WO2007046520A1 - 固定化ピューロマイシン・リンカーを用いたタンパク質のスクリーニング方法 - Google Patents

固定化ピューロマイシン・リンカーを用いたタンパク質のスクリーニング方法 Download PDF

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WO2007046520A1
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WO
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linker
puromycin
protein
mrna
immobilized
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PCT/JP2006/320998
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English (en)
French (fr)
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Naoto Nemoto
Manish Biyani
Original Assignee
National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
Japan Science And Technology Agency
Saitama Small Enterprise Promotion Corporation
Janusys Co., Ltd.
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening a protein that interacts with a target substance, and an immobilized puromycin linker used in this screening method.
  • Protein functional analysis is performed through biochemical functional analysis, for example, analysis of protein-protein interaction and protein-nucleic acid interaction.
  • Methods for analyzing protein-protein interactions include the yeast-to-hyprid method (Chien, CT, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 9578-9582 (1991)), and the phage display method (Smith , GP, Science, 228, pp. 1315-1317 (1985)), GST-fusion protein pull-down method, co-immunoprecipitation method and the like are known. Protein-nucleic acid interactions can be analyzed by electrophoretic mobility shift assay (Revzin, A., et al., Anal. Biochem., 153, 172 (1986)), DN a s e I footprint method
  • the preparation of the mRNA-puromycin conjugate used in the IVV method requires operations such as purification using an RNA purification column, concentration by ethanol precipitation, etc., and the operation is complicated and the recovery rate is high. There was a problem such as low, and it was difficult to achieve high throughput including automation.
  • purifying mRNA-puromycin conjugates using an RNA purification column it is necessary to use an excessive amount of linker to prevent reduction in purification efficiency due to unreacted mRNA. There was also a problem that wasted. Disclosure of the invention
  • the present inventors use an immobilized puromycin linker in which puromycin or a puromycin-like compound is immobilized on a solid phase in protein screening.
  • the present invention includes a protein screening method as shown below, an immobilized puromycin linker, a method for producing an immobilized mRNA-puromycin conjugate using the same, and an mRNA-puromycin-protein linkage. Provide body manufacturing methods.
  • a method for screening a protein that interacts with a target substance is provided.
  • the identification of the protein is performed by analyzing a DNA base sequence prepared by reverse transcription from mRNA of the mRNA-puromycin-linker protein conjugate. the method of.
  • step (d) by synthesizing a DNA corresponding to the mRNA of the mRNA-puromycin-linker-protein conjugate selected in step (c) by reverse transcription and introducing a mutation into the DNA.
  • step (a) A step of obtaining a mutant DNA, preparing an mRNA having a modified sequence using the mutant DNA, and subjecting the mRNA having the modified sequence to step (a):
  • the immobilized puromycin linker is bound via a bond between a solid phase binding site provided in the linker and a solid phase binding site recognition site provided in the solid phase.
  • a method for producing an immobilized mRNA-puromycin / linker conjugate comprising the step of linking mRNA and an immobilized puromycin / linker immobilized on a solid phase.
  • a method for screening a protein that interacts with a target substance is provided.
  • a protein screening apparatus for performing a screening method for a protein that interacts with a target substance, comprising a step of selecting a protein conjugate, wherein the target substance, mRNAZc DNA-puromycin 'linker protein magnetic protein conjugate, The target molecule-bound magnetic substance, reagent and buffer inlet, the used reagent, the buffer and the reaction by-product outlet, mRN AZcDNA-puromycin ⁇ 'linker by magnetic force A protein magnetic conjugate, and a means for recovering the target molecule-bound magnetic substance.
  • Protein screening devices characterized in that it comprises the only reactor.
  • the protein screening method of the present invention has the following effects, for example.
  • immobilized puromycin / linker immobilized mR NA-puromycin 'linker, immobilized mR NA / puromycin / linker-protein conjugate, mR NA-puromycin / linker protein conjugate, etc. It can be obtained in high yield.
  • FIG. 1 is a diagram showing an outline of a protein screening method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing an outline of a method for synthesizing a protein using the immobilized pure mycin linker of the present invention according to an embodiment suitable for automation of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing an outline of a method for selecting and identifying a protein according to an embodiment suitable for automation of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of electrophoresis for examining linkers that were not immobilized in Example 1.
  • FIG. ' is a diagram showing the results of electrophoresis for examining linkers that were not immobilized in Example 1.
  • FIG. 5 shows the results of SDS-PAGE of the DNA-protein conjugate (IVD V virion) obtained in Example 1 and protein synthesis in solution.
  • the present invention relates to a method for screening a protein that interacts with a target substance, which comprises the following steps (a) to (c).
  • the present invention also relates to a screening method for obtaining a protein having enhanced interaction force with a target substance, which further comprises the following step (d) following step (c).
  • step (d) Modified using the mutant DNA obtained by introducing the mutation into the mRNA prepared by reverse transcription from the mRNA-puromycin 'linker-protein conjugate mRNA selected in step (c).
  • step (c) Modified using the mutant DNA obtained by introducing the mutation into the mRNA prepared by reverse transcription from the mRNA-puromycin 'linker-protein conjugate mRNA selected in step (c).
  • step (c) Modified using the mutant DNA obtained by introducing the mutation into the mRNA prepared by reverse transcription from the mRNA-puromycin 'linker-protein conjugate mRNA selected in step (c).
  • mRN.A and immobilized puromycin-linker were ligated and immobilized mRNA-puro.
  • puromycin or a puromycin-like compound (sometimes simply referred to as “puromycin”) is bound to the linker.
  • This conjugate of puromycin and linker is referred to as “purumomycin-linker”.
  • puromycin and the linker are bound to a solid phase.
  • puromycin or puromycin-like compound is a protein that has been translated into mRNA when the immobilized mRNA-puromycin conjugate immobilized on the solid phase is introduced into the translation system to synthesize the protein. It acts as a hinge or connecting part that connects the two. That is, it is known that when a translation system is brought into contact with puromycin bound to mRNA via a linker, an in vitro virus virion is produced in which the mRNA is bound to a protein translated via puromycin. (See Nemo to et al., FEBS Lett. 414, 405 (1997)).
  • Puromycin has a chemical structure similar to aminoacyl tRNA at the 3 'end, and has the following formula (I):
  • This compound has the ability to bind to the C-terminus of the synthesized protein when the protein is synthesized in a translation system.
  • the term “puromycin-like compound” means that the 3 ′ end has a chemical structure similar to that of aminoacyl-tRNA and the protein C synthesized when the protein is synthesized in a translation system. A compound having the ability to bind to the terminal.
  • puromycin-like compounds examples include 3'-N-aminoacylpuromycin aminonucleoside (PANS-amino acid), for example, PANS_Gly, whose amino acid part is glycine, amino acid PAN S—V a 1 with the parin part, PANS—A la with the amino acid part alanine, and other PA NS—amino acid compounds whose amino acid part corresponds to all amino acids.
  • PANS-amino acid 3'-N-aminoacylpuromycin aminonucleoside
  • amino group of 3′-aminoadenosine 3'— N-aminoacyl adenosine amino nucleoside (3'— amino acyl adenosine amino acid, A AN S—amino acid) linked by amide bond formed by dehydration condensation of amino acid, for example, amino acid part AANS—G 1 y with glycine, AANS S Aval with amino acid part Palin, AANS—A 1 a with amino acid part alanine, and other AANS—amino acid compounds with amino acid parts corresponding to all amino acids of all amino acids Can be used.
  • a nucleoside or an ester bond of nucleoside and amino acid can also be used.
  • Puromycin-like compounds preferably used in addition to the above puromycin include lipocytidylpuromycin (r CpPur), deoxydylpuromycin (dCpPur), and doxyuridylpuromycin (dUpPur).
  • r CpPur lipocytidylpuromycin
  • dCpPur deoxydylpuromycin
  • dUpPur doxyuridylpuromycin
  • the linker used in the present invention is a linker for linking mRNA and puromycin or a puromycin-like compound when preparing the mRNA-puromycin-protein conjugate used in the present invention.
  • the linker is mainly used to efficiently incorporate puromycin into a site called A size of ribosome. Therefore, the linker is not particularly limited as long as it has such properties.
  • any linker can be used as long as it can be used in the Invitrovirus method.
  • a spacer having a simple structure with few side chains is preferred.
  • a polynucleotide Those containing as a main skeleton a polyalkylene such as polyethylene, polyalkylene glycol such as polyethylene, polyalkylene glycol such as polyethylene glycol, peptide nucleic acid (PNA), linear substance such as polystyrene, or a combination thereof.
  • the appropriate linking group —NH—, —CO—, — O—, —NHCO—, —CONH—, —NHNH—, 1 (CH 2 ) n — [n is, for example, 1 to 10, preferably 1 to 3], 1 S—, 1 SO—, etc.).
  • the linker of the present invention preferably contains a single-stranded DNA and / or peptide nucleic acid (PNA) as the main skeleton, and as long as the linker functions as described above, it is not a single-stranded DNA and / or a PNA part. In addition, it may have other skeleton parts.
  • PNA peptide nucleic acid
  • PNA unlike DNA and RNA, is a compound with a DNA-like structure that forms a skeleton with peptide bonds instead of phosphate bonds.
  • RNA strands for the portion other than single-stranded DNA and Z or PNA, for example, RNA strands, polyalkylenes such as polyethylene, polyalkylene glycols such as polyethylene glycol, linear substances such as polystyrene, or combinations thereof should be selected. Can do. When these straight chain substances are used in combination, they are appropriately combined with an appropriate linking group (one NH—, —CO one, — O—, —NHCO—, one CONH—, —NHNH—, — (CH 2 ) n — [n is, for example, 1 to 10, preferably 1 to 3, 1 S—, 1 SO—, etc.].
  • the linker of the present invention is preferably 10 to 601116 1 considering the reactivity in various reaction steps and the purification efficiency of the resulting mRNA-protein complex (in vitro virus virion). *, More preferably 10 to 45 me r, more preferably It has a length of 15-3 Ome r.
  • the linker of the present invention can be prepared using a known chemical synthesis method.
  • the linker of the present invention is preferably provided with a solid phase binding site for binding the puromycin 'linker to the solid phase.
  • the linker of the present invention includes a pair of cleavages at positions sandwiching the solid-phase binding site in order to remove the mRNA-puromycin linker (protein) conjugate from the solid phase, if necessary.
  • a site is not particularly limited, and is, for example, an enzyme cleavage site.
  • the cleavage site is an enzyme cleavage site, for example, ribo'G (Guanosine).
  • Enzymes used here include RN as eTl, RNa se A, RNa se I, knee RNa se, SI nuclease, snake venom nuclease, spleen phosphodiesterase, Subtilis phyllococcus nuclease, and mangrove nuclease Acapannulease or the like can be used.
  • RNa se T l, RNa se A, RNa se I and knee RNa se are preferable, and RNa se Tl is particularly preferable.
  • the enzyme cleavage site can be appropriately selected according to the type of enzyme used.
  • the linker of the present invention can be labeled by binding a labeling substance as necessary.
  • a labeling substance is appropriately selected from fluorescent substances, radioactive labeling substances and the like.
  • the fluorescent substance has a free functional group (for example, a carboxyl group that can be converted into an active ester, a hydroxyl group that can be converted into a phosphoramidide, or an amino group), and can be linked to a linker, puromycin, or puromycin-like compound.
  • Various fluorescent dyes can be used.
  • Suitable labeling substances include, for example, fluorescent substances such as fluorescein isothiocyanate, phycopyriprotein, rare earth metal chelate, dansyl mouthpiece or tetramethylrhodamine isothiocyanate; 3 H, “C , 125 I or 131 I and the like.
  • the puromycin ′ linker of the present invention may be provided with a DNA sequence as a site for linking mRNA, and is preferably provided with a DNA sequence. Puromycin '' Li
  • the puromycin linker of the present invention may be provided with a reverse transcription primer, and is preferably provided with a reverse transcription primer. If a puromycin 'linker is provided with a reverse transcription primer, the reverse transcription primer is used to (immobilize) the mRNA NA-pimycin' linker-protein conjugate for reverse transcription reaction. By using this, DNA corresponding to mRNA can be generated, and mR NAZ cDNA-puromycin / linker protein conjugate can be prepared. (Immobilized puromycin / linker)
  • a puromycin linker is immobilized on a solid phase.
  • the puromycin ′ linker of the present invention can be produced by linking the above-mentioned puromycin or puromycin-like compound and the above-mentioned linker by a known scientific method. Furthermore, the immobilized puromycin 'linker of the present invention can be produced by immobilizing the aforementioned puromycin' linker on a solid phase.
  • the solid phase on which the immobilized puromycin linker of the present invention is immobilized is not particularly limited, and is appropriately selected according to the intended use.
  • a solid carrier can be used.
  • polymer beads for example, styrene beads
  • glass beads agarose beads, cephalose beads
  • magnetic beads such as: Glass substrates, silicon (quartz) substrates, plastic substrates, metal substrates (eg, gold foil substrates), etc .; glass containers, plastic containers, etc .; nitrocellulose, polyvinylidene fluoride (PVDF), etc.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • Examples include membranes made of materials.
  • beads such as magnetic beads include polymer beads (for example, styrene beads, polystyrene beads, agarose beads, and sepharose beads), glass beads, and silica beads.
  • the means for immobilizing the immobilized puromycin 'linker of the present invention on the solid phase may be immobilized so as not to interfere with the subsequent steps such as the preparation of an immobilized mRNA-puromycin / linker conjugate.
  • the solid phase binding site is bound to the solid phase binding site recognition site provided on the solid phase.
  • the solid phase binding site to which the immobilized puromycin 'linker of the present invention is immobilized is not particularly limited as long as it can bind the puromycin linker of the present invention to the solid phase.
  • a molecule for example, a ligand, an antibody, etc.
  • a specific polypeptide that binds to the molecule is used as the solid-phase binding site recognition site.
  • Solid phase binding sites examples include, for example, biotin z avidin and streptavidin and other piotin binding proteins, maltose maltose binding protein, guanine nucleotide ZG protein, nickel or cobalt, etc.
  • Various ligands / receptor proteins such as noestradiol receptor protein.
  • Solid phase binding site recognition site combinations include biotin avidin and streptavidin and other biotin binding proteins, maltose / maltose binding protein, metal ions such as nickel or cobalt Z polyhis Preferred are thiidine peptide, daryuthion, daltathion-S-transferase, antigen molecule (epitorp) antibody and the like, and particularly preferred is a combination of piotinostreptavidin. '
  • the above solid phase binding site may be provided, for example, by binding a compound or binding group capable of binding the puromycin linker to the solid phase by a known chemical method to the base in the linker. it can. More specifically, examples of the compound or linking group that can bind puromycin 'phosphorus to the solid phase include piotin.
  • Examples of the base in the linker include (deoxythymine (dT)), a base modified with an amino group (for example, amino-modified deoxythymine (eg, Amino-Modifier C6-dT: manufactured by Glen Research Search), carboxy group Modified by a base (eg, force loxy modified deoxythymine (Carboxy-dT)), a base employed by a thiol group (For example, thiol-modified deoxythymine (4-Thio-dT)) and the like.
  • dT deoxythymine
  • a base modified with an amino group for example, amino-modified deoxythymine (eg, Amino-Modifier C6-dT: manufactured by Glen Research Search), carboxy group Modified by a base (eg, force loxy modified deoxythymine (Carboxy-dT)), a base employed by a thiol group (For example, thiol-modified deoxythymine (4-Th
  • a mycin linker can be immobilized on a solid phase.
  • the puromycin linker can be immobilized on the solid phase by an ester bond or an amide bond.
  • a known method can be used to bind the polypeptide used as the solid-phase binding site recognition site to the solid-phase surface.
  • Such known methods include, for example, tannic acid, formalin, dartal aldehyde, pyruvic aldehyde, bis-diazolated benzidizone, toluene-2,4-diisocyanate, amino group, carboxyl group, or Examples include the use of hydroxyl groups or amino groups (PM Abdel la, PK Smith, GP Royer, A New Cleavabl e Reagent for Cross- Linking and Reversible Immobilizat ion of Proteins, Biochems, Biophys Res. Commun., 87, 734 (1979) etc.).
  • the above-mentioned immobilization means is an immobilization method using two substances having an affinity for each other.
  • the solid phase is a plastic material such as styrene beads or a styrene substrate, a known method can be used as necessary. It is also possible to covalently bond some of the linkers directly to their solid phase using a technique (see Qiagen, LiCiChip Application Handbook, etc.).
  • the fixing means is not limited to the above method, and any fixing means known to those skilled in the art can be used.
  • mRNA and the immobilized puromycin linker are linked to prepare an immobilized mRNA-puromycin conjugate.
  • the mRNA used in the present invention includes both those whose sequence is unknown and those whose sequence is known. That is, when searching for or quantifying a substance that binds to a protein with a known sequence using the mRNA-puromycin-linker conjugate of the present invention, an mRNA having a nucleic acid sequence encoding a protein with a known sequence is used. . Conversely, when analyzing the function of a protein of unknown sequence using the mRNA-puromycin-linker conjugate of the present invention, mRNA having a nucleic acid sequence encoding a protein of unknown sequence can be used.
  • mRNA is transcribed from, for example, various receptor sequences with known sequences—mRNA encoding proteins, mRNA encoding various antibodies or fragments thereof, mRNA encoding various enzymes, and DNA in various gene libraries.
  • MRNA having an unknown sequence mRNA having a random sequence transcribed from DNA having a sequence synthesized randomly by organic synthesis, and the like.
  • Ligation between mRNA and immobilized puromycin 'linker can be performed directly or indirectly, chemically or physically using a known method.
  • DNA is used as a linker, or when a DNA sequence is provided in the linker, both are linked by providing a complementary sequence to the DNA sequence at the 3 ′ end of mRNA. be able to.
  • a portion of the linker is formed at the 3 ′ end of the mRNA when preparing the mRNA, and the remainder of the puromycin-linker is added to this. It is also possible to produce an mRNA-puromycin 'linker-linked conjugate by binding the. In this case, a cleavage site can be provided in a part of the linker formed on the 3 ′ end side of mRNA.
  • step (b) protein synthesis is carried out by bringing the immobilized mRNA-puromycin-linker conjugate into contact with the translation system, and the mRNA-puromycin-linker-protein conjugate (simply referred to as “mRNA”). —Sometimes called “protein conjugates”).
  • the mRNA-protein conjugate is sometimes referred to as “Invitrovirus (IVV) virion”.
  • Examples of translation systems that can be used here include cell-free translation systems and living cells.
  • a cell-free translation system composed of prokaryotic or eukaryotic extracts, for example, Escherichia coli, Rabbit reticulocytes, wheat germ extract, etc. can be used.
  • a cleavable site is provided at a position sandwiching the solid phase binding site of the puromycin linker. Therefore, after synthesizing the protein, preferably the protein is folded on the solid phase, and then the cleavable site is cleaved to prepare the mRNA-puromycin 'linker-protein conjugate. can do.
  • the thus obtained mRNA-puromycin.linker-monoprotein conjugate can be used for various analysis experiments and screening.
  • DNA-puromycin 'linker-protein conjugate (sometimes simply referred to as FmRNAZcDNA-protein conjugate) may be prepared. It is preferable to subject the puromycin-linker to a reverse transcription reaction before cleaving the cleavable site because it is easy to perform operations such as buffer exchange and washing.
  • mRNA (/ c DNA) 1 puromycin-linker-1 protein conjugate 1 puromycin-linker-1 protein conjugate.
  • mRNA (/ c DNA) 1 puromycin-linker-1 protein conjugate 1 puromycin-linker-1 protein conjugate.
  • the thus prepared mRNAZc DNA-puromycin / linker-protein conjugate shows that when it is brought into contact with the target substance in step (c), the mRNA and the target substance bind nonspecifically. Since it can be suppressed, the target substance This is preferable in that the background when measuring the interaction between protein and protein can be reduced. It is also preferable in that mRNA is not easily degraded. Furthermore, the DNA thus generated can be used to identify a protein in step (c) described below. It can also be used to generate mutant DNA in step (d) described below. 'If necessary, the mRNA of the obtained mRNAZc DNA-puromycin-linker mono-protein conjugate is degraded by an enzyme such as RNa se H, and the DNA-puromycin. Linker mono-protein conjugate ( Simply referred to as “DNA-protein conjugate” may be prepared. These mRNAZ cDNA-protein conjugates or DNA-protein conjugates are sometimes referred to as “Invitro DNA virus (IVDV) virions
  • step (c) the target substance and mRNA (/ c DNA) containing the protein that interacts with the target substance by contacting the mRNA.
  • (/ C DNA) puromycin / linker—protein conjugate.
  • DNA One Puromycin ⁇ One Linker Select a protein conjugate.
  • Selection of mRNA (/ c DNA) -puromycin, linker-protein conjugates containing proteins that interact with the target substance can be made by measuring the interaction between the target substance and the protein.
  • the “interaction” between the target substance and the protein usually means at least one of a covalent bond, a hydrophobic bond, a hydrogen bond, a van der Waals bond, and an electrostatic force bond between the protein and the target molecule.
  • the term should be interpreted in the broadest sense and should not be construed in any way restrictive, as it refers to the action of forces acting between the resulting molecules.
  • Covalent bonds include coordination bonds and dipole bonds.
  • electrostatic coupling includes electric repulsion in addition to electrostatic coupling.
  • a binding reaction, a synthesis reaction, and a decomposition reaction resulting from the above action are also included in the interaction.
  • interactions include binding and dissociation between antigen and antibody, binding and dissociation between protein receptor and ligand, binding and dissociation between adhesion molecule and counterpart molecule, binding between enzyme and substrate. And dissociation, binding and dissociation between a nucleic acid and a protein that binds to it, binding and dissociation between proteins in an information transmission system, binding and dissociation between a glycoprotein and a protein, or a sugar chain and a protein There is a bond and dissociation between the two.
  • Whether or not the target substance and protein are interacting can be measured by measuring and detecting a change in the signal generated based on the interaction between the two molecules.
  • Such measurement techniques include, for example, surface plasmon resonance (Culen, DC, eta 1., Biosensors, 3 (4), 21 1-22 5 (1987-88)), evanescent field molecular imaging Funatsu, T., eta 1., Nture, 374, 555—559 (1995), Fluorescence imaging analysis, solid-phase enzyme immunoassay (EL) ISA): C r owt he r, J.
  • mRNA (/ cDNA) -puffymycin / linker-coprotein combination containing protein that interacts with the target substance can be performed simply by determining whether or not both molecules bind.
  • a binding experiment can be performed by a method using the specific affinity of both molecules (for example, affinity chromatography).
  • an insoluble carrier such as a cellulose carrier, agarose carrier, polyacrylamide carrier, dextran carrier, polystyrene carrier, polypinyl alcohol carrier, polyamino acid carrier or porous silicic carrier.
  • Immobilize the target substance on the top for example, beads, fills, membranes, etc.
  • Immobilize the target substance on the top for example, beads, fills, membranes, etc.
  • conventional methods physical adsorption, polymerisation by cross-linking, sealing in matrix or non-co-polymerization
  • immobilizing the insoluble carrier into a glass, plastic, or stainless steel column and eluting the sample through the column (for example, a columnar column).
  • the mRNA (/ cNA) -puromycin'-linker-protein conjugate that binds to the target substance contained in the sample can be separated.
  • This procedure also eliminates mR NA (Z c D NA) —puromycin / linker monoprotein conjugate that did not bind to the target substance from the screening process, and the necessary mR NA (Z c D NA)-Only puromycin-linker protein conjugates can be selected.
  • binding experiments can be performed by affinity beads as a method using the specific affinity of both molecules (Reference, Ogata Y, et al., Anal Chei.
  • a magnetic bead in which streptavidin is bound to the surface or a magnetic bead in which a target molecule is immobilized on the surface through an amino group or the like is used.
  • the mR NA (/ c D NA) -puromycin-linker-protein conjugate that binds to the biotinylated target molecule is separated by contacting the streptavidin beads and then collecting the streptavidin magnetic beads with a magnet. be able to.
  • target molecule-bound magnetic substance bead
  • mR NA / c D NA
  • one puromycin 'linker one protein conjugate are brought into contact with a magnet.
  • the body beads can be collected and recovered.
  • target substance means a substance for examining whether or not it interacts with a protein synthesized in the present invention. Specifically, proteins, nucleic acids, sugar chains, low molecular weight compounds, etc. Can be mentioned.
  • the protein is not particularly limited, and may be a full-length protein or a partial peptide containing a binding activity site.
  • the protein may be a protein whose amino acid sequence and its function are known or an unknown protein. These can also be used as target molecules, such as synthesized peptide chains, proteins purified from living organisms, or proteins that have been translated from a cDNA library using an appropriate translation system and purified.
  • the synthesized peptide chain may be a glycoprotein having a sugar chain bound thereto. These Of these, a purified protein having a known amino acid sequence, or a protein that has been translated and purified from a cDNA library or the like using an appropriate method can be used.
  • the nucleic acid is not particularly limited, and DNA or RNA can also be used. Further, it may be a nucleic acid with a known base sequence or function or an unknown nucleic acid. Preferably, a nucleic acid having the ability to bind to a protein and a nucleotide sequence known in the art, or a nucleic acid that has been cleaved and isolated from a genomic library or the like using a restriction enzyme or the like can be used.
  • the sugar chain is not particularly limited, and the sugar sequence or function thereof may be a known sugar chain or an unknown sugar chain. Preferably, a sugar chain that has already been separated and analyzed and whose sugar sequence or function is known is used.
  • the low molecular weight compound is not particularly limited, and can be used even if the function is unknown or the ability to bind to a protein is already known.
  • the target substance used here can be labeled with a labeling substance as necessary. If necessary, labeling can be performed by binding a labeling substance.
  • a labeling substance is appropriately selected from fluorescent substances, radioactive labeling substances and the like.
  • the fluorescent substance various fluorescent dyes having free functional groups (for example, a carboxyl group that can be converted into an active ester, a hydroxyl group that can be converted into a phosphoramidide, or an amino group) that can be linked to a target substance are used. it can.
  • Suitable labeling substances include, for example, fluorescent substances such as fluorescein isothiocyanate, phycopyriprotein, rare earth metal chelate, dansyl mouth lide or tetramethylrhodamine isothiocyanate; 3 H, “C, 125 1 Or a radioisotope such as 131 I. These labeling substances are suitable for measuring or analyzing the change in signal generated based on the interaction between the target substance and the immobilized protein.
  • the labeling substance can be bound to the target substance based on a known method.
  • the mRNA (/ cNA) containing a protein that interacts with the target substance selected in the step (c) (/ c DNA) one puromycin 'linker one protein conjugate Identify the protein.
  • the protein can be identified using a normal amino acid sequence sequencer. By analyzing the nucleotide sequence of DNA bound to DNA, ie, the mRNA (/ c DNA) of the present invention obtained by reverse transcription—puromycin. The DNA corresponding to the mRNA of the linker-protein conjugate. You can also. This reverse transcription may be performed after protein synthesis in the above-mentioned step (b).
  • step (c) preferably, following step (c), (d) interacting with the target substance MRNA (/ c DNA) containing the protein to be synthesized
  • MRNA (/ c DNA) containing the protein to be synthesized
  • MRNA having a modified sequence is prepared using the mutated DNA, the mRNA having the modified sequence is subjected to step (a), and then the steps (b) and (c) are performed as described above.
  • the reverse transcription may be performed after the protein synthesis in the step (b), and the timing for performing the transcription is not particularly limited.
  • the introduction of mutations into the DNA is carried out using the following methods: Error-P rone P CI ⁇ £ (Gram H, et al, Proc Natl Acad Sci US A. 1992, 89, 3576-80.) (Sterner WP, Nature. 1994, 370, 389-391).
  • the Error-P rone PCR method which can randomly introduce mutations into DNA with low probability, is preferred.
  • An Error-P rone PCR method kit is commercially available from Stratagene as GeneMorph PCT Mutagenesis Kit (GeneMorp is a trademark).
  • GeneMorp is a trademark.
  • a plurality of proteins that interact with a specific target substance can be obtained.
  • a protein having a new amino acid sequence based on consensus sequence information of amino acid sequences of a plurality of proteins, and providing this to the step (a), a protein having a higher interaction force can be obtained. It becomes possible.
  • the protein thus obtained can be organically synthesized based on known organic synthesis techniques (see Nobuo Izumiya et al., Peptide synthesis basics and experiments, Maruzen Co., Ltd. (1975), etc.).
  • the protein obtained by such a screening method can be used for various pharmaceutical uses as a physiologically active substance that adjusts the physiological function of the target substance.
  • FIG. 1 is a diagram showing an outline of one embodiment of the present invention for explaining the protein screening method of the present invention.
  • linker 1 shown in Fig. 1 (1) puromycin 2 is linked to linker 3.
  • the linker 3 is provided with a solid-phase binding site 3 a, a cleavage site 3 b, and a fluorescent label 3 c.
  • the immobilized puromycin linker 5 of the present invention is prepared (FIG. 1 (2)).
  • Protein 8 is synthesized by contacting the resulting immobilized mR NA-puromycin / linker conjugate 7 with the translation system to prepare immobilized mR NA-puromycin / linker-protein conjugate 9. (Fig. 1 (5)). The synthesized protein 8 binds to puromycin 2. Next, immobilized mR NA—Puroma Isin 'Linker-Monoprotein Linkage 9 is subjected to reverse transcription to synthesize DNA 10 corresponding to mRNA and prepare immobilized mRNAZc DNA-Puromycin * Linker-Monoprotein Linkage 11 ( Figure 1 (6)).
  • mRNA / cDNA-puromycin.linker-1 protein conjugate 12 is prepared by cleaving the linker at the cleavage site 3a (FIG. 1 (7)).
  • mRNAZc DNA-puromycin / protein linker 12 in various screening systems, mRNAZc DNA-puromycin / linker containing a protein that interacts with the target substance A protein conjugate can be selected.
  • the automated screening apparatus using the protein screening method of the present invention comprises a reaction inlet provided with a reagent inlet, a buffer, a washing solution, etc., a discharge outlet for discharging them, and a magnetic holding means. Equipped with a vessel (evolution reactor).
  • a vessel evolution reactor
  • it is not necessary to provide the input port and the discharge port separately, and an input / discharge port for performing input and discharge may be provided.
  • mRNA (cDNA) Puromycin 'Prinmycin protein, which contains a protein that interacts with the target substance, and a synthesis reactor for synthesizing mRNA (cDNA) —Puromycin * Linker protein conjugate, etc.
  • a screening reactor for selecting a conjugate or the like may be provided separately, or a synthesis / screening reactor for performing synthesis and screening may be provided.
  • P is puromycin
  • St AV is a streptavidin magnetic bead
  • puromycin linker is immobilized on the magnetic bead by piotin-streptavidin binding. Immobilized puromycin 'linker 1).
  • an mRNA library containing mRNA linked to the immobilized puromycin 'linker was added to prepare an immobilized mRNA-puromycin / linker conjugate.
  • puromycin can be ligated to the end of mRNA using an RNA ligase such as T4 RNA ligase.
  • the immobilized mRNA_puromycin 'linker is immobilized. While adsorbing the magnetic beads with a magnet, the reaction solution containing unreacted mRNA and RNA ligase is discharged and the buffer is exchanged (Fig. 2 (3)).
  • the translation system is discharged and washed while adsorbing the magnetic beads on which the immobilized mRNA-puromycin / linker protein conjugate is immobilized with a magnet (Fig. 2 (5)). Then, it may be subjected to reverse transcription reaction to generate DNA corresponding to mRNA (Fig. 2 (6)).
  • the reverse transcriptase and the buffer are discharged while adsorbing the magnetic beads on which the immobilized mRNAZc DNA-puromycin / linker protein conjugate is immobilized with a magnet. And wash (Fig. 2 (7)).
  • mRNA may be degraded by an enzyme such as RNaseH.
  • the linker at the cleavage site with an enzyme such as RNa se T 1, the mRNA-cDNA-puromycin / linker-1 protein conjugate or the DNA-puromycin / linker-1 protein conjugate is magnetically beaded. (Fig. 2 (8) '), and by eluting it, mRNAZcDNA-puromycin.
  • Linker-1 protein conjugate or DNA-puromycin' linker-1 conjugate (I VDV virion ) Can be obtained.
  • an IVDV virion containing a protein that interacts with the target substance is selected by bringing the target substance into contact with the obtained IVDV virion.
  • the IVDV virion is contacted with a magnetic bead on which a target molecule is immobilized, and the IVDV virion containing a protein that interacts with the target substance is bound to the magnetic bead (FIG. 3 (10)).
  • a washing buffer In order to select an I VDV virion whose binding to the target molecule is greater than or equal to the desired strength, it is washed with a washing buffer and the IVVV virion with less than the desired binding strength. Remove on.
  • the magnetic beads with the target molecule immobilized can be adsorbed with a magnet.
  • the cleaning efficiency can be improved by moving the magnetic beads in the cleaning buffer using a magnet.
  • Selection of an IVDV virion having a desired binding strength can be performed by appropriately setting the composition (for example, salt concentration) of the washing buffer.
  • the IVDV virion containing the protein that interacts with the target substance can be obtained by eluting the IVDV virion with an eluent such as a high salt concentration solution while adsorbing the magnetic beads with the target molecule immobilized with a magnet.
  • an eluent such as a high salt concentration solution
  • the IVDV pillion can be separated according to the interaction force with the target substance.
  • IVDV virion is subjected to PCR (Fig. 3 (13)), and its DNA sequence is determined (Fig. 3 (14)), whereby the protein in the IVVV virion is determined. Can be identified.
  • (rG) Ribo G
  • (T) Amino-Modifier C6 dT
  • (T-B) Biotin-dT, manufactured by Glen Research Search.
  • the linker of the present invention is obtained by cross-linking and purifying (A) Puro-F-S and (B). Hybri according to the following method, and this is named “SBP linker 1”.
  • the synthesis method is shown below. Dissolve Puro-FS lOnmol in 100 w 1 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), add 1 lOOmM Tris [2-carboxyethyl] phosphine (TCEP, Pierce) (final ImM), 6 hours at room temperature The Puro-FS Thiol was reduced. Immediately before the crosslinking reaction, TCEP was removed using NAP5 (Amersham, 17-0853-02) equilibrated with 50 ⁇ phosphate buffer (pH 7.0) '.
  • HPLC fractions were analyzed on an 18 acrylamide gel (8M urea, 62) and the desired fraction was reduced under reduced pressure.
  • the optimal amount necessary to completely bind the molecule to be immobilized to the StAV beads was first examined.
  • the StAV beads were washed and diluted with 0.1 M NaCl DEPC-treated water to a final concentration of 2.5 g / 1 (about 150,000 beads 1).
  • washed beads were subsequently used as mRNA for translation on the solid phase.
  • IVVDV DNA in vitro virus
  • RNase T1 was used as follows.
  • I VDV virions are present in this supernatant, they are usually used for screening, but this time, the following RNaseH treatment was performed in order to know the synthesis efficiency of I VDV. This is because the molecular weight of the inRNA / c DNA-protein 'form' is large and cannot be easily confirmed by electrophoresis.
  • IVDV virions DNA-protein conjugates
  • the “solid phase” in FIG. 5 is the result of analyzing the DNA-protein conjugate (IVDV virion) prepared according to Example 1 of the present invention.
  • the “liquid phase” is the mRNAZDNA-pieuromycin linker linkage. Add the body to the cell-free translation system and in solution (as usual) This is the result of analyzing a DNA-protein conjugate (IVDV virion) prepared by protein synthesis and then removing mRNA by RNAse treatment.
  • i VD V-virion represents a DNA-puromycin-linker protein conjugate
  • I VDV-genome represents a DNA-puromycin 'linker conjugate without protein binding.
  • the synthesis efficiency of DNA-protein conjugate (IVDV virion) by the method of the present invention (solid phase synthesis) was more than 5 times that in the case of liquid phase synthesis. Industrial applicability
  • the protein screening method of the present invention does not waste expensive linkers, and does not require complicated and low recovery purification and concentration operations, thus reducing time, cost, and labor. This is useful as a protein screening method.
  • the protein screening method of the present invention is suitable for automation, it can be used for high-throughput automated screening equipment.
  • immobilized puromycin linker of the present invention can be used in the above-described protein screening method, screening automation apparatus, and the like.

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Abstract

本発明は、（ａ）ｍＲＮＡと、固相に固定化されている固定化ピューロマイシン・リンカーとを連結して固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体を調製する工程；（ｂ）該固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー連結体と翻訳系とを接触させることによってタンパク質を合成することを含む、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体を調製する工程；（ｃ）標的物質と、該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体とを接触させることによって、該標的物質と相互作用するタンパク質を含むｍＲＮＡ−ピューロマイシン・リンカー−タンパク質連結体を選択する工程；を含む、標的物質と相互作用するタンパク質のスクリーニング方法、および前記スクリーニング方法を実施するタンパク質のスクリーニング装置などを提供する。本発明によれば、時間、コスト、手間などが削減されたタンパク質のスクリーニング方法およびスクリーニング装置を提供することができる。

Description

明 細 書
固定化ピューロマイシン ' リンカ一を用いた
タンパク質のスクリーニング方法 技術分野
本発明は、 標的物質と相互作用するタンパク質のスクリーニング方法、 このスク リーニング方法に用いる固定化ピューロマイシン · リンカーなどに関する。 背景技術
最近のゲノム科学の領域においては、 遺伝子配列を明らかにするという 「構造解 析」 から遺伝子の発現産物による 「機能解析」 へと研究テーマがシフトしている。 遺伝子の機能を具現するのは、 基本的に、 タンパク質などの発現産物だからである。 ゆえに、 遺伝子の機能解析にはタンパク質の解析が必須となる。 タンパク質の機能 解析は、 例えば、 タンパク質一タンパク質相互作用やタンパク質一核酸相互作用等 の解析による生化学的機能解析を通して行われている。
タンパク質—タンパク質相互作用の解析法としては、 イーストツーハイプリッド 法 (Chien, C. T. , et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88， 9578-9582 (1991)) 、 ファージディスプレー法 (Smith, G. P., Science, 228, pp.1315-1317 (1985)) 、 GST—融合タンパク質プルダウン法、 免疫共沈法等が知られている。 タンパク質 —核酸相互作用の解析法としては、 電気泳動移動度シフトアツセィ法 （Revzin, A., et al., Anal. Biochem. , 153, 172 (1986)) 、 DN a s e Iフットプリント法
(Calas, D. , et al., Nucleic Acids Res. , 5， 3157 (1978)) 、 メチル化緩衝法 等が知られている。
また、 ピューロマイシンの特異的性質を利用した in vitro virus法 （Nemoto et al., FEBS Lett. 414, 405 (1997) ； Tabuchi et al., FEBS Lett. 508, 309
(2001)等参照） を用いてタンパク質相互作用の解析方法も開発されている （国際公 開第 01/016600号パンフレツ卜参照） 。 mR N Aとピューロマイシンとがリンカ一を介して連結された mR N A—ピュ ロマイシン連結体を用いる In vi t ro vi rus (IVV) 法はタンパク質の進化工学にお ける有力な手法として注目されている。
しかしながら、 I V V法で用いられる mR NA—ピューロマイシン連結体の調製 には、 R NA精製カラムなどによる精製、 エタノール沈殿などによる濃縮などの操 作が必要であり、 操作が煩雑である、 回収率が低いなどの問題があり自動化を含む ハイスループット化が困難であった。 また、 mR NA—ピューロマイシン連結体を R N A精製カラムを用いて精製する場合、 未反応の mR N Aによる精製効率の低下 を防止するために過剰量のリンカーを用いる必要があることから、 高価なリンカー が無駄になるという問題もあった。 発明の開示
このような状況下、 煩雑な操作を必要とせず、 かつ高価なリンカ一などを無駄に することのない、 時間、 コスト、 手間などが削減されたタンパク質のスクリーニン グ方法の開発が望まれていた。 また、 自動化に適したタンパク質のスクリーニング 方法の開発が望まれていた。
本発明者らは、 前記課題を解決するため鋭意検討した結果、 タンパク質のスクリ —ニングにおいて、 ピューロマイシンまたはピューロマイシン様化合物が固相に固 定化されている固定化ピューロマイシン · リンカ一を用いることにより、 時間、 コ スト、 手間などが削減できることを見出し、 本発明を完成したものである。 すなわ ち、 本発明は、 以下に示すようなタンパク質のスクリーニング方法、 固定化ピュー ロマイシン · リンカ一、 それを用いる固定化 mR NA—ピューロマイシン連結体の 製造方法、 m N A—ピューロマイシン一タンパク質連結体の製造方法などを提供 する。
( 1 ) ( a ) mR NAと、 固相に固定化されている固定化ピューロマイシン · リン カーとを連結して固定化 mR NA—ピューロマイシン · リンカ一連結体を調製する 工程； (b) 該固定化 mRNA—ピューロマイシン · リンカ一連結体と翻訳系とを接触さ せることによってタンパク質を合成することを含む、 mRN A—ピューロマイシ ン ' リンカ一一タンパク質連結体を調製する工程；
(c) 標的物質と、 該 mRNA—ピューロマイシン · リンカ一一タンパク質連結体 とを接触させることによって、 該標的物質と相互作用するタンパク質を含む mRN
A—ピューロマイシン · リンカ一一タンパク質連結体を選択する工程；
を含む、 標的物質と相互作用するタンパク質のスクリーニング方法。
(2) 工程 （c) において選択された mRNA—ピューロマイシン · リンカ一一夕 ンパク質連結体のタンパク質を同定する工程：
をさらに含む、 上記 （1) 記載の方法。
(3) 前記タンパク質の同定が、 前記 mRNA—ピューロマイシン♦ リンカ一一夕 ンパク質連結体の m R N Aから逆転写により調製された DN A塩基配列を解析する ことによって行われる、 上記 （2) 記載の方法。
(4) さらに、 （d) 工程 （c) において選択された mRNA—ピューロマイシ ン ' リンカ一—タンパク質連結体の mRNAに対応する DNAを逆転写により合成 し、 該 DNAに変異を導入することによって変異 DNAを得、 該変異 DNAを用い て改変された配列を有する mRN Aを調製し、 該改変された配列を有する mRN A を工程 （a) に供する工程：
を含む、 標的物質との相互作用力が強化されたタンパク質を取得する、 上記 （1) 〜 （3) のいずれかに記載の方法。
(5) 工程 （a) 〜 （d) を複数回繰り返すことによって標的物質との相互作用力 が強化されたタンパク質を取得する、 上記 （4) 記載の方法。
(6) 前記固定化ピューロマイシン · リンカ一が、 リンカ一に設けられた固相結合 部位と、 固相に設けられた固相結合部位認識部位との結合を介して結合されている、 上記 （1) 〜 （5) のいずれかに記載の方法。
(7) 前記固相結合部位がピオチンである、 上記 （6) 記載の方法。
(8) 前記固相結合部位認識部位がアビジンまたはストレプトアビジンである、 上 記 （6) または （7) に記載の方法。
(9) 前記固相がビーズである、 上記 （1) 〜 （8) のいずれかに記載の方法。 (10) 前記ビーズが磁性ビーズである、 上記 （9) 記載の方法。
(11) 前記磁性ビーズが、 ポリマ一ゼ一ズ、 ガラスビーズ、 シリカビーズ、 ポリ スチレンビーズ 、 ァガロースビーズおよびセファロースビーズから選択される、 上記 （10) 記載の方法。
(12) 前記標的物質が固相に固定化されている、 上記 （1) 〜 （1 1) のいずれ かに記載の方法。
(13) 前記標的物質が固定化されている固相が、 磁性ビーズである、 上記 （1 2) 記載の方法。
(14) mRNA—ピューロマイシン · リンカ一連結体を作製するための、 固相に 固定化されている固定化ピューロマイシン ' リンカ一。
(15) 前記固相が、 ビーズ、 基板、 容器およびメンブレンから選択される、 上記 (14) 記載の固定化ピューロマイシン · リンカ一。
(16) 前記固相が、 ビーズである、 上記 （15) 記載の固定化ピューロマイシ ン · リン力一。
(17) 前記ビーズが、 磁性ビーズである、 上記 （16) 記載の固定化ピューロマ イシン · リン力一。
(18) リンカ一に設けられた固相結合部位と、 固相に設けられた固相結合部位認 識部位との結合を介して結合されている上記 （14) 〜 （17) のいずれかに記載 の固定化ピューロマイシン · リンカ一。
(19) mRNAと、 固相に固定化されている固定化ピューロマイシン · リンカ一 とを連結する工程を含む、 固定化 mRNA—ピューロマイシン · リンカ一連結体の 製造方法。
(20) mRNAと、 固相に固定化されている固定化ピューロマイシン · リンカ一 とを連結して固定化 mRNA—ピューロマイシン · リンカー連結体を調製するェ 程；および、 該固定化 mRNA—ピューロマイシン ' リンカ一連結体と翻訳系とを 接触させることによってタンパク質を合成する工程を含む、 mRNA—ピューロマ イシン · リンカ一一タンパク質連結体の製造方法。 (21) (a) mRNAと、 固相に固定化されている固定化ピューロマイシン · リ ンカーとを連結して固定化 mRNA—ピューロマイシン · リンカ一連結体を調製す る工程；
(b) 該固定化 mRNA—ピューロマイシン ' リンカ一連結体と翻訳系とを接触さ せることによってタンパク質を合成した後、 逆転写反応に供することを含む、 mR
NAZcDNA—ピューロマイシン · リンカ一—タンパク質連結体を調製するェ 程；
(c) 標的物質と、 該 mRNA/c DNA—ピューロマイシン ' リンカ一—タンパ ク質連結体とを接触させることによって、 該標的物質と相互作用するタンパク質を 含む mRNAZc DNA—ピューロマイシン ' リンカ一一タンパク質連結体を選択 する工程；
を含む、 標的物質と相互作用するタンパク質のスクリーニング方法。
(22) 標的物質あるいは標的分子結合磁性体と、 mRNAZcDNA—ピュー口 マイシン · リンカ" "一タンパク質連結体とを接触させることによって、 該標的物質 と相互作用するタンパク質を含む mRNAZc DNA—ピューロマイシン · リンカ 一一タンパク質連結体を選択する工程を含む、 標的物質と相互作用するタンパク質 のスクリーニング方法を実施するタンパク質のスクリーニング装置であって、 標的 物質、 mRNAZc DNA—ピューロマイシン ' リンカ一一タンパク質磁性連結体、 標的分子結合磁性体、 試薬及びバッファーを投入するための投入口と、 使用後の試 薬、 バッファ一及び反応副生成物を排出するための排出口と、 磁力によって mRN AZcDNA—ピューロマイシン ·'リンカ一一タンパク質磁性連結体、 及び、 標的 分子結合磁性体を回収する手段とを設けた反応器を備えることを特徴とするタンパ ク質のスクリーニング装置。 本発明のタンパク質のスクリーニング方法などは、 例えば、 次のような効果を有 する。
(1) 本発明においては、 mRNAとピューロマイシン · リンカ一との結合効率が 極めて改善されている。 このため、 高価なピューロマイシン · リンカ一を無駄にし ない。 ( 2 ) カラム精製 （例えば、 R NAカラム精製など） などの煩雑で回収率の低い精 製操作を必要としない。
( 3 ) エタノール沈殿などの濃縮操作を必要としない。
したがって、 本発明のスクリーニング方法などによれば、 時間、 コスト、 手間な どを削減することができる。 さらに、 固定化ピューロマイシン · リンカ一、 固定化 mR NA—ピューロマイシン ' リンカ一、 固定化 mR NA—ピューロマイシン · リ ンカー—タンパク質連結体、 mR NA—ピューロマイシン ' リンカ一一タンパク質 連結体などを高収率で得ることができる。
さらに、 本発明の好ましい態様によれば、 固相としてビーズを用いることにより、 タンパク質のスクリーニングを自動化することが容易になる。 また、 タンパク質の スクリーニングのハイスループット化が可能となる。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の一実施態様に係るタンパク質のスクリーニング方法の概要を示 す図である。
図 2は、 本発明の自動化に適した実施態様に係る、 本発明の固定化ピュー口マイ シン · リンカ一を用いてタンパク質を合成する方法の概要を示す図である。
図 3は、 本発明の自動化に適した実施態様に係る、 タンパク質を選択および同定 する方法の概要を示す図である。
図 4は、 実施例 1において固定化されなかったリンカ一を調べるための電気泳動 の結果を示す図である。 '
図 5は、 実施例 1および溶液中でのタンパク質合成で得られた D N A—夕ンパク 質連結体 （I VD Vビリオン） の S D S— P A G Eの結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明をその実施態様に基づいて詳細に説明する。 タンパク質のスクリーニング方法 本発明は、 下記工程 （a) 〜 （c) を有する、 標的物質と相互作用するタンパク 質のスクリーニング方法に関する。
(a) mRNAと、 ピューロマイシンまたはピューロマイシン様化合物が固相に 固定化されている固定化ピューロマイシン · リンカーとを連結して固定化 mRNA —ピューロマイシン ' リンカ一連結体を調製する工程；
(b) 該固定化 mRNA—ピューロマイシン · リンカ一連結体と翻訳系とを接触 させることによってタンパク質を合成することを含む、 mRNA—ピューロマイシ ン · リンカ一一タンパク質連結体を調製する工程；
(c) 標的物質と、 該 mRNA—ピューロマイシン ' リンカ一一タンパク質連結 体とを接触させることによって、 該標的物質と相互作用するタンパク質を含む mR
NA—ピューロマイシン · リンカ一一タンパク質連結体を選択する工程。
さらに、 好ましい態様としては、 工程 （c) に続いて、 さらに下記工程 （d) を 含む、 標的物質との相互作用力が強化されたタンパク質を取得するスクリーニング 方法にも関する。
(d) 工程 （c) において選択された mRNA—ピューロマイシン ' リンカ一— タンパク質連結体の mRNAから逆転写により調製された DN Aに変異を導入する ことによって得られた変異 DN Aを用いて改変された配列を有する mRNAを調製 し、 この mRNAを工程 （a) に供する工程。
以下、 各工程の詳細について説明する。
(1) 工程 （a) ：固定化 mRNA—ピューロマイシン · リンカ一連結体の調製 工程 （a) では、 mRN.Aと、 固定化ピューロマイシン · リンカ一とを連結して、 固定化 mRNA—ピューロマイシン · リンカ一連結体を調製する。
ここで、 固定化ピューロマイシン ' リンカ一においては、 ピューロマイシンまた はピューロマイシン様化合物 （単に 「ピューロマイシン」 と称することもある） は リンカ一と結合されている。 このピューロマイシンとリンカ一との結合体を 「ピュ 一口マイシン · リンカ一」 と称する。 さらに、 ピューロマイシン， リンカ一は、 固 相に結合されている。
(ピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物） ここで、 ピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物は、 固相に固定化され た固定化 m RNA—ピューロマイシン連結体を翻訳系に投入してタンパク質を合成 する際に、 mRN Aと翻訳されたタンパク質とを連結するヒンジあるいは連結部の 役割をする。 すなわち、 mRNAにリンカ一を介してピューロマイシンを結合した ものと翻訳系を接触させると、 その mRNAがピューロマイシンを介して翻訳され たタンパク質と結合した In vitro virusビリオンが生成することが知られている (Nemo to et al., FEBS Lett. 414, 405 (1997)参照） 。 ピューロマイシン （Pu r omyc i n) は、 その 3 '末端がアミノアシル t R N Aに化学構造骨格が類似 している、 下記式 （I) ：
Figure imgf000010_0001
に示される化合物で、 翻訳系でタンパク質の合成が行われた際に、 合成されたタン パク質の C末端に結合する能力を有する。 本明細書中、 「ピューロマイシン様化合 物」 とは、 その 3'末端がアミノアシル t RNAに化学構造骨格が類似し、 翻訳系 でタンパク質の合成が行われた際に、 合成されたタンパク質の C末端に結合する能 力を有する化合物をいう。
ピューロマイシン様化合物としては、 3'—N—アミノアシルピューロマイシン アミノヌクレ才シド (3 — N— Am i n o a c y l pu r omyc i n am i n onu c l e o s i d e, PANS—アミノ酸） 、 例えば、 アミノ酸部がグリシン の PANS_G l y、 アミノ酸部がパリンの PAN S— V a 1、 アミノ酸部がァラ ニンの PANS— A l a、 その他、 アミノ酸部が全ての各アミノ酸に対応する P A NS—アミノ酸化合物が挙げられる。 また、 3'—アミノアデノシンのァミノ基と アミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合して形成されるアミド結合で連結した 3'— N—アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド （3'— Am i n o a c y 1 a d e n o s i n e ami n o n u c l e o s i d e, A AN S—アミノ酸） 、 /こと えば、 アミノ酸部がグリシンの AANS—G 1 y、 アミノ酸部がパリンの AAN S 一 Va l、 アミノ酸部がァラニンの AANS— A 1 a、 その他、 アミノ酸部が全ァ ミノ酸の各アミノ酸に対応する AANS—アミノ酸化合物を使用できる。 また、 ヌ クレオシドあるいはヌクレオシドとァミノ酸のエステル結合したものなども使用で きる。 なお、 上記ピューロマイシン以外に好ましく用いられるピューロマイシン様 化合物は、 リポシチジルピューロマイシン （r CpPu r) 、 デォキシジルピュー ロマイシン （dCpPu r) 、 デォキシゥリジルピューロマイシン （dUpPu r) などであり、 下記にその化学構造式を示す。
Figure imgf000011_0001
rCpPur dCpPur
Figure imgf000012_0001
dUpPur Fluoropur
Figure imgf000012_0002
Lurothiopur
(リンカ一）
次に、 本発明で用いられるリンカ一とは、 本発明で用いられる mR NA—ピュー ロマイシン一タンパク質連結体を作製する際に、 mR NAとピューロマイシンまた はピューロマイシン様化合物を連結するためのリンカーを意味する。 リンカ一は、 主として、 ピューロマイシンをリボソームの Aサイ卜と呼ばれる部位に効率良く取 り込ませるために用いられる。 したがって、 リンカ一としては、 そのような性質を 有する限り特に限定されない。 例えば、 リンカ一としては、 I n v i t r o v i r u s法で使用しうるリンカ一であればいずれのリンカ一も使用できるが、 柔軟 性があり、 親水性で、 側鎖の少ない単純な構造を有する骨格を有するものが好まし レ^ 具体的には、 ここで用いられるスぺーサ一として、 これらに限定されないが、 ポリヌクレオチド （DNA含む） 、 ポリエチレンなどのポリアルキレン、 ポリェチ レンダリコールなどのポリアルキレングリコール、 ペプチド核酸 （PNA) 、 ポリ スチレン等の直鎖状物質又はこれらの組合せを主骨格として含むものが好ましく用 いられる。 上記直鎖上物質を組み合わせて用いる際は、 適宜、 それらを適当な連 結基 （― NH―、 —CO—、 — O—、 -NHCO-, — CONH—、 -NHNH-, 一 (CH2) n— [nは例えば 1〜10、 好ましくは 1〜3] 、 一 S—、 一 SO—な ど） で化学的に連結することができる。
本発明のリンカ一は、 好ましくは、 1本鎖 DNA及び 又はペプチド核酸 （PN A) を主骨格として含むものであり、 上記リンカ一の機能を果たす限り、 1本鎖 D N A及び 又は P N Aの部分以外に、 それ以外の骨格部分を有することもできる。 ペプチド核酸 （PNA) とは、 DNAや RNAとは異なり、 リン酸結合ではなくぺ プチド結合で骨格を形成している D N A類似構造の化合物である。 1本鎖 D N A及 び Z又は PNA以外の部分としては、 例えば、 RNA鎖、 ポリエチレンなどのポリ アルキレン、 ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、 ポリスチ レン等の直鎖状物質又はこれらの組合せを選択することができる。 これらの直鎖上 物質を組み合わせて用いる際は、 適宜、 それらを適当な連結基 （一 NH—、 -CO 一、 ― O—、 —NHCO—、 一 CONH -、 -NHNH-, - (CH2) n—[nは 例えば 1〜10、 好ましくは 1〜3] 、 一 S—、 一 SO—など） で化学的に連結す ることができる。 なお、 本明細書で、 「1本鎖 DNA及び Z又は PNAを主骨格と して含む」 とは、 例えば、 リンカ一の骨格全長に対して、 60%以上、 好ましくは 70%以上、 さらに好ましくは 80%以上、 最も好ましくは 90 %以上が 1本鎖 D NA及び Z又は PNAで構成されていることをいう。 なお、 DNAと PNAの両者 を主骨格中に含む場合は、 その比率は特に制限されないが、 例えば、 DNA： PN A=l ： 9〜9 ： 1の範囲が例示される。
本発明のリンカ一は、 種々の反応工程での反応性、 得られる mRNA—タンパク 質複合体 （in vitro virus ビリオン （virion) ) の精製効率などを考慮して、 好 ましくは10〜601116 1*、 より好ましくは 10〜45me r、 さらに好ましくは 15〜3 Ome rの長さを有する。 なお、 本発明のリンカ一は、 公知の化学合成の 手法を用いて作成することができる。
本発明のリンカ一には、 好ましくは、 ピューロマイシン ' リンカ一を固相に結合 するための固相結合部位を設ける。
また、 本発明のリンカ一には、 必要に応じて、 mRNA—ピューロマイシン ' リ ンカ一一 （タンパク質） 連結体を固相から取り外すために、 前記固相結合部位を挟 む位置に一対の切断部位を設ける。 このような切断部位は、 特にこれに限定されな いが、 例えば、 酵素切断部位である。 本発明の好ましい態様においては、 前記切断 部位は酵素切断部位であり、 例えば、 リボ' G (Guanos ine) である。 固相に結合さ れた mRNA—ピューロマイシン— （タンパク質） 連結体を固相から取り外す際は、 上記切断部位を切断する酵素等で切断する。 ここで用いられる酵素としては、 RN a s eTl、 RNa s e A、 RNa s e I、 膝臓 RNa s e、 S Iヌク ア一 ゼ、 蛇毒ヌクレアーゼ、 脾臓ホスホジエステラーゼ、 ス夕フイロコッカスヌクレア —ゼ、 マングマメヌクレアーゼ、 ァカパンヌクレア一ゼなどを用いることができる。 本発明では、 RNa s eT l、 RNa s e A, RNa s e I及び膝臓 RNa s eが好ましく、 特に RNa s eTlが好ましい。 また、 酵素切断部位は、 使用する 酵素の種類に応じて適宜選択することができる。
なお、 本発明のリンカ一は、 必要に応じて標識物質を結合させることによって標 識することができる。 そのような標識物質は、 蛍光性物質、 放射性標識物質などか ら適宜選択される。 蛍光物質としては、 フリーの官能基 （例えば活性エステルに変 換可能なカルボキシル基、 ホスホアミダイドに変換可能な水酸基、 あるいはァミノ 基など） を持ち、 リンカ一又はピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物に 連結可能な種々の蛍光色素を用いることができる。 適当な標識物質としては、 例え ばフルォレスセインイソチオシァネート、 フィコピリタンパク、 希土類金属キレー ト、 ダンシルク口ライド若しくはテ卜ラメチルローダミンイソチオシァネート等の 蛍光物質； 3 H、 "C、 125 I若しくは131 I等の放射性同位体などが挙げられる。
本発明のピューロマイシン ' リンカ一には、 mRNAを連結する部位として DN A配列を設けても良く、 DNA配列を設けるのが好ましい。 ピューロマイシン ' リ ンカーに D N A配列を設けた場合には、 例えば、 mR NAの 3， 末端にその D N A 配列と相補的な配列を設けておくことにより、 両者を連結することができる。 さらに、 本発明のピューロマイシン ' リンカ一には、 逆転写用プライマーを設け てもよく、 逆転写用プライマーを設けるのが好ましい。 ピューロマイシン ' リンカ 一に逆転写用プライマーを設けた場合には、 その逆転写用プライマーを利用して、 (固定化） mR NA—ピ 一口マイシン ' リンカ一—タンパク質連結体を逆転写反 応に供することにより、 mR NAに対応する D NAを生成させ、 mR NAZ c D N A—ピューロマイシン · リンカ一一タンパク質連結体を調製することができる。 (固定化ピューロマイシン · リンカ一）
本発明の固定化ピューロマイシン ' リンカ一においては、 ピューロマイシン · リ ンカーが固相に固定化されている。 本発明のピューロマイシン ' リンカ一は、 上述 のピューロマイシンまたはピューロマイシン様化合物と上述のリンカーとを公知の 科学的手法によって連結することにより製造することができる。 さらに、 本発明の 固定化ピューロマイシン ' リンカ一は、 前述のピューロマイシン ' リンカ一を固相 に固定化することにより製造することができる。
本発明の固定化ピューロマイシン · リンカ一が固定化される固相は特に限定され ず、 その使用目的に応じて適宜選択される。 本発明で用いられる固相としては、 生 体分子を固定する担体となるものを用いることができ、 例えば、 ポリマービーズ (例えば、 スチレンビーズ） 、 ガラスビーズ、 ァガロースビーズ、 セファロ一スビ ーズ、 磁性ビーズなどのビーズ；ガラス基板、 シリコン （石英） 基板、 プラスチッ ク基板、 金属基板 （例えば、 金箔基板） 等の基板；ガラス容器、 プラスチック容器 等の容器；ニトロセルロース、 ポリビニリデンフルオリ ド （P V D F ) 等の材料か らなるメンブレンなどが挙げられる。 磁性ビーズなどのビーズとしては、 ポリマー ビーズ （例えば、 スチレンビーズ、 ポリスチレンビーズ、 ァガロースビーズ、 セフ ァロースビーズなど） 、 ガラスビーズ、 シリカビーズなどが挙げられる。
本発明の固定化ピューロマイシン ' リンカ一を固相に固定化する手段は、 固定化 mR NA—ピューロマイシン · リンカ一連結体の調製など、 その後の工程の障害と ならないように固定すればよく、 特に限定されない。 好ましくは、 リンカ一に設け られた固相結合部位と、 固相に設けられた固相結合部位認識部位との結合を介して 結合される。
本発明の固定化ピューロマイシン ' リンカ一が固定される固相結合部位は、 本発 明のピューロマイシン . リンカ一を固相に結合しうるものであればよく、 特に限定 されない。 固相結合部位としては、 例えば、 特定のポリペプチドに特異的に結合す る分子 （例えば、 リガンド、 抗体など） を用いることができる。 この場合には、 固 相結合部位認識部位としては、 その分子と結合する特定のポリペプチドが用いられ る。 固相結合部位 固相結合部位認識部位の組合せの例としては、 例えば、 ビォチ ン zアビジン及びストレプトアビジン等のピオチン結合タンパク質、 マルトース マルトース結合タンパク質、 グァニンヌクレオチド ZGタンパク質、 ニッケルある いはコバルト等の金属イオン/ポリヒスチジンペプチド、 ダル夕チオン/ダル夕チ オン一 S—トランスフェラーゼ、 D NAZD NA結合タンパク質、 抗原分子，（ェピ トープ） Z抗体、 カルモジュリン結合ペプチド カルモジュリン、 A T P ZA T P 結合タンパク質、 あるいはエストラジオールノエストラジオール受容体タンパク質 などの、 各種リガンド/その受容体タンパク などが挙げられる。
これらの中で、 固相結合部位 固相結合部位認識部位の組合せとしては、 ビォチ ン アビジン及びストレプトアビジンなどのピオチン結合タンパク質、 マルト一ス /マルトース結合タンパク質、 ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン Zポリヒ スチジンペプチド、 ダル夕チオン ダルタチオン— S—トランスフェラーゼ、 抗原 分子 （ェピトープ） 抗体などが好ましく、 特にピオチンノストレブトアビジンの 組合せが最も好ましい。 '
上記の固相結合部位は、 例えば、 ピューロマイシン ' リンカ一を固相に結合しう る化合物または結合基を、 公知の化学的方法によって、 リンカ一中の塩基に結合さ せることによって設けることができる。 より具体的には、 ピューロマイシン ' リン 力一を固相に結合しうる化合物または結合基としては、 ピオチンなどが挙げられる。 リンカ一中の塩基としては、 （デォキシチミン （d T) ) 、 アミノ基によって修飾 された塩基 （例えば、 ァミノ修飾デォキシチミン（例、 Amino- Mod i f ier C6-dT： Glen Research Search社製）、 カルボキシ基によって修飾された塩基 （例えば、 力 ルポキシ修飾デォキシチミン（Carboxy-dT) ) 、 チオール基によって就職された塩基 (たとえば、 チオール修飾デォキシチミン（4- Thio-dT) ) 等が挙げられる。 固相結 合部位としては、 リンカ一中のデオギシチミン （d T) に結合したピオチンが好ま しい。 固相結合部位としてピオチンを用いた場合には、 固相結合部位認識部位とし てアビジンまたはストレプトアビジンを有する固相を用いることにより、 ピオチン とアビジンまたはストレプトアビジンとの親和性を利用して、 ピューロマイシン · リンカ一を固相に固定化することができる。 なお、 上記固相結合部位としてカルボ キシル基またはアミノ基を用いる場合には、 エステル結合またはアミド結合によつ てピューロマイシン · リンカ一を固相に固定化することができる。
上記の固相結合部位認識部位として用いられるポリペプチドの固相表面への結合 は、 公知の方法を用いることができる。 そのような公知の方法としては、 例えば、 タンニン酸、 ホルマリン、 ダルタルアルデヒド、 ピルビックアルデヒド、 ビスージ ァゾ化べンジゾン、 トルエン— 2， 4ージイソシァネート、 アミノ基、 カルボキシ ル基、 又は水酸基あるいはアミノ基などを利用する方法を挙げることができる （P. M. Abdel la, P. K. Smi th, G. P. Royer, A New Cleavabl e Reagent for Cross- Linking and Revers ible Immobi l izat ion of Prote ins, B iochem. Biophys. Res. Commun. ， 87, 734 (1979)等参照） 。
なお、 上記組合せは、 固相結合部位に用いられる特定のポリペプチドに特異的に 結合する分子と固相結合部位認識部位に用いられる前記分子と結合する特定のポリ ペプチドとを逆転させて用いることもできる。 上記の固定化手段は、 2つの相互に 親和性を有する物質を利用した固定化方法であるが、 固相がスチレンビース、 スチ レン基板などのプラスチック材料であれば、 必要に応じて、 公知の手法を用いてリ ンカーの一部を直接それらの固相に共有結合させることもできる （Qiagen社、 LiQu iChip Appl icat ions Handbook等参照） 。 なお、 本発明においては、 固定手段 については上記の方法に限定されることなく、 当業者に公知である如何なる固定手 段をも利用することができる。
(固定化 mR N A—ピューロマイシン連結体の調製）
上記工程 （a ) では、 mR NAと、 上記固定化ピューロマイシン · リンカ一とを 連結して、 固定化 mR NA—ピューロマイシン連結体を調製する。 本発明で用いられる mRN Aは、 配列未知のもの、 配列既知のものの両者を含む。 すなわち、 本発明の mRNA—ピューロマイシン · リンカ一連結体を用いて配列既 知のタンパク質に結合する物質を探索あるいは定量する場合は、 配列既知のタンパ ク質をコードする核酸配列を有する mRNAを用いる。 逆に、 本発明の mRNA— ピューロマイシン · リンカ一連結体を用いて配列未知のタンパク質の機能を解析す る場合は、 配列未知のタンパク質をコードする核酸配列を有する mRNAを用いる ことができる。 ここで用いられる、 mRNAは、 例えば、 配列既知の各種レセプ夕 —タンパク質をコードする mRNA、 各種抗体又はその断片をコードする mRNA、 各種酵素をコードする mRNA、 各種遺伝子ライブラリ一中の DNAから転写され る配列未知の mRNA、 有機合成によってランダムに合成された配列を有する DN Aから転写されたランダムな配列を有する mRN Aなどから選択される。
mRNAと固定化ピューロマイシン ' リンカ一との連結は、 公知の手法を^いて 直接的又は間接的に、 化学的又は物理的に行うことができる。 例えば、 DNAをリ ンカーとして用いる場合、 またはリンカ一に DNA配列を設けた場合には、 mRN Aの 3' 末端にその DNA配列と相補的な配列を設けておくことにより、 両者を連 結することができる。
また、 mRNA—ピューロマイシン · リンカ一連結体を作成するに際しては、 リ ンカーの一部を mRNAを調製する際に mRNAの 3 ' 末端側に形成しておき、 こ れにピューロマイシン · リンカーの残部を結合することによって mRNA—ピュー ロマイシン ' リンカ一連結体を作製することもできる。 この場合は、 mRNAの 3 ' 末端側に形成したリンカーの一部中に切断部位を設けることもできる。
(2) 工程 （b) ： mRNA—ピューロマイシン · リンカ一—タンパク質連結体の 調製
工程 （b) では、 上記固定化 mRNA—ピューロマイシン · リンカ一連結体と翻 訳系とを接触させることによってタンパク質の合成を行い、 mRNA—ピューロマ イシン ' リンカ一一タンパク質連結体 （単に、 「mRNA—タンパク質連結体」 と 称することもある） を調製する。 なお、 mRNA—タンパク質連結体のことを、 「I n v i t r o v i r u s (I V V) ビリオン （v i r i on) 」 と称する こともある。 ここで用いることができる翻訳系としては、 無細胞翻訳系又は生細胞などが挙げ られる。 無細胞翻訳系としては、 原核又は真核生物の抽出物により構成される無細 胞翻訳系、 例えば大腸菌、 ゥサギ網状赤血球、 小麦胚芽抽出物などが使用できる
(Lamfrom H, Grunberg-Manago M. Ambiguities of translation of poly U in the rabbit reticulocyte system. Biochem Biophys Res Com匪. 1967 27(1) :ト 6 等参照） 。 生細胞翻訳系としては、 原核又は真核生物、 例えば大腸菌の細胞などが 使用できる。 本発明においては、 取り扱いの容易さから、 無細胞系を使用すること が好ましい。
本発明の好ましい態様によれば、 前記ピューロマイシン · リンカ一の固相結合部 位を挟む位置に切断可能部位が設けられている。 そこで、 タンパク質を合成した後、 好ましくは固相上で夕ンパク質を確実にフォールディングさせた後に、 その切断可 能部位を切断することにより、 mRNA—ピューロマイシン ' リンカ一一タンパク 質連結体を調製することができる。 このようにして得られた mRNA—ピューロマ イシン . リンカ一一タンパク質連結体は、 種々の解析実験やスクリーニングに用い ることができる。
必要に応じて、 タンパク質を合成した後、 前記ピューロマイシン ' リンカ一の切 断可能部位を切断する前または切断した後に、 逆転写反応に供することにより、 m RNAに対応する DNAを生成させ、 mRNAZc DNA—ピューロマイシン ' リ ンカ一一タンパク質連結体 （単に、 FmRNAZcDNA—タンパク質連結体」 と 称することもある） を調製しても良い。 ピューロマイシン · リンカ一の切断可能部 位を切断する前に逆転写反応に供するのが、 バッファー交換、 洗浄などの操作を行 うのが容易である点で好ましい。 なお、 mRNA—ピューロマイシン ' リンカ一一 タンパク質連結体と mRNAZc DNA—ピューロマイシン · リンカ一一タンパク 質連結体とを、 まとめて 「mRNA (/c DNA) 一ピューロマイシン · リンカ一 —タンパク質連結体」 または 「mRNA (/c DNA) 一夕
ンパク質連結体」 と称することもある。
このようにして調製された mRNAZc DNA—ピューロマイシン · リンカ一― タンパク質連結体は、 工程 （c) において標的物質と接触させた場合に、 mRNA と該標的物質とが非特異的に結合することを抑制することができるので、 標的物質 とタンパク質との相互作用を測定する際のバックグラウンドを低減させることがで きる点で好ましい。 また、 mRNAが分解されにくいという点でも好ましい。 さらに、 このようにして生成された DNAは、 以下に説明する工程 （c) におい てタンパク質を同定するために用いることができる。 また、 以下に説明する工程 (d) において、 変異 DNAを生成させるために用いることもできる。 ' また、 必要に応じて、 得られた mRNAZc DNA—ピューロマイシン · リンカ 一—タンパク質連結体の mRNAを、 RNa s eHなどの酵素によって分解し、 D NA—ピューロマイシン . リンカ一一タンパク質連結体 （単に、 「DNA—タンパ ク質連結体」 と称することもある） を調製してもよい。 なお、 これらの mRNAZ c DNA—タンパク質連結体または DNA—タンパク質連結体のことを、 「I n v i t r o DNA v i r u s (I VDV) ビリオン （v i r i on) 」 と称す ることちある。
(3) 工程 （c) ： mRNA (ZcDNA) —ピューロマイシン · リンカ一一タン パク質連結体の選択
工程 （c) では、 標的物質と、 上記 mRNA. (/c DNA) —ピューロマイシ ン · リンカ一—タンパク質連結体とを接触させることによって該標的物質と相互作 用するタンパク質を含む mRNA (/c DNA) 一ピューロマイシン · リンカ一一 タンパク質連結体を選択する。
標的物質と相互作用するタンパク質を含む mRNA (/c DNA) 一ピューロマ イシン， リンカ一—タンパク質連結体の選択は、 標的物質とタンパク質との相互作 用を測定することによって行うこどができる。
なお、 これら標的物質とタンパク質との 「相互作用」 とは、 通常は、 タンパク質 と標的分子間の共有結合、 疎水結合、 水素結合、 ファンデルワールス結合、 及び静 電力による結合のうち少なくとも 1つから生じる分子間に働く力による作用を示す 、 この用語は最も広義に解釈すべきであり、 いかなる意味においても限定的に解 釈してはならない。 共有結合としては、 配位結合、 双極子結合を含有する。 また静 電力による結合とは、 静電結合の他、 電気的反発も含有する。 また、 上記作用の結 果生じる結合反応、 合成反応、 分解反応も相互作用に含有される。 相互作用の具体例としては、 抗原と抗体間の結合及び解離、 タンパク質レセプ夕 一とリガンドの間の結合及び解離、 接着分子と相手方分子の間の結合及び解離、 酵 素と基質の間の結合及び解離、 核酸とそれに結合するタンパク質の間の結合及び解 離、 情報伝達系におけるタンパク質同士の間の結合と解離、 糖タンパク質とタンパ ク質との間の結合及び解離、 あるいは糖鎖とタンパク質との間の結合及び解離が挙 げられる。
標的物質とタンパク質とが相互作用しているか否かの測定は、 両分子間の相互作 用に基づいて発生される信号の変化を測定、 検出することにより行うことができる。 そのような測定手法としては、 例えば、 例えば、 表面プラズモン共鳴法 （Cu l l e n, D. C. , e t a 1. ， B i o s e n s o r s, 3 (4) ， 21 1 -22 5 (1987 - 88) ) 、 エバネッセント場分子イメージング法 F u n a t s u, T. ， e t a 1. ， N t u r e, 374, 555— 559 (1995) 、 ，蛍光 イメージングアナライズ法、 固相酵素免疫検定法 （En z yme L i n k e d I mmu no s o r b e n t As s ay (EL I S A) : C r owt he r, J . R. , Me t hod s i n Mo l e c u l a r B i o l ogy, 2_ (199 5 ) ) 、 蛍光偏光解消法 （P e r r an, J. , e t a 1. , J. Phy s. R ad. , 1， 390 -401 (1926) ) 、 及び蛍光相関分光法 （F 1 u o r e s c e n c e Co r r e l a t i on S p e c t r o s c o py (FCS) ： E i g e n, M. , e t a 1 - ， P r o c. N t l . Ac a d. S c i . USA, 91， 5740-5747 (1994) ) 等が挙げられる。
また、 標的物質と相互作用するタンパク質を含む mRNA (/cDNA) ーピュ 一口マイシン · リンカ一一タンパク質連結体の選択は、 単純に両分子が結合するか 否かを判定す ¾ことによって行うことができ、 両分子の特異的親和性を利用した方 法 （例えば、 ァフィ二ティークロマトグラフィー） によってそのような結合実験を 行うことができる。 具体的には、 セルロース系担体、 ァガロース系担体、 ポリアク リルアミド系担体、 デキストラン系担体、 ポリスチレン系担体、 ポリピニルアルコ ール系担体、 ポリアミノ酸系担体あるいは多孔性シリ力系担体等のような不溶性担 体上 （例えばビーズ、 フィル夕一、 メンブレン等の担体） に標的物質を常法により 固定化 （物理的吸着、 架橋による高分子化、 マトリックス中への封印あるいは非共 有結合等による固定化） し、 該不溶性担体をガラス製、 プラスチック製あるいはス テンレス製等のカラムに充填し、 該カラム （例えば、 円柱状カラム） に、 試料を通 して溶出させることにより、 該試料中に含まれる、 標的物質に結合する mR NA (/ c D NA) 一ピューロマイシン ' リンカ一—タンパク質連結体を分離すること ができる。 またこのような操作を行なうことによって、 標的物質に結合しなかった mR NA (Z c D NA) —ピューロマイシン · リンカ一一タンパク質連結体を本ス クリーニングプロセスから排除することができ、 必要な mR N A (Z c D NA) - ピューロマイシン · リンカ一一タンパク質連結体のみを選別することができる。 あるいは、 両分子の特異的親和性を利用した方法としてァフィ二ティービーズ法 によって結合実験を行うことができる （文献， Ogata Y， et al.， Anal Chei.
2002 ; 74:4702-4708) 。 具体的にはストレプトアビジンを表面に結合させた磁性ビ ーズまたは標的分子をァミノ基などを介して表面に固定した磁性ビーズを用いる。 ピオチン化した標的分子に結合する mR NA (/ c D NA) 一ピューロマイシン ' リンカ一—タンパク質連結体はストレプトアビジンビーズと接触させた後、 磁石で ストレプトアビジン磁性体ビーズを回収することによって分離することができる。 また、 標的分子を表面に固定した磁性体ビーズ （ 「標的分子結合磁性体」 ビーズ） と mR NA (/ c D NA) 一ピューロマイシン ' リンカ一一タンパク質連結体とを 接触させた後に磁石で磁性体ビーズを回収することによって分離することができる。 他にも、 ビーズが磁性体でなく、 ァガローズビーズ、 等の場合は、 磁石の代わりに 遠心機を用いてビーズのみ沈殿させて回収することで分離することが可能である。 ここで用いられる 「標的物質」 とは、 本発明において合成されるタンパク質と相 互作用するか否か調べるための物質を意味し、 具体的にはタンパク質、 核酸、 糖鎖、 低分子化合物などが挙げられる。
タンパク質としては、 特に制限はなく、 タンパク質の全長であっても結合活性部 位を含む部分ペプチドでもよい。 またアミノ酸配列、 及びその機能が既知のタンパ ク質でも、 未知のタンパク質でもよい。 これらは、 合成されたペプチド鎖、 生体よ り精製されたタンパク質、 あるいは c D NAライブラリ一等から適当な翻訳系を用 いて翻訳し、 精製したタンパク質等でも標的分子として用いることができる。 合成 されたぺプチド鎖はこれに糖鎖が結合した糖夕ンパク質であってもよい。 これらの うち好ましくはアミノ酸配列が既知の精製されたタンパク質か、 あるいは c D NA ライブラリ一等から適当な方法を用いて翻訳、 精製されたタンパク質を用いること ができる。
核酸としては、 特に制限されることはなく、 D NAあるいは R NAも用いること ができる。 また、 塩基配列あるいは機能が既知の核酸でも、 未知の核酸でもよい。 好ましくは、 タンパク質に結合能力を有する核酸としての機能、 及び塩基配列が既 知のものか、 あるいはゲノムライブラリ一等から制限酵素等を用いて切断単離して きたものを用いることができる。
糖鎖としては、 特に制限はなく、 その糖配列あるいは機能が、 既知の糖鎖でも未 知の糖鎖でもよい。 好ましくは、 既に分離解析され、 糖配列あるいは機能が既知の 糖鎖が用いられる。
低分子化合物としては、 特に制限されず、 機能が未知のものでも、 あるいはタン パク質に結合する能力が既に知られているものでも用いることができる。
ここで用いられる標的物質は、 必要に応じて標識物質により標識して用いること ができる。 必要に応じて標識物質を結合させることによって標識することができる。 そのような標識物質は、 蛍光性物質、 放射性標識物質などから適宜選択される。 蛍 光物質としては、 フリーの官能基 （例えば活性エステルに変換可能なカルボキシル 基、 ホスホアミダイドに変換可能な水酸基、 あるいはアミノ基など） を持ち、 標的 物質に連結可能な種々の蛍光色素を用いることができる。 適当な標識物質としては、 例えばフルォレスセインイソチオシァネート、 フィコピリタンパク、 希土類金属キ レート、 ダンシルク口ライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシァネート 等の蛍光物質； 3 H、 "C、 125 1若しくは131 I等の放射性同位体などが挙げられる。 これらの標識物質は、 標的物質と固定化タンパク質との間の相互作用に基づいて発 生される信号の変化の測定又は解析方法に適したものが適宜用いられる。 上記標識 物質の標的物質への結合は、 公知の手法に基づいて行うことができる。
本発明の方法においては、 必要に応じて、 さらに、 工程 （c ) において選択され た標的物質と相互作用するタンパク質を含む mR NA (/ c D NA) 一ピューロマ イシン ' リンカ一一タンパク質連結体中の、 タンパク質を同定する。 タンパク質の 同定は、 通常のアミノ酸配列シークェンサ一で行うこともできるし、 該タンパク質 に結合している DNA、 すなわち、 逆転写により得られる本発明の mRNA (/ c DNA) —ピューロマイシン . リンカ一—タンパク質連結体の mRNAに対応する DNA、 の塩基配列を解析することによって行うこともできる。 この逆転写は、 前 述の工程 （b) におけるタンパク質合成後に行えばよい。 例えば、 前記ピューロマ イシン · リンカ一の切断部位を切断する前に行ってもよいし、 切断部位の切断後、 工程 （c) に供する前に行ってもよい。 さらに、 工程 （c) において標的物質と相 互作用するタンパク質を含む mRNA—ピューロマイシン · リンカ一一タンパク質 連結体を選択した後に行っても良い。 (4) 工程 （d) ：標的物質との相互作用力が強化されたタンパク質の調製 本発明においては、 好ましくは、 工程 （c) に続いて、 さらに、 （d) 前記標的 物質と相互作用をするタンパク質を含む mRNA (/c DNA) 一ピューロマイシ ン—タンパク質連結体の mRNAに対応する DNAを逆転写により合成し、 得られ た DNAに変異を導入することによって変異 DNAを調製し、 得られた変異 DNA を用いて改変された配列を有する mRNAを調製し、 この改変された配列を有する mRNAを工程 （a) に供し、 次いで上述のように工程 （b) 及び （c) の処理を 行うことによって、 標的物質との相互作用力を強化したタンパク質を取得すること ができる。 ここで、 前記逆転写は、 前述のように、 工程 （b) におけるタンパク質 合成後に行えばよく、 それを行う時期は特に限定されない。 また、 前記 DNAへの 変異の導入は、 E r r o r— P r o n e P CI^£ (Gram H, et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 1992, 89, 3576-80. ) 、 DNA S h u f f 1 i n g法 （Sterner WP， Nature. 1994, 370， 389-391)等の公知の方法によって行うことができる。 本 発明においては、 DNAにランダムに低確率で変異を導入することができる、 E r r o r— P r o n e PCR法が好ましい。 なお、 E r r o r— P r o n e PCR 法のキットは、 S t r a t a g e n e社から Ge n eMo r p h PCT Mu t a g e n e s i s K i t (Ge n eMo r p hは商標）として市販されている。 この ような方法を利用すると、 上記工程 （a) 〜 （c) において、 ある標的物質に対し て少しでも相互作用するタンパク質を取得できた場合に、 そのタンパク質のァミノ 酸配列をランダムに改変して、 より相互作用力の強いタンパク質を取得することが できる。 したがって、 上記工程 （a ) 〜 （d ) を複数回繰り返すことによって標的 物質との相互作用力をより強化したタンパク質を取得することができる。
また、 このような工程を複数回 （例えば、 2〜 1 0回、 好ましくは 4〜8回） 繰 り返すことによって、 ある特定の標的物質と相互作用するタンパク質が複数取得で きた場合は、 それら複数タンパク質のアミノ酸配列のコンセンサス配列情報等に基 づいて新たなアミノ酸配列を有するタンパク質を設計し、 これを前記工程 （a ) に 供することによって、 さらに高い相互作用力を有するタンパク質を取得することが 可能となる。
このようにして得られたタンパク質は、 公知の有機合成手法に基づいて有機合成 することができる （泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975 年） 等参照） 。
なお、 このようなスクリーニング方法によって得られるタンパク質は、 標的物質の 生理的機能を調整する、 生理活性物質として、 種々の医薬用途に用いることができ る。
次に、 本発明のタンパク質のスクリーニング方法の好ましい実施態様について、 図 1に基づいて説明する。 図 1は、 本発明のタンパク質のスクリーニング方法につ いて説明するための、 本発明の一実施態様の概要を示す図である。 図 1 ( 1 ) に示 されたピューロマイシン， リンカ一 1においては、 ピューロマイシン 2がリンカ一 3と結合されている。 リンカ一 3には、 固相結合部位 3 a、 切断部位 3 b、 蛍光標 識 3 cが設けられている。 ピューロマイシン · リンカ一 1と、 ストレプトアビジン ビーズ 4とを結合することによって、 本発明の固定化ピューロマイシン · リンカ一 5を調製する （図 1 ( 2 ) ) 。
次に、 図 1 .( 3 ) および （4 ) に示すように、 mR N A 6と、 固定化ピューロマ イシンリンカー 5とを連結することによって、 固定化 mR N A—ピューロマイシ ン · リンカ一連結体 7を調製する。
得られた固定化 mR NA—ピューロマイシン · リンカー連結体 7と翻訳系とを接 触させることによってタンパク質 8を合成し、 固定化 mR NA—ピューロマイシ ン · リンカ一—タンパク質連結体 9を調製する （図 1 ( 5 ) ) 。 合成されたタンパ ク質 8は、 ピューロマイシン 2に結合する。 次いで、 固定化 mR NA—ピューロマ イシン ' リンカ一一タンパク質連結体 9を逆転写反応に供することによって、 mR NAに対応する DNA 10を合成し、 固定化 mRNAZc DNA—ピューロマイシ ン * リンカ一一タンパク質連結体 1 1を調製する （図 1 (6) ) 。
さらに、 切断部位 3 aでリンカ一を切断することによって、 mRNA/cDNA —ピューロマイシン . リンカ一一タンパク質連結体 12を調製する （図 1 (7) ) 。 このようにして得られる mRNAZc DNA—ピューロマイシン · リンカ一一タン パク質連結体 12を種々のスクリーニング系に供することによって、 標的物質と相 互作用するタンパク質を含む mRNAZc DNA—ピューロマイシン · リンカ一一 夕ンパク質連結体を選択することができる。
2. 自動化に適したタンパク質のスクリーニング方法
次に、 図 2および図 3に基づいて、 自動化に適したタンパク質のスクリーニング 方法について具体的に説明する。
本発明のタンパク質のスクリーニング方法を用いたスクリーニング自動化装置は、 試薬、 バッファー、 洗浄液などを投入するた^の投入口と、 それらを排出するため の排出口と、 磁力による保持手段とを設けた反応器 （進化リアクター） を備える。 ここで、 投入口と排出口とを別々に設ける必要はなく、 投入と排出とを行うための 投入 ·排出口を設けてもよい。 また、 mRNA ( cDNA) —ピューロマイシ ン * リンカ一一タンパク質連結体などを合成するための合成反応器と、 標的物質と 相互作用するタンパク質を含む mRNA ( cDNA) —ピューロマイシン ' リン 力一一タンパク質連結体などを選択するためのスクリーニング反応器とを別々に設 けてもよいし、 合成とスクリーニングとを行うための合成 ·スクリーニング反応器 を設けてもよい。
図 2 (1) 中、 Pはピューロマイシン、 S t AVはストレプトアビジン磁性ビー ズであり、 ピューロマイシン · リンカ一は、 ピオチン一ストレプトアビジン結合に よって磁性ビーズに固定化されている （本発明の固定化ピューロマイシン ' リンカ 一） 。
まず、 この固定化ピューロマイシン ' リンカ一と連結する mRNAを含む mRN Aライブラリを加えて固定化 mRNA—ピューロマイシン · リンカ一連結体を調製 する （図 2 (2) ) 。 次いで、 T4 RNAリガーゼなどの RNAリガ一ゼを用い てピューロマイシン ' リ:ン为 の末端と mRNAの末端をライゲーシヨンしてもよ レ^ その後、 固定化 mRNA_ピューロマイシン ' リンカ一が固定化されている磁 性ビーズを磁石で吸着しながら、 未反応の mR N Aや R N Aリガーゼを含む反応液 を排出し、 バッファー交換する （図 2 (3) ) 。
次に、 得られた固定化 mRNA—ピューロマイシン · リンカ一連結体を無細胞翻 訳系などの翻訳系に接触させることによって、 その mRNAに対応するタンパク質 を合成する （図 2 (4) ) 。 このタンパク質は、 図に示されるようにピュー口マイ シン Pに結合する。
その後、 得られた固定化 mRNA—ピューロマイシン · リンカ一一タンパク質連結 体が固定化されている磁性ビーズを磁石で吸着しながら、 翻訳系を排出し、 洗浄す る （図 2 (5) ) 。 次いで、 逆転写反応に供することによって、 mRNAに対応す る DNAを生成させてもよい （図 2 (6) ) 。 逆転写反応に供した場合には、 得ら れた固定化 mRNAZc DNA—ピューロマイシン · リンカ一一タンパク質連結体 が固定化されている磁性ビーズを磁石で吸着しながら、 逆転写酵素とバッファーを 排出し、 洗浄する （図 2 (7) ) 。 ここで、 必要に応じて、 RNa s eHなどの酵 素によって mRNAを分解してもよい。
さらに、 RNa s e T 1などの酵素によって、 切断部位でリンカ一を切断する ことによって mRNAノ c DNA—ピューロマイシン · リンカ一一タンパク質連結 体または DNA—ピューロマイシン · リンカ一一タンパク質連結体を磁性ビーズか ら分離することができ （図 2 (8) ') 、 これを溶出することによって、 mRNAZ c DNA—ピューロマイシン . リンカ一一タンパク質連結体または DNA—ピュー ロマイシン ' リンカ一連結体 （I VDVビリオン） を得ることができる。
次に、 標的物質と、 得られた I VDVビリオンとを接触させることによって、 該 標的物質と相互作用するタンパク質を含む I VDVビリオンを選択する。
まず、 I VDVビリオンを、 標的分子を固定した磁性ビーズと接触させ、 該標的 物質と相互作用するタンパク質を含む I VDVビリオンを磁性ビーズに結合させる (図 3 (10) ) 。 標的分子との結合が所望の強度以上である I VDVビリオンを 選択するために、 洗浄用バッファーで洗浄し、 所望の結合強度未満の I VDVピリ オンを除去する。 洗浄用バッファーを交換する場合には、 標的分子を固定した磁性 ビーズを磁石によって吸着しながら行うことができる。 また、 洗浄用バッファ一中 の磁性ビーズを磁石を用いて移動させることにより、 洗浄効率を向上させることが できる。 所望の結合強度の I VDVビリオンの選択は、 洗浄用バッファ一の組成 (例えば、 塩濃度など） を適宜設定することにより行うことができる。
次いで、 標的分子を固定した磁性ビーズを磁石によって吸着しながら、 高塩濃度 溶液などの溶出液によって I VDVビリオンを溶出することによって、 標的物質と 相互作用するタンパク質を含む I VDVビリオンを得ることができる （図 3 (1
2) ) 。 溶出液の組成を段階的に （ステップワイズ） 、 あるいは連続的に （ダラジ ェント） 変化させることによって、 標的物質との相互作用力に応じて I VDVピリ オンを分離することもできる。
このようにして得られた I VDVビリオンを PCRに供し （図 3 (13) ), 、 そ の DN A配列を決定 （図 3 (14) ) することにより、 該 I VDVビリオン中の夕 ンパク質を同定することができる。
このようにして、 本発明によれば、 mRNAライブラリを本発明の固定化ピュー ロマイシン · リンカ一を含む反応系に加えることによって、 標的分子と相互作用す る （親和性の高い） タンパク質を選択し、 そのアミノ酸配列を決定するスクリー二 ング自動化装置を提供することが可能となる。 実 施 例
以下、 本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。 なお、 本発明はこれら の実施例に限定されるものではない。
1. In vitro virus用リンカ一 Short- Biot in-ピューロマイシン Linker (SBP リ ンカー）の合成 まず、 以下の特殊 DNA合成を BEX社に合成依託した。
(A) Puro-F-S 己列； 5' - (S) -TC (F) - (Spacerl8) - (Spacerl8)― (Spacerl8) - (Spacerl8) -CC- (Puro) -3'] ここで、 （S) は 5'- Thio卜 Modifier C6、 （Puro) はピューロマイシン CPG、 (Spacerl8) は商品名 「Spacer Phosphoramidite 18」 で化学名は (18-0- Dimethoxytritylhexaethyleneglycol, 1- [ (2-cyanoethyl) - (N, N-di isopropyl) ] - phosphoramidite) で次の化学構造を有する。
D TO-(CH2)2-0-[(CH2)2-0]4-(CH2)2-0
I " (Pr)2N-P-OCH2CH2CN
以上すベて Glen Research社製。
(B) Hybri [配列番号 1 ： 5' -CC (rG) C (T-B) C (rG) CCC CGCCG CCCCC CG (T) CC T- 3Ί
ここで、 （rG)はリボ G、 （T)は Amino-Modifier C6 dT、 （T- B)は Biotin-dTですベて Glen Research Search社製。
本発明のリンカ一は （A) Puro-F-Sと （B). Hybriを以下の方法に従って架橋し 精製したもので、 これを 「SBP リンカ一」 と名づける。 以下に合成法を示す。 Puro-F-S lOnmolを、 100 w 1の 50mMリン酸バッファ一 （pH7.0) に溶かし、 lOOmM Tris [2-carboxyethyl] phosphine (TCEP、 Pierce社）を 1 1加え (final ImM) 、 室温で 6時間放置し、 Puro-F-S の Thiol を還元した。 架橋反応を行う直前 に 50πιΜリン酸バッファー （pH7.0)'で平衡化した NAP5 (アマシャム、 17-0853- 02) を用いて TCEPを除いた。
0.2Mリン酸バッファー （pH7.0) 100 1に、 500pmol//zl の Hybri 20 1、 lOOmM架橋剤 EMCS (344-05051； 6-Maleimidohexanoic acid N-hydroxysuccinide ester) 、 Dojindo社製） 20wl、 を加え、 良く攪拌した後、 37でで 30分放置した 後に、 未反応の EMCSを取り除いた。 沈殿を減圧下で乾燥させた後、 0.2Mリン酸バ ッファー （pH7.0) 10 1に溶かし、 上記の還元した Puro-F-S (〜10mnol) を加え て 4 で一晩放置した。 サンプルに最終で 4mMになるように TCEPを加え室温で 15 分放置した後、 未反応の Puro-F- Sをエタノール沈殿で取り除き、 未反応の Hybri を取り除くために以下の条件で HPLC精製を行った。
カラム； nacalai tesque CSOMOSIL 37918-31 10x250匪 C18-AR-300 (Waters) BufferA； 0.1M TEM、 Buf fer B ; 80%ァセトニ卜リル （超純水で希釈したもの） 流速： 0.5ml/min (B¾: 15-35% 33min)
HPLCの分画は 18 アクリルアミドゲル （8M尿素、 62 ） で解析し、 目的の分画 を減圧下
で乾燥させた後、 DEPC処理水で溶かして、 lOpmol/zzlにした。 2. SBPリンカ一のストレプトアビジン · ビーズ（StAVビーズ）への固定化
実験にあたっては以下に示すようにまず固定化する分子を完全に StAVビーズに 結合させるために必要な最適な量を検討した。 ， (1) StAVビーズを洗浄後、 0.1 M NaCl DEPC処理水で最終濃度 2.5 g/ 1 (約、 150, 000 ビーズ 1)に希釈した。
(2) 1 pmolの SBPリンカ一は
Figure imgf000030_0001
から の範囲で StAVビーズに結合 バッファー （10 Tris-HCl ( H 8.0) 1 mM EDTA, 1M NaCl, 0.1% TritonX-100) 中で、 25 、 15分間、 攪拌しながら固定した。
(3) 反応後、 固定化されなかったリンカ一を調べるため上清を回収し電気泳動 (12% PAGE) で解析した。 結果は図 4に示すとおり、 リンカ一 lp molに対しダイ ナビーズ M - 270を 10 g以上必要なことがわかった。
以上のことより固相上での IVV形成には、 10 pmolのリンカ一に対し
10 1 (lOOwg)の M-270ビーズを用いて固定化し、 0.01% RNaseフリー BSAバッファ 一 （0.01% BSA. , RNase free water (ambion)) で 2回洗った。 3. 固定化リンカ一への mRN Aの固相連結反応
滅菌した RNaseフリーエツペンドルフチューブに 10 pmolの Pou ドメインの mRNAと 2. で作製したリンカ一固定化ビーズを以下に示す組成の順番に加え、 最 終体積を 20 lになるように氷上でゆっくり混合した。
2 (1 10XT4 RNA Ligase Buffer (500 mM Tris-HCl, ρΗ7.5； 100 mM MgCl2; 100 mM DTT; 10 uiM ATP) → 1.2 (1 0.1¾ BSA→ mRNA→ 固定化 linker- DNA ビーズ
次に、 ヒートブロックにこのエツペンドルフチューブを置き、 8(T で 2分間イン キュべ一卜した後、 室温に放置し 15分間ハイブリダィゼーシヨンする。 さらに 1 (1 の T4 Polynucleotide Kinase (10 U/(l), 1.5 (1 の T4 RNA Ligase (40 U/(l) , 1 (1 の SUPERase RNase inhibitor (20 U/ (1)を加えた後、 ライゲーショ ン反応のためにローターにチューブをセッ卜し 1時間 25°Cで反応させた。 ライゲ ーシヨン反応後、 1分間マグネットスタンドにチューブを静置し上精を取り除き、 0.01% RNaseフリー BSAバッファーで 2回ビーズを洗う。
固相上翻訳用 mRNAとしてこの洗浄したビーズを以後用いた。
4. 固相 In vitro virus (IVV) 合成 , ゥサギ網状赤血球の無細胞翻訳系 （Ambion社） の試薬はすべて氷上において以 下の順番で 50 ζΓスケールで調整した。
(1) ( 「― methionine Master Mix」 1.25 (1 + 「 —leucine Master Mix」 1.25 (1 + 「1 M Potassium acetatej 2.5 (1 + 「 SUPERase RNase inhibitorj 2 (1) を 注意深く混ぜ合わせた後、 34 (1 の Retic lysate を泡立てないように丁寧にピぺ ッ卜を用いて混合した。
(2) 調整した （1) の混合液を mRNA固定化ビーズの入ったチューブに加え、 泡 立てないように再び注意深く攪拌した。
(3) 氷上からチューブをインキュベーターに移して 30分、 30秒反応させた。
(4) 1M MgCl2 6 (1 と 3M KC1 14(1 をさらに加えて 37° C で 90 minインキュ ベー卜した。 . 5. 逆転写
氷上で以下の組成をピぺッ卜によって丁寧に混合した。
(1) 5X First-Strand Buffer (250 mM Tris-HCl, pH 8.3; 375 mM KC1; 15 mM MgCl2) 4 (1 + 0.1 M DTT 1 (1 + SUPERase RNase inhibitor 1 (1 + dNTP mixture (2.5 mM e ach) 3 (1 + Superscript III RT (200 IV (1 from Invitrogen) 1 (1
(2) (1) を 4. で反応させたビーズの入ったチューブに加え、 ピペットでビー ズを懸濁させた。
(3) 50°Cのヒートブロックにチューブを移した後、 30分間ほどローターを用い 'てゆつくり攪拌しながらィンキュベ一夕一の中で反応させた。
(4) ビーズをマグネットスタンドで集め、 注意深く上清を取り除き次の反応に用 いた。
6. DNA化した in vitro virus (In vitro DNA virus; I VDV) ビリオンのビー ズからの解離と m R N Aの除去
スクリーニングをする際には 5. の過程のままではビーズに固定されたままであ るので、 これをビーズから解離する必要がある。 このために RNase T1を用いて以 下のように行った。
(1) 5. のビーズが入ったチューブに RNase Π (Ambion社） 100Uと 50 mM Tris-HCl, pH 7.5を 2ul加え 20 1になるように水を加え、 15分間、 37でで口 一ターを用いてィンキュベー卜した。
(2) マグネットスタンドを用いてビーズを分離し、 ビーズを攪拌しないように注 意深く上清を取り除いた。
この上清の中に I VDVビリオンが存在するため通常これを用いてスクリ一ニン グするが、 今回は I VDVの合成効率を知るために以下の RNaseH処理をした。 こ れは inRNA/ c D N A—タンパク質の'形であると分子量が大きレゝため電気泳動によつ て容易に確認できないからである。
(3) (2) の上清に、 Tth RNase-H (東洋紡） 10 U加え、 20分間、 40で反応さ せた。
8M-urea 6% SDS- PAGEによって DNA -タンパク質連結体 （I VDVビリオン） を 解析した （図 5) 。
図 5の 「固相」 は、 本発明の実施例 1により作成した DNA—タンパク質連結体 (I VDVビリオン） を解析した結果であり、 「液相」 は、 mRNAZDNA—ピ ユーロマイシン · リンカ一連結体を無細胞翻訳系に加え、 溶液中で （通常通りに） タンパク質合成を行い、 その後 RNa s eH処理により mRNAを除去して作成し た DNA—タンパク質連結体 （ I VDVビリオン） を解析した結果である。 i VD V—ビリオンは、 DNA—ピューロマイシン · リンカ一一タンパク質連結体を表し、 I VDV—ゲノムは、 タンパク質が結合していない DNA—ピューロマイシン ' リ ンカー連結体を表す。 図 3に示されるように、 本発明の方法 （固相合成） による D NA—タンパク質連結体 （I VDVビリオン） の合成効率は、 液相合成の場合に比 ベて 5倍以上であった。 産業上の利用可能性
本発明のタンパク質のスクリーニング方法は、 高価なリンカ一を無駄にすること がなく、 かつ、 煩雑で回収率の低い精製操作および濃縮操作を必要としないので、 時間、 コスト、 手間などが低減されたタンパク質のスクリーニング方法として有用 である。
さらに、 本発明のタンパク質のスクリーニング方法は自動化に適しているので、 ハイスループッ卜なスクリーニング自動化装脣に利用することができる。
また、 本発明の固定化ピューロマイシン ' リンカ一は、 前述のタンパク質のスク リーニング方法、 スクリーニング自動化装置などに利用することができる。

Claims

請求の範囲
1. (a) mRNAと、 固相に固定化されている固定化ピューロマイシン · リ ンカーとを連結して固定化 mRN A—ピューロマイシン · リンカー連結体を調製 する工程； -
(b) 該固定化 mRNA—ピューロマイシン · リンカ一連結体と翻訳系とを接触 させることによってタンパク質を合成することを含む、 mRN A—ピュー口マイ シン · リンカ一一タンパク質連結体を調製する工程；
(c) 標的物質と、 該 mRNA—ピューロマイシン ' リンカ一一タンパク質連結 体とを接触させることによって、 該標的物質と相互作用するタンパク質を含む m
RN A—ピューロマイシン · リンカ一一タンパク質連結体を選択する工程； . を含む、 標的物質と相互作用するタンパク質のスクリーニング方法。
2. 工程 （c) において選択された mRNA—ピューロマイシン · リンカ一一 タンパク質連結体のタンパク質を同定する工程： をさらに含む、 請求項 1記載の 方法。
3. 前記タンパク質の同定が、 前記 mRNA—ピューロマイシン ' リンカ一一 タンパク質連結体の mRN Aから逆転写により調製された DN Aの塩基配列を解 析することによって行われる、 請求項 2記載の方法。
4. さらに、 （d) 工程 （c) において選択された mRNA—ピューロマイシ ン ' リンカ一一タンパク質連結体の mRN Aに対応する DN Aを逆転写により合 成し、 該 DNAに変異を導入することによって変異 DNAを得、 該変異 DNAを 用いて改変された配列を有する mRN Aを調製し、 該改変された配列を有する m RNAを工程 （a) に供する工程：
を含む、 標的物質との相互作用力が強化されたタンパク質を取得する、 請求項 1 〜 3のいずれかに記載の方法。
5. 工程 （a) 〜 （d) を複数回繰り返すことによって標的物質との相互作用 力が強化されたタンパク質を取得する、 請求項 4記載の方法。
6. 前記固定化ピューロマイシン · リンカ一が、 リンカ一に設けられた固相結 合部位と、 固相に設けられた固相結合部位認識部位との結合を介して結合されて いる、 請求項 1〜5のいずれかに記載の方法。
7. 前記固相結合部位がピオチンである、 請求項 6記載の方法。
8. 前記固相結合部位認識部位がアビジンまたはストレプトアビジンである、 請求項 6または 7に記載の方法。
9. 前記固相がビーズである、 請求項 1〜8のいずれかに記載の方法。
10. 前記ビーズが磁性ビーズである、 請求項 9記載の方法。
1 1. 前記磁性ビーズが、 ポリマービーズ、 ガラスビーズ、 シリカビーズ、 ポ リスチレンビーズ 、 ァガロースビーズおよびセファロ一スビーズから選択され る、 請求項 10記載の方法。
12. 前記標的物質が固相に固定化されている、 請求項 1〜1 1のいずれかに 記載の方法。
13. 前記標的物質が固定化されている固相が、 磁性ビーズである、 請求項 1 2記載の方法。
14. mRNA—ピューロマイシン . リンカ一連結体を作製するための、 固相 に固定化されている固定化ピュー口マイシン · リンカー。
15. 前記固相が、 ビーズ、 基板、 容器およびメンブレンから選択される、 請 求項 14記載の固定化ピューロマイシン · リンカ一。
16. 前記固相が、 ビーズである、 請求項 15記載の固定化ピューロマイシ ン · リンカー。
17. 前記ビーズが、 .磁性ビーズである、 請求項 16記載の固定化ピューロマ イシン · リンカー。
18. リンカ一に設けられた固相結合部位と、 固相に設けられた固相結合部位 認識部位との結合を介して結合されている請求項 14〜17のいずれかに記載の 固定化ピューロマイシン ' リンカ一。
19. mRNAと、 固相に固定化されている固定化ピューロマイシン ' リンカ 一とを連結する工程を含む、 固定化 mRNA—ピューロマイシン ' リンカ一連結 体の製造方法。
20. mRNAと、 固相に固定化されている固定化ピューロマイシン ' リンカ 一とを連結して固定化 mRNA—ピューロマイシン · リンカ一連結体を調製する 工程；および、 該固定化 mRNA—ピューロマイシン ' リンカ一連結体と翻訳系 とを接触させることによってタンパク質を合成する工程を含む、 mRNA—ピュ 一口マイシン ' リンカ一一タンパク質連結体
の製造方法。
21. (a) mRNAと、 固相に固定化されている固定化ピューロマイシン · リンカ一とを連結して固定化 mRNA—ピューロマイシン · リンカ一連結体を調 製する工程；
(b) 該固定化 mRNA—ピューロマイシン · リンカ一連結体と翻訳 とを接触 させることによってタンパク質を合成した後、 逆転写反応に供することを含む、 mRNAZc DNA—ピューロマイシン · リンカー—タンパク質連結体を調製す る工程； '
(c) 標的物質と、 該 mRNA/c DNA—ピューロマイシン · リンカ一—タン パク質連結体とを接触させることによって、 該標的物質と相互作用するタンパク 質を含む mRNAZc DNA—ピューロマイシン · リンカ一一タンパク質連結体 を選択する工程；
を含む、 標的物質と相互作用するタンパク質のスクリーニング方法。
22. 標的物質あるいは標的分子結合磁性体と、 mRNAZcDNA—ピュー ロマイシン ' リンカ一—タンパク質連結体とを接触させることによって、 該標的 物質と相互作用するタンパク質を含む mRNAZc DNA—ピューロマイシン · リンカ一一タンパク質連結体を選択する工程を含む、 標的物質と相互作用する夕 ンパク質のスクリーニング方法を実施するタンパク質のスクリーニング装置であ つて、 標的物質、 mRNAZcDNA—ピューロマイシン · リンカ一一タンパク 質磁性連結体、 試薬及びバッファーを投入するための投入口と、 使用後の試薬、 バッファー及び反応副生成物を排出するための排出口と、 磁力によって mRNA /c DNA—ピューロマイシン ' リンカ一—タンパク質磁性連結体、 標的分子結 合磁性体を回収する手段とを設けた反応器を備えることを特徴とするタンパク質 のスクリーニング装置。
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