JP5804520B2 - 核酸構築物、それを用いた複合体の製造方法およびスクリーニング方法 - Google Patents

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Description

本発明は、核酸構築物、それを用いた複合体の製造方法およびスクリーニング方法に関する。
ターゲットを特異的に認識して結合する結合分子は、例えば、検査、診断および治療等の医療分野で幅広く使用されており、疾患および病態の解析において、極めて重要なツールである。中でも、モノクローナル抗体は、ターゲットに対する特異性および親和性、安定性ならびにコスト面に優れることから、最も広く研究されている。しかしながら、通常の動物への免疫法では、低分子抗原または生物種間で高度に保存されている抗原に対する抗体の作製が困難であり、必ずしも、ターゲットに対する特異的な抗体が入手できるとは限らない。実際に、疾患に関連する有力なマーカーが報告されているにも関わらず、特異的な抗体が存在しないために、診断および治療に応用できないという問題がある。
そこで、近年、動物を用いた抗体作製に代わり、人工的に結合分子を作製する方法が、報告されている。例えば、ペプチド性の結合分子については、ファージディスプレイ法、リボゾーム法、ピューロマイシンプローブを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉｒｕｓ法（ｍＲＮＡディスプレイ法）、ペプチドアレイ法等があげられる（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。いずれの方法も、免疫法により抗体を得ることができないターゲットについて、人工的な選択により、結合分子を分離できる。
しかしながら、これらの手法は、例えば、特殊な試薬および装置の使用、効率、コスト等の問題がある。これらの中でも、例えば、ファージディスプレイ法は、比較的実施されているが、いまだ、技術面でノウハウを必要とするため、実験者の経験および知識に影響され、誰でも容易に実施することが困難である。
Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．２２８：ｐ．１３１５−１３１７ Ｍａｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、Ｖｏｌ．９１：ｐ．９０２２−９０２６ Ｋｅｅｆｅ，Ａ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．４１０：ｐ．７１５−７１８
そこで、本発明の目的は、ターゲットに結合可能な候補分子を、簡便にスクリーニングするための新たなツールならびにそれを用いた候補分子のスクリーニング方法を提供することにある。
本発明の核酸構築物は、任意のペプチドのコード核酸を挿入するためのクローニング領域、ペプチドタグのコード核酸および前記ペプチドタグに結合可能なアプタマーのコード核酸を有することを特徴とする、前記任意のペプチドのコード核酸、前記ペプチドタグのコード核酸および前記アプタマーのコード核酸を含む塩基配列の融合転写産物と、前記任意のペプチドおよび前記ペプチドタグを含む融合翻訳産物との複合体を形成するための核酸構築物である。
本発明の製造方法は、任意のペプチドのコード核酸を挿入するためのクローニング領域、ペプチドタグのコード核酸および前記ペプチドタグに結合可能なアプタマーのコード核酸を有し、前記クローニング領域に前記任意のペプチドのコード核酸が挿入された前記本発明の核酸構築物を発現させることを特徴とする、前記任意のペプチドのコード核酸、前記ペプチドタグのコード核酸および前記アプタマーのコード核酸を含む塩基配列の融合転写産物と、前記任意のペプチドおよび前記ペプチドタグを含む融合翻訳産物との複合体を製造する複合体製造方法である。
本発明のスクリーニング方法は、下記（Ａ）〜（Ｃ）工程を含むことを特徴とする、ターゲットに結合可能なペプチドまたは前記ペプチドのコード核酸をスクリーニングする方法である。
（Ａ）前記本発明の複合体製造方法により複合体を製造する工程
（Ｂ）前記複合体と前記ターゲットとを接触させる工程
（Ｃ）前記ターゲットに結合した前記複合体を回収する工程
本発明の複合体製造用キットは、前記本発明の核酸構築物を含むことを特徴とする、前記本発明の複合体製造方法に使用するためのキットである。また、本発明のスクリーニング用キットは、前記本発明の核酸構築物を含むことを特徴とする、前記本発明のスクリーニング方法に使用するためのキットである。
本発明の核酸構築物は、転写された前記アプタマーと翻訳された前記ペプチドタグとの結合を利用して、前記融合転写産物と前記融合翻訳産物との複合体を形成できる。前記複合体において、前記融合転写産物は、前記任意ペプチドのコード配列の転写産物を有し、前記融合翻訳産物は、前記任意ペプチドを有する。このため、前記複合体がターゲットに結合した場合、例えば、前記複合体における前記転写産物の同定により、前記ターゲットに結合可能な前記任意ペプチドを同定できる。このように、本発明によれば、本発明の核酸構築物に前記任意ペプチドのコード核酸を挿入して、前記複合体を形成させ、前記ターゲットと結合した複合体を回収するのみで、容易に、前記ターゲットに結合可能なペプチドならびにそのコード核酸を同定できる。したがって、本発明は、例えば、医療分野等において、タ−ゲットに対する結合分子のスクリーニングに、極めて有用なツールならびに方法といえる。
図１は、本発明の実施例における各種アプタマーのセンサーグラムである。 図２は、本発明の実施例におけるアプタマーｓｈｏｔ４７のセンサーグラムである。 図３は、本発明の実施例における各種アプタマーの推定二次構造を示す模式図である。 図４は、本発明の実施例におけるアプタマー＃４７ｓの二次構造を示す模式図である。 図５は、本発明の実施例における各種アプタマーのセンサーグラムである。 図６は、本発明の実施例における各種融合タンパク質の構造を示す模式図である。 図７は、本発明の実施例におけるアプタマーｓｈｏｔ４７の各種融合タンパク質への結合を示すグラフである。 図８は、本発明の実施例におけるアプタマーｓｈｏｔ４７の融合タンパク質への結合を示すグラフである。 図９は、本発明の実施例におけるアプタマーｓｈｏｔ４７ｓｓｓの融合タンパク質への結合を示すグラフである。 図１０は、本発明の実施例におけるアプタマーｓｈｏｔ４７の各種融合タンパク質への結合を示すブロッティング写真である。 図１１は、本発明の実施例におけるアプタマーｓｈｏｔ４７のＨｉｓ−ＭＩＦへの結合を示すブロッティング写真である。 図１２は、本発明のスクリーニング方法の一例において、各工程の概略を示す模式図である。 図１３は、本発明の実施例における、スクリーニングにより回収したＲＮＡの増幅産物の電気泳動写真である。 図１４は、本発明の実施例における、ターゲットに対するラウンド１およびラウンド２の溶菌液の結合を示すグラフである。 図１５は、本発明の実施例における、固定化抗体に結合した複合タンパク質をコードするＲＮＡを鋳型とした増幅産物の電気泳動写真である。
本発明において、以下、前記ペプチドタグに結合可能なアプタマーを「タグアプタマー」または「アプタマー」、前記アプタマーのコード核酸を「タグアプタマーコード核酸」または「アプタマーコード核酸」ともいう。前記ペプチドタグのコード核酸を「ペプチドタグコード核酸」または「タグコード核酸」ともいう。前記クローニング領域に挿入される前記任意のペプチドのコード核酸を「任意コード核酸」または「ランダムコード核酸」という。
本発明において、アンチセンス鎖は、二本鎖のうち、転写の鋳型となる鎖をいい、センス鎖は、二本鎖のうち、前記アンチセンス鎖の相補鎖であって、転写の鋳型とならない鎖をいう。転写産物は、前記アンチセンス鎖と相補的であるため、前記センス鎖と同じ配列である（Ｔは、Ｕに代わる）。「融合転写産物」は、例えば、ＲＮＡであり、具体的にはｍＲＮＡである。「融合翻訳産物」は、例えば、融合ペプチドであり、融合タンパク質の意味も含む。本発明において、「ペプチド」は、例えば、２個以上のアミノ酸残基が結合したものである。本発明において、前記ペプチドは、例えば、いわゆるポリペプチドの意味を含み、前記ポリペプチドは、いわゆる前記オリゴペプチドの意味を含む。一般的に、前記オリゴペプチドは、例えば、アミノ酸残基数１０個程度以下のペプチドである。なお、本発明において、ペプチドのアミノ酸残基数は、制限されない。本発明において、５’側は、上流側、３’側は、下流側ともいう。
＜核酸構築物＞
本発明の核酸構築物は、前述のように、前記任意コード核酸を挿入するためのクローニング領域、前記ペプチドタグコード核酸および前記ペプチドタグに結合可能なアプタマーのコード核酸を有することを特徴とする、前記任意コード核酸、前記ペプチドタグコード核酸および前記アプタマーコード核酸を含む塩基配列の融合転写産物と、前記任意ペプチドおよび前記ペプチドタグを含む融合翻訳産物との複合体を形成するための核酸構築物である。
本発明の核酸構築物は、例えば、前記クローニング領域に挿入される前記任意コード核酸、前記ペプチドタグコード核酸および前記アプタマーコード核酸を含む塩基配列の融合転写産物を転写可能であり、前記任意ペプチドおよび前記ペプチドタグを含む融合翻訳産物を翻訳可能である。
本発明の核酸構築物は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよく、後者が好ましい。本発明の説明において、センス鎖またはアンチセンス鎖という用語を使用するが、これは、本発明の核酸構築物を二本鎖に限定するものではない。これらの用語の使用は、例えば、各コード核酸の配列およびこれらの位置関係等を説明する際、転写の鋳型となるアンチセンス鎖として説明するか、その相補鎖として説明するかを明確にするためである。
本発明の核酸構築物において、前記クローニング領域と、前記ペプチドタグコード核酸と、前記アプタマーコード核酸との位置関係は、特に制限されない。前記クローニング領域と前記ペプチドタグコード核酸との位置関係は、例えば、センス鎖において、前記クローニング領域の５’側に、前記ペプチドタグコード核酸を有してもよいし、前記クローニング領域の３’側に、前記ペプチドタグコード核酸を有してもよく、好ましくは前者である。また、前記クローニング領域および前記ペプチドタグコード核酸と前記アプタマーコード核酸との位置関係は、特に制限されない。前記アプタマーコード核酸の位置は、例えば、センス鎖において、前記クローニング領域および前記ペプチドタグコード核酸の５’側でもよいし、３’側でもよく、好ましくは後者である。
具体例として、前記クローニング領域、前記ペプチドタグコード核酸および前記アプタマーコード核酸は、例えば、センス鎖において、前記ペプチドタグコード核酸、前記クローニング領域および前記アプタマーコード核酸が、５’側または３’側から、この順序で配置されていることが好ましく、より好ましくは、５’側から、この順序で配置されている。すなわち、本発明の核酸構築物は、例えば、前記クローニング領域の５’側に前記ペプチドタグコード核酸を有し、前記クローニング領域の３’側に前記アプタマーコード核酸を有することが好ましい。また、前記アプタマーコード核酸は、例えば、転写終結点または転写終結点近傍のステムループ構造に含まれることが好ましい。
本発明の核酸構築物において、前記クローニング領域は、例えば、制限酵素の認識部位を有していることが好ましい。前記制限酵素の認識部位は、何ら制限されず、種々の制限酵素の認識部位に基づいて設計できる。本発明の核酸構築物は、前記クローニング領域に前記任意コード核酸を挿入する際、例えば、１箇所のみを切断して、前記任意コード核酸を挿入してもよいし、複数箇所を切断して、前記任意コード核酸を挿入してもよい。後者の場合、前記クローニング領域は、例えば、複数箇所の切断により、その部分配列または全配列が除去されてもよい。すなわち、前記クローニング領域に前記任意コード核酸を挿入する際、例えば、複数箇所を切断して、その部分配列または全配列を除去し、前記任意コード核酸を挿入してもよい。このような場合、前記クローニング領域は、例えば、ｓｔｕｆｆｅｒ配列を有することが好ましい。前記ｓｔｕｆｆｅｒ配列の塩基配列は、特に制限されない。
本発明の核酸構築物において、前記クローニング領域に挿入される前記任意コード核酸は、何ら制限されない。前記任意コード配列は、例えば、ランダムに設計した塩基配列でもよいし、目的のアミノ酸配列をコードする塩基配列でもよい。具体的には、例えば、ｃＤＮＡライブラリー、ランダムな塩基配列を有するランダムＤＮＡライブラリー等の核酸ライブラリーがあげられる。前記任意コード核酸の長さは、特に制限されず、例えば、３の倍数の塩基長であり、下限は、例えば、１２塩基長、好ましくは２１塩基長、より好ましくは４２塩基長、さらに好ましくは６０塩基長であり、上限は、例えば、３０００塩基長、好ましくは５０１塩基長、より好ましくは１２０塩基長であり、その範囲は、例えば、２１〜３０００塩基長、好ましくは４２〜５０１塩基長、より好ましくは６０〜１２０塩基長である。前記任意コード核酸のライブラリーを作成して、これを前記核酸構築物に挿入する場合、前記任意コード核酸は、例えば、ライブラリー内で共通する共通配列と、ライブラリー内で異なるランダム配列とを有することが好ましい。前記任意コード核酸が前記ランダム配列を有する場合、前記ランダム配列の長さは、例えば、２１〜１８０塩基長であり、好ましくは３９〜１２０塩基長であり、より好ましくは６０〜９９塩基長である。
前記任意コード核酸として、ランダムな塩基配列を有する前記核酸ライブラリーを挿入する場合、前記ランダムな塩基配列は、例えば、その配列途中において、終止コドンの出現確率が低くなるように設計することが好ましい。このため、センス鎖における前記ランダムな塩基配列は、例えば、コドンの３番目に当たる塩基をＡ以外の塩基とすることが好ましく、具体的には、コドンの配列を「ＮＮＫ」とすることが好ましい。ここで、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵであり、Ｋは、Ｇ、ＴまたはＵである。さらに、終始コドンの出現を防ぐため、センス鎖における前記ランダムな塩基配列は、例えば、コドンの１番目に当たる塩基をＴ以外の塩基とすることもでき、具体的には、コドンの配列を「ＶＮＫ」とすることができる。ここで、Ｖは、Ａ、ＧまたはＣである。
本発明の核酸構築物は、例えば、使用前から、前記クローニング領域に、前記任意コード核酸が挿入されていてもよいし、使用時において、前記クローニング領域に、前記任意コード核酸を挿入してもよい。前者の場合、前記任意コード核酸は、例えば、前記任意ペプチドのアミノ酸配列に従った読み枠となるように配置されており、また、後者の場合、前記任意コード核酸は、例えば、前記任意ペプチドのアミノ酸配列に従った読み枠となるように配置される。
前記任意コード核酸は、例えば、開始コドンを含むことが好ましい。また、例えば、前記クローニング領域に前記任意コード核酸が挿入された際に、前記任意コード核酸の５’側に隣接して前記開始コドンが配置されるように、前記クローニング領域が開始コドンを有してもよい。
前記ペプチドタグコード核酸の３’側に、前記クローニング領域を有する場合、前記任意コード核酸は、例えば、終止コドンを有することが好ましい。具体例として、例えば、センス鎖において、５’側から、前記ペプチドタグコード核酸、前記クローニング領域および前記アプタマーコード核酸が、この順序で配置されている場合、前記アプタマーコード核酸の翻訳を防止できることから、前記任意コード核酸は、前述のように終止コドンを有することが好ましい。前記任意コード核酸における終止コドンの位置は、例えば、前記任意ペプチドのＣ末端アミノ酸残基に対するコドンの３’側に隣接していることが好ましい。これによって、例えば、前記任意ペプチドが翻訳された段階で、翻訳を終了できる。また、例えば、前記クローニング領域に前記任意コード核酸が挿入された際に、前記任意コード核酸の３’側に隣接して前記終止コドンが配置されるように、前記クローニング領域が終止コドンを有してもよい。
一方、前記ペプチドタグコード核酸の５’側に、前記クローニング領域を有する場合、前記任意コード核酸は、例えば、終止コドンを有さないことが好ましい。具体例として、例えば、前記センス鎖において、５’側から、前記クローニング領域、前記ペプチドタグコード核酸および前記アプタマーコード核酸が、この順序で配置されている場合、前記任意コード核酸は、前記ペプチドタグコード核酸の翻訳を効率良く行うため、終止コドンを含まないことが好ましい。
本発明において、前記ペプチドタグの種類は、特に制限されず、また、前記ペプチドタグに結合可能なアプタマーの種類も、特に制限されず、両者が結合可能であればよい。前記ペプチドタグとそれに結合可能なアプタマーに設定することで、本発明の核酸構築物により、前記融合転写産物および前記融合翻訳産物が生成された際、前記ペプチドタグと前記アプタマーとの結合により、前記複合体を形成できる。本発明において、「ペプチドタグ」は、例えば、分子の目印として、前記分子に結合または付加させるペプチドを意味する。
本発明において、「ペプチドタグに結合可能である」は、例えば、前記ペプチドタグに対する結合能を有している、または、前記ペプチドタグに対する結合活性（ペプチドタグ結合活性）を有しているということもできる。前記アプタマーと前記ペプチドタグとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用解析等により決定でき、前記決定には、例えば、ビアコアＸ(商品名、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．)等の装置を使用できる。前記アプタマーの前記ペプチドタグに対する結合活性は、例えば、前記アプタマーと前記ペプチドタグとの解離定数で表わすことができる。本発明において、前記アプタマーの解離定数は、特に制限されない。
前記アプタマーは、例えば、前記ペプチドタグに特異的に結合可能であることが好ましく、また、前記ペプチドタグに対する結合力に優れることが好ましい。前記アプタマーは、前記ペプチドタグに対する結合定数（ＫＤ）が、例えば、１×１０−９ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、より好ましくは、５×１０−１０ｍｏｌ／Ｌであり、さらに好ましくは１×１０−１０ｍｏｌ／Ｌである。
前記ペプチドタグアプタマーは、例えば、単独の前記ペプチドタグに結合する他、前記ペプチドタグを含む融合ペプチドに、前記ペプチドタグを介して結合可能である。前記融合ペプチドは、例えば、Ｎ末端側に前記ペプチドタグを含む融合ペプチド、Ｃ末端側に前記ペプチドタグを含む融合ペプチド等があげられ、さらに、他のペプチドを含んでもよい。
前記ペプチドタグは、例えば、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＧＳＴタグ、抗体Ｆｃ領域タグ等があげられ、中でもヒスチジンタグが好ましい。前記ペプチドタグの長さは、特に制限されず、例えば、６〜３３０個が好ましく、または、６〜３０個が好ましく、より好ましくは６〜１５個であり、さらに好ましくは８〜１５個である。
本発明の核酸構築物において、前記ペプチドタグコード核酸は、例えば、前記ペプチドタグのアミノ酸配列に従った読み枠となるように配置される。また、本発明の核酸構築物において、前記ペプチドタグコード核酸と前記任意コード核酸は、例えば、翻訳された際に、前記任意ペプチドに前記ペプチドタグが付加されるように配置される。翻訳された際、前記ペプチドタグは、例えば、前記任意ペプチドに、直接付加されてもよいし、ペプチド等のリンカーを介して間接的に付加されてもよい。
本発明において、以下、ヒスチジンを「Ｈｉｓ」、ヒスチジンタグを「Ｈｉｓタグ」、前記Ｈｉｓタグのコード核酸を「Ｈｉｓタグコード核酸」ともいう。また、前記Ｈｉｓタグに結合可能なアプタマーを「Ｈｉｓタグアプタマー」または「アプタマー」、前記Ｈｉｓタグアプタマーのコード核酸を「Ｈｉｓタグアプタマーコード核酸」または「アプタマーコード核酸」ともいう。
前記Ｈｉｓタグは、通常、複数個の連続するＨｉｓ、すなわち、Ｈｉｓペプチドを意味する。本発明において、前記Ｈｉｓタグは、例えば、複数個のＨｉｓが連続したＨｉｓペプチドのみからなるペプチドでもよいし、前記Ｈｉｓペプチドを含むペプチド、すなわち、前記ＨｉｓペプチドのＮ末端側およびＣ末端側の少なくとも一方に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、１個のアミノ酸残基でもよいし、２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドでもよい。本発明の核酸構築物において、前記Ｈｉｓタグコード核酸がコードする前記Ｈｉｓタグの長さは、特に制限されない。前記Ｈｉｓタグのアミノ酸残基数は、例えば、６〜３０個であり、好ましくは６〜１５個であり、より好ましくは８〜１５個である。前記ＨｉｓタグにおけるＨｉｓペプチドのヒスチジンの個数は、例えば、６〜１０個が好ましく、より好ましくは６〜８個である。
前記Ｈｉｓタグコード核酸の配列は、特に制限されず、Ｈｉｓペプチドをコードする配列（以下、「Ｈｉｓペプチドコード配列」という）を有していればよく、具体的には、Ｈｉｓのコドンを連続して有していればよい。また、前記Ｈｉｓタグは、前述のように、Ｈｉｓペプチドの他に、さらに、前記付加配列を有してもよい。このため、前記Ｈｉｓタグコード核酸は、例えば、前記付加配列をコードする配列（以下、「付加コード配列」という）を、前記Ｈｉｓペプチドコード配列の５’側および３’側の少なくとも一方に有してもよい。前記付加コード配列は、特に制限されない。
具体例として、前記Ｈｉｓペプチドコード配列の５’側における前記付加コード配列は、例えば、開始コドンを含む配列があげられる。前記開始コドンを含む配列は、例えば、前記開始コドンのみでもよいし、前記開始コドンと、３の倍数の塩基長の配列とを有してもよい。後者の場合、例えば、前記３の倍数の塩基長の配列は、例えば、１以上のアミノ酸残基をコードする配列であり、前記開始コドンの３’側に隣接している。
また、前記Ｈｉｓペプチドコード配列の３’側における前記付加コード配列は、例えば、３の倍数の塩基長の配列が好ましい。中でも、前記Ｈｉｓタグコード核酸の５’側に、前記クローニング領域を有する場合、例えば、前記３’側の前記付加コード配列は、終止コドンを有することが好ましい。具体例として、例えば、センス鎖において、５’側から、前記クローニング領域、前記Ｈｉｓタグコード核酸および前記アプタマーコード核酸が、この順序で配置されている場合、前記アプタマーコード核酸の翻訳を防止できることから、前述のように終止コドンを有することが好ましい。一方、前記Ｈｉｓタグコード核酸の３’側に、前記クローニング領域を有する場合、前記３’側の前記付加コード配列は、終止コドンを有さないことが好ましい。具体例として、例えば、前記センス鎖において、５’側から、前記Ｈｉｓタグコード核酸、前記クローニング領域および前記アプタマーコード核酸が、この順序で配置されている場合、前記３’側の前記付加コード配列は、前記クローニング領域に挿入される前記任意コード核酸の翻訳を効率良く行うため、終止コドンを含まないことが好ましい。
本発明の核酸構築物において、前記アプタマーコード核酸は、特に制限されず、前記ペプチドタグに結合可能なアプタマーをコードする核酸であればよい。前記アプタマーコード核酸がコードするアプタマーの具体例は、後述する。
本発明の核酸構築物において、前述のように、前記ペプチドタグコード核酸および前記クローニング領域に挿入される前記任意コード核酸は、それぞれ、開始コドンを有することが好ましく、例えば、５’側に位置するいずれか一方のコード核酸のみが開始コドンを有してもよい。
本発明の核酸構築物は、例えば、２つ以上のペプチドタグコード核酸を有してもよい。この場合、１つのペプチドタグコード核酸は、前述した、前記アプタマーが結合可能なペプチドタグのコード核酸である。このペプチドタグコード核酸を、以下、「主ペプチドタグコード核酸」といい、このコード核酸でコードされるペプチドタグを「主ペプチドタグ」という。前記主ペプチドタグおよび前記主ペプチドタグコード核酸は、前述のような前記ペプチドタグおよび前記ペプチドタグコード核酸があげられ、好ましくは、前記Ｈｉｓタグと前記Ｈｉｓタグコード核酸である。他方、本発明の核酸構築物において、前記主ペプチドタグコード核酸以外のペプチドタグコード核酸を、以下、「副ペプチドタグコード核酸」といい、このコード核酸でコードされるペプチドタグを「副ペプチドタグ」という。前記副ペプチドタグおよび前記副ペプチドタグコード核酸は、特に制限されず、例えば、Ｔ７ ｇｅｎｅ １０ ｌｅａｄｅｒおよびＴ７ ｇｅｎｅ １０ ｌｅａｄｅｒのコード配列があげられる。本発明の核酸構築物が、前記主ペプチドタグコード配列と前記副ペプチドタグコード配列とを有する場合、本発明の核酸構築物の転写および翻訳により、例えば、前記主ペプチドタグコード核酸、前記副ペプチドタグコード核酸、前記任意コード核酸および前記アプタマーコード核酸を含む塩基配列の融合転写物と、前記主ペプチドタグ、前記副ペプチドタグおよび前記任意ペプチドを含む融合翻訳産物との複合体が形成される。前記副ペプチドタグコード核酸の位置は、特に制限されず、例えば、センス鎖において、前記主ペプチドタグコード核酸と隣接していることが好ましく、前記主ペプチドタグコード核酸の５’側および３’側のいずれに配置されてもよく、より好ましくは、前記主ペプチドタグコード核酸の３’側である。
具体例として、本発明の核酸構築物は、例えば、前記主ペプチドタグコード核酸として前記Ｈｉｓタグコード核酸を有する他に、さらに、前記副ペプチドタグコード核酸を有してもよい。この場合、本発明の核酸構築物の転写および翻訳により、例えば、前記Ｈｉｓタグコード核酸、前記副ペプチドタグコード核酸、前記任意コード核酸および前記アプタマーコード核酸を含む塩基配列の融合転写物と、前記Ｈｉｓタグ、前記副ペプチドタグおよび前記任意ペプチドを含む融合翻訳産物との複合体が形成される。前記副ペプチドタグは、例えば、Ｔ７ ｇｅｎｅ １０ ｌｅａｄｅｒが好ましく、本発明の核酸構築物は、前記副ペプチドタグコード核酸として、Ｔ７ ｇｅｎｅ １０ ｌｅａｄｅｒのコード配列を有することが好ましい。前記副ペプチドタグコード核酸の位置は、特に制限されず、例えば、センス鎖において、前記Ｈｉｓタグコード核酸と隣接していることが好ましく、前記Ｈｉｓタグコード核酸の５’側および３’側のいずれに配置されてもよく、より好ましくは、前記Ｈｉｓタグコード核酸の３’側である。
本発明の核酸構築物は、例えば、さらに、リンカーをコードする配列（以下、「リンカーコード配列」という）を有してもよい。前記リンカーは、例えば、１個のアミノ酸残基でもよいし、２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドでもよい。前記リンカーコード配列の位置は、特に制限されず、例えば、前記ペプチドタグコード核酸と、前記クローニング領域もしくは挿入された前記任意コード核酸または前記アプタマーコード核酸との間、前記クローニング領域もしくは挿入された前記任意コード核酸と前記アプタマーコード核酸との間等があげられる。
本発明の核酸構築物を用いて転写および翻訳を行った際、前述のように、転写により生成される前記アプタマーコード核酸の転写産物（ＲＮＡアプタマー）は、その配列情報に基づいて、ペプチドに翻訳されないことが望ましい。そこで、本発明の核酸構築物は、例えば、さらに、前記アプタマーの翻訳を防止するための配列を有することが好ましい。前記アプタマーの翻訳防止用の配列は、例えば、前述のような終止コドンがあげられる。前記アプタマーの翻訳防止用の配列は、例えば、センス鎖において、前記ペプチドタグコード核酸および前記任意コード核酸の３’側に前記アプタマーコード核酸が配置されている場合、前記両者と前記アプタマーコード核酸との間に、配置されていることが好ましい。
本発明の核酸構築物は、例えば、ヌクレオシドから構成され、具体的には、ヌクレオシドを含むヌクレオチド残基から構成されることが好ましい。前記ヌクレオシドは、例えば、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシド等があげられる。本発明の核酸構築物は、例えば、リボヌクレオシドとデオキシヌクレオシドのいずれか一方から構成されてもよいし、両方を含んでもよい。本発明の核酸構築物は、例えば、デオキシリボヌクレオシドから構成されるＤＮＡであることが好ましい。
本発明の核酸構築物は、塩基として、例えば、天然塩基（非人工塩基）、非天然塩基（人工塩基）を含んでもよい。前記天然塩基は、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｕおよびこれらの修飾塩基があげられる。前記修飾は、例えば、メチル化、フルオロ化、アミノ化、チオ化等があげられる。前記非天然塩基は、例えば、２’−フルオロピリミジン、２’−Ｏ−メチルピリミジン等があげられ、具体例としては、２’−フルオロウラシル、２’−アミノウラシル、２’−Ｏ−メチルウラシル、２−チオウラシル等があげられる。本発明の核酸構築物は、核酸として、天然核酸、非天然核酸を含んでもよい。前記天然核酸は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｕおよびこれらの修飾塩基を有するヌクレオチド残基があげられる。前記修飾は、例えば、前述と同様である。前記非天然核酸は、例えば、２’−メチル化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−メチル化−シトシンヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−アミノ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−アミノ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−チオ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−チオ化−シトシンヌクレオチド残基等があげられる。本発明の核酸構築物は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等を含んでもよい。
本発明の核酸構築物は、例えば、ベクターが好ましい。前記ベクターを、以下、「発現ベクター」ともいう。前記発現ベクターは、例えば、ベクターの基本骨格に、前記クローニング領域、前記ペプチドタグコード核酸および前記アプタマーコード核酸を挿入することで構築できる。前記ベクターの基本骨格は、特に制限されず、例えば、従来のベクターが使用できる。以下、前記ベクターの基本骨格を、「基本ベクター」という。前記基本ベクターが、例えば、前記クローニング領域および前記ペプチドタグコード核酸を有している場合、所望の部位に、前記アプタマーコード核酸を挿入することで、前記発現ベクターを構築できる。前記基本骨格となる基本ベクターは、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター等があげられる。前記プラスミドベクターは、例えば、ｐＣｏｌｄシリーズ（登録商標、タカラバイオ社）、ｐＥＴシリーズ（Ｍｅｒｃｋ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社他）、ｐＲＳＥＴシリーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＢＡＤシリーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐｃＤＮＡシリーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＥＦシリーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９等の大腸菌由来プラスミドベクター；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等の枯草菌由来のプラスミドベクター；ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等の酵母由来のプラスミドベクター等があげられる。また、前記ウイルスベクターは、例えば、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等のλファージベクター；Ｍ１３ＫＥ、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ等の繊維状ファージベクター；Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔシリーズ等のＴ７ファージベクター；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等の動物ＤＮＡウイルスベクターまたはＲＮＡウイルスベクター；バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクター；植物ウイルスベクター等があげられる。これらの基本ベクターの中でも、例えば、コールドショック発現系のベクターであるｐＣｏｌｄが好ましい。このようなベクターによれば、例えば、大腸菌等の生細胞中で発現されるペプチドの不溶化を防止して、可溶化を促進できるため、発現したペプチドの回収が容易になる。
本発明の核酸構築物は、例えば、前記融合翻訳物が効率良く発現するように、Ｔ７プロモーター、コールドショック発現プロモーター（ｃｓｐＡプロモーター）、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔａｃプロモーター等のプロモーターを有することが好ましい。この他にも、例えば、ターミネーター；エンハンサー等のシスエレメント；ポリアデニル化シグナル；複製起点配列（ｏｒｉ）；選択マーカー；ＳＤ配列、ＫＯＺＡＫ配列等のリボソーム結合配列；サプレッサー配列等を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等があげられる。
本発明の核酸構築物において、前記アプタマーコード核酸の配列は、前述のように、前記ペプチドタグに結合可能な前記アプタマーをコードする核酸であればよい。以下に、前記アプタマーとして、前記Ｈｉｓタグアプタマーを例示するが、これには制限されない。
前記Ｈｉｓタグアプタマーは、前記Ｈｉｓタグに結合可能であればよく、その配列は、特に制限されない。前記Ｈｉｓタグアプタマーの解離定数は、特に制限されず、例えば、１×１０−９ｍｏｌ／Ｌ以下である。一般的に、Ｈｉｓタグに対する抗体の解離定数（Ｋｄ）は、１×１０−９ｍｏｌ／Ｌを超えることから、抗体よりも優れた結合性を有している。前記Ｈｉｓタグアプタマーの解離定数は、好ましくは、５×１０−１０ｍｏｌ／Ｌ以下であり、さらに好ましくは、１×１０−１０ｍｏｌ／Ｌ以下である。
前記Ｈｉｓタグアプタマーは、例えば、単独のＨｉｓタグに結合する他、Ｈｉｓタグを含む融合ペプチドに、前記Ｈｉｓタグを介して結合可能である。前記融合ペプチドは、例えば、Ｎ末端側にＨｉｓタグを含む融合ペプチド、Ｃ末端側にＨｉｓタグを含む融合ペプチド等があげられ、さらに、他のペプチド断片を含んでもよい。
前記Ｈｉｓタグアプタマーの具体例を以下に示す。本発明において、前記アプタマーは、これらの例には制限されない。以下に示す前記Ｈｉｓタグアプタマーは、例えば、解離定数が１×１０−９ｍｏｌ／Ｌ以下のアプタマーであり、一般的な抗体よりも、Ｈｉｓタグに対して優れた結合性を有している。以下に示す配列は、前記Ｈｉｓタグアプタマーの配列である。前記Ｈｉｓタグアプタマーのコード核酸の配列は、例えば、以下のＨｉｓタグアプタマーの配列に対して、相補的または相同的であり、且つ、ＵがＴに代わった配列である。
前記Ｈｉｓタグアプタマーは、例えば、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のいずれかの核酸があげられる。
（ａ）配列番号１７で表わされる塩基配列を含む核酸
ＧＧＵＮｎＡＹＵｍＧＧＨ （配列番号１７）
ここで、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴを表わし、Ｎｎのｎは、前記Ｎの個数であって、１〜３の整数を表わし、Ｙは、Ｕ、ＴまたはＣを表わし、Ｕｍのｍは、前記Ｕの個数であって、１〜３の整数を表わし、Ｈは、Ｕ、Ｔ、ＣまたはＡを表わす。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸
（ｃ）配列番号１８で表わされる塩基配列を含む核酸
ＧＧＣＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ （配列番号１８）
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸
前記（ａ）のＨｉｓタグアプタマーは、配列番号１７で表わされる塩基配列を含む核酸であればよい。以下、配列番号１７で表わされる塩基配列を、「結合モチーフ配列」ともいう。配列番号１７で表わされる結合モチーフ配列において、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴを表わし、Ａ、Ｇ、ＣまたはＵが好ましく、Ｎｎのｎは、前記Ｎの個数であって、１〜３の整数を表わし、Ｙは、Ｕ、ＴまたはＣを表わし、ＵまたはＣが好ましく、Ｕｍのｍは、前記Ｕの個数であって、１〜３の整数を表わし、Ｈは、Ｕ、Ｔ、ＣまたはＡを表わし、Ｕ、ＣまたはＡが好ましい。前記結合モチーフ配列は、後述する配列番号１〜１６で表わされる塩基配列等に共通して見出されるコンセンサス配列である。前記結合モチーフ配列において、ＮｎにおけるＮの個数（ｎ）は、特に制限されず、例えば、１個（Ｎ）、２個（ＮＮ）または３個（ＮＮＮ）のいずれであってもよく、Ｎは、それぞれ同じ塩基でもよいし、異なる塩基でもよい。前記結合モチーフ配列において、ＵｍにおけるＵの個数（ｍ）は、特に制限されず、例えば、１個（Ｕ）、２個（ＵＵ）または３個（ＵＵＵ）のいずれでもよい。
前記（ａ）のＨｉｓタグアプタマーは、例えば、下記（ａ１）〜（ａ４）の核酸があげられる。
前記（ａ）のＨｉｓタグアプタマーは、例えば、下記（ａ１）の核酸があげられる。
（ａ１）配列番号８９〜１０４のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
これらの配列番号で表わされる塩基配列は、それぞれ、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列を有する。前記（ａ１）のアプタマーは、例えば、これらの配列番号のうち、いずれの配列番号で表わされる塩基配列からなる核酸でもよいし、いずれの配列番号で表わされる塩基配列を含む核酸でもよい。下記表１に、配列番号８９〜１０４で表わされる塩基配列を示す。下記表において、下線部は、配列番号１７で表わされる結合モチーフ配列である。以下、下記表１における各アプタマーは、配列の前に示す名称で示すこともある（以下、同様）。
Figure 0005804520
前記（ａ１）のＨｉｓタグアプタマーは、具体例として、例えば、下記（ａ１−１）の核酸があげられる。
（ａ１−１）配列番号１〜１６のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
配列番号１〜１６で表わされる塩基配列は、それぞれ、前述した配列番号８９〜１０４で表わされる塩基配列を含む。前記（ａ１−１）のアプタマーは、例えば、配列番号１〜１６のいずれかで表わされる塩基配列からなる核酸でもよいし、いずれかの塩基配列を含む核酸でもよい。下記表２に、配列番号１〜１６で表わされる塩基配列を示す。下記表２において、下線部が、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列である。以下、本発明において、下記表２における各アプタマーは、配列の前に示す名称で示すこともある（以下、同様）。
Figure 0005804520
前記（ａ）のＨｉｓタグアプタマーは、この他に、具体例として、例えば、下記（ａ２）の核酸があげられる。
（ａ２）配列番号１０５〜１１４、配列番号１１６〜１２４および配列番号１２７〜１４６のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
これらの配列番号で表わされる塩基配列は、それぞれ、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列を有する。前記（ａ２）のアプタマーは、例えば、これらの配列番号のうち、いずれの配列番号で表わされる塩基配列からなる核酸でもよいし、いずれの配列番号で表わされる塩基配列を含む核酸でもよい。下記表３および表４に、配列番号１０５〜１１４、配列番号１１６〜１２４、配列番号１２７〜１４６で表わされる塩基配列を示す。下記表３および表４において、下線部は、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列である。以下、本発明において、下記表３および表４における各アプタマーは、配列の前に示す名称で示すこともある（以下、同様）。
Figure 0005804520
Figure 0005804520
前記（ａ２）のＨｉｓタグアプタマーは、具体例として、例えば、下記（ａ２−１）の核酸があげられる。
（ａ２−１）配列番号２６〜３５、配列番号３７〜４５、配列番号６５〜６８、配列番号１９〜２５および配列番号４８〜５６のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
配列番号２６〜３５、配列番号３７〜４５、配列番号６５〜６８、配列番号１９〜２５および配列番号４８〜５６で表わされる塩基配列は、それぞれ、前述した配列番号１０５〜１１４、配列番号１１６〜１２４および配列番号１２７〜１４６で表わされる塩基配列を含む。前記（ａ２−１）のアプタマーは、例えば、これらの配列番号のうち、いずれの配列番号で表わされる塩基配列からなる核酸でもよいし、いずれの配列番号で表わされる塩基配列を含む核酸でもよい。下記表５および表６に、配列番号２６〜３５、配列番号３７〜４５、配列番号６５〜６８、配列番号１９〜２５および配列番号４８〜５６で表わされる塩基配列を示す。下記表５および表６において、下線部が、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列である。以下、本発明において、下記表５および表６における各アプタマーは、配列の前に示す名称で示すこともある（以下、同様）。
Figure 0005804520
Figure 0005804520
前記（ａ）のＨｉｓタグアプタマーは、この他に、具体例として、例えば、下記（ａ３）の核酸があげられる。
（ａ３）配列番号１４７で表わされる塩基配列を含む核酸
ＧＧＵＮｎＡＹＵｍＧＧＨＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ （配列番号１４７）
配列番号１４７で表わされる塩基配列において、「ＧＧＵＮｎＡＹＵｍＧＧＨ」は、前述した配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列であり、前述の通りである。また、配列番号１４７で表わされる塩基配列において、「ＧＧＨＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ」は、後述する配列番号１８で表わされる塩基配列（ここで、ＨはＣ）であり、後述の通りである。配列番号１８で表わされる塩基配列は、例えば、アプタマーにおいて、ステムループ構造を形成する領域の塩基配列であり、以下、「ステムループモチーフ配列」ともいう。配列番号１４７で表わされる塩基配列において、前記結合モチーフ配列の３’末端の３塩基と、前記ステムループモチーフ配列の５’末端の３塩基とは重複している。
配列番号１４７で表わされる塩基配列は、例えば、配列番号１４８で表わされる塩基配列があげられる。
ＧＧＵＡＵＡＵＵＧＧＣＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ （配列番号１４８）
前記（ａ３）のＨｉｓタグアプタマーは、具体例として、例えば、下記（ａ３−１）の核酸があげられる。
（ａ３−１）配列番号２、１２、１４、１５および５５のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
配列番号２、１２、１４、１５および５５で表わされる塩基配列は、それぞれ、前述した配列番号１４７、具体的には、配列番号１４８で表わされる塩基配列を含む。前記（ａ３−１）のアプタマーは、例えば、これらの配列番号のうち、いずれの配列番号で表わされる塩基配列からなる核酸でもよいし、いずれの配列番号で表わされる塩基配列を含む核酸でもよい。下記表７に、配列番号２、１２、１４、１５および５５で表わされる塩基配列を示す。下記表７において、下線部が、配列番号１７で表わされる塩基配列であり、四角で囲んだ領域が、配列番号１８で表わされる塩基配列である。
Figure 0005804520
前記（ｂ）のＨｉｓタグアプタマーは、前述のように、前記（ａ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸である。「１または複数」は、特に制限されず、配列番号１７で表わされる塩基配列において、例えば、１〜５個であり、好ましくは１〜４個であり、より好ましくは１〜３個であり、さらに好ましくは１個または２個であり、特に好ましくは１個である。また、前記（ｂ）のアプタマーは、例えば、前述した、前記（ａ）のアプタマーで列挙した各配列番号で表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸でもよい。この場合、「１または複数」は、特に制限されず、前記塩基配列において、例えば、１〜１０個であり、好ましくは１〜５個であり、より好ましくは１〜４個であり、さらに好ましくは１〜３個であり、特に好ましくは１個または２個であり、最も好ましくは１個である。また、前記（ｂ）のアプタマーは、例えば、前記（ａ）のアプタマーの全長塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸でもよい。この場合、「１または複数」は、特に制限されず、前記全長配列において、例えば、１〜１０個であり、好ましくは１〜５個であり、より好ましくは１〜４個であり、さらに好ましくは１〜３個であり、特に好ましくは１個または２個であり、最も好ましくは１個である。
置換、付加または挿入に使用する塩基は、特に制限されず、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＴがあげられ、この他にも、例えば、修飾塩基、人工塩基等があげられる。前記修飾塩基は、例えば、２’−フルオロピリミジン、２’−Ｏ−メチルピリミジン等があげられる。また、塩基の置換、付加または挿入は、例えば、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを用いてもよいし、デオキシヌクレオシドまたはデオキシヌクレオチドを用いてもよく、この他に、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等を用いてもよい。
前記（ｂ）のＨｉｓタグアプタマーは、例えば、前記表３および表５に示す塩基配列を含む核酸があげられる。具体例としては、例えば、配列番号１１５（＃７３６）または配列番号３６（＃７３６）で表わされる塩基配列を含む核酸または前記塩基配列からなる核酸があげられる。配列番号３６で表わされる塩基配列は、配列番号１１５で表わされる塩基配列を含む。また、例えば、配列番号１２５（＃７００９）および配列番号４６（＃７００９）で表わされる塩基配列を含む核酸または前記塩基配列からなる核酸があげられる。配列番号４６で表わされる塩基配列は、配列番号１２５で表わされる塩基配列を含む。前記表３および表５において、これらの塩基配列の二重下線部は、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列に対応し、四角で囲んだ塩基は、配列番号１７で表わされる塩基配列と異なる置換塩基である。また、例えば、配列番号１２６（＃７０６２）および配列番号４７（＃７０６２）で表わされる塩基配列からなる核酸または前記塩基配列を含む核酸があげられる。前記表３および表５において、これらの塩基配列の二重下線部は、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列に対応し、四角で囲んだ塩基（ＵＵ）のいずれか一方が、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列のＡとは異なる置換塩基である。また、例えば、配列番号１４３（＃ＡＴ５−５）および配列番号５３（＃ＡＴ５−５）で表わされる塩基配列からなる核酸または前記塩基配列を含む核酸があげられる。
前記Ｈｉｓタグアプタマーは、例えば、下記（ｅ）または（ｆ）の核酸でもよい。
（ｅ）前記（ａ）の塩基配列において、６０％以上の相同性を有する塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸
（ｆ）前記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列またはその相補的塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸
前記（ｅ）において、前記相同性（以下、「同一性」ともいう）は、例えば、７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算することにより、算出できる。前記（ｅ）のアプタマーは、例えば、前記（ａ）のアプタマーにおける配列番号１７で表わされる塩基配列において、前記相同性を有する塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。前記（ｅ）のアプタマーは、例えば、前記（ａ）のアプタマーで列挙した前記各配列番号で表わされる塩基配列において、前記相同性を有する塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。また、前記（ｅ）のアプタマーは、例えば、前記（ａ）のアプタマーの全長塩基配列において、前記相同性を有する塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。
前記（ｆ）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、例えば、当該技術分野の当業者において、周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、「ストリンジェントな条件」は、例えば、０．７〜１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６０〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍のＳＳＣ溶液を用い、６５〜６８℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。１×ＳＳＣは、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムからなる。前記（ｆ）のアプタマーは、例えば、前記（ａ）のアプタマーにおける配列番号１７で表わされる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列またはその相補的塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。前記（ｆ）のアプタマーは、例えば、前記（ａ）のアプタマーで列挙した前記各配列番号で表わされる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列またはその相補的塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。また、前記（ｆ）のアプタマーは、例えば、前記（ａ）のアプタマーの全長塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列またはその相補的塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。
また、前記Ｈｉｓタグアプタマーは、例えば、前記（ａ）のアプタマーで列挙した各配列の部分配列を含む核酸であり、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。前記部分配列は、例えば、連続する複数の塩基からなる配列であり、好ましくは、連続する５〜４０個、より好ましくは８〜３０個、特に好ましくは１０〜１２個の塩基配列である。
つぎに、前記（ｃ）のアプタマーは、前述のように、配列番号１８で表わされる塩基配列を含む核酸である。配列番号１８で表わされる塩基配列は、前述のように、例えば、前記アプタマーにおいて、ステムループ構造を形成する領域の塩基配列である。
ＧＧＣＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ （配列番号１８）
前記（ｃ）のＨｉｓタグアプタマーは、例えば、配列番号２、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５および配列番号５５で表わされる塩基配列を含む核酸があげられる。前記（ｃ）のアプタマーは、例えば、これらの配列番号のうち、いずれの配列番号で表わされる塩基配列からなる核酸でもよいし、いずれの配列番号で表わされる塩基配列を含む核酸でもよい。これらの塩基配列は、前記表７に示す通りである。
前記（ｄ）のＨｉｓタグアプタマーは、前述のように、前記（ｃ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸である。「１または複数」は、特に制限されず、配列番号１８で表わされる塩基配列において、例えば、１〜５個であり、好ましくは１〜４個であり、より好ましくは１〜３個であり、さらに好ましくは１個または２個であり、特に好ましくは１個である。また、前記（ｄ）のアプタマーは、例えば、前述した、配列番号２、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５および配列番号５５で表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸でもよい。この場合、「１または複数」は、特に制限されず、前記塩基配列において、例えば、１〜１０個であり、好ましくは１〜５個であり、より好ましくは１〜４個であり、さらに好ましくは１〜３個であり、特に好ましくは１個または２個であり、最も好ましくは１個である。また、前記（ｄ）のアプタマーは、前記（ｃ）のアプタマーの全長塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸でもよい。この場合、「１または複数」は、特に制限されず、前記全長配列において、例えば、１〜１０個であり、好ましくは１〜５個であり、より好ましくは１〜４個であり、さらに好ましくは１〜３個であり、特に好ましくは１個または２個であり、最も好ましくは１個である。前記（ｄ）のアプタマーは、例えば、配列番号１８で表わされる塩基配列により形成されるステムループ構造と実質的に同一のステムループ構造を有することが好ましい。
置換、付加または挿入に使用する塩基は、特に制限されず、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＴがあげられ、この他にも、例えば、修飾塩基、人工塩基等があげられる。前記修飾塩基は、例えば、２’−フルオロピリミジン、２’−Ｏ−メチルピリミジン等があげられる。また、塩基の置換、付加または挿入は、例えば、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを用いてもよいし、デオキシヌクレオシドまたはデオキシヌクレオチドを用いてもよく、この他に、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等を用いてもよい。
前記（ｄ）のＨｉｓタグアプタマーは、例えば、配列番号１３、配列番号６５〜６８、配列番号１６、配列番号５４および配列番号５６で表わされる塩基配列からなる核酸または前記塩基配列を含む核酸等があげられる。これらの塩基配列を、前記表７に示す。前記表７に示す配列番号１３、配列番号６５〜６８、配列番号１６、配列番号５４および配列番号５６で表わされる塩基配列において、四角で囲んだ塩基が、配列番号１８で表わされるステムループモチーフ配列と比較して、同一部位であり、白抜きで示した塩基が、前記ステムループモチーフ配列と比較して、欠失または置換された部位である。前記表７において、欠失部位は、「−」で示す。前記（ｄ）のアプタマーは、例えば、配列番号１８で表わされるステムループモチーフ配列において、７番目および１１番目のＵならびに１５番目のＡが保存されていることが好ましい。
前記Ｈｉｓタグアプタマーは、例えば、下記（ｇ）または（ｈ）の核酸でもよい。
（ｇ）前記（ｃ）の塩基配列において、６０％以上の相同性を有する塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸
（ｈ）前記（ｃ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列またはその相補的塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸
前記（ｇ）において、前記相同性は、例えば、７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記（ｇ）のアプタマーは、例えば、前記（ｃ）のアプタマーにおける配列番号２、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５および配列番号５５で表わされる塩基配列において、前記相同性を有する塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。前記（ｇ）のアプタマーは、例えば、前記（ｃ）のアプタマーで列挙した前記各配列番号で表わされる塩基配列において、前記相同性を有する塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。また、前記（ｇ）のアプタマーは、例えば、前記（ｃ）のアプタマーの全長塩基配列において、前記相同性を有する塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。前記（ｇ）のアプタマーは、例えば、配列番号１８で表わされる塩基配列により形成されるステムループ構造と実質的に同一のステムループ構造を有することが好ましい。
前記（ｈ）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、例えば、前述の通りである。前記（ｈ）のアプタマーは、例えば、前記（ｃ）のアプタマーにおける配列番号２、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５および配列番号５５で表わされる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列またはその相補的塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。前記（ｈ）のアプタマーは、例えば、前記（ｃ）のアプタマーで列挙した前記各配列番号で表わされる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列またはその相補的塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。また、前記（ｈ）のアプタマーは、例えば、前記（ｃ）のアプタマーの全長塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列またはその相補的塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。前記（ｈ）のアプタマーは、例えば、配列番号１８で表わされる塩基配列により形成されるステムループ構造と実質的に同一のステムループ構造を有することが好ましい。
また、前記Ｈｉｓタグアプタマーは、例えば、前記（ｃ）のアプタマーで列挙した各配列の部分配列を含む核酸であり、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。前記部分配列は、例えば、連続する複数の塩基からなる配列であり、好ましくは、連続する５〜４０個、より好ましくは８〜３０個、特に好ましくは１０〜１２個の塩基配列である。
前記アプタマーの一例として、図３に、アプタマーｓｈｏｔ４７（配列番号２）、＃７０１（配列番号１）、＃７１６（配列番号３）、＃７１４（配列番号１０）および＃７４６（配列番号９）の予想される二次構造の模式図を示す。図３において、白抜きの黒四角で示された配列が、これらのコンセンサス配列であり、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列である。前記結合モチーフ配列は、図３において、ステムの折れ曲がった部分に位置する。本発明は、これには制限されない。
前記アプタマーの一例として、図４に、さらに、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７（配列番号２）、＃７０１（配列番号１）、＃７１４（配列番号１０）および＃７４６（配列番号９）の予想される二次構造の模式図を示す。図４において、文字が白抜きの黒四角で示された配列が、配列番号１７で表わされるコンセンサス配列であり、前記コンセンサス配列は、ステムの折れ曲がった部分に位置する。本発明は、これには制限されない。
前記形態は、特に制限されず、一例として、例えば、Ｙ領域、Ｘ領域およびＹ’領域を含み、５’末端から前記Ｙ領域、前記Ｘ領域および前記Ｙ’領域が連結したアプタマーがあげられる。本形態のアプタマーにおいて、前記Ｘ領域が、例えば、前記（ａ）〜（ｈ）の核酸に含まれる前記塩基配列を有することが好ましい。具体例として、前記Ｘ領域は、例えば、前記表１、表３および表４に列挙したいずれかの配列番号で表わされる塩基配列を有することが好ましい。
前記アプタマーは、例えば、前記Ｘ領域の５’側上流、すなわち前記Ｙ領域、および、前記Ｘ領域の３’側下流、すなわち前記Ｙ’領域の少なくとも一方に、プライマーがアニーリング可能なプライマー配列およびポリメラーゼが認識可能なポリメラーゼ認識配列を有することが好ましい。このように、例えば、プライマー配列およびポリメラーゼ認識配列を有することによって、例えば、プライマーおよびポリメラーゼ等を用いた逆転写反応および／または核酸増幅反応により、前記アプタマーを増幅できる。前記ポリメラーゼ認識配列は、例えば、核酸増幅で使用するポリメラーゼの種類に応じて適宜決定できる。前記ポリメラーゼの認識配列は、例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの認識配列（以下、「ＲＮＡポリメラーゼ認識配列」ともいう）が好ましく、具体例としては、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの認識配列であるＴ７プロモーター等があげられる。本形態のアプタマーがＲＮＡの場合、例えば、５’末端側の前記Ｙ領域は、前記ＲＮＡポリメラーゼ認識配列と前記プライマー配列（以下、「５’末端側プライマー配列」ともいう）とを、この順序で有することが好ましい。そして、前記Ｙ領域の３’末端側に、前記Ｘ領域が連結されていることが好ましい。さらに、前記Ｘ領域の３’末端側に、前記Ｙ’領域が連結され、前記Ｙ’領域が、前記プライマー配列（以下、「３’末端側プライマー配列」ともいう）を有することが好ましい。前記ＲＮＡにおける前記５’末端側プライマー配列は、例えば、前記ＲＮＡを鋳型として合成したＤＮＡアンチセンス鎖の３’末端に対して相補的な配列、つまり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合可能なプライマーと同様の配列であることが好ましい。また、本形態のアプタマーは、例えば、前記Ｙ領域と前記Ｘ領域、および、前記Ｘ領域と前記Ｙ’領域が、それぞれ、直接隣接してもよいし、介在配列を介して間接的に隣接してもよい。前記Ｙ領域およびＹ’領域は、特に制限されず、例えば、当業者であれば、使用するプライマーおよびポリメラーゼの種類に応じて、適宜設定できる。
前記Ｙ領域およびＹ’領域の塩基配列は、それぞれ、特に制限されず、任意に決定できる。前記Ｙ領域の一例としては、例えば、配列番号１４９で表わされる塩基配列からなる領域または前記塩基配列を含む領域があげられる。また、前記Ｙ’領域の一例としては、例えば、配列番号１５０で表わされる塩基配列からなる領域または前記塩基配列を含む領域があげられる。これらの配列は一例であって、本発明を制限するものではない。
ＧＧＧＡＣＧＣＵＣＡ ＣＧＵＡＣＧＣＵＣＡ （配列番号１４９）
ＵＣＡＧＵＧＣＣＵＧ ＧＡＣＧＵＧＣＡＧＵ （配列番号１５０）
前記Ｙ領域、前記Ｘ領域および前記Ｙ’領域を有するアプタマーの具体例は、例えば、前記表２、表５および表６に列挙したいずれかの配列番号で表わされる塩基配列からなる核酸または前記塩基配列を含む核酸があげられる。前記各表において、例えば、５’末端側の小文字の配列が、配列番号１４９で表わされる塩基配列からなる前記Ｙ領域、大文字の配列が、前記Ｘ領域、３’末端側の小文字の配列が、配列番号１５０で表わされる塩基配列からなる前記Ｙ’領域となる。
前記Ｘ領域の塩基数は、特に制限されず、例えば、１０〜６０塩基であり、好ましくは１５〜５０塩基であり、より好ましくは２０〜４０塩基である。前記Ｙ領域およびＹ’領域の塩基数は、特に制限されず、それぞれ、例えば、１０〜５０塩基であり、好ましくは１５〜４０塩基であり、より好ましくは２０〜３０塩基である。前記アプタマーの全塩基数は、特に制限されず、例えば、２０〜１６０塩基であり、好ましくは３０〜１２０塩基であり、より好ましくは４０〜１００塩基である。
また、前記アプタマーは、例えば、前述の例示以外にも、例えば、ＳＥＬＥＸ法や、以下に示す改良ＳＥＬＥＸ法（以下、「ＳＥＬＥＸ−Ｔ法」という）により、調製することもできる。なお、本発明は、以下の方法には、何ら制限されない。
前記ＳＥＬＥＸ−Ｔ法は、例えば、下記（ｉ）工程〜（ｉｖ）工程を含む。
（ｉ）ＲＮＡプールを、Ｈｉｓタグを有する物質、例えば、Ｈｉｓタグが付加された融合ペプチド（以下、「Ｈｉｓタグ−ペプチド」という）と混合する工程
（ｉｉ）前記ＲＮＡプールから、前記Ｈｉｓタグ−ペプチドと結合するＲＮＡを分離する工程
（ｉｉｉ）分離したＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写−ポリメラーゼチェーンリアクション）に供し、ＤＮＡ産物（ｃＤＮＡ）を合成する工程
（ｉｖ）前記ＤＮＡ産物からＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する工程
前記ＲＮＡプールは、例えば、ランダム配列を含むＲＮＡの集団である。前記ランダム配列は、例えば、Ｎ（Ａ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＴ）が１０〜６０個、好ましくは３０〜５０個からなる配列である。また、前記ＲＮＡプール中のＲＮＡは、例えば、前記（ｉｉｉ）ＲＴ−ＰＣＲ工程や前記（ｉｖ）ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成工程を考慮し、前記ランダム配列の両端に、所定のプライマー配列とプロモーター配列（またはこれらの相補配列）を、機能的に連結したものでもよい。
以下に、ＳＥＬＥＸ−Ｔ法の一例について説明する。まず、前記ＲＮＡプールと前記Ｈｉｓタグ−ペプチドを準備する。前記ＲＮＡプールは、例えば、核酸の自動合成装置を用いて化学的に合成してもよいし、ＤＮＡテンプレートからｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により合成することもできる。前記Ｈｉｓタグ−ペプチドは、例えば、市販品でもよいし、生物学的サンプルから単離したものでもよいし、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写・翻訳により合成したものでもよい。
次いで、前記ＲＮＡプールを前記Ｈｉｓタグ−ペプチドと混合する。この際、前記Ｈｉｓタグ−ペプチドを、担体または支持体に固定化してもよい。前記固定化は、例えば、前記両者を混合する前に行ってもよいし、前記両者を混合した後に行ってもよい。前記固定化には、例えば、ビオチン−アビジン結合、Ｎｉ２＋−Ｈｉｓタグ結合またはＣｏ２＋−Ｈｉｓタグ結合、化学架橋剤による共有結合、核酸ハイブリダイゼーション等を利用できる。前記担体または支持体は、例えば、ビーズ、チップ、レジン等があげられる。前記両者の混合条件は、例えば、前記ＲＮＡと前記Ｈｉｓタグ−ペプチドとが特異的に結合する条件であればよい。条件の具体例は、温度が、例えば、４〜４０℃、好ましくは２０〜３７℃、ｐＨが、例えば、ｐＨ５．０〜９．０、好ましくはｐＨ６．５〜７．５、塩濃度が、例えば、５０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１００〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌであり、処理時間は、例えば、１０分〜１８時間、好ましくは３０分〜２時間である。
前記両者を混合した後、形成された前記ＲＮＡと前記Ｈｉｓタグ−ペプチドとの複合体を、洗浄、溶出、精製等に供し、前記Ｈｉｓタグ−ペプチドに結合したＲＮＡを分離する。洗浄は、例えば、一般的なＳＥＬＥＸ法またはそれよりも緩和な条件で行うことができる。洗浄方法は、例えば、前記複合体を固定化した担体等を沈殿させて、上清を除去する方法、また、前記上清の除去後、前記複合体を固定化した担体等を、前記担体等の１００倍体積の洗浄用バッファーで洗浄する方法等があげられる。洗浄用バッファーによる洗浄回数は、特に制限されず、例えば、１回である。前記溶出は、例えば、所定濃度、例えば、１００〜３００ｍｍｏｌ／Ｌのイミダゾール等を溶出溶媒として用いて行うことができる。また、精製手段は、例えば、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿等があげられる。
つぎに、精製・分離したＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲに供し、ＤＮＡ産物（ｃＤＮＡ）を合成する。例えば、前記ＲＮＡを、ｄＮＴＰ Ｍｉｘ、所定のプライマー、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼ等を含む反応液に添加し、ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲに供する。ＲＴ−ＰＣＲは、例えば、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔを用いることができる。ＲＴ−ＰＣＲ条件は、例えば、５０℃で３０分、９５℃で１０分の処理を行った後、９４℃で１分、５６℃で１分、７２℃で１分の処理を１サイクルとして、合計５サイクル行い、さらに、７２℃で５分の処理があげられる。なお、前記ＳＥＬＥＸ−Ｔ法では、例えば、ＰＣＲによるバイアス（ＲＮＡプールの配列偏向）を抑制すべく、通常のＳＥＬＥＸ法に比べて、ＲＴ−ＰＣＲのサイクル数を、例えば、１〜１０サイクル、好ましくは４〜６サイクルとすることが好ましい。
次いで、合成したＤＮＡ産物をテンプレートとして、ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ（すなわち、ＲＮＡアプタマー）を合成する。ＲＮＡポリメラーゼは、特に制限されず、いずれのものも使用可能であり、適宜選択できるが、例えば、耐熱性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＳｃｒｉｐｔＭＡＸ Ｔｈｅｒｍｏ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ、東洋紡社）等があげられる。前記耐熱性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼをＲＮＡポリメラーゼとして用いた場合、例えば、ＲＮＡプール作製の際に、前記ランダム配列の一末端にＴ７プロモーターを連結しておくことで、前記耐熱性Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成できる。ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成条件は、特に制限されず、例えば、３７℃〜５０℃で、２時間〜６時間があげられる。
そして、ＲＮＡ合成後、得られたＲＮＡをＤＮａｓｅ Ｉ処理、ゲル濾過、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿等に供し、精製・分離する。このようにして、Ｈｉｓタグに結合可能なアプタマーを得ることができる。
また、得られたＲＮＡについて、前記Ｈｉｓタグ−ペプチドとの混合工程からＲＮＡ合成工程まで、反復して行ってもよい。反復回数（ラウンド数）は、特に制限されず、例えば、５〜１０回、好ましくは６〜８回である。得られたＲＮＡアプタマーとＨｉｓタグ−ペプチドとの結合能は、例えば、ＢｉａｃｏｒｅＸ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．社）を用いた表面プラズモン共鳴分子間相互作用解析等により決定できる。
本発明の核酸構築物は、例えば、ターゲットに結合可能なペプチドまたはそのコード核酸をスクリーニングするためのスクリーニング用核酸構築物であることが好ましい。
＜複合体の製造方法＞
本発明の複合体の製造方法は、前述のように、前記任意のペプチドのコード核酸を挿入するためのクローニング領域、前記ペプチドタグのコード核酸および前記ペプチドタグに結合可能なアプタマーのコード核酸を有し、前記クローニング領域に前記任意のペプチドのコード核酸が挿入された本発明の核酸構築物を発現させることを特徴とする、前記任意のペプチドのコード核酸、前記ペプチドタグのコード核酸および前記アプタマーのコード核酸を含む塩基配列の融合転写産物と、前記任意のペプチドおよび前記ペプチドタグを含む融合翻訳産物との複合体を製造する複合体製造方法である。
本発明の複合体製造方法は、前述した、前記任意コード核酸が挿入された本発明の核酸構築物を使用することが特徴であって、その他の工程や条件等は、何ら制限されない。本発明の複合体の製造方法については、以下の本発明のスクリーニング方法において、あわせて説明する。
＜スクリーニング方法＞
本発明のスクリーニング方法は、前述のように、下記（Ａ）〜（Ｃ）工程を含むことを特徴とする、ターゲットに結合可能なペプチドまたは前記ペプチドのコード核酸をスクリーニングするスクリーニング方法である。
（Ａ）本発明の複合体製造方法により複合体を製造する工程
（Ｂ）前記複合体と前記ターゲットとを接触させる工程
（Ｃ）前記ターゲットに結合した前記複合体を回収する工程
まず、前記（Ａ）工程、すなわち、本発明の複合体製造方法について説明する。前記（Ａ）工程では、前記クローニング領域に前記任意コード核酸が挿入された本発明の核酸構築物を発現させる。これによって、前記任意コード核酸、前記ペプチドタグコード核酸および前記アプタマーコード核酸を含む塩基配列の融合転写産物が転写され、さらに、前記任意ペプチドおよび前記ペプチドタグを含む融合翻訳産物が翻訳される。そして、前記アプタマーは、前記ペプチドタグに結合可能であることから、前記融合転写産物における前記アプタマーが、前記融合翻訳産物における前記ペプチドタグと結合する。これによって、前記融合転写産物と、前記融合翻訳産物との複合体が形成される。
前記複合体は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで形成させてもよいし、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形成させてもよい。前者の場合、例えば、前記核酸構築物をｉｎ ｖｉｖｏで発現させればよく、具体的には、例えば、生細胞等の細胞を使用して、前記核酸構築物の発現を行い、前記細胞内で前記複合体を形成することが好ましい。また、後者の場合、例えば、前記核酸構築物をｉｎ ｖｉｔｒｏで発現させればよく、具体的には、例えば、無細胞タンパク質合成系等を使用して、前記核酸構築物の発現を行うことが好ましい。本発明においては、例えば、操作が簡易であることから、前者が好ましい。
前記ｉｎ ｖｉｖｏの場合、前記細胞の種類は、特に制限されず、例えば、種々の宿主があげられる。前記宿主は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバシラス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属の細菌；サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等の酵母があげられる。また、前記宿主は、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞；Ｓｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞等も使用できる。前記宿主は、例えば、前記核酸構築物のベクターの種類に応じて適宜決定できる。本発明において、前記宿主とベクターとの組み合わせは、特に制限されず、例えば、タンパク質等のペプチドの発現誘導、トランスフェクションの効率等に優れるものが好ましい。具体例として、例えば、宿主は、大腸菌が好ましく、前記ベクターは、大腸菌由来のベクターが好ましく、さらに、低温での前記誘導が可能であることから、コールドショック発現系のベクターであるｐＣｏｌｄが好ましい。前記コールド発現系のベクターは、前述のように、例えば、大腸菌等の細胞中で発現されるペプチドの不溶化を防止して、可溶化を促進できるため、発現したペプチドの回収が容易である。また、ペプチドの不溶化は、例えば、ペプチドの封入体が形成されることが原因であるため、前記封入体を破壊して、ペプチドを取り出す必要がある。しかしながら、前記ベクターを用いれば、このような処理も不要であるため、例えば、前記封入体の破壊に伴う、前記複合体における前記融合転写産物と前記融合翻訳産物との結合の解離も十分に防止できる。また、前記コールドショック発現系のベクターは、例えば、低温での発現誘導により、宿主由来のタンパク質の発現を抑制できるため、前記核酸構築物由来のタンパク質を効率良く合成できる。
前記ｉｎ ｖｉｖｏでの前記核酸構築物の発現は、例えば、前記細胞に、前記核酸構築物をトランスフェクションし、トランスフェクション後の前記細胞について、タンパク質等のペプチドの発現誘導を行うことで実現できる。
前記核酸構築物のトランスフェクションの方法は、特に制限されず、例えば、前記細胞の種類、前記ベクターの種類等によって、適宜設定できる。前記トランスフェクションの方法は、例えば、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、Ｈａｎａｈａｎ法、エレクトロポレーション法、ウイルスベクター等を用いた感染導入法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、バクテリオファージ等を用いた感染導入法、超音波核酸導入法、遺伝子銃による導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等があげられる。
前記ペプチドの発現誘導の方法は、特に制限されず、例えば、前記トランスフェクション後の細胞の培養によって行うことができる。前記培養条件は、特に制限されず、前記細胞の種類、前記ベクターの種類等によって、適宜決定できる。具体例として、前記細胞が大腸菌の場合、培養条件は、例えば、培養温度２０〜４０℃、培養時間０．５〜６時間であることが好ましく、より好ましくは培養温度３０〜３７℃、培養時間１〜３時間である。使用する培地は、例えば、ＬＢ培地、ＮＺＹＭ培地、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地、ＳＯＢ培地、ＳＯＣ培地、２×ＹＴ培地等があげられる。
また、前記核酸構築物における前記基本ベクターがｐＣｏｌｄの場合、例えば、低温での発現誘導が可能である。このため、発現誘導時の培養条件は、例えば、培養温度４〜１８℃、培養時間１〜２４時間とすることが好ましく、より好ましくは培養温度１０〜１６℃、培養時間１２〜２４時間である。また、前記細胞および前記ベクターの種類に応じて、前記培養の際、適宜、発現を誘導する誘導物質を培地に添加してもよい。前記誘導物質は、特に制限されず、例えば、ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−ガラクトシド）等があげられ、培地における前記誘導物質の濃度は、例えば、０．１〜２ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．５〜１ｍｍｏｌ／Ｌである。
前記細胞には、例えば、前記核酸構築物のライブラリーを導入してもよい。すなわち、それぞれ異なる任意コード核酸を有する、複数の核酸構築物を含むライブラリーを、前記細胞に導入してもよい。具体例としては、例えば、それぞれ異なるランダムな任意コード核酸を有する、複数の核酸構築物を含むライブラリーを、前記細胞に導入してもよい。
前記（Ｂ）工程は、前記（Ａ）工程で得られた前記複合体と、ターゲットとを接触させる工程である。前記複合体は、前述のように、融合転写産物と融合翻訳産物との複合体であり、前記融合翻訳産物における任意ペプチドが前記ターゲットに結合可能であれば、例えば、前記ターゲットに、前記任意ペプチドを介して、前記複合体が結合する。
前記（Ａ）工程において、前記複合体をｉｎ ｖｉｖｏで形成させた場合、例えば、前記細胞の内部から前記複合体を回収して、前記ターゲットと接触させればよい。前記細胞からの前記複合体の回収方法は、何ら制限されず、前記細胞の種類に応じて適宜選択できる。
また、前記（Ａ）工程において、前記複合体をｉｎ ｖｉｔｒｏで形成させた場合、例えば、前記無細胞タンパク質合成系等から前記複合体を回収して、前記ターゲットと接触させればよい。
前記ターゲットの種類は、何ら制限されず、タンパク質等のペプチド、ホルモン、核酸、低分子化合物、有機化合物、無機化合物、糖類、脂質、ウイルス、細菌、細胞、生体組織等のいずれでもよい。前記ターゲットは、例えば、取扱いが容易であることから、例えば、固相に固定化された固定化ターゲットが好ましい。前記固相は、特に制限されず、例えば、ウェルプレート、マイクロプレート等のプレート、チップ、マイクロスフェア等のビーズ、ゲル、レジン、セルロース膜等のメンブレン、フィルム、試験管、マイクロチューブ、プラスチック容器、前記ターゲットを含む細胞、組織またはパラフィン固定切片、粒子等があげられる。前記ターゲットは、例えば、標的物質または標的分子ともいう。
前記固相は、例えば、不溶性であることが好ましい。前記不溶性材料は、特に制限されず、例えば、有機樹脂材料、無機材料等があげられる。前記有機樹脂材料は、例えば、天然物でもよく、合成物でもよく、具体例としては、例えば、アガロース、架橋アガロース、架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、セルロース、微結晶セルロース、架橋アガロース、ポリスチレン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ＡＢＳ樹脂、ポリフッ化ビニル、ポリアミンメチルビニルエーテル−マレイン酸共重合体、６−ナイロン、６，６−ナイロン、ラテックス等があげられる。前記無機材料は、例えば、ガラス、シリカゲル、ケイ藻土、二酸化チタン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、ケイ砂等があげられる。前記固相は、例えば、前記不溶性材料のいずれか一種類を含んでもよいし、二種類以上を含んでもよい。
前記固相が前記粒子の場合、例えば、磁性粒子が好ましい。前記固相が磁性粒子であれば、例えば、磁力によって、容易に、前記磁性粒子を回収できる。
前記ターゲットは、例えば、前記固相に、直接結合してもよいし、間接的に結合してもよい。前記ターゲットの前記固相への固定化は、例えば、物理的な結合でも化学的な結合でもよく、具体例としては、例えば、吸着、共有結合等の化学結合等があげられる。
前記複合体と前記ターゲットとの接触条件は、特に制限されず、例えば、前記ターゲットの種類に応じて適宜決定できる。前記接触条件は、例えば、温度４〜３７℃、ｐＨ４〜１０、時間１０分〜６０分が好ましく、より好ましくは、温度４〜２０℃、ｐＨ６〜９、時間１５〜３０分である。前記両者の接触は、例えば、溶媒中で行うことが好ましく、前記溶媒は、例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液等の緩衝液等が使用できる。
前記（Ｃ）工程は、前記ターゲットに結合した前記複合体を回収する工程である。前記複合体は、その融合翻訳産物における任意ペプチドを介して、前記ターゲットに結合している。したがって、前記ターゲットに結合した複合体を回収すれば、前記ターゲットに結合可能なペプチドならびに前記ペプチドのコード核酸を選択できる。前記（Ｃ）工程で回収される前記複合体における前記任意ペプチドは、前記ターゲットに結合可能と考えられることから、「候補ペプチド」ともいい、前記候補ペプチドのコード核酸は、「候補コード核酸」ともいい、前記候補ペプチドを含む前記複合体は、「候補複合体」ともいう。
前記ターゲットに結合した複合体は、例えば、前記ターゲットに結合した状態で回収してもよいし、前記ターゲットから遊離させた状態で回収してもよい。
前記ターゲットに結合した複合体の回収は、例えば、前記ターゲットの洗浄により行える。このように、前記ターゲットの洗浄によって、例えば、前記ターゲットに結合しない複合体を除去し、前記ターゲットに結合した複合体のみを回収できる。この場合、前記ターゲットは、前述のように、前記固相に固定化されていることが好ましい。前記固相を洗浄することで、例えば、前記固相に固定化された前記ターゲットに未結合の複合体が除去される。そして、前記固相上には、固定化された前記ターゲットに結合した複合体が残るため、前記ターゲットに結合した状態で前記複合体を回収できる。
前記（Ｃ）工程は、例えば、さらに、前記ターゲットから、前記ターゲットに結合した複合体を遊離させる工程を含んでもよい。前記ターゲットからの前記複合体の遊離方法は、特に制限されない。
また、前記（Ｃ）工程は、例えば、さらに、前記複合体から、前記複合体を構成する前記複合転写産物を遊離させる工程を含んでもよい。前記複合転写物は、例えば、前記ターゲットから前記複合体を回収した後に遊離させてもよいし、前記ターゲットに結合した前記複合体から遊離させてもよい。前記複合体から前記複合転写産物を遊離させる方法は、何ら制限されず、例えば、フェノール等を含む溶出液が使用できる。前記フェノールを含む溶出液は、例えば、Ｔｒｉｚｏｌ（商品名、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等が使用できる。
本発明のスクリーニング方法は、さらに、下記（Ｄ）工程を含むことが好ましい。
（Ｄ）前記（Ｃ）工程で回収した複合体における前記任意コード核酸の転写産物を鋳型として、前記任意コード核酸を合成する工程
このように、さらに、前記ターゲットに結合した前記複合体における前記任意コード核酸の転写産物を鋳型として、前記任意コード核酸を合成することによって、前記ターゲットに結合可能な任意ペプチドならびにそのコード核酸を同定できる。前記合成した前記任意コード核酸は、例えば、クローニングしてから、同定を行ってもよい。前記任意コード核酸について、例えば、塩基配列を同定すれば、間接的に、前記任意ペプチドのアミノ酸配列を同定できる。
前記（Ｄ）工程において、前記任意コード核酸の合成は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲにより行うことが好ましい。具体的には、例えば、前記任意コード核酸の転写産物を鋳型として、逆転写反応により前記任意コード核酸を合成し、さらに、合成した前記任意コード核酸を増幅することが好ましい。
前記任意コード核酸の転写産物を鋳型とする前記任意コード核酸の合成は、例えば、前記任意コード核酸の転写産物が前記複合体に含まれる状態で行ってもよいし、前記複合体から前記融合転写産物を遊離させた状態で行ってもよい。
本発明のスクリーニング方法によれば、前述のように、例えば、前記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）工程により、前記ターゲットに結合可能な任意ペプチドおよびそのコード核酸を選択でき、さらに、前記（Ｄ）工程によって、前記任意ペプチドおよびそのコード核酸を同定できる。
また、本発明のスクリーニング方法は、例えば、前記（Ｄ）工程で得られた前記任意コード核酸を、再度、本発明の核酸構築物のクローニング領域に挿入し、さらに、前記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）工程を実行することが好ましく、より好ましくは、前記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）工程を２回以上繰り返し行うことが好ましい。
前述のように、前記核酸構築物のライブラリーを前記細胞に導入すると、異なる核酸構築物が導入された複数の形質転換体が得られる。そして、前記複数の形質転換体が混在する状態で培養を行うと、前記各形質転換体由来の複合体が混在する複合体ミックスが得られる。この複合体ミックスについて、前記（Ｂ）および（Ｃ）工程を実行すると、例えば、前記ターゲットに結合する複数の複合体が回収される。そこで、前記（Ｄ）工程において、前記（Ｃ）工程で回収した複数の複合体について、例えば、それぞれの前記任意コード核酸を合成する。そして、合成した前記任意コード核酸を、再度、本発明の核酸構築物のクローニング領域に挿入し、複数の核酸構築物のライブラリーを作製し、同様に、前記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）工程を実行することが好ましい。これによって、前記ターゲットに結合する任意ペプチドならびにそのコード核酸を、さらに濃縮して、前記ターゲットへの結合能に優れる任意ペプチドならびにそのコード核酸を選択可能となる。前記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）工程を１サイクルとした場合、サイクル数は、特に制限されず、例えば、２サイクル以上が好ましい。
また、前記核酸構築物のライブラリーを前記細胞に導入した場合、例えば、複数の形質転換体を、各クローンに分離し、または、数種のクローンを含む複数のグループに分離してから、前記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）工程、さらに、前記（Ｄ）工程を行ってもよい。前記クローンまたは前記グループへの分離は、例えば、１サイクルの段階で行ってもよいし、２サイクル以降の段階で行ってもよい。
前記ターゲットに対する前記複合体の結合性の評価方法は、特に制限されない。具体例として、例えば、標識物質で標識化した標識抗ペプチドタグ抗体を使用する方法があげられる。この方法では、例えば、前記ターゲットと前記複合体とが結合したものに、前記標識ペプチドタグ抗体を接触させた後、前記標識抗ペプチドタグ抗体の検出を行う。前記標識抗ペプチドタグ抗体の検出によって、ペプチドタグの有無が確認できる。すなわち、前記ターゲットに前記複合体が結合していれば、前記複合体におけるペプチドタグに前記標識抗ペプチドタグ抗体が結合する。このため、前記標識抗ペプチドタグ抗体の検出により、間接的に、前記ターゲットに前記複合体が結合していると判断できる。一方、前記ターゲットに前記複合体が結合していなければ、前記ペプチドタグは存在しない。このため、前記標識抗ペプチドタグ抗体を検出できず、前記ターゲットに複合体は結合していないと判断できる。前記標識抗ペプチドタグ抗体の標識は、例えば、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）等があげられ、前記ＨＲＰの検出試薬は、例えば、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）等の発色試薬があげられる。また、例えば、前記ターゲットの分子量が増加しているか否かによって、複合体の結合を確認することもできる。
本発明のスクリーニング方法において、前記結合性の評価は、例えば、前記（Ｃ）工程において行ってもよいし、前記候補ペプチドおよび前記候補コード核酸を選択した後に、行ってもよい。
以下に、本発明のスクリーニング方法の一例について、図１２を用いて説明する。図１２は、ｉｎ ｖｉｖｏで複合体を形成させたスクリーニング方法の概略を示す模式図である。この例において、本発明の核酸構築物は、ベクターとし、前記ペプチドタグは、前記Ｈｉｓタグとした。
まず、図１２（Ａ）に示すように、前記Ｈｉｓタグコード核酸（Ｈ）と前記アプタマーコード核酸（Ａ）とを有するベクターに、前記任意コード核酸として、ランダムペプチドをコードするランダムＤＮＡを挿入して、組換えベクターを作製する（図１２（Ｂ））。この際、Ｈｉｓタグコード核酸（Ｈ）と、ランダムＤＮＡとは、正しい読み枠となるように配置される。
そして、前記組換えベクターを宿主に導入して、形質転換を行う（図１２（Ｃ））。続いて、得られた形質転換体を増幅させ（図１２（Ｄ））、さらに、ペプチドの発現誘導を行う（図１２（Ｅ））。図１２（Ｅ）に示すように、発現誘導によって、まず、前記組換えベクターにおける前記Ｈｉｓタグコード核酸（Ｈ）と前記ランダムＤＮＡと前記アプタマーコード核酸（Ａ）とから、それぞれの転写産物を含む融合転写産物（融合ｍＲＮＡ）が形成され、さらに、前記融合転写産物に基づいて、前記Ｈｉｓタグと前記ランダムＤＮＡがコードするランダムペプチドとを含む融合翻訳産物（融合ペプチド：Ｈｉｓ−ｐｅｐ）が形成される。そして、前記融合ｍＲＮＡにおけるＲＮＡアプタマーは、前記Ｈｉｓタグに結合可能であることから、図１２（Ｆ）に示すように、前記融合ｍＲＮＡにおけるＲＮＡアプタマーが、前記融合ペプチドにおけるＨｉｓタグに結合し、複合体が形成される。
続いて、前記形質転換体の内部から、前記複合体およびその他のタンパク質を取り出し、固相に固定化したターゲットと接触させる。その結果、前記複合体における前記ランダムペプチドが前記ターゲットに結合可能であれば、前記ランダムペプチドを介して、前記複合体が、前記固定化ターゲットに結合する（図１２（Ｇ））。ここで、前記固定化ターゲットに結合した前記ランダムペプチドには、Ｈｉｓタグが結合しており、前記Ｈｉｓタグには、前記アプタマーを介して、前記融合ｍＲＮＡが結合している。この融合ｍＲＮＡにおける前記ランダムＤＮＡの転写産物は、前記固定化ターゲットに結合したランダムペプチドをコードするｍＲＮＡである。したがって、前記固定化ターゲットに結合した前記複合体における前記融合転写産物（図１２（Ｈ））を選択することにより、前記固定化ターゲットに結合するランダムペプチドならびにそのコード核酸の情報を得ることができる。具体的には、前記複合体における前記融合転写産物を鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲを行い、ランダムＤＮＡのｍＲＮＡに基づきｃＤＮＡを合成する（図１２（Ｉ））。これによって、前記ターゲットに結合可能なペプチドのコード核酸の塩基配列、ならびに、前記ペプチドのアミノ酸配列の情報が得られる。また、ＲＴ−ＰＣＲにより得られるｃＤＮＡを、再度、前記ベクターに導入して（図１２（Ａ））、一連の処理を繰り返すことによって、前記ターゲットに結合可能なペプチドのコード核酸を、さらに選択できる。
つぎに、本発明のスクリーニング方法について、前記細胞が大腸菌であり、前記核酸構築物として、ランダムＤＮＡを有するプラスミドライブラリーを導入して、スクリーニングを行う一例をあげて説明する。なお、以下の方法は、あくまでも一例であって、本発明は、これには制限されない。
まず、プラスミドライブラリーをエレクトロポレーション等により大腸菌に導入し、振盪培養する。前記培養の培地は、例えば、アンピシリンを含むＬＢ培地があげられる。前記大腸菌の培養は、例えば、ＯＤ６００ｎｍの吸光度が０．５〜０．６になるまで行うことが好ましい。そして、前記プラスミドライブラリーのベクターが、前記コールドショック発現系のベクターの場合は、例えば、１５℃で１８時間、０．５〜１ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ存在下で、コールドショック発現誘導を行うことが好ましい。
つぎに、培養した大腸菌を遠心により集菌し、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む生理食塩水５０ｍＬに懸濁して、再度、遠心により集菌する。回収した大腸菌を、２０％スクロース、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液５ｍＬに懸濁し、１０ｍｇのリゾチームを加え、氷上で１時間インキュベートすることにより、細胞壁を溶解する。続いて、終濃度２ｍｍｏｌ／ＬになるようにＭｇ２＋を加え、遠心により、集菌する。そして、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸マグネシウムを含む生理食塩水５０ｍＬに懸濁し、再度、遠心することにより、スフェロプラストを回収する。
前記回収したスフェロプラストを、０．０５〜０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ１００、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸マグネシウム、０．１ｍｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ、０．１％ ＨＳＡまたはＢＳＡ（ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ）、プロテアーゼインヒビターを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液２．５〜５ｍＬに速やかに懸濁し、溶菌させた後、機械的剪断、またはＤＮａｓｅ Ｉにより、大腸菌のゲノムＤＮＡを細断する。そして、終濃度１５０ｍｍｏｌ／ＬになるようにＮａＣｌを加えて５分放置し、遠心により、前記複合体を含む上清を得る。前記上清は、例えば、ターゲットに対する結合の評価を行うまで、例えば、−８０℃で保管できる。
前記複合体を含む上清を、ターゲットに接触させ、４℃で１０〜３０分間インキュベートする。前記ターゲットは、前述のように、前記固相に固定化されていることが好ましい。前記ターゲットが固定化された固相は、例えば、前記ターゲットが固定されたゲル、前記ターゲットが固定されたプラスチック容器、または、前記ターゲットを含む細胞または組織があげられる。前記ターゲットが固定化された固相は、例えば、前記溶菌の際に添加したのと同じ、ＨＳＡまたはＢＳＡにより、予めブロックキングしておくことが好ましい。
続いて、前記固相を洗浄液により洗浄して、前記ターゲットに未結合の複合体を除去する。前記洗浄液は、例えば、０．０５〜０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ１００、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸マグネシウム、１００〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液があげられる。
つぎに、前記固相に固定化された前記ターゲットから、前記溶出液により、前記複合体を遊離して回収する。前記溶出液は、例えば、Ｔｒｉｚｏｌ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｉｓｏｇｅｎ（Ｗａｋｏ社）、８ｍｏｌ／Ｌ ｕｒｅａ、６ｍｏｌ／Ｌ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ、１％ ＳＤＳ等の変性剤を含む緩衝液、前記変性剤の他に、さらに、例えば、０．０５〜０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ１００、１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む緩衝液があげられる。前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液があげられる。
つぎに、得られた複合体から、融合転写産物（ＲＮＡ）を精製する。前記ＲＮＡの精製は、例えば、Ｔｒｉｚｏｌ（商品名、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等が使用できる。また、エタノール沈澱の場合は、例えば、ｔＲＮＡ、グリコーゲン、Ｅｔｈａｔｉｎｍａｔｅ（商品名、Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ社）等の沈殿補助剤を使用することが好ましい。前記ＲＮＡの精製においては、例えば、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅのＤＮａｓｅを用いて、３７℃で３０分間インキュベートしてから、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿を行うのが好ましい。
続いて、精製したＲＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡは、例えば、相補的な二本鎖を形成させるために、さらに、ＰＣＲを行うことが好ましい。任意コード核酸として複数のランダムＤＮＡを使用した場合、例えば、前記ＲＴ−ＰＣＲによって、前記任意コード核酸における５’側領域と３’側領域とが共通し、中間領域の配列が異なる複数のｃＤＮＡが合成され、ヘテロの二本鎖ｃＤＮＡが形成される場合がある。そこで、ＲＴ−ＰＣＲにより合成したｃＤＮＡについて、さらに、ＰＣＲを行うことによって、相補鎖を伸長し、相補的な二本鎖ｃＤＮＡを増幅することが好ましい。前記相補的な二本鎖ｃＤＮＡを増幅する方法は、特に制限されず、例えば、前記ＲＴ−ＰＣＲの反応液に、さらに、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを添加し、熱変性の後、アニーリング反応および伸長反応を繰り返し行うことで実行できる。前記反応液に添加するプライマーの量は、特に制限されず、例えば、各プライマーを、終濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加することが好ましい。また、熱変性は、例えば、９５℃で３０秒処理した後、９４℃で３分間処理することが好ましく、アニーリング反応は、例えば、６３．２℃で３分間、伸長反応は、例えば、７２℃で３分間であり、前記アニーリング反応と前記伸長反応を、例えば、５回繰り返すことが好ましい。このようにして、相補的な二本鎖ｃＤＮＡを得ることができる。
得られた二本鎖ｃＤＮＡは、再度、前述したプラスミド等のベクターに挿入して、前述した一連の工程を繰り返し行うことが好ましい。これによって、ターゲットに結合可能な任意プラスミドを、さらに選択できる。
また、選択効率を向上させるため、例えば、大腸菌に、前記核酸構築物を導入した後、前記大腸菌を、マルチウェルプレートに分注し、クローンの限定を行ってもよい。具体的には、前記プレート内で前記大腸菌の増殖を行い、培養した大腸菌の一部を保存した後、発現誘導と溶菌を行う。前記溶菌は、例えば、前記プレートにおいて、大腸菌を集菌した後、０．０５〜０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ１００、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、２ｍｇ／ｍＬ リゾチームおよび１ｍｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液を加えることによって行える。このようにして調製した溶菌液を、前記ターゲットを固定したプレートに添加して、前記溶菌液中の複合体と、前記ターゲットとを結合させる。その後、前記プレートを、０．０５〜０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ１００および１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄した後、前記ターゲットに結合した複合体を、前述のように、ＨＲＰ標識抗Ｈｉｓタグ抗体等を用いて検出する。これによって、前記ターゲットに結合する複合体を形成するクローンを多く含むウェルを特定する。そして、予め保存した大腸菌から、対応するウェルのものを選択して増殖させ、引き続き、一連の処理により、選択を行う。
＜キット＞
本発明の複合体製造用キットは、前記本発明の複合体製造方法に使用するためのキットであり、本発明の核酸構築物を含むことを特徴とする。本発明の複合体製造用キットは、本発明の核酸構築物を含むことが特徴であって、その他の構成等は、何ら制限されない。
本発明のスクリーニング用キットは、前記本発明のスクリーニング方法に使用するためのキットであり、本発明の核酸構築物を含むことを特徴とする。本発明のスクリーニング用キットは、本発明の核酸構築物を含むことが特徴であって、その他の構成等は、何ら制限されない。
本発明の各キットは、さらに、前記核酸構築物を導入するための生細胞を含んでもよい。また、本発明の各キットは、例えば、前記核酸構築物を生細胞に導入するための試薬、使用説明書等を含んでもよい。
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。
［実施例１］
アプタマーを作製し、その結合能を確認した。
１．材料と方法
（１）試薬
モノクローナル抗体については、抗ＧＦＰ抗体（ＪＬ−８）は、タカラバイオ社より、抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体は、ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ社より、抗ＭＩＦ抗体（ＭＡＢ２８９）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ社より購入した。ＨＲＰ−抗ＭＩＦ抗体は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．社より購入した。
（２）ＲＮＡアプタマー
前記表２および表５に示す、配列番号１〜１２および配列番号２６〜４７で表わされるＲＮＡアプタマーを合成した。前記表２および表５において、小文字で示す配列を、共通配列といい、大文字で示す配列を、ランダム配列という。
前記ＲＮＡアプタマーについて、予想された二次構造の模式図を、図３および図４に示す。図３は、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７（配列番号２）、＃７０１（配列番号１）、＃７１４（配列番号１０）、＃７１６（配列番号３）および＃７４６（配列番号９）の図であり、図４は、小型化アプタマー＃４７ｓ（配列番号１２）の図である。これらの二次構造は、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣソフトウェアによって予測した。図３および図４において、配列番号１７で表わされるコンセンサス配列を、文字が白抜きの黒四角で示した。図３および図４に示すように、これらのＲＮＡアプタマーは、ステムが折れ曲がった部分に、前記コンセンサス配列を有していると推測された。
さらに、前記各アプタマーの二次構造、特に、図３に示すｓｈｏｔ４７と＃７１４の情報に基づいて、配列番号１２〜１６、配列番号５４〜５６および配列番号６５〜６８で表わされる、小型化したＲＮＡアプタマー（以下、「小型化ＲＮＡアプタマー」という）を合成した。
（３）標的タンパク質
標的タンパク質として、図６に示す、タグ領域とマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ：Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ）とを含む融合タンパク質、および、タグ領域とＧＦＰとを含む融合タンパク質を準備した。図６は、調製した６種類の融合タンパク質Ｈｉｓ−ＭＩＦ、ＨＴＸ、ＨＴ、Ｈ、ＴＸおよびＴの構造の概略を示す図である。図６において、「Ｈｉｓ」は、６個のＨｉｓが連結したＨｉｓペプチドを含むＨｉｓタグ（１１アミノ酸残基）であり、「Ｔ」は、１０アミノ酸残基のＴ７ ｇｅｎｅ １０ ｌｅａｄｅｒを含むペプチドタグ（１１アミノ酸残基）、「Ｘｐｒｅｓｓ」は、１４アミノ酸残基のＸｐｒｅｓｓＴＭＥｐｉｔｏｐｅ（以下、「Ｘｐｒｅｓｓ ｔａｇ」ともいう）であり、これら全体をタグ領域という。また、図６において、「ＭＩＦ」は、１１５アミノ酸残基のＭＩＦであり、「ＧＦＰ」は、２４２アミノ酸残基のＧＦＰである。なお、「Ｘｐｒｅｓｓ」の配列は、Ｎ末端から９番目と１０番目のアミノ酸の間で、エンテロキナーゼにより切断可能である。図６に示す各融合タンパク質のＮ末端領域のアミノ酸配列および対応する塩基配列、具体的には、タグ領域とＭＩＦまたはＧＦＰとの塩基配列およびアミノ酸配列を、下記表８に示す。下記表８において、ＭＩＦまたはＧＦＰの塩基配列およびアミノ酸配列は、５’末端の９塩基長およびＮ末端の３アミノ酸残基のみを記載した。
Figure 0005804520
ＨｉｓタグとＭＩＦとの融合タンパク質であるＨｉｓ−ＭＩＦは、ＡＴＧｅｎ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．社(Ｇｙｅｏｎｇｇｉ−ｄｏ， Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ)より購入した。Ｈｉｓタグを有さないＭＩＦは、前記Ｈｉｓ−ＭＩＦを、エンテロキナーゼ(Ｎｏｖａｇｅｎ，ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．，社、ＵＳＡ)で処理し、前記Ｈｉｓタグ切断することによって作製した。
ＧＦＰを含む融合タンパク質（ＨＴＸ、ＨＴ、Ｈ、ＴＸおよびＴ）は、それぞれ以下の方法により調製した。まず、ＨｉｓタグのコードＤＮＡ、Ｔ７ ｇｅｎｅ １０ ｌｅａｄｅｒのコードＤＮＡおよびＸｐｒｅｓｓ ｔａｇのコードＤＮＡを有するｐＲＳＥＴ発現ベクター(インビトロゲン社、ＵＳＡ)を鋳型として、プライマーセットを用いたＰＣＲにより、前記表８に示す各融合タンパク質のタグ領域のＤＮＡ断片を増幅した。得られた各ＤＮＡ断片とＧＦＰ遺伝子(タカラバイオ社、日本)とを、ｐＣｏｌｄ ＩＶ発現ベクター(タカラバイオ社、日本)に組み込み、この組換えベクターを、さらに、大腸菌ＢＬ２１スター(ＤＥ３)(インビトロゲン社)に導入して、形質転換を行った。そして、前記ｐＣｏｌｄ ＩＶ発現ベクターの標準的な使用方法に従って、大腸菌の形質転換体を、１ｍｍｏｌ／Ｌ イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシドを含む培地において、１５℃で１８時間培養し、融合タンパク質を発現させた。培養後、菌体を遠心分離(５，０００×ｇ、１０分)により回収し、１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ１００を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）に懸濁した。この懸濁液について、凍結融解を２回繰り返して行った後、３００ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムおよび０．２ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸マグネシウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）を等量加え、遠心分離(１４，０００×ｇ、１０分)を行った。そして、得られた上清を、融合タンパク質溶液とした。前記融合タンパク質溶液における前記融合タンパク質の濃度は、段階希釈した試料および抗ＧＦＰ抗体を用いたウェスタンブロットの結果から推定した。
（４）分子間相互作用解析
各ＲＮＡアプタマーと前記融合タンパク質との分子間相互作用、すなわち、前記ＲＮＡアプタマーの前記融合タンパク質に対する結合能を、表面プラズモン共鳴により解析した。前記結合能の解析には、ＢｉａｃｏｒｅＸ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．社）を使用し、使用説明書に従って行った。具体的には、まず、ＲＮＡアプタマーの３’末端に２０塩基のポリアデニンを付加して、ポリアデニン付加ＲＮＡアプタマーを調製し、これを９５℃で５分間加熱した後、氷上で急冷した。そして、５’末端をビオチン化した２０塩基のビオチン化ポリチミンを結合させたストレプトアビジンチップ（Ｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐ ＳＡ， ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．）のフローセルに、ランニングバッファーを用いて、前記ポリアデニン付加ＲＮＡアプタマーを導入した。ここで、前記ポリアデニン付加ＲＮＡアプタマーのポリＡと、前記ビオチン化ポリチミンのポリチミンとの相補的な結合により、前記ポリアデニン付加ＲＮＡアプタマーを、前記ビオチン化ポリチミンを介して、前記チップに固定化した。前記ポリアデニン付加ＲＮＡアプタマーは、共鳴単位ＲＵ（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｕｎｉｔ；１ＲＵ＝１ｐｇ／ｍｍ２）が７００ＲＵになるまで、結合させた。続いて、所定濃度の融合タンパク質を含むＨＢＳ（Ｈｅｐｅｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）を、前記ランニングバッファーを用いて、前記チップに導入し、シグナル（ＲＵ）の測定を行った。なお、前記ランニングバッファーの組成は、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウム、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸マグネシウム、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ｐＨ７．２）とした。また、コントロールとして、前記ポリアデニン付加ＲＮＡアプタマーを固定化していない、前記ビオチン化ポリチミンを結合させた前記チップを使用し、前述と同様にして、融合タンパク質の導入ならびにシグナル測定を行った。
（５）ＲＮＡアプタマーを用いたＥＬＩＳＡ改良法
各種抗体（抗ＧＦＰ抗体、抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体または抗ＭＩＦ抗体）を９６穴プレート(Ｉｗａｋｉ、ＡＧＣテクノガラス社、日本)に吸着させ、１％のウシ血清アルブミンでブロッキングを行った。次いで、前記プレートに、５０μＬの融合タンパク質(１μｇ／ｍＬ)、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸マグネシウムおよび０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ１００を加えて、室温で３時間インキュベートし、前記プレートに前記融合タンパク質を結合させた。インキュベート後、前記プレートをＨＢＳ−Ｔで３回洗浄した。なお、コントロールは、５０μＬの融合タンパク質に代えて、５０μＬの前記ＨＢＳ−Ｔを添加して、同様に、インキュベートならびに洗浄を行った。
次いで、ＲＮＡアプタマーの３’末端に２０塩基のポリアデニン（ポリＡ）を付加して、ポリアデニン付加ＲＮＡアプタマーを調製した。前記ポリアデニン付加ＲＮＡアプタマーを変性した後、５’末端をビオチン化した２０塩基のビオチン化ポリチミン(７４０ｎｍｏｌ／Ｌ)、ｔＲＮＡ（１００μｇ／ｍＬ）およびＲＮａｓｅインヒビター(０．１６ｕｎｉｔｓ／ｍＬ)と混合してから、前記ポリアデニン付加ＲＮＡアプタマーのポリＡと、前記ビオチン化ポリチミンのポリチミンとの相補的な結合により、ビオチン標識ＲＮＡアプタマーを作製した。このビオチン標識ＲＮＡアプタマーを、前記プレートに添加し、４℃で３０分間インキュベートした。続いて、前記プレートを洗浄し、０．１μｇ／ｍＬのＨＲＰ−ストレプトアビジン(Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，社、ＵＳＡ）を添加した。さらに、前記プレートを洗浄した後、１−Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ基質(Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，社、ＵＳＡ)を加えて発色させ、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
（６）プルダウンアッセイ
前記（５）と同様にして、ビオチン標識ＲＮＡアプタマーを作製した。前記ビオチン標識ＲＮＡアプタマー（５０μＬ）と、融合タンパク質を含む溶液とを、同量で混合し、４℃で１５分間インキュベートした。これによって、前記ビオチン標識ＲＮＡアプタマーと、前記融合タンパク質を含むサンプルとを結合させた。前記融合タンパク質を含むサンプルは、Ｈｉｓ−ＭＩＦを終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加した前記ＨＢＳ−Ｔ（２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡを含む)、Ｈｉｓ−ＭＩＦを終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加したウサギの腎由来細胞株（ＲＫ−１３細胞株）の培養上清（５％ウシ胎児血清含有）、Ｈｉｓ−ＧＦＰ（ＨＴ）を発現させた大腸菌の抽出液を使用した。次いで、前記混合液に、ストレプトアビジン−セファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）５μＬを加えて、４℃で１時間インキュベートし、前記ビオチン標識ＲＮＡアプタマーを前記セファロースに結合させた。インキュベート後、前記セファロースを前記ＨＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動用のサンプルバッファーを加え、９５℃で５分間の熱処理を行うことにより、ストレプトアビジンとビオチンとの結合を介して前記セファロースに結合していた融合タンパク質を溶出した。前記溶出したタンパク質を１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供し、前記タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写した。転写後の前記膜を５％スキムミルクでブロッキングし、１μｇ／ｍＬの抗体を加えて、室温で３時間結合させた。前記抗体は、抗ＭＩＦ抗体または抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体を使用した。さらに、前記膜を洗浄した後、ＨＲＰ−抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を結合させた。そして、洗浄した後、ＥＣＬ化学発光試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、前記融合タンパク質の存在を確認した。
（７）ノースウェスタンブロッティング
段階希釈した融合タンパク質を非還元ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供し、前記（６）と同様にして、前記融合タンパク質をＰＶＤＦ膜にブロッティングした後、前記膜のブロッキングを行った。そして、前記膜に、前記（６）と同様にして準備したビオチン標識ＲＮＡアプタマーを、前記抗体（抗ＭＩＦ抗体または抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体）の代わりに添加した。さらに、ＨＲＰ−ストレプトアビジンを加えて、前記（６）と同様にして、ＥＣＬ化学発光試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、前記融合タンパク質の存在を確認した。
２．結果
（１）分子間相互作用解析
（１−１）各種ＲＮＡアプタマーのＨｉｓ−ＭＩＦへの結合
前記チップに導入する前記ＨＢＳ−ＴにおけるＨｉｓ−ＭＩＦ濃度を６００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記分子間相互作用解析により、融合タンパク質Ｈｉｓ−ＭＩＦに対するＲＮＡアプタマーの結合能を解析した。前記ＲＮＡアプタマーは、５’側および３’側に２０塩基長の共通配列を有する配列番号１〜１１、配列番号２６〜４７を使用した。これらのうち、ＲＮＡアプタマー＃７０１（配列番号１）、ｓｈｏｔ４７（配列番号２）、＃７１６（配列番号３）、＃７２７（配列番号４）、＃７０４（配列番号５）、＃７１３（配列番号６）、＃７０８（配列番号７）、＃７１８（配列番号８）、＃７４６（配列番号９）、＃７１４（配列番号１０）、＃７３３（配列番号１１）を用いた結果を、図１に示す。図１は、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて検出したシグナルのセンサーグラムであり、図１において、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、０秒〜４５秒が、前記融合タンパク質を導入した時期である。また、図１には、比較例として、前記ＲＮＡアプタマーに代えて、融合タンパク質Ｈｉｓ−ＭＩＦとは結合不可であるＲＮＡ（以下、Ｎ４０）を使用した結果を、あわせて示す。Ｎ４０は、５’側および３’側に、前記ＲＮＡアプタマーと同じ２０塩基長の共通配列を有し、前記共通配列の間に、４０塩基長のランダム配列を有するＲＮＡとした。
図１に示すように、いずれのＲＮＡアプタマーも、Ｈｉｓ−ＭＩＦに対する結合能を示し、中でも、ｓｈｏｔ４７は、極めて優れた結合能を示した。なお、図示していないが、この他、配列番号２６〜配列番号４７のＲＮＡアプタマーについても、Ｈｉｓ−ＭＩＦに対する結合能が確認できた。
（１−２）ｓｈｏｔ４７の結合能
前記チップに導入する前記ＨＢＳ−ＴにおけるＨｉｓ−ＭＩＦの濃度を、０、１９、３８、７５、１５０、３００および６００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前述と同様にして、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７（配列番号２）について、分子間相互作用解析を行った。また、比較例として、前記ＲＮＡアプタマーに代えて、前記Ｎ４０を使用した以外は、同様にして分子間相互作用解析を行った。そして、これらの結果から、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７について、結合速度定数（Ｋａ）、解離速度定数（Ｋｄ）ならびに解離定数（ＫＤ＝Ｋｄ／Ｋａ）を求めた。これらの結果を、図２に示す。図２は、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて検出したシグナルのセンサーグラムであり、縦軸および横軸は、前記図１と同様である。
図２に示すように、分子間相互作用解析により、ｓｈｏｔ４７は、結合速度定数（Ｋａ）が２．０２×１０４ｍｏｌ／Ｌ−１ｓ−１、解離速度定数（Ｋｄ）が７．６４×１０−８ｓ−１ならびに解離定数（ＫＤ）が３．７８×１０−１２ｍｏｌ／Ｌであることがわかった。ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７の結合力は、市販のＨｉｓタグに対する抗体の解離定数が１×１０−９ｍｏｌ／Ｌ（QIAexpress Detection and Assay Handbook, QIAGEN GmbH, Hilden, Germany, Oct, 2002, p．15．）であることから、極めて結合力に優れるアプタマーであることがわかった。
（１−３）小型化ＲＮＡアプタマーのＨｉｓ−ＭＩＦへの結合
前記分子間相互作用解析により、融合タンパク質Ｈｉｓ−ＭＩＦに対する小型化ＲＮＡアプタマーの結合能を解析した。前記小型化ＲＮＡアプタマーは、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７（配列番号２）を小型化した、＃４７ｓ（配列番号１２）、＃４７ｓＴ（配列番号１３）、ｓｈｏｔ４７ｓｓｓ（配列番号１４）、＃４７ｓｓｓＴ（配列番号１６）を使用した。これらの結果を、図５に示す。図５は、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて検出したシグナルのセンサーグラムであり、縦軸および横軸は、前記図１と同様である。また、図５には、小型化していないＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７を使用した結果を、あわせて示す。
図５に示すように、いずれの小型化ＲＮＡアプタマーも、Ｈｉｓ−ＭＩＦに対する結合能を示した。中でも、＃４７ｓおよびｓｈｏｔ４７ｓｓｓは、図４に示すｓｈｏｔ４７のステムループ構造を壊さないように設計された小型化アプタマーであり、ｓｈｏｔ４７と同等の効果を示した。このことから、前記ステムループ構造が、アプタマーにとって、重要な構造であると推測される。また、＃４７ｓおよびｓｈｏｔ４７ｓｓｓは、その他の小型化ＲＮＡアプタマーよりも優れた結合能を示した。その他の小型化ＲＮＡアプタマー、＃４７ｓＴ（配列番号１３）、＃４７ｓｓｓＴ（配列番号１６）は、前記表７に示すように、＃４７ｓの塩基配列の四角で囲んだ配列番号１８の配列において、７番目のＵ、１１番目のＵ、および、１５番目のＡのいずれかが欠損または置換されている。このため、配列番号１８において、ループ構造における７番目のＵ、１１番目のＵ、および、図４に示すように、ステム構造の折れ曲がり部分の１５番目のＡが保存されていることが重要であると推測される。
（２）ＥＬＩＳＡ改良法
（２−１）ｓｈｏｔ４７のＨｉｓ−ＧＦＰにおける結合部位
ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７が、融合タンパク質のどの部位に結合するかを、前述のＥＬＩＳＡ改良法により確認した。融合タンパク質は、前述した図６に示す融合タンパク質のうち、ＧＦＰを含むＨＴＸ、ＨＴ、Ｈ、ＴＸ、Ｔの５種類の融合タンパク質を使用した。また、前記ＥＬＩＳＡ改良法における前記プレートには、抗ＧＦＰ抗体を固定化した。また、比較例として、前記ｓｈｏｔ４７に代えて、前記Ｎ４０を使用した以外は、同様にして、結合を確認した。
これらの結果を、図７に示す。図７は、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７の融合タンパク質に対する結合能を示すグラフである。図７において、縦軸は、結合能（ＲＮＡアプタマーの結合）を示す４５０ｎｍの吸光度であり、３回の測定に基づく平均値±偏差（ＳＤ）を示す。横軸は、融合タンパク質の種類を示し、白抜きバーは、Ｎ４０の結果であり、黒いバーは、ｓｈｏｔ４７の結果である。また、図７内の右上の写真は、使用した融合タンパク質のウェスタンブロットの結果であり、前述のような形質転換体からの調製により、各種タンパク質が得られていることは、確認済みである。
図７のグラフに示すように、ｓｈｏｔ４７は、Ｈｉｓタグを有する融合タンパク質（ＨＴＸ、ＨＴおよびＨ）には、結合能を示したが、Ｈｉｓタグを有していない融合タンパク質（ＴＸおよびＴ）には、結合しなかった。前記融合タンパク質は、すべてＧＦＰを有することから、ｓｈｏｔ４７は、ＧＦＰに結合しているのではないことが明らかとなった。融合タンパク質のうちＨＴは、Ｘｐｒｅｓｓ（ＸｐｒｅｓｓＴＭＥｐｉｔｏｐｅ）を欠損し、Ｈは、Ｔ（Ｔ７ ｇｅｎｅ １０ ｌｅａｄｅｒ）を欠損した融合タンパク質であることから、ｓｈｏｔ４７が、Ｈｉｓタグに結合していることが明らかとなった。また、ｓｈｏｔ４７の結合能は、ＨＴＸ≒ＨＴ＞Ｈとなることから、Ｈｉｓタグの他に、Ｘｐｒｅｓｓ（ＸｐｒｅｓｓＴＭＥｐｉｔｏｐｅ）またはＴ（Ｔ７ ｇｅｎｅ １０ ｌｅａｄｅｒ）等のタグをさらに有するほど、結合能が高いことがわかった。
（２−２）ｓｈｏｔ４７のＨｉｓ−ＭＩＦへの結合
ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７の融合タンパク質Ｈｉｓ−ＭＩＦおよびＨｉｓタグを有さないＭＩＦに対する結合能を、前述のＥＬＩＳＡ改良法により確認した。前記ＥＬＩＳＡ改良法における前記プレートには、抗ＭＩＦ抗体および抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体を固定化した。比較例として、前記ｓｈｏｔ４７に代えて、前記Ｎ４０を使用した以外は、同様にして、結合を確認した。コントロールとして、Ｈｉｓ−ＭＩＦの前記プレートへの結合を確認するため、前記ＲＮＡアプタマーに代えてＨＲＰ標識抗ＭＩＦポリクローナル抗体（抗ＭＩＦｐＡｂ）を添加し、同様に基質を添加して、４５０ｎｍにおける吸光度の測定を行った。
これらの結果を、図８に示す。図８は、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７の融合タンパク質Ｈｉｓ−ＭＩＦに対する結合能を示すグラフである。図８において、縦軸は、ＲＮＡアプタマーの結合能を示す４５０ｎｍの吸光度であり、３回の測定に基づく平均値±偏差（ＳＤ）を示す。図８において、白抜きバーは、Ｎ４０の結果であり、黒いバーは、ｓｈｏｔ４７の結果であり、グレーのバーは、ＨＲＰ標識抗ＭＩＦポリクローナル抗体で検出した結果である。また、左側は、抗ＭＩＦ抗体を固定化したプレートにおけるＨｉｓ−ＭＩＦの結果であり、中央は、抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体を固定化したプレートにおけるＨｉｓ−ＭＩＦの結果であり、右側は、抗ＭＩＦ抗体を固定化したプレートにおけるＭＩＦの結果である。また、図８において、前記グラフの下に、結合形態の模式図を示す。
図８に示すように、固定化抗ＭＩＦ抗体と、Ｈｉｓタグを有さないＭＩＦとを結合させた結果、抗ＭＩＦポリクローナル抗体でＨｉｓタグを有さないＭＩＦが検出されていることから、固定化ＭＩＦ抗体にＭＩＦが結合していることは確認できたが、ｓｈｏｔ４７の結合は確認されなかった。これに対して、固定化抗ＭＩＦ抗体と、融合タンパク質Ｈｉｓ−ＭＩＦとを結合させた結果、ｓｈｏｔ４７の結合が確認された。この結果から、ｓｈｏｔ４７は、Ｈｉｓタグを認識しており、このため、Ｈｉｓタグを有する融合タンパク質であれば、ｓｈｏｔ４７による検出が可能であることがわかった。また、固定化抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体と、融合タンパク質Ｈｉｓ−ＭＩＦとを結合させた結果、前記固定化抗ＭＩＦ抗体を使用した場合と比較して、ｓｈｏｔ４７の結合が低下した。これは、固定化抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体が、ｓｈｏｔ４７がターゲットとするＨｉｓタグに結合しているため、ｓｈｏｔ４７が結合し難くなったためと考えられる。
（２−３）ｓｈｏｔ４７およびｓｈｏｔ４７ｓｓｓのＨＴへの結合
ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７およびｓｈｏｔ４７ｓｓｓについて、Ｈｉｓ（Ｈｉｓタグ）、Ｔ（Ｔ７ ｇｅｎｅ １０ ｌｅａｄｅｒ）およびＧＦＰからなる融合タンパク質ＨＴの結合能を、前述のＥＬＩＳＡ改良法により確認した。前記ＥＬＩＳＡ改良法における前記プレートには、抗ＧＦＰ抗体を固定化した。また、比較例として、前記ｓｈｏｔ４７に代えて、前記Ｎ４０を使用した以外は、同様にして、結合を確認した。
これらの結果を、図９に示す。図９は、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７およびｓｈｏｔ４７ｓｓｓの融合タンパク質ＨＴに対する結合能を示すグラフである。図９において、縦軸は、結合能（ＲＮＡアプタマーの結合）を示す４５０ｎｍの吸光度であり、３回の測定に基づく平均値±偏差（ＳＤ）を示す。横軸は、ＲＮＡアプタマーの種類を示し、白抜きバーは、Ｎ４０の結果であり、黒いバーは、ｓｈｏｔ４７の結果であり、グレーのバーは、ｓｈｏｔ４７ｓｓｓの結果である。
図９のグラフに示すように、ｓｈｏｔ４７およびｓｈｏｔ４７ｓｓｓは、ともに、Ｈｉｓタグを有する融合タンパク質ＨＴに、結合能を示した。
（３）プルダウンアッセイ
（３−１）ｓｈｏｔ４７の融合タンパク質への結合
ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７について、融合タンパク質Ｈｉｓ-ＭＩＦおよびＨｉｓ-ＧＦＰとの結合を、前述のプルダウンアッセイおよびノースウェスタンブロッティングにより確認した。また、比較例として、前記ｓｈｏｔ４７に代えて、前記Ｎ４０を使用した以外は、同様にして、結合を確認した。
プルダウンアッセイの結果を、図１０に示す。図１０は、ｓｈｏｔ４７と融合タンパク質Ｈｉｓ−ＭＩＦおよびＨＴとの結合を示すプルダウンアッセイの写真である。図１０において、「バッファー中」は、Ｈｉｓ−ＭＩＦ含有ＨＢＳ−Ｔを使用した結果であり、「５％ＦＢＳ中」は、Ｈｉｓ−ＭＩＦ含有培養上清を使用した結果であり、「細胞溶解物中」は、ＨＴを発現させた大腸菌の抽出液を使用した結果である。また、図１０のアプタマーの欄において、「Ｎ」は、ＲＮＡアプタマーＮ４０の結果であり、「４７」は、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７の結果であり、Ｈｉｓ−ＭＩＦの欄において、「＋」は、前記サンプル中の融合タンパク質がＨｉｓ−ＭＩＦであることを示し、「ＨＴ」は、前記サンプル中の融合タンパク質がＨＴであることを示し、「−」は、前記サンプル中に両融合タンパク質を含まないことを示す。図１０に示すように、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７により、融合タンパク質Ｈｉｓ−ＭＩＦおよびＨＴをプルダウンできた。また、図１０の「細胞溶解物中」の結果に示すように、大腸菌のホモジェネートからでも、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７により、ＨＴをプルダウン可能であった。
ノースウェスタンブロッティングの結果を、図１１に示す。図１１において、各レーンの数値は、Ｈｉｓ−ＭＩＦのレーンあたりの濃度（μｇ／レーン）を示す。図１１に示すように、ブロッティングした融合タンパク質についても、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７により、ノースウェスタンブロッティングによる検出が可能であった。
［実施例２］
核酸構築物として、ＨＴＭＣＳｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄベクターまたはＨＴＢＳＮｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄ ｖ３ベクターを構築し、これにランダムＤＮＡを有する任意コードＤＮＡを挿入して、プラスミドライブラリーを作製した。
（ＨＴＭＣＳｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄベクター）
ｐＣｏｌｄ（登録商標）ＩＶ（タカラバイオ社）のＮｄｅＩ−ＸｂａＩ部位に、ＨｉｓタグコードＤＮＡ、Ｔ−ｔａｇコードＤＮＡ、ｓｔｕｆｆｅｒ配列およびアプタマーコードＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡを挿入して、ＨＴＭＣＳｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄベクターを作製した。前記二本鎖ＤＮＡのセンス鎖の配列を、下記表９の配列番号５７に示す。下記配列において、ＨｉｓタグコードＤＮＡおよびＴ７ ｇｅｎｅ ｌｅａｄｅｒは、ｐＲＳＥＴ（インビトロゲン社）に由来する。下記配列において、ｓｔｕｆｆｅｒ配列は、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１（シグマ社）のマルチクローニングサイトに由来し、５’側の矢印は、ＢａｍＨＩの切断部であり、３’側の矢印は、ＮｏｔＩの切断部である。下記配列中のアプタマーコードＤＮＡは、表１に示す２５塩基長のｓｈｏｔ４７ｓｓｓ（配列番号１０２：gguauauuggcgccuucguggaaug)に対応するＤＮＡ配列を有する配列とした。
Figure 0005804520
（ＨＴＢＳＮｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄ ｖ３ベクター）
ｐＣｏｌｄ（登録商標）ＩＶ（タカラバイオ社）のＮｄｅＩ−転写終結点部位に、ＨｉｓタグコードＤＮＡ、Ｔ−ｔａｇコードＤＮＡ、ｓｔｕｆｆｅｒ配列およびアプタマーコードＤＮＡを挿入して、ＨＴＢＳＮｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄ ｖ３ベクターを作製した。前記アプタマーコードＤＮＡは、ｐＣｏｌｄ ＩＶの転写終結点配列の内部に挿入した。ｐＣｏｌｄ ＩＶの３’ＵＴＲ付近の配列を、下記配列番号５８に示す。配列番号５８の配列において、５’側の下線部が、終止コドンであり、３’側の下線部が、転写終結点配列（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）であり、小文字の「ｔｔ」の部位に、前記アプタマーコードＤＮＡを置換挿入した。
ｐＣｏｌｄ ＩＶの部分配列（配列番号５８）
５’−CATATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGATCCCCCGGGAGCGGCCGCTAATCTAGATAGGTAATCTCTGCTTAAAAGCACAGAATCTAAGATCCCTGCCAttTGGCGGGGATT−３’
前記各配列を挿入した後の前記ｐＣｏｌｄ ＩＶのセンス鎖の部分配列を、下記配列番号５９に示す。下記配列において、ＨｉｓタグコードＤＮＡおよびＴ７ ｇｅｎｅ ｌｅａｄｅｒは、ｐＲＳＥＴ（インビトロゲン社）に由来する。下記配列において、ｓｔｕｆｆｅｒ配列内の５’側の矢印は、ＢａｍＨＩの切断部であり、中央の矢印は、ＳｍａＩの切断部であり、３’側の矢印は、ＮｏｔＩの切断部である。また、下記配列において、ｐＣｏｌｄ ＩＶ由来配列内の下線部は、転写終結点配列を示す。下記配列中のアプタマーコードＤＮＡは、表１に示す２５塩基長のｓｈｏｔ４７ｓｓｓ（配列番号１０２：gguauauuggcgccuucguggaaug)に対応するＤＮＡ配列を有する配列とした。
Figure 0005804520
（プラスミドライブラリー１）
６０塩基長のランダム配列Ｎ６０を有するポリヌクレオチド（Ｌｉｂ６０Ｆ）と、前記Ｌｉｂ６０Ｆの３’領域にアニーリング可能なポリヌクレオチド（Ｌｉｂ６０Ｒ）とを合成した。これらの配列を、以下の配列番号６０および６１に示す。下記配列において、下線部が、前記両ポリヌクレオチドにおける相補的な配列である。
Ｌｉｂ６０Ｆ （配列番号６０）
CACGGATCC(N60)GGTGGAGGCGGGTCTGGGGGCGGAGGTTCAG
Ｌｉｂ６０Ｒ （配列番号６１）
CGTCTAGCGGCCGCCTGAACCTCCGCCCCCAGA
そして、１００μｍｏｌ／Ｌ Ｌｉｂ６０Ｆ １μＬと、１００μｍｏｌ／Ｌ Ｌｉｂ６０Ｒ １０μＬとを混合し、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、合計１００μＬの反応液で、伸長反応を行った。伸長反応の条件は、まず、９５℃で１５分反応させた後、６０℃で３分および７２℃で３分を１サイクルとして５回繰り返し行い、最後に、７２℃で１０分反応させた。前記反応液からエタノール沈殿により増幅産物を精製し、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで消化した後、フェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿により、精製した。これを、６０塩基長のランダム配列Ｎ６０を有する二本鎖の任意コードＤＮＡとした。そして、前記任意コードＤＮＡを、前記ＨＴＭＣＳｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄベクターに、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。前記ＨＴＭＣＳｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄベクターは、予め、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩとで消化し、アガロースゲル電気泳動およびゲル抽出により精製したものを使用した。得られたライブラリーを、プラスミドライブラリー１とした。
（プラスミドライブラリー２）
２カ所に２１塩基長のランダム配列（ＭＮＮ）７を有するポリヌクレオチド（Ｌｉｂ７８７Ｒ、Ｌｉｂ７４７ＲまたはＬｉｂ７２７Ｒ）または１カ所に４２塩基長のランダム配列（ＭＮＮ）１４を有するポリヌクレオチド（Ｌｉｂ７０７Ｒ）と、前記各ポリヌクレオチドの３’領域にアニーリング可能なポリヌクレオチド（Ｌｉｂ７０７Ｆ）とを合成した。これらの配列を、以下の配列番号６２〜６４、８１および８２に示す。下記配列において、下線部が、前記両ポリヌクレオチドにおける相補的な配列である。
Ｌｉｂ７０７Ｆ （配列番号６２）
CAAATGGGATCCGAATCTGGT
Ｌｉｂ７８７Ｒ （配列番号６３）
CTTAGCGGCCGCT(MNN)7AGAAGCTTTACCGTTAATGCTACC(MNN)7 ACCAGATTCGGATCCCATTTG
（Ｍ＝ＡまたはＣ）
Ｌｉｂ７４７Ｒ （配列番号６４）
CTTAGCGGCCGCT(MNN)7TTTACCGTTAAT(MNN)7 ACCAGATTCGGATCCCATTTG
（Ｍ＝ＡまたはＣ）
Ｌｉｂ７２７Ｒ （配列番号８１）
CTTAGCGGCCGCT(MNN)7ACCCGG(MNN)7 ACCAGATTCGGATCCCATTTG
（Ｍ＝ＡまたはＣ）
Ｌｉｂ７０７Ｒ （配列番号８２）
CTTAGCGGCCGCT(MNN)14 ACCAGATTCGGATCCCATTTG
（Ｍ＝ＡまたはＣ）
そして、１００μｍｏｌ／Ｌ Ｌｉｂ７０７Ｆ ２．５μＬと、１００μｍｏｌ／Ｌ Ｌｉｂ７８７Ｒ １μＬ、１００μｍｏｌ／Ｌ Ｌｉｂ７４７Ｒ １μＬ、１００μｍｏｌ／Ｌ Ｌｉｂ７２７Ｒ １μＬまたは１００μｍｏｌ／Ｌ Ｌｉｂ７０７Ｒ １μＬとを使用した以外は、前記プラスミドライブラリー１と同様にして、ＰＣＲを行い、増幅産物を精製した。前記増幅産物を、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩとで消化した後、フェノールクロロホルム抽出および限外濾過膜（商品名アミコンＹＭ−３０）により、精製した。これを、アンチセンス鎖に２１塩基長のランダム配列（ＭＮＮ）７を有する二本鎖の任意コードＤＮＡとした。なお、センス鎖においては、２カ所に２１塩基長のランダム配列（ＮＮＫ）７または１カ所に４２塩基長のランダム配列（ＮＮＫ）１４を有することとなる（Ｋ＝Ｇ、ＴまたはＵ）。そして、前記任意コードＤＮＡを、前記ＨＴＢＳＮｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄ ｖ３ベクターに、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。前記ＨＴＢＳＮｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄ ｖ３ベクターは、予め、ＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩおよびＳｍａＩで消化し、フェノールクロロホルム抽出および限外濾過膜（商品名アミコンＹＭ−５０）により精製したものを使用した。それぞれのプラスミドを等量ずつ混合し、これをプラスミドライブラリー２とした。
（プラスミドライブラリー３）
５’側から３カ所に、６塩基長のランダム配列（ＭＮＮ）２、１８塩基長のランダム配列（ＭＮＮ）６および２１塩基長のランダム配列（ＭＮＮ）７を有するポリヌクレオチド（ｓＦＢＧ７６２Ｒ）と、前記ｓＦＢＧ７６２Ｒの３’領域にアニーリング可能なポリヌクレオチド（ｓＦＢＧ７６２Ｆ）とを合成した。これらの配列を、以下の配列番号８３および８４に示す。下記配列において、下線部が、前記両ポリヌクレオチドにおける相補的な配列である。
ｓＦＢＧ７６２Ｆ （配列番号８３）
CAAATGGGATCCGAAATCAAA
ｓＦＢＧ７６２Ｒ （配列番号８４）
TTAGCGGCCGCTCTGATA(MNN)2GCC(MNN)6ATACAGGCCATC(MNN)7 TTTGATTTCGGATCCCATTTG
（Ｍ＝ＡまたはＣ）
そして、１００μｍｏｌ／ＬのｓＦＢＧ７６２Ｆ ２．５μＬと１００μｍｏｌ／ＬのｓＦＢＧ７６２Ｒ １μＬとを使用した以外は、前記プラスミドライブラリー１と同様にして、ＰＣＲ、増幅産物の制限酵素処理および精製を行った。これを、アンチセンス鎖の３カ所にランダム配列（ＭＮＮ）２、（ＭＮＮ）６および（ＭＮＮ）７を有する二本鎖の任意コードＤＮＡとした。なお、センス鎖においては、５’側から３カ所に、２１塩基長のランダム配列（ＮＮＫ）７、１８塩基長のランダム配列（ＮＮＫ）６および６塩基長のランダム配列（ＮＮＫ）２を有することとなる（Ｋ＝Ｇ、ＴまたはＵ）。そして、前記任意コードＤＮＡを、前記プラスミドライブラリー２と同様にして、前記ＨＴＢＳＮｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄ ｖ３ベクターに結合させた。これをプラスミドライブラリー３とした。
［実施例３］
前記実施例２で作製した各種プラスミドライブラリーを大腸菌ＤＨ５α株に導入した。この大腸菌を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地１００ｍＬで、ＯＤ６００ｎｍの吸光度が０．５〜０．６になるまで振盪培養した。その後、培養液に、さらに０．５ｍｍｏｌ／ＬになるようにＩＰＴＧを添加し、１５℃、１８時間培養を行うことにより、コールドショック発現誘導を行った。
前記培養液を遠心して、大腸菌を回収し、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む生理食塩水５０ｍＬに懸濁して、再度、遠心により集菌した。前記大腸菌を、２０％スクロースおよび１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液５ｍＬに懸濁し、１０ｍｇのリゾチームを加え、氷上で１時間培養した。さらに、終濃度２ｍｍｏｌ／ＬになるようにＭｇ２＋を加え、遠心により沈澱物を回収した後、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸マグネシウムを含む生理食塩水５０ｍＬに懸濁し、再度遠心することによって、スフェロプラストを回収した。
回収したスフェロプラストを、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ１００、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ(ＯＡｃ)２、０．１ｍｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ、０．１％ ＨＳＡ（ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ）、プロテアーゼインヒビター（商品名ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｎｉ ＥＤＴＡ ｆｒｅｅ、ロシュ社）を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液４ｍＬに速やかに懸濁し、溶菌させた後、機械的剪断により大腸菌ゲノムＤＮＡを細断した。そして、終濃度１５０ｍｍｏｌ／ＬになるようにＮａＣｌを加えて５分放置し、遠心により上清を回収した。これらの操作は、４℃で行った。
得られた溶菌液を、ターゲットとしてウサギＩｇＧまたはマウスＩｇＧを固定した固相（９６穴マイクロタイタープレート）に加え、４℃で３０分間インキュベートし、前記ターゲットに前記溶菌液に含まれる複合体を結合させた。前記固相は、予め、前記溶菌液に加えたＨＳＡにより、ブロッキングしたものを使用した。
そして、前記固相を、洗浄液で洗浄し、前記ターゲットに未結合の複合体を除去した。前記洗浄液は、０．０５〜０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ１００、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸マグネシウム、１００〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液を使用した。そして、洗浄後の前記固相に、溶出液を添加して、前記固相から、前記ターゲットに結合した複合体のＲＮＡおよびペプチドを分離して、回収した。前記溶出液は、ＲＮＡ分離試薬（商品名Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。
つぎに、前記溶出液からＲＮＡを精製し、得られたＲＮＡを、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅのＤＮａｓｅ Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で、３７℃、３０分間処理した後、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、精製した。精製ＲＮＡについて、ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（商品名、ＱＩＡＧＥＮ社）を用いたＲＴ−ＰＣＲにより、ｃＤＮＡを合成した。前記ＰＣＲにおけるプライマーのアニーリング条件は、温度６３．２℃とし、ＰＣＲのサイクル数は、２６または３４サイクルとした。また、プライマーは、下記フォワードプライマーｓｈｏｔＰＣＲＦ２と、下記リバースプライマーｓｈｏｔＰＣＲＲ２とを使用した。
ｓｈｏｔＰＣＲ Ｆ２ （配列番号８５）
GGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAA
ｓｈｏｔＰＣＲ Ｒ２ （配列番号８６）
CTGACATTCCACGAAGGCGCCAATA
さらに、サイクル数３４の各ＲＴ−ＰＣＲ反応液について、相補的二本鎖を形成させるための反応を行った。まず、前記各ＲＴ−ＰＣＲ反応液に、終濃度が１０μｍｏｌ／Ｌとなるように、前記フォワードプライマーと、前記リバースプライマーとを、それぞれ添加した。そして、９５℃で５分間熱変性を行った後、６３．２℃で３分間のアニーリング反応および７２℃で３分間の伸長反応を１サイクルとして５回繰り返し行い、最後に、７２℃で７分間反応させた。これによって、ＲＴ−ＰＣＲで合成したｃＤＮＡについて、相補的な二本鎖が形成された。
続いて、前記ＲＴ−ＰＣＲのみを行った前記ＲＴ−ＰＣＲ反応液、および、相補的二本鎖を形成させるための反応を行った前記ＲＴ−ＰＣＲ反応液から、それぞれ、エタノール沈澱により増幅産物を回収し、これらを電気泳動に供した。
前記電気泳動の結果を図１３に示す。図１３において、各レーンは、以下の通りである。
Ｍ１：分子量マーカー（１００ｂｐラダーマーカー）
Ｌａｎｅ１： マウスＩｇＧ
サイクル数２６のＲＴ−ＰＣＲ反応液
Ｌａｎｅ２： マウスＩｇＧ
サイクル数３４のＲＴ−ＰＣＲ反応液
Ｌａｎｅ３： マウスＩｇＧ
サイクル数３４のＲＴ−ＰＣＲ反応後、相補的二本鎖を形成させるための反応を施した反応液
Ｌａｎｅ４： ウサギＩｇＧ
サイクル数２６のＲＴ−ＰＣＲ反応液
Ｌａｎｅ５： ウサギＩｇＧ
サイクル数３４のＲＴ−ＰＣＲ反応液
Ｌａｎｅ６： ウサギＩｇＧ
サイクル数３４のＲＴ−ＰＣＲ反応後、相補的二本鎖を形成させるための反応を施した反応液
Ｍ２：分子量マーカー（２００ｂｐラダーマーカー）
図１３に示すように、前記ＲＴ−ＰＣＲ反応液を電気泳動した結果、実際の正しい分子サイズ（１７２ｂｐ）より高分子側に泳動された。しかしながら、前記ＲＴ−ＰＣＲ反応液に、相補的二本鎖を形成させるための反応を施すことによって、レーン３およびレーン６に示すように、１７２ｂｐにバンドが確認できた。このことから、前述のような、ヘテロの二本鎖ｃＤＮＡが減少し、相補的な二本鎖ｃＤＮＡが得られたことがわかる。
［実施例４］
前記実施例３で調製した増幅産物を、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで消化した後、フェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製した。これを、前記実施例３と同様にして、前記ＨＴＭＣＳｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄベクターに挿入した。以下、前記実施例３と同様に、大腸菌培養、コールドショック発現誘導、大腸菌の溶菌を行い、再度、溶菌液を得た。前記実施例３で得られた１回目の溶菌液を、セレクションを行っていないラウンド１の溶菌液、本例で得られた２回目の溶菌液を、セレクションを行ったラウンド２の溶菌液とした。
ターゲットとして、ウサギＩｇＧ（Ｔａｒｇｅｔ０１）またはマウスＩｇＧ（Ｔａｒｇｅｔ０２）を、吸着により９６穴マイクロタイタープレートに固定し、ＢＳＡでブロッキングした。そして、前記ラウンド１の溶菌液およびラウンド２の溶菌液を、それぞれ、各ウェルに加え、室温で２時間反応させた。次に、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、０．９％ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）（以下、「ＴＢＳＴ」という）により前記プレートを洗浄し、さらに、０．２％ ＢＳＡを含むＴＢＳＴで希釈したＨＲＰ標識抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体（Ｑｕａｇｅｎ社）を加え、室温で２時間反応させた。反応後、前記プレートを前記ＴＢＳＴで洗浄した後、１−ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ基質(Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，社、ＵＳＡ)を加えて発色させ、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。また、ブランクとして、ＢＳＡのみを固定化したプレートを使用して、同様に各溶菌液を使用して、反応および吸光度測定を行った。
Ｔａｒｇｅｔ０１を使用した結果を、実施例４−１、Ｔａｒｇｅｔ０２を使用した結果を、実施例４−２として、図１４に示す。図１４は、溶菌液のターゲットに対する結合能を示すグラフである。図１４において、縦軸は、ターゲットへのペプチドの結合を示す４５０ｎｍの吸光度を示し、値が高い程、ターゲットに結合したペプチド量が多いことを示す。図１４において、白抜きのバーは、ラウンド１の溶菌液の結果であり、黒塗りのバーは、ラウンド２の溶菌液の結果である。
図１４に示すように、ターゲットとして、ウサギＩｇＧおよびマウスＩｇＧのいずれを使用した場合も、ブランクよりも高い吸光度を示し、各ラウンドの溶菌液に、前記各ターゲットに結合するペプチドが含まれていることがわかった。
さらに、ラウンド１の溶菌液と比較して、ラウンド２の溶菌液の方が、高い吸光度を示し、前記各ターゲットに結合するペプチド量が多いことがわかった。これは、セレクションによって、ターゲットに特異的に結合するペプチドが溶菌液中で増加していることを示し、すなわち、ターゲットに特異的に結合するペプチドのクローンが濃縮されていることを意味する。
［実施例５］
前記実施例１の「１．（３）」で作製した、融合タンパク質ＨＴを発現するプラスミド（ＨＴＧＦＰ／ｐＣｏｌｄ）を準備した。前記プラスミドは、前述のように、ＨｉｓタグのコードＤＮＡ、Ｔ７ ｇｅｎｅ １０ ｌｅａｄｅｒのコードＤＮＡ、ＧＦＰのコードＤＮＡが挿入されたプラスミドであって、アプタマーのコードＤＮＡは含まない。また、ｐＣｏｌｄ ＩＶのＮｄｅＩ−ＸｂａＩ部位に、ＨｉｓタグのコードＤＮＡ、Ｔ７ ｇｅｎｅ １０ ｌｅａｄｅｒのコードＤＮＡ、ＧＦＰのコードＤＮＡ、アプタマーのコードＤＮＡを、この順序で挿入したプラスミド（ＨＴＧＦＰｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄ）を作製した。そして、これらのプラスミドを、それぞれ大腸菌ＤＨ５α株に導入し、以下、前記実施例３と同様に、大腸菌培養、コールドショック発現誘導、大腸菌の溶菌を行い、溶菌液を得た。
ターゲットとして抗ＧＦＰ抗体を、吸着により固相（９６穴マイクロタイタープレート）に固定し、ＨＳＡでブロッキングした。そして、前記各溶菌液を、それぞれ、各ウェルに加え、４℃で３０分間インキュベートし、前記ターゲットに、前記溶菌液に含まれる複合体を結合させた。以下、前記実施例３と同様に、洗浄、溶出、ＲＮＡ精製、ＲＴ−ＰＣＲを行い、ｃＤＮＡを合成した。なお、前記ＰＣＲにおけるプライマーのアニーリング条件は、温度６０℃とし、ＰＣＲのサイクル数は３０サイクルとした。また、プライマーは、下記フォワードプライマーｐＣｏｌｄＦ２と、下記リバースプライマーｐＣｏｌｄＲとを使用した。
ｐＣｏｌｄＦ２ （配列番号８７）
ＧＴＡＡＧＧＣＡＡＧＴＣＣＣＴＴＣＡＡＧＡＧ
ｐＣｏｌｄＲ （配列番号８８）
ＧＧＣＡＧＧＧＡＴＣＴＴＡＧＡＴＴＣＴＧ
そして、前記ＲＴ−ＰＣＲの反応液をサンプルとして、電気泳動に供した。陰性対照として、ＲＮＡ無添加とした以外は、同様にして、前記ＲＴ−ＰＣＲを行った反応液についても、サンプルとして電気泳動を行った。また、陽性対象として、前記抗ＧＦＰ抗体と接触させる前の溶菌液からＲＮＡを精製し、これを鋳型として、同様に、ＲＴ−ＰＣＲによってＤＮＡを合成し、前記ＲＴ−ＰＣＲの反応液についても、サンプルとして電気泳動を行った。
これらの結果を図１５に示す。図１５は、前記溶菌液に含まれるｍＲＮＡ−ＧＦＰ複合体と抗ＧＦＰ抗体との結合を示す、前記ＲＴ−ＰＣＲの反応液の電気泳動写真である。図１５において、陰性対照は、ＲＮＡ無添加でＲＴ−ＰＣＲを行った反応液の結果であり、陽性対照は、各溶菌液に含まれるＲＮＡをそのまま鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行った反応液の結果である。サンプルのうち、抗ＧＦＰ抗体（−）は、抗ＧＦＰ抗体に代えて、ＨＳＡを固定化した固相を使用した結果であり、また、抗ＧＦＰ抗体（＋）は、抗ＧＦＰ抗体を固定化した固相を使用した結果である。アプタマー（＋）は、ＨＴＧＦＰｓｈｏｔ／ｐＣｏｌｄの使用により、アプタマーが付加されたｍＲＮＡを発現させた結果であり、アプタマー（−）は、ＨＴＧＦＰ／ｐＣｏｌｄの使用によりアプタマーが付加されていないｍＲＮＡを発現させた結果である。
図１５のレーン４に示すように、アプタマーが付加されたｍＲＮＡを発現させた場合、ＨＳＡを固定化した固相では、非特異的に吸着したわずかな量のｍＲＮＡ−ＧＦＰ複合体しか回収されなかった。また、レーン６に示すように、アプタマーが付加されていないｍＲＮＡを発現させた場合、ｍＲＮＡ−ＧＦＰ複合体が形成されず、抗ＧＦＰ抗体を固定化した固相でも、非特異的に吸着したわずかな量のｍＲＮＡしか回収されなかった。これに対して、レーン５に示すように、アプタマーが付加されたｍＲＮＡを発現させ、且つ、抗ＧＦＰ抗体を固定化した固相を使用した場合、抗ＧＦＰ抗体に特異的に吸着したｍＲＮＡ−ＧＦＰ複合体を、より多く回収できた。これは、アプタマーのコード核酸の転写産物を含むｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡから翻訳されたＨｉｓタグ−ＧＦＰとが複合体を形成したこと、前記複合体が、固相に固定化された抗ＧＦＰ抗体に結合したこと、前記抗ＧＦＰ抗体に結合したペプチドのコード核酸のＲＮＡが特異的に回収されたことを示している。このため、回収した前記ＲＮＡまたはそれに対応するＤＮＡの配列を、シークエンス等の従来技術により解析することで、前記抗ＧＦＰ抗体に結合する候補ペプチドのコード核酸配列および前記候補ペプチドのアミノ酸配列を解析できることは、明らかである。
このように、本発明によれば、前記ペプチドタグとそれに対するアプタマーとの結合を利用することで、ターゲットに結合する候補ペプチドのコード核酸情報を容易に解析でき、その解析結果から、前記候補ペプチドのアミノ酸配列を決定できる。このため、本発明によれば、例えば、免疫法等による抗体の取得のように、多大な時間および労力を費やすことなく、候補ペプチドの選択を行うことができる。
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
この出願は、２０１０年４月１日に出願された日本出願特願２０１０−０８５５４５を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
本発明の核酸構築物によれば、転写されたアプタマーと翻訳された前記ペプチドタグとの結合を利用して、前記融合転写産物と前記融合翻訳産物との複合体を形成できる。前記複合体において、前記融合翻訳産物は、任意ペプチドを有し、前記融合転写産物は、前記任意ペプチドの転写産物を有する。このため、前記複合体がターゲットに結合した場合、例えば、前記複合体における前記転写産物の同定により、前記ターゲットに結合可能な前記任意ペプチドを同定できる。このように、本発明によれば、本発明の核酸構築物に前記任意ペプチドのコード核酸を挿入して、前記複合体を形成させ、前記ターゲットと結合した複合体を回収するのみで、容易に、前記ターゲットに結合可能なペプチドならびにそのコード核酸を同定できる。したがって、本発明は、例えば、医療分野等において、タ−ゲットに対する結合分子のスクリーニングに、極めて有用なツールならびに方法であるといえる。

Claims (35)

  1. 任意のペプチドのコード核酸を挿入するためのクローニング領域、ヒスチジンタグのコード核酸および前記ヒスチジンタグに結合可能なアプタマーのコード核酸を有することを特徴とする、
    前記任意のペプチドのコード核酸、前記ヒスチジンタグのコード核酸および前記アプタマーのコード核酸を含む塩基配列の融合転写産物と、前記任意のペプチドおよび前記ヒスチジンタグを含む融合翻訳産物との複合体を形成するための核酸構築物。
  2. 前記クローニング領域に挿入される前記任意のペプチドのコード核酸、前記ヒスチジンタグのコード核酸および前記アプタマーのコード核酸を含む塩基配列の融合転写産物を転写可能であり、
    前記任意のペプチドおよび前記ヒスチジンタグを含む融合翻訳産物を翻訳可能である、請求項１記載の核酸構築物。
  3. 前記核酸構築物が、ベクターである、請求項１記載の核酸構築物。
  4. 前記ベクターが、コールドショック発現系のベクターである、請求項３記載の核酸構築物。
  5. 前記ヒスチジンタグのコード核酸および前記アプタマーのコード核酸が、ＤＮＡである、請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  6. 前記アプタマーが、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のいずれかの核酸である、請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸構築物。
    （ａ）配列番号１７で表わされる塩基配列を含む核酸
    ＧＧＵＮｎＡＹＵｍＧＧＨ （配列番号１７）
    ここで、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴを表わし、Ｎｎのｎは、前記Ｎの個数であって、１〜３の整数を表わし、Ｙは、Ｕ、ＴまたはＣを表わし、Ｕｍのｍは、前記Ｕの個数であって、１〜３の整数を表わし、Ｈは、Ｕ、Ｔ、ＣまたはＡを表わす。
    （ｂ）前記（ａ）の塩基配列において、１〜５個の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記ヒスチジンタグに結合可能である核酸
    （ｃ）配列番号１８で表わされる塩基配列を含む核酸
    ＧＧＣＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ （配列番号１８）
    （ｄ）前記（ｃ）の塩基配列において、１〜５個の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記ヒスチジンタグに結合可能である核酸
  7. 前記（ａ）の核酸が、
    配列番号８９〜１０４のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸、
    配列番号１〜１６のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸、
    配列番号１０５〜１１４、配列番号１１６〜１２４および配列番号１２７〜１４６のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸、
    配列番号２６〜３５、配列番号３７〜４５、配列番号６５〜６８、配列番号１９〜２５および配列番号４８〜５６のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸、または、
    配列番号２、１２、１４、１５および５５のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
    である、請求項６記載の核酸構築物。
  8. 前記（ａ）の核酸が、配列番号１４７で表わされる塩基配列を含む核酸である、請求項６記載の核酸構築物。
    ＧＧＵＮｎＡＹＵｍＧＧＨＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ （配列番号１４７）
    ここで、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴを表わし、Ｎｎのｎは、前記Ｎの個数であって、１〜３の整数を表わし、Ｙは、Ｕ、ＴまたはＣを表わし、Ｕｍのｍは、前記Ｕの個数であって、１〜３の整数を表わし、Ｈは、Ｕ、Ｔ、ＣまたはＡを表わす。
  9. 配列番号１４７で表わされる塩基配列が、配列番号１４８で表わされる塩基配列である、請求項８記載の核酸構築物。
    ＧＧＵＡＵＡＵＵＧＧＣＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ （配列番号１４８）
  10. 前記（ｃ）の核酸が、
    配列番号２、１２、１４、１５および５５のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸である、請求項６記載の核酸構築物。
  11. 前記ヒスチジンタグにおけるヒスチジン個数が、６〜１０個である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  12. 前記クローニング領域の５’側に、前記ヒスチジンタグのコード核酸を有し、前記クローニング領域の３’側に、前記アプタマーのコード核酸を有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  13. さらに、Ｔ７ ｇｅｎｅ ｌｅａｄｅｒのコード核酸を有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  14. さらに、前記クローニング領域に前記任意のペプチドのコード核酸が挿入されている、請求項１から１３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  15. ターゲットに結合可能なペプチドまたはそのコード核酸をスクリーニングするためのスクリーニング用核酸構築物である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  16. 任意のペプチドのコード核酸を挿入するためのクローニング領域、ヒスチジンタグのコード核酸および前記ヒスチジンタグに結合可能なアプタマーのコード核酸を有し、前記クローニング領域に前記任意のペプチドのコード核酸が挿入された請求項１から１５のいずれか一項に記載の核酸構築物を発現させることを特徴とする、
    前記任意のペプチドのコード核酸、前記ヒスチジンタグのコード核酸および前記アプタマーのコード核酸を含む塩基配列の融合転写産物と、前記任意のペプチドおよび前記ヒスチジンタグを含む融合翻訳産物との複合体を製造する複合体製造方法であって、ただし、ヒトの生体を使用した製造方法を除く製造方法。
  17. 前記複合体を、ｉｎ ｖｉｖｏで形成させる、請求項１６記載の複合体製造方法。
  18. 前記核酸構築物を、ｉｎ ｖｉｖｏで発現させる、請求項１６または１７記載の複合体製造方法。
  19. 前記核酸構築物を、生細胞内で発現させる、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の複合体製造方法。
  20. 前記生細胞が、大腸菌である、請求項１９記載の複合体製造方法。
  21. 前記複合体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形成させる、請求項１６記載の複合体製造方法。
  22. 前記核酸構築物を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで発現させる、請求項１６または２１に記載の複合体製造方法。
  23. 前記核酸構築物が、ベクターである、請求項１６から２２のいずれか一項に記載の複合体製造方法。
  24. 下記（Ａ）〜（Ｃ）工程を含むことを特徴とする、ターゲットに結合可能なペプチドまたは前記ペプチドのコード核酸をスクリーニングするスクリーニング方法。
    （Ａ）請求項１６から２３のいずれか一項に記載の複合体製造方法により複合体を製造する工程
    （Ｂ）前記複合体と前記ターゲットとを接触させる工程
    （Ｃ）前記ターゲットに結合した前記複合体を回収する工程
  25. 前記（Ｂ）工程において、前記ターゲットが、固相に固定化されたターゲットである、請求項２４記載のスクリーニング方法。
  26. さらに、下記（Ｄ）工程を含む、請求項２４または２５記載のスクリーニング方法。
    （Ｄ）前記（Ｃ）工程で回収した複合体における前記任意のペプチドのコード核酸の転写産物を鋳型として、前記任意のペプチドのコード核酸を合成する工程
  27. 前記（Ｄ）工程において、逆転写−ポリメラーゼチェーンリアクションにより、前記任意のペプチドのコード核酸を合成する、請求項２６記載のスクリーニング方法。
  28. 前記（Ｄ）工程で得られた前記任意のペプチドのコード核酸を、請求項１から１５のいずれか一項に記載の核酸構築物の前記クローニング領域に挿入し、再度、前記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）工程を行う、請求項２６または２７記載のスクリーニング方法。
  29. 前記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）工程を、繰り返し行う、請求項２８記載のスクリーニング方法。
  30. さらに、前記（Ｄ）工程で得られた前記任意のペプチドのコード核酸の塩基配列を決定する、請求項２６から２９のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
  31. 前記任意のペプチドのコード核酸の塩基配列から、前記ターゲットに結合可能な前記任意のペプチドのアミノ酸配列を決定する、請求項３０記載のスクリーニング方法。
  32. 請求項１から１５のいずれか一項に記載の核酸構築物を含むことを特徴とする、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の複合体製造方法に使用するための複合体製造用キット。
  33. さらに、前記核酸構築物を導入するための生細胞を含む、請求項３２記載の複合体製造用キット。
  34. 請求項１から１５のいずれか一項に記載の核酸構築物を含むことを特徴とする、請求項２４から３１のいずれか一項に記載のスクリーニング方法に使用するためのスクリーニング用キット。
  35. さらに、前記核酸構築物を導入するための生細胞を含む、請求項３４記載のスクリーニング用キット。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002101036A1 (fr) * 2001-05-11 2002-12-19 Kazunari Taira Methode de formation d'un complexe stable d'un transcrit d'adn codant un peptide arbitraire a l'aide d'un produit de traduction, construction d'acide nucleique utilisee dans cette methode, complexe obtenu par cette methode et criblage de proteine fonctionnelle et marn ou adn codant la proteine a l'aide de cette methode

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002101036A1 (fr) * 2001-05-11 2002-12-19 Kazunari Taira Methode de formation d'un complexe stable d'un transcrit d'adn codant un peptide arbitraire a l'aide d'un produit de traduction, construction d'acide nucleique utilisee dans cette methode, complexe obtenu par cette methode et criblage de proteine fonctionnelle et marn ou adn codant la proteine a l'aide de cette methode

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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