WO2005061706A1 - ｃ−Ｊｕｎ蛋白質と複合体を形成する蛋白質、及び、それをコードする核酸、ならびに、それらの利用方法 - Google Patents

ｃ−Ｊｕｎ蛋白質と複合体を形成する蛋白質、及び、それをコードする核酸、ならびに、それらの利用方法 Download PDF

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nucleic acid
bait
interacts
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Etsuko Miyamoto
Kenichi Horisawa
Hiroshi Yanagawa
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Keio University
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1055—Protein x Protein interaction, e.g. two hybrid selection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a protein that interacts with c-Jun, an inhibitor using the same, and a method for detecting and screening the interaction.
  • Non-patent Documents 1 and 2 base sequences of genomes of various organisms are being decoded.
  • Act 2 the act of post-acting in Act 2 involves analyzing the meaning of the decoded genomic information, that is, analyzing the structure and function of genes and proteins.
  • Non-patent Document 3 the analysis of protein-protein and nucleic acid-protein interaction is expected.
  • Non-patent Document 5 immunoprecipitation
  • Non-patent Document 6 pull-down by GST fusion protein 'Atsusei
  • TAP method Non-patent Document 7
  • yeast The hybrid method Non-Patent Document 8
  • the C-fos gene is derived from Bohmann et al., V-jun, an oncogene of avian sarcoma virus 17 (later derived from the genome of -avian bird and conserved in many species). Was isolated as a human homolog having 80% or more amino acid sequence homology (Non-Patent Document 15).
  • c-jun a typical immediate early gene, is a transcription factor that is detected in many cell types in response to growth stimulation.
  • junB and junD are known as known family genes.
  • c-Jun has a trans-activation domain at the N-terminus that controls transcription and a bZIP domain that forms a homo'heterodimer at the C-terminus and binds to a DNA element. It is known that it interacts with the following factors (Non-Patent Document 17). Recently, screening using the Tuno and Ibrit methods revealed that BAF60a, a subunit of the chromatin remodeling factor SWI / SNF, interacts with the c-Jun / c-Fos complex.
  • Non-Patent Document 18 it is becoming clear that c-Jun regulates gene expression through a complex mechanism, such as through a structural change in chromatin, which is not possible with a simple transcription control model.
  • c-Jun plays an important role as a hub of the protein-protein interaction network in maintaining this complex mechanism with a large number of interacting factors. Is likely to be responsible for
  • chromatin regulation is a mechanism related to the roots of cellular activities, such as development and segregation, it is related to various diseases including cancer, and comprehensive analysis of factors that interact with c-Jun Is thought to have a significant impact not only on basic research but also on drug discovery.
  • Non-Patent Document 1 Saegusa A. Nature 401, 6751 (1999)
  • Non-Patent Document 2 Dalton R, Abbott A. Nature 402, 6763 (1999)
  • Non-Patent Document 3 Etsuko Takamoto, Hiroshi Yanagawa (2000) Series' Genome Science of Post-sequence 3: Proteomitas, pp.136-145
  • Non-patent document 4 Etsuko Takamoto, Hiroshi Yanagawa (2001) Proteins, nucleic acids, enzymes, 46 (2), pp.138-147)
  • Non-patent document 5 Xiong et al. 1993 Nature 366, 701-704
  • Non-Patent Document 6 Kaelin, et al. 1991 Cell 64, 521-532
  • Non-patent document 7 Nicolas Rigaut, et al., Nature biotechnology 17, 1030 (1999)
  • Non-patent document 8 Fields S, Song O. Nature 340, 245 (1989)
  • Non-Patent Document 9 Miyamoto- Sato E, et al. Viva Origino 25, 35 (1997)
  • Non-Patent Document 10 Nemoto N, et al. FEBS Lett. 414, 405 (1997)
  • Patent Document 1 International Publication No. W098Z16636 pamphlet
  • Patent Document 2 International Publication No. WO02Z46395 pamphlet
  • Non-patent literature ll Doi N, Yanagawa H. FEBS Lett. 457, 227 (1999)
  • Non-Patent Document 12 Smith G.P.Science 228, 1315 (1985)
  • Non-Patent Document 13 Mattheakis, L.C. et al. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91, 9022-9026 (1994)
  • Patent Document 3 International Publication No.W095Z11922 pamphlet
  • Non-Patent Document 14 Roberts R.W, Szostak J.W.Proc.Natl.Acad.Sci. USA 94, 12297 (1997)
  • Patent Document 4 U.S. Pat.No. 6,228,994
  • Patent Document 5 International Publication No. WO02Z48347 pamphlet
  • Non-Patent Document 15 Bohmann, D .; Bos, TJ; Admon, A .; Nishimura, T .; Vogt, PK; Tjian, R. Science 238, 1386-1392 (1987)
  • Non-Patent Document 16 Hilberg, F .; Aguzzi, A .; Howells, N .; Wagner, E.F.Nature 365, 179-181 (1993)
  • Non-Patent Document 17 Chinenov Y, Kerppola TK.Oncogene.20, 2438-2452 (2001)
  • Non-Patent Document 18 Ito T, Yamauchi M, Nishina M, Yamamichi N, Mizutani T, Ui M, Murakami M, Iba H. J Biol Chem. 276, 2852-2857 (2001)
  • An object of the present invention is to provide a complex that interacts with c-Jun, using c-Jun protein, which is well known as a transcription control factor, as a target protein.
  • the inventors of the present invention have pursued puromycin technology based on the in vitro virus method described above as a comprehensive analysis method that is an alternative to the conventional method, which is a multimolecular analysis method.
  • two techniques were designated as one, i n vitro cotranslation screening and C-terminal labeling method viral (IW) (U.S. Pat. No. 6228994, WO 02/48347) using, as the base site the c-Jun
  • IW C-terminal labeling method viral
  • a comprehensive analysis of transcription factor complex analysis was carried out, and it was found that complex formation with a previously unknown protein or a c-Jun protein known as a protein was not possible.
  • forming a complex means having a direct or indirect interaction with the c-Jun protein.
  • Another object of the present invention is to provide a protein that interacts with c-Jun, an inhibitor using the same, and a method for detecting and screening the interaction.
  • the present inventors have discovered a new protein that interacts with c-Jun by co-translation screening using IW, and found that a known protein interacts with c-Jun. completed.
  • the present invention provides the following.
  • Agent An inhibitor of an interaction between a protein that interacts with c-Jun protein and c-Jun protein, wherein the inhibitor comprises the following protein (a) or (b) as an active ingredient: Agent.
  • nucleic acid comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 126 to 199,
  • nucleic acid which binds to a nucleic acid having any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 126 to 199 under stringent conditions and encodes a protein which interacts with the c-Jun protein
  • nucleic acid comprises any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 126 to 199
  • a method for detecting an interaction between a bait and a prey comprising contacting the bait with a prey and detecting a complex formed by the contact, wherein the bait comprises the following: The method of j, wherein the protein is (a) or (b), or the following (a ′) or (b ′) is also a nucleic acid translated protein.
  • nucleic acid comprising the base sequence of! or any of SEQ ID NOS: 126 to 199;
  • (b ′) a nucleic acid that encodes a protein that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid having any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 126 to 199 and that interacts with the c-Jun protein
  • nucleic acid comprises any one of SEQ ID NOs: 126 to 199.
  • a step of detecting an interaction between the bait and the play by the method according to any one of (5) to (7), and selecting a play in which the interaction is detected. Includes selection process
  • a play screening method that interacts with the bait.
  • nucleic acid comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 200 to 217,
  • nucleic acid encoding any of SEQ ID NOS: 200 to 217, which has the ability to bind to the nucleic acid under stringent conditions and encodes a protein that interacts with the c-Jun protein
  • a method for detecting an interaction between a bait and a prey comprising contacting the bait with a prey and detecting a complex formed by the contact, wherein the bait has the following ( a) a protein which is translated from the nucleic acid of (a ') or (b') or a protein of (b), or
  • nucleic acid comprises any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 200 to 217.
  • nucleic acid comprising any one of SEQ ID NOs: 218 to 224;
  • nucleic acid that encodes a protein that interacts with the c-Jun protein under stringent conditions with a nucleic acid having any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 218 to 224 under stringent conditions
  • nucleic acid comprises any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 218 to 224.
  • a method for detecting an interaction between a bait and a prey comprising contacting the bait with a prey and detecting a complex formed by the contact, wherein the bait has the following ( a) a protein which is translated from the nucleic acid of (a ') or (b') or a protein of (b), or
  • a protein comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 88 to 94;
  • (b ′) a nucleic acid that binds to a nucleic acid having any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 218 to 224 under stringent conditions and encodes a protein that interacts with the c-Jun protein
  • nucleic acid comprises any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 218 to 224.
  • nucleic acid comprising the nucleotide sequence of! or any of SEQ ID NOs: 225 to 229;
  • nucleic acid that encodes a protein that interacts with the c-Jun protein under stringent conditions with a nucleic acid having any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 225 to 229 under stringent conditions
  • the inhibitor according to (27), wherein the nucleic acid comprises any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 225 to 229.
  • a method for detecting an interaction between a bait and a prey comprising contacting the bait with a prey and detecting a complex formed by the contact, wherein the bait has the following ( a) a protein which is translated from the nucleic acid of (a ') or (b') or a protein of (b), or
  • (b ′) a nucleic acid which binds to a nucleic acid having any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 225 to 229 under stringent conditions and encodes a protein that interacts with the c-Jun protein
  • nucleic acid comprises any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 225 to 229.
  • the protein of the active ingredient contains any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 100 to 104. (33) The inhibitor according to (33).
  • nucleic acid capable of hybridizing with a nucleic acid having any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 230 to 234 under stringent conditions and encoding a protein that interacts with the c-Jun protein
  • nucleic acid comprises any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 230 to 234.
  • a method for detecting an interaction between a bait and a prey which comprises contacting the bait with the prey and detecting a complex formed by the contact, wherein the bait has the following ( a) a protein which is translated from the nucleic acid of (a ') or (b') or a protein of (b) or a nucleic acid of (b ') below.
  • nucleic acid that encodes a protein that interacts with the c-Jun protein under stringent conditions with a nucleic acid having any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 230 to 234, and
  • nucleic acid comprises any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 230 to 234.
  • nucleic acid comprising any one of SEQ ID NOs: 235 to 238;
  • nucleic acid that encodes a protein that interacts with the c-Jun protein under stringent conditions with a nucleic acid having any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 235 to 238 under stringent conditions
  • nucleic acid comprises any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 235 to 238.
  • a method for detecting an interaction between a bait and a prey comprising contacting the bait with a prey and detecting a complex formed by the contact, wherein the bait comprises the following ( a) a protein which is translated from the nucleic acid of (a ') or (b') or a protein of (b) or a nucleic acid of (b ') below.
  • nucleic acid comprises any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 235 to 238.
  • (48) The step of detecting an interaction between the bait and the play by the method described in paragraph 1 of any of (45) to (47), and selecting a play in which the interaction is detected.
  • nucleic acid comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 239 to 241;
  • nucleic acid that encodes a protein that interacts with the c-Jun protein under stringent conditions with a nucleic acid having any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 239 to 241 under stringent conditions
  • nucleic acid comprises any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 239 to 241.
  • a method for detecting an interaction between a bait and a play comprising contacting a bait with a play and detecting a complex formed by the contact, wherein the bait has the following ( a) a protein which is translated from the nucleic acid of (a ') or (b') or a protein of (b) or a nucleic acid of (b ') below.
  • (b ′) a nucleic acid that encodes a protein capable of hybridizing with a nucleic acid having any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 239 to 241 under stringent conditions and interacting with the c-Jun protein
  • nucleic acid comprises any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 239 to 241.
  • nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 242 or 243
  • nucleic acid that hybridizes with a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 242 or 243 under stringent conditions and encodes a protein that interacts with the c-Jun protein.
  • nucleic acid comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 242 or 243.
  • nucleic acid comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 242 or 243.
  • a method for detecting an interaction between a bait and a play comprising contacting a bait with a play and detecting a complex formed by the contact, wherein the bait has the following ( a) a protein which is translated from the nucleic acid of (a ') or (b') or a protein of (b), or
  • nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 242 or 243
  • (b ′) a nucleic acid that hybridizes with a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 242 or 243 under stringent conditions and encodes a protein that interacts with the c-Jun protein.
  • nucleic acid comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 242 or 243.
  • nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 244 or 245.
  • nucleic acid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 244 or 245 A nucleic acid encoding a protein that hybridizes and interacts with the c-Jun protein.
  • a method for detecting an interaction between a bait and a prey comprising contacting the bait with a prey and detecting a complex formed by the contact, wherein the bait has the following ( a) a protein which is translated from the nucleic acid of (a ') or (b') or a protein of (b), or
  • nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 244 or 245.
  • (b ′) a nucleic acid that hybridizes with a nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 244 or 245 under stringent conditions and encodes a protein that interacts with the c-Jun protein.
  • nucleic acid comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 244 or 245.
  • nucleic acid that hybridizes with a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 246 or 247 under stringent conditions and encodes a protein that interacts with the c-Jun protein.
  • a method for detecting an interaction between a bait and a prey comprising contacting the bait with a prey and detecting a complex formed by the contact, wherein the bait has the following ( a) a protein which is translated from the nucleic acid of (a ') or (b') or a protein of (b), or
  • nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 246 or 247.
  • (b ′) a nucleic acid that hybridizes with a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 246 or 247 under stringent conditions and encodes a protein that interacts with the c-Jun protein.
  • nucleic acid comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 246 or 247.
  • the inhibitor according to (81), wherein the protein of the active ingredient comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 118 or 119. [0095] (83) The inhibitor according to (81), wherein the protein is a protein translated from a nucleic acid as described in (a) or (b) below.
  • nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 248 or 249;
  • nucleic acid that hybridizes with a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 248 or 249 under stringent conditions and encodes a protein that interacts with the c-Jun protein.
  • nucleic acid comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 248 or 249.
  • a method for detecting an interaction between a bait and a prey comprising contacting the bait with a prey and detecting a complex formed by the contact, wherein the bait comprises the following ( a) a protein which is translated from the nucleic acid of (a ') or (b') or a protein of (b), or
  • nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 248 or 249.
  • (b ′) a nucleic acid that hybridizes with a nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 248 or 249 under stringent conditions and encodes a protein that interacts with the c-Jun protein.
  • nucleic acid comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 248 or 249.
  • nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 250 or 251
  • nucleic acid that hybridizes with a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 250 or 251 under stringent conditions and encodes a protein that interacts with the c-Jun protein.
  • nucleic acid comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 250 or 251.
  • a method for detecting an interaction between a bait and a prey comprising contacting the bait with a prey and detecting a complex formed by the contact, wherein the bait has the following ( a) a protein which is translated from the nucleic acid of (a ') or (b') or a protein of (b), or
  • nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 250 or 251
  • nucleic acid that hybridizes with a nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 250 or 251 under stringent conditions and encodes a protein that interacts with the c-Jun protein.
  • nucleic acid comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 250 or 251.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 122 or 123 lacks one or several amino acids; A protein that contains a lost, substituted or added amino acid sequence and interacts with the c-Jun protein.
  • nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 252 or 253
  • nucleic acid that hybridizes with a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 252 or 253 under stringent conditions and encodes a protein that interacts with the c-Jun protein.
  • a method for detecting an interaction between a bait and a prey comprising contacting the bait with a prey and detecting a complex formed by the contact, wherein the bait comprises the following ( a) a protein which is translated from the nucleic acid of (a ') or (b') or a protein of (b), or
  • nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 252 or 253
  • (b ′) a nucleic acid that hybridizes with a nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 252 or 253 under stringent conditions and encodes a protein that interacts with the c-Jun protein.
  • nucleic acid comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 252 or 253.
  • nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 254 or 255;
  • nucleic acid that hybridizes with a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 254 or 255 under stringent conditions and encodes a protein that interacts with the c-Jun protein.
  • a method for detecting an interaction between a bait and a play comprising contacting a bait with a play and detecting a complex formed by the contact, wherein the bait has the following ( a) a protein which is translated from the nucleic acid of (a ') or (b') or a protein of (b), or
  • nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 254 or 255.
  • (b ′) a nucleic acid that hybridizes with a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 254 or 255 under stringent conditions and encodes a protein that interacts with the c-Jun protein.
  • nucleic acid comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 254 or 255.
  • FIG. 1 collectively shows information such as the amino acid sequence and gene sequence of the protein of the present invention and the number of claws.
  • the number in parentheses of the nucleic acid sequence number indicates the number of the amino acid sequence encoded by the sequence number. Branched numbers indicate that they encode the same amino acid sequence, but differ in base sequence.
  • FIG. 2 shows an outline of a co-translation screening method using an IW random library, which is a method for detecting the proteins and genes of the present invention and their base sequences.
  • Cell-free co-translation screening was performed using the mouse brain IW random library and c-Jun as a bait. The screened library was amplified by RT-PCR, and again cell-free co-translation screening with the bait. By repeating this step three times, the protein and gene of the present invention and their base sequences were detected.
  • FIG. 3 shows an outline of a random priming library of IVV used for detection of the protein and gene of the present invention and its nucleotide sequence, and a method for producing the same.
  • the ligated adapter is ligated using DNA ligase to synthesize a ligated dsDNA library (111). Perform PCR using the specific sequences of the adapter and random primer to create a cDNA library (IW cDNA library) of the mapping molecule with a promoter and enhancer sequence on the 5 'side and an A tail on the 3' side. (IV).
  • IW cDNA library is transcribed into an IW RNA library (V), and a spacer for IW is ligated (VI), and further translated by a cell-free translation system. It becomes the library of attached molecules ( ⁇ ).
  • ⁇ 4] shows the results of verification of the direct interaction between the proteins and genes of the present invention and their nucleotide sequences (electrophoretic photographs).
  • Group 1 SEQ ID NO: 18 (SNAP19), Group 2: 76 (KINN), Group 3: 93 (Kif5a), Group 6: 1060ip-c3.1), Group 7: 110 (Jip-cl), Group 8 113 (EB2), group 9; 115 (Cspg6), group 10; 117 (Mapk8ip3), group 11; 119 (Jip-c3.2), group 13; 1230ip-c8) o a, b: bait c- With and without Jun (lanes 1, 2, 3; translation product, supernatant fraction, elution fraction).
  • FIG. 5 shows the results of verification of the enrichment rate and indirect interaction of the gene of the present invention.
  • 14 types of SEQ ID NOs: 18 (SNAP19), 76 (KINN), 93 (Kif5a), 99 (Eefld), 102 (Nef3), 106 (Jip-c3.1), 1100ip-cl), 113 (EB2), 115 (Cspg6), 117 (Mapk8ip3), 119 (Jip-c3.2), 12KGFAP), 1230ip-c8), 125 (Kif5b)
  • SEQ ID NOs: 143, 206, 223, 229 , 232, 236, 240, 243, 245, 247, 249, 253 nucleic acid sequences were subjected to real-time PCR.
  • the present invention can be applied to the evolutionary molecular engineering using IVV of the protein or nucleic acid sequence of the present invention and used for creating a functional protein by primary screening.In this case, primary screening and secondary screening are combined. Thus, it is also possible to analyze the details of the interaction of the created functional protein.
  • FIG. 7 shows the structure of a translation template (A) and its components, a coding molecule (B) and a spacer molecule (C).
  • the translation template is composed of a coding part derived from a coding molecule and a spacer part derived from a spacer molecule.
  • F1 and F2 represent fluorescent dyes.
  • FIG. 9 shows an outline of complex formation by cell-free cotranslation.
  • A Bait and prey are translated together in a cell-free translation system and interact to form a complex in the cell-free translation system. The play may be singular (I) or plural (II), and even if it is a polypeptide itself obtained by translation in a cell-free translation system, it may be a mapping molecule (conjugate). It does not matter.
  • B In the presence of bait, prey is translated in the cell-free translation system and interacts to form a complex in the cell-free translation system. The play may be singular (I) or plural ( ⁇ ), and even if the polypeptide itself is obtained by translation in a cell-free translation system, it may be associated with the corresponding molecule (conjugate). I don't care
  • FIG. 10 shows an outline of the formation of a complex by cell-free cotranslation when a complex bait is used.
  • a part of the bait and prey constituting the composite bait are translated together in the cell-free translation system and interact with each other to form a complex in the cell-free translation system.
  • Prey may be singular (I) or plural (II), and even if the polypeptide itself is obtained by translation in a cell-free translation system, the assigning molecule (conjugate) It does not matter.
  • the composite bait is not limited to the combination of the polypeptide and the DNA bait translated by the cell-free translation system shown in the figure. Coexist in Or a combination of a plurality of single baits (eg, DNA bait, etc.).
  • FIG. 11 shows an outline of a method for screening a complex by cell-free cotranslation.
  • the step of forming a complex by cell-free cotranslation (1), the step of screening the prey of the complex (2), and the step of analyzing the prey (3) Cell-free cotranslation and screening can be realized in vitro in total. If the play is an assigning molecule and a plurality of plays, screening can be repeated from step (1) again by reconstituting the mRNA or DNA encoding the play by RT-PCR or PCR. In addition, after analyzing the obtained play, the process ability of (1) can be newly screened as a bait.
  • a protein found to interact with c-Jun is referred to as a protein of the present invention, including a novel protein.
  • the first group of proteins of the present invention is a protein having a known function, but the function of forming a complex with C-Jun is a novel protein. That is, it is not any of the proteins known to form a complex with c-Jun (Yurii Chinenovl and Tom K Kerppola, Oncogene (2001) 20, 2438-2452).
  • SNAP19 (SNAPc5), which corresponds to amino acid sequence No. 169, binds to PSE, which is the sn motor of snRNA transcribed by pol II and pol III, and regulates transcription.
  • Kif5a corresponding to amino acid sequence numbers 88-94, is a motor protein that functions in transporting substances along microtubules. Mutations are known to cause hereditary spastic paraplegia (Niclas, J .; Navone, F .; Horn—Booher, N .; Vale, RD Neuron 12: 1059-1072, 1994.
  • Eefld which corresponds to amino acid sequence Nos. 95-99, is known as a protein that regulates translational elongation, but recently may also be a gene related to cancer and tumors.
  • Nef3 corresponding to amino acid sequence number 100—104 is One of the three types of neuron-specific intermediate filament constituent molecules and a protein with a molecular weight of 125 kD (Levy, E .; Liem, RK ⁇ .; D'Eustachio, P .; Cowan, NJ Europ J. Biochem. 166: 71-77, 1987.
  • EB2 (PubMed ID: 3036526) EB2, an amino acid sequence number 112-113, is an APC-binding protein EB2 (Mapre3) that interacts with APC and is cooperative.
  • the EBl family which is known to promote microtubule polymerization in the field of ⁇ u, L.-K .; Qi, Y .: Geno haracterization of human MAPRE genes and their proteins. Geno mics 71: 143-149, 2001.
  • Cspg6, amino acid sequence number 114-115 is a subunit of the cohesin complex that plays an important role in sister chromosome segregation.
  • Mapk8ip3 one of the amino acid sequence numbers 116-117, is one of the JNK-binding scaffold proteins and is important in the JNK-mediated MAP kinase signal cascade. (Dickens, M .; Davis, RJ Molec. Cell. Biol. 20: 1030-1043, 2000. (PubMed ID: 10629060)) corresponding to the amino acid sequence numbers 120-121.
  • GFAP is one of the intermediate filament constituent molecules highly expressed in astrocytes, and has a specific sequence at the N-terminus and is thought to play a cell-specific role.
  • Kif5b amino acid sequence numbers 124-125, is a substance along microtubules.
  • a member of the kinesin superfamily which is a motor protein that acts as a transporter, is involved in organelle transport, and causes abnormalities in mitochondrial arrangement in KO mice (Tanaka, Y .; Kanai, Y .; Okada, Y .; Nonaka, S .; Takeda, S .; Harada,
  • Nef3 those without a leucine zipper are Nef3, EB2, GFAP, and KilSb. Those that indirectly interact with c-Jun are Nef3 and GFAP.
  • SNAP19, Kif5c, Kif5a, Eefld, Cspg6, and Mapk8ip3 all have leucine zippers and form complexes with c-Jun.
  • the second group of proteins of the present invention is a protein of unknown function, a protein having a novel function of forming a complex with c-Jun.
  • Jip-c3.1 corresponding to amino acid sequence numbers 105-108
  • Jip-cl corresponding to amino acid sequence numbers 109-111
  • Jip-c3.2 corresponding to amino acid sequence numbers 118-119
  • amino acid sequence numbers 122-123 These proteins are Jip-c8 (Fig. 1).
  • These proteins all have leucine zippers and interact directly with c-Jun.
  • the protein having any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1 to 124 interacts with the c-Jun protein, ie, It is a protein that has been found to form the body. Generally, it is expected that a protein has a variant having the same function. Also, by appropriately modifying the amino acid sequence of the protein, a mutant having the same function can be obtained. Accordingly, a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 124, and which interacts with the c-Jun protein is also included in the present invention. Included in proteins.
  • the term “several” is preferably 5 or less, and more preferably 2 or less. Further, it has a homology of usually 15% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more with respect to the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 124, and interacts with the c-Jun protein. Also included are proteins that do.
  • the amino acid sequence of a protein is modified by modifying the nucleotide sequence of the DNA encoding the protein by well-known means such as site-directed mutagenesis, and expressing the modified DNA. Can be.
  • modified proteins those that interact with the c-Jun protein are included in the protein of the present invention.
  • Interaction with c-Jun protein is public It can be measured by a known interaction measurement method, and examples include a method for detecting the formation of a complex as described in Examples below.
  • the protein of the present invention may be made into a fusion protein by fusing it with another protein.
  • the nucleic acid of the present invention is a nucleic acid encoding the protein of the present invention.
  • the nucleic acid is usually RNA or DNA.
  • Examples of the nucleic acid of the present invention include a nucleic acid having any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 126 to 254.
  • This nucleic acid is a nucleic acid whose base sequence has been determined in Examples described later. Genes are predicted to be genes that encode the same product but have different nucleotide sequences, or genes that encode variants having the same function. Further, by modifying the base sequence, it is possible to obtain genes encoding the same product or a mutant having the same function.
  • the nucleic acid of the present invention also includes a nucleic acid having a nucleotide sequence similar to any one of SEQ ID NOs: 126 to 254 and encoding a protein that interacts with the c-Jun protein.
  • Examples of the nucleic acid having a similar base sequence include a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid having a base sequence complementary to any of the base sequences of SEQ ID NOS: 126 to 254, or any of the nucleic acids having SEQ ID NOs: 126 to 254.
  • a nucleic acid having a base sequence having a homology of usually 16% or more, preferably 90% or more, and more preferably 95% or more with such a base sequence is exemplified.
  • the stringent conditions are, for example, hybridization at 42 ° C in DIG Easy Hyb (Roche's Diagnostics Co., Ltd.), and then 0.1 X SSC / 0.1% at 60 ° C for 15 minutes. Washing in SDS.
  • the homology of the nucleotide sequences is the ratio of the number of matched nucleotides to the chain length of the sequence to be compared by calculating the number of matched nucleotides by performing alignment between the sequences to be compared.
  • the homology of amino acid sequences is the ratio of the number of matched amino acids to the chain length of the sequence to be compared, by performing alignment between the compared sequences and calculating the number of matched amino acids.
  • DNA encodes a protein that interacts with the c-Jun protein means that the protein is expressed from the DNA and that the expressed protein interacts with the c-Jun protein by the above-described method. Can be easily confirmed.
  • the nucleic acid of the present invention can be obtained by a conventional method based on the determined base sequence. For example, it may be synthesized by a chemical synthesis method, or by using an appropriately set primer, by RT-PCR from mRNA prepared from a cell or tissue expressing a protein that interacts with the c-Jun protein. You may get it.
  • a new function of the protein, gene or nucleic acid sequence according to the present invention (here, a function capable of binding to c-Jun), as an inhibitor that blocks transcription and gene replication as functions of c-Jun Can be applied.
  • the basis is that the gene of the protein of the present invention has been detected through a competition process by repeating screening a plurality of times. Gene groups detected by this method draw a certain number distribution, and more competitive genes are detected more often. This indicates that the greater the number of clones detected by this method, the stronger the competitiveness, and that it works effectively as a blocking agent / inhibitor! /.
  • the use of the protein of the present invention and the genes and sequences encoding the same include, in vitro, the use of the novel functions of the protein, gene or nucleic acid sequence of the present invention, for example, cell-free proteins. It can be applied to evolutionary molecular engineering using synthetic systems, or to clarify the function of genomes. In this case, analysis using co-translation screening / selection of the assigning molecule is very effective. This is because the co-translation screening / selection method has made it possible to comprehensively detect proteins that directly or indirectly interact with bait proteins. Furthermore, it can be used as a “target molecule (bait protein)” for analysis of the interaction between IVVs or between IW and the C-terminal labeled protein.
  • common methods for analyzing interactions include, for example, microarray, fluorescence correlation spectroscopy (FCS / FCCS), fluorescence imaging analysis, fluorescence resonance energy transfer, evanescent field molecular imaging, fluorescence depolarization, A surface plasmon resonance method or an enzyme-linked immunosorbent assay may be used.
  • specific examples of the cell-free protein synthesis system include a wheat germ extract, a heron reticulocyte extract, and an Escherichia coli S30 extract.
  • a translation template for the protein, gene or nucleic acid sequence according to the present invention is added to these cell-free protein synthesis systems. In the case of C-terminal labeling, a 100 M modifier is added at the same time, and 25-37 ° C.
  • the C-terminal modified protein is synthesized by incubating for one to several hours.
  • mapping the mapping molecule of the protein, gene or nucleic acid sequence according to the present invention Simply add the template and incubate at 25-37 ° C for a few hours to complete the assigned molecules.
  • in vivo applications include, for example, modification for separation and labeling for detection synthesized in a cell-free protein synthesis system by utilizing a new function of a protein, gene or nucleic acid sequence according to the present invention.
  • the resulting proteins can be directly used for the next purification process or detection process, or directly into cells.
  • the cell expression system include bacteria such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, thermophiles, and yeast, cultured cells such as insect cells and mammals, as well as nematodes, Drosophila, zebrafish, and mice. Cells.
  • the above-mentioned C-terminal-labeled or associated modified proteins can be directly introduced into these cells to block the target protein.
  • the gene or nucleic acid sequence of the protein of the present invention can also be used to block proteins that are expressed in E. coli and interact with each other as proteins or assigning molecules.
  • 11-100 M of C-terminal labeling modifier is simultaneously introduced into cells by electroporation, microinjection, etc., and the cells are grown at the optimal growth temperature.
  • the modified protein is synthesized by incubating for several hours at.
  • the assignment molecule is synthesized by introducing a template of the assignment molecule having the gene or nucleic acid sequence of the protein of the present invention and keeping the cells at the optimal growth temperature of the cells for several hours.
  • the synthesized both modified proteins can be recovered by crushing the cells and subjected to the subsequent purification or detection process. Moreover, it is also possible to subject it to a detection process in a cell as it is.
  • the detection method of the present invention uses the protein of the present invention as a bait in detecting an interaction between a bait and a prey.
  • the bait and prey are subjected to separation modification and detection labeling in a specific manner, and the prey is generated by translation in the presence of the bait in a cell-free translation system, thereby producing the bait and prey.
  • the main feature is to contact with
  • the term prey is generated by translation in the presence of a bait in a cell-free translation system.
  • the contact between the bait and the play is also referred to as "cell-free cotranslation".
  • bait and prey have meanings commonly used in the technical field of analysis of interaction between substances.
  • proteins and nucleic acids that are known substances are called baits, and proteins and nucleic acids that interact with them are called prey.
  • the prey is preferably a protein.
  • the bait may be any protein, ligand (eg, a ligand such as a protein, nucleic acid, antibody, hormone, etc.) as long as the protein of the present invention or the protein of the present invention is included. And a complex composed of natural and artificial ones. There is no particular restriction on the molecular weight of the bait.
  • ligand eg, a ligand such as a protein, nucleic acid, antibody, hormone, etc.
  • a complex composed of natural and artificial ones There is no particular restriction on the molecular weight of the bait.
  • a functional domain or a full-length protein containing a functional domain may be used.
  • a full-length protein allows more comprehensive detection.
  • a protein is preferably used as a play.
  • the detection method of the present invention preferably performs, as described above, a label for detection and a modification for separation in a format specific to the bait and prey, in the detection of the interaction between bait and prey, and
  • the main feature is that cell-free cotranslation is performed. Therefore, the detection method of the present invention preferably comprises a bait and a prey except that the bait and the prey are subjected to detection labeling and separation modification in a specific manner, and cell-free cotranslation is performed. It can be similar to the usual method of detecting the interaction between bait and prey, including contacting and detecting the complex formed by the contact.
  • the modification for detection of bait and prey and the label for detection are appropriately selected as appropriate for the detection of the complex.
  • both bait and prey are labeled with a detection label. Must be performed so as not to receive modification for separation. Therefore, the play is used as a force or an associating molecule to be a fusion protein with a protein that can be used as a detection label, and accordingly, the bait has a modification for separation.
  • the bait has a modification for separation.
  • the bait is a protein
  • the bait is used as a fusion protein with a protein that can be used as a modification for separation.
  • the NA is translated so that it is present in a cell-free translation system.
  • modification for separation when the bait is a protein examples include, for example, CBP (separable by affinity with calmodulin beads) and protein A (IgG- Affinity tags include fusion proteins with various antibody tags and the like. If the bait itself has properties that can be used as a modification for separation, the bait can be used as it is as a bait having the modification for separation.
  • the modification for detection of prey includes a fusion protein with a fluorescent protein such as GFP (green fluorescent protein).
  • Preparation of the mRNA encoding the above fusion protein and translation of the mRNA in a cell-free translation system can be performed according to ordinary methods.
  • the mRNA may be produced by transcription of DNA in a cell-free transcription / translation system.
  • the bait can be subjected to an arbitrary modification for separation.
  • the bait is a protein
  • examples of the modification for separation described above are given.
  • examples of the modification for separation when the bait is a nucleic acid or a drug include streptavidin and biotin which interacts with avidin. Use. If the bait itself has a property that can be used as a modification for separation, the bait can be used as it is as a bait having the modification for separation.
  • the assigning molecule means a molecule that associates a phenotype with a genotype.
  • the mapping molecule is usually a molecule in which a genotype molecule containing a nucleic acid having a nucleotide sequence reflecting a genotype is combined with a phenotype molecule containing a protein involved in phenotypic expression.
  • prey By using prey as this protein, prey can be used as an associating molecule.
  • Such an assigning molecule may be used to translate the mRNA encoding play in a cell-free translation system so that the translated play associates with the mRNA, or to encode the play in a cell-free transcription translation system.
  • the transcription and translation of the DNA can be performed by performing the translated prey in association with the DNA. Therefore, cell-free cotranslation can be performed by the presence of a bait during this production. That is, cell-free cotranslation can be performed by the following (1) or (2).
  • mRN encoding the play in the presence of the bait
  • the translation of A is performed such that the translated prey is associated with the mRNA, thereby causing the cell-free translation system to generate the prey and bring the bait into contact with the prey.
  • a prey is generated by the cell-free transcription / translation system, and the bait is brought into contact with the prey.
  • the mRNA force comprises a spacer region bound to its 3 'end and a peptide acceptor region bound to the spacer region and containing a group capable of binding to a peptide by a transpeptidation reaction.
  • the translated prey will associate with the mRNA.
  • An example of a method for detecting an interaction using such an assigning molecule is an in vitro virus method (FIG. 6).
  • the mRNA is preferably a 5 'untranslated region containing a transcription promoter and a translation enhancer, an ORF region encoding a prey bound to the 3' side of the 5 'untranslated region, and a 3' side of the ORF region.
  • a nucleic acid containing a 3'-terminal region containing a poly A sequence which is bound to a nucleic acid.
  • an expression amplification sequence containing an SNNS (S is G or C) sequence (for example, a sequence recognized by the restriction enzyme Xhol) is further included on the 5 ′ side of the poly A sequence.
  • the 5 'end may or may not have a Cap structure.
  • the poly A sequence is a mixture of dA and / or rA of at least 2 or more residues or a single continuous poly A chain, preferably 3 or more residues, more preferably 6 or more, still more preferably 8 or more. It is a poly-A continuous chain of residues or more.
  • Factors affecting translation efficiency include a combination of a 5'UTR consisting of a transcription promoter and a translation enhancer, and a 3'terminal region containing a polyA sequence.
  • the effect of the poly A sequence in the 3 'terminal region is usually exerted with 10 residues or less.
  • the 5′UTR transcription promoter can be T7 / T3 or SP6, and is not particularly limited. SP6 is preferred, and SP6 is particularly preferred when an omega sequence or a sequence containing a part of the omega sequence is used as the translation sequence.
  • the translation gene is preferably a part of an omega sequence, and the omega sequence includes a part of a TMV omega sequence (029; Gallie DR, Walbot V.
  • a combination of an Xhol sequence and a polyA sequence is preferable.
  • a combination of a polyA sequence and an affinity tag attached downstream of the ORF region, ie, upstream of the Xhol sequence is preferred.
  • the affinity tag sequence is not particularly limited, as long as it is a sequence capable of detecting a protein such as an antigen antibody reaction or the like and using such a means.
  • it is a Flag-tag sequence or His-tag sequence which is a tag for affinity separation and analysis by an antigen-antibody reaction.
  • the translation efficiency of an affinity tag such as a flag-tag with an Xhol sequence and a poly A sequence further added thereto increases.
  • the His-tag even without the Xhol sequence, it shows sufficient translation efficiency and is effective.
  • the configuration effective for the translation efficiency described above is also effective for the association efficiency.
  • each length is about 49 bp in the 5 ′ UTR and about 38 bp or about 26 bp in the 3 ′ end region, and is a length that can be incorporated as an adapter region into a PCR primer.
  • a coding region having a 5 'UTR and a 3' terminal region can be easily prepared by PCR from any vector, plasmid, or cDNA library.
  • translation may extend beyond the ORF region. That is, there may be no stop codon at the end of the ORF region.
  • the peptide acceptor region is not particularly limited as long as it can bind to the C-terminus of the peptide.
  • puromycin 3-N-aminoacylpuromycin aminonucleoside (3'-N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside)
  • PANS-Gly of glycine PANS-Val of norin, PANS-Ala of alanine, and other PANS-amino acids corresponding to all amino acids can be used.
  • a 3'-N-aminoacyl adenosine aminonucleoside (a chemical bond formed by an amide bond formed as a result of dehydration condensation of the amino group of 3'-amino adenosine and the carboxyl group of amino acid (
  • AANS-amino acid for example, AANS-Gly of glycine, AANS-Val of norin, AANS-Ala of alanine, and other AANS-amino acids corresponding to all amino acids can be used.
  • nucleosides or those in which a nucleoside and an amino acid are ester-linked can also be used.
  • the peptide acceptor region preferably comprises puromycin or a derivative thereof, or puromycin or a derivative thereof and one or two residues of deoxyribonucleotide or ribonucleotide.
  • the derivative means a derivative capable of binding to the C-terminus of the peptide in the protein translation system.
  • the puromycin derivative is not limited to one having a complete puromycin structure, but also includes a puromycin structure in which a part of the puromycin structure is missing. Specific examples of the puromycin derivative include PANS-amino acids, AANS-amino acids, and the like.
  • the peptide ceptor region does not work even if it is composed of only puromycin, it preferably has a nucleotide sequence of one or more residues of DNA and / or RNA on the 5 'side.
  • the sequence may be dC-puromycin, rC-puromycin, etc., more preferably dCdC-puromycin, rCrC-puromycin, rCdC-puromycin, dCrC-puromycin, etc., and 3 ′ of aminoacyl-tRNA.
  • CCA sequences that mimic the ends Philipps, GR (1969) Nature 223, 374-377) are suitable.
  • the type of base is preferably in the order of C> (U or T)> G> A.
  • the spacer region is preferably a PEG region containing polyethylene glycol as a main component.
  • the spacer region usually contains, in addition to the PEG region, a donor region capable of binding to the 3 ′ end of the nucleic acid.
  • the donor region capable of binding to the 3 'end of a nucleic acid usually consists of one or more nucleotides.
  • the number of nucleotides is usually 115, preferably 112.
  • Nucleotides may be ribonucleotides or deoxyribonucleotides! / ⁇ .
  • the donor region may have a modifier!
  • the sequence at the 5 'end of the donor region affects the efficiency of ligation with the coding region encoding play. Ligation of the coding region and the spacer region requires the inclusion of at least one or more residues.For receptors having a poly A sequence, at least one residue of dC (doxycytidylic acid) is required. ) Or dCdC (dideoxycytidylic acid) having two residues.
  • the type of the base is preferably in the order of C> (U or T)>G> A.
  • the PEG region contains polyethylene glycol as a main component.
  • main component means that the total number of nucleotides contained in the PEG region is 20 bp or less, or the average molecular weight of polyethylene glycol is 400 or more. Preferably, it means that the total number of nucleotides is 10 bp or less, or the average molecular weight of polyethylene glycol is 1000 or more.
  • the average molecular weight of polyethylene glycol in the PEG region is usually 400 to 30,000, preferably 1,000 to 10,000, and more preferably 2,000 to 8,000.
  • post-processing of associative translation may be required. Liu, R., Barrick, E., Szostak, JW, Roberts, RW (2000) Methods in Enzymology, vol. 318, 268-293), using PEG with a molecular weight of 1000 or more, more preferably 2000 or more Since high-efficiency association can be performed only by translation, post-processing of translation is not required.
  • a molecular weight of polyethylene glycol increases, the stability of genotype molecules tends to increase.Particularly, a molecular weight of 1000 or more is good, and a molecular weight of 400 or less is not so stable and its properties are unstable. It can be.
  • the corresponding molecules can be formed not only in the reticulocytes of the egret but also in the cell-free translation system of the wheat germ.
  • the stability of the translation is dramatically improved, eliminating the need for post-translational processing.
  • the DNA encodes a fusion protein of the protein and streptavidin or avidin, the DNA is labeled with biotin, and the DNA is transcribed in a state where the DNA-molecule is contained in one section of the emulsion.
  • the translated play is associated with the DNA by performing the translation.
  • the emulsion is usually a W / 0 type emulsion formed by mixing two kinds of surfactants and mineral oil with a reaction solution of a cell-free transcription / translation system.
  • the surfactant In order to form a W / 0 type emulsion, the surfactant usually needs to have an HLB (hydrophile-lipophile balance) value of 3 ⁇ 40.5-6. HLB value when two surfactants are mixed The HLB value of each surfactant can be calculated by a simple formula.
  • the ratio of surfactant to mineral oil is usually The ratio of the reaction solution is 1 to 50% (volume ratio), usually 5%, based on the whole emulsion, and it is usually 5% in the mixture of the surfactant and the mineral oil.
  • the reaction solution can be divided into several portions at low temperature with stirring to form an emulsion by mixing, and the transcription and translation reactions can be started by raising the temperature of the emulsion. It comes out.
  • Preparation of prey-encoding DNA and transcription and translation of this DNA in a cell-free transcription / translation system can be carried out according to ordinary methods.
  • the complex formed by the cell-free cotranslation can be specifically detected by performing the labeling for detection and the modification for separation on the bait and prey in a specific manner.
  • cell-free translation systems that perform cell-free co-translation (including cell-free transcription and translation systems) include E. coli, Egret reticulocytes, and wheat germ. Any system is acceptable. In the in vitro virus method, the assignment molecule formation is quite unstable in E. coli, but the reticulocyte system of the egret (Nemoto N,
  • the bait and prey templates to be added to the cell-free translation system may be either RNA or DNA as long as the cell-free translation system also generates transcription.
  • a translation part characterized in that a coding part having information to be translated into a protein and a PEG spacer also have a partial strength.
  • the coding part is information to be translated into a protein, and may have any sequence.
  • the coding part has an receptor (A sequence) in the 3 'end region of the coding part, or the 3' end of the coding part. It has an acceptor (A sequence) in the region and a translation amplification sequence (X sequence) 5 ′ upstream of the A sequence.
  • a short poly A sequence is included as the A sequence in the coding section.
  • a short poly A sequence is a sequence usually consisting of 2 to 10 bases of A. It is characterized by having a sequence having a (C or G) NN (C or G) sequence as the X sequence, for example, an Xhol sequence.
  • a part of the PEG spacer has a PEG region containing polyethylene glycol as a main component, a donor region for linking to a coding part, and a CCA region at the 3 ′ end. Although a part of the PEG spacer is not effective with only the donor region or the CCA region alone, it preferably has a configuration including a PEG region mainly composed of polyethylene glycol.
  • the CCA region is characterized in that it has no function of binding to a protein translated by the translation template by a transpeptidation reaction.
  • the polyethylene glycol in the PEG region has a molecular weight of 500 or more.
  • at least one function imparting unit (F) is included in the donor region and / or the CCA region.
  • the function imparting unit (F1 and / or F2) immobilizes or fluorescent labels the translation template and / or the protein translated from the translation template.
  • Piotin and the like can be considered as the immobilization substance
  • fluorescein, Cy5, or rhodamine green (RhG) can be considered as the fluorescent substance. It relates to these coding parts, translation templates and their libraries, as well as proteins translated on liposomes and their libraries.
  • the translation template of the bait (A in Fig. 7) is composed of the coding part derived from the coding molecule (B in Fig. 7) and a part of the PEG spacer derived from one PEG spacer molecule (C in Fig. 7). It is also powerful. In this embodiment, basically, the stability is improved and the translation efficiency can be improved by connecting (ligating) a part of the PEG spacer to the code part regardless of the sequence of the code part. However, the translation efficiency can be further improved depending on the structure of the code part and the type of the PEG spacer. The details are described below.
  • the coding portion (B in Fig. 7) of the present embodiment also has a 5 'terminal region, an ORF region, and a 3' terminal region, and may or may not have a Cap structure at the 5 'terminal.
  • the sequence of the coding part is used as a part incorporated into any vector or plasmid.
  • the 3'-terminal region of the C region is composed of a poly Ax8 sequence as the A sequence, an Xhol sequence as the X sequence, an SNNS sequence with 4 or more bases (S is G or C), There is an XA array.
  • a flag-tag sequence as an affinity tag sequence upstream of the A sequence, X sequence, or XA sequence, and a powerful configuration can be considered.
  • the affinity tag sequence a sequence using any means capable of detecting or purifying a protein, such as one utilizing an antigen-antibody reaction such as HA-tag or IgG protein A (z domain) or His-tag, is used. But I can't help.
  • the combination of XA sequences is important.
  • the first four bases are important, and those having an SNNS sequence are preferable.
  • the 5'-terminal region is composed of a transcription promoter and a translation enhancer, and the transcription promoter can be T7 / T3 or SP6, etc., and is not particularly limited.
  • omega is used as a translation enhancer sequence.
  • SP6 is used as a promoter that preferably uses a sequence containing a part of the sequence or the omega sequence.
  • a part of the omega sequence of translation enhancer (029) contains a part of the omega sequence of TMV (Gallie DR, Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., Vol. 20, 4631-4638). And FIG. 3 of WO 02/48347).
  • the ORF region in the coding part may be any sequence consisting of DNA and / or RNA. Gene sequences, exon sequences, intron sequences, random sequences, or any natural or artificial sequences are possible, and there are no sequence restrictions.
  • the PEG spacer molecule of this embodiment (C in FIG. 7) is composed of a CCA region, a PEG region, and a donor region.
  • the minimum required configuration is the donor region.
  • puromycin which has not only a donor region but also a PEG region, and further has an ability to bind to an amino acid.
  • the molecular weight range of polyethylene glycol in the PEG region is 400 to 30,000, preferably 1,000 to 10,000, and more preferably 2,000 to 6,000.
  • the CCA region can be configured with or without puromycin.
  • puromycin Puromycin
  • 3 N-aminoannolepure 1 to romaine-/ ⁇ nonnucleonto 3-N — Aminoacylpuromycin aminonucleoside (PANS-amino acid), for example, PANS-Gly of glycine, PANS-Val of norin, PANS-Ala of alanine, and PANS-all amino acids corresponding to all amino acids are available.
  • PANS-amino acid for example, PANS-Gly of glycine, PANS-Val of norin, PANS-Ala of alanine, and PANS-all amino acids corresponding to all amino acids are available.
  • the amino group of 3'-aminoadenosine and the carboxyl group of amino acid are dehydrated.
  • AANS-amino acids 3'-N-aminoacyl adenosine aminonucleosides linked by amide bonds formed as a result of condensation, such as AANS-Gly of glycine in the amino acid part, AANS_Val of phosphorus AANS_Ala of alanine and other AANS-all amino acids corresponding to all amino acids can be used.
  • nucleosides or those in which a nucleoside and an amino acid are ester-bonded can also be used.
  • any nucleoside or a substance having a chemical structure skeleton similar to a nucleoside and an amino acid or a substance having a chemical structure skeleton similar to an amino acid can be used as long as they can be chemically bonded.
  • any substance in which the amino group of the above puromycin derivative lacks the ability to bind to an amino acid, and a CCA region lacking puromycin can be considered, but puromycin, which cannot bind to proteins on the ribosome, is considered. By doing so, the translation efficiency can be further improved. For unknown reasons, puromycin, which cannot bind to proteins, may stimulate turnover by stimulating ribosomes.
  • the type of base is preferably in the order of C> (U or T)>G> A.
  • the sequence may be dC-puromycin, rC-puromycin or the like, more preferably dCdC-puromycin, rCrC-puromycin, rCdC-puromycin, dCrC-pieuromycin or the like, and the aminoacyl-tRNA 3′-terminal.
  • a CCA sequence Philipps GR (1969) Nature 223, 374-377) that mimics is suitable. In one aspect of the invention, these puromycins are unable to bind to amino acids in any way.
  • a part of the PEG spacer according to the present embodiment can have a configuration having a modifying substance (F1 and / or F2).
  • the translation template can be used as a tag for recovery, reuse by purification, or immobilization.
  • a modifying substance at least one base of DNA and / or RNA may be introduced with a fluorescent substance, biotin, or various separation tags such as His-tag.
  • the method of ligation of one molecule of PEG spacer and a coding molecule of the present embodiment is not particularly limited to any method, such as a method using a general DNA ligase or a ligation by photoreaction.
  • the A sequence in the 3'-terminal region is important as the range that affects ligation efficiency in the coding region, and at least two or more dA and / or rA mixtures or single residues are important. And preferably a polyA continuous chain of 3 or more residues, more preferably 6 to 8 or more residues.
  • the DNA and / or RNA sequence at the 5 'end of the donor region of a part of the PEG spacer influences the ligation efficiency.
  • the coding region and a part of the PEG spacer with RNA ligase it is necessary to include at least one or more residues.
  • at least one residue is required.
  • DC (doxycytidylic acid) or dCdC (dideoxycytidylic acid) having two residues is preferred.
  • the type of the base is preferably in the order of C> (U or T)> G> A.
  • polyethylene glycol having the same molecular weight as the PEG region during the ligation reaction.
  • a translation template consists of a coding part having information to be translated into a protein and a part of a PEG spacer. It has an A sequence at the 3 'end of the code portion, and the A sequence includes a short poly A sequence.
  • the PEG spacer has a molecular weight of at least 00 in the PEG region containing polyethylene glycol as the main component, and at least one modification in the donor region and / or the CCA region. It contains a substance (F1 and / or F2).
  • the CCA region is characterized by having a function of binding to a protein translated by the translation template by a transpeptidation reaction, and typically has pure mouth mycin in the CCA region.
  • the modifying substance F1 and / or F2 may be used for immobilizing or fluorescently labeling the translation template and / or the protein translated from the translation template.
  • Piotin and the like can be considered as the immobilizing substance
  • fluorescein, Cy5, or rhodamine green (RhG) can be considered as the fluorescent substance.
  • Play is a protein synthesized by translation using a translation template and modified at the C-terminus with the translation template (A in FIG. 8; assigning molecule).
  • the translation template (B in FIG. 8) and PEG It is characterized by the structure of the C-terminal modified protein (C in Fig. 8). The details are described below.
  • the PEG spacer portion of the translation template (Fig. 8B) is similar to the translation template preferred for use as the bait described above, except that puromycin can be linked to amino acids. .
  • the coding part is also the same as the translation template preferable for use as the above-mentioned bait.However, as a configuration suitable for association, it is important to make the 3 ′ terminal region an A sequence, and the total protein The efficiency of the association is significantly improved, and the amount of free protein is drastically reduced.
  • a code portion having a 5 ′ terminal region and a 3 ′ terminal region can be easily created, and by ligating a part of a PEG spacer, a translation template with high association efficiency can be obtained.
  • the protein of the present embodiment modified with C-terminal by PEG (C in Fig. 8) can be used for detection of protein interaction when the coding region is not used, for example, in FCCS measurement, fluorescence reader, protein chip, etc. When applied, it may be intentionally cut with RNase A or the like. Cleavage can eliminate the difficulty of detecting protein-protein interactions due to interference with the coding region. It is also possible to fix a single assigning molecule to a plate, a bead or a slide glass.
  • FIG. 9 Cell-free cotranslation will be described with reference to FIG.
  • Ray is translated in vitro.
  • FIGS. 9A and 9B the case where the bait is a protein and is translated at the same time as play in the cell-free translation system, and the case where the bait is a nucleic acid or hormone, etc. May be added.
  • the prey is a fusion protein or an assigning molecule.
  • the complex may also be formed by combining another play with a play linked to a bait (II). is there.
  • the detection method of the present invention since a complex can be formed in vitro, it is possible to consistently detect an interaction between proteins or between a nucleic acid and a protein in vitro.
  • the bait when the bait is a protein, examples of the bait include a protein having only a functional domain for interacting with a target protein, a protein containing a functional domain, and a full-length protein.
  • a full-length protein it is preferable to use a full-length protein, since it is generally predicted that the protein has a plurality of functional domains, and it is possible to detect play more comprehensively.
  • the full-length protein may be a full-length protein alone or a collection of baits that reconstitute the full-length protein.
  • a bait which may be a complex, is referred to as a "composite bait.”
  • complexes that can be considered in cell-free cotranslation include a complex of a single bait and a single play, a complex of a composite bait and a play, a complex of a bait and a plurality of plays, Also, a composite of a composite bait and multiple plays is possible. Therefore, the interaction that can be detected by the detection method of the present invention also includes an indirect interaction for forming a complex that is not only a direct interaction between bait and prey.
  • the protein is folded in a native state, is in a non-denatured state after translation, and interacts with a bait to be interacted with. It is considered that play or bait and bait or play and play coexist in the cell-free translation system and can interact with each other quickly. This is supported by the superior results obtained when translated together, rather than separately translated and mixed together immediately after translation. In other words, the in vitro translated protein is This is probably because a protein or a nucleic acid can be encountered in the inking state, so that a complex can be quickly formed by the interaction.
  • the conventional interaction detection method required that bait be expressed and purified in large amounts in Escherichia coli. For example, in order to express bait-prey interaction in cells by the TAP method, etc., preparation for at least one month was required.
  • the mRNA display method using the GST fusion protein pull-down method requires a minimum of 2-3 weeks because bait is expressed in large quantities in E. coli and purified.
  • cell-free cotranslation in a cell-free translation system, only the same amount of mRNA or DNA template needs to be added, and bait does not need to be expressed in cells at all, and the working time can be greatly reduced.
  • complex baits and full-length proteins can enhance the bait-prey interaction to make it more specific and avoid the detection of non-specific binding.
  • the composite bait also allows for a comprehensive analysis of more plays interacting with the second bait.
  • the present invention also provides a screening method using the detection method of the present invention.
  • the screening method of the present invention is characterized in that bait and prey interact through cell-free cotranslation to form a complex, and the prey interacting with the bait is analyzed by screening the complex.
  • the screening method of the present invention comprises a detection step of detecting an interaction between a bait and a prey by the detection method of the present invention, except that a detection step of detecting an interaction between a bait and a prey, and It may be the same as a normal screening method for plays that interact with the bait, including a selection step of selecting a play in which an interaction is detected.
  • the screening method of the present invention further comprises a preparation step of preparing the prey selected in the selection step, wherein the prepared prey is used instead of or in place of the bait used in the detection step.
  • the detection step, the selection step and the preparation step are repeated using the bait.
  • 1) a step of cell-free cotranslation in a cell-free translation system in which a prey and a bait form an interaction, and 2) a prey interacting with a bait is detected.
  • the screening process, 3) the analysis and analysis of the play, and 4) the play analyzed and analyzed in 3) are used as the new next bait, and the process capability to repeat from 1) is also configured.
  • Steps 1) and 2) correspond to the detection step and the selection step
  • step 3) corresponds to the preparation step. That is, the step of bringing the bait into contact with the prey in the detection step corresponds to the cell-free cotranslation step, and the step of detecting and selecting the complex in the detection step corresponds to the screening step.
  • the play selected in the selection step may be subjected to the detection step again.
  • cell-free cotranslation between the bait and the prey's library 1, which is a group of a plurality of preys, may be performed, and two or more preys may be detected in the screening step.
  • the composite bait and play may coexist and form a composite of the composite bait and play by interaction.
  • multiple plays of the play 'library coexist with the bait, forming a complex of the bait and the multiple plays by interaction, and thus interacting exhaustively at once in screening. Multiple play can be detected.
  • the bait is a full-length protein
  • the full-length protein generally includes a plurality of functional domains of interaction, and thus more plays can be comprehensively detected.
  • the play is a mapping molecule (fosion).
  • the play may or may not directly interact with the bait.
  • the prey that forms the complex is detected by RT-PCR or PCR, and further,
  • the PCR product may be rescreened as a prey (reconstruction of the prey), or the prey analyzed by PCR product analysis may be screened as a new next bait.
  • the method of rescreening from the PCR product or screening the play that also analyzed the PCR product power as a new next byte is possible only with the evolutionary molecular techniques such as the in vitro virus method and STABLE method. Yes, it cannot be done by methods that directly analyze proteins, such as the pull-down method and the TAP method.
  • the gene sequence of the protein prey can be known by RT-PCR or PCR after screening.
  • the protein play here refers to a play interacting with the bait or a play interacting with the play, and all of the plurals interacting with the bait are played. Can be analyzed comprehensively. If further rescreening of the prey is necessary, transcribe the DNA template that is the product of RT-PCR or PCR and repeat the same cycle. If play is determined by RT-PCR or PCR followed by a sequence, the protein play can be used as a bait. If more than one play interacts with the first bait, a composite bait can be formed and more plays can be detected.
  • the cycle can be easily performed without the necessity.
  • the play can be comprehensively screened without breaking the complex formed by the cell-free cotranslation.
  • the bait may be provided with a mechanism of fixing the bait by means of an affinity tag or the like, and play interacting with the bait may be detected.
  • the mechanism of the fixed dani may be any.
  • two-step screening using IgG-protein A affinity or calmodulin beads, such as the existing TAP method, or streptavidin or avidin-biotin affinity GST -One-step or two-step screening using tag, Flag-tag, T7-tag, His-tag and the like.
  • Prey's libraries include cDNA libraries (random priming 'libraries, dT priming' libraries), random 'libraries, peptide' libraries, formone 'libraries, antibody' libraries, ligands' Libraries, libraries of drug combinations, etc., and any library may be used. For example, if a random primed cDNA library is used as a play 'library, full-length play cannot be expected from this library, but play including functional domains can be expected. Such a library is particularly effective for comprehensive prey detection when used for screening in combination with a composite bait or a full-length protein.
  • Examples of the random priming library include a promoter of SP6 RNA polymerase (SP6) on the 5 'side of the multiple cloning site (MCS) and a TMV omega sequence of tobacco mosaic virus as a translation enhancer.
  • SP6 RNA polymerase SP6 RNA polymerase
  • MCS multiple cloning site
  • a flag-tag sequence which is a tag for affinity separation analysis by an antigen-antibody reaction, has a 5 'untranslated (UTR) region containing a part (029) of Has a 3 'end that contains a flag-tag at the C-terminus of the protein expressed from the inserted sequence incorporated into the MCS
  • the vector MCS contains the cDNA obtained by random priming.
  • the detection method of the present invention includes a step of bringing a bait into contact with a prey to form a complex. Accordingly, a method for forming a complex of a bait and a prey interacting with the bait according to this step is provided.
  • the method of the present invention uses the protein of the present invention as a bait in forming a complex of bait and a prey that is a protein that interacts with the bait.
  • the main features of the present invention are that labeling for detection and modification for separation are performed in the following manner, and cell-free cotranslation is performed. Therefore, the preferred construction of the method of the present invention is to provide bait and prey with a detection label and a modification for separation in a specific manner! It may be similar to the usual method of forming a bait-prey complex, including contacting the prey with an interacting prey. Labeling for detection and modification for separation in a particular mode of bait and prey and cell-free co-translation may be as described for the detection method of the present invention.
  • Fluorescence correlation spectroscopy Fluorescence correlation spectroscopy, fluorescence imaging analysis, fluorescence resonance energy transfer, evanescent field molecular imaging, fluorescence depolarization, surface plasmon resonance, or solid-phase enzyme immunization using the protein of the present invention.
  • a method for analyzing the interaction between a protein and a substance performed by an assay.
  • a method for detecting an interaction between a protein and a substance characterized by using the protein of the present invention and a cell-free cotranslation method or a cell-free cotranslation screening method.
  • the protein of the present invention is characterized in that the protein is fluorescently labeled and / or immobilized. To analyze the interaction between proteins and substances.
  • a method for analyzing the interaction with a protein or substance which comprises using the protein of the present invention and using a cotranslation method in vitro.
  • a method for analyzing the interaction between a protein and a target molecule which comprises using a C-terminal modified protein containing the protein and a modifying agent bound to the C-terminal. Interactions are analyzed by fluorescence correlation spectroscopy, fluorescence imaging analysis, fluorescence resonance energy transfer, evanescent field molecular imaging, fluorescence depolarization, surface plasmon resonance, or enzyme-linked immunosorbent assay. be able to.
  • the C-terminal modified protein may be immobilized.
  • a C-terminal modified protein may be added to the array on which the target molecule is immobilized, and the C-terminal modified protein specifically bound to the target molecule may be detected.
  • the modified protein of the present invention obtained above and a target molecule are brought into contact with each other by appropriately combining them according to the type of the modifying substance, the type of the reaction system, and the like.
  • the interaction is analyzed by measuring a change in the signal generated based on the interaction between the two molecules in the signal generated by the modified protein of the present invention or the target molecule.
  • the interaction is analyzed by, for example, fluorescence correlation spectroscopy, fluorescence imaging analysis, fluorescence resonance energy transfer, evanescent field molecular imaging, fluorescence depolarization, surface plasmon resonance, or enzyme-linked immunosorbent assay. Is The details of these methods are described below.
  • target molecule means a molecule that interacts with the modified protein of the present invention, and specifically includes proteins, nucleic acids, sugar chains, low-molecular compounds, and the like, and is preferably a protein or DNA. is there.
  • the protein is not particularly limited as long as it has the ability to interact with the modified protein of the present invention, and may be a full-length protein or a partial peptide containing a binding active site.
  • the protein may be a protein whose amino acid sequence and its function are known or unknown. They are, A synthesized peptide chain, a protein purified from a living body, or a cDNA library can be used as a target molecule even if it is translated using an appropriate translation system and purified.
  • the synthesized peptide chain may be a glycoprotein having a sugar chain bonded thereto.
  • a protein that has been translated and purified using a suitable method can be used for a purified protein having a known amino acid sequence or a cDNA library.
  • nucleic acid any DNA or RNA can be used without particular limitation as long as it has an ability to interact with the modified protein of the present invention.
  • the nucleic acid may have a known base sequence or function, or may have an unknown nucleic acid.
  • a nucleic acid having a function as a nucleic acid capable of binding to a protein and having a known base sequence, or a nucleic acid which has been cut and isolated using a genomic library first-class restriction enzyme or the like can be used.
  • the sugar chain is not particularly limited as long as it has an ability to interact with the modified protein of the present invention.
  • the sugar chain or function may be a known sugar chain or an unknown sugar chain.
  • a sugar chain which has already been separated and analyzed and whose sugar sequence or function is known is used.
  • the low molecular weight compound is not particularly limited as long as it has an ability to interact with the modified protein of the present invention. Even those whose functions are unknown or whose ability to bind to a protein is already known can be used.
  • the "interaction" performed by these target molecules with the modified protein of the present invention is usually defined as a covalent bond, a hydrophobic bond, a hydrogen bond, a van der Waals bond, and a bond by electrostatic force between the protein and the target molecule.
  • the term refers to the effect of a force acting between molecules that produces at least one of the following, but this term should be interpreted in the broadest sense and not in any way limited.
  • the covalent bond includes a coordination bond and a dipole bond.
  • the coupling by electrostatic force includes not only electrostatic coupling but also electric repulsion.
  • the interaction also includes a binding reaction, a synthesis reaction, and a decomposition reaction resulting from the above action.
  • Specific examples of the interaction include binding and dissociation between an antigen and an antibody, binding and dissociation between a protein receptor and a ligand, binding and dissociation between an adhesion molecule and a partner molecule, and interaction between an enzyme and a substrate. Binding and dissociation, binding and dissociation between nucleic acids and proteins that bind to it, binding and dissociation between proteins in the signal transduction system, between glycoproteins and proteins Binding or dissociation, or binding and dissociation between a sugar chain and a protein.
  • the target molecule to be used can be used after being modified with a modifying substance according to the embodiment.
  • the modifier is usually selected from non-radioactive modifiers such as fluorescent substances.
  • the fluorescent substance include various fluorescent dyes having a free functional group (for example, a carboxyl group, a hydroxyl group, an amino group, etc.) and capable of being linked to the above-mentioned target substances such as proteins and nucleic acids, for example, fluorescein series, rhodamine series, Cy3, Any type such as Cy5, eosin series, and NBD series may be used.
  • the compound is a modifiable compound such as a dye, the type and size of the compound are not limited.
  • these modifying substances those suitable for a method for measuring or analyzing a change in a signal generated based on the interaction between the target molecule and the modified protein of the present invention are appropriately used.
  • the above-mentioned modifying substance can be bound to the target molecule using an appropriate method known per se. Specifically, for example, when the target molecule is a protein, the method of modifying the C-terminal described in WO 02/48347 can be used. When the target molecule is a nucleic acid, it can be easily modified by a method of performing PCR using an oligo DNA primer to which a modifying substance is previously bound by a covalent bond or the like.
  • the modified protein of the present invention or the target molecule used in the present invention may be bound (that is, immobilized) to a solid phase depending on the embodiment. There are two types: one that is bound via a decorating substance and one that is bound by other parts.
  • the modifying substance used when binding via a modifying substance is usually a molecule that specifically binds to a specific polypeptide (hereinafter sometimes referred to as "ligand”).
  • a specific polypeptide hereinafter, sometimes referred to as “adaptor protein” that binds to the ligand is bound to the phase surface.
  • the adapter protein also includes a binding protein, a receptor protein constituting a receptor, an antibody, and the like.
  • adapter protein Z ligands examples include biotin and iminobiotin binding protein Z biotin or iminobiotin such as avidin and streptavidin, maltose binding protein Z maltose, G protein Z guanine nucleotide, polyhistidine peptide Z nickel or Metal ions such as cobalt, glutathione S transfer Various receptor proteins such as erase Z daltathione, DNA binding protein ZDNA, antibody Z antigen molecule (epitope), calmodulin Z calmodulin binding peptide, ATP binding protein ZATP, or estradiol receptor protein Z estradiol, and its ligands.
  • biotin and iminobiotin binding protein Z biotin or iminobiotin such as avidin and streptavidin, maltose binding protein Z maltose, G protein Z guanine nucleotide, polyhistidine peptide Z nickel or Metal ions such as cobalt, glutathione S transfer Various
  • combinations of adapter protein Z ligands include a biotin such as avidin and streptavidin and an iminobiotin binding protein Z or biotin, a maltose binding protein z maltose, a polyhistidine peptide Z nickel or a metal such as cobalt or the like. Ion, daltathione-s-transferase z daltathione, antibody Z antigen molecule (epitope), and the like are preferred, and a combination of streptavidin z biotin or iminobiotin is most preferred.
  • binding proteins are known per se, and the DNA encoding the protein has already been closed.
  • the binding of the adapter protein to the solid phase surface can be carried out by a method known per se, and specifically, for example, tannic acid, formalin, daltaraldehyde, pyruvaldehyde, bisdiazotization
  • a method utilizing benzodizone, toluene-2,4-diisocyanate, an amino group, a carboxyl group convertible to an active ester, or a hydroxyl group or amino group convertible to a phosphoramidide can be used.
  • a known method usually used for binding proteins, nucleic acids, sugar chains, and low molecular weight compounds to a solid phase specifically, for example, tannic acid Utilization of formalin, glutaraldehyde, pyrvicaldehyde, benzodiazobis bisdiazonation, toluene-2,4-diisocyanate, amino group, carboxyl group convertible to active ester, or hydroxyl group or amino group convertible to phosphoamidide Can be used.
  • the solid phase is usually used for immobilizing proteins, nucleic acids and the like, and its material and shape are not particularly limited.
  • a glass plate, a trocellulose membrane, a nylon membrane, a polyvinylidene fluoride film, a plastic microplate, or the like can be used.
  • Measurement is a means for collecting changes in signals used for analysis, and should not be construed as limiting in any sense.
  • measurement methods used include For example, molecular interactions can be detected using fluorescence correlation spectroscopy, fluorescence resonance energy transfer, evanescent field molecular imaging, fluorescence depolarization, fluorescence imaging analysis, surface plasmon resonance, enzyme-linked immunosorbent assay, etc. All systems are available.
  • This measurement method also includes a method comprising adding the modified protein of the present invention to an array having the target molecule immobilized thereon, and detecting the modified protein of the present invention specifically bound to the target molecule.
  • the array on which the target molecules are immobilized means a solid phase on which the target molecules are immobilized in such an arrangement that they can be identified.
  • the method for detecting the modified protein of the present invention specifically bound to the target molecule is not particularly limited as long as the modified protein of the present invention specifically bound to the target molecule is detected.
  • a method of removing the modified protein of the present invention that does not bind to the target molecule from the array to which the modified protein has been added by washing, and detecting the remaining modified protein of the present invention can be mentioned.
  • Eigen, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5740-5747 (1994)) is a confocal laser. This is a method for measuring the flow velocity, diffusion rate, volume shrinkage, etc. of particles under a microscope or the like.
  • the interaction between the modified protein of the present invention (C-terminal modified protein) and a target molecule is determined. By measuring the change in the translational Brownian motion of one molecule of the original modified molecule by the action, the interacting molecules can be measured.
  • the sample particles are excited by the excitation light, emit fluorescence in a part of the sample solution volume, and the emitted light is measured to obtain a photon ratio. This value varies with the number of particles present in the volume of space observed at a particular time.
  • the various parameters described above can also use the autocorrelation function to calculate the fluctuating power of this signal.
  • Equipment for performing this FCS is also commercially available from Carl Zeiss and the like, and the analysis can be performed using these apparatuses also in this method.
  • FCCS fluorescence cross-correlation spectroscopy
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the FCCS method when compared to other detection systems such as the fluorescence depolarization method, the FCCS method has the advantages of requiring less sample volume, shorter detection time, and easier automation for HTS.
  • the FCCS method provides very basic information such as the size and number of fluorescently labeled molecules, and may be used for general-purpose applications such as surface plasmon resonance. The difference between the two is that surface plasmon resonance can detect interactions in a protein immobilized state, whereas FCCS can see interactions in a solution that is closer to the natural state. .
  • the FCCS method instead of the necessity of immobilizing proteins, it is necessary to label proteins with fluorescent dyes. The present invention has made it possible to overcome this problem.
  • the FCCS method can examine the protein-protein interaction / protein-nucleic acid interaction in a solution state close to the intracellular environment, and can easily measure the dissociation constant (binding constant) in one measurement. Can be calculated.
  • any method may be used as long as the two molecules come into contact with each other to an extent sufficient for interaction.
  • a solution prepared by dissolving a C-terminal modified protein at an appropriate concentration in a buffer solution or the like normally used for biochemistry was added to a measuring well of a commercially available FCS device, and the target molecule was dissolved at an appropriate concentration in the same buffer. It is performed by a method of charging a solution.
  • a modified molecule is brought into contact with an immobilized molecule, and the interaction between the two molecules causes the fluorescence emitted from the modified molecule remaining on the immobilized molecule to be converted to a commercially available fluorescent imaging analyzer. It is a method of measuring or analyzing using.
  • the C-terminal modified protein or the target molecule is immobilized by the method described above. It is.
  • the target molecule is used by immobilization, either the modified molecule or the unmodified molecule can be used.
  • the C-terminal modified protein can be either a protein immobilized through a modified portion or a protein immobilized in a portion other than the modified portion!
  • a substrate (solid phase) for immobilizing a C-terminal modified protein or a target molecule As a substrate (solid phase) for immobilizing a C-terminal modified protein or a target molecule, a glass plate or a -trocellulose membrane or a nylon membrane usually used for immobilizing a protein, a nucleic acid or the like is used. Alternatively, a plastic microplate or the like can be used.
  • the surface has various functional groups (amino groups, carboxyl groups, thiol groups, hydroxyl groups, etc.) and various ligands (metal ions such as biotin, iminobiotin, nickel or cobalt, glutathione, sugars, nucleotides, DNA, RNA , Antibodies, calmodulin, receptor proteins, etc.) can also be used.
  • any method for bringing the modified target molecule or the C-terminal modified protein into contact with the immobilized molecule may be used as long as the two molecules can be brought into contact with each other to an extent sufficient for interaction. It is preferable to use a method in which a solution in which the modified target molecule or the C-terminal modified protein is dissolved in a buffer commonly used in biochemistry at an appropriate concentration is prepared, and the solution is brought into contact with the surface of the solid phase.
  • a step of washing the excessively present modified target molecule or C-terminal modified protein with the same buffer or the like is performed, and the target molecule or the C Is a commercially available signal that is a mixture of the fluorescence signal emitted from the modifying substance of the c-terminal modified protein or the fluorescence emitted from the immobilized modifying molecule and the fluorescence emitted from the modifying molecule remaining on the solid phase.
  • an imaging analyzer By performing measurement or analysis using an imaging analyzer, a molecule that interacts with the immobilized molecule can be identified.
  • this method as a method of performing a large number of analyzes simultaneously, for example, a method of addressing and immobilizing a plurality of C-terminal modified proteins or modified or unmodified target molecules on the surface of the solid phase, or one method And a method of contacting a plurality of types of C-terminal modified proteins or modified target molecules that are not immobilized on the C-terminal modified protein or the modified or unmodified target molecule.
  • a plurality of types of C-terminal modified proteins or modified target molecules are brought into contact with each other, the molecules remaining on the solid phase are obtained by dissociation due to a difference in buffer concentration, etc., and analyzed by a known method. Can be identified.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the fluorescence spectrum of the donor is observed because of the large FRET, but the fluorescence spectrum of the donor is observed when the two proteins interact and the distance between the fluorescent dyes is reduced.
  • the presence or absence of protein-protein interaction can be determined from the difference in the wavelength of the fluorescence spectrum.
  • a fluorescent dye a combination of fluorescein as a donor and rhodamine as an acceptor is often used. Recently, attempts have been made to detect the interaction by observing FRET in cells using a combination of mutants of fluorescent green protein (GFP) having different wavelengths.
  • the disadvantage of this method is that the two fluorescent dyes must be close to each other within 40-50 A for FRET to occur, so depending on the size of the protein and the location of the fluorescent dye, the mutual Even if FRET is observed, there is a danger that there is a danger.
  • the evanescent field molecular imaging method is a method described in Funatsu, T., et al., Nature, 374, 555-559 (1995), etc., which is used as a solution for molecules immobilized on a transparent body such as glass.
  • a second molecule is brought into contact with a light source such as a laser beam at an angle at which an evanescent field is generated, and the generated evanescent light is measured or analyzed by a detector.
  • a substrate for immobilizing the C-terminal modified protein or the target molecule a substrate made of a material such as glass is used, and quartz glass is preferably used. Further, it is preferable that the surface is subjected to ultrasonic cleaning in order to prevent scattering of laser light and the like.
  • any method can be used so long as both molecules are in contact with each other to an extent sufficient for interaction! /
  • a solution obtained by dissolving a C-terminally modified protein or a modified target molecule at a suitable concentration in a buffer commonly used in biochemistry, which is preferably immobilized, may be used.
  • a preferred method is to create and drop this on the solid phase surface.
  • the fluorescence polarization method (Perran, J., et al, J. Phys. Rad., 1, 390-401 (1926))
  • the excited fluorescent molecule maintains the steady state during the excited state, it emits fluorescence in the same plane of polarization, but when the excited molecule performs rotational Brownian motion or the like during the excited state.
  • This is a method that utilizes the fact that the emitted fluorescence is on a different plane from the excitation light.
  • the motion of a molecule is affected by its size, and when the fluorescent molecule is a macromolecule, the motion of the molecule during the excited state is almost negligible, whereas the emitted light remains polarized.
  • the polarization of the emitted light is eliminated because the moving speed is high. Therefore, the intensity of the fluorescence emitted from the fluorescent molecule excited by the plane-polarized light is measured on the original plane and a plane perpendicular to the original plane. The information about is obtained. According to this method, the behavior of a target molecule that interacts with a fluorescence-modified molecule without being affected by contaminants can be tracked. This is also a force that is measured as a change in the degree of polarization only when the target molecule interacts with the fluorescently modified molecule.
  • BECON manufactured by Panyera
  • this method can also be performed by using these apparatuses.
  • any method of bringing the target molecule into contact with the C-terminal modified protein may be used, as long as it is a method in which both molecules come into contact with each other to an extent sufficient for interaction.
  • a solution prepared by dissolving a C-terminal modified protein at an appropriate concentration in a buffer or the like normally used in biochemistry is added to the measuring solution of a commercially available fluorescence depolarizer, and the target molecule is then added to the buffer at an appropriate concentration. Is carried out by a method of charging a solution in which is dissolved.
  • the interaction between the C-terminal modified protein and the target molecule measured in this method is not necessarily considered to be as high in specificity as an antigen-antibody reaction, so that it is necessary to detect the optimal combination. It is effective to numerically determine the degree of interaction.
  • an index indicating the degree of interaction for example, the maximum The value of the minimum target concentration giving the degree of fluorescence polarization can be used.
  • a method for performing a large number of analyzes at the same time for example, a plurality of different C-terminal modified proteins are respectively injected into each measurement well of the above-mentioned fluorescence depolarization measurement apparatus, and a specific target molecule is added thereto.
  • a method is used in which a solution or a specific C-terminal modified protein is charged and a plurality of types of target molecule solutions different from each other are charged into each cell.
  • the surface plasmon resonance method is a method in which surface plasmons are excited by molecules interacting at the metal Z liquid interface and are measured by changes in the intensity of reflected light (Cullen, DC, et al., Biosensors, 3 ( 4), 211-225 (1987-88)).
  • the C-terminal modified protein needs to be fixed by the above-described method, but the target molecule is not required to be modified.
  • a substrate for immobilizing the C-terminal modified protein a substrate in which a metal thin film such as gold, silver, or platinum is formed on a transparent substrate such as glass is used. Any transparent substrate may be used as long as it is used for a surface plasmon resonance device.
  • the thickness is about 0.1-5 mm.
  • the thickness of the metal thin film is preferably about 100 to 2000 A.
  • a commercially available solid substrate for such a surface plasmon resonance device can also be used.
  • the C-terminal modified protein can be immobilized on the substrate by the method described above.
  • the method of bringing the target molecule into contact with the C-terminal-modified protein may be any method as long as the two molecules are brought into contact with each other to an extent sufficient for interaction.
  • a method in which the immobilized C-terminal protein is brought into contact with a solution in which the target molecule is dissolved in a buffer commonly used in biochemistry at an appropriate concentration can be used.
  • ELIbA Enzyme Lined Immunosoroent Assay
  • a plastic microplate or the like usually used for ELISA can also be used.
  • the method for bringing the modified target molecule to be an antibody into contact with the solid phase molecule may be any method as long as the two molecules are brought into contact with each other to an extent sufficient for interaction. It is preferable, but preferably, to prepare a solution in which the modified target molecule is dissolved at an appropriate concentration in a buffer commonly used in biochemistry, and inject the solution into a microplate.
  • a step of washing the excessively present modified molecules not bound to the immobilized lignin molecules with the same buffer or the like is performed to remove the modified molecules remaining on the solid phase.
  • a molecule that interacts with the immobilized antigen molecule can be identified.
  • a method for performing a large number of analyzes at the same time for example, a method of immobilizing a plurality of different modified target molecules in each hole of the microplate is used.
  • the protein of the present invention can also be used for identification of interacting molecules.
  • the primary structure of the target molecule which is measured by each of the above methods and has an interaction with the C-terminal modified protein, is unknown, its primary molecule can be obtained by an appropriate method known per se.
  • the structure can be analyzed. Specifically, when the target molecule for which the interaction is recognized is a protein, the primary structure can be identified by analyzing the amino acid sequence using an amino acid analyzer or the like.
  • the base sequence can be determined by a base sequence determination method using an auto DNA sequencer or the like.
  • the protein of the present invention can also be used for analysis of the interaction with a protein library.
  • co-translational selection / screening of IW can be performed using bait as a c-Jun protein and prey as a mouse brain cDNA library, and form a complex with the resulting c-Jun protein.
  • a gene or a nucleic acid sequence encoding a novel protein and a method for using the same.
  • the present invention also provides a method of using a gene or a nucleic acid sequence encoding a known protein that is not known to be capable of forming a complex with the c-Jun protein.
  • the present invention is not limited to searching for a known gene sequence or nucleic acid sequence, a novel protein having a novel amino acid sequence due to an unexpected frame shift, or a nucleic acid sequence whose nucleic acid sequence was disclosed only from genome information. Or a protein having a completely new nucleic acid sequence, a protein that forms a complex by not only direct interaction but also an unexpected indirect interaction, It is possible to provide a gene or nucleic acid sequence encoding
  • PCR primers 5′SP6 (029) T7 (SEQ ID NO: 257) and 3′FosCBPzz (SEQ ID NO: 258)
  • a DNA template was prepared by the PCR program CYCB1 (see Table 1).
  • the DNA template was transcribed (37 ° C, 2 hours) using RiboMAX TM Large Scale RNA Production Systems (Promega) to prepare an mRNA template of bait c-Jun protein.
  • the coexisting DNA was DNA-Fos / Jun (SEQ ID NO: 259) containing the binding sequence of FosZjun as a template and PCR (primers 5 'DNA (SEQ ID NO: 260) and 3' DNA (SEQ ID NO: 261), PCR program V -2 (see Table 1)).
  • the method of preparing the prey mouse brain cDNA library was as follows.
  • An IW random library was created according to Figure 3.
  • RNA library a commercially available mouse brain (polyA +) RNA library (purified tissue library RNA library by oligo dT column; clontech) was purchased.
  • the adapter was designed to add a 5 ′ UTR sequence (promoter SP6 + enhancer 029 or 0 ′) suitable for forming an assigning molecule to the library as a sequence necessary for IW formation.
  • An adapter with Enhancer 029 was used for the mouse brain (polyA +) RNA library.
  • the main chain (SEQ ID NO: 262 or 263) and the side chain (gaattcgc) of the adapter for Enhancer 029 are each dissolved in TE buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, ImM EDTA) to 100 M, and the main chain Each side chain was mixed in equimolar with 101 each. Heated at 90 ° C for 2 minutes, heated at 70 ° C for 5 minutes, set in a 60 ° C water bath, turned off the heater of the bath, and slowly lowered from 60 ° C to room temperature. Aliquots of 5 ⁇ l were stored at ⁇ 20 ° C. Next, the mouse brain (polyA +) RNA library was reverse transcribed into single-stranded DNA (Fig.
  • mice brain (polyA +) RNA library (1.4 pmole / 0.5 ⁇ g) was 2 pmol of the random primer (SEQ ID NO: 264) was mixed with DEPC water to make 12.0 ⁇ l, heated at 70 ° C. for 10 min, and cooled on ice for 1 minute. Using this, lh reverse transcription reaction was performed at 45 ° C. with SuperScript II RT (Superscript Double Strand cDNA Synthesis Kit; Invitrogen). Next, using the entire amount of the single-stranded DNA synthesized by the reverse transcription reaction, E. coli DNA ligase, E. coli polymerase I, and E.
  • IgG binding buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% 5040) 50 1 was added to give a total of 100 1 (cotranslation sample). Thereafter, IgG agarose (Sigma) was washed twice with an IgG binding buffer, a cotranslation sample (1001) was added thereto, and the mixture was rotated and stirred at 4 ° C for 2 hours.
  • TEV cleavage buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% NP40, 0.5 mM EDTA, ImM DTT)
  • the bait / prey complex bound to IgG agarose was washed.
  • Cleavage was performed with TEV protease (GIBCO-BRL) (16 ° C, 2 hours).
  • RT-PCR One step RT-PCR kit (QIAGEN), primers; SEQ ID NOs: 265 and 266, program; RT-QH3090 (see Table 1)) After repeating this operation (Step 1 in Figure 2) for 5 rounds, the library was cloned and sequenced to obtain the amino acid sequence and nucleic acid sequence of the gene in Figure 1.
  • the DNA sequence numbers corresponding to Nos. 1-169 are shown below in Listing 1. The results were generated using a library made using SEQ ID No. 262 as the backbone of the adapter for Enhancer 029 and SEQ ID No. 263. The same was true for all of the libraries. [0295] List 1>
  • Each of the proteins in Fig. 1 is the first protein to be found to form a complex with c-Jun.
  • the sequence cloned into the pDrive vector (SEQ ID NO: 267, manufactured by QIAGEN) was extracted from the cells, and PCR (primers 5'F3 (SEQ ID NO: 268) and 3'R3 (SEQ ID NO: 268) was performed using TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo). (SEQ ID NO: 269) and the PCR program ISHI 1562 (see Table 1), 100 1 scale) DNA template was transcribed using RiboMAX TM Large Scale RNA Production Systems (Promega) (37 ° C). 2 hours, 50 1 scale), and prepared mRNA template for prey protein. [0298] The method for preparing the bait c-Jun protein was the same as that used in the screening.
  • the play template was subjected to cell-free translation (10 ⁇ l scale) using the C-terminal labeling method for 1 hour to prepare a prey protein in a C-terminal labeled state.
  • the bait c-jun template was subjected to a translation reaction for 1 hour by cell-free translation (501 scale) to produce a bait protein.
  • the two and the binding buffer were mixed (play: 81, bait: 10 ⁇ l, IgG binding buffer: 821), incubated in 50 ⁇ l of IgG agarose beads for 2 hours, washed the beads, and added 20 1 to the beads.
  • the SDS-containing buffer solution was washed and boiled at 100 ° C for 5 minutes to elute. This sample was developed by 17.5% SDS-PAGE, and the FITC fluorescent dye was observed with a fluorescent imager (FIG. 4B).
  • a reaction in which bait c-Jun protein was not calorie was also performed.
  • c-Jun Direct and indirect interaction confirmed the enrichment of the gene (Fig. 5).
  • SEQ ID NOS: 25 GFAP) and 255 (Ki! 5b) were also enriched similarly to other directly interacting genes, confirming that they had an indirect interaction with c-Jun.
  • a specific real-time PCR method was obtained by screening 14 genes (SEQ ID NOs: 143, 206, 223, 229, 232, 236, 240, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255).
  • Primers were designed to be amplified within the range of the rooster (SEQ ID NOs: 270-297).
  • the gene in which the positive control DNA fragment was incorporated into the pDrive vector was subjected to PCR (primer 5'M13_F (SEQ ID NO: 298) and primer 3'M13_R (SEQ ID NO: 299) and the PCR program shown in Table 1). using a light cycler) to prepare 1E03, 1E05, 1E07, and 1E09 clones / reaction.
  • library DNA before screening, library DNA in each screening cycle, and motta (Mock) library DNA without bait c-jun were prepared at 5 ng / reaction.
  • PCR measurement reaction Pama LightCycler Instrument ⁇ Light and ycler FastStart DNA Master b BR ureen I (both It was performed at a scale of 20 ⁇ l using the program shown in Table 1 using Roche's Diagnostics.
  • genes detected by the IW method have been detected through a competition process by repeating screening multiple times. Therefore, the gene group detected by the IVV method draws a certain number distribution, and the more highly competitive genes are detected. This indicates that the greater the number of clones, the more effective it is as a blocking agent 'inhibitor, which is more competitive.
  • the temperature of the annealing is 62 ''51 ° C depending on the Tm value of the primer.
  • proteins that interact with c-Jun not only proteins that directly interact with c-Jun but also proteins that form complexes due to expected indirect interactions and those proteins And nucleic acids encoding the same, and methods of using them.

Abstract

　in vitroウイルス(IVV)の共翻訳セレクション/スクリーニングおよびＣ末端ラベル化法を用いて、c-Junをベイトとして、マウス脳のcDNAライブラリーから転写制御因子複合体解析を網羅的に行い、c-Jun蛋白質と複合体を形成することは知られていなかった既知および未知の蛋白質を提供する。これにより、c-Junと相互作用する蛋白質及びそれを利用した阻害剤、ならびに、相互作用の検出方法及びスクリーニング方法などを提供する。

Description

明 細 書
c一 Jun蛋白質と複合体を形成する蛋白質、及び、それをコードする核酸、 ならびに、それらの利用方法
技術分野
[0001] 本発明は、 c-Junと相互作用する蛋白質及びそれを利用した阻害剤、ならびに、相 互作用の検出方法及びスクリーニング方法に関する。
背景技術
[0002] 現在、多様な生物のゲノムの塩基配列が解読されようとしている。ゲノムシーケンス の研究では、第 2幕のポストシーケンスの研究として、解読したゲノム情報力もその意 味を解析する研究、すなわち、遺伝子や蛋白質の構造や機能解析 (非特許文献 1、 非特許文献 2)、および蛋白質間、核酸-蛋白質間相互作用解析などが期待されてい る (非特許文献 3、非特許文献 4)。
[0003] 以上のような技術を駆使したポストゲノム機能解析によって、蛋白質間および蛋白 質-核酸間などの相互作用ネットワーク解析力 公知の蛋白質の新たな機能やこれ まで知られていな力つた新規の蛋白質などの重要な生体酵素の発見による医薬品の 創製などが期待されている。
[0004] 蛋白質間相互作用の検出方法として、これまで免疫沈降 (非特許文献 5)、 GST融合 蛋白質によるプルダウン 'アツセィ (非特許文献 6)、 TAP法（非特許文献 7)、酵母ツー ノ、イブリツド法（非特許文献 8)などが知られている。一方、進化分子工学のツールとし て誕生した「遺伝子 (遺伝子型)と蛋白質 (表現型)の対応付け」を応用して、ポストゲノ ム機能解析における蛋白質間相互作用を網羅的に解析する方法として、 in vitroウイ ルス法（非特許文献 9、非特許文献 10、特許文献 1、特許文献 2)、 STABLE法（非特 許文献 11)、ファージディスプレイ法（非特許文献 12)、リボソーム 'ディスプレイ法 (非 特許文献 13、特許文献 3)、 mRNA-ペプチドヒユージョン (mRNAディスプレイ)法 (非特 許文献 14)などである。
[0005] さらに、表面プラズモン共鳴法、蛍光共鳴エネルギー移動法、蛍光偏光解消法、ェ バネッセント場イメージング法、蛍光相関分光法、蛍光イメージング法、固相酵素免 疫検定法などが知られている。また、ピューロマイシン等の核酸誘導体を用いて翻訳 系中で蛋白質の C末端を修飾する方法 (特許文献 4、特許文献 5)が先に提案されて いる。これらの方法は、従来の化学修飾法や蛍光蛋白質融合法に比べて、蛋白質の 機能を損ないにくい等の利点がある。
[0006] 生命科学の領域ではヒトゲノムの配列解析が終了し、ゲノム研究は遺伝子の機能 解析のポストゲノム時代に突入し、網羅的なゲノム機能解析による創薬などが期待さ れて 、る。これまで単独で研究されて 、た遺伝子ゃ蛋白質を網羅的に解析できる手 法、たとえば、創薬のターゲット蛋白質である転写制御因子の種種のコファクターな どを一度に解析する手法などが所望されている。転写制御因子としては、 c-Fos/c-Jun蛋白質がよく知られている。
[0007] C- fos遺伝子は、 Bohmannら〖こより、トリ肉腫ウィルス 17のもつ癌遺伝子である v-jun ( 後に、これは-ヮトリのゲノム由来のもので、多くの種に保存されていることが分かつ た）と 80%以上のアミノ酸配列の相同性をもつヒトホモログとして単離された (非特許文 献 15)。 c-junは、典型的な極初期遺伝子 (immediate early gene)として、多くの細胞 種で増殖刺激に伴って検出される転写制御因子である。また、既知のファミリー遺伝 子として、 junB、 junDが知られている。 Hilbergらがジーンターゲッティングによりヌル (null)変異マウスを作製し解析を行ったところ、 C- jun欠損マウスでは肝臓形成の異常 などを示し、胎生致死となることが確認された。これにより c-jun遺伝子の肝臓形成へ の根源的な関与が示された (非特許文献 16)。
[0008] c-Junは、 N末端側に転写をコントロールするトランス作用 (trans-activation)ドメイン、 C末端側にホモ'ヘテロダイマーを形成し、 DNAエレメントに結合する bZIPドメインをも ち、それぞれ多くの因子と相互作用することが知られている（非特許文献 17)。最近 になり、ツーノ、イブリット法を用いたスクリーニングにより、 c-Jun/c-Fosの複合体に対 し、クロマチンリモデリング因子 SWI/SNFのサブユニットである BAF60aが相互作用す ることが明らかになり（非特許文献 18)、 c-Junによる遺伝子の発現制御は、単純な転 写制御モデルではなぐクロマチンの構造変化などを介した複雑なメカニズムによる ものであることが明らかにされつつある。 c-Junは相互作用する因子の数が多ぐこの 複雑な機構を維持する上で、蛋白質間相互作用ネットワークのハブとして重要な働き を担っている可能性は高い。また、クロマチン制御は発生 ·分ィ匕など、細胞活動の根 源にかかわる機構であるため、癌を始め、様々な疾患とも関連性があり、 c-Junと相互 作用する因子群の網羅的解析は、基礎研究のみならず、創薬の面からも重大なイン パクトがあると考えられる。し力しながら、ツーハイブリッド法のような 1 : 1の分子解析 手法では、大変な労力と時間を要し、現実的ではない。
非特許文献 1 : Saegusa A. Nature 401, 6751 (1999)
非特許文献 2 : Dalton R, Abbott A. Nature 402, 6763 (1999)
非特許文献 3 :宫本悦子、柳川弘志（2000)シリーズ 'ポストシークェンスのゲノム科学 3:プロテオミタス， pp.136- 145
非特許文献 4:宫本悦子、柳川弘志（2001)蛋白質 ·核酸 ·酵素、 46(2), pp.138-147) 非特許文献 5 :Xiong et al. 1993 Nature 366, 701-704
非特許文献 6 : Kaelin, et al. 1991 Cell 64, 521-532
非特許文献 7 : Guillaume Rigaut, et al., Nature biotechnology 17, 1030 (1999) 非特許文献 8 : Fields S, Song O. Nature 340, 245 (1989)
非特許文献 9 : Miyamoto- Sato E, et al. Viva Origino 25, 35 (1997)
非特許文献 10 :Nemoto N, et al. FEBS Lett. 414, 405 (1997)
特許文献 1：国際公開第 W098Z16636号パンフレット
特許文献 2：国際公開第 WO02Z46395号パンフレット
非特許文献 ll : Doi N, Yanagawa H. FEBS Lett. 457, 227 (1999)
非特許文献 12 : Smith G.P. Science 228, 1315 (1985)
非特許文献 13 :Mattheakis, L.C. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9022-9026 (1994)
特許文献 3:国際公開第 W095Z11922号パンフレット
非特許文献 14: Roberts R.W, Szostak J.W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297 (1997)
特許文献 4:米国特許第 6, 228, 994号明細書
特許文献 5：国際公開第 WO02Z48347号パンフレット
非特許文献 15 : Bohmann, D.; Bos, T. J.; Admon, A.; Nishimura, T.; Vogt, P. K.; Tjian, R. Science 238, 1386-1392 (1987)
非特許文献 16 : Hilberg, F.; Aguzzi, A.; Howells, N.; Wagner, E. F. Nature 365, 179-181 (1993)
非特許文献 17 : Chinenov Y, Kerppola TK. Oncogene. 20, 2438-2452 (2001) 非特許文献 18 : Ito T, Yamauchi M, Nishina M, Yamamichi N, Mizutani T, Ui M, Murakami M, Iba H. J Biol Chem. 276, 2852-2857 (2001)
発明の開示
[0009] 本発明は、転写制御因子として良く知られている c-Jun蛋白質をターゲット蛋白質と して、 c-Junと相互作用する複合体を提供することを課題とする。
[0010] 本発明者らは、従来法に代わる 1:多分子解析法である網羅的解析手法として、上 述の in vitroウィルス法を土台とし、これまでに研究を重ねてきたピューロマイシンテク ノロジ一と命名した二つの技術、 in vitroウィルス (IW)の共翻訳スクリーニングおよび C末端ラベル化法 (米国特許第 6228994号、 WO 02/48347)を用いて、 c-Junをべイトと して、マウス脳の cDNAライブラリ一力も転写制御因子複合体解析を網羅的に行い、 これまで知られていなかった蛋白質、あるいは蛋白質としては公知であった力 c-Jun 蛋白質と複合体を形成することは知られていな力つた蛋白質などを解析することを試 みた。ここで複合体を形成するとは、 c-Jun蛋白質と直接又は間接的な相互作用があ ることである。
[0011] 本発明の他の課題は、 c-Junと相互作用する蛋白質ならびにそれを利用した阻害 剤、ならびに、相互作用の検出方法及びスクリーニング方法を提供することである。
[0012] 本発明者らは、 IWを用いた共翻訳スクリーニングにより、 c-Junと相互作用する新 規蛋白質を見出すとともに、既知の蛋白質が c-Junと相互作用することを見出し、本 発明を完成した。本発明は、以下のものを提供する。
[0013] (1) c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害剤 であって、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 1一 69のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 1一 69のいずれかのアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が 欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋 白質。
[0014] (2) 有効成分の蛋白質が配列番号 1一 69のいずれかのアミノ酸配列を含む（2) 記載の阻害剤。
[0015] (3) 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸力も翻訳された蛋白質である（2)記載の 阻害剤。
(a)配列番号 126— 199のいずれかの塩基配列を含む核酸。
(b)配列番号 126— 199のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸
[0016] (4) 核酸が配列番号 126— 199のいずれかの塩基配列を含む（3)記載の阻害剤
[0017] (5) ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含 む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)もしく は (b)の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸力も翻訳された蛋白質である j記方法。
(a)配列番号 1一 69のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 1一 69のいずれかのアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が 欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋 白質。
(a， )配列番号 126— 199の!、ずれかの塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 126— 199のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸
[0018] (6) 蛋白質が配列番号 1一 69のいずれかのアミノ酸配列を含む（5)記載の方法。
[0019] (7) 核酸が配列番号 126— 199のいずれかの塩基配列を含む（5)記載の方法。
[0020] (8) (5)—（7)のいずれか 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の相互作 用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む
、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。 [0021] (9) c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害剤 であって、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 70— 87のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 70— 87のいずれかのアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸 が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する 蛋白質。
[0022] (10) 有効成分の蛋白質が配列番号 70— 87のいずれかのアミノ酸配列を含む（9 )記載の阻害剤。
[0023] (11) 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸力も翻訳された蛋白質である（9)記載 の阻害剤。
(a)配列番号 200— 217のいずれかの塩基配列を含む核酸。
(b)配列番号 200— 217のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸
[0024] (12) 核酸が配列番号 200— 217のいずれかの塩基配列を含む（11)記載の阻 害剤。
[0025] (13) ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを 含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)も しくは (b)の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸から翻訳された蛋白質であ る會 U，己方法。
(a)配列番号 70— 87のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 70— 87のいずれかのアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸 が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する 蛋白質。
(a' )配列番号 200— 217の!、ずれかの塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 200— 217のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸 [0026] (14) 蛋白質が配列番号 70— 87のいずれかのアミノ酸配列を含む（13)記載の 方法。
[0027] (15) 核酸が配列番号 200— 217のいずれかの塩基配列を含む（13)記載の方 法。
[0028] (16) (13)—（15)のいずれ力 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の相 互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を 含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
[0029] (17) c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害剤 であって、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 88— 94のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 88— 94のいずれかのアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸 が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する 蛋白質。
[0030] (18) 有効成分の蛋白質が配列番号 88— 94のいずれかのアミノ酸配列を含む（1 7)記載の阻害剤。
[0031] (19) 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸力も翻訳された蛋白質である（17)記載 の阻害剤。
(a)配列番号 218— 224のいずれかの塩基配列を含む核酸。
(b)配列番号 218— 224のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸
[0032] (20) 核酸が配列番号 218— 224のいずれかの塩基配列を含む（19)記載の阻 害剤。
[0033] (21) ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを 含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)も しくは (b)の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸から翻訳された蛋白質であ る會 U，己方法。
(a)配列番号 88— 94のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。 (b)配列番号 88— 94のいずれかのアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸 が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する 蛋白質。
(a' )配列番号 218— 224の!、ずれかの塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 218— 224のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸
[0034] (22) 蛋白質が配列番号 88— 94のいずれかのアミノ酸配列を含む（21)記載の 方法。
[0035] (23) 核酸が配列番号 218— 224のいずれかの塩基配列を含む（21)記載の方 法。
[0036] (24) (21)—（23)のいずれ力 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の相 互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を 含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
[0037] (25) c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害剤 であって、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 95— 99のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 95— 99のいずれかのアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸 が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する 蛋白質。
[0038] (26) 有効成分の蛋白質が配列番号 95— 99のいずれかのアミノ酸配列を含む（2 5)記載の阻害剤。
[0039] (27) 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸力も翻訳された蛋白質である（25)記載 の阻害剤。
(a)配列番号 225— 229の!、ずれかの塩基配列を含む核酸。
(b)配列番号 225— 229のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸 [0040] (28) 核酸が配列番号 225— 229のいずれかの塩基配列を含む（27)記載の阻 害剤。
[0041] (29) ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを 含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)も しくは (b)の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸から翻訳された蛋白質であ る會 U，己方法。
(a)配列番号 95— 99のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 95— 99のいずれかのアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸 が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する 蛋白質。
(a' )配列番号 225— 229の!、ずれかの塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 225— 229のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸
[0042] (30) 蛋白質が配列番号 95— 99のいずれかのアミノ酸配列を含む（29)記載の 方法。
[0043] (31) 核酸が配列番号 225— 229のいずれかの塩基配列を含む（29)記載の方 法。
[0044] (32) (29)—（31)のいずれ力 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の相 互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を 含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
[0045] (33) c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害剤 であって、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 100— 104のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 100— 104の!、ずれかのアミノ酸配列にお 、て、 1もしくは数個のァミノ 酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用す る蛋白質。
[0046] (34) 有効成分の蛋白質が配列番号 100— 104のいずれかのアミノ酸配列を含 む (33)記載の阻害剤。
[0047] (35) 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸力も翻訳された蛋白質である（33)記載 の阻害剤。
(a)配列番号 230— 234の!、ずれかの塩基配列を含む核酸。
(b)配列番号 230— 234のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸
[0048] (36) 核酸が配列番号 230— 234のいずれかの塩基配列を含む（35)記載の阻 害剤。
[0049] (37) ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを 含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)も しくは (b)の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸から翻訳された蛋白質であ る會 U，己方法。
(a)配列番号 100— 104のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 100— 104の!、ずれかのアミノ酸配列にお 、て、 1もしくは数個のァミノ 酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用す る蛋白質。
(a' )配列番号 230— 234の!、ずれかの塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 230— 234のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸
[0050] (38) 蛋白質が配列番号 100— 104のいずれかのアミノ酸配列を含む（37)記載 の方法。
[0051] (39) 核酸が配列番号 230— 234のいずれかの塩基配列を含む（37)記載の方 法。
[0052] (40) (37)—（39)のいずれ力 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の相 互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を 含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。 [0053] (41) c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害剤 であって、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 105— 108のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 105— 108の!、ずれかのアミノ酸配列にお 、て、 1もしくは数個のァミノ 酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用す る蛋白質。
[0054] (42) 有効成分の蛋白質が配列番号 105— 108のいずれかのアミノ酸配列を含 む (41)記載の阻害剤。
[0055] (43) 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸力も翻訳された蛋白質である（41)記載 の阻害剤。
(a)配列番号 235— 238のいずれかの塩基配列を含む核酸。
(b)配列番号 235— 238のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸
[0056] (44) 核酸が配列番号 235— 238のいずれかの塩基配列を含む（43)記載の阻 害剤。
[0057] (45) ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを 含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)も しくは (b)の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸から翻訳された蛋白質であ る會 U，己方法。
(a)配列番号 105— 108のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 105— 108の!、ずれかのアミノ酸配列にお 、て、 1もしくは数個のァミノ 酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用す る蛋白質。
(a' )配列番号 235— 238の!、ずれかの塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 235— 238のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸 [0058] (46) 蛋白質が配列番号 105— 108のいずれかのアミノ酸配列を含む（45)記載 の方法。
[0059] (47) 核酸が配列番号 235— 238のいずれかの塩基配列を含む（45)記載の方 法。
[0060] (48) (45)—（47)のいずれ力 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の相 互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を 含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
[0061] (49) c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害剤 であって、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 109— 111の!、ずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 109— 111の!、ずれかのアミノ酸配列にお 、て、 1もしくは数個のァミノ 酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用す る蛋白質。
[0062] (50) 有効成分の蛋白質が配列番号 109— 111のいずれかのアミノ酸配列を含 む (49)記載の阻害剤。
[0063] (51) 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸力も翻訳された蛋白質である（49)記載 の阻害剤。
(a)配列番号 239— 241のいずれかの塩基配列を含む核酸。
(b)配列番号 239— 241のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸
[0064] (52) 核酸が配列番号 239— 241のいずれかの塩基配列を含む（51)記載の阻 害剤。
[0065] (53) ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを 含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)も しくは (b)の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸から翻訳された蛋白質であ る會 U，己方法。
(a)配列番号 109— 111の!、ずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。 (b)配列番号 109— 111の!、ずれかのアミノ酸配列にお 、て、 1もしくは数個のァミノ 酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用す る蛋白質。
(a' )配列番号 239— 241の!、ずれかの塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 239— 241のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸
[0066] (54) 蛋白質が配列番号 109— 111のいずれかのアミノ酸配列を含む（53)記載 の方法。
[0067] (55) 核酸が配列番号 239— 241のいずれかの塩基配列を含む（53)記載の方 法。
[0068] (56) (53)—（55)のいずれ力 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の相 互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を 含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
[0069] (57) c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害剤 であって、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 112もしくは 113のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 112もしくは 113のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。
[0070] (58) 有効成分の蛋白質が配列番号 112又は 113のアミノ酸配列を含む（57)記 載の阻害剤。
[0071] (59) 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸力も翻訳された蛋白質である（57)記載 の阻害剤。
(a)配列番号 242もしくは 243の塩基配列を含む核酸。
(b)配列番号 242もしくは 243の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[0072] (60) 核酸が配列番号 242又は 243の塩基配列を含む（59)記載の阻害剤。 [0073] (61) ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを 含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)も しくは (b)の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸から翻訳された蛋白質であ る會 U，己方法。
(a)配列番号 112もしくは 113のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 112もしくは 113のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。
(a' )配列番号 242もしくは 243の塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 242もしくは 243の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[0074] (62) 蛋白質が配列番号 112又は 113のアミノ酸配列を含む（61)記載の方法。
[0075] (63) 核酸が配列番号 242又は 243の塩基配列を含む（61)記載の方法。
[0076] (64) (61)—（63)のいずれ力 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の相 互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を 含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
[0077] (65) c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害剤 であって、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 114もしくは 115のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 114もしくは 115のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。
[0078] (66) 有効成分の蛋白質が配列番号 114又は 115のアミノ酸配列を含む（65)記 載の阻害剤。
[0079] (67) 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸力も翻訳された蛋白質である（65)記載 の阻害剤。
(a)配列番号 244もしくは 245の塩基配列を含む核酸。
(b)配列番号 244もしくは 245の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[0080] (68) 核酸が配列番号 244又は 245の塩基配列を含む（67)記載の阻害剤。
[0081] (69) ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを 含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)も しくは (b)の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸から翻訳された蛋白質であ る會 U，己方法。
(a)配列番号 114もしくは 115のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 114もしくは 115のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。
(a' )配列番号 244もしくは 245の塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 244もしくは 245の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[0082] (70) 蛋白質が配列番号 114又は 115のアミノ酸配列を含む（69)記載の方法。
[0083] (71) 核酸が配列番号 244又は 245の塩基配列を含む（69)記載の方法。
[0084] (72) (69)—（71)のいずれ力 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の相 互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を 含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
[0085] (73) c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害剤 であって、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 116もしくは 117のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 116もしくは 117のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。
[0086] (74) 有効成分の蛋白質が配列番号 116又は 117のアミノ酸配列を含む（73)記 載の阻害剤。
[0087] (75) 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸力も翻訳された蛋白質である（73)記載 の阻害剤。 (a)配列番号 246もしくは 247の塩基配列を含む核酸。
(b)配列番号 246もしくは 247の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[0088] (76) 核酸が配列番号 246又は 247の塩基配列を含む（75)記載の阻害剤。
[0089] (77) ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを 含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)も しくは (b)の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸から翻訳された蛋白質であ る會 U，己方法。
(a)配列番号 116もしくは 117のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 116もしくは 117のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。
(a' )配列番号 246もしくは 247の塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 246もしくは 247の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[0090] (78) 蛋白質が配列番号 116又は 117のアミノ酸配列を含む（77)記載の方法。
[0091] (79) 核酸が配列番号 246又は 247の塩基配列を含む（77)記載の方法。
[0092] (80) (77)—（79)のいずれ力 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の相 互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を 含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
[0093] (81) c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害剤 であって、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 118もしくは 119のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 118もしくは 119のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。
[0094] (82) 有効成分の蛋白質が配列番号 118又は 119のアミノ酸配列を含む（81)記 載の阻害剤。 [0095] (83) 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸力も翻訳された蛋白質である（81)記載 の阻害剤。
(a)配列番号 248もしくは 249の塩基配列を含む核酸。
(b)配列番号 248もしくは 249の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[0096] (84) 核酸が配列番号 248又は 249の塩基配列を含む（83)記載の阻害剤。
[0097] (85) ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを 含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)も しくは (b)の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸から翻訳された蛋白質であ る會 U，己方法。
(a)配列番号 118もしくは 119のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 118もしくは 119のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。
(a' )配列番号 248もしくは 249の塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 248もしくは 249の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[0098] (86) 蛋白質が配列番号 118又は 119のアミノ酸配列を含む（85)記載の方法。
[0099] (87) 核酸が配列番号 248又は 249の塩基配列を含む（85)記載の方法。
[0100] (88) (85)—（88)のいずれ力 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の相 互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を 含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
[0101] (89) c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害剤 であって、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 120もしくは 121のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 120もしくは 121のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。 [0102] (90) 有効成分の蛋白質が配列番号 120又は 121のアミノ酸配列を含む（89)記 載の阻害剤。
[0103] (91) 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸力も翻訳された蛋白質である（89)記載 の阻害剤。
(a)配列番号 250もしくは 251の塩基配列を含む核酸。
(b)配列番号 250もしくは 251の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[0104] (92) 核酸が配列番号 250又は 251の塩基配列を含む（91)記載の阻害剤。
[0105] (93) ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを 含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)も しくは (b)の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸から翻訳された蛋白質であ る會 U，己方法。
(a)配列番号 120もしくは 121のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 120もしくは 121のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。
(a' )配列番号 250もしくは 251の塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 250もしくは 251の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[0106] (94) 蛋白質が配列番号 120又は 121のアミノ酸配列を含む（93)記載の方法。
[0107] (95) 核酸が配列番号 250又は 251の塩基配列を含む（93)記載の方法。
[0108] (96) (93)—（95)のいずれ力 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の相 互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を 含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
[0109] (97) c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害剤 であって、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 122もしくは 123のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 122もしくは 123のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。
[0110] (98) 有効成分の蛋白質が配列番号 122又は 123のアミノ酸配列を含む（97)記 載の阻害剤。
[0111] (99) 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸力も翻訳された蛋白質である（97)記載 の阻害剤。
(a)配列番号 252もしくは 253の塩基配列を含む核酸。
(b)配列番号 252もしくは 253の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[0112] (100) 核酸が配列番号 252又は 253の塩基配列を含む（99)記載の阻害剤。
[0113] (101) ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを 含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)も しくは (b)の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸から翻訳された蛋白質であ る會 U，己方法。
(a)配列番号 122もしくは 123のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 122もしくは 123のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。
(a' )配列番号 252もしくは 253の塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 252もしくは 253の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[0114] (102) 蛋白質が配列番号 122又は 123のアミノ酸配列を含む（101)記載の方法
[0115] (103) 核酸が配列番号 252又は 253の塩基配列を含む（101)記載の方法。
[0116] (104) (101)—（103)のいずれ力 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の 相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程 を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
[0117] (105) c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害 剤であって、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 124もしくは 125のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 124もしくは 125のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。
[0118] (106) 有効成分の蛋白質が配列番号 124又は 125のアミノ酸配列を含む（105) 記載の阻害剤。
[0119] (107) 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸力も翻訳された蛋白質である（105)記 載の阻害剤。
(a)配列番号 254もしくは 255の塩基配列を含む核酸。
(b)配列番号 254もしくは 255の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[0120] (108) 核酸が配列番号 254又は 255の塩基配列を含む（107)記載の阻害剤。
[0121] (109) ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを 含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)も しくは (b)の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸から翻訳された蛋白質であ る會 U，己方法。
(a)配列番号 124もしくは 125のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 124もしくは 125のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。
(a' )配列番号 254もしくは 255の塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 254もしくは 255の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[0122] (110) 蛋白質が配列番号 124又は 125のアミノ酸配列を含む（109)記載の方法
[0123] (111) 核酸が配列番号 254又は 255の塩基配列を含む（109)記載の方法。
[0124] (112) (109)—（111)のいずれ力 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の 相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程 を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
図面の簡単な説明
[図 1]本発明の蛋白質のアミノ酸配列と遺伝子配列およびクローユング数などの情報 をまとめて示す。核酸配列番号の括弧内の数字は、それがコードするアミノ酸配列の 番号を示す。枝番のあるものは、同じアミノ酸配列をコードするが、塩基配列が異なる ことを示す。
[図 2]本発明の蛋白質および遺伝子とその塩基配列の検出方法である IWランダムラ イブラリーによる共翻訳スクリーニング法の概略を示す。マウス脳の IWランダムライブ ラリーとベイトとして c-Junを用いて、無細胞共翻訳スクリーニングを行い、スクリーニン グ後のライブラリーを RT-PCRで増幅して再びべイトと共に無細胞共翻訳スクリーニン グすることを 3回繰り返すことにより本発明の蛋白質および遺伝子とその塩基配列を 検出した。
[図 3]本発明の蛋白質および遺伝子とその塩基配列の検出に用いた IVVのランダム プライミンダライブラリーとその製法の概略を示す。 RNAライブラリーを铸型として、 9塩 基力もなるランダム配列と特定配列 (tag2配列）を含むランダムプライマーを用いてラ ンダムプライミング法により逆転写で mRNAに相補的な一本鎖 cDNA(ssDNA)ライブラ リーを合成する 0)。 RNaseHにより cDNAと RNAの二本鎖から RNAのみを分解すると同 時に、 DNAポリメラーゼ Iにより cDNAに相補的な DNAを合成し、さらに、 DNAリガーゼ により DNAポリメラーゼ I〖こより合成された DNA間にあるニックを修正して二本鎖
(dsDNA)ライブラリーを合成する (11)。合成された二本鎖 cDNAは DNAポリメラーゼ I〖こよ り合成された側のみ 5'末端にリン酸基を持つのでこれを利用し、特定配列 (5'1 11?=プ 口モーター +ェンハンサー)を持つアダプターを、 DNAリガーゼを用いて結合し、ライゲ 一テッド dsDNAライブラリーを合成する (111)。アダプターとランダムプライマーの特定 配列を利用して PCRを行い、 5'側にプロモーターとェンハンサ一の配列、 3'側に A tailをもつ対応付け分子の cDNAライブラリー (IW cDNAライブラリー)を作成する (IV) 。次に IW cDNAライブラリーを転写して IW RNAライブラリ一とし (V)、 IWとするため のスぺーサーをライゲーシヨンし (VI)、さらに、無細胞翻訳系などで翻訳すれば、対応 付け分子のライブラリ一となる (νπ)。
圆 4]本発明の蛋白質および遺伝子とその塩基配列の直接的な相互作用の検証結 果（電気泳動写真）を示す。 A: 配列番号 143, 206, 223, 229, 232, 236, 240, 243, 245, 247, 249, 253の核酸酉己歹 IJをもとにして、酉己歹 IJ番号 18(SNAP19), 76 (KINN), 93(Kif5a)、 99(Eefld), 102(Nef3), 106(Jip— c3.1), HO(Jip-cl), 113(EB2) , 115(Cspg6), 117(Mapk8ip3), 119(Jip- c3.2), 121(GFAP), 123(Jip- c8), 125 (Kif5b)の蛋白質 (図 1)が無細胞翻訳系で発現することを C末端ラベルイ匕法により小麦 の無細胞翻訳系で確認。レーン 1-14 ;配列番号 18(SNAP19), 76(KINN), 93(Kif5a) 、 99(Eefld), 102(Nef3), 106(Jip- c3.1), 110(Jip- cl), 113(EB2), 115(Cspg6), 11 7(Mapk8ip3), 119(Jip- c3.2), 121(GFAP), 123(Jip- c8), 125(Kif5b)の蛋白質。 B: 得られた蛋白質と c-Junとの相互作用の検証実験として、配列番号 143, 206, 223, 236, 240, 243, 245, 249の核酸酉己歹 IJをもとにして、酉己歹 IJ番号 18(SNAP19), 76 (KINN), 93(Kif5a)、 106(Jip- c3.1), 110(Jip- cl), 113(EB2), 115(Cspg6), 117 (Mapk8ip3), 1190ip-c3.2), 123(Jip- c8)の蛋白質 (図 1)のアミノ酸配列を有する C末 端ラベルイ匕蛋白質を用いて puU-downで c-Junとの直接的な相互作用を確認。グルー プ 1 ;配列番号 18(SNAP19),グループ 2 ; 76(KINN),グループ 3 ; 93(Kif5a)、グルー プ 6； 1060ip-c3.1),グループ 7； 110(Jip- cl),グループ 8； 113(EB2),グループ 9； 1 15(Cspg6),グループ 10 ; 117(Mapk8ip3),グループ 11； 119(Jip- c3.2),グループ 13 ; 1230ip-c8)o a, b:ベイト c-Junあり、なし (レーン 1, 2, 3 ;翻訳産物、上澄み画分、 溶出画分)。
[図 5]本発明の遺伝子の濃縮率と間接的な相互作用の検証の結果を示す。 14種類 の配列番号 18(SNAP19), 76(KINN), 93(Kif5a)、 99(Eefld), 102(Nef3), 106 (Jip-c3.1), 1100ip-cl), 113(EB2), 115(Cspg6), 117(Mapk8ip3), 119(Jip- c3.2), 12KGFAP), 1230ip-c8), 125(Kif5b)の蛋白質の濃縮を確認するために、配列番 号 143, 206, 223, 229, 232, 236, 240, 243, 245, 247, 249, 253の核酸配 列をもとにしてリアルタイム PCRを行った。
圆 6]本発明の蛋白質や核酸配列を用いた IVVと物質や蛋白質との相互作用解析の 一次スクリーニングと二次スクリーニングの概略を示す。本発明の蛋白質や核酸配列 を用いた、一次スクリーニングで物質や蛋白質と相互作用を検出し、さらに、相互作 用の詳細を FCCSやマイクロアレイなどの二次スクリーニングで解析することが可能で ある。また、本発明の蛋白質や核酸配列は、 IW又は C末端ラベルイ匕蛋白質として、 単独で FCCSやマイクロアレイなどにより物質や蛋白質との相互作用解析に利用する ことも可能である。また、本発明の蛋白質や核酸配列の IVVを用いた進化分子工学 に応用し、一次スクリーニングにより機能性蛋白質の創出に利用することも可能であり 、その際に、一次スクリーニングと二次スクリーニングを組み合わせて、創出した機能 性蛋白質の相互作用の詳細を解析することも可能である。
[図 7]翻訳テンプレート (A)ならびにその構成要素であるコード分子 (B)及びスぺー サー分子 (C)の構成を示す。翻訳テンプレートは、コード分子由来のコード部とスぺ ーサ一分子由来のスぺーサ一部からなる。 F1及び F2は蛍光色素を示す。
圆 8]C末端修飾された蛋白質 (C末端ラベルイ匕蛋白質) (A)、本発明の翻訳テンプレ ート (B)、及び、修飾剤 (C)の構成を示す。
[図 9]無細胞共翻訳による複合体の形成の概略を示す。 A: ベイトとプレイが無細胞 翻訳系で共に翻訳され相互作用し、無細胞翻訳系において複合体を形成する。プレ ィは単数 (I)であっても複数 (II)であっても構わないし、また、無細胞翻訳系での翻訳 で得られるポリペプチドそのものであっても、対応付け分子 (結合体)であっても構わな い。 B: ベイトの共存下、プレイが無細胞翻訳系で翻訳され相互作用し、無細胞翻訳 系にお 、て複合体を形成する。プレイは単数 (I)であっても複数 (Π)であっても構わな いし、また、無細胞翻訳系での翻訳で得られるポリペプチドそのものであっても、対応 付け分子 (結合体)であっても構わな 、。
[図 10]複合べイトを用いた場合の無細胞共翻訳による複合体の形成の概略を示す。 複合べイトを構成する一部のベイトとプレイが無細胞翻訳系で共に翻訳され相互作 用し、無細胞翻訳系において複合体を形成する。プレイは、単数 (I)であっても複数 (II)であっても構わないし、また、無細胞翻訳系での翻訳で得られるポリペプチドその ものであっても、対応付け分子 (結合体)であっても構わない。また、複合べイトは、図 に示した無細胞翻訳系で翻訳されたポリペプチドと DNAベイトの組合せに限られず、 無細胞翻訳系で翻訳された複数又は単独のポリペプチドと、無細胞翻訳系で共存す る複数又は単独のベイト (たとえば、 DNAベイトなど)の組み合わせが挙げられる。
[図 11]無細胞共翻訳による複合体のスクリーニング方法の概略を示す。 図 9及び 1 0で示したような無細胞共翻訳による複合体形成の工程 (1)、その複合体のプレイをス クリーニングする工程 (2)、及び、プレイの解析の工程 (3)により、無細胞共翻訳とスクリ 一二ングをトータルに in vitroで実現することができる。プレイが対応付け分子でかつ 複数であれば、 RT-PCR又は PCRによってプレイをコードする mRNA又は DNAを再構 成することにより再度 (1)の工程からスクリーニングを繰り返すことができる。また、得ら れたプレイを解析後、ベイトとして (1)の工程力もスクリーニングを新たに繰り返すこと ができる。
発明を実施するための最良の形態
[0126] < 1 >本発明の蛋白質
本明細書においては、説明の便宜のため、 c-Junと相互作用することが見出された 蛋白質を、新規蛋白質も含めて、本発明の蛋白質と呼ぶ。
[0127] 本発明の蛋白質の第一群は、機能既知の蛋白質であるが、 C- Junと複合体を形成 する機能は新規の蛋白質である。すなわち、これまで、 c-Junと複合体を形成すること が知られていた蛋白質（Yurii Chinenovl and Tom K Kerppola, Oncogene (2001) 20, 2438-2452)のいずれでもない。具体的には、図 1に示すように、アミノ酸配列番号 1 一 69にあたる SNAP19(SNAPc5)は、 pol IIおよび pol IIIによって転写される snRNAのプ 口モーターである PSEに結合し、転写を制御する SNAP複合体のサブユニットの一つ である (Henry, R. W.; Mittal, V.; Ma, B.; Kobayashi, R.; Hernandez, N. Genes Dev. 12: 2664-2672, 1998. (PubMed ID： 9732265》。アミノ酸配列番号 70— 87にあたる Kif5cは、微小管に沿って物質輸送の働きをするモーター蛋白質である、キネシンス 一パーファミリーの一分子である。脳に高発現していることが知られる (Nagase, T.; Ishikawa, K.; Miyajima, Ν·; Tanaka, A.; Kotani, H.; Nomura, N.; Ohara, O. DNA Res. 5: 31-39, 1998. (PubMed ID： 9628581))。アミノ酸配列番号 88— 94にあたる Kif5aは、微小管に沿って物質輸送の働きをするモーター蛋白質である、キネシンス 一パーファミリーの一分子である。変異は遺伝性痙性対麻痺を引き起こすことが知ら れている (Niclas, J.; Navone, F.; Horn— Booher, N.; Vale, R. D. Neuron 12: 1059-1072, 1994. (PubMed ID ： 7514426》。アミノ酸配列番号 95— 99にあたる Eefld は、翻訳の伸長を調節する蛋白質として知られているが、最近、癌'腫瘍関係の遺伝 子でもあることが示された (Joseph, P.; Lei, Y. X.; Whong, W. Z.; Ong, T. M. J. Biol. Chem. 277 ： 6131-6136, 2002. (PubMed ID ： 11711542》。アミノ酸配列番号 100— 1 04にあたる Nef3は、 3種類の神経細胞特異的中間径フィラメントの構成分子のうち一 つであり、分子量 125 kDの蛋白質である (Levy, E.; Liem, R. K. Η.; D'Eustachio, P.; Cowan, N. J. Europ. J. Biochem. 166: 71-77, 1987. (PubMed ID ： 3036526》。ァミノ 酸配列番号 112一 113にあたる EB2は、 APC— binding protein EB2(Mapre3)であり、 APCと相互作用し、協調的に微小管の重合を促進することが知られている EBlファミリ ~~の丄つで &)る (¾u, L.-K.; Qi, Y. ： し haracterization of human MAPRE genes and their proteins. Genomics 71: 143-149, 2001)。アミノ酸配列番号 114一 115にあたる Cspg6は、姉妹染色体の分配に重要な役割をもつコヒーシン複合体のサブユニットの 一つで、 ATPase活性をもつ球状部位とロッド状の部位力 なる蛋白質である (Sumara,
I.; Vorlaufer, E.; Gieffers, C; Peters, B. H.; Peters, J.-M. J. Cell Biol. 151:
749-761, 2000. (PubMed ID ： 11076961》。アミノ酸配列番号 116— 117にあたる Mapk8ip3は、 JNKと結合するスキヤフォールド蛋白質の一つであり、 JNKを介した MAPキナーゼシグナルカスケードにお 、て、重要な役割を示すと考えられて!/、る (Dickens, M.; Davis, R. J. Molec. Cell. Biol. 20: 1030—1043, 2000. (PubMed ID ： 10629060))。アミノ酸配列番号 120— 121にあたる GFAPは、星状膠細胞に高発現す る中間径フィラメント構成分子の一つである。 N末端に特異的な配列を持ち、細胞特 異的な働きをして 、ると考えられて 、る。奇病であるァレキサンダー病の原因遺伝子 である (Bongcam— Rudloff, E.; Nister, M.; Betsholtz, C; Wang, J.-L.; Stenman, u.; Huebner, K.; Croce, C. M.; Westermark, B. Cancer Res. 51: 1553—1560, 1991. (PubMed ID ： 1847665)。アミノ酸配列番号 124— 125にあたる Kif5bは、微小管に沿 つて物質輸送の働きをするモーター蛋白質である、キネシンスーパーファミリーの一 分子である。オルガネラの輸送に関与しており、 KOマウスではミトコンドリアの配置に 異常が発生する (Tanaka, Y.; Kanai, Y.; Okada, Y.; Nonaka, S.; Takeda, S.; Harada,
A.; Hirokawa, N. Cell 93: 1147—1158, 1998. PubMed ID ： 9657148)、 Kamal, A.; Almenar-Queralt, A.; LeBlanc, J. F.; Roberts, E. A.; Goldstein, L. S. B. Nature 414: 643-648, 2001. (PubMed ID： 11740561》。
[0128] これら蛋白質のうち、ロイシンジッパーを持たないものは、 Nef3、 EB2、 GFAP、 KilSb である。また、 c-Junと間接的に相互作用しているものは Nef3、 GFAPである。その他、 SNAP19、 Kif5c、 Kif5a、 Eefld、 Cspg6、 Mapk8ip3は、全てロイシンジッパーを持ち、 c-Junと複合体を形成するものである。
[0129] 本発明の蛋白質の第 2の群は、機能未知の蛋白質であり、 c-Junと複合体を形成す る機能が新規に見いだされた蛋白質である。具体的には、アミノ酸配列番号 105— 1 08にあたる Jip-c3.1、アミノ酸配列番号 109— 111にあたる Jip-cl、アミノ酸配列番号 118-119にあたる Jip- c3.2、アミノ酸配列番号 122— 123にあたる Jip- c8である (図 1 )oこれら蛋白質は、全てロイシンジッパーを持ち、 c-Junと直接相互作用するものであ る。
[0130] 以下、本発明の蛋白質についてさらに説明する。
[0131] 本発明の蛋白質のうち、配列番号 1一 124のいずれかのアミノ酸配列を有する蛋白 質は、後述の実施例に記載したように、 c-Jun蛋白質と相互作用すること、すなわち、 複合体を形成することが判明した蛋白質である。蛋白質には一般に同一の機能を有 する変異体の存在が予測される。また、蛋白質のアミノ酸配列を適宜改変することに よって、同一の機能を有する変異体を得ることができる。従って、配列番号 1一 124の いずれかに示すアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは 付加されたアミノ酸配列を有し、かつ c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質も本発明の 蛋白質に包含される。ここで数個とは、好ましくは 5個以内、さらに好ましくは 2個以内 である。また、配列番号 1一 124のいずれかに示すアミノ酸配列に対して、通常 15% 以上、好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上の相同性を有し、かつ c-Jun 蛋白質と相互作用する蛋白質も包含される。
[0132] 蛋白質のアミノ酸配列の改変は、部位特異的変異誘発法などの周知の手段により 蛋白質をコードする DNAの塩基配列を改変し、塩基配列が改変された DNAを発現さ せることによって行うことができる。このような改変された蛋白質のうち、 c-Jun蛋白質と 相互作用するものが本発明の蛋白質に含まれる。 c-Jun蛋白質との相互作用は、公 知の相互作用の測定法により測定することでき、例として、後記実施例に記載された ような複合体の形成を検出する方法が挙げられる。
[0133] 本発明の蛋白質は、他の蛋白質と融合させることにより、融合蛋白質とされてもよい
[0134] 本発明の核酸は、本発明の蛋白質をコードする核酸である。核酸は通常には RNA 又は DNAである。本発明の核酸としては、配列番号 126— 254のいずれかの塩基配 列を有する核酸が挙げられる。この核酸は後述の実施例において、塩基配列が決定 された核酸である。遺伝子には、同一の産物をコードするが塩基配列の異なる遺伝 子や、同一の機能を有する変異体をコードする遺伝子の存在が予測される。また、塩 基配列の改変により、同一の産物や同一の機能を有する変異体をコードする遺伝子 を得ることができる。従って、本発明の核酸には、配列番号 126— 254のいずれかの 塩基配列に類似する塩基配列を有し、かつ c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコ ードする核酸も包含される。類似の塩基配列を有する核酸としては、配列番号 126— 254のいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸とストリンジ ントな条 件でハイブリダィズする核酸、又は、配列番号 126— 254のいずれかの塩基配列と 相同性が通常 16%以上、好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上の塩基配 列を有する核酸が挙げられる。
[0135] ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば 42°Cで DIG Easy Hyb (ロシェ'ダイァグノ スティックス株式会社）におけるハイブリダィゼーシヨン、次いで 60°Cで 15分 0.1 X SSC/0.1%SDS中での洗浄である。塩基配列の相同性は、比較する配列間でァライン メントを行い一致した塩基数を算出し、比較対象となる配列の鎖長に対する一致した 塩基数の割合である。また、アミノ酸配列の相同性は、比較する配列間でァラインメ ントを行い一致したアミノ酸数を算出し、比較対象となる配列の鎖長に対する一致し たアミノ酸数の割合である。
[0136] DNAが c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードすることは、その DNAから蛋白 質を発現させ、発現した蛋白質が c-Jun蛋白質と相互作用することを上述の方法によ り確認することにより容易に確認できる。
[0137] 本発明の核酸は、明らかにされた塩基配列に基づき常法により得ることができる。 例えば、化学合成法により合成してもよいし、適宜設定されたプライマーを用いて、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質を発現している細胞や組織から調製された mRNAから RT- PCR法により得ても良い。
[0138] < 2>本発明の蛋白質等の用途
本発明による蛋白質や遺伝子又は核酸配列による新たな機能 (ここでは c-Junと結 合できる機能)を利用して、 c-Junの持つ機能としての転写や遺伝子複製などをブロッ クする阻害剤として応用することができる。その根拠は、本発明の蛋白質の遺伝子は 、スクリーニングを複数回繰り返すことにより競争過程を経て検出されてきて 、ること に起因する。この方法で検出された遺伝子群は、ある個数分布を描き、競争力が強 い遺伝子ほど多く検出されることになる。このことは、この方法で検出されるクローン 数が多 、ほど競争力が強く、ブロック剤 ·阻害剤として有効に働くことを示して!/、る。
[0139] 本発明の蛋白質とそれをコードする遺伝子および配列の用途として、 in vitroでの 応用としては、本発明による蛋白質や遺伝子又は核酸配列による新たな機能を利用 して、たとえば、無細胞蛋白質合成系を利用した進化分子工学、又は、ゲノム機能解 祈へ応用できる。この場合に、対応付け分子の共翻訳スクリーニング/セレクションを 用いた解析は非常に有効である。なぜなら、共翻訳スクリーニング/セレクション法に よって、ベイト蛋白質と直接又は間接的に相互作用のある蛋白質を網羅的に検出す ることが可能となった力もである。さらに、 IVV間又は IWと C末端ラベルイ匕蛋白質との 間の相互作用の解析などにお!、て、「標的分子 (ベイト蛋白質)」としても利用出来る。 さらに、一般的な相互作用の解析の方法としては、例えば、マイクロアレイ、蛍光相関 分光法 (FCS/FCCS)、蛍光イメージングアナライズ法、蛍光共鳴エネルギー移動法、 エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン共鳴法、又 は、固相酵素免疫検定法などが挙げられる。無細胞蛋白質合成系の具体例としては 、小麦胚芽抽出液、ゥサギ網状赤血球抽出液、大腸菌 S30抽出液等が挙げられる。 これらの無細胞蛋白質合成系の中に、本発明による蛋白質や遺伝子又は核酸配列 の翻訳テンプレートを加え、 C末端ラベルイ匕の場合は、同時に 1一 100 Mの修飾剤 を加え、 25— 37°Cで 1一数時間保温することによって C末端修飾蛋白質が合成される 。対応付けの場合は、本発明による蛋白質や遺伝子又は核酸配列の対応付け分子 のテンプレートを加えて、 25— 37°Cで 1一数時間保温するだけで対応付け分子が合 成される。
[0140] また、 in vivoでの応用としては、本発明による蛋白質や遺伝子又は核酸配列による 新たな機能を利用して、たとえば、無細胞蛋白質合成系で合成された、分離用修飾 及び検出用標識された蛋白質 (両修飾蛋白質)は、そのまま次の精製プロセス又は 検出プロセス、あるいは直接細胞への導入に供することができる。細胞発現系の具 体例としては、大腸菌、枯草菌、好熱菌、酵母等の細菌から、昆虫細胞、哺乳類等の 培養細胞、さらに線虫、ショウジヨウバエ、ゼブラフィッシュ、マウス等に至るまでいか なる細胞でもよい。これらの細胞の中に、上記 C末端ラベル化又は対応付けされた両 修飾蛋白質を直接導入し、目的の蛋白質をブロックすることができる。あるいは、上記 本発明の蛋白質の遺伝子や核酸配列を導入し、アンチセンス配列や RNAi配列とし て遺伝子や核酸配列をそのまま利用して目的の核酸配列の発現をブロックすることも 可能であるし、細胞内で発現させて蛋白質や対応付け分子として相互作用のある蛋 白質をブロックすることにも利用できる。蛋白質として利用する場合は、 C末端ラベル 化法では、同時に 1一 100 Mの C末端ラベル化修飾剤を電気穿孔法、マイクロイン ジェクシヨン法等により細胞の中に導入し、細胞の至適生育温度で数時間保温する ことによって修飾蛋白質が合成される。対応付けの場合は、上記本発明の蛋白質の 遺伝子や核酸配列をもつ対応付け分子のテンプレートを導入し、細胞の至適生育温 度で数時間保温することによって対応付け分子が合成される。合成された両修飾蛋 白質は、細胞を破砕することによって回収し次の精製プロセス又は検出プロセスに供 することができる。また、そのまま細胞の中で検出プロセスに供することも可能である。
[0141] 以下、本発明の蛋白質等の用途についてさらに説明する。
[0142] 本発明検出方法は、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出において、ベイトとして 本発明の蛋白質を用いるものである。
[0143] 好ましくは、ベイト及びプレイに特定の様式で分離用修飾及び検出用標識を行い、 そして、無細胞翻訳系においてべイトの存在下で、プレイを翻訳により生成させること によりべイトとプレイとを接触させることを主な特徴とするものである。本明細書にぉ ヽ ては、無細胞翻訳系においてべイトの存在下で、プレイを翻訳により生成させること によりべイトとプレイとを接触させることを「無細胞共翻訳」ともいう。
[0144] 本明細書において、ベイト及びプレイの用語は、物質間の相互作用の解析の技術 分野で通常に用いられる意味を有する。すなわち、既知の物質である蛋白質や核酸 などをべイト (おとり)と呼び、それと相互作用する物質である蛋白質や核酸などをプレ ィ (獲物)と呼ぶ。本発明では、プレイは蛋白質であることが好ましい。
[0145] ここで、ベイトとしては、本発明の蛋白質、又は、本発明の蛋白質を含む限り、あら ゆる蛋白質 (ペプチドを含む）、核酸、抗体、ホルモンなどのリガンド、金属などの任 意のものから構成される複合体が挙げられ、天然のものでも人工のものの 、ずれでも 構わない。ベイトとしての分子量の制限などは特にない。たとえば蛋白質であれば、 機能ドメイン又は機能ドメインを含む完全長蛋白質などが挙げられる。プレイライブラ リーを用いる場合は、完全長蛋白質とすることでより網羅的検出が可能となる。
[0146] また、プレイとしては、好ましくは、蛋白質が用いられる。プレイとしての分子量の制 限などは特にない。
[0147] 本発明検出方法は、好ましくは、上述のように、ベイトとプレイとの間の相互作用の 検出において、ベイト及びプレイに特定の様式で検出用標識及び分離用修飾を行 い、そして、無細胞共翻訳を行うことを主な特徴とするものである。従って、本発明検 出方法の好まし 、構成は、ベイト及びプレイに特定の様式で検出用標識及び分離用 修飾を行い、そして、無細胞共翻訳を行うことを除いて、ベイトとプレイとを接触させ、 接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用 の通常の検出方法と同様でよい。
[0148] ベイト及びプレイの分離用修飾及び検出用標識は、複合体の検出に適合したもの が適宜選択されるが、無細胞共翻訳において、ベイトとプレイとが共に検出用標識で 標識されたり、分離用修飾を受けたりしないように行われる必要がある。そのため、プ レイは、検出用標識として使用できる蛋白質との融合蛋白質とされる力 又は、対応 付け分子とされ、それに応じて、ベイトは分離用修飾を有するものとされる。
[0149] プレイが融合蛋白質とされる場合には、ベイトは分離用修飾を有するようにする。ベ イトが蛋白質である場合には、ベイトは、分離用修飾として使用できる蛋白質との融 合蛋白質として、無細胞翻訳系において、ベイトを含む融合蛋白質をコードする mR NAの翻訳が行われることにより無細胞翻訳系に存在させることが好ま 、。
[0150] ベイトが蛋白質の場合の分離用修飾の例としては、蛋白質として、 GST蛋白質や TAP法などに用いられて 、る CBP (カルモジュリンビーズとの親和性により分離可能） やプロテイン A(IgG-プロテイン A親和性により分離可能)、親和性タグとして、各種の 抗体タグなどとの融合蛋白質とすることが挙げられる。ベイト自体が分離用修飾として 使用できる性質を有する場合には、ベイトをそのまま、分離用修飾を有するベイトとし て使用できる。プレイの検出用修飾としては、 GFP(green fluorescent protein)などの 蛍光蛋白質との融合蛋白質とすることが挙げられる。
[0151] 上記の融合蛋白質をコードする mRNAの調製及びこの mRNAの無細胞翻訳系で の翻訳は通常の方法に従って行うことができる。 mRNAは、無細胞転写翻訳系にお いて、 DNAの転写により生成するものであってもよい。
[0152] プレイが対応付け分子とされる場合には、ベイトには任意の分離用修飾を施すこと ができる。ベイトが蛋白質である場合には、上述の分離用修飾の例が挙げられる他、 ベイトが核酸やドラッグなどの場合の分離用修飾の例としては、ストレプトアビジンや アビジンと相互作用のあるピオチンなどを利用することが挙げられる。ベイト自体が分 離用修飾として使用できる性質を有する場合には、ベイトをそのまま、分離用修飾を 有するベイトとして使用できる。
[0153] 対応付け分子とは、表現型と遺伝子型と対応付ける分子を意味する。対応付け分 子は、通常には、遺伝子型を反映する塩基配列を有する核酸を含む遺伝子型分子 と、表現形の発現に関与する蛋白質を含む表現型分子とが結合してなる分子である 。この蛋白質としてプレイを用いることによりプレイを対応付け分子とすることができる 。このような対応付け分子は、無細胞翻訳系において、プレイをコードする mRNAの 翻訳を、翻訳されたプレイが該 mRNAと会合するように行うこと、又は、無細胞転写 翻訳系において、プレイをコードする DNAの転写及び翻訳を、翻訳されたプレイが 該 DNAと会合するように行うことにより形成することができる。従って、この製造の際 に、ベイトを存在させることにより、無細胞共翻訳を行うことができる。すなわち、下記（ 1)又は（2)により無細胞共翻訳を行うことができる。
[0154] (1)無細胞翻訳系において、前記べイトの存在下で、前記プレイをコードする mRN Aの翻訳を、翻訳されたプレイが該 mRNAと会合するように行うことにより、無細胞翻 訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させる。
[0155] (2)無細胞転写翻訳系にお!/、て、前記べイトの存在下で、前記プレイをコードする
DNAの転写及び翻訳を、翻訳されたプレイが該 DNAと会合するように行うことにより
、無細胞転写翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させる。
[0156] 以下、上記（1)及び（2)の態様について説明する。
[0157] (1)の態様では、 mRNA力 その 3'末端に結合したスぺーサー領域と、スぺーサー 領域に結合した、ペプチド転移反応によってペプチドと結合し得る基を含むペプチド ァクセプター領域とを有することにより、翻訳されたプレイが該 mRNAと会合すること が好ましい。このような対応付け分子を用いる相互作用の検出方法としては、 in vitro ウィルス方法が挙げられる (図 6)。
[0158] mRNAは、好ましくは、転写プロモーター及び翻訳ェンハンサーを含む 5'非翻訳 領域と、 5'非翻訳領域の 3'側に結合した、プレイをコードする ORF領域と、 ORF領域 の 3'側に結合した、ポリ A配列を含む 3'末端領域を含む核酸である。好ましくは、ポリ A配列の 5'側に、 SNNS (Sは G又は C)配列を含む発現増幅配列（例えば制限酵素 Xholが認識する配列）が更に含まれる。 5'末端に Cap構造があってもなくても良い。
[0159] ポリ A配列は、少なくとも 2残基以上の dA及び/又は rAの混合又は単一のポリ A連続 鎖であり、好ましくは、 3残基以上、より好ましくは 6以上、さらに好ましくは 8残基以上 のポリ A連続鎖である。
[0160] 翻訳効率に影響する要素としては、転写プロモーターと翻訳ェンハンサ一からなる 5'UTR、及び、ポリ A配列を含む 3'末端領域の組み合わせがある。 3'末端領域のポリ A配列の効果は通常には 10残基以下で発揮される。 5'UTRの転写プロモーターは T7/T3又は SP6などが利用でき、特に制限はない。好ましくは SP6であり、特に、翻訳 のェンノ、ンサ一配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用する場 合は SP6を用いることが特に好ま 、。翻訳ェンノヽンサ一は好ましくはオメガ配列の 一部であり、オメガ配列の一部としては、 TMVのオメガ配列の一部 (029; Gallie D.R., Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., vol. 20, 4631—4638、および、 WO 02/48347 の図 3参照)を含んだものが好ましい。 [0161] また、翻訳効率に関し、 3'末端領域においては、 Xhol配列とポリ A配列の組み合わ せが好ましい。さらに、 ORF領域の下流部分、すなわち Xhol配列の上流に親和性タ グがついたものとポリ A配列の組み合わせが好ましい。親和性タグ配列としては、抗 原抗体反応など、蛋白質を検出できる 、かなる手段を用いるための配列であればよ ぐ制限はない。好ましくは、抗原抗体反応によるァフィユティー分離分析用タグであ る Flag-tag配列又は His-tag配列である。ポリ A配列効果としては、 Flag-tag等の親和 性タグに Xhol配列がついたものとそこへさらにポリ A配列がついたものの翻訳効率が 上昇する。ここで、 His-tagについては、 Xhol配列のない構成でも十分な翻訳効率を 示し、有効である。
[0162] 上記の翻訳効率に関し効果のある構成は、対応付け効率にも有効である。
[0163] 5'UTRを SP6+029とし、 3'末端領域を、たとえば、 Flag+Xhol+A (n=8)又は His+A
(n=8)とすることで、各長さは、 5'UTRで約 49bp、 3'末端領域で約 38bp又は約 26bpであ り、 PCRのプライマーにアダプター領域として組み込める長さである。このため、あら ゆるベクターやプラスミドや cDNAライブラリーから PCRによって、 5'UTRと 3'末端領域 をもったコード領域を簡単に作成できる。コード領域において、翻訳は ORF領域を超 えてされてもよい。すなわち、 ORF領域の末端に終止コドンがなくてもよい。
[0164] ペプチドァクセプター領域は、ペプチドの C末端に結合できるものであれば特に限 定されないが、例えば、ピューロマイシン、 3し N-アミノアシルピューロマイシンアミノヌ クレオシド (3'— N— Aminoacylpuromycin aminonucleoside, PANS—アミノ酸)、例えばアミ ノ酸部がグリシンの PANS- Gly、 ノ リンの PANS- Val、ァラニンの PANS- Ala、その他、 全アミノ酸に対応する PANS-全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として 3'-ァミノ アデノシンのァミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミ ド結合でつながった 3'-N-アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（
3'- Aminoacyladenosine aminonucleoside, AANS-アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリ シンの AANS-Gly、 ノ リンの AANS-Val、ァラニンの AANS-Ala、その他、全アミノ酸に 対応する AANS-全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシド又はヌクレオシドとァミノ 酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシド又はヌクレオシド に類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸又はアミノ酸に類似した化学構造 骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することがで きる。
[0165] ペプチドァクセプター領域は、好ましくは、ピューロマイシンもしくはその誘導体、又 は、ピューロマイシンもしくはその誘導体と 1残基もしくは 2残基のデォキシリボヌクレ ォチドもしくはリボヌクレオチドからなることが好ましい。ここで、誘導体とは蛋白質翻 訳系にお 、てペプチドの C末端に結合できる誘導体を意味する。ピューロマイシン誘 導体は、ピューロマイシン構造を完全に有しているものに限られず、ピューロマイシン 構造の一部が欠落して ヽるものも包含する。ピューロマイシン誘導体の具体例として は、 PANS-アミノ酸、 AANS-アミノ酸などが挙げられる。
[0166] ペプチドァクセプター領域は、ピューロマイシンのみの構成でも力まわないが、 5'側 に 1残基以上の DNA及び/又は RNAからなる塩基配列を持つことが好まし 、。配列と しては、 dC-ピューロマイシン， rC-ピューロマイシンなど、より好ましくは dCdC-ピュー ロマイシン， rCrC-ピューロマイシン， rCdC-ピューロマイシン， dCrC-ピューロマイシン などの配列で、アミノアシル -tRNAの 3'末端を模倣した CCA配列 (Philipps, G.R. (1969) Nature 223, 374- 377)が適当である。塩基の種類としては、 C〉(U又は T)〉G〉A の順で好ましい。
[0167] スぺーサー領域は、好ましくは、ポリエチレングリコールを主成分とした PEG領域で ある。スぺーサー領域は、通常には、 PEG領域の他に、核酸の 3'末端に結合できるド ナー領域を含む。
[0168] 核酸の 3'末端に結合できるドナー領域は、通常、 1以上のヌクレオチドからなる。ヌ クレオチドの数は、通常には 1一 15、好ましくは 1一 2である。ヌクレオチドはリボヌタレ ォチドでもデォキシリボヌクレオチドでもよ!/ヽ。ドナー領域は修飾物質を有して!/ヽても よい。
[0169] ドナー領域の 5'末端の配列は、プレイをコードするコード領域とのライゲーシヨン効 率を左右する。コード領域とスぺーサー領域をライゲーシヨンさせるためには、少なく とも 1残基以上を含むことが必要であり、ポリ A配列をもつァクセプターに対しては、少 なくとも 1残基の dC (デォキシシチジル酸)又は 2残基の dCdC (ジデォキシシチジル酸) が好ましい。塩基の種類としては、 C〉(U又は T)〉G〉Aの順で好ましい。 [0170] PEG領域はポリエチレングリコールを主成分とするものである。ここで、主成分とする とは、 PEG領域に含まれるヌクレオチドの数の合計が 20 bp以下、又は、ポリエチレン グリコールの平均分子量力 S400以上であることを意味する。好ましくは、ヌクレオチドの 合計の数が 10 bp以下、又は、ポリエチレングリコールの平均分子量が 1000以上であ ることを意味する。
[0171] PEG領域のポリエチレングリコールの平均分子量は、通常には、 400— 30,000、好ま しくは 1,000— 10,000、より好ましくは 2,000— 8,000である。ここで、ポリエチレングリコ ールの分子量が約 400より低 、と、このスぺーサー領域を含む遺伝子型分子を対応 付け翻訳したときに、対応付け翻訳の後処理が必要となることがあるが (Liu, R., Barrick, E., Szostak, J.W., Roberts, R.W. (2000) Methods in Enzymology, vol. 318, 268-293)、分子量 1000以上、より好ましくは 2000以上の PEGを用いると、対応付け翻 訳のみで高効率の対応付けができるため、翻訳の後処理が必要なくなる。また、ポリ エチレングリコールの分子量が増えると、遺伝子型分子の安定性が増す傾向があり、 特に分子量 1000以上で良好であり、分子量 400以下では ぺーサ一と性質がそ れほどかわらず不安定となることがある。
[0172] ポリエチレングリコールを主成分とするスぺーサー領域を有することによって、対応 付け分子がゥサギ網状赤血球のみならず小麦胚芽の無細胞翻訳系でも形成可能と なり、両翻訳系での遺伝子型分子の安定性が飛躍的に向上し、翻訳後の処理を施 すことが不要となる。
[0173] (2)の態様では、 DNAが、蛋白質とストレプトアビジン又はアビジンとの融合蛋白 質をコードし、 DNAがピオチンにより標識され、 DNA—分子がェマルジヨンの一区 画に含まれる状態で転写及び翻訳が行われることにより、翻訳されたプレイが該 DN Aと会合することが好ましい。このような対応付け分子を用いる相互作用の検出方法 としては、 STABLE法が挙げられる。
[0174] ェマルジヨンは、通常には、 2種の界面活性剤及びミネラルオイルと、無細胞転写 翻訳系の反応液を混合して形成される W/0型のェマルジヨンである。 W/0型のエマ ルジョンを形成するには、通常には、界面活性剤の HLB(hydrophile-lipophile balance)値力 ¾.5— 6である必要がある。 2種の界面活性剤を混合した場合の HLB値 は、個々の界面活性剤の HLB値力も簡単な計算式で求められる。例えば、 Span 85(HLB=1.8及び Tween 80(HLB=15.0)を、それぞれ 40.2 μ 1及び 9.8 μ 1の割合で混合 することにより HLB=4.4となる。界面活性剤とミネラルオイルの割合は、通常 1 : 18 (容 量比）である。また、反応液の割合はェマルジヨン全体に対して 1一 50% (容量比）で あり、通常は 5%である。界面活性剤とミネラルオイルの混合物に、撹拌しながら、低 温で、反応液をいくつかに分けて添加し、混合することによりェマルジヨンを形成する ことができる。転写及び翻訳の反応は、ェマルジヨンの温度を上げることにより、開始 させることがでさる。
[0175] プレイをコードする DNAの調製及びこの DNAの無細胞転写翻訳系での転写及び 翻訳は通常の方法に従って行うことができる。
[0176] 上述のように、ベイト及びプレイに特定の様式で検出用標識及び分離用修飾を行う ことにより、無細胞共翻訳により形成された複合体を特異的に検出することができる。
[0177] ベイトとプレイの無細胞共翻訳にぉ 、て、無細胞共翻訳を行う無細胞翻訳系（無細 胞転写翻訳系を含む）については、大腸菌 E. coli、ゥサギ網状赤血球、小麦胚芽の 系などいずれでも構わない。 in vitroウィルス法では、対応付け分子の形成は、大腸 菌 E. coliではかなり不安定であるが、ゥサギ網状赤血球の系 (Nemoto N,
Miyamoto-Sato E, Yanagawa H. (1997) FEBS Lett. 414, 405; Roberts R.W, Szostak J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297)では安定であることが確認されて おり、さらに小麦胚芽の系 (特開 2002-176987)ではより安定であることが確認されてい る。 STABLE法では、大腸菌 E. coli,ゥサギ網状赤血球、小麦胚芽の系などいずれで も構わない。
[0178] 無細胞共翻訳における翻訳又は転写及び翻訳の条件は、用いる無細胞翻訳系に 応じて適宜選択される。
[0179] 無細胞翻訳系に添加するべイトとプレイのテンプレートは、無細胞翻訳系が転写も 生じる無細胞転写翻訳系であれば、 RNA又は DNAのどちらでも構わな 、。
[0180] 以下、ベイトとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートの例について説明する。
[0181] 本態様の共翻訳スクリーニングにおけるベイトとして、図 7に示すように、蛋白質に 翻訳される情報を持つコード部と PEGスぺーサ一部力もなることを特徴とする翻訳テ ンプレートを利用する。コード部は、蛋白質に翻訳される情報であり、どのような配列 でも良いが、好ましくは、コード部の 3'末端領域にァクセプター（A配列)を持つ、ある いは、コード部の 3'末端領域にァクセプター (A配列)を持ち、かつ A配列の 5'上流に 翻訳増幅配列 (X配列）を持つことを特徴とする。コード部の A配列として、短いポリ A 配列を含む。短いポリ A配列とは、通常には 2— 10塩基の Aからなる配列である。 X配 列として、（C又は G)NN(C又は G)配列を有する配列、たとえば、 Xhol配列を有すること を特徴とする。 PEGスぺーサ一部は、ポリエチレングリコールを主成分とした PEG領域 、コード部と連結するためのドナー領域、および 3'末端に CCA領域を持つ。 PEGスぺ ーサ一部は、ドナー領域のみ、 CCA領域のみでも力まわないが、好ましくは、ポリエ チレングリコールを主成分とした PEG領域を含む構成をとる。 CCA領域は、該翻訳テ ンプレートによって翻訳された蛋白質と、ペプチド転移反応によって結合する機能を 有しないことを特徴とする。 PEG領域のポリエチレングリコールの分子量は、 500以上 であることを特徴とする。また、ドナー領域及び/又は CCA領域において、少なくとも 1 つの機能付与ユニット (F)を含むことを特徴とする。機能付与ユニット (F1及び/又は F 2)が、該翻訳テンプレート及び/又は該翻訳テンプレートから翻訳された蛋白質を固 定化又は蛍光ラベル化することを特徴とする。固定ィ匕物質としてピオチンなどが考え られ、蛍光性物質として、フルォレセイン， Cy5,又はローダミングリーン (RhG)などが 考えられる。これらのコード部や翻訳テンプレート、およびそのライブラリー、さらに、リ ポソーム上で翻訳された蛋白質やそのライブラリーに関するものである。
[0182] ベイトの翻訳テンプレート (図 7の A)は、コード分子 (図 7の B)に由来するコード部と PEGスぺーサ一分子 (図 7の C)に由来する PEGスぺーサ一部力もなる。本態様では、 基本的にはコード部の配列によらず、コード部に PEGスぺーサ一部を連結 (ライゲー シヨン)することでその安定性が向上して翻訳効率を向上出来る。し力しながら、さらに コード部の構成や PEGスぺーサ一部の種類によって、その翻訳効率をより向上させる ことが可能である。以下にその詳細を記載する。
[0183] 本態様のコード部 (図 7の B)は、 5'末端領域、 ORF領域、 3'末端領域力もなり、 5'末 端に Cap構造があってもなくても良い。また、コード部の配列には特に制限はなぐあ らゆるベクターやプラスミドに組み込まれたものとしての利用が考えられる。また、コー ド部の 3'末端領域は、 A配列としてポリ Ax8配列、又は X配列として Xhol配列や 4塩基 以上で SNNS(Sは G又は C)の配列を持つもの、および A配列と X配列の組み合わせと しての XA配列がある。 A配列、 X配列、又は XA配列の上流に親和性タグ配列として Flag-tag配列、力 なる構成が考えられる。ここで、親和性タグ配列としては HA-tagや IgGのプロテイン A(zドメイン)などの抗原抗体反応を利用したものや His-tagなど、蛋白 質を検出又は精製できるいかなる手段を用いるための配列でも力まわない。ここで、 翻訳効率に影響する範囲としては、 XA配列の組み合わせが重要であり、 X配列のな かで、最初の 4塩基が重要であり、 SNNSの配列を持つものが好ましい。また、 5'末端 領域は、転写プロモーターと翻訳ェンハンサーからなり、転写プロモーターは T7/T3 又は SP6などが利用でき、特に制限はないが、小麦の無細胞翻訳系では、翻訳のェ ンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用することが 好ましぐプロモーターとしては、 SP6を用いることが好ましい。翻訳ェンハンサ一のォ メガ配列の一部 (029)は、 TMVのオメガ配列の一部を含んだものである (Gallie D.R., Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., vol. 20, 4631-4638、および、 WO 02/48347の 図 3参照)。コード部の ORF領域については、 DNA及び/又は RNAからなるいかなる配 列でもよい。遺伝子配列、ェキソン配列、イントロン配列、ランダム配列、又は、いかな る自然界の配列、人為的配列が可能であり、配列の制限はない。
本態様の PEGスぺーサ一分子 (図 7の C)は、 CCA領域、 PEG領域、ドナー領域から なる。最低限必要な構成は、ドナー領域である。翻訳効率に影響する範囲としては、 ドナー領域のみならず PEG領域を持つものが好ましぐさらにアミノ酸との結合能力の な 、ピューロマイシンを持つことが好まし 、。 PEG領域のポリエチレングリコールの分 子量の範囲は、 400— 30,000で、好ましくは 1,000— 10,000、より好ましくは 2, 000— 6,000である。また、 CCA領域にはピューロマイシンを含む構成と含まない構成が可 能であり、ピューロマイシンについては、ピューロマイシン（Puromycin)、 3し N-アミノア ンノレピュ1 ~~ロマインン—/ ^ノヌクレオント (3— N— Aminoacylpuromycin aminonucleoside, PANS-アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンの PANS- Gly、 ノ リンの PANS- Val、ァラ ニンの PANS-Ala、その他、全アミノ酸に対応する PANS-全アミノ酸が利用できる。ま た、化学結合として 3'-アミノアデノシンのァミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水 縮合した結果形成されたアミド結合でつながった 3'-N-アミノアシルアデノシンアミノヌ クレオシド (3'— Aminoacyladenosine aminonucleoside, AANS—アミノ酸)、例えばァミノ 酸部がグリシンの AANS-Gly、ノ《リンの AANS_Val、ァラニンの AANS_Ala、その他、全 アミノ酸に対応する AANS-全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシド又はヌクレオシ ドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシド又はヌク レオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸又はアミノ酸に類似した 化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用す ることができる。本翻訳テンプレートでは、以上のピューロマイシン誘導体のアミノ基 がアミノ酸と結合する能力を欠いたあらゆる物質、およびピューロマイシンを欠いた CCA領域も考えられるが、リボソーム上で蛋白質と結合不能なピューロマイシンを含 むことで、より翻訳効率を高められる。その理由は定かではないが、蛋白質と結合不 能なピューロマイシンがリボソームを刺激することでターンオーバーが促進される可 能性がある。 CCA領域 (CCA)の 5'側に 1残基以上の DNA及び/又は RNAからなる塩 基配列を持つことが好ましい。塩基の種類としては、 C〉(U又は T)〉G〉Aの順で好まし い。配列としては、 dC-ピューロマイシン， rC-ピューロマイシンなど、より好ましくは dCdC-ピューロマイシン， rCrC-ピューロマイシン， rCdC-ピューロマイシン， dCrC-ピ ユーロマイシンなどの配列で、アミノアシル -tRNAの 3'末端を模倣した CCA配列 (Philipps G.R. (1969) Nature 223, 374-377)が適当である。本発明の一態様では、こ れらのピューロマイシンが何らかの方法でアミノ酸と結合不可能となっている。
本態様の PEGスぺーサ一部は修飾物質 (F1及び/又は F2)を有する構成が可能で ある。このことによって、翻訳テンプレートを回収、精製による再利用、あるいは固定 化などのためのタグとして利用することが出来る。少なくとも 1残基の DNA及び/又は RNAの塩基に修飾物質として、蛍光物質、ピオチン、又は His-tagなど各種分離タグ などを導入したものが可能である。また、コード部の 5'末端領域を SP6+029とし、 3'末 端領域を、たとえば、 Flag+Xhol+A (n=8)とすることで、各長さは、 5'末端領域で約 60bp、 3'末端領域で約 40bpであり、 PCRのプライマーにアダプター領域として設計可 能な長さである。これによつて新たな効果が生み出された。すなわち、あらゆるベクタ 一やプラスミドや cDNAライブラリ一力も PCRによって、本態様の 5'末端領域と 3'末端 領域をもったコード部を簡単に作成可能となり、このコード部に、 3'UTRの代わりとし て PEGスぺーサ一部をライゲーシヨンすることで、翻訳効率の高い翻訳テンプレート を得られる。
[0186] 本態様の PEGスぺーサ一分子とコード分子のライゲーシヨンは、その方法について は、一般的な DNAリガーゼを用いるものや光反応による連結など何でもよぐ特に限 定されるものではない。 RNAリガーゼを用いるライゲーシヨンでは、コード部でライゲ ーシヨン効率に影響を与える範囲としては 3'末端領域の A配列が重要であり、少なくと も 2残基以上の dA及び/又は rAの混合又は単一のポリ A連続鎖であり、好ましくは、 3 残基以上、より好ましくは 6から 8残基以上のポリ A連続鎖である。 PEGスぺーサ一部 のドナー領域の 5'末端の DNA及び/又は RNA配列は、ライゲーシヨン効率を左右する 。コード部と PEGスぺーサ一部を、 RNAリガーゼでライゲーシヨンするためには、少な くとも 1残基以上を含むことが必要であり、ポリ A配列をもつァクセプターに対しては、 少なくとも 1残基の dC (デォキシシチジル酸)又は 2残基の dCdC (ジデォキシシチジル 酸)が好ましい。塩基の種類としては、 C〉(U又は T)〉G〉Aの順で好ましい。さら〖こ、ライ ゲーシヨン反応時に、 PEG領域と同じ分子量のポリエチレングリコールを添加すること が好ましい。
[0187] 次に、プレイとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートの例について説明する。
[0188] 本態様の共翻訳スクリーニングにおけるプレイとして、図 8に示すように、翻訳テン プレートによって C末端修飾された蛋白質 (=対応付け分子)を利用する。翻訳テンプ レートは、蛋白質に翻訳される情報を持つコード部と PEGスぺーサ一部からなる。コ ード部の 3'末端に A配列を有し、 A配列は、短いポリ A配列を含む。 PEGスぺーサー 部は、ポリエチレングリコールを主成分とした PEG領域において、ポリエチレングリコ ールの分子量力 00以上であることを特徴とする、また、ドナー領域及び/又は CCA 領域において、少なくとも 1つの修飾物質 (F1及び/又は F2)を含むことを特徴とする。 また、 CCA領域は、該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、ペプチド転移 反応によって結合する機能を有することを特徴とし、代表的には CCA領域にピュー口 マイシンを有する。また、修飾物質 (F1及び/又は F2)力 該翻訳テンプレート及び/又 は該翻訳テンプレートから翻訳された蛋白質を固定ィ匕又は蛍光ラベルイ匕することを 特徴とする。固定ィ匕物質としてピオチンなどが考えられ、蛍光性物質として、フルォレ セイン， Cy5,又はローダミングリーン (RhG)などが考えられる。これら、コード部および 翻訳テンプレート、およびそのライブラリ一力 リボソーム上で翻訳されることにより合 成される蛋白質 (=対応付け分子)および蛋白質 (=対応付け分子)のライブラリーに関 するものである。
[0189] プレイは、翻訳テンプレートを用いた翻訳によって合成された、翻訳テンプレートで C末端修飾された蛋白質 (図 8の A;対応付け分子)であり、翻訳テンプレート (図 8の B) と、 PEGによって C末端修飾された蛋白質 (図 8の C)の構成に特徴を持つ。以下詳細 に記述する。
[0190] 翻訳テンプレート (図 8の B)の PEGスぺーサ一部は、ピューロマイシンがアミノ酸と連 結できることを特徴とする以外は上記のベイトとして用いるのに好ましい翻訳テンプレ ートと同様である。また、コード部も上記のベイトとして用いるのに好ましい翻訳テンプ レートと同様であるが、特に、対応付けに適した構成としては、 3'末端領域を A配列に することが重要であり、トータル蛋白の対応付けの効率が著しく向上してフリー蛋白 質の量が激減する。ここでも、コード部の 5'末端領域を SP6+029とし、 3'末端領域を、 たとえば、 Flag+Xhol+A (n=8)とすることで、各長さは、 5'末端領域で約 60bp、 3'末端 領域で約 40bpであり、 PCRのプライマーにアダプター領域として設計できる長さであ る。これによつて、あらゆるベクターやプラスミドや cDNAライブラリーから PCRによって
、本態様の 5'末端領域と 3'末端領域をもったコード部を簡単に作成可能となり、 PEG スぺーサ一部をライゲーシヨンすることで、対応付け効率の高 、翻訳テンプレートが 得られる。
[0191] 本態様の PEGによって C末端修飾された蛋白質 (図 8の C)は、蛋白質の相互作用検 出などにおいて、コード部を利用しない場合、たとえば、 FCCS測定、蛍光リーダー、 プロテインチップなどに応用する場合は、 RNase Aなどで意図的に切断してもよい。 切断することによって、コード部の妨害による蛋白質間相互作用の検出の困難性が 解消出来る。また、単独の対応付け分子をプレートやビーズやスライドガラスに固定 することも可會である。
[0192] 無細胞共翻訳を、図 9を参照して説明する。図 9に示すように、ベイトの存在下でプ レイが in vitroで翻訳される。図 9の A及び Bに示されるように、ベイトが蛋白質であつ て、無細胞翻訳系でプレイと同時に翻訳される場合と、ベイトが、核酸やホルモンな どであって、無細胞翻訳系に添加される場合がある。図 9に示すように、プレイは融合 蛋白質又は対応付け分子とされる。
[0193] 複合体は、ベイトと一つのプレイが結合して形成されること (I)の他に、ベイトに結合 したプレイにさらに別のプレイが結合することにより形成されること（II)もある。
[0194] 本発明検出方法によれば、 in vitroで複合体の形成を行うことができるので、一貫し て in vitroで蛋白質間又は核酸-蛋白質間などの相互作用を検出できる。
[0195] ベイトが蛋白質である場合は、ベイトとしては、目的蛋白質との相互作用のための 機能ドメインのみの蛋白質、機能ドメインを含む蛋白質、又は完全長蛋白質などが挙 げられる。ここで、完全長蛋白質を用いることは、複数の機能ドメインを有することが 一般に予測されるため、さらに網羅的にプレイを検出可能となることから、好ましい。 完全長蛋白質は、単独で完全長の蛋白質でもよいし、完全長の蛋白質を再構成す る複数のベイトの集まりでもよ 、。
[0196] ベイトは、図 10に示したように、複合体であってもよぐこれを「複合べイト」と呼ぶ。
複合体にすることによって、より非特異的な吸着を減らすことができ、かつ完全長蛋 白質と同様の効果として、より網羅的にプレイを検出することが可能となる。
[0197] 以上のように、無細胞共翻訳で考えられる複合体としては、単独のベイトと単独のプ レイの複合体、複合べイトとプレイの複合体、ベイトと複数のプレイの複合体、及び、 複合べイトと複数のプレイの複合体が可能である。従って、本発明検出法により検出 可能な相互作用は、ベイトとプレイとの間の直接の相互作用だけでなぐ複合体を形 成するための間接的な相互作用をも包含するものである。
[0198] 本発明における無細胞共翻訳で最も重要なことは、蛋白質がネイティブな状態でフ オールデイングしており、翻訳されたての変性していない状態であり、相互作用する べきべイトとプレイ又はべイトとベイトやプレイとプレイが無細胞翻訳系に共存しており 、速やかに相互作用できると言うことと考えられる。このことは、別々に翻訳して翻訳 直後に混合して共存させるよりも、共に翻訳したものの方が優れた結果が得られたこ とにより支持される。すなわち、 in vitroで翻訳された蛋白質がネイティブなフォールデ イング状態で、蛋白質又は核酸などと出会うことができるため、速やかに相互作用に よる複合体の形成が可能となったためと思われる。
[0199] 従来の相互作用の検出法では、ベイトを大腸菌で大量に発現精製する必要があつ た。例えば、 TAP法などでベイトとプレイの相互作用を細胞で発現させる場合は、最 低一ヶ月の準備が必要であった。また、 GST融合蛋白によるプルダウン法を採用して V、る mRNAディスプレイ法では、ベイトを大腸菌などで大量に発現させて精製するた め、最低 2— 3週間かかり、大腸菌で発現しないものはべイトに出来ないなどの問題が あり、さらに、プレイと相互作用させるにはプレイの 50— 100倍の量のベイトを添カ卩する 必要があった。無細胞共翻訳では、無細胞翻訳系において、ほぼ同量の mRNA又は DNAテンプレートを添加すればょ 、だけとなり、ベイトを細胞で発現させる必要は全く なくなり作業時間の大幅な短縮が行える。さらに、複合べイトや完全長蛋白質によつ て、ベイトとプレイの相互作用をより強化し特異的なものとし、非特異的な結合の検出 を回避することができる。また、複合べイトによって、その第二のベイトと相互作用する より多くのプレイを網羅的に解析できる。
[0200] これまで、一貫して in vitroで相互作用による複合体形成とスクリーニングを実現す るシステムは存在しな力つた力 以上の本発明検出法によって、ベイトも含めて完全 に in vitroで翻訳とスクリーニングを行って、蛋白質間又は蛋白質-核酸間の相互作 用を非特異的な検出を回避しかつ網羅的に検出可能なシステムを構築できる。従つ て、本発明は、本発明検出方法を利用したスクリーニング方法も提供する。
[0201] 本発明スクリーニング法は、ベイトとプレイが無細胞共翻訳を通して相互作用して複 合体を形成し、複合体のスクリーニングによってべイトと相互作用するプレイを解析す ることを特長とする。従って、本発明スクリーニング方法は、本発明検出方法により、 ベイトとプレイとの間の相互作用を検出する検出工程を含む他は、ベイトとプレイとの 間の相互作用を検出する検出工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する 選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイの通常のスクリーニング方法と同様で よい。
[0202] 本発明スクリーニング方法は、選択工程で選択されたプレイを調製する調製工程を さらに含み、調製されたプレイを、検出工程で使用されたべイトの代わりに又はその ベイトと共に用いて、検出工程、選択工程及び調製工程を繰り返すことが好ましい。 この態様は、例えば、図 10に示すように、 1)プレイ及びべイトが相互作用を形成する 無細胞翻訳系における無細胞共翻訳の工程、 2)ベイトと相互作用しているプレイを 検出するスクリーニングの工程、 3)プレイを分析及び解析する工程、及び 4) 3)で分析 及び解析されたプレイを新たな次のベイトとし、 1)から繰り返す工程力も構成される。 1)及び 2)の工程が検出工程及び選択工程に相当し、 3)の工程が調製工程に相当す る。すなわち、検出工程のうちの、ベイトとプレイを接触させる工程が無細胞共翻訳の 工程に相当し、検出工程のうちの複合体の検出及び選択工程がスクリ一ユングのェ 程に相当する。
[0203] 本発明スクリーニング法では、選択工程で選択されたプレイを再度検出工程に付し てもよい。
[0204] 本発明スクリーニング法では、ベイトと複数のプレイの集団であるプレイ'ライブラリ 一との無細胞共翻訳を行い、スクリーニングの工程において、 2つ以上のプレイが検 出されてもよい。
[0205] 図 9に示すように、複合べイトとプレイが共存し、相互作用によって複合べイトとプレ ィの複合体を形成する場合がある。この無細胞共翻訳で、プレイ'ライブラリーの複数 のプレイがベイトと共存し、相互作用によってベイトと複数のプレイの複合体を形成す ることによって、スクリーニングにおいて、一挙に網羅的な相互作用する複数のプレイ を検出できる。また、ベイトが完全長蛋白質であることによって、完全長蛋白質は一般 に相互作用の機能ドメインを複数含むので、より多くのプレイを網羅的に検出可能と なる。
[0206] さらに、図 10に示すように、複合べイトと相互作用する複数のプレイの複合体を形 成することによって、複合べイトと相互作用する複数のプレイを検出でき、また、第二 のべイトがベイトとプレイの相互作用の補強剤となり、より特異的な相互作用が実現さ れることによって、網羅的検出における非特異的検出の回避が可能となる。 in vitroゥ ィルス法や STABLE法など進化分子工学的手法では、プレイは対応付け分子 (fosion) となる。プレイ'ライブラリーや複数のプレイを用いた場合の複合体の形成では、プレ ィは直接べイトと相互作用する場合としない場合がある。 [0207] 複合体のスクリーニングにより得られた複合体が対応付け分子である場合には、図 11〖こ示すよう〖こ、複合体を形成するプレイを RT-PCR又は PCRにより検出し、さらに、 PCR産物をプレイとして再スクリーニングする（プレイの再構築）、あるいは、 PCR産物 力 解析したプレイを新たな次のベイトとしてスクリーニングしてもよい。ここで、 PCR産 物から再スクリーニングする、あるいは、 PCR産物力も解析したプレイを新たな次のベ イトとしてスクリーニングする方法は、 in vitroウィルス法や STABLE法など進化分子ェ 学的手法においてのみ可能であり、プルダウン法、 TAP法など蛋白質を直接解析す る方法ではできない。
[0208] 対応付け分子を用いた場合には、スクリーニングの後、 RT-PCR又は PCRによって 蛋白質プレイの遺伝子配列を知ることが出来る。図 9及び 10に示すように、ここでの 蛋白質プレイとは、ベイトと相互作用しているプレイ又はそのプレイと相互作用してい るプレイなどであり、ベイトと相互作用して 、るすべての複数のプレイが網羅的に解 析できる。さらにプレイの再スクリーニングが必要な場合は、 RT-PCR又は PCRの産物 である DNAテンプレートを転写し、同じサイクルを繰り返す。また、 RT-PCR又は PCR とそれに続くシークェンスによってプレイが定まった場合は、その蛋白質プレイはべィ トとして使えるようになる。はじめのベイトに対して相互作用するプレイが複数個見つ かれば、複合べイトを形成することが出来るようになり、さらにより多くのプレイを検出 することが出来るようになる。
[0209] 無細胞共翻訳を用いると、プルダウン法や TAP法にぉ 、ても一貫して in vitroで蛋 白質間相互作用を検出できることになるが、 TAP法では対応付け分子を形成して ヽ ないので、プレイの解析において直接的に蛋白質を解析しなければならない。そこで 、プルダウン法や TAP法をスクリーニングの方法として in vitroウィルス法や STABLE 法に応用すれば、対応付け分子を形成しているので、 RT-PCR又は PCRによって、相 互作用するプレイの解析においてその遺伝子配列を簡単に検出することが出来る。 さらに、無細胞共翻訳を用いると、 in vitroウィルス法や STABLE法において、一貫し て in vitroで蛋白質間相互作用を検出できることになる。また、プレイの数が莫大な場 合は、サイクルを回すことで再スクリーニングによりプレイを絞り込むことが可能である 。また、解析されたプレイは、次の解析では、ベイトとして使うことができ、ベイトの数が 増えれば、ベイトの複合化が進み、さらなるプレイが検出されることにつながる。このよ うに、プレイをべイトとして次のサイクルで使用することは、対応付け分子を用いる in vitroウィルス法や STABLE法などでのみ簡単に実現できる。しかしながら、 mRNAディ スプレイなどの方法では、新しいベイトの GST融合蛋白を大腸菌で大量合成と精製 が必要であり、ベイトの用意に時間が力かり困難である。無細胞共翻訳によれば、そ の必要もなく簡単にサイクルを回すことが出来る。
[0210] 無細胞共翻訳後の複合体のスクリーニングにおいて、無細胞共翻訳によって出来 た複合体を壊すことなくプレイを網羅的にスクリーニングできることが好まし 、。このた めに、親和性タグなどによってべイトに固定ィ匕の仕組みを持たせ、ベイトと相互作用 するプレイを検出してもよい。その固定ィ匕の仕組みは、いかなるものでも構わない。た とえば、既存の TAP法などのように、 IgG-プロテイン A親和性やカルモジュリンビーズ を用いた 2段階のスクリーニングを行う方法、あるいはプルダウン法のように、ストレプ トァビジン又はアビジン-ピオチン親和性、 GST- tag、 Flag-tag, T7- tag, His- tagなど を利用した一段階又は二段階のスクリーニングを行う方法が挙げられる。
[0211] プレイ'ライブラリ一としては、 cDNAライブラリー (ランダムプライミング 'ライブラリー、 dTプライミング'ライブラリー)、ランダム 'ライブラリー、ペプチド 'ライブラリー、ホルモ ン 'ライブラリー、抗体 'ライブラリー、リガンド 'ライブラリー、医薬ィ匕合物ライブラリーな どが挙げられ、いかなるライブラリーでも構わない。たとえば、プレイ'ライブラリ一とし てランダムプライミング 'cDNAライブラリーを用いた場合、このライブラリーには完全長 プレイは望めないが、機能ドメインを含むプレイは期待できる。このようなライブラリー は、特に、複合べイトや完全長蛋白質との組み合わせによるスクリーニングに用いる と、プレイの網羅的検出に有効となる。
[0212] ランダムプライミングライブラリーの例としては、マルチクローニングサイト (MCS)の 5' 側に、転写プロモーターとして SP6の RNAポリメラーゼのプロモーター (SP6)と、翻訳ェ ンハンサ一としてタバコモザイクウィルスの TMVオメガ配列の一部 (029)とを含んだ 5' 非翻訳 (UTR)領域を持ち、かつ MCSの 3'側に親和タグ配列として、抗原抗体反応に よるァフィユティー分離分析用タグである Flag-tag配列を、 MCSに組み込まれた挿入 配列から発現した蛋白質の C末端に Flag-tagが付加されるように含む 3'末端を持つ ベクターの MCSに、ランダムプライミングで得られた cDNAが組み込まれたものが挙 げられる。
[0213] 上記の本発明検出方法は、ベイトとプレイとを接触させ複合体を形成させる工程を 含んでいる。従って、この工程に準じて、ベイトとそのべイトと相互作用するプレイとの 複合体を形成させる方法が提供される。
[0214] 本発明形成方法は、ベイトとベイトと相互作用する蛋白質であるプレイとの複合体 の形成において、ベイトとして本発明の蛋白質を用いるものであり、好ましくは、さらに 、ベイト及びプレイに特定の様式で検出用標識及び分離用修飾を行い、そして、無 細胞共翻訳を行うことを主な特徴とするものである。従って、本発明形成方法の好ま L ヽ構成は、ベイト及びプレイに特定の様式で検出用標識及び分離用修飾を行!ヽ、 そして、無細胞共翻訳を行うことを除いて、ベイトとそのべイトと相互作用するプレイと を接触させることを含む、ベイトとプレイとの複合体の通常の形成方法と同様でよい。 ベイト及びプレイの特定の様式での検出用標識及び分離用修飾ならびに無細胞共 翻訳については、本発明検出方法に関し説明した通りでよい。
[0215] 本発明形成方法では、相互作用が既知のベイトとプレイとの間の複合体だけでなく 、ベイトと、複数のプレイ力もなるプレイライブラリーとを接触させることにより、ベイトと そのべイトと相互作用するプレイとを接触させる工程を行うことによって、相互作用が 未知の要素を含む複合体を形成することもできる。
[0216] その他の本発明の蛋白質の利用方法としては以下のものが挙げられる。
[0217] 本発明の蛋白質を用いた、蛍光相関分光法、蛍光イメージングアナライズ法、蛍光 共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消法、表 面プラズモン共鳴法、又は、固相酵素免疫検定法により行われる蛋白質と物質の相 互作用解析方法。
[0218] 本発明の蛋白質を用い、該蛋白質の C末端に結合したコード部の塩基配列の増幅 により蛋白質と物質の相互作用を検出する方法。
[0219] 本発明の蛋白質を用い、無細胞共翻訳法や無細胞共翻訳スクリーニング法を用い ることを特徴とする蛋白質と物質の相互作用を検出する方法。
[0220] 本発明の蛋白質を用い、蛋白質を蛍光ラベル化及び/又は固定化することを特徴と する、蛋白質と物質の相互作用解析方法。
[0221] 本発明の蛋白質を用い、 in vitroで蛋白質又は物質の相互作用を解析する方法。
[0222] 本発明の蛋白質を用い、 in vitroで共翻訳法を利用することを特徴とする蛋白質又 は物質との相互作用を解析する方法。
[0223] 本発明の蛋白質を用い、 in vivoで蛋白質又は物質との相互作用を解析する方法。
[0224] 本発明の蛋白質をコードする核酸を用いた、上記の相互作用解析方法。
[0225] また、以下のものも挙げられる。
[0226] 蛋白質と標的分子との間の相互作用を解析する方法であって、該蛋白質を含む、 修飾剤が C末端に結合した C末端修飾蛋白質を用いることを特徴とする方法。相互 作用の解析は、蛍光相関分光法、蛍光イメージングアナライズ法、蛍光共鳴エネル ギー移動法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消法、表面ブラズモ ン共鳴法、又は、固相酵素免疫検定法により行うことができる。 C末端修飾蛋白質を 固定ィ匕してもよい。標的分子が固定されたアレイ上に C末端修飾蛋白質を添加し、該 標的分子と特異的に結合した該 C末端修飾蛋白質を検出してもよい。
[0227] 本態様の解析方法においては、通常には、上記で得られた本発明修飾蛋白質と標 的分子を、修飾物質の種類や反応系の種類などにより適宜組み合わせて接触せし め、該本発明修飾蛋白質又は該標的分子が発する信号において両分子間の相互 作用に基づいて発生される上記信号の変化を測定することにより相互作用を解析す る。相互作用の解析は、例えば、蛍光相関分光法、蛍光イメージングアナライズ法、 蛍光共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消 法、表面プラズモン共鳴法、又は、固相酵素免疫検定法により行われる。これらの方 法の詳細にっ ヽては下記で説明する。
[0228] 「標的分子」とは、本発明修飾蛋白質と相互作用する分子を意味し、具体的には蛋 白質、核酸、糖鎖、低分子化合物などが挙げられ、好ましくは、蛋白質又は DNAで ある。
[0229] 蛋白質としては、本発明修飾蛋白質と相互作用する能力を有する限り特に制限は なぐ蛋白質の全長であっても結合活性部位を含む部分ペプチドでもよい。またアミ ノ酸配列、およびその機能が既知の蛋白質でも、未知の蛋白質でもよい。これらは、 合成されたペプチド鎖、生体より精製された蛋白質、あるいは cDNAライブラリ一等 力 適当な翻訳系を用いて翻訳し、精製した蛋白質等でも標的分子として用いること ができる。合成されたペプチド鎖はこれに糖鎖が結合した糖蛋白質であってもよい。 これらのうち好ましくはアミノ酸配列が既知の精製された蛋白質力、あるいは cDNAラ イブラリー等力も適当な方法を用いて翻訳および精製された蛋白質を用いることがで きる。
[0230] 核酸としては、本発明修飾蛋白質と相互作用する能力を有する限り、特に制限はな ぐ DNA又は RNAも用いることができる。また、塩基配列又は機能が既知の核酸で も、未知の核酸でもよい。好ましくは、蛋白質に結合能力を有する核酸としての機能、 および塩基配列が既知のもの力、あるいはゲノムライブラリ一等力 制限酵素等を用 V、て切断単離してきたものを用いることができる。
[0231] 糖鎖としては、本発明修飾蛋白質と相互作用する能力を有する限り、特に制限はな ぐその糖配列又は機能が、既知の糖鎖でも未知の糖鎖でもよい。好ましくは、既に 分離解析され、糖配列又は機能が既知の糖鎖が用いられる。
[0232] 低分子化合物としては、本発明修飾蛋白質と相互作用する能力を有する限り、特 に制限はない。機能が未知のものでも、あるいは蛋白質に結合する能力が既に知ら れて 、るものでも用いることができる。
[0233] これら標的分子が本発明修飾蛋白質と行う「相互作用」とは、通常は、蛋白質と標 的分子間の共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、および静電 力による結合のうち少なくとも 1つ力も生じる分子間に働く力による作用を示すが、こ の用語は最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈して はならない。共有結合としては、配位結合、双極子結合を含有する。また静電力によ る結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有する。また、上記作用の結果生じる結 合反応、合成反応、分解反応も相互作用に含有される。
[0234] 相互作用の具体例としては、抗原と抗体間の結合および解離、蛋白質レセプターと リガンドの間の結合および解離、接着分子と相手方分子の間の結合および解離、酵 素と基質の間の結合および解離、核酸とそれに結合する蛋白質の間の結合および 解離、情報伝達系における蛋白質同士の間の結合と解離、糖蛋白質と蛋白質との間 の結合および解離、又は糖鎖と蛋白質との間の結合および解離が挙げられる。
[0235] 用いられる標的分子は、態様に応じて修飾物質により修飾して用いることができる。
修飾物質は、通常、蛍光性物質などの非放射性修飾物質から選択される。蛍光物質 としては、フリーの官能基 (例えばカルボキシル基、水酸基、アミノ基など）を持ち、蛋 白質、核酸等の上記標的物質と連結可能な種々の蛍光色素、例えばフルォレセイン 系列、ローダミン系列、 Cy3、 Cy5、ェォシン系列、 NBD系列などのいかなるものであ つてもよい。その他、色素など修飾可能な化合物であれば、その化合物の種類、大き さは問わない。
[0236] これらの修飾物質は、標的分子と本発明修飾蛋白質との間の相互作用に基づいて 発生される信号の変化の測定又は解析方法に適したものが適宜用いられる。
[0237] 上記修飾物質の標的分子への結合は、それ自体既知の適当な方法を用いて行う ことができる。具体的には、例えば、標的分子が蛋白質の場合、 WO 02/48347に記 載された C末端を修飾する方法等を用いることができる。また標的分子が核酸の場合 は、予め修飾物質を共有結合などで結合させたオリゴ DNAプライマーを用いた PCR を行う方法などによって簡便に修飾することができる。
[0238] また、本発明修飾蛋白質又は本発明に用いられる標的分子は態様に応じて、固相 に結合させる（即ち、固定化する）場合があるが、固相に結合させる方法としては、修 飾物質を介して結合させるものと、それ以外の部分により結合させるものが挙げられ る。
[0239] 修飾物質を介して結合させる場合に用いられる修飾物質は、通常には、特定のポリ ペプチドに特異的に結合する分子 (以下、「リガンド」と称することがある。）であり、固 相表面には該リガンドと結合する特定のポリペプチド (以下、「アダプター蛋白質」と 称することがある）を結合させる。アダプター蛋白質には、結合蛋白質、受容体を構 成する受容体蛋白質、抗体なども含まれる。
[0240] アダプター蛋白質 Zリガンドの組み合わせとしては、例えば、アビジンおよびストレ プトアビジン等のピオチンおよびイミノビォチン結合蛋白質 Zピオチン又はイミノビォ チン、マルトース結合蛋白質 Zマルトース、 G蛋白質 Zグァニンヌクレオチド、ポリヒス チジンペプチド Zニッケル又はコバルト等の金属イオン、グルタチオン S トランスフ エラーゼ Zダルタチオン、 DNA結合蛋白質 ZDNA、抗体 Z抗原分子 (ェピトープ） 、カルモジュリン Zカルモジュリン結合ペプチド、 ATP結合蛋白質 ZATP、又はエス トラジオール受容体蛋白質 Zエストラジオールなどの各種受容体蛋白質 Zそのリガ ンドなどが挙げられる。
[0241] これらの中で、アダプター蛋白質 Zリガンドの組み合わせとしては、アビジンおよび ストレプトアビジンなどのピオチンおよびイミノビォチン結合蛋白質 Zピオチン又はィ ミノピオチン、マルトース結合蛋白質 zマルトース、ポリヒスチジンペプチド Zニッケル 又はコバルト等の金属イオン、ダルタチオン—s—トランスフェラーゼ zダルタチオン、 抗体 Z抗原分子 (ェピトープ)、などが好ましぐ特にストレプトアビジン zピオチン又 はイミノビォチンの組み合わせが最も好ましい。これらの結合蛋白質は、それ自体既 知のものであり、該蛋白質をコードする DNAは既にクローユングされている。
[0242] アダプター蛋白質の固相表面への結合は、それ自体既知の方法を用いることがで きるが、具体的には、例えば、タンニン酸、ホルマリン、ダルタルアルデヒド、ピルビッ クアルデヒド、ビス ジァゾ化べンジゾン、トルエン- 2,4-ジイソシァネート、アミノ基、活 性エステルに変換可能なカルボキシル基、又はホスホアミダイドに変換可能な水酸 基又はアミノ基などを利用する方法を用いることができる。
[0243] 修飾物質以外の部分により固相に結合させる場合は、通常蛋白質、核酸、糖鎖、 低分子化合物を固相に結合させるのに用いられる既知の方法、具体的には例えば、 タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス ジァゾ化べ ンジゾン、トルエン- 2, 4-ジイソシァネート、アミノ基、活性エステルに変換可能なカル ボキシル基、又はホスホアミダイドに変換可能な水酸基又はアミノ基などを利用する 方法を用いることができる。
[0244] 固相は、通常、蛋白質や核酸等を固定ィ匕するのに用いられるものでよぐその材質 および形状は特に限定されない。例えば、ガラス板や-トロセルロースメンブレンや ナイロンメンブレンやポリビ-リデンフロライド膜、又はプラスチック製のマイクロプレー ト等を用いることができる。
[0245] 「測定」とは解析のために用いられる信号の変化を収集するための手段であり、い 力なる意味においても限定的に解釈してはならない。用いられる測定法としては、例 えば、蛍光相関分光法、蛍光共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子イメージ ング法、蛍光偏光解消法、蛍光イメージングアナライズ法、表面プラズモン共鳴法、 固相酵素免疫検定法など、分子間相互作用を検出できるあらゆる系が利用可能であ る。
[0246] この測定法は、標的分子が固定されたアレイ上に本発明修飾蛋白質を添加し、該 標的分子と特異的に結合した本発明修飾蛋白質を検出することを含む方法も含む。 標的分子が固定されたアレイとは、標的分子がそれらの同定が可能な配置で固定ィ匕 されている固相を意味する。該標的分子と特異的に結合した本発明修飾蛋白質の 検出の方法は、該標的分子と特異的に結合した本発明修飾蛋白質が検出される限 り、特に限定されず、通常には、本発明修飾蛋白質を添加したアレイから、標的分子 に結合しない本発明修飾蛋白質を洗浄により除去し、残った本発明修飾蛋白質を検 出する方法が挙げられる。
[0247] 以下、測定法の例について説明する。
[0248] (1)蛍光相関分光法
光ネ目関分光法 (Fluorescence し orrelation Spectroscopy (Fし S)： Eigen, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5740-5747(1994))は、共焦点レーザー顕微鏡等の 下で、粒子の流動速度、又は拡散率、容積収縮等を測定する方法であり、本発明に お!ヽては、本発明修飾蛋白質 (C末端修飾蛋白質)と標的分子間の相互作用により 元の修飾分子 1分子の並進ブラウン運動の変化を測定することにより、相互作用する 分子を測定することができる。
[0249] 具体的には試料粒子が励起光により励起されて、試料液容積の一部において蛍光 を放射し、この放射光を測定し光子割合を得る。この値は、特定の時間に観測されて いる空間容積中に存在する粒子の数と共に変化する。上述した種々のパラメタ一は 自己相関関数を使用してこの信号の変動力も算出され得る。この FCSを行う為の装 置もカールツァイス（Zeiss)社等から市販されており、本方法においてもこれらの装置 を用いて解析を行うことができる。
[0250] この方法を用いて蛋白質 標的分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、 C末 端修飾蛋白質又は標的分子のいずれも溶液として供することが必要である (液相法） 。標的分子は修飾の必要はない。また相互作用を調べようとする c末端修飾蛋白質 より非常に分子量の小さい分子は、 c末端修飾蛋白質のブラウン運動に影響を及ぼ さな 、ため本方法にぉ 、てはふさわしくな！/、。
[0251] しかし、 2種類の蛍光色素を用いる蛍光相互相関分光法 (FCCS)は、 1種類の蛍光 色素を用いる FCSでは困難であった同じくらいの分子量をもつ蛋白質間の相互作用 も検出できる。 2種類の蛍光色素を用いる他の方法としては蛍光共鳴エネルギー移 動（FRET)法が知られて!/、るが、 FRETが生じるためには 2つの蛍光色素が 40— 50 A 以内に近接する必要があり、蛋白質の大きさや蛍光色素の付 、て 、る位置によって は、相互作用していても FRETが観測されない危険性がある。 FCCS法では相互相関 の検出は蛍光色素間の距離に依存しないので、そのような問題がない。一方、他の 検出系である蛍光偏光解消法と比較すると、 FCCS法は必要なサンプル量が少なぐ 検出時間が短ぐ HTSのための自動化が容易等の長所がある。さらに FCCS法では蛍 光標識された分子の大きさや数と 、うきわめて基本的な情報が得られるので、表面プ ラズモン共鳴法のように汎用的な用途に利用できる可能性がある。両者の違いは、 表面プラズモン共鳴法では蛋白質が固定化された状態で相互作用を検出するのに 対して、 FCCS法ではより天然の状態に近い溶液中の相互作用を見ることができる点 にある。 FCCS法では、蛋白質の固定ィ匕が必要ないかわりに、蛋白質を蛍光色素で 標識する必要があるが、本発明により、この課題を克服することが可能となった。
[0252] また、 FCCS法では細胞内の環境に近い溶液状態で蛋白質 ·蛋白質相互作用ゃ蛋 白質'核酸相互作用を調べることができ、かつ解離定数 (結合定数)を 1回の測定で 簡便に算出することができる。
[0253] 本方法において C末端修飾蛋白質に標的分子を接触せしめる方法としては、両分 子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であれば如何なるものであってもよ いが、好ましくは市販の FCS用装置の測定用ゥエルに通常生化学的に用いられる緩 衝液等に適当な濃度で C末端修飾蛋白質溶解した溶液を投入し、さらに同緩衝液に 適当な濃度で標的分子を溶解した溶液を投入する方法によって行われる。
[0254] この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記 FCS用測 定装置の各測定用ゥエルにそれぞれ異なる複数の C末端修飾蛋白質を投入し、これ に特定の標的分子溶液を投入するか、あるいは特定の c末端修飾蛋白質を投入し、 各ゥヱルに互いに異なる複数種の標的分子溶液を投入する方法が用いられる。
[0255] (2)蛍光イメージングアナライズ法
蛍光イメージングアナライズ法は、固定化された分子に、修飾分子を接触せしめ、 両分子の相互作用により、固定化された分子上にとどまった修飾分子から発せられ る蛍光を、市販の蛍光イメージングアナライザーを用いて測定又は解析する方法で ある。
[0256] この方法を用いて蛋白質 標的分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、 C末 端修飾蛋白質又は標的分子の 、ずれか一方は上記した方法により固定ィ匕されて ヽ ることが必要である。標的分子は固定ィ匕して用いる場合には修飾されているものと、 されていないもののどちらも利用可能である。また、固定ィ匕しないで用いる場合には 上記した修飾物質により修飾されていることが必要である。 C末端修飾蛋白質は、修 飾部を介して固定ィ匕されているものも、修飾部以外の部分で固定ィ匕されているものも 用!/、ることができる。
[0257] C末端修飾蛋白質又は標的分子を固定ィ匕するための基板（固相）としては、通常、 蛋白質や核酸等を固定ィ匕するのに用いられるガラス板や-トロセルロースメンブレン やナイロンメンブレン、又はプラスチック製のマイクロプレート等も用いることができる。 また、表面が種々の官能基 (ァミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基等)や種 々のリガンド（ピオチン、イミノビォチン、ニッケル又はコバルト等の金属イオン、グルタ チオン、糖類、ヌクレオチド類、 DNA、 RNA、抗体、カルモジュリン、受容体蛋白質等） が結合した上記基板等も用いることができる。
[0258] 本方法において修飾標的分子又は C末端修飾蛋白質を固定化分子へ接触せしめ る方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいか なるものであってもよいが、好ましくは修飾標的分子又は C末端修飾蛋白質を生化学 的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液を作成し、これを固相表面 に接触させる方法が好まし ヽ。
[0259] 両分子を接触せしめた後、好ましくは過剰に存在する修飾標的分子又は C末端修 飾蛋白質を同緩衝液等により洗浄する工程を行い、固相上にとどまった標的分子又 は c末端修飾蛋白質の修飾物質から発せられる蛍光信号、又は固定化されている修 飾分子から発せられる蛍光と固相上にとどまった修飾分子から発せられる蛍光が混 ざり合った信号を、市販のイメージングアナライザーを用いて測定又は解析すること により、固定化された分子と相互作用する分子を同定することができる。
[0260] この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記固相表面 に、複数の C末端修飾蛋白質又は修飾もしくは非修飾標的分子を番地付けして固定 化する方法、あるいは 1種類の C末端修飾蛋白質又は修飾もしくは非修飾標的分子 に固定化されていない複数種の C末端修飾蛋白質又は修飾標的分子を接触させる 方法等が用いられる。複数種の C末端修飾蛋白質又は修飾標的分子を接触させる 場合には、固相にとどまった該分子を緩衝液の濃度の差等により解離させて取得し、 これを既知の方法により分析することにより同定できる。
[0261] (3)蛍光共鳴エネルギー移動法
2種類の蛍光色素を用いる他の分子間相互作用検出法として、蛍光共鳴エネルギ 一移動（FRET)法がよく知られている。 FRETとは、 2種類の蛍光色素の一方（ェネル ギー供与体）の蛍光スペクトルと、もう一方（エネルギー受容体）の吸収スペクトルに 重なりがあるとき、 2つの蛍光色素間の距離が十分小さいと、供与体力 の発光が起 こらないうちに、その励起エネルギーが受容体を励起してしまう確率が高くなる現象 をいう。したがって、相互作用を検出したい 2つの蛋白質を、それぞれ供与体および 受容体となる蛍光色素で標識しておき、供与体を励起すれば、 2つの蛋白質が相互 作用しない場合は、蛍光色素間の距離が大きいため FRETは起こらず、供与体の蛍 光スペクトルが観察されるが、 2つの蛋白質が相互作用して蛍光色素間の距離が小 さくなると、 FRETにより受容体の蛍光スペクトルが観察されるので、蛍光スペクトルの 波長の違いから蛋白質間相互作用の有無を判別することができる。蛍光色素として は、供与体がフルォレセイン、受容体がローダミンという組み合わせがよく用いられて いる。また最近では、蛍光緑色蛋白質 (GFP)の波長の異なる変異体の組み合わせ により、細胞の中で FRETを観察し相互作用を検出する試みがなされている。この方 法の欠点としては、 FRETが生じるために 2つの蛍光色素が 40— 50 A以内に近接す る必要があるため、蛋白質の大きさや蛍光色素の付いている位置によっては、相互 作用して 、ても FRETが観測されな 、危険性があると 、う点が挙げられる。
[0262] (4)エバネッセント場分子イメージング法
エバネッセント場分子イメージング法とは、 Funatsu, T., et al.， Nature, 374, 555-559 (1995)等に記載されている方法で、ガラス等の透明体に固定ィ匕した分子に 溶液として第 2の分子を接触せしめ、これにエバネッセント場が発生する角度でレー ザ一光等の光源を照射し、発生したエバネッセント光を検出器によって測定又は解 析する方法である。これらの操作は、それ自体既知のエバネッセント場蛍光顕微鏡 装置を用いて行うことができる。
[0263] この方法を用いて蛋白質 標的分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、 C末 端修飾蛋白質又は標的分子の 、ずれか一方は上記した方法により固定ィ匕されて ヽ ることが必要である。標的分子は固定ィ匕する場合は修飾の必要はないが、固定化し な 、で用いる場合には上記した修飾物質により修飾されて 、ることが必要である。
[0264] C末端修飾蛋白質又は標的分子を固定ィ匕するための基板としては、ガラス等の材 質の基板が用いられ、好ましくは石英ガラスが用いられる。また、レーザー光の散乱 等を防ぐために表面を超音波洗浄したものが好ましい。
[0265] 本方法において固定ィ匕していない C末端修飾蛋白質又は修飾標的分子を固定ィ匕 分子へ接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する 方法であれば!/、かなるものであってもよ 、が、好ましくは固定化して ヽな 、C末端修 飾蛋白質又は修飾標的分子を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で 溶解した溶液を作成し、これを固相表面に滴下する方法が好ま ヽ。
[0266] 両分子を接触せしめた後、エバネッセント場照明により励起された蛍光を CCDカメ ラ等の検出器を用いて測定することにより、固定化された分子と相互作用する分子を 同定することができる。
[0267] この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記基板に、複 数の C末端修飾蛋白質又は修飾標的分子を番地付けして固定ィヒする方法等が用い られる。
[0268] (5)蛍光偏光解消法
蛍光偏光法（Perran, J., et al, J. Phys. Rad., 1, 390- 401(1926))は、蛍光偏光で励 起された蛍光分子が、励起状態の間、定常状態を保っている場合には同一の偏光 平面で蛍光を放射するが、励起された分子が励起状態中に回転ブラウン運動等を 行った場合に、放射された蛍光は励起光とは異なった平面になることを利用する方 法である。分子の運動はその大きさに影響を受け、蛍光分子が高分子である場合に は、励起状態の間の分子の運動はほとんどなぐ放射光は偏光を保ったままになって いるのに対して、低分子の蛍光分子の場合は、運動速度が速いために放射光の偏 光が解消される。そこで、平面偏光で励起された蛍光分子から放射される蛍光の強 度を、元の平面とそれに垂直な平面とで測定し、両平面の蛍光強度の割合力 この 分子の運動性およびその存在状態に関する情報が得られるものである。この方法に よれば、夾雑物があってもこれに影響されることなぐ蛍光修飾された分子と相互作 用する標的分子の挙動を追跡できる。これは蛍光修飾された分子と標的分子が相互 作用するときにのみ、偏光度の変化として測定される力もである。
[0269] この方法を行うための装置としては例えば BECON (Panyera社製)等が市販されて おり、本方法もこれらの装置を用いることにより行うことができる。
[0270] この方法を用いて蛋白質 標的分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、 C末 端修飾蛋白質又は標的分子のいずれも溶液として供する必要がある。標的分子は 修飾の必要はない。また相互作用を調べようとする C末端修飾蛋白質より非常に分 子量の小さい分子は、 C末端修飾蛋白質のブラウン運動に影響を及ぼさないため本 方法にお ヽてはふさわしくな!/、。
[0271] 本方法において C末端修飾蛋白質に標的分子を接触せしめる方法としては、両分 子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であれば如何なるものであってもよ いが、好ましくは市販の蛍光偏光解消装置の測定用ゥ ルに通常生化学的に用いら れる緩衝液等に適当な濃度で C末端修飾蛋白質溶解した溶液を投入し、さらに同緩 衝液に適当な濃度で標的分子を溶解した溶液を投入する方法によって行われる。
[0272] 本方法において測定する C末端修飾蛋白質および標的分子との間の相互作用は 、必ずしも抗原抗体反応ほど特異性は高くないことが考えられるため、最適の組み合 わせを検出するためには、相互作用の程度を数値ィ匕することが有効である。相互作 用の程度を示す指標としては、例えば一定濃度の C末端修飾蛋白質に対して、極大 蛍光偏光度を与える最小標的物濃度の値等を用いることができる。
[0273] この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記蛍光偏光 解消法測定装置の各測定用ゥエルにそれぞれ異なる複数の C末端修飾蛋白質を投 入し、これに特定の標的分子溶液を投入するか、あるいは特定の C末端修飾蛋白質 を投入し、各ゥヱルに互いに異なる複数種の標的分子溶液を投入する方法が用いら れる。
[0274] (6)表面プラズモン共鳴法
表面プラズモン共鳴法とは、金属 Z液体界面で相互作用する分子によって表面プ ラズモンが励起され、これを反射光の強度変化で測定する方法である（Cullen, D.C., et al.， Biosensors, 3(4), 211-225(1987-88))。この方法を用いて蛋白質 標的分子 間相互作用の測定又は解析を行う場合、 C末端修飾蛋白質は上記した方法により固 定ィ匕されていることが必要であるが、標的分子の修飾は必要ない。
[0275] C末端修飾蛋白質を固定ィ匕するための基板としては、ガラスの等の透明基板上に 金、銀、白金等の金属薄膜が構成されたものが用いられる。透明基板としては、通常 表面プラズモン共鳴装置用に用いられるものであればいかなるものであってもよぐレ 一ザ一光に対して透明な材料力もなるものとして一般的にはガラス等力もなるもので あり、その厚さは 0. 1— 5mm程度のものが用いられる。また金属薄膜の膜厚は 100 一 2000 A程度が適当である。このような表面プラズモン共鳴装置用固基板として巿 販されているものも用いることができる。 C末端修飾蛋白質の上記基板への固定化は 前述した方法により行うことができる。
[0276] 本方法において標的分子を C末端修飾蛋白質へ接触せしめる方法としては、両分 子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであってもよ いが、好ましくは標的分子を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解 した溶液に固定化された C末端蛋白質を接触させる方法を用いることができる。
[0277] これらの行程は市販の表面プラズモン共鳴装置、例えば BIAcore2000 (Pharmacia Biosensor社製)によってもよい。両分子を接触せしめた後、それ自体既知の表面ブラ ズモン共鳴装置を用いて、それぞれの反射光の相対強度の時間的変化を測定する ことにより、固定化された C末端修飾蛋白質と標的分子の相互作用が解析できる。 [0278] この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記表面プラズ モン共鳴装置に用いられる基板に、複数の C末端修飾蛋白質を番地付けして固定 化するか、あるいは 1種類の固定化された C末端修飾蛋白質に複数種の標的分子を 接触させる方法等が用いられる。
[0279] (7)固相酵素免疫検定法
固相酵素免役検疋法 (Enzyme Lin ed Immunosoroent Assay (ELIbA): Crowther, J.R., Methods in Molecular Biology, 42 (1995))は、固相上に固定化した抗原に対し 、抗体を含む溶液を接触せしめ、両分子の相互作用（抗原抗体反応）により、固定化 された抗原上にとどまった抗体をこれと特異的に結合する修飾分子 (IgG等)力 発 せられる蛍光、又は修飾分子を基質とする色素から発せられる信号を、市販の検出 器 (ELISAリーダー）を用いて測定又は解析する方法である。
[0280] この方法を用いて蛋白質 標的分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、抗原 となる C末端修飾蛋白質は上記した方法により固定ィ匕されていることが必要である。 また抗体となる標的分子は上記した修飾物質により修飾されていることが必要である
[0281] 抗原となる C末端修飾蛋白質を固定ィ匕するための基板としては、通常 ELISAに用 V、られるプラスチック製のマイクロプレート等も用いることができる。
[0282] 本方法にお!、て抗体となる修飾標的分子を固相分子へ接触せしめる方法としては 、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであつ てもよいが、好ましくは修飾標的分子を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な 濃度で溶解した溶液を作成し、これをマイクロプレートに注入する方法が好まし 、。
[0283] 両分子を接触せしめた後、好ましくは過剰に存在する固定ィヒ分子に結合していな い修飾分子を同緩衝液等により洗浄する工程を行い、固相上にとどまった修飾分子 から発せられる蛍光を、市販の ELISAリーダー等を用いて測定又は解析することに より、固定化された抗原分子と相互作用する分子を同定することができる。
[0284] この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記マイクロプ レートの各穴にそれぞれ異なる複数の修飾標的分子を固定ィ匕する方法が用いられる [0285] また、本発明の蛋白質は相互作用する分子の同定にも使用できる。
[0286] 上記のそれぞれの方法により測定され C末端修飾蛋白質との間に相互作用が認め られた標的分子は、該分子の一次構造が未知の場合、それ自体既知の適当な方法 により、その一次構造を解析することができる。具体的には、相互作用を認められた 標的分子が蛋白質の場合、アミノ酸分析装置等によりアミノ酸配列を解析し、一次構 造を特定することができる。また、標的分子が核酸の場合には、塩基配列決定方法 により、オート DNAシーケンサーなどを用いれば塩基配列を決定することができる。
[0287] さらに、本発明の蛋白質は、蛋白質のライブラリーとの相互作用の解析にも使用で きる。
[0288] 本発明は、ベイトを c-Jun蛋白質として、プレイをマウス脳の cDNAライブラリ一として 、 IWの共翻訳セレクション /スクリーニングを行い、その結果得た c-Jun蛋白質と複合 体を形成しうる新規の蛋白質をコードする遺伝子又は核酸配列、およびそれらの利 用方法を提供する。また、 c-Jun蛋白質と複合体を形成しうることが知られていない既 知の蛋白質をコードする遺伝子又は核酸配列の利用方法を提供する。
[0289] 本発明は、既知の遺伝子配列や核酸配列を探索するにとどまらず、予想されなか つたフレームシフトによる新規のアミノ酸配列を持つ新規の蛋白質、ゲノム情報から 核酸配列のみ公開されていた核酸配列を持つ新規の蛋白質、又は、全く新規の核 酸配列を持つ新規の蛋白質、さらに、直接的な相互作用のみならず、予想されなか つた間接的な相互作用による複合体を形成する蛋白質やそれら蛋白質をコードする 遺伝子又は核酸配列、およびそれらの利用方法を提供することが可能である。
[0290] 以下、本発明の蛋白質のアミノ酸配列とそれをコードする核酸の配列について具体 的に記するが、下記の実施例は本発明につ 、ての具体的認識を得る一助とみなす べきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものでない。 実施例 1
[0291] ベイトを c-Jun蛋白質として、プレイをマウス脳の cDNAライブラリ一として、 IVVの共 翻訳セレクション /スクリーニングを行い (図 2)、その結果、 c-Jun蛋白質と複合体を形 成しうる、機能既知および未知の新規の蛋白質をコードする遺伝子又は核酸配列を [0292] ベイト c-Jun蛋白質の作製方法は以下の通りであった。
pCMV- cjun(502- 957)CBPzzベクター（配列番号 256)から、 TaKaRa Ex Taq (宝酒造 )を用いて、 PCR (プライマー 5'SP6(029)T7 (配列番号 257)と 3'FosCBPzz (配列番 号 258)、 PCRプログラム CYCB1 (表 1参照））によって DNAテンプレートを準備した 。 DNAテンプレートを RiboMAX™ Large Scale RNA Production Systems (Promega)を用いて転写（37°C、 2時間）し、ベイト c-Jun蛋白質の mRNAテンプレ ートを準備した。共存させる DNAは、 FosZjunの結合配列を含む DNA-Fos/Jun (配 列番号 259)をテンプレートとし、 PCR (プライマー 5'DNA (配列番号 260)と 3'DNA( 配列番号 261)、 PCRプログラム V-2 (表 1参照） )によって準備した。
[0293] プレイのマウス脳 cDNAライブラリーの作成方法は以下の通りであった。図 3に従つ て IWランダムライブラリーを作成した。 RNAライブラリ一として、市販のマウス脳 (polyA+) RNAライブラリー (組織抽出 RNAライブラリーを oligo dTカラムで精製したもの ； clontech)を購入した。アダプター設計は、対応付け分子の形成に適した 5'UTR配列 (プロモーター SP6+ェンハンサー 029又は 0')をライブラリーに、 IW形成に必要な配 列として付加するための設計を行った。マウス脳 (polyA+) RNAライブラリーには、ェン ハンサー 029をもつアダプターを使用した。ェンハンサー 029用のアダプターの主鎖 (配列番号 262又は 263)と副鎖 (gaattcgc)は、各々 TEバッファー (10mM Tris-Cl, pH8.0, ImM EDTA)に溶解して 100 Mとし、主鎖と副鎖をそれぞれ 10 1ずつ等モ ルで混合した。 90°Cで 2分間加熱し、 70°Cで 5分加熱し、 60°Cのウォーターバスにセ ットしてバスのヒーターを切ってゆっくりと 60°Cから室温まで下げた。 5 μ 1ずつに分注 して- 20°Cに保存した。次に、マウス脳 (polyA+) RNAライブラリーを一本鎖 DNAに逆 転写した (図 3, I)oマウス脳 (polyA+) RNAライブラリー (1.4pmole/0.5 μ g)を 0.5 μ g、 3' ランダムプライマー (配列番号 264)を 2pmolと DEPC水とをカ卩えて 12.0 μ 1とし、 70°Cで lOmin加熱し、氷上で 1分間冷却した。これを用いて、 SuperScriptll RT (Superscript Double Strand cDNA Synthesis Kit; Invitrogen)で 45°Cで lh逆転写反応を行った。次 に、逆転写反応で合成した一本鎖 DNAを全量用いて、 E.coli DNAリガーゼ、 E.coli ポリメラーゼ I、および E.coli RNase H (Superscript Double Strand cDNA Synthesis Kit; Invitrogen)で 16°Cで 2h反応し、さらに T4 DNAポリメラーゼで 16°Cで 5minで末端 を平滑ィ匕し、二本鎖 DNAを合成した (図 3, 11)。次に、この二本鎖 DNAの 5'末端がリン 酸ィ匕されていることを利用して、先に準備したアダプターを用いてライゲーシヨンした（ 図 3, 111)。合成した二本鎖 DNAライブラリーをエタノール沈殿し、 4 1の DEPC水に溶 解した。これに、 100 μ Μの準備したアダプターを 1.0 μ 1添加し、 50 μ 1 ligation high(TOYOBO)をカ卩えて、 16°Cでオーバーナイトで反応させ、精製 (DNA purification kit； QIAGEN)した後 50 μ 1とした。次に、 PCR(EX Taq Hot Start Version; TaKaRa)を 行った (図 3, IV)。 50 μ 1のライゲーシヨンした二本鎖 DNAライブラリーから 2 μ 1をテンプ レートとして、 IVVに必要な特定配列 (029)を持つ 5'PCRプライマー (配列番号 260)と 3'PCRプライマー (配列番号 261)を用いて、 IW cDNAライブラリーを作成した。 PCR の条件は、全量 100 μ 1、 22サイクル (94°Cで 30秒、 60°Cで 30秒、 72°Cで 90秒を 1サイク ルとし、最後の伸長反応は、 72°Cで 180秒)とした。
これらべイト c-Jun蛋白質の mRNAテンプレート、プレイのマウス脳 cDNAライブラリー 、そして共存させるベイト DNAを小麦の無細胞翻訳系 (Wheat Germ
Extract(Promega))を用いて 50 1で共翻訳 (26°C, 60min)させた。 50 のサンプルに 対し、 IgG結合バッファー（10mM Tris-Cl, pH8.0, 150mM NaCl, 0.1% ΝΡ40) 50 1を 添カロし計 100 1(共翻訳サンプル）とした。その後、 IgGァガロース (Sigma)を IgG結合バ ッファーで 2回洗浄し、これに共翻訳サンプル (100 1)を加え、 4°Cで 2時間回転攪拌 した。結合バッファーで 3回、 TEV切断バッファー（10mM Tris-Cl pH8.0, 150mM NaCl, 0.1% NP40, 0.5mM EDTA, ImM DTT)で 1回洗浄し、 IgGァガロースに結合し たべイト/プレイ複合体を TEVプロテアーゼ (GIBCO-BRL)で切断した (16°C、 2時間)。 回収した溶液 100 1中 1 1をテンプレートとして、容量 50 μ 1で RT- PCR(One step RT-PCR kit (QIAGEN),プライマー；配列番号 265と 266、プログラム； RT-QH3090( 表 1参照》を行った。この操作 (図 2のステップ 1)を 5ラウンド繰り返した後のライブラリ 一をクローニングしてシーケンスすることで、図 1の遺伝子のアミノ酸配列と核酸配列 が得られた。図 1のアミノ酸配列番号 1一 69に対応する DNA配列番号は下記のリスト 1に示す。この結果は、ェンハンサー 029用のアダプターの主鎖として配列番号 262 を用いて作成したライブラリーおよび配列番号 263を用いて作成したライブラリーの いずれでも同様であった。 [0295] くリスト 1 >
126(1), 127(2), 128(3), 129(4), 130(5), 131(6), 132(7), 133(8), 134(9), 135(10), 136(11), 137(12), 138(13), 139(14), 140(15), 141(16), 142(17), 143(18), 144(19), 145(20), 146(21-1), 147(21-2), 148(22), 149(23), 150(24), 151(25), 152(26), 153(27), 154(28), 155(29), 156(30), 157(31), 158(32), 159(33), 160(34—1),
161(34-2), 162(35), 163(36), 164(37), 165(38), 166(39), 167(40), 168(41), 169(42), 170(43-1), 171(43-2), 172(44), 173(45), 174(46), 175(47), 176(48), 177(49), 178(50), 179(51), 180(52), 181(53), 182(54), 183(55), 184(56), 185(57), 186(58), 187(59), 188(60), 189(61-1), 190(61-2), 191(62), 192(63), 193(64-1), 194(64-2), 195(65), 196(66), 197(67), 198(68), 199(69)
[0296] 図 1のどの蛋白質も、 c-Junと複合体形成があることが今回初めて明らかとなった蛋 白質である。
[0297] 得られた蛋白質と c-Junとの相互作用の検証実験として、配列番号 18(SNAP19), 7 6(KINN), 93((Kif5a)、 99(Eefld), 102((Nel3), 106(Jip— c3.1), 110(Jip— cl), 113 (EB2), 115(Cspg6), 117(Mapk8ip3), 119(Jip- c3.2), 121(GFAP), 123(Jip- c8), 1 25(Kif5b)の蛋白質 (図 1)が無細胞翻訳系で発現することを、配列番号 143, 206, 2 23, 229, 232, 236, 240, 243, 245, 247, 249, 253の核酸酉己歹 IJをもとにして、 WO 02/46395の実施例 1の (2)コード分子の調製と (3)コード分子の翻訳にしたがって 実験し、小麦無細胞翻訳系で各蛋白質が発現することを C末端ラベル化法で確認し た (図 4,A)。また、発現を確認したそれらの C末端ラベルイ匕蛋白質をプレイ蛋白質とし て用いて、ベイト c-Junとの相互作用をプルダウン (puU-down)により確認した。具体的 には、プレイ蛋白質の作製方法は、 PCR cloning kit (QIAGEN社製）を用いて、 pDriveベクター（配列番号 267、 QIAGEN社製）にクローユングされた配列を菌体から 抽出し、 TaKaRa Ex Taq (宝酒造）を用いて、 PCR (プライマー 5'F3 (配列番号 268)と 3'R3 (配列番号 269)、 PCRプログラム ISHI 1562 (表 1参照）、 100 1スケール）によつ て DNAテンプレートを準備した。 DNAテンプレートを RiboMAX™ Large Scale RNA Production Systems (Promega)を用いて転写（37°C、 2時間、 50 1スケ ール）を行 、、プレイ蛋白質の mRNAテンプレートを準備した。 [0298] ベイト c-Jun蛋白質の作製方法はスクリーニングの際と同じであった。
[0299] プレイテンプレートを C末端ラベルイ匕法を用いた無細胞翻訳（10 μ 1スケール)を 1時 間行い、 C末端ラベル化された状態でプレイ蛋白質を作製した。同時にべイト c-junテ ンプレートは無細胞翻訳 (50 1スケール）により 1時間翻訳反応を行い、ベイト蛋白質 を作製した。翻訳後、両者および結合バッファーを混合させ (プレイ : 8 1、ベイト： 10 μ 1、 IgG結合バッファー： 82 1)、 IgGァガロースビーズ 50 μ 1に 2時間インキュベートし 、ビーズを洗浄後、ビーズに 20 1の SDS含有の緩衝液をカ卩え、 5分間 100°Cで煮沸し 溶出させた。このサンプルを 17.5% SDS-PAGEにより展開し、 FITC蛍光色素を蛍光ィ メージャーにより観察した (図 4B)。なお、コントロールとして、ベイト c-Jun蛋白質をカロ えない反応も行った。
[0300] その結果、配列番号 2(SNAP19), 71(KINN), 89((Kif5a)、 96(Eefld), 101((Nef3), 1060ip-c3.1), HO(Jip-cl), 113(EB2), 115(Cspg6), 117(Mapk8ip3), 119 (Jip-c3.2), 123(Jip-c8)の蛋白質は c-Junと直接相互作用していることが確認できた。
[0301] さらに、配列番号 143, 206, 223, 229, 232, 236, 240, 243, 245, 247, 249 , 251, 253、 255の核酸配列をもとにして、リアルタイム PCRにより c-Junと直接およ び間接的に相互作用して 、る遺伝子の濃縮を確認した (図 5)。配列番号 25 GFAP) , 255(Ki!5b)も他の直接的に相互作用する遺伝子と同様に濃縮されていることから、 c-Junと間接的に相互作用があることが確認できた。具体的なリアルタイム PCRの方法 は、 14種の遺伝子 (配列番号 143, 206, 223, 229, 232, 236, 240, 243, 245, 247, 249, 251, 253、 255)についてスクリーニングにより得られた酉己列の範囲内で 増幅されるよう、プライマーを設計した (配列番号 270— 297)。検量線作製用に、ポ ジティブコントロールの DNA断片が pDriveベクターに組み込まれた遺伝子を PCR( 5'M13_Fプライマー（配列番号 298)、 3'M13_Rプライマー（配列番号 299)を用い、表 1の PCRプログラム lightcyclerを使用）により増幅し、 1E03、 1E05、 1E07、 1E09クローン /反応となるように調製した。測定においては、スクリーニング前のライブラリー DNA、 スクリーニングの各サイクルのライブラリー DNA、およびべイト c-junを添カ卩しなかった モッタ (Mock)ライブラリー DNAをそれぞれ 5ng/反応となるよう調製した。 PCR測定反応 ίま LightCycler Instrument ^ Lightし ycler FastStart DNA Master b BR ureen I (共に ロシュ'ダイァグノスティックス）を用いて表 1に示したプログラムにより、 20 μ 1のスケー ルで行った。
[0302] また、本発明による蛋白質や遺伝子又は核酸配列による新たな機能 (ここでは c-Jun と結合できる機能)を利用して、 c-Junの持つ機能としての転写や遺伝子複製などをブ ロックする阻害剤として応用することができる。その根拠は、 IW法で検出された遺伝 子は、スクリーニングを複数回繰り返すことにより競争過程を経て検出されてきて 、る こと〖こ起因する。よって、 IVV法で検出された遺伝子群は、ある個数分布を描き、競争 力が強い遺伝子ほど多く検出されることになる。このことは、クローン数が多いほど競 争力が強ぐブロック剤'阻害剤として有効に働くことを示している。本実施例の IWセ レクシヨンでは、ベイト c-Junに対して、プレイとしてよく知られている c-Fosが 3コ (/132 コ)、 C— Junが 1コ (/132コ)、 ATF4力 コ (/132コ)、 Jpp2が 5コ (/132コ)検出された。こ のように、セレクションで検出されるクローン数 (図 1)から、 SNAP19や KINNは既知の蛋 白質に比較して非常に強い競争力を持ち、また、 Kif5a、 Eefld、 Nef3、 Jip-c3.1、 Jip-clなどは、 c-Fosと十分競争することができることを示しており、 EB2、 Cspg6、 Mapk8ip3、 Jip-c3.2、 Jip-c8などは、 c-Junや ATF4と十分競争することができることを 示しており、各蛋白質は、 c-Junと既知の蛋白質の相互作用による複合体の転写や 遺伝子複製などの機能をブロックする阻害剤として応用することができる。
[0303] [表 1]
表 1 PCRプログラム プログラム名 ： CYCB1
反応条件：
95°C 1min
15サイクル
Figure imgf000068_0001
4°C ポーズ
プログラム名 ： V-2
反応条件：
35サイクル
Figure imgf000068_0002
4°C ポ一ズ
プログラム名 ： RT-0H3090
反応条件：
50°C 30m in
95°C 15m in
(1回目: 30サイクル， 2-4回目： 26サイクル， 5回目 28サイクル)
Figure imgf000068_0003
72°C 10m in
プログラム名 ： ISHI1562
反応条件：
94°C 2m in
15サイクル
Figure imgf000068_0004
73°C 15m in
プログラム名 ： I i htcycler
反応条件：
95°C 10m i n
95°C 15sec ^——
X°C lOsec 40サイクル
72°C 5sec
X：ァニ一リングの温度はプライマ一の Tm値により 62' '51°C 産業上の利用の可能性
c-Junと相互作用する蛋白質が提供されたことにより、 c-Junとの直接的な相互作用 のみならず、予想されな力つた間接的な相互作用による複合体を形成する蛋白質及 びそれら蛋白質をコードする核酸、ならびに、それらの利用方法を提供することが可 會 になる。

Claims

請求の範囲
[1] c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害剤であって 、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 1一 69のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 1一 69のいずれかのアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が 欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋 白質。
[2] 有効成分の蛋白質が配列番号 1一 69のいずれかのアミノ酸配列を含む請求項 2記 載の阻害剤。
[3] 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸から翻訳された蛋白質である請求項 2記載の阻 害剤。
(a)配列番号 126— 199のいずれかの塩基配列を含む核酸。
(b)配列番号 126— 199のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸
[4] 核酸が配列番号 126— 199のいずれかの塩基配列を含む請求項 3記載の阻害剤。
[5] ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベ イトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)もしくは (b) の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸力 翻訳された蛋白質である前記方 法。
(a)配列番号 1一 69のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 1一 69のいずれかのアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が 欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋 白質。
(a， )配列番号 126— 199の!、ずれかの塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 126— 199のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸
[6] 蛋白質が配列番号 1一 69のいずれかのアミノ酸配列を含む請求項 5記載の方法。
[7] 核酸が配列番号 126— 199のいずれかの塩基配列を含む請求項 5記載の方法。
[8] 請求項 5— 7のいずれか 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の相互作用を 検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベ イトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
[9] c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害剤であって
、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 70— 87のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 70— 87のいずれかのアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸 が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する 蛋白質。
[10] 有効成分の蛋白質が配列番号 70— 87のいずれかのアミノ酸配列を含む請求項 9記 載の阻害剤。
[11] 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸力も翻訳された蛋白質である請求項 9記載の阻 害剤。
(a)配列番号 200— 217のいずれかの塩基配列を含む核酸。
(b)配列番号 200— 217のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸
[12] 核酸が配列番号 200— 217のいずれかの塩基配列を含む請求項 11記載の阻害剤
[13] ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベ イトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)もしくは (b) の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸力 翻訳された蛋白質である前記方 法。
(a)配列番号 70— 87のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 70— 87のいずれかのアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸 が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する 蛋白質。
(a' )配列番号 200— 217の!、ずれかの塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 200— 217のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸
[14] 蛋白質が配列番号 70— 87のいずれかのアミノ酸配列を含む請求項 13記載の方法
[15] 核酸が配列番号 200— 217のいずれかの塩基配列を含む請求項 13記載の方法。
[16] 請求項 13— 15のいずれか 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の相互作用 を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、 ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
[17] c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害剤であって
、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 88— 94のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 88— 94のいずれかのアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸 が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する 蛋白質。
[18] 有効成分の蛋白質が配列番号 88— 94のいずれかのアミノ酸配列を含む請求項 17 記載の阻害剤。
[19] 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸力も翻訳された蛋白質である請求項 17記載の 阻害剤。
(a)配列番号 218— 224のいずれかの塩基配列を含む核酸。
(b)配列番号 218— 224のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸
[20] 核酸が配列番号 218— 224のいずれかの塩基配列を含む請求項 19記載の阻害剤
[21] ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベ イトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)もしくは (b) の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸力 翻訳された蛋白質である前記方 法。
(a)配列番号 88— 94のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 88— 94のいずれかのアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸 が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する 蛋白質。
(a' )配列番号 218— 224の!、ずれかの塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 218— 224のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸
[22] 蛋白質が配列番号 88— 94のいずれかのアミノ酸配列を含む請求項 21記載の方法
[23] 核酸が配列番号 218— 224のいずれかの塩基配列を含む請求項 21記載の方法。
[24] 請求項 21— 23のいずれか 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の相互作用 を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、 ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
[25] c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害剤であって
、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 95— 99のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 95— 99のいずれかのアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸 が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する 蛋白質。
[26] 有効成分の蛋白質が配列番号 95— 99のいずれかのアミノ酸配列を含む請求項 25 記載の阻害剤。
[27] 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸力も翻訳された蛋白質である請求項 25記載の 阻害剤。
(a)配列番号 225— 229の!、ずれかの塩基配列を含む核酸。 (b)配列番号 225— 229のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸
[28] 核酸が配列番号 225— 229の 、ずれかの塩基配列を含む請求項 27記載の阻害剤
[29] ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベ イトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)もしくは (b) の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸力 翻訳された蛋白質である前記方 法。
(a)配列番号 95— 99のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 95— 99のいずれかのアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸 が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する 蛋白質。
(a' )配列番号 225— 229の!、ずれかの塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 225— 229のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸
[30] 蛋白質が配列番号 95— 99のいずれかのアミノ酸配列を含む請求項 29記載の方法
[31] 核酸が配列番号 225— 229のいずれかの塩基配列を含む請求項 29記載の方法。
[32] 請求項 29— 31のいずれか 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の相互作用 を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、 ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
[33] c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害剤であって
、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 100— 104のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 100— 104の!、ずれかのアミノ酸配列にお 、て、 1もしくは数個のァミノ 酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用す る蛋白質。
[34] 有効成分の蛋白質が配列番号 100— 104のいずれかのアミノ酸配列を含む請求項 33記載の阻害剤。
[35] 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸力も翻訳された蛋白質である請求項 33記載の 阻害剤。
(a)配列番号 230— 234の!、ずれかの塩基配列を含む核酸。
(b)配列番号 230— 234のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸
[36] 核酸が配列番号 230— 234の 、ずれかの塩基配列を含む請求項 35記載の阻害剤
[37] ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベ イトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)もしくは (b) の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸力 翻訳された蛋白質である前記方 法。
(a)配列番号 100— 104のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 100— 104の!、ずれかのアミノ酸配列にお 、て、 1もしくは数個のァミノ 酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用す る蛋白質。
(a' )配列番号 230— 234の!、ずれかの塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 230— 234のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸
[38] 蛋白質が配列番号 100— 104のいずれかのアミノ酸配列を含む請求項 37記載の方 法。
[39] 核酸が配列番号 230— 234の 、ずれかの塩基配列を含む請求項 37記載の方法。
[40] 請求項 37— 39のいずれか 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の相互作用 を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、 ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
[41] c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害剤であって 、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 105— 108のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 105— 108の!、ずれかのアミノ酸配列にお 、て、 1もしくは数個のァミノ 酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用す る蛋白質。
[42] 有効成分の蛋白質が配列番号 105— 108のいずれかのアミノ酸配列を含む請求項 41記載の阻害剤。
[43] 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸から翻訳された蛋白質である請求項 41記載の 阻害剤。
(a)配列番号 235— 238のいずれかの塩基配列を含む核酸。
(b)配列番号 235— 238のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸
[44] 核酸が配列番号 235— 238の 、ずれかの塩基配列を含む請求項 43記載の阻害剤
[45] ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベ イトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)もしくは (b) の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸力 翻訳された蛋白質である前記方 法。
(a)配列番号 105— 108のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 105— 108の!、ずれかのアミノ酸配列にお 、て、 1もしくは数個のァミノ 酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用す る蛋白質。
(a' )配列番号 235— 238の!、ずれかの塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 235— 238のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸
[46] 蛋白質が配列番号 105— 108のいずれかのアミノ酸配列を含む請求項 45記載の方 法。
[47] 核酸が配列番号 235— 238の 、ずれかの塩基配列を含む請求項 45記載の方法。
[48] 請求項 45— 47のいずれか 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の相互作用 を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、 ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
[49] c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害剤であって
、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 109— 111の!、ずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 109— 111の!、ずれかのアミノ酸配列にお 、て、 1もしくは数個のァミノ 酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用す る蛋白質。
[50] 有効成分の蛋白質が配列番号 109— 111の 、ずれかのアミノ酸配列を含む請求項 49記載の阻害剤。
[51] 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸力も翻訳された蛋白質である請求項 49記載の 阻害剤。
(a)配列番号 239— 241のいずれかの塩基配列を含む核酸。
(b)配列番号 239— 241のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸
[52] 核酸が配列番号 239— 241のいずれかの塩基配列を含む請求項 51記載の阻害剤
[53] ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベ イトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)もしくは (b) の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸力 翻訳された蛋白質である前記方 法。
(a)配列番号 109— 111の!、ずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。 (b)配列番号 109— 111の!、ずれかのアミノ酸配列にお 、て、 1もしくは数個のァミノ 酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用す る蛋白質。
(a' )配列番号 239— 241の!、ずれかの塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 239— 241のいずれかの塩基配列力もなる核酸とストリンジ ントな条 件下でノ、イブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸
[54] 蛋白質が配列番号 109— 111の 、ずれかのアミノ酸配列を含む請求項 53記載の方 法。
[55] 核酸が配列番号 239— 241のいずれかの塩基配列を含む請求項 53記載の方法。
[56] 請求項 53— 55のいずれか 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の相互作用 を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、 ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
[57] c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害剤であって
、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 112もしくは 113のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 112もしくは 113のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。
[58] 有効成分の蛋白質が配列番号 112又は 113のアミノ酸配列を含む請求項 57記載の 阻害剤。
[59] 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸力も翻訳された蛋白質である請求項 57記載の 阻害剤。
(a)配列番号 242もしくは 243の塩基配列を含む核酸。
(b)配列番号 242もしくは 243の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[60] 核酸が配列番号 242又は 243の塩基配列を含む請求項 59記載の阻害剤。
[61] ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベ イトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)もしくは (b) の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸力 翻訳された蛋白質である前記方 法。
(a)配列番号 112もしくは 113のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 112もしくは 113のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。
(a' )配列番号 242もしくは 243の塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 242もしくは 243の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[62] 蛋白質が配列番号 112又は 113のアミノ酸配列を含む請求項 61記載の方法。
[63] 核酸が配列番号 242又は 243の塩基配列を含む請求項 61記載の方法。
[64] 請求項 61— 63のいずれか 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の相互作用 を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、 ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
[65] c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害剤であって
、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 114もしくは 115のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 114もしくは 115のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。
[66] 有効成分の蛋白質が配列番号 115のアミノ酸配列を含む請求項 65記載の阻害剤。
[67] 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸力も翻訳された蛋白質である請求項 65記載の 阻害剤。
(a)配列番号 244もしくは 245の塩基配列を含む核酸。
(b)配列番号 244もしくは 245の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[68] 核酸が配列番号 244又は 245の塩基配列を含む請求項 67記載の阻害剤。
[69] ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベ イトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)もしくは (b) の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸力 翻訳された蛋白質である前記方 法。
(a)配列番号 114もしくは 115のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 114もしくは 115のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。
(a' )配列番号 244もしくは 245の塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 244もしくは 245の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[70] 蛋白質が配列番号 114又は 115のアミノ酸配列を含む請求項 69記載の方法。
[71] 核酸が配列番号 244又は 245の塩基配列を含む請求項 69記載の方法。
[72] 請求項 69— 71のいずれか 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の相互作用 を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、 ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
[73] c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害剤であって
、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 116もしくは 117のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 116もしくは 117のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。
[74] 有効成分の蛋白質が配列番号 116又は 117のアミノ酸配列を含む請求項 73記載の 阻害剤。
[75] 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸力も翻訳された蛋白質である請求項 73記載の 阻害剤。
(a)配列番号 246もしくは 247の塩基配列を含む核酸。
(b)配列番号 246もしくは 247の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[76] 核酸が配列番号 246又は 247の塩基配列を含む請求項 75記載の阻害剤。
[77] ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベ イトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)もしくは (b) の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸力 翻訳された蛋白質である前記方 法。
(a)配列番号 116もしくは 117のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 116もしくは 117のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。
(a' )配列番号 246もしくは 247の塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 246もしくは 247の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[78] 蛋白質が配列番号 116又は 117のアミノ酸配列を含む請求項 77記載の方法。
[79] 核酸が配列番号 246又は 247の塩基配列を含む請求項 77記載の方法。
[80] 請求項 77— 79のいずれか 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の相互作用 を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、 ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
[81] c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害剤であって
、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 118もしくは 119のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 118もしくは 119のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。
[82] 有効成分の蛋白質が配列番号 118又は 119のアミノ酸配列を含む請求項 81記載の 阻害剤。
[83] 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸力も翻訳された蛋白質である請求項 81記載の 阻害剤。 (a)配列番号 248もしくは 249の塩基配列を含む核酸。
(b)配列番号 248もしくは 249の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[84] 核酸が配列番号 248又は 249の塩基配列を含む請求項 83記載の阻害剤。
[85] ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベ イトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)もしくは (b) の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸力 翻訳された蛋白質である前記方 法。
(a)配列番号 118もしくは 119のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 118もしくは 119のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。
(a' )配列番号 248もしくは 249の塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 248もしくは 249の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[86] 蛋白質が配列番号 118又は 119のアミノ酸配列を含む請求項 85記載の方法。
[87] 核酸が配列番号 248又は 249の塩基配列を含む請求項 85記載の方法。
[88] 請求項 85— 88のいずれか 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の相互作用 を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、 ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
[89] c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害剤であって
、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 120もしくは 121のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 120もしくは 121のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。
[90] 有効成分の蛋白質が配列番号 120又は 121のアミノ酸配列を含む請求項 89記載の 阻害剤。
[91] 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸力も翻訳された蛋白質である請求項 89記載の 阻害剤。
(a)配列番号 250もしくは 251の塩基配列を含む核酸。
(b)配列番号 250もしくは 251の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[92] 核酸が配列番号 250又は 251の塩基配列を含む請求項 91記載の阻害剤。
[93] ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベ イトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)もしくは (b) の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸力 翻訳された蛋白質である前記方 法。
(a)配列番号 120もしくは 121のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 120もしくは 121のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。
(a' )配列番号 250もしくは 251の塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 250もしくは 251の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[94] 蛋白質が配列番号 120又は 121のアミノ酸配列を含む請求項 93記載の方法。
[95] 核酸が配列番号 250又は 251の塩基配列を含む請求項 93記載の方法。
[96] 請求項 93— 95のいずれか 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の相互作用 を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、 ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
[97] c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害剤であって
、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 122もしくは 123のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 122もしくは 123のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。
[98] 有効成分の蛋白質が配列番号 122又は 123のアミノ酸配列を含む請求項 97記載の 阻害剤。
[99] 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸力も翻訳された蛋白質である請求項 97記載の 阻害剤。
(a)配列番号 252もしくは 253の塩基配列を含む核酸。
(b)配列番号 252もしくは 253の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[100] 核酸が配列番号 252又は 253の塩基配列を含む請求項 99記載の阻害剤。
[101] ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベ イトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)もしくは (b) の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸力 翻訳された蛋白質である前記方 法。
(a)配列番号 122もしくは 123のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 122もしくは 123のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。
(a' )配列番号 252もしくは 253の塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 252もしくは 253の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[102] 蛋白質が配列番号 122又は 123のアミノ酸配列を含む請求項 101記載の方法。
[103] 核酸が配列番号 252又は 253の塩基配列を含む請求項 101記載の方法。
[104] 請求項 101— 103のいずれか 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の相互作 用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む
、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
[105] c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質と、 c-Jun蛋白質との相互作用の阻害剤であって
、以下の (a)又は (b)の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
(a)配列番号 124もしくは 125のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 124もしくは 125のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。
[106] 有効成分の蛋白質が配列番号 124又は 125のアミノ酸配列を含む請求項 105記載 の阻害剤。
[107] 蛋白質が以下の（a)又は (b)の核酸力も翻訳された蛋白質である請求項 105記載の 阻害剤。
(a)配列番号 254もしくは 255の塩基配列を含む核酸。
(b)配列番号 254もしくは 255の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[108] 核酸が配列番号 254又は 255の塩基配列を含む請求項 107記載の阻害剤。
[109] ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベ イトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（a)もしくは (b) の蛋白質、又は以下の（a' )もしくは (b ' )の核酸力 翻訳された蛋白質である前記方 法。
(a)配列番号 124もしくは 125のアミノ酸配列を含む蛋白質。
(b)配列番号 124もしくは 125のアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白 質。
(a' )配列番号 254もしくは 255の塩基配列を含む核酸。
(b ' )配列番号 254もしくは 255の塩基配列からなる核酸とストリンジ ントな条件下で ハイブリダィズし、かつ、 c-Jun蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
[110] 蛋白質が配列番号 124又は 125のアミノ酸配列を含む請求項 109記載の方法。
[111] 核酸が配列番号 254又は 255の塩基配列を含む請求項 109記載の方法。
[112] 請求項 109— 111のいずれか 1項に記載の方法によりべイトとプレイとの間の相互作 用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む
、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
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