WO2012026541A1 - タンパク質又はペプチドのプリンティング方法、及び、タンパク質アレイ又はペプチドアレイ、並びに、機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法 - Google Patents

タンパク質又はペプチドのプリンティング方法、及び、タンパク質アレイ又はペプチドアレイ、並びに、機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法 Download PDF

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peptide
micro
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一木　隆範
マニッシュ ビヤニ
博文 塩野
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国立大学法人東京大学
株式会社ニコン
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    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J19/0046—Sequential or parallel reactions, e.g. for the synthesis of polypeptides or polynucleotides; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making molecular arrays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
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    • C07K17/14—Peptides being immobilised on, or in, an inorganic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B20/00—Methods specially adapted for identifying library members
    • C40B20/02—Identifying library members by their fixed physical location on a support or substrate

Definitions

  • the present invention relates to protein or peptide printing methods, arrays produced by these methods, and functional protein or functional peptide identification methods using the arrays.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2010-191060 filed in Japan on August 27, 2010 and Japanese Patent Application No. 2010-258302 filed on November 18, 2010 in Japan. , The contents of which are incorporated herein.
  • a micro contact printing method (hereinafter, referred to as a ⁇ CP method) capable of large-area patterning on the sub-micro order has attracted attention. Since the ⁇ CP method does not require a strong acid or a strong base necessary for photolithography patterning, it is applied to patterning proteins and other biomolecules.
  • Non-Patent Document 1 silicon rubber used for printing is subjected to low-temperature plasma treatment to increase the hydrophilicity of the silicon rubber surface. Thereby, denaturation etc. of biomolecules, such as protein, are controlled.
  • Non-Patent Document 1 uses a relief printing technique and is a method of directly printing biomolecules such as protein, the protein used as ink is easily dried. There is room for improvement as a method for printing proteins with low storage stability.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and reduces the damage to a protein or peptide having low storage stability, and can be used to print the protein or peptide in an arbitrary shape. It is an object of the present invention to provide a method, an array produced by these methods, and a method for identifying a functional protein or functional peptide using the array.
  • the protein or peptide printing method comprises: (a) a micro-intaglio plate comprising micro-recesses having a specific opening shape, and preparing a nucleic acid and cell-free protein synthesis system in the micro-recesses And (b) a step of superimposing a substrate on the micro-intaglio so as to contact a protein or peptide described later in the micro-recess, and (c) the cell-free protein synthesis system in the micro-recess And a step of synthesizing a protein or peptide from the nucleic acid using the method and immobilizing the protein or peptide on the substrate along a specific opening shape of the microrecess.
  • the protein or the peptide includes an amino acid sequence as a solid phase binding site, and the substrate has a solid phase binding having an affinity for the amino acid sequence. It is preferable to have a site recognition site.
  • the solid-phase binding site recognition site is preferably a nickel ion or a cobalt ion.
  • the amino acid sequence is preferably polyhistidine.
  • the protein or peptide printing method includes: (a) a micro-intaglio plate composed of micro-recesses having a specific opening shape, wherein a nucleic acid, a biotinylated puromycin derivative, and A step of preparing a cell-free protein synthesis system, and (b) a step of superimposing a substrate modified with avidin so as to come into contact with a protein or peptide described later in the microrecessed portion on the microintaglio plate, (c) ) In the microrecess, the protein or peptide is synthesized from the nucleic acid using the cell-free protein synthesis system, and the protein or peptide is immobilized on the substrate along a specific opening shape of the microrecess.
  • the biotinylated puromycin derivative is preferably a compound represented by the following general formula (1).
  • Z represents a group represented by the following formula (2), (3), or (4).
  • at least one of X 1 and X 2 is a group represented by the following formula (5), and the other is a fluorescent group or a hydrogen atom. * Represents a binding site.
  • Z is preferably a group represented by the formula (2).
  • the cell-free protein synthesis system comprises only factors necessary for protein synthesis independently purified.
  • the nucleic acid in the step (a), is DNA modified at a solid phase binding site and modified at a solid phase binding site recognition site. It is preferable that it is fixed by magnetic beads.
  • the nucleic acid in the step (a), is DNA modified with biotin and immobilized by magnetic beads modified with streptavidin. It is preferable.
  • a protein array or peptide array according to an embodiment of the present invention is manufactured using the protein or peptide printing method.
  • the method for identifying a functional protein or functional peptide includes the step (c) of performing functional screening using a protein array or peptide array and identified by the functional screening.
  • the protein or peptide immobilized in step (a) is identified using the nucleic acid in the corresponding microrecess in step (a).
  • a protein array or peptide array in which the protein or peptide is printed in an arbitrary shape can be obtained without damaging the protein or peptide with low storage stability.
  • the utility value is high.
  • the method for identifying a functional protein or functional peptide of the present invention can quickly identify a protein or peptide having a desired function from a densified protein array or peptide array. Preferably used.
  • the protein or peptide printing method of the present embodiment comprises: (A) a step of preparing a nucleic acid 3 and a cell-free protein synthesis system 9 in the microrecess 2 in the micro intaglio 1 comprising a plurality of microrecesses 2 having a specific opening shape; (B) a step of superimposing the substrate 5 on the micro-intaglio 1 so as to come into contact with the protein or peptide 7 to be described later synthesized in the micro-recess 2; (C) In the microrecess 2, a protein or peptide 7 is synthesized from the nucleic acid 3 using the cell-free protein synthesis system 9, and the protein or peptide 7 is on the substrate 5 and the microrecess 2 has And a step of fixing along a specific opening shape.
  • each step will be described with reference to FIGS. 2A to 2E.
  • Step (a) is a step of preparing a nucleic acid and cell-free protein synthesis system 19 in the microrecess 12 in the micro intaglio plate 11 composed of the microrecess 12 having a specific opening shape.
  • the micro intaglio 11 is preferably composed of a plurality of minute recesses 12.
  • the micro intaglio 11 composed of the micro concave portions 12 each having a wall is used, there is no concern about leakage between the spots when the protein or peptide 17 is printed on the substrate 15, and the micro intaglio plate 11 is fine.
  • the pattern of the shape can be printed, and in the step (c) described later, the specific opening shape of the minute recess 12 is printed on the substrate 15 as it is and reflected in the spot shape. Therefore, the densified protein array 18 can be manufactured by the shape.
  • the spot shape on the substrate 15 depends on the opening shape of the minute recess 12, in this embodiment, the spot shape on the substrate 15 can be determined by an arbitrary shape.
  • the number of DNA molecules immobilized on the DNA microarray is limited, in this embodiment, since a multimolecular DNA can be added on the micro intaglio 11, the cell-free method described later
  • a protein having a large number of molecules can be synthesized, and a protein array in which a protein having a large number of molecules per spot is immobilized can be produced.
  • the transfer stage and the translation stage can be performed at a time, which is efficient.
  • the surface of the micro intaglio 11 and the inner wall of the micro recess 12 can be suitably coated with a blocking agent for preventing nonspecific adsorption of biomolecules such as DNA, for example, polyethylene glycol (PEG) or 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC). .
  • a blocking agent for preventing nonspecific adsorption of biomolecules such as DNA, for example, polyethylene glycol (PEG) or 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC).
  • the substrate material used for the micro intaglio 11 is preferably a transparent glass or polymer material, and more preferably an elastomer material such as polydimethylsiloxane for the purpose of suppressing leakage.
  • an elastomer material such as polydimethylsiloxane for the purpose of suppressing leakage.
  • the nucleic acid prepared in the minute recess 12 is not particularly limited as long as it encodes a protein or peptide used for printing, but is preferably DNA or mRNA, and is DNA from the viewpoint of ease of handling. It is preferable.
  • the DNA is preferably immobilized in the micro intaglio 11 in view of the necessity of specifying the position information of the DNA.
  • DNA is modified with a functional group such as an amino group, an aldehyde group, or an SH group, and the solid phase is a silane having an amino group, an aldehyde group, an epoxy group, or the like.
  • a method using a surface treatment with a coupling agent can be used, and a method using an avidin-biotin bond is particularly preferable. In this case, it is preferable to fix avidin on a solid phase and bind biotin to DNA.
  • the solid phase is preferably a bead from the viewpoint of recovering DNA later, and more preferably a magnetic bead from the viewpoint that it can be arranged in each microrecess 12 in the micro-intaglio 11 in a short time. preferable.
  • beads when beads are used, it is possible to immobilize DNA having a higher molecular weight than when immobilizing DNA on a substrate. Since the number of molecules of DNA is reflected in the number of molecules of protein synthesized using a cell-free protein synthesis system, according to this embodiment, the number of molecules per spot is higher than the method of producing a protein array from a DNA microarray. A protein having a large number of molecules can be immobilized.
  • a magnetic plate is disposed under the substrate material used for the micro intaglio 11.
  • the magnetic beads 14 can be easily and reliably disposed in the micro concave portion 12.
  • a magnet is disposed under the substrate material, and a dispersion liquid in which magnetic beads 14 having DNA 13 immobilized thereon is dispersed is dropped onto the substrate material.
  • the magnetic beads are attracted into the minute recesses 12 by the action of magnetic force by the magnetic beads 14 and the magnetic thin film, so that the magnetic beads are easily arranged.
  • the magnetic beads 14 are dispersed by appropriately moving the magnet in the direction parallel to the substrate, and the filling rate into the minute recesses 12 is improved.
  • the strength of the magnetic field applied to the bead-arranging substrate by the magnet is preferably 100 to 10,000 gauss. Further, since the magnetization of the magnetic plate remains after the magnet is removed, the magnetic beads 14 can continue to maintain a stable arrangement.
  • metals such as nickel, nickel alloy, iron and iron alloy can be suitably used.
  • the filling rate of the magnetic beads 14 into the micro-recesses 12 depends on the diameter of the micro-recesses 12. The filling rate is higher when the diameter of the micro-recesses 12 is slightly wider than the diameter of the magnetic beads 14, and preferably the diameter of the micro-recesses 12. Is 1-2 times the diameter of the magnetic beads. In addition, when filling one minute recess 12 with one magnetic bead 14, the depth of the minute recess 12 is preferably 1 to 2 times the diameter of the magnetic bead 14.
  • the minute recesses 12 are preferably hydrophilized, and when the minute recesses 12 are subjected to a hydrophilic treatment by irradiation with oxygen plasma or the like, filling of the microbeads 12 with magnetic beads dispersed therein is facilitated. , The filling rate is improved.
  • a mixture of a plurality of types of DNA such as a DNA library
  • a DNA amplification reagent is mixed with a DNA amplification reagent, and the mixture is diluted with an appropriate buffer or the like. You may dispense into.
  • a DNA library a mutant DNA library into which a gene mutation has been introduced may be used as it is suitably used for evolutionary molecular engineering applications.
  • the amplification reagent, and the dilution are not particularly limited.
  • the conditions of the micro intaglio 11 are set so that the DNA is suitable for amplification, and the reaction is performed.
  • Different types of DNA are amplified.
  • amplifying DNA it is preferable to use a PCR reaction, and a commercially available reaction solution necessary for the reaction can be used.
  • DNA in the microscopic recess 12 is fixed to a bead, if DNA is amplified so that biotin is taken up, coated with avidin, and the bead is used, the DNA can be easily obtained through an avidin-biotin bond. Can be immobilized on the beads.
  • a method for incorporating biotin into DNA for example, a method using a PCR primer labeled with biotin can be used.
  • the step (b) is a step of superimposing the substrate 15 on the micro-intaglio 11 so as to come into contact with a protein or peptide 17 described later synthesized in the micro-recess 12.
  • the step (b) uses an intaglio printing (intaglio printing) technique in which ink is put into a recessed portion of the plate and paper or the like is pressed from above.
  • a reaction solution is dropped onto the micro concave portion 12 which is a concave portion on the micro intaglio 11, and the substrate 15 is superposed on the micro intaglio 11 from above and pressed using a hand press or the like. Yes, protein or peptide 17 is printed on the substrate 15 in the step (c) described later.
  • the specific opening shape of the minute concave portion 12 is directly reflected in the shape of the spot on the substrate 15, according to the present embodiment, a protein or peptide having an arbitrary size and shape is printed on the substrate. be able to. Therefore, if the shape is fine, the shape of the transferred spot becomes fine. Such a fine shape makes it possible to produce a highly densified protein array or peptide array.
  • a protein or peptide can be synthesized from the nucleic acid without changing the positional information of the nucleic acid immobilized on the sequence, and the protein or the peptide can be printed on the substrate.
  • the opening shape of the minute recess 12 is arbitrary, but is preferably a shape that can be filled with at least one bead.
  • the opening shape of the minute recess 12 may be a circle, a square, a hexagon, a line, or the like.
  • the substrate 15 used in the step (b) examples include a glass substrate, a silicon substrate, a polymer substrate, and a metal substrate.
  • the surface of the substrate 15 to be overlapped with the micro intaglio 11 is not necessarily flat.
  • the unevenness may be processed to increase the surface area for fixing the protein or peptide 17.
  • the surface of the substrate in contact with the micro intaglio 11 is flat so that the reagent in all the micro recesses 12 on the micro intaglio 11 is sealed without leakage. Need to be.
  • the protein or peptide 17 is synthesized from the nucleic acid using the cell-free protein synthesis system 19 in the microrecess 12, and the protein or peptide 17 is formed on the substrate 15 and the microrecess 12. It is the process of fixing along the specific opening shape which has.
  • the cell-free protein synthesis system is a protein translation system composed of components having the ability to synthesize proteins extracted from appropriate cells.
  • This system includes ribosomes, translation initiation factors, translation elongation factors, dissociation factors, aminoacyl tRNA synthetases. Etc., and elements necessary for translation are included. Examples of such protein translation systems include Escherichia coli extract, rabbit reticulocyte extract, and wheat germ extract.
  • a reconstituted cell-free protein synthesis system in which the elements necessary for the translation are composed solely of independently purified factors. Since the reconstituted cell-free protein synthesis system can more easily prevent nuclease and protease from being mixed than when a conventional cell extract is used, translation efficiency can be improved. From the viewpoint of such translation efficiency, in this embodiment, it is preferable to use a reconstituted cell-free protein synthesis system as the cell-free protein synthesis system. By using such a system, the protein or peptide 17 is produced in the microrecess 12.
  • a protein to be synthesized is easily deactivated by decomposition or denaturation, it is necessary to maintain the protein in a stable state as much as possible when printing on a substrate.
  • the array 18 in which the inactivation of the protein is suppressed as much as possible can be manufactured.
  • RNA 16 can be obtained by transcription from immobilized DNA 13 encoding the protein to be screened by RNA polymerase.
  • RNA polymerase examples include T7 RNA polymerase.
  • the reaction may be performed in combination with other devices that control the temperature of the micro intaglio 11, the pH conditions in the micro recess 12, and the like.
  • a system in which transcription and translation are coupled may be used.
  • step (c) following the synthesis of the protein or peptide 17, the protein or peptide is immobilized on the substrate 15. Specifically, after adding necessary reagents and materials (nucleic acids) to the micro-recesses 12 on the micro-intaglio 11 in the step (a), the micro-intaglio 11 from above using the substrate 15 in the step (b). Seal and seal.
  • step (c) a series of transcription / translation reactions of DNA13 ⁇ mRNA16 ⁇ protein 17 proceed from the point where the reagent is mixed, and the tag of the translated protein 17 is bound to the substrate 15.
  • the protein or the peptide in order to fix a protein or peptide to a substrate, includes an amino acid sequence as a solid phase binding site, and the substrate has a solid phase binding site recognition site having affinity for the amino acid sequence. It is preferable to have.
  • Examples of such combinations of solid phase binding site / solid phase binding site recognition site include maltose binding protein / maltose, G protein / guanine nucleotide, polyhistidine / nickel or metal ions such as cobalt, glutathione-S-transferase / glutathione, Examples include various receptor proteins / ligands such as DNA-binding protein / DNA, antibody / antigen molecule (epitope), calmodulin / calmodulin-binding peptide, ATP-binding protein / ATP, or estradiol receptor protein / estradiol.
  • combinations of solid phase binding site / solid phase binding site recognition site include maltose binding protein / maltose, metal ions such as polyhistidine / nickel or cobalt, glutathione-S-transferase / glutathione, antibody / antigen molecule (Epitope) and the like are preferable, and a combination of metal ions such as polyhistidine / nickel or cobalt is most preferable from the viewpoint of ease of use.
  • polyhistidine hexamer or more is preferably used.
  • the solid-phase binding site recognition site is formed on the substrate based on a predetermined pattern such as a circular or square pattern having a predetermined pitch, a line pattern having a predetermined pitch, or a combination pattern thereof. May be.
  • a predetermined pattern such as a circular or square pattern having a predetermined pitch, a line pattern having a predetermined pitch, or a combination pattern thereof. May be.
  • the above-described protein or peptide is printed in an arbitrary size and shape according to the pattern of the solid-phase binding site recognition site patterned on the substrate.
  • the overlapped substrate 15 is peeled off from the micro intaglio 11 (step d).
  • the shape of the spot on the substrate 15 reflects the specific opening shape of the minute recess 12 as it is. Further, the spots on the substrate 15 are printed without changing the position information of the DNA 13 immobilized on the corresponding micro intaglio 11.
  • the substrate 15 on which the protein or peptide 17 is immobilized in this manner is washed with PBS or the like to produce a protein array or peptide array 18 (step e).
  • the protein or peptide printing method of this embodiment comprises: (A) In the micro intaglio plate 1 composed of the micro concave portion 2 having a specific opening shape, a step of preparing a nucleic acid 3, a biotinylated puromycin derivative 10, and a cell-free protein synthesis system 9 in the micro concave portion 2; (B) a step of superimposing the substrate 5 modified with avidin so as to come into contact with the protein or peptide 7 synthesized in the microrecess 2 with the micro-intaglio 1; (C) In the microrecess 2, a protein or peptide 7 is synthesized from the nucleic acid 3 using the cell-free protein synthesis system 9, and the protein or peptide 7 is on the substrate 5 and the microrecess 2 has And a step of fixing along a specific opening shape.
  • FIGS. 4A to 4E the same components as those shown in the schematic diagrams of the protein or peptide printing method of FIGS. 2A to 2E are denoted by the same reference numerals, and description thereof is omitted.
  • the nucleic acid prepared in the minute recess 12 is preferably DNA immobilized on a solid phase.
  • a method using an avidin-biotin bond is preferable, and a method in which avidin is immobilized on a solid phase and biotin is bound to DNA is more preferable.
  • the substrate 15 used in the step (b) is modified with avidin, and the biotinylated synthetic protein or peptide 17 can be immobilized in the step (c) described later.
  • avidin used for the modification of the substrate 15
  • streptavidin is preferable from the viewpoint of ease of use.
  • the biotinylated puromycin derivative 10 is a complex of puromycin and a biotinylated nucleotide.
  • Puromycin is a compound having a chemical structure similar to aminoacyl-tRNA at the 3 'end, and has a property of binding to the C-terminus of the synthesized protein when the protein is synthesized in a translation system. Therefore, in this embodiment, at the time of protein or peptide synthesis, in step (a), the biotinylated puromycin derivative 10 prepared in the microrecess 12 binds to the C-terminus of the synthesized protein or peptide 17. .
  • the biotinylated puromycin derivative is preferably a compound represented by the general formula (1).
  • Z is a group represented by the formula (2), (3), or (4). That is, the biotinylated puromycin derivative is more preferably a derivative in which deoxycytidylpuromycin, ribocytidylpuromycin, or deoxyuridylpuromycin is biotinylated.
  • Z is preferably a group represented by the formula (2), and the biotinylated puromycin derivative may be a biotinylated deoxy represented by the following formula (6).
  • a cytidylpuromycin derivative is particularly preferred.
  • X 1 and X 2 are a group represented by the following formula (5), and the other is a fluorescent group or a hydrogen atom.
  • X 1 and X 2 are a group (biotin) represented by the formula (5). Specifically, only X 1 or X 2 may be biotin, and both X 1 and X 2 may be biotin. Since the puromycin derivative has biotin, biotin is added to the C-terminus when the protein or peptide 17 is synthesized in step (c). Therefore, in this embodiment, it is not necessary to add a base sequence encoding hexahistidine or another peptide / protein tag to the end of cDNA used as a template.
  • a mutant DNA library is used as the nucleic acid prepared in the microrecess 12 in step (a)
  • DNA having a stop codon introduced in the coding region in the mutant DNA library there is a case.
  • a polyhistidine tag cannot be added to the C-terminal by a method in which a base sequence encoding polyhistidine is previously added to the 3 ′ end of the DNA.
  • biotin can be added to such a truncated protein. Therefore, the protein or peptide printing method of the present embodiment is suitably used for evolutionary molecular engineering techniques.
  • X 1 or X 2 when X 1 or X 2 is not biotin, X 1 or X 2 is a fluorescent group or a hydrogen atom.
  • the fluorescent group include fluorescent dyes commonly used for fluorescent labeling of proteins or peptides such as fluorescein, rhodamine, Cy dye, Alexa (registered trademark) Fluor, HiLyte (trade name) Fluor, and the like. Since the biotinylated puromycin derivative 10 has a fluorescent group, the amount of the protein or peptide immobilized in the produced protein array or peptide array can be confirmed by measuring the fluorescence intensity.
  • the concentration of the biotinylated puromycin derivative 10 in the total amount of the reaction solution added to the microrecesses 12 is preferably 1 ⁇ M to 100 ⁇ M, and more preferably 10 ⁇ M to 50 ⁇ M. When the concentration is 1 ⁇ M or more, the efficiency of protein biotinylation does not become too low, and when the concentration is 100 ⁇ M or less, the expression level of the protein does not become too low.
  • the protein to be synthesized is easily deactivated by decomposition or denaturation, it is necessary to maintain the protein in a stable state as much as possible when printing on a substrate.
  • the protein 17 synthesized in the minute recess 12 is printed on the substrate 15 as it is, an array 18 ′ in which protein inactivation is suppressed as much as possible can be produced.
  • the protein array or peptide array of this embodiment produced by using the protein or peptide printing method of this embodiment has an arbitrary spot shape and can cope with the increase in the density of spots. .
  • the protein array or peptide array is manufactured from the micro-intaglio at any time during use, denaturation of proteins and peptides on the array can be suppressed.
  • the functional protein or functional peptide identification method of the present embodiment is performed by performing functional screening using the above-described protein array or peptide array, and immobilizing in the step (c) specified by the functional screening.
  • the identified protein or peptide is identified using the nucleic acid in the corresponding microrecess.
  • the functional screening method depends on the desired function of the protein or peptide.
  • the following steps may be mentioned. First, similarly to the micro intaglio in the step (a), a micro intaglio corresponding to the position of the spot immobilized on the protein array or peptide array is prepared. Next, a solution necessary for measuring the activity of the protein or peptide is preliminarily filled in the microrecesses of the microintaglio, and the protein array or peptide array and the microintaglio are overlapped and reacted. By these steps, the activity of the protein or peptide on the array can be measured.
  • the protein array or peptide array produced by the protein or peptide printing method of this embodiment is printed on a substrate without changing the positional information of the nucleic acid immobilized on the corresponding micro-intaglio. Therefore, by using the protein array or the peptide array, the DNA in the microrecesses on the microintaglio corresponding to the spots specified by the functional screening is collected and analyzed for the specific function. And the like, and DNAs encoding the protein and the like can be identified.
  • a protein or peptide having a desired function can be rapidly identified from a densified protein array or peptide array. Is preferably used.
  • the protein or peptide printing method of the present embodiment the protein or peptide is synthesized in a microstructure such as a microwell mold, and the synthesized protein or peptide is formed into a substrate in a fine pattern shape. Can be immobilized on the surface. Therefore, according to the protein or peptide printing method of the present embodiment, proteins of any size and shape can be printed on the substrate.
  • PURESYSTEM (trade name) classic II (manufactured by Biocommer) was used to synthesize the protein. Specifically, 5 ⁇ l (0.1 ⁇ g / ⁇ l) of PCR product was mixed with 35 ⁇ l of PURESYSTEM TM class II lysate (transcription / translation system mixture) followed by 2 ⁇ l of fluorescently labeled biotinylated puromycin-nucleotide complex. 8 ⁇ l was added to each well of a 384 well microtiter plate to which (final concentration: 2-40 ⁇ M) had been previously added. The reaction was carried out at 37 ° C.
  • lane 1 is a GFP expression sample to which no fluorescently labeled biotinylated puromycin-nucleotide complex and no fluorescently labeled puromycin-nucleotide complex are added
  • lane 2 is a GFP expression to which 10 ⁇ M of fluorescently labeled puromycin-nucleotide complex is added.
  • lane 3 is a GFP expression sample to which 2 ⁇ M of fluorescently labeled biotinylated puromycin-nucleotide complex is added
  • lane 4 is a GFP expression sample to which 10 ⁇ M of fluorescently labeled biotinylated puromycin-nucleotide complex is added
  • lane 5 is fluorescently labeled biotin GFP expression sample to which 40 ⁇ M of purified puromycin-nucleotide complex was added, the arrow indicates the target protein GFP.
  • the upper and lower electrophoresis results are obtained by analyzing the same gel using different imaging methods.
  • the upper row (GreenScan) is the result of acquiring a fluorescent image by GFP
  • the lower row is the result of acquiring a fluorescent image by Cy5.
  • the expression of GFP was confirmed.
  • the expression of biotinylated GFP incorporating the fluorescently labeled biotinylated puromycin-nucleotide complex was confirmed.
  • the fluorescence intensity derived from GFP was detected more strongly in lane 4.
  • the Cy5 fluorescence intensity was detected more strongly in lane 5. From these results, it was confirmed that the sample to which 40 ⁇ M of the fluorescently labeled biotinylated puromycin-nucleotide complex was added had particularly high biotinylation efficiency.
  • the slide glass coated with streptavidin was peeled off from the 384-well microtiter plate intaglio and washed 3 times with PBS 1x wash buffer (100 mM Phosphate, 150 mM NaCl, 0.05% Triton X-100) for 15 seconds. Further, it was rinsed with water and air-dried. Whether or not the GFP protein is patterned on the slide glass was confirmed by GFP-derived fluorescence using a FluoroImager). The results are shown in FIG.
  • the upper left spot is a GFP expression sample to which 10 ⁇ M of fluorescently labeled puromycin-nucleotide complex is added
  • the upper right spot is a GFP expression sample to which 2 ⁇ M of fluorescently labeled biotinylated puromycin-nucleotide complex is added
  • the lower left spot is A GFP expression sample to which 10 ⁇ M of fluorescently labeled biotinylated puromycin-nucleotide complex is added
  • the lower right spot represents a GFP expression sample to which 40 ⁇ M of fluorescently labeled biotinylated puromycin-nucleotide complex is added.
  • biotinylated protein or biotinylated peptide was synthesized in a microstructure such as a microwell mold, and the synthesized biotinylated protein or biotinylated The peptide can be immobilized on the surface of the substrate modified with avidin in a fine pattern shape. Therefore, according to the protein or peptide printing method of the present embodiment, proteins of any size and shape can be easily and efficiently printed on a substrate.
  • the protein array or peptide array of the present embodiment is simply and efficiently produced using the protein or peptide printing method of the present embodiment as described above, diagnosis has recently been made at the gene level. It is possible to flexibly deal with single nucleotide polymorphism (SNP) analysis of genes related to lifestyle-related diseases and cancer, and pathogenic bacteria and virus genes. And according to the protein array or peptide array of this embodiment, such single nucleotide polymorphism diagnosis can be performed rapidly and in detail at a protein level.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the present invention can be used in the field of single nucleotide polymorphism analysis of genes related to lifestyle-related diseases and cancer, and pathogenic bacteria and viral genes.

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Abstract

（ａ）特定の開口形状を有する微小凹部からなるマイクロ凹版において、前記微小凹部内に、核酸と無細胞タンパク質合成系を用意する工程と、（ｂ）前記微小凹部中で合成される後記タンパク質又はペプチドと接触するように基板を前記マイクロ凹版と重ね合わせる工程と、（ｃ）前記微小凹部内において、前記無細胞タンパク質合成系を用いて前記核酸からタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドを前記基板上に、前記微小凹部が有する特定の開口形状に沿って固定化する工程と、を有する。

Description

タンパク質又はペプチドのプリンティング方法、及び、タンパク質アレイ又はペプチドアレイ、並びに、機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法
本発明は、タンパク質又はペプチドのプリンティング方法、及び、これらの方法により製造されたアレイ、並びに、該アレイを用いた機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法に関する。本願は、２０１０年８月２７日に、日本に出願された特願２０１０－１９１０６０号、及び２０１０年１１月１８日に、日本に出願された特願２０１０－２５８３０２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年、基板への分子パターニング方法は、バイオチップやバイオセンサーといった様々な生物学的用途に用いられている。
特に、サブマイクロオーダーでの大面積パターニングが可能なマイクロコンタクトプリント法（以下、μＣＰ法）が注目を集めている。μＣＰ法は、ホトリソグラフィックパターニングに必要な強酸や強塩基を必要としないため、タンパク質や他の生体分子のパターニングに適用されている。
しかしながら、タンパク質や他の生体分子は、変性や分解を受けやすいものであるため、上記μＣＰ法においても様々な改良が行われてきている（例えば、非特許文献１）。
非特許文献１で提案されている方法は、プリントに用いるシリコンゴムを低温プラズマ処理し、シリコンゴム表面の親水性を増加させたものである。これにより、タンパク質等の生体分子の変性等が抑制される。
Ｊａｍｅｓら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、第１４巻、第７４１～７４４頁、１９９８年
しかしながら、非特許文献１で提案されている方法は、凸版印刷技術を利用したものであり、タンパク質等の生体分子を直接プリンティングする方法であるため、インクとして用いられる該タンパク質は乾燥しやすく、例えば保存安定性の低いタンパク質をプリンティングする方法としては改良の余地がある。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、保存安定性の低いタンパク質又はペプチドに与えるダメージを低減し、前記タンパク質又はペプチドを任意の形状にプリントすることができるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法、及び、これらの方法により製造されたアレイ、並びに、該アレイを用いた機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法を提供することを目的とする。
本発明者らは上記の課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、凹版印刷（インタリオプリンティング）技術を応用することにより課題を解決できることを見出した。
すなわち本発明の一実施態様は、下記（１）～（１２）を提供するものである。
（１）本発明の一実施態様におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法は、（ａ）特定の開口形状を有する微小凹部からなるマイクロ凹版において、前記微小凹部内に、核酸と無細胞タンパク質合成系を用意する工程と、（ｂ）前記微小凹部中で合成される後記タンパク質又はペプチドと接触するように基板を前記マイクロ凹版と重ね合わせる工程と、（ｃ）前記微小凹部内において、前記無細胞タンパク質合成系を用いて前記核酸からタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドを前記基板上に、前記微小凹部が有する特定の開口形状に沿って固定化する工程と、を有することを特徴とする。
（２）本発明の一実施態様におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法は、前記タンパク質又は前記ペプチドは、固相結合部位としてのアミノ酸配列を含み、前記基板は前記アミノ酸配列に親和性を有する固相結合部位認識部位を有することが好ましい。
（３）本発明の一実施態様におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法は、前記固相結合部位認識部位は、ニッケルイオン又はコバルトイオンであることが好ましい。
（４）本発明の一実施態様におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法は、前記アミノ酸配列は、ポリヒスチジンであることが好ましい。
（５）本発明の一実施態様におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法は、（ａ）特定の開口形状を有する微小凹部からなるマイクロ凹版において、前記微小凹部内に、核酸と、ビオチン化ピューロマイシン誘導体と、無細胞タンパク質合成系を用意する工程と、（ｂ）前記微小凹部中で合成される後記タンパク質又はペプチドと接触するようにアビジンで修飾された基板を前記マイクロ凹版と重ね合わせる工程と、（ｃ）前記微小凹部内において、前記無細胞タンパク質合成系を用いて前記核酸からタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドを前記基板上に、前記微小凹部が有する特定の開口形状に沿って固定化する工程と、を有することを特徴とする。
（６）本発明の一実施態様におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法は、前記ビオチン化ピューロマイシン誘導体は、下記一般式（１）で表される化合物であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 ［式中、Ｚは、下記式（２）、（３）、又は（４）で表される基である。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ［式中、Ｘ１及びＸ２のうち少なくとも一方は、下記式（５）で表される基であり、他方は、蛍光基又は水素原子である。＊は結合部位を表す。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 ［式中、＊は結合部位を表す。］
（７）本発明の一実施態様におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法は、Ｚは、前記式（２）で表される基であることが好ましい。
（８）本発明の一実施態様におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法は、前記無細胞タンパク質合成系は、独立に精製されたタンパク質合成に必要な因子のみからなることが好ましい。
（９）本発明の一実施態様におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法は、前記工程（ａ）において、前記核酸は固相結合部位で修飾されたＤＮＡであり、固相結合部位認識部位で修飾された磁気ビーズにより固定化されたものであることが好ましい。
（１０）本発明の一実施態様におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法は、前記工程（ａ）において、前記核酸はビオチンで修飾されたＤＮＡであり、ストレプトアビジンで修飾された磁気ビーズにより固定化されたものであることが好ましい。
（１１）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイ又はペプチドアレイは、前記タンパク質又はペプチドのプリンティング方法を用いて製造されたことを特徴とする。
（１２）本発明の一実施態様における機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法は、タンパク質アレイ又はペプチドアレイを用いて、機能性スクリーニングを行い、前記機能性スクリーニングにより特定された、前記工程（ｃ）において固定化されたタンパク質又はペプチドを、前記工程（ａ）において対応する微小凹部内の核酸を用いて同定することを特徴とする。
本発明のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法によれば、保存安定性の低いタンパク質やペプチドにダメージを与えずに、前記タンパク質又は前記ペプチドが任意の形状にプリントされたタンパク質アレイ又はペプチドアレイが得られる。
本発明によれば、前記タンパク質アレイ又は前記ペプチドアレイを高密度化することも可能であり、かかる高密度タンパク質アレイ又は高密度化ペプチドアレイは、膨大な種類のタンパク質又はペプチドが固定化されているだけではなく、１スポット当たりに多分子数のタンパク質又はペプチドが固定化されたものであるため、利用価値が高い。
　また、本発明の機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法は、高密度化タンパク質アレイ又はペプチドアレイから所望の機能を有するタンパク質又はペプチドを迅速に同定することができるため、進化分子工学的用途に好適に用いられる。
本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。 本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。 本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。 本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。 本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。 本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。 本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。 本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。 本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。 本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。 本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。 本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。 本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。 本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。 本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。 本実施形態におけるタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図である。 実施例において、磁気ビーズを封入した凹版の顕微鏡像である。 実施例におけるＧＦＰ－Ｈｉｓタグタンパク質をパターニングしたガラス基板の蛍光顕微鏡像である。 実施例におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果である。 実施例におけるＧＦＰタンパク質をパターニングしたスライドガラスの蛍光画像である。
　≪タンパク質又はペプチドのプリンティング方法≫
［第１実施形態］
図１Ａ～図１Ｃに示されるように、本実施形態のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法は、
（ａ）特定の開口形状を有する複数の微小凹部２からなるマイクロ凹版１において、前記微小凹部２内に、核酸３と無細胞タンパク質合成系９を用意する工程と、
（ｂ）前記微小凹部２中で合成される後記タンパク質又はペプチド７と接触するように基板５を前記マイクロ凹版１と重ね合わせる工程と、
（ｃ）前記微小凹部２内において、前記無細胞タンパク質合成系９を用いて前記核酸３からタンパク質又はペプチド７を合成し、前記タンパク質又はペプチド７を前記基板５上に、前記微小凹部２が有する特定の開口形状に沿って固定化する工程と、を有することを特徴とする。
以下、図２Ａ～図２Ｅを参照しながら、各工程について説明する。
工程（ａ）は、特定の開口形状を有する微小凹部１２からなるマイクロ凹版１１において、前記微小凹部１２内に、核酸と無細胞タンパク質合成系１９を用意する工程である。
前記マイクロ凹版１１は、複数の微小凹部１２からなることが好ましい。本実施形態においては、個々に壁を有する微小凹部１２からなるマイクロ凹版１１を用いるため、基板１５へのタンパク質又はペプチド１７のプリントの際に、各スポット間のリーク等の心配が無く、微細な形状のパターン印刷が可能となり、後記する工程（ｃ）において、前記微小凹部１２の有する特定の開口形状がそのまま基板１５上にプリントされ、スポット形状に反映される。
よって、該形状により、高密度化タンパク質アレイ１８の製造が可能となる。更に、基板１５上のスポット形状は、前記微小凹部１２の開口形状に依存するため、本実施形態においては、任意の形状にて基板１５上のスポット形状を決めることができる。
また、ＤＮＡマイクロアレイ上に固定化するＤＮＡの分子数には制限があるのに対し、本実施形態においては、マイクロ凹版１１上に多分子数のＤＮＡを添加することができるため、後記する無細胞タンパク質合成系を用いることにより、多分子数のタンパク質を合成することができ、１スポット当たり多分子数のタンパク質を固定化したタンパク質アレイを作製することができる。また、本実施形態では、微小凹部１２からなるマイクロ凹版１１を用いるため、転写段階と翻訳段階とを１度に行うことができ、効率的である。
マイクロ凹版１１の表面及び微小凹部１２内壁を、ＤＮＡ等生体分子の非特異吸着防止用ブロッキング剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）で好適にコーティングすることができる。かかるブロッキング剤をコーティングすることで、基板表面や微小反応槽の内壁への生体分子の非特異吸着を抑制することができる。
マイクロ凹版１１に用いられる基板材料は、透明なガラス又はポリマー材であることが好ましく、リークを抑える目的からは、ポリジメチルシロキサンなどのエラストマー材料であることがより好ましい。なお、マイクロ凹版１１に用いられる基板材料にエラストマー材料を用いる場合、微小なゴミなどの粒子が凹版と基板１５との間に挟まれた時に生じる凹版全体の基板との密着性に及ぼす悪影響がエラストマーの局所的な変形により回避される利点がある。
工程（ａ）において、微小凹部１２内に用意される核酸は、プリンティングに用いられるタンパク質又はペプチドをコードするものであれば特に限定されないが、ＤＮＡ又はｍＲＮＡが好ましく、取り扱い安さの観点からＤＮＡであることが好ましい。
該ＤＮＡは、マイクロ凹版１１において、該ＤＮＡの位置情報が特定されている必要性の観点から固定化されていることが好ましい。
固定化には、アビジン－ビオチン結合を利用する方法の他、ＤＮＡをアミノ基、アルデヒド基、ＳＨ基、などの官能基で修飾し、固相をアミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理したものを利用する方法などを用いることができ、特に、アビジン－ビオチン結合を利用した方法が好ましい。この場合、アビジンを固相に固定化し、ビオチンをＤＮＡに結合させたものが好ましい。
前記固相は、後にＤＮＡを回収する観点から、ビーズであることが好ましく、短時間でマイクロ凹版１１中の各微小凹部１２に配列させることが可能であるという観点から磁気ビーズであることがより好ましい。
また、ビーズを用いる場合には、基板上にＤＮＡを固定する場合より多分子数のＤＮＡを固定することができる。かかるＤＮＡの分子数は、無細胞タンパク質合成系を用いて合成されるタンパク質の分子数に反映されるため、本実施形態によれば、ＤＮＡマイクロアレイからタンパク質アレイを作製する方法よりも１スポット当たりに多分子数のタンパク質を固定することができる。
本実施形態において、固相として磁気ビーズを用いる場合には、マイクロ凹版１１に用いられる基板材料下に、磁性体板が配設されていることが好ましい。
かかる構造のマイクロ凹版１１を用いることにより、微小凹部１２内に磁気ビーズ１４を容易にかつ確実に配置することができる。具体的には、該基板材料の下部に磁石を配置し、該基板材料上にＤＮＡ１３を固定した磁気ビーズ１４を分散させた分散液を滴下する。磁気ビーズ１４及び磁性体薄膜による磁力の作用により、微小凹部１２内へ磁気ビーズが誘引されることにより配置されやすくなる。さらに磁石を適宜基板に対し平行方向に動かすことで磁気ビーズ１４が分散し、微小凹部１２内への充填率が向上する。磁石によりビーズ配置用基板に印加する磁場の強さは、所望の効果を得る上で、好ましくは１００～１００００ガウスである。
また、磁石を取り除いた後も磁性体板の磁化は残るため、磁気ビーズ１４は安定した配置を保持し続けることが可能となる。
かかる磁性体の材料としては、ニッケル、ニッケル合金、鉄および鉄合金などの金属を好適に用いることができ、本実施形態においては残留磁化の大きな磁性材料を用いることが好ましい。
磁気ビーズ１４の微小凹部１２への充填率は微小凹部１２の直径に依存し、微小凹部１２の直径が磁気ビーズ１４の直径よりも若干広い方が充填率が高く、好ましくは微小凹部１２の径は磁気ビーズの直径の１～２倍である。また、１個の微小凹部１２に１個の磁気ビーズ１４を充填する上で、微小凹部１２の深さは、好ましくは磁気ビーズ１４の直径の１～２倍である。
微小凹部１２は、親水化されていることが好ましく、該微小凹部１２を酸素プラズマ照射などにより親水化処理することにより、微小凹部１２内部への磁気ビーズを分散させた液の充填が容易になり、充填率が向上する。
本実施形態において、微小凹部１２内に核酸を用意する際には、ＤＮＡライブラリーなど複数種類のＤＮＡの混合物をＤＮＡ増幅試薬と混合し、混合物を適当なバッファーなどで希釈して、微小凹部１２に分注してもよい。また、ＤＮＡライブラリーとしては、進化分子工学的用途に好適に用いられるものとして、遺伝子変異が導入された変異ＤＮＡライブラリーを用いてもよい。ここで、各微小凹部１２に確率的にＤＮＡが１分子になるように希釈して分注を行うことが好ましい。ＤＮＡと増幅試薬と希釈との前後は特に限定するものではなく、分注後、ＤＮＡが増幅するのに適するように、マイクロ凹版１１の条件を設定し、反応を行わせると、微小凹部１２毎に異なる種類のＤＮＡが増幅される。
ここで、ＤＮＡを増幅する場合、ＰＣＲ反応を利用することが好ましく、該反応のために必要な反応溶液な市販のものを使用することができる。また、微小凹部１２内のＤＮＡをビーズに固定する場合、ＤＮＡにビオチンが取り込まれるように増幅反応を行わせ、アビジンでコートしてビーズを用いれば、アビジン－ビオチン結合を介して、ＤＮＡは容易にビーズ上に固定化することができる。ＤＮＡにビオチンを取り込ませる方法としては、例えば、ビオチン標識したＰＣＲプライマーを用いる方法などを利用することができる。
工程（ｂ）は、前記微小凹部１２中で合成される後記タンパク質又はペプチド１７と接触するように基板１５を前記マイクロ凹版１１と重ね合わせる工程である。
前記工程（ｂ）は、版の凹んだ部分にインクをいれ、上から紙などを押し当てる凹版印刷（インタリオプリンティング）技術を利用したものである。前記工程（ｂ）は、マイクロ凹版１１上の凹部である微小凹部１２に反応溶液を滴下し、上から基板１５を前記マイクロ凹版１１と重ね合わせ、ハンドプレス器等を用いて、押し当てる工程であり、後記工程（ｃ）において、基板１５上にタンパク質又はペプチド１７がプリントされる。よって、微小凹部１２の有する特定の開口形状がそのまま基板１５でのスポットの形状に反映されることになるため、本実施形態によれば、基板に任意のサイズ及び形状のタンパク質又はペプチドを印刷することができる。従って、該形状が微細であれば、転写されるスポットの形状も微細なものとなる。かかる微細な形状により、高密度化したタンパク質アレイ又はペプチドアレイの作製が可能となる。
　更に、後記工程（ｃ）により、配列上に固定化された核酸の位置情報を変更することなく、該核酸からタンパク質又はペプチドを合成し、該タンパク質又は該ペプチドを基板上にプリントすることができる。
　前記微小凹部１２が有する前記開口形状は任意であるが、少なくとも１つのビーズを充填可能な形状であることが好ましい。例えば、前記微小凹部１２が有する前記開口形状は、円形状、四角状、六角状、ライン状、などであってもよい。
前記工程（ｂ）において用いられる基板１５としては、ガラス基板、シリコン基板、ポリマー基板、金属基板等が挙げられる。
本実施形態においては、マイクロ凹版１１と重ね合わせる基板１５の表面は必ずしも平坦である必要はなく、例えば、タンパク質又はペプチド１７を固定する表面積を増やすために凹凸を加工してもよい。ただし、基板１５とマイクロ凹版１１を重ね合わせた際に、マイクロ凹版１１上の全ての微小凹部１２内の試薬等の漏れがなく封じられるように、マイクロ凹版１１が接触する部分の基板表面は平坦である必要がある。
工程（ｃ）は、前記微小凹部１２内において、前記無細胞タンパク質合成系１９を用いて前記核酸からタンパク質又はペプチド１７を合成し、前記タンパク質又はペプチド１７を前記基板１５上に、前記微小凹部１２が有する特定の開口形状に沿って固定化する工程である。
無細胞タンパク質合成系とは、適当な細胞から抽出されたタンパク質合成能を有する成分からなるタンパク質翻訳系であり、この系にはリボゾーム、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素等、翻訳に必要な要素が含まれている。このようなタンパク質翻訳系として、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等が挙げられる。
更に、上記翻訳に必要な要素が独立に精製された因子のみからなる再構成型無細胞タンパク質合成系が挙げられる。再構成型無細胞タンパク質合成系は、従来の細胞抽出液を使用する場合よりもヌクレアーゼやプロテアーゼの混入を容易に防ぐことができるため、翻訳効率を高めることができる。かかる翻訳効率の観点から、本実施形態においては、無細胞タンパク質合成系として、再構成型無細胞タンパク質合成系を用いることが好ましい。
このような系を用いることにより、前記微小凹部１２内においてタンパク質又はペプチド１７が製造される。
合成されるタンパク質は、分解や変性により失活しやすいため、基板へのプリントの際にはできるだけ安定な状態で該タンパク質を維持する必要がある。本実施形態においては、微小凹部１２内で合成したタンパク質１７を、そのまま基板１５にプリントするため、タンパク質の失活を極力抑えたアレイ１８を作製することができる。
前記工程（ｃ）において、無細胞タンパク質合成系１９に用いられる核酸がＤＮＡ１３である場合には、無細胞タンパク質転写系を用いて前記ＤＮＡ１３からｍＲＮＡ１６を合成する工程が含まれる。前記ｍＲＮＡ１６は、スクリーニングすべきタンパク質をコードする固定化されたＤＮＡ１３から、ＲＮＡポリメラーゼにより転写させることにより得られる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
転写反応及び後述する翻訳反応を最適な状態で行わせるために、マイクロ凹版１１の温度、微小凹部１２内のｐＨ条件などを制御する他の装置などを組み合わせて、実施してもよい。
また、簡便であることから、転写翻訳がカップルした系を用いてもよい。
工程（ｃ）において、前記タンパク質又はペプチド１７の合成に続いて、前記タンパク質又はペプチドの基板１５への固定化が行われる。具体的には、工程（ａ）において、マイクロ凹版１１上の微小凹部１２に、必要な試薬や材料（核酸）を添加した後に、工程（ｂ）において、基板１５を用いて上からマイクロ凹版１１に封をし、密閉状態にする。工程（ｃ）において、試薬を混ぜた先から、ＤＮＡ１３→ｍＲＮＡ１６→タンパク質１７の一連の転写／翻訳反応が進行し、さらに翻訳されたタンパク質１７の有するタグが前記基板１５に結合する。
本実施形態において、タンパク質又はペプチドを基板に固定するため、前記タンパク質又は前記ペプチドは、固相結合部位としてのアミノ酸配列を含み、前記基板は前記アミノ酸配列に親和性を有する固相結合部位認識部位を有することが好ましい。
このような固相結合部位／固相結合部位認識部位の組み合わせとしては、マルトース結合タンパク質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジン／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合タンパク質／ＤＮＡ、抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、あるいはエストラジオール受容体タンパク質／エストラジオールなどの、各種受容体タンパク質／そのリガンドなどが挙げられる。
これらの中で、固相結合部位／固相結合部位認識部位の組合せとしては、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジン／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ／グルタチオン、抗体／抗原分子（エピトープ）などが好ましく、使い勝手の良さからポリヒスチジン／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオンの組合せが最も好ましい。
ポリヒスチジンとしては、ヘキサマー以上のものが好ましく用いられる。タンパク質又はペプチド中にポリヒスチジンを含ませるためには、ＰＣＲ等で予めｃＤＮＡの末端に該ポリヒスチジンをコードする塩基配列を付加しておくことが好ましい。
また、上記の固相結合部位認識部位は、該基板上において、所定ピッチの円形状や四角状のパターン、所定ピッチのラインパターン、又はそれらの組み合わせパターン、などの所定パターンに基づいて形成されていてもよい。この場合、上述のタンパク質又はペプチドは、基板にパターンニングされた固相結合部位認識部位のパターンに応じて、任意のサイズ及び形状で印刷される。
次に、重ね合わせた前記基板１５を前記マイクロ凹版１１から剥がす（工程ｄ）。前記基板１５でのスポットの形状は、前記微小凹部１２の有する特定の開口形状がそのまま反映されたものである。さらに、前記基板１５上のスポットは、対応するマイクロ凹版１１上に固定化されたＤＮＡ１３の位置情報を変更することなくプリントされたものである。
このようにしてタンパク質又はペプチド１７が固定化された基板１５をＰＢＳ等で洗浄して、タンパク質アレイ又はペプチドアレイ１８が製造される（工程ｅ）。
［第２実施形態］
図３Ａ～図３Ｃに示されるように、本実施形態のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法は、
（ａ）特定の開口形状を有する微小凹部２からなるマイクロ凹版１において、前記微小凹部２内に、核酸３と、ビオチン化ピューロマイシン誘導体１０と、無細胞タンパク質合成系９を用意する工程と、
（ｂ）前記微小凹部２中で合成される後記タンパク質又はペプチド７と接触するようにアビジンで修飾された基板５を前記マイクロ凹版１と重ね合わせる工程と、
（ｃ）前記微小凹部２内において、前記無細胞タンパク質合成系９を用いて前記核酸３からタンパク質又はペプチド７を合成し、前記タンパク質又はペプチド７を前記基板５上に、前記微小凹部２が有する特定の開口形状に沿って固定化する工程と、を有することを特徴とする。
以下、図４Ａ～図４Ｅを参照しながら、各工程について説明する。図４Ａ～図４Ｅにおいて、図２Ａ～図２Ｅのタンパク質又はペプチドのプリンティング方法の模式図に示されたものと同じ構成要素には、同一の符号を付して説明を省略する。
工程（ａ）において、微小凹部１２内に用意される核酸としては、固相に固定化されたＤＮＡが好ましい。固定化には、アビジン－ビオチン結合を利用した方法が好ましく、アビジンを固相に固定化し、ビオチンをＤＮＡに結合させた方法がより好ましい。
工程（ｂ）において用いられる基板１５はアビジンで修飾されており、後記工程（ｃ）において、ビオチン化された合成タンパク質又はペプチド１７を固定することができる。ここで、基板１５の修飾に用いられるアビジンとしては、使い勝手の良さからストレプトアビジンが好ましい。
本実施形態において、ビオチン化ピューロマイシン誘導体１０とは、ピューロマイシンとビオチン化されたヌクレオチドの複合体である。ピューロマイシンは、３’末端がアミノアシルｔＲＮＡに化学構造が類似している化合物であり、翻訳系においてタンパク質の合成がされた際に、合成されたタンパク質のＣ末端に結合する性質を有する。そのため、本実施形態においては、タンパク質又はペプチド合成の際、工程（ａ）において、微小凹部１２内に用意されたビオチン化ピューロマイシン誘導体１０が、合成されたタンパク質又はペプチド１７のＣ末端に結合する。
本実施形態において、前記ビオチン化ピューロマイシン誘導体は、前記一般式（１）で表される化合物であることが好ましい。前記一般式（１）において、Ｚは、前記式（２）、（３）、又は（４）で表される基である。
即ち、前記ビオチン化ピューロマイシン誘導体としては、デオキシシチジルピューロマイシン、リボシチジルピューロマイシン、デオキシウリジルピューロマイシンがビオチン化された誘導体がより好ましい。
更に、前記一般式（１）において、Ｚは、前記式（２）で表される基であることが好ましく、前記ビオチン化ピューロマイシン誘導体としては、下記式（６）で表されるビオチン化デオキシシチジルピューロマイシン誘導体であることが特に好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 ［式中、Ｘ１及びＸ２のうち少なくとも一方は、下記式（５）で表される基であり、他方は、蛍光基又は水素原子である。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 ［式中、＊は結合部位を表す。］
前記式（２）～（４）、（６）中、Ｘ１及びＸ２のうち少なくとも一方は、前記式（５）で表される基（ビオチン）である。具体的には、Ｘ１又はＸ２のみがビオチンであってもよく、Ｘ１及びＸ２の両方がビオチンであってもよい。ピューロマイシン誘導体がビオチンを有することにより、工程（ｃ）においてタンパク質又はペプチド１７が合成される際、そのＣ末端にビオチンが付加される。従って、本実施形態においては、鋳型として用いるｃＤＮＡの末端にヘキサヒスチジンや他のペプチド・タンパク質タグをコードする塩基配列を付加しておく必要がない。
また、工程（ａ）において、微小凹部１２内に用意される核酸として、変異ＤＮＡライブラリーを用いる場合には、該変異ＤＮＡライブラリー中に、コード領域中に終止コドンが導入されたＤＮＡが存在する場合がある。このようなＤＮＡを鋳型としてタンパク質を合成する場合、ＤＮＡの３’末端側に予めポリヒスチジンをコードする塩基配列を付加する方法では、Ｃ末端にポリヒスチジンタグを付加することができない。一方、本実施形態においては、このようなトランケート型のタンパク質にもビオチンを付加することができる。従って、本実施形態のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法は、進化分子工学的手法に好適に用いられる。
前記式（１）中、Ｘ１又はＸ２がビオチンでない場合、Ｘ１又はＸ２は、蛍光基又は水素原子である。蛍光基としては、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ 、ｒｈｏｄａｍｉｎｅ 、Ｃｙ　ｄｙｅ、Ａｌｅｘａ（登録商標）Ｆｌｕｏｒ、ＨｉＬｙｔｅ（商標名）Ｆｌｕｏｒ等、タンパク質又はペプチドの蛍光標識に汎用される蛍光色素が挙げられる。ビオチン化ピューロマイシン誘導体１０が蛍光基を有することにより、作製したタンパク質アレイ又はペプチドアレイ中に固定されたタンパク質又はペプチドの量を、蛍光強度を測定することにより確認することができる。
　微小凹部１２に添加された反応溶液総量におけるビオチン化ピューロマイシン誘導体１０の濃度としては、１μＭ～１００μＭが好ましく、１０μＭ～５０μＭがより好ましい。１μＭ以上の場合、タンパク質のビオチン化の効率が低くなりすぎず、１００μＭ以下の場合、タンパク質の発現量が低くなりすぎない。
　合成されるタンパク質は、分解や変性により失活しやすいため、基板へのプリントの際にはできるだけ安定な状態で該タンパク質を維持する必要がある。本実施形態においては、微小凹部１２内で合成したタンパク質１７を、そのまま基板１５にプリントするため、タンパク質の失活を極力抑えたアレイ１８’を作製することができる。
≪タンパク質アレイ又はペプチドアレイ≫
本実施形態のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法を用いて製造された本実施形態のタンパク質アレイ又はペプチドアレイは、任意のスポット形状を有するものであり、スポットの高密度化にも対応し得るものである。また、該タンパク質アレイ又はペプチドアレイは、使用時に、随時、前記マイクロ凹版から製造されるものであるため、アレイ上のタンパク質やペプチドの変性等を抑制することができる。
≪機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法≫
本実施形態の機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法は、上述したタンパク質アレイ又はペプチドアレイを用いて、機能性スクリーニングを行い、前記機能性スクリーニングにより特定された、前記工程（ｃ）において固定化されたタンパク質又はペプチドを、前記工程（ａ）において対応する微小凹部内の核酸を用いて同定する方法である。
前記機能性スクリーニング方法は、タンパク質又はペプチドの有する所望の機能に依存するものであるが、タンパク質又はペプチドの活性を測定する場合、例えば以下の工程が挙げられる。
先ず、工程（ａ）におけるマイクロ凹版と同様に、タンパク質アレイ又はペプチドアレイ上に固定化されているスポットの位置に対応するようなマイクロ凹版を用意する。
次いで、マイクロ凹版の微小凹部内にタンパク質又はペプチドの活性を測定するために必要な溶液を予め充填し、タンパク質アレイ又はペプチドアレイとマイクロ凹版を重ね合わせて反応させる。
これらの工程により、アレイ上のタンパク質又はペプチドの活性を測定することができる。
本実施形態のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法により製造されたタンパク質アレイ又はペプチドアレイは、対応するマイクロ凹版上に固定化された核酸の位置情報を変更することなく基板上にプリントされたものである。よって、該タンパク質アレイ又は該ペプチドアレイを用いて、前記機能性スクリーニングにより特定されたスポットに対応するマイクロ凹版上の微小凹部内のＤＮＡを回収し、その塩基配列を解析することにより、特定の機能を有するタンパク質等、及び該タンパク質等をコードするＤＮＡを同定することができる。
本実施形態の機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法によれば、高密度化タンパク質アレイ又はペプチドアレイから所望の機能を有するタンパク質又はペプチドを迅速に同定することができるため、進化分子工学的用途に好適に用いられる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（ｃＤＮＡ結合磁気ビーズの作製）
直径約４０μｍのストレプトアビジン修飾されたビーズ３０μｌ（約３０００個)を１．５ ｍｌチューブに取り、磁石を用いてビーズをチューブの底に引き寄せ、上清を取り除いた。１×Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ　ＥＤＴＡ，１Ｍ　ＮａＣｌ，及び０．１％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）を用いて、二回洗浄した後、ビオチン修飾されたＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）－ＨｉｓタグｃＤＮＡ５０μｌ［４０ｐｍｏｌ]と２×Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２ｍＭ　ＥＤＴＡ，２Ｍ　ＮａＣｌ，及び０．２％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）を５０μｌを加え、６０分間転倒混和した。磁石を用いてビーズをチューブの底に引き寄せ、上清を取り除いた後、ＰＢＳもしくはＴＮＴ（商標名）Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ(Ｐｒｏｍｅｇａ)１０μｌに懸濁した。
（ｃＤＮＡ結合磁気ビーズの凹版への導入）
上記により作製したｃＤＮＡ結合磁気ビーズ懸濁液１０μｌを１００×１００個のマイクロウェル(直径８０μｍ、 深さ４５μｍ)がアレイ状に並んだシリカガラス製の鋳型(３０ｍｍ×３０ｍｍ，ｔ＝０．５)の凹部に導入した。
ｃＤＮＡ結合磁気ビーズがマイクロウェルモールドの中に導入されているかどうか、倒立顕微鏡を用いて観察した。結果を図５に示す。
図５中、凹版の各々の凹部に１つずつｃＤＮＡ結合磁気ビーズが導入されている。このように、効率よく磁気ビーズがマイクロウェルモールド中に導入されていることが確認された。
（ガラス基板を用いたＧＦＰ－Ｈｉｓタグタンパク質のパターニング）
ｃＤＮＡ結合磁気ビーズがマイクロウェルモールドの中に導入された凹版上に、転写・翻訳を同時に起こさせる無細胞タンパク質合成系溶液（ＴＮＴ（商標名） Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ））を滴下した後、Ｎｉｃｋｅｌ－ｎｉｔｌｉｒｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（Ｎｉ－ＮＴＡ)で修飾されたガラス基板を密着させ、約１時間保持した。
その後、Ｎｉ－ＮＴＡ基板を凹版から剥がし、ＰＢＳバッファーで洗浄し、基板上にＧＦＰ－Ｈｉｓタグタンパク質がパターニングされているかどうかを、蛍光顕微鏡（Ｅｘ：４８８ｎｍ ，Ｅｍ：５１５ｎｍ)にて確認した。結果を図６に示す。
図６に示されるように、ガラス基板上にＧＦＰ由来の蛍光スポットがアレイ状に並んでいることが観察された。このことから、ＧＦＰ－ＨｉｓタグｃＤＮＡ結合磁気ビーズが導入された凹版に対応して、ＧＦＰ－Ｈｉｓタグタンパク質がＮｉ－ＮＴＡで修飾されたガラス基板上にパターニングされていることが確認された。
以上の結果から、本実施形態のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法によれば、マイクロウェルモールドといった微小構造体の中でタンパク質又はペプチドの合成を行い、合成されたタンパク質又はペプチドを微細なパターン形状で基板表面に固定化することができる。従って、本実施形態のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法によれば、基板に任意のサイズ及び形状のタンパク質を印刷することができる。
（蛍光標識ビオチン化ピューロマイシン－ヌクレオチド複合体の合成）
　前記式（６）で表される化合物であって、Ｘ１がＣｙ５、Ｘ２が前記式（５）で表されるビオチンである化合物（以下、蛍光標識ビオチン化ピューロマイシン－ヌクレオチド複合体）を標準的なホスホラミダイト法により合成した。また、対照として、Ｘ１がＣｙ５、Ｘ２が水素原子である化合物（以下、蛍光標識ピューロマイシン－ヌクレオチド複合体）も作製した。
（無細胞転写／翻訳系を用いたタンパク質合成及びビオチン化）
ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）ｃＤＮＡが挿入されたｐＥＴ２１ａ－ｄ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を制限酵素を用いて直線化した。
次いで、この直線化したベクターを鋳型として、ベクター由来のＴ７プロモーターを含むＧＦＰｃＤＮＡをＥｘＴａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて増幅した。増幅された断片（ＰＣＲ産物）をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、無細胞転写／翻訳系の鋳型として用いた。
次いで、無細胞転写／翻訳系として、ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（商標名）ｃｌａｓｓｉｃ　ＩＩ（バイオコゥマー社製）を用い、タンパク質を合成した。詳細には、５μｌ（０．１μｇ／μｌ）のＰＣＲ産物をＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（商標名）ｃｌａｓｓｉｃ　ＩＩのライセート（転写／翻訳系混合物）３５μｌと混ぜた後、２μｌの蛍光標識ビオチン化ピューロマイシン－ヌクレオチド複合体（最終濃度：２～４０μＭ）が前もって加えられている３８４ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに８μｌずつ加えた。反応は、３７℃１時間の条件で行い、プレートを氷上に置いて反応を停止した。反応産物を、１２％ゲルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＦｌｕｏｒｏＩｍａｇｅｒ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、商品名：Ｔｙｐｈｏｏｎ９４１０）を用いて解析した。結果を図７に示す。
図７中、レーン１は蛍光標識ビオチン化ピューロマイシン－ヌクレオチド複合体及び蛍光標識ピューロマイシン－ヌクレオチド複合体未添加のＧＦＰ発現サンプル、レーン２は蛍光標識ピューロマイシン－ヌクレオチド複合体を１０μＭ添加したＧＦＰ発現サンプル、レーン３は蛍光標識ビオチン化ピューロマイシン－ヌクレオチド複合体を２μＭ添加したＧＦＰ発現サンプル、レーン４は蛍光標識ビオチン化ピューロマイシン－ヌクレオチド複合体を１０μＭ添加したＧＦＰ発現サンプル、レーン５は蛍光標識ビオチン化ピューロマイシン－ヌクレオチド複合体を４０μＭ添加したＧＦＰ発現サンプル、矢印は目的タンパク質であるＧＦＰを示す。上段及び下段の電気泳動結果は、同一のゲルを異なるイメージング法を用いて解析したものである。上段（ＧｒｅｅｎＳｃａｎ）は、ＧＦＰによる蛍光イメージを取得した結果であり、下段は、Ｃｙ５による蛍光イメージを取得した結果である。
上段のレーン３～５において、ＧＦＰの発現が確認された。また、下段のレーン３～５において、蛍光標識ビオチン化ピューロマイシン－ヌクレオチド複合体を取り込んだビオチン化ＧＦＰの発現が確認された。
更に、上段のレーン４及びレーン５において、ＧＦＰ由来の蛍光強度はレーン４の方が強く検出された。その一方、下段のレーン４及びレーン５においては、Ｃｙ５蛍光強度はレーン５の方が強く検出された。これらのことから、蛍光標識ビオチン化ピューロマイシン－ヌクレオチド複合体を４０μＭ添加したサンプルは、ビオチン化効率が特に高いことが確認された。
（スライドガラスを用いたビオチン化ＧＦＰタンパク質のパターニング）
ビオチンコートされたスライドガラス（ＭｉｃｒｏＳｕｒｆａｃｅ社製、商品名：Ｂｉｏ－０２）上に、２０μｇのストレプトアビジンと１０％グリセロールを含有したＰＢＳ（ｐＨ７．５）を滴下し、ストレプトアビジンでコートされたスライドガラスを作製した。次いで、（無細胞転写／翻訳系を用いたタンパク質合成及びビオチン化）で述べた方法により、３８４ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルにＧＦＰタンパク質合成反応液を加え、ストレプトアビジンでコートされたスライドガラスを密着させ、加湿チャンバー中で約３０分、室温で保持した。
その後、ストレプトアビジンでコートされたスライドガラスを３８４ウェルマイクロタイタープレート凹版から剥がし、ＰＢＳ　１ｘ　ｗａｓｈバッファー（１００ｍＭ　Ｐｈｏｓｐａｔｅ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）で１５秒間、３回洗浄した。更に、水を用いてリンスし、風乾した。スライドガラス上にＧＦＰタンパク質がパターニングされているかどうかを、ＦｌｕｏｒｏＩｍａｇｅｒ）を用いてＧＦＰ由来の蛍光を確認した。結果を図８に示す。
図８中、左上のスポットは蛍光標識ピューロマイシン－ヌクレオチド複合体を１０μＭ添加したＧＦＰ発現サンプル、右上のスポットは蛍光標識ビオチン化ピューロマイシン－ヌクレオチド複合体を２μＭ添加したＧＦＰ発現サンプル、左下のスポットは蛍光標識ビオチン化ピューロマイシン－ヌクレオチド複合体を１０μＭ添加したＧＦＰ発現サンプル、右下のスポットは蛍光標識ビオチン化ピューロマイシン－ヌクレオチド複合体を４０μＭ添加したＧＦＰ発現サンプルを示す。左上のスポットにおいて蛍光が観察されない一方、その他のスポットにおいては、蛍光標識ビオチン化ピューロマイシン－ヌクレオチド複合体の用量依存にスポットの蛍光強度が強まっていることが確認された。
このことから、ビオチン化ピューロマイシン－ヌクレオチド複合体をタンパク質合成系に加えることにより、タンパク質がビオチン化され、基板上に容易にパターニングされることが確認された。
以上の結果から、本実施形態のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法によれば、マイクロウェルモールドといった微小構造体の中でビオチン化タンパク質又はビオチン化ペプチドの合成を行い、合成されたビオチン化タンパク質又はビオチン化ペプチドを微細なパターン形状でアビジン修飾された基板表面に固定化することができる。従って、本実施形態のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法によれば、基板に任意のサイズ及び形状のタンパク質を簡便にかつ効率よく印刷することができる。
更に、本実施形態のタンパク質アレイ又はペプチドアレイは、上記の様に本実施形態のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法を用いて、簡便でかつ効率よく製造されるものであるため、近年遺伝子レベルで診断が行われている生活習慣病やガンなどに関連する遺伝子や、病原細菌やウイルスの遺伝子の一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）解析に柔軟に対応することができる。そして、本実施形態のタンパク質アレイ又はペプチドアレイによれば、かかる一塩基多型診断をタンパク質レベルで迅速にかつ詳細に行うことができる。
本発明は、生活習慣病やガンなどに関連する遺伝子や、病原細菌やウイルスの遺伝子の一塩基多型解析の分野において利用が可能である。
１、１１…マイクロ凹版、２、１２…微小凹部、３…核酸、４、１４…磁気ビーズ、５、１５…基板、１０…ビオチン化ピューロマイシン誘導体、１３…ＤＮＡ、１６…ｍＲＮＡ、７、１７…タンパク質又はペプチド、９、１９…無細胞タンパク質合成系、１８、１８’…タンパク質アレイ又はペプチドアレイ。

Claims (12)

  1. （ａ）特定の開口形状を有する微小凹部からなるマイクロ凹版において、前記微小凹部内に、核酸と無細胞タンパク質合成系を用意する工程と、
    （ｂ）前記微小凹部中で合成される後記タンパク質又はペプチドと接触するように基板を前記マイクロ凹版と重ね合わせる工程と、
    （ｃ）前記微小凹部内において、前記無細胞タンパク質合成系を用いて前記核酸からタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドを前記基板上に、前記微小凹部が有する特定の開口形状に沿って固定化する工程と、を有することを特徴とするタンパク質又はペプチドのプリンティング方法。
  2. 前記タンパク質又はペプチドは、固相結合部位としてのアミノ酸配列を含み、前記基板は前記アミノ酸配列に親和性を有する固相結合部位認識部位を有する請求項１に記載のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法。
  3. 前記固相結合部位認識部位は、ニッケルイオン又はコバルトイオンである請求項２に記載のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法。
  4. 前記アミノ酸配列は、ポリヒスチジンである請求項２又は３に記載のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法。
  5. （ａ）特定の開口形状を有する微小凹部からなるマイクロ凹版において、前記微小凹部内に、核酸と、ビオチン化ピューロマイシン誘導体と、無細胞タンパク質合成系を用意する工程と、
    （ｂ）前記微小凹部中で合成される後記タンパク質又はペプチドと接触するようにアビジンで修飾された基板を前記マイクロ凹版と重ね合わせる工程と、
    （ｃ）前記微小凹部内において、前記無細胞タンパク質合成系を用いて前記核酸からタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドを前記基板上に、前記微小凹部が有する特定の開口形状に沿って固定化する工程と、を有することを特徴とするタンパク質又はペプチドのプリンティング方法。
  6. 　前記ビオチン化ピューロマイシン誘導体は、下記一般式（１）で表される化合物である請求項５に記載のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、Ｚは、下記式（２）、（３）、又は（４）で表される基である。］
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式中、Ｘ１及びＸ２のうち少なくとも一方は、下記式（５）で表される基であり、他方は、蛍光基又は水素原子である。＊は結合部位を表す。］
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式中、＊は結合部位を表す。］
  7. Ｚは、前記式（２）で表される基である請求項６に記載のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法。
  8. 　前記無細胞タンパク質合成系は、独立に精製されたタンパク質合成に必要な因子のみからなる請求項１～７のいずれか一項に記載のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法。
  9. 前記工程（ａ）において、前記核酸は固相結合部位で修飾されたＤＮＡであり、固相結合部位認識部位で修飾された磁気ビーズにより固定化されたものである請求項１～８のいずれか一項に記載のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法。
  10. 前記工程（ａ）において、前記核酸はビオチンで修飾されたＤＮＡであり、ストレプトアビジンで修飾された磁気ビーズにより固定化されたものである請求項１～９のいずれか一項に記載のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法。
  11. 　請求項１～１０のいずれか一項に記載のタンパク質又はペプチドのプリンティング方法を用いて製造されたことを特徴とするタンパク質アレイ又はペプチドアレイ。
  12. 　請求項１１に記載のタンパク質アレイ又はペプチドアレイを用いて、機能性スクリーニングを行い、前記機能性スクリーニングにより特定された、前記工程（ｃ）において固定化されたタンパク質又はペプチドを、前記工程（ａ）において対応する微小凹部内の核酸を用いて同定することを特徴とする機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法。
     
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