ES2929650T3 - Método para el cribado in vitro de alta velocidad - Google Patents

Abstract

El propósito de la presente invención es proporcionar un método de selección in vitro de alta velocidad para cualquier biblioteca seleccionada del grupo que consiste en una biblioteca de presentación de ADNc y una biblioteca de aptámeros de ácidos nucleicos. Este método de cribado in vitro de alta velocidad implica: (i) un paso para preparar estructuras esféricas positivas formadas inmovilizando una molécula diana en una estructura esférica y estructuras esféricas negativas que no tienen moléculas diana inmovilizadas sobre ellas; (ii) un paso en el que una molécula de detección de diana, seleccionada de la biblioteca antes mencionada que tiene un tamaño de biblioteca mayor o igual a 1010, se une a cada estructura esférica para obtener conjugados esféricos; (iii) un paso en el que los conjugados esféricos se clasifican en conjugados esféricos positivos y conjugados esféricos negativos con un clasificador de células; (v) un paso para suministrar el ácido nucleico en la superficie de los conjugados esféricos clasificados para PCR; (vi) y un paso de repetición para repetir los pasos (ii) a (v) anteriores usando ADN obtenido por PCR. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para el cribado in vitro de alta velocidad

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para el cribado in vitro de alta velocidad para una presentación de ADNc o un aptámero de ácido nucleico.

Antecedentes

En la actualidad, la intención de la investigación de moléculas funcionales está pasando del estilo convencional, en el que se seleccionan a partir de productos naturales, incluidas las criaturas, a otro estilo, en el que se crean nuevas moléculas funcionales tales como proteínas o péptidos a partir de ADN sintetizado artificialmente. Por ejemplo, existe el problema de que un anticuerpo tiene una gran diferencia de lote debido a una mutación que se introduce en el mismo durante su paso, incluso si se trata de un anticuerpo monoclonal en el campo de los reactivos de diagnóstico o investigación.

En cambio, un anticuerpo de última generación o el aptámero peptídico tiene las siguientes ventajas: la mutación es apenas introducida en el mismo, porque se sintetiza utilizando E. coli sobre la base de la secuencia de ADN o se sintetiza artificialmente; tal síntesis se realiza con bajo costo; y tiene una alta estabilidad térmica. Como ingeniería de evolución molecular para obtener tales anticuerpos de última generación, se desarrollan una variedad de métodos de presentación, y el método de presentación en fagos es un ejemplo típico.

En el método de presentación en fagos, se fusiona una proteína deseada con una proteína de cápside localizada en la vaina más exterior de un bacteriófago que se va a presentar, y luego se criba mediante la unión al ligando biotinizado. El método se utiliza para la detección del anticuerpo, la proteína de unión al ADN, un inhibidor de la proteasa y similares, y proporciona la proteína o el péptido, que funciona como ligando fisiológicamente activo o como agente farmacéutico. También, se desarrolla un método de presentación en el que la proteína se presenta en los microbios.

Entre estos métodos de presentación, se ha establecido el método de presentación en levadura, en el que los péptidos que tienen una actividad particular o los péptidos se presentan en una superficie de levadura, eucariota. Por lo tanto, se ha propuesto un método que permite presentar la proteína de la célula eucariota para permitir su aplicación en el método de presentación en levadura (Documento no patente 1).

En el método, se presenta una secuencia de ADN que incluye una proteína del objeto en el siguiente procedimiento. En primer lugar, una secuencia de señal de secreción que transfiere proteína postraducción a una membrana celular, secuencia de código de la proteína del objeto, una secuencia de código de la proteína localizada en la pared celular o la membrana celular, y se sintetiza una secuencia de código de una proteína de anclaje de la membrana celular para fabricar una construcción. A continuación, se transforma una célula de levadura utilizando la construcción para expresar una proteína fusionada, que se expone a la luz del retículo endoplásmico, se transfiere a la membrana celular a través del cuerpo de Goldi mediante el uso de exocitosis a través de la vesícula secretora. Después de eso, se fusiona la proteína de anclaje con la membrana celular, y se presenta la proteína del objeto en la membrana celular. Cuando la célula tiene la pared celular, por ejemplo, la levadura, la proteína de anclaje es escindida con una enzima, y tanto la proteína del objeto como la localizada en la pared celular son transferidas a la pared celular para presentar la proteína del objeto en la pared celular.

Mediante la aplicación de la presentación en levadura, Feldhaus et al., desarrollaron un método para elegir la célula de levadura transformada para presentar scFv en la superficie de la célula (véase el documento de patente 1 y el documento no patente 2, más adelante, que se denomina “Estado de la técnica 1”.). También, se propone el método altamente eficiente y rápido para la transformación de levadura para fabricar una biblioteca con un tamaño de 2 X 1010 en el máximo utilizando el método de electroporación (véase el documento de patente 2: en adelante, se denomina algunas veces “Estado de la técnica 2”).

Por otro lado, se propuso un virus in vitro, que imita un ciclo retroviral utilizado en un mayor tamaño de la biblioteca, y mantiene su mayor diversidad en comparación con una presentación en fagos. Luego, se propuso la presentación en ADNc, que es mejorada reemplazando su porción de ácido nucleico del ARNm a ADNc (Documento no patente 3: en adelante, denominado algunas veces "Estado de la técnica 3").

Además, aparte de la presentación en ADNc descrita anteriormente, la investigación y el desarrollo de preparaciones farmacéuticas o reactivos de diagnóstico que utilizan aptámeros de ácido nucleico están progresando. El aptámero de ácido nucleico tiene propiedades que se fabrica sin ningún cosa viva; se fabrica utilizando síntesis química con bajo costo, y similares. En la actualidad, el aptámero de ácido nucleico correspondiente a una molécula diana deseable se prepara utilizando métodos SELEX (evolución sistemática del ligando por enriquecimiento exponencial) y similares.

En el método SELEX, la biblioteca inicial compuesta por una mezcla que incluye de 1010 a 1014 de oligo ADN de una sola hebra con una secuencia diferente es sometida a una columna de afinidad en la que las moléculas diana son inmovilizadas para separar el oligo ADN con la actividad de unión a la molécula diana y aquellos sin la actividad de unión. Luego, el ADN mostró que la afinidad con la molécula diana se amplificó utilizando PCR; y luego se cambió la doble hebra obtenida después de la amplificación a la hebra única utilizando el método que utiliza A exonucleasa y similares. Luego, la hebra única es sometida a la selección utilizando la columna y similares y luego se amplifica con PCR. Al repetir la selección y la amplificación, se condensa la secuencia de ADN (biblioteca de ADN) que muestra la afinidad con la molécula diana.

Luego, se aísla el aptámero de ADN de la biblioteca de ADN condensado mediante el método de clonación.

Recientemente se ha mejorado el método SELEX. Tanto la molécula diana inmovilizada en la fase sólida como la biblioteca de ácidos nucleicos en la fase líquida tienen diferentes afinidades de unión, que se utilizan para separar la secuencia activa, sin embargo, a veces se produce una unión no específica. En el método mejorado, tal absorción no específica es disminuida (véase, el documento no patente 4: en adelante, a veces denominado "Estado de la técnica 4").

Además, se describe el método de cribado para el aptámero de ácido nucleico que no utiliza la columna de afinidad ni la electroforesis de zona capilar, sino que utiliza un microscopio de fuerza atómica (véase el documento de patente 3: en adelante, a veces denominado "Estado de la técnica 5").

Aparte de estos, se conoce el aptámero de ARN que se une a la estreptavidina, que puede utilizarse como etiqueta de afinidad utilizando biotina como agente de elución competitivo, cuando el aptámero de ARN que se une a la estreptavidina se selecciona de la biblioteca de ARN (véase el documento no patente 5: en adelante, a veces denominado "Estado de la técnica 6").

Documentos del estado de la técnica

[Documento de patente]

[Documento de patente 1] US 6699658 B1

[Documento de patente 2] Tokuhyou 2011-512841

[Documento de patente 3] JP 2011-055770A

[Documento de patente 4] WO 2015/056713 A1

[Documento de patente 5] US 2005/038229 A1

[Documento de patente 6] JP 2009-124946 A

[Documento de patente 7] JP 2014-515749 A

[Documento de patente 8] JP 2012-531887 A

[Documento no patente]

[Documento no patente 1] Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, vol. 40, No. 4 (2002)

[Documento no patente 2] Nature Biotech, vol. 21, 163-170 (2003)

[Documento no patente 3] Nucleic Acid Research, vol. 37, No. 16, e108 (2009)

[Documento no patente 4] http://www.nedo.go.jp/news/press/AA5_100222.html

[Documento no patente 5] RNA, vol. 7, 632-641 (2001)

[Documento no patente 6] Journal of Biotechnology, vol. 212, 174-180(2015)

Síntesis de la invención

Problemas que serán resueltos por la invención

El documento de patente 4 se refiere a un complejo peptídico que sirve como agonista de la proteína c-Met.

El documento de patente 5 se refiere a los andamios de proteínas que son, por ejemplo, útiles para la generación de productos con nuevas características de unión. A este respecto, el documento de patente 5 describe un método para un cribado de la proteína de unión a TNF-alfa, en el que el ARNm está unido a un conector de puromicina, seguido de una transcripción inversa y una amplificación por PCR.

El documento de patente 6 describe medios para detectar un marcador de enfermedad de manera conveniente, rápida y en alta sensibilidad sin realizar una operación de separación.

El documento de patente 7 proporciona una proteína aislada, modificada genéticamente o no natural que comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo que puede comprender al menos un aminoácido cargado negativamente, y en donde esta proteína es capaz de unirse específicamente a un antígeno. A este respecto, se describe que una molécula fluorescente puede ser una etiqueta detectable.

El documento de patente 8 describe métodos para detectar uno o más ácidos nucleicos diana presentes en una muestra.

El documento no patente 6 se refiere a la presentación de ADNc en general y describe, a este respecto, un conector de puromicina que emplea 3-cianovinilcarbazol. El estado de la técnica 1 es una buena técnica desde el punto de vista de que aporta el tamaño de la biblioteca con 1 X 1010 a través del método de cribado mediante el uso del dispositivo de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) en la presentación en levadura, y permite el cribado simultáneo de una pluralidad de anticuerpos contra una pluralidad de antígenos en un par de semanas. Sin embargo, tiene el problema de que solo entre 40 y 80 % de los scFv introducidos para la transformación se expresan en la superficie de la célula, y es imposible obtener moléculas que tengan una alta especificidad porque los scFv expresados se unen a diferentes péptidos que tienen la misma secuencia de aminoácidos.

El estado de la técnica 2 es una buena técnica desde el punto de vista de que permite fabricar la biblioteca con un tamaño máximo de 2 X 1010, que es más grande que la descrita en el estado de la técnica 1, utilizando la electroporación para aumentar la eficacia de transformación en sí misma de la levadura. Sin embargo, existe el problema de que el tamaño de la biblioteca sigue estando limitado a 1010 órdenes en cualquiera de los dos métodos de presentación en levadura.

Además, hay otro problema que es que la presentación no se construye rápidamente, porque la levadura a la que se introdujeron las secuencias de genes para la proteína o los péptidos debe ser cultivada; y debe ser etiquetada mediante el uso de anticuerpos y similares, cuando se realiza la clasificación de células mediante el uso de FACS.

El estado de la técnica 3 es una buena técnica desde el punto de vista de que permite el cribado en poco tiempo en comparación con las descritas en el Estado de la técnica 1 y 2. Sin embargo, En el proceso de cribado mediante el método convencional de presentación de ADNc, hay problemas de que se tarda de medio día a varios días debido a la operación manual de condensación o selección de las proteínas de unión; y da resultados variados debido a las operaciones manuales.

En el estado de la técnica 3, se construye la biblioteca que tiene un tamaño de 1014, que es casi 1000 veces más grande en comparación con la tratada por el método de presentación en levadura. Sin embargo, el proceso de cribado se convierte en una etapa que determina la velocidad en los procesos de operación del método de presentación de ADNc, y se convierte en un obstáculo para el cribado rápido de las moléculas que tienen nuevas funciones.

Por lo tanto, existe una fuerte necesidad social de un cribado a alta velocidad de presentación de ADNc mediante el uso de una biblioteca de gran tamaño para obtener la molécula que tiene una alta especificidad.

El estado de la técnica 4 es una buena técnica desde el punto de vista de que permite separar en gran medida un conjugado de la molécula diana y las secuencias activas y las inactivas que no se unen a la diana, en donde tanto la molécula diana como la biblioteca existen en la fase líquida. Por otro lado, puede separar la molécula diana y el conjugado incluyendo la secuencia activa, sin embargo, la secuencia inactiva no se contamina en la fracción de secuencia activa en principio. Es decir, existe el problema de si es posible o no realizar un cribado preciso.

El estado de la técnica 5 es una buena técnica desde el punto de vista de que detecta eficazmente el aptámero de ácido nucleico que tiene una capacidad de unión altamente específica contra el compuesto de bajo peso molecular tales como los aminoácidos y similares. Por otro lado, tiene el problema de que toma tiempo y trabajo, por ejemplo, el material diana debe ser inmovilizado en un cantilever (brazo de palanca) en el microscopio de fuerza atómica, y el ácido nucleico debe ser inmovilizado en una superficie de placa que se escanea con una sonda. Por lo tanto, el cribado rápido y conveniente sigue siendo un problema.

El estado de la técnica 6 es una buena técnica desde el punto de vista que puede elegir aptámero de ARN de unión a estreptavidina de la biblioteca de ARN con tamaño de 1016 mediante la realización de ciclos de selección durante 9 veces. Sin embargo, dado que la selección realizada aquí son las purificaciones mediante el corte y el uso de la columna, mantiene la eficacia de condensación baja, como 60 veces.

Por lo tanto, existe una fuerte necesidad social de obtener la molécula altamente específica en el cribado del aptámero de ácido nucleico.

Problemas que serán resueltos por la invención

Bajo tales condiciones, los inventores de la presente invención continúan la investigación para completar la presente invención.

Es decir, un aspecto de la presente invención es un método para el cribado in vitro a alta velocidad de una biblioteca seleccionada del grupo que consiste en una biblioteca de ADNc y una biblioteca de aptámeros de ácido nucleico que comprende las etapas de:

(i) preparar una estructura de forma esférica positiva o una estructura de forma esférica negativa, en donde una molécula diana es estabilizada en la estructura de forma esférica positiva y la molécula diana no es estabilizada en la estructura de forma esférica negativa; (ii) formar el conjugado de forma esférica positivo o el conjugado de forma esférica negativo mediante la unión de una molécula de detección de diana capaz de unirse a la molécula diana seleccionada de la biblioteca con un tamaño superior a 1010 mm a la estructura de forma esférica positiva o a la estructura de forma esférica negativa; (iii) separar los conjugados de forma esférica positivos y negativos mediante un clasificador de células por fluorescencia; (iv) amplificar un ácido nucleico unido a la molécula diana en una superficie de los conjugados de forma esférica positivos o negativos separados mediante PCR; (v) repetir las etapas (i) a (iv) utilizando todo el ADN de doble hebra obtenido en la etapa de amplificación en 5 veces; y (vi) analizar el producto de PCR respectivo obtenido de los conjugados de forma esférica positivos y de los conjugados de forma esférica negativos, en donde la molécula diana de detección es (1) un conjugado ácido nucleico-conector obtenido de la biblioteca de ADNc mediante el método de presentación de ADNc; o (2) una secuencia de ácidos nucleicos obtenida del conjugado ácido nucleico-conector; y en donde, si (1) se aplica, la molécula de detección de diana se obtiene utilizando el método de presentación de ADNc que comprende las etapas de: (a) preparar un ARNm deseable; (b) unir el ARNm deseable al conector utilizando 3-cianovinilcarbazol para obtener el conjugado ARNm- conector; (c) formar el conjunto ARNm-conector-proteína mediante la traducción del conjugado ARNm-conector; y (d) llevar a cabo una transcripción inversa del conjugado ARNm-conector-proteína para obtener el conjugado ARNm/ADNc-conectorproteína.

Es preferible que la estructura de forma esférica sea una cualquiera de las seleccionadas del grupo que consiste en liposoma, perla de sefarosa, perla de sílice y perla de látex, o una cualquiera de las seleccionadas del grupo que consiste en una perla de sefarosa recubierta con liposomas, una perla de sílice recubierta con liposomas, y una perla de látex recubierta con liposomas, desde el punto de vista de la inmovilización de la molécula diana. Además, es preferible que la estructura de forma esférica tenga un diámetro de 0,5 pm a 20 pm, porque la clasificación mediante el uso de FACS se realiza con precisión.

La molécula diana es un conjugado ácido nucleico-conector obtenido de la biblioteca de ADNc mediante el método de presentación de ADNc (Fig. 1A) o una secuencia de ácidos nucleicos obtenida del conjugado ácido nucleico-conector. La molécula de detección de diana está preferentemente directamente unida a la estructura de forma esférica a través de un sustituto en sus superficies, o unida a la misma a través de la molécula diana inmovilizada en la superficie para escoger la molécula específicamente unida a la estructura esférica.

La molécula diana es preferentemente una cualquiera seleccionada del grupo que consiste en biotina, estreptavidina, azida obtenida mediante la química clic, y N-hidroxi succinimida éster (NHS), porque da una fuerte interacción entre la molécula diana y la molécula de detección de diana. El sustituto es preferentemente uno cualquiera de los seleccionados del grupo que consiste en carboxilo, amino, hidroxilo y tiol, porque da una fuerte interacción entre la estructura esférica y la molécula de detección de diana.

La molécula de detección de diana se obtiene preferentemente mediante el método de presentación de ADNc que comprende las siguientes etapas: (a) preparar un ARNm deseable; (b) unir el ARNm con el conector para obtener el conjugado ARNm-conector; (c) formar el conjugado ARNm-conector-proteína mediante la traducción del conjugado ARNm-conector; y (d) llevar a cabo una transcripción inversa realizando la transcripción inversa del conjugado ARNmconector-proteína para obtener el conjugado ARNm/ADNc-proteína; dado que se realiza el cribado a alta velocidad de la biblioteca de presentación de ADNc.

Los números repetidos de (i) a (iv) no son más de 5 veces, debido a la realización del cribado de alta velocidad.

El conector tiene un esqueleto y una cadena lateral; en donde el esqueleto comprende (p1) un sitio de unión en fase sólida en el que el conector está unido a una fase sólida, (p2) un sitio de escisión en el que el conector es escindido de la fase sólida, (p3) estando el sitio de unión al ARNm compuesto por 3-ciano-vinilcarbazol cerca del extremo 3' terminal o cercano al mismo; la cadena lateral comprende (s1) un sitio de unión al esqueleto, (s2) un espaciador que tiene un sitio de unión a la etiqueta fluorescente para el esqueleto, (s3) una etiqueta fluorescente para la unión del esqueleto al sitio de unión a la etiqueta fluorescente para el esqueleto, y (s4) puromicina como un sitio de unión al péptido. Es preferible que el sitio de escisión esté dispuesto en dicho sitio de unión en fase sólida, debido a que el ARNm está ligado al conector sin enzima mediante el uso de fotoentrecruzamiento, y acorta el período de síntesis del conector.

La estructura de forma esférica comprende preferentemente la siguiente combinación, ya que la clasificación se lleva a cabo utilizando las etiquetas fluorescentes correspondientes a los propósitos: (1) el conjugado de forma esférica positivo con una etiqueta fluorescente, el conjugado de forma esférica negativo sin la etiqueta y la molécula de detección de diana sin la etiqueta; (2) el conjugado de forma esférica positivo con la etiqueta fluorescente, el conjugado de forma esférica negativo con la etiqueta con fluorescencia diferente de la del conjugado de forma esférica positivo, y la molécula de detección de diana sin la etiqueta; (3) el conjugado de forma esférica positivo sin la etiqueta fluorescente, el conjugado de forma esférica negativo con la etiqueta y la molécula de detección de diana con la etiqueta que tiene fluorescencia diferente a la de la etiqueta; y (4) el conjugado de forma esférica positivo sin la etiqueta fluorescente, el conjugado de forma esférica negativo sin la etiqueta, y la molécula de detección de diana con la etiqueta que tiene fluorescencia diferente a la de la etiqueta.

Por ejemplo, cuando la concentración del conjugado ARNm/ADNc-proteína elegido por el cribado es baja, se puede seleccionar (1). Cuando su concentración es alta, se puede elegir (2). Además, el conjugado de forma esférica positivo con la etiqueta fluorescente comprende preferentemente el conjugado ARNm-proteína o la molécula diana que se unirá al mismo en su superficie, y encapsula la etiqueta fluorescente; debido a que brinda una precisión elevada a la clasificación y permite llevar a cabo un cribado eficaz de la molécula de presentación de ADNc o del aptámero de ácido nucleico.

Además, la etiqueta fluorescente es preferentemente una cualquiera de las seleccionadas del grupo que consiste en Alexa Fluor 594, fluoresceína Amina, FITC, Rodamina, mCherry2 y Punto Cuántico (Quantum Dot), ya que pueden utilizarse para la expresión génica y el etiquetado múltiple. Además, como la etiqueta expresa una fluorescencia diferente de estas etiquetas fluorescentes, es preferible uno cualquiera de los intercaladores fluorescentes seleccionados del grupo que consiste en SYBR Gold, SYBR Green y Punto Cuántico, porque pueden etiquetar convenientemente la molécula de detección de diana y son adecuados para la clasificación celular.

La separación se realiza preferentemente utilizando, por ejemplo, 2 etiquetas fluorescentes excitadas utilizando 2 longitudes de onda diferentes; y el conjugado de forma especial en el que la etiqueta fluorescente excitada con ambos de 2 longitudes de onda diferentes solo se separa utilizando el clasificador de células, debido a la mejora de la precisión del cribado. Además, la separación es preferentemente realizada además por coexistencia con un polipéptido particular para aplicar la presión de selección, debido a la mejora de la precisión del cribado más alto.

Efecto ventajoso

Para el cribado de la biblioteca de presentación de ADNc o de la biblioteca de aptámeros de ácidos nucleicos se necesita tiempo y trabajo para condensarlos y seleccionarlos utilizando la columna, la electroforesis de zona capilar y el microscopio de fuerza atómica.

De acuerdo con el método de cribado in vitro de alta velocidad de la presente invención, se selecciona convenientemente la molécula de presentación de ADNc o el aptámero de ácidos nucleicos del objeto de la biblioteca de presentación de ADNc que tiene más de un tamaño de biblioteca de 1010 o de la biblioteca de aptámeros de ácidos nucleicos mediante la unión de la etiqueta fluorescente a la estructura esférica para llevar a cabo la selección de alta velocidad.

Breve descripción de los dibujos

[Fig. 1A] La Fig. 1A es un dibujo que muestra el procedimiento de cribado del método de presentación de ADNc in vitro.

[Fig. 1B] La Fig. 1B es el dibujo que muestra el procedimiento de cribado, cuando se utiliza ARN como molécula de detección de diana.

[Fig. 2A] La Fig. 2A es el dibujo que muestra la estructura esférica negativa (en adelante, se denomina a veces la “estructura de forma esférica N”).

[Fig. 2B] La Fig. 2B es el dibujo que muestra la estructura esférica positiva (en adelante, se denomina a veces la “estructura de forma esférica P”).

[Fig. 2C] La Fig. 2C es el dibujo que muestra los procedimientos del cribado de alta velocidad mediante el uso de las estructuras de forma esférica P y N (1).

[Fig. 2D] La Fig. 2D es el dibujo que muestra los procedimientos del cribado de alta velocidad mediante el uso de las estructuras de forma esférica P y N (2).

[Fig. 3] La Fig. 3 es una microfotografía que muestra el liposoma incluyendo la sustancia fluorescente. A1 es una imagen de microscopio de interferencia diferencial, B es una imagen fluorescente utilizando FITC, y C1 es la que utiliza Alexa-Flour 594, respectivamente. A2 a C2 son las figuras esquemáticas de A1 a C1, respectivamente.

[Fig. 4A] La Fig. 4A es el dibujo que muestra el resultado del análisis FACS del liposoma fluorescente sin tratamiento con Magainina 2.

[Fig. 4B] La Fig. 4B es el dibujo que muestra el resultado del análisis FACS del liposoma fluorescente con tratamiento con 10 |jm de Magainina 2.

[Fig. 4C] La Fig. 4C es el dibujo que muestra el resultado del análisis FACS del liposoma fluorescente con tratamiento con 30 jm de Magainina 2.

[Fig. 5] La Fig. 5 es el dibujo que muestra la secuencia peptídica predecible que será traducida por una biblioteca de

ADN diseñada y la secuencia como dos ruedas de hélices a, A y B. En donde, A muestra aminoácidos en las posiciones de expresión Nros. 1 a 18 y B los muestras en las posiciones de expresión Nros. 19 a 35.

[Fig. 6] La Fig. 6 es la figura esquemática que muestra la PCR de extensión para fabricar el conjugado de promotor-ADN (244 mero).

[Fig. 7] La Fig. 7 es la figura esquemática que muestra un conector de tipo fotoentrecruzamiento.

[Fig. 8] La Fig. 8 es la figura esquemática que muestra el conector de tipo fotoentrecruzamiento y ARNm que se une al mismo mediante el uso de fotoentrecruzamiento.

[Fig. 9] La Fig. 9 es la figura esquemática que muestra un conector de tipo convencional y ARNm que está unido enzimáticamente al mismo mediante el uso de T4 ARN ligasa.

[Fig. 10] La Fig. 10 es una fotografía del resultado de electroforesis para el producto de ligación de ARNm con puromicina-conector.

[Fig. 11A] La Fig. 11A es el dibujo que muestra los resultados del análisis FACS del liposoma fluorescente en el primer ciclo de cribado de alta velocidad de la presente invención.

[Fig. 11B] La Fig. 11B es el dibujo que muestra los resultados del análisis FACS del liposoma fluorescente en el segundo ciclo de cribado de alta velocidad de la presente invención.

[Fig. 11C] La Fig. 11C es el dibujo que muestra los resultados del análisis FACS del liposoma fluorescente en el tercer ciclo de cribado de alta velocidad de la presente invención.

[Fig. 12] La Fig. 12 es la fotografía de la electroforesis para el producto de PCR de la molécula de presentación de

ADNc después del primer al tercer ciclo de cribado de la presente invención.

[Fig. 13] La Fig. 13 es el dibujo que muestra la secuencia de aminoácidos del péptido obtenido de la secuencia de clonación y 2 ruedas de hélices a A y B, en las que se dispone la secuencia. En donde, A muestra las posiciones de aparición entre los números 1 a 18 y B muestra aquellas entre los números, y se muestran en paralelo.

[Fig. 14A] La Fig. 14A es la figura esquemática que muestra una secuencia de genes de la proteína fusionada introducida en un vector. [Fig. 14B] La Fig. 14B es la figura esquemática que muestra la estructura de la molécula de reconocimiento de diana.

[Fig. 15] La Fig. 15 es una imagen de microscopio fluorescente del liposoma reaccionado con proteína de fusión mCherry-LB-1 o solo mCherry. A1 es la imagen de microscopio fluorescente del liposoma al que se unen 2 jm de proteína de fusión mCherry-LB-1 a su membrana externa. B1 es la imagen de microscopio fluorescente del liposoma al que se unen 2 jm de mCherry únicamente a su membrana externa. Tanto A2 como B2 son las figuras esquemáticas de A1 a B1 respectivamente. X muestra la membrana liposómica que tiene fluorescencia roja brillante e Y muestra la membrana liposómica que tiene fluorescencia roja oscura.

[Fig. 16] La Fig.16 es la imagen de electroforesis que muestra

ADN del aptámero de ARN unido a estreptavidina [Fig. 17] La Fig.17 es la imagen de electroforesis que muestra

aptámero de ARN unido a estreptavidina.

[Fig. 18] La Fig.18 es la imagen de electroforesis que muestra

aptámero de ARN unido a estreptavidina.

[Fig. 19] La Fig.19 es la imagen de electroforesis que muestra la intensidad fluorescente de los productos de reacci de las perlas de sílice marcadas con rodamina B inmovilizada por estreptavidina y biotina marcada con fluoresceína en FITC.

[Fig. 20] La Fig. 20 es un gráfico que muestra un área de clasificación de rodamina B utilizando FACS.

[Fig. 21] La Fig. 21 es la imagen de electroforesis en gel de los resultados de clasificación de FACS de los productos de PCR después de mezclar el aptámero de ARN unido a estreptavidina y el aptámero de ARN no unido a estreptavidina con una relación de 1:10 a 1: 10.000, y luego la solución fue sometida a 15 ciclos de PCR bajo las condiciones predeterminadas. R muestra los ácidos nucleicos antes de la selección, P los muestra eluidos de las perlas positivas y N muestra los eluidos de las perlas negativas, respectivamente.

[Fig. 22] La Fig. 22 es la imagen de electroforesis en gel de los resultados de clasificación de FACS de los productos de PCR después de mezclar el aptámero de ARN unido a estreptavidina y el aptámero de ARN no unido a estreptavidina con una relación de 1:1000 o 1: 10.000, y luego la solución fue sometida a PCR para realizarse 10 ciclos, 15 ciclos o 20 ciclos bajo las mismas condiciones en la Fig. 21. Después de eso, los productos fueron sometidos a clasificación FACS.

Forma de realización para llevar a cabo la invención

A continuación, se explicará la presente invención en forma detallada, haciendo referencia a las figuras 1A a 2D, y 6 a 9.

Según lo descrito anteriormente, la presente invención es el método de cribado de alta velocidad de ya sea la biblioteca de presentación de ADNc o la biblioteca de aptámero, ambas componen la biblioteca para la presente invención. El método comprende las siguientes etapas (Fig. 1A y B).

(i) preparar una estructura de forma esférica positiva o una estructura de forma esférica negativa, en donde una molécula diana es inmovilizada en la estructura de forma esférica positiva, pero no es inmovilizada en la estructura de forma esférica negativa;

(ii) formar el conjugado de forma esférica positivo o el conjugado de forma esférica negativo mediante la unión, respectivamente, de una molécula de detección de diana capaz de unirse a la molécula diana, que se selecciona de la biblioteca que tiene el tamaño igual o superior a 1010 para formar la estructura de forma esférica positiva o la estructura de forma esférica negativa;

(iii) separar los conjugados de forma esférica positivos y negativos utilizando un clasificador de células por fluorescencia;

(iv) amplificar un ácido nucleico unido a la molécula diana en una superficie de los conjugados de forma esférica positivos separados o negativos separados mediante PCR;

(v) repetir las etapas (i) a (iv) utilizando todo el ADN de doble hebra obtenido en la etapa de amplificación en 5 veces; y

(vi) analizar el producto de PCR respectivo obtenido de los conjugados de forma esférica positivos y de los conjugados de forma esférica negativos, en donde la molécula de detección de diana es

(1) un conjugado ácido nucleico-conector obtenido de la biblioteca de ADNc utilizando el método de presentación de ADNc; o

(2) una secuencia de ácidos nucleicos obtenida del conjugado ácido nucleico-conector;

y en donde, si (1) es aplicable, la molécula de detección de diana se obtiene preferentemente mediante el método de presentación de ADNc que comprende las siguientes etapas:

(a) preparar un ARNm deseable;

(b) unir el ARNm deseable con el conector utilizando 3-cianovinilcarbazol para obtener el conjugado ARNm-conector; (c) formar el conjugado ARNm-conector-proteína traduciendo el conjugado ARNm-conector; y

(d) llevar a cabo una transcripción inversa del conjugado ARNm-conector-proteína para obtener el conjugado ARNm/ADNc-conector-proteína.

En cuanto a las moléculas de forma esférica empleadas en la etapa, se pueden utilizar aquellas siempre que sean aceptables para la separación mediante el uso del clasificador de células y no está limitado. Por ejemplo, pueden mencionarse los liposomas que están compuestos por bicapa lipídica, perlas de sefarosa, perlas de sílice, perlas de látex, perlas de dextrano, perlas de quitosán, perlas de poliestireno y similares. Preferentemente pueden emplearse los liposomas, perlas de sefarosa, perlas de sílice, perlas de látex.

Preferentemente, los diámetros de las perlas son de 0,5 |jm a 20 |jm para una determinación precisa. El control del diámetro de los liposomas es difícil. Sin embargo, las perlas de forma esférica que tienen una distribución uniforme del diámetro se preparan cubriendo la superficie de las perlas con el liposoma en el método convencional. Tales perlas mejoran la precisión de la separación mediante el uso del clasificador de células.

Además, la molécula de forma esférica puede incluir las etiquetas tales como Alexa Fluor 594, Fluoresceína Amina, FITC, Rodamina, mCherry2, Punto Cuántico y similares en su interior. Pueden incluir material magnetizado tal como magnetita y similares. Además, tales perlas pueden tener un exterior con color tal como azul, rojo, verde, negro y similares. La molécula de forma esférica no suele ser porosa, sin embargo, puede ser porosa. Sus superficies se modifican preferentemente con grupos funcionales tales como carboxilo, amino, hidroxilo, tiol y similares, porque facilita la unión de la proteína en el conjugado ARNm-proteína o el conjugado ARNm/ADNc-proteína.

Como tal molécula de forma esférica, se pueden comprar las comercialmente disponibles, o, por ejemplo, se puede preparar el liposoma de la siguiente manera.

El liposoma (en adelante a veces denominado "vesícula") se prepara principalmente utilizando el método de emulsión W/O y se prepara de la siguiente manera. En primer lugar, el fosfolípido como materia prima para el liposoma es disuelto en disolvente orgánico como alcoholes, cloroformo y similares para preparar solución lipídica. A continuación, se vierte en materiales de vidrio tales como tubos de ensayo y similares, posteriormente, se forma una película delgada sobre la superficie interna de los mismos, volatizando tales disolventes orgánicos.

A continuación, se añade aceite en el material de vidrio para disolver la película delgada de fosfolípido formada sobre la superficie interna de los mismos. Luego, se añade la solución acuosa que se convierte en fluido interno del liposoma en el material de vidrio y se mezcla bien para preparar la mezcla de aceite y agua. Se vierte suavemente la mezcla de aceite y agua en la solución acuosa, que se convierte en el fluido externo de la vesícula; y entonces la mezcla se mantiene por un rato, y se somete a centrifugación. Mediante la operación descrita anteriormente, las gotitas recubiertas con una única capa de fosfolípido pasan a través de la única capa de fosfolípido formada en la superficie de contacto del aceite y la solución para obtener el liposoma. En general, el tamaño de las sustancias tal como la célula u otras que se separarán utilizando el clasificador de células se conoce como las de aproximadamente 0,5 pm a 20 pm. Por lo tanto, se prefiere preparar el liposoma con tales tamaños.

Cuando se fabrica el liposoma, como el fluido interno del liposoma, es preferible emplear la solución que incluye la molécula de etiqueta de fluorescencia, porque el liposoma objetivo es separado con precisión en la etapa de separación utilizando el clasificador de células explicado más adelante. Dicha etiqueta de fluorescencia no está particularmente limitada, siempre y cuando se emplee en el clasificador de células. Es más preferible emplear aquella seleccionada del grupo que consiste en Alexa Fluor 594, FITC, Rodamina, mCherry2 y Punto Cuántico, porque facilita la confirmación de la expresión génica, y puede utilizarse para el etiquetado múltiple.

Cuando el liposoma es etiquetado con la etiqueta de fluorescencia incluida allí, la membrana del liposoma es preferentemente modificada utilizando las siguientes proteínas o péptidos; debido a que el liposoma objetivo es separado con precisión en la etapa de separación utilizando el clasificador de células explicado más adelante. Como los péptidos de modificación, se mencionan, por ejemplo, la molécula peptídica a ser anclada en la membrana liposómica, la proteína fluorescente, una variedad de anticuerpos, la proteína fusionada que tiene la secuencia codificante para otras biomoléculas tal como la proteína de marcado de la enfermedad y similares.

Además, dado que el liposoma no está etiquetado con la etiqueta fluorescente, es preferible para la molécula diana etiquetada, que es capaz de unirse al conjugado ARNm/ADNc-proteína, en la superficie del liposoma; porque el liposoma objetivo es separado con precisión en la etapa de separación mediante el clasificador de células que se explica más adelante. En este caso, el liposoma puede ser etiquetado con la etiqueta de fluorescencia según lo descrito anteriormente o intercalador. Tales intercaladores no son particularmente mientras se utilizan comúnmente. Es preferible utilizar una cualquiera de las moléculas fluorescentes seleccionadas del grupo que consiste en SYBR Gold, SYBR Green y Punto Cuántico, porque se obtienen fácilmente y por su intensidad fluorescente.

La molécula diana que se va a inmovilizar en la molécula de forma esférica se elige teniendo en cuenta la combinación con la molécula de detección de diana que se une a la misma y se prepara. Aquí, la molécula de detección de diana se define como la molécula capaz de unirse a la molécula diana inmovilizada en la molécula de forma esférica. La molécula de forma esférica con la molécula diana unida se denomina la estructura esférica positiva (estructura de forma esférica P; Fig. 2A), y que sin la molécula diana unida se denomina la estructura esférica negativa (estructura de forma esférica N; Fig. 2B).

Por ejemplo, cuando la molécula de detección de diana es el aptámero de ARN que se une a la estreptavidina, o la biotina se une a la molécula de detección de diana, la estreptavidina se elige como la molécula diana para preparar el conjugado de forma esférica P o el conjugado N. Como la molécula de forma esférica a la que la molécula diana se une, si se utiliza la molécula de forma esférica cuya superficie se modifica con el grupo carboxilo, el grupo carboxilo es activado con N - hidroxisuccinimida (NHS) para formar éster de NHS. Después de eso, se hace reaccionar con estreptavidina para formar una unión de amida entre el éster de NHS y el grupo amino en la estreptavidina a la estreptavidina inmovilizada en la estructura de forma esférica. Aparte de eso, se pueden utilizar moléculas de forma esférica comercialmente disponibles, como las perlas de sílice o las perlas de látex, estreptavidina modificada en la superficie. La estructura de forma esférica P y la estructura de forma esférica N así obtenidas son sometidas a la siguiente etapa.

Luego, en la etapa de formación del conjugado de forma esférica (ii), la estructura de forma esférica P o la estructura de forma esférica N obtenida en la etapa de preparación de la estructura de forma esférica se hace reaccionar con la molécula de detección de diana (Fig. 2C).

En la presente memoria descriptiva, la molécula de detección de diana se define como el ácido nucleico obtenido mediante el método de presentación de ADNc, el péptido derivado del ácido nucleico y aquellos a los que se une el conector, o el aptámero de ácido nucleico fabricado sobre la base de los mismos (Fig. 1A). El ácido nucleico contiene un oligo ADN de una sola hebra, ADN de doble hebra o ARN. Además, el derivado de ácido nucleico contiene la molécula diana, por ejemplo, el aptámero de ARN que se une a la estreptavidina y similares.

El conjugado del ácido nucleico y el conector contiene, por ejemplo, el conjugado ARNm-proteína explicado más adelante, el conjugado ARNm/ADNc-proteína, y similares.

Cuando se utiliza la biblioteca de ADNc, preferentemente comprende las etapas de (a) preparar el ARNm que se va a utilizar en el método de presentación de ADNc, (b) unir el ARNm al conector por fotoentrecruzamiento, (c) unir la proteína traducida del ARNm al ARNm-conector para formar la etapa de formación del conjugado ARNm-conectorproteína, (d) llevar a cabo la transcripción inversa del ARNm del conjugado ARNm-conector-proteína para formar el conjugado ARNm/ADNc-conector-proteína; debido a que el ARNm deseable, ADNc y similares se obtienen mediante el método de presentación de ADNc.

Tanto la molécula de forma esférica como la molécula de detección de diana se preparan para convertirse en la concentración predeterminada en el tampón de unión predeterminado para su unión. Por ejemplo, se hacen reaccionar en el tampón entre aproximadamente 4 °C y aproximadamente 30 °C durante aproximadamente 0,5 horas a aproximadamente 3 horas.

En la etapa de separación del conjugado de forma esférica (iii), en primer lugar, tanto el conjugado de forma esférica P como N obtenidos en la etapa antes mencionada se preparan para ser la concentración predeterminada en la solución predeterminada. A continuación, se clasifican mediante el clasificador de células disponible comercialmente de acuerdo con las instrucciones adjuntas para separar el conjugado de forma esférica objetivo (Fig. 2D). Por ejemplo, cuando se utiliza el liposoma como la molécula de forma esférica, el liposoma fluorescente (en adelante, a veces se denomina "liposoma fluorescente") con la etiqueta de fluorescencia se obtiene selectivamente sobre la base de la intensidad fluorescente de la etiqueta fluorescente en el liposoma, o la etiqueta fluorescente, que es, por ejemplo, intercalador, se une a la molécula de detección de diana, que es, por ejemplo, el conjugado ARNm/ADNc-proteína.

Utilizando la etiqueta de fluorescencia para el liposoma y que emite la fluorescencia de la longitud de onda diferente para la molécula de detección de diana, el conjugado de forma esférica que tiene las etiquetas fluorescentes excitadas con las dos longitudes de onda diferentes excitantes se separan únicamente. Luego, tal separación permite mejorar la eficacia de clasificación, y obtener la fracción que contiene el conjugado de forma esférica con la molécula diana deseable en mayor contenido.

Además, la molécula de unión diana y la molécula que les causa inhibición competitiva coexisten juntas en la solución para aplicar la presión de selección. Por esto, se obtiene la fracción que contiene el conjugado de forma esférica, el cual tiene una mayor cantidad de la molécula diana deseable.

La Tabla 1 muestra la combinación de la estructura de forma esférica y la molécula de detección de diana. En la figura, “la estructura de forma esférica P” y la “estructura de forma esférica N” son como se describieron anteriormente. Las etiquetas 1 y 2 muestran aquellas diferentes respectivamente. La molécula de detección de diana es la molécula de conector - ácido nucleico (C) seleccionada mediante el método de presentación de ADNc de la biblioteca de ADNc, o la molécula de aptámeros incluida en la biblioteca de aptámeros de ácido nucleico (A).

continuación

Cuando se emplea el liposoma, el liposoma, incluida la sustancia fluorescente, se purifica eliminando los agregados del fosfolípido, que no se utiliza para formar el liposoma, de la fracción de liposoma fluorescente fabricada y fraccionada según el método convencional, por ejemplo, mediante la centrifugación.

Utilizando el liposoma purificado, se preparan respectivamente el conjugado positivo del liposoma que se une a la molécula diana (en adelante, a veces se denomina LiBP), y el conjugado negativo del liposoma que no se une a la molécula diana (en adelante, a veces se denomina LiBN). A continuación, se hacen reaccionar con la molécula de detección de diana mediante el método descrito anteriormente. Posteriormente, se separan mediante un clasificador de células. La separación del liposoma se termina aproximadamente de 0,1 a aproximadamente 6 horas, aunque es ligeramente diferente dependiendo del aparato clasificador celular que se va a utilizar.

Además, después de la etapa de separación, dependiendo del método convencional, el ARNm en el conjugado ARNmproteína es transcrito inversamente para obtener el conjugado ARNm/ADNc-proteína. Concretamente, por ejemplo, el conjugado ARNm-proteína según lo descrito anteriormente es inmovilizado en las perlas magnéticas tales como las perlas de estireno; y entonces se someten a la transcripción inversa. Es preferible realizar dicha transcripción inversa antes de la etapa de amplificación descrita a continuación, ya que permite purificar eficazmente el conjugado ARNm/ADNc-p roteína.

Luego, se lavan las perlas magnéticas con el tampón de lavado deseable y, a continuación, se añade el agente liberador del conjugado ARNm/ADNc-proteína, tal como una enzima, y se incuba para obtener el conjugado ARNm/ADNc-proteína liberado en el sitio de escisión en el conector. Luego, es preferible purificar el conjugado ARNm/ADNc-proteína liberado utilizando la etiqueta para la purificación de proteínas tal como His-tag y similares.

En la etapa de amplificación (iv), se amplifica el ADN contenido en el conjugado ARNm/ADNc-proteína (la molécula de detección de diana) en el conjugado de forma esférica obtenido según lo descrito anteriormente utilizando PCR de acuerdo con el método convencional. Cuando la molécula de detección de diana es el ARN, se somete a la transcripción inversa para preparar el ADNc. Por ejemplo, en primer lugar, el conjugado de ARNm/ADNc-proteína es precipitado utilizando un agente co-precipitante tal como etanol para obtener el ADNc. Se añade el ADNc obtenido a la mezcla de reacción de PCR deseado que se va a amplificar de acuerdo con el programa de PCR deseado. Se repiten las etapas (i) a (iv) utilizando el ADN amplificado para obtener el ADN que tiene la secuencia deseada de la biblioteca de ADN inicial utilizando el cribado de alta velocidad. Para el cribado de alta velocidad del ADN, se repiten las etapas (i) a (iv) no más de 5, y además es preferible fijarlo no más de 3 desde el punto de vista de la rentabilidad. En la etapa (v), se repiten las etapas (i) a (iv) utilizando todo el ADN de doble hebra obtenido en la etapa de amplificación en 5 veces.

El método de la presente invención comprende además una etapa (vi) de analizar el producto de PCR respectivo obtenido de los conjugados de forma esférica positivos y de los conjugados de forma esférica negativos, en donde la molécula de detección de diana es (1) un conjugado de ácido nucleico-conector obtenido de la biblioteca de ADNc mediante el método de presentación de ADNc; o (2) una secuencia de ácidos nucleicos obtenida a partir del conjugado de ácido nucleico-conector; y en donde, si (1) se aplica, la molécula de detección de diana se obtiene utilizando el método de presentación de ADNc que comprende las etapas de: (a) preparar un ARNm deseable; (b) unir el ARNm deseable al conector utilizando 3-cianovinilcarbazol para obtener el conjugado ARNm-conector; (c) formar el conjunto ARNm-conector-proteína mediante la traducción del conjugado ARNm-conector; y (d) llevar a cabo una transcripción inversa del conjugado ARNm-conector-proteína para obtener el conjugado ARNm/ADNc-conector-proteína.

Además, entre el método de presentación del ADNc que comprende las etapas (a) a (d), en la etapa de preparación del ARNm (a), el promotor y otras secuencias necesarias para construir una construcción completa están unidas a un cierto número del ADN seleccionado para construir un ADN de construcción completa para preparar ARNm del ADN de construcción completa (Fig. 6). Aquí, como "promotor", se mencionan, por ejemplo, tales como promotor T7, SP6, promotor T3, y similares. Es preferible emplear el promotor T7 desde el punto de vista de la versatilidad. También, como la expresión, “otras secuencias necesarias para construir una construcción completa”, se mencionan tales como la secuencia de unión al liposoma, la secuencia etiqueta para la purificación tal como His-tag, etiqueta de estreptavidina (Strep-tag) y similares, cuando se emplea liposoma como la estructura esférica. El ADN de construcción completa de doble hebra (en adelante, a veces se denomina "conjugado promotor-ADN") se obtiene preparando un fragmento de ADN que contiene la secuencia descrita anteriormente, y extendiéndolo con una PCR de extensión para amplificarlo.

Además, el conjugado promotor-ADN obtenido se somete a la transcripción según el método convencional. Aquí, utilizando el kit para transcripción tal como Scrip TMAX (R) Thermo T7 Transcription Kit (TOYOBO Co. Ltd.), RiboMAX™ Large Scale RNA Production System-T7 (Promega), T7 Transcription Kit (Cosmo Bio Co., Ltd.) y otros kits de transcripción comercialmente disponibles, el ARNm se prepara rápida y convenientemente con alta precisión.

En la siguiente etapa de unión al conector (b), el ARNm obtenido según lo descrito anteriormente se une al conector de presentación de ADNc mediante el uso de 3-cianovinilcarbazol para preparar un conjugado conector-ARNm. Dado que el cribado de alta velocidad necesita acortar el tiempo de ligación entre el conector y el ARNm, es preferible emplear el conector que permite la ligación en poco tiempo de los mismos. Dado que se lleva a cabo tal ligación en poco tiempo utilizando fotoentrecruzamiento, se utiliza un conector del tipo fotoentrecruzamiento. Como el conector del tipo fotoentrecruzamiento, se utiliza un conector comprende el ácido nucleico artificial de tipo fotoentrecruzamiento 3 - cianovinilcarbazol (en adelante, a veces denominado "cnvK") en su esqueleto, porque permite obtener el conjugado conector-ARNm rápida y convenientemente.

Concretamente, el esqueleto del conector comprende (p1) un sitio de unión en fase sólida en el que el conector está unido a la fase sólida, (p2) un sitio de unión a la cadena lateral para unir la cadena lateral, (p3) el esqueleto que tiene el sitio de unión al ARNm, (p4) un sitio de escisión en el que el conector es escindido de la fase sólida. La cadena lateral comprende

(S1) un sitio de unión al esqueleto en el que está unida al esqueleto, (s2) un sitio de unión a la etiqueta para unir una etiqueta de detección para el conjugado ARNm-conector, (S3) un sitio de unión al péptido al que un péptido tiene una secuencia correspondiente a la del ARNm. Luego, cnvK se localiza entre el sitio de escisión en el esqueleto y el sitio de unión a la cadena lateral. Además, el sitio de unión a la etiqueta de la cadena lateral puede estar compuesto por al menos una secuencia espaciadora, y la etiqueta de fluorescencia está unida a la misma. Además, el sitio de unión al péptido puede estar compuesto por puromicina o sus derivados.

Dado que el conector tiene la estructura descrita anteriormente, se liga a ARNm y en poco tiempo no más de 1/30, en comparación con T4 ARN ligasa que se emplea. Tal ligación de poco tiempo reduce enormemente el riesgo de que la ARNasa degrade el ARNm. Además, al utilizar la etiqueta unida a la cadena lateral del conector, el conjugado conector-ARNm se separa fácilmente.

Obsérvese que el conjugado conector-ARNm según lo descrito anteriormente puede ser preparado mediante el procedimiento de ligación enzimática, que emplea tanto el conector de uso convencional como el ARNm obtenido según lo descrito anteriormente, y se ligan con una enzima tal como T4 ARN ligasa y similares.

A continuación, en la etapa de formación del conjugado ARNm-proteína (c), el conjugado conector-ARNm obtenido según lo descrito anteriormente es traducido utilizando el sistema de traducción libre de células para presentar el péptido que tiene la secuencia correspondiente al ARNm en el sitio de unión al péptido del conector al conjugado ARNm-conector-proteína. Como sistema de traducción libre de células, es preferible el lisado comercialmente disponible de reticulocitos como los de conejo, porque da una traducción rápida y resultados estables.

El péptido se une al sitio de unión al péptido en el conector, incluido en el conjugado ARNm-proteína (la molécula de detección de diana) obtenido en la etapa (c) o en el conjugado ARNm/ADNc-proteína obtenido en la etapa (d) descrita más adelante, se une a la molécula diana en la estructura esférica o se une directamente al grupo funcional en la misma. De este modo se obtiene el conjugado de forma esférica.

La etapa para llevar a cabo la transcripción inversa del conjugado ARNm-proteína para obtener el conjugado ARNm/ADNc-proteína puede realizarse antes de la etapa de separación (iii) o después de la misma. Es preferible que la etapa para llevar a cabo la transcripción inversa se realice antes de la etapa de separación (iii), porque hace que el ARNm unido al conector sea estable. Concretamente, en la etapa de transcripción inversa (d), la transcripción inversa del conjugado ARNm-proteína en el conjugado de forma esférica se lleva a cabo en las condiciones predeterminadas. Es decir, la condición de la transcripción inversa puede establecerse opcionalmente. Por ejemplo, de acuerdo con el método convencional, la mezcla de dNTP, DTT, transcriptasa inversa y el agua con eliminación de RNasa (en adelante, a veces se denomina “agua libre de RNasa”) se mezclan para preparar el sistema de reacción predeterminado. Luego, se puede llevar a cabo la transcripción inversa a la temperatura y tiempo predeterminados. La transcripción inversa puede realizarse de acuerdo con el protocolo adjunto al kit comercialmente disponible tal como el PrimeScript RT-PCR Kit (Takara Bio Inc.), ReverTra Ase (TOYOBO Co. Ltd.) y similares. Cuando la etapa de transcripción inversa se realiza después de la etapa de separación (iii) se explica más adelante.

A continuación, la presente invención es explicada en detalle, ilustrando el liposoma como la estructura esférica, se utilizan el promotor T7, la secuencia Cap, la secuencia n, la secuencia Kozak, la secuencia de la etiqueta His y la secuencia de ADN que codifica el péptido deseado.

(1) Preparación del conjugado promotor-ADN

Se puede sintetizar el fragmento de ADN que tiene la secuencia deseada de acuerdo con el método convencional. Por ejemplo, en primer lugar, se prepara la mezcla de reacción PCR que contiene la secuencia que codifica la secuencia peptídica y el fragmento de ADN que tiene la etiqueta His, y luego se lleva a cabo la PCR de extensión en las condiciones deseables. Luego, se añade la mezcla de reacción PCR que contiene el promotor T7, la secuencia Cap, la secuencia Q, la secuencia Kozak en el producto de PCR y luego se realiza la PCR de extensión en las condiciones deseables para obtener el ADN que tiene la secuencia objetivo.

Por ejemplo, se preparan de 25 a 75 |jL de la mezcla de reacción PCR (1 X tampón PrimeSTAR (Mg2+), de 0,1 a 0,4 mM de dNTP, de 0,01 a 0,04 U/jL PrimeSTAR HS ADN polimerasa (Takara Bio Inc.)) que contiene la secuencia que codifica el péptido deseado y la que tiene la etiqueta His, y luego se realiza la PCR 1 de extensión por solapamiento utilizando el siguiente programa de PCR. La PCR contiene, por ejemplo, (a) a 92 a 96 °C (1 a 3 minutos), (b) a 92 a 96 °C (5 a 45 segundos), (c) a 50 a 70 °C (2 a 30 segundos), (d) a 65 a 80 °C (20 a 40 segundos), y (e) a 65 a 80 °C (1 a 3 minutos); es preferible repetir las etapas (b) a (d) durante 6 a 10 veces, porque se obtiene la cantidad suficiente de productos de amplificación.

Luego, se añaden los productos de PCR obtenidos en la PCR 1 de extensión por solapamiento en de 25 a 75 jL de la mezcla de reacción PCR (contiene la secuencia que consiste en la secuencia del promotor T7 - secuencia Cap -secuencia O - secuencia Kozak. Es la misma que la utilizada en la PCR 1 de extensión por solapamiento excepto que contiene además 0,6 jM de F1) para establecer la cantidad total de 50 a 150 jL. A continuación, se lleva a cabo la PCR 2 de extensión por solapamiento utilizando el siguiente programa de PCR. Es preferible utilizar el mismo programa de PCR que el descrito anteriormente, ya que se obtiene una cantidad suficiente de productos de amplificación.

El ADN de construcción completa de doble hebra obtenido de la PCR 2 de extensión por solapamiento es precipitado, por ejemplo, mediante un co-precipitante (Quick-Precip Plus Solution, EdgeBio) y, a continuación, es preferible purificar utilizando, por ejemplo, FavorPrep PCR Clean-Up Mini Kit (Favogen).

De forma similar, la PCR de extensión se lleva a cabo utilizando una secuencia aleatoria que contiene ADN diseñado para codificar el péptido deseado, la secuencia que contiene tanto el promotor T7 como la secuencia SD, y la secuencia Ytag para obtener el ADN de construcción completa de doble hebra. En este caso, en primer lugar, se prepara la mezcla de reacción PCR que comprende la secuencia aleatoria y la secuencia de etiqueta Y, y luego se lleva a cabo la PCR de extensión en las condiciones deseables. Es preferible utilizar el mismo programa de PCR, excepto que las etapas (b) a (d) se llevan a cabo de 4 a 10 ciclos, ya que se obtiene la cantidad suficiente de productos de amplificación.

Después de eso, se añade la mezcla de reacción PCR que comprende la secuencia promotor T7-SD a los productos de PCR obtenidos para llevar a cabo la PCR de extensión en las condiciones deseables para obtener el ADN que tiene la secuencia objetivo. Es preferible utilizar el mismo programa de PCR, excepto que las etapas (b) a (d) se realizan de 4 a 10 ciclos.

(2) Preparación de ARNm

Se utiliza ADN según lo descrito anteriormente como un ADN plantilla, se realiza una transcripción de acuerdo con el método convencional. Por ejemplo, la mezcla de reacción que comprende la concentración predeterminada del tampón de transcripción T7, rNTP (mezcla de 25 mM de ATP, CTP, UTP y GTP cada uno), una mezcla enzimática, y el ADN patrón se hace reaccionar a aproximadamente 37 °C durante aproximadamente 2 a 6 horas. A continuación, se añade DNasa libre de RNasa RQ-1 (Promega) a la mezcla de reacción, y luego se hace reaccionar a aproximadamente 37 °C durante aproximadamente 15 a 30 minutos. Luego de finalizada la reacción, se lleva a cabo la purificación utilizando, por ejemplo, el kit de limpieza Rneasy minElute Cleanup (QIAGEN) para obtener ARNm purificado.

Dicha transcripción puede realizarse utilizando el kit de transcripción comercialmente disponible. Por ejemplo, es preferible utilizar el sistema de producción de ARN a gran escala RiboMAX-T7 (Promega), porque la transcripción se realiza en forma rápida, conveniente y precisa. Cuando se emplea dicho kit, la transcripción se realiza utilizando de 0,5 a 5 mg de dsDNA (ADN bicatenario) en la escala de 10 a 30 j L según el protocolo adjunto al kit. La transcripción se lleva a cabo en las condiciones deseables incubando la mezcla de reacción, y se añade la cantidad deseable de DNasa en la misma y de nuevo se incuba en el baño de agua a temperatura constante para obtener ARNm.

Además, por ejemplo, se prefiere obtener el ARNm utilizando un bloque de aluminio para el baño de agua a temperatura constante (Anatech, Cool Stat 5200), se incuba la mezcla de reacción a aproximadamente 35 a 40 °C, durante 1 a 3 horas, y luego, se añade de 0,5 a 2 |jL de RQ1 DNasa unida al kit en la muestra y se incuba a aproximadamente 35 a 40 °C durante 5 a 30 minutos, debido a la eficacia de síntesis. El ARNm obtenido puede ser purificado utilizando el kit deseado. Como el kit de purificación, por ejemplo, se puede utilizar el kit After Tri-Reagent RNA Clean-Up Kit (Favogen).

(3) Preparación de conjugado ARNm-conector

(3-1) Preparación del conector

En la presente memoria descriptiva, el término, "conector", es definido como el conector que se emplea para generar uno cualquiera de: conjugado conector-ARNm, conjugado conector-ARNm-proteína, o conjugado conector -ARNm/ADNc-proteína (en adelante, a veces denominado "IVV".) utilizado en la presentación del ADNc. Además, la expresión "conjugado ARNm-proteína" se define como el conjugado conector-ARNm-péptido. El conjugado conector-ARNm es traducido, al que se une el péptido que tiene la secuencia correspondiente a la del ARNm en el sitio de unión al péptido en el conector. Adicionalmente, la expresión "conjugado ARNm/ADNc-proteína" se define como el complejo conector-ARNm/ADNc - péptido, que se forma por la transcripción inversa del conjugado ARNm-proteína, y el ADNc está unido en el esqueleto del conector.

El conector está compuesto principalmente de ADN; contiene cnvK, debido a que forma un entrecruzamiento con el ARNm en poco tiempo. Además, puede contener un análogo de ADN tal como desoxi-inosina, desoxi-timina modificada con biotina, desoxi-timina modificada con fluoresceína y similares. Es preferible que el conector esté diseñado con propiedades hidrófilas y de flexibilidad.

Como la molécula forma la unión a la fase sólida, por ejemplo, es preferible la biotina o sus derivados cuando la avidina, la estreptavidina y similares están unidas a la fase sólida; la maltosa cuando la proteína de unión a la maltosa está unida a la misma; el nucleótido de guanina cuando la proteína G está unida a la misma; metal tal como Ni, Co y similares cuando el péptido de polihistidina está unido a la misma; glutatión cuando la glutatión S-transferasa está unida a la misma.

Se mencionan, por ejemplo, el ADN o el ARN que tienen una secuencia específica cuando la proteína de unión al ADN o al ARN de secuencia específica está unida a los mismos; el antígeno o el epítopo cuando el anticuerpo o el aptámero están unidos; el péptido de unión a la calmodulina cuando la calmodulina está unida a los mismos; ATP cuando la proteína de unión a ATP está unida a los mismos; estradiol y similares cuando la proteína receptora para estradiol está unida a los mismos. Entre ellos, es preferible utilizar biotina, maltosa, metales como Ni y Co, glutatión, molécula de antígeno. Desde el punto de vista de la síntesis fácil del conector, es preferible utilizar biotina o sus derivados.

El sitio de unión a la fase sólida (p1) se define como el sitio de unión en el que se une a través del conector el conjugado ARN-proteína o el conjugado ARNm/ADNc-proteína descrito. El sitio de unión a la fase sólida (p1) está compuesto por al menos 1 a 10 nucleótidos. Por ejemplo, está preferentemente compuesto por uno cualquiera de los compuestos seleccionados del grupo que consiste en la desoxi-timidina modificada con biotina (dT), biotina, estreptavidina, alquinos, compuestos azídicos obtenidos a través de la química clic, grupo amino, éster de N-hidroxisuccinimida (NHS), grupo S^h , y Au; y poli A unido a los mismos. Es preferible que poli A, que se compone de al menos 10 adeninas se unan, porque tal estructura permite mantener la distancia de la fase sólida adecuadamente para liberar el conector sin problemas. Es más preferible que esté compuesto por aproximadamente 20 de adenina se une.

El sitio de unión a la cadena lateral (ps), que se encuentra cerca del extremo 3' terminal del conector, es el sitio al que se une la cadena lateral que se explica más adelante. Además, por ejemplo, cuando el sitio de unión a la cadena lateral (p2) del conector está compuesto por Amino-Modificador C6 dT, la cadena lateral y el esqueleto se entrecruzan utilizando EMCS ya que el extremo 5' terminal de la cadena lateral es 5'-Tiol-Modificador C6.

La región del cebador (PR) está situada en el lado 3' terminal del conector adyacente al lado 3' del sitio de unión a la cadena lateral, y funciona como un cebador para la transcripción inversa, cuando la transcripción inversa se lleva a cabo en el conector. Aquí, la región del cebador (PR) funciona como cebador para la transcripción inversa, cuando la transcripción inversa se realiza en el conector. La región está compuesta preferentemente por 1 a 15 nucleótidos, y más preferentemente de 3 a 5 nucleótidos. Dado que el número de nucleótidos es superior a 15, la eficacia de unión como el conector se reduce, la región está compuesta preferentemente por el número de nucleótidos según lo descrito anteriormente, tanto desde el punto de vista de la eficacia de unión con el conector como de la eficacia de reacción como el cebador.

Preferentemente, el sitio de unión al péptido está compuesto por puromicina o su derivado. Como los derivados de puromicina, se puede utilizar 3'-N- aminoacil puromicina (PANS-aminoácido), o un nucleósido tal como 3'-N- aminoacil adenosina aminoácido (AANS-aminoácido). Es más preferible utilizar un compuesto seleccionado del grupo que consiste en PANS-Gly que tiene glicina como la porción de aminoácido de PANS, PANS-Val que tiene valina como la de PANS, PANS-Ala que tiene alanina como la de PANS, una mezcla de aminoácidos PANS, AANS-Gly que tiene glicina como la porción de aminoácido de AANS, AANS- Val que tiene valina como la de AANS, AANS-Ala que tiene alanina como la de AANS, y la mezcla de AANS aminoácidos.

Como PANS-aminoácidos, se mencionan, por ejemplo, PANS-Gly, PANS-Val, PANS-Ala y similares, y como AANS-aminoácidos, se mencionan, por ejemplo, AANS-Gly, AANS-Val, AANS-Ala y similares. Además, pueden utilizarse los compuestos compuestos por el nucleósido y el aminoácido a través de la unión del éster. Sin embargo, es preferible utilizar puromicina, porque proporciona alta estabilidad a la unión peptídica en el sitio de unión peptídica.

La cadena lateral tiene el grupo fluorescente entre el sitio de unión peptídica y el sitio de unión a la cadena lateral. De este modo, se hace más fácil detectar la unión con o sin el conector en cada etapa de la presentación de ADNc que se explica más adelante. Es preferible que el grupo fluorescente emplee el compuesto fluorescente, por ejemplo, que tiene un grupo funcional libre tal como grupo carboxilo que se cambia a éster activo, grupo hidroxilo que se cambia a fosforamidita, o grupo amino, y permite la unión al conector como el nucleótido etiquetado. Como tal compuesto fluorescente, se mencionan, por ejemplo, tal como tiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, colorante Cy, Alexa Fluor y similares. Es preferible utilizar FITC, debido al menor costo.

La presente invención utiliza preferentemente el conector de tipo fotoentrecruzamiento (Fig. 7). Cuando se utiliza una enzima tal como T4 ARN ligasa para unir el esqueleto y el ARNm, el ARNm se degrada a menudo, porque la eliminación completa de la RNasa es imposible, y se necesita mucho tiempo para unirlos. Sin embargo, puesto que la presente invención no utiliza la enzima para la unión del conector, hace que la degradación de ARNm sea evitable. Además, puesto que el conector de la presente invención contiene cnvK, el ARNm y el conector son entrecruzados en agua, no tampón, en muy poco tiempo utilizando radiación UV. Además, la estructura del conector entrecruzado es según lo descrito anteriormente.

Es preferible que el sitio de escisión en fase sólida (p2) esté compuesto por desoxi inosina por las siguientes razones. Para escindir los dos conjugados de la fase sólida, se utiliza la endonucleasa V, es decir, el conjugado del presente conector-ARNm y ADNc, o el del presente conector-ARNm/ADNc y péptido (en adelante, a veces se denomina correctivamente "difusor") explicado más adelante. El sitio de escisión de fase sólida que está compuesto por desoxiinosina proporciona una escisión específica de la fase sólida con el sitio de unión a la fase sólida.

El conector de fotoentrecruzamiento puede ser preparado de la siguiente manera.

En primer lugar, el esqueleto del conector de la presente invención, segmento poli A cnvK, está diseñado para tener cnvK en la posición deseada entre el sitio de unión a la fase sólida y el sitio de unión a la cadena lateral en el esqueleto, el ADN es químicamente sintetizado de acuerdo con el método convencional. Esta síntesis química de la cadena de ADN puede ser confiada a las empresas que la realizan.

El esqueleto está diseñado para que comprenda el sitio de inicio de la transcripción inversa como se muestra en la Fig. 7, el sitio de inicio de la transcripción inversa, el sitio de unión a la cadena lateral, el sitio de fotoentrecruzamiento de alta velocidad que está compuesto por 3-ciano-vinilcarbazol, y el sitio de unión a la fase sólida. En el esqueleto que se muestra en la Fig. 7, la secuencia de nucleótidos que no sea el sitio modificado se muestra como la siguiente secuencia (Secuencia N° 1). Al siguiente esqueleto, se une BioTEG en el extremo 5' terminal. Además, en la siguiente secuencia de nucleótidos, R representa inosina e Y representa amino C6-dT.

[Secuencia N° 1] 5'AAAAAAAAAAAAAAAAAAAARTTCCAGCCGCCCCCCGYCCT 3'

La cadena lateral del conector (en adelante, a veces denominada "segmento de puromicina") está también diseñada de modo de tener una secuencia deseable, el ADN es químicamente sintetizado de acuerdo con el método convencional del mismo modo al realizado para el segmento Poli A cnvK. Dicha síntesis química de la cadena de ADN puede ser confiada a las empresas que la realizan.

Es preferible que dicha cadena lateral sea diseñada de manera que comprenda el sitio de unión a la cadena lateral, la etiqueta de fluorescencia y el sitio de unión peptídica, como se muestra en la Fig. 7. En la cadena lateral, la secuencia de nucleótidos (Secuencia N° 2) sin el sitio modificado es la siguiente. En la siguiente cadena lateral, P (K en la siguiente secuencia), el extremo terminal libre, es puromicina como el sitio de unión peptídica. Además, en la siguiente secuencia de nucleótidos, R representa 5' Tiol C6, Y representa FITC-dT, y M representa el Espaciador 18, respectivamente.

[Secuencia N° 2]

5' RTCTYMMCCK

Por ejemplo, se añade EMCS (Dojindo Laboratories) en tampón de fosfato sódico 0,1 a 0,3 M (pH 7,0 a 7,4), que ^{contiene de 10 a 20 nmol (conc. final de 100 a 200} |^{j M) del esqueleto que tiene la secuencia mencionada} anteriormente, para que tenga una concentración final de 15 a 18 mM. Se incuba el tampón y luego se somete a precipitación con etanol. Preferentemente, se añade EMCS (Dojindo Laboratories) a aproximadamente 16,7 mM en tampón de fosfato sódico 0,1 a 0,3 M (pH de aproximadamente 7,2), que contiene 15 nmol (conc. final 150 jM) del esqueleto que tiene la secuencia mencionada anteriormente. Se incuba el tampón a aproximadamente 37 °C durante aproximadamente 30 minutos, y luego se somete a precipitación con etanol utilizando, por ejemplo, solución Quick-Precip Plus Solution (Edge BioSystems) y similares para su modificación.

A continuación, se disuelven de 30 a 45 nmol de la cadena lateral en 0,8 a 1,5 M de tampón de hidrógeno fosfato sódico que contiene de 40 a 60 mM de DTT a una concentración final entre 400 y 430 mM y se agitan aproximadamente de 0,75 a 1,5 horas con un agitador. Posteriormente, se realiza un intercambio de tampón para la solución. Preferentemente, se disuelven aproximadamente 7,5 nmol de la cadena lateral de modo que sean aproximadamente 417 mM a una concentración final en aproximadamente 1 M de tampón de hidrógeno fosfato sódico que contiene aproximadamente 50 mM de DTT. Se agita el tampón a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora con el agitador. Posteriormente, se realiza el intercambio de tampón para la solución. Por ejemplo, el tampón se intercambia por aproximadamente 0,1 M de fosfato sódico (pH aproximadamente 7,0) que contiene aproximadamente 0,15 M de NaCl utilizando la columna NAP5 para obtener una cadena lateral reducida.

A continuación, la solución que contiene la cadena lateral reducida de la que se intercambia el tampón como se ha descrito anteriormente se mezcló con el precipitado de etanol del esqueleto modificado con EMCS, y se dejó reposar entre 2 y 6 °C durante toda la noche. Luego, se añadió DTT en la mezcla de reacción de modo que sea de 40 a 60 mM, y se agitó a temperatura ambiente durante 15 a 60 minutos. Luego, la mezcla es sometida a precipitación con etanol, que se disuelve en 50 a 200 jL de agua libre de nucleasas para su purificación. Preferentemente, la solución que contiene el tampón reducido del que se intercambia el tampón se mezcla con los precipitados de etanol del esqueleto modificado con EMCS y se deja reposar a aproximadamente 4 °C durante toda la noche. A continuación, se añade DTT a la mezcla de reacción para que tenga una concentración final de aproximadamente 50 mM y se agita a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Luego, se lleva a cabo la precipitación con etanol utilizando, por ejemplo, la solución Quick-Precip Plus (Edge Biosystems). Se disuelve el producto de la precipitación con etanol obtenido en aproximadamente 100 jL del agua libre de nucleasas y se somete a purificación por HPLC en las siguientes condiciones utilizando, por ejemplo, columna C18 con elución mediante gradiente para obtener el conector del tipo fotoentrecruzamiento (Fig. 8).

El tampón de elución para la elución en gradiente puede contener, por ejemplo, de 0,05 a 0,2 M de acetato de trimetilamonio (en agua ultrapura) como solución A, y de 75 a 85 % de acetonitrilo como solución B; la relación de la solución A en el tampón de elución al principio puede reducirse en aproximadamente 20 % en un plazo de 40 a 50 minutos. La velocidad de flujo puede ser de 0,5 a 1,5 ml/min, y el volumen de la fracción puede ser de 0,5 a 1,5 ml. Preferentemente, la solución A es aproximadamente 0,1 M de acetato de trimetilamonio (en agua ultrapura), la solución B es aproximadamente 80 % de acetonitrilo; la relación de la solución A (aproximadamente 85 %) en el tampón de elución en el punto de partida se reduce a aproximadamente 65 % en 40 a 50 minutos. La velocidad de flujo es de aproximadamente 1,0 ml/minuto, el volumen de la fracción es de aproximadamente 1,0 ml.

Los componentes de la fracción se confirman tanto con fluorescencia como con absorción UV (aproximadamente 280 nm). Se recogen las fracciones que muestran los picos por ambos medios de detección y, a continuación, se evapora el disolvente de las fracciones recogidas mediante el uso de un evaporador de vacío. Luego, se somete a precipitación con etanol y se disuelve el precipitado en el agua libre de nucleasas para fabricar el conector de la presente invención. Por ejemplo, cuando las fracciones de 30 a 32 minutos muestran los picos tanto de fluorescencia como de UV, se recogen esas fracciones y el disolvente se evapora mediante el evaporador de vacío. A continuación, se lleva a cabo la precipitación con etanol mediante, por ejemplo, solución Quick-Precip Plus Solution, para obtener el conector de fotoentrecruzamiento. El conector de fotoentrecruzamiento obtenido puede ser disuelto en el agua libre de nucleasas para almacenarlo a aproximadamente -20 °C.

Obsérvese que en la presente invención se puede utilizar el conector del tipo enzima convencional. En primer lugar, se sintetiza el ADN de modo que tenga la secuencia deseada de acuerdo con el método convencional para fabricar un oligómero de una sola hebra utilizado como el esqueleto. Según lo descrito anteriormente, el oligómero de una sola hebra sintetizado comprende el sitio de unión a la fase sólida, al menos dos sitios de escisión, el sitio de unión al ARNm, el sitio de unión a la cadena lateral y la región del cebador. Dependiendo de la longitud y la localización en el esqueleto de los al menos 2 sitios de escisión, la longitud del oligómero de una sola hebra que será el esqueleto se determina correctamente. A continuación, se sintetiza la cadena lateral que tiene la longitud deseable que se unirá en el sitio de unión a la cadena lateral en el esqueleto. En el extremo terminal libre de la cadena lateral, por ejemplo, se introduce puromicina, se introduce Fluoresceína-dT según lo descrito anteriormente en el sitio de la etiqueta de fluorescencia. De este modo, se puede obtener el conector para fabricar el conjugado ARNm/ADNc-péptido de la presente invención.

Cuando se diseña el esqueleto, se puede hacer referencia a una variedad de secuencias codificantes de ARNm. Por ejemplo, se mencionan ARNm como los que codifican proteínas receptoras cuyas secuencias se conocen, los que codifican anticuerpos o fragmentos de los mismos y similares. El análogo 3' terminal de aminoacil ARNt tal como puromicina o sus derivados se incorporan en el extremo C terminal de la cadena polipeptídica generada por la traducción de la secuencia codificante de ARNm. Para unir la cadena polipeptídica y el conjugado conector-ARNm, se elige la secuencia sin codón de terminación. Este ARNm puede obtenerse mediante transcripción in vitro, síntesis química y otros métodos, tales como extracción del cuerpo vivo, células, microorganismos y similares. Sin embargo, da alta eficacia de unión al conector y a la traducción del sistema libre de células, cuando se fabrica utilizando transcripción in vitro.

Preferentemente comprende al menos uno de estructura de caperuza de guanosina 7-metilada en el extremo 5' terminal, o estructura de cola poli A en el extremo 3' terminal, debido a la eficacia de la síntesis de proteínas. Más preferentemente comprende una secuencia Kozak, o una secuencia Shine-Dalgarno, porque promueve el inicio de la traducción. En principio, la longitud del ARNm utilizada en la presente depende de la de la región codificante, que se define en función de la longitud de la proteína o del polipéptido para su evolución molecular utilizando la presente invención. Es preferible una longitud de 50 a 1.000 nucleótidos, por la eficacia de la reacción, y es más preferible una longitud de 200 a 500 nucleótidos, porque se consigue la mayor eficacia de la reacción.

(3-2) Ligación del ARNm y el conector

El fotoentrecruzamiento del ARNm obtenido y el conector de la presente invención se realiza irradiando UV con longitud de onda larga, de 300 a 400 nm, durante 0,5 a 5 minutos. Tiene las ventajas de obtener el péptido deseable que tiene la secuencia correspondiente a la del ARNm utilizado sin el problema de que se genere el dímero de timina en el ADNc sintetizado, porque el UV empleado tiene una longitud de onda larga y un tiempo de irradiación corto.

(3-3) Preparación del conjugado ARNm/ADNc-proteína a través de la traducción libre de células del conjugado ARNmconector

Es preferible que la traducción libre de células del conjugado ARNm-conector utilice lisado de reticulocitos de mamíferos, y más es más preferible que utilice el de sangre de conejo. Para inducir la anemia, antes se administra acetil fenil hidrazina al mamífero, y se recoge su sangre varios días después de la administración. De este modo, la relación del reticulocito en la sangre aumenta. Por ejemplo, se utiliza el lisado tratado con la nucleasa micrococal para degradar el ARNm derivado de células e inactivado mediante la adición de ácido glicol éter diamina tetra acético (EGTA) para quelar el calcio (en adelante, se denomina a veces "tratado con nucleasa micrococal").

Por ejemplo, se añaden el lisado de reticulocitos de conejo tratado con nucleasa micrococal y el conjugado en 10 a 100 |jL de la mezcla de reacción que contiene aproximadamente 16 a aproximadamente 400 mM de acetato de potasio, aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2,5 mM de acetato de magnesio, aproximadamente 0,2 a aproximadamente 50 mM de fosfato de creatina, de 0 a aproximadamente 0,25 mM de aminoácidos (estas son concentraciones finales) para llevar a cabo la traducción.

Desde el punto de vista de la eficacia de la reacción, el volumen del reticulocito de conejo es de aproximadamente 8,5 a aproximadamente 17 jL, el del conjugado es de aproximadamente 1,2 a aproximadamente 2 pmol, y el tamaño del sistema de reacción es de aproximadamente 12,5 a aproximadamente 25 jL. Luego, la traducción se realiza en el rango de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 °C, durante aproximadamente 10 a aproximadamente 30 minutos. La mezcla de reacción utilizada aquí contiene aproximadamente 80 mM de acetato de potasio, aproximadamente 0,5 mM de acetato de magnesio, aproximadamente 10 mM de fosfato de creatina, cada uno aproximadamente 0,025 mM de metionina y leucina, aproximadamente 0,05 mM de aminoácidos distintos de metionina y leucina. Cuando la traducción se lleva a cabo a aproximadamente 30 °C durante aproximadamente 20 minutos, tanto la eficacia de generación como la eficacia de trabajo son altas.

Después de la traducción, cuando los productos de la traducción, el péptido, se hace reaccionar con el péptido y el conjugado conector- ARNm en las condiciones, por ejemplo, la presencia de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 1,6 M de cloruro de sodio y aproximadamente 40 a aproximadamente 170 mM de magnesio de sodio (cualquiera es la concentración final), a aproximadamente 27 hasta aproximadamente 47 °C durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 1,5 horas, el péptido y el conjugado se unen eficazmente.

(4) Preparación de la estructura de forma esférica

(4-1) Preparación de la molécula de forma esférica

Se ilustra cuando el liposoma se utiliza como la molécula de forma esférica. Los liposomas enormes que son confirmados utilizando un microscopio óptico y utilizables en el clasificador de células se preparan utilizando el método de emulsión W/O (agua/aceite). En primer lugar, se preparan de 5 a 15 mM de fosfolípido en cloroformo. Se vierte la solución en un tubo de ensayo de vidrio, y se elimina el cloroformo soplando gas nitrógeno a la solución para formar una película delgada hecha del fosfolípido en la superficie interior del tubo de ensayo. Aquí, se utiliza como el fosfolípido, por ejemplo, dioleoil fosfatidilcolina (DOPC), dioleoil fosfatidil glicerol (DOPG), dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC), fosfatidilcolina de huevo (PC de huevo) y similares.

A continuación, se añaden de 200 a 400 |jL de parafina líquida en el tubo de ensayo y se administran ultrasonidos entre 55 °C y 65 °C durante más de 1 hora. De este modo, se disuelve el fosfolípido en parafina líquida. Después de la administración de ultrasonidos, se añade a la solución la cantidad deseada de solución de membrana interna para el liposoma y se mezcla vigorosamente durante más de 30 segundos mediante la administración de ultrasonidos. Como solución interna del liposoma, se puede utilizar una solución de glucosa de 0,1 a 0,4 M que contiene de 25 a 75 mM de NaCl y de 27 a 75 mM de tampón de Tris (pH 7,5).

Se puede etiquetar el liposoma añadiendo la etiqueta fluorescente que se utilizará para la citometría de flujo en la solución intermembrana del liposoma. Como las etiquetas fluorescentes, se mencionan por ejemplo AMCA, Pacific Blur, Alexa Flour 405, Naranja Pacífico, Naranja Krome, Violeta Brillante 421, Violeta Brillante 510, Violeta Brillante 605, Violeta Brillante 650, Violeta Brillante 711, Violeta Brillante 785, Alexa Flour 488, Punto Cuántico (Quantum Dot), FITC, PE/RD1, ECD, PE-Rojo Texas, PC5, SPRD, PE- Cy5, PC5.5, PE-Cy5.5, PerCP, PerCP-5.5, PE-Alex Fluor 700, PE-Alex Fluor 750, PC7, PE-Cy7, TRITC, Cy3, Alex Fluor 594, Rojo Texas, Alexa Flour 594, Alexa Flour 700, Cy5, Cy5.5, APC, APC7, APC-Cy7, APC Alexa Fluor 700, APC Alexa Fluor 750, Hoechst 33342, DAPI, Violeta de Ciclo de Tinte, Cromomicina A3, PI, YOYO-1, CPO, Pironina Y, 7-AAD, Homodímero de etidio-1, SYTO9, SYBR Green I, LDS751, DRAQ5, DRAQ 7, TO-PRO3, Indo-1(AM), Fluo-3(AM), Fluo- 4(AM), Rojo Fura (AM), BCECF(AM), SNARF-1(AM), Fluoresceína, R110, EBFP, ECFP, Rojo Keima, AmCyan, ^e G^f P, ZsGreen, EY^f P, mBanana, mOrange, DsRed, tdTomato, mCherry, mCherry2, E2-Crimson, Naranja Kusabira, JC-1, Rodamina, mCIB, CMFDA, CFSE, DiOC2(3), DiBAC4(3), PKH26, DCFH-DA, DHR, FDA, Caleína AM, Rojo Nilo, Fluoresceína Amina, y similares.

También, es preferible etiquetar el liposoma utilizando la pluralidad de las etiquetas de fluorescencia con la longitud de onda fluorescente diferente elegida de las etiquetas de fluorescencia, porque permite elegir el liposoma fluorescente objetivo con precisión. Por ejemplo, se elige para el doble etiquetado del liposoma la fluoresceína amina que genera fluorescencia verde y Alexa Fluor 594 que genera fluorescencia roja, o FITC que genera fluorescencia verde y mCherry2 que genera fluorescencia roja, se elige con precisión el liposoma etiquetado con fluorescencia (en adelante, a veces denominado "liposoma fluorescente").

Después, por ejemplo, se utiliza tampón de Tris (pH 7,5) o solución de glucosa de 0,1 a 0,5 M que contiene NaCl como solución externa de la membrana liposómica, la solución interna de la membrana liposómica se deja reposar en la solución externa; y se centrifuga la solución a temperatura ambiente. De este modo, dado que la gota en la mezcla de la membrana liposómica recubierta por la única capa de fosfolípido, que se forma en la superficie de contacto entre el aceite y la solución externa del liposoma, se forma el liposoma. Luego, la parafina líquida existe en la porción superior, se obtiene la solución que contiene el liposoma.

La membrana del liposoma obtenido puede ser etiquetada con una etiqueta de fluorescencia de acuerdo con el método convencional. Alternativamente, se puede etiquetar la membrana del liposoma utilizando el kit comercialmente disponible, por ejemplo, el kit de tinción de membrana citoplásmica fluorescente verde (Green-Fluorescent citoplasmic Membrane Staining Kit) (Takara Bio Inc.), que contiene colorante de carbocianina con fluorescencia verde. Además, se puede etiquetar el liposoma con fluorescencia naranja utilizando el kit de tinción de membrana citoplásmica fluorescente naranja (Orange-fluorescent Cytoplasmic Membrane Staining Kit) (Takara Bio Inc.), fluorescencia roja utilizando el kit de tinción de membrana citoplásmica fluorescente roja (Takara Bio Inc.), o fluorescencia azul utilizando el kit de tinción de membrana citoplásmica fluorescente azul (Takara Bio Inc.). Mediante el uso de estas etiquetas, se distinguen los liposomas etiquetados fluorescentes.

Además, utilizando la proteína de fusión compuesta por la proteína unida a la membrana del liposoma y la molécula de etiqueta, la membrana del liposoma puede ser modificada con la molécula de etiqueta. Por ejemplo, se sintetizan las siguientes secuencias: la que codifica el péptido LB-1 que funciona como ancla a la membrana del liposoma, la que codifica la biomolécula como la proteína fluorescente, mCherry2, GFP y similares como molécula de etiqueta, una variedad de anticuerpos, proteínas para ser marcadores de enfermedades, y etiqueta His y similares. Posteriormente, estas secuencias son inducidas en un sitio de multiclonación de un vector para expresar la proteína de fusión compuesta por LB-1 y la proteína fluorescente en E. coli de acuerdo con el método convencional. A continuación, se puede obtener la proteína de fusión, por ejemplo, mediante la purificación con etiqueta His.

La proteína de fusión obtenida se añade a la solución del liposoma a la concentración predeterminada y se agita lo suficiente. De este modo, la proteína LB-1 se une a la membrana del liposoma, y las moléculas de etiqueta son expuestas en la superficie de la membrana del liposoma. Si las moléculas diana son la proteína fluorescente, se obtienen imágenes de la membrana liposómica etiquetada con la etiqueta fluorescente utilizando el microscopio.

(4-2) Unión del conjugado ARNm-proteína o el conjugado ARNm/ADNc-proteína al liposoma.

El conjugado ARNm-proteína o el conjugado ARNm/ADNc-proteína obtenido como se describe se une al liposoma a través de la unión de la molécula diana en la membrana del liposoma y el péptido se une al sitio de unión al péptido del conector, o unión directa del péptido en el conector con el grupo funcional en el liposoma. Por ejemplo, los péptidos antibacterianos tales como Magainina 2, PGLa, melitina y similares están unidos a la membrana celular de la bacteria. Dado que estos péptidos incluyen de 15 a 40 residuos de aminoácidos y son un grupo anfifílico compuesto por aminoácidos básicos con aminoácidos hidrófobos, la mayoría de ellos tienen la propiedad de formar - estructura helicoidal cuando se unen a la superficie de la membrana celular bacteriana. Mediante el uso de la propiedad, se diseña ADN que codifica la proteína de unión a la membrana liposómica, y el conjugado ARNm-proteína o ARNm/ADNc-proteína se une al liposoma para obtener el conjugado liposómico como conjugado de forma esférica.

(5) Transcripción inversa

La transcripción inversa se puede realizar antes de la etapa de separación utilizando el clasificador celular o después de la etapa. La cadena de ADNc se sintetiza utilizando el ARNm como plantilla y el extremo 3' terminal del esqueleto en el conector contenido en el conjugado ARNm-proteína como punto de partida en las condiciones predeterminadas de acuerdo con el método convencional para obtener el conjugado ARNm/ADNc-proteína. El sistema de transcripción inversa se elige opcionalmente y no está limitado. Sin embargo, es preferible preparar el sistema de reacción con el conjugado conector-ARNm, la mezcla de dNTP, DTT, transcriptasa inversa, solución estándar, y agua de la que se elimina la RNasa (a continuación, a veces se le denomina "agua libre de RNasa") y realizar transcripción inversa en el sistema en condiciones tales como o 5 a 20 minutos en el intervalo de temperatura de 30 a 50 °C. La transcripción inversa puede realizarse utilizando el kit comercialmente disponible, por ejemplo, PrimeScript RT-PCR Kit (Takara Bio Inc.) o ReverTra Ase (TOYOBO Co. Ltd.) de acuerdo con los protocolos adjuntos.

(6) Clasificación

Utilizando el clasificador de células para uso general, el liposoma fluorescente se clasifica únicamente de acuerdo con el manual. Cuando se utilizan los tintes de fluorescencia, se realiza adecuadamente la compensación de la fluorescencia, y el área del liposoma objetivo se especifica a partir de la distribución de la intensidad fluorescente. Concretamente, se hace reaccionar la muestra control que tiene una función similar al péptido objetivo, y luego se especifica el área fluorescente en un histograma, el liposoma fluorescente se fracciona selectivamente de la misma área con la muestra objetivo.

Por ejemplo, se diseñan péptidos tipo péptido antibacterianos que codifican el ADN para unirse a la membrana celular, tales como Magainina 2, PGLa, melitina y similares. Anteriormente, estos péptidos antibacterianos y liposomas marcados con fluorescencia se hacen reaccionar para especificar el área de fluorescencia utilizando el clasificador celular. Luego, haciendo referencia a las propiedades del péptido antibacteriano, se diseña el ADN que codifica el péptido que se une al liposoma. De acuerdo con el diagrama de análisis del clasificador de células, se rodea un área similar a la especificada para fraccionar el conjugado liposómico al que se une el péptido objetivo que se va a fraccionar (en adelante, a veces se le denomina "conjugado liposómico fluorescente").

Se agita la solución de conjugado de liposoma después de la clasificación mediante vórtice y similares para liberar la molécula presentada de ADNc (el conjugado ARNm-proteína, o el conjugado ARNm/ADNc-proteína) del conjugado de liposoma. A continuación, se centrifuga la solución para separar una fase orgánica que contiene lípido y una fase acuosa que contiene la molécula de presentación de ADNc. El conjugado ARNm-proteína o el conjugado ARNm/ADNc-proteína puede ser purificado utilizando precipitación con etanol o purificación mediante columnas de ácidos nucleicos de la molécula de presentación de ADNc disuelta en la fase acuosa.

(7) Preparación de la muestra de PCR

El conjugado ARNm-proteína obtenido a través de la purificación mencionada anteriormente puede ser inmovilizado en la fase sólida deseable cuando se lleva a cabo la transcripción inversa. Como la fase sólida, por ejemplo, se mencionan, por ejemplo, perlas tales como perlas de estireno, perlas de vidrio, perlas de agarosa, perlas de sefarosa y similares; sustratos tales como sustrato de vidrio, sustrato de silicona (cuarzo), sustrato de plástico, sustrato de metal (por ejemplo, sustrato de oro); materiales tales como materiales de vidrio, plástico y similares; membrana hecha de material tal como nitrocelulosa, fluoruro de polivinilideno (PVDF) y similares.

Cuando la fase sólida está hecha de materiales plásticos tales como perlas de estireno, sustrato de estireno y similares, el conector o una parte del mismo puede estar unido directamente covalentemente utilizando el método convencional (Qiagen, véase LiquiChip Applications Handbook y similares). Cuando la biotina o su derivado se une al conjugado ARNm/ADNc-proteína, el conjugado se une fácilmente a la fase sólida al unir la avidina a la fase sólida.

Se retiraron las perlas del conjugado ARNm/ADNc-proteína obtenido mediante inmovilización para recuperar el conjugado conector-ARNm/ADNc. En primer lugar, se lavan las perlas magnéticas con el tampón de lavado deseado, y posteriormente, se incuba el agente liberador en el mismo y se incuba, para liberar el conjugado conector-ARNm/ADNc escindido en el sitio de escisión. Por ejemplo, como tales, pueden utilizarse los tampones de lavado, 1 X de tampón de lavado con etiqueta His (que contiene fosfato sódico 10 a 30 mM (pH 7,4), NaCl 0,25 a 0,75 M, imidazol 10 a 30 mM, Tween-20 del 0,025 al 0,1 %), o 1 X de tampón NEB 4. Además, como agente liberador, se puede utilizar enzima de degradación de ARN con la concentración deseada, por ejemplo, 1 X de tampón de lavado de etiqueta His que contiene de 500 a 1.500 U de RNasa T1, o 1 X de tampón NE que contiene 10 U de Endonucleasa V (New England Biolabs) y similares.

El conjugado conector-ARNm/ADNc puede ser purificado utilizando perlas de purificación de proteínas marcadas con His y similares. Como estas perlas de purificación de proteínas marcadas con His, puede utilizarse His Mag Sepharose Ni (GE healthcare) y similares. Las perlas de purificación de proteínas marcadas con His se lavan previamente con tampón de lavado con etiqueta His. A continuación, se añaden los conjugados conector-ARNm/ADNc recolectados a las perlas de purificación de proteínas marcadas con His lavadas y se incuban en las condiciones deseadas. Luego, se lavan las perlas con tampón de lavado con etiqueta His, y se añade tampón de elución de proteínas con etiqueta His y se agita en las condiciones deseadas para obtener el conjugado conector-ARNm/ADNc purificado.

El conjugado conector-ARNm/ADNc purificado es amplificado utilizando el método de PCR con los cebadores deseados, y se puede preparar una biblioteca de ADN que comprenda las secuencias codificantes deseadas. Por ejemplo, el conjugado conector-ARNm/ADNc purificado contenido en la solución es precipitado utilizando, por ejemplo, el coprecipitante (Quick-Precip Plus Solution, EdgeBio), y luego se añade una mezcla de reacción PCR para llevar a cabo el programa de PCR deseado.

Además, la presente invención es explicada cuando se utiliza estreptavidina como la molécula diana, y se utiliza el aptámero de ARN como la molécula de detección de diana como un ejemplo.

(1) Fabricación del aptámero de ADN y ARN

Como aptámero de ARN que se une a la molécula diana, se puede utilizar estreptavidina, conocido como aptámero de ARN de unión a estreptavidina (en adelante, a veces se le conoce como "aptámero de SAB-ARN"). Por ejemplo, se construyen tanto ADN del aptámero de SAB-ARN como aptámero de ARN al que no se une la estreptavidina (en adelante, a veces se denomina "aptámero de SAN-ARN") como la secuencia que tiene la secuencia promotora T7 en el extremo 5' terminal de ambos aptámeros de ARN para fabricar el ARN objetivo después de la transcripción.

Cuando se fabrica el ADN del aptámero de SAB-ARN, se preparan y utilizan respectivamente los cebadores que tienen las siguientes secuencias que se muestran en la siguiente Tabla 2. Entre los cebadores 5', la secuencia del promotor ^{T7 está el tercer al 22o} A^dN.

De manera similar, cuando se fabrica ADN del aptámero de SAN-ARN, se fabrica el cebador (mostrado como Secuencia N° 12) que tiene la siguiente secuencia y se utiliza junto con el cebador que tiene la secuencia mostrada como Secuencia N° 11. Entre estos cebadores 5', los números 3 a 22 de la secuencia de aminoácidos muestran la secuencia del promotor T7.

[Tabla 2]

cebador secuencia Secuencia N°

AGTAATACGACTCACTAT AGGGAGT CGACCGACCA 10

^5'

GAAT CAT GCAAGT GCGTAAGATAGTCGC GGGCCGG GGGCGTATTATGTGCGTCTACATCTAGACTCAT

3' ATGAGTCTAGATGTAGACGCACATA 11

^5' AGTAATACGACTCACTAT AGGGAGT CGACCGACCA 12

GAAATGGATAACAAATTCAACAAAGAACAACAATA TGTGCGTCTACATCTAGACTCAT

Se prepara una mezcla de reacción para la síntesis de ADN que contiene una polimerasa, por ejemplo, la ADN polimerasa Taq y dNTP, y se añaden dos cebadores descritos anteriormente para llegar a la concentración predeterminada; y luego se sintetiza cada ADN mediante el método de extensión por solapamiento. Como mezcla de reacción de síntesis de ADN, se puede utilizar la incluida en el kit comercialmente disponible como PrimeSTAR (Takara Bio Inc.). Además, las condiciones de la extensión por solapamiento son las siguientes: 30 segundos a 90 segundos de 95 a 98 °C, de 5 a 10 segundos de 60 a 62 °C, de 20 a 40 segundos de 71 a 73 °C, y luego enfriamiento hasta 10 °C. A continuación, se lleva a cabo la purificación del ADN de acuerdo con el método convencional. La purificación se lleva a cabo utilizando, por ejemplo, el kit comercialmente disponible, tal como FavorPrep PCR Clean-Up Mini Kit (Favogen), de acuerdo con el manual de instrucciones adjunto.

A continuación, se prepara la mezcla de reacción de transcripción que contiene ARN polimerasa, tal como la ARN polimerasa T7 y rNTP, y se añaden los ADN purificados a la cantidad predeterminada, y luego se realiza la transcripción incubando a 37 °C de 20 minutos a 1 hora. A continuación, se somete a purificación, por ejemplo, a corte o al kit tal como Rneasy minElute Cleanup kit (QIAGEN) y similares de acuerdo con los manuales de instrucciones adjuntos. El aptámero de ARN unido a SA obtenido y el aptámero de ARN no unido a SA son sometidos a unión con la estructura de forma esférica.

(2) Inmovilización de la molécula diana en la estructura de forma esférica

Para unir la estreptavidina como la molécula diana a la estructura esférica, por ejemplo, puede elegirse la estructura esférica modificada con los grupos funcionales tal como el grupo carboxi y similares. Como estas estructuras esféricas, se puede comprar y utilizar para la comercialmente disponible, por ejemplo, perlas de sílice tal como Sicastar (la marca registrada: Micromod), perlas de látex tal como Micormer (la marca registrada: Micromod) y similares.

Cuando se elige la estructura esférica modificada con grupo carboxilo, el grupo carboxilo es activado con compuesto de imida para formar el éster de NHS, y luego se une a estreptavidina como la proteína. Por ejemplo, como la estructura esférica, se utilizan las perlas de sílice modificadas con grupo carboxilo, en primer lugar, se añaden aproximadamente 10 a aproximadamente 30 |jL de las perlas de sílice en el tubo centrifugado y se centrifugan con aproximadamente 15.000 rpm (aproximadamente 20.000 3 g) durante 3 a 7 minutos a temperatura ambiente; y luego se elimina el sobrenadante. Posteriormente, se añaden aproximadamente 80 a aproximadamente 120 jL de N, N -dimetilformamida (en adelante, a veces abreviado "DMF") al tubo y se agita lo suficiente; y luego, se centrifuga con aproximadamente 15.000 rpm (aproximadamente 20.000 X g) durante aproximadamente 3 a 7 minutos para eliminar el sobrenadante (la etapa de lavado),

La etapa de lavado se repite varias veces, y luego se añaden aproximadamente 40 a aproximadamente 60 ^j L de aproximadamente 100 a aproximadamente 300 mM de solución NHS, y aproximadamente 40 a aproximadamente 60 jL de aproximadamente 100 a aproximadamente 300 mM de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (en adelante, algunas veces se abrevia "EDC".), luego se agita entre la temperatura de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 °C durante aproximadamente 1 a aproximadamente 3 horas. Después de agitar, se centrifuga con aproximadamente 15.000 rpm (aproximadamente 20.000 x g) durante aproximadamente 3 a 7 minutos para eliminar el sobrenadante. Aquí, la etapa de lavado se repite varias veces. Después del lavado, se añaden aproximadamente 80 a aproximadamente 120 jL de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 jM de estreptavidina y se agita durante la noche a temperatura ambiente.

Después de agitar, se centrifuga con aproximadamente 15.000 rpm (aproximadamente 20.000 x g) durante aproximadamente 3 a aproximadamente 7 minutos para eliminar el sobrenadante. A continuación se añaden aproximadamente 80 a aproximadamente 120 ^j L de agua ultrapura y se agita suficientemente, y luego se elimina el sobrenadante. La etapa de lavado se repite varias veces. Por último, se añaden aproximadamente 10 a aproximadamente 30 jL de tampón HEPES- Na (pH de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 7,6) para dispersar las perlas de sílice inmovilizadas con estreptavidina (estructura esférica positiva) para obtener la solución que contiene la estructura esférica positiva.

Para la preparación de la estructura esférica, se puede utilizar la estructura esférica que tiene etiquetas rojas, azules o verdes en ella, además de la que tiene el grupo funcional en ella, porque pueden mejorar la eficacia de la clasificación. Como la estructura esférica que tiene tales etiquetas, pueden utilizarse las comercialmente disponibles. Aquí, la etiqueta contiene por ejemplo proteínas fluorescentes, tintes fluorescentes y similares.

(3) Formación del conjugado de forma esférica y su clasificación

La estructura esférica positiva (la estructura de forma esférica P) con molécula diana inmovilizada (estreptavidina), la estructura esférica negativa (la estructura de forma esférica N) sin molécula diana inmovilizada, el aptámero de SAB-ARN y el aptámero de SAN-ARN se añaden a la estructura esférica como se describe anteriormente en el tampón HEPES-Na (PH de aproximadamente 7,2 a 7,4) que contiene 30 % de glicerol para que sea la concentración predeterminada. A continuación, la mezcla se hace reaccionar a temperatura ambiente entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente una hora y media para obtener el conjugado de forma esférica positivo (el conjugado de forma esférica P), en donde el aptámero de SAB-ARN está principalmente unido a la estructura de forma esférica P, el conjugado de forma esférica negativo (el conjugado de forma esférica N), en donde el aptámero de SAN-ARN está principalmente unido a la estructura esférica negativa, son obtenidos.

Se añade la concentración predeterminada de tampón HEPES-Na (pH de aproximadamente 7,2 a 7,4) tanto al conjugado de forma esférica P como al conjugado de forma esférica N y, a continuación, se someten a la clasificación mediante FACS. Cuando se realiza la clasificación, se ajusta para que coincida con las etiquetas de la estructura esférica y los tamaños empleados y se lleva a cabo según el manual de instrucciones adjunto a la máquina empleada.

EJEMPLO

A continuación, se explicará la presente invención en forma detallada, ilustrando los ejemplos.

(Ejemplo 1) Preparación de la estructura esférica etiquetada

Según lo descrito anteriormente, puesto que el liposoma puede utilizarse para recubrir la superficie de las perlas, se utiliza como la molécula de forma esférica.

(1) Preparación de los reactivos

(1-1) Solución de cloroformo que contiene fosfolípido

Como el fosfolípido que forma el liposoma, se disolvieron tanto dioleoil fosfatidilcolina como dioleoil fosfatidilglicerol (ambos de Avanti) en cloroformo (Wako Pure Chemical industries) para que su concentración final sea de 10 mM para preparar soluciones de cloroformo que contengan el fosfolípido como se muestra en la siguiente Tabla 3.

T l 1

(1-2) Preparación de la solución de membrana interna y la solución de membrana externa del liposoma fluorescente

Para preparar el liposoma con la etiqueta fluorescente (en adelante, a veces se le denomina "liposoma fluorescente"), la solución de membrana interna del liposoma que contiene la sustancia fluorescente con la composición mostrada en la siguiente Tabla 4, y la solución de membrana externa del liposoma con la composición mostrada en la siguiente tabla 5, respectivamente. Se compraron sacarosa, glucosa, NaCl, Tris-HCl mostrados en la tabla de Wako Pure Chemical Industries, la fluoresceína amina se compra en Sigma-Aldrich, y se compró la transferrina Alexa Fluor 594 (en adelante, algunas veces denominada simplemente "Alexa") en Life Technologies.

T l 41

Tabla 5

(2) Preparación del liposoma

El liposoma se preparó utilizando emulsión de agua/aceite de la siguiente manera. En primer lugar, se colocaron 20 |jL de la solución de cloroformo que contenía el fosfolípido preparada anteriormente (1) en el tubo de ensayo Durham con una longitud total de 30 mm (Maruemu Corp.); se sopló gas nitrógeno a la solución de cloroformo para evaporar el cloroformo para formar una película delgada del fosfolípido en la superficie interna del tubo de ensayo Durham. El tubo de ensayo Durham con la película delgada de fosfolípido se dejó en reposo en un desecador con una bomba de vacío para eliminar el cloroformo restante más de 1 hora. Se sacó el tubo de ensayo Durham del desecador y, a continuación, se añadieron 150 ml de parafina líquida (Wako Pure Chemical Industries) al tubo, y se colocó en un homogeneizador ultrasónico a 60 °C durante más de 1 hora para disolver el fosfolípido en parafina líquida para preparar la solución de parafina que contiene fosfolípido.

A continuación, se añadieron 20 pL de la solución interna de la membrana liposómica que contenía Alexa, la etiqueta fluorescente, en la solución de parafina que contenía fosfolípido, y luego se mezcló vigorosamente utilizando el homogeneizador ultrasónico durante más de 30 segundos. A continuación, se añadieron suavemente 200 pL de la solución externa de la membrana liposómica en la solución, y la mezcla se dejó en reposo durante más de 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, se centrifugó utilizando la microcentrífuga para múltiples usos, SWING MAN (Hi-tech Inc.) a temperatura ambiente con 4.200 X g durante 10 minutos. Después de la centrifugación, se eliminó la parafina líquida situada en la parte superior de la solución utilizando la pipeta motorizada electrónica (pipetman) para recoger la solución que contenía el liposoma encapsulando la etiqueta fluorescente.

(3) Purificación del liposoma que encapsula la etiqueta fluorescente

La solución de liposomas que encapsula la etiqueta fluorescente recogida como se ha descrito anteriormente (en adelante, se denomina a veces "liposoma fluorescente") se centrifugó a temperatura ambiente con 1.000 X g durante 10 minutos para eliminar los materiales en suspensión, como los fosfolípidos agregados no formados en el liposoma y similares, para purificar el liposoma fluorescente.

(4) Observación mediante el uso de un microscopio láser confocal

El liposoma fluorescente preparado como se describió anteriormente se observó utilizando el microscopio de la siguiente manera. En primer lugar, se cortó una lámina de silicona de 200 pm de espesor (AS ONE Corporation) en piezas de tamaño de 20 X 20 mm (un tamaño de un cubreobjetos), y luego se formó una abertura de un diámetro de 5 mm en el centro de las piezas utilizando el punzón de papel disponible comercialmente. Se colocó la pieza de silicona que tiene la abertura sobre el cubreobjetos, y luego se tiraron aproximadamente 5 pL de la solución que contenía el liposoma fluorescente en la forma hueca por la abertura, y se cubrió con otros cubreobjetos para preparar la muestra para la observación. La muestra se colocó en la plataforma del microscopio láser confocal FV-1000D (Olympus Corporation) para observar la solución liposómica fluorescente purificada (en adelante, a veces denominada "suspensión liposómica fluorescente").

Como resultado, se determinó que la encapsulación de fluoresceína amina o transferrina - Alexa Fluor 594 no afectó la formación de los liposomas (Fig. 3A), y el tamaño de las partículas de los liposomas formados estaba entre varios pm y varias decenas de pm. Asimismo, se confirmó que ambos tintes fluorescentes tienen suficiente intensidad fluorescente para la observación mediante el microscopio confocal (Figs. 3B y 3C).

(5) Especificación de las áreas del liposoma fluorescente mediante FACS

Como clasificador de células, se empleó FACS. Antes de fraccionar la suspensión liposómica fluorescente mediante FACS, se confirmó la estabilidad del liposoma, que afecta a la reproducibilidad del experimento. Para la confirmación, se utilizó Magainina 2 (Sigma-Aldrich), que tiene las propiedades de unirse a la membrana del fosfolípido para su destrucción.

Dependiendo de la cantidad agregada de Magainina 2, se cambió el histograma por FACS. A partir de los resultados, se especificó el liposoma que se va a fraccionar. En primer lugar, se analizó únicamente la suspensión liposómica fluorescente con FACS. Posteriormente, se añadieron a la suspensión 400 pL de la suspensión liposómica fluorescente y 400 pM de Magainina 2 (conc. final 10 pM o 30 pM), y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, se filtró la suspensión utilizando un filtro con 40 pm del tamaño de poro, y se analizó la intensidad fluorescente del filtrado mediante FACS (Clasificador Celular SH800: SONY Business Solution).

Como resultado, se confirmó que la muestra sin Magainina 2 tenía dos áreas, en una de las áreas, ambas de 2 intensidades fluorescentes eran altas (en adelante, a veces denominadas “áreas altas”), y ambas eran bajas (en adelante, a veces denominada "área baja"). (Fig. 4A). Por otro lado, en la muestra con 10 pM de Magainina 2, el área baja desapareció (Fig. 4B); en la muestra con 30 pM de Magainina, tanto el área alta como el área baja desaparecieron (Fig. 4C). Así, se confirmó que los liposomas fluorescentes existían tanto en las áreas altas como en las bajas. También, el área más baja era más amplia comparada con el área alta, se fraccionó el liposoma del área alta para el cribado de la presente invención, considerando la reproducibilidad del fluorescente.

(Ejemplo 2) Preparación del liposoma fluorescente

(1) Fabricación de la biblioteca de ADN

El péptido reaccionado con la membrana fosfolipídica debería tener la secuencia que era rica en lisina y arginina, y forma fácilmente una estructura anfifílica de hélices a en la membrana fosfolipídica. Por lo tanto, se diseñó la biblioteca de ADN líneas 5' - 3' que se muestran en A y B en la Fig. 5 utilizando el diagrama de rueda de hélice a, para ordenar las posiciones de aparición de los aminoácidos polares que contienen lisina y arginina en la mitad derecha del diagrama de la rueda (A), y los aminoácidos no polares en la mitad izquierda del mismo (B).

La biblioteca de ADN se fabricó de la siguiente manera. En primer lugar, se preparó una secuencia con la longitud completa de 244 meros como 3 fragmentos, región aleatoria (Secuencia N° 3), región R-Ytag (Secuencia N° 4) y región T7-PRO-SD (Secuencia N° 5), ya que cada fragmento incluía una región de solapamiento respectivamente. A continuación, estos fragmentos se extendieron mediante PCR de extensión para obtener la secuencia de longitud completa. Se ordenó la síntesis de toda la región aleatoria, la región R-Ytag y la región T7-PRO- SD a Tsukuba Oligo Service Co., Ltd. Mediante su utilización, se llevó a cabo la PCR de extensión de acuerdo con el procedimiento mostrado en la figura esquemática de la Fig. 6 para preparar tres fragmentos de ADN con la siguiente secuencia descrita anteriormente.

[Secuencia N° 3]

5 ^'

ATTCC A CC AT GGGC GGTBDHBDHK SWRYMK SWK SWRYMRYMK SWK SWR

YMKSWKSWRYMRYMKSWBDHBDHBDHBDHKSWRYMKSWKSWRYMRY

MK SWK SWRYMK SWK SWRYMRYMK SWBDB GGGGGAGGC AGC C A 3'

En la secuencia descrita anteriormente, la frecuencia de los nucleótidos distintos de ATCG en lugar de ATGC (A: T: G: C) era como se muestra en la siguiente Tabla 6.

[Tabla 6]

Frecuencia de expresión de nucleótidos distintos de ATGC

Posición expresada A T G C

R 0,2 0,15 0,35 0,3

Y 0,1 0,4 0,15 0,35

M 0,15 0,3 0,25 0,3

K 0,55 0 0,25 0,2

S 0,6 0,1 0,2 0,1

W 0,4 0,1 0,4 0,1

B 0,33 0,07 0,35 0,25

D 0,38 0,25 0,2 0,17

H 0,1 0,3 0,3 0,3

[Secuencia N° 4] 5' TTTCCCCGCCGCCCCCCGTCCTATGGCTGCCTCCCCC 3'

[Secuencia N° 5]

5 ^'

G AT C C C GC G A A AT TA ATAC G AC T C AC TATAGGG AG AC C AC A AC GGT TT C C C T C TAG A A ATA AT TT T GTT TA AC T TTA AG A AGG AG ATT C C AC C AT GGGC GG 31

La PCR 1 de extensión mostrada en la Fig. 1 se llevó a cabo utilizando PrimeSTAR (marca registrada) HS ADN Polimerasa (Takara Bio Inc.). Se ajustó la mezcla de reacción que tenía la composición mostrada en la siguiente Tabla 7 a 25 |jL con agua ultrapura, se amplificó su región aleatoria con el siguiente programa de PCR: (a) a 96 °C (2 minutos), (b) a 94 °C (20 segundos), (c) a 51 °C (5 segundos), (d) a 72 °C (30 segundos), y (e) a 72 °C (2 minutos), y se llevaron a cabo las etapas (b) a (d) en 5 ciclos.

T l 7

En la PCR 2 de extensión mostrada en la Fig. 6, se ajustó la mezcla de reacción mostrada en la siguiente Tabla 8 a 25 |jL con agua ultrapura, se amplificó la región T7-PRO-SD con el siguiente programa de PCR: (a) a 96 °C (2 minutos), (b) a 94 °C (20 segundos), (c) a 58 °C (5 segundos), (d) a 72 °C (30 segundos), y (e) a 72 °C (2 minutos), y se llevaron a cabo las etapas (b) a (d) en 5 ciclos.

T l 1

(2) Preparación de la molécula de unión diana (ligación del ARNm y el conector)

(2-1) Preparación de ARNm

En primer lugar, se llevó a cabo la transcripción de la biblioteca de la ADN obtenida como se describió anteriormente a ARNm de la siguiente manera.

Se ajustó la mezcla de reacción que se muestra en la siguiente Tabla 9 a 20 jL con agua ultrapura, y se hizo reaccionar a 37 °C durante 4 horas. A continuación, se añadió 1 jL de DNasa libre de RNasa RQ-1 (Promega) a la mezcla de reacción, y luego se hizo reaccionar aún más a 37 °C durante 20 minutos. Después de completar la reacción, se llevó a cabo la purificación inmediatamente utilizando el kit de limpieza Rneasy minElute (QIAGEN), de acuerdo con el manual de instrucciones adjunto.

(2-2) Unión del ARNm y el conector convencional

A continuación, se ligaron el ARNm obtenido y el conector-puromicina descritos más adelante de la siguiente manera. En primer lugar, se ajustó la mezcla de reacción mostrada en la siguiente Tabla 10 a 20 jL con agua ultrapura. Se incubó la mezcla de reacción a 90 °C durante 2 minutos y luego a 70 °C durante 1 minuto, y luego se enfrió a 4 °C. Finalmente, se mantuvo a 25 °C durante 1 hora para la hibridación. A continuación, se añadieron 1 jL de T4 polinucleótido quinasa, 1 jL de T4 ARN ligasa a la mezcla de reacción, y se incubaron adicionalmente a 25 °C durante 1 hora.

[Tabla 10]

Se fabricó el conector-puromicina (Fig. 9) utilizando el método descrito en la siguiente referencia.

Referencia: Mochizuki Y, Biyani M, Tsuji-Ueno S, Suzuki M, Nishigaki K, Husimi Y, y Nemoto N. (2011) One-pot preparation of mRNA/cDNA display by a novel and versatile puromycin-linker DNA. ACS Comb. Sci., 13, 478-485 Es decir, el "segmento de puromicina (PS)", y "segmento corto de biotina (SBS)", que se obtuvieron en GeneWorld Ltd. (Tokio, Japón), que eran oligonucleótidos modificados para ser utilizados en la fabricación del segmento de biotina caliente y el conector puromicina (segmento corto de biotina y conector puromicina (SBP)). El PS tiene la siguiente estructura.

5'-(S)-TC(F)-((Spc18) X 4)-CC-(Puro)-3'

Aquí, (S) representa el modificador de 5'-tiol C6, (F) representa fluoresceína -dT. (Puro) representa puromicina CPG, y (Spc18) representa el espaciador - fosforamidita 18. El SBS tiene la siguiente estructura.

5'-CC-(rG)C(T-B)C(rG)ACCCCGCCGCCCCCCG(T)CCT-3'

Aquí, (T) representa el modificador amino C6 dT, y (T-B) representa la biotina dT.

(rG) representa ribo G. EMCS se adquirió en Dojindo laboratories (Kumamoto, Japón). Se sintetizó químicamente el conector puromicina mediante entrecruzamiento de 2 segmentos (el segmento de puromicina (PS) y el segmento corto de biotina (SBS)) con EMCS (N-(6-maleimidocaproiloxi) succinimida).

De acuerdo con el método convencional, se confirmaron los productos de ligación mediante electroforesis PAGE al 6 %. Los resultados se mostraron en la Fig. 10. Como se muestra en la Fig. 10, sobre la base de las posiciones de bandas del ARNm de la biblioteca obtenido de la transcripción de la biblioteca de ADN, y ARNm unido al conector puromicina, se demostró que tanto la transcripción de la biblioteca de ADN a ARNm, como la ligación del ARNm y el conector puromicina se realizaron sin problemas, y luego se obtuvo el conjugado ARNm-conector.

(3) Formación del conjugado ARNm-proteína

El conjugado ARNm-conector, fraccionado mediante el uso de FACS según lo descrito anteriormente, se tradujo mediante el uso de un sistema de traducción libre de células de la siguiente manera. Se preparó la mezcla de reacción que tenía la composición mostrada en la siguiente Tabla 11 y se ajustó a 25 |jL con agua ultrapura, y luego se hizo reaccionar a 37 °C durante 15 minutos. A continuación, se añadieron 5 jL de KCl 3 M y 1,5 jL de MgCb 1 M a la mezcla de reacción. A continuación, se hizo reaccionar la mezcla adicionalmente a 37 °C durante 40 minutos para obtener el conjugado ARNm-proteína (la molécula de unión diana).

(4) Preparación del conjugado de liposoma fluorescente

Se mezclaron el liposoma fluorescente obtenido en el ejemplo 1 y el conjugado ARNm-proteína obtenido como se ha descrito anteriormente a temperatura ambiente para obtener el conjugado de liposoma fluorescente.

(5) Fraccionamiento del liposoma mediante FACS

Se cargó el tanque designado de FACS (Clasificador celular SH800: SONY Business solutions Corporation) con agua ultrapura hasta el volumen predeterminado y luego se puso en marcha el programa informático. Una vez ajustada la punta de clasificación, se realizó la operación de acuerdo con las instrucciones del programa informático. Durante la operación, se eliminaron las burbujas generadas en el filtro. Posteriormente, se llevaron a cabo la configuración de la trayectoria del flujo de la muestra y las condiciones de formación de las gotas para el fraccionamiento utilizando perlas especializadas para la configuración automática.

Cuando se analizaron y fraccionaron los conjugados liposómicos fluorescentes obtenidos mediante FACS, con anterioridad, se filtró la suspensión liposómica con el filtro con el tamaño de poro, 35 |jm, para evitar que la trayectoria del flujo se atascara con el liposoma. A partir de los resultados del análisis del histograma, se eligió un área alta para fraccionar el liposoma fluorescente objetivo.

(Ejemplo 3) Purificación del conjugado ARNm/ADNc-proteína y ADNc

(1) Remoción del liposoma fluorescente

Del liposoma fluorescente conjugado fraccionado en el ejemplo 2, se eliminaron los liposomas fluorescentes mediante centrifugación para obtener el conjugado ARNm-conector-proteína.

(2) Purificación mediante perlas magnéticas

Se lavaron las perlas magnéticas de estreptavidina (SA) (Dynabeads MyOne Streptavidin C1: Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones. A continuación, se tomó la cantidad necesaria para la inmovilización del conjugado ARNmproteína en un tubo Eppendorf, y se dejó el tubo en el soporte magnético durante 1 minuto. Después, se eliminó el sobrenadante y se resuspendió con la solución A (NaOH 100 mM, NaCl 50 mM). Después de dar un golpecito al tubo durante 1 a 2 minutos, el tubo se dejó reposar durante 1 minuto en el soporte magnético. Después, se repitió el mismo procedimiento una vez con la solución A, y luego se repitió el mismo procedimiento una vez con la solución B.

Se añadió un volumen igual del tampón de unión 2 x (Tris-HCl 20 mM que contenía EDTA 2 mM, NaCl 2 M, Tween 20 al 0,2 %, y EDTA 500 mM (pH 8,0)) al conjugado ARNm-proteína del que se eliminaron los liposomas fluorescentes, y se incubó con las perlas magnéticas de estreptavidina (SA) a temperatura ambiente durante 60 minutos. Se dejó el tubo Eppendorf en reposo en el soporte magnético durante 1 minuto, y luego se eliminó el sobrenadante. Se añadieron200 j L de 1 X tampón de unión al tubo, se le dio un golpecito durante 1 a 2 minutos. A continuación, el tubo se dejó reposar sobre el soporte magnético durante 1 minuto para eliminar el sobrenadante. El procedimiento se repitió dos veces para obtener el conjugado ARNm-proteína inmovilizado en las perlas magnéticas de estreptavidina (SA). (3) Síntesis de ADNc mediante transcripción inversa

Se añadió la mezcla de reacción con la composición mostrada en la siguiente Tabla 12 al conjugado ARNm-proteína inmovilizado y se incubó a 42 °C durante 30 minutos para la transcripción inversa. De este modo, se preparó el conjugado ARNm/ADNc-proteína que todavía está inmovilizado en las perlas magnéticas de estreptavidina (SA).

(4) Purificación de ADNc

Se lavó el conjugado ARNm/ADNc-proteína inmovilizado en las perlas magnéticas de estreptavidina (SA) una vez con 1 X tampón NEB 4. Luego, se les añadieron 40 |jL de 1 X tampón NEB 4 que contenía 10 U de endonucleasa V (New England Biolabs), y luego se incubaron a 37 °C durante 60 minutos para eluir la molécula de presentación de ADNc unida a las perlas magnéticas de estreptavidina (SA).

(Ejemplo 4) Cada análisis después del cribado

(1) Análisis mediante FACS

Análisis de los resultados del cribado mediante el uso de FACS del conjugado de liposoma fluorescente, obtenido en el ejemplo 1 a 3, en el primer al tercer ciclo de selección in vitro que se muestran en la Fig. 1A, que se muestra en las Figs. 11a a 11C. Estos histogramas mostraron que el tamaño o la densidad del conjugado de liposoma fluorescente que se va a fraccionar variaba; sin embargo, las propiedades de las propias regiones no se modificaban; y el conjugado de liposoma fluorescente pudo fraccionarse en el cribado con ciclos de selección in vitro.

(2) Electroforesis de los productos de PCR de la molécula de presentación de ADNc

Se eluyeron las moléculas de presentación de ADNc obtenidas en el Ejemplo 3, y se llevó a cabo la PCR utilizando los siguientes cebadores, de acuerdo con el método convencional. A continuación, de acuerdo con el método convencional, los productos de PCR fueron sometidos a electroforesis PAGE al 6 %. Los resultados de la electroforesis demostraron que la banda de productos de PCR se hizo más gruesa en el cribado posterior (los números de ciclo de selección in vitro se hicieron grandes). De este modo, se demostró que el número de moléculas obtenido cuando se fraccionó el área del liposoma mediante el uso de FACS. Por el contrario, como las bandas de los contaminantes se hicieron más finas, se demostró que se seleccionaron los productos de traducción sin las propiedades funciones al liposoma en la biblioteca de ADN (Fig. 12).

Cebador delantero:

GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCC (Secuencia N° 6) Cebador inverso: TTTCCCCGCCGCCCCCCGTCCT (Secuencia N° 7)

(2) Análisis de la secuencia de clonación

Para confirmar el grado de convergencia de la biblioteca de ADN en detalle, se realizó un análisis de secuencia de clonación mediante E. coli. El protocolo del experimento fue el siguiente.

Como medio líquido para la placa de cultivo de E. coli o medio de cultivo, se mezclaron 5 g de Bacto Trypton (Invitrogen), 2,5 g de extracto de levadura Bacto (Invitrogen) y 5 g de NaCl, y se ajustaron a 500 mL utilizando agua MilliQ, y luego se esterilizaron en autoclave. Después de que la temperatura del medio no superara los 40 °C, se añadieron 50 mg de ampicilina al medio. Para el medio de placa de cultivo de colonias de E. coli, se añadieron 7,5 g de agar para preparar la placa de agar. Antes de solidificar la placa de agar, se vertió el medio de agar en la placa para tener aproximadamente 0,5 cm de espesor. Inmediatamente antes de la siembra en placa de E. coli, se empaparon 100 |^jL de IPTG 100 mM y 20 |^jL de 50 mg/ml de X-Gal en cada placa.

Para expresar el ADN obtenido en los ciclos de selección in vitro en E. coli, se ligaron los ADN a los plásmidos. La reacción se realizó en la solución con la composición mostrada en la siguiente Tabla 13 que se preparó usando agua MilliQ durante 1 hora a temperatura ambiente.

T l 11

^{Se añadieron 3 jL de los productos de ligación al vector en 40} |^{j L de la solución de células competentes, y luego se} hicieron reaccionar durante 30 minutos con hielo. Después de la reacción, se dejaron reposar a 42 °C durante 30 segundos en el incubador para administrar el choque térmico. Posteriormente, se transfirieron en hielo de inmediato, se hicieron reaccionar nuevamente durante 2 minutos. A continuación, se añadieron 470 jL de medio de cultivo SOC al medio de cultivo a 37 °C durante 1 hora para agitar el cultivo para preparar la solución que contenía E. coli. Se sembraron en placas 100 jL de la solución que contenía E. coli en cada placa de cultivo y se incubaron a 37 °C durante 12 a 16 horas para formar colonias. Las colonias se recogieron individualmente y se transfirieron al medio líquido y, a continuación, se cultivaron a 37 °C durante 12 a 16 horas. Después del cultivo, se purificó el plásmido obtenido, de acuerdo con el manual de instrucciones adjunto al kit de purificación (Qiagen).

Se ordenó la secuenciación a Eurofins. De los resultados de la secuencia, uno de los aminoácidos secuenciados entre el péptido obtenido tiene la siguiente secuencia.

[Secuencia N° 8]

Thr Asp Gln Phe Lys Arg Cys Ala Arg Thr Met Glu Lys Val Thr Gln Cys Pro

Met lie Glu Thr Lys Glu Gly Ala Thr Lys lie Glu Ser Pro Pro Gln Arg

Las secuencias se dispusieron en dos ruedas de hélices a, que se dividieron con las posiciones de aparición de los aminoácidos de 1 a 18, y de 19 a 35 (Fig. 13A y B) para confirmar las posiciones de aparición tanto del aminoácido polar como del aminoácido no polar. La hélice anfifílica es similar a las de la secuencia inicialmente diseñada (Fig. 5), y mostró que el cribado objetivo se llevó a cabo.

(Ejemplo 5) Modificación del liposoma con la proteína de fusión de unión a membrana

Se preparó la unión de la proteína de fusión a la membrana del liposoma y, a continuación, se modificó la superficie del liposoma mediante el uso de moléculas diana.

En primer lugar, la secuencia que comprende la secuencia codificante del péptido LB -1 (Secuencia n° 9), que funciona como ancla contra la membrana del liposoma, y la secuencia que codifica el tinte rojo fluorescente, mCherry2, como molécula de etiqueta, fue sintetizada por Eurofins. De acuerdo con el método convencional, se insertó la secuencia en los sitios de multiclonación del vector pET-21a (+) (Fig. 14A). Luego, de acuerdo con el método convencional, se introdujo el vector en E. coli para expresar la proteína de fusión de LB-1 y mCherry2. Luego, de acuerdo con el método convencional, se realizó la purificación con la etiqueta de His para obtener la solución de proteína de fusión. En la Fig. 14B se mostró esquemáticamente la proteína de fusión obtenida.

[Secuencia N° 9]

Arg His Ser Lys Ser Leu Pro Ser Arg Val lie Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Arg Thr Leu Cys (F)

Se preparó la solución de liposoma sin el tinte fluorescente como en el Ejemplo 1, y luego se añadió la solución de proteína de fusión en la solución de liposoma para que la concentración de mCherry2 sea de 2 |^j M. Se excitó la muestra con una luz de 587 nm para ser observada. Como resultado, se observó que el fluorescente rojo de mCherry2 estaba localizado en el liposoma al que se le añadió la proteína de fusión (Fig. 15A). Por otro lado, el liposoma al que se le añadió únicamente mCherry 2 mostró baja intensidad fluorescente, y la superficie del liposoma no estaba suficientemente etiquetada (Fig. 15B). De este modo, se demostró que el péptido LB-1 se unió a la membrana del liposoma para modificar la molécula etiquetada, mCherry2.

(Ejemplo 6) Cribado mediante el uso del aptámero de ARN

El cribado se llevó a cabo utilizando perlas de sílice (Micromod) como molécula de forma esférica, aptámero de ARN de unión a estreptavidina (en adelante, a veces se le denomina "aptámero de SAB-ARN") o aptámero de ARN no unido a estreptavidina (en adelante, a veces se le denomina “aptámero de SAN-ARN”) como molécula de detección de diana.

(1) Preparación del aptámero de ADN y ARN

Para preparar ADN para la preparación del aptámero de SAB-ARN, se fabricaron los cebadores (cebador 5' y cebador 3') con la siguiente secuencia.

Cebador 5':

AGTA ATAC G AC T C AC TATAGGG AGT C G AC C G AC C AG A AT C AT GC A AGT GC

GTA AGATA GT C GC GGGC C GGGGGC GTAT TAT GT GC GT C TAC AT C TAG AC T C AT (Sequence No. 10)

Cebador 3': ATGAGTCTAGATGTAGACGCACATA (Secuencia N° 11)

Además, para preparar ADN para el aptámero de SAN-ARN, se fabricó el cebador (cebador 5') con la siguiente secuencia. El cebador 3' era el mismo que el utilizado en la fabricación de ADN para el aptámero de SAB-ARN.

Cebador 5':

AGTAATACGACTCACTATAGGGAGTCGACCGACCAGAAATGGATAACAAAT TCAACAAAGAACAACAATATGTGCGTCTACATCTAGACTCAT ( ^{Secuencia N°}

12)

Utilizando los cebadores descritos anteriormente, se preparó la mezcla de reacción mostrada en la siguiente Tabla 14; y luego, se fabricaron tanto el ADN para el aptámero de SAB-ARN como el ADN para el aptámero de SAN-ARN utilizando PrimeSTAR HS ADN Polimerasa (Takara Bio Inc.) con extensión por solapamiento (extensión por solapamiento). La extensión por solapamiento se llevó a cabo en las siguientes condiciones: reacción durante 1 minuto a 98 °C, 5 segundos a 61 °C, 30 segundos a 72 °C, y luego se enfrió a 10 °C. Después de la reacción, se sometió a la purificación mediante el kit FavorPrep PCR Clean-Up Mini Kit (Favorgen) de acuerdo con el manual adjunto.

T l 141

El ADN obtenido mediante la purificación descrita anteriormente se sometió a electroforesis en gel en condiciones de 200 V durante 30 minutos. Como resultado, se confirmó una banda de ADN de 103 pb para el aptámero de SAB-ARN en la senda del extremo derecho (Fig. 16). En la Fig. 16, M representa un marcador.

Utilizando el sistema de producción de ARN a gran escala rápido T7 RiboMAX (marca registrada) (Promega), se preparó la mezcla de reacción mostrada en la siguiente Tabla 15 y se llevó a cabo la transcripción a 37 °C durante 3 horas para obtener ARN. Después de la transcripción, se añadieron 4 |jL de RQ1 DNasa (Promega), y luego se hizo reaccionar a 37 °C durante 30 minutos para degradar el ADN de plantilla. A continuación, se cortó el gel para purificación y, a continuación, se realizó electroforesis en gel en condiciones de 200 V durante 30 minutos. Como resultado, se confirmó la banda del ADN objetivo para el aptámero de SAB-ARN, 84 meros, en la senda del extremo derecho (véase la Fig. 17). En la Fig. 17, M representa el marcador.

(2) Ensayo de unión para el aptámero de SAB-ARN

Con el fin de realizar un ensayo de unión para el aptámero de SAB-ARN obtenido anteriormente y la estreptavidina, se preparó el tampón de unión (pH 7,4). Se compraron HEPES, MgCh y NaCl en Wako Pure Chemical. La composición del tampón de ensayo se mostró en la siguiente Tabla 16 y se ajustó el volumen del tampón a 200 ml con agua ultrapura. La solución con la composición que se muestra en la Tabla 16 se ajustó a 800 ml añadiendo agua ultrapura para preparar un tampón de unión de glicerol al 30 % (pH7,4).

T l 11

Se añadieron 50 pmol, 200 pmol o 456 pmol de estreptavidina a 1,25 |jL del tampón de unión, y se ajustó el volumen de la mezcla de reacción con agua ultrapura para ajustar la concentración final del aptámero de SAB-ARN a 1 jM. Se hizo reaccionar la mezcla de reacción a 25 °C durante 1 hora, y se añadieron 2 jL de tampón de unión a glicerol al 30 %, y luego se sometió la muestra a electroforesis en gel sin poliacrilamida a 200 V durante 30 minutos. Como resultado, se demostró que apareció una banda con menor movilidad (apuntada con una flecha en la figura) con estreptavidina comparada con la que no tiene estreptavidina (Fig. 18). La razón de la menor movilidad fue la unión de estreptavidina y el aptámero de SAB-ARN. A partir de los resultados, se demostró que el aptámero de SAB-ARN se unió a la estreptavidina.

(3) Inmovilización de la estreptavidina en la estructura esférica

Como estructura esférica en la que se inmovilizó la molécula diana, la estreptavidina, se emplearon perlas de sílice cuya superficie se modificó con un grupo COOH, con un diámetro de partícula de 1,5 jm , y rodamina B de encapsulación (nombre del producto: Sicaster-red F, Micromod). Los grupos COOH de las perlas de sílice se convirtieron en éster de NHS y, a continuación, se inmovilizó la estreptavidina como molécula diana (una proteína) al grupo NHS-carboxilo en los siguientes protocolos.

En primer lugar, se añadieron 20 jL de la suspensión que contenía las perlas de sílice en el tubo de centrifugación, y se centrifugó el tubo a 15.000 rpm durante 5 minutos para eliminar el sobrenadante. Luego, se añadieron 100 jL de dimetilformamida (DMF) al tubo y luego se agitó. A continuación, se centrifugó el tubo a 15.000 rpm durante 5 minutos para eliminar el sobrenadante. Se repitió tres veces el procedimiento de añadir DMF al tubo y centrifugar a 15.000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente para eliminar el sobrenadante. Posteriormente, se añadieron al tubo 50 j L de solución NHS 200 mM y 50 jL de EDC 200 mM y se agitaron a 25 °C durante 2 horas.

Luego de terminar la agitación, se centrifugó la solución a 15.000 rpm durante 5 minutos para eliminar el sobrenadante. Se añadieron 100 jL de DMF al tubo y se agitaron bien, y luego se centrifugó el tubo a 15.000 rpm durante 5 minutos para eliminar el sobrenadante. Se repitió tres veces el procedimiento de añadir DMF al tubo y centrifugar para eliminar el sobrenadante. Posteriormente, se añadieron 100 jL de estreptavidina 10 jM (Funakoshi Co. Ltd.) al tubo y luego se agitó a 25 °C durante la noche. Después de agitar, se centrifugó el tubo a 15.000 rpm durante 5 minutos para eliminar el sobrenadante. Se repitió tres veces el procedimiento de añadir 100 ^j L de agua ultrapura en el tubo y centrifugar a 15.000 rpm durante 5 minutos para la eliminación. Luego, se añadieron al tubo 20 jL de la dilución de 4 veces del tampón de unión para dispersar las perlas de sílice (estructura esférica) a las que se unió la estreptavidina.

Se hicieron reaccionar la estructura esférica obtenida y la biotina etiquetada con fluoresceína de la siguiente manera y, a continuación, se determinó la cantidad de estreptavidina inmovilizada mediante la intensidad fluorescente de FITC. En primer lugar, se añadió 1 pmol de biotina 4-fluoresceína (Sigma-Aldrich Co. LLC.) a 1 jL de la dispersión, y se añadieron además 20 jL del tampón de unión. Después de incubación a 25 °C durante 1 hora, se centrifugó el tubo a 15.000 rpm durante 5 minutos para eliminar el sobrenadante. Luego, se repitió tres veces el procedimiento de añadir 20 jL de tampón de unión al tubo y centrifugar a 15.000 rpm durante 5 minutos para eliminar el sobrenadante. Por último, se añadieron 20 jL del tampón de unión al tubo para preparar la muestra para la determinación de la intensidad fluorescente.

Para evitar la afectación por la rodamina B en las perlas de sílice, se determinó la intensidad fluorescente de la biotina 4-fluoresceína liberada en el sobrenadante, obtenido de la centrifugación después de la incubación con la biotina 4-fluoresceína (en adelante, se denomina a veces "Sobre".), y la del sobrenadante lavado con el tampón de unión (en adelante, se denomina a veces "Lavado") para obtener la cantidad inmovilizada de estreptavidina (Fig. 19).

La suma de la intensidad fluorescente de Sobre más Lavado (en adelante, a veces se le denomina Sobre Lavado), y la de la biotina 4-fluoresceína (en adelante, a veces se le denomina "B4F") se estableció completamente como 100. La relación de Sobre Lavado: B4F era de 23,82: 76,18. Teniendo en cuenta que la cantidad medida de cada muestra fue de 20 pL y la de la biotina 4-fluoresceína añadida fue de 1 pmol, la cantidad total de biotina 4-fluoresceína liberada en el Sobre y Lavado fue de 0,31 pmol. Como resultado, la cantidad de biotina 4-fluoresceína unida a estreptavidina inmovilizada en 1 pL de las perlas de sílice utilizadas fue de 0,69 pmol.

(4) Clasificación mediante FACS

Se preparó cada tampón de clasificación con la composición mostrada en la siguiente Tabla 17 utilizando los siguientes 2 tipos de perlas de sílice: un tipo era las perlas de sílice con estreptavidina inmovilizada - rodamina B encapsulada (en adelante, se denomina a veces "perlas positivas". ); y otro tipo era las que no tenían estreptavidina inmovilizada y etiqueta de fluorescencia, Sicastar (Micromod, en adelante, se denomina a veces "perlas negativas"), aptámero de SAB-ARN y aptámero de SAN-ARN, y se ajustó la cantidad de tampón con agua ultrapura a 5 pL.

T l 171

El tampón de clasificación que contenía las composiciones que se muestran en la Tabla 17 se incubó respectivamente a 25 °C durante 1 hora; y luego se realizó la clasificación utilizando la solución diluida que se ajustó a 2 mL con el tampón de unión y el clasificador celular de alta velocidad MoFlo Astrois EQ (Beckman coulter). Como resultado, se confirmó que apareció el área que tenía rodamina BB cerca de alrededor de 103 (Fig. 20). La clasificación se llevó a cabo fijando el área como la Sicastar-redF fija, y la cercana a 100 a 101 como Sicastar.

(5) Selección

La solución de clasificación que contenía las perlas positivas o las perlas negativas se clasificó respectivamente con el clasificador celular. Se añadió un pL de biotina 4-fluoresceína 24 pM en 200 pL de la solución clasificada y se incubó a 25 °C durante 1 hora. Luego, se liberó el aptámero de SAB-ARN o el aptámero de SAN-ARN de las perlas positivas o de las perlas negativas con elución competitiva. A continuación, se centrifugaron los tubos que contenían la solución a 15.000 rpm durante 5 minutos, y se recogió el ARN en el sobrenadante utilizando precipitación con etanol.

Se añadieron 6,5 pL de agua ultrapura y 0,5 pL de cebador 3' 10 pM (secuencia N° 11]) a la solución que contenía el ARN recogido, y luego se incubaron a 65 °C durante 5 minutos. Se transfirieron los tubos en hielo, y luego, se añadieron 8 pL de mezcla de dNTP 2,5 mM, 4 pL del tampón y 1 pL de ReverTra Ace (TOYOBO Co. Ltd.) al tubo para realizar la transcripción inversa a 60 °C durante 30 minutos.

A continuación, se calentaron los tubos a 99 °C durante 5 minutos. Se preparó una mezcla de reacción PCR con la composición que se muestra en la siguiente Tabla 18 y se añadió a los tubos para realizar la PCR. Las condiciones de reacción fueron las siguientes: se repitieron 5 a 20 ciclos del ciclo que contenía a 98 °C durante 10 segundos, a 68 °C durante 5 segundos y a 72 °C durante 7 segundos, y luego se incubó la mezcla a 72 °C durante 1 minuto y se enfrió a 10 °C. Se utilizaron el cebador T7 con la secuencia mostrada como Secuencia N° 13, y el cebador 3' con la secuencia mostrada en Secuencia N° 11.

T l 11

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un método para el cribado in vitro de alta velocidad de una biblioteca seleccionada del grupo que consiste en una biblioteca de ADNc y una biblioteca de aptámeros de ácido nucleico que comprende las etapas de:

(i) preparar una estructura de forma esférica positiva o una estructura de forma esférica negativa, en donde una molécula diana es inmovilizada en la estructura de forma esférica positiva pero no es inmovilizada en la estructura de forma esférica negativa;

(ii) formar el conjugado de forma esférica positivo o el conjugado de forma esférica negativo mediante la unión, respectivamente, de una molécula de detección de diana capaz de unirse a la molécula diana, que se selecciona de la biblioteca que tiene el tamaño igual o superior a 1010 para formar la estructura de forma esférica positiva o la estructura de forma esférica negativa;

(iii) separar los conjugados de forma esférica positivos y negativos utilizando un clasificador de células por fluorescencia;

(iv) amplificar un ácido nucleico unido a la molécula diana en una superficie de los conjugados de forma esférica positivos separados o negativos separados mediante PCR;

(v) repetir las etapas (i) a (iv) utilizando todo el ADN de doble hebra obtenido en la etapa de amplificación en 5 veces; y

(vi) analizar el producto de PCR respectivo obtenido de los conjugados de forma esférica positivos y de los conjugados de forma esférica negativos, en donde la molécula de detección de diana es

(1) un conjugado ácido nucleico-conector obtenido de la biblioteca de ADNc utilizando el método de presentación de ADnc; o

(2) una secuencia de ácidos nucleicos obtenida del conjugado ácido nucleico-conector;

y en donde, si (1) es aplicable, la molécula de detección de diana se obtiene mediante el método de presentación de ADNc que comprende las siguientes etapas:

(a) preparar un ARNm deseable;

(b) unir el ARNm deseable con el conector utilizando 3-cianovinilcarbazol para obtener el conjugado ARNm-conector; (c) formar el conjugado ARNm-conector-proteína traduciendo el conjugado ARNm-conector; y

(d) llevar a cabo una transcripción inversa del conjugado ARNm-conector-proteína para obtener el conjugado ARNm/ADNc-conector-proteína.

2. El método para el cribado in vitro de alta velocidad de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la estructura de forma esférica es una cualquiera seleccionada del grupo que consiste en liposoma, perla de sefarosa, perla de sílice y perla de látex; o una cualquiera seleccionada del grupo que consiste en una perla de sefarosa recubierta con liposoma, una perla de sílice recubierta con liposoma, y una perla de látex recubierta con liposoma.

3. El método para el cribado in vitro de alta velocidad de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la estructura de forma esférica tiene un diámetro entre 0,5 |jm y 20 jm .

4. El método para el cribado in vitro de alta velocidad de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la molécula de detección de diana está unida directamente a la estructura de forma esférica a través de un grupo funcional en su superficie, o está unida a la misma a través de la molécula diana que está inmovilizada en la superficie de la estructura esférica.

5. El método para el cribado in vitro de alta velocidad de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el grupo funcional es uno cualquiera seleccionado del grupo que consiste en carboxilo, amino, hidroxilo y tiol.

6. El método para el cribado in vitro de alta velocidad de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la molécula diana es una cualquiera seleccionada del grupo que consiste en biotina, estreptavidina, azida obtenida utilizando química clic, y éster de N-hidroxi- succinimida (NHS).

7. El método para el cribado in vitro de alta velocidad de acuerdo con la reivindicación 1, en donde

el conector tiene un esqueleto y una cadena lateral;

el esqueleto comprende (p1) un sitio de unión a la fase sólida en el que el conector está unido a la fase sólida, (p2) un sitio de escisión en el que el conector es escindido de la fase sólida, (p3) un sitio de unión al ARNm compuesto por 3-cianovinilcarbazol cerca del extremo 3' terminal o cercano al mismo;

la cadena lateral comprende (s1) un sitio de unión al esqueleto, (s2) un espaciador que tiene un sitio de unión a la etiqueta de fluorescencia para el esqueleto, (s3) una etiqueta fluorescente unida al sitio de unión a la etiqueta fluorescente para el esqueleto, y (s4) puromicina como un sitio de unión al péptido,

en donde el sitio de escisión está dispuesto dentro del sitio de unión a la fase sólida.

8. El método para el cribado in vitro de alta velocidad de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la estructura de forma esférica comprende una combinación seleccionada del grupo que consiste en los siguientes (1) a (4): (1) el conjugado de forma esférica positivo con una etiqueta fluorescente incluida, el conjugado de forma esférica negativo sin la etiqueta fluorescente y la molécula detección de diana sin la etiqueta fluorescente;

(2) el conjugado de forma esférica positivo con la etiqueta fluorescente incluida, el conjugado de forma esférica negativo con la etiqueta incluida que tiene la fluorescencia diferente de la del conjugado de forma esférica positivo, y la molécula de detección de diana sin la etiqueta;

(3) el conjugado de forma esférica positivo sin la etiqueta fluorescente, el conjugado de forma esférica negativo con la etiqueta incluida, y la molécula de detección de diana con la etiqueta que tiene la fluorescencia diferente a la de la etiqueta fluorescente; y

(4) el conjugado de forma esférica positivo sin la etiqueta fluorescente, el conjugado de forma esférica negativo sin la etiqueta, y la molécula de detección de diana con la etiqueta fluorescente.

9. El método para el cribado in vitro de alta velocidad de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la etiqueta fluorescente es una cualquiera seleccionada del grupo que consiste en Alexa Fluor 594, Fluoresceína amina, FITC, Rodamina, mCherry2 y Punto Cuántico (Quantum Dot).

10. El método para el cribado in vitro de alta velocidad de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la etiqueta que tiene la fluorescencia diferente de la etiqueta fluorescente es una cualquiera de las moléculas fluorescentes seleccionadas del grupo que consiste en SYBR Gold, SYBR Green y Punto Cuántico (Quantum Dot).

11. El método para el cribado in vitro de alta velocidad de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde las etiquetas fluorescentes son excitadas utilizando dos longitudes de onda diferentes, y los conjugados de forma esférica que tienen la etiqueta fluorescente son excitados con ambas longitudes de onda diferentes, en donde los conjugados de forma esférica solo son separados utilizando el clasificador de células por fluorescencia.

12. El método para el cribado in vitro de alta velocidad de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la separación se realiza además bajo la coexistencia de un polipéptido particular para aplicar presión de selección.