ＯＲＦ領域の３’側に結合した、ポリＡ配列及び、必要によりその５’側に翻訳増強配列（例えば制限酵素ＸｈｏＩが認識する配列）を含む３’末端領域を含む核酸である。
コード分子は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、ＲＮＡの場合、５’末端にＣａｐ構造があってもなくても良い。また、コード分子は任意のベクターやプラスミドに組み込まれたものとしてもよい。
３’末端領域は、好ましくはＳＮＮＳ配列（例えばＸｈｏＩ配列）とその下流にポリＡ配列を含む。スペーサー分子とコード分子とのライゲーション効率に影響を与える要素としては３’末端領域のポリＡ配列が重要であり、ポリＡ配列は、少なくとも２残基以上のｄＡあるいは／またはｒＡの混合あるいは単一のポリＡ連続鎖であり、好ましくは、３残基以上、より好ましくは６以上、さらに好ましくは８残基以上のポリＡ連続鎖である。
コード分子の翻訳効率に影響する要素としては、転写プロモーターと翻訳エンハンサーからなる５’ＵＴＲ、および、ポリＡ配列を含む３’末端領域の組み合わせがある。３’末端領域のポリＡ配列の効果は通常には１０残基以下で発揮され。５’ＵＴＲの転写プロモーターはＴ７／Ｔ３あるいはＳＰ６などが利用でき、特に制限はない。好ましくはＳＰ６であり、特に、翻訳のエンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用する場合はＳＰ６を用いることが特に好ましい。翻訳エンハンサーは好ましくはオメガ配列の一部であり、オメガ配列の一部としては、ＴＭＶのオメガ配列（ＧａｌｌｉｅＤ．Ｒ．，ＷａｌｂｏｔＶ．（１９９２）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，ｖｏｌ．２０，４６３１−４６３８）の一部（０２９）を含んだものが好ましい。
また、翻訳効率に関し、３’末端領域においては、ＸｈｏＩ配列とポリＡ配列の組み合わせが重要となる。また、ＯＲＦ領域の下流部分、すなわちＸｈｏＩ配列の上流に親和性タグがついたものとポリＡ配列の組み合わせも重要となる。親和性タグ配列としては、抗原抗体反応など、タンパク質を検出できるいかなる手段を用いるための配列であればよく、制限はない。好ましくは、抗原抗体反応によるアフィニティー分離分析用タグであるＦｌａｇ−ｔａｇ配列である。ポリＡ配列効果としては、Ｆｌａｇ−ｔａｇ等の親和性タグにＸｈｏＩ配列がついたものとそこへさらにポリＡ配列がついたものの翻訳効率が上昇する。
上記の翻訳効率に関し効果のある構成は、対応付け効率にも有効である。
ＯＲＦ領域については、ＤＮＡあるいは／またはＲＮＡからなるいかなる配列でもよい。遺伝子配列、エキソン配列、イントロン配列、ランダム配列、あるいは、いかなる自然界の配列、人為的配列が可能であり、配列の制限はない。また、コード分子の５’ＵＴＲをＳＰ６＋０２９とし、３’末端領域を、たとえば、Ｆｌａｇ＋ＸｈｏＩ＋Ａ_ｎ（ｎ＝８）とすることで、各長さは、５’ＵＴＲで約６０ｂｐ、３’末端領域で約４０ｂｐであり、ＰＣＲのプライマーにアダプター領域として組み込める長さである。このため、あらゆるベクターやプラスミドやｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって、５’ＵＴＲと３’末端領域をもったコード分子を簡単に作成できる。コード分子において、翻訳はＯＲＦ領域を超えてされてもよい。すなわち、ＯＲＦ領域の末端に終止コドンがなくてもよい。
図１０に、コード分子の一例の詳細な構成を示す。コード分子は、３’末端領域と、ＤＮＡあるいは／またはＲＮＡからなる転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む５’ＵＴＲと、デコード部の配列情報からなる、すなわち表現型タンパク質をコードするＯＲＦ領域とからなる。ここでは、３’末端領域として、ＤＮＡあるいは／またはＲＮＡからなる親和性タグ配列、ＸｈｏＩ配列、ポリＡ配列を含み、Ｆｌａｇ−ｔａｇ配列を用いている。５’ＵＴＲとして、転写プロモーターのＳＰ６、翻訳エンハンサーのオメガ配列の一部である０２９を含む配列を用いている。
＜１−３＞遺伝子型分子およびその製造方法
遺伝子型分子は、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む５’非翻訳領域と、５’非翻訳領域の３’側に結合した、タンパク質をコードするＯＲＦ領域と、ＯＲＦ領域の３’側に結合した、ポリＡ配列を含む３’末端領域を含む核酸であるコード分子の３’末端と、スペーサー分子のドナー領域とが結合してなる。
遺伝子型分子を構成するコード分子は、上記のコード分子においてＸｈｏＩ配列が必須ではない他は、コード分子について説明したとおりである。しかしながら、ＸｈｏＩ配列を有することが好ましい。
遺伝子型分子は、上記コード分子の３’末端と、スペーサー分子のドナー領域を、通常のリガーゼ反応により結合させることにより製造できる。反応条件としては、通常、４〜２５℃で４〜４８時間の条件が挙げられ、ＰＥＧ領域を含むスペーサー分子のＰＥＧ領域内のポリエチレングリコールと同じ分子量のポリエチレングリコールを反応系に添加する場合には、１５℃で０．５〜４時間に短縮することも可能である。
スペーサー分子とコード分子の組み合わせはライゲーション効率に重要な効果をもたらす。アクセプターにあたるコード部の３’末端領域において、少なくとも２残基以上、好ましくは３残基以上、さらに好ましくは６〜８残基以上のＤＮＡあるいは／またはＲＮＡのポリＡ配列があること、さらに、５’ＵＴＲの翻訳エンハンサーとしては、オメガ配列の部分配列（０２９；図１０）が好ましく、スペーサー部のドナー領域としては、少なくとも１残基のｄＣ（デオキシシチジル酸）あるいは２残基のｄＣｄＣ（ジデオキシシチジル酸）が好ましい。このことによって、ＲＮＡリガーゼを用いることでＤＮＡリガーゼのもつ問題点を回避し、かつ効率を６０〜８０％に保つことができる。
遺伝子型分子がＲＮＡである場合には、（ａ）転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む５’非翻訳領域と、５’非翻訳領域の３’側に結合した、タンパク質をコードするＯＲＦ領域と、ＯＲＦ領域の３’側に結合した、ポリＡ配列を含む３’末端領域を含むコード分子の３’末端と、（ｂ）（１）〜（４）のいずれか１項に記載のスペーサー分子のドナー領域であってＲＮＡからなるものとを、スペーサー分子内のＰＥＧ領域を構成するポリエチレングリコールと同じ分子量をもつ遊離のポリエチレングリコールの存在下で、ＲＮＡリガーゼにより結合させることが好ましい。
ライゲーション反応時に、ＰＥＧ領域を含むスペーサー部のＰＥＧ領域と同じ分子量のポリエチレングリコールを添加することによって、スペーサー部のポリエチレングリコールの分子量によらずライゲーション効率が８０〜９０％以上に向上し、反応後の分離工程も省略することができる。
＜１−４＞対応付け分子及びその製造方法
対応付け分子は、上記の遺伝子型分子を、ペプチド転移反応で、遺伝子型分子内のＯＲＦ領域によりコードされたタンパク質である表現型分子と連結してなるものである。
対応付け分子は、遺伝子型分子を無細胞翻訳系で翻訳することにより、ペプチド転移反応で、遺伝子型分子内のＯＲＦ領域によりコードされたタンパク質である表現型分子と連結することを含む。
無細胞翻訳系は、好ましくは、小麦胚芽又はウサギ網状赤血球のものである。翻訳の条件は通常に採用される条件でよい。例えば、２５〜３７℃で１５〜２４０分の条件が挙げられる。
無細胞翻訳系については、これまで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽の系で対応付け分子の形成が検討され、ウサギ網状赤血球の系でのみ対応付け分子が確認されていたが（Ｎｅｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．，Ｙａｎａｇａｗａ，Ｈ．（１９９７）ＦＥＢＳＬｅｔｔ．４１４，４０５；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ，Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４，１２２９７）、この態様によれば、ＰＥＧ領域を含むスペーサー部をもつ対応付け分子として、小麦胚芽の系でも対応付け分子の形成を行うことができる。また、これまでウサギ網状赤血球の系では遺伝子型分子の安定性を欠くために実用性に乏しく、短い鎖長の遺伝子型分子にのみ適用されてきたが（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ，Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４，１２２９７；Ｎｅｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．，Ｙａｎａｇａｗａ，Ｈ．（１９９７）ＦＥＢＳＬｅｔｔ．４１４，４０５）、ＰＥＧ領域を含むスペーサー部をもつ対応付け分子は、小麦胚芽の系ではより安定であり長い鎖長を取り扱える実用的な系である。
＜１−５＞対応付け分子（ＩＶＶ）の好ましい態様
本態様の共翻訳におけるＩＶＶは、図２０に示すように、翻訳テンプレートによってＣ末端修飾された蛋白質（＝対応付け分子）に関するものである。翻訳テンプレートは、蛋白質に翻訳される情報を持つコード部とＰＥＧスペーサー部からなる。コード部の３’末端にＡ配列を有し、Ａ配列は、短いポリＡ配列を含む。短いポリＡ配列とは、通常には２〜１０塩基のＡからなる配列である。ＰＥＧスペーサー部は、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域において、ポリエチレングリコールの分子量が４００以上であることを特徴とする、また、ドナー領域あるいは／かつＣＣＡ領域において、少なくとも１つの修飾物質（Ｆ１あるいは／かつＦ２）を含むことを特徴とする。また、ＣＣＡ領域は、該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、ペプチド転移反応によって結合する機能を有することを特徴とし、代表的にはＣＣＡ領域にピューロマイシンを有する。また、修飾物質（Ｆ１あるいは／かつＦ２）が、該翻訳テンプレートあるいは／かつ該翻訳テンプレートから翻訳された蛋白質を固定化あるいは蛍光ラベル化することを特徴とする。固定化物質としてビオチンなどが考えられ、蛍光性物質として、フルオレセイン，Ｃｙ５，あるいはローダミングリーン（ＲｈＧ）などが考えられる。これら、コード部および翻訳テンプレート、およびそのライブラリーが、リボソーム上で翻訳されることにより合成される蛋白質（＝対応付け分子）および蛋白質（＝対応付け分子）のライブラリーに関するものである。
リボソーム上で翻訳されることにより合成される蛋白質（＝Ｃ末端ラベル化蛋白質、対応付け分子）およびそのライブラリーのいろいろな組み合わせを用いて、ｉｎｖｉｔｒｏで蛋白質と物質の相互作用解析が可能であり、たとえば、ＩＶＶの一次スクリーニング後の詳細な遺伝子ネットワークを解析する二次スクリーニングに利用できる（図２１）。
共翻訳のＩＶＶは、翻訳テンプレートを用いた翻訳によって合成された、翻訳テンプレートでＣ末端修飾された蛋白質（図２０のＡ；対応付け分子）も利用可能であり、翻訳テンプレート（図２０のＢ）と、ＰＥＧによってＣ末端修飾された蛋白質（図２０のＣ）の構成に特徴を持つ。以下詳細に記述する。
翻訳テンプレート（図２０のＢ）のＰＥＧスペーサー部は、ピューロマイシンがアミノ酸と連結できることを特徴とする以外は第一の発明と同様である。また、コード部も第一の発明と同様であるが、特に、対応付けに適した構成としては、３’末端領域をＡ配列にすることが重要であり、トータル蛋白の対応付けの効率が著しく向上してフリー蛋白質の量が激減することが確認された。ここでも、コード部の５’末端領域をＳＰ６＋０２９とし、３’末端領域を、たとえば、Ｆｌａｇ＋ＸｈｏＩ＋Ａ_ｎ（ｎ＝８）とすることで、各長さは、５’末端領域で約６０ｂｐ、３’末端領域で約４０ｂｐであり、ＰＣＲのプライマーにアダプター領域として設計できる長さである。これによって、あらゆるベクターやプラスミドやｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって、本態様の５’末端領域と３’末端領域をもったコード部を簡単に作成可能となり、ＰＥＧスペーサー部をライゲーションすることで、対応付け効率の高い翻訳テンプレートが得られた。
本態様のＰＥＧによってＣ末端修飾された蛋白質（図２０のＣ）は、蛋白質の相互作用検出などにおいて、コード部を利用しない場合、たとえば、ＦＣＣＳ測定、蛍光リーダー、プロテインチップなどに応用する場合は、ＲＮａｓｅＡなどで故意的に切断してもよい。切断することによって、コード部の妨害による蛋白質間相互作用の検出の困難性が解消出来る。また、単独の対応付け分子をプレートやビーズやスライドガラスに固定することも可能である。
リボソーム上で翻訳されることにより合成される蛋白質（＝Ｃ末端ラベル化蛋白質、対応付け分子）およびそのライブラリーのいろいろな組み合わせを用いて、ｉｎｖｉｔｒｏで蛋白質と物質の相互作用解析が可能であり、たとえば、ＩＶＶの一次スクリーニング後の詳細な遺伝子ネットワークを解析する二次スクリーニングに利用できる（図２１）。
＜２＞Ｃ末端ラベル化蛋白質
Ｃ末端ラベル化蛋白質は、Ｃ末端が修飾された蛋白質であり、図１１のＡに示すように、ラベル化剤が蛋白質のＣ末端に結合した構成をもっている。すなわち、Ｃ末端ラベル化蛋白質は、蛋白質とラベル化剤とにより構成される。
Ｃ末端ラベル化蛋白質を構成する「蛋白質」とは、その機能が既知又は未知である相互作用の解析対象として用いる蛋白質を意味する。本発明のＣ末端ラベル化蛋白質は、この蛋白質と後述する標的分子との相互作用の有無の測定に使用できる。
この蛋白質は、天然蛋白質又はその変異体、および人工蛋白質又はその変異体の何れでもよい。天然蛋白質は、種々の生物の器官、組織又は細胞に由来するｃＤＮＡライブラリーから転写および翻訳される、多様性を有する蛋白質のライブラリーをも含むものである。人工蛋白質は、天然蛋白質の全てもしくは部分配列を組み合わせた配列、又はランダムなアミノ酸配列を含むものである。
Ｃ末端ラベル化蛋白質を構成する蛋白質は、全長蛋白質であることが好ましい。本明細書において「全長蛋白質」とは、Ｃ末端が完全に翻訳されている蛋白質、すなわち、その蛋白質をコードする塩基配列の終止コドンの一つ前までのコドンが翻訳されて得られた蛋白質を意味する。全長蛋白質のＮ末端は、シグナルペプチドの切断等何らかのプロセシングを受けていてもよい。
また、Ｃ末端ラベル化蛋白質を構成する蛋白質は親和性タグと融合した蛋白質であってもよい。親和性タグの例としては、ポリヒスチジンペプチドやエピトープペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテインＡ、マルトース結合蛋白質、カルモジュリン結合ペプチド等が挙げられる。
Ｃ末端ラベル化蛋白質は、ラベル化剤存在下で、翻訳テンプレートを翻訳系で発現させて蛋白質合成を行わせ、合成された蛋白質を精製することにより製造することができる。以下、ラベル化剤、翻訳テンプレートおよび製造の例について説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜２−１＞ラベル化剤
ラベル化剤は、図１１のＢに示すように、蛋白質の翻訳系でのペプチド転移反応、すなわち、リボソーム上でのペプチド転移反応によって蛋白質と結合し得る基（残基を含む）をもつペプチドアクセプター部が、ヌクレオチドリンカーを介して修飾部と結合した構成をもつ。このラベル化剤の存在下で蛋白質合成を行い、得られるＣ末端ラベル化蛋白質を精製し、分子間相互作用の検出系を用いることによって、蛋白質相互作用の検出が可能となる。
修飾部に含まれる修飾物質の具体例としては、蛍光性、非蛍光性修飾物質等が挙げられる。蛍光性物質としては、フルオレセイン系列、ローダミン系列、Ｃｙ３、Ｃｙ５、エオシン系列、ＮＢＤ系列等の蛍光色素や、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）等の蛍光性蛋白質がある。また、非蛍光性物質としては、ビオチンのような補酵素、蛋白質、ペプチド、糖類、脂質類、色素、ポリエチレングリコール等、何らかの目印となり得る化合物であればいかなるものでもよい。
Ｃ末端ラベル化剤においては、修飾部が蛍光基、蛋白質と結合する基（例えばビオチニル基やイミノビオチニル基）、または、その両方をもつことが好ましい。特に、ビオチニル基やイミノビオチニル基を有することは、本発明Ｃ末端ラベル化剤による修飾の効率が上昇するため、好ましい。
ペプチドアクセプター部は、蛋白質の翻訳系で、ペプチド転移反応によって蛋白質と結合し得る基をもち、好ましくはピューロマイシン又はその誘導体の残基をもつ。
ピューロマイシンはアミノアシルｔＲＮＡと類似した構造をもち、蛋白質合成を阻害する抗生物質として知られているが、低濃度では蛋白質のＣ末端に結合することが知られている（Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．ｅｔａｌ．（２０００）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２８：１１７６−１１８２）。本発明で用いることができるピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシンと類似した構造を有し、蛋白質のＣ末端に結合することができる物質であればいかなるものでもよい。具体例としては、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド等が挙げられる。
修飾部とペプチドアクセプター部との間をつなぐヌクレオチドリンカーとは、具体的には、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドが１個ないし複数個つながった核酸または核酸誘導体であり、特に好ましい例として、シトシン塩基を含むリボヌクレオチド（−ｒＣ−）またはデオキシリボヌクレオチド（−ｄＣ−）が１個ないし複数個つながった化合物が挙げられる。その他、修飾部とペプチドアクセプター部との間に挿入することによって修飾蛋白質の収量を上げることができる物質であればいかなるものでもよい。
ラベル化剤においては、ヌクレオチドリンカーが２’−デオキシシチジル酸、２’−デオキシシチジル−（３’，５’）−２’−デオキシシチジル酸、リボシチジル酸、又は、リボシチジル−（３’，５’）−リボシチジル酸であることが好ましい。
ラベル化剤は、上記修飾部とペプチドアクセプター部とを所望のヌクレオチドリンカーを介して、それ自体既知の化学結合方法によって結合させることにより製造することができる。具体的には、例えば、適当な保護基で保護された上記ペプチドアクセプター部を固相担体上に結合させ、核酸合成機等を用いてヌクレオチドリンカーとしてヌクレオチドホスホアミダイト、およびデオキシヌクレオチドホスホアミダイト、修飾物質として蛍光物質やビオチンなどを結合したヌクレオチドホスホアミダイトを順次結合させた後、脱保護を行うことによって作製することができる。上記各部の種類、あるいは結合の種類によっては液相合成法で結合させるかあるいは両者を併用することもできる。また、修飾物質としてニッケル等の金属イオンを用いる場合には、金属イオンが配位しうるニトリロトリ酢酸やイミノジ酢酸等のキレート性の試薬を結合させ、次いで金属イオンを配位させることができる。
＜２−２＞翻訳テンプレート
翻訳テンプレートは、本発明修飾蛋白質を製造する際に利用できる翻訳テンプレートであり、図１１のＣに示すように、ポリＡ配列を含む３’末端領域、転写プロモーターを含んだ５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、および、蛋白質のコードされたＯＲＦ領域から構成される。翻訳テンプレートはＤＮＡでもＲＮＡでもよい。
さらに詳細には、翻訳テンプレートは、蛋白質をコードするＯＲＦ領域と、ＯＲＦ領域の５’側に位置する、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含んだ５’ＵＴＲと、ＯＲＦ領域の３’側に位置する、ポリＡ配列（ｐｏｌｙＡ）を含んだ３’末端領域から構成される。
さらに好ましい翻訳テンプレートは、５’ＵＴＲの転写プロモーターとしてＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含み、翻訳エンハンサーとしてタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のオメガ配列の一部（０２９）を含む。また、ＯＲＦ領域がその下流部分に親和性タグ配列を含むことが好ましい。親和性タグ配列は、上述の親和性タグをコードする配列であり、好ましくはＨｉｓ−ｔａｇ（ポリヒスチジンタグ）配列を含む。本発明翻訳テンプレートを用いて製造された本発明修飾蛋白質をポリヒスチジンタグを用いて製造する場合には、ポリヒスチジンタグは長い方が、ニッケルキレート樹脂による回収率が向上するため、好ましい。ポリヒスチジンタグの好ましい長さの範囲は、修飾される蛋白質の種類や標識の種類により変化し得るが、通常には、８〜１２残基である。
なお、本明細書において「上流」および「下流」とは、転写または翻訳の方向におけるものを意味する。
翻訳テンプレートは、ＤＮＡである場合、上記の領域を適当なＤＮＡベクター又はプラスミドに導入することにより得られたＤＮＡベクター又はプラスミドであってもよい。また、翻訳テンプレートは、ＲＮＡである場合、５’末端にＣａｐ構造があってもなくてもよい
＜２−３＞Ｃ末端ラベル化蛋白質の製造
Ｃ末端ラベル化蛋白質の製造に用いられる翻訳系としては、無細胞蛋白質合成系や細胞発現系が挙げられる。無細胞蛋白質合成系の具体例としては、小麦胚芽抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、大腸菌Ｓ３０抽出液等が挙げられる。これらの無細胞蛋白質合成系の中に、上記翻訳テンプレートを加え、同時に１〜１００μＭの修飾剤を加え、２５〜３７℃で１〜数時間保温することによってＣ末端修飾蛋白質が合成される。合成された修飾蛋白質は、そのまま次の精製プロセスまたは検出プロセスに供することができる。一方、細胞発現系の具体例としては、大腸菌、枯草菌、好熱菌、酵母等の細菌から、昆虫細胞、哺乳類等の培養細胞、さらに線虫、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、マウス等に至るまで、遺伝子導入が可能な細胞であればいかなるものでもよい。これらの細胞の中に、上記本発明翻訳テンプレートを導入し、同時に１〜１００μＭの修飾剤を電気穿孔法、マイクロインジェクション法等により細胞の中に導入し、細胞の至適生育温度で数時間保温することによって修飾蛋白質が合成される。合成された修飾蛋白質は、細胞を破砕することによって回収し次の精製プロセスまたは検出プロセスに供することができる。また、そのまま細胞の中で検出プロセスに供することも可能である。翻訳テンプレートは、用いる翻訳系に合わせて適切なものを選択する。
Ｃ末端ラベル化蛋白質を精製する方法としては、アフィニティー、ゲルろ過、イオン交換等のクロマトグラフィーや、電気泳動、沈澱、透析等、一般に蛋白質の精製に用いられるあらゆる方法が利用可能である。好ましくは、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過、イオンクロマトグラフィー、電気泳動、沈殿、透析、および、それらの任意の組合せが挙げられる。特に好ましい例として、ポリヒスチジンペプチドやエピトープペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテインＡ、マルトース結合蛋白質、カルモジュリン結合ペプチド等の親和性タグを融合した修飾蛋白質を親和性樹脂で精製し、さらに未反応の修飾剤を完全に除去するためにゲルろ過カラムに数回かける方法がある。
また、上記の親和性タグを融合した修飾蛋白質を親和性樹脂で予め精製した後、修飾部のビオチニル基あるいはイミノビオチニル基とアビジンあるいはストレプトアビジンの親和性を利用して、未修飾蛋白質を完全に除き、１００％修飾された蛋白質を得る方法もある。
＜２−５＞Ｃ末端ラベル化蛋白質の好ましい態様
本態様の共翻訳におけるＣ末端ラベル化蛋白質は、図１９に示すように、翻訳テンプレートにより翻訳され、修飾剤によってＣ末端ラベル化された蛋白質を利用することも可能である。翻訳テンプレートは、蛋白質に翻訳される情報を持つコード部とポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧスペーサー部からなる。コード部は、アクセプター領域（Ａ配列）と発現増強配列（Ｘ配列）を有し、Ａ配列として、短いポリＡ配列を含む。短いポリＡ配列とは、通常には２〜１０塩基のＡからなる配列である。Ｘ配列として、Ｃ（あるいはＧ）ＮＮＣ（あるいはＧ）配列を有する配列、たとえば、ＸｈｏＩ配列を有することを特徴とする。ＰＥＧスペーサー部は、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域において、ポリエチレングリコールの分子量が４００以上であることを特徴とする、また、ドナー領域あるいは／かつＣＣＡ領域において、少なくとも１つの機能付与ユニット（Ｆ）を含むことを特徴とする。ＣＣＡ領域は、該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、ペプチド転移反応によって結合する機能を有しないことを特徴とする。機能性修飾物質（Ｆ１あるいは／かつＦ２）が、該翻訳テンプレートあるいは／かつ該翻訳テンプレートから翻訳された蛋白質を固定化あるいは蛍光ラベル化することを特徴とする。固定化物質としてビオチンなどが考えられ、蛍光性物質として、フルオレセイン，Ｃｙ５，あるいはローダミングリーン（ＲｈＧ）などが考えられる。また、修飾剤は、蛋白質のＣ末端を標識する修飾部とピューロマイシンを含むペプチドアクセプター部、およびそれらを連結するヌクレオチドのリンカー、からなる。また、修飾剤は、修飾部に、機能性修飾物質（Ｆ３）を含むことを特徴とする。該Ｆ３が、該翻訳テンプレートにより翻訳された蛋白質を固定化あるいは蛍光ラベル化することを特徴とする。固定化物質としてビオチンなどが考えられ、蛍光性物質として、フルオレセイン，Ｃｙ５，あるいはローダミングリーン（ＲｈＧ）などが考えられる。これら、コード部および翻訳テンプレート、およびそのライブラリーが、修飾剤の存在下で、リボソーム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質および蛋白質のライブラリーに関するものである。
共翻訳のＣ末端修飾された蛋白質（Ｃ末端ラベル化蛋白質）は、翻訳テンプレートを用いた翻訳によって合成された、修飾剤でＣ末端修飾された蛋白質（図１９のＡ）でも可能であり、翻訳テンプレート（図１９のＢ）と、修飾剤（図１９のＣ）からなる。ここでの特徴は、特に翻訳テンプレートのコード部の構成にある。以下詳細に記述する。
本態様の翻訳テンプレート（図１９のＢ）のＰＥＧスペーサー部は、ピューロマイシンがアミノ酸と連結出来ないことを特徴とし、第一の発明と同様である。また、コード部も第一の発明と同様であるが、特に、Ｃ末端ラベル化に適した構成としては、３’末端領域が、ＸＡ配列であることが重要であり、Ｘ配列のなかで、最初の４塩基が重要で、ＣｏｒＧＮＮＣｏｒＧの配列を持つものが好ましい。ここでも、コード部の５’末端領域をＳＰ６＋０２９とし、３’末端領域を、たとえば、Ｆｌａｇ＋ＸｈｏＩ＋Ａ_ｎ（ｎ＝８）とすることで、各長さは、５’末端領域で約６０ｂｐ、３’末端領域で約４０ｂｐであり、ＰＣＲのプライマーにアダプター領域として設計できる長さである。これによって、あらゆるベクターやプラスミドやｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって、本態様の５’末端領域と３’末端領域をもったコード部を簡単に作成可能となり、このコード部に３’ＵＴＲの代わりとしてＰＥＧスペーサー部をライゲーションすることで、Ｃ末端ラベル化に適した翻訳効率の高い翻訳テンプレートを得られた。
本態様の修飾剤（図１９のＣ）は、タンパク質の翻訳系でのペプチド転移反応、すなわち、リボソーム上でのペプチド転移反応によってタンパク質と結合し得る基（残基を含む）をもつペプチドアクセプター部が、ヌクレオチドリンカーを介して修飾部と結合した構成をもつ。この修飾剤の存在下でタンパク質合成を行い、得られるＣ末端修飾タンパク質を精製し、分子間相互作用の検出系を用いることによって、タンパク質相互作用の検出が可能となる。修飾部には、ＰＥＧスペーサー部と同様に修飾物質（Ｆ３）が含まれる。修飾物質として、非放射性修飾物質の具体例としては、蛍光性、非蛍光性修飾物質等が挙げられる。蛍光性物質としては、フルオレセイン系列、ローダミン系列、Ｃｙ３、Ｃｙ５、エオシン系列、ＮＢＤ系列等の蛍光色素や、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光性タンパク質がある。また、非蛍光性物質としては、ビオチンのような補酵素、タンパク質、ペプチド、糖類、脂質類、色素、ポリエチレングリコール等、何らかの目印となり得る化合物であればいかなるものでもよい。本態様の修飾剤においては、修飾部が蛍光基、タンパク質と結合する基、または、その両方をもつことが好ましい。ペプチドアクセプター部は、タンパク質の翻訳系で、ペプチド転移反応によってタンパク質と結合し得る基をもち、好ましくはピューロマイシン又はその誘導体の残基をもつ。ピューロマイシンはアミノアシルｔＲＮＡと類似した構造をもち、タンパク質合成を阻害する抗生物質として知られているが、低濃度ではタンパク質のＣ末端に結合することが知られている（Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．ｅｔａｌ．（２０００）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２８：１１７６−１１８２）。本態様で用いることができるピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシンと類似した構造を有し、タンパク質のＣ末端に結合することができる物質であればいかなるものでもよい。具体例としては、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド等が挙げられる。修飾部とペプチドアクセプター部との間をつなぐヌクレオチドリンカーとは、具体的には、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドが１個ないし複数個つながった核酸または核酸誘導体であり、特に好ましい例として、シトシン塩基を含むリボヌクレオチド（−ｒＣ−）またはデオキシリボヌクレオチド（−ｄＣ−）が１個ないし複数個つながった化合物が挙げられる。その他、修飾部とペプチドアクセプター部との間に挿入することによって修飾タンパク質の収量を上げることができる物質であればいかなるものでもよい。本態様の修飾剤においては、ヌクレオチドリンカーが２’−デオキシシチジル酸、２’−デオキシシチジル−（３’，５’）−２’−デオキシチジル酸、リボシチジル酸、又は、リボシチジル−（３’，５’）−リボシチジル酸であることが好ましい。
本態様の修飾剤は、上記修飾部とペプチドアクセプター部とを所望のヌクレオチドリンカーを介して、それ自体既知の化学結合方法によって結合させることにより製造することができる。具体的には、例えば、適当な保護基で保護された上記ペプチドアクセプター部を固相担体上に結合させ、核酸合成機を用いてヌクレオチドリンカーとしてヌクレオチドホスホアミダイト、およびデオキシヌクレオチドホスホアミダイト、機能性修飾物質として蛍光物質やビオチンなどを結合したホスホアミダイトを順次結合させた後、脱保護を行うことによって作製することができる。上記各部の種類、あるいは結合の種類によっては液相合成法で結合させるかあるいは両者を併用することもできる。また、機能性修飾物質としてニッケル等の金属イオンを用いる場合には、金属イオンが配位しうるニトリロトリ酢酸やイミノジ酢酸等のキレート性の試薬を結合させ、次いで金属イオンを配位させることができる。
＜３＞本発明の第１の態様の複合体
本態様の複合体は、遺伝子型と表現型の対応付け分子と、Ｃ末端がピューロマイシン又はその誘導体を含むＣ末端ラベル化剤によりラベル化されたＣ末端ラベル化蛋白質との相互作用によって形成される複合体であって、対応付け分子を構成する蛋白質部分以外の部分および該Ｃ末端ラベル化剤がそれぞれ相互作用解析に必要な修飾を受けている、対応付け分子とＣ末端ラベル化蛋白質の複合体である。
複合体を構成する対応付け分子及びＣ末端ラベル化蛋白質は、それぞれ１つでも複数でもよい。また、対応付け分子及びＣ末端ラベル化蛋白質が含む蛋白質は、同一でも互いに異なっていてもよい。すなわち、本発明の複合体は、或る蛋白質を解する相互作用及び／又は同一の蛋白質間の相互作用による複合体を包含する。本発明の複合体は、例えば、該複合体が一種類の対応付け分子と二種類以上のＣ末端ラベル化蛋白質から構成されていてもよい。
本発明において対応付け分子とＣ末端ラベル化蛋白質に含まれる蛋白質は、蛋白質の全長であっても結合活性部位を含む部分ペプチドでもよい。またアミノ酸配列、およびその機能が既知の蛋白質でも、未知の蛋白質でもよい。これらは、合成されたペプチド鎖、生体より精製されたＲＮＡやｃＤＮＡライブラリー等から適当な翻訳系を用いて翻訳したものでもよい。合成されたペプチド鎖はこれに糖鎖が結合した糖蛋白質であってもよい。糖鎖としては、他の蛋白質と相互作用する能力を有する限り、特に制限はなく、その糖配列あるいは機能が、既知の糖鎖でも未知の糖鎖でもよい。好ましくは、既に分離解析され、糖配列あるいは機能が既知の糖鎖が用いられる。
本発明における対応付け分子とＣ末端ラベル化蛋白質の「相互作用」とは、通常は、蛋白質間の共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、および静電力による結合のうち少なくとも１つから生じる分子間に働く力による作用を示すが、この用語は最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。共有結合としては、配位結合、双極子結合を含有する。また静電力による結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有する。また、上記作用の結果生じる結合反応、合成反応、分解反応も相互作用に含有される。
対応付け分子は、スペーサーを介して蛋白質とそれをコードするｍＲＮＡを連結した対応付け分子（ＩＶＶ）であり、かつ該対応付け分子のスペーサーに、対応付け分子間の相互作用解析に必要な修飾を有することが好ましい。
相互作用解析に必要な修飾は通常には検出用修飾および分離用修飾である。
図１のＡ及びＢに、本発明の分離用修飾あるいは検出用修飾を施されたＩＶＶとＣ末端ラベル化蛋白質の複合体の構成例を示す。
図１のＡは、ＩＶＶと単数のＣ末端ラベル化蛋白質の複合体を示す。ＩＶＶは、蛋白質１とそれをコードしているｍＲＮＡ１がスペーサー１を介して連結したものである。スペーサー１は、必要によって修飾剤（Ｘ）を導入した構成をとる。Ｃ末端ラベル化蛋白質は、蛋白質２のＣ末端にＣ末端ラベル化剤（Ｙ）が連結したものである。無細胞共翻訳における相互作用によって、これらＣ末端ラベル化蛋白質とＩＶＶが複合体を形成すると共に、同時に蛋白質やＩＶＶに必要な修飾が施される。
図１のＢはＩＶＶと複数のＣ末端ラベル化蛋白質の複合体を示す。ＩＶＶは、蛋白質１とそれをコードしているｍＲＮＡ１がスペーサー１を介して連結したものである。複数のＣ末端ラベル化蛋白質は、複数の蛋白質Ａ，Ｂ，Ｃ．．．（ライブラリー）のＣ末端にＣ末端ラベル化剤（Ｙ）が連結したものである。スペーサー１は、必要によって修飾剤（Ｘ）を導入した構成をとる。無細胞共翻訳における相互作用によって、これら複数のＣ末端ラベル化蛋白質とＩＶＶが複合体を形成すると共に、同時に複合体の解析に必要な修飾が施される。
本発明のＩＶＶとＣ末端ラベル化蛋白質の複合体を構成する要素であるＩＶＶは、上述のように、スペーサーと蛋白質がコードされたｍＲＮＡをライゲーション反応によって連結して遺伝子型分子をつくり、遺伝子型分子と表現型分子（蛋白質）を無細胞翻訳によってリボソーム上でピューロマイシンを介して連結するものである。このＩＶＶを用いたｉｎｖｉｔｒｏウイルス法は、ある機能をもつ蛋白質に対応する遺伝子群をｃＤＮＡライブラリーなどから網羅的に検出（対応付け分子の遺伝子部分を利用してＰＣＲで増幅して検出）するシステムである。本発明では、ＩＶＶとＣ末端ラベル化蛋白質間の相互作用の解析において、ＩＶＶの分離あるいは／および検出を目的とした物質を修飾剤として導入したスペーサー（図３）を利用すること、かつＣ末端ラベル化蛋白質の分離あるいは／および検出を目的とした物質を修飾剤として導入したＣ末端ラベル化剤（図４）を利用することが大きな特徴となっている。また、修飾剤は、スペーサーへ一つの物質を導入することで分離あるいは検出の目的を達成する場合もあるし、スペーサーへ一つの物質を導入することで分離と検出の目的を兼ねられる場合もあるし、スペーサーへ二つの物質を導入して、分離と検出の目的を達成する場合もある。
本発明の複合体を構成する要素であるＣ末端ラベル化蛋白質は、上述のように、蛋白質の翻訳系でのペプチド転移反応、すなわち、リボソーム上でのペプチド転移反応によって蛋白質と結合し得る基（残基を含む）をもつラベル化剤（図４）をそのＣ末端に結合することが特徴であり、そのラベル化剤としては、ピューロマイシンが代表的である。ピューロマイシンは、アミノアシルｔＲＮＡと類似した構造をもち、蛋白質合成を阻害する抗生物質として知られているが、低濃度では蛋白質のＣ末端に結合することが知られている（Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．ｅｔａｌ．（２０００）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２８：１１７６−１１８２）。本発明で用いることができるピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシンと類似した構造を有し、蛋白質のＣ末端に結合することができる物質であればいかなるものでもよい。具体例としては、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド等が挙げられる。また、ラベル化剤は放射性物質あるいは非放射性物質を含むことが出来る。具体例としては、ＲＩ，蛍光性、非蛍光性修飾物質等が挙げられる。蛍光性物質としては、フルオレセイン系列、ローダミン系列、Ｃｙ３、Ｃｙ５、エオシン系列、ＮＢＤ系列等の蛍光色素や、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）等の蛍光性蛋白質がある。また、非蛍光性物質としては、ビオチンのような補酵素、蛋白質、ペプチド、糖類、脂質類、色素、ポリエチレングリコール等、何らかの目印となり得る化合物であればいかなるものでもよい。これら化合物とピューロマイシンとの間をつなぐリンカーは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドが１個ないし複数個つながった核酸または核酸誘導体であり、特に好ましい例として、シトシン塩基を含むリボヌクレオチド（−ｒＣ−）またはデオキシリボヌクレオチド（−ｄＣ−）が１個ないし複数個つながった化合物が挙げられる。具体的には、ヌクレオチドリンカーが２’−デオキシシチジル酸、２’−デオキシシチジル−（３’，５’）−２’−デオキシチジル酸、リボシチジル酸、又は、リボシチジル−（３’，５’）−リボシチジル酸であることが好ましい。
Ｃ末端ラベル化蛋白質およびスペーサーの分離用修飾剤としては、アビジンあるいはストレプトアビジンとの相互作用が知られているビオチンのような補酵素を代表例として、その他、ニッケル−ＮＴＡ、抗体、蛋白質、ペプチド、糖類、脂質類、色素、ポリエチレングリコールなどが挙げられ、現在知られている分離や固定化のための物質の他、何らかの方法でＩＶＶを固定化できる物質であればいかなるものでも良い。詳しい例を挙げると、アビジンおよびストレプトアビジン等のビオチン結合蛋白質／ビオチン、マルトース結合蛋白質／マルトース、Ｇ蛋白質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合蛋白質／ＤＮＡ、抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合蛋白質／ＡＴＰ、あるいはエストラジオール受容体蛋白質／エストラジオールなどの各種受容体蛋白質／そのリガンドなどが挙げられる。これらの中で、アダプター蛋白質／リガンドの組み合わせとしては、アビジンおよびストレプトアビジンなどのビオチン結合蛋白質、マルトース結合蛋白質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、抗体／抗原分子（エピトープ）、などが好ましく、特にストレプトアビジン／ビオチンの組み合わせが最も好ましい。これらの結合蛋白質は、それ自体既知のものであり、該蛋白質をコードするＤＮＡは既にクローニングされている。アダプター蛋白質の固相表面への結合は、それ自体既知の方法を用いることができるが、具体的には、例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン−２，４−ジイソシアネート、アミノ基、活性エステルに変換可能なカルボキシル基、又はホスホアミダイドに変換可能な水酸基あるいはアミノ基などを利用する方法を用いることができる。
スペーサーの検出用修飾剤は、放射性および蛍光性修飾物質等が挙げられ、蛍光性物質としては、フルオロセイン系列、ローダミン系列、Ｃｙ３，Ｃｙ５，エオシン系列、ＮＢＤ系列等の蛍光物質が挙げられる。これら検出のための修飾剤は、何らかの方法でＩＶＶの蛋白質を検出できる物質ならいかなるものでも良い。
蛍光物質は複数種類を組み合わせて用いてもよい。例えば、対応付け分子がスペーサーにＣｙ５を有する場合は、該Ｃ末端ラベル化蛋白質のラベル化剤がローダミングリーンを有してもよいし、また、対応付け分子がスペーサーにローダミングリーンを有する場合は、該Ｃ末端ラベル化蛋白質のラベル化剤がＣｙ５を有してもよい。
本発明の複合体には、対応付け分子であるＩＶＶと単数のＣ末端ラベル化蛋白質が相互作用しているもの（図１のＡ）と、ＩＶＶと複数のＣ末端ラベル化蛋白質が相互作用しているもの（図１のＢ）が含まれる。まず、図１のＡでは、一組の同一あるいは異なる蛋白質を含む対応付け分子（ＩＶＶ）とＣ末端ラベル化蛋白質の複合体の構成をとっている。ＩＶＶは、蛋白質１のｍＲＮＡを有し、固有の修飾剤（Ｘ１）として分離や固定化あるいは検出のための修飾剤を有する。Ｃ末端ラベル化蛋白質は、蛋白質２のＣ末端がラベル化剤（Ｙ；図１）で修飾されている。ここで、蛋白質１と２は同じ場合と異なる場合があるが、修飾剤（Ｘ１）とラベル化剤はその色素の種類や機能などが必ず異なる。本発明は、これらＩＶＶとＣ末端ラベル化蛋白質の相互作用によって形成された複合体である。次ぎに、図１のＢでは、多数のＣ末端ラベル化蛋白質とＩＶＶが相互作用している構成をとっている。多数のＣ末端ラベル化蛋白質は、各々の蛋白質はラベル化剤（Ｙ；図１）を有する。これら多数のＣ末端ラベル化蛋白質については、原理的に、全て同一のラベル化剤で修飾される。本発明は、多数のＣ末端ラベル化蛋白質とＩＶＶの相互作用によって形成された複合体である。
本発明の複合体は、対応付け分子およびＣ末端ラベル化蛋白質をそれぞれ調製し、それらを混合することによって得ることができる。
また、本発明者等は、対応付け分子がＩＶＶである場合、無細胞翻訳系で、蛋白質間の相互作用解析において、異なる修飾を有するＣ末端ラベル化蛋白質を共に翻訳（無細胞共翻訳）により得ると同時に、それらの複合体を形成できれば、蛋白質の検出や固定に必要なタグや蛍光性色素などの修飾も同時に行うことが出来ればハイスループットな蛋白質間相互作用解析が実現できると考えた。しかしながら、Ｃ末端ラベル化法は原理的に、翻訳される蛋白質をラベル化剤で無差別に修飾することになり、一つの試験管内で複数の蛋白質に別々の異なる所望のラベル化剤を修飾することは出来ない。そのため、別々の試験管内でＣ末端ラベル化した二つのＣ末端ラベル化蛋白質を後から混合する以外に方法はない。よって、蛋白質間の相互作用解析において、一つの試験管内で別々の異なる所望のラベル化剤を各蛋白質に修飾できるとする技術（特開２００１−２７６３３号公報）は実際には不可能である。本発明者等は、ＩＶＶ形成とＣ末端ラベル化を組み合わせた場合に、Ｃ末端ラベル化剤がＩＶＶ形成を阻害することがほとんどない条件が存在することを見出し、一つの試験管で異なる所望のＣ末端ラベル化剤を所望の蛋白質に修飾することに成功した。
すなわち、この態様は、無細胞翻訳系で、Ｃ末端ラベル化剤の存在下で、該ｍＲＮＡと該Ｃ末端ラベル化蛋白質の蛋白質をコードするｍＲＮＡが翻訳されることにより対応付け分子とＣ末端ラベル化蛋白質が同時に生成し、生成した対応付け分子とＣ末端ラベル化蛋白質との間で相互作用することで複合体が形成されるとき、無細胞共翻訳系におけるＣ末端ラベル化剤の濃度を、該Ｃ末端ラベル化蛋白質のラベル化効率に十分で、かつ該対応付け分子の形成を阻害しない範囲とすることを特徴とする。
無細胞共翻訳で、「相互作用」が共翻訳で実現される場合、その無細胞翻訳系については、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽の系などいずれでも構わない。ｉｎｖｉｔｒｏｖｉｒｕｓ法では、対応付け分子の形成は、大腸菌Ｅ．ｃｏｌではかなり不安定であるが、ウサギ網状赤血球の系（ＮｅｍｏｔｏＮ，Ｍｉｙａｍｏｔｏ−ＳａｔｏＥ，ＹａｎａｇａｗａＨ．（１９９７）ＦＥＢＳＬｅｔｔ．４１４，４０５；ＲｏｂｅｒｔｓＲ．Ｗ，ＳｚｏｓｔａｋＪ．Ｗ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４，１２２９７）では安定に確認されており、さらに小麦胚芽の系（ＷＯ０２／４６３９５）ではより安定に確認されている。
無細胞共翻訳における翻訳又は転写及び翻訳の条件は、用いる無細胞翻訳系に応じて適宜選択される。
＜４＞ｍＲＮＡが除去された対応付け分子を含む第１の態様の複合体
いったん対応付け翻訳によって蛋白質の検出や固定に必要なタグや蛍光性色素などの修飾が施されれば、ｍＲＮＡを検出や固定に利用しない場合は、ｍＲＮＡ部分は必要なくなる。従って、本発明は、ＩＶＶが、ｍＲＮＡが除去されたＩＶＶであり、ｍＲＮＡが除去されたＩＶＶとＣ末端ラベル化蛋白質との間の相互作用によって形成される複合体を提供する。ｍＲＮＡが相互作用検出で弊害となる場合などにはこの形態を検出に利用することが望ましい。
図１のＣ及びＤに、ｍＲＮＡが除去されたｉｎｖｉｔｏｒウイルス（ＩＶＶ（ｍＲＮＡ−））を含む複合体の構成例を示す。
図１のＣはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）とＣ末端ラベル化蛋白質の複合体を示す。蛋白質１とがスペーサー１からなるｍＲＮＡを欠いた構成と、蛋白質２とＣ末端ラベル化蛋白質の相互作用により形成された複合体である。スペーサー１は、蛋白質１に必要な修飾剤（Ｘ）を導入した構成をとり、Ｃ末端ラベル化蛋白質は、そのＣ末端に、Ｃ末端ラベル化剤（Ｙ）が連結した構成をとる。無細胞共翻訳における相互作用によってＩＶＶとＣ末端ラベル化蛋白質の複合体を形成すると共に、同時に各蛋白質に必要な修飾が施され、後処理としてＲＮａｓｅなどでｍＲＮＡを消化して、ＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）とＣ末端ラベル化蛋白質の複合体を形成する。
図１のＤはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）と複数のＣ末端ラベル化蛋白質の複合体を示す。蛋白質１とスペーサー１からなるｍＲＮＡを欠いた構成と、複数の蛋白質Ａ、Ｂ，Ｃ．．．．などがＣ末端ラベル化剤（Ｙ）で修飾された構成のものが、蛋白質間相互作用により形成された複合体である。スペーサー１は、蛋白質１に必要な修飾剤（Ｘ）を導入した構成をとり、蛋白質Ａ、Ｂ，Ｃ．．．．（ライブラリー）などにＣ末端ラベル化剤（Ｙ）を導入した構成のものが、無細胞共翻訳によって相互作用することによって複合体を形成すると共に、同時に各蛋白質に必要な修飾が施され、後処理として、ＲＮａｓｅなどでｍＲＮＡを消化して、ＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）と複数のＣ末端ラベル化蛋白質の複合体を形成する。
ｍＲＮＡの除去方法は特に限定されないが、例えば、ＲＮａｓｅ処理があげられる。
ＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）のスペーサーの修飾は、上記のＩＶＶと同様でよい。
＜５＞第１の態様の複合体を用いる蛋白質間相互作用解析方法
本発明の蛋白質間相互作用解析方法は、相互作用させる分子として、本発明の複合体を形成する対応付け分子を用いることを特徴とし、相互作用させる分子として、本発明の複合体を形成する対応付け分子とＣ末端ラベル化蛋白質を用いることの他は公知の方法に従って行うことができる。解析方法としては、対応付け分子を固定化する方法及び対応付け分子を固定化しない方法が挙げられる。本発明の解析方法においては、通常には、本発明の分離・固定用あるいは検出用修飾を持つ対応付け分子の複合体を、修飾物質の種類や反応系の種類などにより適宜組み合わせて形成せしめ、該複合体が発する信号において両分子間の相互作用に基づいて発生される上記信号の変化を測定することにより相互作用を解析する。相互作用の解析は、例えば、蛍光相関分光法、蛍光イメージングアナライズ法、蛍光共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン共鳴法、又は、固相酵素免疫検定法により行われる。前者としては、ＲＩもしくは蛍光イメージングアナライズ法による、またはＤＮＡチップもしくはプロテインチップを用いる解析方法が挙げられ、後者としては蛍光相互相関分析法による解析方法が挙げられる。
図２に、本発明の複合体による蛋白質の相互作用の解析の概略を示す。Ａに示すように、本発明の「ＩＶＶとＣ末端ラベル化蛋白質の複合体」は、無細胞共翻訳において、スペーサーの修飾剤（Ｘ）で修飾を施されたある蛋白質を含むＩＶＶ、そして、Ｃ末端ラベル化剤（Ｙ）で修飾を施されたある蛋白質あるいは複数の蛋白質との相互作用によって形成されたものである。このＩＶＶのｍＲＮＡを何らかの方法で消化した複合体が「ＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）とＣ末端ラベル化蛋白質の複合体」である。これら複合体の相互作用について、ＦＣＣＳ、蛍光リーダー、ＤＮＡチップ、プロテインチップなどで解析する。また、９６穴プレートを利用することによって大規模解析に容易に発展できる点も特徴である。ＦＣＣＳ解析では、単なる相互作用のあり無しのみ成らず、相互作用の強さの指標としてＫｄを算出可能となる。また、Ｂに示すように、無細胞共翻訳において、そのスペーサーの修飾剤（Ｘ）に固定化のための修飾を施された「ＩＶＶ」あるいは「ＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）」とＣ末端ラベル化剤（Ｙ）で修飾を施されたある蛋白質あるいは複数の蛋白質との相互作用をＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動パターンによって解析する。また、９６穴プレートを利用して、複数の「ＩＶＶ」あるいは「ＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）」を固定化してスクリーニングすることによって大規模並行解析に容易に発展できる。
このように、本発明の複合体に修飾されたタグや蛍光性色素を利用して、相互作用を検出するさまざまな方法が挙げられる。具体的には、二種類の異なる蛍光性色素を異なる蛋白質に修飾することでＦＣＣＳ解析へ、あるいは、固定用のタグと蛍光性色素を異なる蛋白質に修飾することにより蛍光リーダー、プロテインチップなどへ応用可能であり（図２のＡ）、さらに、ＩＶＶに固定用のタグを修飾し、Ｃ末端ラベル化により蛍光性色素を複数の蛋白質に修飾することによりスクリーニング後のゲルアッセイなどでｉｎｖｉｔｒｏウイルスの蛋白質と相互作用可能な複数の蛋白質についての解析へ応用可能である（図２のＢ）。また、本発明の複合体を、第１、２の発明の複合体を９６穴プレートなどを利用することで、並列的に解析することにより、一挙に大量の蛋白質間相互作用を解析することが可能である。
図２のＡに示したのは、ＩＶＶまたはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）をＦＣＣＳ測定、蛍光リーダー、ＤＮＡチップ、プロテインチップなどへ応用して蛋白質の相互作用を解析する方法である。ＦＣＣＳ測定では、対応付け分子として、修飾剤（Ｘ）として蛍光性物質を有するスペーサーと蛋白質をコードしているｍＲＮＡのライゲーションによって対応付け分子のテンプレートを用意し、Ｃ末端ラベル化蛋白質として、蛍光性物質を有するラベル化剤（Ｙ）と蛋白質をコードしているｍＲＮＡのテンプレートを用意する。ここで、修飾剤（Ｘ）とラベル化剤（Ｙ）は、ＦＣＣＳ測定が可能な吸収領域をもつ、たとえば、Ｃｙ５とローダミングリーンなどの蛍光性物質の組み合わせが選択される。これらの対応付け分子とＣ末端ラベル化蛋白質のテンプレートは、無細胞翻訳系で共に翻訳され、修飾剤（Ｘ）を有する対応付け分子は、リボソーム上で蛋白質と修飾剤（Ｘ）を有するスペーサーを持つｍＲＮＡと連結して対応付け分子となり、Ｃ末端ラベル化蛋白質は、リボソーム上で蛋白質とラベル化剤（Ｙ）が連結してＣ末端ラベル化蛋白質となり、それら対応付け分子の蛋白質とＣ末端ラベル化蛋白質が相互作用により複合体を形成しているかどうかをＦＣＣＳ測定により解析することになる。また、蛍光リーダーやＤＮＡチップ、プロテインチップに応用する場合も、上記と同様であるが、ＸとＹの少なくとも一方に固定化剤を有し、プレートやビーズやスライドガラスに固定する。このとき、ＸやＹは、検出剤と固定化剤の両方を有していても構わない。また、対応付け分子とＣ末端ラベル化蛋白質は一対あるいは複数からなる複合体の両方が可能であり、ある一つの対応付け分子とＣ末端ラベル化蛋白質のライブラリーなどの複合体を用いることもできる。あるいはその反対に、ある一つのＣ末端ラベル化蛋白質に対する対応付け分子のライブラリーなどを用いることもできる。ライブラリーとしては、ｃＤＮＡライブラリー（ランダムプライミング・ライブラリー、ｄＴプライミング・ライブラリー）、ランダム・ライブラリー、ペプチド・ライブラリー、ホルモン・ライブラリー、抗体・ライブラリー、リガンド・ライブラリー、医薬化合物ライブラリーなどいかなるライブラリーでも構わない。
ここで、ｍＲＮＡ部分は蛋白質の相互作用検出で利用しない場合、たとえば、ＦＣＣＳ測定、蛍光リーダー、プロテインチップなどに応用する場合は、ＲＮａｓｅＡなどで故意的に切断することが出来る。図１のＣおよびＤに切断後の複合体を示す。切断することによって、ｍＲＮＡの妨害による蛋白質間相互作用の検出の困難性が解消出来る。また、複合体を形成しない単独の対応付け分子をプレートやビーズやスライドガラスに固定することも可能であり、この場合、ｍＲＮＡを削除したＩＶＶやＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）を固定化することは、Ｃ末端ラベル化蛋白質（特開平１１−３２２７８１）に比較して、遊離の修飾剤が１／１００以下と少ないため固定化の前に精製の必要がないことでも有利である。
図２のＢに示したのは、第１の発明をＩＶＶの遺伝子部分を活用してＲＴ−ＰＣＲで検出するｉｎｖｉｔｒｏセレクション法などへ応用したもので、対応付け分子のＸとして固定化できる物質を導入しておき、対応付け分子と相互作用のあるＣ末端ラベル化蛋白質をスクリーニング後にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出する。Ｘによる固定化の仕組みは、いかなるものでも構わない。たとえば、ＩｇＧ−プロテインＡの親和性やカルモジュリンビーズとの親和性を利用したスクリーニング。あるいはプルダウン法でストレプトアビジンあるいはアビジン−ビオチン親和性、ＧＳＴ−ｔａｇ、Ｆｌａｇ−ｔａｇ，Ｔ７−ｔａｇ，Ｈｉｓ−ｔａｇなどを利用したスクリーニングやそれらを組み合わせたスクリーニングなど。スクリーニングの後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動することによって、対応付け分子の蛋白質と相互作用のあるＣ末端ラベル化蛋白質を検出することが出来る。ここで、Ｃ末端ラベル化蛋白質は複数あるいはライブラリーなども用いることが出来る。
図２のＡにおいて、９６穴のプレートなどを利用することによって、単に一対の蛋白質の相互作用を解析するにとどまらず、多数の組み合わせの相互作用を並列に分析することが可能となり、多数の蛋白質間相互作用の解析および、巨大な蛋白質複合体の構成を解析することも可能となる。特に、二種類の蛍光色素を用いる蛍光相互相関分光法（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＣｒｏｓｓ−ＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＣＳ）では、一種類の蛍光色素を用いるＦＣＳでは困難であった同程度の大きさをもつ分子間の相互作用も検出が可能であり、測定に必要な試料量が少なく、測定時間も短く、９６穴プレートの自動解析が可能な蛋白質間相互作用解析のハイスループットな手法として期待される。また、図２のＢにおいては、ｉｎｖｉｔｒｏウイルスと複数のＣ末端ラベル化蛋白質の相互作用を一度に検出することが出来、単に一対の蛋白質の相互作用を解析するにとどまらず、多数の組み合わせの相互作用を並列に分析することが可能となり、巨大な蛋白質複合体の構成を解析することも可能となる。
以下にさらに具体的に解析方法を述べる。
○蛍光相関分光法
蛍光相関分光法（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＦＣＳ）：Ｅｉｇｅｎ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，５７４０−５７４７（１９９４））は、共焦点レーザー顕微鏡等の下で、粒子の流動速度、あるいは拡散率、容積収縮等を測定する方法である。
具体的には試料粒子が励起光により励起されて、試料液容積の一部において蛍光を放射し、この放射光を測定し光子割合を得る。この値は、特定の時間に観測されている空間容積中に存在する粒子の数と共に変化する。上述した種々のパラメターは自己相関関数を使用してこの信号の変動から算出され得る。このＦＣＳを行う為の装置もカールツァイス（Ｚｅｉｓｓ）社等から市販されており、本方法においてもこれらの装置を用いて解析を行うことができる。
この方法を用いてＩＶＶとＣ末端ラベル化蛋白質あるいはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）とＣ末端ラベル化蛋白質間相互作用の測定又は解析を行う場合、溶液として供することが必要である（液相法）。２種類の蛍光色素を用いる蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ）は、１種類の蛍光色素を用いるＦＣＳでは困難であった同じくらいの分子量をもつ蛋白質間の相互作用も検出できる。２種類の蛍光色素を用いる他の方法としては蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法が知られているが、ＦＲＥＴが生じるためには２つの蛍光色素が４０〜５０Å以内に近接する必要があり、蛋白質の大きさや蛍光色素の付いている位置によっては、相互作用していてもＦＲＥＴが観測されない危険性がある。ＦＣＣＳ法では相互相関の検出は蛍光色素間の距離に依存しないので、そのような問題がない。一方、他の検出系である蛍光偏向解消法と比較すると、ＦＣＣＳ法は必要なサンプル量が少なく、検出時間が短く、測定の自動化が容易等の長所がある。さらにＦＣＣＳ法では蛍光標識された分子の大きさや数というきわめて基本的な情報が得られるので、表面プラズモン共鳴法のように汎用的な用途に利用できる可能性がある。両者の違いは、表面プラズモン共鳴法では蛋白質が固定化された状態で相互作用を検出するのに対して、ＦＣＣＳ法ではより天然の状態に近い溶液中の相互作用を見ることができる点にある。
通常、蛍光を修飾した蛋白質は、精製し、両分子を何らかの方法で相互作用させる必要がある。本方法においては、その工程を一工程で実現できる。すなわち、無細胞翻訳系で共翻訳によって、ＩＶＶとＣ末端ラベル化蛋白質を形成し相互作用させることが出来る。この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば、特定のＩＶＶと異なる複数のＣ末端ラベル化蛋白質を共翻訳した溶液をそのまま、あるいはＲＮａｓｅ処理によってＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）とＣ末端ラベル化蛋白質の複合体として、上記ＦＣＳ用測定装置の各測定用ウェルにそれぞれ投入する方法が用いられる。
○蛍光イメージングアナライズ法
蛍光イメージングアナライズ法は、固相化された分子に、修飾分子を接触せしめ、両分子の相互作用により、固相化された分子上にとどまった修飾分子から発せられる蛍光を、市販の蛍光イメージングアナライザーを用いて測定又は解析する方法である。
この方法を用いてＩＶＶとＣ末端ラベル化蛋白質あるいはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）とＣ末端ラベル化蛋白質間相互作用の測定又は解析を行う場合、一方のＩＶＶとＣ末端ラベル化蛋白質あるいはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）とＣ末端ラベル化蛋白質は上記した方法により固相化されていることが必要である。ＩＶＶとＣ末端ラベル化蛋白質あるいはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）とＣ末端ラベル化蛋白質のＣ末端ラベル化剤に固定化物質を導入しておくことで実現できる。
ＩＶＶとＣ末端ラベル化蛋白質あるいはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）とＣ末端ラベル化蛋白質を固相化するための基板としては、通常蛋白質や核酸等を固定化するのに用いられるニトロセルロースメンブレンやナイロンメンブレン、あるいはプラスチック製のマイクロプレート等も用いることができる。固相化のためのこれらの物質を、無細胞共翻訳系に投入することで、ＩＶＶとＣ末端ラベル化蛋白質あるいはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）とＣ末端ラベル化蛋白質を固相化すると同時に、複合体を形成することも可能である。また、プレートの場合は、無細胞共翻訳系をプレートに投入することで、ＩＶＶとＣ末端ラベル化蛋白質あるいはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）とＣ末端ラベル化蛋白質を固相化すると同時に、複合体を形成することも可能である。複合体を形成せしめた後、好ましくは過剰に存在する蛍光色素を同緩衝液等により洗浄する工程を行い、固相上にとどまったＩＶＶとＣ末端ラベル化蛋白質あるいはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）とＣ末端ラベル化蛋白質の修飾物質から発せられる蛍光信号、又は固相化されている修飾分子から発せられる蛍光と固相上にとどまった修飾分子から発せられる蛍光が混ざり合った信号を、市販のイメージングアナライザーを用いて測定あるいは解析することにより、固相化された分子と相互作用する分子を同定することができる。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記固相表面に、複数のＩＶＶあるいはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）を番地付けして固相化する方法、あるいは１種類のＩＶＶあるいはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）に固相化されていない複数種のＣ末端ラベル化蛋白質を接触させる方法等が用いられるが、ここでは、その組み合わせのＩＶＶとＣ末端ラベル化蛋白質の共翻訳をウェル上で行う方法が可能であるところが特徴である。複数種のＩＶＶあるいはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）を接触させる場合には、固相にとどまった該分子を緩衝液の濃度の差等により解離させて取得し、これを既知の方法により分析することにより同定できる。
その他、２種類の蛍光色素を用いる他の分子間相互作用検出法として、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法、ガラス等の透明体に固相化した分子に溶液として第２の分子を接触せしめ、これにエバネッセント場が発生する角度でレーザー光等の光源を照射し、発生したエバネッセント光を検出器によって測定又は解析する方法であるエバネッセント場分子イメージング法（Ｆｕｎａｔｓｕ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７４，５５５−５５９（１９９５）等）、蛍光偏光で励起された蛍光分子が、励起状態の間、定常状態を保っている場合には同一の偏光平面で蛍光を放射するが、励起された分子が励起状態中に回転ブラウン運動等を行った場合に、放射された蛍光は励起光とは異なった平面になることを利用する蛍光偏光解消法（Ｐｅｒｒａｎ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｒａｄ．，１，３９０−４０１（１９２６））、金属／液体界面で相互作用する分子によって表面プラズモンが励起され、これを反射光の強度変化で測定する表面プラズモン共鳴法（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ，３（４），２１１−２２５（１９８７−８８））などへの応用が挙げられる。
＜６＞本発明の第２態様の複合体
本態様の複合体は、複数の、遺伝子型と表現型の対応付け分子を含み、該対応付け分子間の相互作用によって形成される複合体であり、対応付け分子間の相互作用解析に必要な修飾を、対応付け分子を構成する蛋白質部分以外の部分に有することを特徴とする対応付け分子の複合体である。
複合体を構成する対応付け分子は２種でも３種以上もよく、それらの対応付け分子が含む蛋白質は、同一でも互いに異なっていてもよい。すなわち、本発明の複合体は、或る蛋白質を介する相互作用及び／又は同一の蛋白質間の相互作用による複合体を包含する。
本発明において対応付け分子に含まれる蛋白質は、蛋白質の全長であっても結合活性部位を含む部分ペプチドでもよい。またアミノ酸配列、およびその機能が既知の蛋白質でも、未知の蛋白質でもよい。これらは、合成されたペプチド鎖、生体より精製されたＲＮＡやｃＤＮＡライブラリー等から適当な翻訳系を用いて翻訳したものでもよい。合成されたペプチド鎖はこれに糖鎖が結合した糖蛋白質であってもよい。糖鎖としては、他の蛋白質と相互作用する能力を有する限り、特に制限はなく、その糖配列あるいは機能が、既知の糖鎖でも未知の糖鎖でもよい。好ましくは、既に分離解析され、糖配列あるいは機能が既知の糖鎖が用いられる。
本発明における対応付け分子間の「相互作用」とは、通常は、蛋白質間の共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、および静電力による結合のうち少なくとも１つから生じる分子間に働く力による作用を示すが、この用語は最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。共有結合としては、配位結合、双極子結合を含有する。また静電力による結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有する。また、上記作用の結果生じる結合反応、合成反応、分解反応も相互作用に含有される。
対応付け分子は、スペーサーを介して蛋白質とそれをコードするｍＲＮＡを連結した対応付け分子（ＩＶＶ）であり、かつ該対応付け分子のスペーサーに、対応付け分子間の相互作用解析に必要な修飾を有することが好ましい。
相互作用解析に必要な修飾は通常には検出用修飾および分離用修飾である。
図１２に、本発明の分離用修飾あるいは検出用修飾を施されたＩＶＶの複合体の構成を示す。図１２のＡに示すように、ＩＶＶの単体の構成は、蛋白質とそれをコードしているｍＲＮＡがスペーサーを介して連結したものである。スペーサーは、必要によって修飾剤（Ｘ）を導入した構成をとる。
図１２のＢに示すような一対のＩＶＶから成る複合体は、蛋白質１とそれをコードしているｍＲＮＡ１がスペーサー１を介して連結したＩＶＶ１と、蛋白質２とそれをコードしているｍＲＮＡ２がスペーサー２を介して連結したＩＶＶ２が、蛋白質１と蛋白質２の相互作用により形成された複合体である。スペーサー１は、蛋白質１に必要な修飾剤（Ｘ１）を導入した構成をとり、スペーサー２は、蛋白質２に必要な修飾剤（Ｘ２）を導入した構成をとり、相互作用によって複合体を形成すると共に、同時に各蛋白質に必要な修飾が施されることになる。
図１２のＣに示すような３つ以上の多数のＩＶＶから成る複合体は、蛋白質１とそれをコードしているｍＲＮＡ１がスペーサー１を介して連結したＩＶＶ１と、複数の蛋白質２、３，４などとそれをコードしているｍＲＮＡ２、３，４などがスペーサー２、３，４などを持つＩＶＶ２、３，４などが、蛋白質間相互作用により形成された複合体である。スペーサー１は、蛋白質１に必要な修飾剤（Ｘ１）を導入した構成をとり、スペーサー２、３，４などは、蛋白質２、３，４などに必要な修飾剤（Ｘ２、３，４など）を導入した構成をとり、無細胞共翻訳によって相互作用によって複合体を形成すると共に、同時に各蛋白質に必要な修飾が施されることになる。この時、蛋白質１に対するライブラリーの相互作用を検出する際は、検出用修飾剤（Ｘ２、３，４など）は共通の場合がある。
本発明の複合体を構成する要素であるＩＶＶは、上述のように、蛋白質がコードされたｍＲＮＡとスペーサーをライゲーション反応によって連結して遺伝子型分子をつくり、遺伝子型分子と表現型分子（蛋白質）を無細胞翻訳によってリボソーム上でピューロマイシンを介して連結するものである。このＩＶＶを用いたｉｎｖｉｔｒｏウイルス法は、ある機能をもつ蛋白質に対応する遺伝子群をｃＤＮＡライブラリーなどから網羅的に検出（対応付け分子の遺伝子部分を利用してＰＣＲで増幅して検出）するシステムである。ここでは、ＩＶＶの分離あるいは／および検出を目的とした物質を修飾剤（図１２中，Ｘ）として導入したスペーサー（図１５、１６及び３）を蛋白質間相互作用検出に利用することが大きな特徴となっている。また、修飾剤は、スペーサーへ一つの物質を導入することで分離あるいは検出の目的を達成する場合もあるし、スペーサーへ一つの物質を導入することで分離と検出の目的を兼ねられる場合もあるし、スペーサーへ二つの物質を導入して、分離と検出の目的を達成する場合もある。
分離用修飾剤としては、アビジンあるいはストレプトアビジンとの相互作用が知られているビオチンのような補酵素を代表例として、その他、ニッケル−ＮＴＡ、抗体、蛋白質、ペプチド、糖類、脂質類、色素、ポリエチレングリコールなどが挙げられ、現在知られている分離や固定化のための物質の他、何らかの方法でＩＶＶを固定化できる物質であればいかなるものでも良い。詳しい例を挙げると、アビジンおよびストレプトアビジン等のビオチン結合蛋白質／ビオチン、マルトース結合蛋白質／マルトース、Ｇ蛋白質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合蛋白質／ＤＮＡ、抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合蛋白質／ＡＴＰ、あるいはエストラジオール受容体蛋白質／エストラジオールなどの各種受容体蛋白質／そのリガンドなどが挙げられる。これらの中で、アダプター蛋白質／リガンドの組み合わせとしては、アビジンおよびストレプトアビジンなどのビオチン結合蛋白質、マルトース結合蛋白質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、抗体／抗原分子（エピトープ）、などが好ましく、特にストレプトアビジン／ビオチンの組み合わせが最も好ましい。これらの結合蛋白質は、それ自体既知のものであり、該蛋白質をコードするＤＮＡは既にクローニングされている。アダプター蛋白質の固相表面への結合は、それ自体既知の方法を用いることができるが、具体的には、例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン−２，４−ジイソシアネート、アミノ基、活性エステルに変換可能なカルボキシル基、又はホスホアミダイドに変換可能な水酸基あるいはアミノ基などを利用する方法を用いることができる。
検出用修飾剤は、放射性および蛍光性修飾物質等が挙げられ、蛍光性物質としては、フルオロセイン系列、ローダミン系列、Ｃｙ３，Ｃｙ５，エオシン系列、ＮＢＤ系列等の蛍光物質が挙げられる。これら検出のための修飾剤は、何らかの方法でＩＶＶの蛋白質を検出できる物質ならいかなるものでも良い。
蛍光物質は複数種類を同時に用いてもよい。例えば、対応付け分子の少なくとも一つがスペーサーに検出用修飾としてＣｙ５を有し、残りの対応付け分子が検出用修飾としてローダミングリーンを有してもよいし、対応付け分子の少なくとも一つがスペーサーに検出用修飾としてローダミングリーンを有し、残りの対応付け分子がスペーサーに検出用修飾としてＣｙ５を有していてもよい。
本発明の複合体には、二つの同一あるいは異なる対応付け分子のＩＶＶが相互作用しているもの（図１２のＢ）と、３つ以上の複数の対応付け分子が相互作用しているもの（図１２のＣ）がある。まず、図１２のＢでは、二つの同一あるいは異なる対応付け分子１，２（たとえば、ＩＶＶ１、２）が相互作用している構成をとっている。ＩＶＶ１は、蛋白質１のｍＲＮＡを有し、ＩＶＶ１に固有の修飾剤（Ｘ１）として分離や固定化あるいは検出のための修飾剤を有する。ＩＶＶ２は、蛋白質２のｍＲＮＡを有し、ＩＶＶ２に固有の修飾剤（Ｘ２）を有する。ここで、蛋白質１と蛋白質２は同じ場合と異なる場合がある。修飾剤（Ｘ１）と修飾剤（Ｘ２）については、検出用修飾剤（Ｘ１）と検出用修飾剤（Ｘ２）の組み合わせの場合は、異なる蛍光性物質の修飾剤の組み合わせとなり、一方が分離用修飾剤（Ｘ１）を有する場合と、分離用修飾剤（Ｘ１）と検出用修飾剤（Ｘ２）の組み合わせの場合がある。次ぎに、図１２のＣでは、３つ以上の多数のＩＶＶが相互作用している構成をとっている。多数のＩＶＶは、各々の蛋白質のｍＲＮＡを有し、修飾剤（Ｘ１，２．．．）を有する。修飾剤（Ｘ１，２．．．）については、該複合体の構成分子として、検出用修飾剤（Ｘ１）を有する少なくとも一つのＩＶＶ１を持つ、または、該複合体の構成分子として、分離用修飾剤（Ｘ１）を有する少なくとも一つのＩＶＶ１を持つ構成をもっている。
本発明の複合体は、それぞれの対応付け分子を調製し、それらを混合することによって得ることができるが、本発明者らは、対応付け分子がＩＶＶである場合には、無細胞翻訳系で、２つ以上のＩＶＶを共に翻訳（無細胞共翻訳）すると同時に、蛋白質の検出や固定に必要なタグや蛍光色素などの異なる修飾を所望の蛋白質を含むＩＶＶに行うことが可能であり、かつそれらＩＶＶ間の相互作用により複合体を形成出来ることを見いだした。この態様によれば、融合蛋白質など従来のクローニングが必要な方法を用いることなく、ＩＶＶのスペーサーの分離用及び検出用の修飾剤（図１２中，Ｘ）により、蛋白質の検出や固定に必要なタグや蛍光色素などの修飾を実現できる。すなわち、蛋白質合成、検出や固定のためのタグや蛍光性色素などの蛋白質への修飾、修飾した蛋白質の分離・精製、そして相互作用の形成などの各工程を一工程で実現できる。
無細胞共翻訳で「相互作用」が実現される場合、その無細胞翻訳系については、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽の系などいずれでも構わない。ｉｎｖｉｔｒｏウイルス法では、対応付け分子の形成は、大腸菌Ｅ．ｃｏｌではかなり不安定であるが、ウサギ網状赤血球の系（ＮｅｍｏｔｏＮ，Ｍｉｙａｍｏｔｏ−ＳａｔｏＥ，ＹａｎａｇａｗａＨ．（１９９７）ＦＥＢＳＬｅｔｔ．４１４，４０５；ＲｏｂｅｒｔｓＲ．Ｗ，ＳｚｏｓｔａｋＪ．Ｗ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４，１２２９７）では安定に確認されており、さらに小麦胚芽の系（ＷＯ０２／４６３９５）ではより安定に確認されている。
無細胞共翻訳における翻訳又は転写及び翻訳の条件は、用いる無細胞翻訳系に応じて適宜選択される。
＜７＞ｍＲＮＡが除去された対応付け分子を含む第２態様の複合体
いったん対応付け翻訳によって蛋白質の検出や固定に必要なタグや蛍光性色素などの修飾が施されれば、ｍＲＮＡを検出や固定に利用しない場合は、ｍＲＮＡ部分は必要なくなる。従って、本発明は、ＩＶＶが、ｍＲＮＡが除去されたＩＶＶであり、ｍＲＮＡが除去されたＩＶＶ間の相互作用によって形成される複合体を提供する。ｍＲＮＡが相互作用検出で弊害となる場合などにはこの形態を検出に利用することが望ましい。
図１３に、本発明のｍＲＮＡを欠いたＩＶＶ（ＩＶＶ（ｍＲＮＡ−））とその複合体の構成を示す。図１３のＡに示すＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）は、ＩＶＶのｍＲＮＡを除去したものであり、蛋白質とスペーサーから成る。スペーサーは、必ず修飾剤（Ｘ）を導入した構成をとる。
図１３のＢに示す一対のＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）から成る複合体は、蛋白質１とスペーサー１からなるＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）１と、蛋白質２とスペーサー２からなるＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）２が、蛋白質１と蛋白質２の相互作用により形成された複合体である。スペーサー１は、蛋白質１に必要な修飾剤（Ｘ１）を導入した構成をとり、スペーサー２は、蛋白質２に必要な修飾剤（Ｘ２）を導入した構成をとり、相互作用によって複合体を形成すると共に、同時に各蛋白質に必要な修飾が施されている。
図１３のＣに示す３つ以上の多数のＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）から成る複合体；蛋白質１とスペーサー１からなるＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）１と、複数の蛋白質２、３、４などとスペーサー２、３、４などからなるＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）２、３、４などが、蛋白質間相互作用により形成された複合体である。スペーサー１は、蛋白質１に必要な修飾剤（Ｘ１）を導入した構成をとり、スペーサー２、３、４などは、蛋白質２、３、４などに必要な修飾剤（Ｘ２、３、４など）を導入した構成をとり、相互作用によって複合体を形成すると共に、同時に各蛋白質に必要な修飾が施されることになる。この時、蛋白質１に対するライブラリーの相互作用を検出する際は、検出用修飾剤（Ｘ２、３、４など）は共通の場合がある。
ｍＲＮＡの除去方法は特に限定されないが、例えば、ＲＮａｓｅ処理があげられる。
ＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）のスペーサーの修飾は、上記のＩＶＶと同様でよい。
本発明は、また、この態様の複合体を形成し得る対応付け分子、すなわち、スペーサーを介して蛋白質とそれをコードするｍＲＮＡを連結した対応付け分子からｍＲＮＡを除去することにより得られる対応付け分子であって、スペーサーが、蛋白質のＣ末端に結合した、ピューロマイシンあるいはピューロマイシンと少なくとも１残基のＤＮＡあるいは／またはＲＮＡからなるペプチドアクセプター領域、ペプチドアクセプター領域に結合した、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域、及び、ＰＥＧ領域に結合した、少なくとも１残基のＤＮＡあるいは／またはＲＮＡの塩基に機能修飾を施した機能付与ユニットを含む、対応付け分子を提供する。
この対応付け分子は、上述のスペーサー分子に由来するスペーサーを介して蛋白質とそれをコードするｍＲＮＡを連結した対応付け分子からｍＲＮＡを除去することにより得ることができる。ｍＲＮＡの除去は、スペーサーの構成に従って、対応付け分子に機能付与ユニットが残存するように行えばよい。例えば、機能付与ユニット及びペプチドアクセプター領域がＤＮＡからなる場合には、ＲＮａｓｅ処理により得ることができる。また、ペプチドアクセプター領域及び機能付与ユニットを構成するリボヌクレオチドの種類を考慮した特異性を有するＲＮａｓｅを用いれば、ペプチドアクセプター領域及び機能付与ユニットはＲＮＡを含んでいてもよい。
＜８＞第２態様の複合体を用いる蛋白質間相互作用解析方法
本発明の蛋白質間相互作用解析方法は、相互作用させる分子として、本発明の複合体を形成する対応付け分子を用いることを特徴とし、相互作用させる分子として、本発明の複合体を形成する対応付け分子を用いることの他は公知の方法に従って行うことができる。解析方法としては、対応付け分子を固定化する方法及び対応付け分子を固定化しない方法が挙げられる。本発明の解析方法においては、通常には、本発明の分離・固定用あるいは検出用修飾を持つ対応付け分子の複合体を、修飾物質の種類や反応系の種類などにより適宜組み合わせて形成せしめ、該複合体が発する信号において両分子間の相互作用に基づいて発生される上記信号の変化を測定することにより相互作用を解析する。相互作用の解析は、例えば、蛍光相関分光法、蛍光イメージングアナライズ法、蛍光共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン共鳴法、又は、固相酵素免疫検定法により行われる。前者としては、ＲＩもしくは蛍光イメージングアナライズ法による、またはＤＮＡチップもしくはプロテインチップを用いる解析方法が挙げられ、後者としては蛍光相互相関分析法による解析方法が挙げられる。
図１４に、本発明の複合体による蛋白質の相互作用の解析の概略を示す。Ａに示すように、本発明の複合体であるＩＶＶ複合体あるいはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）複合体は、無細胞共翻訳で合成できる。無細胞共翻訳において、スペーサーの修飾剤（Ｘ）で修飾を施されたＩＶＶが蛋白質１と蛋白質２あるいは多数の蛋白質との相互作用によって形成されたものが「ＩＶＶ複合体」である。このＩＶＶのｍＲＮＡを除去した複合体が「ＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）複合体」である。これら複合体の相互作用について、ＦＣＣＳ、蛍光リーダー、ＤＮＡチップ、プロテインチップなどで解析する。また、９６穴プレートを利用することによって大規模解析に容易に発展できる点も特徴である。ＦＣＣＳ解析では、単なる相互作用のあり無しのみならず、相互作用の強さの指標としてのＫｄを算出可能となる。また、Ｂに示すように、本発明の複合体であるＩＶＶ複合体あるいはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）複合体は、無細胞共翻訳において、そのスペーサーの修飾剤（Ｘ）にスクリーニングのための修飾を施された「ベイトＩＶＶ」と遺伝子タグを持つ「プレイのＩＶＶ」とを相互作用せしめたものであり、その相互作用は、遺伝子タグの増幅を利用するＲＴ−ＰＣＲとその電気泳動パターンによって解析する。また、９６穴プレートを利用することによって大規模並行解析に容易に発展できる点も特徴である。
このように、本発明の複合体に修飾されたタグや蛍光性色素を利用して、相互作用を検出するさまざまな方法が挙げられる。具体的には、二種類の異なる蛍光性色素を異なる蛋白質に修飾することでＦＣＣＳ解析へ応用可能であり（図１４のＡ）、固定用のタグと蛍光色素を異なる蛋白質に修飾することにより蛍光リーダー、ＤＮＡチップ、プロテインチップなどへ応用可能である（図１４のＡ）。さらに、ｉｎｖｉｔｒｏウイルスの対応付け分子である本来の性質を利用して、一つのｉｎｖｉｔｒｏウイルスには固定用のタグを修飾し、９６穴プレートなどへの固定による並行スクリーニングを施し、もう一方のｉｎｖｉｔｒｏウイルスの遺伝子部分を活用してＲＴ−ＰＣＲで検出するｉｎｖｉｔｒｏセレクション法などへの応用が考えられる（図１４のＢ）。また、本発明の複合体を９６穴プレートなどを利用することで、並列的に解析することにより、一挙に大量の蛋白質間相互作用を解析することが可能である。以下、さらに詳細に説明する。
図１４のＡに示したのは、ＩＶＶ，ＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）をＦＣＣＳ測定、蛍光リーダー、ＤＮＡチップ、プロテインチップなどへ応用して蛋白質の相互作用を解析する方法である。ＦＣＣＳ測定では、修飾剤（Ｘ１）として蛍光性物質を有するスペーサーと蛋白質をコードしているｍＲＮＡのライゲーションによってＩＶＶ１のテンプレートを用意し、修飾剤（Ｘ２）として蛍光性物質を有するスペーサーと蛋白質をコードしているｍＲＮＡのライゲーションによってＩＶＶ２のテンプレートを用意する。ここで、修飾剤（Ｘ１）と修飾剤（Ｘ２）は、ＦＣＣＳ測定が可能な吸収領域をもつ、たとえば、Ｃｙ５とローダミングリーンなどの蛍光性物質の組み合わせが選択される。これらのＩＶＶ１とＩＶＶ２のテンプレートは、無細胞翻訳系で共に翻訳され、修飾剤（Ｘ１）を有するＩＶＶ１のテンプレートは、リボソーム上で蛋白質１と連結してＩＶＶ１となり、修飾剤（Ｘ２）を有するＩＶＶ２のテンプレートは、リボソーム上で蛋白質２と連結してＩＶＶ２となり、それらの蛋白質１と蛋白質２が相互作用により複合体を形成しているかどうかをＦＣＣＳ測定により解析することになる。また、蛍光リーダーやＤＮＡチップ、プロテインチップに応用する場合も、上記と同様であるが、Ｘ１あるいはＸ２の少なくとも一方に固定化剤を含み、プレートやビーズやスライドガラスに固定する。このとき、Ｘは、検出剤と固定化剤の両方を兼ねた物質あるいは、二つの物質を導入しても構わない。また、ＩＶＶは一対あるいはそれ以上の複数からなる複合体の両方が可能であり、ある一つのＩＶＶとＩＶＶライブラリーなどとの複合体を用いることもできる。ＩＶＶライブラリーとしては、ｃＤＮＡライブラリー（ランダムプライミング・ライブラリー、ｄＴプライミング・ライブラリー）、ランダム・ライブラリー、ペプチド・ライブラリー、ホルモン・ライブラリー、抗体・ライブラリー、リガンド・ライブラリー、医薬化合物ライブラリーなどいかなるライブラリーでも構わない。
ここで、ｍＲＮＡ部分は蛋白質の相互作用検出で利用しない場合（遺伝子タグのＲＴ−ＰＣＲによる検出が必要ない場合）、たとえば、ＦＣＣＳ測定、蛍光リーダー、プロテインチップなどに応用する場合は、ＲＮａｓｅＡなどで故意的に切断することが出来る。切断することによって、ｍＲＮＡの妨害による蛋白質間相互作用の検出の困難性が解消出来る。また、複合体を形成しない単独のＩＶＶをプレートやビーズやスライドガラスに固定することも可能であり、この場合、ｍＲＮＡを削除したＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）を固定化することは、Ｃ末端ラベル化蛋白質（特開平１１−３２２７８１「蛋白質のラベル化化合物およびその化合物を用いた蛋白質のラベル化方法」柳川弘志ほか）を固定化することに比較して、遊離の修飾剤が１／１００以下と少ないため固定化の前の精製や固定化後の洗いでも有利である。また、検出用修飾が施されたＩＶＶやＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）についても同様に、Ｃ末端ラベル化蛋白質と比較して、遊離の修飾剤が１／１００以下と少ないためクルードな状態で利用可能となる。
図１４のＢに示したのは、ＩＶＶの遺伝子部分を活用してＲＴ−ＰＣＲで検出するｉｎｖｉｔｒｏセレクション法などへ応用したもので、ベイト対応付け分子のＸとして固定化できる物質を導入しておき、ベイト対応付け分子と相互作用のある蛋白質をスクリーニング後にＲＴ−ＰＣＲによってその遺伝子を検出する。Ｘによる固定化の仕組みは、上記した固定化剤を利用できる。スクリーニングの後、ＲＴ−ＰＣＲあるいはＰＣＲによって蛋白質の遺伝子配列を知ることが出来る。ここで、検出（プレイ）側のＩＶＶは複数あるいは上述したライブラリーなども用いることが出来る。
図１４のＡにおいて、９６穴のプレートなどを利用することによって、単に一対の蛋白質の相互作用を解析するにとどまらず、多数の組み合わせの相互作用を並列に分析することが可能となり、巨大な蛋白質複合体の構成を解析することも可能となる。特に、二種類の蛍光色素を用いる蛍光相互相関分光法（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＣｒｏｓｓ−ＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＣＳ）では、一種類の蛍光色素を用いるＦＣＳでは困難であった同程度の大きさをもつ分子間の相互作用も検出が可能であり、測定に必要な試料量が少なく、測定時間も短く、９６穴プレートの自動解析が可能な蛋白質間相互作用解析のハイスループットな手法として期待される。また同様に、図１４のＢにおいて、分離用修飾剤を有するベイトＩＶＶとの相互作用を検出用飾剤を有するプレイＩＶＶの遺伝子部分を活用してＲＴ−ＰＣＲで検出するｉｎｖｉｔｒｏセレクション法を９６穴のプレートを利用して並行スクリーニングにより、単に一対の蛋白質の相互作用を解析するにとどまらず、多数の組み合わせの相互作用を並列に分析することが可能となり、巨大な蛋白質複合体の構成を解析することも可能となる。
以下にさらに具体的に解析方法を述べる。
○蛍光相関分光法
蛍光相関分光法（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＦＣＳ）：Ｅｉｇｅｎ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，５７４０−５７４７（１９９４））は、共焦点レーザー顕微鏡等の下で、粒子の流動速度、あるいは拡散率、容積収縮等を測定する方法である。
具体的には試料粒子が励起光により励起されて、試料液容積の一部において蛍光を放射し、この放射光を測定し光子割合を得る。この値は、特定の時間に観測されている空間容積中に存在する粒子の数と共に変化する。上述した種々のパラメターは自己相関関数を使用してこの信号の変動から算出され得る。このＦＣＳを行う為の装置もカールツァイス（Ｚｅｉｓｓ）社等から市販されており、本方法においてもこれらの装置を用いて解析を行うことができる。
この方法を用いてＩＶＶあるいはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）間相互作用の測定又は解析を行う場合、溶液として供することが必要である（液相法）。２種類の蛍光色素を用いる蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ）は、１種類の蛍光色素を用いるＦＣＳでは困難であった同じくらいの分子量をもつ蛋白質間の相互作用も検出できる。２種類の蛍光色素を用いる他の方法としては蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法が知られているが、ＦＲＥＴが生じるためには２つの蛍光色素が４０〜５０Å以内に近接する必要があり、蛋白質の大きさや蛍光色素の付いている位置によっては、相互作用していてもＦＲＥＴが観測されない危険性がある。ＦＣＣＳ法では相互相関の検出は蛍光色素間の距離に依存しないので、そのような問題がない。一方、他の検出系である蛍光偏向解消法と比較すると、ＦＣＣＳ法は必要なサンプル量が少なく、検出時間が短く、測定の自動化が容易等の長所がある。さらにＦＣＣＳ法では蛍光標識された分子の大きさや数というきわめて基本的な情報が得られるので、表面プラズモン共鳴法のように汎用的な用途に利用できる可能性がある。両者の違いは、表面プラズモン共鳴法では蛋白質が固定化された状態で相互作用を検出するのに対して、ＦＣＣＳ法ではより天然の状態に近い溶液中の相互作用を見ることができる点にある。
通常、蛍光を修飾した蛋白質は、精製し、両分子を何らかの方法で相互作用させる必要がある。本方法においては、その工程を一工程で実現できる。すなわち、無細胞翻訳系での共翻訳によって、ＩＶＶを形成し相互作用させることが出来る。このクルードなＩＶＶ複合体を含む溶液をそのまま、あるいはＲＮａｓｅ処理によってＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）複合体として、好ましくは市販のＦＣＳ用装置の測定用ウェルに通常生化学的に用いられる緩衝液等に適当な濃度で投入する方法によって行われる。先に説明したように、クルードな溶液で測定可能となった理由は、ＩＶＶが非常に高効率で蛍光色素で修飾可能（６０−７０％）であり、修飾されていないフリーの蛋白質の存在頻度が非常に低い（２０−１０％）ため、分離の必要なくそのまま解析可能だからである。
適当な濃度への希釈方法としては、バッファー１（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＣｌｐＨ８．０，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．１％ＮＰ４０，０．５ｍＭＥＤＴＡ，１ｍＭＤＴＴ）あるいはバッファー２（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．０，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．１％ＮＰ４０）、あるいは翻訳系そのもので、１０〜５０倍に希釈することが挙げられる。サンプル量は、通常には１〜５ｎＭである。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば、特定のＩＶＶと異なる複数のＩＶＶを共翻訳したＩＶＶ複合体を含む溶液をそのまま、あるいはＲＮａｓｅ処理によってＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）複合体として、上記ＦＣＳ用測定装置の各測定用ウェルにそれぞれ投入する方法が用いられる。
○蛍光イメージングアナライズ法
蛍光イメージングアナライズ法は、固相化された分子に、修飾分子を接触せしめ、両分子の相互作用により、固相化された分子上にとどまった修飾分子から発せられる蛍光を、市販の蛍光イメージングアナライザーを用いて測定又は解析する方法である。
この方法を用いてＩＶＶあるいはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）間相互作用の測定又は解析を行う場合、一方のＩＶＶあるいはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）は上記した方法により固相化されていることが必要である。ＩＶＶあるいはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）のスペーサーの修飾剤に固定化物質を導入しておくことで実現できる。
ＩＶＶあるいはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）を固相化するための基板としては、通常蛋白質や核酸等を固定化するのに用いられるニトロセルロースメンブレンやナイロンメンブレン、あるいはプラスチック製のマイクロプレート等も用いることができる。固相化のためのこれらの物質を、無細胞共翻訳系に投入することで、ＩＶＶあるいはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）を固相化すると同時に、複合体を形成することも可能である。また、プレートの場合は、無細胞共翻訳系をプレートに投入することで、ＩＶＶあるいはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）を固相化すると同時に、複合体を形成することも可能である。複合体を形成せしめた後、好ましくは過剰に存在する蛍光色素を同緩衝液等により洗浄する工程を行い、固相上にとどまったＩＶＶあるいはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）の修飾物質から発せられる蛍光信号、又は固相化されている修飾分子から発せられる蛍光と固相上にとどまった修飾分子から発せられる蛍光が混ざり合った信号を、市販のイメージングアナライザーを用いて測定あるいは解析することにより、固相化された分子と相互作用する分子を同定することができる。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記固相表面に、複数のＩＶＶあるいはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）を番地付けして固相化する方法、あるいは１種類のＩＶＶあるいはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）に固相化されていない複数種のＩＶＶあるいはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）を接触させる方法等が用いられるが、ここでは、その組み合わせのＩＶＶ共翻訳をウェル上で行う方法が可能であるところが特徴である。複数種のＩＶＶあるいはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）を接触させる場合には、固相にとどまった該分子を緩衝液の濃度の差等により解離させて取得し、これを既知の方法により分析することにより同定できる。
その他、２種類の蛍光色素を用いる他の分子間相互作用検出法として、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法、ガラス等の透明体に固相化した分子に溶液として第２の分子を接触せしめ、これにエバネッセント場が発生する角度でレーザー光等の光源を照射し、発生したエバネッセント光を検出器によって測定又は解析する方法であるエバネッセント場分子イメージング法（Ｆｕｎａｔｓｕ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７４，５５５−５５９（１９９５）等）、蛍光偏光で励起された蛍光分子が、励起状態の間、定常状態を保っている場合には同一の偏光平面で蛍光を放射するが、励起された分子が励起状態中に回転ブラウン運動等を行った場合に、放射された蛍光は励起光とは異なった平面になることを利用する蛍光偏光解消法（Ｐｅｒｒａｎ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｒａｄ．，１，３９０−４０１（１９２６））、金属／液体界面で相互作用する分子によって表面プラズモンが励起され、これを反射光の強度変化で測定する表面プラズモン共鳴法（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ，３（４），２１１−２２５（１９８７−８８））などへの応用が挙げられる。
実施例
以下、具体的に無細胞翻訳系におけるＩＶＶとＣ末端ラベル化蛋白質の共翻訳により形成された複合体、または、複数のＩＶＶの共翻訳により形成された複合体による蛋白質間相互作用解析に関する実施例を記述するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものでない。
実施例１ＩＶＶとＣ末端ラベル化蛋白質の無細胞共翻訳の条件の検討
ＩＶＶ形成とＣ末端ラベル化蛋白質の翻訳を両立させる（両方を無細胞共翻訳する）ためには、添加するＣ末端ラベル化剤の濃度の検討が重要である。ＩＶＶのスペーサーの３’末端はピューロマイシン又はその誘導体であり、Ｃ末端ラベル化剤の３’末端もピューロマイシン又はその誘導体である。よって、使用するＣ末端ラベル化剤の濃度が高すぎると、ＩＶＶ形成を阻害し、低すぎると、蛋白質のＣ末端ラベル化効率が悪くなる。Ｃ末端ラベル化剤の濃度を最適に決定するために、使用するＣ末端ラベル化剤について、各無細胞翻訳糸で、ＩＶＶの形成を阻害しない濃度を検討することが必要である。本実施例では、蛋白質としてＪｕｎを用いて、小麦胚芽の無細胞翻訳系（ＷｈｅａｔＧｅｒｍＥｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ））における、Ｃ末端ラベル化剤としてのＦｌｕ−ｄＣｐＰｕｒｏの添加濃度を変化させたときのＪｕｎのＣ末端ラベル化効率と対応付け分子（Ｊｕｎ−Ｆｌｕ−ＩＶＶ）の形成阻害率について検討した。
方法：
Ｊｕｎは、ｐＥＵ−Ｔ７ＪｕｎＦｌａｇベクター（配列番号１）からＰＣＲ（プライマー５’ＳＰ６（０−２９）Ｔ７（配列番号２）と３’ＦｌａｇＡ（配列番号３）、ＰＣＲプログラムＳＴ６０（表４参照））によってＤＮＡテンプレートを準備した。ｐＥＵ−Ｔ７ＪｕｎＦｌａｇベクターは、市販のベクターｐＵＣ（Ｔａｋａｒａ）にマウス精巣ｃＤＮＡライブラリー（Ｔａｋａｒａ）からクローニングしたｃ−Ｊｕｎ（１７９−３３５）を組み込んだものである。フルオロセインを有するスペーサー（ｐ（ｄＣｐ）_２Ｔ（Ｆｌｕ）ｐＰＥＧ（２０００）ｐ（ｄＣｐ）_２Ｐｕｒｏ；図４）の合成は、図５のＢに概略を示す方法を用いて合成した。ここで化合物１はＩｋｅｄａらが報告した方法（Ｉｋｅｄａ，Ｓ．ｅｔａｌ．（１９９８）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．３９：５９７５−５９７８）を用い合成した。用いたヌクレオチドホスホアミダイト（それぞれｄＣ、Ｔ（Ｆｌ）及びＴ（Ｂｉｏ）を与えるホスホアミダイト）、ＰＥＧホスホアミダイト又は化学リン酸化剤の構造は図５のＡに示す。ヌクレオチドホスホアミダイトおよび化学リン酸化剤はグレンリサーチ社（アメリカ合衆国、バージニア州）より購入した。平均分子量２０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は日本油脂（東京都渋谷区）より購入した。平均分子量４０００のＰＥＧはフルカ社（スイス）より購入した。ＰＥＧアミダイトはＪａｓｃｈｋｅらが報告した方法（Ｊａｓｃｈｋｅ，Ａ．ｅｔａｌ．（１９９３）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．３４：３０１−３０４）を用い合成した。なお、図５中、ＤＭＴｒは４，４’−ジメトキシトリチル基を、Ｆｍｏｃはフルオレン−９−メトキシカルボニル基を示す。
化合物１（４００ｍｇ，ピューロマイシン残基１０μｍｏｌ含有）に対し、以下のＡ〜Ｄの処理を、所定の配列に従い、所定数のヌクレオチドおよびＰＥＧが導入されるまで繰り返し行なった。
Ａ．３％トリクロロ酢酸−塩化メチレン溶液１ｍＬを加え室温で３分間放置後、塩化メチレン５ｍＬで３回洗浄する。再度同じ操作を繰り返した後、無水アセトニトリル５ｍＬで５回洗浄する。
Ｂ．ヌクレオチドホスホアミダイト、ＰＥＧアミダイト又は化学リン酸化剤３０μｍｏｌ、０．４５７Ｍテトラゾール−無水アセトニトリル溶液１００μＬ、および無水アセトニトリル１ｍＬを加え、室温で１５分間振盪する。アセトニトリル５ｍＬで５回洗浄する。
Ｃ．５０ｍＭヨウ素溶液（テトラヒドロフラン−ピリジン−水＝７５：２０：５）１ｍＬを加え室温で３分間放置後、ピリジン５ｍＬで３回洗浄する。再度同じ操作を繰り返した後、無水ピリジン５ｍＬで５回洗浄する。
Ｄ．１０％無水酢酸−ピリジン溶液１ｍＬおよび触媒量の４，４−ジメチルアミノピリジンを加え室温で２０分間放置後、ピリジン５ｍＬで５回、塩化メチレン５ｍＬで５回洗浄する。
上記の処理により、所定の配列で、所定数のヌクレオチド及びＰＥＧが導入された化合物１に濃アンモニア水１．５ｍＬおよびエタノール０．５ｍＬを加え、室温で１４時間振盪した。ろ過により固相担体（ＣＰＧ）を取り除き、ろ液を凍結乾燥した。残査をＨＰＬＣ［カラム：ＹＭＣ社（京都府）製ＹＭＣｐａｃｋＯＤＳ−ＡＳＨ−３４３−５，溶離液：１０〜６０％アセトニトリル−０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ７．０）３０分間の直線濃度勾配、流速：１０ｍＬ／分］で精製後、ＰＥＧ領域を含むスペーサー分子を得た。
なお、記号の意味は以下の通りである。ｐ：リン酸基、ｄＣ：デオキシシチジン、ＰＥＧ（数字）：数字で示す平均分子量を有するＰＥＧ、Ｐｕｒｏ：ピューロマイシン、Ｔ（Ｆｌ）：蛍光色素で標識されたチミジン、Ｔ（Ｂｉｏ）：ビオチンで標識されたチミジン。
スペーサーとＪｕｎｍＲＮＡを以下の組成の反応液でライゲーション（１５℃，２０ｈ）し、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製し、Ｊｕｎ−Ｆｌｕ−ＩＶＶのＲＮＡテンプレートを作成した。

以下の組成の小麦胚芽の無細胞翻訳系（ＷｈｅａｔＧｅｒｍＥｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて、用意したＪｕｎ−Ｆｌｕ−ＩＶＶのＲＮＡテンプレート（Ｊｕｎ（ｍＲＮＡ）−Ｆｌｕ−スペーサー）の翻訳（２６℃，６０ｍｉｎ）を行い、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで１０μｌ中２μｌをチャージして泳動した。この時、Ｃ末端ラベル化剤Ｆｌｕ−ｄＣｐＰｕｒｏを０．０２μＭから２００μＭまで変化させて対応付け分子を形成するのに阻害しない濃度を検討した。

結果：
図６に示したように、Ｃ末端ラベル化剤Ｆｌｕ−ｄＣｐＰｕｒｏは、この小麦胚芽の系では、２０μＭ以上添加すると、Ｃ末端ラベル化効率が劇的に低下すると共に、対応付け分子の形成阻害効率が劇的に上昇する。この結果、共翻訳において、Ｊｕｎ−Ｆｌｕ−ＩＶＶの形成効率も良く、Ｃ末端ラベル化蛋白質の合成効率も良いＦｌｕ−ｄＣｐＰｕｒｏの濃度条件は、２μＭ付近から２０μＭ付近であることがわかった。これらの濃度では、Ｊｕｎ−Ｆｌｕ−ＩＶＶの形成は全く阻害されず、Ｃ末端ラベル化効率もそこそこ得られた。Ｃ末端ラベル化効率については、１０μＭ付近から２０μＭ付近で特に好ましい結果が得られた。
実施例２ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる蛋白質間相互作用の解析
相互作用が既知の蛋白質としてＦｏｓ／Ｊｕｎの組合せを用いて、Ｆｏｓ−Ｆｌｕ−ビオチン−ＩＶＶとＣ末端ラベル化Ｊｕｎ蛋白質の複合体を無細胞翻訳系で共翻訳によって形成させ、Ｆｏｓ／Ｊｕｎの両方に相互作用のないサイクリンＢ１も添加した系で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで相互作用を検出した。ＦｏｓのＤＮＡテンプレートをＰＣＲによって作成し、転写してｍＲＮＡテンプレートとした。ＦｏｓのｍＲＮＡテンプレートと、修飾剤としてビオチンおよびフルオロセインを有するスペーサーをライゲーションし、Ｆｏｓ（ｍＲＮＡ）−Ｆｌｕ−ビオチン−スペーサーを作成した。次ぎに、ＪｕｎのｍＲＮＡテンプレートとサイクリンＢ１のｍＲＮＡテンプレートをＰＣＲによって作成した。ＪｕｎとサイクリンＢ１のｍＲＮＡテンプレートと先に作成したＦｏｓ（ｍＲＮＡ）−Ｆｌｕ−ビオチン−スペーサーテンプレート、そしてＣ末端ラベル化剤Ｆｌｕ−ｄＣｐＰｕｒｏを対応付け分子を形成するのに阻害しない濃度で添加し、小麦胚芽の無細胞翻訳系で共翻訳を行い、Ｃ末端ラベル化サイクリンＢ１の共存下でのＣ末端ラベル化ＪｕｎとＦｏｓ−Ｆｌｕ−ビオチン−ＩＶＶとの相互作用について、アビジンビーズでスクリーニングしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出した。
方法：
Ｆｏｓは、ｐＮｚｚＣＢＰＦｏｓベクター（配列番号４）から、ＴａＫａＲａＥｘＴａｑ（宝酒造）を用いて、ＰＣＲ（プライマー５’ＳＰ６（０２９／Ｆ．Ｈ．）（配列番号５）と３’ＦｏｓＦｌａｇ［Ｘ］Ａ（配列番号６）、ＰＣＲプログラムＳＴ６２（表４参照））によってＤＮＡテンプレートを準備した。ｐＮｚｚＣＢＰＦｏｓベクターは、市販のベクターｐＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にマウス精巣ｃＤＮＡライブラリー（Ｔａｋａｒａ）からクローニングしたｃ−Ｆｏｓ（１１８−２１１）を組み込んだものである。Ｊｕｎは、実施例１と同様にして用意した。サイクリンＢ１は、ｐＣＭＶｚｚＣＢＰｃＢ１ベクター（配列番号７）からＰＣＲ（プライマー５’ＳＰ６（０２９）ｃＢ１（配列番号８）と３’（６４６）ＦｌａｇＡ（配列番号９）、ＰＣＲプログラムＣＹＣＢ１（表４参照））によってＤＮＡテンプレートを準備した。ｐＣＭＶｚｚＣＢＰｃＢ１ベクターは、市販のベクターｐＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に完全長サイクリンＢ１遺伝子を組み込んだものである。ベイトＤＮＡ（配列番号１０）は、Ｆｏｓ／Ｊｕｎの結合配列を含むＤＮＡ−Ｆｏｓ／Ｊｕｎをテンプレートとし、ＰＣＲ（プライマー５’ＤＮＡ（配列番号１１）と３’ＤＮＡ（配列番号１２）、ＰＣＲプログラムＶ−２（表４参照））によって準備した。Ｆｏｓ、ＪｕｎおよびサイクリンＢ１のＤＮＡテンプレートをＲｉｂｏＭＡＸ^ＴＭＬａｒｇｅＳｃａｌｅＲＮＡＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて転写（３７℃，２ｈ）し、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製し、各ｍＲＮＡテンプレートを準備した。フルオロセインとビオチンを有するスペーサー（ｐ（ｄＣｐ）_２Ｔ（Ｂｉｏ）Ｔ（Ｆｌｕ）ｐＰＥＧ（２０００）ｐ（ｄＣｐ）_２Ｐｕｒｏ；図４）の合成は上記のように行った。スペーサーとＦｏｓｍＲＮＡテンプレートを実施例１と同様にライゲーション（１５℃，２０ｈ）し、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製し、Ｆｏｓ（ｍＲＮＡ）−Ｆｌｕ−ビオチン−スペーサーを作成した。
用意したＦｏｓ（ｍＲＮＡ）−Ｆｌｕ−ビオチン−スペーサーテンプレートとＪｕｎのｍＲＮＡテンプレートのみ、あるいはＪｕｎとサイクリンＢ１のｍＲＮＡテンプレート、そしてＣ末端ラベル化剤Ｆｌｕ−ｄＣｐＰｕｒｏを対応付け分子を形成するのに阻害しない２０μＭの濃度で添加し（実施例１で検討）、以下の組成の小麦胚芽の無細胞翻訳系（ＷｈｅａｔＧｅｒｍＥｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて共翻訳（２６℃，６０ｍｉｎ）を行った。比較実験として、Ｆｏｓ（ｍＲＮＡ）−Ｆｌｕ−ビオチン−スペーサーテンプレートを添加しない系でも同様の実験を行った。

共翻訳後、５０μｌの無細胞翻訳系に５０μｌのバッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＣｌｐＨ８．０，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．１％ＮＰ４０，０．５ｍＭＥＤＴＡ，１ｍＭＤＴＴ）と５０μｌの磁性アビジン・ビーズを加え、３０分室温でインキュベートし、磁性スタンドで分離し上清を捨て、３〜５回バッファー１で洗浄し、最終的に、５０μｌの磁性アビジン・ビーズを得た。うちビーズ１０μｌを用いて、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動電気泳動によって確認した。
結果：
図７に示したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、Ｆｏｓ−Ｆｌｕ−ビオチン−ＩＶＶはウエルに残り、相互作用していたＣ末端ラベル化Ｊｕｎ蛋白質のみが検出される。Ｆｏｓの添加されていない共翻訳の系では、Ｃ末端ラベル化Ｊｕｎ、Ｃ末端ラベル化サイクリンＢ１共に検出されなかったが（Ｆｏｓ−，レーン２）、Ｆｏｓの添加された共翻訳の系では、Ｆｏｓ−Ｆｌｕ−ビオチン−ＩＶＶ、Ｃ末端ラベル化Ｊｕｎのみ、あるいはＣ末端ラベル化ＪｕｎとＣ末端ラベル化サイクリンＢ１が翻訳され、Ｆｏｓ−Ｆｌｕ−ビオチン−ＩＶＶとＣ末端ラベル化サイクリンＢ１の相互作用は検出されなかったが、どちらの実験でもＦｏｓ−Ｆｌｕ−ビオチン−ＩＶＶとＣ末端ラベル化Ｊｕｎの相互作用が確認できた（Ｆｏｓ＋，レーン２）。このシステムによって、複数の未知の遺伝子から特定の蛋白質との相互作用を持つ蛋白質を解析可能なことが確認された。

実施例３ＦＣＣＳへの応用
相互作用が既知の蛋白質としてＦｏｓ／Ｊｕｎの組合せを用いて、無細胞翻訳系で共翻訳によってＦｏｓ／Ｊｕｎ複合体を形成させ、ＦＣＣＳで相互作用を測定した。ＦｏｓおよびＪｕｎのＤＮＡテンプレートをＰＣＲによって作成し、転写してｍＲＮＡテンプレートとした。ＦｏｓのｍＲＮＡテンプレートと、修飾剤としてＣｙ５あるいはローダミングリーン（ＲｈＧ）を有するスペーサーをライゲーションし、Ｆｏｓ（ｍＲＮＡ）−Ｃｙ５−スペーサーとＦｏｓ（ｍＲＮＡ）−ＲｈＧ−スペーサーを作成した。同様に、ＪｕｎのｍＲＮＡテンプレートとＲｈＧを有するスペーサーをライゲーションし、Ｊｕｎ（ｍＲＮＡ）−ＲｈＧ−スペーサーを作成した。Ｆｏｓ（ｍＲＮＡ）−Ｃｙ５−スペーサーとＪｕｎ（ｍＲＮＡ）−ＲｈＧ−スペーサーの組み合わせについて、小麦胚芽の無細胞翻訳系で共翻訳し、Ｆｏｓ−Ｃｙ５−ＩＶＶとＪｕｎ−ＲｈＧ−ＩＶＶの相互作用についてＦＣＣＳで測定した。また、コントロールとして相互作用の可能性のないことが知られているＦｏｓ−Ｃｙ５−ＩＶＶとＦｏｓ−ＲｈＧ−ＩＶＶを測定した。
方法：
Ｆｏｓは、ｐＮｚｚＣＢＰＦｏｓベクター（配列番号４）から、ＴａＫａＲａＥｘＴａｑ（宝酒造）を用いて、ＰＣＲ（プライマー５’ＳＰ６（０２９／Ｆ．Ｈ．）（配列番号５）と３’ＦｏｓＦｌａｇ［Ｘ］Ａ（配列番号６）、ＰＣＲプログラムＳＴ６２（表８参照））によってＤＮＡテンプレートを準備した。ｐＮｚｚＣＢＰＦｏｓベクターは、市販のベクターｐＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にマウス精巣ｃＤＮＡライブラリー（Ｔａｋａｒａ）からクローニングしたｃ−Ｆｏｓ（１１８−２１１）を組み込んだものである。Ｊｕｎは、ｐＥＵ−Ｔ７ＪｕｎＦｌａｇベクター（配列番号１）からＰＣＲ（プライマー５’ＳＰ６（０−２９）Ｔ７（配列番号２）と３’ＦｌａｇＡ（配列番号３）、ＰＣＲプログラムＳＴ６０（表８参照））によってＤＮＡテンプレートを準備した。ｐＥＵ−Ｔ７ＪｕｎＦｌａｇベクターは、市販のベクターｐＵＣ（Ｔａｋａｒａ）にマウス精巣ｃＤＮＡライブラリー（Ｔａｋａｒａ）からクローニングしたｃ−Ｊｕｎ（１７９−３３５）を組み込んだものである。ベイトＤＮＡは、Ｆｏｓ／Ｊｕｎの結合配列を含むＤＮＡ−Ｆｏｓ／Ｊｕｎ（配列番号１４）をテンプレートとし、ＰＣＲ（プライマー５’ＤＮＡ（配列番号１１）と３’ＤＮＡ（配列番号１２）、ＰＣＲプログラムＶ−２（表８参照））によって準備した。ＦｏｓとＪｕｎのＤＮＡテンプレートをＲｉｂｏＭＡＸ^ＴＭＬａｒｇｅＳｃａｌｅＲＮＡＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて転写（３７℃，２ｈ）し、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製し、各ｍＲＮＡテンプレートを準備した。Ｃｙ５あるいはローダミングリーン（ＲｈＧ）を有するスペーサー（ｐ（ｄＣｐ）_２Ｔ（Ｃｙ５又はＲｈＧ）ｐＰＥＧ（２０００）ｐ（ｄＣｐ）_２Ｐｕｒｏ）は以下のように合成した。
スペーサーの合成
ＰＥＧスペーサーは、図１５、１６及び３に示す方法で合成した。図１５中、化合物１はＩｋｅｄａらが報告した方法（Ｉｋｅｄａ，Ｓ．ｅｔａｌ．（１９９８）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．３９：５９７５−５９７８）を応用し合成した。ビオチンを含むホスホアミダイト試薬４およびその他のホスホアミダイト試薬（２、３、５）はグレンリサーチ社（アメリカ合衆国、バージニア州）より購入した。平均分子量２０００のＰＥＧは日本油脂（東京都渋谷区）より購入し、それを原料にしてホスホアミダイト試薬（６）を、Ｊａｓｃｈｋｅらが報告した方法（Ｊａｓｃｈｋｅ，Ａ．ｅｔａｌ．（１９９３）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．３４：３０１−３０４）を用い合成した。図１６のＣｙ５活性エステル（７）はアマシャムファルマシアバイオテク社（イギリス、バッキンガムシャー）より、ＲｈｏｄａｍｉｎｅＧｒｅｅｎ（ＲｈＧ）活性エステル（８）はモレキュラプローブ社（アメリカ合衆国、オレゴン州）より購入した。なお、図１５、１６及び３中ＤＭＴｒは４，４’−ジメトキシトリチル基を、Ｂｏｃはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を示す。
化合物１（４００ｍｇ，ピューロマイシン１０ｍｍｏｌ含有）に対し、以下のＡ〜Ｄの処理を所定の配列に従い、所定数のヌクレオチドおよびＰＥＧが導入されるまで繰り返し行なった。
Ａ．３％トリクロロ酢酸−塩化メチレン溶液を１ｍＬ加え室温で３分間放置後、塩化メチレン５ｍＬで３回洗浄する。再度同じ操作を繰り返した後、無水アセトニトリル５ｍＬで５回洗浄する。
Ｂ．ホスホアミダイト試薬（２〜６）３０ｍｍｏｌ、０．４５７Ｍテトラゾール−無水アセトニトリル溶液１００ｍＬ、および無水アセトニトリル１ｍＬを加え、室温で１５〜６０分間震盪する。その後、アセトニトリル５ｍＬで５回洗浄する。
Ｃ．５０ｍＭヨウ素溶液（テトラヒドロフラン−ピリジン−水＝７５：２０：５）を１ｍＬ加え室温で３分間放置後、ピリジン５ｍＬで３回洗浄する。再度同じ操作を繰り返した後、無水ピリジン５ｍＬで５回洗浄する。
Ｄ．１０％無水酢酸−ピリジン溶液１ｍＬおよび触媒量の４，４−ジメチルアミノピリジンを加え室温で２０分間放置後、ピリジン５ｍＬで５回、塩化メチレン５ｍＬで５回洗浄する。
上記の処理を行ない、所定の配列および所定数のヌクレオチドが導入された化合物１に濃アンモニア水１．５ｍＬおよびエタノール０．５ｍＬを加え、室温で１４時間震盪した。ろ過により固相担体（ＣＰＧ）を取り除き、ろ液を凍結乾燥した。残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＹＭＣ社（京都府）製ＹＭＣｐａｃｋＯＤＳ−ＡＳＨ−３４３−５，溶離液１０−６０％アセトニトリル−０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ７．０）３０分間の直線濃度勾配、流速１０ｍＬ／分］で精製後、化合物９を得た。化合物９を３０％アセトニトリル−水０．１ｍＬに溶かし、化合物７あるいは８を１０ｍｍｏｌ、および１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ８．３）を１０ｍＬ加え室温で２時間放置した。反応液を同上の条件のＨＰＬＣで精製後、産物を含む画分を濃縮した。残渣を６０％トリフルオロ酢酸−水１ｍＬにより室温で３０分処理後、濃縮乾固し、残渣を濃アンモニア水１ｍＬにより室温で１５分処理後、濃縮乾固した。残渣を同上の条件のＨＰＬＣで精製後、産物を含む画分を濃縮し、ＰＥＧスペーサー（１０）を得た。蛍光性色素のみ又は固定化物質のビオチンのみの場合、あるいは何も導入されていない場合のＰＥＧスペーサーの合成は、ホスホアミダイト試薬（２〜６）の組合せ及び反応の順序を変えて、また、蛍光性色素がフルオレセインである場合は下記のホスホアミダイト試薬を用いて、上記と同様に行った。

以上の手順により以下のＰＥＧスペーサーを得た。

ＦｏｓのｍＲＮＡテンプレートとスペーサー（ｐ（ｄＣｐ）_２Ｔ（Ｃｙ５又はＲｈＧ）ｐＰＥＧ（２０００）ｐ（ｄＣｐ）_２Ｐｕｒｏ）を以下の組成の反応液でライゲーション（１５℃，２０ｈ）し、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製し、Ｆｏｓ−Ｃｙ５−スペーサーとＦｏｓ−ＲｈＧ−スペーサーを作成した。同様に、ＪｕｎのｍＲＮＡテンプレートとＲｈＧを有するスペーサー（ｐ（ｄＣｐ）_２Ｔ（ＲｈＧ）ｐＰＥＧ（２０００）ｐ（ｄＣｐ）_２Ｐｕｒｏ）をライゲーションし、Ｊｕｎ−ＲｈＧ−スペーサーを作成した。

用意したＦｏｓ−Ｃｙ５−スペーサーとＦｏｓ−ＲｈＧ−スペーサーあるいはＦｏｓ−Ｃｙ５−スペーサーとＪｕｎ−ＲｈＧ−スペーサーの組み合わせについて、以下の組成の小麦胚芽の無細胞翻訳系（ＷｈｅａｔＧｅｒｍＥｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ））あるいはウサギ網状赤血球の無細胞翻訳系（ＲａｂｂｉｔＲｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅＬｙｓａｔｅＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて共翻訳（それぞれ２６℃，６０ｍｉｎあるいは３０℃，３０ｍｉｎ）を行った。各コントロールとして翻訳系にヘパリン（翻訳を阻害する薬品）を加えたサンプルも作成した。

共翻訳後、バッファー１（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＣｌｐＨ８．０，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．１％ＮＰ４０，０．５ｍＭＥＤＴＡ，１ｍＭＤＴＴ）を用いて１５倍に希釈した。相互作用が期待されないＦｏｓ−Ｃｙ５−ＩＶＶとＦｏｓ−ＲｈＧ−ＩＶＶの組み合わせと、相互作用が期待されるＦｏｓ−Ｃｙ５−ＩＶＶとＪｕｎ−ＲｈＧ−ＩＶＶの組み合わせについて、ヘパリン入りとヘパリンなしで、ＦＣＣＳ測定（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｚｅｉｓｓ））を行った。測定条件は、３ｎＭのサンプルをチェンバーに１０μｌのせ、Ｃｙ５；６３３ｎｍとＲｈＧ；４８８ｎｍの吸収で相関（ＣｒｏｓｓＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）を測定した。なお、共翻訳後に最終的なヘパリン濃度は揃えて測定した。
結果：
Ｆｏｓ−Ｃｙ５−ＩＶＶとＪｕｎ−ＲｈＧ−ＩＶＶの組み合わせでは、ヘパリンなし（図１７のＡ；黒丸）とヘパリン入り（図１７のＡ；黒四角）で、相関（ＣｒｏｓｓＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）が異なり、ｉｎｖｉｔｒｏウイルスを形成しているヘパリンなしのものでは、自己相関関数（Ｇ（τ））が高かった。Ｆｏｓ−Ｃｙ５−ＩＶＶとＦｏｓ−ＲｈＧ−ＩＶＶの組み合わせでは、ヘパリンなし（図１７のＢ；黒丸）とヘパリン入り（図１７のＢ；黒四角）とで自己相関関数（Ｇ（τ））に差はなかった。よって、無細胞共翻訳において異なる二つのＩＶＶを、異なる所望の色素で修飾し、かつ相互作用による複合体を形成させるこの方法で、それら蛋白質を何ら分離精製することなくＦＣＣＳで相互作用を検出できることが示された。
実施例４Ｉｎｖｉｔｒｏセレクションへの応用
相互作用が既知の蛋白質としてＦｏｓ／Ｊｕｎの組合せを用いて、Ｆｏｓ−ＩＶＶをベイトとし、Ｊｕｎ−ＩＶＶをプレイとし、無細胞翻訳系での共翻訳によってＦｏｓ／ＪｕｎのＩＶＶ複合体を形成させ、相互作用をＲＴ−ＰＣＲで検出した。Ｆｏｓ−ＩＶＶおよびＪｕｎ−ＩＶＶのＤＮＡテンプレートをＰＣＲによって作成し、転写してｍＲＮＡテンプレートとした。Ｆｏｓ−ＩＶＶのｍＲＮＡテンプレートと、実施例１に従って合成した修飾剤としてビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）を有するスペーサーをライゲーションし、Ｆｏｓ（ｍＲＮＡ）−Ｂｉｏ−スペーサーを作成した。同様に、ＪｕｎのｍＲＮＡテンプレートとスペーサーをライゲーションし、Ｊｕｎ（ｍＲＮＡ）−スペーサーを作成した。Ｆｏｓ（ｍＲＮＡ）−Ｂｉｏ−スペーサーとＪｕｎ（ｍＲＮＡ）−スペーサーあるいはＪｕｎ（ｍＲＮＡ）−スペーサーのみ（Ｆｏｓ無し）を、小麦胚芽の無細胞翻訳系で共翻訳あるいは翻訳し、Ｆｏｓ−Ｂｉｏ−ＩＶＶとＪｕｎ−ＩＶＶを合成した。これをＦｏｓテンプレートのスペーサーに付加されているビオチンを用いてアビジンビーズでスクリーニングし、ＲＴ−ＰＣＲによりＪｕｎ−ＩＶＶの遺伝子タグを増幅しＦｏｓ／Ｊｕｎ相互作用を検出した（図１８）。
方法：
Ｆｏｓは、ｐＮｚｚＣＢＰＦｏｓベクター（配列番号４）から、ＴａＫａＲａＥｘＴａｑ（宝酒造）を用いて、ＰＣＲ（プライマー５’ＳＰ６（０２９／Ｆ．Ｈ．）（配列番号５）と３’Ｆｏｓ［Ｘ］ＨｉｓＡ（配列番号１３）、ＰＣＲプログラムＶ−２（表８参照））によってＤＮＡテンプレートを準備した。ＰＮｚｚＣＢＰＦｏｓベクターは、市販のベクターｐＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にマウス精巣ｃＤＮＡライブラリー（Ｔａｋａｒａ）からクローニングしたｃ−Ｆｏｓ（１１８−２１１）を組み込んだものである。Ｊｕｎは、ｐＥＵ−Ｔ７ＪｕｎＦｌａｇベクター（配列番号１）からＰＣＲ（プライマー５’ＳＰ６（０−２９）Ｔ７（配列番号２）と３’ＦｌａｇＡ（配列番号３）、ＰＣＲプログラムＳＴ６０（表８参照））によってＤＮＡテンプレートを準備した。ｐＥＵＴ７ＪｕｎＦｌａｇベクターは、市販のベクターｐＵＣ（Ｔａｋａｒａ）にマウス精巣ｃＤＮＡライブラリー（Ｔａｋａｒａ）からクローニングしたｃ−Ｊｕｎ（１７９−３３５）を組み込んだものである。ベイトＤＮＡは、Ｆｏｓ／Ｊｕｎの結合配列を含むＤＮＡ−Ｆｏｓ／Ｊｕｎ（配列番号１４）をテンプレートとし、ＰＣＲ（プライマー５’ＤＮＡ（配列番号１１）と３’ＤＮＡ（配列番号１２）、ＰＣＲプログラムＶ−２（表８参照））によって準備した。ＦｏｓとＪｕｎのＤＮＡテンプレートをＲｉｂｏＭＡＸ^ＴＭＬａｒｇｅＳｃａｌｅＲＮＡＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて転写（３７℃，２ｈ）し、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製し、各ｍＲＮＡテンプレートを準備した。修飾剤としてビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）を導入する以外は実施例１と同様に合成したスペーサー（ｐ（ｄＣｐ）_２Ｔ（Ｂｉｏ）ｐＰＥＧ（２０００）ｐ（ｄＣｐ）_２Ｐｕｒｏ）と、ＦｏｓのｍＲＮＡテンプレートとを、実施例３と同様にライゲーションし、Ｆｏｓ−Ｂｉｏ−スペーサーを作成した。また、スペーサー（ｐ（ｄＣｐ）_２ｐＰＥＧ（２０００）ｐ（ｄＣｐ）_２Ｐｕｒｏ）とＪｕｎのｍＲＮＡテンプレートとを実施例３と同様にライゲーションし、Ｊｕｎ−スペーサーを作成した。用意したＦｏｓ−Ｂｉｏ−スペーサーとＪｕｎ−スペーサーの組み合わせ、あるいはベイト無しのＪｕｎ−スペーサーのみについて、実施例３と同様にして、５０μｌスケールの小麦胚芽の無細胞翻訳系（ＷｈｅａｔＧｅｒｍＥｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ））あるいはウサギ網状赤血球の無細胞翻訳系（ＲａｂｂｉｔＲｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅＬｙｓａｔｅＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて共翻訳（それぞれ２６℃，６０ｍｉｎあるいは３０℃，３０ｍｉｎ）を行った。共翻訳後、５０μｌの無細胞翻訳系に５０μｌのバッファー１と５０μｌの磁性アビジン・ビーズを加え、３０分室温でインキュベートし、磁性スタンドで分離し上清を捨て、３〜５回バッファー１で洗浄し、最終的に、５０μｌの磁性アビジン・ビーズを得た。うちビーズ２μｌをテンプレートとしてＲＴ−ＰＣＲ（プライマー５’０２９−Ｆ３（配列番号１５）と３’Ｆｌａｇ−Ｒ３（配列番号１６）、プログラムＲＴ−３０（表８参照））を行った。ここで、ＲＴ−ＰＣＲでは、Ｊｕｎのテンプレートのみが増幅されるようにプライマーは設計されている。ＲＴ−ＰＣＲの結果は、アガロースゲル電気泳動によって確認した。
結果：
図１８に示したように、ベイトＦｏｓ−Ｂｉｏ−ＩＶＶとプレイＪｕｎ−ＩＶＶ（ベイト＋）、あるいはベイトは無しでプレイＪｕｎ−ＩＶＶのみ（Ｆｏｓ−）の無細胞翻訳およびスクリーニング後のＲＴ−ＰＣＲにより、Ｆｏｓ−Ｂｉｏ−ＩＶＶ（ベイト）あるなしで有意な差（１００−１０００倍）が観察され、Ｆｏｓ−Ｂｉｏ−ＩＶＶとＪｕｎ−ＩＶＶの相互作用、すなわち、Ｆｏｓ／Ｊｕｎ相互作用が検出された。よって、この方法で、無細胞共翻訳において異なる二つのＩＶＶの一方（ベイト）に固定化剤（ここではビオチン）を修飾することが可能であり、ビオチンを用いてベイトＩＶＶと相互作用しているプレイＩＶＶを分離し、その遺伝子タグの増幅により相互作用のある蛋白質を検出できることが示された。

実施例５Ｃ末端ラベル化蛋白質の作成
コード分子は、マウス由来のｃ−ｊｕｎまたはｃ−ｆｏｓ（ＧｅｎｔｚＲ，ＲａｕｓｃｈｅｒＦＪ３ｄ，ＡｂａｔｅＣ，ＣｕｒｒａｎＴ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３：１６９５−９；ＮｅｕｂｅｒｇＭ，ＳｃｈｕｅｒｍａｎｎＭ，ＨｕｎｔｅｒＪＢ，ＭｕｌｌｅｒＲ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３３８：５８９−９０）の組み込まれているプラスミド（ｃ−ｊｕｎは、ｐＥＵ−Ｔ７ＪｕｎＦｌａｇ（配列番号１７）；ｃ−ｆｏｓは、ｐＣＭＶＦｏｓＣＢＰｚｚ（配列番号１８））からＰＣＲで作成した。ＰＣＲのプライマーとしては、ｃ−ｊｕｎでは５’ＵＴＲ領域について１種類（プライマー；５’ＳＰ６−０２９（配列番号１９））と３’末端領域については１３種類（プライマー；３’Ａ８＝Ａ（配列番号２２）、３’Ｘ（ＣＴＣＧＡＧ）（配列番号２３）、３’Ｘ（ＣＴＣＧＡＧ）Ａ８＝ＸＡ（配列番号２４）、３’Ｘ（ＣＴＣＧＣＣ）Ａ８（配列番号２５）、３’Ｘ（ＣＴＣＧ）Ａ８（配列番号２６）、３’Ｘ（ＣＴＣ）Ａ８（配列番号２７）、３’Ｘ（ＣＴＣＴ）Ａ８（配列番号２８）、３’Ｘ（ＴＴＣＧ）Ａ８（配列番号２９）、３’Ｘ（ＧＴＣＣ）Ａ８（配列番号３０）、３’Ｘ（ＣＡＴＧ）Ａ８（配列番号３１）、３’Ｘ（ＣＴＣＣ）Ａ８（配列番号３２）、３’Ｘ（ＧＴＣＧ）Ａ８（配列番号３３）、３’ｎｏｎｅ（配列番号２１））、ｃ−ｆｏｓでは５’ＵＴＲ領域について１種類（プライマー；５’Ｔ７（０’）−ｂａｉｔ（配列番号２０））と３’末端領域については２種類（プライマー；３’ｂａｉｔＦｏｓＤ（配列番号３４），３’ｂａｉｔＦｏｓＤＡ（配列番号３５））を用い、計１５種類のＤＮＡテンプレートを調製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。これらのＤＮＡテンプレートを、ＲｉｂｏＭＡＸ^ＴＭＬａｒｇｅＳｃａｌｅＲＮＡＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をもちいて転写（３７℃，２ｈ）し、合成したｍＲＮＡをＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製し、ｍＲＮＡテンプレート（コード分子）を得た。
まず、得られたｍＲＮＡテンプレートを翻訳テンプレートとして用いて、翻訳を行った。翻訳テンプレート２ｐｍｏｌを用いて、ＷｈｅａｔＧｅｒｍＥｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の１０μｌの系で翻訳（２６℃，６０ｍｉｎ）を行い、翻訳と同時に、修飾剤として２４０ｐｍｏｌのＦｌｕｏｒ−ｄＣｐＰｕｒｏを用いて、蛋白質のラベル化（Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．，Ｎｅｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．，ａｎｄＹａｎａｇａｗａ，Ｈ．（２０００）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２８：１１７６−１１８２；Ｎｅｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．ａｎｄＹａｎａｇａｗａ，Ｈ．（１９９９）ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，４６２：４３−４６）を行い、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、バンドの蛍光（フルオレセイン）をマルチ画像解析装置、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａｇｅｒＦＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。その結果をまとめたグラフを図２２に示す。
図２２から、ポリＡ配列（Ａ配列）よりＳＮＮＳ配列（Ｘ配列）を有する場合に、さらにＳＮＮＳ−ポリＡ配列（ＸＡ配列）を有する場合に、翻訳量が増加することが示された。このことから、ＸＡ配列を持つ翻訳テンプレートは、一般的な翻訳やＣ末端ラベル化により好ましいといえる。また、Ｘ配列を変えたときの翻訳結果から、Ｘ配列がＡ配列と組み合わさって効果を現すには、最低４塩基からなることが必要であり、第一番目と第四番目の塩基はＣかＧであることが要求され、ＳＮＮＳ（ＳはＣまたはＧ）の構成が必要であることが示された。
さらに、ｍＲＮＡテンプレートの３’側にＰＥＧスペーサー分子（下記製造例１〜４参照）をライゲーションした翻訳テンプレートを作成した。ここでは、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（宝酒造）をもちいて、ＰＥＧスペーサー部（（ｄＣ）_２（Ｔ）_２，ＰＥＧ４０００，ＰＥＧ４０００Ｐｕｒｏ−Ｂｏｃ）と、コード分子（Ｊｕｎ−Ｘ（ＣＴＣＧＡＧ）Ａ８＝Ｊｕｎ−ＸＡ（プライマー３’Ｘ（ＣＴＣＧＡＧ）Ａ８＝ＸＡを用いて得られたもの））またはコード分子（Ｆｏｓ−Ｄ（−Ａ）または３’ｂａｉｔＦｏｓ−ＤＡ（＋Ａ）（プライマー３’ｂａｉｔＦｏｓＤまたは３’ｂａｉｔＦｏｓＤＡを用いて得られたもの））とのライゲーション（１５℃，２０ｈ）を行い、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製し、８Ｍ尿素４％ＰＡＧＥで電気泳動し、エチレンブロマイド（ＥｔＢｒ）で染色し、バンドの蛍光（ＥｔＢｒとフルオレセイン）をマルチ画像解析装置、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａｇｅｒＦＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で検出した。ライゲーションした２ｐｍｏｌの翻訳テンプレートを用いて、ＷｈｅａｔＧｅｒｍＥｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）あるいは、ＰＲＯＴＥＩＯＳ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いて、１０μｌの系で翻訳（２６℃；１，３，６，２０ｈｒ）を行い、翻訳と同時に、修飾剤として２４０ｐｍｏｌのＦｌｕｏｒ−ｄＣｐＰｕｒｏを用いて、蛋白質のラベル化（Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．，Ｎｅｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．，ａｎｄＹａｎａｇａｗａ，Ｈ．（２０００）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２８：１１７６−１１８２；Ｎｅｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．ａｎｄＹａｎａｇａｗａ，Ｈ．（１９９９）ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，４６２：４３−４６）を行い、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、バンドの蛍光（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）をマルチ画像解析装置、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａｇｅｒＦＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。ＲＮＡの安定性実験は、ＰＥＧスペーサー部の蛍光を用いて、ＲＮＡの残量をマルチ画像解析装置、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａｇｅｒＦＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。対照としてライゲーションしていない翻訳テンプレートを用いて同様の手順を行った。それらの結果をまとめたグラフを図２３および図２４に示す。
図２３から、コード部の配列は基本的にはどのような配列でもＰＥＧスペーサー部をライゲーションすることで翻訳量が増加することが示された（図２３のＡ）。また、ＸＡ配列を持つコード部をもつ翻訳テンプレート（ＸＡ）では、ＸＡ配列もＰＥＧスペーサー部も持たないコード分子（Ｎｏｎｅ）に比べて、翻訳量が約３〜４倍増加していることが示された。また、ＸＡ配列を持つコード部では、ＰＥＧ４０００Ｐｕｒｏ−Ｂｏｃの構成が最も翻訳量が増加することが示された（図２３のＢ）。よって、一般的な翻訳やＣ末端ラベル化を行う場合にはＰＥＧスペーサー部がライゲーションされたＸＡ配列を持つ翻訳テンプレートを用いることが適しているといえる。図２４から、ＸＡ配列を持つコード分子（●；ＸＡ）、ＸＡ配列を持たないコード分子（□；Ｎｏｎｅ）は３時間で翻訳量は飽和に達したが、ＰＥＧ４０００Ｐｕｒｏ−Ｂｏｃをもつ翻訳テンプレート（○；ＸＡ＋ＰＥＧ４００Ｐｕｒｏ−Ｂｏｃ）は、６時間でも翻訳の増加が見られた（図２４のＡ）。また、その翻訳量は、６時間で比較すると、ＰＥＧ４０００Ｐｕｒｏ−Ｂｏｃをもつ翻訳テンプレート（○）は、ＸＡ配列を持つコード分子（●；ＸＡ）の約２倍、ＸＡ配列を持たないコード分子（□；Ｎｏｎｅ）の約４倍であった（図２４のＡ）。コード分子と、ＰＥＧスペーサー部をもつ翻訳テンプレートとの安定性を比較すると、コード分子（●；ＸＡ）は、そのｍＲＮＡが１時間で５０％減るのに対して、ＰＥＧスペーサー部をもつ翻訳テンプレート（○）は、１３時間でようやく５０％減ることから、ＰＥＧスペーサー部をもつコード分子（○）の安定性が非常によいことがわかる（図２４のＢ）。以上から、翻訳テンプレート（○）の翻訳量が増加したのは、ライゲーションされたＰＥＧ４０００Ｐｕｒｏ−Ｂｏｃによる安定性向上が原因と考えられる。
実施例６ＩＶＶの作成
コード分子（ｍＲＮＡテンプレート）にＰＥＧスペーサー分子（下記製造例１〜４参照）をライゲーションしたものを翻訳テンプレートとして用いた。ここでは、実施例５で得たコード分子のｍＲＮＡテンプレート（Ｊｕｎ−ＸＡ，Ｊｕｎ−Ａ８＝Ｊｕｎ−Ａ）とＰＥＧスペーサー部（ＰＥＧ２０００Ｐｕｒｏ）を実施例５と同様の方法でライゲーションした。ライゲーションしたｍＲＮＡテンプレートを小麦胚芽の無細胞翻訳系としてＷｈｅａｔＧｅｒｍＥｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をもちいて、実施例５と同様の方法で翻訳し、対応付け分子を８Ｍ尿素１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、蛍光（フルオレセイン）によってマルチ画像解析装置、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａｇｅｒＦＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で検出した。また、フリー蛋白質の量は、翻訳と同時に、修飾剤としてＦｌｕｏｒ−ｄＣｐＰｕｒｏを用いて、蛋白質のラベル化（Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．，Ｎｅｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．，ａｎｄＹａｎａｇａｗａ，Ｈ．（２０００）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２８：１１７６−１１８２；Ｎｅｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ，Ｅ．ａｎｄＹａｎａｇａｗａ，Ｈ．（１９９９）ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，４６２：４３−４６）を行い、８ＭＵｒｅａ１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、バンドの蛍光（フルオレセイン）をマルチ画像解析装置、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａｇｅｒＦＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定し、あわせて、Ｔ７−ｔａｇによる抗体を用いたウエスタンブロットで総蛋白量を決定した。それらの結果をまとめたグラフを図２５に示す。
図２５から、対応付け分子は、ＸＡ配列を持つコード部とＡ配列を持つコード部について比較すると、添加するＲＮＡ量を変化させたときの対応付け効率は両方とも７０％でほとんど変わらないことが示された（図２５のＡ）。しかしながら、添加したＲＮＡテンプレートから合成された蛋白質総量（フリー蛋白質＋対応付け分子＝１００％）に対する対応付け効率については、添加するＲＮＡ量を変化させたとき、Ａ配列を持つコード部の場合は９０％（フリー蛋白質１０％）を超える高い効率を示すことが示された（図２５のＢ）。一方、ＸＡ配列を持つコード部の場合は、フリー蛋白質の生成割合が高い（図２５のＢ）。よって、対応付け分子にはＸＡ配列よりもＡ配列を持つコード部が適しているといえる。
製造例１ＰＥＧスペーサー分子（１１）の合成
ＰＥＧスペーサー分子（１１）は、図２６に示す試薬を用い、図２７に示す方法で合成した。図２６中アミダイト試薬（１〜５）はグレンリサーチ社（アメリカ合衆国、バージニア州）より購入した。平均分子量１０００、２０００、３０００のＰＥＧは日本油脂（東京都渋谷区）より購入した。平均分子量４０００のＰＥＧはフルカ社（スイス）より購入した。それらを原料にしてアミダイト試薬（６）を、Ｊａｓｃｈｋｅらが報告した方法（Ｊａｓｃｈｋｅ，Ａ．ｅｔａｌ．（１９９３）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．３４：３０１−３０４）を用い合成した。図２６中１０はＩｋｅｄａらが報告した方法（Ｉｋｅｄａ，Ｓ．ｅｔａｌ．（１９９８）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．３９：５９７５−５９７８）で合成した。なお、図２６中ＤＭＴｒは４，４’−ジメトキシトリチル基を、図２７中Ｆｍｏｃは９−フルオレンメトキシカルボニル基を示す。
１０（４００ｍｇ，ピューロマイシン１０μｍｏｌ含有）に対し、以下のＡ〜Ｄの処理を所定の配列に従い、所定数のヌクレオチドおよびＰＥＧが導入されるまで繰り返し行なった。
Ａ．３％トリクロロ酢酸−塩化メチレン溶液を１ｍＬ加え室温で３分間放置後、塩化メチレン５ｍＬで３回洗浄する。再度同じ操作を繰り返した後、無水アセトニトリル５ｍＬで５回洗浄する。
Ｂ．ヌクレオチドアミダイト３０μｍｏｌ、０．４５７Ｍテトラゾール−無水アセトニトリル溶液１００μＬ、および無水アセトニトリル１ｍＬを加え、室温で１５分間振盪する。アセトニトリル５ｍＬで５回洗浄する。
Ｃ．５０ｍＭヨウ素溶液（テトラヒドロフラン−ピリジン−水＝７５：２０：５）１ｍＬを加え室温で３分間放置後、ピリジン５ｍＬで３回洗浄する。再度同じ操作を繰り返した後、無水ピリジン５ｍＬで５回洗浄する。
Ｄ．１０％無水酢酸−ピリジン溶液１ｍＬおよび触媒量の４，４−ジメチルアミノピリジンを加え室温で２０分間放置後、ピリジン５ｍＬで５回、塩化メチレン５ｍＬで５回洗浄する。
上記の処理をし所定の配列および所定数のヌクレオチドが導入された１０に濃アンモニア水１．５ｍＬおよびエタノール０．５ｍＬを加え、室温で１４時間震盪した。ろ過により固相担体（ＣＰＧ）を取り除き、ろ液を凍結乾燥した。残査をＨＰＬＣ［カラム：ＹＭＣ社（京都府）製ＹＭＣｐａｃｋＯＤＳ−ＡＳＨ−３４３−５，溶離液１０−６０％アセトニトリル−０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ７．０）の３０分間の直線濃度勾配、流速：１０ｍＬ／分］で精製後、ＰＥＧスペーサー分子（１１）を得た。得られたＰＥＧスペーサー分子（１１）の構造及び収率を以下に示す。

製造例２ＰＥＧスペーサー分子（１４）の合成
ＰＥＧスペーサー分子（１４）は、図２６に示す試薬を用い、図２７及び２８に示す方法で合成した。図２６中、ローダミングリーン（ＲｈｏｄＧ）活性エステル（７）はモレキュラプローブ社（アメリカ合衆国、オレゴン州）より、Ｃｙ５活性エステル（８）およびＣｙ３活性エステル（９）はアマシャムファルマシアバイオテク社（イギリス、バッキンガムシャー）より、購入した。図２８中、１２はＩｋｅｄａらが報告した方法（Ｉｋｅｄａ，Ｓ．ｅｔａｌ．（１９９８）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．３９：５９７５−５９７８）を応用し合成した。なお、図２６中、Ｂｏｃはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を示す。
１２（４００ｍｇ，ピューロマイシン１０μｍｏｌ含有）に対し、ＰＥＧスペーサー分子（１１）の合成の場合と同様のＡ〜Ｄの処理を所定の配列に従い、所定数のヌクレオチドおよびＰＥＧが導入されるまで繰り返し行なった。
上記の処理を行ない、所定の配列および所定数のヌクレオチドが導入された１２に濃アンモニア水１．５ｍＬおよびエタノール０．５ｍＬを加え、室温で１４時間震盪した。ろ過により固相担体（ＣＰＧ）を取り除き、ろ液を凍結乾燥した。残査をＨＰＬＣ［カラム：ＹＭＣ社（京都府）製ＹＭＣｐａｃｋＯＤＳ−ＡＳＨ−３４３−５，溶離液：１０−６０％アセトニトリル−０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ７．０）の３０分間の直線濃度勾配、流速：１０ｍＬ／分］で精製後、１３を得た。１３を３０％アセトニトリル−水０．１ｍＬに溶かし、７，８または９を１０μｍｏｌ、および１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ８．３）を１０μＬ加え室温で２時間放置した。反応液を同上の条件のＨＰＬＣで精製後、産物を含む画分を濃縮した。残査を６０％トリフルオロ酢酸−水１ｍＬにて室温で３０分処理後、濃縮乾固した。残査を濃アンモニア水１ｍＬにて室温で１５分処理後、濃縮乾固した。残査を同上の条件のＨＰＬＣで精製後、産物を含む画分を濃縮し、ＰＥＧスペーサー分子（１４）を得た。なお、図２９中、ＲｈｏｄＧは図２６中７の、Ｃｙ５は図２６中８の、Ｃｙ３は図２６中９の、蛍光色素残基部をそれぞれ示す。得られたＰＥＧスペーサー分子（１４）の構造及び収率を以下に示す。

製造例３Ｂｏｃ保護ＰＥＧスペーサー分子（１５）の合成
図３０に示したように、１２（４００ｍｇ，ピューロマイシン１０μｍｏｌ含有）より、ＰＥＧスペーサー部（１１）と同じ方法を用いてＢｏｃ保護ＰＥＧスペーサー部（１５）を合成した。得られたＢｏｃ保護ＰＥＧスペーサー分子（１５）の構造と収率を以下に示す。
ｐ（ｄＣｐ）_２Ｔ（Ｆｌ）ｐＰＥＧ（４０００）ｐ（ｄＣｐ）_２Ｐｕｒｏ（Ｂｏｃ）
収率４１％
製造例４ピューロマイシン非含有ＰＥＧスペーサー分子（１６）の合成
Ｊａｓｃｈｋｅらが報告した方法（Ｊａｓｃｈｋｅ，Ａ．ｅｔａｌ．（１９９３）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．３４：３０１−３０４）に従い合成した。得られたピューロマイシン非含有ＰＥＧスペーサー分子（１６）の構造と収率を以下に示す。
ｐ（ｄＣｐ）_２Ｔ（Ｆｌ）ｐＴｐＰＥＧ（４０００）
収率５５％
製造例５修飾剤１〜７の合成
修飾剤１〜７は、図３１および図３２に示した試薬を用い、図３３および３４にその概略を示す方法を用いて合成した。図３１中、アミダイト試薬（１５〜１９）はグレンリサーチ社（アメリカ合衆国、バージニア州）より、スクシンイミド試薬（２０〜２２）はピアス社（アメリカ合衆国、イリノイ州）より購入した。
１０または１２（４００ｍｇ，ピューロマイシン１０μｍｏｌ含有）に対し、ＰＥＧスペーサー分子（１１）の合成に関して示したＡ〜Ｄの処理を所定数のアミダイト試薬が導入されるまで繰り返し行なった。その後、５０ｍＭ炭酸ナトリウム−水を２ｍＬまたは濃アンモニア水１．５ｍＬおよびエタノールを０．５ｍＬ加え、室温で１４時間震盪した。ろ過により固相担体（ＣＰＧ）を取り除き、ろ液を減圧濃縮した。残査をＨＰＬＣ［カラム：ＹＭＣ社（京都府）製ＹＭＣｐａｃｋＯＤＳ−ＡＳＨ−３４３−５，溶離液：１０−６０％アセトニトリル−０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ７．０）の３０分間の直線濃度勾配、流速：１０ｍＬ／分］で精製後、凍結乾燥した。その後、修飾剤によっては、残査を３０％アセトニトリル−水１ｍＬに溶解させ、１Ｍ炭酸水素ナトリウム−水（ｐＨ８．３）を０．１ｍＬ、およびスクシンイミド試薬（７，８または２０）０．１ｍｍｏｌをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド０．５ｍＬに溶解させた液を加え、室温で２時間放置した。その後、減圧濃縮し、残査をＨＰＬＣ［カラム：ＹＭＣ社（京都府）製ＹＭＣｐａｃｋＯＤＳ−ＡＳＨ−３４３−５，溶離液：１０−６０％アセトニトリル−０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ７．０）の３０分間の直線濃度勾配、流速：１０ｍＬ／分］で精製後、凍結乾燥した。その後、修飾剤によっては、残査を８０％酢酸−水２ｍＬに溶解させ、室温で４時間放置後、減圧濃縮した。残査を３０％アセトニトリル−水１ｍＬに溶解させ、１Ｍ炭酸水素ナトリウム−水（ｐＨ８．３）を０．１ｍＬ、およびスクシンイミド試薬（２１または２２）０．１ｍｍｏｌをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド０．５ｍＬに溶解させた液を加え、室温で２時間放置した。その後、Ｐｏｌｙ−ＰａｋＩＩ（グレンリサーチ社）で脱塩し減圧濃縮した。その後、上記の残査に６０％トリフルオロ酢酸−水２ｍＬを加え、室温で３０分間放置後、減圧濃縮した。残査をＨＰＬＣ［カラム：ＹＭＣ社（京都府）製ＹＭＣｐａｃｋＯＤＳ−ＡＳＨ−３４３−５，溶離液：１０−６０％アセトニトリル−０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ７．０）の３０分間の直線濃度勾配、流速：１０ｍＬ／分］で精製後、凍結乾燥した。得られた修飾剤１〜７の物性データを以下に示す。

実施例７ＦＣＣＳ（ＩＶＶ−ＩＶＶ相互作用の検出）
実施例１と同様にして、相互作用が既知の蛋白質としてＦｏｓ／Ｊｕｎを用いて、無細胞翻訳系で共翻訳によってＦｏｓ／Ｊｕｎ複合体を形成させ、ＦＣＣＳで相互作用を測定した。実施例１において、Ｆｏｓのテンプレートを作る際に用いるＰＣＲの３’プライマーとして３’ＦｏｓＦｌａｇ１Ａ（配列番号３６）を用い、Ｊｕｎのテンプレートを作る際に用いるＰＣＲの３’プライマーとして３’Ｆｌａｇ１Ａ（配列番号３７）を用い、スペーサーとしては、ＰＥＧ４０００を用いた以外は同様に行い、Ｆｏｓ（ｍＲＮＡ）−Ｃｙ５−ｓｐａｃｅｒ、Ｆｏｓ（ｍＲＮＡ）−ＲｈＧ−ｓｐａｃｅｒ、そしてＪｕｎ（ｍＲＮＡ）−ＲｈＧ−ｓｐａｃｅｒを作成した。すなわち、実施例１では、ｍＲＮＡはＸＡ配列を持つが、本実施例では、ｍＲＮＡはＡ配列を持ち、かつ分子量の高いＰＥＧ４０００を用いることで、より翻訳時に遊離の蛋白が少なくなりＩＶＶ効率が向上する条件で測定した。Ｆｏｓ（ｍＲＮＡ）−Ｃｙ５−ｓｐａｃｅｒ、Ｆｏｓ（ｍＲＮＡ）−ＲｈＧ−ｓｐａｃｅｒとＦｏｓ−Ｃｙ５−ｓｐａｃｅｒ、Ｊｕｎ−ＲｈＧ−ｓｐａｃｅｒの組み合わせについて、小麦胚芽の無細胞翻訳系で共翻訳し、Ｆｏｓ−Ｃｙ５とＦｏｓ−ＲｈＧ、およびＦｏｓ−Ｃｙ５とＪｕｎ−ＲｈＧの相互作用についてＦＣＣＳで測定した（図１）。ここで、無細胞翻訳系で共翻訳の条件は、各テンプレート１ｐｍｏｌを無細胞翻訳系１０ｕｌに添加し、共翻訳後の希釈は、バッファー１で１０倍に希釈し、最終的測定濃度は１０ｎＭとした以外は、全て実施例１に従った。Ｆｏｓ−Ｃｙ５とＦｏｓ−ＲｈＧの自己相関関数（Ｇ（τ）；図３５，−○−）とＦｏｓ−Ｃｙ５とＪｕｎ−ＲｈＧの自己相関関数（Ｇ（τ）；図３５，−□−）を比較すると、相互作用の期待されないＦｏｓ−Ｃｙ５とＦｏｓ−ＲｈＧの自己相関関数（Ｇ（τ））は１に近いものであり、相互作用が期待されるＦｏｓ−Ｃｙ５とＪｕｎ−ＲｈＧの自己相関関数（Ｇ（τ））は１からより離れており大きな値を示すことが確認された。ここで、Ｆｏｓ−Ｃｙ５とＪｕｎ−ＲｈＧのＫｄを算出してみると約１４０ｎＭとなり、文献値の１００ｎＭにほぼ等しかった。ここで、Ｋｄ＝（ＣＲｈＧ−Ｃｃｒｏｓｓ）（Ｃｃｙ５−Ｃｃｒｏｓｓ）／Ｃｃｒｏｓｓである（ＣＲｈＧ：Ｊｕｎ−ＲｈＧの濃度、Ｃｃｙ５：Ｆｏｓ−Ｃｙ５の濃度、Ｃｃｒｏｓｓ：Ｆｏｓ／Ｊｕｎ相互作用しているものの濃度）。
実施例８ＦＣＣＳ（ＩＶＶ−ＩＶＶ（ＲＮａｓｅ処理）相互作用の検出）
実施例７と同様にして、小麦胚芽の無細胞翻訳系で共翻訳後にＲＮａｓｅ処理をしたものとしていないものでＦｏｓ−Ｃｙ５とＦｏｓ−ＲｈＧ、およびＦｏｓ−Ｃｙ５とＪｕｎ−ＲｈＧの相互作用についてＦＣＣＳで測定した（図３６）。ここで、無細胞翻訳系で共翻訳後の希釈は、バッファー１で６倍に希釈し、次にＲＮａｓｅＡを５ｎＭになるように添加し、室温で１０ｍｉｎ放置した。最終的測定濃度は約２０ｎＭとした以外は、全て実施例７に従った。Ｆｏｓ−Ｃｙ５とＦｏｓ−ＲｈＧの自己相関関数（Ｇ（τ）；図３６，灰色）とＦｏｓ−Ｃｙ５とＪｕｎ−ＲｈＧの自己相関関数（Ｇ（τ）；図３６，黒）を比較すると、共翻訳後にＲＮａｓｅ処理をしないもの（図３６のＡ）でもしたもの（図３６のＢ）でも、相互作用の期待されないＦｏｓ−Ｃｙ５とＦｏｓ−ＲｈＧの自己相関関数（Ｇ（τ））はより１に近いものであり、相互作用が期待されるＦｏｓ−Ｃｙ５とＪｕｎ−ＲｈＧの自己相関関数（Ｇ（τ））は１からより離れており大きな値を示すことが確認された。ここで、ＲＮａｓｅ処理をしてＦＣＣＳ測定する方法は、測定条件がｍＲＮＡの違いに左右されることなくより普遍的な測定方法と考えられる。
実施例９プロテインチップ（ＩＶＶ−ＩＶＶおよびＩＶＶ−Ｃ末端ラベル化蛋白質相互作用の検出）
実施例７と同様にして、相互作用が既知の蛋白質としてＦｏｓ／Ｊｕｎを用いて、無細胞翻訳系で２００ｎＭのＦｏｓ（ｍＲＮＡ）−Ｃｙ５−ｓｐａｃｅｒ（ｂｉｏｔｉｎ）あるいは、Ｊｕｎ（ｍＲＮＡ）−Ｃｙ５−ｓｐａｃｅｒ（ｂｉｏｔｉｎ）を単独で翻訳し、ＭｉｃｒｏｇｒｉｄＩＩ（Ｂｉｏｒｏｂｏｔｉｃｓ）を用いて、スライドグラス（ＸＥＮＯＳＬＩＤＥＳ，ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｅｓｌｉｄｅｓ（ＸＥＮＯＰＯＲＥ））あるいは、スライドグラス（ＳＴＲＥＲＴＡＶＩＤＩＮｓｌｉｄｅｓ（ｇｌａｓｓｓｌｉｄｅｓｗｉｔｈａＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｃｏａｔｅｄｓｕｔｆａｃｅ），ｇｒｅｉｎｅｒｂｉｏ−ｏｎｅ）に４０ｎＭでプロットした。次に、プロットしたＦｏｓ−Ｃｙ５−ＩＶＶ、Ｊｕｎ−Ｃｙ５−ＩＶＶをスライドグラスに固定化するために、湿度を５５％に保ったアレイヤー中に１時間放置した。固定化するＩＶＶに使用するスペーサーは、Ｃｙ５のみならずビオチンが導入されたものを用いた。１％ＢＳＡでブロッキングした後、スポットエリアにハイベイドシール（ＴｈｅｒｍｏＨｙｂａｉｄ（ＴｈｅｒｍｏｂｉｏＡｎａｌｙｓｉｓＪａｐａｎ））を貼った。固定化した蛋白質については、Ｔ７およびＪｕｎ抗体（図３７のＡ）とスペーサーのＣｙ５の波長による検出（図３７のＢ，Ｃ）で確認した。
４００ｎＭのＦｏｓ（ｍＲＮＡ）−Ｃｙ３−ｓｐａｃｅｒ、Ｊｕｎ−Ｃｙ３−ｓｐａｃｅｒあるいは、ｃＢ１（ｍＲＮＡ）−Ｃｙ３−ｓｐａｃｅｒ（ｃＢ１のＤＮＡテンプレートの作成方法は、プライマー３’（６４６）ＦｌａｇＡの代わりに、３’（６４６）Ｆｌａｇ１Ａ（配列番号３８）を使用した他は実施例２に従った。）を無細胞翻訳系で上からかける側のＩＶＶを合成し、５ｍＭのＲＮａｓｅＡで３７℃で１時間処理したものをハイベイドシールを貼ったスポットエリアに添加した（図３７のＢ）。あるいは無細胞翻訳系で上からかける側のＣ末端ラベル化蛋白質（Ｆｏｓ）を合成したものをハイベイドシールを貼ったスポットエリアに添加した（図３７のＣ）。上からカバーシールをして密閉し、アルミホイルで遮光して室温で１時間で反応させた後、スライドグラスをＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ（ＩｎｔｅｒＭｅｆｉｃａｌｃｏ．，Ｉｔｄ．）でＣｙ５とＣｙ３の波長で解析した。
図３７より、固定化したＩＶＶがｍＲＮＡが付いていても（図３７のＡ）いなくても（図３７のＢ，Ｃ）検出出来ることがわかった。また、スペーサーのＣｙ５による検出（図３７のＢ，Ｃ）は抗体（図３７のＡ）同様に非常に鮮明であることがわかった。また、上からかける蛋白質は、ＩＶＶ（図３７のＢ，Ｃｙ３）でもＣ末端ラベル化蛋白質（図３７のＣ，Ｃｙ３）でもシグナルが検出された。また、図３７のＢに示すように、Ｆｏｓ−Ｃｙ３−ＩＶＶ（＋Ｆｏｓ）を上からかけた場合は、Ｊｕｎ−Ｃｙ５−ＩＶＶを固定化したスポットに強いシグナルが得られ、Ｊｕｎ−Ｃｙ３−ＩＶＶ（＋Ｊｕｎ）を上からかけた場合は、Ｆｏｓ−Ｃｙ５−ＩＶＶとＪｕｎ−Ｃｙ５−ＩＶＶを固定化したスポットに強いシグナルが得られ、ＦｏｓともＪｕｎとも相互作用のないｃＢ１−Ｃｙ３−ＩＶＶ（＋Ｊｕｎ）を上からかけた場合は、強いシグナルが得られるスポットは特にはなかった。図３７のＡの抗体（Ｃｙ３付き）や図３７のＢ，ＣのＩＶＶのＣｙ５付きのスペーサーによる検出から、ＩＶＶが効率的にビオチン−アビジン親和性によってスライドに固定化されていることが示された。抗体で検出できただけでなく、固定化ＩＶＶのスペーサーのＣｙ５による検出も明瞭であり、ＩＶＶの場合はスライドへの非特異的結合などによるバックが低いことが伺えた。このことは、単に相互作用のあるなしの判定のみならず、ＤＮＡチップと同様に、プロテインチップとして、固定化したＩＶＶや上からかけたＩＶＶの定量化が可能であることを示している。
実施例１０プロテインチップ
図３８に示すように、プロテインチップを用いる共翻訳によるＩＶＶ−ＩＶＶ複合体の相互作用検出が実施可能である。ここでは、実施例７と同様にして、たとえば、相互作用が既知の蛋白質としてＦｏｓ／Ｊｕｎを用いて、無細胞翻訳系でＦｏｓ（ｍＲＮＡ）−ｓｐａｃｅｒ（ｂｉｏｔｉｎ）とＪｕｎ（ｍＲＮＡ）−Ｃｙ５−ｓｐａｃｅｒを共翻訳し、スライドグラスにプロットして固定化した後、Ｃｙ３を持つ第三のＩＶＶを上からかけることによりＦｏｓ／Ｊｕｎと複合体を形成する蛋白質を探索することが可能となる。Ｃｙ３を持つ第三のＩＶＶの代わりに、Ｊｕｎ抗体（Ｃｙ３）をふりかけてＦｏｓ／Ｊｕｎの相互作用検出を行うこともできる。プロテインチップを用いる蛋白質相互作用の検出において、ある蛋白質（ここではＦｏｓ）と１：１で直接的に相互作用する蛋白質については、実施例９の方法で検出できるが、１：多分子で間接的に相互作用する第三の蛋白質については、図３８のように共翻訳を利用することで始めて検出可能となる。ＩＶＶにおいては、二つ以上の蛋白質をいくつでも共翻訳することが可能であり、その場合でも、各蛋白質に別々の所望の色素や固定化物質といった修飾剤をスペーサーを介して導入することが可能であり、このことによって、図３８のように、蛋白質複合体をスライドへ固定化し、そこへどの組み合わせの複合体と相互作用しているかを知りたい第三の蛋白質のＩＶＶを上からかけて複合体を形成する相手を見つけることなどが可能となる。また、反対に、単独のＩＶＶを固定化しておいて、第二第三の蛋白質を共翻訳したものを上からかけて複合体を検出することも可能である。
産業上の利用可能性
本発明によれば、ＩＶＶあるいはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）とＣ末端ラベル化蛋白質間の相互作用による複合体を利用して、ＩＶＶのスペーサーに分離用あるいは検出用の修飾剤を施し、かつＣ末端ラベル化蛋白質のＣ末端ラベル化剤に分離用あるいは検出用の修飾剤を施すことにより、通常、翻訳後に行われる各種の蛋白質への修飾反応の工程を一工程で実現することが可能である。本発明は、非固定あるいは固定化による多くの蛋白質間相互作用解析法へ応用可能である。また、ＩＶＶとＣ末端ラベル化蛋白質の性質の違いを利用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルアッセイ（核酸を含むＩＶＶは泳動されないがＣ末端ラベル化蛋白質は泳動されることを利用）などで簡単に複数の蛋白質間相互作用検出が可能となる。
また、本発明によれば、ＩＶＶあるいはＩＶＶ（ｍＲＮＡ−）を翻訳する際に、ＩＶＶのスペーサーを用いて所望の分離用あるいは／および検出用の修飾を施すことが可能であり、通常、翻訳後に行われる各種の蛋白質への修飾反応の工程を一工程で実現し、特に、「無細胞共翻訳」によって、通常、翻訳後に行われる相互作用形成の工程を一工程で実現できる。また、ＩＶＶの形成効率が高く、遊離の蛋白質（対応付け分子と共に生産される遺伝子型を持たないフリーの蛋白質）も少ないために、通常必要な蛋白質へ修飾した蛍光色素や未修飾の蛋白質の分離精製の工程も必要ない。本発明は、非固定あるいは固定化による多くの蛋白質間相互作用解析法へ応用可能である。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の分離用修飾あるいは検出用修飾を施されたＩＶＶとＣ末端ラベル化蛋白質の複合体の構成例を示す。
図２は、本発明の複合体による蛋白質の相互作用の解析の概略を示す。
図３は、ＩＶＶのスペーサーの詳細な構成を示す。スペーサーは、ピューロマイシンを有したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を主成分としたもので、修飾剤（Ｘａ）としてビオチンＴ（Ｂｉｏ）など、修飾剤（Ｘｂ）として蛍光物質Ｔ（Ｆｌ）、Ｔ（Ｃｙ５）、Ｔ（ＲｈＧ）などが例として挙げられる。
図４は、Ｃ末端ラベル化剤の構成を示す。Ａは、Ｆｌｕ−ｄＣ−Ｐｕｒｏの構成を示す。Ｃ末端ラベル化剤に検出用修飾として蛍光性物質（フルオロセイン）が導入されている。Ｂは、Ｂｉｏ−Ｔ（ＴＡＭＲＡ）−ｄＣ−Ｐｕｒｏの構成を示す。Ｃ末端ラベル化剤に検出用修飾として蛍光性物質（ＴＡＭＲＡ）および分離用修飾剤として固定化剤（Ｂｉｏ；ビオチン）が導入されている。
図５は、実施例１で用いたスペーサー分子の合成スキームを示す。Ａは合成に用いる化合物の構造、Ｂは工程を示す。
図６は、小麦胚芽の無細胞翻訳系においてＩＶＶ形成とＣ末端ラベル化蛋白質の翻訳を両立（無細胞共翻訳）できるＣ末端ラベル化剤の添加濃度の検討結果を示す。小麦胚芽の無細胞翻訳系（ＷｈｅａｔＧｅｒｍＥｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ））における、Ｃ末端ラベル化剤としてＦｌｕ−ｄＣｐＰｕｒｏの添加濃度を変化させたときのＪｕｎのＣ末端ラベル化効率（白丸）とＪｕｎ−Ｆｌｕ−ＩＶＶの形成阻害率（黒丸）を示す。
図７は、無細胞共翻訳によるＩＶＶ複合体を用いたｉｎｖｉｔｒｏセレクション解析の概略及び結果（電気泳動写真）を示す。結果における記号の意味は以下の通りである。レーン１；スクリーニング上清、レーン２；スクリーニング溶出液。Ｆｏｓ＋；Ｆｏｓ（ｍＲＮＡ）−Ｆｌｕ−ビオチン−スペーサー添加、Ｆｏｓ−；Ｆｏｓ（ｍＲＮＡ）−Ｆｌｕ−ビオチン−スペーサ−無添加。サイクリンＢ１／Ｊｕｎ（−／＋）；ＪｕｎのｍＲＮＡ添加、サイクリンＢ１／Ｊｕｎ（＋／＋）；サイクリンＢ１およびＪｕｎのｍＲＮＡ添加。
図８は、対応付け分子、スペーサー分子及びコード分子の構造の概略を示す。
図９は、スペーサー分子の一例の詳細な構成を示す。Ｄ：ドナー領域、Ｘ２及びＸ１：機能付与ユニット、ＰＥＧ：ＰＥＧ領域、Ａ：ペプチドアクセプター領域。Ｂｉｏ：ビオチン、Ｆｌ：蛍光色素。
図１０は、コード分子の一例の詳細な構成を示す。
図１１は、Ｃ末端修飾蛋白質（Ａ）、修飾剤（Ｂ）、および、翻訳テンプレート（Ｃ）の構成を示す図である。
図１２は、本発明の分離用修飾あるいは検出用修飾を施されたＩＶＶの複合体の構成を示す。
図１３は、本発明のｍＲＮＡを欠いたＩＶＶ（ＩＶＶ（ｍＲＮＡ−））とその複合体の構成を示す。
図１４は、本発明の複合体による蛋白質の相互作用の解析の概略を示す。
図１５及び図１６は、スペーサーの合成と構成の例を示す。スペーサーは、ピューロマイシンを有したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を主成分としたもので、修飾剤（Ｘａ）としてビオチンＴ（Ｂｉｏ）など、修飾剤（Ｘｂ）として蛍光物質Ｔ（Ｆｌ）、Ｔ（Ｃｙ５）、Ｔ（ＲｈＧ）などが例として挙げられる。
図１７は、無細胞共翻訳によるＩＶＶ複合体を用いたＦＣＣＳ解析の概略及び結果を示す。グラフの横軸は時間マイクロ秒（ｕｓ）、縦軸はＧ（τ）。Ｇ（τ）は平均蛍光強度をＩとすると、時間ｔにおける蛍光強度Ｉ（ｔ）ならびにｔ＋τにおける蛍光強度Ｉ（ｔ＋τ）の積で表される。（Ｇ（τ）＝＜Ｉ（ｔ）Ｉ（ｔ＋τ）＞）
Ａ：Ｆｏｓ−Ｃｙ５−ＩＶＶとＪｕｎ−ＲｈＧ−ＩＶＶ（黒丸）
Ｆｏｓ（ｍＲＮＡ）−Ｃｙ５−スペーサーとＪｕｎ（ｍＲＮＡ）−ＲｈＧ−スペーサー（ヘパリン添加；黒四角）
Ｂ：Ｆｏｓ−Ｃｙ５−ＩＶＶとＦｏｓ−ＲｈＧ−ＩＶＶ（黒丸）
Ｆｏｓ（ｍＲＮＡ）−Ｃｙ５−スペーサーとＦｏｓ（ｍＲＮＡ）−ＲｈＧ−スペーサー（ヘパリン添加；黒四角）
図１８は、無細胞共翻訳によるＩＶＶ複合体を用いたｉｎｖｉｔｒｏセレクション解析の概略及び結果（電気泳動写真）を示す。Ｆｏｓ＋／−；ペイトＦｏｓ−Ｂｉｏ−ＩＶＶがあり／なし。レーン１；スクリーニング後のビーズをテンプレートとしたもの。レーン２；ビーズを１００倍に希釈したもの。レーン３；ビーズを１００００倍に希釈したもの。Ｍ；マーカー。
図１９は、本発明の翻訳テンプレート（Ａ）ならびにその構成要素であるコード分子（Ｂ）及びスペーサー分子（Ｃ）の構成を示す。翻訳テンプレートは、コード分子由来のコード部とスペーサー分子由来のスペーサー部からなる。Ｆ１及びＦ２は蛍光色素を示す。
図２０は、Ｃ末端修飾された蛋白質（対応付け分子）（Ａ）、本発明の翻訳テンプレート（Ｂ）、及び、修飾剤（Ｃ）の構成を示す。
図２１は、本発明の対応づけ分子やＣ末端ラベル化法による物質や蛋白質の相互作用解析の一次スクリーニングと二次スクリーニングの説明図を示す。本発明翻訳テンプレートから合成されたＣ末端修飾タンパク質（修飾剤でＣ末端修飾された蛋白質、翻訳テンプレートでＣ末端修飾された蛋白質（対応付け分子）、ＰＥＧによってＣ末端修飾された蛋白質を利用したタンパク質を、標的分子との間の相互作用の解析に利用可能である。一次スクリーニングの後、物質や蛋白質と相互作用の詳細をＦＣＣＳやマイクロアレイなどによりさらに解析することが可能である。
図２２は、コード分子の３’末端配列の違いによる翻訳量の比較を示す。ｃ−ｊｕｎの遺伝子配列を有する、異なる１２種類の３’末端配列を持つコード分子（Ａ８＝Ａ配列）の翻訳量の比較。Ｘ配列のバリエーションと必要な条件を示した。詳細は、実施例１参照。
図２３は、翻訳テンプレートがＰＥＧスペーサー部を持たない場合及び異なるＰＥＧスペーサー部を持つ場合の翻訳量の比較を示す。
Ａ：ｃ−ｆｏｓの遺伝子配列を有するＡ配列もＸ配列も持たないコード分子（Ｎｏｎｅ（ｍＲＮＡ））と，Ａ配列を持つコード分子（Ａ（ｍＲＮＡ））、およびｄＣｄＣＴ（Ｆｌｕ）ＰＥＧ４０００ｄＣｄＣＰｕｒｏ−Ｂｏｃをライゲーションした翻訳テンプレート（＋ＰＥＧ４０００ｄＣｄＣＰｕｒｏ−Ｂｏｃ，）の翻訳量の比較。詳細は、実施例１参照。
Ｂ：ｃ−ｊｕｎの遺伝子配列を有するＡ配列もＸ配列も持たないコード分子（Ｎｏｎｅ（ｍＲＮＡ）），ＸＡ配列を持つコード分子（ＸＡ（ｍＲＮＡ））、およびコード分子（ＸＡ（ｍＲＮＡ））に（ｄＣ）_２Ｔ（Ｆｌｕ）Ｔ（ＸＡ＋（ｄＣ）_２Ｔ_２），ｄＣｄＣＴ（Ｆｌｕ）ＴＰＥＧ４０００（ＸＡ＋ＰＥＧ４０００），ｄＣｄＣＴ（Ｆｌｕ）ＰＥＧ４０００ｄＣｄＣＰｕｒｏ−Ｂｏｃ（ＸＡ＋ＰＥＧ４０００ｄＣｄＣＰｕｒｏ−Ｂｏｃ）をライゲーションした翻訳テンプレートの翻訳量の比較（電気泳動の結果（写真）も示す）。詳細は、実施例１参照。
図２４は、翻訳テンプレートの翻訳量と安定性を示す。
Ａ：ｃ−ｊｕｎの遺伝子配列を有するＸＡ配列を持つコード分子（●；ＸＡ配列）、Ａ配列もＸ配列も持たないコード分子（□；Ｎｏｎｅ配列）、およびコード分子（ＸＡ配列）とｄＣｄＣＴ（Ｆｌｕ）ＰＥＧ４０００ｄＣｄＣＰｕｒｏ−Ｂｏｃをライゲーションした翻訳テンプレート（○）の翻訳量のタイムコース。詳細は、実施例１参照。
Ｂ：ｃ−ｊｕｎの遺伝子配列を有するコード分子（●；ＸＡ配列）と、およびコード分子（ＸＡ配列）とｄＣｄＣＴ（Ｆｌｕ）ＰＥＧ４０００ｄＣｄＣＰｕｒｏ−Ｂｏｃをライゲーションした翻訳テンプレート（○）の安定性のタイムコース。詳細は、実施例１参照。
図２５は、本発明の翻訳テンプレートが異なるＰＥＧスペーサー部を持つ場合の翻訳量の比較（電気泳動の結果（写真）も示す）を示す。
Ａ：ｃ−ｊｕｎの遺伝子配列を有するコード分子（ＸＡ配列，Ａ配列）とｄＣｄＣＴ（Ｆｌｕ）ＰＥＧ４０００ｄＣｄＣＰｕｒｏ−Ｂｏｃをライゲーションした場合の翻訳テンプレートの添加量の違いによる対応付け分子の形成効率。ＩＶＶ；対応付け分子、ＬｉｇａｔｅｄｍＲＮＡ；コード部にＰＥＧスペーサー部がライゲーションされた翻訳テンプレート。レーン１〜６；ＲＮＡ添加量が１０，２５，５０，１００，２００，４００ｎＭ．詳細は、実施例２参照。
Ｂ：ｃ−ｊｕｎの遺伝子配列を有するコード分子（ＸＡ配列，Ａ配列）とｄＣｄＣＴ（Ｆｌｕ）ＰＥＧ４０００ｄＣｄＣＰｕｒｏ−Ｂｏｃをライゲーションした場合の翻訳テンプレートの添加量の違いによるフリー蛋白質（Ｆｒｅｅｐｒｏｔｅｉｎ）の合成率（対応付け分子の形成量＋フリー蛋白質の合成量＝１００％）。レーン１〜６；ＲＮＡ添加量が１０，２５，５０，１００，２００，４００ｎＭ．詳細は、実施例２参照。
図２６〜３０は、本発明に使用されるＰＥＧスペーサー分子とその合成スキームを示す。
図３１〜３４は、本発明に使用される修飾剤とその合成スキームを示す。
図３５は、無細胞共翻訳によるＩＶＶ複合体を用いたＦＣＣＳ解析（実施例７）の結果を示す。小麦胚芽の無細胞翻訳系で共翻訳し、Ｆｏｓ−Ｃｙ５−ＩＶＶとＪｕｎ−ＲｈＧ−ＩＶＶの複合体をＦＣＣＳで測定した（−○−）。コントロールとして相互作用の可能性のないことが知られているＦｏｓ−Ｃｙ５−ＩＶＶとＦｏｓ−ＲｈＧ−ＩＶＶの組み合わせを測定した（−□−）。グラフの横軸は時間マイクロ秒（ｕｓ）、縦軸はＧ（τ）である。Ｇ（τ）は平均蛍光強度をＩとすると、時間ｔにおける蛍光強度Ｉ（ｔ）ならびにｔ＋τにおける蛍光強度Ｉ（ｔ＋τ）の積で表される（Ｇ（τ）＝＜Ｉ（ｔ）Ｉ（ｔ＋τ）＞）。
図３６は、無細胞共翻訳によるＩＶＶ複合体を用いたＦＣＣＳ解析（実施例８）の結果を示す。
Ａ：Ｆｏｓ−Ｃｙ５−ＩＶＶとＪｕｎ−ＲｈＧ−ＩＶＶの相互作用（黒色線）、及び、Ｆｏｓ−Ｃｙ５−ＩＶＶとＦｏｓ−ＲｈＧ−ＩＶＶの相互作用（灰色線）。
Ｂ：ＲＮａｓｅＡ処理をしてｍＲＮＡ部分を分解してＦｏｓ−Ｃｙ５−ＩＶＶとＪｕｎ−ＲｈＧ−ＩＶＶの相互作用をＦＣＣＳで測定した（黒色線）。また同様にして、コントロールとして相互作用の可能性のないことが知られているＦｏｓ−Ｃｙ５−ＩＶＶとＦｏｓ−ＲｈＧ−ＩＶＶを測定した（灰色線）。
図３７は、ＩＶＶ複合体あるいはＩＶＶ−Ｃ末端ラベル化蛋白質複合体を用いたプロテインチップ解析の概略及び結果（写真）を示す。
Ａ：無細胞翻訳系でＪｕｎ（ｍＲＮＡ）−ｓｐａｃｅｒ（ｂｉｏｔｉｎ）を単独で翻訳し、スライドグラスにＩＶＶの文字を描くようにプロットし、スペーサーのビオチンでスライドグラスのアビジンに固定化した。Ｔ７およびＪｕｎの抗体によりＩＶＶの固定化を確認した。
Ｂ：相互作用が既知の蛋白質としてＦｏｓ／Ｊｕｎを用いて、無細胞翻訳系でＦｏｓ（ｍＲＮＡ）−Ｃｙ５−ｓｐａｃｅｒ（ｂｉｏｔｉｎ）、Ｊｕｎ（ｍＲＮＡ）−Ｃｙ５−ｓｐａｃｅｒ（ｂｉｏｔｉｎ）あるいはｃＢ１（ｍＲＮＡ）−Ｃｙ３−ｓｐａｃｅｒ（ｂｉｏｔｉｎ）を単独で翻訳し、スライドグラスにプロットし固定化した。固定化したＩＶＶについて、スペーサーのＣｙ５の波長による検出で確認した。上からかける側のＩＶＶを無細胞翻訳系で合成し、ＲＮａｓｅＡ処理したものをスポットエリアに添加し、スライドグラスをＣｙ３の波長で解析して相互作用を検出した。
Ｃ：上からかける蛋白質として、Ｃ末端ラベル化蛋白質（Ｆｏｓ（Ｃｙ３））を無細胞翻訳系で合成したものをスポットエリアに添加する以外は、Ｂと同様にして、スライドグラスをＣｙ５とＣｙ３の波長で解析し相互作用を検出した。
図３８は、共翻訳によるＩＶＶ複合体を用いたプロテインチップ解析の概略を示す。

Claims

遺伝子型と表現型の対応付け分子と、Ｃ末端がピューロマイシン又はその誘導体を含むＣ末端ラベル化剤によりラベル化されたＣ末端ラベル化蛋白質との相互作用によって形成される複合体であって、対応付け分子を構成する蛋白質部分以外の部分および該Ｃ末端ラベル化剤がそれぞれ相互作用解析に必要な修飾を受けている、対応付け分子とＣ末端ラベル化蛋白質の複合体。
一種類の対応付け分子と一種類のＣ末端ラベル化蛋白質から構成され、該対応付け分子が含む蛋白質と該Ｃ末端ラベル化蛋白質が同一あるいは異なる、請求項１記載の複合体。
該複合体が一種類の対応付け分子と二種類以上のＣ末端ラベル化蛋白質から構成される、請求項１記載の複合体。
対応付け分子が、スペーサーを介して蛋白質とそれをコードするｍＲＮＡを連結した対応付け分子であり、該対応付け分子のスペーサーに対応付け分子間の相互作用解析に必要な修飾を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の複合体。
無細胞翻訳系で、Ｃ末端ラベル化剤の存在下で、該ｍＲＮＡと該Ｃ末端ラベル化蛋白質の蛋白質をコードするｍＲＮＡが翻訳されることにより対応付け分子とＣ末端ラベル化蛋白質が同時に生成し、生成した対応付け分子とＣ末端ラベル化蛋白質との間で相互作用することで形成される複合体であって、無細胞翻訳系におけるＣ末端ラベル化剤の濃度が、該Ｃ末端ラベル化蛋白質のラベル化効率に十分で、かつ該対応付け分子の形成を阻害しない範囲である、請求項４記載の複合体。
相互作用解析に必要な修飾が検出用修飾および分離用修飾である請求項４又は５記載の複合体。
該対応付け分子がスペーサーに検出用修飾を有する、請求項６記載の複合体。
該対応付け分子がスペーサーに分離用修飾を有する、請求項６記載の複合体。
該対応付け分子がスペーサーに検出用修飾および分離用修飾を有する、請求項６記載の複合体。
該Ｃ末端ラベル化蛋白質のラベル化剤が検出用修飾を有する、請求項４〜９のいずれか１項に記載の複合体。
該Ｃ末端ラベル化蛋白質のラベル化剤が分離用修飾を有する、請求項４〜９のいずれか１項に記載の複合体。
該Ｃ末端ラベル化蛋白質のラベル化剤が検出用修飾および分離用修飾を有する、請求項４〜９のいずれか１項に記載の複合体。
分離用修飾として蛍光性物質を有する、請求項８記載の複合体。
検出用修飾として固定化物質を有する、請求項９記載の複合体。
検出用修飾として蛍光性物質および分離用修飾として固定化物質を有する、請求項９記載の複合体。
検出用修飾として蛍光性物質を有する、請求項１０記載の複合体。
分離用修飾として固定化物質を有する、請求項１１記載の複合体。
検出用修飾として蛍光性物質および分離用修飾として固定化物質を有する、請求項１２記載の複合体。
対応付け分子がスペーサーにＣｙ５を有する場合は、該Ｃ末端ラベル化蛋白質のラベル化剤がローダミングリーンを有する、請求項１３または１５記載の複合体。
対応付け分子がスペーサーにローダミングリーンを有する場合は、該Ｃ末端ラベル化蛋白質のラベル化剤がＣｙ５を有する、請求項１３または１５記載の複合体。
固定化物質がビオチンである、請求項１４、１５、１７及び１８のいずれか１項に記載の複合体。
対応付け分子からｍＲＮＡが除去されている、請求項４〜２１のいずれか１項に記載の複合体。
請求項１〜２２に記載された複合体を形成する対応付け分子及びＣ末端ラベル化分子を用いる蛋白質間相互作用の解析方法であって、対応付け分子を固定化することを特徴とする、解析方法。
請求項１〜２２に記載された複合体を形成する対応付け分子及びＣ末端ラベル化分子を用いる蛋白質間相互作用の解析方法であって、対応付け分子を固定化しないことを特徴とする蛋白質間相互作用の解析方法。
ＲＩもしくは蛍光イメージングアナライズ法による、またはＤＮＡチップもしくはプロテインチップを用いる、請求項２３記載の解析方法。
蛍光相互相関分析法による、請求項２４記載の解析方法。
複数の、遺伝子型と表現型の対応付け分子を含み、該対応付け分子間の相互作用によって形成される複合体であり、対応付け分子間の相互作用解析に必要な修飾を、対応付け分子を構成する蛋白質部分以外の部分に有することを特徴とする対応付け分子の複合体。
同一あるいは異なる蛋白質を含む２種類の対応付け分子からなる、請求項２７記載の複合体。
同一あるいは異なる蛋白質を含む３種類以上の対応付け分子からなる、請求項２７又は２８記載の複合体。
対応付け分子が、スペーサーを介して蛋白質とそれをコードするｍＲＮＡを連結した対応付け分子であり、かつ該対応付け分子のスペーサーに、対応付け分子間の相互作用解析に必要な修飾を有する、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の複合体。
無細胞翻訳系で複数のｍＲＮＡが翻訳されることにより複数の対応付け分子が同時に生成し、生成した対応付け分子間で相互作用することで形成される、請求項３０記載の複合体。
相互作用解析に必要な修飾が検出用修飾および分離用修飾である、請求項３０又は３１記載の複合体。
対応付け分子の少なくとも一つがスペーサーに検出用修飾を有する、請求項３２記載の複合体。
対応付け分子の少なくとも一つがスペーサーに分離用修飾を有する、請求項３２記載の複合体。
対応付け分子の少なくとも一つがスペーサーに分離用修飾を有し、残りの少なくとも一つがスペーサーに検出用修飾を有する、請求項３２記載の複合体。
検出用修飾として蛍光性物質を有する、請求項３２、３３及び３５のいずれか１項に記載の複合体。
分離用修飾として、固定化物質を有する、請求項３２、３４及び３５のいずれか１項に記載の複合体。
検出用修飾として蛍光性物質、および分離用修飾として固定化物質を有する、請求項３５記載の複合体。
固定化物質がビオチンである、請求項３７又は３８記載の複合体。
対応付け分子の少なくとも一つがスペーサーに検出用修飾としてＣｙ５を有し、残りの対応付け分子が検出用修飾としてローダミングリーンを有する、請求項３６又は３８記載の複合体。
対応付け分子の少なくとも一つがスペーサーに検出用修飾としてローダミングリーンを有し、残りの対応付け分子がスペーサーに検出用修飾としてＣｙ５を有することを特徴とする複合体。
対応付け分子が、ｍＲＮＡが除去された対応付け分子であり、ｍＲＮＡが除去された対応付け分子間の相互作用によって形成される請求項３０〜４１のいずれか１項に記載の複合体。
ｍＲＮＡが除去された対応付け分子のスペーサーに検出用修飾を有する、請求項４２記載の複合体。
ｍＲＮＡが除去された対応付け分子のスペーサーに分離用修飾を有する、請求項４２記載の複合体。
ｍＲＮＡが除去された対応付け分子のスペーサーに分離用修飾および検出用修飾を有する、請求項４２記載の複合体。
請求項２７〜４５のいずれか１項に記載された複合体を形成する対応付け分子を用いる蛋白質間相互作用の解析方法であって、対応付け分子を固定化することを特徴とする、解析方法。
請求項２７〜４５のいずれか１項に記載された複合体を形成する対応付け分子を用いる蛋白質間相互作用の解析方法であって、対応付け分子を固定化しないことを特徴とする、解析方法。
ＲＩもしくは蛍光イメージングアナライズ法による、またはＤＮＡチップもしくはプロテインチップを用いる、請求項４６記載の解析方法。
蛍光相互相関分析法による、請求項４７記載の解析方法。
スペーサーを介して蛋白質とそれをコードするｍＲＮＡを連結した対応付け分子からｍＲＮＡを除去することにより得られる対応付け分子であって、スペーサーが、蛋白質のＣ末端に結合した、ピューロマイシンあるいはピューロマイシンと少なくとも１残基のＤＮＡあるいは／またはＲＮＡからなるペプチドアクセプター領域、ペプチドアクセプター領域に結合した、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域、及び、ＰＥＧ領域に結合した、少なくとも１残基のＤＮＡあるいは／またはＲＮＡの塩基に機能修飾を施した機能付与ユニットを含む、対応付け分子。