JP4318721B2 - mRNA−ピューロマイシン−タンパク質連結体作製用リンカー - Google Patents
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Description
タンパク質−タンパク質相互作用の解析法としては、イーストツーハイブリッド法(Chien,C.T.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,9578−9582(1991))、ファージディスプレー法(Smith,G.P.,Science,228,pp.1315−1317(1985))、GST−融合タンパク質プルダウン法、免疫共沈法等が知られている。タンパク質−核酸相互作用の解析法としては、電気泳動移動度シフトアッセイ法(Revzin,A.,et al.,Anal.Biochem.,153,172(1986))、DNaseIフットプリント法(Calas,D.,et al.,Nucleic Acids Res.,5,3157(1978))、メチル化緩衝法等が知られている。
また、ピューロマイシンの特異的性質を利用したin vitro virus法(Nemoto et al.,FEBS Lett.414,405(1997)(非特許文献1);Tabuchi et al.,FEBS Lett.508,309(2001)(非特許文献2)等参照)を用いてタンパク質相互作用の解析方法も開発されている(WO01/016600号公報(特許文献1)参照)。
In vitro virus(IVV)法はランダムな配列を有する莫大なペプチドあるいはタンパク質のライブラリ中から特定の分子(タンパク質に限らない)に特異的に結合するペプチド、等を選択するタンパク質の進化工学における有力な手法であるが、mRNAにピューロマイシンを連結する「リンカー」が高価で非効率であることが実用化の大きな障害になっている。実用的なリンカーは、(1)リンカーとmRNAとの連結効率(ライゲーション)が良いこと(2)翻訳系から直ちに精製でき、逆転写DNAプライマーを持ち、速やかにDNA化できること(3)DNA化したDNA/RNA−タンパク質連結体の精製が容易なこと等の条件が重要である。特に上記(2)の逆転写を効率的に進めるためにはビオチン修飾したリンカーを用いて翻訳後、速やかにmRNA−タンパク質連結体を無細胞翻訳系から精製することが重要である。
しかしながら、上記3つの条件を同時に満たすリンカー未だ知られておらず、そのようなリンカー及びそのようなリンカーを用いて作製されるmRNA/cDNA−ピューロマイシン−タンパク質連結体の開発が望まれていた。
(1)mRNA−ピューロマイシン連結体、mRNA−ピューロマイシン−タンパク質連結体又はmRNA/cDNA−ピューロマイシン−タンパク質連結体を作製するためのリンカーであって、1本鎖DNA、RNA及び/又はペプチド核酸(PNA)を主骨格として含み、この主骨格中にmRNA−ピューロマイシン連結体、mRNA−ピューロマイシン−タンパク質連結体又はmRNA/cDNA−ピューロマイシン−タンパク質連結体を固相部位に結合するための固相結合部位と、前記固相結合部位を挟む位置に設けられた一対の切断部位を有するリンカー。
(2)前記切断部位が、酵素切断部位である上記(1)記載のリンカー。
(3)前記酵素切断部位が、RNaseT1、RNase AまたはRNase Iによって切断可能である上記(2)記載のリンカー。
(4)前記酵素切断部位がリボGである上記(2)記載のリンカー。
(5)前記酵素切断部位がピリミジン塩基である上記(2)記載のリンカー。
(6)前記酵素切断部位がRNAである上記(2)記載のリンカー。
(7)前記固相結合部位が、ビオチン−デオキシチミン(ビオチンが結合されているデオキシチミン)、アミノ修飾デオキシチミン、カルボキシ修飾デオキシチミン又はチオール−デオキシチミンである上記(1)記載のリンカー。
(8)前記固相結合部位が、ビオチン−デオキシチミンある上記(7)記載のリンカー。
(9)10〜60merの長さを有する上記(1)〜(8)のいずれかに記載のリンカー。
(10)mRNAとピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物が上記(1)〜(9)記載のリンカーで連結されたmRNA−ピューロマイシン連結体。
(11)上記(10)に記載のmRNA−ピューロマイシン−タンパク質連結体が、上記(1)〜(9)のいずれかに記載のリンカーに設けた固相結合部位を介して固相に結合されている固定化mRNA−ピューロマイシン連結体。
(12)前記固相が、スチレンビーズ、ガラスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、磁性体ビーズ、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板、ガラス容器、プラスチック容器及びメンブレンから選択される、上記(9)に記載の固定化mRNA−ピューロマイシン連結体。
(13)上記(11)に記載の固定化mRNA−ピューロマイシン連結体を複数含むmRNAチップ。
(14)上記(13)記載のmRNAチップを用いて作製されるプロテインチップ。
(15)上記(11)に記載の固定化mRNA−ピューロマイシン連結体がビーズに固定してなるmRNAビーズ。
(16)上記(13)記載のmRNAチップ又は上記(15)記載のmRNAビーズ、及び無細胞翻訳系を含む診断キット。
本発明のリンカーは、合成効率が良く安価に作製できるという利点がある。また、本発明の好ましい態様におけるリンカーは、従来のリンカーと比較して短く設計することが可能であるため、mRNAとのライゲーション効率が良いという利点もある。また、本発明のリンカーを用いて作製したmRNA−ピューロマイシン−タンパク質連結体は、固相に結合したmRNA−ピューロマイシン−タンパク質連結体を固相から取り外す際の効率も向上している。さらに、mRNA−ピューロマイシン−タンパク質連結体を用いてin vitro virus法を実施した場合は、得られるmRNA/cDNA−タンパク質連結体の精製が容易であるという利点もある。
図2は、実施例で用いたSBPリンカーとLBPリンカーを用いた場合のライゲーションについて説明する図である。
図3は、実施例で得られた反応物を変性アクリルアミドゲル電気泳動に供した結果を示す図である。
図4、実施例で用いたSBPリンカーとLBPリンカーにおける固相結合部位の切断について説明する図である。
図5は、実施例において、固相結合部位を切除した後の反応物を変性アクリルアミドゲル電気泳動に供した結果を示す図である。
図6は、実施例において、RNaseHによる処理後の反応産物を変性アクリルアミドゲル電気泳動に供した結果を示す図である。
1.mRNA−ピューロマイシン−タンパク質連結体作製用リンカー
本発明の第1の態様は、mRNA−ピューロマイシン−タンパク質連結体を作製するためにmRNAとピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物を連結するためのリンカーに関する。本発明において、「リンカー」とは、in vitro virus法において用いられるmRNA−ピューロマイシン連結体又はmRNA−ピューロマイシン−タンパク質連結体を作製する際に、mRNAとピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物を連結するためのリンカーのことをいう。ここで、mRNA−ピューロマイシン連結体のことを「mRNA−PM連結体」、mRNA−ピューロマイシン−タンパク質連結体のことを「mRNA−PM−PRT連結体」、そしてmRNA−PM連結体又はmRNA−PM−PRT連結体のことを「mRNA−PM−(PRT)連結体」ともいう。このリンカーは、主として、ピューロマイシンをリボソームのAサイトと呼ばれる部位に効率良く取り込ませるために、mRNAとピューロマイシンの間に挿入される。また、このようなリンカーに固相結合部位を設けることによって、mRNA−PM−(PRT)連結体を固相に結合させることができ、種々の反応を効率良く行なうことができる。
本発明のリンカーは、1本鎖DNA及び/又はペプチド核酸を主骨格として含み、この主骨格中にmRNA−PM−(PRT)連結体を固相部位に結合するための固相結合部位と、前記固相結合部位を挟む位置に設けられた一対の切断部位を有することを特徴とする。なお、ペプチド核酸(PNA)はDNAやRNAとは異なり、リン酸結合ではなくペプチド結合で骨格を形成しているDNA類似構造の化合物である。本発明のリンカーは、全体として、柔軟性があり、親水性で、側鎖の少ない単純な構造を有する骨格を有するように設計する。本発明のリンカーは、1本鎖DNA及び/又はPNAを主骨格として含むものであり、上記リンカーの機能を果たす限り、1本鎖DNA及び/又はPNAの部分以外に、それ以外の骨格部分を有することもできる。本発明のリンカー中で、1本鎖DNA及び/又はPNA以外の部分としては、例えば、RNA鎖、ポリエチレンなどのポリアルキレン、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、ポリスチレン等の直鎖状物質又はこれらの組合せを選択することができる。これらの直鎖上物質を組み合わせて用いる際は、適宜、それらを適当な連結基(−NH−、−CO−、−O−、−NHCO−、−CONH−、−NHNH−、−(CH2)n−[nは例えば1〜10、好ましくは1〜3]、−S−、−SO−など)で化学的に連結することができる。なお、本明細書で、「1本鎖DNA及び/又はPNAを主骨格として含む」とは、例えば、リンカーの骨格全長に対して、60%以上、好ましくは70%以上、さらに好ましくは80%以上、最も好ましくは90%以上が1本鎖DNA及び/又はPNAで構成されていることをいう。なお、DNAとPNAの両者を主骨格中に含む場合は、その比率は特に制限されないが、例えば、DNA:PNA=1:9〜9:1の範囲が例示される。
本発明のリンカーは、その主骨格中にmRNA−PM−(PRT)連結体を固相部位に結合するための固相結合部位を有する。この固相結合部位としては、例えば、mRNA−PM−(PRT)連結体をリンカーを介して固相に結合させるための部位であり、例えば、mRNA−PM−(PRT)連結体を固相に結合させる化合物、結合基などを結合し得る塩基、あるいは、mRNA−PM−(PRT)連結体を固相に結合させる化合物、結合基などが結合した塩基である。より具体的には、固相結合部位としては、ビオチンを結合し得る塩基(例えば、デオキシチミン(dT))もしくはビオチンが結合した塩基(例えば、ビオチン−デオキシチミン(Biotin−dT))、アミノ基によって修飾された塩基(例えば、アミノ修飾デオキシチミン(例、Amino−Modifier C6−dT:Glen Research Search社製)、カルボキシ基によって修飾された塩基(例えば、カルボキシ修飾デオキシチミン(Carboxy−dT))、チオール基によって就職された塩基(たとえば、チオール修飾デオキシチミン(4−Thio−dT))等が挙げられる。本発明の好ましい態様では、固相結合部位はビオチン−デオキシチミンである。そして、このような固相結合部位を介し、ビオチンとアビジンの親和性を利用して、ビオチンが連結されたmRNA−PM−(PRT)連結体をアビジンが固定された固相に結合させることができる。なお、上記固相結合部として、カルボキル基やアミノ基が結合した塩基が選択された場合は、固相とmRNA−PM−(PRT)連結体をエステル結合やアミド結合で結合させることができる。
本発明のリンカーは、必要に応じて、mRNA−PM−(PRT)連結体を固相から取り外すために、前記固相結合部位を挟む位置に一対の切断部位を設ける。このような切断部位は、特にこれに限定されないが、例えば、酵素切断部位である。本発明の好ましい態様においては、前記切断部位は酵素切断部位であり、例えば、リボG(Guanosine)である。固相に結合されたmRNA−PM−(PRT)連結体を固相から取り外す際は、上記切断部位を切断する酵素等で切断する。ここで用いられる酵素としては、RNaseT1、RNase A、RNase I、膵臓RNase、S1ヌクレアーゼ、蛇毒ヌクレアーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、マングマメヌクレアーゼ、アカパンヌクレアーゼなどを用いることができる。本発明では、RNaseT1、RNase A、RNase I及び膵臓RNaseが好ましく、特にRNaseT1が好ましい。酵素切断部位は、使用する酵素の種類によって適宜選択することができる。
本発明のリンカーは、種々の反応工程での反応性、得られるDNA/タンパク質複合体の精製効率などを考慮して、好ましくは10〜60mer、より好ましくは10〜45mer、さらに好ましくは15〜30merの長さを有する。なお、本発明のリンカーは、公知の化学合成の手法を用いて作成することができる。
2.固定化mRNA−ピューロマイシン連結体
本発明は、上記リンカーを用いてmRNAとピューロマイシンとを連結させてなるmRNA−PM連結体にも関する。
本発明で用いられるmRNAは、配列未知のもの、配列既知のものの両者を含む。すなわち、本発明のmRNA−PM連結体を用いて配列既知のタンパク質に結合する物質を探索あるいは定量する場合は、配列既知のタンパク質をコードする核酸配列を有するmRNAを用いる。逆に、本発明のmRNA−PM連結体を用いて配列未知のタンパク質の機能を解析する場合は、配列未知のタンパク質をコードする核酸配列を有するmRNAを用いることができる。ここで用いられるmRNAは、例えば、配列既知の各種レセプタータンパク質をコードするmRNA、各種抗体又はその断片をコードするmRNA、各種酵素をコードするmRNA、各種遺伝子ライブラリー中のDNAから転写される配列未知のmRNA、有機合成によってランダムに合成された配列を有するDNAから転写されたランダムな配列を有するmRNAなどから選択される。
本発明のmRNA−PM連結体は、通常、mRNAの3’末端に上記リンカーを介してピューロマイシン(PM)を連結したものである。ここで、ピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物は、固相に固定されたmRNA−PM連結体を翻訳系に投入してタンパク質を合成する際に、mRNAと翻訳されたタンパク質とを連結するヒンジあるいは連結部の役割をする。すなわち、mRNAにリンカーを介してピューロマイシンを結合したものと翻訳系を接触させると、そのmRNAがピューロマイシンを介して翻訳されたタンパク質と結合したIn vitro virusビリオンが生成することが知られている(Nemoto et al.,FEBS Lett.414,405(1997)参照)。ピューロマイシン(Puromycin)は、その3’末端がアミノアシルtRNAに化学構造骨格が類似している、下記式(I):
に示される化合物で、翻訳系でタンパク質の合成が行われた際に、合成されたタンパク質のC末端に結合する能力を有する。本明細書中、「ピューロマイシン様化合物」とは、その3’末端がアミノアシルtRNAに化学構造骨格が類似し、翻訳系でタンパク質の合成が行われた際に、合成されたタンパク質のC末端に結合する能力を有する化合物をいう。
ピューロマイシン様化合物としては、3’−N−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド(3’−N−Aminoacylpuromycin aminonucleoside、PANS−アミノ酸)、例えば、アミノ酸部がグリシンのPANS−Gly、アミノ酸部がバリンのPANS−Val、アミノ酸部がアラニンのPANS−Ala、その他、アミノ酸部が全ての各アミノ酸に対応するPANS−アミノ酸化合物が挙げられる。また、3’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合して形成されるアミド結合で連結した3’−N−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド(3’−Aminoacyladenosine aminonucleoside,AANS−アミノ酸)、たとえば、アミノ酸部がグリシンのAANS−Gly、アミノ酸部がバリンのAANS−Val、アミノ酸部がアラニンのAANS−Ala、その他、アミノ酸部が全アミノ酸の各アミノ酸に対応するAANS−アミノ酸化合物を使用できる。また、ヌクレオシドあるいはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども使用できる。なお、上記ピューロマイシン以外に好ましく用いられるピューロマイシン様化合物は、リボシチジルピューロマイシン(rCpPur)、デオキシジルピューロマイシン(dCpPur)、デオキシウリジルピューロマイシン(dUpPur)などであり、下記にその化学構造式を示す。
mRNAとリンカーとの連結は、公知の手法を用いて直接的又は間接的に、化学的又は物理的に行うことができる。例えば、DNAをリンカーとして用いる場合は、mRNAの3’末端にそのDNAリンカーの末端と相補的な配列を設けておくことにより、両者を連結することができる。また、リンカーとピューロマイシンを連結する場合は、通常、公知の化学的手法によって連結される。
また、mRNA−PM連結体を作成するに際しては、リンカーの一部をmRNAを調製する際にmRNAの3’末端側に形成しておき、これにピューロマイシンを結合したリンカーの残部を結合することによってmRNA−PM連結体を作製することもできる。この場合は、mRNAの3’末端側に形成したリンカーの一部中に切断部位を設けることもできる。
なお、本発明のmRNA−PM連結体には、必要に応じて標識物質を結合させることによって標識することができる。そのような標識物質は、蛍光性物質、放射性標識物質などから適宜選択される。蛍光物質としては、フリーの官能基(例えば活性エステルに変換可能なカルボキシル基、ホスホアミダイドに変換可能な水酸基、あるいはアミノ基など)を持ち、リンカー又はピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物に連結可能な種々の蛍光色素を用いることができる。適当な標識物質としては、例えばフルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質;3H、14C、125I若しくは131I等の放射性同位体などが挙げられる。
3.固定化mRNA−PM連結体
本発明の別の態様によれば、上記リンカーの固相結合部を介してmRNA−PM連結体を固相に固定化してなる固定化mRNA−PM連結体が提供される。
mRNA−PM連結体が固定される固相は特に限定されず、その連結体が使用される目的に応じて適宜選択される。本発明で用いられる固相としては、生体分子を固定する担体となるものを用いることができ、例えば、スチレンビーズ、ガラスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、磁性体ビーズ等のビーズ;ガラス基板、シリコン(石英)基板、プラスチック基板、金属基板(例えば、金箔基板)等の基板;ガラス容器、プラスチック容器等の容器;ニトロセルロース、ポリビニリデンフルオリド(PVDF)等の材料からなるメンブレンなどが挙げられる。なお、本明細書では、上記mRNA−PM連結体がビーズに固定されたものを「mRNAビーズ」という。
本発明のmRNA−PM連結体においては、mRNAとPMを連結するリンカーに固相結合部位が設けられており、その固相結合部位を、固相に結合させた「固相結合部位認識部位」を介して、mRNA−PM連結体を固相に固定する。固相結合部位は、mRNA−PM連結体を所望の固相に結合し得るものであれば特に限定されない。例えば、このような固相結合部位として、特定のポリペプチドに特異的に結合する分子(例えば、リガンド、抗体など)が用いられ、この場合は、固相表面には固相結合部位認識部位として、その分子と結合する特定のポリペプチドを結合させておく。固相結合部位/固相結合部位認識部位の組合せの例としては、例えば、アビジン及びストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質/ビオチン、マルトース結合タンパク質/マルトース、Gタンパク質/グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド/ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ/グルタチオン、DNA結合タンパク質/DNA、抗体/抗原分子(エピトープ)、カルモジュリン/カルモジュリン結合ペプチド、ATP結合タンパク質/ATP、あるいはエストラジオール受容体タンパク質/エストラジオールなどの、各種受容体タンパク質/そのリガンドなどが挙げられる。
これらの中で、固相結合部位/固相結合部位認識部位の組合せとしては、アビジン及びストレプトアビジンなどのビオチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質/マルトース、ポリヒスチジンペプチド/ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ/グルタチオン、抗体/抗原分子(エピトープ)などが好ましく、特にストレプトアビジン/ビオチンの組合せが最も好ましい。
上記タンパク質の固相表面への結合は、公知の方法を用いることができる。そのような公知の方法としては、例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン−2,4−ジイソシアネート、アミノ基、カルボキシル基、又は水酸基あるいはアミノ基などを利用する方法を挙げることができる(P.M.Abdella,P.K.Smith,G.P.Royer,A New Cleavable Reagent for Cross−Linking and Reversible Immobilization of Proteins,Biochem.Biophys.Res.Commun.,87,734(1979)等参照)。
なお、上記組合せは、固相結合部位と固相結合部位認識部位とを逆転させて用いることもできる。上記の固定化手段は、2つの相互に親和性を有する物質を利用した固定化方法であるが、固相がスチレンビース、スチレン基板などのプラスチック材料であれば、必要に応じて、公知の手法を用いてリンカーの一部を直接それらの固相に共有結合させることもできる(Qiagen社、LiquiChip Applications Handbook等参照)。なお、本発明においては、固定手段については上記の方法に限定されることなく、当業者に公知である如何なる固定手段をも利用することができる。
4.タンパク質の固相固定化方法及びタンパク質の固相合成方法
本発明の別の態様によれば、タンパク質の固相固定化又は固相合成法であって、(a)上記リンカーを介して、mRNAとピューロマイシンを連結して、mRNA−PM連結体を調製する工程、(b)該リンカーの固相結合部位を固相に結合させることによって、該mRNA−PM連結体を固相に固定する工程;及び(c)該mRNA−PM連結体と翻訳系とを接触させることにより(例えば、該連結体に翻訳系を投入、あるいは該連結体を翻訳系に投入)、タンパク質を合成する工程を含む、タンパク質の固相固定化又は合成法が提供される。工程(b)において、mRNA−PM連結体が固相に固定されているので、この連結体を翻訳系に投入した際に、前述のin vitro virus法の対応づけ技術を利用して、合成されたタンパク質がピューロマイシンを介して固相に固定化されるのである。
上記(c)工程では、mRNA−PM連結体を翻訳系と接触させることによって、タンパク質の合成を行う。ここで用いることができる翻訳系としては、無細胞翻訳系又は生細胞などが挙げられる。無細胞翻訳系としては、原核又は真核生物の抽出物により構成される無細胞翻訳系、例えば大腸菌、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽抽出物などが使用できる(Lamfrom H,Grunberg−Manago M.Ambiguities of translation of poly U in the rabbit reticulocyte system.Biochem Biophys Res Commun.1967 27(1):1−6等参照)。生細胞翻訳系としては、原核又は真核生物、例えば大腸菌の細胞などが使用できる。本発明においては、取り扱いの容易さから、無細胞系を使用することが好ましい。
ここで、図1に基づいて、本発明のmRNA−PM連結体を用いたin vitro virus法のプロセスについて簡単に説明する。
図1(a)中、1はmRNA、2はピューロマイシンであり、両者はリンカー3を介して連結され、mRNA−PM連結体4を構成している。リンカー3は、固相結合部位3a及び切断部位3bを有している。なお、5はピューロマイシン2に結合したタンパク質である。図1(b)及び(c)中、6は固相結合部位3aが結合しているストレプトアビジン磁性体ビーズである。図1(c)〜(d)中、7は逆転写によって生成したDNAである。なお、図1(b)〜(e)において、重複する図番は省略している。
in vitro virus法においては、まず、図1(a)に示すように、mRNA−PM連結体4を無細胞翻訳系などの翻訳系に供することによって、そのmRNAに対応するタンパク質が合成される。このタンパク質は図に示されるようにピューロマイシン2に結合する。次いで、得られたmRNA−PM−PRT連結体をビーズ6に固定し(図1(b))、これを逆転写反応に供することによって、mRNAに対応するDNAが生成する(図1(c))。ここで、RNaseTIなどの酵素によって、切断部位3bでリンカーを切断すると、ストレプトアビジン磁性体ビーズ6を除去することができる(図1(d))。さらに、必要に応じて、RNaseHで、mRNAを分解するとタンパク質とそれをコードするDNAが連結したDNA−タンパク質連結体が生成する。このようにして得られるmRNA/cDNA−PM−PRT連結体(複合体)、DNA−タンパク質連結体(複合体)を種々の解析実験に供することによって、タンパク質の機能などを効率良く解析することができる。
5.mRNAチップ及びプロテインチップ
本発明の別の態様によれば、上記した固定化mRNA−PM連結体を複数含むmRNAチップ(mRNAマイクロアレイ)が提供される。このmRNAチップは、上述したmRNA−PM連結体を複数基板上に固定化したものである。このmRNAチップを翻訳系に投入することにより、あるいは、翻訳系をmRNAチップに投入することにより、上述のタンパク質合成がチップ上で起こり、各タンパク質が固相に結合した、いわゆるプロテインチップが作製される。
本発明のmRNAチップにおいては、機能既知のタンパク質をコードするmRNA複数を、mRNA−PM連結体として固相に固定してもよいし、機能未知のタンパク質をコードするmRNA複数をmRNA−PM連結体として固相に固定してもよい。例えば、疾病に関与する機能既知のタンパク質をコードするmRNAを複数チップに固定する場合は、例えば、疾病の診断用mRNAチップとすることができる。この場合は、ある特定の疾病の診断マーカーと結合するタンパク質をコードするmRNAをそれぞれプレートの所定の位置に固定しておく。そして、診断を行う直前にこのプレートに無細胞翻訳系を投入して、プレート上の所定の位置に所望の診断マーカーと結合するタンパク質を合成し、固定する。このようにすれば、診断の直前にプロテインチップを作製することができる。プロテインチップは、その保存上あるいは取り扱い上に問題がある。不安定なプロテインの代わりに安定なmRNAの形でチップ化したところに、本発明の特徴がある。ゆえに、mRNAの固相固定化及びタンパク質の合成・固定化以外の技術(例えば、使用するプレートの材料・サイズ、使用するプロテインの種類・配置、プロテインチップを用いたタンパク質の機能解析方法等)は、公知のプロテインチップの技術をそのまま利用することができる(Kukar T,Eckenrode S,Gu Y,Lian W,Megginson M,She JX,Wu D.Protein microarrays to detect protein−protein interactions using red and green fluorescent proteins.Anal Biochem.2002;306(1):50−4等参照)。なお、上記mRNAビーズ又は上記mRNAチップと無細胞翻訳系を含む診断キットも本発明の範囲内である。このようなmRNAチップを用いることによって、タンパク質−タンパク質相互作用、DNA−タンパク質相互作用、リガンドの探索、疾病マーカーの探索、疾病の診断、薬効評価、薬物動態の評価などに利用することができる。
6.タンパク質と分子との相互作用を解析する方法
本発明の別の態様によれば、上記したmRNA−PM連結体を用いたタンパク質と分子との相互作用を解析する方法が提供される。この解析方法は、(a)−以上の固定化mRNA−PM連結体を、翻訳系に投入し、固相上でタンパク質を合成する工程;(b)工程(a)において合成されたタンパク質と一以上の標的物質とを接触させる工程;及び(c)該タンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを測定する工程を含む。
この解析方法は、例えば、(i)配列既知のタンパク質に作用する物質をスクリーニングする場合、(ii)ある特定の物質(例えば、リガンド)が結合する配列未知のタンパク質をスクリーニングする場合等に用いることができる。例えば、(i)の場合は、配列既知のタンパク質(例えばオーファンレセプタータンパク質)をコードする核酸配列を有するmRNAとピューロマイシンとの連結体を複数用意しておき(すなわち、複数のオーファンレセプタータンパク質に対応するmRNAをそれぞれ有するmRNA−PM連結体を複数用意)、これを翻訳系に投入する。すると、各mRNA−PM連結体のmRNAから複数のオーファンレセプタータンパク質が合成される。各オーファンレセプタータンパク質は、固相に固定されたmRNA−PM連結体のピューロマイシンにC末端が結合することによって固定される。必要に応じて、不要な成分を洗浄除去し、これに標的物質及びバッファー等を加えて、標的物質をオーファンレセプタータンパク質に結合させることによって、結合実験を行う。(ii)の場合は、例えば、ある遺伝子ライブラリーから複数のmRNAを取得し、複数のmRNAとピューロマイシンとの連結体を作成し、固相に固定する。以下、同様にタンパク質の合成を行い、標的物質をそのタンパク質に接触させて結合実験を行う。
上記工程(b)においては、工程(a)において合成されたタンパク質と一以上の標的物質とを接触させる。ここで用いられる「標的物質」とは、本発明において合成されるタンパク質と相互作用するか否か調べるための物質を意味し、具体的にはタンパク質、核酸、糖鎖、低分子化合物などが挙げられる。
タンパク質としては、特に制限はなく、タンパク質の全長であっても結合活性部位を含む部分ペプチドでもよい。またアミノ酸配列、及びその機能が既知のタンパク質でも、未知のタンパク質でもよい。これらは、合成されたペプチド鎖、生体より精製されたタンパク質、あるいはcDNAライブラリー等から適当な翻訳系を用いて翻訳し、精製したタンパク質等でも標的分子として用いることができる。合成されたペプチド鎖はこれに糖鎖が結合した糖タンパク質であってもよい。これらのうち好ましくはアミノ酸配列が既知の精製されたタンパク質か、あるいはcDNAライブラリー等から適当な方法を用いて翻訳、精製されたタンパク質を用いることができる。
核酸としては、特に制限されることはなく、DNAあるいはRNAも用いることができる。また、塩基配列あるいは機能が既知の核酸でも、未知の核酸でもよい。好ましくは、タンパク質に結合能力を有する核酸としての機能、及び塩基配列が既知のものか、あるいはゲノムライブラリー等から制限酵素等を用いて切断単離してきたものを用いることができる。
糖鎖としては、特に制限はなく、その糖配列あるいは機能が、既知の糖鎖でも未知の糖鎖でもよい。好ましくは、既に分離解析され、糖配列あるいは機能が既知の糖鎖が用いられる。
低分子化合物としては、特に制限されず、機能が未知のものでも、あるいはタンパク質に結合する能力が既に知られているものでも用いることができる。
なお、これら標的物質とタンパク質との「相互作用」とは、通常は、タンパク質と標的分子間の共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、及び静電力による結合のうち少なくとも1つから生じる分子間に働く力による作用を示すが、この用語は最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。共有結合としては、配位結合、双極子結合を含有する。また静電力による結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有する。また、上記作用の結果生じる結合反応、合成反応、分解反応も相互作用に含有される。相互作用の具体例としては、抗原と抗体間の結合及び解離、タンパク質レセプターとリガンドの間の結合及び解離、接着分子と相手方分子の間の結合及び解離、酵素と基質の間の結合及び解離、核酸とそれに結合するタンパク質の間の結合及び解離、情報伝達系におけるタンパク質同士の間の結合と解離、糖タンパク質とタンパク質との間の結合及び解離、あるいは糖鎖とタンパク質との間の結合及び解離が挙げられる。
ここで用いられる標的物質は、必要に応じて標識物質により標識して用いることができる。必要に応じて標識物質を結合させることによって標識することができる。そのような標識物質は、蛍光性物質、放射性標識物質などから適宜選択される。蛍光物質としては、フリーの官能基(例えば活性エステルに変換可能なカルボキシル基、ホスホアミダイドに変換可能な水酸基、あるいはアミノ基など)を持ち、標的物質に連結可能な種々の蛍光色素を用いることができる。適当な標識物質としては、例えばフルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質;3H、14C、125I若しくは131I等の放射性同位体などが挙げられる。これらの標識物質は、標的物質と固定化タンパク質との間の相互作用に基づいて発生される信号の変化の測定又は解析方法に適したものが適宜用いられる。上記標識物質の標的物質への結合は、公知の手法に基づいて行うことができる。
次いで、本解析方法によれば、工程(c)において、該タンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを測定する。該タンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かの測定は、両分子間の相互作用に基づいて発生される信号の変化を測定、検出することにより行う。そのような測定手法としては、例えば、例えば、表面プラズモン共鳴法(Cullen,D.C.,et al.,Biosensors,3(4),211−225(1987−88))、エバネッセント場分子イメージング法Funatsu,T.,et al.,Nature,374,555−559(1995)、蛍光イメージングアナライズ法、固相酵素免疫検定法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA):Crowther,J.R.,Methods in Molecular Biology,42(1995))、蛍光偏光解消法(Perran,J.,et al.,J.Phys.Rad.,1,390−401(1926))、及び蛍光相関分光法(Fluorescence Correlation Spectroscopy(FCS):Eigen,M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91,5740−5747(1994))等が挙げられる。
本発明の解析方法においては、必要に応じて、さらに、工程(c)において相互作用していると判断されたタンパク質−標的物質結合体中の、タンパク質及び/又は標的物質を同定する。タンパク質の同定は、通常のアミノ酸配列シークエンサーで行うこともできるし、該タンパク質に結合しているmRNAからDNAを逆転写し、得られたDNAの塩基配列を解析することによって行うこともできる。標的物質の同定は、NMR、IR、各種質量分析などによって行うことができる。なお、本発明のmRNAチップ及びプロテインチップを用いて、タンパク質−タンパク質間相互作用を解析する場合は、通常のプロテインチップ上のサンプル解析と同様に、飛行時間型質量分析計(MALDI−TOF MS)を用いることができる。
実施例
新規リンカーを用いたIn vitro virus virion(ビリオン)(RNA/DNA−タンパク質連結体)の合成
(1)新規リンカーと従来のリンカー合成効率の比較
1.In vitro virus用リンカー:Short−Biotin−ピューロマイシン・リンカー(SBPリンカー)及びLong−Biotin−ピューロマイシン・リンカー(LBPリンカー)の合成
まず、以下の特殊DNA合成をBEX社から購入した。
(A)Puro−F−S[配列;5’−(S)−TC(F)−(Spacer18)−(Spacer18)−(Spacer18)−(Spacer18)−CC−(Puro)−3’]
ここで、(S)は5’−Thiol−Modifier C6、(Puro)はピューロマイシン CPG、(Spacer18)は商品名「Spacer Phosphoramidite 18」で化学名は(18−0−Dimethoxytritylhexaethyleneglycol,1−[(2−cyanoethyl)−(N,N−diisopropyl)]−phosphoramidite)で次の化学構造を有する(すべてGlen Research社製)。
(B)Hybri[配列番号1:5’−CC(rG)C(T−B) C(rG)CCC CGCCG CCCCC CG(T)CC T−3’]
ここで、(rG)はリボG、(T)はAmino−Modifier C6 dT(5’−Dimethoxytrityl−5−[N−(trifluoroacetylaminohexyl)−3−acrylimido]−2’−deoxyUridine,3’−[(2−cyanoethyl)−(N,N−diisopropyl)]−phosphoramidite)、(T−B)はBiotin−dT(5’−Dimethoxytrityloxy−5−[N−((4−t−butylbenzoyl)−biotinyl)−aminohexyl)−3−acrylimido]−2’−deoxyUridine−3’−[(2−cyanoethyl)−(N,N−diisopropyl)]−phosphoramidite)
である(すべてGlen Research Search社製)。
(C)Biotin−loop[(56mer)配列番号2;5’−CCCGG TGCAG CTGTT TCATC(T−B)CGGA AACAG CTGCA CCCCC CGCCG CCCCC CG(T)CCT−3’]
(アンダーラインは制限酵素PvuIIのサイトを示す)
本発明のリンカーは(A)Puro−F−Sと(B)Hybriを以下の方法に従って架橋し精製したもので、これを「SBPリンカー」と名づける。また、比較のために(A)Puro−F−Sと(B)Biotin−loopを架橋した「LBPリンカー」も合成した。以下に、合成法を示す。
Puro−F−S 10nmolを、100μlの50mMリン酸バッファー(pH7.0)に溶かし、100mM Tris[2−carboxyethyl]phosphine(TCEP、Pierce社)を1μl加え(final 1mM)、室温で6時間放置し、Puro−F−SのThiolを還元した。架橋反応を行う直前に50mMリン酸バッファー(pH7.0)で平衡化したNAP5(アマシャム、17−0853−02)を用いてTCEPを除いた。
0.2Mリン酸バッファー(pH7.0)100μlに、500pmol/μlのHybriまたはBiotin−loop 20μl、100mM架橋剤EMCS(344−05051;6−Maleimidohexanoic acid N−hydroxysuccinide ester)、Dojindo社製)20μl、を加え、良く攪拌した後、37℃で30分放置した後に、未反応のEMCSを取り除いた。沈殿を減圧下で乾燥させた後、0.2Mリン酸バッファー(pH7.0)10μlに溶かし、上記の還元したPuro−F−S(〜10nmol)を加えて4℃で一晩放置した。サンプルに最終で4mMになるようにTCEPを加え、室温で15分放置した後、未反応のPuro−F−Sをエタノール沈殿で取り除き、未反応のHybriまたはBiotin−loopを取り除くために以下の条件でHPLC精製を行った。
カラム:nacalai tesque CSOMOSIL 37918−31 10x250mm C18−AR−300(Waters)
BufferA:0.1M TEAA、Buffer B;80%アセトニトリル(超純水で希釈したもの)
流速:0.5ml/min(B%:15−35% 33min)
HPLCの分画は18%アクリルアミドゲル(8M 尿素、62℃)で解析し、目的の分画を減圧下で乾燥させた後、DEPC処理水で溶かして、10pmol/μlにした。
2.リンカー合成効率の比較
上記の方法により合成した結果、(1)SBPリンカー、(2)LBPリンカーのどちらも等量の5nmolのHybri,Biotin−Loopから出発して合成した。しかし、最終的に得られたリンカーの量は(1)SBPリンカー449.2pmol(2)LBPリンカー198pmolで、SBPリンカーはLBPリンカーと比較してほぼ2倍程度の収率で得られた。これは、HybriがBiotin−Loopの約半分程度の分子量であるために反応性が良いことが理由であると考えられる。また、HPLCの精製の際に、Biotin−Loopは長いため反応産物はいくつかの2次構造を取ると思われる。このため、LBPリンカーの場合は精製効率が悪いと思われる。
(2)ライゲーション効率の比較
モデルmRNAとして転写因子Oct−1のPOU DNA−binding domain(340mer)とアルデヒド還元酵素(ALR)(1.12k mer)を用いて、(図2)に示したような2種類のリンカーの連結効率を比較した。図2中、矢印は連結すべき箇所を示している。
1.T4 RNAリガーゼを用いたライゲーション酵素反応
ライゲーション反応はmRNA10pmolに対しリンカー15pmolを加え20μlのT4 RNA Ligase buffer(50mM Tris−HCl,pH7.5;10mM MgCl2;10mM DTT;1mM ATP)で行なった。酵素を加える前にアニーリングするため、70℃で5分間ヒートブロックで温めた後、10分間室温で冷やし氷上に置いた。ここに1μlのT4 Polynucleotide Kinase(10U/μl;Takara),1.5μlのT4 RNA Ligase(40U/μl;Takara)と2μlのSUPERase RNase inhibitor(20U/μl;Ambion)を加え25℃で10分から30分インキュベーションした。
2.ライゲーション反応の結果
上記に従って反応した産物は、65℃、8M Ureaの5%変性アクリルアミドゲルで電気泳動を行った。その結果を図3に示す。
図3中、レーン1はPouのmRNA、レーン4はALRのmRNAである。レーン2、5はSBPリンカーを使ってライゲーション反応を行ったもの、レーン3,6はLBPリンカーを用いてライゲーション反応を行ったものである。なお、図3中、矢印はmRNAまたはリンカーが連結していないmRNAの位置を示し、*はリンカーが連結された位置を示す。
図3から分かるとおり、SBPリンカーを用いた場合の連結効率は95%以上である。一方、LBPリンカーを用いた場合は80%以下で、反応時間を2時間以上に延ばしてもこの結果は変わらなかった。したがって、SBPリンカーは反応時間を10分という従来の10分の1の時間で従来のリンカー以上の連結効率を得ることができた。
(3)ビオチン部分の切断効率
図4に示すように、ビオチン部分の切断において、SBPリンカーとLBPリンカーでは使用する酵素が異なる。
1.RNaseT1による切断(SBPリンカーの場合)
10pmolのSBPリンカーとmRNAのライゲーションを行なった後、20μlの逆転写用バッファー(250mM Tris−HCl,pH8.3;375mM KCl;15mM MgCl2)中で逆転写酵素SuperScriptIIIRT(200U/μl、Invitrogen社)を1μl加え50℃、30分反応させDNA化した。次にそのままRNase T1(Ambion)を100U加え、37℃で10分反応させた。
2.制限酵素PvuIIによる切断(LBPリンカーの場合)
10pmolのLBPリンカーとmRNAのライゲーションを行なった後、20μlの逆転写用バッファー中で逆転写酵素SuperScript III RT(200U/μl、Invitrogen社)を1μl加え50℃、30分反応させDNA化した。ここに24unitの制限酵素PvuII(TaKaRa)で37℃、2時間反応させた。
3.切断反応の結果
上記のような反応を行なった後、得られた反応物を5%の8M Ureaアクリルアミドゲル電気泳動を65℃恒温下で行った結果を、図5に示す。図5中、*印は分解された産物のバンドを示し、矢印は分解されなかった産物のバンドである。
図5に示されるように、SBPリンカーはほとんど分解されているが、LBPリンカーは2時間の反応後も分解されない反応物があることが分かった。
(4)SBPリンカーとLBPリンカーのIn vitro virus virion(DNA/RNA−タンパク質結合体)合成効率の比較
SBPリンカーとLBPリンカーをPouのmRNAに連結し、図1に示したようなスキームでそれぞれの場合のDNA/RNA−タンパク質結合体を得た。ただし、LBPリンカーの場合、図中のRNase T1の部分については、上記(3)「ビオチン部分の切断効率」に記載した方法で制限酵素のPvuIIで切断した。また、最終産物(DNA/RNA−タンパク質結合体)の確認は逆転写後、このままでは元のmRNAに比べ分子量が2倍以上になって電気泳動で確認できないため、RNaseHを用いてRNA部分を分解し、DNA−タンパク質結合体にして確認した。
1.mRNAのリンカーDNAへの連結
10pmolのPou−mRNAと15pmolのリンカーは、上述の(2)ライゲーション反応の比較の「1.T4 RNAリガーゼを用いたライゲーション酵素反応」に基づいて連結を行った。
2.mRNA−DNAリンカーの精製と沈殿
次に、未連結のDNAリンカーを除くために、QIAGENのRNeasy Kitを用いて添付のプロトコールに従い精製した。回収したmRNA−DNAリンカー(30−50μl)は、共沈剤Quick−Precip Plus solution(Edge Bio system)によって添付のプロトコールに従いエタノール沈殿した。これを4−10μlのDEPC水に溶解し翻訳用テンプレートとした。
3.IVV形成(翻訳とmRNA−タンパク質連結)
翻訳に使用される全ての試薬は撹拌して遠心後、氷上に置いた。25μlスケールの反応は次のような順番で混合して反応させた。
0.625μlの? methionine Master Mixと0.625μlの? leucine Master Mixを混合し1.25μlの1M Potassium acetateを加えた。ここに2μlのSUPERase RNase inhibitor(Ambion社)を加えた。さらに17μのRetic lysate(Ambion社)を注意深く加え丁寧にピペッテイングして泡が出ないようにした。この混合液を上記の2.で調整したテンプレートに加えた。そして再び泡がでないように丁寧に混合した。次に30°C、20分反応させた。ここに3μlの1M MgCl2と7μlの3M KClを加え37℃で2hインキュベーションした。
4.mRNA−タンパク質連結体のストレプトアビジンビーズ(StAVビーズ)への固定
ビオチン−ストレプトアビジンの結合を利用してmRNA−タンパク質連結体を無細胞翻訳系から精製した。上記3で形成されたmRNA−タンパク質連結体をまず、Magnotex−SA particles(Takara社)20μlを1.5mlエッペンドルフチューブにとり、マグネットスタンドに1分間靜置した後上清捨てた。次に200μlの1×binding bufferで2回洗浄し、次にmRNA−タンパク質連結体と同体積の2×binding bufferを加え、ここに洗浄したMagnotex−SA particlesを加えた。サスペンドしたparticlesを室温で15分間ゆっくりローテーションした。結合反応の後、particlesを2回ほど10倍量の1×binding bufferで洗浄し、1回0.01% BSA solutionで洗浄した。
5.逆転写反応
固定化したmRNA−タンパク質連結体のmRNAをDNA化して安定化するために以下のように行った。
4μl 5×First−Strand Buffer(250mM Tris−HCl,pH8.3;375mM KCl;15mM MgCl2)に1μl 0.1M DTT、1μl SUPERase RNase inhibitor、3μl dNTP mixture(2.5mM each)、1μl SuperScript III RT(200U/μl from Invitrogen)を加え、洗浄したmRNA−タンパク質連結体付のビーズを加えて最終体積が20μlになるようにし、50°Cで反応させた。この際、チューブをローテーションさせてビーズが沈殿しないように留意した。
6.StAVビーズからのDNA/RNA−タンパク質連結体の切り出し
SBPリンカー、LBPリンカーのそれぞれについて上記(3)「ビオチン部分の切断効率」に記載の方法に従って切断反応を行った。反応時間終了後、マグネットスタンドを用いてビーズを壁に吸着させ、切り離されたDNA/RNA−タンパク質連結体を含む上清を回収した。
7.RNaseHによるRNA部分の分解反応
上記6で得られた上清に1μlのRNaseH(Ambion社)を加え40℃、20分反応させた。反応物は、6%アクリルアミドゲルの8M 尿素SDS−PAGEで解析した。その結果を図6に示す。図6中、レーン1,2はSBPリンカー、レーン3,4はLBPリンカーでそれぞれIVV反応を行った結果である。レーン1,3の「A」はmRNA−タンパク質連結体で「B」はmRNAとリンカーの結合体の位置で;レーン2,4における「C」の位置はcDNA−タンパク質連結体を示す。
図6に示される結果から分かるように、SBPリンカー、LBPリンカーに連結したmRNAの量は等量であるが、レーン1と3を比べると全体的にレーン1のバンドが濃い(つまり量が多い)。これはSBPリンカーの方がリンカーとの連結反応時間も短く効率も良いため、RNAの分解が少なくてすむためと考えられる。また、レーン2,4を比べるとCの位置のcDNA−タンパク質連結体のバンドがLBPリンカーに比べSBPリンカーの方が2倍ほど濃い。これは最終的なDNA/RNA−たんぱく質連結体がSBPリンカーはLBPリンカーの2倍得られたことを意味する。SBPリンカーはLBPリンカーに比べ短い時間で完全に切り離すことができること、及び全体の行程を半分の時間以下で行うことができたためRNAの分解も少ないこと等の理由により、最終的な収量が2倍以上になったと考えられる。さらに、リンカー自体の合成単価も半分以下にすることができたので、従来のものに比べ全体で4倍以上の効率化を達成することができたと考えられる。
Claims (15)
- mRNA−ピューロマイシン連結体、mRNA−ピューロマイシン−タンパク質連結体又はmRNA/cDNA−ピューロマイシン−タンパク質連結体を作製するためにmRNAとピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物を連結するためのリンカーであって、1本鎖DNA、RNA及び/又はペプチド核酸を主骨格として含み、この主骨格中にmRNA−ピューロマイシン連結体、mRNA−ピューロマイシン−タンパク質連結体又はmRNA/cDNA−ピューロマイシン−タンパク質連結体を固相部位に結合するための固相結合部位と、前記固相結合部位を挟む位置に設けられた一対のRNaseT1、RNase A、RNase I、膵臓RNase、S1ヌクレアーゼ、蛇毒ヌクレアーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、マングマメヌクレアーゼおよびアカパンヌクレアーゼからなる群から選択される酵素によって切断可能な酵素切断部位を有するリンカー。
- 前記酵素切断部位が、RNaseT1、RNase AまたはRNase Iによって切断可能である請求項1記載のリンカー。
- 前記酵素切断部位がリボGである請求項1または2記載のリンカー。
- 前記酵素切断部位がピリミジン塩基である請求項1または2記載のリンカー。
- 前記酵素切断部位がRNAである請求項1または2記載のリンカー。
- 前記固相結合部位が、ビオチン−デオキシチミン(ビオチンが結合されているデオキシチミン)、アミノ修飾デオキシチミン、カルボキシ修飾デオキシチミン又はチオール−デオキシチミンである請求項1記載のリンカー。
- 前記固相結合部位が、ビオチン−デオキシチミンである請求項6記載のリンカー。
- 10〜60merの長さを有する請求項1〜7のいずれかに記載のリンカー。
- mRNAとピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物が請求項1〜8のいずれかに記載のリンカーで連結されたmRNA−ピューロマイシン連結体。
- 請求項9に記載のmRNA−ピューロマイシン−タンパク質連結体が、請求項1〜8のいずれかに記載のリンカーに設けた固相結合部位を介して固相に結合されている固定化mRNA−ピューロマイシン連結体。
- 前記固相が、スチレンビーズ、ガラスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、磁性体ビーズ、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板、ガラス容器、プラスチック容器及びメンブレンから選択される、請求項10に記載の固定化mRNA−ピューロマイシン連結体。
- 請求項10に記載の固定化mRNA−ピューロマイシン連結体を複数含むmRNAチップ。
- 請求項12記載のmRNAチップを用いて作製されるプロテインチップ。
- 請求項10に記載の固定化mRNA−ピューロマイシン連結体がビーズに固定してなるmRNAビーズ。
- 請求項12記載のmRNAチップ又は請求項14記載のmRNAビーズ、及び無細胞翻訳系を含む診断キット。
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