JP2002257832A

JP2002257832A - タンパク質のラベル化試薬

Info

Publication number: JP2002257832A
Application number: JP2001052840A
Authority: JP
Inventors: Naoto Nemoto; 直人根本; Susumu Sasaki; 享佐々木
Original assignee: GENCOM CO
Current assignee: GENCOM CO
Priority date: 2001-02-27
Filing date: 2001-02-27
Publication date: 2002-09-11
Also published as: WO2002073201A1

Abstract

(57)【要約】【課題】標識すべき標的タンパク質一分子に対して一
分子の標識物質と一分子の親和性物質又は共有結合形成
性反応基を導入することを可能にするタンパク質のラベ
ル化試薬を提供すること。【解決手段】タンパク質のＣ末端に結合する能力を有
する物質一分子に対して一分子の標識物質と一分子の親
和性物質又は共有結合形成性反応基とが結合して成る、
タンパク質のラベル化試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、タンパク質のラベ
ル化試薬に関する。より詳細には、本発明は、一分子中
に一分子の標識物質と一分子の親和性物質又は共有結合
形成性反応基とを含むタンパク質のラベル化試薬に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】ヒトゲノム計画の進展により２００１年
には全ヒトゲノムの一次配列が解読されようとしてい
る．現在、いわゆるポストゲノム研究と呼ばれる遺伝子
相互作用の研究が注目され、蛍光偏光解消法（Checovic
h, W.C., et al. (1995) Nature375, 254-256）、表面
プラズモン法（Jonsson U et al. (1991) Anal Bioche
m.198, 268-277）、蛍光相関分光法（Eigen M. and Rig
ler, R. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5470
-5747）等を含む幾つかの方法が検討され研究が進めら
れている。船津らは近年、初めて水中でエバーネッセン
ト光を用いて蛍光ラベルしたタンパク質分子を１分子レ
ベルで観測する技術を開発することに成功した（Funats
u, T et al. (1995) Nature 374, 555-559）。この技術
における大きな課題の一つはタンパク質分子に１個の蛍
光分子を付加することであった。

【０００３】一方、根本らは無細胞翻訳系にピューロマ
イシンと蛍光分子を化学結合させた分子をある濃度で加
えることにより、合成されるタンパク質のＣ末端に特異
的に蛍光分子が付加されることを発見した(Nemoto, N.,
et al (1999) FEBS Lett. 462, 43-46)。

【０００４】上記したような１分子イメージング法と１
分子ラベル法とを組み合わせることができれば、従来に
ない迅速性と定量性を有するシステムを構築することが
可能になる。さらに、大量並立処理を可能とするＤＮＡ
チップのようなタンパク質のチップ化に成功すれば技術
的に非常に有意義である。

【０００５】しかしながら、ＤＮＡの場合と異なり、タ
ンパク質は安定性や精製法等の点において極めて困難な
課題を持っている。例えば、既にタンパク質チップとし
て報告されているものも抗体のような極めて安定性の高
いタンパク質に限られている。ｃＤＮＡ等にコードされ
るタンパク質をその機能を保持したまま基盤上に固定す
る方法はまだ確立されていないのが現状である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】いわゆるＤＮＡチップ
におけるＤＮＡ−ＤＮＡ間の相互作用の検出とタンパク
質チップにおけるタンパク質？タンパク質間の相互作用
の検出との違いは，タンパク質間相互作用の結合する度
合いの程度の差（ダイナミックレンジ）が極めて大きく
おおよそ１０の４乗のオーダーの強度差を検出する必要
があるということである。本発明は、このようなタンパ
ク質又は核酸と標的分子との間の分子間相互作用を迅速
かつ定量的に測定することを可能にする手段を提供する
ことを解決すべき課題とした。より具体的には、本発明
は、標識すべき標的タンパク質一分子に対して一分子の
標識物質と一分子の親和性物質又は共有結合形成性反応
基を導入することを可能にするタンパク質のラベル化試
薬を提供することを解決すべき課題とした。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討した結果、蛍光ラベルと固定化
のためのビオチンを結合したピューロマイシンを、無細
胞翻訳系を用いることによって、固定すべきタンパク質
のＣ末端に特異的に導入することにより、当該タンパク
質をその機能を失うことなくガラスやメンブレン等に支
持体上にストレプトアビジンを介して固定化できること
を見出した。また本発明者らは、上記のようにして固定
化したタンパク質を１分子イメージング法を用いて測定
すると、極めて正確に固定化した分子数を同定できるこ
とを見出した。さらに、上記のようにして固定化された
タンパク質の正確な数を特定し、さらにこのタンパク質
と相互作用するかどうか調べたいタンパク質のＣ末端を
波長の異なる蛍光分子で標識化し、その数を定量した上
で，エバーネッセント光を用いた１分子イメージング法
で相互作用するタンパク質の数を定量することにより、
正確な解離定数を求めることが可能になる（図１及び
２）。本発明はこれらの知見に基づいて完成したもので
ある。

【０００８】即ち、本発明によれば、以下の発明が提供
される。（１）タンパク質のＣ末端に結合する能力を有する物
質一分子に対して一分子の標識物質と一分子の親和性物
質又は共有結合形成性反応基とが結合して成る、タンパ
ク質のラベル化試薬。（２）標識物質と親和性物質又は共有結合形成性反応
基がそれぞれスペーサーを介して、タンパク質のＣ末端
に結合する能力を有する物質に結合している、（１）に
記載のラベル化試薬。（３）一般式：Ｘ−（Ｌ¹）_m−Ａ−（Ｌ²）_n−Ｙ（式中、Ｘは標識物質の残基を示し、Ｙは親和性物質の
残基又は共有結合形成性反応基を示し、Ｌ¹およびＬ²は
それぞれ独立に２価のスペーサ基を示し、ｍおよびｎは
それぞれ独立に０又は１の整数を示し、Ａはタンパク質
のＣ末端に結合する能力を有する物質の残基を示す）で
表される化合物から成る（１）又は（２）に記載のラベ
ル化試薬。

【０００９】（４）標識物質が蛍光物質である、
（１）から（３）の何れかに記載のラベル化試薬。（５）親和性物質が、ビオチン、マルトース、グアニ
ンヌクレオチド、金属イオン、グルタチオン、タンパク
質結合性ＤＮＡ、抗原分子、カルモジュリン結合ペプチ
ド、ＡＴＰ、及びエストラジオールからなる群より選ば
れる物質であり、共有結合形成性反応基がケトン基、ジ
オール基、アジド基又はソラレンである、（１）から
（４）の何れかに記載のラベル化試薬。（６）タンパク質のＣ末端に結合する能力を有する物
質が、ピューロマイシン、3’−Ｎ−アミノアシルピュ
ーロマイシンアミノヌクレオシド、又は3’−Ｎ−アミ
ノアシルアデノシンアミノヌクレオシドのいずれかの化
学構造骨格を含む化合物又はそれらの類縁体である、
（１）から（５）の何れかに記載のラベル化試薬。

【００１０】（７）（１）から（６）の何れかに記載
のタンパク質のラベル化試薬の存在下においてタンパク
質をコードする核酸を用いて転写・翻訳系においてタン
パク質合成を行う工程を含む、タンパク質のＣ末端を標
識する方法。（８）一般式：Ｘ−（Ｌ¹）_m−Ａ−（Ｌ²）_n−Ｙ（式中、Ｘは標識物質の残基を示し、Ｙは親和性物質の
残基又は共有結合形成性反応基を示し、Ｌ¹およびＬ²は
それぞれ独立に２価のスペーサ基を示し、ｍおよびｎは
それぞれ独立に０又は１の整数を示し、Ａはタンパク質
のＣ末端に結合する能力を有する物質の残基を示す）で
表される化合物又はその塩。

【００１１】（９）標識物質が蛍光物質である、
（８）に記載の化合物又はその塩。（１０）親和性物質が、ビオチン、マルトース、グア
ニンヌクレオチド、金属イオン、グルタチオン、タンパ
ク質結合性ＤＮＡ、抗原分子、カルモジュリン結合ペプ
チド、ＡＴＰ、及びエストラジオールからなる群より選
ばれる物質であり、共有結合形成性反応基がケトン基、
ジオール基、アジド基又はソラレンである、（８）又は
（９）に記載の化合物又はその塩。（１１）タンパク質のＣ末端に結合する能力を有する
物質が、ピューロマイシン、3’−Ｎ−アミノアシルピ
ューロマイシンアミノヌクレオシド、又は3’−Ｎ−ア
ミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドのいずれかの
化学構造骨格を含む化合物又はそれらの類縁体である、
（８）から（１０）の何れかに記載の化合物又はその
塩。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施方法および実
施態様について詳細に説明する。（１）タンパク質のラベル化試薬本発明によれば、タンパク質のＣ末端に結合する能力を
有する物質一分子に対して一分子の標識物質と一分子の
親和性物質又は共有結合形成性反応基とが結合して成
る、タンパク質のラベル化試薬が提供される。即ち、本
発明のラベル化試薬は、その分子一分子中に一分子の標
識物質と一分子の親和性物質又は共有結合形成性反応基
とを有し、かつタンパク質のＣ末端に結合する能力を有
する物質を有する。標識物質および親和性物質又は共有
結合形成性反応基はそれぞれ、タンパク質のＣ末端に結
合する能力を有する物質に対して直接化学結合していて
もよいし、あるいはスペーサーを介して化学結合してい
てもよい。

【００１３】標識物質は、通常は蛍光性物質などの非放
射性標識物質から選択される。蛍光物質としては、フリ
ーの官能基（例えば活性エステルに変換可能なカルボキ
シル基、ホスホアミダイドに変換可能な水酸基、あるい
はアミノ基など）を持ち、ピューロマイシン又はピュー
ロマイシン様化合物などの上記核酸誘導体に連結可能な
種々の蛍光色素、例えばフルオレセイン系列、ローダミ
ン系列、エオシン系列、ＮＢＤ系列などのいかなるもの
であってもよい。蛍光物質としては、具体的には、Ｃｙ
５（アマシャム）、Ｃｙ３（アマシャム）、ＩＣ５（同
仁化学）、ＩＣ３（同仁化学）、フルオレセイン、テト
ラメチルローダミン、テキサスレッド、アクリジンオレ
ンジなどが挙げられる。また、標識物質としては化学発
光物質（例えば、ルミノール、アクリジニウム−Ｉな
ど）を使用してもよい。

【００１４】親和性物質としては、特定の物質に対する
親和性を有する物質であればタンパク質、ペプチド、糖
類、脂質類、低分子化合物などその種類は特に限定され
ない。親和性物質の具体例としては、ビオチン、マルト
ース、グアニンヌクレオチド、金属イオン、グルタチオ
ン、タンパク質結合性ＤＮＡ、抗原分子、カルモジュリ
ン結合ペプチド、ＡＴＰ、及びエストラジオールなどが
挙げられる。共有結合形成性反応基としては、ケトン
基、ジオール基、アジド基又はソラレンなどが挙げられ
る。

【００１５】ラベル化試薬を構成する「タンパク質のＣ
末端に結合する能力を有する物質」としては、通常は核
酸誘導体が用いられる。この核酸誘導体としては、無細
胞タンパク質合成系又は生細胞中でタンパク質の合成
（翻訳）が行われた時に、合成されたタンパク質のＣ末
端に結合する能力を有する化合物である限り限定されな
いが、その３’末端がアミノアシルtRNAに化学構造骨格
が類似しているものを選択することができる。代表的な
化合物として、アミド結合を有するピューロマイシン
（Puromycin）、３’-N-アミノアシルピューロマイシン
アミノヌクレオシド（3'-N-Aminoacylpuromycin aminon
ucleoside 、 PANS-アミノ酸）、たとえば、アミノ酸部
がグリシンのPANS-Gly、アミノ酸部がバリンのPANS-Va
l、アミノ酸部がアラニンのPANS-Ala、その他、アミノ
酸部が全ての各アミノ酸に対応するPANS−アミノ酸化合
物が挙げられる。

【００１６】また、３’−アミノアデノシンのアミノ基
とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合して形成される
アミド結合で連結した３’-N-アミノアシルアデノシン
アミノヌクレオシド（3'-Aminoacyladenosine aminonuc
leoside, AANS-アミノ酸）、たとえば、アミノ酸部がグ
リシンのAANS-Gly、アミノ酸部がバリンのAANS-Val、ア
ミノ酸部がアラニンのAANS-Ala、その他、アミノ酸部が
全アミノ酸の各アミノ酸に対応するAANS-アミノ酸化合
物を使用できる。

【００１７】また、ヌクレオシドあるいはヌクレオシド
とアミノ酸のエステル結合したものなども使用できる。
さらにまた、核酸あるいは核酸に類似した化学構造骨格
及び塩基を有する物質と、アミノ酸に類似した化学構造
骨格を有する物質とを化学的に結合した化合物は、すべ
て本方法において用いられる核酸誘導体に含まれる。

【００１８】タンパク質のＣ末端に結合する能力を有す
る物質としては、ピューロマイシン、ＰＡＮＳ−アミノ
酸もしくはＡＡＮＳ−アミノ酸がリン酸基を介してヌク
レオシドと結合している化合物がより好ましい。これら
の化合物の中でピューロマイシン、リボシチジルピュー
ロマイシン（ｒＣｐＰｕｒ）、デオキシジルピューロマ
イシン（ｄＣｐＰｕｒ）、デオキシウリジルピューロマ
イシン（ｄＵｐＰｕｒ）などのピューロマイシン誘導体
が特に好ましい。

【００１９】本発明のタンパク質のラベル化試薬を構成
する物質の具体例としては、一般式：Ｘ−（Ｌ¹）_m−Ａ
−（Ｌ²）_n−Ｙ（式中、Ｘは標識物質の残基を示し、Ｙは親和性物質の
残基又は共有結合形成性反応基を示し、Ｌ¹およびＬ²は
それぞれ独立に２価のスペーサ基を示し、ｍおよびｎは
それぞれ独立に０又は１の整数を示し、Ａはタンパク質
のＣ末端に結合する能力を有する物質の残基を示す）で
表される化合物が挙げられる。

【００２０】Ｘで表される標識物質の残基、Ｙで表され
る親和性物質の残基又は共有結合形成性反応基、Ａで表
されるタンパク質のＣ末端に結合する能力を有する物質
の残基の具体例としては、それぞれ上述した標識物質お
よび親和性物質の残基又は共有結合形成性反応基が挙げ
られる。

【００２１】Ｌ¹およびＬ²が示す２価のスペーサ基とし
ては、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基
又はこれらの組み合わせが挙げられ、これらの炭素原子
上には１又は複数の置換基が存在していてもよい。主鎖
の炭素数の数は特に限定されないが、好ましくは炭素数
１から１０であり、より好ましくは炭素数１から６であ
り、さらに好ましくは炭素数１から４である。主鎖の炭
素原子上に存在することができる置換基の種類は特に限
定されないが、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜
４のアルケニル基、炭素数１〜４のアルキニル基、水酸
基又はハロゲン原子（例えば、フッ素、原子、塩素原
子、臭素原子、ヨウ素原子など）等を挙げることができ
る。Ｌ¹が示すスペーサー基としては、無置換のアルキ
レン基、アルケニレン基、アルキニレン基又はこれらの
組み合わせが好ましく、無置換のアルキレン基がより好
ましく、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチ
レン基が特に好ましく、エチレン基が最も好ましい。ま
た、２価のスペーサ基としては、ポリエチレン、ポリエ
チレングリコールなどの高分子物質に由来する基でもよ
い。また、スペーサ基の中には、アミド結合（−ＣＯ−
ＮＨ−基）、エステル結合（−ＣＯＯ−基）、チオウレ
ア結合（−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−基）、スルホンアミド基
（−ＳＯ₂−ＮＨ−）、リン酸ジエステル結合（−Ｏ−
Ｐ（Ｏ）ＯＨ−Ｏ−）などが含まれていてもよい。ｍお
よびｎは好ましくは１である。

【００２２】ラベル化試薬は、上記標識物質と上記親和
性物質又は共有結合形成性反応基とタンパク質のＣ末端
に結合する能力を有する物質とを所望によりスペーサー
を介して、それ自体既知の化学結合方法によって結合さ
せることにより製造することができる。具体的には、例
えば、適当な保護基で保護された「タンパク質のＣ末端
に結合する能力を有する物質」を固相担体上に結合さ
せ、核酸合成機を用いてスペーサーとしてスペーサーホ
スホアミダイト、蛍光物質または親和性物質又は共有結
合形成性反応基を結合したホスホアミダイトを順次結合
させた後、脱保護を行うことによって作成することがで
きる。上記各部の種類、あるいは結合の種類によっては
液相合成法で結合させるかあるいは両者を併用すること
もできる。また親和性物質としてニッケル等の金属イオ
ンを結合させるには、金属イオンが配位しうるニトリロ
トリ酢酸やイミノジ酢酸等のキレート性の試薬用いて行
うことができる。

【００２３】標識物質又は親和性物質又は共有結合形成
性反応基と、タンパク質のＣ末端に結合する能力を有す
る物質とをつなぐスペーサーとしては、炭素数の１から
１０程度の脂肪族炭化水素基（例えば、アルキレン基、
アルケニレン基など）や、ポリエチレン、ポリエチレン
グリコールなどの高分子物質に由来する基でもよい。

【００２４】上記した通り、本発明は、タンパク質のＣ
末端に結合する能力を有する物質一分子に対して一分子
の標識物質と一分子の親和性物質又は共有結合形成性反
応基とが結合して成る、タンパク質のラベル化試薬に関
するものであり、その具体例として、一般式：Ｘ−（Ｌ
¹）_m−Ａ−（Ｌ²）_n−Ｙ（式中、Ｘは標識物質の残基を
示し、Ｙは親和性物質の残基又は共有結合形成性反応基
を示し、Ｌ¹およびＬ²はそれぞれ独立に２価のスペーサ
基を示し、ｍおよびｎはそれぞれ独立に０又は１の整数
を示し、Ａはタンパク質のＣ末端に結合する能力を有す
る物質の残基を示す）で表される化合物を例示したが、
当該化合物自体新規なものであり、本発明の一つの側面
を構成する。即ち、一般式：Ｘ−（Ｌ¹）_m−Ａ−
（Ｌ²）_n−Ｙ（式中、Ｘは標識物質の残基を示し、Ｙは
親和性物質の残基又は共有結合形成性反応基を示し、Ｌ
¹およびＬ²はそれぞれ独立に２価のスペーサ基を示し、
ｍおよびｎはそれぞれ独立に０又は１の整数を示し、Ａ
はタンパク質のＣ末端に結合する能力を有する物質の残
基を示す）で表される化合物又はその塩も本発明の範囲
内である。

【００２５】ここで言う塩としては、化合物中に存在す
る置換基の種類などに応じて任意の可能な塩の全てを包
含するものであり、塩の種類は特に限定されない。例え
ば、酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、又は有機アミ
ン付加塩等が包含される。酸付加塩としては、塩酸塩、
硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレ
イン酸塩、フマル酸塩、又はクエン酸塩等の有機酸塩が
挙げられる。金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム
塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩
等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、又は亜鉛塩
等が挙げられ、アンモニウム塩としては、アンモニウム
又はテトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられ、有機
アミン付加塩としては、モルホリン又はピペリジン等の
付加塩が挙げられる。

【００２６】一般式：Ｘ−（Ｌ¹）_m−Ａ−（Ｌ²）_n−Ｙ
の化合物には、位置異性体、幾何異性体、互変異性体、
又は光学異性体のような異性体が存在する場合がある
が、全ての可能な異性体、並びに２種類以上の該異性体
を任意の比率で含む混合物も本発明の範囲内のものであ
る。

【００２７】上記化合物の塩を取得したい場合、上記化
合物が塩の形態で得られる場合にはそのまま精製すれば
よく、また、遊離の形態で得られる場合には適当な溶媒
に溶解又は懸濁させ、酸又は塩基を加えて塩を形成させ
単離、精製すればよい。また、上記化合物及びその塩
は、水あるいは各種溶媒との付加物（水和物又は溶媒和
物）の形で存在することもあるが、これらの付加物も本
発明の範囲内のものである。また、上記化合物及びその
塩の任意の結晶形も本発明の範囲内のものである。

【００２８】（２）タンパク質のラベル化試薬を用いた
タンパク質のＣ末端を標識する方法本発明はさらに、上記した本発明のタンパク質のラベル
化試薬の存在下においてタンパク質をコードする核酸を
用いて転写・翻訳系においてタンパク質合成を行う工程
を含む、タンパク質のＣ末端を標識する方法に関する。

【００２９】本発明の方法で標識するタンパク質は、そ
の機能が既知又は未知である相互作用の解析対象として
用いるタンパク質を意味する。本発明の方法で標識され
たタンパク質を用いて、後述する標的分子との相互作用
を測定することができる。このタンパク質は、天然タン
パク質又はその変異体、及び人工タンパク質又はその変
異体の何れでもよい。天然タンパク質としては、種々の
生物の器官、組織又は細胞に由来するｃＤＮＡライブラ
リーから転写、翻訳される多様性を有するタンパク質の
ライブラリーをも含むものである。人工タンパク質とし
ては、天然タンパク質の全てもしくは部分配列を組み合
わせた配列、又はランダムなアミノ酸配列を含むもので
ある。

【００３０】本発明によるタンパク質のＣ末端を標識す
る方法においては、例えば、上記ラベル化試薬の存在下
で、前記タンパク質をコードするコーディング領域をＴ
７等のウイルスや細胞に由来するプロモーター領域の制
御下に連結し、これを転写することによりmRNAを合成す
る。該コーディング領域ＤＮＡとしては、ラベル化の効
率が数十倍よくするためにストップコドンを削除した配
列が好ましく用いられる。また、それ自体既知の方法で
生体から取得されたｍRNAを用いることもできる。これ
らのmRNAは、翻訳系で発現させてタンパク質合成を行わ
せることにより調製することができる。

【００３１】用いられる翻訳系としては、無細胞翻訳系
又は生細胞などが挙げられる。無細胞翻訳系又は生細胞
などは、その中にタンパク質をコードする核酸を添加又
は導入することによってタンパク質合成が行われるもの
である限り制限されない。無細胞翻訳系としては、原核
又は真核生物の抽出物により構成される無細胞翻訳系、
例えば大腸菌、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽抽出物など
が使用できる。生細胞翻訳系としては、原核又は真核生
物、例えば大腸菌の細胞などが使用できる。無細胞翻訳
系を用いる場合、用いる核酸がＤＮＡである場合、それ
自体既知のＲＮＡポリメラーゼなどを用いる方法により
転写して合成したＲＮＡを鋳型として導入する。

【００３２】この翻訳系において、ラベル化試薬を適当
な濃度で存在させることにより、タンパク質のＣ末端を
ラベル化試薬で標識することができる。存在させるラベ
ル化試薬の濃度としては、実際に用いるラベル化試薬、
核酸、あるいは翻訳系によって異なるが、一般的には最
終濃度が０．１〜２００μＭの範囲が好ましい。

【００３３】本発明で用いる標識物質および親和性物質
又は共有結合形成性反応基が結合した核酸誘導体の濃度
としては、実際に使用するRNA、ラベル物質、核酸誘導
体、及び翻訳系等によって異なるが、下記の方法等によ
り当業者は該濃度を適宜決定することができる。即ち、
上記したＣ末端ラベル化タンパク質を作成する系におい
て、ラベル物質が結合した核酸誘導体を濃度を違えて添
加し、得られた翻訳産物をＳＤＳポリアクリルアミド電
気泳動を用いる等して分離し、Ｃ末端に結合している標
識物質より発せられる信号強度を測定し、最も信号強度
の高い値を示した濃度を選択する。

【００３４】このようにして合成されたＣ末端ラベル化
タンパク質は、翻訳系に生細胞を用いた場合は細胞をそ
れ自体既知の方法で溶解後、ゲル濾過など（例えば、Bi
o-Spin 6；BIO-Rad社製）によって未反応のラベル化試
薬を除去し、取得することができる。また、無細胞翻訳
系を用いた場合には、ゲル濾過によって未反応のラベル
化試薬を除去すればよい。

【００３５】本発明の方法で製造されたＣ末端ラベル化
タンパク質を固相に結合させる場合があるが、固相に結
合させる方法としては、親和性物質又は共有結合形成性
反応基を介して結合させることが好ましい。本発明で用
いる親和性物質又は共有結合形成性反応基は、特定のポ
リペプチドに特異的に結合する分子であり、固相表面に
は該分子と結合する特定のポリペプチドを結合させる。
ここで言う「特定のポリペプチド」としては、結合タン
パク質、受容体を構成する受容体タンパク質、抗体など
も含まれる。

【００３６】固相に結合された特定のポリペプチド／親
和性物質又は共有結合形成性反応基の組み合わせとして
は、例えば、アビジン及びストレプトアビジン等のビオ
チン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパ
ク質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチ
ド、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバル
ト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ
ーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合タンパク質／ＤＮＡ、
抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カル
モジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴ
Ｐ、あるいはエストラジオール受容体タンパク質／エス
トラジオールなどの、各種受容体タンパク質／そのリガ
ンド、並びにケトン基／ヒドラジド基、ジオール基／ヒ
ドラジド基、アジド基／アルキル基、ソラレン／核酸塩
基（ピリミジン環又はプリン環などの核酸塩基またはそ
のアナログ）などが挙げられる。

【００３７】これらの中で、アビジン及びストレプトア
ビジンなどのビオチン結合タンパク質、マルトース結合
タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニ
ッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン
−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、抗体／抗原
分子（エピトープ）などが好ましく、特にストレプトア
ビジン／ビオチンの組み合わせが最も好ましい。これら
の結合タンパク質は、それ自体既知のものであり、該タ
ンパク質をコードするＤＮＡは既にクローニングされて
いる。

【００３８】上記した特定のポリペプチドの固相表面へ
の結合は、それ自体既知の方法を用いることができる
が、具体的には、例えば、タンニン酸、ホルマリン、グ
ルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジア
ゾ化ベンジゾン、トルエン-2,4-ジイソシアネート、ア
ミノ基、カルボキシル基、又は水酸基あるいはアミノ基
などを利用する方法を用いることができる。

【００３９】親和性物質又は共有結合形成性反応基以外
の部分により固相に結合させる場合は、通常はタンパク
質を固相に結合させるのに用いられる既知の方法、例え
ばタンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピル
ビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエ
ン-2,4-ジイソシアネート、アミノ基、カルボキシル
基、又は水酸基あるいはアミノ基などを利用して行うこ
とができる。

【００４０】さらに本発明では、上記した本発明のＣ末
端ラベル化タンパク質の多数を固相に結合することによ
り、タンパク質の集合体を含むプロテインチップを構築
することができる。このようなプロテインチップはタン
パク質と標的分子との間の分子間相互作用を解析する際
に有用である。

【００４１】（３）本発明のラベル化試薬の利用本発明のラベル化試薬を用いることにより、一分子中に
一分子の標識物質と一分子の親和性物質又は共有結合形
成性反応基とを有するタンパク質（本明細書中、Ｃ末端
ラベル化タンパク質とも称する）を調製することができ
る。このようなタンパク質を利用することにより、当該
タンパク質と標的分子との間の相互作用を分析すること
ができる。具体的には、例えば、下記の工程を含む方法
が提供される。（ａ）一分子中に一分子の第１の標識物質と一分子の親
和性物質又は共有結合形成性反応基とを有するタンパク
質と、第２の標識物質で標識した標的分子とを接触させ
る工程；及び（ｂ）上記タンパク質又は核酸と相互作用
した標的分子中の第２の標識のシグナルを検出する工
程；

【００４２】上記で言う標的分子とは、Ｃ末端ラベル化
タンパク質と相互作用する分子を意味し、具体的にはタ
ンパク質、核酸、糖鎖、低分子化合物などが挙げられ
る。タンパク質としては、Ｃ末端ラベル化タンパク質と
相互作用する能力を有する限り特に制限はなく、タンパ
ク質の全長であっても結合活性部位を含む部分ペプチド
でもよい。またアミノ酸配列、及びその機能が既知のタ
ンパク質でも、未知のタンパク質でもよい。これらは、
合成されたペプチド鎖、生体より精製されたタンパク
質、あるいはｃＤＮＡライブラリー等から適当な翻訳系
を用いて翻訳し、精製したタンパク質等でも標的分子と
して用いることができる。合成されたペプチド鎖はこれ
に糖鎖が結合した糖タンパク質であってもよい。これら
のうち好ましくはアミノ酸配列が既知の精製されたタン
パク質か、あるいはｃＤＮＡライブラリー等から適当な
方法を用いて翻訳、精製されたタンパク質を用いること
ができる。

【００４３】核酸としては、Ｃ末端ラベル化タンパク
質と相互作用する能力を有する限り、特に制限はなく、
ＤＮＡあるいはＲＮＡも用いることができる。また、塩
基配列あるいは機能が既知の核酸でも、未知の核酸でも
よい。好ましくは、タンパク質に結合能力を有する核酸
としての機能、及び塩基配列が既知のものか、あるいは
ゲノムライブラリー等から制限酵素等を用いて切断単離
してきたものを用いることができる。

【００４４】糖鎖としては、Ｃ末端ラベル化タンパク
質と相互作用する能力を有する限り、特に制限はなく、
その糖配列あるいは機能が、既知の糖鎖でも未知の糖鎖
でもよい。好ましくは、既に分離解析され、糖配列ある
いは機能が既知の糖鎖が用いられる。

【００４５】低分子化合物としては、Ｃ末端ラベル化
タンパク質と相互作用する能力を有する限り、特に制限
はない。機能が未知のものでも、あるいはタンパク質に
結合する能力が既に知られているものでも用いることが
できる。

【００４６】これら標的分子がＣ末端ラベル化タンパク
質と行う「相互作用」とは、通常は、タンパク質又は核
酸と標的分子間の共有結合、疎水結合、水素結合、ファ
ンデルワールス結合、及び静電力による結合のうち少な
くとも１つから生じる分子間に働く力による作用を示す
が、この用語は最も広義に解釈すべきであり、いかなる
意味においても限定的に解釈してはならない。共有結合
としては、配位結合、双極子結合を含有する。また静電
力による結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有す
る。また、上記作用の結果生じる結合反応、合成反応、
分解反応も相互作用に含有される。

【００４７】相互作用の具体例としては、抗原と抗体間
の結合及び解離、タンパク質レセプターとリガンドの間
の結合及び解離、接着分子と相手方分子の間の結合及び
解離、酵素と基質の間の結合及び解離、核酸とそれに結
合するタンパク質の間の結合及び解離、情報伝達系にお
けるタンパク質同士の間の結合と解離、糖タンパク質と
タンパク質との間の結合及び解離、あるいは糖鎖とタン
パク質との間の結合及び解離が挙げられる。

【００４８】標的分子は通常、標識物質により標識して
用いる。標的分子の標識に用いる標識物質は、Ｃ末端ラ
ベル化タンパク質又はラベル化核酸の標識に用いた標識
物質とは異なる標識物質を使用する。

【００４９】標識物質は、通常は蛍光性物質などの非放
射性標識物質から選択される。蛍光物質としては、フリ
ーの官能基（例えばカルボキシル基、水酸基、アミノ基
など）を持ち、タンパク質、核酸等の上記標的物質と連
結可能な種々の蛍光色素、例えばフルオレセイン系列、
ローダミン系列、エオシン系列、ＮＢＤ系列などのいか
なるものであってもよい。その他、色素など標識化可能
な化合物であれば、その化合物の種類、大きさは問わな
い。蛍光物質としては、具体的には、Ｃｙ５（アマシャ
ム）、Ｃｙ３（アマシャム）、ＩＣ５（同仁化学）、Ｉ
Ｃ３（同仁化学）、フルオレセイン、テトラメチルロー
ダミン、テキサスレッド、アクリジンオレンジなどが挙
げられる。また、標識物質としては化学発光物質（例え
ば、ルミノール、アクリジニウム−Ｉなど）を使用して
もよい。

【００５０】上記標識物質の標的分子への結合は、それ
自体既知の適当な方法を用いて行うことができる。具体
的には、例えば、標的分子がタンパク質の場合、上記
（１）に記載したＣ末端を標識化する方法等を用いるこ
とができる。また標的分子が核酸の場合は、予め標識物
質を共有結合などで結合させたオリゴＤＮＡプライマー
を用いたＰＣＲを行う方法などによって簡便に標識化す
ることができる。

【００５１】上記した分析方法では、上記工程（ａ）に
先立って、固相に固定化されたタンパク質の量を、エバ
ーネッセント光を用いて、当該第１の標識物質のシグナ
ルを指標として定量する工程を含むことが好ましい。ま
た、当該分析方法では、工程（ｂ）で検出された第２の
標識のシグナル強度と、予め定量化しておいた固相に固
定化されたタンパク質の量とを用いて、エバーネッセン
ト光を用いて当該固定化タンパク質の単位量当たりのシ
グナル強度を測定することにより、分子間の相互作用の
強度を定量化する工程を含むことが好ましい。このよう
な好ましい態様においては、タンパク質と標的分子との
間の分子間相互作用を比較的簡単に定量化することが可
能になる。

【００５２】このような分析方法では、標的分子に標識
されている第２の標識物質の検出方法は特に限定されな
いが、例えば、蛍光イメージングアナライザー法を用い
て検出することができる。蛍光イメージングアナライザ
ー法は、固相化された分子に、標識化分子を接触せし
め、両分子の相互作用により、固相化された分子上にと
どまった標識化分子から発せられる蛍光を、市販の蛍光
イメージングアナライザーを用いて測定又は解析する方
法である。

【００５３】この方法を用いてタンパク質−分子間相互
作用の測定又は解析を行う場合、Ｃ末端ラベル化タンパ
ク質又はラベル化核酸を固相化しておき、標識物質で標
識した標的分子をそれに接触させる。Ｃ末端ラベル化タ
ンパク質又はラベル化核酸を固相化するための基盤とし
ては、通常タンパク質や核酸等を固定化するのに用いら
れるニトロセルロースメンブレンやナイロンメンブレ
ン、あるいはプラスチック製のマイクロプレート等も用
いることができる。

【００５４】標識した標的分子を固相化分子へ接触せし
める方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度
に接触する方法であればいかなるものであってもよい
が、好ましくは標識した標的分子を生化学的に通常使用
される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液を作成し、こ
れを固相表面に接触させる方法が好ましい。両分子を接
触せしめた後、好ましくは過剰に存在する標識した標的
分子を同緩衝液等により洗浄する工程を行い、固相上に
とどまった標的分子の標識物質から発せられる信号（蛍
光信号）を、市販のイメージングアナライザーを用いて
測定あるいは解析することにより、固相化された分子と
相互作用する分子を同定することができる。

【００５５】この方法において、同時に多数の解析を行
う方法としては、例えば上記固相表面に、複数のＣ末端
ラベル化タンパク質を番地付けして固相化する方法、あ
るいは１種類のＣ末端ラベル化タンパク質に複数種の標
識化標的分子を接触させる方法等が用いられる。

【００５６】上記方法により、Ｃ末端ラベル化タンパク
質と相互作用することが認められた標的分子は、該分子
の一次構造が未知の場合、それ自体既知の適当な方法に
より、その一次構造を解析することができる。具体的に
は、相互作用を認められた標的分子がタンパク質の場
合、アミノ酸分析装置等によりアミノ酸配列を解析し、
一次構造を特定することができる。また、標的分子が核
酸の場合には、塩基配列決定方法により、オートＤＮＡ
シーケンサーなどを用いれば塩基配列を決定することが
できる。これにより標的分子を同定することができる。

【００５７】

【実施例】以下の実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明は実施例によって限定されることは
ない。実施例１：１分子ラベル法と１分子イメージング法を用
いたキネシン分子と微小管分子の相互作用解析（１）Cy５？puroの合成ピューロマイシン２塩酸塩（和光純薬工業）250 mgを30
mlの0.3 M炭酸ナトリウム-0.2 M炭酸水素ナトリウム-
2.0 M塩化ナトリウム水溶液（水溶液A）と20 mlの塩化
メチレンに溶かし、撹拌したのち有機層を分離した。水
層に塩化メチレン（20 ml）を加えて再度分液し、有機
層を合わせてエバポレーターで濃縮したのち、少量のピ
リジンを加えて濃縮する操作を２回繰り返し、得られた
固体をアセトニトリル（5 ml）とピリジン（2.5 ml）に
溶解した。無水トリフルオロ酢酸1.0 gを加えて室温で3
0分撹拌したのち氷冷して水5 mlを加え、さらに20 mlの
水溶液Aを徐々に加えた。塩化メチレン（20 ml）で２回
抽出し、得られた有機層を濃縮してからピリジンを加え
て濃縮する操作を２回繰り返し、粗Nα-trifluoroacety
l-puromycin（250 mg）を得た。

【００５８】粗Nα-trifluoroacetyl-puromycin（250 m
g）をピリジン5 ml中で1.5等量の塩化ジメトキシトリチ
ルと室温で１時間反応させ、水と塩化メチレンで分液し
て有機層を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ
ー（移動層；酢酸エチル/ヘキサン/ピリジン 90:10:0.
5）でNα-trifluoroacetyl-5'-dimethoxytrityl puromy
cinを精製した（収量360 mg）。

【００５９】この全量をピリジン3 mlに溶かし、3等量
の無水コハク酸と10 mgのジメチルアミノピリジン（DMA
P）を加えて室温で２日間撹拌したのち水と酢酸エチル
で分液して有機層を濃縮し、酢酸エチルを移動相として
12 gのシリカゲルに通して目的物のコハク酸エステルを
精製した（収量380 mg）。コハク酸エステルと1.1等量
のN-ヒドロキシコハク酸をジメチルホルムアミド（DM
F）に溶かし、氷浴中で1.1等量のジシクロヘキシルカル
ボジイミドのDMF溶液を加え、室温に戻しつつ１６時間
撹拌した。生じた沈殿物を濾去したのち濾液をNovaSyn
TG amino resin (novabiochem) と触媒量のDMAPを加え
たDMF懸濁液に加えて室温で１６時間撹拌した。グラス
フィルターでレジンを集め、DMF、メタノール、酢酸エ
チルで洗ってから真空ポンプで乾燥したのち、未反応の
レジンのアミノ基をDNA合成における通常のキャッピン
グ法でアセチル化した。得られたピューロマイシンレジ
ンの１部から通常の脱保護法によりピューロマイシンを
遊離させて定量したところ、67μmol／gram resinと計
算された。

【００６０】調製したピューロマイシンレジン10 μmol
相当を固相合成用の反応容器に入れ、ホスホアミダイト
法によりAc-dC-CE ホスホアミダイト（25等量）、5'-ア
ミノ修飾 5（10等量）（共にグレンリサーチ）を順次結
合させた。キャップ反応を省略した他は通常のホスホア
ミダイト法の合成サイクルに従い、デブロック液、アク
チベーター溶液、酸化溶液はすべてグレンリサーチ社製
のものを用いた。5'末端のモノメトキシトリチル基を外
してから濃アンモニア水を加え室温で６時間放置して脱
保護した。抽出した溶液を濃縮し、水で希釈してから氷
浴中で30％酢酸を徐々に加えて中和したあと凍結乾燥
し、得られた固体を逆相高速液体クロマトグラフィー
（HPLC）で精製した。カラムはCOSMOSIL ODS AR-300（2
0 mm x 250 mm）（ナカライ）を用い、0.1 M トリエチ
ルアミン水溶液と80％アセトニトリル-0.02 M トリエチ
ルアミン水溶液のリニアグラジエントで溶出した。目的
物であるアミノリンク-dC-ピューロマイシンが約6 micr
omol得られた。(MS; ESI 927.6 [M-H])

【００６１】Cy5 Monofunctional Dye（アマシャムファ
ルマシアバイオテク）１チューブに50μｌのDMF を加
え、その直後にアミノリンク-dC-ピューロマイシン80 n
molを0.15 M炭酸ナトリウム緩衝液（pH 9.0）100 μｌ
に溶かした溶液を加え、時々撹拌しつつ室温で１時間放
置した。Shim-Pack CLC-ODS（4.6 mm x 250 mm）（島津
製作所）と前記の溶媒系を用いた逆相HPLCでCy5-Puroを
精製した。ラベルは5'末端のアミノ基で優先的に進行し
たと考えられ、Nα位のアミノ基がラベルされた生成物
は検出されなかった。

【００６２】（２）Kinesin DNAの調製 NcoIとSacIの制限酵素部位を両端にもつKinesin断片
は、C末端側を欠いたkinesinをコードしたpUC8ベクター
（phskinZ）を鋳型として、配列番号１に記載の塩基配
列を有するプライマーと配列番号２に記載の塩基配列を
有するプライマーとを用いてPCRを行った。得られたPCR
産物を精製後、制限酵素NcoIとSacIで３７℃で１６時間
反応後、短い断片をPrimer Remover(Edge BioSysytemC
o.)で除去し精製した。一方、pCITE-2a-c(+)(Clonetech
Co)を制限酵素NcoIとSacIで同じ条件下で切断し、精製
した。これらをLigation High(TOYOBO.Co)を用いて、16
℃で1.5時間ライゲーション反応させたものをサブクロ
ーンして、シーケンスにより確認した。

【００６３】（３）転写および翻訳直鎖状化したKinesin DNAplasmidを最終濃度10 nMにな
るようにTransriptionMix(Invitrogene)に加え,15分間3
0℃で反応した。Translation Mix (Invitrogene) 30 μ
lとCy5-puro（最終濃度 30μM）を加え、１時間反応す
ることで翻訳されるとともに、C末端に特異的に一分子
のCy5-puroを結合されたkinesin(Cy5-puro-kinesin)が
得られる。翻訳されたサンプルを7.5\%アクリルアミド
ゲルでSDS-PAGEにより分離し、染色せずにFluorImager
(BioRad Co)の530DF30 band-passfilterでバンドを可視
化した。

【００６４】（４）Cy5-puroキネシンの精製 NAP5(ファルマシア)(30mM KCl, 80mM PIPES, 2mM MgC
l₂, 1mM EGTA, 1mM DTTのバッファーで平衡化)でゲルろ
過し、Sample内のフリーのCy5-puroを取り除いた。

【００６５】（５）１分子イメージング石英ガラスに、Biotin化BSAを介してStreptavidinを固
定し,そこに部分的にBiotin化したMicrotubule（豚脳か
ら抽出しTMR-SEで染色したもの）を結合させる。Cy5-pu
ro-kinesinの非特異的な吸着を防ぐため、ガラス面を1m
g/mlCasein(Sigma)でコートした後、NAP5でゲルろ過し
たKinesin sampleをAssayBuffer（80mM PIPES, 2mM MgC
l2, 1mM EGTA）で1/200に薄め、酵素系（10mM DTT, Cat
arase, Glucose, Glucose Oxidase）、Methylcellcose
(finel 0.3\%), 2mM ATP, 2mM MgCl ₂のもとで全反射顕
微鏡(TIRF)を用いてKinesinと微小管の相互作用を直接
観察した（23〜25℃）。画像はビデオに録画し、後
に、画像ボードでパソコンにとりこみHalcon5.2で、微
小管上を動く輝点の速度および蛍光強度を計測した。

【００６６】（６）相互作用観察 Gelろ過したサンプルをbufferで200倍にうすめ、TIRF顕
微鏡で観察した。結果を図３に示す。図３において、一
分子のCy5-puro-kinesinは輝点として明確に見分けるこ
とができる。2mM AMP-PNP存在下では、微小管に沿って
一定方向に運動するCy5-puro-kinesinの輝点が観察され
た（図３）。

【００６７】実施例２：蛍光色素Cy5とビオチンを有す
るピューロマイシン誘導体（Cy5-biotin-puro）の合成
とそれによるタンパク質のラベル化（１）化学合成実施例１と同様の方法でピューロマイシンレジン（7.5
μmol相当）にAc-dC-CEホスホアミダイト（ピューロマ
イシンに対し30等量使用）、ビオチン TEG ホスホアミ
ダイト（同6等量）、5'-アミノ修飾 C6（40等量）（３
つともグレンリサーチ社製）を順次反応させた。5'末端
のモノメトキシトリチル基を残したまま室温で濃アンモ
ニア水による脱保護を行い、エバポレーターで濃縮した
のち氷浴中で80％酢酸を徐々に加えて最終脱保護をし
た。実施例１のアミノリンク-dC-ピューロマイシンとほ
ぼ同じ条件で精製してアミノリンクービオチンーdC？ピ
ューロマイシンを得た。 MS; MALDI 1509.2[M+H]⁺

【００６８】実施例１のCy5-Puroの合成の場合と同様の
方法で、Cy5 Monofunctional Dye（アマシャムファルマ
シアバイオテク）による蛍光ラベルと精製を行なった。
得られた蛍光色素Cy5とビオチンを有するピューロマイ
シン誘導体（Cy5-biotin-puro）の構造式を図４に示
す。

【００６９】（２）GFP mRNAの調製上記で合成したCy5-biotin-puroが無細胞翻訳系におい
て実際にタンパク質に取り込まれるかどうかを確認する
ために，タンパク質として分子量約27,000のGreen Fluo
rescent Protein (GFP)を選んで取り込みの試験を行っ
た。GFPとしては伊藤らが見い出したGFPuv4と称される
もの（Ito, Y. et al., Biochemical and Biophysical
Research Communication 264, 556-560, (1999)）を用
い、488nmのレーザー光でも容易に励起されてイメージ
アナライザーで確認できるようにした。このGFPの上流
にT'7プロモーター領域及びKozak配列を有するＤＮＡ構
築物を以下の通り作成した。T'7プロモーター領域及びK
ozak配列をもったＤＮＡ（配列番号３）を鋳型ＤＮＡと
する。この鋳型の5'側の配列を含むプライマー（配列番
号４）と３’側の相補鎖の一部とGFPの５’側の相補鎖
配列を含むプライマー（配列番号５）とを用いてＰＣＲ
を行った。ＰＣＲの条件は、95℃で20秒、68℃で20秒及
び72℃で20秒のサイクルを２５サイクルとし、EX Taqポ
リメラーゼ（Takara）を用いて行った。

【００７０】次に、GFPuv4をコードするプラスミドを鋳
型として、配列番号６に記載の塩基配列を有するプライ
マーと配列番号７に記載の塩基配列を有するプライマー
とを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は95℃で20
秒、68℃で20秒及び72℃で30秒のサイクルを３０サイク
ルとし、EX Taqポリメラーゼ（Takara）を用いて行っ
た。

【００７１】これらのＰＣＲ産物はフェノール抽出後、
プライマーリムーバー（Edge Biosystem）を用いてエタ
ノール沈澱を行い精製した。これらのＤＮＡテンプレー
トを各々等モル加えて、配列番号４の塩基配列を有する
プライマー及び配列番号７の塩基配列を有するプライマ
ーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、95℃で20
秒、68℃で20秒及び72℃で40秒のサイクルを３０サイク
ルとし、EX Taqポリメラーゼ（Takara）を用いて行っ
た。これらのＰＣＲ産物はフェノール抽出後、プライマ
ーリムーバー（Edge Biosystem）を用いてエタノール沈
澱を行い精製した。精製したDNAはRiboMAX（Promega）
を用いて転写し翻訳用のmRNAとした。

【００７２】（３）無細胞翻訳系を用いたラベル化 T7プロモーターをもつGFPのmRNAと、上記の方法で合成
したCy5-biotin-puroとを最終濃度がそれぞれ２０μMと
４０μMになるように小麦胚芽無細胞翻訳系に加え、２
６℃で１時間反応させた。比較用として、Cy5-biotin-p
uroの代わりにCy5-dC-Puroを用いた実験も行った。これ
らの反応物を１５％SDS？アクリルアミド電気泳動で分
離した後，蛍光イメージアナライザーMolecular Imager
(Bio-Rad社)で確認した。結果を図５に示す（図５中で
は、Cy5-dC-Puroを用いて得た結果をCy5-Puroと記
す）。図５に示す通り、Cy5-dC-Puroを用いた場合に比
べ、Cy5-biotin-puroを用いた場合には極めて効率よく
ラベルできることが確認された。

【００７３】実施例３：Cy5-biotin-puroの支持体（ス
トレプトアビジンメンブレン又はストレプトアビジンス
ライドガラス）への固定化（１）固定化の比較実施例２で合成したCy5-biotin-puro、又は比較用とし
てビオチンを有さないCy5-puroを各々、２０mM（pH 8.
0）のトリスバッファーに溶解し、５００μM、 100μ
M、及び10μMの濃度に調整した。各溶液５０μlをスト
レプトアビジンメンブレン（プロメガ社）上にスポット
し、２０分静置した。次いで、２０mM（pH 8.0）のトリ
スバッファーで１０回ほど洗浄し、その後、蛍光イメー
ジアナライザーMolecular Imager(Bio-Rad社)で確認し
た。結果を図６に示す。

【００７４】同様に、ストレプトアビジンスライドガラ
ス（グライナー社）にも100μMのCy5-biotin-puroとCy5
-puroをそれぞれ５０μlスポットし、１時間静置した。
次いで、洗浄した後、蛍光イメージアナライザーMolecu
lar Imager(Bio-Rad社)で確認した。結果を図６に示
す。

【００７５】その結果、Cy5-puroよりもCy5-biotin-pur
oの方が、ストレプトアビジンメンブレン又はストレプ
トアビジンスライドガラスに特異的に結合できることが
確認できた。

【００７６】例えば，図６におけるFluorpuroとFluor-b
iotin-puroのストレプトアビジンメンブレンへの固定化
率は、2回の洗浄後，Fluorpuroは１５％に対しFluor-bi
otin-puroは８８％であった。また、スライドガラスへ
の固定化量は，Fluor-biotin-puroはFluorpuroの約３．
５倍であった。即ち、Fluor-biotin-puroのスライドガ
ラスへの固定化は、非特異的な吸着を考慮しても十分に
特異的結合であることがわかる。

【００７７】従って上記のようなコントロールを取得す
ることにより、実施例２で調製したようなCy5-biotin-p
uroでＣ末端をラベル化したタンパク質をストレプトア
ビジンでコートした支持体に固定化した場合でも、固定
化された該タンパク質の個数を定量的に測定することが
可能になる。

【００７８】実施例４：エバーネッセント光によるビオ
チン結合蛍光分子（ビオチン及び蛍光物質で標識したＤ
ＮＡ）の定量化（１）ビオチン及び蛍光物質で標識したＤＮＡの合成 Oct1のPou？specific domain (Nature vol.362 852-85
5, 1993)と相互作用するＤＮＡ配列を含み，かつ５’側
をビオチン化した一本鎖ＤＮＡ（配列番号８）と、その
相補配列を有し、かつ５’側をTAMRA(5-carboxytetrame
thylrhodamine)で標識化した一本鎖ＤＮＡ（配列番号
９）を各々、ＤＮＡ合成機を用いて３’側から日本製粉
に依頼して合成した。逆相簡易カラムで精製したものを
用いた。これをpH6.8（80mM Pipes, 2mM MgCl₂, 1mM EG
TA）のバッファーに溶解後，６０℃でアニーリングし，
２本鎖ＤＮＡにして以下の実験に用いた。

【００７９】（２）ビオチン及び蛍光物質で標識したＤ
ＮＡの石英ガラスへの固定化と定量ビオチン及び蛍光物質で標識したＤＮＡの濃度が低濃度
(50〜300pM)の場合と、高濃度(1.5〜15nM)の場合の各々
についてガラスに固定化される程度を観察した。Biotin
BSA、Streptavidin、Oct１結合ＤＮＡの順で石英ガラ
スに流し、エバーネッセント光で観察した。

【００８０】測定の具体的方法は，以下の通りである。（低濃度の場合）図７の（１）の５枚の図はそれぞれ15
0×150Pix（約２３×２３μｍ）を６０フレーム（約２
秒間）にわたって平均化した。非特異的なビオチン及び
蛍光物質で標識したＤＮＡの結合はStreptavidinがない
条件下で調べた。

【００８１】（高濃度の場合）一分子が観察できる条件
で見るとビオチン及び蛍光物質で標識したＤＮＡが３０
０pM以上では画面が真っ白になるので、ゲージを下げて
観察した。ダイナミックレンジが狭いため同じ観察条件
では、濃度を１０倍までしかあげられなかった。それで
も、濃度が高くなるに従い画面が明るくなる様子が観察
された。

【００８２】上記した測定の結果から、次のことが確認
できた。流したビオチン及び蛍光物質で標識したＤＮＡ
の濃度に従ってガラス面に吸着するビオチン及び蛍光物
質で標識したＤＮＡの数も増える。５０pM、100pM及び3
00pMとビオチン及び蛍光物質で標識したＤＮＡの濃度が
濃いものをガラス面上に流すと輝点の数（固定された分
子数）も約３０、約６０、約１８０と比例して増加する
ことが確認できた。一方、コントロールとしてstreptav
idinをガラス面上に固定していない場合は、そのような
増加は確認できなかった。従って、ビオチン及び蛍光物
質で標識したＤＮＡについた一分子のTAMRAの蛍光が観
察出来ることが分かる。

【００８３】

【発明の効果】本発明により、標識すべき標的タンパク
質一分子に対して一分子の標識物質と一分子の親和性物
質又は共有結合形成性反応基を導入することを可能にす
るタンパク質のラベル化試薬を提供することが可能にな
った。本発明のラベル化試薬を利用してＣ末端を標識し
たタンパク質を用いて標的分子との分子間相互作用を解
析することにより、当該相互作用を迅速かつ定量的に測
定することが可能になる。

【００８４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> GenCom <120> An agent for labeling a protein <130> A01555MA <160> 9

【００８５】 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 1 tgataatacc atggccgcgg aacgagagat tc 32

【００８６】 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 2 ctatggagct cttgctggca tccgtgccag c 31

【００８７】 <210> 3 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 3 gatcccgcga aattaatacg actcactata gggagaccac aacggtttcc ctctagaaat 60 aattttgttt aactttaaga aggagatgcc accatggttg agccccgcat 110

【００８８】 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 4 gatcccgcga aattaatacg actcactata ggg 33

【００８９】 <210> 5 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 5 agatccgccg ccacccatct ccttcttaaa gttaaacaaa att 43

【００９０】 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 6 ggtggcggcg gatctatgag taaaggagaa gaacttttca 40

【００９１】 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 7 tttgtagagc tcatccatgc catgtgtaat cc 32

【００９２】 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 8 ccagggtatg caaattatta agggcaaaaa 30

【００９３】 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 9 tttttgccct taataatttg cataccctgg 30

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、１分子イメージングによる結合タンパ
ク質の検出の模式図を示す。

【図２】図２は、標的分子と相互作用する道遺伝子を同
定する手法の模式図を示す。

【図３】図３は、１分子ラベル法と１分子イメージング
法を用いたキネシン分子と微小管分子の相互作用を解析
した結果を示す。

【図４】図４は、蛍光色素Cy5とビオチンを有するピュ
ーロマイシン誘導体（Cy5-biotin-puro）の構造式を示
す。

【図５】図５は、蛍光色素Cy5とビオチンを有するピュ
ーロマイシン誘導体（Cy5-biotin-puro）によるタンパ
ク質のラベル化の結果を示す。

【図６】図６は、Cy5-biotin-puroの支持体（ストレプ
トアビジンメンブレン又はストレプトアビジンスライド
ガラス）への固定化実験の結果を示す。

【図７】図７は、エバーネッセント光によるビオチン結
合蛍光分子（ビオチン及び蛍光物質で標識したＤＮＡ）
の定量化を行った結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｚ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＦターム(参考） 2G045 AA40 BB20 DA12 DA13 DA36 DA80 FA11 FB03 FB04 FB05 FB06 FB07 FB12 FB14 FB15 FB17 FB20 GC15 GC22 GC30 HA09 HA20 JA01 JA20 4B024 AA20 CA04 CA12 EA04 FA10 HA03 HA19 4C057 BB02 DD01 LL09 LL30 LL41 LL44 LL46 MM05 4H045 AA20 BA70 EA50 FA30 FA51

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】タンパク質のＣ末端に結合する能力を有
する物質一分子に対して一分子の標識物質と一分子の親
和性物質又は共有結合形成性反応基とが結合して成る、
タンパク質のラベル化試薬。
【請求項２】標識物質と親和性物質又は共有結合形成
性反応基がそれぞれスペーサーを介して、タンパク質の
Ｃ末端に結合する能力を有する物質に結合している、請
求項１に記載のラベル化試薬。
【請求項３】一般式：Ｘ−（Ｌ¹）_m−Ａ−（Ｌ²）_n−
Ｙ（式中、Ｘは標識物質の残基を示し、Ｙは親和性物質の
残基又は共有結合形成性反応基を示し、Ｌ¹およびＬ²は
それぞれ独立に２価のスペーサ基を示し、ｍおよびｎは
それぞれ独立に０又は１の整数を示し、Ａはタンパク質
のＣ末端に結合する能力を有する物質の残基を示す）で
表される化合物から成る請求項１又は２に記載のラベル
化試薬。
【請求項４】標識物質が蛍光物質である、請求項１か
ら３の何れかに記載のラベル化試薬。
【請求項５】親和性物質が、ビオチン、マルトース、
グアニンヌクレオチド、金属イオン、グルタチオン、タ
ンパク質結合性ＤＮＡ、抗原分子、カルモジュリン結合
ペプチド、ＡＴＰ、及びエストラジオールからなる群よ
り選ばれる物質であり、共有結合形成性反応基がケトン
基、ジオール基、アジド基又はソラレンである、請求項
１から４の何れか１項に記載のラベル化試薬。
【請求項６】タンパク質のＣ末端に結合する能力を有
する物質が、ピューロマイシン、3’−Ｎ−アミノアシ
ルピューロマイシンアミノヌクレオシド、又は3’−Ｎ
−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドのいずれ
かの化学構造骨格を含む化合物又はそれらの類縁体であ
る、請求項１から５の何れか１項に記載のラベル化試
薬。
【請求項７】請求項１から６の何れか１項に記載のタ
ンパク質のラベル化試薬の存在下においてタンパク質を
コードする核酸を用いて転写・翻訳系においてタンパク
質合成を行う工程を含む、タンパク質のＣ末端を標識す
る方法。
【請求項８】一般式：Ｘ−（Ｌ¹）_m−Ａ−（Ｌ²）_n−
Ｙ（式中、Ｘは標識物質の残基を示し、Ｙは親和性物質の
残基又は共有結合形成性反応基を示し、Ｌ¹およびＬ²は
それぞれ独立に２価のスペーサ基を示し、ｍおよびｎは
それぞれ独立に０又は１の整数を示し、Ａはタンパク質
のＣ末端に結合する能力を有する物質の残基を示す）で
表される化合物又はその塩。
【請求項９】標識物質が蛍光物質である、請求項８に
記載の化合物又はその塩。
【請求項１０】親和性物質が、ビオチン、マルトー
ス、グアニンヌクレオチド、金属イオン、グルタチオ
ン、タンパク質結合性ＤＮＡ、抗原分子、カルモジュリ
ン結合ペプチド、ＡＴＰ、及びエストラジオールからな
る群より選ばれる物質であり、共有結合形成性反応基が
ケトン基、ジオール基、アジド基又はソラレンである、
請求項８又は９に記載の化合物又はその塩。
【請求項１１】タンパク質のＣ末端に結合する能力を
有する物質が、ピューロマイシン、3’−Ｎ−アミノア
シルピューロマイシンアミノヌクレオシド、又は3’−
Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドのいず
れかの化学構造骨格を含む化合物又はそれらの類縁体で
ある、請求項８から１０の何れか１項に記載の化合物又
はその塩。