JP7221511B2 - タンパク質標的核酸アプタマー、その製造方法、及び標的タンパク質の検出方法 - Google Patents
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Description
Chem.Commun.,2011,47,4712-4714及びその補充情報(ESI;DOI:10.1039/c1cc10393h)に記載された方法に準じて以下に示す蛍光プローブを合成した。合成スキームを以下に示す。
Angew.Chem.Int.Ed.2015,54,1855-1858及びそのサポート情報(DOI:10.1002/anie.201410339)に記載された方法に準じて、以下に示す構造の蛍光プローブ(conjugate 1)を合成した。
BHQ1固定化アフィニティレジンの調製
EAHセファロース4Bレジン(GEヘルスケア社製;0.5ml,5μモルのアミノ基を含む)に、BHQ-1カルボン酸(LGC Biosearch Technologies社製;0.5mg,1μモル)、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド(DMT-MM;東京化成社製;29.5mg,0.1mモル)とトリエチルアミン(0.1mモル)をジオキサン-水(3:1,v/v)中で加えた。室温で昼夜振とうした後、レジンを水切りし、ジオキサン-水で洗浄した。レジンの未反応アミノ基をブロックするために、得られたレジンに酢酸(30mg,0.5mモル)とDMT-MM(147.4mg,0.5mモル)を加えて昼夜反応させた後、樹脂を水切りし、含水ジオキサン、含水メタノールで洗浄した。得られたレジンは3倍量のメタノール-水(1:3、v/v)中、-20℃で保存した。
インビトロセレクション法
5’側及び3’側に下表に示すプライマー配列(配列番号17及び18)が付加された60塩基のランダム配列合成オリゴヌクレオチド[5’-GAATTCCGCGTGTGCACACC-N60-GTCCGTTGGGATCCTCATGG-3’]を鋳型として、Platinum Pfx DNAポリメラーゼ(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用い、下表に示すプライマー(配列番号19及び20)を用いるPCRにより、二重鎖DNAライブラリーを得た。得られた二重鎖DNAライブラリーを、T7RNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を用いて転写して、最初のRNAライブラリーを得た。転写後にRQ1 DNase I(Promega社製)で処理し、2.5M酢酸アンモニウム/イソプロパノールで沈殿を得た。得られたRNAをNAP-5カラム(GEヘルスケア社製)にかけて未反応NTPを除去し、2.5M酢酸アンモニウム/イソプロパノールで沈殿させ、遠心してペレット化して、次の選択工程に用いた。選択工程のそれぞれでは、RNAは、結合用緩衝液(10mM Tris-HCl,100mM KCl,50mM NaCl,5mM MgCl2,pH7.5)中でアニールし、BHQ1固定化アフィニティレジン上、4℃、30分インキュベートした。レジンを水切りし、結合用緩衝液で6回洗浄して非結合物を除去した。結合したRNAを、BHQ-1アミンを飽和させた結合用緩衝液を用いて、それぞれ10分ずつ3回溶離させた。溶離液を集めてエタノールで沈殿させた。選択されたRNAをPrime Script逆転写酵素(タカラバイオ社製)で逆転写して、得られたcDNAを先のプライマーを用いてPCR増幅した。得られたDNAを鋳型としてインビトロ転写して得られたRNAライブラリーを次回の選択工程に供した。13回の選択工程後、得られたRNAを逆転写し、PCRによって二重鎖DNAに変換した。得られたDNAを、EcoRIサイト及びBamHIサイトでpUC19に組み込み、得られたベクターで大腸菌DH5αを形質転換した。28クローンが単離され、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystem社製)を用いて配列決定した。得られたクローンに含まれるBHQ1結合RNAの例を下表に示す。また、Chem.Commun.,2011,47,4712-4714の補充情報(ESI;DOI:10.1039/c1cc10393h)に記載された方法で測定した解離定数Kdを併せて示す。
インビトロセレクション法
蛍光クエンチャーを認識するループ部分の配列として配列番号5(下線部)を含み、ステム部分と接続配列を付加した第1オリゴヌクレオチド[UGGCCUAGAUAAAUUCGGAGCUU](配列番号21)に対応するオリゴデオキシヌクレオチドの5’側と3’側のそれぞれに20塩基のランダム配列及びプライマー領域を付加した合成オリゴヌクレオチド[5’-GGATCCAAGCTTGTTTGGC-N20-TGGCCTAGATAAATTCGGAGCTT-N20-GCTTTCGACGGAGAATTC-3’]を得た。この合成オリゴヌクレオチドを鋳型として、KOD FX Neo(TOYOBO社製)を用い、下表に示すプライマー(配列番号22及び23)を用いたPCRにより、二重鎖DNAライブラリーを得た。得られた二重鎖DNAライブラリーを、T7RNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を用いてインビトロ転写して、最初のRNAライブラリーを得た。転写後にDNase I(Ambion社製)で処理し、1.25M酢酸アンモニウム/イソプロパノールで沈殿を得た。得られたRNAをNAP-5カラム(GEヘルスケア社製)にかけて未反応NTPを除去し、0.136M酢酸アンモニウム/イソプロパノールで沈殿させ、遠心してペレット化し、70%エタノールで洗浄して、次の選択工程に用いた。
溶離用抗体BA3Rに代えて、AC40(Abcam社製;β-アクチンのC末端ペプチドをエピトープペプチドとして作製されたもの)を用いたこと以外は実施例1と同様にして、タンパク質標的RNAアプタマーを得た。得られたタンパク質標的RNAアプタマーのうちの1つであるApt568に対応する塩基配列(配列番号25)を以下に示す。
標的タンパク質蛍光標識評価(in vitro)
実施例1で得られたRNAアプタマー(Apt311)によるβ-アクチンの蛍光標識能を以下のようにしてin vitroで評価した。RNAアプタマー3μMを85℃で10分間変性させ、氷浴上で10分間冷却した。ついで、50μLの緩衝液(10mM Tris-HCl,100mM KCl,pH7.6)中でβ-アクチン3μMと25℃、30分間混合した。このRNA溶液を50μLの緩衝液(20mM Tris-HCl,100mM KCl,10mM MgCl2,pH7.6)中の蛍光プローブ(conjugate 1;終濃度2μM)に加えて室温で10分インキュベートした。蛍光測定は、励起波長620nm、測定波長640nmから800nmで行った。また、競合実験は、β-アクチンのN末端ペプチド(エピトープペプチド)をβ-アクチンの添加時に添加して実施した。このときエピトープペプチドは1%DMSO溶液として0から20μMで添加した。結果を図4及び図5に示す。
競合実験を、エピトープペプチドに代えて、実施例1のRNAアプタマーの選択時に使用したβアクチンN末端抗体BA3Rを用い、抗体の終濃度を3μMとしたこと以外は、実施例3と同様にして、蛍光標識能を評価した。結果を図6に示す。
実施例2で選択されたRNAアプタマー(Apt568)を用い、競合実験にβ-アクチンC末端抗体AC40を用いたこと以外は実施例3と同様にして、蛍光標識能を評価した。結果を図7に示す。
実施例1で選択されたRNAアプタマー(Apt311)と実施例2で選択されたRNAアプタマー(Apt568)を用い、競合実験にβ-アクチンN末端抗体BA3Rとβ-アクチンC末端抗体AC40を用いて、実施例3と同様にして結合交差実験を行った。結果を図8AからDに示す。
実施例1で選択されたRNAアプタマー(Apt311)のcDNAを鋳型とし、以下のプライマー(配列番号22と26、27と23)を用いたPCRにより、第1オリゴヌクレオチドの3’側に配置される第3オリゴヌクレオチドが欠損したRNAアプタマー(5’-arm)と、5’側に配置される第2オリゴヌクレオチドが欠損したRNAアプタマー(3’-arm)とを作製した。
HeLa細胞を、1%ペニシリン、100μg/mL硫酸ストレプトマイシン、10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS;Biowest社)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM;Gibco社製)中、37℃、5%CO2の加湿インキュベータ内に維持した。上記で得られたRNAアプタマー発現プラスミドとpSuper.gfpをFuGENE(R)HD トランスフェクション試薬(Promega社製)を用い、製造者のプロトコールに従ってHeLa細胞にコトランスフェクトした。これにより、RNAアプタマー配列をpSuperベクターにクローニングした。
固定化細胞でのタンパク質イメージング
HeLa細胞を、ポリ-D-リジンコートされたガラス底ViewPlate(R)-96F マイクロプレート(PerkinElmer社製)に1ウェルあたり7.5×103cellsで播種した。24時間後に4%パラホルムアルデヒド(ムトー純薬社製)を用いて室温10分で細胞を固定し、PBSで2回洗浄し、0.5%トリトン-X100で10分透過処理した。細胞を、10%硫酸デキストラン、2mMバナジル-リボヌクレオシド、0.01%サーモンDNA、30μgイーストtRNA、10mMTris-HCl(pH7.6)、10mM KClを含むアプタマーブロッキング溶液で、室温、1時間インキュベートした。PBSで2回洗浄し、50μLの0.3μM DNase Iで、室温、1時間染色した。過剰な溶液を除去し、ウェルをPBSで2回洗浄した。次いで10μMのRNAaptamerと結合緩衝液(10mM Tris-HClpH7.6,100mM KCl,10mM MgCl2)中、4℃、12時間インキュベートし、結合緩衝液を用いて2回洗い流した。細胞を、結合緩衝液50μL中、DAPI(10μg/mL)で、室温、20分間染色し、結合緩衝液30μL中、5μMの蛍光プローブ(conjugate 1)で室温、5分処理した。過剰の蛍光プローブを結合緩衝液で洗い流し、高感度カメラを備えたCellVoyager(TM)CV1000共焦点スキャナーボックス(横川電機社製)で細胞を観察した。
生細胞でのタンパク質イメージング
0日目、HeLa細胞を35mmの4-ウェル Advanced TC glass bottom細胞培養皿(Greiner Bio-One社製)に1ウェル当たり、5.0×105cellsで播種した。1日目、細胞に、それぞれのRNAアプタマー配列が導入されたpSuperベクターとpSuper.gfpをコトランスフェクトした。2日目、細胞を、完全生育培地(500μL)中のHoechst 33342(1mg/mL,同仁堂社製)で染色し、37℃で20分、5%CO2インキュベータ中で、インキュベートした。完全生育培地(100μL)中の蛍光プローブ(conjugate 1)を終濃度5μMで加えて、37℃で5分、5%CO2インキュベータ中で、インキュベートした。その後、溶液をフレッシュな培地に置換し、CV1000で細胞を観察して、生細胞のイメージを得た。経時画像を5分から1時間毎に撮影して取得した。
20 第1複合体
23 標的タンパク質
30 第2複合体
40 蛍光プローブ
Claims (7)
- ステム-ループ構造を形成して蛍光クエンチャーを認識する第1オリゴヌクレオチドと、該第1オリゴヌクレオチドの5’側に配置される第2オリゴヌクレオチドと、第1オリゴヌクレオチドの3’側に配置される第3オリゴヌクレオチドとを含み、該第2オリゴヌクレオチド及び第3オリゴヌクレオチドが協同して標的タンパク質を認識し、
前記第1オリゴヌクレオチドが、前記ループ構造の途中にループ構造から突出する少なくとも1つの第2のステム-ループ構造を形成する塩基配列を有する、タンパク質標的核酸アプタマーを含む標的タンパク質検出剤。 - 前記第2オリゴヌクレオチド及び第3オリゴヌクレオチドの塩基数は、それぞれ独立して10から30塩基である請求項1に記載のタンパク質標的核酸アプタマーを含む標的タンパク質検出剤。
- リボ核酸からなる請求項1又は請求項2に記載のタンパク質標的核酸アプタマーを含む標的タンパク質検出剤。
- 蛍光クエンチャー及び蛍光発色団を含む蛍光プローブと、
請求項1から請求項3のいずれか1項に記載のタンパク質標的核酸アプタマーを含む標的タンパク質検出剤と、
を含む標的タンパク質検出用キット。 - 蛍光クエンチャー及び蛍光発色団を含む蛍光プローブの存在下で、請求項1から請求項3のいずれか1項に記載のタンパク質標的核酸アプタマーを含む標的タンパク質検出剤と、標的タンパク質とを接触させることを含む標的タンパク質の検出方法(但し、ヒトの体内で行われる方法を除く)。
- 前記標的タンパク質は、生細胞に由来するタンパク質である請求項5に記載の検出方法。
- ステム-ループ構造を形成して蛍光クエンチャーを認識する第1オリゴヌクレオチドと、該第1オリゴヌクレオチドの5’側及び3’側のそれぞれに配置され、ランダム配列を有するオリゴヌクレオチドとを含み、
前記第1オリゴヌクレオチドが、前記ループ構造の途中にループ構造から突出する少なくとも1つの第2のステム-ループ構造を形成する塩基配列を有する核酸アプタマー候補群を準備することと、
該核酸アプタマー候補群を、標的タンパク質の存在下に、該蛍光クエンチャーを有する担体と接触させて、該標的タンパク質及び蛍光クエンチャーを認識する核酸アプタマーを選択することと、
を含むタンパク質標的核酸アプタマーの製造方法。
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Live-Cell Imaging of Endogenous mRNAs with a Small Molecule,Angewandte Chemie International Edition,2015年,Volume 54, Issue 6,pp. 1855-1858 |
細胞内エネルギー代謝に関係するタンパク質の細胞内動態観察を可能とする基盤技術の創生,京都大学エネルギー理工学研究所ゼロエミッションエネルギー研究拠点共同利用・共同研究成果報告書平成29年度,2018年03月,pp. 116-117,http://www.iae.kyoto-u.ac.jp/zero_emission/docs/2017ze_houkokusho.pdf |
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