WO2010131748A1 - ペプチドを認識するアプタマー - Google Patents

ペプチドを認識するアプタマー Download PDF

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WO2010131748A1
WO2010131748A1 PCT/JP2010/058221 JP2010058221W WO2010131748A1 WO 2010131748 A1 WO2010131748 A1 WO 2010131748A1 JP 2010058221 W JP2010058221 W JP 2010058221W WO 2010131748 A1 WO2010131748 A1 WO 2010131748A1
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aptamer
nucleic acid
rna
base sequence
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PCT/JP2010/058221
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祥太郎 辻
穣 秋冨
信太郎 加藤
巌 和賀
敬 大津
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地方独立行政法人神奈川県立病院機構
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity

Definitions

  • the present invention relates to an aptamer that recognizes a peptide, and specifically relates to an aptamer that recognizes a histidine peptide.
  • Antibodies such as monoclonal antibodies have been widely studied as binding molecules that recognize targets and bind specifically. Antibodies are generally produced by immunizing animals. However, for example, antibodies against low molecular compounds such as ionic atoms and peptides, or antigens highly conserved among biological species are difficult to produce. For this reason, an antibody that specifically binds to the target is not always available. Thus, in recent years, attention has been focused on nucleic acid molecules such as RNA oligonucleotides or DNA oligonucleotides that specifically bind to the target in place of antibodies. The nucleic acid molecule is generally called an aptamer.
  • Non-patent Document 1 As for the aptamer, for example, as described above, it has been reported that it is possible to obtain one that specifically binds to a target such as a low-molecular compound for which it is difficult to obtain an antibody (Non-patent Document 1). .
  • the aptamer since it is possible to obtain an aptamer that specifically binds to the target for which it is difficult to produce an antibody, the aptamer is used in the fields of biochemistry and medicine, for example, as shown below. It is being used as an important tool.
  • Aptamers can be chemically synthesized in large quantities, for example. Some aptamers have low immunogenicity and exhibit stronger binding ability to the target than antibodies. For this reason, aptamers can be candidates for excellent molecular target drugs (Non-patent Document 2).
  • pegaptanib generic name Pegaptanib, trade name Macugen
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • This aptamer is actually approved in the United States, Europe and Japan as a therapeutic agent for age-related macular degeneration (Non-patent Document 3). In addition, at least 5 types of aptamers are currently undergoing clinical trials in the United States.
  • aptamers for targets such as serum proteins (Non-patent Document 4), cocaine (Non-patent Document 5) or ions (Non-patent Document 6) change their higher order structure by binding to the target.
  • a method for measuring the target utilizing this feature has been developed (Non-patent Document 7).
  • Non-patent Document 8 a highly valuable refined product is obtained, for example, medically and biochemically
  • a method for expressing a fusion protein by fusing to the N-terminal or C-terminal of the target protein using a peptide consisting of several to several tens of amino acids as a tag is known. It has been. According to this method, it is possible to confirm the expression of the target protein and purify the target protein using the tag of the fusion protein as a clue.
  • the tag for example, a histidine peptide containing several histidines is widely used as a so-called histidine tag.
  • the fusion protein to which the histidine tag is added can be purified by, for example, a nickel ion column or an anti-histidine tag antibody.
  • the nickel ion column has many problems such as non-specific adsorption, and the anti-histidine antibody is expensive. Therefore, in the purification of the target protein using a histidine tag, development of a new anti-histidine tag antibody or a binding molecule in place of the antibody is underway.
  • an object of the present invention is to provide an aptamer that can bind to a histidine peptide.
  • the aptamer of the present invention is an aptamer that can bind to a histidine peptide, and is characterized by being any one of the following nucleic acids (a), (b), (c), and (d).
  • N represents A, G, C, U or T
  • n in N n is the number of N, and represents an integer of 1 to 3
  • Y represents U, T or C.
  • U m is the number of U and represents an integer of 1 to 3
  • H represents U, T, C or A.
  • nucleic acid comprising a base sequence in which one or more bases are substituted, deleted, added or inserted in the base sequence of (a), and capable of binding to the histidine peptide
  • SEQ ID NO: Nucleic acid comprising the base sequence represented by GGCGCCUCUCGUGAGAUGUC (SEQ ID NO: 18)
  • D a nucleic acid comprising a base sequence in which one or more bases are substituted, deleted, added or inserted in the base sequence of (c), and capable of binding to the histidine peptide
  • the reagent of the present invention includes the aptamer of the present invention.
  • the kit of the present invention comprises the aptamer of the present invention.
  • the nucleic acid for producing an aptamer of the present invention is a nucleic acid for producing the aptamer of the present invention, and is a nucleic acid containing a base sequence complementary to the aptamer of the present invention.
  • the antisense nucleic acid of the present invention is characterized by including a base sequence complementary to the aptamer of the present invention.
  • the identification method of the present invention is an identification method of an aptamer that can bind to a target, and includes the following steps (i) to (iv).
  • the aptamer of the present invention is superior in binding power to the histidine peptide as compared with, for example, a general anti-histidine peptide antibody that binds to the histidine peptide. For this reason, for example, in the detection of the histidine peptide, it can be used in place of the anti-histidine peptide antibody, and detection with better accuracy becomes possible. Thus, the aptamer of the present invention is a very useful tool for detecting the histidine peptide in biological techniques, for example.
  • FIG. 1 is a sensorgram of various aptamers in an example of the present invention.
  • FIG. 2 is a sensorgram of aptamer shot 47 in the embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the estimated secondary structures of various aptamers in the examples of the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing the secondary structure of aptamer # 47s in the example of the present invention.
  • FIG. 5 is sensorgrams of various aptamers in the examples of the present invention.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing the structures of various fusion proteins in the examples of the present invention.
  • FIG. 7 is a graph showing the binding of aptamer shot47 to various fusion proteins in Examples of the present invention.
  • FIG. 1 is a sensorgram of various aptamers in an example of the present invention.
  • FIG. 2 is a sensorgram of aptamer shot 47 in the embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the estimated secondary structures of various apt
  • FIG. 8 is a graph showing the binding of aptamer shot47 to a fusion protein in an example of the present invention.
  • FIG. 9 is a graph showing the binding of various aptamers to fusion proteins in the examples of the present invention.
  • FIG. 10 is a blotting photograph showing the binding of aptamer shot47 to various fusion proteins in Examples of the present invention.
  • FIG. 11 is a blotting photograph showing the binding of aptamer shot47 to His-MIF in the examples of the present invention.
  • FIG. 12 is a sensorgram of various aptamers in the examples of the present invention.
  • FIG. 13 is a sensorgram of various aptamers in the examples of the present invention.
  • histidine is referred to as “His”, and histidine peptide is referred to as “His peptide”.
  • the His peptide can be used as a histidine tag as described above.
  • the histidine tag is referred to as “His-tag”.
  • the His peptide can be read as His-tag.
  • the aptamer capable of binding to the His peptide is hereinafter referred to as “His peptide aptamer”, “His-tag aptamer” or “aptamer”.
  • the His peptide means a peptide having a plurality of Hiss.
  • the His peptide may be, for example, a peptide consisting only of a plurality of consecutive Hiss, that is, a poly-His peptide (hereinafter referred to as “poly-His”), or a peptide containing the poly-His peptide, ie, the poly-His peptide. It may be a peptide having an additional sequence on at least one of the N-terminal side and the C-terminal side. The additional sequence may be, for example, one amino acid residue or a peptide composed of two or more amino acid residues.
  • the His peptide may be, for example, a peptide containing a plurality of discontinuous Hiss, that is, a peptide containing a plurality of Hiss and other amino acids.
  • the length of the His peptide is not particularly limited, but the number of amino acid residues is, for example, 6 to 30, preferably 6 to 15, and more preferably 8 to 15 .
  • the number of poly-His histidines in the His peptide is, for example, preferably 6 to 10, more preferably 6 to 8.
  • the aptamer of the present invention is an aptamer capable of binding to a His peptide, and is characterized by being one of the following nucleic acids (a), (b), (c) or (d).
  • N represents A, G, C, U or T
  • n in N n is the number of N, and represents an integer of 1 to 3
  • Y represents U, T or C.
  • U m is the number of U and represents an integer of 1 to 3
  • H represents U, T, C or A.
  • the aptamer (a) may be a nucleic acid containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 17.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 17 is also referred to as “binding motif sequence”.
  • N represents A, G, C, U or T, preferably A, G, C or U
  • n of N n is the number of N, represents an integer of 1 to 3
  • Y is U
  • T or C preferably U or C
  • H is U, T, C or A is represented, and U, C or A is preferred.
  • the binding motif sequence is a consensus sequence found in common with the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 1 to 16, which will be described later.
  • the number of N in N n (n) is not particularly limited, for example, may be either one (N), 2 pieces (NN) or 3 (NNN), N May be the same base or different bases.
  • the number of U in U m (m) is not particularly limited, for example, one (U), may be either a two (UU) or 3 (UUU).
  • Examples of the aptamer (a) include the following nucleic acid (a1).
  • (A1) a nucleic acid comprising the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 89 to 104
  • the base sequences represented by these SEQ ID NOs each have the binding motif sequence represented by SEQ ID NO: 17.
  • the aptamer (a1) may be, for example, a nucleic acid having a base sequence represented by any sequence number among these sequence numbers, or a nucleic acid having a base sequence represented by any sequence number.
  • Table 1 below shows the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 89 to 104.
  • the underlined portion is a binding motif sequence represented by SEQ ID NO: 17.
  • each aptamer in the following Table 1 may be indicated by a name shown before the sequence (hereinafter the same).
  • aptamer (a1) include the following nucleic acid (a1-1).
  • A1-1) a nucleic acid comprising the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 16
  • the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 16 include the base sequences represented by SEQ ID NOs: 89 to 104, respectively.
  • the aptamer (a1-1) may be, for example, a nucleic acid consisting of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 16, or a nucleic acid containing any base sequence.
  • Table 2 below shows the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 16.
  • the underlined portion is the binding motif sequence represented by SEQ ID NO: 17.
  • each aptamer in the following Table 2 may be indicated by a name shown before the sequence (hereinafter the same).
  • nucleic acid (A2) a nucleic acid comprising the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 105 to 114, SEQ ID NOs: 116 to 124, and SEQ ID NOs: 127 to 146
  • the base sequences represented by these SEQ ID NOs each have the binding motif sequence represented by SEQ ID NO: 17.
  • the aptamer (a2) may be, for example, a nucleic acid having a base sequence represented by any sequence number among these sequence numbers, or a nucleic acid having a base sequence represented by any sequence number.
  • Tables 3 and 4 below show the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 105 to 114, SEQ ID NOs: 116 to 124, and SEQ ID NOs: 127 to 146.
  • the underlined portion is the binding motif sequence represented by SEQ ID NO: 17.
  • each aptamer in the following Table 3 and Table 4 may be indicated by the name shown before the sequence (hereinafter the same).
  • aptamer (a2) include the following nucleic acid (a2-1).
  • A2-1 Nucleic acid comprising the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 26 to 35, SEQ ID NOs: 37 to 45, SEQ ID NOs: 65 to 68, SEQ ID NOs: 19 to 25, and SEQ ID NOs: 48 to 56
  • the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 26 to 35, SEQ ID NO: 37 to 45, SEQ ID NO: 65 to 68, SEQ ID NO: 19 to 25, and SEQ ID NO: 48 to 56 are the aforementioned SEQ ID NO: 105 to 114, SEQ ID NO: 116 to 124 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 127 to 146.
  • the aptamer (a2-1) may be, for example, a nucleic acid consisting of the base sequence represented by any of these SEQ ID NOs, or a nucleic acid comprising the base sequence represented by any of the SEQ ID NOs. Also good.
  • Tables 5 and 6 below show the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 26 to 35, SEQ ID NOs: 37 to 45, SEQ ID NOs: 65 to 68, SEQ ID NOs: 19 to 25, and SEQ ID NOs: 48 to 56.
  • the underlined portion is the binding motif sequence represented by SEQ ID NO: 17.
  • each aptamer in the following Tables 5 and 6 may be indicated by a name shown before the sequence (hereinafter the same).
  • nucleic acid (a3) Nucleic acid containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 147 GGUN n AYU m GGHGCCUUCGUGGAAUGUC (SEQ ID NO: 147)
  • GGUN n AYU m GGH is the above-mentioned binding motif sequence represented by SEQ ID NO: 17 as described above.
  • GGHGCCCUUCGUGGAAUGUC is a base sequence represented by SEQ ID NO: 18 (herein, H is C), which will be described later.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 18 is, for example, a base sequence of a region that forms a stem loop structure in an aptamer, and is hereinafter also referred to as “stem loop motif sequence”.
  • 3 bases at the 3 ′ end of the binding motif sequence overlap with 3 bases at the 5 ′ end of the stem loop motif sequence.
  • Examples of the base sequence represented by SEQ ID NO: 147 include the base sequence represented by SEQ ID NO: 148. GGUAUAUUGGCGCCUUCGUGGAAUGUC (SEQ ID NO: 148)
  • aptamer (a3) include the following nucleic acid (a3-1).
  • A3-1) a nucleic acid comprising the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2, 12, 14, 15 and 55
  • the base sequences represented by SEQ ID NOs: 2, 12, 14, 15 and 55 each include the above-mentioned SEQ ID NO: 147, specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 148.
  • the aptamer (a3-1) may be, for example, a nucleic acid consisting of the base sequence represented by any sequence number among these sequence numbers, or a nucleic acid comprising the base sequence represented by any sequence number. Also good.
  • Table 7 below shows the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 2, 12, 14, 15 and 55. In Table 7 below, the underlined portion is the base sequence represented by SEQ ID NO: 17, and the region surrounded by a square is the base sequence represented by SEQ ID NO: 18.
  • the aptamer (a4) may be, for example, a nucleic acid consisting of a base sequence represented by any sequence number among these sequence numbers, or a nucleic acid containing a base sequence represented by any sequence number. . (A4) a nucleic acid comprising the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 158 to 2302 and SEQ ID NOs: 2303 to 2312
  • aptamer (a) specific examples include, for example, the following nucleic acid (a5).
  • the aptamer (a5) may be, for example, a nucleic acid having a base sequence represented by any sequence number among these sequence numbers or a nucleic acid having a base sequence represented by any sequence number. . (A5) a nucleic acid comprising the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2313 to 2347
  • the aptamer of (b) includes a base sequence in which one or more bases are substituted, deleted, added or inserted in the base sequence of (a), and the His peptide includes A nucleic acid that is capable of binding.
  • “One or more” is not particularly limited, but in the base sequence represented by SEQ ID NO: 17, for example, 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3 More preferably, it is one or two, and particularly preferably one.
  • the aptamer of (b) is, for example, in the base sequence represented by each sequence number listed in the aptamer of (a) described above, one or more bases are substituted, deleted, added or inserted.
  • the aptamer (b) includes, for example, a base sequence in which one or more bases are substituted, deleted, added or inserted in the full-length base sequence of the aptamer (a), and the His It may be a nucleic acid capable of binding to a peptide.
  • “one or more” is not particularly limited, but is, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 4, in the full length sequence. The number is preferably 1 to 3, particularly preferably 1 or 2, and most preferably 1.
  • the base used for substitution, addition, or insertion is not particularly limited, and examples thereof include A, C, G, U, and T, and other examples include a modified base and an artificial base.
  • examples of the modified base include 2'-fluoropyrimidine, 2'-O-methylpyrimidine and the like.
  • a nucleoside or nucleotide may be used, or a deoxynucleoside or deoxynucleotide may be used.
  • PNA peptide nucleic acid
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • Examples of the aptamer (b) include nucleic acids containing the base sequences shown in Tables 3 and 5 above. Specific examples include a nucleic acid comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 115 (# 736) or SEQ ID NO: 36 (# 736) or a nucleic acid comprising the above base sequence.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 36 includes the base sequence represented by SEQ ID NO: 115. Examples thereof include nucleic acids containing the base sequences represented by SEQ ID NO: 125 (# 7009) and SEQ ID NO: 46 (# 7009), or nucleic acids comprising the above base sequences.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 46 includes the base sequence represented by SEQ ID NO: 125.
  • the double underlined portion of these base sequences corresponds to the binding motif sequence represented by SEQ ID NO: 17, and the base surrounded by a square is different from the base sequence represented by SEQ ID NO: 17. It is a substituted base.
  • the nucleic acid which consists of a base sequence represented by sequence number 126 (# 7062) and sequence number 47 (# 7062), or the nucleic acid containing the said base sequence is mention
  • the double underlined portion of these base sequences corresponds to the binding motif sequence represented by SEQ ID NO: 17, and any one of the bases (UU) enclosed by a square is represented by SEQ ID NO: 17 A substituted base different from A in the binding motif sequence represented by
  • a nucleic acid having the base sequence represented by SEQ ID NO: 143 (# AT5-5) and SEQ ID NO: 53 (# AT5-5) or a nucleic acid containing the base sequence can be mentioned.
  • the aptamer of the present invention may be, for example, the following nucleic acid (e) or (f).
  • the homology is, for example, 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, further preferably 95% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • the homology can be calculated, for example, by calculating under default conditions using BLAST or the like.
  • the aptamer (e) may be a nucleic acid that includes the base sequence having the homology in the base sequence represented by SEQ ID NO: 17 in the aptamer (a) and can bind to the His peptide.
  • the aptamer (e) is, for example, a nucleic acid that includes the base sequence having the homology in the base sequences represented by the respective sequence numbers listed in the aptamer (a) and can bind to the His peptide. But you can.
  • the aptamer of (e) may be a nucleic acid that includes the homologous base sequence in the full-length base sequence of the aptamer of (a) and can bind to the His peptide.
  • hybridizes under stringent conditions is, for example, well-known hybridization experimental conditions for those skilled in the art.
  • stringent conditions refers to, for example, hybridization at 60 to 68 ° C. in the presence of 0.7 to 1 mol / L NaCl, and then 0.1 to 2 times the SSC solution. Used refers to conditions that can be identified by washing at 65-68 ° C. 1 ⁇ SSC consists of 150 mmol / L NaCl and 15 mmol / L sodium citrate.
  • the aptamer of (f) includes, for example, a nucleic acid capable of binding to the His peptide, including a base sequence that hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 17 in the aptamer of (a) under stringent conditions. But you can.
  • the aptamer (f) includes, for example, a base sequence that hybridizes under stringent conditions with the base sequence represented by each of the SEQ ID NOs listed in the aptamer (a) and binds to the His peptide. Possible nucleic acids may be used.
  • the aptamer (f) may be a nucleic acid that includes a base sequence that hybridizes with the full-length base sequence of the aptamer (a) under stringent conditions and can bind to the His peptide.
  • the aptamer of the present invention may be a nucleic acid containing a partial sequence of each sequence listed in the aptamer (a), for example, and may be a nucleic acid capable of binding to the His peptide.
  • the partial sequence is, for example, a sequence composed of a plurality of continuous bases, preferably a continuous 5 to 40, more preferably 8 to 30, and particularly preferably 10 to 12 base sequences.
  • the aptamer of (c) is a nucleic acid containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 18, as described above.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 18 is, for example, the base sequence of a region that forms a stem loop structure in the aptamer. GGCGCCUCUCGUGGAUUGUC (SEQ ID NO: 18)
  • Examples of the aptamer (c) include nucleic acids including the base sequences represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 55.
  • the aptamer of (c) may be, for example, a nucleic acid consisting of the base sequence represented by any sequence number among these sequence numbers, or a nucleic acid containing the base sequence represented by any sequence number. . These base sequences are as shown in Table 7 above.
  • the aptamer of (d) includes a base sequence in which one or more bases are substituted, deleted, added or inserted in the base sequence of (c), and the His peptide includes A nucleic acid that is capable of binding.
  • “One or more” is not particularly limited, but in the base sequence represented by SEQ ID NO: 18, for example, 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3 More preferably, it is one or two, and particularly preferably one.
  • the aptamer of (d) is, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 55, wherein one or more bases are substituted, It may be a nucleic acid containing a deleted, added or inserted nucleotide sequence and capable of binding to the His peptide.
  • “one or more” is not particularly limited, but in the base sequence, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 4, The number is preferably 1 to 3, particularly preferably 1 or 2, and most preferably 1.
  • the aptamer of (d) includes a base sequence in which one or more bases are substituted, deleted, added or inserted in the full-length base sequence of the aptamer of (c), and the His peptide includes It may be a nucleic acid capable of binding.
  • “one or more” is not particularly limited, but is, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 4, in the full length sequence.
  • the number is preferably 1 to 3, particularly preferably 1 or 2, and most preferably 1.
  • the aptamer (d) preferably has a stem-loop structure that is substantially the same as the stem-loop structure formed by the base sequence represented by SEQ ID NO: 18, for example.
  • the base used for substitution, addition, or insertion is not particularly limited, and examples thereof include A, C, G, U, and T, and other examples include a modified base and an artificial base.
  • examples of the modified base include 2'-fluoropyrimidine, 2'-O-methylpyrimidine and the like.
  • a nucleoside or nucleotide may be used, or a deoxynucleoside or deoxynucleotide may be used.
  • PNA peptide nucleic acid
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • Examples of the aptamer (d) include a nucleic acid comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 65 to 68, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 54 and SEQ ID NO: 56, or a nucleic acid containing the base sequence. It is done. These base sequences are shown in Table 7 above.
  • the base surrounded by a square is a stem loop motif sequence represented by SEQ ID NO: 18
  • the bases shown in white in the same site as compared with the above are the sites where the bases shown in white are deleted or replaced as compared with the stem loop motif sequence. In Table 7, the deletion site is indicated by “ ⁇ ”.
  • the aptamer of (d) for example, in the stem loop motif sequence represented by SEQ ID NO: 18, the 7th and 11th Us and the 15th A are preferably conserved.
  • the aptamer of the present invention may be, for example, the following nucleic acid (g) or (h).
  • the homology is, for example, 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, further preferably 95% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • the aptamer of (g) is, for example, a base sequence having the homology in the base sequences represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 55 in the aptamer of (c) And a nucleic acid capable of binding to the His peptide.
  • the aptamer of (g) includes, for example, a nucleic acid that includes the base sequence having the homology in the base sequences represented by the respective sequence numbers listed in the aptamer of (c) and can bind to the His peptide. But you can.
  • the aptamer (g) may be a nucleic acid that includes the homologous base sequence in the full-length base sequence of the aptamer (c) and can bind to the His peptide.
  • the aptamer (g) preferably has a stem-loop structure that is substantially the same as the stem-loop structure formed by the base sequence represented by SEQ ID NO: 18, for example.
  • hybridizes under stringent conditions is, for example, as described above.
  • the aptamer of (h) hybridizes under stringent conditions with the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 55 in the aptamer of (c), for example.
  • a nucleic acid capable of binding to the His peptide includes, for example, a base sequence that hybridizes under stringent conditions with the base sequence represented by each of the sequence numbers listed in the aptamer of (c), and binds to the His peptide. Possible nucleic acids may be used.
  • the aptamer (h) may be, for example, a nucleic acid that includes a base sequence that hybridizes with the full-length base sequence of the aptamer (c) under stringent conditions and can bind to the His peptide.
  • the aptamer (h) preferably has a stem-loop structure that is substantially the same as the stem-loop structure formed by the base sequence represented by SEQ ID NO: 18, for example.
  • the aptamer of the present invention may be, for example, a nucleic acid containing a partial sequence of each sequence listed in the aptamer (c) and a nucleic acid capable of binding to the His peptide.
  • the partial sequence is, for example, a sequence composed of a plurality of continuous bases, preferably a continuous 5 to 40, more preferably 8 to 30, and particularly preferably 10 to 12 base sequences.
  • FIG. 3 shows aptamers shot47 (SEQ ID NO: 2), # 701 (SEQ ID NO: 1), # 716 (SEQ ID NO: 3), # 714 (SEQ ID NO: 10) and # 746 (SEQ ID NO: 9).
  • SEQ ID NO: 2 the sequences indicated by white letters are these consensus sequences, which are the binding motif sequences represented by SEQ ID NO: 17.
  • the binding motif sequence is located in the bent portion of the stem in FIG.
  • the present invention is not limited to this.
  • FIG. 4 shows a schematic diagram of a predicted secondary structure of aptamer # 47s (SEQ ID NO: 12).
  • the 12th to 22nd sequences indicated by white letters are the consensus sequence, that is, the binding motif sequence of SEQ ID NO: 17.
  • the 20 th to 38 th sequences in the 3 ′ region of the binding motif sequence are the stem loop motif sequences represented by SEQ ID NO: 18.
  • the stem loop motif sequence in aptamer # 47s forms a stem loop structure by intramolecular annealing.
  • the binding motif sequence is located in a bent portion of the stem. The present invention is not limited to this.
  • the form of the aptamer of the present invention is not particularly limited.
  • the aptamer includes, for example, a Y region, an X region and a Y ′ region, and the Y region, the X region and the Y ′ region are linked from the 5 ′ end. Can be given.
  • the X region has the base sequence contained in the nucleic acids (a) to (h), for example.
  • the X region may be, for example, the base sequence represented by any of the SEQ ID NOs listed in Table 1, Table 3, and Table 4, or SEQ ID NOS: 158 to 2302, SEQ ID NOS: 2303 to 2312, and SEQ ID NO: It preferably has a base sequence represented by any of 2313 to 2347.
  • the aptamer of this embodiment is, for example, a primer sequence capable of annealing a primer at least one of the 5 ′ upstream of the X region, that is, the Y region, and the 3 ′ downstream of the X region, that is, the Y ′ region.
  • a polymerase recognition sequence that can be recognized by the polymerase.
  • the aptamer of the present invention can be amplified by, for example, a reverse transcription reaction and / or a nucleic acid amplification reaction using a primer and a polymerase.
  • the polymerase recognition sequence can be appropriately determined depending on, for example, the type of polymerase used in nucleic acid amplification.
  • the recognition sequence of the polymerase is preferably a DNA-dependent RNA polymerase recognition sequence (hereinafter also referred to as “RNA polymerase recognition sequence”), and specific examples thereof include a T7 promoter, which is a T7 RNA polymerase recognition sequence.
  • RNA polymerase recognition sequence DNA-dependent RNA polymerase recognition sequence
  • specific examples thereof include a T7 promoter, which is a T7 RNA polymerase recognition sequence.
  • the Y region on the 5 ′ end side contains the RNA polymerase recognition sequence and the primer sequence (hereinafter also referred to as “5 ′ end primer sequence”) in this order. It is preferable to have.
  • the X region is preferably linked to the 3 'end of the Y region.
  • the Y ′ region is linked to the 3 ′ end side of the X region, and the Y ′ region has the primer sequence (hereinafter also referred to as “3 ′ end primer sequence”).
  • the 5 ′ terminal primer sequence in the RNA is, for example, a sequence complementary to the 3 ′ end of a DNA antisense strand synthesized using the RNA as a template, that is, bound to the 3 ′ end of the antisense strand.
  • the sequence is preferably the same as possible primers.
  • the Y region and the X region, and the X region and the Y ′ region may be directly adjacent to each other or indirectly adjacent via an intervening sequence. May be.
  • the Y region and Y ′ region are not particularly limited, and for example, those skilled in the art can appropriately set according to the types of primers and polymerase used.
  • the base sequences of the Y region and Y ′ region are not particularly limited and can be arbitrarily determined.
  • Examples of the Y region include a region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 149 or a region containing the base sequence.
  • Examples of the Y ′ region include a region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 150 or a region containing the base sequence. These sequences are examples and do not limit the present invention.
  • GGGACGCUCA CGUACGCUCA SEQ ID NO: 149) UCAGUGCCUG GACGUGCAGU (SEQ ID NO: 150)
  • the aptamer having the Y region, the X region, and the Y ′ region are, for example, a nucleic acid having the base sequence represented by any one of the sequence numbers listed in Table 2, Table 5, and Table 6, or the base Examples include nucleic acids containing sequences.
  • the Y region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 149, the lower case sequence on the 5 ′ end side, the upper case sequence is the X region, and the lower case sequence on the 3 ′ end side is:
  • the Y ′ region consists of the base sequence represented by SEQ ID NO: 150.
  • a specific example of an aptamer having the Y region, the X region and the Y ′ region is, for example, the Y region is the Y region comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 149, and the X region is a sequence. No. 158 to 2302, SEQ ID Nos. 2303 to 2312 and SEQ ID Nos. 2313 to 2347, the Y ′ region is a base sequence represented by SEQ ID No. 150, and 5 ′ of the X region Examples thereof include a nucleic acid having the Y region at the end and the Y ′ region at the 3 ′ end of the X region.
  • the number of bases in the X region is not particularly limited, but is, for example, 10 to 60 bases, preferably 15 to 50 bases, and more preferably 20 to 40 bases.
  • the number of bases in the Y region and Y ′ region is not particularly limited, but is, for example, 10 to 50 bases, preferably 15 to 40 bases, and more preferably 20 to 30 bases.
  • the total number of bases of the aptamer of the present invention is not particularly limited, but is, for example, 20 to 160 bases, preferably 30 to 120 bases, more preferably 40 to 100 bases.
  • “being able to bind to a His peptide” means, for example, having a binding ability to the His peptide, or having a binding activity to the His peptide (His peptide binding activity). You can also.
  • the binding between the aptamer and the His peptide can be determined by, for example, surface plasmon resonance molecular interaction analysis, and can be determined by using, for example, Biacore X (trade name, GE Healthcare UK Ltd.).
  • the binding activity of the aptamer of the present invention to the His peptide can be represented, for example, by the dissociation constant between the aptamer and the His peptide.
  • the dissociation constant of the aptamer of the present invention is, for example, 1.0 ⁇ 10 ⁇ 9 mol / L or less.
  • the dissociation constant (Kd) of an antibody against a His peptide exceeds 1.0 ⁇ 10 ⁇ 9 mol / L. For this reason, the aptamer of the present invention has a binding property superior to that of an antibody.
  • the dissociation constant of the aptamer of the present invention is preferably 5.0 ⁇ 10 ⁇ 10 mol / L or less, and more preferably 1.0 ⁇ 10 ⁇ 10 mol / L or less.
  • the aptamer of the present invention is an aptamer characterized in that, for example, the dissociation constant with a His peptide is 1.0 ⁇ 10 ⁇ 9 mol / L or less.
  • the aptamer of the present invention can bind to a single His peptide or can bind to a fusion peptide containing a His peptide via the His peptide.
  • the fusion peptide include a fusion peptide containing a His peptide on the N-terminal side, a fusion peptide containing a His peptide on the C-terminal side, a fusion peptide containing a His peptide inside, and the like.
  • the fusion polypeptide may include, for example, a His peptide and other peptides.
  • the other peptide may be a protein, for example.
  • the fusion peptide includes, for example, the meaning of a fusion protein.
  • the fusion peptide may include, for example, a fusion tag peptide including His-tag which is a His peptide and another tag.
  • the other tags include amino acid sequences such as T7 gene 10 leader sequence and Xpress TM Epitope (hereinafter also referred to as “Xpress tag”).
  • the fusion tag peptide may contain, for example, His-tag, T7 gene 10 leader sequence and Xpress tag from the N terminus, or may contain His-tag and T7 gene 10 leader sequence from the N terminus.
  • the aptamer of the present invention may be, for example, a single-stranded nucleic acid or a double-stranded nucleic acid.
  • the single-stranded nucleic acid include single-stranded RNA and single-stranded DNA.
  • the double-stranded nucleic acid include a double-stranded RNA, a double-stranded DNA, and a double-stranded RNA (DNA-DNA hybrid).
  • the aptamer of the present invention is the double-stranded nucleic acid, for example, one single-stranded nucleic acid is the nucleic acid described above, and the other single-stranded nucleic acid is complementary to part or all of the single-stranded nucleic acid.
  • the double-stranded nucleic acid is preferably made into a single strand by denaturation or the like before use, for example.
  • the single-stranded nucleic acid may be, for example, DNA or RNA as described above, but the sequence may contain both deoxyribonucleotides that are constituent units of DNA and ribonucleotides that are constituent units of RNA. Good.
  • the aptamer of the present invention is preferably RNA, and particularly preferably single-stranded RNA.
  • the base is not limited to, for example, natural bases (non-artificial bases) such as adenine (a), cytosine (c), guanine (g), thymine (t) and uracil (u).
  • the base may be a non-natural base (artificial base) such as a modified base or a modified base having the same function as the natural base.
  • the artificial base having the same function as described above include an artificial base capable of binding to cytosine (c) instead of guanine (g), and an artificial base capable of binding to guanine (g) instead of cytosine (c).
  • an artificial base capable of binding to thymine (t) or uracil (u) an artificial base capable of binding to adenine (a) instead of thymine (t), and uracil (u)
  • an artificial base capable of binding to adenine (a) examples include 2'-fluorouracil, 2'-aminouracil, 2'-O-methyluracil, 2-thiouracil and the like.
  • the structural unit of the aptamer of the present invention may be, for example, PNA (peptide nucleic acid), LNA (Locked Nucleic Acid), etc., in addition to nucleotides such as deoxyribonucleotides or ribonucleotides.
  • PNA peptide nucleic acid
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • the aptamer of the present invention can be used, for example, in the same manner as the anti-His peptide antibody used in the detection of His peptide.
  • the method for detecting the His peptide is not particularly limited, and examples thereof include various biochemical analysis methods including fluorescence analysis such as flow cytometry and ELISA.
  • the aptamer of the present invention can be used in place of, for example, the anti-His antibody.
  • a necessary reagent can be appropriately added to the nucleic acid according to the analysis method.
  • the reagent added to the nucleic acid is not particularly limited, and examples thereof include fluorescent substances, radioactive substances, enzymes, and the like.
  • the aptamer of the present invention can be used for, for example, detection, recovery and purification of the fusion protein containing a His peptide.
  • the aptamer of the present invention is immobilized on a solid phase, and a sample containing a fusion protein to which a His peptide is added is contacted.
  • the fusion protein in the sample binds to the aptamer of the present invention immobilized on the solid phase via the His peptide.
  • the solid phase is washed to remove components in the sample that are not bound to the immobilized aptamer of the present invention.
  • the fusion protein can be recovered by dissociating the bound fusion protein from the aptamer of the present invention immobilized on the solid phase.
  • the method for detecting the fusion protein is not particularly limited, and examples thereof include Northwestern blotting, pull-down assay, ELISA, flow cytometry, and the like.
  • the aptamer of the present invention may be used instead of the anti-His antibody. .
  • the aptamer of the present invention can be produced by, for example, a known method based on information on the base sequence.
  • the known method is not particularly limited, and examples thereof include a chemical synthesis method using an automatic synthesizer, a synthesis method using an enzymatic reaction using various polymerases, and a synthesis by in vitro transcription from a DNA template.
  • the aptamer of the present invention can be prepared by, for example, a known SELEX method. Moreover, the aptamer of this invention can also be prepared with the identification method of the aptamer newly established by this inventor shown below, for example. The present invention is not limited to the following method.
  • the aptamer identification method of the present invention includes, for example, the following steps (i) to (iv). (I) Step of mixing RNA pool and target (ii) Step of separating RNA binding to target from said RNA pool (iii) Synthesize cDNA using DNA polymerase using separated RNA as template Step (iv) Step of synthesizing RNA using RNA polymerase using the cDNA as a template
  • RNA capable of binding to the target can be efficiently selected as an aptamer from an RNA pool.
  • the identification method of the present invention can also be said to be an aptamer selection method, for example.
  • the aptamer identification method of the present invention is hereinafter referred to as an improved SELEX method (SELEX-T method).
  • the SELEX-T method of the present invention mainly obtains an aptamer exhibiting a lower dissociation constant as described above by synthesizing RNA mainly by the step (iv) using RNA polymerase. Is possible. This is considered to be because, for example, the SELEX method in which the bias due to PCR, that is, the sequence deviation of the RNA pool is suppressed, has become possible.
  • the RNA pool is, for example, a population of RNA including a random sequence.
  • the random sequence is, for example, a sequence comprising 10 to 60, preferably 30 to 50 N (A, C, G, U or T).
  • the target is not particularly limited, and examples thereof include low molecular compounds such as ion atoms, amino acids, and peptides, viruses, proteins, cells, and the like.
  • the target when identifying an aptamer that can bind to a His peptide, the target may be, for example, a His peptide or a substance to which a His peptide is added. Examples of the latter target include a fusion polypeptide in which a His peptide is added to another peptide.
  • the cDNA can be synthesized, for example, by a reverse transcription reaction.
  • the synthesis method by the reverse transcription reaction include a method using a primer and a polymerase such as an RNA-dependent DNA polymerase.
  • cDNA may be synthesized using RNA as a template, and further, the cDNA may be amplified by nucleic acid amplification using the synthesized cDNA as a template.
  • the step (iii) preferably synthesizes cDNA by, for example, reverse transcription (RT) -polymerase chain reaction (PCR).
  • RT reverse transcription
  • PCR polymerase chain reaction
  • the cDNA obtained in the step (iii) can also be referred to as a DNA product, for example.
  • the RNA can be synthesized, for example, by a reaction using a primer and a polymerase such as a DNA-dependent RNA polymerase.
  • the RNA pool is preferably, for example, one in which a predetermined primer sequence is functionally linked to both ends of the random sequence.
  • the RNA pool is preferably, for example, one in which a promoter sequence or a complementary sequence thereof is functionally linked to both ends of the random sequence.
  • the primer sequence and the promoter region can be set based on a known SELEX method.
  • the RNA pool and the target are prepared.
  • the RNA pool may be chemically synthesized using, for example, an automatic nucleic acid synthesizer, or may be synthesized from a DNA template by in vitro transcription.
  • Examples of the target include a commercially available product, a chemically synthesized product, and a product isolated from a biological sample.
  • the target is, for example, a peptide or a protein, for example, it may be isolated from a biological sample, or may be synthesized by in vitro transcription and translation.
  • the target may be immobilized on a solid phase such as a carrier or a support.
  • the immobilization may be performed, for example, before mixing the RNA pool and the target, or may be performed after mixing the both.
  • a solid phase such as a carrier or a support.
  • the immobilization may be performed, for example, before mixing the RNA pool and the target, or may be performed after mixing the both.
  • immobilization of the target for example, biotin-avidin bond, Ni 2 + -[His-tag] bond or Co 2 + -[His-tag] bond, covalent bond with a chemical cross-linking agent, nucleic acid hybridization and the like can be used.
  • the solid phase include beads, chips, and resins.
  • the mixing conditions of the RNA pool and the target are not particularly limited, and may be any conditions that allow the RNA and the target to specifically bind, for example.
  • the temperature is, for example, 4 to 40 ° C., preferably 20 to 37 ° C.
  • the pH is, for example, pH 5.0 to 9.0, preferably pH 6.5 to 7.5
  • the salt concentration is
  • the treatment time is, for example, 50 to 500 mmol / L, preferably 100 to 150 mmol / L, and the treatment time is, for example, 10 minutes to 18 hours, preferably 30 minutes to 2 hours.
  • the complex of the formed RNA and the target is subjected to washing, elution, purification, etc., and the RNA bound to the target is separated.
  • the cleaning is preferably performed under mild conditions as compared with a general SELEX method.
  • bias due to PCR that is, sequence bias of the RNA pool can be suppressed, and as a result, an aptamer exhibiting a lower dissociation constant can be obtained.
  • the washing method for example, a method of precipitating the solid phase on which the complex is immobilized and removing the supernatant, or after removing the supernatant, the solid phase on which the complex is immobilized is washed with a washing buffer.
  • the method of washing with is mentioned.
  • the amount of the washing buffer is not particularly limited, and examples thereof include a volume 100 times that of the solid phase.
  • the number of times of washing with the washing buffer is not particularly limited, but is, for example, once.
  • As the washing buffer for example, 20 mmol / L HEPES (pH 7.2) containing 100 mmol / L sodium chloride, 0.1 mmol / L magnesium acetate and 0.01% Tween 20 can be used.
  • the elution can be performed using, for example, a predetermined concentration of imidazole. Specifically, for example, 100 to 300 mmol / L imidazole or the like can be used as an elution solvent.
  • Examples of purification means include phenol chloroform extraction and ethanol precipitation.
  • the purified RNA is subjected to RT-PCR to synthesize cDNA.
  • the RNA is added to a reaction solution containing dNTP Mix, a predetermined primer, reverse transcriptase, DNA polymerase and the like, and subjected to one-step RT-PCR.
  • a reaction solution containing dNTP Mix a predetermined primer, reverse transcriptase, DNA polymerase and the like
  • RT-PCR for example, QIAGEN (registered trademark) OneStep RT-PCR Kit can be used.
  • the RT-PCR conditions are, for example, a treatment at 50 ° C. for 30 minutes and at 95 ° C. for 10 minutes, then at 94 ° C. for 1 minute, 56 ° C. for 1 minute, and 72 ° C.
  • the cycle number of the normal SELEX method is, for example, 15 to 30 cycles
  • the cycle number of the SELEX-T method is, for example, 1 to 10 cycles, preferably 4 to 8 cycles. More preferably, 4 to 6 cycles are preferable, and still more preferably 4 to 5 cycles.
  • the PCR cycle is extremely suppressed over the entire process, and clone amplification is performed mainly by RNA transcription.
  • the amplification efficiency of each clone can be kept almost constant, and it is considered that selection reflecting the binding force to the target becomes possible.
  • RNA that is, an RNA aptamer is synthesized by RNA polymerase using the synthesized cDNA as a template.
  • the RNA polymerase is not particularly limited, and for example, a known polymerase can be used and can be appropriately selected. Specific examples thereof include heat-resistant T7 RNA polymerase (ScriptMAX Thermo T7 Transfer Kit, Toyobo Co., Ltd.).
  • the thermostable T7 RNA polymerase is used, for example, in the preparation of an RNA pool, it is preferable to link a T7 promoter to one end of the random sequence.
  • RNA can be synthesized by the heat-resistant T7 RNA polymerase.
  • the conditions for RNA synthesis using RNA polymerase are not particularly limited, and examples include 37 ° C. to 50 ° C. and 2 hours to 6 hours.
  • RNA is separated and purified.
  • the purification method of the RNA is not particularly limited, and examples thereof include DNase I treatment, gel filtration, phenol chloroform extraction, ethanol precipitation, and the like. In this way, an aptamer that can bind to a His peptide can be obtained.
  • the obtained RNA may be repeatedly performed from the step (i) of mixing with the target to the step (iv) of synthesizing RNA.
  • the number of repetitions that is, the number of rounds is not particularly limited, but is, for example, 5 to 10 times, preferably 6 to 8 times.
  • the binding ability between the obtained RNA aptamer and the target can be determined, for example, by surface plasmon resonance intermolecular interaction analysis using BiacoreX (GE Healthcare UK Ltd.).
  • the base sequence of the obtained RNA aptamer is further determined. Based on this base sequence information, for example, the RNA aptamer can be produced by a known method.
  • the SELEX-T method can obtain RNA aptamers efficiently and inexpensively without requiring special equipment, for example.
  • the reagent of the present invention includes the aptamer of the present invention.
  • the kit of the present invention comprises the aptamer of the present invention.
  • the His peptide can be detected, and further, the detection or purification of the fusion peptide to which the His peptide is added can be easily performed. Therefore, the reagents and kits of the present invention can be said to be, for example, His peptide detection reagents and His peptide detection kits.
  • the kit of the present invention may contain, for example, a buffer such as a reaction buffer and a washing buffer, a carrier such as a magnetic bead, an instruction manual, etc., if necessary.
  • the nucleic acid of the present invention is a nucleic acid containing a base sequence complementary to the aptamer of the present invention.
  • the nucleic acid of the present invention is a nucleic acid for producing the aptamer of the present invention, and can be said to be a nucleic acid for producing the aptamer of the present invention.
  • the nucleic acid for producing an aptamer of the present invention is preferably, for example, DNA containing a base sequence complementary to the aptamer of the present invention.
  • the aptamer of the present invention can be produced easily and simply by synthesizing a complementary base sequence using this as a template.
  • the aptamer of the present invention can be produced, for example, by nucleic acid amplification such as PCR using the nucleic acid for producing the aptamer of the present invention.
  • the nucleic acid for producing an aptamer of the present invention may be, for example, a single strand or a double strand.
  • the terms sense strand or antisense strand are used, but this does not limit the aptamer-producing nucleic acid of the present invention to double strands.
  • an antisense serving as a transcription template for a sequence. This is to clarify whether it is described as a strand or a complementary strand.
  • RNA aptamer for example, a DNA complementary to the aptamer is used as the aptamer-producing nucleic acid and used as a template.
  • a DNA serving as a template for an RNA aptamer is also referred to as an antisense strand
  • a DNA having a sequence in which uracil (u) of the RNA aptamer is replaced with thymine (t) is also referred to as a sense strand.
  • the template DNA is, for example, as an antisense strand, a DNA having a sequence obtained by substituting uracil (u) of a complementary strand of the RNA aptamer with thymine (t), or a DNA comprising the sequence, and a sense strand, It is preferable to include any one of DNA having a sequence obtained by substituting uracil (u) of the RNA aptamer with thymine (t) or DNA comprising the sequence.
  • RNA Aptamers can be amplified.
  • RNA aptamer is prepared by a reverse transcription reaction using an RNA-dependent DNA polymerase, DNA is amplified using the cDNA as a template, and the obtained DNA amplification product is used as a template.
  • the RNA aptamer may be amplified by transcribing the RNA aptamer using a DNA-dependent RNA polymerase.
  • the DNA aptamer of the present invention is, for example, a DNA aptamer
  • the DNA aptamer can be amplified by a polymerase chain reaction (PCR) method or the like.
  • the nucleic acid for producing an aptamer of the present invention further has a vector, and the base sequence complementary to the aptamer of the present invention is inserted into the vector.
  • the nucleic acid for producing an aptamer of the present invention can also be referred to as the aptamer expression vector of the present invention.
  • the vector is not particularly limited, and a known vector can be used, and examples thereof include a plasmid vector and a virus vector.
  • examples of the plasmid vector include pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pCold series (trademark, Takara Bio Inc.), pET series (Merck, Invitrogen et al.), PRSET series (Invitrogen), pBAD series (Invitrogen) E.
  • coli-derived plasmid vectors such as pcDNA series (Invitrogen) and pEF series (Invitrogen); plasmid vectors derived from Bacillus subtilis such as pUB110 and pTP5; plasmid vectors derived from yeasts such as YEp13, YEp24 and YCp50.
  • Examples of the viral vector include Charon 4A, Charon 21A, EMBL3, EMBL4, ⁇ phage vectors such as ⁇ gt10, ⁇ gt11, and ⁇ ZAP; filamentous phage vectors such as M13KE and pCANTAB5E; T7 phage vectors such as T7Select series; Examples include animal DNA virus vectors or RNA virus vectors such as vaccinia virus and adenovirus; insect virus vectors such as baculovirus; plant virus vectors and the like.
  • the aptamer expression vector can be used, for example, for producing the aptamer of the present invention as follows. Specifically, for example, the aptamer of the present invention can be obtained by culturing a host into which the aptamer expression vector has been introduced, and collecting the nucleic acid from the resulting transformant after culturing.
  • the type of the host is not particularly limited, and can be appropriately set according to, for example, the type of the vector.
  • E. coli Escherichia coli
  • Escherichia genus such as Bacillus subtilis (Bacillus subtilis)
  • Bacillus such as, such as Pseudomonas putida (Pseudomonas putida) Pseudomonas, Rhizobium meliloti (Rhizobium meliloti), such as Examples include Rhizobium bacteria; yeasts such as Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe .
  • Examples of the host include animal cells such as COS cells and CHO cells; insect cells such as Sf9 and Sf21.
  • the culture conditions can be appropriately determined according to, for example, the type of the host.
  • the method for recovering the RNA aptamer from the cultured transformant is not particularly limited, and can be performed, for example, by crushing the transformant.
  • the aptamer expression vector can be transcribed in vitro, for example, and the resulting nucleic acid can be recovered as the aptamer of the present invention.
  • the antisense nucleic acid of the present invention is a nucleic acid containing a base sequence complementary to the aptamer of the present invention.
  • the antisense nucleic acid of the present invention is preferably DNA containing a base sequence complementary to the aptamer of the present invention.
  • the binding of the aptamer of the present invention to the His peptide can be suppressed as necessary.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can also be referred to as, for example, a binding inhibitory nucleic acid of the aptamer of the present invention to a His peptide.
  • anti-GFP antibody JL-8 is from Takara Bio Inc.
  • anti-His-tag antibody is from QIAGEN GmbH
  • anti-MIF antibody MAB289 is R & D Systems Inc. Purchased from the company.
  • HRP-anti-MIF antibody is available from R & D systems Inc. Purchased from the company.
  • RNA aptamer RNA aptamers comprising the sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 12 and SEQ ID NOs: 26 to 47 in Tables 2 and 5 were synthesized.
  • sequences shown in lower case letters are called common sequences, and sequences shown in upper case letters are called random sequences.
  • FIG. 3 and FIG. 4 show schematic diagrams of the predicted secondary structure of the RNA aptamer.
  • FIG. 3 is a diagram of RNA aptamers shot47 (SEQ ID NO: 2), # 701 (SEQ ID NO: 1), # 714 (SEQ ID NO: 10), # 716 (SEQ ID NO: 3) and # 746 (SEQ ID NO: 9).
  • 4 is a diagram of miniaturized aptamer # 47s (SEQ ID NO: 12). These secondary structures were predicted by GENETYX-MAC software. 3 and 4, the consensus sequence represented by SEQ ID NO: 17 is indicated by a black square with white letters. As shown in FIGS. 3 and 4, these RNA aptamers are presumed to have the consensus sequence in the bent part of the stem.
  • miniaturized RNA aptamers represented by 65 to 68 (hereinafter referred to as “miniaturized RNA aptamers”) were synthesized.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing the structures of six types of prepared fusion proteins His-MIF, HTX, HT, H, TX and T.
  • His is a His-tag (11 amino acid residues) containing poly-His linked with 6 Hiss
  • T is a peptide tag containing 10 amino acid residues of T7 gene 10 leader.
  • Xpress are Xpress TM Epitope (hereinafter, also referred to as “Xpress tag”) of 14 amino acid residues, and these are all referred to as a tag region.
  • MIF MIF of 115 amino acid residues
  • GFP GFP of 242 amino acid residues.
  • the sequence of “Xpress” can be cleaved by enterokinase between the 9th and 10th amino acids from the N-terminus.
  • Table 8 below shows the amino acid sequence of the N-terminal region and the corresponding base sequence of each fusion protein shown in FIG. 6, specifically, the base sequence and amino acid sequence of the tag region and MIF or GFP. In Table 8 below, as for the base sequence and amino acid sequence of MIF or GFP, only the 9 base length at the 5 ′ end and the 3 amino acid residues at the N end are described.
  • His-MIF a fusion polypeptide of His-tag and MIF
  • the MIF without His-tag was prepared by treating the His-MIF with enterokinase (Novagen, EMD Chemicals, Inc., USA) and cleaving the His-tag.
  • Fusion proteins containing GFP were prepared by the following methods, respectively. First, by PCR using a primer set with pRSET expression vector (Invitrogen, USA) having His-tag coding DNA, T7 gene 10 leader coding DNA and Xpress tag coding DNA, PCR was performed using the primer set shown in Table 8 above. The DNA fragment of the tag region of each fusion protein shown was amplified. The obtained DNA fragments and the GFP gene (Takara Bio Inc., Japan) were incorporated into a pCold IV expression vector (Takara Bio Inc., Japan), and this recombinant vector was further added to E. coli BL21 star (DE3) (Invitrogen). And was transformed.
  • pRSET expression vector Invitrogen, USA
  • the E. coli transformant was cultured at 15 ° C. for 18 hours in a medium containing 1 mmol / L isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside.
  • the fusion protein was expressed.
  • the cells were collected by centrifugation (5,000 ⁇ g, 10 minutes) and suspended in 20 mmol / L HEPES (pH 7.2) containing 1% Triton (registered trademark) -X100.
  • This suspension was repeatedly freeze-thawed twice, and then an equal amount of 20 mmol / L HEPES (pH 7.2) containing 300 mmol / L sodium chloride and 0.2 mmol / L magnesium acetate was added, followed by centrifugation (14 , 1,000 ⁇ g, 10 minutes). The obtained supernatant was used as a fusion protein solution. The concentration of the fusion protein in the fusion protein solution was estimated from the serially diluted sample and the result of Western blot using anti-GFP antibody.
  • the polyadenine-added RNA aptamer was introduced into a flow cell of a streptavidin chip (Sensor chip SA, GE Healthcare UK Ltd.) to which a 20-base biotinylated polythymine having a biotinylated 5 ′ end was bound, using a running buffer. did.
  • the polyadenine-added RNA aptamer was immobilized on the chip via the biotinylated polythymine by complementary binding of polyA of the polyadenine-added RNA aptamer and polythymine of the biotinylated polythymine.
  • the composition of the running buffer was 10 mmol / L HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine etheresic acid), 150 mmol / L sodium chloride, 0.1 mmol / L magnesium acetate, 0.01% Tween® 20 (PH 7.2).
  • RNA aptamer Various antibodies (anti-GFP antibody, anti-His-tag antibody or anti-MIF antibody) are adsorbed to a 96-well plate (Iwaki, AGC Techno Glass, Japan), 1% bovine Blocking was performed with serum albumin. Next, 50 ⁇ L of fusion protein (1 ⁇ g / mL), 20 mmol / L HEPES, 150 mmol / L sodium chloride, 0.1 mmol / L magnesium acetate and 0.5% Triton®-X100 are added to the plate, Incubate for 3 hours at room temperature to allow the fusion protein to bind to the plate. After incubation, the plate was washed 3 times with HBS-T. As a control, 50 ⁇ L of the HBS-T was added instead of 50 ⁇ L of the fusion protein, and incubation and washing were performed in the same manner.
  • fusion protein 1 ⁇ g / mL
  • 20 mmol / L HEPES 150 mmol / L
  • RNA aptamer 20 base polyadenine (polyA) was added to the 3 'end of the RNA aptamer to prepare a polyadenine-added RNA aptamer.
  • the polyadenine-added RNA aptamer was denatured and then mixed with 20 base biotinylated polythymine (740 nmol / L), biotinylated at the 5 ′ end, tRNA (100 ⁇ g / mL) and RNase inhibitor (0.16 units / mL).
  • a biotin-labeled RNA aptamer was prepared by complementary binding of poly A of the polyadenine-added RNA aptamer and polythymine of the biotinylated polythymine.
  • This biotin-labeled RNA aptamer was added to the plate and incubated at 4 ° C. for 30 minutes. Subsequently, the plate was washed, and 0.1 ⁇ g / mL HRP-streptavidin (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) was added. Further, after the plate was washed, 1-Step Ultra TMB substrate (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) was added for color development, and the absorbance at 450 nm was measured.
  • a culture supernatant (containing 5% fetal bovine serum) of an added rabbit kidney-derived cell line (RK-13 cell line) and an extract of Escherichia coli expressing His-GFP (HT) were used.
  • 5 ⁇ L of streptavidin-Sepharose (GE Healthcare) was added to the mixed solution and incubated at 4 ° C. for 1 hour to bind the biotin-labeled RNA aptamer to the Sepharose. After incubation, the Sepharose was washed three times with the HBS-T, a sample buffer for SDS-polyacrylamide electrophoresis was added, and heat treatment was performed at 95 ° C. for 5 minutes, thereby allowing the streptavidin to bind to biotin.
  • the fusion protein bound to the Sepharose was eluted.
  • the eluted protein was subjected to 15% SDS-polyacrylamide electrophoresis, and the protein was transferred onto a PVDF membrane (Immobilon-P, Millipore).
  • the membrane after transfer was blocked with 5% skim milk, 1 ⁇ g / mL antibody was added, and the membrane was allowed to bind at room temperature for 3 hours.
  • an anti-MIF antibody or an anti-His-tag antibody was used.
  • an HRP-anti-mouse IgG antibody (GE Healthcare) was bound. And after washing
  • RNA aptamer # 701 (SEQ ID NO: 1), shot47 (SEQ ID NO: 2), # 716 (SEQ ID NO: 3), # 727 (SEQ ID NO: 4), # 704 (SEQ ID NO: 5), # 713 (SEQ ID NO: 6), # 708 (SEQ ID NO: 7), # 718 (SEQ ID NO: 8), # 746 (SEQ ID NO: 9), # 714 (SEQ ID NO: 10), # 733 (SEQ ID NO: 11) are shown in FIG. Shown in FIG. 1 is a sensorgram of a signal detected using Biacore. In FIG.
  • FIG. 1 also shows, as a comparative example, the results of using a round 0 RNA pool (hereinafter referred to as “N40”) prepared in Example 3 described later in place of the RNA aptamer.
  • N40 round 0 RNA pool
  • the N40 has a common sequence having the same 20-base length as the RNA aptamer on the 5 ′ side and the 3 ′ side, and a pool of RNA having a 40-base-long random sequence between the common sequences. It was.
  • RNA aptamers showed binding ability to His-MIF, and among them, shot 47 showed extremely excellent binding ability. Although not shown, the binding ability to His-MIF was confirmed for the RNA aptamers of SEQ ID NOs: 26 to 47 as well.
  • FIG. 2 is a sensorgram of a signal detected using Biacore, and the vertical axis and the horizontal axis are the same as those in FIG.
  • the interaction rate constant (K a ) of shot 47 was 2.02 ⁇ 10 4 mol / L ⁇ 1 s ⁇ 1 and the dissociation rate constant (K d ) was 7.64 by intermolecular interaction analysis. It was found that ⁇ 10 ⁇ 8 s ⁇ 1 and the dissociation constant (K D ) were 3.78 ⁇ 10 ⁇ 12 mol / L.
  • the RNA aptamer shot47 has a dissociation constant of 1 ⁇ 10 ⁇ 9 mol / L of antibody against commercially available His-tag (QIAexpress Detection and Assay Handbook, QIAGEN GmbH, Hilden, Germany, Oct, 2002, p. 15.). Therefore, it was found that the aptamer is extremely excellent in binding strength.
  • RNA aptamer shot47 SEQ ID NO: 2
  • # 47s SEQ ID NO: 12
  • # 47sT SEQ ID NO: 13
  • shot47sss SEQ ID NO: 14
  • # 47sssT SEQ ID NO: 16
  • FIG. 5 is a sensorgram of a signal detected using Biacore, and the vertical axis and the horizontal axis are the same as those in FIG. The figure also shows the results of using an RNA aptamer shot 47 that was not miniaturized.
  • RNA aptamers As shown in FIG. 5, all of the miniaturized RNA aptamers exhibited binding ability to His-MIF. Among them, # 47s and shot47sss are miniaturized aptamers designed so as not to break the stem loop structure of shot47 shown in FIG. 3, and showed the same effect as shot47. From this, the stem loop structure is presumed to be an important structure for the aptamer. Moreover, # 47s and shot47sss showed binding ability superior to other miniaturized RNA aptamers.
  • RNA aptamers # 47sT (SEQ ID NO: 13) and # 47sssT (SEQ ID NO: 16) are 7 in the sequence of SEQ ID NO: 18 surrounded by the square of the base sequence of # 47s as shown in Table 7 above. Any of the 1st U, 11th U, and 15th A is deleted or substituted. Therefore, in SEQ ID NO: 18, it is important that the seventh U in the loop structure, the eleventh U, and the 15th A in the bent portion of the stem structure are preserved as shown in FIG. It is guessed.
  • FIG. 7 is a graph showing the binding ability of RNA aptamer shot47 to a fusion protein.
  • the vertical axis represents the absorbance at 450 nm indicating the binding ability (RNA aptamer binding), and shows an average value ⁇ deviation (SD) based on three measurements.
  • the horizontal axis indicates the type of fusion protein, the white bar is the result of N40, and the black bar is the result of shot 47.
  • the upper right photograph in FIG. 7 is a result of Western blotting of the used fusion protein, and it has been confirmed that various proteins are obtained by the preparation from the transformant as described above.
  • shot47 showed binding ability to fusion proteins having His-tags (HTX, HT and H), but did not have His-tag (TX and T ) Did not bind. Since all the fusion proteins have GFP, it became clear that shot47 is not bound to GFP. Among fusion proteins, HT lacks Xpress (Xpress TM Epitope), and H is a fusion protein lacking T (T7 gene 10 leader). Therefore, shot47 is bound to His-tag. It became clear. In addition, since the binding ability of shot47 is HTX ⁇ HT> H, the binding ability is further increased as the tags further include Xpress (Xpress TM Epitope) or T (T7 gene 10 leader) in addition to His-tag. I found it expensive.
  • an HRP-labeled anti-MIF polyclonal antibody (anti-MIFpAb) was added instead of the RNA aptamer, and the substrate was added in the same manner, and the absorbance at 450 nm was measured. Went.
  • FIG. 8 is a graph showing the binding ability of RNA aptamer shot47 to the fusion protein His-MIF.
  • the vertical axis represents the absorbance at 450 nm indicating the binding ability of the RNA aptamer, and shows an average value ⁇ deviation (SD) based on three measurements.
  • the open bar is the result of N40
  • the black bar is the result of shot 47
  • the gray bar is the result of detection with the HRP-labeled anti-MIF polyclonal antibody.
  • the left side is the result of His-MIF in the plate on which the anti-MIF antibody is immobilized
  • the center is the result of His-MIF in the plate on which the anti-His-tag antibody is immobilized
  • the right side is the anti-MIF antibody. It is the result of MIF in the plate which fix
  • FIG. 8 the schematic diagram of a coupling
  • FIG. 9 is a graph showing the binding ability of RNA aptamers shot47 and shot47sss to fusion protein HT.
  • the vertical axis represents the absorbance at 450 nm indicating the binding ability (RNA aptamer binding), and shows the mean value ⁇ deviation (SD) based on three measurements.
  • the horizontal axis indicates the type of RNA aptamer, the white bar is the result of N40, the black bar is the result of shot 47, and the gray bar is the result of shot 47 sss.
  • both shot47 and shot47sss showed binding ability to the fusion protein HT having His-tag.
  • FIG. 10 is a photograph of a pull-down assay showing the binding of shot47 to the fusion proteins His-MIF and HT.
  • “in buffer” is the result of using His-MIF-containing HBS-T
  • “in 5% FBS” is the result of using His-MIF-containing culture supernatant
  • “In lysate” is the result of using an extract of E. coli expressing HT.
  • “N” is the result of RNA aptamer N40
  • “47” is the result of RNA aptamer shot47
  • + is the sample in the His-MIF column.
  • fusion protein in the sample is His-MIF
  • HT indicates that the fusion protein in the sample is HT
  • ⁇ indicates that the sample does not contain both fusion proteins.
  • the fusion proteins His-MIF and HT could be pulled down by the RNA aptamer shot47.
  • HT could be pulled down from the E. coli homogenate by RNA aptamer shot47.
  • FIG. 11 The results of Northwestern blotting are shown in FIG. In FIG. 11, the numerical value of each lane indicates the concentration ( ⁇ g / lane) of His-MIF per lane. As shown in FIG. 11, the blotted fusion protein was also detectable by north western blotting using RNA aptamer shot47.
  • RNA aptamers His_1, His_2, His_3, His_4, His_5, His_6 and His_10 were synthesized. These aptamers were arranged such that the Y region, the X region and the Y ′ region were continuous from the 5 ′ side (Y region ⁇ X region ⁇ Y ′ region). In each aptamer, the sequences of the Y region and the Y ′ region are common. These sequences are shown below. In each aptamer, the X regions have different random sequences. The sequence of the X region of each aptamer, that is, the random sequence (His_1, His_2, His_3, His_4, His_5, His_6, and His_10) is shown below.
  • FIG. 12 is a sensorgram of a signal detected using Biacore.
  • the vertical axis indicates the signal intensity (RU) measured by BIACORE X
  • the horizontal axis indicates the analysis time (second).
  • 0 to 60 seconds is the time when the fusion protein was introduced.
  • FIG. 12 also shows the results of using the N40 instead of the RNA aptamer as a comparative example.
  • RNA aptamers showed binding ability to His-MIF, and among them, aptamer His_1 showed extremely excellent binding ability.
  • it is represented by the Y region (SEQ ID NO: 149) -X region-Y ′ region (SEQ ID NO: 150), where X is SEQ ID NOS: 2309 to 2312 and SEQ ID NOs: 2313 to 2347.
  • the binding ability to His-MIF was also confirmed for each RNA aptamer, which is a random sequence represented by
  • Example 3 In the known SELEX method, it was predicted that the bias during amplification by PCR was one of the factors that reduced the efficiency of obtaining the target aptamer. That is, when the number of cycles of PCR is large, it was considered that the increase in the number of sequences that are easily amplified by PCR proceeds more rapidly than the concentration of RNA that binds to the target. Therefore, an aptamer for His-MIF was prepared by the SELEX-T method in which RNA molecules are amplified in each round, not by PCR but mainly by T7 RNA polymerase.
  • RNA library SEQ ID NO: 151 comprising a 20 base long fixed sequence, a 40 base long random sequence, a 20 base long fixed sequence and a complementary sequence of the T7 promoter in this order from the 5 ′ side
  • the single stranded DNA library represented was synthesized.
  • DNA library (SEQ ID NO: 151) ACTGCACGTCCAGGCACTGA N 40 TGAGCGTACGTGAGCGTCCC TATAGTGAGTCGTATTA
  • the single-stranded DNA (50 pmol, 3 ⁇ 10 13 molecules) and the T7 promoter sequence (250 pmol) represented by SEQ ID NO: 152 were mixed, heated at 95 ° C. for 5 minutes, and then rapidly cooled.
  • a double-stranded DNA obtained by hybridizing the T7 promoter sequence to the complementary sequence of the T7 promoter of the single-stranded DNA was used as a template for RNA synthesis.
  • T7 promoter sequence SEQ ID NO: 152
  • RNA was transcribed from the template with heat-resistant T7 RNA polymerase, the template was decomposed with DNase I, and purified RNA was obtained by purification treatment.
  • the purification treatment was gel filtration, phenol-chloroform extraction, and ethanol precipitation.
  • Micro Bio-spin 30 Columns (trade name, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) was used.
  • RNA pool The purified RNA was denatured and HB-T, a final concentration of 0.4 units / mL RNase inhibitor (Toyobo Co., Ltd.) and a final concentration of 0.5 mg / mL tRNA were added to make a total of 50 ⁇ L. This was designated as an RNA pool.
  • the composition of the HB-T was 20 mmol / L HEPES, 100 mmol / L sodium chloride, 0.1 mmol / L magnesium acetate and 0.01% Tween 20 (pH 7.2).
  • the RNA pool was pretreated before being subjected to the following SELEX-T method.
  • the RNA pool was mixed with 20 ⁇ L of resin (trade name: TALON Metal Affinity Resin, Takara Bio Inc., the same applies hereinafter) at room temperature for 30 minutes. This mixture was subjected to a filter (trade name Ultrafree-MC, 5 ⁇ m, Millipore) to remove the resin and RNA bound thereto.
  • the RNA pool after this pretreatment was subjected to the following SELEX-T method as a round 0 RNA pool.
  • His-MIF and the RNA pool were mixed and allowed to bind at room temperature for 15 minutes.
  • the His-MIF is a fusion polypeptide of His-tag and MIF. , Ltd., Ltd. (Gyeonggi-do, South Korea).
  • 2.5 ⁇ L of resin (trade name: TALON Metal Affinity Resin) was added to the mixture to immobilize the complex of the fusion protein and RNA.
  • the resin was washed with the HB-T and then eluted with 150 mmol / L imidazole. Table 9 shows the number of washings using the HB-T.
  • the obtained eluate was subjected to ethanol precipitation with phenol chloroform extraction and a coprecipitation agent (trade name 5% Mate, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to purify RNA.
  • the purified RNA was subjected to RT-PCR to prepare a DNA template containing a T7 promoter.
  • 20 ⁇ L of a reaction solution of QIAGEN (registered trademark) OneStep RT-PCR Kit (QIAGEN) was used.
  • the sequences of the SELEX forward primer and the SELEX reverse primer contained in the reaction solution are shown below.
  • the primer concentration in the reaction solution was 10 ⁇ mol / L, respectively.
  • the RT-PCR conditions are as follows: treatment at 50 ° C.
  • Reverse primer for SELEX (SEQ ID NO: 153) TAATACGACTCACTATAGGGACGCTCACGTACGCTCA Reverse primer for SELEX (SEQ ID NO: 154) ACTGCACGTCCAGGCACTGA
  • RNA was synthesized using a heat-resistant T7 RNA polymerase and a T promoter primer, the template was decomposed with DNase I, and purified RNA was obtained by purification treatment.
  • the sequence of the T7 promoter primer is shown below.
  • the purification treatment was gel filtration, phenol-chloroform extraction, and ethanol precipitation.
  • Micro Bio-spin 30 Columns (trade name, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) was used.
  • the purified RNA thus obtained was used as the next round RNA pool.
  • the above process was repeated 7 rounds. The conditions in each round are shown in Table 9 below.
  • Primer for T7 promoter TAATACGACTCACTATA SEQ ID NO: 155)
  • RNA pools (0.1 ⁇ g) and seven round RNA pools (0.1 ⁇ g) obtained by the SELEX-T method are subjected to RT-PCR, and cDNA containing restriction enzyme sites was made.
  • RT-PCR QIAGEN (registered trademark) OneStep RT-PCR Kit (QIAGEN) was used.
  • the primer the following sequence forward primer and sequence reverse primer were used.
  • the primer concentration in the RT-PCR reaction solution was 10 ⁇ mol / L, respectively.
  • Sequence forward primer (SEQ ID NO: 156) TCGACCTCGAGAAAAAAAAAAAAGGGACGCTCACGTACGCTCA Reverse primer for sequence (SEQ ID NO: 157) GAGTCGCGGCCGCTTTTTTTTTTACTGCACGTCCAGGCACTGA
  • the obtained PCR product was purified with MiniElute PCR Purification kit (QIAGEN GmbH), digested with restriction enzymes Xho I and Not I, and incorporated into a plasmid vector for base sequence determination.
  • the plasmid was introduced into E. coli (DH5 ⁇ competent cell, Toyobo Co. Ltd.).
  • E. coli DH5 ⁇ competent cell, Toyobo Co. Ltd.
  • 113 clones were obtained from 6 rounds of RNA-derived cDNA
  • 105 clones were obtained from 7 rounds of RNA-derived cDNA.
  • the obtained clone was amplified using Templiphi DNA amplification kit (GE Healthcare), and the base sequence was determined.
  • the RNA pools of 2 to 5 rounds obtained by the SELEX-T method were prepared by using the PCR primers for sequencing, and then the nucleotide sequence was determined by the Roche Genome Sequencer FLX system.
  • RNA pool starting RNA
  • amount of His-MIF mixed with the RNA pool the number of washings of the complex
  • number of PCR cycles the number of PCR cycles
  • synthesis with T7 RNA polymerase The RNA pool of RNA having the conserved sequence represented by SEQ ID NO: 17 common to the amount of RNA (amplified RNA) obtained in this manner, the number of binding of the RNA pool to His-MIF, and the aptamer that binds to His-MIF The ratio is shown.
  • RNA aptamers obtained by round 7 are shown in Table 10 below. As shown in Table 2 and Table 5, all RNA aptamers obtained in Round 7 shown in Table 10 below contained the conserved sequence shown in SEQ ID NO: 17 and a sequence almost equivalent thereto.
  • FIG. 13 shows the results of intermolecular interaction analysis for SEQ ID NO: 11).
  • FIG. 13 is a sensorgram of a signal detected using Biacore.
  • FIG. 13 also shows the results of using N40 instead of the RNA aptamer. As shown in the figure, in the round 7, the binding ability of the RNA pool is remarkably improved. Moreover, it was shown that all the RNA aptamers contained in the round 7 RNA pool have binding ability. From this result, the SELEX-T method is considered to be highly practical.
  • the aptamer of the present invention is superior in binding power to the His peptide as compared with, for example, a general anti-His peptide antibody that binds to the His peptide. For this reason, for example, in the detection of a His peptide, it can be used in place of the anti-His peptide antibody and can be detected with better accuracy. Thus, the aptamer of the present invention is a very useful tool for detecting His peptides in biological techniques, for example.

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Abstract

　ヒスチジンペプチドに結合可能なアプタマーを提供する。 下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のいずれかの核酸を、ヒスチジンペプチドに結合可能なアプタマーとして使用する。 （ａ）ＧＧＵＮｎＡＹＵｍＧＧＨで表わされる塩基配列を含む核酸 ここで、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴを表わし、Ｎｎのｎは、前記Ｎの個数であって、１～３の整数を表わし、Ｙは、Ｕ、ＴまたはＣを表わし、Ｕｍのｍは、前記Ｕの個数であって、１～３の整数を表わし、Ｈは、Ｕ、Ｔ、ＣまたはＡを表わす。 （ｂ）前記（ａ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記ヒスチジンペプチドに結合可能である核酸 （ｃ）ＧＧＣＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣで表わされる塩基配列を含む核酸 （ｄ）前記（ｃ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記ヒスチジンペプチドに結合可能である核酸

Description

ペプチドを認識するアプタマー
　本発明は、ペプチドを認識するアプタマーに関し、詳細には、ヒスチジンペプチドを認識するアプタマーに関する。
　ターゲットを認識して特異的に結合する結合分子として、モノクローナル抗体等の抗体が、広く研究されている。抗体は、一般的に、動物への免疫により作製される。しかしながら、例えば、イオン原子およびペプチド等の低分子化合物、または生物種間で高度に保存された抗原に対する抗体は、作製が困難である。このため、必ずしも、前記ターゲットに特異的に結合する抗体が入手できるとは限らない。そこで、近年、抗体に代わり、前記ターゲットに特異的に結合する、ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡオリゴヌクレオチド等の核酸分子が注目されている。前記核酸分子は、一般的に、アプタマーと呼ばれる。アプタマーについては、例えば、前述のように、抗体を得ることが困難である低分子化合物等のターゲットに特異的に結合するものを取得可能であることが、報告されている（非特許文献１）。
　このように、抗体の作成が困難である前記ターゲットに対して、特異的に結合するアプタマーの取得が可能であることから、アプタマーは、例えば、以下に示すように、生化学および医療の分野における重要なツールとして利用が試みられている。
　アプタマーは、例えば、化学的に大量合成が可能である。また、アプタマーには、免疫原性が低く、ターゲットに対して抗体よりも強い結合能を示すものがある。このため、アプタマーは、優れた分子標的薬の候補となり得る（非特許文献２）。具体例として、ペガプタニブ（一般名Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ、商品名Ｍａｃｕｇｅｎ）は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に結合するアプタマーとして知られている。このアプタマーは、実際に、加齢黄斑変性症の治療薬として、米国、欧州および日本で承認されている（非特許文献３）。この他にも、現在、少なくとも５種類のアプタマーについて、米国で臨床治験が行われている。
　また、アプタマーを、新たな分子センサーとして利用するための研究も盛んに行われている。例えば、血清タンパク質（非特許文献４）、コカイン（非特許文献５）またはイオン（非特許文献６）等のターゲットに対するアプタマーは、前記ターゲットに結合することで、その高次構造が変化する。この特徴を活かした、前記ターゲットの測定法が開発されている（非特許文献７）。
　また、アプタマーを、例えば、タンパク質等のアフィニティー精製に使用することも試みられている。この方法によれば、例えば、抗体を使用する従来法に比べて、ペプチド等のタンパク質由来物質のコンタミネーションを、極めて低減できる。このため、この方法によれば、例えば、医学的および生化学的に、非常に価値の高い精製品が得られる（非特許文献８）。
　他方、従来、目的タンパク質を大量合成する際、数個から数十個のアミノ酸が連続したペプチドをタグとして、前記目的タンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合させた、融合タンパク質を発現させる方法が知られている。この方法によれば、前記融合タンパク質の前記タグを手掛かりに、前記目的タンパク質の発現の確認および前記目的タンパク質の精製が可能である。前記タグは、例えば、数個のヒスチジンを含むヒスチジンペプチドが、いわゆるヒスチジンタグとして、広く用いられている。前記ヒスチジンタグを付加した融合タンパク質は、例えば、ニッケルイオンカラムまたは抗ヒスチジンタグ抗体等により精製可能である。しかし、前記ニッケルイオンカラムは非特異的吸着が多く、前記抗ヒスチジン抗体は高価である、等の問題点を有する。そこで、ヒスチジンタグを使用した前記目的タンパク質の精製において、新たな抗ヒスチジンタグ抗体または前記抗体に代わる結合分子の開発が進められている。
Mairal　T.ら,　「Anal.　Bioanal.　Chem.」,　2008年,　第390巻,　pp.989-1007 Bunka　D.H.およびStockley　P.G.,　「Nat.　Rev.　Microbiol.」,　2006年,　第4巻,　pp.588-596 Nimjee　S.M.ら,　「Trends　Cardiovasc.　Med.」,　2005年,　第15巻,　pp.41-45 Nimjee　S.M.ら,　「Annu.　Rev.　Med.」,　2005年,　第56巻,　pp.555-583 Ng　E.W.ら,　「Nat.　Rev.　Drug　Discov.」,　2006年,　第5巻,　pp.123-132 Huang　Y.C.ら,　「J.　Am.　Chem.　Soc.」,　2008年,　第130巻,　pp.8023-8029 Deng　C.ら,　「Anal.　Chem.」,　2009年,　第81巻,　pp.739-745 Xu　H.ら,　「Anal.　Chem.」,　2009年,　第81巻,　pp.669-675
　そこで、本発明の目的は、ヒスチジンペプチドに結合可能なアプタマーを提供することにある。
　本発明のアプタマーは、ヒスチジンペプチドに結合可能なアプタマーであり、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のいずれかの核酸であることを特徴とする。
（ａ）配列番号１７で表わされる塩基配列を含む核酸
　　　　ＧＧＵＮｎＡＹＵｍＧＧＨ　（配列番号１７）
ここで、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴを表わし、Ｎｎのｎは、前記Ｎの個数であって、１～３の整数を表わし、Ｙは、Ｕ、ＴまたはＣを表わし、Ｕｍのｍは、前記Ｕの個数であって、１～３の整数を表わし、Ｈは、Ｕ、Ｔ、ＣまたはＡを表わす。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記ヒスチジンペプチドに結合可能である核酸
（ｃ）配列番号１８で表わされる塩基配列を含む核酸
　　　　ＧＧＣＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ　（配列番号１８）
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記ヒスチジンペプチドに結合可能である核酸
　本発明の試薬は、前記本発明のアプタマーを含むことを特徴とする。本発明のキットは、前記本発明のアプタマーを含むことを特徴とする。
　本発明のアプタマー製造用核酸は、本発明のアプタマーを製造するための核酸であって、本発明のアプタマーに相補的な塩基配列を含む核酸である。
　本発明のアンチセンス核酸は、前記本発明のアプタマーに相補的な塩基配列を含むことを特徴とする。
　本発明の同定方法は、ターゲットに結合可能なアプタマーの同定方法であり、下記（ｉ）工程～（ｉｖ）工程を含むことを特徴とする。
（ｉ）ＲＮＡプールと、ターゲットとを混合する工程
（ｉｉ）前記ＲＮＡプールから、前記ターゲットと結合するＲＮＡを分離する工程
（ｉｉｉ）分離したＲＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼを用いてｃＤＮＡを合成する工程
（ｉｖ）前記ｃＤＮＡを鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡを合成する工程
　本発明のアプタマーは、例えば、ヒスチジンペプチドに結合する一般的な抗ヒスチジンペプチド抗体と比較して、前記ヒスチジンペプチドに対する結合力が優れている。このため、例えば、前記ヒスチジンペプチドの検出において、前記抗ヒスチジンペプチド抗体に代わって使用でき、且つ、より優れた精度での検出が可能となる。このように、本発明のアプタマーは、例えば、生物学的手法における前記ヒスチジンペプチドの検出に、極めて有用なツールである。
図１は、本発明の実施例における各種アプタマーのセンサーグラムである。 図２は、本発明の実施例におけるアプタマーｓｈｏｔ４７のセンサーグラムである。 図３は、本発明の実施例における各種アプタマーの推定二次構造を示す模式図である。 図４は、本発明の実施例におけるアプタマー＃４７ｓの二次構造を示す模式図である。 図５は、本発明の実施例における各種アプタマーのセンサーグラムである。 図６は、本発明の実施例における各種融合タンパク質の構造を示す模式図である。 図７は、本発明の実施例におけるアプタマーｓｈｏｔ４７の各種融合タンパク質への結合を示すグラフである。 図８は、本発明の実施例におけるアプタマーｓｈｏｔ４７の融合タンパク質への結合を示すグラフである。 図９は、本発明の実施例における各種アプタマーの融合タンパク質への結合を示すグラフである。 図１０は、本発明の実施例におけるアプタマーｓｈｏｔ４７の各種融合タンパク質への結合を示すブロッティング写真である。 図１１は、本発明の実施例におけるアプタマーｓｈｏｔ４７のＨｉｓ－ＭＩＦへの結合を示すブロッティング写真である。 図１２は、本発明の実施例における各種アプタマーのセンサーグラムである。 図１３は、本発明の実施例における各種アプタマーのセンサーグラムである。
　本発明において、以下、ヒスチジンを「Ｈｉｓ」、ヒスチジンペプチドを「Ｈｉｓペプチド」という。Ｈｉｓペプチドは、前述のように、ヒスチジンタグとして使用できる。前記ヒスチジンタグを、以下、「Ｈｉｓ－ｔａｇ」という。前記Ｈｉｓペプチドは、以下、Ｈｉｓ－ｔａｇに読み替え可能である。前記Ｈｉｓペプチドに結合可能なアプタマーを、以下、「Ｈｉｓペプチドアプタマー」、「Ｈｉｓ－ｔａｇアプタマー」または「アプタマー」という。
　本発明において、前記Ｈｉｓペプチドは、複数個のＨｉｓを有するペプチドを意味する。前記Ｈｉｓペプチドは、例えば、複数個の連続するＨｉｓのみからなるペプチド、すなわち、ポリＨｉｓペプチド（以下、「ポリＨｉｓ」という）でもよいし、前記ポリＨｉｓペプチドを含むペプチド、すなわち、前記ポリＨｉｓのＮ末端側およびＣ末端側の少なくとも一方に、さらに付加配列を有するペプチドでもよい。前記付加配列は、例えば、１個のアミノ酸残基でもよいし、２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドであってもよい。また、前記Ｈｉｓペプチドは、例えば、不連続な複数個のＨｉｓを含むペプチド、すなわち、複数個のＨｉｓとその他のアミノ酸を含むペプチドであってもよい。本発明において、前記Ｈｉｓペプチドの長さは、特に制限されないが、アミノ酸残基数が、例えば、６～３０個であり、好ましくは６～１５個であり、より好ましくは８～１５個である。前記ＨｉｓペプチドにおけるポリＨｉｓのヒスチジンの個数は、例えば、６～１０個が好ましく、より好ましくは６～８個である。
＜アプタマー＞
　本発明のアプタマーは、前述のように、Ｈｉｓペプチドに結合可能なアプタマーであり、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のいずれかの核酸であることを特徴とする。
（ａ）配列番号１７で表わされる塩基配列を含む核酸
　　　　ＧＧＵＮｎＡＹＵｍＧＧＨ　（配列番号１７）
ここで、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴを表わし、Ｎｎのｎは、前記Ｎの個数であって、１～３の整数を表わし、Ｙは、Ｕ、ＴまたはＣを表わし、Ｕｍのｍは、前記Ｕの個数であって、１～３の整数を表わし、Ｈは、Ｕ、Ｔ、ＣまたはＡを表わす。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸
（ｃ）配列番号１８で表わされる塩基配列を含む核酸
　　　　ＧＧＣＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ　（配列番号１８）
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸
　前記（ａ）のアプタマーは、配列番号１７で表わされる塩基配列を含む核酸であればよい。以下、配列番号１７で表わされる塩基配列を、「結合モチーフ配列」ともいう。配列番号１７で表わされる結合モチーフ配列において、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴを表わし、Ａ、Ｇ、ＣまたはＵが好ましく、Ｎｎのｎは、前記Ｎの個数であって、１～３の整数を表わし、Ｙは、Ｕ、ＴまたはＣを表わし、ＵまたはＣが好ましく、Ｕｍのｍは、前記Ｕの個数であって、１～３の整数を表わし、Ｈは、Ｕ、Ｔ、ＣまたはＡを表わし、Ｕ、ＣまたはＡが好ましい。前記結合モチーフ配列は、後述する配列番号１～１６で表わされる塩基配列等に共通して見出されるコンセンサス配列である。前記結合モチーフ配列において、ＮｎにおけるＮの個数（ｎ）は、特に制限されず、例えば、１個（Ｎ）、２個（ＮＮ）または３個（ＮＮＮ）のいずれであってもよく、Ｎは、それぞれ同じ塩基でもよいし、異なる塩基でもよい。前記結合モチーフ配列において、ＵｍにおけるＵの個数（ｍ）は、特に制限されず、例えば、１個（Ｕ）、２個（ＵＵ）または３個（ＵＵＵ）のいずれであってもよい。
　前記（ａ）のアプタマーは、例えば、下記（ａ１）の核酸があげられる。
（ａ１）配列番号８９～１０４のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
　これらの配列番号で表わされる塩基配列は、それぞれ、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列を有する。前記（ａ１）のアプタマーは、例えば、これらの配列番号のうち、いずれの配列番号で表わされる塩基配列からなる核酸でもよいし、いずれの配列番号で表わされる塩基配列を含む核酸であってもよい。下記表１に、配列番号８９～１０４で表わされる塩基配列を示す。下記表１において、下線部は、配列番号１７で表わされる結合モチーフ配列である。以下、本発明において、下記表１における各アプタマーは、配列の前に示す名称で示すこともある（以下、同様）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　前記（ａ１）のアプタマーは、具体例として、例えば、下記（ａ１－１）の核酸があげられる。
（ａ１－１）配列番号１～１６のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
　配列番号１～１６で表わされる塩基配列は、それぞれ、前述した配列番号８９～１０４で表わされる塩基配列を含む。前記（ａ１－１）のアプタマーは、例えば、配列番号１～１６のいずれかで表わされる塩基配列からなる核酸でもよいし、いずれかの塩基配列を含む核酸であってもよい。下記表２に、配列番号１～１６で表わされる塩基配列を示す。下記表２において、下線部が、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列である。以下、本発明において、下記表２における各アプタマーは、配列の前に示す名称で示すこともある（以下、同様）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　前記（ａ）のアプタマーは、この他に、具体例として、例えば、下記（ａ２）の核酸があげられる。
（ａ２）配列番号１０５～１１４、配列番号１１６～１２４および配列番号１２７～１４６のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
　これらの配列番号で表わされる塩基配列は、それぞれ、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列を有する。前記（ａ２）のアプタマーは、例えば、これらの配列番号のうち、いずれの配列番号で表わされる塩基配列からなる核酸でもよいし、いずれの配列番号で表わされる塩基配列を含む核酸であってもよい。下記表３および表４に、配列番号１０５～１１４、配列番号１１６～１２４、配列番号１２７～１４６で表わされる塩基配列を示す。下記表３および表４において、下線部は、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列である。以下、本発明において、下記表３および表４における各アプタマーは、配列の前に示す名称で示すこともある（以下、同様）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　前記（ａ２）のアプタマーは、具体例として、例えば、下記（ａ２－１）の核酸があげられる。
（ａ２－１）配列番号２６～３５、配列番号３７～４５、配列番号６５～６８、配列番号１９～２５および配列番号４８～５６のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
　配列番号２６～３５、配列番号３７～４５、配列番号６５～６８、配列番号１９～２５および配列番号４８～５６で表わされる塩基配列は、それぞれ、前述した配列番号１０５～１１４、配列番号１１６～１２４および配列番号１２７～１４６で表わされる塩基配列を含む。前記（ａ２－１）のアプタマーは、例えば、これらの配列番号のうち、いずれの配列番号で表わされる塩基配列からなる核酸でもよいし、いずれの配列番号で表わされる塩基配列を含む核酸であってもよい。下記表５および表６に、配列番号２６～３５、配列番号３７～４５、配列番号６５～６８、配列番号１９～２５および配列番号４８～５６で表わされる塩基配列を示す。下記表５および表６において、下線部が、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列である。以下、本発明において、下記表５および表６における各アプタマーは、配列の前に示す名称で示すこともある（以下、同様）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　前記（ａ）のアプタマーは、この他に、具体例として、例えば、下記（ａ３）の核酸があげられる。
（ａ３）配列番号１４７で表わされる塩基配列を含む核酸
　　　ＧＧＵＮｎＡＹＵｍＧＧＨＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ　（配列番号１４７）
　配列番号１４７で表わされる塩基配列において、「ＧＧＵＮｎＡＹＵｍＧＧＨ」は、前述した配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列であり、前述の通りである。また、配列番号１４７で表わされる塩基配列において、「ＧＧＨＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ」は、後述する配列番号１８で表わされる塩基配列（ここで、ＨはＣ）であり、後述の通りである。配列番号１８で表わされる塩基配列は、例えば、アプタマーにおいて、ステムループ構造を形成する領域の塩基配列であり、以下、「ステムループモチーフ配列」ともいう。配列番号１４７で表わされる塩基配列において、前記結合モチーフ配列の３’末端の３塩基と、前記ステムループモチーフ配列の５’末端の３塩基とは重複している。
　配列番号１４７で表わされる塩基配列は、例えば、配列番号１４８で表わされる塩基配列があげられる。
　　　ＧＧＵＡＵＡＵＵＧＧＣＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ　（配列番号１４８）
　前記（ａ３）のアプタマーは、具体例として、例えば、下記（ａ３－１）の核酸があげられる。
（ａ３－１）配列番号２、１２、１４、１５および５５のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
　配列番号２、１２、１４、１５および５５で表わされる塩基配列は、それぞれ、前述した配列番号１４７、具体的には、配列番号１４８で表わされる塩基配列を含む。前記（ａ３－１）のアプタマーは、例えば、これらの配列番号のうち、いずれの配列番号で表わされる塩基配列からなる核酸でもよいし、いずれの配列番号で表わされる塩基配列を含む核酸であってもよい。下記表７に、配列番号２、１２、１４、１５および５５で表わされる塩基配列を示す。下記表７において、下線部が、配列番号１７で表わされる塩基配列であり、四角で囲んだ領域が、配列番号１８で表わされる塩基配列である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　前記（ａ）のアプタマーは、この他に、具体例として、例えば、下記（ａ４）の核酸があげられる。前記（ａ４）のアプタマーは、例えば、これらの配列番号のうち、いずれの配列番号で表わされる塩基配列からなる核酸でもよいし、いずれの配列番号で表わされる塩基配列を含む核酸であってもよい。
（ａ４）配列番号１５８～２３０２および配列番号２３０３～２３１２のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
　前記（ａ）のアプタマーは、さらに、この他に、具体例として、例えば、下記（ａ５）の核酸があげられる。前記（ａ５）のアプタマーは、例えば、これらの配列番号のうち、いずれの配列番号で表わされる塩基配列からなる核酸でもよいし、いずれの配列番号で表わされる塩基配列を含む核酸であってもよい。
（ａ５）配列番号２３１３～２３４７のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
　前記（ｂ）のアプタマーは、前述のように、前記（ａ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸である。「１または複数」とは、特に制限されないが、配列番号１７で表わされる塩基配列において、例えば、１～５個であり、好ましくは１～４個であり、より好ましくは１～３個であり、さらに好ましくは１個または２個であり、特に好ましくは１個である。また、前記（ｂ）のアプタマーは、例えば、前述した、前記（ａ）のアプタマーで列挙した各配列番号で表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸であってもよい。この場合、「１または複数」とは、特に制限されないが、前記塩基配列において、例えば、１～１０個であり、好ましくは１～５個であり、より好ましくは１～４個であり、さらに好ましくは１～３個であり、特に好ましくは１個または２個であり、最も好ましくは１個である。また、前記（ｂ）のアプタマーは、例えば、前記（ａ）のアプタマーの全長塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸であってもよい。この場合、「１または複数」とは、特に制限されないが、前記全長配列において、例えば、１～１０個であり、好ましくは１～５個であり、より好ましくは１～４個であり、さらに好ましくは１～３個であり、特に好ましくは１個または２個であり、最も好ましくは１個である。
　置換、付加または挿入に使用する塩基は、特に制限されず、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＴがあげられ、この他にも、例えば、修飾塩基、人工塩基等があげられる。前記修飾塩基としては、例えば、２’－フルオロピリミジン、２’－Ｏ－メチルピリミジン等があげられる。また、塩基の置換、付加または挿入は、例えば、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを用いてもよいし、デオキシヌクレオシドまたはデオキシヌクレオチドを用いてもよく、この他に、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）等を用いてもよい。
　前記（ｂ）のアプタマーとしては、例えば、前記表３および表５に示す塩基配列を含む核酸があげられる。具体例としては、例えば、配列番号１１５（＃７３６）または配列番号３６（＃７３６）で表わされる塩基配列を含む核酸または前記塩基配列からなる核酸があげられる。配列番号３６で表わされる塩基配列は、配列番号１１５で表わされる塩基配列を含む。配列番号１２５（＃７００９）および配列番号４６（＃７００９）で表わされる塩基配列を含む核酸または前記塩基配列からなる核酸があげられる。配列番号４６で表わされる塩基配列は、配列番号１２５で表わされる塩基配列を含む。前記表３および表５において、これらの塩基配列の二重下線部は、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列に対応し、四角で囲んだ塩基は、配列番号１７で表わされる塩基配列と異なる置換塩基である。また、配列番号１２６（＃７０６２）および配列番号４７（＃７０６２）で表わされる塩基配列からなる核酸または前記塩基配列を含む核酸があげられる。前記表３および表５において、これらの塩基配列の二重下線部は、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列に対応し、四角で囲んだ塩基（ＵＵ）のいずれか一方が、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列のＡとは異なる置換塩基である。また、配列番号１４３（＃ＡＴ５－５）および配列番号５３（＃ＡＴ５－５）で表わされる塩基配列からなる核酸または前記塩基配列を含む核酸があげられる。
　本発明のアプタマーとしては、例えば、下記（ｅ）または（ｆ）の核酸でもよい。
（ｅ）前記（ａ）の塩基配列において、６０％以上の相同性を有する塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸
（ｆ）前記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸
　前記（ｅ）において、前記相同性は、例えば、７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算することにより、算出できる。前記（ｅ）のアプタマーは、例えば、前記（ａ）のアプタマーにおける配列番号１７で表わされる塩基配列において、前記相同性を有する塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。前記（ｅ）のアプタマーは、例えば、前記（ａ）のアプタマーで列挙した前記各配列番号で表わされる塩基配列において、前記相同性を有する塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。また、前記（ｅ）のアプタマーは、例えば、前記（ａ）のアプタマーの全長塩基配列において、前記相同性を有する塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。
　前記（ｆ）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、当該技術分野の当業者において、周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、０．７～１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６０～６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１～２倍のＳＳＣ溶液を用い、６５～６８℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。１×ＳＳＣとは、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムからなる。前記（ｆ）のアプタマーは、例えば、前記（ａ）のアプタマーにおける配列番号１７で表わされる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。前記（ｆ）のアプタマーは、例えば、前記（ａ）のアプタマーで列挙した前記各配列番号で表わされる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。また、前記（ｆ）のアプタマーは、例えば、前記（ａ）のアプタマーの全長塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。
　また、本発明のアプタマーは、例えば、前記（ａ）のアプタマーで列挙した各配列の部分配列を含む核酸であり、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。前記部分配列は、例えば、連続する複数の塩基からなる配列であり、好ましくは、連続する５～４０個、より好ましくは８～３０個、特に好ましくは１０～１２個の塩基配列である。
　つぎに、前記（ｃ）のアプタマーは、前述のように、配列番号１８で表わされる塩基配列を含む核酸である。配列番号１８で表わされる塩基配列は、前述のように、例えば、前記アプタマーにおいて、ステムループ構造を形成する領域の塩基配列である。
　　　　ＧＧＣＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ　（配列番号１８）
　前記（ｃ）のアプタマーとしては、例えば、配列番号２、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５および配列番号５５で表わされる塩基配列を含む核酸があげられる。前記（ｃ）のアプタマーは、例えば、これらの配列番号のうち、いずれの配列番号で表わされる塩基配列からなる核酸でもよいし、いずれの配列番号で表わされる塩基配列を含む核酸であってもよい。これらの塩基配列は、前記表７に示す通りである。
　前記（ｄ）のアプタマーは、前述のように、前記（ｃ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸である。「１または複数」とは、特に制限されないが、配列番号１８で表わされる塩基配列において、例えば、１～５個であり、好ましくは１～４個であり、より好ましくは１～３個であり、さらに好ましくは１個または２個であり、特に好ましくは１個である。また、前記（ｄ）のアプタマーは、例えば、前述した、配列番号２、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５および配列番号５５で表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸であってもよい。この場合、「１または複数」とは、特に制限されないが、前記塩基配列において、例えば、１～１０個であり、好ましくは１～５個であり、より好ましくは１～４個であり、さらに好ましくは１～３個であり、特に好ましくは１個または２個であり、最も好ましくは１個である。また、前記（ｄ）のアプタマーは、前記（ｃ）のアプタマーの全長塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸であってもよい。この場合、「１または複数」とは、特に制限されないが、前記全長配列において、例えば、１～１０個であり、好ましくは１～５個であり、より好ましくは１～４個であり、さらに好ましくは１～３個であり、特に好ましくは１個または２個であり、最も好ましくは１個である。前記（ｄ）のアプタマーは、例えば、配列番号１８で表わされる塩基配列により形成されるステムループ構造と実質的に同一のステムループ構造を有することが好ましい。
　置換、付加または挿入に使用する塩基は、特に制限されず、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＴがあげられ、この他にも、例えば、修飾塩基、人工塩基等があげられる。前記修飾塩基としては、例えば、２’－フルオロピリミジン、２’－Ｏ－メチルピリミジン等があげられる。また、塩基の置換、付加または挿入は、例えば、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを用いてもよいし、デオキシヌクレオシドまたはデオキシヌクレオチドを用いてもよく、この他に、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）等を用いてもよい。
　前記（ｄ）のアプタマーとしては、例えば、配列番号１３、配列番号６５～６８、配列番号１６、配列番号５４および配列番号５６で表わされる塩基配列からなる核酸または前記塩基配列を含む核酸等があげられる。これらの塩基配列を、前記表７に示す。前記表７に示す配列番号１３、配列番号６５～６８、配列番号１６、配列番号５４および配列番号５６で表わされる塩基配列において、四角で囲んだ塩基が、配列番号１８で表わされるステムループモチーフ配列と比較して、同一部位であり、白抜きで示した塩基が、前記ステムループモチーフ配列と比較して、欠失または置換された部位である。前記表７において、欠失部位は、「－」で示す。前記（ｄ）のアプタマーは、例えば、配列番号１８で表わされるステムループモチーフ配列において、７番目および１１番目のＵならびに１５番目のＡが保存されていることが好ましい。
　本発明のアプタマーとしては、例えば、下記（ｇ）または（ｈ）の核酸でもよい。
（ｇ）前記（ｃ）の塩基配列において、６０％以上の相同性を有する塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸
（ｈ）前記（ｃ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸
　前記（ｇ）において、前記相同性は、例えば、７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記（ｇ）のアプタマーは、例えば、前記（ｃ）のアプタマーにおける配列番号２、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５および配列番号５５で表わされる塩基配列において、前記相同性を有する塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。前記（ｇ）のアプタマーは、例えば、前記（ｃ）のアプタマーで列挙した前記各配列番号で表わされる塩基配列において、前記相同性を有する塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。また、前記（ｇ）のアプタマーは、例えば、前記（ｃ）のアプタマーの全長塩基配列において、前記相同性を有する塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。前記（ｇ）のアプタマーは、例えば、配列番号１８で表わされる塩基配列により形成されるステムループ構造と実質的に同一のステムループ構造を有することが好ましい。
　前記（ｈ）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、前述の通りである。前記（ｈ）のアプタマーは、例えば、前記（ｃ）のアプタマーにおける配列番号２、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５および配列番号５５で表わされる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。前記（ｈ）のアプタマーは、例えば、前記（ｃ）のアプタマーで列挙した前記各配列番号で表わされる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。また、前記（ｈ）のアプタマーは、例えば、前記（ｃ）のアプタマーの全長塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。前記（ｈ）のアプタマーは、例えば、配列番号１８で表わされる塩基配列により形成されるステムループ構造と実質的に同一のステムループ構造を有することが好ましい。
　また、本発明のアプタマーは、例えば、前記（ｃ）のアプタマーで列挙した各配列の部分配列を含む核酸であり、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。前記部分配列は、例えば、連続する複数の塩基からなる配列であり、好ましくは、連続する５～４０個、より好ましくは８～３０個、特に好ましくは１０～１２個の塩基配列である。
　本発明のアプタマーの一例として、図３に、アプタマーｓｈｏｔ４７（配列番号２）、＃７０１（配列番号１）、＃７１６（配列番号３）、＃７１４（配列番号１０）および＃７４６（配列番号９）の予想される二次構造の模式図を示す。図３において、白抜きの文字で示された配列が、これらのコンセンサス配列であり、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列である。前記結合モチーフ配列は、図３において、ステムの折れ曲がった部分に位置する。本発明は、これには制限されない。
　本発明のアプタマーの一例として、さらに、図４に、アプタマー＃４７ｓ（配列番号１２）の予想される二次構造の模式図を示す。図４において、白抜きの文字で示された１２番目から２２番目の配列が、前記コンセンサス配列、すなわち、配列番号１７の結合モチーフ配列である。図４において、前記結合モチーフ配列の３’領域における２０番目から、３８番目までの配列が、配列番号１８で表わされる前記ステムループモチーフ配列である。図４において、アプタマー＃４７ｓにおける前記ステムループモチーフ配列は、分子内アニーリングによって、ステムループ構造を形成している。また、図４において、前記結合モチーフ配列は、ステムの折れ曲がった部分に位置している。本発明は、これには制限されない。
　本発明のアプタマーの形態は、特に制限されないが、一例として、例えば、Ｙ領域、Ｘ領域およびＹ’領域を含み、５’末端から前記Ｙ領域、前記Ｘ領域および前記Ｙ’領域が連結したアプタマーがあげられる。本形態のアプタマーにおいて、前記Ｘ領域が、例えば、前記（ａ）～（ｈ）の核酸に含まれる前記塩基配列を有することが好ましい。具体例として、前記Ｘ領域は、例えば、前記表１、表３および表４に列挙したいずれかの配列番号で表わされる塩基配列、または、配列番号１５８～２３０２、配列番号２３０３～２３１２および配列番号２３１３～２３４７のいずれかで表わされる塩基配列を有することが好ましい。
　本形態のアプタマーは、例えば、前記Ｘ領域の５’側上流、すなわち前記Ｙ領域、および、前記Ｘ領域の３’側下流、すなわち前記Ｙ’領域の少なくとも一方に、プライマーがアニーリング可能なプライマー配列およびポリメラーゼが認識可能なポリメラーゼ認識配列を有することが好ましい。このように、例えば、プライマー配列およびポリメラーゼ認識配列を有することによって、例えば、プライマーおよびポリメラーゼ等を用いた逆転写反応および／または核酸増幅反応により、本発明のアプタマーを増幅できる。前記ポリメラーゼ認識配列は、例えば、核酸増幅で使用するポリメラーゼの種類に応じて適宜決定できる。前記ポリメラーゼの認識配列は、例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの認識配列（以下、「ＲＮＡポリメラーゼ認識配列」ともいう）が好ましく、具体例としては、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの認識配列であるＴ７プロモーター等があげられる。本形態のアプタマーがＲＮＡの場合、例えば、５’末端側の前記Ｙ領域は、前記ＲＮＡポリメラーゼ認識配列と前記プライマー配列（以下、「５’末端側プライマー配列」ともいう）とを、この順序で有することが好ましい。そして、前記Ｙ領域の３’末端側に、前記Ｘ領域が連結されていることが好ましい。さらに、前記Ｘ領域の３’末端側に、前記Ｙ’領域が連結され、前記Ｙ’領域が、前記プライマー配列（以下、「３’末端側プライマー配列」ともいう）を有することが好ましい。前記ＲＮＡにおける前記５’末端側プライマー配列とは、例えば、前記ＲＮＡを鋳型として合成したＤＮＡアンチセンス鎖の３’末端に対して相補的な配列、つまり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合可能なプライマーと同様の配列であることが好ましい。また、本形態のアプタマーは、例えば、前記Ｙ領域と前記Ｘ領域、および、前記Ｘ領域と前記Ｙ’領域が、それぞれ、直接隣接してもよいし、介在配列を介して間接的に隣接してもよい。前記Ｙ領域およびＹ’領域は、特に制限されず、例えば、当業者であれば、使用するプライマーおよびポリメラーゼの種類に応じて、適宜設定できる。
　前記Ｙ領域およびＹ’領域の塩基配列は、それぞれ、特に制限されず、任意に決定できる。前記Ｙ領域の一例としては、例えば、配列番号１４９で表わされる塩基配列からなる領域または前記塩基配列を含む領域があげられる。また、前記Ｙ’領域の一例としては、例えば、配列番号１５０で表わされる塩基配列からなる領域または前記塩基配列を含む領域があげられる。これらの配列は一例であって、本発明を制限するものではない。
　　　ＧＧＧＡＣＧＣＵＣＡ　ＣＧＵＡＣＧＣＵＣＡ　（配列番号１４９）
　　　ＵＣＡＧＵＧＣＣＵＧ　ＧＡＣＧＵＧＣＡＧＵ　（配列番号１５０）
　前記Ｙ領域、前記Ｘ領域および前記Ｙ’領域を有するアプタマーの具体例は、例えば、前記表２、表５および表６に列挙したいずれかの配列番号で表わされる塩基配列からなる核酸または前記塩基配列を含む核酸があげられる。前記各表において、例えば、５’末端側の小文字の配列が、配列番号１４９で表わされる塩基配列からなる前記Ｙ領域、大文字の配列が、前記Ｘ領域、３’末端側の小文字の配列が、配列番号１５０で表わされる塩基配列からなる前記Ｙ’領域となる。また、前記Ｙ領域、前記Ｘ領域および前記Ｙ’領域を有するアプタマーの具体例は、例えば、前記Ｙ領域が、配列番号１４９で表わされる塩基配列からなる前記Ｙ領域であり、前記Ｘ領域が配列番号１５８～２３０２、配列番号２３０３～２３１２および配列番号２３１３～２３４７のいずれかで表わされる塩基配列であり、前記Ｙ’領域が、配列番号１５０で表わされる塩基配列であり、前記Ｘ領域の５’末端に前記Ｙ領域を有し、前記Ｘ領域の３’末端に前記Ｙ’領域を有する核酸があげられる。
　前記Ｘ領域の塩基数は、特に制限されないが、例えば、１０～６０塩基であり、好ましくは１５～５０塩基であり、より好ましくは２０～４０塩基である。前記Ｙ領域およびＹ’領域の塩基数は、特に制限されないが、それぞれ、例えば、１０～５０塩基であり、好ましくは１５～４０塩基であり、より好ましくは２０～３０塩基である。本発明のアプタマーの全塩基数は、特に制限されないが、例えば、２０～１６０塩基であり、好ましくは３０～１２０塩基であり、より好ましくは４０～１００塩基である。
　本発明において、「Ｈｉｓペプチドに結合可能である」とは、例えば、前記Ｈｉｓペプチドに対する結合能を有している、または、前記Ｈｉｓペプチドに対する結合活性（Ｈｉｓペプチド結合活性）を有しているということもできる。前記アプタマーと前記Ｈｉｓペプチドとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用解析等により決定でき、例えば、ビアコアＸ(商品名、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　ＵＫ　Ｌｔｄ．)を用いて決定できる。
　本発明のアプタマーの前記Ｈｉｓペプチドに対する結合活性は、例えば、前記アプタマーと前記Ｈｉｓペプチドとの解離定数で表わすことができる。本発明のアプタマーの解離定数は、例えば、１．０×１０－９ｍｏｌ／Ｌ以下である。一般的に、Ｈｉｓペプチドに対する抗体の解離定数（Ｋｄ）は、１．０×１０－９ｍｏｌ／Ｌを超える。このため、本発明のアプタマーは、抗体よりも優れた結合性を有している。また、本発明のアプタマーの解離定数は、好ましくは、５．０×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ以下であり、さらに好ましくは、１．０×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ以下である。本発明のアプタマーは、例えば、Ｈｉｓペプチドとの解離定数が１．０×１０－９ｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とするアプタマーである。
　本発明のアプタマーは、例えば、単独のＨｉｓペプチドに結合する他、Ｈｉｓペプチドを含む融合ペプチドに、前記Ｈｉｓペプチドを介して結合可能である。前記融合ペプチドは、例えば、Ｎ末端側にＨｉｓペプチドを含む融合ペプチド、Ｃ末端側にＨｉｓペプチドを含む融合ペプチド、内部にＨｉｓペプチドを含む融合ペプチド等があげられる。前記融合ポリペプチドは、例えば、Ｈｉｓペプチドと、他のペプチドを含んでもよい。前記他のペプチドは、例えば、タンパク質であってもよい。前記融合ペプチドは、例えば、融合タンパク質の意味も含む。また、前記融合ペプチドは、例えば、ＨｉｓペプチドであるＨｉｓ－ｔａｇと他のタグとを含む融合タグペプチドを含んでもよい。前記他のタグとしては、例えば、Ｔ７　ｇｅｎｅ　１０　ｌｅａｄｅｒ配列、ＸｐｒｅｓｓＴＭＥｐｉｔｏｐｅ（以下、「Ｘｐｒｅｓｓ　ｔａｇ」ともいう）等のアミノ酸配列があげられる。前記融合タグペプチドは、例えば、Ｎ末端から、Ｈｉｓ－ｔａｇ、Ｔ７　ｇｅｎｅ　１０　ｌｅａｄｅｒ配列およびＸｐｒｅｓｓ　ｔａｇを含んでもよいし、Ｎ末端から、Ｈｉｓ－ｔａｇおよびＴ７　ｇｅｎｅ　１０　ｌｅａｄｅｒ配列を含んでもよい。
　本発明のアプタマーは、例えば、一本鎖核酸でもよいし、二本鎖核酸であってもよい。前記一本鎖核酸は、例えば、一本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＤＮＡがあげられる。前記二本鎖核酸は、例えば、ＲＮＡの二本鎖、ＤＮＡの二本鎖、ＲＮＡとＤＮＡとの二本鎖（ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド）があげられる。本発明のアプタマーが前記二本鎖核酸の場合、例えば、一方の一本鎖核酸は、前述した核酸であり、他方の一本鎖核酸は、前記一本鎖核酸の一部または全部に相補的な核酸である。前記二本鎖核酸は、例えば、使用に先立って、変性等により一本鎖にすることが好ましい。また、前記一本鎖核酸は、例えば、前述のように、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、配列中に、ＤＮＡの構成単位であるデオキシリボヌクレオチドと、ＲＮＡの構成単位であるリボヌクレオチドの両方を含んでもよい。本発明のアプタマーは、例えば、ＲＮＡが好ましく、特に一本鎖ＲＮＡが好ましい。
　本発明のアプタマーにおいて、塩基は、例えば、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）、グアニン（ｇ）、チミン（ｔ）およびウラシル（ｕ）という天然塩基（非人工塩基）には制限されず、例えば、前記天然塩基と同様の機能を有する修飾塩基または改変塩基等の非天然塩基（人工塩基）であってもよい。前記同様の機能を有する人工塩基とは、例えば、グアニン（ｇ）に代えて、シトシン（ｃ）に結合可能な人工塩基、シトシン（ｃ）に代えて、グアニン（ｇ）に結合可能な人工塩基、アデニン（ａ）に代えて、チミン（ｔ）またはウラシル（ｕ）に結合可能な人工塩基、チミン（ｔ）に代えて、アデニン（ａ）に結合可能な人工塩基、ウラシル（ｕ）に代えて、アデニン（ａ）に結合可能な人工塩基等があげられる。前記修飾塩基としては、例えば、２’－フルオロウラシル、２’－アミノウラシル、２’－Ｏ－メチルウラシル、２－チオウラシル等があげられる。また、本発明のアプタマーの構成単位は、例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド等のヌクレオチドの他に、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）等であってもよい。
　本発明のアプタマーは、例えば、Ｈｉｓペプチドの検出において使用する抗Ｈｉｓペプチド抗体と同様にして使用できる。前記Ｈｉｓペプチドの検出方法は、特に制限されず、例えば、フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡ等の蛍光分析をはじめとする、生化学的な各種分析方法があげられる。前記分析方法において、本発明のアプタマーは、例えば、前記抗Ｈｉｓ抗体に代えて使用できる。本発明のアプタマーは、例えば、分析方法に応じて、前記核酸に、必要な試薬を適宜付加できる。本発明のアプタマーにおいて、前記核酸に付加する試薬としては、特に制限されないが、例えば、蛍光物質、放射線物質、酵素等があげられる。
　本発明のアプタマーは、例えば、Ｈｉｓペプチドを含む前記融合タンパク質の検出、回収および精製等に使用できる。具体的には、例えば、本発明のアプタマーを固相に固定化し、Ｈｉｓペプチドを付加した融合タンパク質を含むサンプルを接触させる。その結果、前記サンプル中の前記融合タンパク質は、そのＨｉｓペプチドを介して、前記固相に固定化された本発明のアプタマーに結合する。続いて、前記固相を洗浄して、前記固定化された本発明のアプタマーに結合していない前記サンプル中の成分を除去する。そして、前記固相に固定化された本発明のアプタマーから、結合した前記融合タンパク質を解離することによって、前記融合タンパク質を回収することが可能である。前記融合タンパク質の検出方法は、特に制限されず、例えば、ノースウエスタンブロッティング、プルダウンアッセイ、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー等があげられ、例えば、抗Ｈｉｓ抗体に代えて、本発明のアプタマーを使用すればよい。
　本発明のアプタマーは、例えば、塩基配列の情報に基づき、公知の方法により製造できる。前記公知の方法は、特に制限されず、例えば、自動合成装置を用いた化学合成法、各種ポリメラーゼを用いた酵素反応による合成法、ＤＮＡテンプレートからのｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写による合成等があげられる。
　本発明のアプタマーは、例えば、公知のＳＥＬＥＸ法により調製できる。また、本発明のアプタマーは、例えば、以下に示す、本発明者が新たに確立した、アプタマーの同定方法により、調製することもできる。本発明は、以下の方法には、何ら制限されない。
＜アプタマーの同定方法＞
　本発明のアプタマーの同定方法は、例えば、下記（ｉ）工程～（ｉｖ）工程を含む。
（ｉ）ＲＮＡプールと、ターゲットとを混合する工程
（ｉｉ）前記ＲＮＡプールから、前記ターゲットと結合するＲＮＡを分離する工程
（ｉｉｉ）分離したＲＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼを用いてｃＤＮＡを合成する工程
（ｉｖ）前記ｃＤＮＡを鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡを合成する工程
　本発明のアプタマーの同定方法によれば、例えば、ＲＮＡプールから、効率よく、前記ターゲットに結合可能なＲＮＡをアプタマーとして選択できる。このため、本発明の同定方法は、例えば、アプタマーの選択方法ともいえる。本発明のアプタマーの同定方法を、以下、改良ＳＥＬＥＸ法（ＳＥＬＥＸ－Ｔ法）という。
　公知のＳＥＬＥＸ法について、例えば、ターゲットに対して、より低い解離定数を示すアプタマーを取得可能な方法への改良が望まれている。本発明のＳＥＬＥＸ－Ｔ法は、前述のように、主に、ＲＮＡポリメラーゼを用いた前記（ｉｖ）工程により、ＲＮＡを合成することによって、前述のような、より低い解離定数を示すアプタマーの取得が可能である。これは、例えば、ＰＣＲによるバイアス、すなわち、ＲＮＡプールの配列偏向が抑制されたＳＥＬＥＸ法が可能になったためと考えられる。
　前記ＲＮＡプールとは、例えば、ランダム配列を含むＲＮＡの集団である。前記ランダム配列は、例えば、Ｎ（Ａ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＴ）が１０～６０個、好ましくは３０～５０個からなる配列である。
　前記ターゲットは、特に制限されず、例えば、イオン原子、アミノ酸、ペプチド等の低分子化合物、ウイルス、タンパク質、細胞等があげられる。前述のように、Ｈｉｓペプチドに結合可能なアプタマーを同定する場合、前記ターゲットは、例えば、Ｈｉｓペプチドでもよいし、Ｈｉｓペプチドが付加された物質であってもよい。後者のターゲットとしては、例えば、Ｈｉｓペプチドが他のペプチドに付加された融合ポリペプチド等があげられる。
　前記（ｉｉｉ）工程において、前記ｃＤＮＡは、例えば、逆転写反応により合成できる。前記逆転写反応による合成方法は、例えば、プライマーと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼとを用いる方法があげられる。また、例えば、ＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡを合成し、さらに、合成したｃＤＮＡを鋳型として、核酸増幅により、前記ｃＤＮＡを増幅させてもよい。この場合、前記（ｉｉｉ）工程は、例えば、逆転写（ＲＴ）－ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）により、ｃＤＮＡを合成することが好ましい。前記（ｉｉｉ）工程で得られるｃＤＮＡは、例えば、ＤＮＡ産物ということもできる。本発明においては、合成したｃＤＮＡを鋳型とする核酸増幅において、増幅反応のサイクル数を低減することが好ましい。
　前記（ｉｖ）工程において、前記ＲＮＡは、例えば、プライマーと、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼとを用いた反応により合成できる。
　前記（ｉｉｉ）工程および（ｉｖ）工程において、前述のようにプライマーを使用する場合、前記ＲＮＡプールは、例えば、前記ランダム配列の両端に、所定のプライマー配列を、機能的に連結したものが好ましい。また、前記ＲＮＡプールは、例えば、前記ランダム配列の両端に、さらに、プロモーター配列またはこれらの相補配列を、機能的に連結したものが好ましい。前記ＲＮＡプールについて、例えば、前記プライマー配列および前記プロモーター領域は、公知のＳＥＬＥＸ法に基づいて、設定できる。
　以下に、ＳＥＬＥＸ－Ｔ法の一例について説明する。
　まず、前記ＲＮＡプールと前記ターゲットを準備する。前記ＲＮＡプールは、例えば、核酸の自動合成装置を用いて化学的に合成してもよいし、ＤＮＡテンプレートからｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写により合成することもできる。前記ターゲットは、例えば、市販品、化学合成したもの、生物学的サンプルから単離したもの等があげられる。前記ターゲットが、例えば、ペプチドおよびタンパク質等の場合、例えば、生物学的サンプルから単離したものでもよいし、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの転写および翻訳により合成したものでもよい。
　次いで、前記ＲＮＡプールと前記ターゲットとを混合する。この際、例えば、前記ターゲットを、担体または支持体等の固相に固定化してもよい。前記固定化は、例えば、前記ＲＮＡプールと前記ターゲットとを混合する前に行ってもよいし、前記両者を混合した後に行ってもよい。前記ターゲットの固定化には、例えば、ビオチン－アビジン結合、Ｎｉ２＋－［Ｈｉｓ－ｔａｇ］結合またはＣｏ２＋－［Ｈｉｓ－ｔａｇ］結合、化学架橋剤による共有結合、核酸ハイブリダイゼーション等を利用できる。前記固相は、例えば、ビーズ、チップ、レジン等があげられる。前記ＲＮＡプールと前記ターゲットとの混合条件は、特に制限されず、例えば、前記ＲＮＡと前記ターゲットとが特異的に結合する条件であればよい。前記条件の具体例として、温度が、例えば、４～４０℃、好ましくは２０～３７℃、ｐＨが、例えば、ｐＨ５．０～９．０、好ましくはｐＨ６．５～７．５、塩濃度が、例えば、５０～５００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１００～１５０ｍｍｏｌ／Ｌであり、処理時間は、例えば、１０分～１８時間、好ましくは３０分～２時間である。
　前記両者を混合した後、形成された前記ＲＮＡと前記ターゲットとの複合体を、洗浄、溶出、精製等に供し、前記ターゲットに結合したＲＮＡを分離する。洗浄は、例えば、一般的なＳＥＬＥＸ法と比較して緩和な条件で行うことが好ましい。これにより、例えば、ＰＣＲによるバイアス、すなわち、ＲＮＡプールの配列偏向を抑制でき、その結果、より低い解離定数を示すアプタマーの取得が可能となる。洗浄方法としては、例えば、前記複合体を固定化した固相を沈殿させて、上清を除去する方法、また、前記上清の除去後、前記複合体を固定化した固相を、洗浄バッファーで洗浄する方法があげられる。前記洗浄バッファーの量は、特に制限されず、例えば、前記固相の１００倍体積が例示できる。前記洗浄用バッファーによる洗浄回数は、特に制限されないが、例えば、１回である。前記洗浄バッファーは、例えば、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸マグネシウムおよび０．０１％　Ｔｗｅｅｎ２０を含む、２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）等が使用できる。前記溶出は、例えば、所定濃度のイミダゾールを使用して行うことができる。具体的には、溶出溶媒として、例えば、１００～３００ｍｍｏｌ／Ｌのイミダゾール等が使用できる。また、精製手段としては、例えば、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿等があげられる。
　つぎに、精製したＲＮＡを、ＲＴ－ＰＣＲに供し、ｃＤＮＡを合成する。具体例としては、例えば、前記ＲＮＡを、ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ、所定のプライマー、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼ等を含む反応液に添加し、ｏｎｅ－ｓｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲに供する。ＲＴ－ＰＣＲは、例えば、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＯｎｅＳｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｋｉｔが使用できる。ＲＴ－ＰＣＲの条件は、例えば、５０℃で３０分、９５℃で１０分の処理を行った後、９４℃で１分、５６℃で１分、７２℃で１分の処理を１サイクルとして、合計５サイクル行い、さらに、７２℃で５分の処理があげられる。前記ＳＥＬＥＸ－Ｔ法では、例えば、ＰＣＲによるバイアス、すなわち、ＲＮＡプールの配列偏向を抑制すべく、通常のＳＥＬＥＸ法に比べて、ＲＴ－ＰＣＲのサイクル数を減少することが好ましい。具体的に、通常のＳＥＬＥＸ法のサイクル数が、例えば、１５～３０サイクルであるのに対して、前記ＳＥＬＥＸ－Ｔ法のサイクル数は、例えば、１～１０サイクル、好ましくは４～８サイクル、より好ましくは４～６サイクルが好ましく、さらに好ましくは４～５サイクルである。本発明においては、例えば、ＰＣＲサイクルを全行程に渡って極端に抑制し、クローンの増幅を、主にＲＮＡ転写によって行うことが好ましい。これによって、例えば、各クローンの増幅効率を、ほぼ一定に保つことができ、ターゲットに対する結合力を反映した選別が可能になると考えられる。
　次いで、合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ、すなわち、ＲＮＡアプタマーを合成する。ＲＮＡポリメラーゼは、特に制限されず、例えば、公知のポリメラーゼが使用可能であり、適宜選択できる。具体例としては、例えば、耐熱性Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ（ＳｃｒｉｐｔＭＡＸ　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｔ７　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、東洋紡社）等があげられる。前記耐熱性Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを使用する場合、例えば、ＲＮＡプールの作製において、前記ランダム配列の一末端にＴ７プロモーターを連結することが好ましい。これによって、例えば、前記耐熱性Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成できる。ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成条件としては、特に制限されず、例えば、３７℃～５０℃で、２時間～６時間があげられる。
　そして、ＲＮＡ合成後、得られたＲＮＡを分離して、精製する。前記ＲＮＡの精製方法は、特に制限されず、例えば、ＤＮａｓｅ　Ｉ処理、ゲル濾過、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿等があげられる。このようにして、Ｈｉｓペプチドに結合可能なアプタマーを得ることができる。
　得られたＲＮＡについて、さらに、前記ターゲットと混合する前記（ｉ）工程から、ＲＮＡを合成する前記（ｉｖ）工程まで、反復して行ってもよい。反復回数、すなわちラウンド数は、特に制限されないが、例えば、５～１０回、好ましくは６～８回である。得られたＲＮＡアプタマーと前記ターゲットとの結合能は、例えば、ＢｉａｃｏｒｅＸ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　ＵＫ　Ｌｔｄ．社）を用いた表面プラズモン共鳴分子間相互作用解析等により決定できる。
　得られたＲＮＡアプタマーについて、さらに、塩基配列を決定する。この塩基配列の情報に基づけば、例えば、公知の方法により、前記ＲＮＡアプタマーを産生できる。
　前記ＳＥＬＥＸ－Ｔ法は、例えば、特殊な機器を必要とせず、効率的且つ安価に、ＲＮＡアプタマーの取得が可能である。
＜試薬・キット＞
　本発明の試薬は、本発明のアプタマーを含むことを特徴とする。本発明のキットは、本発明のアプタマーを含むことを特徴とする。
　本発明の試薬またはキットによれば、例えば、前記Ｈｉｓペプチドの検出が可能であり、さらに、前記Ｈｉｓペプチドを付加した融合ペプチドの検出または精製等を容易に行うことができる。このため、本発明の試薬およびキットは、例えば、Ｈｉｓペプチド検出用試薬およびＨｉｓペプチド検出用キットといえる。
　本発明のキットは、例えば、必要に応じて、反応用バッファーおよび洗浄用バッファー等のバッファー、磁性ビーズ等の担体、使用説明書等を含んでもよい。
＜アプタマー製造用核酸＞
　本発明の核酸は、本発明のアプタマーに相補的な塩基配列を含む核酸であることを特徴とする。本発明の核酸は、本発明のアプタマーを製造するための核酸であって、本発明のアプタマー製造用核酸といえる。本発明のアプタマーがＲＮＡの場合、本発明のアプタマー製造用核酸は、例えば、本発明のアプタマーに相補的な塩基配列を含むＤＮＡであることが好ましい。
　本発明のアプタマー製造用核酸によれば、例えば、これを鋳型として相補的な塩基配列を合成することで、容易且つ簡便に、本発明のアプタマーを製造できる。具体例としては、本発明のアプタマー製造用核酸を用いて、例えば、ＰＣＲ等の核酸増幅により、本発明のアプタマーを製造できる。
　本発明のアプタマー製造用核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。本発明において、センス鎖またはアンチセンス鎖という用語を使用するが、これは、本発明のアプタマー製造用核酸を二本鎖に限定するものではなく、例えば、配列について、転写の鋳型となるアンチセンス鎖として説明するか、その相補鎖として説明するかを明確にするためである。
　本発明のアプタマーがＲＮＡアプタマーの場合、例えば、前記アプタマーに相補的なＤＮＡを、前記アプタマー製造用核酸とし、鋳型として使用する。以下、ＲＮＡアプタマーの鋳型となるＤＮＡをアンチセンス鎖ともいい、前記ＲＮＡアプタマーのウラシル（ｕ）をチミン（ｔ）に置換した配列を有するＤＮＡをセンス鎖ともいう。鋳型となる前記ＤＮＡは、例えば、アンチセンス鎖として、前記ＲＮＡアプタマーの相補鎖のウラシル（ｕ）をチミン（ｔ）に置換した配列を有するＤＮＡまたは前記配列からなるＤＮＡ、および、センス鎖として、前記ＲＮＡアプタマーのウラシル（ｕ）をチミン（ｔ）に置換した配列を有するＤＮＡまたは前記配列からなるＤＮＡのいずれか一方を含むことが好ましい。これらのＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて核酸増幅を行った後、得られたＤＮＡ増幅産物を鋳型として、さらに、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡを転写することにより、ＲＮＡアプタマーを増幅できる。また、例えば、前記ＲＮＡアプタマーを鋳型として、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを調製し、前記ｃＤＮＡを鋳型としてＤＮＡの核酸増幅を行い、得られたＤＮＡ増幅産物を鋳型として、さらに、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡアプタマーを転写することにより、ＲＮＡアプタマーを増幅してもよい。また、本発明のアプタマーが、例えば、ＤＮＡアプタマーの場合、例えば、前記ＤＮＡアプタマーをポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法等によって、増幅できる。
　本発明のアプタマー製造用核酸は、さらにベクターを有し、前記ベクターに、本発明のアプタマーに相補的な前記塩基配列が挿入されていることが好ましい。この場合、本発明のアプタマー製造用核酸は、本発明のアプタマー発現ベクターということもできる。
　前記ベクターは、特に制限されず、公知のベクターが使用でき、プラスミドベクター、ウイルスベクター等があげられる。前記プラスミドベクターとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＣｏｌｄシリーズ（商標、タカラバイオ社）、ｐＥＴシリーズ（Ｍｅｒｃｋ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社他）、ｐＲＳＥＴシリーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＢＡＤシリーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐｃＤＮＡシリーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＥＦシリーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等の大腸菌由来プラスミドベクター；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等の枯草菌由来のプラスミドベクター；ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等の酵母由来のプラスミドベクター等があげられる。また、前記ウイルスベクターとしては、例えば、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等のλファージベクター；Ｍ１３ＫＥ、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ等の繊維状ファージベクター；Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔシリーズ等のＴ７ファージベクター；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等の動物ＤＮＡウイルスベクターまたはＲＮＡウイルスベクター；バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクター；植物ウイルスベクター等があげられる。
　前記アプタマー発現ベクターは、例えば、以下のようにして、本発明のアプタマーの製造に使用できる。具体的には、例えば、前記アプタマー発現ベクターを導入した宿主を培養し、培養後、得られた形質転換体から、核酸を回収することによって、本発明のアプタマーを得ることができる。
前記宿主の種類は、特に制限されず、例えば、前記ベクターの種類等に応じて、適宜設定できる。前記宿主としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバシラス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属の細菌；サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）等の酵母があげられる。また、前記宿主としては、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞；Ｓｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞等も使用できる。培養の条件は、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。培養した前記形質転換体からのＲＮＡアプタマーの回収方法は、特に制限されず、例えば、前記形質転換体を破砕すること等によって行える。
　また、前記アプタマー発現ベクターを、例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで転写し、得られた核酸を、本発明のアプタマーとして回収することもできる。
＜アンチセンス核酸＞
　本発明のアンチセンス核酸は、本発明のアプタマーに相補的な塩基配列を含む核酸である。本発明のアプタマーが、例えば、ＲＮＡの場合、本発明のアンチセンス核酸は、本発明のアプタマーに相補的な塩基配列を含むＤＮＡであることが好ましい。本発明のアンチセンス核酸によれば、例えば、必要に応じて、本発明のアプタマーのＨｉｓペプチドに対する結合を抑制できる。本発明のアンチセンス核酸は、例えば、Ｈｉｓペプチドに対する本発明のアプタマーの結合阻害核酸ということもできる。
　つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。
［実施例１］
　アプタマーを作製し、その結合能を確認した。
１．材料と方法
（１）試薬
　モノクローナル抗体については、抗ＧＦＰ抗体（ＪＬ－８）は、タカラバイオ社より、抗Ｈｉｓ－ｔａｇ抗体は、ＱＩＡＧＥＮ　ＧｍｂＨ社より、抗ＭＩＦ抗体（ＭＡＢ２８９）は、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ社より購入した。ＨＲＰ－抗ＭＩＦ抗体は、Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．社より購入した。
（２）ＲＮＡアプタマー
　前記表２および表５における、配列番号１～１２および配列番号２６～４７で表わされる配列からなるＲＮＡアプタマーを合成した。前記表２および表５において、以下、小文字で示す配列を、共通配列といい、大文字で示す配列を、ランダム配列という。
　前記ＲＮＡアプタマーについて、予想された二次構造の模式図を、図３および図４に示す。図３は、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７（配列番号２）、＃７０１（配列番号１）、＃７１４（配列番号１０）、＃７１６（配列番号３）および＃７４６（配列番号９）の図であり、図４は、小型化アプタマー＃４７ｓ（配列番号１２）の図である。これらの二次構造は、ＧＥＮＥＴＹＸ－ＭＡＣソフトウェアによって予測した。図３および図４において、配列番号１７で表わされるコンセンサス配列を、文字が白抜きの黒四角で示した。図３および図４に示すように、これらのＲＮＡアプタマーにおいては、ステムが折れ曲がった部分に、前記コンセンサス配列を有していると推測される。
　さらに、前記各アプタマーの二次構造、特に、図３に示すｓｈｏｔ４７と＃７１４の情報に基づいて、表２、表５および表６における、配列番号１２～１６、配列番号５４～５６および配列番号６５～６８で表わされる、小型化したＲＮＡアプタマー（以下、「小型化ＲＮＡアプタマー」という）を合成した。
（３）標的タンパク質
　標的タンパク質として、図６に示す、タグ領域とマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ：Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｆａｃｔｏｒ）とを含む融合タンパク質、および、タグ領域とＧＦＰとを含む融合タンパク質を準備した。図６は、調製した６種類の融合タンパク質Ｈｉｓ－ＭＩＦ、ＨＴＸ、ＨＴ、Ｈ、ＴＸおよびＴの構造の概略を示す図である。同図において、「Ｈｉｓ」は、６個のＨｉｓが連結したポリＨｉｓを含むＨｉｓ－ｔａｇ（１１アミノ酸残基）であり、「Ｔ」は、１０アミノ酸残基のＴ７　ｇｅｎｅ　１０　ｌｅａｄｅｒを含むペプチドタグ（１１アミノ酸残基）、「Ｘｐｒｅｓｓ」は、１４アミノ酸残基のＸｐｒｅｓｓＴＭＥｐｉｔｏｐｅ（以下、「Ｘｐｒｅｓｓ　ｔａｇ」ともいう）であり、これら全体をタグ領域という。また、同図において、「ＭＩＦ」は、１１５アミノ酸残基のＭＩＦであり、「ＧＦＰ」は、２４２アミノ酸残基のＧＦＰである。「Ｘｐｒｅｓｓ」の配列は、Ｎ末端から９番目と１０番目のアミノ酸の間で、エンテロキナーゼにより切断可能である。また、図６に示す各融合タンパク質のＮ末端領域のアミノ酸配列および対応する塩基配列、具体的には、タグ領域とＭＩＦまたはＧＦＰとの塩基配列およびアミノ酸配列を、下記表８に示す。下記表８において、ＭＩＦまたはＧＦＰの塩基配列およびアミノ酸配列は、５’末端の９塩基長およびＮ末端の３アミノ酸残基のみを記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　Ｈｉｓ－ｔａｇとＭＩＦとの融合ポリペプチドであるＨｉｓ－ＭＩＦは、ＡＴＧｅｎ　Ｃｏ．，　Ｌｔｄ．社(Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ，　Ｓｏｕｔｈ　Ｋｏｒｅａ)より購入した。Ｈｉｓ－ｔａｇを有さないＭＩＦは、前記Ｈｉｓ－ＭＩＦを、エンテロキナーゼ(Ｎｏｖａｇｅｎ，ＥＭＤ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，　Ｉｎｃ．，社、ＵＳＡ)で処理し、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ切断することによって作製した。
　ＧＦＰを含む融合タンパク質（ＨＴＸ、ＨＴ、Ｈ、ＴＸおよびＴ）は、それぞれ以下の方法により調製した。まず、Ｈｉｓ－ｔａｇのコードＤＮＡ、Ｔ７　ｇｅｎｅ　１０　ｌｅａｄｅｒのコードＤＮＡおよびＸｐｒｅｓｓ　ｔａｇのコードＤＮＡを有するｐＲＳＥＴ発現ベクター(インビトロゲン社、ＵＳＡ)を鋳型として、プライマーセットを用いたＰＣＲにより、前記表８に示す各融合タンパク質のタグ領域のＤＮＡ断片を増幅した。得られた各ＤＮＡ断片とＧＦＰ遺伝子(タカラバイオ社、日本)とを、ｐＣｏｌｄ　ＩＶ発現ベクター(タカラバイオ社、日本)に組み込み、この組換えベクターを、さらに、大腸菌ＢＬ２１スター(ＤＥ３)(インビトロゲン社)に導入して、形質転換を行った。そして、前記ｐＣｏｌｄ　ＩＶ発現ベクターの標準的な使用方法に従って、大腸菌の形質転換体を、１ｍｍｏｌ／Ｌ　イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシドを含む培地において、１５℃で１８時間培養し、融合タンパク質を発現させた。培養後、菌体を遠心分離(５，０００×ｇ、１０分)により回収し、１％　Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）－Ｘ１００を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）に懸濁した。この懸濁液について、凍結融解を２回繰り返して行った後、３００ｍｍｏｌ／Ｌ　塩化ナトリウムおよび０．２ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸マグネシウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）を等量加え、遠心分離(１４，０００×ｇ、１０分)を行った。そして、得られた上清を、融合タンパク質溶液とした。融合タンパク質溶液における融合タンパク質の濃度は、段階希釈した試料および抗ＧＦＰ抗体を用いたウェスタンブロットの結果から推定した。
（４）分子間相互作用解析
　各ＲＮＡアプタマーと融合タンパク質との分子間相互作用、すなわち、前記ＲＮＡアプタマーの融合タンパク質に対する結合能を、表面プラズモン共鳴により解析した。前記結合能の解析には、ＢｉａｃｏｒｅＸ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　ＵＫ　Ｌｔｄ．社）を使用し、使用説明書に従って行った。具体的には、まず、ＲＮＡアプタマーの３’末端に２０塩基のポリアデニンを付加して、ポリアデニン付加ＲＮＡアプタマーを調製し、これを９５℃で５分間加熱した後、氷上で急冷した。そして、５’末端をビオチン化した２０塩基のビオチン化ポリチミンを結合させたストレプトアビジンチップ（Ｓｅｎｓｏｒ　ｃｈｉｐ　ＳＡ，　ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　ＵＫ　Ｌｔｄ．）のフローセルに、ランニングバッファーを用いて、前記ポリアデニン付加ＲＮＡアプタマーを導入した。ここで、前記ポリアデニン付加ＲＮＡアプタマーのポリＡと、前記ビオチン化ポリチミンのポリチミンとの相補的な結合により、前記ポリアデニン付加ＲＮＡアプタマーを、前記ビオチン化ポリチミンを介して、前記チップに固定化した。前記ポリアデニン付加ＲＮＡアプタマーは、共鳴単位ＲＵ（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｕｎｉｔ；１ＲＵ＝１ｐｇ／ｍｍ２）が７００ＲＵになるまで、結合させた。続いて、所定濃度の融合タンパク質を含むＨＢＳ（Ｈｅｐｅｓ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ）を、前記ランニングバッファーを用いて、前記チップに導入し、シグナル（ＲＵ）の測定を行った。前記ランニングバッファーの組成は、１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　塩化ナトリウム、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ　酢酸マグネシウム、０．０１％　Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ｐＨ７．２）とした。また、コントロールとして、前記ポリアデニン付加ＲＮＡアプタマーを固定化していない、前記ビオチン化ポリチミンを結合させた前記チップを使用し、前述と同様にして、融合タンパク質の導入ならびにシグナル測定を行った。
（５）ＲＮＡアプタマーを用いたＥＬＩＳＡ改良法
　各種抗体（抗ＧＦＰ抗体、抗Ｈｉｓ－ｔａｇ抗体または抗ＭＩＦ抗体）を９６穴プレート(Ｉｗａｋｉ、ＡＧＣテクノガラス社、日本)に吸着させ、１％のウシ血清アルブミンでブロッキングを行った。次いで、前記プレートに、５０μＬの融合タンパク質(１μｇ／ｍＬ)、２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸マグネシウムおよび０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）－Ｘ１００を加えて、室温で３時間インキュベートし、前記プレートに前記融合タンパク質を結合させた。インキュベート後、前記プレートをＨＢＳ－Ｔで３回洗浄した。コントロールとしては、５０μＬの融合タンパク質に代えて、５０μＬの前記ＨＢＳ－Ｔを添加して、同様に、インキュベートならびに洗浄を行った。
　次いで、ＲＮＡアプタマーの３’末端に２０塩基のポリアデニン（ポリＡ）を付加して、ポリアデニン付加ＲＮＡアプタマーを調製した。前記ポリアデニン付加ＲＮＡアプタマーを変性した後、５’末端をビオチン化した２０塩基のビオチン化ポリチミン(７４０ｎｍｏｌ／Ｌ)、ｔＲＮＡ（１００μｇ／ｍＬ）およびＲＮａｓｅインヒビター(０．１６ｕｎｉｔｓ／ｍＬ)と混合してから、前記ポリアデニン付加ＲＮＡアプタマーのポリＡと、前記ビオチン化ポリチミンのポリチミンとの相補的な結合により、ビオチン標識ＲＮＡアプタマーを作製した。このビオチン標識ＲＮＡアプタマーを、前記プレートに添加し、４℃で３０分間インキュベートした。続いて、前記プレートを洗浄し、０．１μｇ／ｍＬのＨＲＰ－ストレプトアビジン(Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．，社、ＵＳＡ）を添加した。さらに、前記プレートを洗浄した後、１－Ｓｔｅｐ　Ｕｌｔｒａ　ＴＭＢ基質(Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．，社、ＵＳＡ)を加えて発色させ、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
（６）プルダウンアッセイ
　前記（５）と同様にして、ビオチン標識ＲＮＡアプタマーを作製した。前記ビオチン標識ＲＮＡアプタマー（５０μＬ）と、融合タンパク質を含む溶液とを、同量で混合し、４℃で１５分間インキュベートした。これによって、前記ビオチン標識ＲＮＡアプタマーと、前記融合タンパク質を含むサンプルとを結合させた。前記融合タンパク質を含むサンプルとしては、Ｈｉｓ－ＭＩＦを終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加した前記ＨＢＳ－Ｔ（２００μｇ／ｍＬ　ｔＲＮＡを含む)、Ｈｉｓ－ＭＩＦを終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加したウサギの腎由来細胞株（ＲＫ－１３細胞株）の培養上清（５％ウシ胎児血清含有）、Ｈｉｓ－ＧＦＰ（ＨＴ）を発現させた大腸菌の抽出液を使用した。次いで、前記混合液に、ストレプトアビジン－セファロース（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）５μＬを加えて、４℃で１時間インキュベートし、前記ビオチン標識ＲＮＡアプタマーを前記セファロースに結合させた。インキュベート後、前記セファロースを前記ＨＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動用のサンプルバッファーを加え、９５℃で５分間の熱処理を行うことにより、ストレプトアビジンとビオチンとの結合を介して前記セファロースに結合していた融合タンパク質を溶出した。前記溶出したタンパク質を１５％ＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動に供し、前記タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写した。転写後の前記膜を５％スキムミルクでブロッキングし、１μｇ／ｍＬの抗体を加えて、室温で３時間結合させた。前記抗体としては、抗ＭＩＦ抗体または抗Ｈｉｓ－ｔａｇ抗体を使用した。さらに、前記膜を洗浄した後、ＨＲＰ－抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を結合させた。そして、洗浄した後、ＥＣＬ化学発光試薬（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、前記融合タンパク質の存在を確認した。
（７）ノースウェスタンブロッティング
　段階希釈した融合タンパク質を非還元ＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動に供し、前記（６）と同様にして、前記融合タンパク質をＰＶＤＦ膜にブロッティングした後、前記膜のブロッキングを行った。そして、前記膜に、前記（６）と同様にして準備したビオチン標識ＲＮＡアプタマーを、前記抗体（抗ＭＩＦ抗体または抗Ｈｉｓ－ｔａｇ抗体）の代わりに添加した。さらに、ＨＲＰ－ストレプトアビジンを加えて、前記（６）と同様にして、ＥＣＬ化学発光試薬（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、前記融合タンパク質の存在を確認した。
２．結果
（１）分子間相互作用解析
　（１－１）各種ＲＮＡアプタマーのＨｉｓ－ＭＩＦへの結合
　前記チップに導入する前記ＨＢＳ－ＴにおけるＨｉｓ－ＭＩＦ濃度を６００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記分子間相互作用解析により、融合タンパク質Ｈｉｓ－ＭＩＦに対するＲＮＡアプタマーの結合能を解析した。前記ＲＮＡアプタマーとしては、５’側および３’側に２０塩基長の共通配列を有する配列番号１～１１、配列番号２６～４７を使用した。これらのうち、ＲＮＡアプタマー＃７０１（配列番号１）、ｓｈｏｔ４７（配列番号２）、＃７１６（配列番号３）、＃７２７（配列番号４）、＃７０４（配列番号５）、＃７１３（配列番号６）、＃７０８（配列番号７）、＃７１８（配列番号８）、＃７４６（配列番号９）、＃７１４（配列番号１０）、＃７３３（配列番号１１）を用いた結果を、図１に示す。図１は、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて検出したシグナルのセンサーグラムであり、図１において、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ　Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、０秒～４５秒が、前記融合タンパク質を導入した時期である。また、図１には、比較例として、前記ＲＮＡアプタマーに代えて、後述する実施例３で調製したラウンド０のＲＮＡプール（以下、「Ｎ４０」という）を使用した結果を、あわせて示す。前記Ｎ４０は、後述するように、５’側および３’側に、前記ＲＮＡアプタマーと同じ２０塩基長の共通配列を有し、前記共通配列の間に４０塩基長のランダム配列を有するＲＮＡのプールとした。
　図１に示すように、いずれのＲＮＡアプタマーも、Ｈｉｓ－ＭＩＦに対する結合能を示し、中でも、ｓｈｏｔ４７は、極めて優れた結合能を示した。なお、図示していないが、この他、配列番号２６～４７のＲＮＡアプタマーについても、Ｈｉｓ－ＭＩＦに対する結合能が確認できた。
　（１－２）ｓｈｏｔ４７の結合能
　前記チップに導入する前記ＨＢＳ－ＴにおけるＨｉｓ－ＭＩＦの濃度を、０、１９、３８、７５、１５０、３００および６００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前述と同様にして、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７（配列番号２）について、分子間相互作用解析を行った。また、比較例として、前記ＲＮＡアプタマーに代えて、前記Ｎ４０を使用した以外は、同様にして分子間相互作用解析を行った。そして、これらの結果から、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７について、結合速度定数（Ｋａ）、解離速度定数（Ｋｄ）ならびに解離定数（ＫＤ＝Ｋｄ／Ｋａ）を求めた。これらの結果を、図２に示す。図２は、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて検出したシグナルのセンサーグラムであり、縦軸および横軸は、前記図１と同様である。
　同図に示すように、分子間相互作用解析により、ｓｈｏｔ４７の結合速度定数（Ｋａ）が２．０２×１０４ｍｏｌ／Ｌ－１ｓ－１、解離速度定数（Ｋｄ）が７．６４×１０－８ｓ－１ならびに解離定数（ＫＤ）が３．７８×１０－１２ｍｏｌ／Ｌであることがわかった。ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７は、市販のＨｉｓ－ｔａｇに対する抗体の解離定数が１×１０－９ｍｏｌ／Ｌ（QIAexpress　Detection　and　Assay　Handbook,　QIAGEN　GmbH,　Hilden,　Germany,　Oct,　2002,　p．15．）であることから、極めて結合力に優れるアプタマーであることがわかった。
　（１－３）小型化ＲＮＡアプタマーのＨｉｓ－ＭＩＦへの結合
　前記分子間相互作用解析により、融合タンパク質Ｈｉｓ－ＭＩＦに対する小型化ＲＮＡアプタマーの結合能を解析した。前記小型化ＲＮＡアプタマーとしては、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７（配列番号２）を小型化した、＃４７ｓ（配列番号１２）、＃４７ｓＴ（配列番号１３）、ｓｈｏｔ４７ｓｓｓ（配列番号１４）、＃４７ｓｓｓＴ（配列番号１６）を使用した。これらの結果を、図５に示す。図５は、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて検出したシグナルのセンサーグラムであり、縦軸および横軸は、前記図１と同様である。また、同図には、小型化していないＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７を使用した結果を、あわせて示す。
　図５に示すように、いずれの小型化ＲＮＡアプタマーも、Ｈｉｓ－ＭＩＦに対する結合能を示した。中でも、＃４７ｓおよびｓｈｏｔ４７ｓｓｓは、図３に示すｓｈｏｔ４７のステムループ構造を壊さないように設計された小型化アプタマーであり、ｓｈｏｔ４７と同等の効果を示した。このことから、前記ステムループ構造が、アプタマーにとって、重要な構造であると推測される。また、＃４７ｓおよびｓｈｏｔ４７ｓｓｓは、その他の小型化ＲＮＡアプタマーよりも優れた結合能を示した。その他の小型化ＲＮＡアプタマー、＃４７ｓＴ（配列番号１３）、＃４７ｓｓｓＴ（配列番号１６）は、前記表７に示すように、＃４７ｓの塩基配列の四角で囲んだ配列番号１８の配列において、７番目のＵ、１１番目のＵ、および、１５番目のＡのいずれかが欠失または置換されている。このため、配列番号１８において、ループ構造における７番目のＵ、１１番目のＵ、および、図４に示すように、ステム構造の折れ曲がり部分の１５番目のＡが保存されていることが重要であると推測される。
（２）ＥＬＩＳＡ改良法
　（２－１）ｓｈｏｔ４７のＨｉｓ－ＧＦＰにおける結合部位
　ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７が、融合タンパク質のどの部位に結合するかを、前述のＥＬＩＳＡ改良法により確認した。融合タンパク質としては、前述した図６に示す融合タンパク質のうち、ＧＦＰを含むＨＴＸ、ＨＴ、Ｈ、ＴＸ、Ｔの５種類の融合タンパク質を使用した。また、前記ＥＬＩＳＡ改良法における前記プレートには、抗ＧＦＰ抗体を固定化した。また、比較例として、前記ｓｈｏｔ４７に代えて、前記Ｎ４０を使用した以外は、同様にして、結合を確認した。
　これらの結果を、図７に示す。図７は、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７の融合タンパク質に対する結合能を示すグラフである。図７において、縦軸は、結合能（ＲＮＡアプタマーの結合）を示す４５０ｎｍの吸光度であり、３回の測定に基づく平均値±偏差（ＳＤ）を示す。横軸は、融合タンパク質の種類を示し、白抜きバーは、Ｎ４０の結果であり、黒いバーは、ｓｈｏｔ４７の結果である。また、図７内の右上の写真は、使用した融合タンパク質のウェスタンブロットの結果であり、前述のような形質転換体からの調製により、各種タンパク質が得られていることは、確認済みである。
　図７のグラフに示すように、ｓｈｏｔ４７は、Ｈｉｓ－ｔａｇを有する融合タンパク質（ＨＴＸ、ＨＴおよびＨ）には、結合能を示したが、Ｈｉｓ－ｔａｇを有していない融合タンパク質（ＴＸおよびＴ）には、結合しなかった。前記融合タンパク質は、すべてＧＦＰを有することから、ｓｈｏｔ４７は、ＧＦＰに結合しているのではないことが明らかとなった。融合タンパク質のうちＨＴは、Ｘｐｒｅｓｓ（ＸｐｒｅｓｓＴＭＥｐｉｔｏｐｅ）を欠損し、Ｈは、Ｔ（Ｔ７　ｇｅｎｅ　１０　ｌｅａｄｅｒ）を欠損した融合タンパク質であることから、ｓｈｏｔ４７が、Ｈｉｓ－ｔａｇに結合していることが明らかとなった。また、ｓｈｏｔ４７の結合能は、ＨＴＸ≒ＨＴ＞Ｈとなることから、Ｈｉｓ－ｔａｇの他に、Ｘｐｒｅｓｓ（ＸｐｒｅｓｓＴＭＥｐｉｔｏｐｅ）またはＴ（Ｔ７　ｇｅｎｅ　１０　ｌｅａｄｅｒ）等のタグをさらに有するほど、結合能が高いことがわかった。
　（２－２）ｓｈｏｔ４７のＨｉｓ－ＭＩＦへの結合
　ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７の融合タンパク質Ｈｉｓ－ＭＩＦおよびＨｉｓ－ｔａｇを有さないＭＩＦに対する結合能を、前述のＥＬＩＳＡ改良法により確認した。前記ＥＬＩＳＡ改良法における前記プレートには、抗ＭＩＦ抗体および抗Ｈｉｓ－ｔａｇ抗体を固定化した。比較例として、前記ｓｈｏｔ４７に代えて、前記Ｎ４０を使用した以外は、同様にして、結合を確認した。コントロールとして、Ｈｉｓ－ＭＩＦの前記プレートへの結合を確認するため、前記ＲＮＡアプタマーに代えてＨＲＰ標識抗ＭＩＦポリクローナル抗体（抗ＭＩＦｐＡｂ）を添加し、同様に基質を添加して、４５０ｎｍにおける吸光度の測定を行った。
　これらの結果を、図８に示す。図８は、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７の融合タンパク質Ｈｉｓ－ＭＩＦに対する結合能を示すグラフである。同図において、縦軸は、ＲＮＡアプタマーの結合能を示す４５０ｎｍの吸光度であり、３回の測定に基づく平均値±偏差（ＳＤ）を示す。同図において、白抜きバーは、Ｎ４０の結果であり、黒いバーは、ｓｈｏｔ４７の結果であり、グレーのバーは、ＨＲＰ標識抗ＭＩＦポリクローナル抗体で検出した結果である。また、左側は、抗ＭＩＦ抗体を固定化したプレートにおけるＨｉｓ－ＭＩＦの結果であり、中央は、抗Ｈｉｓ－ｔａｇ抗体を固定化したプレートにおけるＨｉｓ－ＭＩＦの結果であり、右側は、抗ＭＩＦ抗体を固定化したプレートにおけるＭＩＦの結果である。また、図８において、前記グラフの下に、結合形態の模式図を示す。
　同図に示すように、固定化抗ＭＩＦ抗体と、Ｈｉｓ－ｔａｇを有さないＭＩＦとを結合させた結果、抗ＭＩＦポリクローナル抗体でＨｉｓ－ｔａｇを有さないＭＩＦが検出されていることから、固定化ＭＩＦ抗体にＭＩＦが結合していることは確認できたが、ｓｈｏｔ４７の結合は確認されなかった。これに対して、固定化抗ＭＩＦ抗体と、融合タンパク質Ｈｉｓ－ＭＩＦとを結合させた結果、ｓｈｏｔ４７の結合が確認された。この結果から、ｓｈｏｔ４７は、Ｈｉｓ－ｔａｇを認識しており、このため、Ｈｉｓ－ｔａｇを有する融合タンパク質であれば、ｓｈｏｔ４７による検出が可能であることがわかった。また、固定化抗Ｈｉｓ－ｔａｇ抗体と、融合タンパク質Ｈｉｓ－ＭＩＦとを結合させた結果、前記固定化抗ＭＩＦ抗体を使用した場合と比較して、ｓｈｏｔ４７の結合が低下した。これは、固定化抗ＭＩＦ抗体が、ｓｈｏｔ４７がターゲットとするＨｉｓ－ｔａｇに結合しているため、ｓｈｏｔ４７が結合し難くなったためと考えられる。
　（２－３）ｓｈｏｔ４７およびｓｈｏｔ４７ｓｓｓのＨＴへの結合
　ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７およびｓｈｏｔ４７ｓｓｓについて、Ｈｉｓ（Ｈｉｓ－ｔａｇ）、Ｔ（Ｔ７　ｇｅｎｅ　１０　ｌｅａｄｅｒ）およびＧＦＰからなる融合タンパク質ＨＴの結合能を、前述のＥＬＩＳＡ改良法により確認した。前記ＥＬＩＳＡ改良法における前記プレートには、抗ＧＦＰ抗体を固定化した。また、比較例として、前記ｓｈｏｔ４７に代えて、前記Ｎ４０を使用した以外は、同様にして、結合を確認した。
　これらの結果を、図９に示す。図９は、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７およびｓｈｏｔ４７ｓｓｓの融合タンパク質ＨＴに対する結合能を示すグラフである。同図において、縦軸は、結合能（ＲＮＡアプタマーの結合）を示す４５０ｎｍの吸光度であり、３回の測定に基づく平均値±偏差（ＳＤ）を示す。横軸は、ＲＮＡアプタマーの種類を示し、白抜きバーは、Ｎ４０の結果であり、黒いバーは、ｓｈｏｔ４７の結果であり、グレーのバーは、ｓｈｏｔ４７ｓｓｓの結果である。
　図９のグラフに示すように、ｓｈｏｔ４７およびｓｈｏｔ４７ｓｓｓは、ともに、Ｈｉｓ－ｔａｇを有する融合タンパク質ＨＴに、結合能を示した。
（３）プルダウンアッセイ
　（３－１）ｓｈｏｔ４７の融合タンパク質への結合
　ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７について、融合タンパク質Ｈｉｓ-ＭＩＦおよびＨｉｓ-ＧＦＰとの結合を、前述のプルダウンアッセイおよびノースウェスタンブロッティングにより確認した。また、比較例として、前記ｓｈｏｔ４７に代えて、前記Ｎ４０を使用した以外は、同様にして、結合を確認した。
　プルダウンアッセイの結果を、図１０に示す。図１０は、ｓｈｏｔ４７と融合タンパク質Ｈｉｓ－ＭＩＦおよびＨＴとの結合を示すプルダウンアッセイの写真である。同図において、「バッファー中」とは、Ｈｉｓ－ＭＩＦ含有ＨＢＳ－Ｔを使用した結果であり、「５％ＦＢＳ中」とは、Ｈｉｓ－ＭＩＦ含有培養上清を使用した結果であり、「細胞溶解物中」とは、ＨＴを発現させた大腸菌の抽出液を使用した結果である。また、同図のアプタマーの欄において、「Ｎ」は、ＲＮＡアプタマーＮ４０の結果であり、「４７」は、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７の結果であり、Ｈｉｓ－ＭＩＦの欄において、「＋」は、前記サンプル中の融合タンパク質がＨｉｓ－ＭＩＦであることを示し、「ＨＴ」は、前記サンプル中の融合タンパク質がＨＴであることを示し、「－」は、前記サンプル中に両融合タンパク質を含まないことを示す。図１０に示すように、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７により、融合タンパク質Ｈｉｓ－ＭＩＦおよびＨＴをプルダウンできた。また、図１０の「細胞溶解物中」の結果に示すように、大腸菌のホモジェネートからでも、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７により、ＨＴをプルダウン可能であった。
　ノースウェスタンブロッティングの結果を、図１１に示す。図１１において、各レーンの数値は、Ｈｉｓ－ＭＩＦのレーンあたりの濃度（μｇ／レーン）を示す。図１１に示すように、ブロッティングした融合タンパク質についても、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７により、ノースウェスタンブロッティングによる検出が可能であった。
［実施例２］
　ＲＮＡアプタマーＨｉｓ＿１、Ｈｉｓ＿２、Ｈｉｓ＿３、Ｈｉｓ＿４、Ｈｉｓ＿５、Ｈｉｓ＿６およびＨｉｓ＿１０を合成した。これらのアプタマーは、５’側から、Ｙ領域、Ｘ領域およびＹ’領域が連続する配列とした（Ｙ領域－Ｘ領域－Ｙ’領域）。各アプタマーにおいて、前記Ｙ領域および前記Ｙ’領域の配列は、共通する。これらの配列を、以下に示す。また、各アプタマーにおいて、前記Ｘ領域は、それぞれ異なるランダム配列である。各アプタマーのＸ領域の配列、すなわちランダム配列（Ｈｉｓ＿１、Ｈｉｓ＿２、Ｈｉｓ＿３、Ｈｉｓ＿４、Ｈｉｓ＿５、Ｈｉｓ＿６およびＨｉｓ＿１０）を、以下に示す。
Ｙ領域　（配列番号１４９）
　　　　GGGACGCUCA CGUACGCUCA　
Ｙ’領域　（配列番号１５０）
　　　　UCAGUGCCUG GACGUGCAGU
ランダム配列
　　Ｈｉｓ＿１　（配列番号２３０３）
　　　　GGUGAACUGGUCCGCAUUUAGCUUUCUUAUUUGCGGGUAU
　　Ｈｉｓ＿２　（配列番号２３０４）
　　　　GGUGAAUUGGCCGCCGUUCUUUCCGUGGAAUGACGCGAUG
　　Ｈｉｓ＿３　（配列番号２３０５）
　　　　GGUGUACUGGCACUACUGAAAUUUCAUUUGAGUAGGUCUG
　　Ｈｉｓ＿４　（配列番号２３０６）
　　　　UAAGGGUGUACUGGCGAUUGUUGGGACGCACUUCAAUUUG
　　Ｈｉｓ＿５　（配列番号２３０７）
　　　　GAACCCGUAUUGGUCACAGGUGGAUUGGUCUAUAUUGUUA
　　Ｈｉｓ＿６　（配列番号２３０８）
　　　　GGUGUAUUGGAUUUGCUCCGAGGGUGUAGACCCCACAGAU
　　Ｈｉｓ＿１０　（配列番号２３１２）
　　　　UUAGCUUAGCUUCAUGCCCGGGUGUACUGGAGAUCUCUUA
　これらのＲＮＡアプタマーについて、前記実施例１の「１.（４）分子間相互作用解析」と同様にして、前記Ｈｉｓ－ＭＩＦに対する結合能を、表面プラズモン共鳴により解析した。前記チップに導入する前記ＨＢＳ－ＴにおけるＨｉｓ－ＭＩＦ濃度は、６００ｎｍｏｌ／Ｌとした。これらの結果を、図１２に示す。図１２は、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて検出したシグナルのセンサーグラムであり、図１２において、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ　Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、０秒～６０秒が、前記融合タンパク質を導入した時期である。また、図１２には、比較例として、前記ＲＮＡアプタマーに代えて、前記Ｎ４０を使用した結果を、あわせて示す。
　図１２に示すように、いずれのＲＮＡアプタマーも、Ｈｉｓ－ＭＩＦに対する結合能を示し、中でも、アプタマーＨｉｓ＿１は、極めて優れた結合能を示した。なお、図示していないが、この他、前記Ｙ領域（配列番号１４９）－Ｘ領域－Ｙ’領域（配列番号１５０）で表わされ、前記Ｘが配列番号２３０９～２３１２および配列番号２３１３～２３４７で表わされるランダム配列である、各ＲＮＡアプタマーについても、Ｈｉｓ－ＭＩＦに対する結合能が確認できた。
［実施例３］
　公知のＳＥＬＥＸ法は、ＰＣＲによる増幅時のバイアスが、目的のアプタマーの取得の効率を低下させている要因の一つと予想した。すなわち、ＰＣＲのサイクル数が多い場合、ターゲットに結合するＲＮＡの濃縮よりも、ＰＣＲによって増幅されやすい配列の増加が急速に進むと考えた。そこで、各ラウンドで行うＲＮＡ分子の増幅を、ＰＣＲではなく、主にＴ７　ＲＮＡポリメラーゼにより行う前記ＳＥＬＥＸ－Ｔ法によって、Ｈｉｓ－ＭＩＦに対するアプタマーを作製した。
１．材料と方法
（１）ＲＮＡライブラリー
　２０塩基長の固定配列、４０塩基長のランダム配列、２０塩基長の固定配列およびＴ７プロモーターの相補配列を、５’側からこの順序で含む、配列番号１５１で表わされる一本鎖ＤＮＡライブラリーを合成した。
ＤＮＡライブラリー（配列番号１５１）
　　ACTGCACGTCCAGGCACTGA　N40　TGAGCGTACGTGAGCGTCCC　TATAGTGAGTCGTATTA
　前記一本鎖ＤＮＡ（５０ｐｍｏｌ、３×１０１３分子）と、配列番号１５２で表わされるＴ７プロモーター配列（２５０ｐｍｏｌ）とを混合し、９５℃で５分間加熱した後、急冷した。そして、前記一本鎖ＤＮＡのＴ７プロモーターの相補配列に、前記Ｔ７プロモーター配列がハイブリッドした二本鎖ＤＮＡを、ＲＮＡ合成用のテンプレートとした。
Ｔ７プロモーター配列（配列番号１５２）
　　TAATACGACTCACTATAGGG
　耐熱性Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼにより、前記テンプレートからＲＮＡを転写し、ＤＮａｓｅ　Ｉにより前記テンプレートを分解した後、精製処理によって、精製ＲＮＡを得た。精製処理は、ゲルろ過、フェノール－クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行った。前記ゲルろ過は、Ｍｉｃｒｏ　Ｂｉｏ－ｓｐｉｎ　３０Ｃｏｌｕｍｎｓ（商品名、Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用した。
　前記精製ＲＮＡを変性して、ＨＢ－Ｔ、終濃度０．４ｕｎｉｔｓ／ｍＬのＲＮａｓｅインヒビター（Ｔｏｙｏｂｏ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）および終濃度０．５ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡを加え、合計５０μＬとした。これをＲＮＡプールとした。前記ＨＢ－Ｔの組成は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸マグネシウムおよび０．０１％Ｔｗｅｅｎ　２０（ｐＨ７．２）とした。
　前記ＲＮＡプールは、以下のＳＥＬＥＸ－Ｔ法に供する前に、前処理を行った。まず、前記ＲＮＡプールを、２０μＬのレジン（商品名ＴＡＬＯＮ　Ｍｅｔａｌ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｒｅｓｉｎ、タカラバイオ社、以下同様）と、室温で３０分間混合した。この混合物を、フィルター（商品名Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ－ＭＣ、５μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に供して、レジンおよびそれに結合するＲＮＡを除いた。この前処理後のＲＮＡプールを、ラウンド０のＲＮＡプールとして、以下のＳＥＬＥＸ－Ｔ法に供した。
（２）ＳＥＬＥＸ－Ｔ法
　Ｈｉｓ－ＭＩＦと前記ＲＮＡプールとを混合し、室温で１５分間結合させた。前記Ｈｉｓ－ＭＩＦは、Ｈｉｓ－ｔａｇとＭＩＦとの融合ポリペプチドであり、ＡＴＧｅｎ　Ｃｏ．，　Ｌｔｄ．社（Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ，　Ｓｏｕｔｈ　Ｋｏｒｅａ)より購入した。そして、前記混合物に、２．５μＬのレジン（商品名ＴＡＬＯＮ　Ｍｅｔａｌ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｒｅｓｉｎ）を加え、前記融合タンパク質とＲＮＡとの複合体を固定化した。前記レジンを前記ＨＢ－Ｔで洗浄した後、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　イミダゾールを用いて、溶出を行った。前記ＨＢ－Ｔを用いた洗浄回数を、下記表９に示す。そして、得られた溶出液を、フェノールクロロホルム抽出および共沈剤（商品名エタチンメイト、和光純薬）を加えたエタノール沈澱に供し、ＲＮＡを精製した。前記精製ＲＮＡを、ＲＴ－ＰＣＲに供し、Ｔ７プロモーターを含むＤＮＡテンプレートを作製した。前記ＲＴ－ＰＣＲは、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＯｎｅＳｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）の反応液２０μＬを使用した。前記反応液に含まれる、ＳＥＬＥＸ用フォワードプライマーおよびＳＥＬＥＸ用リバースプライマーの配列を以下に示す。前記反応液におけるプライマーの濃度は、それぞれ１０μｍｏｌ／Ｌとした。また、ＲＴ－ＰＣＲ条件は、５０℃で３０分、９５℃で１５分の処理を行った後、９４℃で１分、５３℃で１分および７２℃で１分を、１サイクルとして、所定のサイクル数行った。各ラウンドのサイクル数は、下記表９に示す。
ＳＥＬＥＸ用リバースプライマー　(配列番号１５３)
　　　　TAATACGACTCACTATAGGGACGCTCACGTACGCTCA
ＳＥＬＥＸ用リバースプライマー　(配列番号１５４)
　　　　ACTGCACGTCCAGGCACTGA
　得られたＰＣＲ産物をテンプレートとして、耐熱性Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼとＴプロモーター用プライマーとを用いて、ＲＮＡを合成し、ＤＮａｓｅ　Ｉにより前記テンプレートを分解した後、精製処理によって、精製ＲＮＡを得た。前記Ｔ７プロモーター用プライマーの配列を以下に示す。精製処理は、ゲルろ過、フェノール－クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行った。前記ゲルろ過は、Ｍｉｃｒｏ　Ｂｉｏ－ｓｐｉｎ　３０Ｃｏｌｕｍｎｓ（商品名、Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用した。得られた精製ＲＮＡを、次ラウンドのＲＮＡプールとした。以上の工程を、７ラウンド繰り返し行った。各ラウンドにおける条件を下記表９に示す。
Ｔ７プロモーター用プライマー
　　　　TAATACGACTCACTATA　(配列番号１５５)
（３）塩基配列の決定
　ＳＥＬＥＸ－Ｔ法で得られた６ラウンドのＲＮＡプール（０．１μｇ）と７ラウンドのＲＮＡプール（０．１μｇ）を、ＲＴ－ＰＣＲに供し、制限酵素サイトを含むｃＤＮＡを作製した。前記ＲＴ－ＰＣＲは、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＯｎｅＳｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用した。プライマーは、以下に示すシークエンス用フォワードプライマーおよびシークエンス用リバースプライマーを使用した。ＲＴ－ＰＣＲの反応液におけるプライマーの濃度は、それぞれ１０μｍｏｌ／Ｌとした。
シークエンス用フォワードプライマー　(配列番号１５６)
　　　　TCGACCTCGAGAAAAAAAAAAGGGACGCTCACGTACGCTCA
シークエンス用リバースプライマー　(配列番号１５７)
　　　　GAGTCGCGGCCGCTTTTTTTTTTACTGCACGTCCAGGCACTGA
　得られたＰＣＲ産物を、ＭｉｎｉＥｌｕｔｅ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ　ＧｍｂＨ）で精製した後、制限酵素Ｘｈｏ　ＩおよびＮｏｔ　Ｉで消化し、塩基配列決定用のプラスミドベクターに組み込んだ。前記プラスミドを、大腸菌（ＤＨ５αコンピテントセル、Ｔｏｙｏｂｏ　Ｃｏ．　Ｌｔｄ．）に導入した。その結果、６ラウンドのＲＮＡ由来ｃＤＮＡから１１３クローン、７ラウンドのＲＮＡ由来ｃＤＮＡから１０５クローンを得た。得られたクローンを、Ｔｅｍｐｌｉｐｈｉ　ＤＮＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて増幅した後、塩基配列を決定した。また、ＳＥＬＥＸ－Ｔ法で得られた２ラウンドから５ラウンドのＲＮＡプールは、前記シークエンス用ＰＣＲプライマーを用いてｃＤＮＡを作製した後、Ｒｏｃｈｅ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　ＦＬＸ　ｓｙｓｔｅｍにより塩基配列を決定した。
（４）分子間相互作用解析
　各ラウンドのＲＮＡプールについて、前記実施例１の「１.（４）分子間相互作用解析」と同様にして、前記Ｈｉｓ－ＭＩＦに対する結合能を、表面プラズモン共鳴により解析した。前記チップに導入する前記ＨＢＳ－ＴにおけるＨｉｓ－ＭＩＦ濃度は、６００ｎｍｏｌ／Ｌとした。また、７ラウンドのＲＮＡプールから得た１０５クローンのうち、配列を決定したＲＮＡアプタマーについて、解析を行った。前記Ｎ４０（対照ＲＮＡ）についても、同様に解析を行った。
２．結果
　下記表９に、各ラウンドについて、前記ＲＮＡプール（開始ＲＮＡ）の量、前記ＲＮＡプールと混合したＨｉｓ－ＭＩＦの量、前記複合体の洗浄回数、ＰＣＲのサイクル数、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼにより合成して得られたＲＮＡ（増幅ＲＮＡ）の量、前記ＲＮＡプールのＨｉｓ－ＭＩＦに対する結合数、および、Ｈｉｓ－ＭＩＦに結合するアプタマーに共通する配列番号１７で表わされる保存配列を有するＲＮＡの前記ＲＮＡプールにおける割合を示す。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　前記ＳＥＬＥＸ－Ｔ法によれば、比較的早いラウンド（ラウンド４）から、結合数の増加、ならびに、前記保存配列を有するクローンが占める割合の増加が確認された。
　また、前記表９に示すように、ラウンド７まで行うことによって、ＲＮＡプールの結合能が上昇した。ラウンド７により得られた、配列決定されたＲＮＡアプタマーを、下記表１０に示す。下記表１０に示す、ラウンド７で得られたＲＮＡアプタマーは、全て、前記表２および表５に示すように、配列番号１７に示す保存配列およびそれとほぼ同等の配列を含んでいた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　ラウンド７のＲＮＡプール、および、前記表１０に示すＲＮＡアプタマーのうち、＃７０１（配列番号１）、ｓｈｏｔ４７（配列番号２）、＃７１６（配列番号３）、＃７２７（配列番号４）、＃７０４（配列番号５）、＃７１３（配列番号６）、＃７０８（配列番号７）、＃７１８（配列番号８）、＃７４６（配列番号９）、＃７１４（配列番号１０）、＃７３３（配列番号１１）について、分子間相互作用解析の結果を、図１３に示す。図１３は、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて検出したシグナルのセンサーグラムであり、図１３において、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ　Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、０秒～４５秒が、前記融合タンパク質を導入した時期である。また、図１３には、前記ＲＮＡアプタマーに代えて、前記Ｎ４０を使用した結果を、あわせて示す。同図に示すように、ラウンド７において、ＲＮＡプールの結合能が著しく向上している。また、ラウンド７のＲＮＡプールに含まれる各ＲＮＡアプタマーが、全て、結合能を有していることが示された。この結果から、ＳＥＬＥＸ－Ｔ法は、実用性が高いと考えられる。
　つぎに、各ラウンドについて、代表的なクローンの割合（％）を、下記表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　スタート時のラウンド０のＲＮＡプールには、理論的に、前記保存配列を含むクローンが、約０．１４％存在すると考えられる。ラウンド３では、前記保存配列を含むクローンが５０．３％にまで上昇し、前記表９に示すように、結合能の上昇も見られた。なお、前記表１１に示すように、ラウンド３では、特定のクローンが優勢になってはいなかった。一方、ラウンド６では、前記表９に示すように合成した増幅ＲＮＡの量が上昇し、さらに、前記表１１に示すように、特定の配列として＃７０１が約２０％を越えていた。さらに、ラウンド７では、特定のクローンとして＃７０１、ｓｈｏｔ４７および＃７１６が優勢となり、中でも、２番目に優勢な１０．５％を占めた２番目に優勢なｓｈｏｔ４７が、Ｈｉｓ－ＭＩＦに対して、最も強く結合した。
　本発明のアプタマーは、例えば、Ｈｉｓペプチドに結合する一般的な抗Ｈｉｓペプチド抗体と比較して、前記Ｈｉｓペプチドに対する結合力が優れている。このため、例えば、Ｈｉｓペプチドの検出において、前記抗Ｈｉｓペプチド抗体に代わって使用でき、且つ、より優れた精度での検出も可能となる。このように、本発明のアプタマーは、例えば、生物学的手法におけるＨｉｓペプチドの検出に、極めて有用なツールである。
　以上、実施形態および実施例を参照して、本発明を説明したが、本発明は、上記発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
　本出願は、２００９年５月１５日に出願された日本出願特願２００９－１１９２６９を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。

Claims (19)

  1. 下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のいずれかの核酸であることを特徴とする、ヒスチジンペプチドに結合可能なアプタマー。
    （ａ）配列番号１７で表わされる塩基配列を含む核酸
    　　　ＧＧＵＮｎＡＹＵｍＧＧＨ　（配列番号１７）
    ここで、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴを表わし、Ｎｎのｎは、前記Ｎの個数であって、１～３の整数を表わし、Ｙは、Ｕ、ＴまたはＣを表わし、Ｕｍのｍは、前記Ｕの個数であって、１～３の整数を表わし、Ｈは、Ｕ、Ｔ、ＣまたはＡを表わす。
    （ｂ）前記（ａ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記ヒスチジンペプチドに結合可能である核酸
    （ｃ）配列番号１８で表わされる塩基配列を含む核酸
    　　　ＧＧＣＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ　（配列番号１８）
    （ｄ）前記（ｃ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記ヒスチジンペプチドに結合可能である核酸
  2. 前記（ａ）の核酸が、下記（ａ１）の核酸である、請求の範囲１記載のアプタマー。
    （ａ１）配列番号８９～１０４のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
  3. 前記（ａ１）の核酸が、下記（ａ１－１）の核酸である、請求の範囲２記載のアプタマー。
    （ａ１－１）配列番号１～１６のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
  4. 前記（ａ）の核酸が、下記（ａ２）の核酸である、請求の範囲１記載のアプタマー。
    （ａ２）配列番号１０５～１１４、配列番号１１６～１２４および配列番号１２７～１４６のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
  5. 前記（ａ２）の核酸が、下記（ａ２－１）の核酸である、請求の範囲４記載のアプタマー。
    （ａ２－１）配列番号２６～３５、配列番号３７～４５、配列番号６５～６８、配列番号１９～２５および配列番号４８～５６のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
  6. 前記（ａ）の核酸が、下記（ａ３）の核酸である、請求の範囲１記載のアプタマー。
    （ａ３）配列番号１４７で表わされる塩基配列を含む核酸
    　　　ＧＧＵＮｎＡＹＵｍＧＧＨＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ　（配列番号１４７）
    ここで、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴを表わし、Ｎｎのｎは、前記Ｎの個数であって、１～３の整数を表わし、Ｙは、Ｕ、ＴまたはＣを表わし、Ｕｍのｍは、前記Ｕの個数であって、１～３の整数を表わし、Ｈは、Ｕ、Ｔ、ＣまたはＡを表わす。
  7. 配列番号１４７で表わされる塩基配列が、配列番号１４８で表わされる塩基配列である、請求の範囲６記載のアプタマー。
    　　　ＧＧＵＡＵＡＵＵＧＧＣＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ　（配列番号１４８）
  8. 前記（ａ３）の核酸が、下記（ａ３－１）の核酸である、請求の範囲６または７記載のアプタマー。
    （ａ３－１）配列番号２、１２、１４、１５および５５のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
  9. 前記（ａ）の核酸が、下記（ａ４）の核酸である、請求の範囲１記載のアプタマー。
    （ａ４）配列番号１５８～２３０２および配列番号２３０３～２３１２のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
  10. 前記（ｃ）の核酸が、下記（ｃ１）の核酸である、請求の範囲１記載のアプタマー。
    （ｃ１）配列番号２、１２、１４、１５および５５のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
  11. 前記ヒスチジンペプチドのヒスチジン個数が、６～１０個である、請求の範囲１から１０のいずれか一項に記載のアプタマー。
  12. 前記ヒスチジンペプチドが、ヒスチジンタグである、請求の範囲１から１１のいずれか一項に記載のアプタマー。
  13. 請求の範囲１から１２のいずれか一項に記載のアプタマーを含むことを特徴とする、試薬。
  14. 請求の範囲１から１２のいずれか一項に記載のアプタマーを含むことを特徴とする、キット。
  15. 請求の範囲１から１２のいずれか一項に記載のアプタマーに相補的な塩基配列を含むことを特徴とする、請求の範囲１から１２のいずれか一項に記載のアプタマーを作製するためのアプタマー作製用核酸。
  16. さらに、ベクターを含み、前記ベクターに、前記アプタマーに相補的な塩基配列が挿入されている、請求の範囲１５記載のアプタマー作製用核酸。
  17. 請求の範囲１から１２のいずれか一項に記載のアプタマーに相補的な塩基配列を含むことを特徴とする、請求の範囲１から１２のいずれか一項に記載のアプタマーに対するアンチセンス核酸。
  18. 下記（ｉ）工程～（ｉｖ）工程を含むことを特徴とする、ターゲットに結合可能なアプタマーの同定方法。
    （ｉ）ＲＮＡプールと、ターゲットとを混合する工程
    （ｉｉ）前記ＲＮＡプールから、前記ターゲットと結合するＲＮＡを分離する工程
    （ｉｉｉ）分離したＲＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼを用いてｃＤＮＡを合成する工程
    （ｉｖ）前記ｃＤＮＡを鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡを合成する工程
  19. 前記ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼである、請求の範囲１８記載の同定方法。
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