JP5858415B2 - mRNA/cDNA−タンパク質連結体作製用リンカーとそれを用いたヌクレオチド−タンパク質連結体の精製方法 - Google Patents
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Description
前記ディスプレイ技術は、「機能のあるペプチド分子を選択し、それに対応する遺伝子(DNA、RNA)をこれらの分子に連結させ、それらの配列をPCRによって増幅した後、シーケンシングによって読み取る」という技術である。
固相からcDNAを分離する方法としては、また、デオキシウリジンとDNAグリコシラーゼとを利用する方法も提案されている(特許文献3参照、以下、「従来技術3」という。)。
以上から、cDNAディスプレイ法に適合するリンカーであって、固相からリンカーを切り離す際に、mRNAを分解するおそれのある酵素を必要とせず、低廉な製造コストで製造が可能なリンカーであって、その合成効率が高く、また、ライゲーション効率も高いリンカーに対する高い社会的要請があった。
具体的には、本発明の第1の態様は、主鎖と側鎖とを有するリンカーであって、
前記主鎖は、固相との結合を形成する所定の分子を有している固相結合部位と;前記固相結合部を挟むように位置し、DNA修復酵素で切断される損傷DNAを含む、前記リンカー上で固相合成されたcDNAを前記固相から切り離すための2以上の切断部位と;前記リンカーの5’末端側に位置し、RNAリガーゼが認識し得るmRNA連結部位と;前記リンカーの3’末端側近傍に位置する側鎖連結部位と;前記リンカーの3’末端側に位置し、前記リンカー上で逆転写が行われる場合に逆転写用のプライマーとして機能するプライマー領域と、を備え、前記側鎖は、前記側鎖連結部位に連結される、mRNA/cDNA−タンパク質連結体作製用リンカーである。
前記DNA修復酵素はエンドヌクレアーゼ作用を有する酵素であることが好ましく、エンドヌクレアーゼV、Endo III、Endo IV、Endo VIII、Fpg、hAAG、hNEIL 1、hOGG1、T4 PDG、APE1、Tma Endo III、Tth Endo IVからなる群から選ばれるいずれかの酵素であることがさらに好ましい
さらに、前記DNA修復酵素は、エンドヌクレアーゼV(以下、「Endo V」ということがある。)、Endo III、Endo VIII、Fpg、hNEIL 1、hOGG1、APE1、Tma Endo IIIからなる群から選ばれるものであることがさらに好ましい。
前記損傷DNAは、デオキシイノシン、アプリン酸及びアピリミジン酸からなる群から選ばれる塩基であることがさらに好ましい。
前記DNA修復酵素がエンドヌクレアーゼVであり、前記損傷DNAが下記式(I)で表されるデオキシイノシンであることがさらに好ましい。
図1に示すように、本発明の第1の態様であるmRNA/cDNA-タンパク質連結体作製用リンカーは、(a)固相との結合を形成する所定の分子を有している固相結合部位(BB)と;(b)前記固相結合部位を挟むように位置し、DNA修復酵素で切断される損傷DNAを含む、前記固相から切り離すための2以上の切断部位(C1及びC2)と;(c)前記リンカーの5’末端側に位置し、RNAリガーゼが認識し得るmRNA連結部位(MB)と;(d)前記リンカーの3’末端側近傍に位置する側鎖連結部位(SB)と;(e)前記リンカーの3’末端側に位置し、前記リンカー上で逆転写が行われる場合に逆転写用のプライマーとして機能するプライマー領域(PR)と、を備える主鎖と;(f)前記側鎖連結部位(SB)に連結される側鎖とを有する。
前記リンカーは、主としてDNAで構成されるが、デオキシイノシン、ビオチン修飾デオキシチミン、Fluorescein修飾デオキシチミン等のDNAアナログを含むことができる。また、本発明において使用するリンカーは、全体として、柔軟性と親水性とを有するように、設計することが好ましい。
また、本明細書中において、「所定のmRNA」には、遺伝子をコードする配列、又は連結体形成、翻訳反応促進に必要な配列、あるいはその他の配列等を有するmRNAが含まれるものとする。
これらの中でも、ビオチン、マルトース、Ni又はCo等の金属、グルタチオン、抗原分子又はエピトープペプチド等を使用することが好ましく、リンカー合成の容易さの面から、ビオチンを使用することが、さらに好ましい。
こうした固相結合部位(BB)は、上述したmRNA−リンカー−タンパク質連結体等の連結体を、リンカーを介して固相に結合させるための部位である。具体的には、下記式(III)で示されるビオチン修飾デオキシチミジン(dT)であることが好ましい。
前記(b)中の切断部位(C1及びC2)は、前記固相結合部位(BB)を挟むように位置しており、かつエンドヌクレアーゼで切断される損傷DNAを含むものであることが好ましい。ここでいう「損傷DNA」には、アプリン酸、アピリミジン酸、酸化ピリミジン、酸化プリン、アルキル化プリン、デオキシイノシン、デオキシウリジン、5−ヒドロキシウラシル、5−ヒドロキシメチルウラシル、5−ホルミルウラシル、ピリミジンダイマー、ジヒドロチミン、6−メチルアデニン、8−オキソグアニン、デオキシウラシル等が含まれるものとする。また、後述するエンドヌクレアーゼで認識される部位と、切断部位とは隣接していてもよいが、隣接していない場合があることは言うまでもない。
こうしたエンドヌクレアーゼ作用を有するDNA修復酵素としては、Endo III、Endo IV、Endo V、Endo VIII、Fpg、hAAG、hNEIL 1、hOGG1、T4 PDG、APE1、Tma Endo III、Tth Endo IV等を挙げることができ、Endo V又はEndo VIIIを使用することが、特定の損傷DNAと組み合わせた時に反応効率が高いことから好ましい。
また、例えば、リンカーの側鎖連結部位(SB)が、下記式(IV)で表わされるAmino-Modifier C6 dTで構成されている場合には、前記側鎖の5'末端を下記式(V)の5'-Thiol-Modifier C6として、下記式(VI)で表わされるEMCSを用いて架橋させ、主鎖と側鎖とを連結させることができる。なお、下記の式では保護基がついた状態を示している。
ここで、プライマー領域(PR)は、前記リンカー上で逆転写が行われる場合に逆転写用のプライマーとして機能する領域である。この領域は、約1〜15塩基からなることが好ましく、特に3〜5塩基からなることが好ましい。15塩基を越えると、リンカーとしての結合効率が悪くなるため、リンカーとの結合効率及びプライマーとしての反応効率という面から、上記の塩基数とすることが好ましい。
また、前記(f)の前記側鎖連結部位(SB)に連結する側鎖は、主鎖と相補的なmRNAから合成されたタンパク質を連結するタンパク質連結部位(P)と前記側鎖連結部位との間に、スペーサーと蛍光基(F)とを有するものである。
PANS-アミノ酸としては、例えば、PANS-Gly、PANS-Val、PANS-Ala等を挙げることができ、AANS-アミノ酸としては、AANS-Gly、AANS-Val、AANS-Ala等を挙げることができる。また、ヌクレオシドとアミノ酸とがエステル結合したものなども使用することができるが、ピューロマイシンを使用することが、前記タンパク質連結部位におけるタンパク質の連結の安定性が高いことから特に好ましい。
また、スペーサーとしては、下記式(VII)で表わされるSpacer 18 Phosphoramidite等の分子を、柔軟性があり、立体障害性が低いことから好適に使用することができる。
蛍光基としては、例えば、活性エステルに変換可能なカルボキシル基、ホスホロアミダイドに変換可能な水酸基、又はアミノ基等のフリーの官能基を有し、標識された塩基としてリンカーに連結することができる蛍光化合物を使用することが好ましい。このような蛍光化合物としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、フィコビリタンパク質、希土類金属キレート、ダンシルクロライド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、Fluorescein-dT等を挙げることができる。これらの中でも、分子標識用の化合物として使用されるFluorescein-dTを使用することが、合成が容易であることから好ましい。以下に、Fluorescein-dTの構造式(VIII)を示す。
まず、所望の配列となるように、常法に従ってDNAを合成し、主鎖として使用するための一本鎖のオリゴマーを作製する。このように合成した一本鎖オリゴマーは、上述したように、固相結合部位と、2以上の切断部位と、mRNA連結部位と、側鎖連結部位と、プライマー領域とを備えている。2以上の切断部位の大きさ及び主鎖中の位置によって、主鎖となる一本鎖オリゴマーの長さを適宜決定する。
次いで、所望の長さの側鎖を合成し、主鎖上の側鎖連結部位に連結させる。側鎖の遊離末端に、例えば、ピューロマイシンを導入し、上述したFluorescein-dTを蛍光標識部位に導入して、本発明のmRNA/cDNA-タンパク質連結体作製用リンカーを得ることができる。
ここで使用するmRNAの長さは、原則として本発明を利用して分子進化させるべきタンパク質又はポリペプチドの長さより規定されるコード領域の長さに依存する。50〜1,000塩基長であることが、反応効率の面からであることが好ましく、200〜500塩基であることが、最も高い反応効率を得られることから、さらに好ましい。
こうしたリガーゼのうち、T4 RNAリガーゼ又はTS2126耐熱性ファージ由来DNAリガーゼを使用することが好ましく、T4 RNAリガーゼを利用することが、連結効率の点からさらに好ましい。
この反応系中でのRNA:リンカーとの比は、モル比で3:1〜1:6の範囲とすることができるが、ほぼ1:(1〜6)、具体的には、5〜100pmolのリンカーに対し、5〜100pmolのmRNAとすることが好ましい。反応効率を上げ、残余を最少化するために、1:(1〜2)とすることがさらに好ましい。この場合には、10pmolのmRNAに対し、10〜20pmolのリンカーを反応させることになる。
ライゲーションは、例えば、塩化マグネシウム、ジチオスレイトール(以下、「DTT」と略すことがある。)、ATP、T4ポリヌクレオチドキナーゼ及びT4 RNAリガーゼを含むTris-塩酸緩衝液(pH 7.0〜8.0)中にて、所望の温度で所望の時間、反応させることにより行う。
この反応液には、必要に応じて、SUPERase RNase inhibitor(Ambion社)などのRNA分解酵素阻害剤を添加することもできる。
上記の無細胞翻訳系では、それらが由来する生物種に依存して翻訳に利用されるコドンの種類が異なる。このため、対象となる遺伝子や遺伝子の由来に合わせて無細胞翻訳系を選択することが好ましい。また、利用したい翻訳系に合うように、mRNAの配列や構造を設計しておくことが好ましい。
前記ライセートは、例えば、ヌクレアーゼによって細胞由来のmRNAを分解し、キレート剤によってカルシウムを除去した後に、ヌクレアーゼを不活化処理したものであることが好ましい。マイクロコッカルヌクレアーゼによって細胞由来のmRNAを分解し、グリコールエーテルジアミン四酢酸(EGTA)を加えてカルシウムをキレートし、前記ヌクレアーゼを不活化処理したもの(以下、「マイクロコッカルヌクレアーゼ処理済」という。)を使用することが、より好ましい。
反応効率の点から、ウサギ網状赤血球ライセートの量を約8.5〜約17μL、上記連結体の量を約1.2〜約2pmolとし、反応系のサイズを約12.5〜約25μLとして、約20〜約40℃で約10〜約30分間行うことが好ましい。この場合に使用する反応液は、80mMの酢酸カリウム、0.5mMの酢酸マグネシウム、10mMのクレアチンリン酸、それぞれ0.025mMのメチオニン及びロイシン、0.05mMのメチオニン及びロイシン以外のアミノ酸を含むものであることが好ましい。生成効率と作業効率の点から、約30℃で約20分間、翻訳を行うことがさらに好ましい。
翻訳反応後、翻訳産物であるタンパク質とmRNA−リンカー連結体とを、高塩濃度条件下で結合させることが好ましい。例えば、0.3〜1.6Mの塩化カリウム及び40〜170mMの塩化マグネシウムの存在下(濃度はいずれも終濃度)、約27〜約47℃で、約30分〜約1.5時間反応させると、タンパク質を上記連結体と効率よく結合させることができる。
本工程にて、mRNA−リンカー−タンパク質連結体が固定される固相は特に限定されず、その連結体を使用する用途に応じて適宜選択することができる。こうした固相としては、生体分子を固定する担体となる各種の形状のものを用いることができる。例えば、スチレンビーズ、ガラスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、磁性体ビーズ等のビーズ;ガラス基板、シリコン(石英)基板、プラスチック基板、金属基板(例えば、金箔基板)等の基板;ガラス容器、プラスチック容器等の容器;ニトロセルロース、ポリビニリデンフロリド(PVDF)等の材料からなるメンブレンなどが挙げられる。
固相がスチレンビーズ、スチレン基板などのプラスチック材料で構成されているのであれば、必要に応じて、公知の手法を用いてリンカーの一部を直接それらの固相に共有結合させることもできる(Qiagen社製、LiquiChip Applications Handbook等参照)。したがって、連結体にビオチン又はその類縁体が結合されている場合には、固相にアビジンを結合させておくことによって、上記連結体を容易に固相に結合させることができる。
逆転写反応系は任意に選択できるが、上記mRNA−リンカータンパク質連結体と、dNTP Mixと、DTTと、逆転写酵素と、標準溶液と、RNaseを除去した水(以下、「RNaseフリー水」という。)とを加えて反応系を調製し、この系中、5〜20分間、30〜50℃の条件で逆転写を行わせることが好ましい。
次いで(S7)では、前記主鎖の切断部位を、前記所定のエンドヌクレアーゼで切断する。ここで使用するエンドヌクレアーゼは上述した通りである。この切断反応は、Tris-塩酸緩衝液を含む反応液中で、所定の温度で所定の時間行うことが好ましい。
例えば、Endo V(NEB社製、M0305S)を使用した場合には、約5〜20mMのTris-HCl、約2.5〜約10mMのEDTA、及び約0.1〜約0.4Mの酢酸ナトリウムの組成を有する反応液中で、約5〜約20分間、約30〜約45℃の温度範囲で反応させることができる。
前記切断分離工程に引き続いて、得られたタンパク質のアフィニティー等を利用したカラムクロマトグラフィー等によって、mRNA/cDNA−リンカー−タンパク質連結体を選別することができる。
その後、選別された前記連結体中の塩基配列に、PCR法等を用いて変異を導入して増幅反応を行う。増幅産物を所望のプロモーター配列を有する二本鎖DNAと所定の方法で連結し、第1世代の変異型mRNA(以下、「mRNA G1」と略す。)を得る。次いで、mRNA G1を用いて、上述したcDNAディスプレイ法の各工程を繰り返すことによって、mRNA G2、mRNA G3等を得ることが可能となる。
1.DNAオリゴマー及びリンカーの合成
本発明で使用する合成DNAであるI-hybri、及び比較対象の側鎖用分子Puro-F-S及びLong-Biotin-ピューロマイシン・リンカー(LBPリンカー)を以下のように合成した。
まず、以下に示す特殊DNAの合成をジーンワールド(株)及び(株)BEXに委託した。
ここで、Iはデオキシイノシンを表わす。(T)は、Amino-Modifier C6 dT(5'-Dimethoxytrityl-5-[N-(trifluoroacetylaminohexyl)-3-acrylimido]-2'-deoxyUridine, 3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)を表わし;(T-B)はBiotin-dT(5'-Dimethoxytrityloxy-5-[N-((4-t-butylbenzoyl)-biotinyl)-aminohexyl)-3-acrylimido]-2'-deoxyUridine-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)を表わす(いずれも、Glen Research 社製)。修飾塩基を表す記号は、同様である。
ここで、(S)は、Thiol-Modifier C6 S-Sである(化合物名:o-(dimethoxytrityloxy-hexyl-dithiohexyl)-o'-(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropyl-phosphoramidite)(PL)は、PC Linker Phosphoramiditeである(化合物名:3-(4,4'-Dimethoxytrityl)-1-(2-nitrophenyl)-1-propanyl-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)。(F)は、Fluorescein-dTである(化合物名:(5'-Dimethoxytrityloxy-5-[N-((3',6'-dipivaloylfluoresceinyl)-aminohexyl)-3-acryimido]-2'-deoxyUridine-3'-succinoyl-long chain alkylamino)。また、(Puro)は、ピューロマイシンを表わす。(Spacer18)は、Spacer Phosphoramidite 18である(化合物名:18-0-Dimethoxytritylhexaethyleneglycol,1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)。)(いずれも、Glen Research社製)。
(C)Biotin-loop[(56 mer)配列番号2;5'-CCCGG TGCAG CTGTT TCATC (T-B)CGGA AACAG CTGCA CCCCC CGCCG CCCCC CG(T)CCT-3']
ここで、制限酵素Pvu IIの認識部位を、図3中に下線を付して示した。また、Thiol-Modifier C6 S-Sの化学式を下記式(IX)に示す。
この反応産物を、上記のように還元したPuro-F-S(〜10nmol)に速やかに溶解し、4℃で一晩放置してサンプルとした。このサンプルに、終濃度が50mMになるようにDTTを加え、37℃で30分間放置し、チオール基の架橋反応を停止させた。エタノール沈殿法により、室温で、合成したリンカーを沈殿させ、未反応のPuro-F-Sを除去した。
さらに未反応のBiotin-loop及びそれらのEMCS架橋物を取り除くために、以下の条件でHPLCを用いたグラジエント法で精製を行った。
カラム:Symmetry 300 C18, 5μm, 4.6φ×250 mm (Waters Corporation製)
溶離液:下記の溶液Aと溶液Bとを混合して使用した。
溶液A:0.1M TEAA (triethylammonium acetate)
溶液B:80 %アセトニトリル(超純水で希釈したもの)
流速:0.5 mL/分
溶離液の濃度勾配:溶液A:溶液Bを、30分間で85:15→65:35に変化させた。
HPLCにより分画された生成物を、16%アクリルアミドゲル(8M 尿素、60 ℃)を使用した電気泳動にて検出し、目的の画分を減圧下に乾燥させた。この後、DEPC(二炭酸ジエチル、Diethylpyrocarbonate)処理水に10pmol/μLとなるように溶解した。
Endo VはEndonuclease V (M0305S、New England Biolabs, Inc.(以下、「NEB社」と略すことがある。)製)を使用した。
10pmolのI-hybri(被験物質)、0.5 μLのエンドヌクレアーゼV(10U/μL)、1μLの10 x NEBuffer及び蒸留水を含む10μLの反応液中にて、37℃で、30分間反応させた。反応終了後、P6カラム(Bio-Rad Laboratories, Inc.製)で脱塩した。I-hybriで5pmol相当の溶液を取り、SDS-PAGE法にて分析した。電気泳動は、8M尿素を含有する12%ポリアクリルアミドゲルにて、60℃で、200Vの条件下に、30分間行った。電気泳動終了後、SYBR(登録商標) Goldにて染色し、泳動像を蛍光観察した。
比較例として、上記と同様の反応液中にて10pmolのPuro-F-S(対照物質)又はLBPリンカーを、37℃で、30分反応させた。その後、反応液全量をそれぞれSDS-PAGE法にて分析した。
図4中、第1レーンは、分子量マーカーを表す(図中、Mと示す)。第2レーンは、Endo Vを入れない反応液でI-hybriを反応させた陰性対照を示し(図中、−と示す)、第3レーンはEndo Vを入れた反応液中でI-hybriを反応させた試料を示す(図中、+と示す)。泳動像の左側の数字は分子量マーカーの塩基長を表し、右側の数字は反応後の被験物質の塩基長を表す。
I-hybriは、陰性対照では28塩基長の位置にバンドが検出されたが、Endo Vと反応させると、切断されて19塩基長の位置にバンドが検出された(図4、+のレーン参照)。このことは、Endo VがI-hybri中の切断領域中に存在するデオキシイノシン(dI)を認識し、I-hybriを特異的に切断したことを示す。
Puro-F-S及びLBPでは、いずれも、Endo Vによって切断された産物は検出されなかった。このことはEndo VがdIを含有しないリンカーを非特異的に切断することはないことを示す。
上記の試験結果から、dIを含む切断部位を含むリンカーを用いて、mRNA−リンカー−タンパク質連結体を形成することで、切断用酵素Endo Vによる固相からの遊離が可能となることが示された。
1.リンカーの合成
本発明で使用するイノシン-Short-Biotin-ピューロマイシン・リンカー(SBP(I)リンカー)及びrG-Short-Biotin-ピューロマイシン・リンカー(SBP(rG)リンカー)を以下のように合成した。
まず、実施例1に記載した(A)及び(B)に加えて、以下の特殊DNAの合成をジーンワールド(株)(東京)に委託した。
(C)rG-Hybri[(26mer) 配列番号3:5'-CC(rG)C(T-B) C(rG)CCC CGCCG CCCCC CG(T)CC T-3']
上記SBP(I)リンカーは、(A)Puro-F-Sと(B)I-Hybriとを、以下の方法に従って架橋し精製して得た。また、上記SBP(rG)リンカーは(A)Puro-F-Sと(C)rG-hybriを架橋して得た。
50μLの0.2Mリン酸バッファー(pH 7.2)に、2.5μLの1mM I-HybriまたはrG-Hybri、及び10μLの100mMのEMCSを加えて良く攪拌し、37℃で30分反応させた。その後、反応産物を4℃でエタノール沈殿させて未反応のEMCSを除去した。沈殿物を200μLの70%エタノールで洗浄し、減圧下で乾燥させた。
HPLCにより分画された生成物を、8Mの尿素を含有する12%アクリルアミドゲルにて、200V、60℃の条件下で30分間電気泳動を行い分画した。目的の画分を減圧下で乾燥させた。この後、DEPC(Diethylpyrocarbonate)処理水で溶かして、10 pmol/μLとした。
上記のように合成したリンカーSBP(rG)及びSBP(I)のRNase耐性検査を、大腸菌(E.coli)のペリプラズムに由来のRNase ONE(プロメガ(株)製)を用いて行った。RNase ONEは、A、C、G、Uの各RNAの3'末側のリン酸ジエステル結合を切断する活性を有するRNA分解酵素である。
1pmolのSBP(rG)又はSBP(I)と、0.5μLのRNase ONE(10U/μL)と、1μLの10 x RNase ONE reaction buffer(プロメガ(株)製))と、RNaseフリー水とを加えて混合し、10μLの混合液とした。
図6中、第1レーンには、100bp DNA ladder(プロメガ(株)製)をサイズマーカーとして1μLアプライした。第2レーンには未処理のSBP(rG)を0.5 pmol、第3レーンにはRNase ONEで処理したSBP(rG)を5μL、第4レーンには未処理のSBP(I)を0.5 pmol、第5レーンにはRNase ONEで処理したSBP(I)を5μL、それぞれアプライした。
以上の検査により、SBP(I)は、旧来のSBP(rG)リンカーにはないリボヌクレアーゼ耐性を有することが示された。
1.mRNAの合成
モデルmRNAとしてPDO(POU-specific DNA binding domain of Oct-1)を用いることとした。終始コドンを含まないPDOのコード配列(CDS)(216塩基長)の5'側上流にT7プロモーター配列と翻訳促進配列を、また、3'側下流にスペーサー領域及びピューロマイシン・リンカーとの相補鎖領域を有する配列を、それぞれ付加したDNA(配列番号4:391塩基長)をPCR法で合成し、精製した。
その後、T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System(プロメガ(株)製)を用いて、添付のプロトコールに従い、5〜30pmol/μLのmRNA(配列番号6:361塩基長)を合成した。配列番号5及び配列番号7のアミノ酸配列は、前記PDOのコード配列から翻訳され得るポリペプチド鎖を表し、末端の終始コドンを含んでいないことを特徴としている。
20 pmolのPDO mRNAと10 pmolのSBP(I)と2.2 μlの10 x T4 RNA Ligase buffer(タカラバイオ(株)製)とに、RNaseフリー水を加えて混合し、21.2 μlの混合液とした。この溶液をアルミブロック上で2分間90℃に保った後、1分間70℃に保ち、その後自然放冷して最後に室温(25℃)とした。この溶液に、0.5μLのT4 ポリヌクレオチドキナーゼ(10U/μL、東洋紡績(株)製)と、0.5μLのT4 RNAリガーゼ(40U/μL、タカラバイオ(株)製)を加えて混合液とし、15分間、25℃に保って、前記リンカーとmRNAとを連結させ、ライゲーション産物を得た。図7に模式図を示した。
上記産物を、SDS-PAGE法にて分析した。電気泳動は、8Mの尿素を含有する5%ポリアクリルアミドゲルにて、200V、60℃の条件下で60分間行い、SYBR Gold(Invitrogen製)にて染色観察した。結果を図8に示す。
図8中、第1レーンには、100bp DNA ladder(プロメガ(株)製)をサイズマーカーとして1μLアプライした。第2レーンには未処理のPDO mRNAを0.5 pmol、第3レーンには上記ライゲーション産物をRNA量換算にて0.5 pmol相当、それぞれアプライした。上記mRNA−リンカー連結体であるmRNA-SBP(I)のバンドがサイズマーカーの400〜500bp付近に現れたことから、SBP(I)リンカーはPDO-mRNAと連結する能力のあることが示された。
1.mRNAのEndo V耐性検査
DNA切断活性を有するDNA修復酵素として、10U/μLのEndo V(NEB社製)を使用した。Endo VがmRNAを分解しないことを確認するために、以下の検査を行なった。上記PDO-mRNAを1 pmolと、Endo Vを1pmolと、10 x reaction bufferと、RNaseフリー水とを加えて10μLの混合液1を調製した。また、同量のPDO-mRNAと、RNase T1(Ambion社製)を1pmolと、10 x reaction bufferと、RNaseフリー水とを加えて混合し、10μLの混合液2を調整した。
図9中、第1レーンには100bp DNA ladder(プロメガ(株)製)を、サイズマーカーとして1μLアプライした。第2レーンには未処理のPDO-mRNAを0.5 pmol、第3レーンにはRNase T1にて処理した混合液を5μL、第4レーンにはEndo Vで処理した混合液を5μL、それぞれアプライした。
一方、第2レーンとEndo V処理物をアプライした第4レーンとを比べると、同じ位置にバンドが検出されており、PDO-mRNAはEndo Vによっては分解されないことが示された。
このことから、SBP(rG)とRNase T1とを用いるcDNAディスプレイ法の場合、固相からの切り離し工程の後に、反応液中にRNase T1が残留していると、その後の工程で合成されるmRNAが切断される可能性があることが明らかになった。一方、SBP(I)とRNase T1とを用いる本願発明のcDNAディスプレイ法では、そのような影響のないことが示された。
RNA量換算にて2 pmol相当の上記ライゲーション反応産物、2μLの2.5 mMのdNTP Mix、0.5μLの0.1MのDTTを、0.25μLの200U/μLのSuper script III reverse transcriptase(Invitrogen製、Superscriptは登録商標)、2μLの5 x First strand bufferとに、RNaseフリー水を加えて混合し、10μLの混合液とした。上記の混合液中で、10分間、40℃にて逆転写反応をさせ、mRNA−リンカー連結体から逆転写産物を得た。図10に模式図を示した。
得られた逆転写反応産物のうち5μLを取り、ここにDNA切断活性を有するDNA修復酵素としてEndo V(10U/μL)を0.5μL加え、10分間、37℃にて反応させた。
4.生成物の検出
上記産物をSDS-PAGE法にて分析した。電気泳動は、8Mの尿素を含有する5%ポリアクリルアミドゲルにて、200V、60℃の条件下で60分間行い、リンカー中のFITCを蛍光検出した。結果を図11に示す。
図11中、第1レーンにはmRNA-SBP(I)をRNA量換算にて0.5 pmol相当、第2レーンにはEndo V未処理の逆転写反応産物を2.5μL、第3レーンにはEndo V処理逆転写反応産物を2.5μL、それぞれアプライした。
また、第2レーンとEndo V処理逆転写反応産物をアプライした第3レーンとの比較から、mRNA/cDNA-SBP(I)連結体が、Endo V がmRNA/cDNA-SBP(I)連結体中の切断領域に組み込まれたデオキシイノシンを認識し、特定の切断部位で切断したことが示された。ここで上記連結体から分離したのは、mRNA及びリンカーの5'末端側部分からなる断片であり、cDNA及びFITCを含むリンカーの3'末端側部分からなる断片は分離されなかった。
なお、上記の連結体のmRNAが分解され、その結果、上記連結体のcDNAを含む部分が断片化されたわけではないことは、上記1.のEndo V耐性検査で確認済みである。
1.翻訳反応
mRNA−リンカー連結体を用いて、無細胞翻訳系にて翻訳反応を行った。RNA量換算にて2pmol相当の上記ライゲーション産物と、0.3μLの20 x translation Mix (Met-)(Ambion社製)と、0.3μLの20 x translation Mix (Met-)(Ambion社製)と、8.5μLのウサギ網状赤血球の細胞溶解液であるRabbit Retic Lysate(Ambion社製)とに、RNaseフリー水を加えて混合し、12.5μlの混合液とした。この混合液中、30℃にて20分間反応させ、上記コード配列からPOUのポリペプチド鎖又はタンパク質を合成し、mRNA−リンカー−タンパク質連結体(IVV)を生成させた。図12に模式図を示す。
反応終了後、生成したIVVをSDS-PAGE法にて分析した。電気泳動は8Mの尿素を含有する6%のゲルを用いて、10mA、室温の条件下で150分間行い、リンカー中のFITCを蛍光検出した。蛍光検出の条件は、実施例2と同様とした。結果を図13に示す。
mRNA-SBP(I)をアプライした第1レーンと翻訳反応産物をアプライした第2レーンとを比較すると、第2レーンにmRNA−リンカー−タンパク質連結体に相当するバンドが現れていた。このことはmRNA-SBP(I)連結体から、正常にタンパク質が合成され、ピューロマイシンを介してSBP(I)と前記タンパク質とが結合したことを表す。
以上の結果から、SBP(I)からIVVを形成できることが示された。
Deoxyinosine
Biotin-dT
Amino-Modifier C6 dT
Biotin-loop
Biotin-dT
Amino-Modifier C6 dT
rG-Hybri
DNA
RNA
Biotin-dT
Amino-Modifier C6 dT
Claims (8)
- 主鎖と側鎖とを有するリンカーであって、
前記主鎖は、
固相との結合を形成する所定の分子を有している固相結合部位と;
前記固相結合部を挟むように位置し、DNA修復酵素で切断される損傷DNAを含む、前記リンカー上で固相合成されたcDNAを前記固相から前記リンカーごと前記DNA修復酵素で切り離すための2以上の切断部位と;
前記リンカーの5’末端側に位置し、RNAリガーゼが認識し得るmRNA連結部位と;
前記リンカーの3’末端側近傍に位置する側鎖連結部位と;
前記リンカーの3’末端側に位置し、前記リンカー上で逆転写が行われる場合に逆転写用のプライマーとして機能するプライマー領域と、
を備え、
前記側鎖は、前記側鎖連結部位に連結され、
前記固相結合部位及び前記切断部位は一本鎖DNAで構成されており、
前記DNA修復酵素は、エンドヌクレアーゼV、Endo III、Endo IV、Endo VIII、Fpg、hAAG、hNEIL 1、hOGG1、T4 PDG、APE1、Tma Endo III、Tth Endo IVからなる群から選ばれるいずれかの酵素であり、
前記損傷DNAは、デオキシイノシン、アプリン酸、アピリミジン酸、酸化ピリミジン、酸化プリン、アルキル化プリン、デオキシウリジン、5−ヒドロキシウラシル、5−ヒドロキシメチルウラシル、5−ホルミルウラシル、ピリミジンダイマー、ジヒドロチミン、6−メチルアデニン、8−オキソグアニン、及びデオキシウラシルからなる群から選ばれる塩基である、mRNA/cDNA−タンパク質連結体作製用リンカー。 - 前記DNA修復酵素は、一本鎖DNAに対するエンドヌクレアーゼ作用を有する酵素であることを特徴とする、請求項1に記載のmRNA/cDNA−タンパク質連結体作製用リンカー。
- 前記所定の分子はビオチン又はその類縁体であり、
前記固相結合部位は、少なくとも1〜10塩基で構成され、
前記切断部位は、損傷DNAを含む配列で構成され、
前記mRNA連結部位は、少なくとも1〜10塩基で構成され、
前記側鎖連結部位は、前記プライマー領域の5’側に隣接する位置にある、ことを特徴とする請求項1又は2に記載のmRNA/cDNA−タンパク質連結体作製用リンカー。 - 前記DNA修復酵素がエンドヌクレアーゼVである、ことを特徴とする請求項1又は2のいずれかに記載のmRNA/cDNA−タンパク質連結体作製用リンカー。
- 前記側鎖は、その3’末端に主鎖と相補的なmRNAから合成されたタンパク質を連結するためのタンパク質連結部位を有し、その5’末端で前記リンカーの主鎖と連結されている、ことを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載のmRNA/cDNA−タンパク質連結体作製用リンカー。
- 前記側鎖は、前記タンパク質連結部位と前記側鎖連結部位との間に、スペーサーと蛍光基とを有することを特徴とする、請求項6に記載のmRNA/cDNA−タンパク質連結体作製用リンカー。
- 請求項1〜7のいずれかに記載のmRNA/cDNA−タンパク質連結体作製用リンカーと、前記リンカーの主鎖と相補的な配列を有するmRNAを前記mRNA連結部位でT4 RNAリガーゼによって結合させる、mRNA−リンカー連結体生成工程と;
前記mRNAからタンパク質を合成し、前記合成されたタンパク質が、前記mRNA−リンカー連結体中の前記タンパク質連結部位に連結する、mRNA−リンカー−タンパク質連結体生成工程と;
前記mRNA−リンカー−タンパク質連結体を、前記固相結合部位を介して固相に結合させる固相結合工程と;
前記mRNA−リンカー−タンパク質連結体の結合した固相を第1の緩衝液にて洗浄する、第1洗浄工程と;
前記主鎖の3’末端を反応開始点とし、前記mRNAを鋳型として、逆転写反応を行ってcDNA鎖を合成し、mRNA/cDNA−リンカー−タンパク質連結体を得る工程と;
前記mRNA/cDNA−リンカー−タンパク質連結体の結合した固相を第2の緩衝液にて洗浄する第2洗浄工程と;
前記主鎖の切断部位を、前記所定のDNA修復酵素で切断する工程と;を備える、mRNA/cDNA−リンカー−タンパク質連結体の生成方法。
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