JP5049136B2 - Ｎ末端アミノ酸が標識されたタンパク質の効率的な合成方法 - Google Patents
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Description
本発明はｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系によるタンパク質の合成方法に関し、更に詳しくはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系によるＮ末端アミノ酸が標識されたタンパク質の効率的な合成方法に関するものである。
タンパク質は、通常、２０種類のアミノ酸からなるポリペプチドであり、生体を構成する主要な分子のひとつである。微量にしか存在しないタンパク質自体の解析や、タンパク質を利用した解析を行なう場合、タンパク質を標識することが有効である。たとえば、タンパク質を蛍光色素で標識することによりタンパク質を直接観察できるようになり、様々な解析が可能になる。また、ビオチンで標識することにより、ビオチン・アビジンの相互作用を利用してタンパク質を固定化することができ、様々な利用が可能になる。このようにタンパク質を標識することによって、標識タンパク質自体の解析や、標識タンパク質を利用した様々な解析が可能になる。タンパク質の標識方法としては、従来、目的タンパク質を精製後、ポリペプチドを構成しているリジン残基やシステイン残基の側鎖を標識する方法が用いられてきた（非特許文献１：Ｓｏｕｔｈｗｉｃｋ ＰＬ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １１：４１８−４３０）。しかし、この方法では標識部位に選択性、特異性がなく、ポリペプチド鎖中のリジン残基やシステイン残基の側鎖がランダムに標識されていた。さらに、タンパク質の高次構造にも影響を与える場合が多かった。
近年、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を利用してタンパク質を合成しながら部位特異的に標識する手法が報告されている。代表的な手法として、アンバーサプレッション法（非特許文献２：Ｅｌｌｍａｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０２：３０１−３６）やＣ末端標識法（特許文献１：特開２０００−１３９４６８）などが知られている。
アンバーサプレッション法では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて標識を導入したい部位のアミノ酸をコードするコドンを終止コドンのひとつであるアンバーコドンに置き換えたＤＮＡ（もしくはｍＲＮＡ）からタンパク質を合成する。その際、タンパク質合成反応液に標識された非天然アミノ酸を結合させたサプレッサーｔＲＮＡを添加することで、アンバーコドンに置換した部位に標識アミノ酸が導入されたタンパク質を合成するものである。
Ｃ末端標識法は、標識したピューロマイシンを最適濃度で添加したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系でタンパク質を合成することにより、Ｃ末端特異的に標識が導入されたタンパク質を合成するものである。
また、タンパク質のＮ末端に特異的に標識する方法も報告されている（特許文献２：ＵＳ５，６４３，７２２，非特許文献３：Ｏｌｅｊｎｉｋ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５２−２６０）。
特開２０００−１３９４６８
ＵＳ５，６４３，７２２
Ｓｏｕｔｈｗｉｃｋ ＰＬ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １１：４１８−４３０
Ｅｌｌｍａｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０２：３０１−３６
Ｏｌｅｊｎｉｋ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５２−２６０
近年、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を利用してタンパク質を合成しながら部位特異的に標識する手法が報告されている。代表的な手法として、アンバーサプレッション法（非特許文献２：Ｅｌｌｍａｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０２：３０１−３６）やＣ末端標識法（特許文献１：特開２０００−１３９４６８）などが知られている。
アンバーサプレッション法では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて標識を導入したい部位のアミノ酸をコードするコドンを終止コドンのひとつであるアンバーコドンに置き換えたＤＮＡ（もしくはｍＲＮＡ）からタンパク質を合成する。その際、タンパク質合成反応液に標識された非天然アミノ酸を結合させたサプレッサーｔＲＮＡを添加することで、アンバーコドンに置換した部位に標識アミノ酸が導入されたタンパク質を合成するものである。
Ｃ末端標識法は、標識したピューロマイシンを最適濃度で添加したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系でタンパク質を合成することにより、Ｃ末端特異的に標識が導入されたタンパク質を合成するものである。
また、タンパク質のＮ末端に特異的に標識する方法も報告されている（特許文献２：ＵＳ５，６４３，７２２，非特許文献３：Ｏｌｅｊｎｉｋ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５２−２６０）。
報告されているＮ末端標識法は、タンパク質のＮ末端のメチオニン残基のαアミノ基特異的に標識されたタンパク質を合成する方法である。まず、開始ｔＲＮＡ（以下ｔＲＮＡｆＭｅｔと記載することもある）に結合したメチオニンのαアミノ基を目的の標識剤で標識する。その後、大腸菌Ｓ３０抽出液を用いてタンパク質を合成する際に、標識メチオニル開始ｔＲＮＡを添加して合成することによって、Ｎ末端特異的に標識されたタンパク質を合成する方法である。この従来法で用いていた大腸菌Ｓ３０抽出液には、添加した標識メチオニル開始ｔＲＮＡに対して競争的に阻害する内在性フォルミルメチオニル開始ｔＲＮＡも存在しているが、他の翻訳関連因子の活性に影響を与えずに内在性フォルミルメチオニル開始ｔＲＮＡおよび、またはメチオニル開始ｔＲＮＡのみを特異的に除去することは現実的には難しかった。そのため、従来法では、標識効率（合成されたタンパク質のうち、標識されたタンパク質の割合）が１−２％程度と極めて低かった（Ｏｌｅｊｎｉｋ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５２−２６０）。この標識効率では、その後の解析に用いるためには、標識されたタンパク質を未標識タンパク質から分離する必要があり、Ｎ末端標識タンパク質の利用法が一部に限られていた（Ｏｌｅｊｎｉｋ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５２−２６０）。
最近、内在性ｔＲＮＡを全く含まない合成系を用いて、αアミノ基がビオチン化されたメチオニンからペプチドを合成した例が報告されているが（Ｆｏｒｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３３：３５８−３６４）、この合成系では、解離因子が含まれていないために、合成ペプチドがリボソームから解離していない。また、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素やｔＲＮＡが全く含まれていないため、全てのコドンに対応するアミノアシルｔＲＮＡを加える必要があるなど、Ｎ末端標識タンパク質を利用する上では問題点が多い。
また、従来の方法では、メチオニル開始ｔＲＮＡのメチオニンのαアミノ基を標識した後、標識メチオニル開始ｔＲＮＡを未標識メチオニル開始ｔＲＮＡから分離することが不十分であった可能性も考えられた。この点についても改善しなければタンパク質合成系から開始ｔＲＮＡを除去しても標識効率の改善は難しい。
また、以上のように、タンパク質合成系、および添加する標識メチオニル開始ｔＲＮＡについての問題点を改善しても、タンパク質合成反応時間が長い場合は、添加した標識メチオニル開始ｔＲＮＡが通常の開始ｔＲＮＡとして再利用されるため標識効率が低下することが予想される。
発明者らは以下（１）から（３）のいずれか又はそれらを組み合わせることによりＮ末端特異的に標識されたタンパク質を高い効率で合成できることをはじめて見出し、本願発明を完成させた。
（１）開始ｔＲＮＡを除いた伸長ｔＲＮＡのみからなるｔＲＮＡ混合液（ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ））を用い、さらにメチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ、１０−フォルミル５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸を含まない合成系（ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系）を利用すること、
（２）標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡを分離精製すること、
（３）標識タンパク質合成反応時間も制御することによって、標識効率を上昇させる最適な条件を決定すること。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００５−３３２６７６号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
最近、内在性ｔＲＮＡを全く含まない合成系を用いて、αアミノ基がビオチン化されたメチオニンからペプチドを合成した例が報告されているが（Ｆｏｒｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３３：３５８−３６４）、この合成系では、解離因子が含まれていないために、合成ペプチドがリボソームから解離していない。また、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素やｔＲＮＡが全く含まれていないため、全てのコドンに対応するアミノアシルｔＲＮＡを加える必要があるなど、Ｎ末端標識タンパク質を利用する上では問題点が多い。
また、従来の方法では、メチオニル開始ｔＲＮＡのメチオニンのαアミノ基を標識した後、標識メチオニル開始ｔＲＮＡを未標識メチオニル開始ｔＲＮＡから分離することが不十分であった可能性も考えられた。この点についても改善しなければタンパク質合成系から開始ｔＲＮＡを除去しても標識効率の改善は難しい。
また、以上のように、タンパク質合成系、および添加する標識メチオニル開始ｔＲＮＡについての問題点を改善しても、タンパク質合成反応時間が長い場合は、添加した標識メチオニル開始ｔＲＮＡが通常の開始ｔＲＮＡとして再利用されるため標識効率が低下することが予想される。
発明者らは以下（１）から（３）のいずれか又はそれらを組み合わせることによりＮ末端特異的に標識されたタンパク質を高い効率で合成できることをはじめて見出し、本願発明を完成させた。
（１）開始ｔＲＮＡを除いた伸長ｔＲＮＡのみからなるｔＲＮＡ混合液（ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ））を用い、さらにメチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ、１０−フォルミル５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸を含まない合成系（ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系）を利用すること、
（２）標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡを分離精製すること、
（３）標識タンパク質合成反応時間も制御することによって、標識効率を上昇させる最適な条件を決定すること。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００５−３３２６７６号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
図１は、精製した蛍光標識メチオニル開始ｔＲＮＡ（蛍光化Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｆ Ｍｅｔの電気泳動図を示す。・・・Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ−ＳＥ（レーン１）、Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＳＥ（レーン２）、Ｃａｒｂｏｘｙｒｈｏｄａｍｉｎｅ ６Ｇ−ＳＥ（レーン３）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−ＳＥ（レーン４）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０−ＳＥ（レーン５）、Ｃｙ５−ＳＥ（レーン６）を用いた結果を示す。電気泳動後、ＵＶ（２５４ｎｍ）、Ｇｒｅｅｎ Ｌｉｇｈｔ（５２０ｎｍ）およびＲｅｄ Ｌｉｇｈｔ（６３０ｎｍ）で励起した場合の蛍光を検出した。
図２は、固相化プローブ法によるｔＲＮＡ Ｍｉｘからの開始ｔＲＮＡ除去を示す。・・・レーン１はｉｎ ｖｉｔｒｏ転写法により調製した開始ｔＲＮＡ（０．０１ Ａ２６０ｕｎｉｔ）、レーン２は除去前の大腸菌ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（０．０５ Ａ２６０ｕｎｉｔ）、レーン３はＤＮＡプローブＡを固定した樹脂により処理後のｔＲＮＡ Ｍｉｘ（０．０５ Ａ２６０ｕｎｉｔ）、レーン４はＤＮＡプロープＢを固定した樹脂により処理後のｔＲＮＡ Ｍｉｘ（０．０５ Ａ２６０ｕｎｉｔ）、レーン５はＤＮＡプローブＡを固定した樹脂に結合した開始ｔＲＮＡ（０．０１ Ａ２６０ｕｎｉｔ）、レーン６はＤＮＡプローブＢを固定した樹脂に結合した開始ｔＲＮＡ（０．０１ Ａ２６０ｕｎｉｔ）を示す。また、左側のパネルはメチレンブルーで全ｔＲＮＡを染色した図で、右側はノーザンブロッティングで開始ｔＲＮＡのみを検出した。
図３は、開始ｔＲＮＡを除去した大腸菌ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ）を用いたタンパク質合成を示す。・・・レーン１は、タンパク質分子量マーカー（上から、６６、４２、３０ｋＤａ）を示す。レーン２は、開始ｔＲＮＡおよびＦＤおよびＭＴＦを加えてタンパク質合成を行なった結果を示す。レーン３から６は、開始ｔＲＮＡを除去したｔＲＮＡ Ｍｉｘを用い、ＦＤおよびＭＴＦを加えていないタンパク質合成系に図示した量の開始ｔＲＮＡを加えて合成した結果を示す。
図４は、タンパク質合成反応時間の検討を示す。
図５は、最適化したＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭを用いたＮ末端特異的蛍光導入タンパク質の合成を示す。上側の図は銀染色により、ＩＣ３が導入されたカルモジュリンと導入されていないカルモジュリンを両方とも検出した結果で、下側の図は、Ｇｒｅｅｎ ＬｉｇｈｔでＩＣ３導入カルモジュリンのみを検出した結果を示す。
図６は、様々な蛍光標識メチオニル開始ｔＲＮＡ（蛍光化Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｆ Ｍｅｔを１０％酸性ＰＡＧＥ（７Ｍ Ｕｒｅａ）後、ＵＶ（２５４ｎｍ）、Ｂｌｕｅ Ｌｉｇｈｔ（４６０ｎｍ）、Ｇｒｅｅｎ Ｌｉｇｈｔ（５２０ｎｍ）およびＲｅｄ Ｌｉｇｈｔ（６３０ｎｍ）で励起した場合のＬＡＳ−３０００Ｍｕｌｔｉ ｃｏｌｏｒを用いた蛍光像を示す。なお、図の下に記載の蛍光標識名は、ｔＲＮＡ Ｍｉｘ，Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｆ Ｍｅｔ以外はすべてそれぞれの蛍光標識による蛍光化Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｆ Ｍｅｔを意味する。
図７は、様々な蛍光化Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｆ Ｍｅｔを用いたときのＣａＭのＮ末端蛍光標識効率への影響を示す。電気泳動後、Ｂｌｕｅ Ｌｉｇｈｔ（４６０ｎｍ）、Ｇｒｅｅｎ Ｌｉｇｈｔ（５２０ｎｍ）およびＲｅｄ Ｌｉｇｈｔ（６３０ｎｍ）で励起した場合のＬＡＳ−３０００ Ｍｕｌｔｉ ｃｏｌｏｒを用いた蛍光像、また銀染色による結果を示す。なお、図の下に記載の蛍光標識名は、マーカーとｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ以外は、それぞれの蛍光標識がされた蛍光化Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｆ Ｍｅｔを用いたときのカルモジュリン（蛍光化カルモジュリン）の合成を意味する。
図８は、Ｎ末端蛍光標識タンパク質とカルモジュリン結合ペプチド融合蛍光タンパク質（ＣＢＰ−ＥＣＦＰｈｔ）との結合活性評価を表し、電気泳動後Ｂｌｕｅ Ｌｉｇｈｔ（４６０ｎｍ）、Ｇｒｅｅｎ Ｌｉｇｈｔ（５２０ｎｍ）およびＲｅｄ Ｌｉｇｈｔ（６３０ｎｍ）で励起した場合のＬＡＳ−３０００ Ｍｕｌｔｉ ｃｏｌｏｒを用いた蛍光像を示す。
図９は、ＩＣ３標識Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｆ ＭｅｔおよびｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ）を使用して、カルモジュリン（ＣａＭ，１６．８ｋＤａ，レーン１），ＭｎｍＥ（４９．２ｋＤａ，レーン２），ＥＦ−Ｐ（２１．４ｋＤａ，レーン３），ＤＨＦＲ（１８．４ｋＤａ，レーン４），ＨＳＤＨ（２６．８ｋＤａ，レーン５）を合成した結果を示す。
図１０は、Ａに、Ａｌｅｘａ４８８標識Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｆ ＭｅｔおよびｔＲＮＡ Ｍｉｘを使用してアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ，レーン１），ガラクトシターゼ（β−Ｇａｌ，レーン２），クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ，レーン３），Ｅｎｏｌａｓｅ（レーン４），ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ，レーン５），緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ，レーン６），グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ，レーン７），インターロイキン８（ＩＬ８，レーン８），Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（レーン９），Ｒａｓ（レーン１０）を合成した結果を示す。 Ｂに、上記Ａのそれぞれにつき、合成後Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ１００（ミリポア社）にてリボソーム画分の除去を行った後に電気泳動を行った場合の結果を示す。なお、レーン１１（−ｔｅｍｐｌａｔｅ）は鋳型ＤＮＡを加えていない反応産物を示す。
図２は、固相化プローブ法によるｔＲＮＡ Ｍｉｘからの開始ｔＲＮＡ除去を示す。・・・レーン１はｉｎ ｖｉｔｒｏ転写法により調製した開始ｔＲＮＡ（０．０１ Ａ２６０ｕｎｉｔ）、レーン２は除去前の大腸菌ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（０．０５ Ａ２６０ｕｎｉｔ）、レーン３はＤＮＡプローブＡを固定した樹脂により処理後のｔＲＮＡ Ｍｉｘ（０．０５ Ａ２６０ｕｎｉｔ）、レーン４はＤＮＡプロープＢを固定した樹脂により処理後のｔＲＮＡ Ｍｉｘ（０．０５ Ａ２６０ｕｎｉｔ）、レーン５はＤＮＡプローブＡを固定した樹脂に結合した開始ｔＲＮＡ（０．０１ Ａ２６０ｕｎｉｔ）、レーン６はＤＮＡプローブＢを固定した樹脂に結合した開始ｔＲＮＡ（０．０１ Ａ２６０ｕｎｉｔ）を示す。また、左側のパネルはメチレンブルーで全ｔＲＮＡを染色した図で、右側はノーザンブロッティングで開始ｔＲＮＡのみを検出した。
図３は、開始ｔＲＮＡを除去した大腸菌ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ）を用いたタンパク質合成を示す。・・・レーン１は、タンパク質分子量マーカー（上から、６６、４２、３０ｋＤａ）を示す。レーン２は、開始ｔＲＮＡおよびＦＤおよびＭＴＦを加えてタンパク質合成を行なった結果を示す。レーン３から６は、開始ｔＲＮＡを除去したｔＲＮＡ Ｍｉｘを用い、ＦＤおよびＭＴＦを加えていないタンパク質合成系に図示した量の開始ｔＲＮＡを加えて合成した結果を示す。
図４は、タンパク質合成反応時間の検討を示す。
図５は、最適化したＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭを用いたＮ末端特異的蛍光導入タンパク質の合成を示す。上側の図は銀染色により、ＩＣ３が導入されたカルモジュリンと導入されていないカルモジュリンを両方とも検出した結果で、下側の図は、Ｇｒｅｅｎ ＬｉｇｈｔでＩＣ３導入カルモジュリンのみを検出した結果を示す。
図６は、様々な蛍光標識メチオニル開始ｔＲＮＡ（蛍光化Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｆ Ｍｅｔを１０％酸性ＰＡＧＥ（７Ｍ Ｕｒｅａ）後、ＵＶ（２５４ｎｍ）、Ｂｌｕｅ Ｌｉｇｈｔ（４６０ｎｍ）、Ｇｒｅｅｎ Ｌｉｇｈｔ（５２０ｎｍ）およびＲｅｄ Ｌｉｇｈｔ（６３０ｎｍ）で励起した場合のＬＡＳ−３０００Ｍｕｌｔｉ ｃｏｌｏｒを用いた蛍光像を示す。なお、図の下に記載の蛍光標識名は、ｔＲＮＡ Ｍｉｘ，Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｆ Ｍｅｔ以外はすべてそれぞれの蛍光標識による蛍光化Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｆ Ｍｅｔを意味する。
図７は、様々な蛍光化Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｆ Ｍｅｔを用いたときのＣａＭのＮ末端蛍光標識効率への影響を示す。電気泳動後、Ｂｌｕｅ Ｌｉｇｈｔ（４６０ｎｍ）、Ｇｒｅｅｎ Ｌｉｇｈｔ（５２０ｎｍ）およびＲｅｄ Ｌｉｇｈｔ（６３０ｎｍ）で励起した場合のＬＡＳ−３０００ Ｍｕｌｔｉ ｃｏｌｏｒを用いた蛍光像、また銀染色による結果を示す。なお、図の下に記載の蛍光標識名は、マーカーとｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ以外は、それぞれの蛍光標識がされた蛍光化Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｆ Ｍｅｔを用いたときのカルモジュリン（蛍光化カルモジュリン）の合成を意味する。
図８は、Ｎ末端蛍光標識タンパク質とカルモジュリン結合ペプチド融合蛍光タンパク質（ＣＢＰ−ＥＣＦＰｈｔ）との結合活性評価を表し、電気泳動後Ｂｌｕｅ Ｌｉｇｈｔ（４６０ｎｍ）、Ｇｒｅｅｎ Ｌｉｇｈｔ（５２０ｎｍ）およびＲｅｄ Ｌｉｇｈｔ（６３０ｎｍ）で励起した場合のＬＡＳ−３０００ Ｍｕｌｔｉ ｃｏｌｏｒを用いた蛍光像を示す。
図９は、ＩＣ３標識Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｆ ＭｅｔおよびｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ）を使用して、カルモジュリン（ＣａＭ，１６．８ｋＤａ，レーン１），ＭｎｍＥ（４９．２ｋＤａ，レーン２），ＥＦ−Ｐ（２１．４ｋＤａ，レーン３），ＤＨＦＲ（１８．４ｋＤａ，レーン４），ＨＳＤＨ（２６．８ｋＤａ，レーン５）を合成した結果を示す。
図１０は、Ａに、Ａｌｅｘａ４８８標識Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｆ ＭｅｔおよびｔＲＮＡ Ｍｉｘを使用してアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ，レーン１），ガラクトシターゼ（β−Ｇａｌ，レーン２），クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ，レーン３），Ｅｎｏｌａｓｅ（レーン４），ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ，レーン５），緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ，レーン６），グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ，レーン７），インターロイキン８（ＩＬ８，レーン８），Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（レーン９），Ｒａｓ（レーン１０）を合成した結果を示す。 Ｂに、上記Ａのそれぞれにつき、合成後Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ１００（ミリポア社）にてリボソーム画分の除去を行った後に電気泳動を行った場合の結果を示す。なお、レーン１１（−ｔｅｍｐｌａｔｅ）は鋳型ＤＮＡを加えていない反応産物を示す。
１．本願発明の概要
本願発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いてＮ末端特異的に標識が導入されたタンパク質を合成する方法及び該方法に用いるタンパク質合成系に関する。本願発明のタンパク質合成系には、例えば、系内のフォルミルメチオニル開始ｔＲＮＡの生成量に影響を与える成分の量など、その構成成分の量を調整できるものであれば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いることが可能である。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系としては、好適には、存在量が特定されている複数の成分からなり、鋳型核酸を添加することにより鋳型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じる再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系が挙げられる。
更に本願発明は、メチオニン以外の天然アミノ酸または非天然アミノ酸をＮ末端に有するタンパク質を調製する方法、または、αアミノ基が標識されたメチオニン（Ｍｅｔ）をＮ末端に有するタンパク質を調製する方法を包含し、より具体的には、αアミノ基が蛍光標識されたメチオニンをＮ末端に有するタンパク質を調製する方法を包含する。
また、本願発明の方法は、（１）ｔＲＮＡとして伸長ｔＲＮＡのみを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を調製する工程、（２）標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡを精製する工程、及び（３）前記ｔＲＮＡとして伸長ｔＲＮＡのみを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系により、前記精製された標識メチオニル開始ｔＲＮＡを用いて、Ｎ末端に標識されたメチオニン（Ｍｅｔ）を有するタンパク質を、反応時間を調整して、調製する工程を包含する。更に、本願発明の方法は、（１）ｔＲＮＡ Ｍｉｘから開始ｔＲＮＡが除去された、実質的に伸長ｔＲＮＡのみからなるｔＲＮＡ混合液を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を調製する工程、（２）標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡを精製する工程、及び（３）前記開始ｔＲＮＡが除去され実質的に伸長ｔＲＮＡのみを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系により、前記精製された標識メチオニル開始ｔＲＮＡを用いて、Ｎ末端に標識されたメチオニンを有するタンパク質を、反応時間を調整して、調製する工程を包含する。
更に具体的には、本願発明の方法は（１）開始ｔＲＮＡが除去され実質的に伸長ｔＲＮＡのみからなるｔＲＮＡ混合液（ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ））を含み、さらに１０−フォルミル５、６、７、８−テトラヒドロ葉酸（以下ＦＤと表記することがある。）及びメチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ（以下ＭＴＦと記載することがある。）を含まないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を調製する工程、（２）蛍光標識メチオニル開始ｔＲＮＡを精製する工程、並びに（３）前記開始ｔＲＮＡが除去され実質的に伸長ｔＲＮＡのみからなるｔＲＮＡ混合液（ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ））を含みＦＤおよびＭＴＦを含まないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系により、精製された前記蛍光標識メチオニル開始ｔＲＮＡを用いて、αアミノ基が標識されたメチオニン（Ｍｅｔ）をＮ末端に有するタンパク質を限定された時間で調製する工程を包含する。
より具体的には、（１）開始ｔＲＮＡが除去され実質的に伸長ｔＲＮＡのみからなるｔＲＮＡ混合液（ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ））を含み、ＦＤ及びＭＴＦを含まないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を調製する工程、（２）蛍光標識メチオニル開始ｔＲＮＡをＢｅｎｚｏｙｌ−ＤＥＡＥセルロースを用いて精製する工程、並びに（３）前記開始ｔＲＮＡが除去され実質的に伸長ｔＲＮＡのみからなるｔＲＮＡ混合液（ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ））を含みＦＤ及びＭＴＦを含まないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系により、前記精製された蛍光標識メチオニル開始ｔＲＮＡを用いて、αアミノ基が蛍光標識されたメチオニンをＮ末端に有するタンパク質を、反応時間を制御して調製する工程を包含する。
２．ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系
本願発明で使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系としては、その構成成分の量、例えば、系内のフォルミルメチオニル開始ｔＲＮＡの生成量に影響を与える成分の量を調整できる限り、種々のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いることが可能である。ここで、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系は、無細胞タンパク質合成系とよばれる場合もある。また、ＲＮＡから合成する場合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系であるが、本願におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系を含める。本願発明においては、好適には、再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系によるタンパク質合成系が好ましい。たとえば、ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（ポストゲノム研究所社製）を用いることができる。再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系は、具体的には、存在量が特定されている複数の成分からなるタンパク質合成の基本となる試薬（タンパク質合成基本試薬）からなり、鋳型核酸を添加することにより鋳型核酸がコードするタンパク質の合成ができる再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系が望ましい。より具体的には、タンパク質合成基本試薬が、リボソーム、開始因子類、伸長因子類、解離因子類、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ（ＭＴＦ）、ｔＲＮＡ類、アミノ酸類、リボヌクレオチド３リン酸類、１０−フォルミル５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（ＦＤ）、塩類及び水を含む再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系が望ましいが、以下に説明するように、開始ｔＲＮＡ及びメチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ（ＭＴＦ）及び１０−フォルミル５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（ＦＤ）は含めないほうが望ましい。
２−１．ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系によるタンパク質合成
再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系は、その成分として、リボソーム、開始因子類、伸長因子類、解離因子類、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ類、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ類（ＭＴＦ）、ｔＲＮＡ類、アミノ酸類、リボヌクレオシド３リン酸類、１０−フォルミル５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（ＦＤ）、塩類及び水をそれぞれ予め決められた純度の成分を決められた量だけ含むことを特徴とするが、全ての成分が必要でなく、成分は適宜選択することができ、開始ｔＲＮＡおよびＦＤおよびＭＴＦは含まないほうが望ましい。
系を構成するこれらの成分は、細胞抽出液又はその粗画分を用いない。
本発明の再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系は、系を構成する全ての成分を再構成するため、このような成分を特定し、その含有量を計算することは容易である。
本発明におけるタンパク質合成反応基本試薬は、ＤＮＡからの転写・翻訳、或は、ＲＮＡの翻訳を行わせるタンパク質合成のための反応系として使用できる。本発明に言うタンパク質とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合したものを言い、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドを含む。本発明に言うＲＮＡは化学合成されたＲＮＡ及びｍＲＮＡを含み、ＤＮＡは、化学合成されたＤＮＡ、ＤＮＡベクター、ゲノムＤＮＡ、ＰＣＲ産物及びｃＤＮＡを含む。
本発明におけるタンパク質合成反応基本試薬において、存在量および純度がそれぞれ特定されている成分を含むとは、それぞれの成分について、個々に精製され、その純度が測定可能であり、かつ定量可能であることを意味している。本発明では、存在量および純度がそれぞれ特定された複数の成分とは、予め塩析、クロマトグラフィー、電気泳動、溶解度の差、再結晶、遠心等の物質の精製法により、それぞれが精製された物質であって、クロマトグラフィー、電気泳動、質量分析、遠心等の分析方法により、それぞれの純度がおおむね８０％以上、好適には９０％以上である物質を言う。例えば、タンパク質であれば、主にクロマトグラフィーにより精製され、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により純度が決定され、リボソームであれば、主に超遠心法により精製され、超遠心分離による沈降分析により純度が決定される。リボソームは複数のＲＮＡ分子（原核生物では、２３Ｓ、５Ｓ、及び１６Ｓの３つ、真核生物では２８Ｓ、５．８Ｓ、５Ｓ、１８Ｓの４つのＲＮＡ分子）と複数のリボソーマルタンパク質（原核生物では約５０個、真核生物では約８０個のタンパク質）とからなる分子量数百万の集合体分子であるが、沈降分析によって集合体分子として分子を同定し純度を測定することが可能である。ｔＲＮＡ類はほとんどが７４から９４ヌクレオチドから成り、複数の塩基配列をもつ分子であるが、電気泳動などにより分子を分離・同定し、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度測定により純度を測定することが可能である。その他、アミノ酸や塩等の低分子の物質はいずれもクロマトグラフィー、融点測定、元素分析、質量分析等の常法により、物質を同定し純度を測定することが可能である。
タンパク質合成基本試薬としての転写・翻訳のための因子・酵素としては、大腸菌等の原核細胞由来のものに限らず、真核細胞由来のものも使用でき、（１）ＲＮＡからの翻訳の場合は、リボソーム、開始因子類、伸長因子類、解離因子類、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ類、ｔＲＮＡ類、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン３リン酸（ＧＴＰ）、アミノ酸類、１０−フォルミル５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（ＦＤ）、塩類及び水を含み、大腸菌等の原核細胞由来の反応系である場合は更にメチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ類を含む；（２）ＤＮＡからの転写・翻訳の場合は、（１）に加えウリジン３リン酸（ＵＴＰ）、シチジン３リン酸（ＣＴＰ）及びＲＮＡポリメラーゼ類、例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを含むことができるが、好適には、ＦＤ及びＭＴＦを含めない。
本発明の反応系を構成する各種因子・酵素は、大腸菌、カビ、酵母、及び培養細胞等全ての生物が本来備えているものであるから、これをそれぞれ高度に精製し、成分として用いることもできるが、各タンパク質が多量に得られ、未知の不要又は阻害成分が反応系内に持ち込まれる可能性が低くなることから、組換え生産されたものを用いることがより好ましい。
具体的には開始因子類、伸長因子類、解離因子類、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ類、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ類、又はＲＮＡポリメラーゼ類をコードする遺伝子を適切なベクターにつなぎ、大腸菌、枯草菌、カビ、又は酵母等に形質転換し、発現誘導を行い、該タンパク質を精製し、本発明の反応系を構成する成分とすることができる。組換え体により、各種因子・酵素を生産する場合、インタクトな状態でそのタンパク質を発現させても良いが、融合タンパク質として発現しても良い。そのような融合タンパク質として、ヒスチジンタグ（以下Ｈｉｓ−Ｔａｇ）、ストレプトタグ、ＧＳＴタグ、及びＦＬＡＧタグ等ラベル化されたものを例示することができる（Ｔｅｒｐｅ Ｋ．（２００３）Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０（５）：５２３−５３３）。
一例として、Ｈｉｓ−Ｔａｇとニッケルカラムを利用した、Ｈｉｓ−Ｔａｇを付したタンパク質成分の精製方法の概略を示せば次の通りである。これ以外にも様々なバリエーションが知られており、適宜選択して使用できる。
（１）．遺伝子工学的手法により、目的タンパク質のＮ末端にＨｉｓ−Ｔａｇ（例えば６個のＨｉｓよりなる）を結合させた融合タンパク質を得る。
（２）．タグをつけたタンパク質が発現している細胞を氷中で超音波処理し、ローディングバッファー（３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ８．０）に懸濁させる。
（３）．細胞の溶解物を遠心分離する（３０，０００ｇ、４℃で３０分間）。
（４）．上記で得られた上清に、氷で冷やしたローディングバッファーの中で平衡化した５０％のＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ社製）を加える。４℃で１時間撹拌する。
（５）．樹脂をカラムにロードし、カラム容量の２０倍のローディングバッファーで、４℃でカラムの洗浄を行う。
（６）．カラム容量の２０倍のローディングバッファー（１０ｍＭ イミダゾールｐＨ８．０を含む）で、４℃でカラムの洗浄を行う。
（７）．カラム容量の２０倍のローディングバッファーを用いて、イミダゾールの濃度勾配を１０から２５０ｍＭになるように設定し、カラムから目的タンパク質の溶出を行わせ、１ｍｌずつフラクションを集める。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで目的タンパク質を確認する。
また、反応系を構成する各種因子・酵素として、直接タンパク質の合成反応には関わらないが、クレアチンキナーゼ類、ミオキナーゼ類又はヌクレオシドジフォスフェートキナーゼ類といったエネルギー再生に関わる酵素、及び無機ピロフォスファターゼ類といった、転写・翻訳反応で生じる無機ピロリン酸の分解のための酵素類も、同様な方法で該タンパク質を精製し、本発明の反応系に加えることがより好ましい。
なお、上記したように、タンパク質合成基本試薬の内、タンパク質からなる成分は、Ｈｉｓ−Ｔａｇ、ストレプトタグ、ＧＳＴタグ、及びＦＬＡＧタグ等でラベルすることにより、目的のタンパク質を合成後、当該ラベルを用いて、これら成分を除去することができる。これにより、目的タンパク質を高精製度で得ることができるものである。
塩類としては、転写・翻訳に必須な陽イオン・陰イオンを含むことが必須であり、グルタミン酸カリウム、塩化アンモニウム、酢酸マグネシウム、塩化カルシウム等が通常使用される。なお、上記以外にも適宜選択して使用できることは言うまでもない。水はイオンや微生物類、酵素類及びその他の物質を含まないもので、例えばミリポア社製のミリＱ水製造装置によって製造される水や市販の純水を挙げることができる。
リボソームは、ペプチド合成の場であり、ｍＲＮＡと結合し、アミノアシルｔＲＮＡをＡ部位に、フォルミルメチオニル開始ｔＲＮＡ又はペプチジルｔＲＮＡをＰ部位にそれぞれ配位してペプチド結合を形成させる反応を行う（Ｎｉｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９：９２０−９３０）。本発明においては、かかる機能を有するものであれば、由来を問わず使用することが可能である。例えば、大腸菌由来のリボソームが使用されるが、真核細胞由来のものも使用できる。本発明において用いられるリボソームの好ましい例は、大腸菌由来のものであり、例えば大腸菌Ａ１９株、ＭＲＥ６００株から得られるものを挙げることができる。
開始因子類は、翻訳開始複合体の形成に必須であるか、又は、これを著しく促進する因子であり、大腸菌由来のものとして、ＩＦ１、ＩＦ２及びＩＦ３が知られている（Ｃｌａｕｄｉｏ Ｏ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：５８８１−５８８９）。開始因子ＩＦ３は、翻訳の開始に必要な段階である、７０Ｓリボソームの３０Ｓサブユニットと５０Ｓサブユニットへの解離を促進し、また、翻訳開始複合体の形成の際に、フォルミルメチオニル開始以外のｔＲＮＡのＰ部位への挿入を阻害する。開始因子ＩＦ２は、フォルミルメチオニル開始ｔＲＮＡと結合し、３０ＳリボソームサブユニットのＰ部位へフォルミルメチオニル開始ｔＲＮＡを運び、翻訳開始複合体を形成する。開始因子ＩＦ１は開始因子ＩＦ２、ＩＦ３の機能を促進する。本発明において用いられる開始因子の好ましい例は、大腸菌由来のものであり、例えば大腸菌Ｋ１２株から得られるものを挙げることができるが、真核細胞由来のものも使用できる。
伸長因子ＥＦ−Ｔｕは、ＧＴＰ型とＧＤＰ型の２種類があり、ＧＴＰ型はアミノアシルｔＲＮＡと結合してこれをリボソームのＡ部位へ運ぶ。ＥＦ−Ｔｕがリボソームから離れる際にＧＴＰが加水分解され、ＧＤＰ型へ転換する（Ｐａｐｅ Ｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７：７４９０−７４９７）。伸長因子ＥＦ−Ｔｓは、ＥＦ−Ｔｕ（ＧＤＰ型）に結合し、ＧＴＰ型への転換を促進する（Ｈｗａｎｇ ＹＷ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３４８：１５７−１６２）。伸長因子ＥＦ−Ｇは、ペプチド鎖伸長過程において、ペプチド結合形成反応の後の転位（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）反応を促進する（Ａｇｒａｗａｌ ＲＫ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ６：６４３−６４７、Ｒｏｄｎｉｎａ ＭＷ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２３：３１７−３３３）。本発明において用いられる伸長因子の好ましい例は、大腸菌由来のものであり、例えば大腸菌Ｋ１２株から得られるものを挙げることができるが、真核細胞由来のものも使用できる。
解離因子はタンパク質合成の終結、翻訳されたペプチド鎖の解離、更に次のｍＲＮＡの翻訳開始へのリボソームの再生に必須である。解離因子ＲＦ１及びＲＦ２は、リボソームのＡ部位に終止コドン（ＵＡＡ、ＵＡＧ、ＵＧＡ）が来た時、Ａ部位に入ってペプチジルｔＲＮＡ（Ｐ部位にある）からのペプチド鎖の解離を促進する。ＲＦ１は終止コドンのうちＵＡＡおよびＵＡＧを認識し、ＲＦ２はＵＡＡおよびＵＧＡを認識する。解離因子ＲＦ３は、ＲＦ１、ＲＦ２によるペプチド鎖の解離反応後の、ＲＦ１、ＲＦ２のリボソームからの解離を促進する。リボソーム再生因子（ＲＲＦ）は、タンパク質合成の終結後、Ｐ部位に残っているｔＲＮＡの脱離と、次のタンパク質合成へのリボソームの再生を促進する。本発明においては、ＲＲＦも解離因子類の一つとして取扱うことにする。なお、解離因子ＲＦ１、ＲＦ２、ＲＦ３及びＲＲＦの機能については、Ｆｒｅｉｓｔｒｏｆｆｅｒ ＤＶ ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＥＭＢＯ Ｊ．１６：４１２６−４１３３、Ｐａｖｌｏｖ ＭＹ ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＥＭＢＯ Ｊ．１６：４１３４−４１４１に解説されている。本発明において用いられる解離因子の好ましい例は、大腸菌由来のものであり、例えば大腸菌Ｋ１２株から得られるものを挙げることができるが、真核細胞由来のものも使用できる。
アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、ＡＴＰの存在下でアミノ酸とｔＲＮＡを共有結合させ、アミノアシルｔＲＮＡを合成する酵素である（Ｆｒａｎｃｋｌｙｎ Ｃ ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＲＮＡ ３：９５４−９６０、蛋白質核酸酵素 ３９ １２１５−１２２５（１９９４））。本発明において用いられるアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの好ましい例は、大腸菌由来のものであり、例えば大腸菌Ｋ１２株から得られるものを挙げることができるが、真核細胞由来のものも使用できる。また、非天然アミノ酸を認識する人工アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（特許２６６８７０１号）を用いることもできる。
メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ（ＭＴＦ）は、原核生物におけるタンパク質合成においてメチオニル開始ｔＲＮＡのメチオニンのαアミノ基にフォルミル基がついたフォルミルメチオニル（ｆＭｅｔ）開始ｔＲＮＡを合成する酵素である。即ち、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼは、１０−フォルミルテトラヒドロ葉酸のフォルミル基を、開始コドンに対応するメチオニル開始ｔＲＮＡのメチオニンのαアミノ基に転移させ、フォルミルメチオニル開始ｔＲＮＡにする（Ｒａｍｅｓｈ Ｖ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：８７５−８８０）。真核生物の細胞質におけるタンパク質合成系にはＭＴＦはないが、真核生物のミトコンドリア及び葉緑体における合成系には存在する。
ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ配列をＲＮＡに転写する酵素であり、様々な生物に存在することが知られている。その一例として、Ｔ７ファージ由来の、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを挙げることができ、このポリメラーゼはＴ７プロモーターと呼ばれる特異的なＤＮＡ配列に結合してその下流のＤＮＡ配列をＲＮＡに転写する酵素である。本発明においては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ以外にも種々のＲＮＡポリメラーゼを用いることができる。例えば、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼやＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが市販されており、これ等を利用することもできる。
アミノ酸類としては天然型又は非天然型アミノ酸が挙げられる。
ｔＲＮＡ類としては、大腸菌、酵母等の細胞から精製した全ｔＲＮＡ、又は、大腸菌、酵母等の細胞から各アミノ酸に対応するｔＲＮＡをそれぞれ精製して混合したものを用いることができる。更に、ｔＲＮＡ類としては、各アミノ酸に対応するｔＲＮＡをそれぞれ合成して混合したものも用いることができる。開始コドンに対応する開始ｔＲＮＡは、ペプチド伸長反応時の伸長ｔＲＮＡとは異なる専用のｔＲＮＡである。開始ｔＲＮＡには、メチオニルｔＲＮＡシンテターゼによってメチオニンが結合される。大腸菌などの原核生物では、その後、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼによって、ｔＲＮＡに結合したメチオニンのαアミノ基にフォルミル基が１０−フォルミルテトラヒドロ葉酸から転移される。このフォルミル化されたメチオニル開始ｔＲＮＡと開始因子ＩＦ２がリボソーム３０Ｓサブユニット上でｍＲＮＡの開始コドン（ほとんどの場合はＡＵＧ）に結合し、リボソーム５０Ｓサブユニットがさらに会合して、タンパク質合成反応が開始する。
その他、緩衝液としては、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．３）などが通常使用される。
また、上記された各成分の純度については、測定法を以下に例示する。
上記した開始因子類、伸長因子類、解離因子類、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ類などタンパク質からなる成分は、例えば、前記した、Ｈｉｓ−Ｔａｇとニッケルカラムを利用した、Ｈｉｓ−Ｔａｇを付したタンパク質成分の精製方法により精製した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで目的タンパク質を確認し、各レーンの泳動パターンをデンシトメーターで読み取って算出することができる。
精製したリボソームは、ショ糖密度勾配遠心による分析で純度を測定できる。
ｔＲＮＡ類、アミノ酸類、リボヌクレオチド３リン酸類及びＦＤ、その他緩衝液、ＤＴＴなど通常試薬として市販されている試薬は、市販試薬の純度で使用可能である。なお、市販の試薬の純度はいずれも、８０％以上であった。
３．開始ｔＲＮＡ、ＦＤおよびＭＴＦを含まないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を調製する工程３−１．伸長ｔＲＮＡのみからなるｔＲＮＡ混合液
標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡを調製し、これを用いて遺伝子よりタンパク質合成をおこない、Ｎ末端に標識されたメチオニンを導入できたとしても、仮に、遺伝子からタンパク質を合成する系に、内在性のフォルミルメチオニル開始ｔＲＮＡおよび、またはメチオニル開始ｔＲＮＡが含まれていると、当該内在性のフォルミルメチオニル開始ｔＲＮＡおよび、またはメチオニル開始ｔＲＮＡと、標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡとが、タンパク質合成の開始において競争することとなり、Ｎ末端が標識されたタンパク質の合成効率（標識効率）が低下することとなる。
そのため、開始ｔＲＮＡを含まない実質的に伸長ｔＲＮＡのみからなるｔＲＮＡ混合液を調製する。伸長ｔＲＮＡのみからなるｔＲＮＡ混合液は、（１）タンパク質を構成する２０種類の天然アミノ酸についての各アミノ酸用の伸長ｔＲＮＡのみをそれぞれ合成および精製することにより調製できる。又は（２）細胞に含まれるｔＲＮＡの全混合物（ｔＲＮＡ ｍｉｘ）から開始ｔＲＮＡを除去することにより調製することができる。例えば、常法により分離されたｔＲＮＡの混合物（ｔＲＮＡ ｍｉｘ）から開始ｔＲＮＡを除去するためには、周知の方法（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４、２２（３）、３４７−３５３記載の方法）を用いることができる。例えば、開始ｔＲＮＡのみを分離・除去するためには、当該開始ｔＲＮＡ用のプローブ、たとえば、アンチコドン部分を含むｔＲＮＡ配列に十分に相補的な配列を含むプローブを用いて目的とするｔＲＮＡを採取することができる。プローブは、プローブの回収に好適な手段、たとえば、プローブを支持体（オリゴ−セルロース、オリゴ−セファロース、ｏｌｉｇｏｔｅｘなど）に共有結合したもの、又はビオチン化したものとアビジン若しくはストレプトアビジンを支持体と結合させたもの（アビジンーセファロース、ストレプトアビジンーセルロースなど）と結合させて回収することもできる。
具体的には標的となる開始ｔＲＮＡの配列に対して相補配列を有するビオチン化オリゴＤＮＡを合成し、ストレプトアビジン化した樹脂に固定し、ｔＲＮＡ混合物を当該樹脂カラムを用いて精製する方法がある。
３−２．ＦＤ及びＭＴＦを含まないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系
標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡがタンパク質合成系でタンパク質合成の開始に使用されると、αアミノ基が標識されたメチオニンをＮ末端に有するタンパク質が合成できるとともに、開始ｔＲＮＡが再生することとなる。この再生された開始ｔＲＮＡから通常のフォルミルメチオニル開始ｔＲＮＡが生じて、修飾されたメチオニル開始ｔＲＮＡと競争することがないようにできないか検討した。ここで、タンパク合成の開始においてメチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ類（ＭＴＦ）及び１０−フォルミル５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（ＦＤ）が必須でないことはすでに報告されており（Ｕｄａｇａｗａ Ｔ．ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７９（１０）：８５３９−４６）、実際に、当該成分を合成系から除くことにより、フォルミルメチオニル開始ｔＲＮＡの生成を阻害でき、しかも目的とするαアミノ基が標識されたメチオニンをＮ末端に有するタンパク質の合成は格段の低下は見られないことが分かった。
そこで、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系として、ＦＤ及びＭＴＦを含まないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を調製することとした。好適には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系の成分をそれぞれ精製した後、再構成して調製されたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系、例えば参考文献記載のもの、好適には、ピュアシステム／ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（ポストゲノム研究所社製；商標）において、ＦＤおよびＭＴＦを添加しない系を挙げることができる。
より具体的には、例えば、（１）ＲＮＡからの翻訳の場合は、リボソーム、開始因子類、伸長因子類、解離因子類、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ類、クレアチンキナーゼ類、ミオキナーゼ類、ヌクレオシド−ジフォスフェートキナーゼ類、ピロフォスファターゼ類、ｔＲＮＡ類、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン３リン酸（ＧＴＰ）、アミノ酸類、塩類及び水を含む；（２）ＤＮＡからの転写・翻訳の場合は、（１）に加えウリジン３リン酸（ＵＴＰ）、シチジン３リン酸（ＣＴＰ）及びＲＮＡポリメラーゼ類、例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを含む系をあげることができる。
３−３．開始ｔＲＮＡ、ＦＤ及びＭＴＦを含まないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系
ｔＲＮＡ類として上記３−１．で調製された開始ｔＲＮＡを含まない実質的に伸長ｔＲＮＡのみからなるｔＲＮＡ混合液を上記３−２．で調製されたＦＤ及びＭＴＦを含まないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系に添加することにより、開始ｔＲＮＡ及びＦＤ及びＭＴＦを含まないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を調製することができる。
特に好適には、ｔＲＮＡ類として上記３−１．で調製された開始ｔＲＮＡを含まない実質的に伸長ｔＲＮＡのみからなるｔＲＮＡ混合液を上記３−２．で調製されたＦＤ及びＭＴＦを含まない再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系に添加することにより、調製した実質的に伸長ｔＲＮＡのみからなるｔＲＮＡ混合液を含み、ＦＤ及びＭＴＦを含まない再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系が望ましい。
４．標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡを精製する工程
標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡ、特に蛍光色素で標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡは、例えばＮＡＰ−５（アマシャムバイオサイエンス）のような脱塩カラムを用いて精製することができ（Ｏｌｅｊｎｉｋ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５２−２６０）、また、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅなどを用いて精製できるが、好適には、Ｂｅｎｚｏｙｌ−ＤＥＡＥセルロースを用いて精製することができる。
５．Ｎ末端特異的に標識が導入されたタンパク質を合成する工程
以下では、αアミノ基が標識されたメチオニンをＮ末端に有するタンパク質を合成する工程について説明するが、メチオニン以外の天然アミノ酸または非天然アミノ酸をＮ末端に有するタンパク質を調製する工程も同様に行なうことができる。
５−１．αアミノ基が標識されたメチオニンをＮ末端に有するタンパク質を調製する工程
上記３．で調製した開始ｔＲＮＡ、ＦＤ及びＭＴＦを含まないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系により、上記４．で調製した精製された標識メチオニルされた開始ｔＲＮＡを用いて、αアミノ基が標識されたメチオニンをＮ末端に有するタンパク質を調製することができる。
５−２．合成反応時間の検討
αアミノ基が標識されたメチオニンをＮ末端に有するタンパク質の合成にともない、系に添加した標識メチオニル開始ｔＲＮＡが開始ｔＲＮＡとなる。添加した標識メチオニル開始ｔＲＮＡが、タンパク質合成反応にすべて使用された場合、αアミノ基が標識されたメチオニンをＮ末端に有するタンパク質はそれ以上合成されないと考えられ、逆に、合成反応の進行に伴って生じた開始ｔＲＮＡが使用されることにより、標識されたメチオニンをＮ末端に有さないタンパク質が合成される可能性が高くなる。そこで、Ｎ末端未標識タンパク質合成量を減少させるため、最適な反応時間を検討した。具体的には、合成された標識されたタンパク質量を経時的に分析し、標識されたタンパク質の増加が見られない時点を選択することができる。実際には、通常のリボソーム量であれば、３０分程度で十分であることが分かった。なお、タンパク質合成系内に存在する標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡの量を測定し、標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡが系内に存在しなくなるまでタンパク質合成を行なうように時間を調整することもできる。
５−３．反応時間及びｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系の成分の存在量の比率を変化させて、標識されたアミノ酸をＮ末端に有するタンパク質の合成量を測定することにより、反応時間及び成分の存在量の比率と当該Ｎ末標識タンパク質の合成量との相関を検証し、最適な条件を決定する方法
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系の成分の存在量の比率を変化させて、合成された標識されたタンパク質量を経時的に分析することにより、反応時間及び成分の存在量の比率と当該Ｎ末標識タンパク質の合成量との相関を行なうことができる。例えば、Ｎ末が標識されたタンパク質を、上記５．記載の工程により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系の成分の存在量の比率を変化させて調製するときに、経時的に標識されたタンパク質を分離・採取し、Ｎ末が標識されたタンパク質の量をその標識により測定する。具体的には、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系の成分の存在量の比率を変えた系を複数調製し、それぞれのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて、αアミノ基が蛍光標識されたメチオニンをＮ末端に有するタンパク質の合成にともない、合成されたＮ末蛍光標識タンパク質を、経時的に、電気泳動法により分離し、その蛍光量を光学的に測定することができる。このようにｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系の成分の存在量の比率を変えた系で、経時的に合成されたＮ末標識タンパク質の量を計測し、反応時間及び成分の存在量の比率と当該Ｎ末標識タンパク質の合成量との相関を検証することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成系におけるＮ末標識タンパク質の合成のための最適な反応時間及び成分比率を決定することができる。このように決定した最適な反応時間及び成分比率、言い換えれば最適な条件を用いて、当該反応時間だけＮ末標識タンパク質を合成させ、合成されたＮ末標識タンパク質を適宜な手段で分離することで、Ｎ末が未標識のタンパク質の混入を避けるようにすることができる。
また、逆にタンパク質を分離した後の系内に残存している標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡ又は標識されたアミノ酸が結合したアンチコドンがＣＡＵである開始ｔＲＮＡの量を測定することもできる。
６．Ｎ末端に標識されたメチオニンを有するタンパク質を合成するためのキット
本願発明のキットとして、例えば、αアミノ基が標識されたメチオニンをＮ末端に有するタンパク質を合成するためのキットは、１）開始ｔＲＮＡ及び／又はメチオニル開始ｔＲＮＡ及び／又は標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡ並びに２）開始ｔＲＮＡ及びＦＤ及びＭＴＦを含有しないタンパク質合成反応基本試薬を包含する。更に、好適には、１）開始ｔＲＮＡ及び／又はメチオニル開始ｔＲＮＡ及び／又は標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡ並びに２）開始ｔＲＮＡ、ＦＤ及びＭＴＦを含有しないタンパク質合成反応基本試薬を含有することを特徴とする、再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳キットを包含する。なお、タンパク質合成反応基本試薬としては、上述のように、リボソーム、開始因子類、伸長因子類、解離因子類、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、クレアチンキナーゼ類、ミオキナーゼ類、ヌクレオシド−ジフォスフェートキナーゼ類、ピロフォスファターゼ類、ＲＮＡポリメラーゼ類、開始ｔＲＮＡが除かれたｔＲＮＡ類、アミノ酸類、リボヌクレオチド３リン酸類、塩類及び水を含むタンパク質合成反応基本試薬を用いることができる。
本願発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いてＮ末端特異的に標識が導入されたタンパク質を合成する方法及び該方法に用いるタンパク質合成系に関する。本願発明のタンパク質合成系には、例えば、系内のフォルミルメチオニル開始ｔＲＮＡの生成量に影響を与える成分の量など、その構成成分の量を調整できるものであれば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いることが可能である。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系としては、好適には、存在量が特定されている複数の成分からなり、鋳型核酸を添加することにより鋳型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じる再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系が挙げられる。
更に本願発明は、メチオニン以外の天然アミノ酸または非天然アミノ酸をＮ末端に有するタンパク質を調製する方法、または、αアミノ基が標識されたメチオニン（Ｍｅｔ）をＮ末端に有するタンパク質を調製する方法を包含し、より具体的には、αアミノ基が蛍光標識されたメチオニンをＮ末端に有するタンパク質を調製する方法を包含する。
また、本願発明の方法は、（１）ｔＲＮＡとして伸長ｔＲＮＡのみを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を調製する工程、（２）標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡを精製する工程、及び（３）前記ｔＲＮＡとして伸長ｔＲＮＡのみを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系により、前記精製された標識メチオニル開始ｔＲＮＡを用いて、Ｎ末端に標識されたメチオニン（Ｍｅｔ）を有するタンパク質を、反応時間を調整して、調製する工程を包含する。更に、本願発明の方法は、（１）ｔＲＮＡ Ｍｉｘから開始ｔＲＮＡが除去された、実質的に伸長ｔＲＮＡのみからなるｔＲＮＡ混合液を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を調製する工程、（２）標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡを精製する工程、及び（３）前記開始ｔＲＮＡが除去され実質的に伸長ｔＲＮＡのみを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系により、前記精製された標識メチオニル開始ｔＲＮＡを用いて、Ｎ末端に標識されたメチオニンを有するタンパク質を、反応時間を調整して、調製する工程を包含する。
更に具体的には、本願発明の方法は（１）開始ｔＲＮＡが除去され実質的に伸長ｔＲＮＡのみからなるｔＲＮＡ混合液（ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ））を含み、さらに１０−フォルミル５、６、７、８−テトラヒドロ葉酸（以下ＦＤと表記することがある。）及びメチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ（以下ＭＴＦと記載することがある。）を含まないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を調製する工程、（２）蛍光標識メチオニル開始ｔＲＮＡを精製する工程、並びに（３）前記開始ｔＲＮＡが除去され実質的に伸長ｔＲＮＡのみからなるｔＲＮＡ混合液（ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ））を含みＦＤおよびＭＴＦを含まないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系により、精製された前記蛍光標識メチオニル開始ｔＲＮＡを用いて、αアミノ基が標識されたメチオニン（Ｍｅｔ）をＮ末端に有するタンパク質を限定された時間で調製する工程を包含する。
より具体的には、（１）開始ｔＲＮＡが除去され実質的に伸長ｔＲＮＡのみからなるｔＲＮＡ混合液（ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ））を含み、ＦＤ及びＭＴＦを含まないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を調製する工程、（２）蛍光標識メチオニル開始ｔＲＮＡをＢｅｎｚｏｙｌ−ＤＥＡＥセルロースを用いて精製する工程、並びに（３）前記開始ｔＲＮＡが除去され実質的に伸長ｔＲＮＡのみからなるｔＲＮＡ混合液（ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ））を含みＦＤ及びＭＴＦを含まないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系により、前記精製された蛍光標識メチオニル開始ｔＲＮＡを用いて、αアミノ基が蛍光標識されたメチオニンをＮ末端に有するタンパク質を、反応時間を制御して調製する工程を包含する。
２．ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系
本願発明で使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系としては、その構成成分の量、例えば、系内のフォルミルメチオニル開始ｔＲＮＡの生成量に影響を与える成分の量を調整できる限り、種々のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いることが可能である。ここで、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系は、無細胞タンパク質合成系とよばれる場合もある。また、ＲＮＡから合成する場合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系であるが、本願におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系を含める。本願発明においては、好適には、再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系によるタンパク質合成系が好ましい。たとえば、ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（ポストゲノム研究所社製）を用いることができる。再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系は、具体的には、存在量が特定されている複数の成分からなるタンパク質合成の基本となる試薬（タンパク質合成基本試薬）からなり、鋳型核酸を添加することにより鋳型核酸がコードするタンパク質の合成ができる再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系が望ましい。より具体的には、タンパク質合成基本試薬が、リボソーム、開始因子類、伸長因子類、解離因子類、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ（ＭＴＦ）、ｔＲＮＡ類、アミノ酸類、リボヌクレオチド３リン酸類、１０−フォルミル５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（ＦＤ）、塩類及び水を含む再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系が望ましいが、以下に説明するように、開始ｔＲＮＡ及びメチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ（ＭＴＦ）及び１０−フォルミル５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（ＦＤ）は含めないほうが望ましい。
２−１．ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系によるタンパク質合成
再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系は、その成分として、リボソーム、開始因子類、伸長因子類、解離因子類、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ類、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ類（ＭＴＦ）、ｔＲＮＡ類、アミノ酸類、リボヌクレオシド３リン酸類、１０−フォルミル５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（ＦＤ）、塩類及び水をそれぞれ予め決められた純度の成分を決められた量だけ含むことを特徴とするが、全ての成分が必要でなく、成分は適宜選択することができ、開始ｔＲＮＡおよびＦＤおよびＭＴＦは含まないほうが望ましい。
系を構成するこれらの成分は、細胞抽出液又はその粗画分を用いない。
本発明の再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系は、系を構成する全ての成分を再構成するため、このような成分を特定し、その含有量を計算することは容易である。
本発明におけるタンパク質合成反応基本試薬は、ＤＮＡからの転写・翻訳、或は、ＲＮＡの翻訳を行わせるタンパク質合成のための反応系として使用できる。本発明に言うタンパク質とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合したものを言い、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドを含む。本発明に言うＲＮＡは化学合成されたＲＮＡ及びｍＲＮＡを含み、ＤＮＡは、化学合成されたＤＮＡ、ＤＮＡベクター、ゲノムＤＮＡ、ＰＣＲ産物及びｃＤＮＡを含む。
本発明におけるタンパク質合成反応基本試薬において、存在量および純度がそれぞれ特定されている成分を含むとは、それぞれの成分について、個々に精製され、その純度が測定可能であり、かつ定量可能であることを意味している。本発明では、存在量および純度がそれぞれ特定された複数の成分とは、予め塩析、クロマトグラフィー、電気泳動、溶解度の差、再結晶、遠心等の物質の精製法により、それぞれが精製された物質であって、クロマトグラフィー、電気泳動、質量分析、遠心等の分析方法により、それぞれの純度がおおむね８０％以上、好適には９０％以上である物質を言う。例えば、タンパク質であれば、主にクロマトグラフィーにより精製され、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により純度が決定され、リボソームであれば、主に超遠心法により精製され、超遠心分離による沈降分析により純度が決定される。リボソームは複数のＲＮＡ分子（原核生物では、２３Ｓ、５Ｓ、及び１６Ｓの３つ、真核生物では２８Ｓ、５．８Ｓ、５Ｓ、１８Ｓの４つのＲＮＡ分子）と複数のリボソーマルタンパク質（原核生物では約５０個、真核生物では約８０個のタンパク質）とからなる分子量数百万の集合体分子であるが、沈降分析によって集合体分子として分子を同定し純度を測定することが可能である。ｔＲＮＡ類はほとんどが７４から９４ヌクレオチドから成り、複数の塩基配列をもつ分子であるが、電気泳動などにより分子を分離・同定し、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度測定により純度を測定することが可能である。その他、アミノ酸や塩等の低分子の物質はいずれもクロマトグラフィー、融点測定、元素分析、質量分析等の常法により、物質を同定し純度を測定することが可能である。
タンパク質合成基本試薬としての転写・翻訳のための因子・酵素としては、大腸菌等の原核細胞由来のものに限らず、真核細胞由来のものも使用でき、（１）ＲＮＡからの翻訳の場合は、リボソーム、開始因子類、伸長因子類、解離因子類、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ類、ｔＲＮＡ類、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン３リン酸（ＧＴＰ）、アミノ酸類、１０−フォルミル５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（ＦＤ）、塩類及び水を含み、大腸菌等の原核細胞由来の反応系である場合は更にメチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ類を含む；（２）ＤＮＡからの転写・翻訳の場合は、（１）に加えウリジン３リン酸（ＵＴＰ）、シチジン３リン酸（ＣＴＰ）及びＲＮＡポリメラーゼ類、例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを含むことができるが、好適には、ＦＤ及びＭＴＦを含めない。
本発明の反応系を構成する各種因子・酵素は、大腸菌、カビ、酵母、及び培養細胞等全ての生物が本来備えているものであるから、これをそれぞれ高度に精製し、成分として用いることもできるが、各タンパク質が多量に得られ、未知の不要又は阻害成分が反応系内に持ち込まれる可能性が低くなることから、組換え生産されたものを用いることがより好ましい。
具体的には開始因子類、伸長因子類、解離因子類、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ類、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ類、又はＲＮＡポリメラーゼ類をコードする遺伝子を適切なベクターにつなぎ、大腸菌、枯草菌、カビ、又は酵母等に形質転換し、発現誘導を行い、該タンパク質を精製し、本発明の反応系を構成する成分とすることができる。組換え体により、各種因子・酵素を生産する場合、インタクトな状態でそのタンパク質を発現させても良いが、融合タンパク質として発現しても良い。そのような融合タンパク質として、ヒスチジンタグ（以下Ｈｉｓ−Ｔａｇ）、ストレプトタグ、ＧＳＴタグ、及びＦＬＡＧタグ等ラベル化されたものを例示することができる（Ｔｅｒｐｅ Ｋ．（２００３）Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０（５）：５２３−５３３）。
一例として、Ｈｉｓ−Ｔａｇとニッケルカラムを利用した、Ｈｉｓ−Ｔａｇを付したタンパク質成分の精製方法の概略を示せば次の通りである。これ以外にも様々なバリエーションが知られており、適宜選択して使用できる。
（１）．遺伝子工学的手法により、目的タンパク質のＮ末端にＨｉｓ−Ｔａｇ（例えば６個のＨｉｓよりなる）を結合させた融合タンパク質を得る。
（２）．タグをつけたタンパク質が発現している細胞を氷中で超音波処理し、ローディングバッファー（３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ８．０）に懸濁させる。
（３）．細胞の溶解物を遠心分離する（３０，０００ｇ、４℃で３０分間）。
（４）．上記で得られた上清に、氷で冷やしたローディングバッファーの中で平衡化した５０％のＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ社製）を加える。４℃で１時間撹拌する。
（５）．樹脂をカラムにロードし、カラム容量の２０倍のローディングバッファーで、４℃でカラムの洗浄を行う。
（６）．カラム容量の２０倍のローディングバッファー（１０ｍＭ イミダゾールｐＨ８．０を含む）で、４℃でカラムの洗浄を行う。
（７）．カラム容量の２０倍のローディングバッファーを用いて、イミダゾールの濃度勾配を１０から２５０ｍＭになるように設定し、カラムから目的タンパク質の溶出を行わせ、１ｍｌずつフラクションを集める。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで目的タンパク質を確認する。
また、反応系を構成する各種因子・酵素として、直接タンパク質の合成反応には関わらないが、クレアチンキナーゼ類、ミオキナーゼ類又はヌクレオシドジフォスフェートキナーゼ類といったエネルギー再生に関わる酵素、及び無機ピロフォスファターゼ類といった、転写・翻訳反応で生じる無機ピロリン酸の分解のための酵素類も、同様な方法で該タンパク質を精製し、本発明の反応系に加えることがより好ましい。
なお、上記したように、タンパク質合成基本試薬の内、タンパク質からなる成分は、Ｈｉｓ−Ｔａｇ、ストレプトタグ、ＧＳＴタグ、及びＦＬＡＧタグ等でラベルすることにより、目的のタンパク質を合成後、当該ラベルを用いて、これら成分を除去することができる。これにより、目的タンパク質を高精製度で得ることができるものである。
塩類としては、転写・翻訳に必須な陽イオン・陰イオンを含むことが必須であり、グルタミン酸カリウム、塩化アンモニウム、酢酸マグネシウム、塩化カルシウム等が通常使用される。なお、上記以外にも適宜選択して使用できることは言うまでもない。水はイオンや微生物類、酵素類及びその他の物質を含まないもので、例えばミリポア社製のミリＱ水製造装置によって製造される水や市販の純水を挙げることができる。
リボソームは、ペプチド合成の場であり、ｍＲＮＡと結合し、アミノアシルｔＲＮＡをＡ部位に、フォルミルメチオニル開始ｔＲＮＡ又はペプチジルｔＲＮＡをＰ部位にそれぞれ配位してペプチド結合を形成させる反応を行う（Ｎｉｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９：９２０−９３０）。本発明においては、かかる機能を有するものであれば、由来を問わず使用することが可能である。例えば、大腸菌由来のリボソームが使用されるが、真核細胞由来のものも使用できる。本発明において用いられるリボソームの好ましい例は、大腸菌由来のものであり、例えば大腸菌Ａ１９株、ＭＲＥ６００株から得られるものを挙げることができる。
開始因子類は、翻訳開始複合体の形成に必須であるか、又は、これを著しく促進する因子であり、大腸菌由来のものとして、ＩＦ１、ＩＦ２及びＩＦ３が知られている（Ｃｌａｕｄｉｏ Ｏ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：５８８１−５８８９）。開始因子ＩＦ３は、翻訳の開始に必要な段階である、７０Ｓリボソームの３０Ｓサブユニットと５０Ｓサブユニットへの解離を促進し、また、翻訳開始複合体の形成の際に、フォルミルメチオニル開始以外のｔＲＮＡのＰ部位への挿入を阻害する。開始因子ＩＦ２は、フォルミルメチオニル開始ｔＲＮＡと結合し、３０ＳリボソームサブユニットのＰ部位へフォルミルメチオニル開始ｔＲＮＡを運び、翻訳開始複合体を形成する。開始因子ＩＦ１は開始因子ＩＦ２、ＩＦ３の機能を促進する。本発明において用いられる開始因子の好ましい例は、大腸菌由来のものであり、例えば大腸菌Ｋ１２株から得られるものを挙げることができるが、真核細胞由来のものも使用できる。
伸長因子ＥＦ−Ｔｕは、ＧＴＰ型とＧＤＰ型の２種類があり、ＧＴＰ型はアミノアシルｔＲＮＡと結合してこれをリボソームのＡ部位へ運ぶ。ＥＦ−Ｔｕがリボソームから離れる際にＧＴＰが加水分解され、ＧＤＰ型へ転換する（Ｐａｐｅ Ｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７：７４９０−７４９７）。伸長因子ＥＦ−Ｔｓは、ＥＦ−Ｔｕ（ＧＤＰ型）に結合し、ＧＴＰ型への転換を促進する（Ｈｗａｎｇ ＹＷ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３４８：１５７−１６２）。伸長因子ＥＦ−Ｇは、ペプチド鎖伸長過程において、ペプチド結合形成反応の後の転位（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）反応を促進する（Ａｇｒａｗａｌ ＲＫ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ６：６４３−６４７、Ｒｏｄｎｉｎａ ＭＷ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２３：３１７−３３３）。本発明において用いられる伸長因子の好ましい例は、大腸菌由来のものであり、例えば大腸菌Ｋ１２株から得られるものを挙げることができるが、真核細胞由来のものも使用できる。
解離因子はタンパク質合成の終結、翻訳されたペプチド鎖の解離、更に次のｍＲＮＡの翻訳開始へのリボソームの再生に必須である。解離因子ＲＦ１及びＲＦ２は、リボソームのＡ部位に終止コドン（ＵＡＡ、ＵＡＧ、ＵＧＡ）が来た時、Ａ部位に入ってペプチジルｔＲＮＡ（Ｐ部位にある）からのペプチド鎖の解離を促進する。ＲＦ１は終止コドンのうちＵＡＡおよびＵＡＧを認識し、ＲＦ２はＵＡＡおよびＵＧＡを認識する。解離因子ＲＦ３は、ＲＦ１、ＲＦ２によるペプチド鎖の解離反応後の、ＲＦ１、ＲＦ２のリボソームからの解離を促進する。リボソーム再生因子（ＲＲＦ）は、タンパク質合成の終結後、Ｐ部位に残っているｔＲＮＡの脱離と、次のタンパク質合成へのリボソームの再生を促進する。本発明においては、ＲＲＦも解離因子類の一つとして取扱うことにする。なお、解離因子ＲＦ１、ＲＦ２、ＲＦ３及びＲＲＦの機能については、Ｆｒｅｉｓｔｒｏｆｆｅｒ ＤＶ ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＥＭＢＯ Ｊ．１６：４１２６−４１３３、Ｐａｖｌｏｖ ＭＹ ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＥＭＢＯ Ｊ．１６：４１３４−４１４１に解説されている。本発明において用いられる解離因子の好ましい例は、大腸菌由来のものであり、例えば大腸菌Ｋ１２株から得られるものを挙げることができるが、真核細胞由来のものも使用できる。
アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、ＡＴＰの存在下でアミノ酸とｔＲＮＡを共有結合させ、アミノアシルｔＲＮＡを合成する酵素である（Ｆｒａｎｃｋｌｙｎ Ｃ ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＲＮＡ ３：９５４−９６０、蛋白質核酸酵素 ３９ １２１５−１２２５（１９９４））。本発明において用いられるアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの好ましい例は、大腸菌由来のものであり、例えば大腸菌Ｋ１２株から得られるものを挙げることができるが、真核細胞由来のものも使用できる。また、非天然アミノ酸を認識する人工アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（特許２６６８７０１号）を用いることもできる。
メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ（ＭＴＦ）は、原核生物におけるタンパク質合成においてメチオニル開始ｔＲＮＡのメチオニンのαアミノ基にフォルミル基がついたフォルミルメチオニル（ｆＭｅｔ）開始ｔＲＮＡを合成する酵素である。即ち、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼは、１０−フォルミルテトラヒドロ葉酸のフォルミル基を、開始コドンに対応するメチオニル開始ｔＲＮＡのメチオニンのαアミノ基に転移させ、フォルミルメチオニル開始ｔＲＮＡにする（Ｒａｍｅｓｈ Ｖ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：８７５−８８０）。真核生物の細胞質におけるタンパク質合成系にはＭＴＦはないが、真核生物のミトコンドリア及び葉緑体における合成系には存在する。
ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ配列をＲＮＡに転写する酵素であり、様々な生物に存在することが知られている。その一例として、Ｔ７ファージ由来の、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを挙げることができ、このポリメラーゼはＴ７プロモーターと呼ばれる特異的なＤＮＡ配列に結合してその下流のＤＮＡ配列をＲＮＡに転写する酵素である。本発明においては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ以外にも種々のＲＮＡポリメラーゼを用いることができる。例えば、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼやＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが市販されており、これ等を利用することもできる。
アミノ酸類としては天然型又は非天然型アミノ酸が挙げられる。
ｔＲＮＡ類としては、大腸菌、酵母等の細胞から精製した全ｔＲＮＡ、又は、大腸菌、酵母等の細胞から各アミノ酸に対応するｔＲＮＡをそれぞれ精製して混合したものを用いることができる。更に、ｔＲＮＡ類としては、各アミノ酸に対応するｔＲＮＡをそれぞれ合成して混合したものも用いることができる。開始コドンに対応する開始ｔＲＮＡは、ペプチド伸長反応時の伸長ｔＲＮＡとは異なる専用のｔＲＮＡである。開始ｔＲＮＡには、メチオニルｔＲＮＡシンテターゼによってメチオニンが結合される。大腸菌などの原核生物では、その後、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼによって、ｔＲＮＡに結合したメチオニンのαアミノ基にフォルミル基が１０−フォルミルテトラヒドロ葉酸から転移される。このフォルミル化されたメチオニル開始ｔＲＮＡと開始因子ＩＦ２がリボソーム３０Ｓサブユニット上でｍＲＮＡの開始コドン（ほとんどの場合はＡＵＧ）に結合し、リボソーム５０Ｓサブユニットがさらに会合して、タンパク質合成反応が開始する。
その他、緩衝液としては、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．３）などが通常使用される。
また、上記された各成分の純度については、測定法を以下に例示する。
上記した開始因子類、伸長因子類、解離因子類、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ類などタンパク質からなる成分は、例えば、前記した、Ｈｉｓ−Ｔａｇとニッケルカラムを利用した、Ｈｉｓ−Ｔａｇを付したタンパク質成分の精製方法により精製した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで目的タンパク質を確認し、各レーンの泳動パターンをデンシトメーターで読み取って算出することができる。
精製したリボソームは、ショ糖密度勾配遠心による分析で純度を測定できる。
ｔＲＮＡ類、アミノ酸類、リボヌクレオチド３リン酸類及びＦＤ、その他緩衝液、ＤＴＴなど通常試薬として市販されている試薬は、市販試薬の純度で使用可能である。なお、市販の試薬の純度はいずれも、８０％以上であった。
３．開始ｔＲＮＡ、ＦＤおよびＭＴＦを含まないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を調製する工程３−１．伸長ｔＲＮＡのみからなるｔＲＮＡ混合液
標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡを調製し、これを用いて遺伝子よりタンパク質合成をおこない、Ｎ末端に標識されたメチオニンを導入できたとしても、仮に、遺伝子からタンパク質を合成する系に、内在性のフォルミルメチオニル開始ｔＲＮＡおよび、またはメチオニル開始ｔＲＮＡが含まれていると、当該内在性のフォルミルメチオニル開始ｔＲＮＡおよび、またはメチオニル開始ｔＲＮＡと、標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡとが、タンパク質合成の開始において競争することとなり、Ｎ末端が標識されたタンパク質の合成効率（標識効率）が低下することとなる。
そのため、開始ｔＲＮＡを含まない実質的に伸長ｔＲＮＡのみからなるｔＲＮＡ混合液を調製する。伸長ｔＲＮＡのみからなるｔＲＮＡ混合液は、（１）タンパク質を構成する２０種類の天然アミノ酸についての各アミノ酸用の伸長ｔＲＮＡのみをそれぞれ合成および精製することにより調製できる。又は（２）細胞に含まれるｔＲＮＡの全混合物（ｔＲＮＡ ｍｉｘ）から開始ｔＲＮＡを除去することにより調製することができる。例えば、常法により分離されたｔＲＮＡの混合物（ｔＲＮＡ ｍｉｘ）から開始ｔＲＮＡを除去するためには、周知の方法（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４、２２（３）、３４７−３５３記載の方法）を用いることができる。例えば、開始ｔＲＮＡのみを分離・除去するためには、当該開始ｔＲＮＡ用のプローブ、たとえば、アンチコドン部分を含むｔＲＮＡ配列に十分に相補的な配列を含むプローブを用いて目的とするｔＲＮＡを採取することができる。プローブは、プローブの回収に好適な手段、たとえば、プローブを支持体（オリゴ−セルロース、オリゴ−セファロース、ｏｌｉｇｏｔｅｘなど）に共有結合したもの、又はビオチン化したものとアビジン若しくはストレプトアビジンを支持体と結合させたもの（アビジンーセファロース、ストレプトアビジンーセルロースなど）と結合させて回収することもできる。
具体的には標的となる開始ｔＲＮＡの配列に対して相補配列を有するビオチン化オリゴＤＮＡを合成し、ストレプトアビジン化した樹脂に固定し、ｔＲＮＡ混合物を当該樹脂カラムを用いて精製する方法がある。
３−２．ＦＤ及びＭＴＦを含まないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系
標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡがタンパク質合成系でタンパク質合成の開始に使用されると、αアミノ基が標識されたメチオニンをＮ末端に有するタンパク質が合成できるとともに、開始ｔＲＮＡが再生することとなる。この再生された開始ｔＲＮＡから通常のフォルミルメチオニル開始ｔＲＮＡが生じて、修飾されたメチオニル開始ｔＲＮＡと競争することがないようにできないか検討した。ここで、タンパク合成の開始においてメチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ類（ＭＴＦ）及び１０−フォルミル５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（ＦＤ）が必須でないことはすでに報告されており（Ｕｄａｇａｗａ Ｔ．ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７９（１０）：８５３９−４６）、実際に、当該成分を合成系から除くことにより、フォルミルメチオニル開始ｔＲＮＡの生成を阻害でき、しかも目的とするαアミノ基が標識されたメチオニンをＮ末端に有するタンパク質の合成は格段の低下は見られないことが分かった。
そこで、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系として、ＦＤ及びＭＴＦを含まないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を調製することとした。好適には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系の成分をそれぞれ精製した後、再構成して調製されたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系、例えば参考文献記載のもの、好適には、ピュアシステム／ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（ポストゲノム研究所社製；商標）において、ＦＤおよびＭＴＦを添加しない系を挙げることができる。
より具体的には、例えば、（１）ＲＮＡからの翻訳の場合は、リボソーム、開始因子類、伸長因子類、解離因子類、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ類、クレアチンキナーゼ類、ミオキナーゼ類、ヌクレオシド−ジフォスフェートキナーゼ類、ピロフォスファターゼ類、ｔＲＮＡ類、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン３リン酸（ＧＴＰ）、アミノ酸類、塩類及び水を含む；（２）ＤＮＡからの転写・翻訳の場合は、（１）に加えウリジン３リン酸（ＵＴＰ）、シチジン３リン酸（ＣＴＰ）及びＲＮＡポリメラーゼ類、例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを含む系をあげることができる。
３−３．開始ｔＲＮＡ、ＦＤ及びＭＴＦを含まないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系
ｔＲＮＡ類として上記３−１．で調製された開始ｔＲＮＡを含まない実質的に伸長ｔＲＮＡのみからなるｔＲＮＡ混合液を上記３−２．で調製されたＦＤ及びＭＴＦを含まないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系に添加することにより、開始ｔＲＮＡ及びＦＤ及びＭＴＦを含まないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を調製することができる。
特に好適には、ｔＲＮＡ類として上記３−１．で調製された開始ｔＲＮＡを含まない実質的に伸長ｔＲＮＡのみからなるｔＲＮＡ混合液を上記３−２．で調製されたＦＤ及びＭＴＦを含まない再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系に添加することにより、調製した実質的に伸長ｔＲＮＡのみからなるｔＲＮＡ混合液を含み、ＦＤ及びＭＴＦを含まない再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系が望ましい。
４．標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡを精製する工程
標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡ、特に蛍光色素で標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡは、例えばＮＡＰ−５（アマシャムバイオサイエンス）のような脱塩カラムを用いて精製することができ（Ｏｌｅｊｎｉｋ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５２−２６０）、また、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅなどを用いて精製できるが、好適には、Ｂｅｎｚｏｙｌ−ＤＥＡＥセルロースを用いて精製することができる。
５．Ｎ末端特異的に標識が導入されたタンパク質を合成する工程
以下では、αアミノ基が標識されたメチオニンをＮ末端に有するタンパク質を合成する工程について説明するが、メチオニン以外の天然アミノ酸または非天然アミノ酸をＮ末端に有するタンパク質を調製する工程も同様に行なうことができる。
５−１．αアミノ基が標識されたメチオニンをＮ末端に有するタンパク質を調製する工程
上記３．で調製した開始ｔＲＮＡ、ＦＤ及びＭＴＦを含まないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系により、上記４．で調製した精製された標識メチオニルされた開始ｔＲＮＡを用いて、αアミノ基が標識されたメチオニンをＮ末端に有するタンパク質を調製することができる。
５−２．合成反応時間の検討
αアミノ基が標識されたメチオニンをＮ末端に有するタンパク質の合成にともない、系に添加した標識メチオニル開始ｔＲＮＡが開始ｔＲＮＡとなる。添加した標識メチオニル開始ｔＲＮＡが、タンパク質合成反応にすべて使用された場合、αアミノ基が標識されたメチオニンをＮ末端に有するタンパク質はそれ以上合成されないと考えられ、逆に、合成反応の進行に伴って生じた開始ｔＲＮＡが使用されることにより、標識されたメチオニンをＮ末端に有さないタンパク質が合成される可能性が高くなる。そこで、Ｎ末端未標識タンパク質合成量を減少させるため、最適な反応時間を検討した。具体的には、合成された標識されたタンパク質量を経時的に分析し、標識されたタンパク質の増加が見られない時点を選択することができる。実際には、通常のリボソーム量であれば、３０分程度で十分であることが分かった。なお、タンパク質合成系内に存在する標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡの量を測定し、標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡが系内に存在しなくなるまでタンパク質合成を行なうように時間を調整することもできる。
５−３．反応時間及びｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系の成分の存在量の比率を変化させて、標識されたアミノ酸をＮ末端に有するタンパク質の合成量を測定することにより、反応時間及び成分の存在量の比率と当該Ｎ末標識タンパク質の合成量との相関を検証し、最適な条件を決定する方法
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系の成分の存在量の比率を変化させて、合成された標識されたタンパク質量を経時的に分析することにより、反応時間及び成分の存在量の比率と当該Ｎ末標識タンパク質の合成量との相関を行なうことができる。例えば、Ｎ末が標識されたタンパク質を、上記５．記載の工程により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系の成分の存在量の比率を変化させて調製するときに、経時的に標識されたタンパク質を分離・採取し、Ｎ末が標識されたタンパク質の量をその標識により測定する。具体的には、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系の成分の存在量の比率を変えた系を複数調製し、それぞれのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて、αアミノ基が蛍光標識されたメチオニンをＮ末端に有するタンパク質の合成にともない、合成されたＮ末蛍光標識タンパク質を、経時的に、電気泳動法により分離し、その蛍光量を光学的に測定することができる。このようにｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系の成分の存在量の比率を変えた系で、経時的に合成されたＮ末標識タンパク質の量を計測し、反応時間及び成分の存在量の比率と当該Ｎ末標識タンパク質の合成量との相関を検証することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成系におけるＮ末標識タンパク質の合成のための最適な反応時間及び成分比率を決定することができる。このように決定した最適な反応時間及び成分比率、言い換えれば最適な条件を用いて、当該反応時間だけＮ末標識タンパク質を合成させ、合成されたＮ末標識タンパク質を適宜な手段で分離することで、Ｎ末が未標識のタンパク質の混入を避けるようにすることができる。
また、逆にタンパク質を分離した後の系内に残存している標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡ又は標識されたアミノ酸が結合したアンチコドンがＣＡＵである開始ｔＲＮＡの量を測定することもできる。
６．Ｎ末端に標識されたメチオニンを有するタンパク質を合成するためのキット
本願発明のキットとして、例えば、αアミノ基が標識されたメチオニンをＮ末端に有するタンパク質を合成するためのキットは、１）開始ｔＲＮＡ及び／又はメチオニル開始ｔＲＮＡ及び／又は標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡ並びに２）開始ｔＲＮＡ及びＦＤ及びＭＴＦを含有しないタンパク質合成反応基本試薬を包含する。更に、好適には、１）開始ｔＲＮＡ及び／又はメチオニル開始ｔＲＮＡ及び／又は標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡ並びに２）開始ｔＲＮＡ、ＦＤ及びＭＴＦを含有しないタンパク質合成反応基本試薬を含有することを特徴とする、再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳キットを包含する。なお、タンパク質合成反応基本試薬としては、上述のように、リボソーム、開始因子類、伸長因子類、解離因子類、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、クレアチンキナーゼ類、ミオキナーゼ類、ヌクレオシド−ジフォスフェートキナーゼ類、ピロフォスファターゼ類、ＲＮＡポリメラーゼ類、開始ｔＲＮＡが除かれたｔＲＮＡ類、アミノ酸類、リボヌクレオチド３リン酸類、塩類及び水を含むタンパク質合成反応基本試薬を用いることができる。
大腸菌の開始ｔＲＮＡの調製
大腸菌の開始ｔＲＮＡ遺伝子を組み込んだプラスミドｐＧＥＭＥＸ１−ｔＲＮＡｆＭｅｔで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。ＬＢ−アンピシリン（ａｍｐ）プレート上にて３７℃で一晩培養後、生じたコロニーのひとつを２ｍｌのＬＢ−ａｍｐ培地に植菌し、３７℃で４時間培養した。培養液４５０μｌを１ｌのＬＢ−ａｍｐ培地に加え、３７℃で振とう培養した。６００ｎｍの吸光度が約０．７近くに達した時、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）の終濃度が０．５ｍＭになるように加えた。さらに３７℃で４時間培養して菌体を回収した。１ｌの培養液から回収した菌体を０．２Ｍ ＫＣｌで懸濁して１本の５０ｍｌファルコンチューブにまとめ、６，０００ｘｇ、４℃で１５分間遠心した後、上清を捨て、−８０℃で冷凍保存した。冷凍保存しておいた開始ｔＲＮＡ大量発現菌体を５０ｍｌサイズのファルコンチューブ１本あたり１０ｍｌの０．３Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ４．７５）で懸濁後、１０ｍｌの水飽和フェノールを加えて室温で一晩振とうした。６，０００ｘｇ、２５℃で２０分間遠心した後、水層を新しい５０ｍｌファルコンチューブに移した。残ったフェノール層に、５ｍｌの０．３Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ４．７５）を加えてよく攪拌し、６，０００ｘｇ、２５℃で２０分間遠心した後、水層を１本の５０ｍｌファルコンチューブにまとめた。まとめた水層を４本の５０ｍｌファルコンチューブに分けてエタノール沈殿し、７０％エタノールでリンスした後、沈殿を乾燥させた。７Ｍ尿素を含む１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で開始ｔＲＮＡの発現を確認した後、アミノアシルｔＲＮＡからアミノ酸を解離させるために５０ｍｌファルコンチューブ１本分の沈殿を１０ｍｌの５０ｍＭ炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．１）に溶解し、さらに１０ｍｌの水飽和フェノールを加えて室温で一晩振とうした。６，０００ｘｇ、２５℃で２０分間遠心した後、水層を新しい５０ｍｌファルコンチューブに移した。フェノール層に、５ｍｌの５０ｍＭ炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．１）を加えてよく攪拌し、６，０００ｘｇ、２５℃で２０分間遠心した後、水層を１本の５０ｍｌファルコンチューブにまとめた。この溶液をエタノール沈殿し、７０％エタノールでリンスした後、沈殿を乾燥させた。５０ｍｌファルコンチューブ１本分の沈殿を１０ｍｌのバッファーＡ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．４Ｍ ＮａＣｌ）に溶解して１本にまとめ（合計４０ｍｌ）、バッファーＡで平衡化しておいた陰イオン交換カラムＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（アマシャムバイオサイエンス社製）に流速２ｍｌ／ｍｉｎでロードした。樹脂に吸着しない余分なＲＮＡ等を除くために、バッファーＡで洗浄後、バッファーＡとバッファーＢ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．７Ｍ ＮａＣｌ）を使用して０．４Ｍから０．７Ｍ ＮａＣｌの直線濃度勾配でｔＲＮＡを溶出した。溶出画分は、１０ｍｌずつ分画し、各フラクションの２６０ｎｍの吸光度を測定した。吸光度のピークフラクションの２μｌを、それぞれ７Ｍ尿素を含む１５％ＰＡＧＥで解析し、目的の開始ｔＲＮＡのみが溶出している画分を１本の５０ｍｌファルコンチューブに回収した。エタノール沈殿後、Ｈ２Ｏに溶解し、−３０℃に保存した。２６０ｎｍの吸光度を測定して開始ｔＲＮＡの回収量を算出したところ、４ｌの培養液から、８０８ Ａ２６０ｕｎｉｔｓ／ｍｌの濃度で約６００ Ａ２６０ｕｎｉｔｓの開始ｔＲＮＡが回収された。
大腸菌の開始ｔＲＮＡ遺伝子を組み込んだプラスミドｐＧＥＭＥＸ１−ｔＲＮＡｆＭｅｔで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。ＬＢ−アンピシリン（ａｍｐ）プレート上にて３７℃で一晩培養後、生じたコロニーのひとつを２ｍｌのＬＢ−ａｍｐ培地に植菌し、３７℃で４時間培養した。培養液４５０μｌを１ｌのＬＢ−ａｍｐ培地に加え、３７℃で振とう培養した。６００ｎｍの吸光度が約０．７近くに達した時、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）の終濃度が０．５ｍＭになるように加えた。さらに３７℃で４時間培養して菌体を回収した。１ｌの培養液から回収した菌体を０．２Ｍ ＫＣｌで懸濁して１本の５０ｍｌファルコンチューブにまとめ、６，０００ｘｇ、４℃で１５分間遠心した後、上清を捨て、−８０℃で冷凍保存した。冷凍保存しておいた開始ｔＲＮＡ大量発現菌体を５０ｍｌサイズのファルコンチューブ１本あたり１０ｍｌの０．３Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ４．７５）で懸濁後、１０ｍｌの水飽和フェノールを加えて室温で一晩振とうした。６，０００ｘｇ、２５℃で２０分間遠心した後、水層を新しい５０ｍｌファルコンチューブに移した。残ったフェノール層に、５ｍｌの０．３Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ４．７５）を加えてよく攪拌し、６，０００ｘｇ、２５℃で２０分間遠心した後、水層を１本の５０ｍｌファルコンチューブにまとめた。まとめた水層を４本の５０ｍｌファルコンチューブに分けてエタノール沈殿し、７０％エタノールでリンスした後、沈殿を乾燥させた。７Ｍ尿素を含む１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で開始ｔＲＮＡの発現を確認した後、アミノアシルｔＲＮＡからアミノ酸を解離させるために５０ｍｌファルコンチューブ１本分の沈殿を１０ｍｌの５０ｍＭ炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．１）に溶解し、さらに１０ｍｌの水飽和フェノールを加えて室温で一晩振とうした。６，０００ｘｇ、２５℃で２０分間遠心した後、水層を新しい５０ｍｌファルコンチューブに移した。フェノール層に、５ｍｌの５０ｍＭ炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．１）を加えてよく攪拌し、６，０００ｘｇ、２５℃で２０分間遠心した後、水層を１本の５０ｍｌファルコンチューブにまとめた。この溶液をエタノール沈殿し、７０％エタノールでリンスした後、沈殿を乾燥させた。５０ｍｌファルコンチューブ１本分の沈殿を１０ｍｌのバッファーＡ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．４Ｍ ＮａＣｌ）に溶解して１本にまとめ（合計４０ｍｌ）、バッファーＡで平衡化しておいた陰イオン交換カラムＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（アマシャムバイオサイエンス社製）に流速２ｍｌ／ｍｉｎでロードした。樹脂に吸着しない余分なＲＮＡ等を除くために、バッファーＡで洗浄後、バッファーＡとバッファーＢ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．７Ｍ ＮａＣｌ）を使用して０．４Ｍから０．７Ｍ ＮａＣｌの直線濃度勾配でｔＲＮＡを溶出した。溶出画分は、１０ｍｌずつ分画し、各フラクションの２６０ｎｍの吸光度を測定した。吸光度のピークフラクションの２μｌを、それぞれ７Ｍ尿素を含む１５％ＰＡＧＥで解析し、目的の開始ｔＲＮＡのみが溶出している画分を１本の５０ｍｌファルコンチューブに回収した。エタノール沈殿後、Ｈ２Ｏに溶解し、−３０℃に保存した。２６０ｎｍの吸光度を測定して開始ｔＲＮＡの回収量を算出したところ、４ｌの培養液から、８０８ Ａ２６０ｕｎｉｔｓ／ｍｌの濃度で約６００ Ａ２６０ｕｎｉｔｓの開始ｔＲＮＡが回収された。
メチオニル開始ｔＲＮＡの調製
反応液として、５ｘＡＡＭ（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．２Ｍ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＡＴＰ）を３ｍｌ、開始ｔＲＮＡを１６６ Ａ２６０ｕｎｉｔｓ、１００ｍＭ メチオニンを１０μｌとメチオニルｔＲＮＡ合成酵素（ＭｅｔＲＳ）１．０２ｍｇを混合し、３７℃で３０分反応させた。バッファーＣ（２０ｍＭ 酢酸カリウム（ｐＨ４．７５）、０．２Ｍ ＮａＣｌ）を１４．５ｍｌ加え、ゆっくり攪拌した。この溶液を、バッファーＣで平衡化した樹脂体積１ｍｌの陰イオン交換カラムＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（アマシャムバイオサイエンス社製）にロードした。バッファーＣで十分洗浄した後、バッファーＤ（２０ｍＭ 酢酸カリウム（ｐＨ４．７５）、１Ｍ ＮａＣｌ）で溶出した。目的のメチオニル開始ｔＲＮＡを含む画分を回収し、エタノール沈殿後、乾燥した。２６０ｎｍの吸光度を測定して濃度を算出し、−３０℃で保存した。
反応液として、５ｘＡＡＭ（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．２Ｍ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＡＴＰ）を３ｍｌ、開始ｔＲＮＡを１６６ Ａ２６０ｕｎｉｔｓ、１００ｍＭ メチオニンを１０μｌとメチオニルｔＲＮＡ合成酵素（ＭｅｔＲＳ）１．０２ｍｇを混合し、３７℃で３０分反応させた。バッファーＣ（２０ｍＭ 酢酸カリウム（ｐＨ４．７５）、０．２Ｍ ＮａＣｌ）を１４．５ｍｌ加え、ゆっくり攪拌した。この溶液を、バッファーＣで平衡化した樹脂体積１ｍｌの陰イオン交換カラムＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（アマシャムバイオサイエンス社製）にロードした。バッファーＣで十分洗浄した後、バッファーＤ（２０ｍＭ 酢酸カリウム（ｐＨ４．７５）、１Ｍ ＮａＣｌ）で溶出した。目的のメチオニル開始ｔＲＮＡを含む画分を回収し、エタノール沈殿後、乾燥した。２６０ｎｍの吸光度を測定して濃度を算出し、−３０℃で保存した。
蛍光標識メチオニル開始ｔＲＮＡの調製
メチオニル開始ｔＲＮＡのαアミノ基に蛍光色素を導入した蛍光修飾メチオニル開始ｔＲＮＡを以下のように調製した。６．２５ Ａ２６０ｕｎｉｔｓのメチオニル開始ｔＲＮＡと１０ｍｇ／ｍｌの蛍光色素標識スクシニイミジルエステル（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｅｓｔｅｒ；ＳＥ）ジメチルホルムアミド溶液７．５μｌ、０．１Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ７．９）を含む全量３０μｌ中で、遮光し氷上１時間反応させた。蛍光色素標識ＳＥとして、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ−ＳＥ、Ｃａｒｂｏｘｙｒｈｏｄａｍｉｎｅ ６Ｇ−ＳＥ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−ＳＥ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０−ＳＥ（モレキュラープローブ）、Ｃｙ５−ＳＥ（アマシャムバイオサイエンス）、ＩＣ３−ＳＥ（同仁化学研究所）、及びＣａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＳＥ（リサーチオーガニクス）を使用した。反応終了後、反応液に５０μｌのバッファー１（２０ｍＭ 酢酸カリウム（ｐＨ４．７５）、０．２Ｍ ＮａＣｌ）を加えて希釈し、樹脂量７０μｌのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰで作製した綿栓カラムにロードした。バッファー１で未反応の蛍光色素標識ＳＥが無くなるまで洗浄した後、１００μｌのバッファー２（２０ｍＭ 酢酸カリウム（ｐＨ４．７５）、１Ｍ ＮａＣｌ）で溶出した。樹脂量２０μｌのＢｅｎｚｏｙｌ−ＤＥＡＥセルロースで綿栓カラムを２本作り、３００μｌのバッファー２で平衡化した後、１本目の綿栓カラムに先の溶出液をロードした。通過液を２本目の綿栓カラムにロードした。これら２本の綿栓カラムをそれぞれ１００μｌのバッファー２で４回洗浄した後、３００μｌのバッファー３（２０ｍＭ 酢酸カリウム（ｐＨ４．７５）、１Ｍ ＮａＣｌ、３０％エタノール）で溶出した。溶出液をまとめ、８５０μｌのエタノールを加えてエタノール沈殿した。沈殿をバッファー４（２０ｍＭ 酢酸カリウム（ｐＨ４．７５）、６ｍＭ βメルカプトエタノール）に溶解後、２６０ｎｍの吸光度を測定して濃度を決定した。調製した蛍光標識メチオニル開始ｔＲＮＡは、タンパク質合成で使用するまで−３０℃で保存した。調製した蛍光標識メチオニル開始ｔＲＮＡの０．０１ Ａ２６０ｕｎｉｔを、７Ｍ尿素を含む１０％ＰＡＧＥで分析し、蛍光イメージャーＬＡＳ３０００ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ（富士写真フィルム）により可視化した結果を図１に示す。この結果より、どの蛍光色素標識ＳＥを用いた場合でもメチオニル開始ｔＲＮＡに蛍光が導入できることが示された。
メチオニル開始ｔＲＮＡのαアミノ基に蛍光色素を導入した蛍光修飾メチオニル開始ｔＲＮＡを以下のように調製した。６．２５ Ａ２６０ｕｎｉｔｓのメチオニル開始ｔＲＮＡと１０ｍｇ／ｍｌの蛍光色素標識スクシニイミジルエステル（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｅｓｔｅｒ；ＳＥ）ジメチルホルムアミド溶液７．５μｌ、０．１Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ７．９）を含む全量３０μｌ中で、遮光し氷上１時間反応させた。蛍光色素標識ＳＥとして、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ−ＳＥ、Ｃａｒｂｏｘｙｒｈｏｄａｍｉｎｅ ６Ｇ−ＳＥ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−ＳＥ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０−ＳＥ（モレキュラープローブ）、Ｃｙ５−ＳＥ（アマシャムバイオサイエンス）、ＩＣ３−ＳＥ（同仁化学研究所）、及びＣａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＳＥ（リサーチオーガニクス）を使用した。反応終了後、反応液に５０μｌのバッファー１（２０ｍＭ 酢酸カリウム（ｐＨ４．７５）、０．２Ｍ ＮａＣｌ）を加えて希釈し、樹脂量７０μｌのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰで作製した綿栓カラムにロードした。バッファー１で未反応の蛍光色素標識ＳＥが無くなるまで洗浄した後、１００μｌのバッファー２（２０ｍＭ 酢酸カリウム（ｐＨ４．７５）、１Ｍ ＮａＣｌ）で溶出した。樹脂量２０μｌのＢｅｎｚｏｙｌ−ＤＥＡＥセルロースで綿栓カラムを２本作り、３００μｌのバッファー２で平衡化した後、１本目の綿栓カラムに先の溶出液をロードした。通過液を２本目の綿栓カラムにロードした。これら２本の綿栓カラムをそれぞれ１００μｌのバッファー２で４回洗浄した後、３００μｌのバッファー３（２０ｍＭ 酢酸カリウム（ｐＨ４．７５）、１Ｍ ＮａＣｌ、３０％エタノール）で溶出した。溶出液をまとめ、８５０μｌのエタノールを加えてエタノール沈殿した。沈殿をバッファー４（２０ｍＭ 酢酸カリウム（ｐＨ４．７５）、６ｍＭ βメルカプトエタノール）に溶解後、２６０ｎｍの吸光度を測定して濃度を決定した。調製した蛍光標識メチオニル開始ｔＲＮＡは、タンパク質合成で使用するまで−３０℃で保存した。調製した蛍光標識メチオニル開始ｔＲＮＡの０．０１ Ａ２６０ｕｎｉｔを、７Ｍ尿素を含む１０％ＰＡＧＥで分析し、蛍光イメージャーＬＡＳ３０００ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ（富士写真フィルム）により可視化した結果を図１に示す。この結果より、どの蛍光色素標識ＳＥを用いた場合でもメチオニル開始ｔＲＮＡに蛍光が導入できることが示された。
ビオチン化ＤＮＡ結合樹脂の作製
ＤＮＡプローブは、大腸菌開始ｔＲＮＡの３’領域に相補的なプローブＡ（５’ＴＴＧＣＧＧＧＧＧＣＣＧＧＡＴＴＴＧＡＡＣＣＧＡＣＧＡ ３’ ）とアンチコドンを含む領域に相補的なプローブＢ（５’ ＴＴＡＴＧＡＧＣＣＣＧＡＣＧＡＧＣＴＡＣＣＡＧＧＣＴ ３’ ）の２種類を設計して使用した。１．５ｍｌのろ過チューブのフィルター容器に５０μｌのストレプトアビジンアガロース懸濁液（樹脂量２５μｌ）を加え、６，０００ｘｇで１０秒ほど遠心してバッファーを除いた。フィルター容器内の樹脂を４００μｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で懸濁し、再度６，０００ｘｇで遠心した。この操作を２度繰り返した。大腸菌の開始ｔＲＮＡに相補的なビオチン化オリゴＤＮＡプローブ０．２５ Ａ２６０ｕｎｉｔ相当を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）４００μｌに溶解し、これをストレプトアビジンアガロース樹脂が入ったフィルター容器に加え、たびたび振りながら室温で１０分ほど放置した。これを６，０００ｘｇで遠心し、結合しなかったＤＮＡプローブを除いた。樹脂へのＤＮＡプローブ固定量は、結合しなかったＤＮＡプローブの吸光度を測定することで算出した。
ＤＮＡプローブは、大腸菌開始ｔＲＮＡの３’領域に相補的なプローブＡ（５’ＴＴＧＣＧＧＧＧＧＣＣＧＧＡＴＴＴＧＡＡＣＣＧＡＣＧＡ ３’ ）とアンチコドンを含む領域に相補的なプローブＢ（５’ ＴＴＡＴＧＡＧＣＣＣＧＡＣＧＡＧＣＴＡＣＣＡＧＧＣＴ ３’ ）の２種類を設計して使用した。１．５ｍｌのろ過チューブのフィルター容器に５０μｌのストレプトアビジンアガロース懸濁液（樹脂量２５μｌ）を加え、６，０００ｘｇで１０秒ほど遠心してバッファーを除いた。フィルター容器内の樹脂を４００μｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で懸濁し、再度６，０００ｘｇで遠心した。この操作を２度繰り返した。大腸菌の開始ｔＲＮＡに相補的なビオチン化オリゴＤＮＡプローブ０．２５ Ａ２６０ｕｎｉｔ相当を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）４００μｌに溶解し、これをストレプトアビジンアガロース樹脂が入ったフィルター容器に加え、たびたび振りながら室温で１０分ほど放置した。これを６，０００ｘｇで遠心し、結合しなかったＤＮＡプローブを除いた。樹脂へのＤＮＡプローブ固定量は、結合しなかったＤＮＡプローブの吸光度を測定することで算出した。
固相化プローブ法によるｔＲＮＡ Ｍｉｘからの開始ｔＲＮＡの除去
３５ Ａ２６０ｕｎｉｔｓの大腸菌ｔＲＮＡ Ｍｉｘに、１２ｘバッファーＣ（１８０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．８Ｍ テトラメチルアンモニウムクロライド、１２ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））を２００μｌ加え、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ水で４００μｌとし６５℃で５分間保温した。実施例４で作製したビオチン化ＤＮＡ結合樹脂を含むフィルター容器に添加し、さらに６５℃で２分間保温した。その後２５℃までゆっくり冷却し、開始ｔＲＮＡを樹脂に結合させた。６，０００ｘｇで１０秒ほど遠心し、結合しなかったｔＲＮＡ溶液を回収し、開始ｔＲＮＡを除去した大腸菌ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ）とした。４００μｌの３ｘＳＳＣ（４５ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．４５Ｍ ＮａＣｌ）をフィルター容器に加えて樹脂を攪拌し、６，０００ｘｇで１０秒程度遠心して３ｘＳＳＣを除去することにより樹脂を洗浄した。透過する３ｘＳＳＣの吸光度が０．０１ Ａ２６０ｕｎｉｔ／ｍｌ以下になるまで洗浄操作を繰り返した。樹脂に結合した開始ｔＲＮＡを回収するために、あらかじめ６５℃で保温しておいた０．１ｘＳＳＣ ２００μｌをフィルター容器に加え、６５℃で５分間保温した。溶液の温度が下がらないうちに６，０００ｘｇで１０秒程度遠心し、開始ｔＲＮＡを回収した。この操作をもう一度繰り返し、溶出液をひとつにまとめた。開始ｔＲＮＡを除去した実質的に伸長ｔＲＮＡのみからなる大腸菌ｔＲＮＡ Ｍｉｘの純度および、開始ｔＲＮＡの樹脂への結合を７Ｍ尿素を含む１５％ＰＡＧＥで確認した結果を図２に示す。右側のパネルのノーザンブロッティングの結果から、未処理のｔＲＮＡ Ｍｉｘをロードしたレーン２、および樹脂から溶出した開始ｔＲＮＡをロードしたレーン５、６には開始ｔＲＮＡのバンドが確認できるが、ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ）をロードしたレーン３、４にはバンドが確認できない。この結果は、プローブＡ又はプローブＢのどちらのプローブを用いた場合でも、ｔＲＮＡ Ｍｉｘから開始ｔＲＮＡがほとんど除去できていることを示している。
３５ Ａ２６０ｕｎｉｔｓの大腸菌ｔＲＮＡ Ｍｉｘに、１２ｘバッファーＣ（１８０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．８Ｍ テトラメチルアンモニウムクロライド、１２ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））を２００μｌ加え、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ水で４００μｌとし６５℃で５分間保温した。実施例４で作製したビオチン化ＤＮＡ結合樹脂を含むフィルター容器に添加し、さらに６５℃で２分間保温した。その後２５℃までゆっくり冷却し、開始ｔＲＮＡを樹脂に結合させた。６，０００ｘｇで１０秒ほど遠心し、結合しなかったｔＲＮＡ溶液を回収し、開始ｔＲＮＡを除去した大腸菌ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ）とした。４００μｌの３ｘＳＳＣ（４５ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．４５Ｍ ＮａＣｌ）をフィルター容器に加えて樹脂を攪拌し、６，０００ｘｇで１０秒程度遠心して３ｘＳＳＣを除去することにより樹脂を洗浄した。透過する３ｘＳＳＣの吸光度が０．０１ Ａ２６０ｕｎｉｔ／ｍｌ以下になるまで洗浄操作を繰り返した。樹脂に結合した開始ｔＲＮＡを回収するために、あらかじめ６５℃で保温しておいた０．１ｘＳＳＣ ２００μｌをフィルター容器に加え、６５℃で５分間保温した。溶液の温度が下がらないうちに６，０００ｘｇで１０秒程度遠心し、開始ｔＲＮＡを回収した。この操作をもう一度繰り返し、溶出液をひとつにまとめた。開始ｔＲＮＡを除去した実質的に伸長ｔＲＮＡのみからなる大腸菌ｔＲＮＡ Ｍｉｘの純度および、開始ｔＲＮＡの樹脂への結合を７Ｍ尿素を含む１５％ＰＡＧＥで確認した結果を図２に示す。右側のパネルのノーザンブロッティングの結果から、未処理のｔＲＮＡ Ｍｉｘをロードしたレーン２、および樹脂から溶出した開始ｔＲＮＡをロードしたレーン５、６には開始ｔＲＮＡのバンドが確認できるが、ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ）をロードしたレーン３、４にはバンドが確認できない。この結果は、プローブＡ又はプローブＢのどちらのプローブを用いた場合でも、ｔＲＮＡ Ｍｉｘから開始ｔＲＮＡがほとんど除去できていることを示している。
開始ｔＲＮＡを除去した実質的に伸長ｔＲＮＡのみからなる大腸菌ｔＲＮＡ混合液を用いたタンパク質合成
ＦＤおよびＭＴＦおよびｔＲＮＡ Ｍｉｘをいずれも含まない再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系（ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ／−ＦＤ、ＭＴＦ、ｔＲＮＡ）に、ＤＮＡプローブＢ固定化樹脂を用いて開始ｔＲＮＡを除去した大腸菌ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ）、および開始ｔＲＮＡを加えカルモジュリンの合成を行なった。ＦＤおよびＭＴＦおよびｔＲＮＡ Ｍｉｘをいずれも含まない再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系（ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ／−ＦＤ、ＭＴＦ、ｔＲＮＡ）には、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＧＴＰ、１ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ＵＴＰ、２０ｍＭ クレアチンリン酸、０．３ｍＭ 各アミノ酸、１３ｍＭ 酢酸マグネシウム、１００ｍＭ グルタミン酸カリウム、２ｍＭ スペルミジン（ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）、１ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１．２μＭ リボソーム、０．０２μｇ／μｌ ＩＦ１、０．０４μｇ／μｌ ＩＦ２、０．０１５μｇ／μｌ ＩＦ３、０．０２μｇ／μｌ ＥＦ−Ｇ、０．０４μｇ／μｌ ＥＦ−Ｔｕ、０．０２μｇ／μｌ ＥＦ−Ｔｓ、０．０１μｇ／μｌ ＲＦ１、０．０１μｇ／μｌ ＲＦ２、０．０１μｇ／μｌ ＲＦ３、０．０１μｇ／μｌ ＲＲＦ、０．６−６ｕｎｉｔｓ／μｌ各アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＲＳ）、０．００４μｇ／μｌ クレアチンキナーゼ（ＣＫ；ｃｒｅａｔｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）、０．００３μｇ／μｌ ミオキナーゼ（ＭＫ；ｍｙｏｋｉｎａｓｅ）、０．００１μｇ／μｌ ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＮＤＫ；ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）、０．０３５６ｕｎｉｔｓ／μｌ ピロフォスファターゼ及び０．０１μｇ／μｌ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが含まれている。さらに、０．１６７μｌのｒｅｄｉｖｕｅ Ｐｒｏ−ｍｉｘ Ｌ−［３５Ｓ］ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｅｌｌ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｍｉｘ（アマシャムバイオサイエンス＃ＡＧＱ００８０）と０．１６７μｇのカルモジュリン鋳型ＤＮＡを加え、Ｈ２Ｏで容量を８．３３μｌにした。また、ＦＤを加える場合は０．０６７μｇ、ＭＴＦを加える場合は０．０８３５μｇ、ｔＲＮＡ Ｍｉｘを加える場合は０．４８ Ａ２６０ｕｎｉｔ、ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ）を加える場合は０．４８ Ａ２６０ｕｎｉｔ、開始ｔＲＮＡを加える場合は０．０５−０．２ Ａ２６０ｕｎｉｔをそれぞれ加えた。合成反応は、３７℃で１時間行なった。各合成反応液の５．５μｌを、１５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ＰＡＧＥにて分離後、イメージャーＢＡＳ２５００（富士写真フィルム）により可視化した結果を図３に示す。ｔＲＮＡ Ｍｉｘの代わりにｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ）を使用したタンパク質合成系では、カルモジュリンはほとんど合成されなかったが（レーン６）、そこに開始ｔＲＮＡを加えた場合に合成量が回復した（レーン３−５）。この結果より、タンパク質合成反応試薬からＦＤおよびＭＴＦおよび開始ｔＲＮＡを除去した場合、タンパク質はほとんど合成されないことが確認できた。
ＦＤおよびＭＴＦおよびｔＲＮＡ Ｍｉｘをいずれも含まない再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系（ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ／−ＦＤ、ＭＴＦ、ｔＲＮＡ）に、ＤＮＡプローブＢ固定化樹脂を用いて開始ｔＲＮＡを除去した大腸菌ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ）、および開始ｔＲＮＡを加えカルモジュリンの合成を行なった。ＦＤおよびＭＴＦおよびｔＲＮＡ Ｍｉｘをいずれも含まない再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系（ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ／−ＦＤ、ＭＴＦ、ｔＲＮＡ）には、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＧＴＰ、１ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ＵＴＰ、２０ｍＭ クレアチンリン酸、０．３ｍＭ 各アミノ酸、１３ｍＭ 酢酸マグネシウム、１００ｍＭ グルタミン酸カリウム、２ｍＭ スペルミジン（ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）、１ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１．２μＭ リボソーム、０．０２μｇ／μｌ ＩＦ１、０．０４μｇ／μｌ ＩＦ２、０．０１５μｇ／μｌ ＩＦ３、０．０２μｇ／μｌ ＥＦ−Ｇ、０．０４μｇ／μｌ ＥＦ−Ｔｕ、０．０２μｇ／μｌ ＥＦ−Ｔｓ、０．０１μｇ／μｌ ＲＦ１、０．０１μｇ／μｌ ＲＦ２、０．０１μｇ／μｌ ＲＦ３、０．０１μｇ／μｌ ＲＲＦ、０．６−６ｕｎｉｔｓ／μｌ各アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＡＲＳ）、０．００４μｇ／μｌ クレアチンキナーゼ（ＣＫ；ｃｒｅａｔｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）、０．００３μｇ／μｌ ミオキナーゼ（ＭＫ；ｍｙｏｋｉｎａｓｅ）、０．００１μｇ／μｌ ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＮＤＫ；ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）、０．０３５６ｕｎｉｔｓ／μｌ ピロフォスファターゼ及び０．０１μｇ／μｌ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが含まれている。さらに、０．１６７μｌのｒｅｄｉｖｕｅ Ｐｒｏ−ｍｉｘ Ｌ−［３５Ｓ］ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｅｌｌ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｍｉｘ（アマシャムバイオサイエンス＃ＡＧＱ００８０）と０．１６７μｇのカルモジュリン鋳型ＤＮＡを加え、Ｈ２Ｏで容量を８．３３μｌにした。また、ＦＤを加える場合は０．０６７μｇ、ＭＴＦを加える場合は０．０８３５μｇ、ｔＲＮＡ Ｍｉｘを加える場合は０．４８ Ａ２６０ｕｎｉｔ、ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ）を加える場合は０．４８ Ａ２６０ｕｎｉｔ、開始ｔＲＮＡを加える場合は０．０５−０．２ Ａ２６０ｕｎｉｔをそれぞれ加えた。合成反応は、３７℃で１時間行なった。各合成反応液の５．５μｌを、１５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ＰＡＧＥにて分離後、イメージャーＢＡＳ２５００（富士写真フィルム）により可視化した結果を図３に示す。ｔＲＮＡ Ｍｉｘの代わりにｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ）を使用したタンパク質合成系では、カルモジュリンはほとんど合成されなかったが（レーン６）、そこに開始ｔＲＮＡを加えた場合に合成量が回復した（レーン３−５）。この結果より、タンパク質合成反応試薬からＦＤおよびＭＴＦおよび開始ｔＲＮＡを除去した場合、タンパク質はほとんど合成されないことが確認できた。
タンパク質合成反応時間の検討
ＦＤ、ＭＴＦ及びｔＲＮＡ Ｍｉｘをいずれも含まない再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系（ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ／−ＦＤ、ＭＴＦ、ｔＲＮＡ）に、カルモジュリン鋳型ＤＮＡを１μｇ、ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ）を２．８ Ａ２６０ｕｎｉｔｓ、ＩＣ３付加メチオニル開始ｔＲＮＡを０．１ Ａ２６０ｕｎｉｔ加え、Ｈ２Ｏで容量を５０μｌにした。合成反応は３７℃で行ない、合成開始後、０、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、及び６０分においてサンプリングした。各サンプルを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ＬＡＳ３０００ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ（富士写真フィルム）でＩＣ３の蛍光を検出した（図４）。この結果より、３０分の合成時間でＩＣ３導入カルモジュリンは十分合成されることが分かった。
ＦＤ、ＭＴＦ及びｔＲＮＡ Ｍｉｘをいずれも含まない再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系（ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ／−ＦＤ、ＭＴＦ、ｔＲＮＡ）に、カルモジュリン鋳型ＤＮＡを１μｇ、ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ）を２．８ Ａ２６０ｕｎｉｔｓ、ＩＣ３付加メチオニル開始ｔＲＮＡを０．１ Ａ２６０ｕｎｉｔ加え、Ｈ２Ｏで容量を５０μｌにした。合成反応は３７℃で行ない、合成開始後、０、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、及び６０分においてサンプリングした。各サンプルを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ＬＡＳ３０００ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ（富士写真フィルム）でＩＣ３の蛍光を検出した（図４）。この結果より、３０分の合成時間でＩＣ３導入カルモジュリンは十分合成されることが分かった。
蛍光標識メチオニル開始ｔＲＮＡによるＮ末端標識
ＦＤ、ＭＴＦ、ｔＲＮＡ Ｍｉｘを含まない再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系（ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ／−ＦＤ、ＭＴＦ、ｔＲＮＡ）に、１μｇのカルモジュリン鋳型ＤＮＡを加え、Ｈ２Ｏで容量を５０μｌにした。また、ＦＤを加える場合は０．５μｇ、ＭＴＦを加える場合は０．４μｇ、ｔＲＮＡ Ｍｉｘを加える場合は２．８ Ａ２６０ｕｎｉｔｓ、ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ）を加える場合は２．８ Ａ２６０ｕｎｉｔｓ、ＩＣ３付加メチオニル開始ｔＲＮＡを加える場合は０．１ Ａ２６０ｕｎｉｔをそれぞれ加えた。反応液を混合後、３７℃にて３０分反応させた。
大腸菌Ｓ３０細胞抽出液を使用した合成反応は、１０ｘバッファー（５００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、７７ｍＭ 酢酸マグネシウム、２７５ｍＭ 酢酸アンモニウム、２Ｍ 酢酸カリウム、１７ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ フォリン酸、１０ｍＭ 各アミノ酸）を５μｌ、１００ｍＭ 各ＮＴＰを１．８８μｌ、１Ｍ クレアチンリン酸を４μｌ、１５ｍｇ／ｍｌ ＣＫを０．７μｌ、１７０ Ａ２６０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ大腸菌ｔＲＮＡ Ｍｉｘを１μｌ、１１ｍｇ／ｍｌ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．４６μｌ、２０％ＰＥＧを１０μｌ、Ｓ３０抽出液を１５μｌ、１ｍｇ／ｍｌカルモジュリン鋳型ＤＮＡを１μｌに、精製したＩＣ３付加メチオニル開始ｔＲＮＡ、もしくは未精製ＩＣ３付加メチオニル開始ｔＲＮＡを０．１ Ａ２６０ｕｎｉｔを加え、さらにＨ２Ｏで容量を５０μｌとした反応液を３０℃で３０分間反応させた。カルモジュリンは、カルシウムイオンと結合するとコンフォメーションが変化し、内部に埋まっていた疎水性ドメインが露出する。この特性を利用し、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂ（アマシャムバイオサイエンス）を用いて、合成したカルモジュリンを精製した。合成反応液１００μｌに、１Ｍ ＣａＣｌ２を２．５μｌ加えて室温で１０分間放置した後、１０，０００ｒｐｍ、室温で１０分間遠心した。上清を４倍量の平衡バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ）で希釈後、平衡バッファーで平衡化した２５μｌのＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂ樹脂にロードした。樹脂を洗浄バッファー１（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２）１００μｌ、および洗浄バッファー２（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、５００ｍＭ ＮａＣｌ）１００μｌで洗浄後、吸着したカルモジュリンを溶出バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＥＧＴＡ（ｐＨ８．０））２５μｌで２回溶出した。精製したカルモジュリンを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ＬＡＳ３０００ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ（富士写真フィルム）でＩＣ３の蛍光を検出した。また、銀染色によりタンパク質を染色した。結果を図５に示した。Ｓ３０合成系（レーン１）と比較してＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭを利用した場合、ＩＣ３導入カルモジュリンの合成量が明らかに多いことが確認できた。ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭにおいてはＦＤおよびＭＴＦおよび開始ｔＲＮＡを含まない反応系を使用することで、合成カルモジュリン全体に占めるＩＣ３導入カルモジュリンの割合が８０％以上に向上した（図５：レーン４および９）。また、レーン４と９の比較から精製した蛍光標識メチオニル開始ｔＲＮＡを使用することにより、ＩＣ３導入カルモジュリンの合成量が約２倍増加することが確認できた。
ＦＤ、ＭＴＦ、ｔＲＮＡ Ｍｉｘを含まない再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系（ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ／−ＦＤ、ＭＴＦ、ｔＲＮＡ）に、１μｇのカルモジュリン鋳型ＤＮＡを加え、Ｈ２Ｏで容量を５０μｌにした。また、ＦＤを加える場合は０．５μｇ、ＭＴＦを加える場合は０．４μｇ、ｔＲＮＡ Ｍｉｘを加える場合は２．８ Ａ２６０ｕｎｉｔｓ、ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ）を加える場合は２．８ Ａ２６０ｕｎｉｔｓ、ＩＣ３付加メチオニル開始ｔＲＮＡを加える場合は０．１ Ａ２６０ｕｎｉｔをそれぞれ加えた。反応液を混合後、３７℃にて３０分反応させた。
大腸菌Ｓ３０細胞抽出液を使用した合成反応は、１０ｘバッファー（５００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、７７ｍＭ 酢酸マグネシウム、２７５ｍＭ 酢酸アンモニウム、２Ｍ 酢酸カリウム、１７ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ フォリン酸、１０ｍＭ 各アミノ酸）を５μｌ、１００ｍＭ 各ＮＴＰを１．８８μｌ、１Ｍ クレアチンリン酸を４μｌ、１５ｍｇ／ｍｌ ＣＫを０．７μｌ、１７０ Ａ２６０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ大腸菌ｔＲＮＡ Ｍｉｘを１μｌ、１１ｍｇ／ｍｌ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．４６μｌ、２０％ＰＥＧを１０μｌ、Ｓ３０抽出液を１５μｌ、１ｍｇ／ｍｌカルモジュリン鋳型ＤＮＡを１μｌに、精製したＩＣ３付加メチオニル開始ｔＲＮＡ、もしくは未精製ＩＣ３付加メチオニル開始ｔＲＮＡを０．１ Ａ２６０ｕｎｉｔを加え、さらにＨ２Ｏで容量を５０μｌとした反応液を３０℃で３０分間反応させた。カルモジュリンは、カルシウムイオンと結合するとコンフォメーションが変化し、内部に埋まっていた疎水性ドメインが露出する。この特性を利用し、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂ（アマシャムバイオサイエンス）を用いて、合成したカルモジュリンを精製した。合成反応液１００μｌに、１Ｍ ＣａＣｌ２を２．５μｌ加えて室温で１０分間放置した後、１０，０００ｒｐｍ、室温で１０分間遠心した。上清を４倍量の平衡バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ）で希釈後、平衡バッファーで平衡化した２５μｌのＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂ樹脂にロードした。樹脂を洗浄バッファー１（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２）１００μｌ、および洗浄バッファー２（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、５００ｍＭ ＮａＣｌ）１００μｌで洗浄後、吸着したカルモジュリンを溶出バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＥＧＴＡ（ｐＨ８．０））２５μｌで２回溶出した。精製したカルモジュリンを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ＬＡＳ３０００ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ（富士写真フィルム）でＩＣ３の蛍光を検出した。また、銀染色によりタンパク質を染色した。結果を図５に示した。Ｓ３０合成系（レーン１）と比較してＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭを利用した場合、ＩＣ３導入カルモジュリンの合成量が明らかに多いことが確認できた。ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭにおいてはＦＤおよびＭＴＦおよび開始ｔＲＮＡを含まない反応系を使用することで、合成カルモジュリン全体に占めるＩＣ３導入カルモジュリンの割合が８０％以上に向上した（図５：レーン４および９）。また、レーン４と９の比較から精製した蛍光標識メチオニル開始ｔＲＮＡを使用することにより、ＩＣ３導入カルモジュリンの合成量が約２倍増加することが確認できた。
蛍光標識メチオニル開始ｔＲＮＡの調製
メチオニル開始ｔＲＮＡのαアミノ基に蛍光色素を導入した蛍光修飾メチオニル開始ｔＲＮＡを以下のように調製した。６．２５ Ａ２６０ｕｎｉｔｓのメチオニル開始ｔＲＮＡと約１０ｍｇ／ｍｌの蛍光色素標識スクシニイミジルエステル（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｅｓｔｅｒ；ＳＥ）ジメチルホルムアミド溶液７．５μｌ，０．１Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ７．９）を含む全量３０μｌ中で，遮光し氷上１時間反応させた。
蛍光色素標識ＳＥとして，５−ａｎｄ−６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ ＳＥ（リサーチオーガニクス），５−（ａｎｄ−６）−ｃａｒｂｏｘｙｒｈｏｄａｍｉｎｅ ６Ｇ ＳＥ＜５（６）−ＣＲ ６Ｇ，ＳＥ＞，Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−Ｘ ＳＥ（モレキュラープローブ），Ｃｙ５ Ｍｏｎｏ−ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｄｙｅ（アマシャムバイオサイエンス），ＩＣ３−ＯＳｕ（同仁化学研究所），ＩＣ５−ＯＳｕ（同仁化学研究所），５−（ａｎｄ−６）−ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＳＥ＜５（６）−ＴＡＭＲＡ，ＳＥ＞，Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４３０ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ＳＥ（モレキュラープローブ），Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ＳＥ（モレキュラープローブ），Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ＳＥ（モレキュラープローブ），Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ−ＳＥ（モレキュラープローブ），を使用した。反応終了後，反応液に５０μｌのバッファー１（２０ｍＭ 酢酸カリウム（ｐＨ４．７５），０．２Ｍ ＮａＣｌ）を加えて希釈し，樹脂量７０μｌのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰで作製した綿栓カラムにロードした。バッファー１で未反応の蛍光色素標識ＳＥが無くなるまで洗浄した後，１００μｌのバッファー２（２０ｍＭ 酢酸カリウム（ｐＨ４．７５），１Ｍ ＮａＣｌ）で溶出した。樹脂量２０μｌのＢｅｎｚｏｙｌ−ＤＥＡＥセルロースで綿栓カラムを２本作り，３００μｌのバッファー２で平衡化した後，１本目の綿栓カラムに先の溶出液をロードした。通過液を２本目の綿栓カラムにロードした。これら２本の綿栓カラムをそれぞれ１００μｌのバッファー２で４回洗浄した後，３００μｌのバッファー３（２０ｍＭ 酢酸カリウム（ｐＨ４．７５），１Ｍ ＮａＣｌ、３０％エタノール）で溶出した。溶出液をまとめ，８５０μｌのエタノールを加えてエタノール沈殿した。沈殿をＢｕｆｆｅｒ４（２０ｍＭ 酢酸カリウム（ｐＨ４．７５），６ｍＭ βメルカプトエタノール）に溶解後，２６０ｎｍの吸光度を測定して濃度を決定した。調製した蛍光標識メチオニル開始ｔＲＮＡは，タンパク質合成で使用するまで−３０℃で保存した。調製した蛍光標識メチオニル開始ｔＲＮＡの０．０１ Ａ２６０ｕｎｉｔを，７Ｍ尿素を含む１０％ＰＡＧＥにかけ，蛍光イメージャーＬＡＳ３０００ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ（富士写真フィルム）により可視化した結果を図６に示す。どの蛍光色素標識ＳＥを用いた場合でもメチオニル開始ｔＲＮＡに蛍光が導入できることが確認できた。
メチオニル開始ｔＲＮＡのαアミノ基に蛍光色素を導入した蛍光修飾メチオニル開始ｔＲＮＡを以下のように調製した。６．２５ Ａ２６０ｕｎｉｔｓのメチオニル開始ｔＲＮＡと約１０ｍｇ／ｍｌの蛍光色素標識スクシニイミジルエステル（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｅｓｔｅｒ；ＳＥ）ジメチルホルムアミド溶液７．５μｌ，０．１Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ７．９）を含む全量３０μｌ中で，遮光し氷上１時間反応させた。
蛍光色素標識ＳＥとして，５−ａｎｄ−６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ ＳＥ（リサーチオーガニクス），５−（ａｎｄ−６）−ｃａｒｂｏｘｙｒｈｏｄａｍｉｎｅ ６Ｇ ＳＥ＜５（６）−ＣＲ ６Ｇ，ＳＥ＞，Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−Ｘ ＳＥ（モレキュラープローブ），Ｃｙ５ Ｍｏｎｏ−ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｄｙｅ（アマシャムバイオサイエンス），ＩＣ３−ＯＳｕ（同仁化学研究所），ＩＣ５−ＯＳｕ（同仁化学研究所），５−（ａｎｄ−６）−ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＳＥ＜５（６）−ＴＡＭＲＡ，ＳＥ＞，Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４３０ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ＳＥ（モレキュラープローブ），Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ＳＥ（モレキュラープローブ），Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ＳＥ（モレキュラープローブ），Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ−ＳＥ（モレキュラープローブ），を使用した。反応終了後，反応液に５０μｌのバッファー１（２０ｍＭ 酢酸カリウム（ｐＨ４．７５），０．２Ｍ ＮａＣｌ）を加えて希釈し，樹脂量７０μｌのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰで作製した綿栓カラムにロードした。バッファー１で未反応の蛍光色素標識ＳＥが無くなるまで洗浄した後，１００μｌのバッファー２（２０ｍＭ 酢酸カリウム（ｐＨ４．７５），１Ｍ ＮａＣｌ）で溶出した。樹脂量２０μｌのＢｅｎｚｏｙｌ−ＤＥＡＥセルロースで綿栓カラムを２本作り，３００μｌのバッファー２で平衡化した後，１本目の綿栓カラムに先の溶出液をロードした。通過液を２本目の綿栓カラムにロードした。これら２本の綿栓カラムをそれぞれ１００μｌのバッファー２で４回洗浄した後，３００μｌのバッファー３（２０ｍＭ 酢酸カリウム（ｐＨ４．７５），１Ｍ ＮａＣｌ、３０％エタノール）で溶出した。溶出液をまとめ，８５０μｌのエタノールを加えてエタノール沈殿した。沈殿をＢｕｆｆｅｒ４（２０ｍＭ 酢酸カリウム（ｐＨ４．７５），６ｍＭ βメルカプトエタノール）に溶解後，２６０ｎｍの吸光度を測定して濃度を決定した。調製した蛍光標識メチオニル開始ｔＲＮＡは，タンパク質合成で使用するまで−３０℃で保存した。調製した蛍光標識メチオニル開始ｔＲＮＡの０．０１ Ａ２６０ｕｎｉｔを，７Ｍ尿素を含む１０％ＰＡＧＥにかけ，蛍光イメージャーＬＡＳ３０００ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ（富士写真フィルム）により可視化した結果を図６に示す。どの蛍光色素標識ＳＥを用いた場合でもメチオニル開始ｔＲＮＡに蛍光が導入できることが確認できた。
各種蛍光標識メチオニル開始ｔＲＮＡによるＮ末端標識カルモジュリンの調製
ＦＤ，ＭＴＦ，ｔＲＮＡ Ｍｉｘを除いたタンパク質合成系（ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ／−ＦＤ，ＭＴＦ，ｔＲＮＡ）に，蛍光化メチオニル開始ｔＲＮＡ ０．１ Ａ２６０ｕｎｉｔ、１μｇのカルモジュリン鋳型ＤＮＡを加え，Ｈ２Ｏで容量を５０μｌにし、３７℃にて３０分反応させた。その後、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂ（アマシャムバイオサイエンス）を用いて，合成したカルモジュリンを精製した。合成反応液１００μｌに，１Ｍ ＣａＣｌ２を２．５μｌ加えて室温で１０分間放置した後，１０，０００ｒｐｍ，室温で１０分間遠心した。上清を４倍量の平衡バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），５ｍＭ ＣａＣｌ２，１００ｍＭ ＮａＣｌ）で希釈後，平衡バッファーで平衡化した２５μｌのＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂ樹脂にロードした。樹脂を洗浄バッファー１（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），０．１ｍＭ ＣａＣｌ２）１００μｌ，および洗浄バッファー２（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），０．１ｍＭ ＣａＣｌ２，５００ｍＭ ＮａＣｌ）１００μｌで洗浄後，吸着したカルモジュリンを溶出バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１ｍＭ ＥＧＴＡ（ｐＨ８．０））２５μｌで２回溶出した。精製したカルモジュリン６μｌを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ＬＡＳ３０００ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ（富士写真フィルム）で各種蛍光シグナルを検出した。また，銀染色によりタンパク質を染色した。その結果を図７に示す。
Ｃｙ５標識，ＩＣ３標識，ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ標識，Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４３０標識，Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８標識については高いＮ末端蛍光標識効率を示していることがわかる。逆に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７標識，ＩＣ５標識の場合、Ｎ末端蛍光標識効率は低いレベルに留まっているようである。このことから、蛍光分子によってＮ末端蛍光標識タンパク質の合成量は大きな影響を受けることが分かる。またＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４３０標識ＣａＭに関しては、合成量は十分であるのに、蛍光シグナルがほとんど検出されていないのは、蛍光イメージャーの性能特性によるものと考えている。
ＦＤ，ＭＴＦ，ｔＲＮＡ Ｍｉｘを除いたタンパク質合成系（ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ／−ＦＤ，ＭＴＦ，ｔＲＮＡ）に，蛍光化メチオニル開始ｔＲＮＡ ０．１ Ａ２６０ｕｎｉｔ、１μｇのカルモジュリン鋳型ＤＮＡを加え，Ｈ２Ｏで容量を５０μｌにし、３７℃にて３０分反応させた。その後、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂ（アマシャムバイオサイエンス）を用いて，合成したカルモジュリンを精製した。合成反応液１００μｌに，１Ｍ ＣａＣｌ２を２．５μｌ加えて室温で１０分間放置した後，１０，０００ｒｐｍ，室温で１０分間遠心した。上清を４倍量の平衡バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），５ｍＭ ＣａＣｌ２，１００ｍＭ ＮａＣｌ）で希釈後，平衡バッファーで平衡化した２５μｌのＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂ樹脂にロードした。樹脂を洗浄バッファー１（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），０．１ｍＭ ＣａＣｌ２）１００μｌ，および洗浄バッファー２（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），０．１ｍＭ ＣａＣｌ２，５００ｍＭ ＮａＣｌ）１００μｌで洗浄後，吸着したカルモジュリンを溶出バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１ｍＭ ＥＧＴＡ（ｐＨ８．０））２５μｌで２回溶出した。精製したカルモジュリン６μｌを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ＬＡＳ３０００ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ（富士写真フィルム）で各種蛍光シグナルを検出した。また，銀染色によりタンパク質を染色した。その結果を図７に示す。
Ｃｙ５標識，ＩＣ３標識，ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ標識，Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４３０標識，Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８標識については高いＮ末端蛍光標識効率を示していることがわかる。逆に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７標識，ＩＣ５標識の場合、Ｎ末端蛍光標識効率は低いレベルに留まっているようである。このことから、蛍光分子によってＮ末端蛍光標識タンパク質の合成量は大きな影響を受けることが分かる。またＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４３０標識ＣａＭに関しては、合成量は十分であるのに、蛍光シグナルがほとんど検出されていないのは、蛍光イメージャーの性能特性によるものと考えている。
Ｎ末端蛍光標識カルモジュリンの基質結合能の確認
Ｎ末端蛍光標識ＣａＭの基質結合能を評価するためにゲルシフトアッセイを行った。基質としてはＣａＭ結合ペプチド融合ＥＣＦＰ（ＣＢＰ−ＥＣＦＰｈｔ）を用いた。反応液は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），０．５ｍＭ ＣａＣｌ２，１７μＭ ＣＢＰ−ＥＣＦＰｈｔを含み、さらに精製した蛍光化カルモジュリンもしくは未標識カルモジュリン０．１μｇを加えた。反応は４℃で４時間行った。反応後、３８０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８），１ｍＭ ＣａＣｌ２を含む１２．５％アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ：ｂｉｓ＝２９．２：０．８）ゲルを用い、泳動用緩衝液として０．１ｍＭ ＣａＣｌ２を含むトリスグリシン溶液にて電気泳動を行った。泳動後蛍光シグナルをＬＡＳ−３０００ Ｍｕｌｔｉ ｃｏｌｏｒで解析した。その結果を図８に示す。図８Ｂ，Ｃより、ＥＣＦＰとＮ末端蛍光標識ＣａＭとを反応させた場合、ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ標識ＣａＭ，Ｃｙ５標識ＣａＭ共に基質タンパク質の有無によりバンドのずれが生じており、発現させて回収したＣａＭ（未標識ＣａＭ）と同様に、Ｎ末端蛍光標識ＣａＭにも基質結合活性があることが確認できた。このことより、Ｎ末端蛍光標識されたＣａＭは充分に結合活性を保持していたと言える。
Ｎ末端蛍光標識ＣａＭの基質結合能を評価するためにゲルシフトアッセイを行った。基質としてはＣａＭ結合ペプチド融合ＥＣＦＰ（ＣＢＰ−ＥＣＦＰｈｔ）を用いた。反応液は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），０．５ｍＭ ＣａＣｌ２，１７μＭ ＣＢＰ−ＥＣＦＰｈｔを含み、さらに精製した蛍光化カルモジュリンもしくは未標識カルモジュリン０．１μｇを加えた。反応は４℃で４時間行った。反応後、３８０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８），１ｍＭ ＣａＣｌ２を含む１２．５％アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ：ｂｉｓ＝２９．２：０．８）ゲルを用い、泳動用緩衝液として０．１ｍＭ ＣａＣｌ２を含むトリスグリシン溶液にて電気泳動を行った。泳動後蛍光シグナルをＬＡＳ−３０００ Ｍｕｌｔｉ ｃｏｌｏｒで解析した。その結果を図８に示す。図８Ｂ，Ｃより、ＥＣＦＰとＮ末端蛍光標識ＣａＭとを反応させた場合、ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ標識ＣａＭ，Ｃｙ５標識ＣａＭ共に基質タンパク質の有無によりバンドのずれが生じており、発現させて回収したＣａＭ（未標識ＣａＭ）と同様に、Ｎ末端蛍光標識ＣａＭにも基質結合活性があることが確認できた。このことより、Ｎ末端蛍光標識されたＣａＭは充分に結合活性を保持していたと言える。
蛍光標識メチオニル開始ｔＲＮＡによるＮ末端蛍光標識タンパク質の調製
ＦＤ，ＭＴＦ，ｔＲＮＡ Ｍｉｘを除いたタンパク質合成系（ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ／−ＦＤ，ＭＴＦ，ｔＲＮＡ）に，２．８ Ａ２６０ｕｎｉｔｓ ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ）もしくはｔＲＮＡｍｉｘ，０．１ Ａ２６０ｕｎｉｔ蛍光化メチオニル開始ｔＲＮＡ、１μｇタンパク質合成用鋳型ＤＮＡを加え，３７℃にて３０分反応させた。なお、合成の鋳型は目的タンパク質をコードしている遺伝子が組み込まれたプラスミドＤＮＡ、もしくは、目的タンパク質遺伝子をＰＣＲにより増幅したものを用いた。合成後は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、蛍光シグナルを蛍光イメージャーにて検出した。
ＩＣ３標識Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｆ ＭｅｔおよびｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ）を使用して、カルモジュリン（ＣａＭ，１６．８ｋＤａ，レーン１），ＭｎｍＥ（４９．２ｋＤａ，レーン２），ＥＦ−Ｐ（２１．４ｋＤａ，レーン３），ＤＨＦＲ（１８．４ｋＤａ，レーン４），ＨＳＤＨ（２６．８ｋＤａ，レーン５）を合成した結果を図９に、Ａｌｅｘａ４８８標識Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｆ ＭｅｔおよびｔＲＮＡ Ｍｉｘを使用してアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ，レーン１），ガラクトシターゼ（β−Ｇａｌ，レーン２），クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ，レーン３），Ｅｎｏｌａｓｅ（レーン４），ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ，レーン５），緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ，レーン６），グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ，レーン７），インターロイキン８（ＩＬ８，レーン８），Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（レーン９），Ｒａｓ（レーン１０）を合成した結果を図１０Ａに、合成後Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ１００（ミリポア社）にてリボソーム画分の除去を行った後に電気泳動を行った場合の結果を図１０Ｂに示す。なお、レーン１１は鋳型ＤＮＡを加えていない反応産物である。
図９に示すようにＮ末端蛍光標識タンパク質の合成量は、タンパク質によって差が生じているが、ＣａＭ，ＥＦ−Ｐ，ＤＨＦＲ，ＨＳＤＨに関しては、Ｎ末端蛍光標識タンパク質合成は行なわれていたことが確認できた。ＭｎｍＥについては完全長のタンパク質の合成は少なく、他と比べると合成が途中で停止した産物が確認できた。
図１０Ａではガラクトシターゼ（β−Ｇａｌ）はかなり薄いが、Ｎ末端蛍光標識タンパク質合成は行なわれていたことが確認できた。一方で、目的分子量以外にも蛍光シグナルがみられた。図１０Ｂに示したように、限外ろ過膜にてリボソーム画分を除去したところ、目的分子量のシグナルがはっきりと確認でき、目的分子量以外の蛍光シグナルは減少した。このことから目的分子量以外の蛍光シグナルはタンパク質合成途中の産物が主たるものと考えられた。Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（レーン９）については限外ろ過膜処理により蛍光シグナルが消滅してしまったことから、タンパク質によっては限外ろ過膜処理が負に働く場合があることがわかった。
ＦＤ，ＭＴＦ，ｔＲＮＡ Ｍｉｘを除いたタンパク質合成系（ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ／−ＦＤ，ＭＴＦ，ｔＲＮＡ）に，２．８ Ａ２６０ｕｎｉｔｓ ｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ）もしくはｔＲＮＡｍｉｘ，０．１ Ａ２６０ｕｎｉｔ蛍光化メチオニル開始ｔＲＮＡ、１μｇタンパク質合成用鋳型ＤＮＡを加え，３７℃にて３０分反応させた。なお、合成の鋳型は目的タンパク質をコードしている遺伝子が組み込まれたプラスミドＤＮＡ、もしくは、目的タンパク質遺伝子をＰＣＲにより増幅したものを用いた。合成後は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、蛍光シグナルを蛍光イメージャーにて検出した。
ＩＣ３標識Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｆ ＭｅｔおよびｔＲＮＡ Ｍｉｘ（−開始ｔＲＮＡ）を使用して、カルモジュリン（ＣａＭ，１６．８ｋＤａ，レーン１），ＭｎｍＥ（４９．２ｋＤａ，レーン２），ＥＦ−Ｐ（２１．４ｋＤａ，レーン３），ＤＨＦＲ（１８．４ｋＤａ，レーン４），ＨＳＤＨ（２６．８ｋＤａ，レーン５）を合成した結果を図９に、Ａｌｅｘａ４８８標識Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｆ ＭｅｔおよびｔＲＮＡ Ｍｉｘを使用してアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ，レーン１），ガラクトシターゼ（β−Ｇａｌ，レーン２），クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ，レーン３），Ｅｎｏｌａｓｅ（レーン４），ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ，レーン５），緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ，レーン６），グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ，レーン７），インターロイキン８（ＩＬ８，レーン８），Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（レーン９），Ｒａｓ（レーン１０）を合成した結果を図１０Ａに、合成後Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ１００（ミリポア社）にてリボソーム画分の除去を行った後に電気泳動を行った場合の結果を図１０Ｂに示す。なお、レーン１１は鋳型ＤＮＡを加えていない反応産物である。
図９に示すようにＮ末端蛍光標識タンパク質の合成量は、タンパク質によって差が生じているが、ＣａＭ，ＥＦ−Ｐ，ＤＨＦＲ，ＨＳＤＨに関しては、Ｎ末端蛍光標識タンパク質合成は行なわれていたことが確認できた。ＭｎｍＥについては完全長のタンパク質の合成は少なく、他と比べると合成が途中で停止した産物が確認できた。
図１０Ａではガラクトシターゼ（β−Ｇａｌ）はかなり薄いが、Ｎ末端蛍光標識タンパク質合成は行なわれていたことが確認できた。一方で、目的分子量以外にも蛍光シグナルがみられた。図１０Ｂに示したように、限外ろ過膜にてリボソーム画分を除去したところ、目的分子量のシグナルがはっきりと確認でき、目的分子量以外の蛍光シグナルは減少した。このことから目的分子量以外の蛍光シグナルはタンパク質合成途中の産物が主たるものと考えられた。Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（レーン９）については限外ろ過膜処理により蛍光シグナルが消滅してしまったことから、タンパク質によっては限外ろ過膜処理が負に働く場合があることがわかった。
本願発明は、従来１−２％程度と極めて低かったＮ末端特異的に標識されたタンパク質の標識効率を飛躍的に（９０％以上）に上昇させることができるようになるという優れた効果を奏するものである。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
Claims (10)
- リボソーム、開始因子類、伸長因子類、解離因子類、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、ｔＲＮＡ類、アミノ酸類、リボヌクレオチド３リン酸類、塩類及び水を含み、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ（ＭＴＦ）及び１０−フォルミル５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（ＦＤ）を含まないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いる標識されたアミノ酸をＮ末端に有するタンパク質の合成方法において、以下の工程（１）−（３）を含む方法。
（１）ｔＲＮＡとしては、ｔＲＮＡの全混合物（ｔＲＮＡ ｍｉｘ）から開始ｔＲＮＡを除去することにより調製される伸長ｔＲＮＡのみを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を調製する工程、
（２）標識されたアミノ酸が結合した開始ｔＲＮＡ（以下標識アミノ酸結合開始ｔＲＮＡともいう）を精製する工程、並びに
（３）前記ｔＲＮＡとしては伸長ｔＲＮＡのみを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系に対して精製された標識アミノ酸結合開始ｔＲＮＡ及び目的とするタンパク質をコードする遺伝子を添加して、該遺伝子を鋳型としてタンパク質を合成する工程。 - ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系が、再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系である請求項１に記載のタンパク質の合成方法。
- 前記ｔＲＮＡとしては伸長ｔＲＮＡのみを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系が、開始ｔＲＮＡを添加しないで調製した再構成ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系であることを特徴とする請求項１〜２いずれか１項に記載のタンパク質の合成方法。
- 標識アミノ酸結合開始ｔＲＮＡがαアミノ基が標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡである、請求項１〜３いずれか１項に記載のタンパク質の合成方法。
- 標識が蛍光標識である、請求項４に記載のタンパク質の合成方法。
- 標識アミノ酸結合開始ｔＲＮＡが天然アミノ酸（ただし、メチオニンは除く）または非天然アミノ酸を結合したアンチコドンがＣＡＵである開始ｔＲＮＡを含む、請求項１〜３いずれか１項に記載のタンパク質の合成方法。
- ｔＲＮＡとしては伸長ｔＲＮＡのみを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系が、１０−フォルミル５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（ＦＤ）及びメチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ（ＭＴＦ）を含有しないことを特徴とする請求項１〜６いずれか１項記載のタンパク質の合成方法。
- 標識アミノ酸結合開始ｔＲＮＡを精製する工程をＢｅｎｚｏｙｌ−ＤＥＡＥセルロースを用いて行なう請求項１〜７いずれか１項記載のタンパク質を合成する方法。
- タンパク質合成を、Ｎ末端が標識されたタンパク質が増加されなくなるまで、又は標識されたアミノ酸結合開始ｔＲＮＡが系内に存在しなくなるまで行なう請求項１〜８いずれか１項記載の方法。
- １）開始ｔＲＮＡ及び／又はメチオニル開始ｔＲＮＡ及び／又は標識されたメチオニル開始ｔＲＮＡ、及び
２）開始ｔＲＮＡ及び１０−フォルミル５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（ＦＤ）及びメチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ（ＭＴＦ）を含有しないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系からなるキットであって、
前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系リボソーム、開始因子類、伸長因子類、解離因子類、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、ｔＲＮＡの全混合物（ｔＲＮＡ ｍｉｘ）から開始ｔＲＮＡを除去することにより調製される開始ｔＲＮＡが除かれたｔＲＮＡ類、アミノ酸類、リボヌクレオチド３リン酸類、塩類及び水を含む、キット。
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