JP6506838B2 - 試験管内淘汰及び分子間相互作用解析用高速光架橋型共用リンカー、そのリンカーを用いた試験管内淘汰方法 - Google Patents
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Description
また、図1Cには、前記従来例1に加えて、固相とリンカーとを切り離すための第1及び第2切断部位を有するリンカーが示されている(特許文献1参照、以下、「従来例3」という。)。図1Dには、2本の主鎖がソラレンで連結されたリンカーが示されている(特許文献2参照、以下、「従来例4」という。)。
すなわち、本発明の一態様は、主鎖と側鎖とを有するリンカーであって、前記主鎖は、所定の塩基配列を有し、前記主鎖の5’末端に位置し固相との結合を形成するための固相結合部位と;前記固相結合部位ごと前記固相を切り離すための固相切断部位と;前記側鎖を連結するための側鎖連結部位と;前記側鎖連結部位と前記固相切断部位との間に位置し、300〜400nmの波長の光を0.5〜5分間照射することによって、前記主鎖と相補的な配列を有するmRNAを、前記主鎖と高速光架橋によって連結する高速光架橋部位と;前記側鎖連結部位に隣接し、前記主鎖の3’末端に位置する逆転写開始領域と;を備え、0〜100mM NaClを含む水溶液中、室温にて精製可能なリンカーであって;前記側鎖は、蛍光標識と、遊離末端に位置するタンパク質結合部位と、前記主鎖の側鎖連結部位に連結される連結形成部位とを備え、前記側鎖は前記連結形成部位で前記側鎖連結部位に連結されており、前記固相切断部位は、デオキシイノシン、リボG又はリボピリミジンからなる群から選ばれる塩基で構成され、前記高速光架橋部位はシアノビニルカルバゾール化合物で構成され、前記光架橋は、光架橋反応液中にて、mRNAと主鎖とを2段階相補結合によりアニールさせた後に形成される、試験管内淘汰及び分子間相互作用解析のための高速光架橋型共用リンカーである。
図3Aに示すように、本発明は、(a)主鎖と(b)側鎖とを備える高速光架橋型cDNAディスプレイ用リンカーであり、上記主鎖(a)は、(a1)所定の塩基配列を有し、前記主鎖の5'末端に位置し固相との結合を形成するための固相結合部位と;(a2)前記固相結合部位ごと前記固相を切り離すための固相切断部位と;(a3)前記側鎖を連結するための側鎖連結部位と;(a4)前記側鎖連結部位と前記固相切断部位との間に位置し、主鎖と相補的な配列を有するmRNAを、前記主鎖と光架橋によって連結する高速光架橋部位と;(a5)前記側鎖連結部位に隣接し、前記主鎖の3'末端に位置する逆転写開始領域と;を備えている。また、上記側鎖(b)は、(b1)蛍光標識と、(b2)遊離末端に位置するタンパク質結合部位と、(b3)前記主鎖の側鎖連結部位に連結される連結形成部位と、を備えている。そして、前記側鎖(b)は、前記連結形成部位で前記主鎖(a)の側鎖連結部位に連結されている。
このような主鎖としては、例えば、図3Bに示すような逆転写開始領域と、側鎖連結部位と、高速光架橋部位と、固相結合部位とを含むように設計することができる。図3Bに示す主鎖のうち、修飾された部位を除く主鎖の塩基配列を下記の配列(配列表の配列番号1)に示す。下記の主鎖は、5'末端にBioTEGが付加されている。また、下記の塩基配列中、Nはイノシンを表し、XはアミノC6-dTを表す。
5'AAAAAAAAAAAAAAAAAAAASTTCCAGCCGCCCCCCGVCCT 3'
所望の配列を有するライブラリDNAとFLAG配列とがコードされたDNAを、所望の比率、例えば、25,000〜100,000:1のモル比で混合したDNA混合物を調製し、一部を取って転写する。例えば、250〜1,000ngを、RiboMAX Large Scale RNA Production Systems-T7等のキットを使用して、10〜20μLのスケールで転写を行う。転写に使用する配列としては、例えば、下記のような配列(配列表の配列番号2)を使用することができる。下記の配列中、Nは、任意にA, T, G, 及びCを表し、KはG又はTを表す。
GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAAACAACAACAACATTACATTTTACATTCTACAACTACAAGCCACCATGGGCAGCNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKGGAGGTGGAATTAAAAACATGTGCAATTTGAACCCACTTTTAAAAAAGTGGCTAAATGATGCAAAGGGGGGAGGCAGCCATCATCATCATCATCACGGCGGAAGCAGGACGGGGGGCGGCGTGGAAA
5'-GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACA-3'
5'‐TTTCCACGCCGCCCCCCGTCCTGCTTCCGCCGTGATGAT‐3'
GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGG
GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAAACAACAACAACATTACATTTTACATTCTACAACTACAAGCCACCATGGATAACAAATTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTACATTTACCTAACTTAAACGAAGAACAACGCAATGGTTTCATCCAAAGCCTAAAAGATGACCCAAGCCAAAGCGCTAACCTTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAATGATGCTCAAGCACCAAAAGCTGACAACAAATTCAACGGGGGAGGCAGCCATCATCATCATCATCACGGCGGAAGCAGGACGGGGGGCGGCGTGGAAA
5'-GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAAACAACAACAACATTACATTTTACATTCTACAACTACAAGCCACCATGGGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGATCCGTGCAGGCTGGAGGAAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCTGCTAGCGGAnbnnbndrbyhmyhmyhmdrbnbnnbnTGGTTCCGCCAGGCTCCTGGAAAGGAGCGCGAGGGAGTGnbnnbndrbyhmyhmyhmyhmdrbACCTACTACGCTGACAGCGTGAAGGGACGCTTCACCATCAGCCAGGACAACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCTGAGGACACCGCTATCTACTACTGCGCTGCTdrbdrbyhmyhmyhmyhmyhmyhmyhmyhmyhmyhmdrbTACTGGGGACAGGGAACCCAGGTGACCGTGGGAGGAGGCAGCCATCATCATCATCATCACGGCGGAAGCAGGACGGGGGGCGGCGGGGAAA-3'
5'-TTTCCACGCCGCCCCCCGTCCT-3'
(配列番号8)ΩRT-Lnew (32 mer)
5'‐GGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAAC‐3'
5'-GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACA
ATTACCAACAACAACAACAAACAACAACAACATTACATTTTACATTCTAC
AACTACAAGCCACCATGGATAACAAATTCAACAAAGAACAACAAAATGCT
TTCTATGAAATCTTACATTTACCTAACTTAAACGAAGAACAACGCAATGG
TTTCATCCAAAGCCTAAAAGATGACCCAAGCCAAAGCGCTAACCTTTTAG
CAGAAGCTAAAAAGCTAAATGATGCTCAAGCACCAAAAGCTGACAACAAA
TTCAACGGGGGAGGCAGCCATCATCATCATCATCACGGCGGAAGCAGGAC
GGGGGGCGGCGGGGAAA -3'
(1)本発明のリンカー(Puromycine-linker(polyA+cnvK))の作製
Puromycine-linker(polyA+cnvK)の構造を図3A及び3Bに示す。ビオチンフラグメント(poly A+cnvK:主鎖)は、配列表の配列番号1に記載された配列を有している。ここで、上記主鎖の5'末端にはBioTEGが結合しており、また、塩基配列中のNはイノシンを、XはAminoC6-dTをそれぞれ表す。また、ピューロマイシン-セグメント(側鎖)は、下記の配列を有する。
B液:80%アセトニトリル
プログラム:A液とB液との組成比は、開始時のA液85%を45分かけて65%とするグラディエント
流速:1mL/分
分画:1mL
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems-T7(Promega Corp.製)を使用して転写を行なった。この転写により得られたBDA mRNA とピューロマイシン−リンカー(poly A+cnvK)とを、各々終濃度が1μMになるように100mMのNaClを含む25mMのTris-HClバッファー(pH7.5)に加えた。90℃で1分間インキュベートした後に、70℃で1分間インキュベートし、0.08℃/秒の速度で25℃まで降温させて、ピューロマイシン−リンカー(poly A+cnvK)をmRNAの3'末端側にハイブリダイズさせた。続いてCL-1000 UV Crosslinkerを用いてUV(366nm)を、約1分間照射した。以上の操作によって、BDA mRNAとピューロマイシン−リンカー(poly A+cnvK)とのハイブリダイズ調製物を得た。
モデルとして、Aタンパク質のBドメインがコードされたDNA(配列表の配列番号6)を使用した。RiboMAX Large Scale RNA Production Systems-T7を使用して転写を行なった。転写によって得られたBDA mRNAと、ピューロマイシン−リンカー(poly A+cnvK)を、各々終濃度が1μMとなるように、100mMのNaClを含む25mMのTris-HClバッファー(pH 7.5)に加えた。90℃で1分間インキュベートし、その後、70℃で1分間インキュベートして、0.08℃/秒の速さで25℃まで降温してピューロマイシン−リンカー(poly A+cnvK)をmRNAの3'末端側にハイブリダイズさせた。その後、CL-1000 UV Crosslinkerを用いて、366nmのUVを30秒間〜150秒間UVを照射し、架橋に要する時間を検討した(図7B及び7C)。
(1)ライブラリの転写
下記の配列を有する8アミノ酸ランダムライブラリDNA(配列表の配列番号2)とFLAG配列(配列表の配列番号11)とがコードされたDNAを、50,000:1のモル比で混合したDNA混合物を調製し、その500 ngをRiboMAX Large Scale RNA Production Systems-T7(以下、単に「キット」ということがある。)を使用して、15μLのスケールで転写した。下記配列中、Nは、任意にA, T, G, 及びCを表し、KはG又はTを表す。
GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAAACAACAACAACATTACATTTTACATTCTACAACTACAAGCCACCATGGGCAGCNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKGGAGGTGGAATTAAAAACATGTGCAATTTGAACCCACTTTTAAAAAAGTGGCTAAATGATGCAAAGGGGGGAGGCAGCCATCATCATCATCATCACGGCGGAAGCAGGACGGGGGGCGGCGTGGAAA
GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAAACAACAACAACATTACATTTTACATTCTACAACTACAAGCCACCATGGGCAGCGATTATAAGGACGATGACGATAAGGGGAGGTGGAATTAAAAACATGTGCAATTTGAACCCACTTTTAAAAAAGTGGCTAAATGATGCAAAGGGGGGAGGCAGCCATCATCATCATCATCACGGCGGAAGCAGGACGGGGGGCGGCGTGGAAA
上記実施例2と同様にして、mRNAとピューロマイシン−リンカー(poly A+cnvK)の光架橋を行ない、20pmolのライブラリmRNAにピューロマイシン−リンカー(poly A+cnvK)を光架橋した。このときのUV照射時間は2分とした。
15pmolのmRNA-リンカー連結体を、上記実施例2と同様に、125μLスケールで、上記無細胞翻訳系を用いて30℃で15分間翻訳した。その後、MgCl2及びKClをそれぞれ最終濃度が75mM及び900mMとなるように加えて、37℃で1時間インキュベートし、mRNA-ペプチド連結体を含む翻訳反応液を得た。
上記のようにして得られた翻訳反応液に、0.5MのEDTA(pH 8.0)を終濃度が83mMとなるように加えて、室温で5分間インキュベートし、mRNA-ペプチド連結体に結合しているリボソームを除去した。
150μLの1xNEバッファーで、上記(4)で反応させたDynabeads MyOne C1 ストレプトアビジンを洗浄し、その後10UのEndonuclease V(ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン(株)製)を含む、75μLの1xNEバッファーを加えて、冷却サーモブロックローテーターを用いて37℃で1時間撹拌した。次いで、75μLの2xHis-tag洗浄バッファー(1MのNaCl、0.1%のTween-20を含む40mMのリン酸ナトリウムリム(pH 7.4))を加え、その後上清を回収した。
回収した上清150μLと、20μLのHis Mag Sepharose Ni(GEヘルスケア社製、1xHis-tag洗浄バッファーにより洗浄済み)とを混合し、インテリミキサーRM-2M((株)トーホー製)を用いて、室温で1時間撹拌した。100μLの1xHis-tag洗浄バッファーで2回洗浄し、その後、EDTA濃度を高めた30μLのセレクションバッファー(1MのNaCl、10mMのイミダゾール、5mMのEDTA及び0.1%のTween-20を含む50mMのTris-HClバッファー(pH 7.4))を加え、上記のインテリミキサーRM-2Mを使用して、室温で10分間撹拌し、その後に上清を回収した。
50μLの抗FLAG M2アフィニティゲル(50%懸濁液)を、MicroSpin Empty Columns(GEヘルスケア社製)に充填し、200μLのセレクションバッファーで3回洗浄した。その後、上記の上清100μLをカラムにロードし、ローテーターを用いて室温で1時間撹拌した。200μLのセレクションバッファーで4回カラムを洗浄し、次いで100ng/μLの3xFLAGペプチド(シグマアルドリッチジャパン合同会社製)を100μL加え、上記のローテーターを用いて室温で15分間撹拌し、抗FLAG M2アフィニティゲルに結合しているmRNA/cDNA-ペプチド連結体を競合溶出させた。
5'-GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACA-3'
5'‐TTTCCACGCCGCCCCCCGTCCTGCTTCCGCCGTGATGAT‐3'
GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGG
上記PCR反応液4本分をまとめてカラム精製し次ラウンドに使用した。上記(1)ライブラリDNAの転写から(7)アフィニティセレクションまでを、合計で3ラウンド行い、その結果得られたフルコンストラクトDNAの配列をダイレクトシーケンシングした。このダイレクトシーケンシングは、ユーロフィンジェノミクス(株)に委託した。ダイレクトシーケンシングの結果、FLGA DNAが収束していることを確認した(図8(A)及び8(B))。
本実施例でも、モデルタンパク質として上記と同様にAタンパク質のBドメイン(BDA)を使用した。上記実施例3で行ったcDNAディスプレイ法によるFLAG配列のモデルセレクションの(1)〜(7)までと同様の手順により、BDAをコードしたDNAから、mRNAとして30pmol分のmRNA-ペプチド連結体を調製した。
GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAAACAACAACAACATTACATTTTACATTCTACAACTACAAGCCACCATGGATAACAAATTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTACATTTACCTAACTTAAACGAAGAACAACGCAATGGTTTCATCCAAAGCCTAAAAGATGACCCAAGCCAAAGCGCTAACCTTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAATGATGCTCAAGCACCAAAAGCTGACAACAAATTCAACGGGGGAGGCAGCCATCATCATCATCATCACGGCGGAAGCAGGACGGGGGGCGGCGTGGAAA
Biacore X100(GEヘルスケア社製)に、センサーチップSAをセットした。上記のようにして得たビオチン接着BDA溶液を、1xHis-tag洗浄バッファーで2倍希釈した。この希釈ビオチン接着BDA溶液を、流速5μLで900秒流し、センサーチップ上にビオチン接着BDAを固定化した。
(1)ビオチン−cnvKリンカーの合成
cnvKを含むセグメント(主鎖)と、ピューロマイシンとFITCとを含むPuro-F-S(側鎖)で構成されている本実施例で使用するcnvKリンカー(図3B参照)を、以下の方法によりビオチンとさらに結合させて、Biotin-cnvKリンカーを作成した
(2−1)VHHライブライブラリを鋳型とするPCRによるDNAの増幅
CDR1、2、3にランダム配列を有するVHHライブラリ(配列表の配列番号7)を鋳型DNAとして以下の条件でPCR1を行い、DNAを増幅させた。配列表7中のn、b、d、r、y、h、y、及びmは上記と同様である。
5'-GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAAACAACAACAACATTACATTTTACATTCTACAACTACAAGCCACCATGGGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGATCCGTGCAGGCTGGAGGAAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCTGCTAGCGGAnbnnbndrbyhmyhmyhmdrbnbnnbnTGGTTCCGCCAGGCTCCTGGAAAGGAGCGCGAGGGAGTGnbnnbndrbyhmyhmyhmyhmdrbACCTACTACGCTGACAGCGTGAAGGGACGCTTCACCATCAGCCAGGACAACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCTGAGGACACCGCTATCTACTACTGCGCTGCTdrbdrbyhmyhmyhmyhmyhmyhmyhmyhmyhmyhmdrbTACTGGGGACAGGGAACCCAGGTGACCGTGGGAGGAGGCAGCCATCATCATCATCATCACGGCGGAAGCAGGACGGGGGGCGGCGGGGAAA-3'
RiboMAXTM Large Scale RNA production Systems(Promega社製)を用いて、上記のPCR2で得られたDNAをmRNAに転写した。この転写反応に使用した反応溶液の組成と手順は下記の表4の通りとした。
以上のようにして各セレクションラウンドで得られたmRNAを精製し、精製mRNAを得た。各セレクションラウンドで得られた精製mRNAと、Biotin-cnvKリンカーとを、以下条件で光架橋により連結させた。光架橋用反応溶液の組成を下記の表6に示す。光架橋反応溶液中のmRNAとBiotin-cnvKリンカーとの比率は、いずれの場合も1:1(モル比)とした。また、アニーリングは、90℃で2分、1分間で70℃まで降温、70℃で1分、その後15分間で25℃まで降温させることによって行った。
以上のようにして得られたmRNA-リンカー連結体を、無細胞翻訳系で翻訳し、mRNA-ペプチド連結体を形成させた。無細胞翻訳に用いた反応液の組成を下記表7に示す。
Streptavidin(SA) Magnetic beads:Dynabeads MyOne Streptavidin C1(磁性体ビーズ)をRNase-Freeとするために、洗浄を行った。投入するmRNA-ペプチド連結体の濃度の10倍容の磁性体ビーズを、1.5mL容量のProtein LoBindチューブ(Eppendorf社製)に入れ、磁気スタンド上に静置して上澄を捨てた。1x結合バッファーで再懸濁し、磁気スタンド上に静置して上澄を捨て、磁性体ビーズを洗浄した。ここに、上記(2−4)で得た翻訳産物(mRNA-ペプチド連結体)を加え、25℃で90〜120分間、ローテーターで攪拌しながらインキュベートし、mRNA-ペプチド連結体を磁性体ビーズに結合させた。使用したmRNA-ペプチド連結体の量と、インキュベート時間とは下記表8
に示す通りとした。
以上のようにしてmRNA-ペプチド連結体を磁性体ビーズ上に固定化し、磁性体ビーズが入ったチューブを磁気スタンド上に静置して上澄を捨てた。このチューブに100μLの1x結合バッファーを加えて磁性体ビーズを再懸濁させ、再度上澄を捨てて、磁性体ビーズを洗浄した。この操作を2回繰り返した。
以上のようにしてcDNAディスプレイを調製し、VHHの配列をコードしたペプチドが発現しているものと、発現していないものとをHis-tag精製により分別した。先ず、上記のcDNAディスプレイが入ったチューブにHis Mag sepharose Niを加え、25℃で1時間、シェーカーで振盪しながらインキュベートした。その後、このチューブを磁気スタンド上に静置して上澄を除き、100μLの1x His tagバッファーで1回洗浄した。
磁性体ビーズとビオチン化GlcNAcとをインキュベートしてビオチン化GlcNAcを固定化した磁性体ビーズと、何も固定化していない磁性体ビーズとを用意し、そこにビオチン-DNAを等量ずつ加えてインキュベートし、ビオチン化GlcNAcが磁性体ビーズに固定化されているかどうかの確認を行った。
(1)試験管内淘汰条件の検討
次いで、得られたGlcNAc特異的cDNAディスプレイを用いて、標的分子であるGlcNAcに対するVHHの試験管内淘汰を行った。まず、磁性体ビーズを試験管内でグルコサミン洗浄バッファーを用いて洗浄し、ビオチン化GlcNAcをここに加えて、室温にて30分間、シェーカーで振盪しながらインキュベートした。その後、チューブを磁気スタンド上に静置して上澄を捨て、グルコサミン洗浄用バッファーを加えて再び磁性体ビーズを洗浄し、次いで、ビオチンを加えて、室温にて30分間、シェーカーにて振盪しながらインキュベートした。
GlcNAcを標的分子として、GlcNAcに結合しないAタンパク質のBドメイン(以下、「BDA」ということがある。)と、第6ラウンド後に回収したVHHのcDNAディスプレイとを一緒に試験管内淘汰に供し、そのGlcNAcに対する結合能を確認した。
これは、BDAのcDNAディスプレイが溶出されなかったのに対して、取得したVHHのcDNAディスプレイは溶出されてきたことを示す。この結果から、第6ラウンドの試験管内淘汰によって得られたVHHのcDNAディスプレイはGlcNAcに対して結合能があることが確認された。
上記実施例6(2)と同様の操作で得られたVHHライブラリコンストラクトのPCR産物、それらのmRNA、それらのmRNA-リンカー連結体を、4%PAGE、200Vで30分間、ゲル電気泳動し、SYBER Gold又はFITCで染色して、PCRによる増幅及びmRNAとリンカーとの光架橋を確認した。第1及び第6ラウンドの結果を、それぞれ図12(A)及び(B)、並びに図13(A)及び(B)に示す。
mRNA-リンカー連結体、mRNA-ペプチド連結体、及び磁性体ビーズとを試験管内で共にインキュベートし、インキュベート終了後の上澄を、4%スタッキングゲル、6%ランニングゲル、200Vにて120分間、電気泳動し、FITCで染色してmRNA-ペプチド連結体の形成を確認した。mRNA-リンカー結合体は対照として使用した。結果を図14に示す。
各ラウンドでGlcNAcにより競合溶出したVHH、洗浄液中に含まれるペプチドを、上記と同様の条件でPCRによって増幅させ、4%PAGE、200Vにて30分間ゲル電気泳動し、試験管内淘汰の進行度を確認した。結果を図15(A)〜(C)に示す。
従来例1〜5のリンカー(以下、「従来リンカー1」のようにいう。)の構造を模式的に図1A〜1Dに示す。
(比較例1)従来リンカー1(SBPリンカー)の合成及び特性評価
(1)従来リンカー1の合成
Short-ビオチン-ピューロマイシン・リンカー(SBPリンカー)を合成した。まず、下記の(A)及び(B1)合成をジーンワールド(株)(東京)及び(株)BEX(東京)に委託した。
ここで、(S)は、Thiol-Modifier C6 S-Sである(化合物名:o-(dimethoxytrityloxy-hexyl-dithiohexyl)-o'-(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropyl-phosphoramidite)(PL)は、PC Linker Phosphoramiditeである(化合物名:3-(4,4'-Dimethoxytrityl)-1-(2-nitrophenyl)-1-propanyl-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)。(F)は、Fluorescein-dTである(化合物名:(5'-Dimethoxytrityloxy-5-[N-((3',6'-dipivaloylfluoresceinyl)-aminohexyl)-3-acryimido]-2'-deoxyUridine-3'-succinoyl-long chain alkylamino)。また、(Puro)は、ピューロマイシンを表わす。
ここで、Dはアミノ-モディファイヤーC6 dT(5'-Dimethoxytrityl-5-[N-(trifluoro acetylaminohexyl)-3-acrylimido]-2'-deoxyUridine,3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite);BはBiotin-dT(5'-Dimethoxytrityloxy-5-[N-((4-t-butylbenzoyl)-biotinyl)-aminohexyl)-3-acrylimido]-2'-deoxyUridine-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)、RはriboGである(すべてGlen Research Search社製)。
カラム:COSMOSIL(登録商標)10x250mm C18-AR-300(ナカライテスク(株)製)
バッファーA:0.1M TEAA(triethylammonium acetate)
バッファーB:80%アセトニトリル(超純水で希釈したもの)
流速:0.5ml/分
濃度勾配:A及びBの混合バッファー濃度は85:15→65:15(A:B)で変化させた(33分間)。
モデルmRNAとしてBDA(B domain of Protein A)を用いることとした。BDA遺伝子(BDA gene; 192塩基長)の5'側上流にT7プロモーター配列と翻訳促進配列、3'側下流にスペーサー領域、ヒスチジンタグ(Hisタグ)及びピューロマイシン・リンカーとの相補鎖領域を有する配列を付加したDNA(BDA whole;配列表の配列番号6;367塩基長)をPCRによって合成、精製した後、T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System(プロメガ社製))を用いて、添付のプロトコルに従って5〜30 pmol/μLのmRNA(BDA mRNA)を合成した。
(3−1)mRNAとの連結体の形成
T4 RNAリガーゼを用いたライゲーション反応を以下のように行った。従来リンカー2を1としたときに1〜6倍のmRNAを加え、20μLのT4 RNAリガーゼバッファー(10mM 塩化マグネシウム、10mM DTT及び1mM ATPを含む50mM Tris-HCl(pH 7.5))中にて行なった。酵素を加える前にアニーリングするため、90℃で5分間アルミブロック上にて温め、次に70℃で5分間アルミブロック上にて温め、最後に室温で10分間放置した。その後、氷上に置いた。ここに、1μLのT4ポリヌクレオチドキナーゼ(10U/μL)及び1μLのT4 RNAリガーゼ(40U/μL)(いずれもタカラバイオ(株)製)を加え、25℃で15分間保持した。
以下に示す混合比で、mRNAとSBPリンカーとの連結効率を比較した。比較は、65℃、8M尿素変性5%アクリルアミドゲルを用い、200Vにて25分間の電気泳動にて行った。サンプルを各々1μLずつ分注し、3μLのローディングバッファーと2μLのDEPC水と混合して、ゲルにロードした。結果を図20に示す。バンドの検出はリンカーに結合したFITCの蛍光により行い、未反応のリンカー又は上記連結体Aを検出した。
(1)従来リンカー2(LBPリンカー)の合成
Long-Biotin-ピューロマイシン・リンカー(LBPリンカー)を以下のように合成した。まず、上記(1-1)の(A)及び(B2)の合成をジーンワールド(株)及び(株)BEXに委託した。
カラム:Symmetry 300 C18, 5μm, 内径4.6mmx250mm (Waters Corporation製)
溶離液:下記の溶液Aと溶液Bとを混合して使用した。
溶液A:0.1M TEAA (酢酸トリエチルアンモニウム)
溶液B:80%アセトニトリル(超純水で希釈したもの)
流速:0.5mL/分
溶離液の濃度勾配:溶液A:溶液Bを、30分間で85:15→65:35に変化させた。
従来リンカー2がエンドヌクレアーゼV(以下、「Endo V」ということがある。M0305S、New England Biolabs, Inc.(以下、「NEB社」と略すことがある。)製)で切断されるか否かを評価した。
(1)従来リンカー3の合成
本発明で使用するイノシン-Short-Biotin-ピューロマイシン・リンカー(SBP(I)リンカー)及びrG-Short-Biotin-ピューロマイシン・リンカー(SBP(rG)リンカー)を以下のように合成した。まず、比較例1に記載した(A)及び(B1)に加えて、(C1)I-hybriセグメント((28mer)、配列表の配列番号14)、及び(C2)rG-Hybriセグメント((26mer) 配列表の配列番号15)という特殊DNAの合成をジーンワールド(株)(東京)に委託した。
上記SBP(I)リンカーは、上記実施例1の(1)で合成した(A)Puro-F-Sセグメントと(B)I-Hybriセグメントとを、以下の方法に従って架橋し精製して得た。また、上記SBP(rG)リンカーは(A)Puro-F-Sと(C)rG-hybriを架橋して得た。
上記のように合成したリンカーSBP(rG)及びSBP(I)のRNase耐性検査を、大腸菌(E.coli)のペリプラズムに由来のRNase ONE(プロメガ社製)を用いて行った。RNase ONEは、A、C、G、Uの各RNAの3'末側のリン酸ジエステル結合を切断する活性を有するRNA分解酵素である。
以上の検査により、SBP(I)は、旧来のSBP(rG)リンカーにはないリボヌクレアーゼ耐性を有することが示された。
(1)従来リンカー4の合成
従来リンカー4(図1D)は、(a)ピューロマイシンセグメント(図23A)、(b)ソラレン−アミノセグメント(図23B)、(c)アジドセグメント、及び(d)アルキン−ペプチド−ビオチンセグメントという4つのセグメントに分けて合成した。これらのうち、(a)と(b)とは主鎖の合成に使用し、(c)と(d)とは基質ユニットの合成に使用する。上記(a)〜(c)のセグメントの合成に使用する特殊DNAの合成を、(株)ジーンワールドおよび(株)日本バイオサービスに委託した。(d)に使用するペプチド合成を(株)スクラムに委託した。上記の(a)ピューロマイシンセグメントは、上述した実施例2(2−1)で合成したものを使用した。
以下の構造を有するソラレン−アミノセグメント(配列表の配列番号16)を合成した。ここで、(psoralen)には、Psoralen C6 Phosphoramidite((6-[4'-(Hydroxymethyl)-4,5',8-trimethylpsoralen]-hexyl-1-O-(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidite))を使用した。
5'-(psoralen)-TACGACGATCTCGAACGAACCACCCCCGCCGCCCCCCG-(T-NH2)-CCT-3'
以下の構造を有するアジドセグメント(配列表の配列番号17)を合成した。ここで、(Spacer18)には、Spacer Phosphoramidite 18((18-0-Dimethoxytrityl hexaethyleneglycol,1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite))を使用した。
5'-CCCGTGGTTCGTTCGAGATCGTCGTAAA-3'
(Azide)には、アジドブチレートNHSエステル(4-Azido-butan-1-oic acid N-hydroxy succinimide ester)を使用した。以上の試薬は、いずれもGlen Research社より購入した。これらの試薬を使用して、核酸自動合成機を用いてホスホロアミダイト法に従って反応させ、アジドセグメントを合成した。
以下の構造を有するアルキン−ペプチド−ビオチンセグメント(配列表の配列番号18)を合成した。以下の配列は、N末からC末に向かう構造として示した。ここで、Gly(Propargyl)には、Fmoc-Gly(Propargyl)-OHを使用した。(K-biotin)-NH2は、リジン残基のC末端をアミド化し、リジン残基の側鎖にビオチンを結合させて修飾したものである。
Gly(Propargyl)-EDHVAHALAQ-(K-Biotin)-NH2
10μLの25μM アジド−セグメントと、25μLの1mM アルキレンペプチド-ビオチンセグメントとを、60μLのt-ブタノール、5μLの0.5mM CuSO4、5μLの2.5mM アスコルビン酸エステルからなる溶液と混合し、室温で撹拌しながら64時間、架橋反応をさせた。得られた架橋反応物をリン酸バッファー(pH 7.2)で平衡化したマイクロバイオスピンカラム6 (Bio-rad社製)で脱塩し、脱塩された架橋反応物をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、DNAをSybrGold (invitrogen社製)で染色して解析した。
4mMのピューロマイシンセグメント5μLを、45μLの1Mリン酸バッファー(pH 9.0)と混合し、1M DTTを5μL加えて室温で1時間放置し、ピューロマイシンセグメントのジスルフィド基をチオール基に還元した。架橋反応を行う直前に、20mMのリン酸バッファー(pH 7.2)で平衡化したNAP-5 Columnを用いて、DTTの除去及び脱塩を行った。0.2Mのリン酸バッファー(pH 7.2)100μLに、10μLの1mMのソラレン−アミノセグメント、及び20μLの100mMの架橋剤(EMCS)を加えてよく攪拌し、37℃で30分間反応させた。
カラム:Symmetry300 C18, 5μm, 4.6 x 250mm (Waters 社製)
バッファーA:0.1M TEAA(酢酸トリメチルアンモニウム、和光純薬工業(株)製)
バッファーB:80%アセトニトリル(和光純薬工業(株)製、超純水で希釈したもの)
流速:0.5ml/分
濃度勾配:A及びBの混合バッファー濃度は、85:15→50:50(A:B)で変化させる(50分間)。
1pmolの架橋物(E)と1.2pmolの架橋物(F)を、20mM Tris-HCl (pH 8.0)と100mM NaCl を含む溶液中で混合し、その後60℃に加熱し、10分かけて25℃まで冷却した。次いで、試料にキセノンランプを光源とする365nm(2W/cm2)の光を20分間照射し、試料を露光させて露光試料とした。この露光試料を、上記と同じ条件の下で、尿素変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、SybrGold (invitrogen社製)でDNAを染色し解析した。結果を図23Eに示す。
配列番号2:プライマー(T7Ωnew)の塩基配列
配列番号3:プライマー(NewYtag)の塩基配列
配列番号4:プライマー(Newleft)の塩基配列
配列番号5:Aタンパク質のBドメインの塩基配列
配列番号6:VHHライブラリコンストラクト
配列番号8:ΩRT-Lnew
配列番号9:NewYtag(22mer)
配列番号10:PDOのDNA配列
配列番号11:FLAGの塩基配列
配列番号12:従来リンカーのHybriセグメントの塩基配列
配列番号14:従来リンカーのI-hybriセグメント
配列番号15:従来リンカーのrG-Hybriセグメントの塩基配列
配列番号16:従来リンカーのソラレン−アミノセグメントの塩基配列
配列番号17:従来リンカーのアジドセグメントの塩基配列
配列番号18:従来リンカーの側鎖のビオチンセグメントの塩基配列
Claims (15)
- 主鎖と側鎖とを有するリンカーであって、
前記主鎖は、
所定の塩基配列を有し、前記主鎖の5’末端に位置し固相との結合を形成するための固相結合部位と;
前記固相結合部位ごと前記固相を切り離すための単一の固相切断部位と;
前記側鎖を連結するための側鎖連結部位と;
前記側鎖連結部位と前記固相切断部位との間に位置し、300〜400nmの波長の光を0.5〜5分間照射することによって、前記主鎖と相補的な配列を有するmRNAを、前記主鎖と高速光架橋によって連結する高速光架橋部位と;
前記側鎖連結部位に隣接し、前記主鎖の3’末端に位置する逆転写開始領域と;
を備え、0〜100mM NaClを含む水溶液中、室温にて精製可能なリンカーであって;
前記側鎖は、蛍光標識と、遊離末端に位置するタンパク質結合部位と、前記主鎖の側鎖連結部位に連結される連結形成部位とを備え、
前記側鎖は前記連結形成部位で前記側鎖連結部位に連結されており、
前記固相切断部位は、デオキシイノシン、リボG又はリボピリミジンからなる群から選ばれるいずれかの塩基で構成され、
前記高速光架橋部位はシアノビニルカルバゾール化合物で構成され、
前記光架橋は、光架橋反応液中にて、mRNAと主鎖とを2段階相補結合によりアニールさせた後に形成される、
試験管内淘汰及び分子間相互作用解析のための高速光架橋型共用リンカー。 - 前記シアノビニルカルバゾール化合物は3−シアノビニルカルバゾールである、ことを特徴とする請求項1に記載の試験管内淘汰及び分子間相互作用解析のための高速光架橋型共用リンカー。
- 前記固相結合部位は、ビオチン、ストレプトアビジン、アルキン、クリックケミストリーによるアジ化物、アミノ基、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHS)、SH基、及びAuからなる群から選ばれるいずれかの化合物と、前記化合物に結合したポリAとで構成される、ことを特徴とする請求項1又は2に記載の試験管内淘汰及び分子間相互作用解析のための高速光架橋型共用リンカー。
- 前記タンパク質結合部位はピューロマイシン又はその類縁化合物で構成されている、ことを特徴とする請求項1又は2に記載の試験管内淘汰及び分子間相互作用解析のための高速光架橋型共用リンカー。
- 前記ピューロマイシンの類縁化合物は、3’-N-アミノアシルピューロマイシン及び3’-N-アミノアシルアデノシンアミノ酸のヌクレオシドからなる群から選ばれるいずれかの化合物である、ことを特徴とする請求項4に記載の試験管内淘汰及び分子間相互作用解析のための高速光架橋型共用リンカー。
- 前記2段階相補結合は、0.75〜1.5M NaCl及び0.2〜0.3M Tris-HClを含む光架橋反応液中にて、88〜92℃で1〜3分加熱し、その後約1分間で65〜75℃まで降温し、引き続き、68〜72℃で0.5〜2分加熱し、その後15分間で20〜30℃まで降温して形成される、請求項1に記載の試験管内淘汰及び分子間相互作用解析のための高速光架橋型共用リンカー。
- 請求項1に記載の試験管内淘汰及び分子間相互作用解析のための高速光架橋型共用リンカーの主鎖と所望のmRNAとを2段階で相補結合させる相補結合形成工程と;
前記相補結合が形成された主鎖とmRNAとに、300〜400nmの波長の光を0.5〜5分間照射して高速で光架橋を形成させる高速光架橋工程と;
前記リンカーに結合されたmRNAを無細胞翻訳系で翻訳し、前記mRNAに対応するタンパク質を前記リンカーのタンパク質結合部位に結合させ、mRNA−タンパク質の融合体を形成する融合体形成工程と;
前記融合体を固相に結合させる固相結合工程と;
前記融合体に含まれるmRNAを逆転写し、前記融合体と逆転写されたcDNAとの結合体を形成する逆転写工程と;
前記結合体を固相切断部位から切断し、回収して、所望のcDNAディスプレイ法を選択する選択工程と;を備え、
前記2段階相補結合は、0.75〜1.5M NaCl及び0.2〜0.3M Tris-HClを含む光架橋反応液中にて、88〜92℃で1〜3分加熱し、その後約1分間で65〜75℃まで降温させる第1アニーリング工程と、引き続き、68〜72℃で0.5〜2分加熱し、その後15分間で20〜30℃まで降温させて、相補結合を形成させる第2アニーリング工程とで形成され、
前記高速光架橋工程ではシアノビニルカルバゾール化合物による光架橋が行われ、
前記結合体は、デオキシイノシン、リボG又はリボピリミジンからなる群から選ばれるいずれかの塩基で構成され前記固相切断部位から切断される、試験管内淘汰方法。 - 前記固相は、ストレプトアビジン又はアビジンでコーティングされた磁性粒子である、ことを特徴とする請求項7に記載の試験管内淘汰方法。
- 前記選択工程における前記結合体の切断は、エンドヌクレアーゼV、RNase T1、及びRNase Aからなる群から選ばれるいずれかの酵素で行う、ことを特徴とする請求項7又は8に記載の試験管内淘汰方法。
- 前記高速光架橋型共用リンカーの主鎖は、糖鎖抗原を認識する配列を有する、ことを特徴とする、請求項9に記載の試験管内淘汰方法。
- 前記固相に結合する部位は、ビオチン、ストレプトアビジン、アルキン、クリックケミストリーによるアジ化物、アミノ基、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHS)、SH基、及びAuからなる群から選ばれるいずれかの化合物と、前記化合物に結合したポリAとで構成される、ことを特徴とする請求項8に記載の試験管内淘汰方法。
- 請求項1に記載の試験管内淘汰及び分子間相互作用解析のための高速光架橋型共用リンカーの主鎖と所望のmRNAとを2段階で相補結合させる相補結合形成工程と;
前記相補結合が形成された主鎖とmRNAとに、300〜400nmの波長の光を0.5〜5分間照射して高速で光架橋を形成させる高速光架橋工程と;
前記リンカーに結合されたmRNAを無細胞翻訳系で翻訳し、前記mRNAに対応するタンパク質を前記リンカーのタンパク質結合部位に結合させ、mRNA−タンパク質の融合体を形成する融合体形成工程と;
前記融合体をRNaseで消化してリンカー−タンパク質融合体とするリンカー−タンパク質融合体形成工程と;
前記リンカー−タンパク質融合体を固相に結合させる固相結合工程と;
前記リンカー−タンパク質融合体を所定の条件下で前記固相から溶出させ、0〜100mM NaClを含む水溶液中、室温にて精製する精製工程と;を備え、
前記2段階相補結合は、0.75〜1.5M NaCl及び0.2〜0.3M Tris-HClを含む光架橋反応液中にて、88〜92℃で1〜3分加熱し、その後約1分間で65〜75℃まで降温させる第1アニーリング工程と、引き続き、68〜72℃で0.5〜2分加熱し、その後15分間で20〜30℃まで降温させて、相補結合を形成させる第2アニーリング工程とで形成される、親和性測定用リンカー−タンパク質の作製方法。 - 前記固相は、ストレプトアビジン又はアビジンでコーティングされた磁性粒子である、ことを特徴とする請求項12に記載の親和性測定用リンカー−タンパク質の作製方法。
- 前記固相に結合する部位は、ビオチン、ストレプトアビジン、アルキン、クリックケミストリーによるアジ化物、アミノ基、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHS)、SH基、及びAuからなる群から選ばれるいずれかの化合物と、前記化合物に結合したポリAとで構成される、ことを特徴とする請求項10に記載の親和性測定用リンカー−タンパク質の作製方法。
- 請求項12〜14のいずれかに記載の方法で作製された親和性測定用リンカー−タンパク質。
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