KR101716055B1

KR101716055B1 - Ｄｎａ 앱타머를 활용한 새로운 단백질 탐지 시스템 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101716055B1
Application number: KR1020150159302A
Authority: KR
Inventors: 김양훈; 엄현주; 이상희; 이경아; 조성진
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2015-11-13
Filing date: 2015-11-13
Publication date: 2017-03-14

Abstract

본 발명은 GST (Glutathione-S-transferase)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머, 디곡시게닌(digoxigenin)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머, 및 이들을 이용하여 다양한 목적 단백질을 탐지하는 앱타머 블랏(aptamer blotting) 기술에 관한 것이다.

Description

ＤＮＡ 앱타머를 활용한 새로운 단백질 탐지 시스템 및 이의 용도{Development of new protein detection system using DNA aptamer and uses thereof}

웨스턴 블랏(Western blotting 또는 Immuno-blotting)은 항원성 에피토프(antigenic epitope)와 특이적으로 반응하는 항체(antigen)를 이용하여 단백질 혼합물 중에서 원하는 단백질(antigen)만을 찾아내는데 널리 사용되는 방법이다. 웨스턴 블랏 기법은 전체 단백질 샘플에서 목적 단백질과 특이적으로 결합하는 단백질 탐침을 이용하여 목적 단백질을 탐지하는 방법으로, 목적 단백질 탐지를 위하여 항체, 방사선 동위원소(radio isotope), 형광 염료(fluorescent dye) 등이 많이 이용되고 있다. 일반적으로는 원하는 단백질과 특이적으로 결합하는 일차 항체를 반응시킨 후, 일차 항체와 특이적으로 결합하며 HRP(Horseradish peroxidase), AP(Alkaline phosphatase)등의 특정 기질 분해 효소가 결합되어 있는 이차 항체를 반응시켜 목적하는 단백질 탐지를 시각화한다. 이 때, 탐지에 활용되는 HRP, AP 등의 효소는 특정 기질을 분해하여 색깔을 나타내는 산물을 생성함으로써 목적 단백질이 탐지되었음을 시각화하여 보여주는 역할을 한다. 이와 같은 일련의 웨스턴 블랏 과정을 통하여 실험자는 목적하는 단백질의 존재를 시각화하여 눈으로 확인할 수 있게 된다.

그러나, 웨스턴 블랏 기법을 이용한 목적 단백질 탐지를 위해서는 먼저 목적 단백질과 특이적으로 결합하는 일차 항체와 일차 항체에 따라 특이적으로 결합하는 이차 항체가 반드시 필요하다는 단점을 가지고 있다. 탐지를 목적으로 하는 단백질에 따라 개별적으로 일차 항체를 생산해야 해서 번거롭고, 이러한 항체는 동물실험을 통하여 생산되기 때문에 독성을 가지는 단백질에 대해서는 제작이 어려우며, 동물 기반의 생산 실험 후, 까다로운 분리 정제 실험을 진행해야 하는 문제가 있다. 또한, 일차 항체를 생산한 동물(rabbit, rat 등)에 따라 이에 맞는 각기 다른 이차 항체를 생산, 분리, 정제, 변형하여 탐지에 활용해야 한다는 단점을 가지고 있다. 이에, 최근 다양한 융합 단백질을 활용하여 목적 단백질을 일괄 탐지하고자 하는 다양한 기법들이 개발 활용되고 있으나, 이와 같은 노력에도 불구하고, 동물 실험을 통하여 생산되는 항체를 기반으로 하는 웨스턴 블랏 기법을 활용한 목적 단백질 탐지 기법은 독성을 가지는 표적 단백질 및 불활성 단백질에는 여전히 그 활용이 불가능하다.

한편, 최근에는 다양한 표적 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 활용한 다양한 표적 단백질 탐지 시스템이 개발 활용되고 있다. DNA 앱타머는 일반적인 단백질 탐지에 활용되는 항체와 비교하여 여러 가지 장점을 가지고 있는데, 먼저 특정 표적 물질과 특이적으로 결합하는 앱타머는 제작 과정이 in vitro에서 진행되기 때문에 비교적 까다롭지 않을 뿐만 아니라, 작고 단순한 분자로 여러 가지 실험에 필요한 변형이 가능한 장점이 있다. 또한 동물에 주입하여 항체를 생성하기 어려운 다양한 동성 단백질에 대해서도 앱타머 제작이 가능하며, 화학적 합성 방법을 이용하여 순도가 높은 앱타머를 대량 생산하는 것도 가능하다. 일반적인 단백질 기반의 항체와 달리 핵산 제제인 앱타머는 온도 및 pH 등 주변 환경에 대해 안정하여 실온에서 장기간 보존이 가능할 뿐만 아니라, 여러 번 재사용이 가능하다는 장점을 가지고 있다. 이와 같은 장점을 바탕으로 앱타머는 기존의 항체를 대체할 수 있는 탐지, 진단, 치료제 등으로 다양한 분야에서 활발한 활용이 기대되고 있다.

본 발명에서는 다양한 목적 단백질의 발현, 정제, 탐지를 위하여 다양하게 활용되는 GST (Glutathione-S-transferase) 융합 단백질을 탐지하기 위하여 일반적으로 활용되는 일차 anti-GST 항체와 일차 항체를 시각화하기 위하여 사용되는 2차 항체를 대체하는데 활용될 수 있는 앱타머 제작 방법과 이를 활용하여 새로운 표적 단백질 탐지 기법인 앱타머 블랏(aptamer blotting)에 관한 내용을 기술하고자 한다.

GST 단백질 기반의 GST 융합 단백질 발현 시스템은 1988년 Smith와 Johnson에 의하여 개발 된 재조합 시스템으로 목적 단백질을 과발현하거나 목적 단백질을 높은 활성형 단백질로 생산 또는 목적단백질의 순수, 분리, 정제를 위하여 폭 넓게 활용되고 있는 시스템이다. 이는 GST 단백질이 구전자성(求電子性) 화합물에 대한 세포 방어에 관여하는 효소로, 글루타치온(glutathione)에 고친화성을 가지고 특이적으로 결합하는 성질이 있다. 이러한 GST 단백질의 성질을 이용하여, 목적 단백질의 C-/N- 말단 또는 양쪽 말단에 GST 단백질을 융합시켜, GST 단백질과 융합된 재조합 단백질의 순수, 정제에 많이 활용하고 있다. 뿐만 아니라, GST 단백질은 자연 상태(native form)의 또는 변형 상태(denaturant form)의 GST 형태를 인지할 수 있는 단일 클론 항체를 가지고 있어 웨스턴 블랏 기법을 이용한 GST 단백질 및 GST 융합 단백질의 탐지가 가능하다. 그러나, GST 단일 클론 항체 제작을 위해서는 쥐, 토끼 등의 실험동물의 희생이 필요하며 동물 내에서 항체 생산 후에도 특별한 정제 과정 후, 단일 클론으로 활용할 수 있다는 단점을 가지고 있다. 또한, 쥐, 토끼 등 항체를 생산하는 실험동물에 따라 시각화에 사용되는 2차 항체의 종류가 달라 2차 항체를 따로 구매하여 실험해야하는 번거로움이 있다. 또한, 특정 단백질 탐지에 활용되는 항체는 단백질이기 때문에 주변 pH 및 온도 등에 민감하여 보관 및 실험이 까다롭다. 이에 동물 실험 없이 손쉽게 생산할 수 있으며, 온도 및 pH에 안정적인 새로운 GST 단백질 탐지 기법의 개발이 절실히 필요한 실정이다.

표적 단백질 탐지에 활용되는 항체는 스스로 시각화되지 못하기 때문에 이를 시각화하기 위하여 1차 항체를 직접 HRP, fluorescein, rhodamine 등의 물질로 변형시켜 시각화하거나, 1차 항체와 특이적으로 결합하는 2차 항체를 HRP, fluorescein, rhodamine 등의 물질로 변형시켜 시각화 한다. 일반적으로 1차 항체는 표적물질과 특이적으로 결합하는 특징을 가지고 있어 실험에 따라 특이적으로 제작되어 활용된다. 이에 많은 실험자들은 1차 항체는 실험에 따라 특이적으로 제작 활용하고, 2차 항체는 1차 항체를 제작한 동물 (쥐, 토끼 등)에 맞춰 HRP, fluorescein, rhodamine 등의 물질로 변형된 2차 항체를 구매 활용한다. 그러나 이와 같은 일반적인 2차 항체 구매는 1차 탐침자가 단백질인 경우에 국한적으로 활용될 수 있으며, DNA, RNA 등이 탐침자로 활용되는 경우에는 활용될 수 없다는 단점이 있다.

이에 최근에는 탐침자가 DNA, RNA, 일반적인 단백질 등인 경우 탐침자를 ㄷ디곡시게닌(digoxigenin, Dig)으로 변형 시킨 후, 이를 2차적으로 탐지할 수 있는 anti-Dig 항체를 개발하여 HRP, fluorescein, rhodamine 등으로 변형한 후 표적 물질을 탐지하고, 시각화하는데 활용하고 있다. 디곡시게닌은 일반적으로 스스로 시각화 될 수 없다는 단점을 가지고 있지만, 화학물질로서 탐침자로 널리 활용되고 있는 DNA, RNA, 단백질 등의 변형에 쉽게 활용될 수 있다는 장점을 가지고 있으며, anti-Dig 항체와 특이적으로 결합한다는 장점을 가지고 있다. 그러나, 이 또한 스스로 시각화하는데 어려움이 있어 HRP, fluorescein, rhodamine 등으로 변형된 anti-Dig 항체등을 활용하여 시각화해야한다는 단점을 가지고 있다. 단백질인 anti-Dig 항체는 다른 항체와 마찬가지로 주변 pH, 온도등에 민감하여 보관 및 실험이 까다로우며, 동물 실험을 변형해야한다는 단점을 가지고 있다. 이에 동물 실험 없이 손쉽게 생산할 수 있으며, 온도, pH 등 주변 환경에 보다 안정적인 새로운 디곡시게닌 탐지 기법 개발이 절실히 필요하다.

이와 같이, 동물 내에서 독성 단백질로 작용하여 항체 생산에 어려움이 있거나, 단일 클론 항체 생산에 어려움이 있는 항원성 단백질 탐지 및 정제를 위한 새로운 형태의 탐침자가 필요하다. 예를 들어, 동물 실험 없이 원하는 GST 단백질 및 디곡시게닌을 탐지할 수 있는 새로운 탐지 기법의 개발이 요구된다.

Yoshida Y, et al., Anal Biochem. 375(2):217-22 (2008년)

본 발명은 GST (Glutathione-S-transferase)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머, 디곡시게닌(digoxigenin, Dig)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머, 및 이들을 이용하여 다양한 목적 단백질을 탐지하는 앱타머 블랏(aptamer blotting) 기술을 제공한다.

보다 상세하게, 본 발명은 일반적으로 GST 탐지 및/또는 디곡시게닌(Dig) 탐지를 위한 앱타머를 제공하며, 이를 이용하여 종래 항체-항원 반응을 기반으로 하는 웨스턴 블랏(western blotting) 기법을 대체할 수 있는, 이른바 앱타머 블랏(aptamer blotting) 기술을 제공한다.

일 예로, 본 발명은 GST (Glutathione-S-transferase) 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공한다. 상기 앱타머는, 서열번호 1 내지 서열번호 15로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열로 이루어진 DNA 앱타머일 수 있다.

다른 예로, 본 발명은 상기 DNA 앱타머의 선별 방법을 제공한다.

다른 예로, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는, GST 단백질 또는 GST를 포함하는 융합 단백질의 검출용 조성물을 제공한다.

다른 예로, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는, GST 단백질 또는 GST를 포함하는 융합 단백질의 검출용 키트를 제공한다.

다른 예로, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, 시료 내 GST 단백질 또는 GST를 포함하는 융합 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.

다른 예로, 본 발명은 디곡시게닌에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공한다. 상기 앱타머는, 서열번호 16 내지 서열번호 27로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열로 이루어진 DNA 앱타머일 수 있다.

다른 예로, 본 발명은 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는, 디곡시게닌 또는 디곡시게닌이 결합된 물질의 검출용 조성물을 제공한다.

다른 예로, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는, 디곡시게닌 또는 디곡시게닌이 결합된 물질의 검출용 키트를 제공한다.

다른 예로, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, 시료 내 디곡시게닌 또는 디곡시게닌이 결합된 물질을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 GST에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머, 디곡시게닌에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머, 및 이들을 이용하여 다양한 목적 단백질을 탐지하는 앱타머 블랏 기술에 관한 것이다.

본 발명은 일반적으로 GST 단백질 탐지 및 디곡시게닌(Dig) 탐지를 위한 앱타머를 제공하며, 이를 이용하여 종래 항체-항원 반응을 기반으로 하는 웨스턴 블랏(western blotting) 기법을 대체할 수 있는 새로운 형태의 GST 단백질 탐지 및 디곡시게닌 탐지 시스템을 개발하였으며, 이를 앱타머 블랏(aptamer blotting)이라고 칭한다. 도 2는 기존 항체 기반의 웨스턴 블랏 기법과 본 발명의 앱타머 블랏 기법을 비교한 모식도이다.

본 발명은 재조합 단백질의 발현 확인 및 정제시 융합 (fusion) 단백질로 많이 사용되는 GST 단백질을 탐지할 수 있는, DNA 앱타머를 기반으로 한 새로운 형태의 탐지 시스템에 관한 것이다. 또한, 일반적인 생물학적 분자를 시각화하기 위하여 널리 활용되고 있는 디곡시게닌을 탐지할 수 있는, DNA 앱타머를 기반으로 한 새로운 형태의 탐지 시스템에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명은 GST 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA　앱타머의 선별방법, 이를 통하여 획득한 GST 단백질 결합 DNA 앱타머, 상기 앱타머를 포함하는 조성물 및 키트, 상기 앱타머를 이용한 GST 단백질 탐지 기법에 관한 것이다. 또한, 디곡시게닌에 특이적으로 결합하는 DNA　앱타머의 선별방법, 이를 통하여 획득한 디곡시게닌 결합 DNA 앱타머, 상기 앱타머를 포함하는 조성물 및 키트, 상기 앱타머를 이용한 디곡시게닌 탐지 기법에 관한 것이다.

본 발명의 몇 가지 구체화된 예시적 양태를 도 1에 개략적으로 표현하였다. 도 1의 첫번째 그림은 GST 단백질에 특이적으로 결합하는 GST 단백질 결합 DNA 앱타머 제작 방법을 나타낸다. 두번째 그림은 탐침자 Dig의 시각화를 위한 Dig과 특이적으로 결합하는 비오틴으로 변형된 Dig 결합 앱타머 제작 방법을 나타낸다. 세번째 그림은 상용화되어 사용되는 anti-GST 일차 항체와 GST 단백질 간의 결합을 나타낸 것으로, 종래 기술에 해당한다. 본원 실시예에서는 이러한 종래 기술과 비교하여 결합력을 확인하였다. 네번째 그림은 GST 단백질과 특이적으로 결합하는 HRP로 변형된 GST 단백질 결합 앱타머 제작 방법을 나타낸다. 다섯번째 그림은 GST 단백질과 특이적으로 결합하는 Dig으로 변형된 GST 단백질 결합 앱타머와 HRP로 변형된 Dig 결합 앱타머 제작 방법을 나타낸다. 여섯번째 그림은 anti-GST 항체 및 2차 항체를 이용한 방법으로, 종래 기술에 해당한다. 본원 실시예에서는 이러한 종래 기술과 비교하여 앱타머를 기반으로 하는 기법을 발명하였다.

일 양태로, 본 발명은 GST 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 디곡시게닌에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머에 관한 것이다.

본 발명에서, DNA 앱타머 (Aptamer) 란 표적으로 한 물질에 높은 친화력과 특이성을 가지는 단일가닥의 DNA 또는 RNA를 말한다. 본 발명의 목적상, DNA 앱타머는 GST 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머, 또는 디곡시게닌에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머이다.

본 발명의 일 구현예에 따른, GST 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 서열번호 15의 염기서열 중 적어도 하나의 염기서열을 가질 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른, 디곡시게닌에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 서열번호 16 내지 서열번호 27의 염기서열 중 적어도 하나의 염기서열을 가질 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 16의 염기서열을 가질 수 있다.

또한, 상기 서열과 상보적인 DNA 앱타머 서열도 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다. 또한, 상기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1 내지 서열번호 27의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, DNA 앱타머 유전자는 서열번호 1 내지 27의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 DNA 앱타머는 단일가닥 DNA일 수 있다. 단일가닥 DNA 앱타머는 2차 구조를 형성하여 GST 패밀리에 속하는 단백질, 바람직하게는 종래 anti-GST 항체에 의하여 탐지되는 특징을 가지는 GST 단백질에 특이적으로 결합하여 이를 탐지 할 수 있다. 또한, 단일가닥 DNA 앱타머는 2차 구조를 형성하여 DNA, RNA, 단백질 탐지를 위한 변형체로 주로 사용되는 화학물질인 디곡시게닌(Dig), 바람직하게는 종래 anti-Dig 항체에 의하여 탐지되는 특징을 가지는 화학물질 디곡시게닌(Dig)에 특이적으로 결합하여 이를 탐지 할 수 있다

상기 DNA 앱타머는 전형적으로는 타겟 분자의 결합에 대한 시험관내 선택법에 의해 얻을 수 있다. 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택하는 방법은 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 유기 분자, 뉴클레오타이드, 아미노산, 폴리펩타이드, 세포 표면상의 마커분자, 이온, 금속, 염, 다당류가 각 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머를 분리하는 적절한 타겟 분자가 될 수 있다. 앱타머의 선별은 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 방법으로 공지된 생체내 또는 시험관내 선택 기술을 이용할 수 있다(Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; 및 Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990). 본원에서 "SELEX 방법"이란 임의적으로 합성된 DNA의 집합에서 특정 분자에 대해 높은 결합력을 지니는 DNA를 선별하여 증폭시킴으로써 해당 분자의 DNA 결합 서열을 알아내는 방법을 의미한다(Louis et al. 1992. Nature 355, 564-566).

일 예로, 본 발명은 (a) PCR을 통해 랜덤 dsDNA (double strand DNA) 라이브러리를 증폭하는 단계, (b) 상기 랜덤 dsDNA 라이브러리로부터 비대칭(asymmetric) PCR을 통해 ssDNA (single strand DNA) 앱타머를 증폭하는 단계, 및 (c) 상기 증폭된 ssDNA 앱타머를 GST 또는 디곡시게닌과 반응시켜 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 기법을 통해 GST 또는 디곡시게닌 대장균 생균 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하는 단계를 포함하는, DNA 앱타머의 선별 방법에 관한 것이다.

단계 (a)는 DNA 앱타머 선별 방법의 첫번째 단계로, PCR을 이용하여 랜덤 dsDNA 라이브러리를 증폭하는 것이다.

단계 (b)는 PCR을 이용하여 증폭한 dsDNA 중 ssDNA 만을 증폭하기 위해 비대칭(asymmetric) PCR을 수행하는 것이다. 비대칭 PCR은 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 중 하나의 프라이머, 예를 들면, 정방향 프라이머만을 이용하여 PCR을 수행함으로써 단일가닥 DNA를 수득할 수 있다. ssDNA 앱타머를 선별하는 방법은, 예를 들면, PCR 수행 시 역방향 프라이머에 비오틴을 부착시켜 dsDNA를 증폭하고, 증폭 산물의 3'에 스트렙트아비딘을 처리하여 비오틴-스트렙트아비딘 복합체를 형성하여 복합체를 선택적으로 제거함으로써 비오틴이 결합되지 않은 반대쪽의 ssDNA 앱타머 만을 수득할 수 있다. 수득한 ssDNA 앱타머에 S1 nuclease를 처리하여 ssDNA인지를 확인할 수 있다. 또한, 수득한 ssDNA 앱타머는 SELEX 방법에 사용하기 위해 ssDNA를 가열하여 변성시킨 후 상온에서 천천히 식혀 3차원 구조를 형성시킬 수 있다.

단계 (c)는 상기 ssDNA 앱타머를 GST 또는 디곡시게닌과 서로 접촉하여 반응시킨 후, SELEX 기법을 통해 GST 또는 디곡시게닌에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하는 것이다. GST 또는 디곡시게닌에 결합하지 않는 ssDNA 앱타머는 세척하여 제거하고 특이적으로 결합하는 ssDNA만을 용출시킬 수 있다. 또한, 이 단계에서 GST 또는 디곡시게닌이 아닌 다른 단백질에 결합하는 ssDNA를 제거하는 Negative SELEX 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 GST 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별 방법은, 예를 들어, glutahione sepharose 4B bead (Armersham Biosciences, USA)에 GST 단백질을 고정하는 단계 및 SELEX 방법을 이용하여 GST 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별 방법을 포함할 수 있다. 또한, GST 단백질을 선택적으로 고정시켜 GST 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별하는 방법은, 카르복실기로 코팅된 센서 칩에 GST 단백질을 고정하는 단계, 상기 GST 단백질이 고정된 칩을 이용한 최적 GST 단백질 결합 DNA 앱타머 선별 단계, 및 최적 GST 단백질 결합 DNA 앱타머에 대한 GST 단백질과의 결합력 측정 단계를 포함할 수 있다. 카르복실기로 코팅된 센서 칩은 상용화된 CM5 (GE Healthcare)일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명에서의 디곡시게닌과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별 방법은, 스트렙트아비딘 아가로스 비드(streptavidin agarose bead)에 비오틴(biotin)으로 변형된 디곡시게닌을 고정하는 단계 및 SELEX 방법을 이용하여 디곡시게닌에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별 방법을 포함할 수 있다. 디곡시게닌을 선택적으로 고정시켜 디곡시게닌에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별하는 방법은, 스트렙트아비딘으로 코팅된 SA 센서 칩에 비오틴으로 변형된 디곡시게닌을 부착하는 단계, 및 상기 디곡시게닌과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별 단계로 이루어질 수 있다. 스트렙트아비딘으로 코팅된 센서 칩은 Biacore에서 판매되고 있는 SA 센서 칩일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

GST 또는 디곡시게닌을 이용한 SELEX 기법의 일 구현예로, GST 또는 디곡시게닌과 DNA 앱타머를 결합시키는 단계, GST 또는 디곡시게닌에 결합하는 DNA 앱타머 만을 회수하는 단계를 SELEX 의 한 라운드로 하여, 최적 특이성 (specificitiy)와 친화성 (affinity)을 갖는 SELEX 라운드를 선별하는 과정을 포함할 수 있다.

최적 SELEX 라운드의 선별 과정은, 나노드랍을 통한 정량화 및 실시간 PCR를 통한 최적 SELEX 라운드 선별 단계, 선별된 라운드에서 최적의 GST 또는 디곡시게닌 결합 DNA 앱타머 후보군을 확보하기 위하여 앱타머 풀을 클로닝하여 DNA 앱타머 후보군 각 앱타머 서열을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.

구체적인 실시예에서는, 최적 친화성(affinity)을 갖는 SELEX 라운드 선별을 위하여, SELEX를 10회까지 마친 후 SELEX의 계속적 진행 여부 및 최적 라운드 선별을 위하여 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머의 친화성을 실시간 PCR 기법을 이용하여 정량적으로 확인한 결과, 8 라운드에서 획득한 ssDNA 앱타머의 GST 단백질 결합 효율이 가장 높은 것을 확인하였고 (표 1 참고), 9 라운드에서 획득한 ssDNA 앱타머의 디곡시게닌 결합 효율이 가장 높은 것을 확인하였다 (표 3 참고). 이에, 최적 SELEX 라운드에서 GST 또는 디곡시게닌 결합 DNA 앱타머 후보군 선별을 위한 PCR 및 클로닝을 수행한 후, 선별된 GST 또는 디곡시게닌 결합 DNA 앱타머 후보군의 DNA 서열을 결정하였다. 최종적으로 선별된 15종류의 GST 결합 DNA 앱타머의 서열은 표 2에 나타내었으며, 12종류의 디곡시게닌 결합 DNA 앱타머의 서열은 표 4에 나타내었다.

본 발명의 DNA 앱타머 선별 방법에서, 상기 GST 단백질은 바람직하게는 anti-GST 항체에 의하여 탐지되는 특징을 가지는 GST 단백질 및 GST 융합 단백질 일 수 있다.

또 하나의 양태로, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 15로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열로 이루어진 DNA 앱타머를 포함하는, GST 단백질 또는 GST를 포함하는 융합 단백질의 검출용 조성물에 관한 것이다.

또 하나의 양태로, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는, GST 단백질 또는 GST를 포함하는 융합 단백질의 검출용 키트에 관한 것이다.

또 하나의 양태로, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, 시료 내 GST 단백질 또는 GST를 포함하는 융합 단백질을 검출하는 방법에 관한 것이다.

또 하나의 양태로, 본 발명은 서열번호 16 내지 서열번호 27로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열로 이루어진 DNA 앱타머를 포함하는, 디곡시게닌 또는 디곡시게닌이 결합된 물질의 검출용 조성물에 관한 것이다.

또 하나의 양태로, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는, 디곡시게닌 또는 디곡시게닌이 결합된 물질의 검출용 키트에 관한 것이다.

또 하나의 양태로, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, 시료 내 디곡시게닌 또는 디곡시게닌이 결합된 물질을 검출하는 방법에 관한 것이다.

본원에서, DNA 앱타머에 의하여 검출되는 상기 GST 단백질은, 종래 anti-GST 항체에 의하여 탐지되는 특징을 가지는 GST 단백질 및 GST 융합 단백질을 포함한다. GST 단백질은 단량체(monomer) 또는 이량체(dimer)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, GST 융합 단백질은 GST 와 임의의 목적 단백질이 융합된 융합 단백질을 포함한다.

또한, 본원에서 DNA 앱타머에 의하여 검출되는 상기 디곡시게닌은, 종래 anti-dig 항체에 의하여 탐지되는 특징을 가지는, 디곡시게닌과 특이적으로 결합하는 물질을 포함한다. 예를 들어, 디곡시게닌이 결합된 다양한 핵산(RNA, DNA 등), 펩타이드 또는 단백질을 포함한다.

본 발명의 조성물 및 키트는 앱타머의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 안정성을 유지하기 위해, 분말 상태 또는 적절한 완충액에 용해된 상태로 제공될 수 있다. 또한, 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 키트는 DNA 앱타머가 기판 상에 고정화된 형태일 수 있으며, 예를 들어, 마이크로어레이 형태일 수 있다. DNA 앱타머를 기판 상에 고정화시키는 것은 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.

용어 "기판"은 결합 특성을 보유하고, 결합의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건하에 DNA 앱타머가 부착될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막(예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스) 또는 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용 또는 고정 전에, DNA 앱타머를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 결합 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH₂ 기, SH 기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 비오틴, 합텐 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.

마이크로어레이 기판의 특정의 영역에 DNA 핵산 물질이 고밀도로 부착된 어레이(배열)를 의미한다. 마이크로어레이의 기판은, 적합한 견고성 또는 반-견고성을 갖는 지지체를 의미하며, 예컨대, 유리, 막(membrane), 슬라이드, 필터, 칩, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 DNA 앱타머는 상기 기판상에 배열되고 고정화될 수 있다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시될 수 있다. 예를 들어, DNA 앱타머는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 유리 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 DNA 앱타머는 링커 (예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기판에 결합될 수 있다. 본 발명의 DNA 앱타머는 예를 들어, 비오티닐화될 수 있고, 이는 스트랩트아비딘이 코팅된 기판상에 성공적으로 결합될 수 있다.

본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 15의 염기서열 중 적어도 하나의 염기서열을 가지는 DNA 앱타머를 이용한 GST 단백질 탐지 시스템, 서열번호 16 내지 서열번호 27의 염기서열 중 적어도 하나의 염기서열을 가지는 DNA 앱타머를 이용한 디곡시게닌 탐지 시스템을 제공한다. 이와 더불어 앱타머 만을 이용하여 표적 물질을 탐지하는 기존 western blotting 기법을 대체할 수 있는 aptamer blotting이라는 새로운 기법을 제공한다.

본원에서, "앱타머 기반 GST 단백질 탐지 시스템"은 표지물질로 변형(modification)된 DNA 앱타머를 이용하여 자연 형태 또는 변형 상태의 GST 단백질을 모두 탐지할 수 있는 시스템, 디곡시게닌으로 변형된 GST 단백질 결합 DNA 앱타머와 디곡시게닌 결합 DNA 앱타머를 순차적으로 이용하여 자연 형태 또는 변형 상태의 GST 단백질을 모두 탐지할 수 있는 시스템을 포함한다. 또한, 본원에서, "앱타머 기반 디곡시게닌 탐지 시스템" 은 표지물질로 로 변형된 DNA 앱타머를 이용하여 디곡시게닌으로 변형된 다양한 DNA, RNA, 단백질 탐침자를 탐지할 수 있는 시스템을 포함한다. 또한, 본원에서, "앱타머 블랏(aptamer blotting)"이란 기존 항체를 이용하여 표적 물질을 탐지하는 웨스턴 블랏western blotting 기법을 대체하는 기법으로, 항체 대신 앱타머를을 이용하여 표적물질을 탐지하고, 시각화하는 기법을 의미한다.

일 구체예로, 본 발명은 GST 단백질에 특이적으로 결합하는DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, 시료 내 GST 단백질 또는 GST를 포함하는 융합 단백질을 검출하는 방법에 관한 것이다.

상기 DNA 앱타머는 표지물질 또는 디곡시게닌(digoxigenin)이 결합된 것일 수 있고, 상기 표지물질은 발색 효소, 형광물질, 발광물질, 리간드, 미소입자, 레독스 분자 또는 방사선 동위원소일 수 있다.

효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 (호스라디시 퍼옥시다제 등), 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제, GDPase, RNase, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제, 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 비오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W (CN)₈ , [Os (bpy) 3 ] ²⁺ , [RU (bpy) ₃ ] ²⁺, [MO (CN) ₈ ] ^4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I , ¹⁸⁶Re 등이 포함되며 이에 제한되지 않는다.

바람직하게는 HRP, 플루오레신, 로다민, 방사성 동위원소, Cy3 또는 Cy5 등과 같은 물질 또는 비오틴 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

일 구현예로, 본 발명은 표지물질이 결합된, GST 에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계, 및 상기 표지물질에 의한 시그널의 크기를 분석하는 단계를 포함하는, 시료 내 GST 단백질 또는 GST를 포함하는 융합 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.

다른 구현예로, 본 발명은 디곡시게닌이 결합된 GST 에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계, 표지물질이 결합된, 디곡시게닌에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 또는 항체를 처리하는 단계, 상기 표지물질에 의한 시그널의 크기를 분석하는 단계를 포함하는, 시료 내 GST 단백질 또는 GST를 포함하는 융합 단백질을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 디곡시게닌에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 서열번호 16 내지 서열번호 27로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열로 이루어진 DNA 앱타머일 수 있다.

다른 구현예로, 본 발명은 표지물질이 결합된, 디곡시게닌에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계, 및 상기 표지물질에 의한 시그널의 크기를 분석하는 단계를 포함하는, 시료 내 디곡시게닌 또는 디곡시게닌이 결합된 물질을 검출하는 방법을 제공한다.

상기 표지물질은 발색 효소, 형광물질, 발광물질, 리간드, 미소입자, 레독스 분자 또는 방사선 동위원소일 수 있다.

다른 구현예로, 본 발명은 제1 표지물질이 결합된, 디곡시게닌에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계, 제2 표지물질이 결합된, 상기 제1 표지물질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 또는 항체를 처리하는 단계, 및 상기 제2 표지물질에 의한 시그널의 크기를 분석하는 단계를 포함하는, 시료 내 디곡시게닌 또는 디곡시게닌이 결합된 물질을 검출하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 상기 제1 표지물질은 비오틴(biotin) 이고, 제2 표지물질은 HRP (horseradish peroxidase)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명을 이용하여, GST 단일 단백질 또는 GST 단백질과 융합된 수많은 GST 융합 단백직을 특이적으로 탐지 할 수 있게 될 뿐만니라, 디곡시게닌으로 변형된 수 많은 DNA, RNA, 단백질 탐침자를 탐지할 수 있게 된다.

구체적인 실시예에서는, 선별된 GST 단백질 결합 DNA 앱타머를 85℃에서 5분간 반응시킨 후 실온에서 서서히 식혀 2차 구조를 형성한 후, 자연 상태 GST 단백질, 변형 상태의 GST 단백질, GST 단백질과 융합된 B. subtilis 유래의 지질 분해 효소 탐지에 이용하였다. 또한, 디곡시게닌으로 변형된 GST 단백질 결합 DNA 앱타머를 이용하여 GST 단백질 탐지를 확인을 위하여 anti-Dig-Alkaline phosphatae conjugated와 NBT/BCIP 시스템과 HRP 시스템을 활용하여 시각화하였다. 이 단계를 통하여 상기 최적 GST 단백질 결합 DNA 앱타머를 활용한 새로운 GST 단백질 탐지 시스템의 다양한 산업적 응용가능성을 확인하였다. 또한, HRP로 변형된 디곡시게닌 결합 DNA 앱타머를 이용하여 디곡시게닌 탐지를 확인하기 위하여 enhanced chmiluminescence (ECL) kit (GE Healthcare, Sweden)을 사용하여, 시그널을 시각화하였다. 이러한 단계를 통하여 상기 최적 GST 단백질 결합 DNA 앱타머와 최적 Dig 결합 DNA 앱타머를 이용하여 새로운 형태의 DNA 앱타머 기반의 탐지 시스템을 환성할 수 있었으며, 이들의 다양한 산업적 응용가능성을 확인할 수 있었다.

본 발명은 현재 선진국 및 다국적 기업에 의해 독점되어 있는 면역 반응을 이용한 DNA, RNA, 단백질 탐지 기술을 대체할 수 있는 핵심기술로 DNA, RNA, 단백질 등 표적 물질 탐지 분야 및 면역 반응을 이용한 진단 분야 등에서 폭 넓은 산업적 응용성을 가지고 있다.

도 1은 기존 1차, 2차 항체를 이용한 Western blotting 기법(오른쪽 그림)과 1차, 2차 앱타머를 이용하는 Aptamer blotting 기법(왼쪽 그림)을 비교한 모식도를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 Aptamer blotting 기법과 기존 Western blotting 기법을 비교하기 위하여 실시한 실험의 계략적인 모식도를 나타낸다.
도 3은 랜덤 DNA 앱타머를 PCR 및 비대칭 PCR 기법을 이용하여 증폭한 후, 스트렙트아비딘 비드를 이용하여 ssDNA만을 선택적으로 회수한 결과를 아가로스 전기영동을 통하여 확인한 결과를 나타낸다.
레인 M: 100 bp DNA 마커.
레인 1: 랜덤 DNA 앱타머를 PCR 기법을 이용하여 증폭한 후 결과.
레인 2: 랜덤 DNA 앱타머를 비대칭 PCR 기법을 이용하여 증폭한 후 결과.
레인 3: 스트렙트아비딘 비드를 이용하여 ssDNA만을 선택적으로 회수한 결과.
도 4a는 GST 단백질에 특이적으로 결합하는 GST 앱타머(GST-1, GST-2)의 구조를 m-fold 프로그램을 이용하여 2차원적으로 나타낸 결과이다.
도 4b는 GST 단백질에 특이적으로 결합하는 GST 앱타머(GST-3, GST-4)의 구조를 m-fold 프로그램을 이용하여 2차원적으로 나타낸 결과이다.
도 4c는 GST 단백질에 특이적으로 결합하는 GST 앱타머(GST-5, GST-6)의 구조를 m-fold 프로그램을 이용하여 2차원적으로 나타낸 결과이다.
도 4d는 GST 단백질에 특이적으로 결합하는 GST 앱타머(GST-7, GST-8)의 구조를 m-fold 프로그램을 이용하여 2차원적으로 나타낸 결과이다.
도 4e는 GST 단백질에 특이적으로 결합하는 GST 앱타머(GST-9, GST-10)의 구조를 m-fold 프로그램을 이용하여 2차원적으로 나타낸 결과이다.
도 4f는 GST 단백질에 특이적으로 결합하는 GST 앱타머(GST-11, GST-12)의 구조를 m-fold 프로그램을 이용하여 2차원적으로 나타낸 결과이다.
도 4g는 GST 단백질에 특이적으로 결합하는 GST 앱타머(GST-13, GST-14)의 구조를 m-fold 프로그램을 이용하여 2차원적으로 나타낸 결과이다.
도 4h는 GST 단백질에 특이적으로 결합하는 GST 앱타머(GST-15)의 구조를 m-fold 프로그램을 이용하여 2차원적으로 나타낸 결과이다.
도 5는 확보한 GST 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군이 GST 단백질과 anti-GST 항체 간의 결합 저해능을 western blotting 기법을 이용하여 확인한 결과이다.
1-15: GST-1부터 GST-15 앱타머를 GST 단백질과 먼저 반응 시킨 후, anti-GST 항체와 반응 시킨 결과.
C1: GST 단백질 5ng를 anti-GST 항체와 반응 시킨 결과.
C2: GST 단백질 10ng를 anti-GST 항체와 반응 시킨 결과.
C3: GST 단백질 15ng를 anti-GST 항체와 반응 시킨 결과.
도 6의 (a)는 GST 단백질 결합 앱타머를 이용하여 탐지할 수 있는 GST 단백질 탐지 농도를 민감도를 확인한 결과이다.
레인 1: 정제된 GST 단백질 1 ug.
레인 2: 정제된 GST 단백질 500 ng.
레인 3: 정제된 GST 단백질 100 ng.
레인 4: 정제된 GST 단백질 50 ng.
레인 5: 정제된 GST 단백질 10 ng.
레인 6: 정제된 GST 단백질 5 ng.
레인 7: 정제된 GST 단백질 1 ng.
도 6의 (b)는 anti-GST 항체를 이용하여 탐지할 수 있는 GST 단백질 탐지 농도를 민감도를 확인한 결과이다.
레인 1: 정제된 GST 단백질 1 ug.
레인 2: 정제된 GST 단백질 500 ng.
레인 3: 정제된 GST 단백질 100 ng.
레인 4: 정제된 GST 단백질 50 ng.
레인 5: 정제된 GST 단백질 10 ng.
레인 6: 정제된 GST 단백질 5 ng.
레인 7: 정제된 GST 단백질 1 ng.
도 7a의 (a)는 GST 단백질을 발현하는 벡터, pGEX4T-1를 대장균에 형질도입한 후, 이들로부터 생산되는 GST 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 결과이다.
레인 M: 단백질 분자량 마커
레인 1: pGEX4T-1 발현 벡터를 BL21(DE3) 균주에 형질도입한 후의 단백질 상층액.
레인 2: pGEX 4T-1 발현 벡터를 BL21(DE3) 균주에 형질도입 한 후 Glutathione agarose를 이용하여 순수 분리 정제한 GST 단백질.
도 7a의 (b)는 자연상태의 GST 단백질을 GST 단백질 결합 DNA 앱타머를 이용하여 탐지할 수 있는지를 EMSA 기법을 이용하여 확인한 결과이다.
레인 1: EMSA 기법을 이용하여 GST 단백질 결합 DNA 앱타머의 이동위치를 확인한 결과
레인 2: EMSA 기법을 이용하여 GST 단백질과 GST 단백질 결합 DNA 앱타머의 결합 후의 이동위치를 확인한 결과.
도 7b의 (c)는 anti-GST 항체를 이용한 BL21(DE3) 균주에 형질도입된 pGEX4T-1 발현 벡터가 생산하는 전체 단백질 내의 GST 단백질 및 정제 GST 단백질 탐지 결과이다.
레인 M: 단백질 분자량 마커
레인 1: pGEX4T-1 발현 벡터를 BL21(DE3) 균주에 형질도입 한 후의 단백질 상층액.
레인 2: pGEX 4T-1 발현 벡터를 BL21(DE3) 균주에 형질도입 한 후 Glutathione agarose를 이용하여 순수 분리 정제한 GST 단백질.
도 7b의 (d)는 GST 단백질 결합 DNA 앱타머를 이용한 BL21(DE3) 균주에 형질도입 된 pGEX4T-1 발현 벡터가 생산하는 전체 단백질 내의 GST 단백질 및 정제 GST 단백질 탐지 결과이다.
레인 M: 단백질 분자량 마커
레인 1: pGEX4T-1 발현 벡터를 BL21(DE3) 균주에 형질도입 한 후의 단백질 상층액.
레인 2: pGEX 4T-1 발현 벡터를 BL21(DE3) 균주에 형질도입 한 후 Glutathione agarose를 이용하여 순수 분리 정제한 GST 단백질.
도 8a는 Dig과 특이적으로 결합하여 선별 확보된 Dig 결합 DNA 앱타머(Dig-1, Dig-2)의 구조를 m-fold 프로그램을 이용하여 2차원적으로 나타낸 결과이다.
도 8b는 Dig과 특이적으로 결합하여 선별 확보된 Dig 결합 DNA 앱타머(Dig-3, Dig-4)의 구조를 m-fold 프로그램을 이용하여 2차원적으로 나타낸 결과이다.
도 8c는 Dig과 특이적으로 결합하여 선별 확보된 Dig 결합 DNA 앱타머(Dig-5, Dig-6)의 구조를 m-fold 프로그램을 이용하여 2차원적으로 나타낸 결과이다.
도 8d는 Dig과 특이적으로 결합하여 선별 확보된 Dig 결합 DNA 앱타머(Dig-7, Dig-8)의 구조를 m-fold 프로그램을 이용하여 2차원적으로 나타낸 결과이다.
도 8e는 Dig과 특이적으로 결합하여 선별 확보된 Dig 결합 DNA 앱타머(Dig-9, Dig-10)의 구조를 m-fold 프로그램을 이용하여 2차원적으로 나타낸 결과이다.
도 8f는 Dig과 특이적으로 결합하여 선별 확보된 Dig 결합 DNA 앱타머(Dig-11, Dig-12)의 구조를 m-fold 프로그램을 이용하여 2차원적으로 나타낸 결과이다.
도 9는 Dig 결합 Dig-1 앱타머 및 anti-Dig 항체를 이용하여 탐지할 수는 Dig 농도의 민감도를 확인한 결과이다.
레인 1: Dig으로 변형된 주형 DNA 100 pmol.
레인 2: Dig으로 변형된 주형 DNA 80 pmol.
레인 3: Dig으로 변형된 주형 DNA 60 pmol.
레인 4: Dig으로 변형된 주형 DNA 40 pmol.
레인 5: Dig으로 변형된 주형 DNA 20 pmol.
레인 6: Dig으로 변형된 주형 DNA 10 pmol.
레인 7: Dig으로 변형된 주형 DNA 5 pmol.
레인 8: Dig으로 변형된 주형 DNA 1 pmol.
도 10은 HRP로 변형된 Dig 결합 Dig-1 앱타머를 이용하여 탐지할 수는 Dig 농도의 민감도를 확인한 결과이다.
레인 1: Dig으로 변형된 주형 DNA 100 pmol.
레인 2: Dig으로 변형된 주형 DNA 80 pmol.
레인 3: Dig으로 변형된 주형 DNA 60 pmol.
레인 4: Dig으로 변형된 주형 DNA 40 pmol.
레인 5: Dig으로 변형된 주형 DNA 20 pmol.
레인 6: Dig으로 변형된 주형 DNA 10 pmol.
레인 7: Dig으로 변형된 주형 DNA 5 pmol.
레인 8: Dig으로 변형된 주형 DNA 1 pmol.
도 11a 및 도 11b는 Dig으로 변형된 GST 결합 GST-1 앱타머 및 HRP로 변형된 Dig 결합 Dig-1 앱타머를 이용한 Aptamer blotting 기법을 활용한 GST 단백질 탐지능과 기존 GST 탐지에 활용된 1차, 2차 항체를 이용한 Western blotting 기법의 GST 단백질 탐지능, Dig으로 변형된 GST 결합 GST-1 앱타머 및 HRP로 변형된 Dig 결합 2차 항체 (anti-Dig-Alkaline phosphatae conjugated)를 이용한 southwestern blotting을 이용한 GST 단백질 탐지능을 비교 확인한 실험 결과이다.
보다 상세하게, 도 11a의 (a)는 anti-GST 항체와 anti-mouse IgG peroxidase conjugated 항체를 이용한 기존 WB (Western blotting) 기법을 활용하여 GST 단백질을 탐지한 결과이다.
레인 M: 단백질 분자량 마커
레인 1: pGEX4T-1 발현 벡터를 BL21(DE3) 균주에 형질도입 한 후의 단백질 상층액.
레인 2: pGEX 4T-1 발현 벡터를 BL21(DE3) 균주에 형질도입 한 후 Glutathione agarose를 이용하여 순수 분리 정제한 GST 단백질.
도 11a의 (b)는 Dig으로 변형된 GST 단백질 결합 GST-2 앱타머와 anti-Dig-Alkaline phosphatae conjugated 항체를 이용한 기존 SWB (Southwestern blotting) 기법을 활용하여 GST 단백질을 탐지한 결과이다.
레인 M: 단백질 분자량 마커
레인 1: pGEX4T-1 발현 벡터를 BL21(DE3) 균주에 형질도입 한 후의 단백질 상층액.
레인 2: pGEX 4T-1 발현 벡터를 BL21(DE3) 균주에 형질도입 한 후 Glutathione agarose를 이용하여 순수 분리 정제한 GST 단백질.
도 11b 의 (c)는 Dig으로 변형된 GST 단백질 결합 GST-2 앱타머와 HRP 변형된 Dig 결합 Dig-1 앱타머를 이용한 새로운 형태의 Aptamer blotting기법을 이용하여 GST 단백질을 탐지한 결과이다.
레인 M: 단백질 분자량 마커
레인 1: pGEX4T-1 발현 벡터를 BL21(DE3) 균주에 형질도입 한 후의 단백질 상층액.
레인 2: pGEX 4T-1 발현 벡터를 BL21(DE3) 균주에 형질도입 한 후 Glutathione agarose를 이용하여 순수 분리 정제한 GST 단백질.
도 12는 GST 단백질 융합 단백질을 확보하기 위한 재조합 PNBE 발현 벡터 제조 및 클로닝(cloning) 결과를 나타낸 결과이다.
레인 M: 1kb DNA 마커
레인 1: B. subtilis 유래의 PNBE 유전자를 PNBE F primer와 PNBE R primer를 이용하여 PCR을 통항 증폭한 후, BamH I/Not I 제한 효소를 이용하여 자른 DNA를 agarose gel 전기영동 후 확인한 결과.
레인 2: pGEX4T-1 발현 벡터를 BamH I/Not I 제한 효소를 이용하여 자른 DNA를 agarose gel 전기영동 후 확인한 결과.
레인 3: B. subtilis 유래의 PNBE 유전자를 pGEX4T-1 발현 벡터에 클로닝 한 후, BamH I/Not I 제한 효소로 잘라 클로닝이 되었음을 확인한 결과.
도 13은 GST 단백질 결합 앱타머와 Dig 결합 앱타머만을 이용한 Aptamer blotting 기법을 이용하여 GST 융합 단백질을 직접 탐지할 수 있는지를 확인한 결과이다. (a)는 GST 단백질을 발현하는 벡터, pGEX4T-1를 대장균에 형질도입한 후, 이들로부터 생산되는 pGEX4T과 pGEX4T-1 발현 벡터에 클로닝된 B. subtilis 유래의 PNBE 유전자, 즉 GST 단백질과 융합된 PNBE 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 결과이다.
레인 M: 단백질 분자량 마커
레인 1: pGEX4T-1 발현 벡터를 BL21(DE3) 균주에 형질도입 한 후의 단백질 상층액.
레인 2: pGEX 4T-1 발현 벡터를 BL21(DE3) 균주에 형질도입 한 후 Glutathione agarose를 이용하여 순수 분리 정제한 GST 단백질.
레인 3: B. subtilis 유래의 PNBE 유전자 서열을 포함한 pGEX4T-1 발현 벡터를 BL21(DE3) 균주에 형질도입 한 후의 단백질 상층액.
레인 4: B. subtilis 유래의 PNBE 유전자 서열을 포함한 pGEX4T-1 발현 벡터를 BL21(DE3) 균주에 형질도입 한 후 Glutathione agarose를 이용하여 순수 분리 정제한 GST 단백질과 융합된 PNBE 단백질.
도 13의 (b)는 GST 단백질 결합 DNA 앱타머와 HRP로 변형된 Dig 결합 DNA 앱타머를 이용한 BL21(DE3) 균주에 형질 도입된 pGEX4T-1 발현 벡터가 생산하는 전체 단백질 내의 GST 단백질, 정제 GST 단백질, BL21(DE3) 균주에 형질 도입된 B. subtilis 유래의 PNBE 유전자 재조합 서열을 포함한 pGEX4T-1 발현 벡터가 생산하는 전체 단백질 내의 GST 융합 PNBE 단백질, 정제 GST 융합 PNBE 단백질의 탐지 결과이다.
레인 M: 단백질 분자량 마커
레인 1: pGEX4T-1 발현 벡터를 BL21(DE3) 균주에 형질도입 한 후의 단백질 상층액.
레인 2: pGEX 4T-1 발현 벡터를 BL21(DE3) 균주에 형질도입 한 후 Glutathione agarose를 이용하여 순수 분리 정제한 GST 단백질.
레인 3: B. subtilis 유래의 PNBE 유전자 서열을 포함한 pGEX4T-1 발현 벡터를 BL21(DE3) 균주에 형질도입 한 후의 단백질 상층액.
레인 4: B. subtilis 유래의 PNBE 유전자 서열을 포함한 pGEX4T-1 발현 벡터를 BL21(DE3) 균주에 형질도입 한 후 Glutathione agarose를 이용하여 순수 분리 정제한 GST 단백질과 융합된 PNBE 단백질.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: DNA 앱타머 제작 과정

1.1 PCR 기법을 활용한 랜덤(random) DNA 라이브러리(library) 증폭(amplification)

GST 단백질에 특이적으로 결합(binding)하는 ssDNA(single strand DNA)를 제작(construction)하기 위하여 40개의 랜덤 서열(random sequence)을 dA : dG : dC : dT = 1.5 : 1.15 : 1.25 : 1 비율(rate)로 포함하고 있는 100bp의 주형 DNA (5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-N40-AGAT TGCACTTACTATCT-3'; 서열번호 28)와 이를 증폭(amplification)할 수 있는 프라이머(primer) 한 쌍을 bioneer(Korea)에 주문 제작하였다 (정방향 프라이머(forward primer): 5'-GGTAATACGACTCAC TATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-3'(서열번호 29), 바이오티닐화된(biotinylated) 역방향 프라이머(reverse primer): 5'-비오틴-AGATTGCACTTACTATCT-3'(서열번호 30)). 임의의 DNA 라이브러리(library)는 PCR(Biorad, USA)을 이용하여 증폭(amplification)하였다. PCR에 의한 100 bp DNA 라이브러리(library)의 증폭(amplification)을 위한 반응(reaction) 조성 (reagent mixture)은 주형 DNA 5~10㎕, 10X PCR 완충용액 10㎕, 각 2.5mM dNTP 혼합물 8㎕, 25uM 정방향 프라이머(forward primer) 1㎕, 25uM 바이오티닐화된 역방향 프라이머biotinylated reverse primer) 1㎕, 5M 베타인 (betain) 20㎕, Ex Taq 중합효소(polymerase)(Takara, Japan) 1㎕ (1unit/㎕)와 49~54㎕의 물로 이루어져 있다. PCR 반응 조건(reaction condition)은 우선 94℃에서 5분간 변성(denaturation) 시키고, 94℃에서 30초, 52℃에서 1분, 그리고 72℃에서 1분간 반응을 4주기(cycle) 반복한 후, 72℃에서 5분간 연장(extension)시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 2㎕를 취하여, 2% 아가로스 겔(agarose gel)을 이용하여 정확한 크기의 밴드(band)가 나타나는지 확인(detected)하였다. 나머지 DNA는 PCR (purification kit) 정제 키트 (purification kit)(Qiagen, USA)을 이용하여 DNA만을 회수(elution or purification)하였으며, 2% 아가로스 겔을 이용하여 회수한 DNA를 확인하였다 (도 3, 레인 1 참고).

1.2 비대칭(asymmetric) PCR 기법을 활용한 ssDNA 증폭(amplification)

PCR 기법을 이용하여 증폭(amplification)한 dsDNA 중 ssDNA만을 증폭하기 위하여 비대칭(asymmetric) PCR를 수행하였다. 비대칭(asymmetric) PCR 반응 조성은 1.1을 통하여 획득한 주형(template) DNA 50㎕, 10X PCR 완충용액(reaction buffer) 10㎕, 10mM dNTPs mixture 8㎕, 25uM 정방향 프라이머(forward primer) 2㎕, Ex Taq polymerase(중합효소) (Takara, Japan) 1㎕ (1unit/㎕)와 29㎕의 물로 이루어져 있다. 비대칭(asymmetric) PCR 반응 조건(reaction condition)은 우선 94℃에서 5분간 변성(denaturantion)시키고, 94℃에서 30초, 52℃에서 1분, 그리고 72℃에서 1분간 반응을 15주기 (cycles) 반복한 후, 72℃에서 5분간 연장(extension)시키는 반응(reaction)을 이용하였다. PCR 반응(reaction) 후 2㎕를 취하여, 2% 아가로스 겔 (agarose gel)을 이용하여 정확한 크기의 밴드가 나타나는지 확인하였으며, 나머지 DNA에는 1/10 부피 (volume)의 3M NaOAc (pH4.5)와 2~3 부피(volume)의 100% 에탄올(ethanol)을 첨가하여 -70℃에서 1시간 반응 후, 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리(centrifuge)하여 DNA만을 회수(elution)한다. 회수된 DNA는 공기 중에서 말린 후, 100㎕의 증류수에 녹인 후, 2% 아가로스 겔을 이용하여 비대칭 PCR을 이용하여 확보한 DNA를 확인하였다 (도 3, 레인 2 참고).

1.3 ssDNA의 선별 및 회수

비대칭 PCR을 이용하여 증폭한 PCR 산물 중 비오틴이 붙어 있는 dsDNA 및 ssDNA를 제거하고 순수한 정방향의 ssDNA만을 확보하기 위하여, 100㎕에 스트렙트아비딘(Pierce, USA) 50㎕를 첨가 후, 4℃에서 2시간 동안 반응시킨다. 반응이 끝난 후, 반응액은 4℃, 13,000 rpm의 원심분리기를 이용하여 10분간 원심분리한 후, 상층액만을 회수하여 1/10 부피의 3M NaOAc (pH4.5)와 2~3 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 1시간 동안 방치한다. 반응 후에는 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 ssDNA만을 회수한다. 회수된 DNA는 공기 중에서 말린 후, 100㎕의 증류수에 녹인다. 회수된 ssDNA 중 2㎕를 취하여 2% 아가로스 겔을 이용하여 정확한 크기의 밴드가 나타나는지 확인하였다 (도 3, 레인 3 참고). 나머지 DNA 중 2㎕를 취하여 S1 nuclease를 처리하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 2% 아가로스 겔을 이용하여 회수한 ssDNA가 완벽하게 제거됨을 확인하였다.

실시예 2: SELEX 기법을 이용한 GST 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별

2.1 SELEX에 이용될 ssDNA 앱타머 제작

GST 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위하여 기 제작 확보한 ssDNA 95㎕에 증류수 55㎕을 첨가하고, 2X PBS 용액 150㎕을 첨가한 후 95℃에서 5분간 끓여 변성(Denaturation) 시켰다가 상온에서 서서히 식혀 ssDNA 앱타머의 안정한 3차원 구조를 형성시켰다.

2.2 GST 단백질에 결합하는 DNA 앱타머 선별을 위한 GST 단백질 결합 컬럼 제작 및 SELEX 방법을 이용한 ssDNA 앱타머의 선별

GST 결합 컬럼(Affinity column)을 제작하기 위하여 먼저 pGEX 4T-1 벡터가 BL21(DE3) 균주에 형질전환 된 형질전환체를 LB 배지(0.5% 효모 추출물, 1% 박토펩톤, 0.5% NaCl)에 종균 배양하였다. 접종 후, 37℃, 200 rpm 조건에서 12 시간 이상 배양 후, 종균 무세포 배양액의 일부를 2차 배양 배지(LB 배지 + 100 mg/L 앰피실린)에 접종(1%)한 다음 37℃에서 200 rpm으로 배양하였다. 배양 중 OD₆₀₀ 값이 0.6 - 0.7에 이르렀을 때에 IPTG (isopropylthio-β-D-galactoside)를 1 mM의 농도로 첨가하고 동일한 조건에서 4시간 더 배양하는 방법으로 GST 단백질의 과발현을 유도하였다. GST 단백질 과발현을 수행한 세포 배양액을 10분간 13,000 rpm의 조건으로 원심분리를 수행하여 균체만 따로 분리하고, 상기 원심분리를 통하여 수득한 균체는 10 mM Tris-HCl을 이용하여 재현탁한 후, 초음분쇄기를 이용하여 균체를 파괴하였다. 또한, 상기 배양액은 13,000 rpm의 조건으로 10분간 원심분리를 수행하여 활성형 단백질과 비활성형 단백질로 분리하였다.

활성형 단백질은 1X PBS 버퍼로 활성화되어 있는 glutathione agarose resin과 4도에서 1 시간 동안 반응시키고, 레진과 결합하지 않는 단백질들을 제거하기 위하여 레진 부피의 5배 양의 1X PBS 버퍼를 이용하여 레진을 씻어주었다. 이렇게 GST 단백질이 glutathione agarose resin에 고정된 GST 결합 컬럼(Affinity column)을 제작하고, 제작된 GST 결합 컬럼에 상기 준비한 ssDNA 앱타머를 4도시에서 1시간 동안 반응시켰다. GST 결합 컬럼과 ssDNA 앱타머 반응 후, GST 단백질과 결합하지 못한 ssDNA 앱타머 제거를 위하여 레진 부피의 5배 양의 1X PBS 버퍼를 이용하여 레진을 씻어주었다.

2.3 Negative SELEX을 통한 비특이적 ssDNA 앱타머 제거

GST 단백질이 아닌 glutathione agarose resin에 비특이적으로 흡착하는 ssDNA 앱타머를 제거하기 위하여 SELEX 7회와 8회 사이에는 GST 단백질을 고정되어 있지 않은 pre 컬럼을 제작하여 negative SELEX을 진행하였다. 1X PBS 버퍼를 이용하여 레진 평형 및 활성화된 glutathione agarose resin으로 충전시킨 pre 컬럼에 상온에서 식힌 ssDNA 앱타머를 1시간 동안 반응시킨 후 컬럼에 결합하지 않고 나온 ssDNA 앱타머 용액을 8회 SELEX에 이용하였다. 이후, SELEX는 10회까지 진행하였으며, SELEX의 결합 조건은 횟수가 증가할수록 ssDNA 앱타머 양과 반응 시간을 줄였으며, 횟수가 거듭될수록 반응 조건을 거칠게 하여 목표 물질인 GST에 특이적으로 결합하는 앱타머를 얻고자 하였다.

실시예 3: 실시간(Real time) PCR 방법 및 전기영동 기법을 이용한 각 라운드의 앱타머와 GST 단백질과의 친화성 테스트

SELEX를 10회까지 마친 후 SELEX의 계속적인 진행 여부 및 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 실시간 PCR을 수행하였다. 먼저 초기 ssDNA 라이브러리와 8 라운드, 9 라운드, 10 라운드에서 용리된 각각의 ssDNA 앱타머를 PCR을 통하여 증폭하고, 비대칭 PCR기법을 이용하여 ssDNA 앱타머를 확보하였다. 만들어진 ssDNA 앱타머 농도는 1㎍로 고정한 후 GST 결합 컬럼과 1시간 동안 반응시킨 후, 결합 앱타머를 회수한 후 각각을 10^-1, 10^-2, 10^-3로 희석 구분하여 실시간 PCR을 진행하였다. 실시간 PCR은 Biorad사의 iQ SYBR Green Supermix (Bio-rad, USA)를 이용하였으며, 실시간 PCR 반응 조건은 우선 94℃에서 5분간 변성시키고, 94℃에서 20초, 52℃에서 20초, 그리고 72℃에서 20초간 반응을 40주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 연장시키는 반응 조건으로 반응을 진행하였다. 실시간 PCR 결과, 8, 9, 10 라운드의 10^-3로 희석된 ssDNA를 실시간 PCR의 주형 DNA로 이용한 실시간 PCR 결과의 효율이 각각 83.90%, 80.06%, 74.39%로 나타났으며, 8 라운드의 앱타머가 GST 단백질과의 결합 효율이 가장 높았으며, 9 라운드, 10 라운드에서 획득된 DNA를 주형 DNA로 이용하였을 때, 점차적으로 효율이 떨어지는 것을 확인함으로써 더 이상의 SELEX 진행이 무의미함을 없음을 알 수 있었다. 뿐만 아니라, 실시간　PCR 결과를 토대로 8 라운드에서 획득한 ssDNA 앱타머가 GST 단백질과의 결합 효율이 가장 높다는 것을 확인할 수 있었다. 표 1은 GST 결합 컬럼을 이용하여 총 10 라운드의 SELEX를 진행하여 획득한 ssDNA 앱타머 중, 초기 ssDNA 라이브러리와 8 라운드, 9 라운드, 10 라운드에서 용리된 ssDNA에 대해 각 라운드의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 실시간 PCR을 수행한 결과를 나타낸 표이다.

	0R (1X10^-3)	8R (1X10^-3)	9R (1X10^-3)	10R (1X10^-3)
Efficiency(%)	90.38	83.90	80.06	74.39
C(t)	15.78	16.97	16.49	13.33

실시예 4: GST 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군의 클로닝

실시간 PCR을 통하여 GST 단백질과 결합 효율이 가장 높은 것으로 판단된 8 라운드의 ssDNA 앱타머에 대해 정방향 프라이머: 5'-GGTAATACGACTCAC TATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-3'(서열번호 29)와 역방향 프라이머: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3'(서열번호 30)를 이용한 PCR 수행으로 dsDNA를 획득하였다. 이렇게 획득한 dsDNA는 RBC의 T&A 클로닝 키트를 이용하여 TA 클로닝을 수행하였다. TA 클로닝은 T-벡터 (25ng/㎕) 2㎕와 PCR 산물 (20ng/㎕) 5㎕, 리가아제(3unit) 1㎕, 10X 라이게이션 버퍼 A 1㎕, 10X 라이게이션 버퍼 B 1㎕을 섞어서 4℃에서 16시간 동안 반응시키는 조건을 이용하였다. TA 클로닝한 ligate 10㎕는 200㎕의 DH5α와 섞은 후 42℃에서 1분 30초 동안 열충격(heat shock)을 주고 얼음에 놓아둔다. 여기에 800㎕의 LB broth 800㎕을 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 배양 후, 200㎕의 용액을 취하여 앰피실린(ampicillin, 50ng/ml), X-gal(50㎍/ml), IPTG (5㎍/ml)이 포함되어 있는 LB 배양 플레이트(LB plate)에 스프레딩하고 37℃에서 15시간 동안 배양시킨 후 흰색 콜로니만을 선별하여 솔젠트(solgent, Korea)에 의뢰하여 앱타머의 염기서열을 결정하였다. 표 2는 GST 결합 컬럼을 활용한 SELEX 과정 중 획득한 GST 결합 DNA 앱타머 후보군 15개에 대한 서열을 나타낸 것이다.

Clone	Selected sequences	Sequence size ( bp )	Identical sequences	Kd ( nM )
GST-1	GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT ACCGCTGCAATCGTGTGCCATACACAGATGATCCGCACA AGATAGTAAGTGCAATCT(서열번호1)	99	3	0.02 ± 0.01
GST-2	GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT CAGGGTTGGAGAGGTTTGGTGGTTATCATAAGCGGTACAC AGATAGTAAGTGCAATCT(서열번호2)	100	2	0.01 ± 0.01
GST-3	GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT TAGGTTTGGGTAGGTTGGAATGGTGAATAATATGGGACGG AGATAGTAAGTGCAATCT(서열번호3)	100	6	0.02 ± 0.02
GST-4	GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT CGGACGTTGCACTGGAAAAGGAGGTTTGGTTCGGTTGGTC AGATAGTAAGTGCAATCT(서열번호4)	100	2	0.12 ± 0.15
GST-5	GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT AGACAGCATAGCACTGTAACGATTGGTTTGGTGTGGTTGG AGATAGTAAGTGCAATCT(서열번호5)	100	8	2.28 ± 1.25
GST-6	GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT AGATATCAGGAGCGGGGTTTGGGGTGGTTGGCGGTGGACG AGATAGTAAGTGCAATCT(서열번호6)	100	2	95.110? 15.35
GST-7	GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT GCTCTAAGTATACCGGTAGGGTTGGCTGCGGTTTGGCTCG AGATAGTAAGTGCAATCT(서열번호7)	100	3	0.01 ± 0.01
GST-8	GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT ACTATCGGATTTCTGGGTTTGGATCGGTTGGCAGCGAGTG AGATAGTAAGTGCAATCT(서열번호8)	100	2	0.34 ± 0.12
GST-9	GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT GCTCTAAGTATTCCGGTAGGGTTGGCTGCGGTTTGGCTCA AGATAGTAAGTGCAATCT(서열번호9)	100	2	8.37 ± 1.25
GST-10	GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATTGGGCATGTGGACTTGCGATTTCGGTTTGGTGTGGTTGGGGAGATAGTAAGTGCAATCT(서열번호10)	100	2	84.14 ± 9.22
GST-11	GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATTCAGCGCTCCCCACGGGGACATTGTCTCAGTTCTACGGCCCAGATAGTAAGTGCAATCT(서열번호11)	100	3	0.15 ± 0.14
GST-12	GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATTAGATAGCGTAGCACTGTAACGATTGGTTTGGTGTGGTTGGAGATAGTAAGTGCAATCT(서열번호12)	100	2	598.32 ± 3.47
GST-13	GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATTCCACGTTTCCACGTATCCTCGGAGCTTGCTTAACCGTACGAGATAGTAAGTGCAATCT(서열번호13)	100	2	69.37 ± 6.19
GST-14	GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATTCGCGCGGCACTTAATGCTGCTGCATCAACCCCCCTGGGCGAGATAGTAAGTGCAATCT(서열번호14)	100	4	3.51 ± 1.27
GST-15	GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATTAGATAGCATAGCACTGTAACGATTGGTTTGGTTTGTTACGAGATAGTAAGTGCAATCT (서열번호15)	100	3	61.42 ± 4.32

실시예 5: SPR 을 이용한 GST 단백질과 결합하는 DNA 　 앱타머 후보군의 친화도 테스트

5.1 GST 단백질과 결합하는 DNA 앱타머 후보군의 각 친화도 테스트를 위한 GST 단백질 코팅 센서 칩 CM5 제작 실험

GST 단백질과 실시예 4에서 획득한 GST 결합 DNA 앱타머 후보군과의 친화도를 정량하기 위하여, 본 발명자들은 SPR 검출 시스템 기기인 BIAcore 2000(BIACORE)을 이용하여 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 실험을 실시하였다.

GST 단백질과 15개의 GST 결합 DNA 앱타머 후보군과의 친화도를 확인하기 위하여, 표면이 카르복실기로 코팅된 센서 칩 CM5 (GE Healthcare)을 이용하였다. 센서 칩 CM5는 0.1M N-hydroxysuccinimide(NHS)와 0.4M N-ethyl-N'-(dimethyl aminopropyl)carbodiimide(EDC) 혼합액을 5 ㎕/min의 속도로 10분 동안 칩에 흘려 활성화시켜 카르복실기를 반응성이 더 좋은 N-hydroxysuccinimide ester로 전환하였으며, NHS-ester로 활성화된 센서 칩 CM5의 표면에 GST 단백질로 코팅하기 위하여 10 mM NaOAc (pH4.0)에 녹아있는 0.5 ㎍/㎕ 농도의 GST 단백질을 35 ㎕/min의 속도로 7분 동안 처리하여 칩 표면에 GST 단백질을 고정하였다. GST 단백질이 고정되어 있는 센서 칩은 1 M 에탄올아민 하이드로클로라이드(pH 8.5)로 불활성화시켜 다른 시약 및 ssDNA 앱타머가 칩에 직접 붙는 것을 방지하였으며, 각 실험 후 센서 칩은 10 mM EGTA로 재생시켰다. 속도 변수는 BIA 평가프로그램 (BIACORE)으로 수득하였다.

5.2 GST 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군의 친화력 측정

GST 단백질에 가장 좋은 친화력을 가지는 앱타머를 선별하기 위하여 각 후보군의 ssDNA 앱타머를 HBS2P 버퍼(GE Healthcare)에 녹여 다양한 농도 (300nM, 200nM, 100nM, 50nM, 10nM)의 기 제작 확보한 GST 단백질 결합 DNA 앱타머군을 GST 단백질을 붙이지 않은 센서 칩 (채널 1)과 GST 단백질이 고정된 (채널 2) 센서 칩에 순차적으로 주입함으로써, 본 발명자들은 GST 단백질 결합 DNA　앱타머 후보군과 GST 단백질 간의 해리상수 (Kd, dissociation), 즉 친화도를 수득할 수 있었다 (표 2). Biacore를 활용한 GST 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군과 GST 단백질간의 친화도 정량 결과 GST-2에 해당하는 GST 결합 DNA 앱타머 후보의 해리상수가 0.002 ± 0.003 nM로 GST 단백질과 결합력이 가장 좋은 앱타머임을 확인할 수 있었다. 이와 같은 SPR 분석 결과는 작은 크기의 단백질과 결합하는 DNA 앱타머의 해리상수로는 매우 높은 값이다. 상기 SPR 분석을 통하여 획득한 GST 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군의 구조는 Rensselear polytechnic institute에서 제공하는 DNA mfold 프로그램을 활용하여 이미지화 할 수 있었다 (도 4a 내지 도 4h).

실시예 6: Dot blotting 기법을 이용한 GST 단백질 결합 DNA 　 앱타머 후보와 GST 단백질과의 결합력 확인

GST 단백질 결합 DNA 앱타머와 GST 단백질간의 결합에 의하여 GST 단백질과 anti-GST 일차 항체간의 결합 억제를 확인하기 위하여 dot blotting을 실시하였다. 먼저 선별된 9개의 GST 단백질 결합 DNA 앱타머 (100 pmol)과 GST protein (10 pmol)을 4℃에서 12시간 동안 반응 시킨 후, methanol에 의하여 활성화된 PVDF membrane에 GST 단백질 결합 DNA 앱타머와 GST 단백질을 함께 반응 시킨 샘플을 고정한다. 이렇게 샘플이 고정된 membrane은 1X PBS (pH 7.2) buffer를 이용하여 2번에 걸쳐 washing한 후, 샘플이 고정된 membrane은 blocking buffer (5% nonfat dry milk, 1X PBS (pH 7.2), tween 20 (0.1% v/v)를 이용하여 비특이적인 단백질과의 반응을 차단하였다. 이후 blocking buffer에 1 : 1,000로 희석한 anti-GST 항체 (Sigma, USA) 용액과 4℃에서 1시간 동안 반응 시켰다. 1차 GST-항체와 반응을 마친 membrane은 시각화를 위하여 blocking buffer에 1:10,000로 희석한 anti-mouse IgG peroxidase conjugated (Sigma, USA) 항체 용액과 4℃에서 1시간 동안 반응 시킨다. 모든 반응과 반응 사이는 washing buffer (PBS (pH 7.2), 0.5% tween 20)를 이용하여 15 분 동안 washing을 실시한다. 이후 이를 시각화하기 위하여 enhanced luminol-based chemiluminescent (ECL) kit (GE Healthcare, Sweden)을 사용하였다. Dot blotting 결과 GST-2 앱타머만이 GST 단백질과 anti-GST 항체간의 결합을 100% 저해하는 것을 확인할 수 있었다 (도 5 참고).

실시예 7: GST 단백질 결합 DNA 앱타머 및 anti - GST 항체를 이용한 GST 단백질 탐지 민감도 비교 실험

HRP 변형 GST 단백질 결합 DNA 앱타머 및 HRP 변형 anti-GST 항체를 이용한 GST 단백질 탐지 민감도를 비교하기 위하여, 순수 분리 정제한 GST 단백질을 methanol로 활성화된 PVDF membrane에 다양한 농도 (1 ug-1 ng)로 spotting 하였다. 이때 2장의 membrane을 제작하여 하나의 membrane은 HRP로 변형된 anti-GST 항체를 이용한 WB(웨스턴 블랏) 기법을 활용하여 GST 단백질을 탐지하였으며, 다른 한 장은 HRP로 변형된 GST 단백질 결합 DNA 앱타머-2를 이용한 aptamer blotting기법을 이용하여 GST 단백질을 탐지하였다. 이를 위하여 먼저 단백질이 고정된 두 장의 membrane 모두 1X PBS (pH 7.2) buffer를 이용하여 2번에 걸쳐 washing한 후, 샘플이 고정된 membrane은 blocking buffer (5% nonfat dry milk, 1X PBS (pH 7.2), tween 20 (0.1% v/v)를 이용하여 비특이적인 단백질과의 반응을 차단하였다. WB의 경우 blocking buffer에 1 : 1,000로 희석한 HRP anti-GST 항체 용액과 4℃에서 1시간 동안 반응 시켰으며, aptamer blotting의 경우 blocking buffer에 1ug/ml로 HRP으로 변형된 GST-2 앱타머를 희석 용액과 4℃에서 1시간 동안 반응 시켰다. WB와 aptamer blotting 두 기법 모두 반응과 반응 사이는 washing buffer (PBS (pH 7.2), 0.5% tween 20)를 이용하여 15 분씩 3회 반복 washing을 실시하였다. 이후 이를 시각화하기 위하여 두 membrane 모두 enhanced chmiluminescence (ECL) kit (GE Healthcare, Sweden)을 사용하였다. 이를 통하여 GST 결합 앱타머를 기반으로 한 aptamer blotting 기법은 1 ug에서 50 ng 농도의 GST 정제 단백질을 탐지할 수 있음을 확인 할 수 있었으며 (도 6의 (a) 참고), anti-GST 항체를 기반으로 한 WB 방법으로는 1 ug에서 10 ng 농도의 GST 정제 단백질 까지 탐지할 수 있음을 확인 할 수 있었다 (도 6의 (b) 참고).

실시예 8: GST 단백질 결합 DNA 앱타머 및 anti - GST 항체를 이용한 GST 단백질 탐지능 비교 실험

GST 단백질 결합 DNA 앱타머 및 anti-GST 항체를 이용한 GST 단백질 탐지능을 비교 분석하기 위하여 먼저 GST 활성형 단백질과 정제된 GST 단백질을 확보하고자 하였다. 이를 위하여 pGEX4T-1 벡터 형질 전환체의 단일 클론을 확보하고, LB (0.5% 효모 추출물, 1% 박토-펩톤, 0.5% NaCl) 배지에 종균을 배양하였다. 이후 하루 종일 배양된 종균 배양액의 일부를 본 배양 배지 (LB 배지 + 100 mg/L 앰피실린)에 접종 (1%)한 다음 37℃에서 200 rpm으로 배양하여, GST 단백질 발현을 세포의 성장과 함께 유도하였다. 형질 전환체의 배양액의 OD₆₀₀값이 0.4 - 0.6에 이르렀을 때, GST 단백질의 과발현을 유도하기 위하여 1 mM의 IPTG를 첨가한 후, 37℃에서 200 rpm의 조건에서 3-4 시간 더 배양하였다. 이렇게 획득한 세포 배양액은 원심분리기를 이용하여 균체만을 따로 분리(13,000 rpm, 10분)하고, 10 mM Tris-HCl을 이용하여 재현탁한다. 획득된 균체는 초음분쇄기를 이용하여 파괴하였으며, 다시 한번 원심분리기 (13,000 rpm, 10분)를 이용해 활성형 단백질과 비 활성형 단백질로 분리하였다. GST 활성형 단백질만을 순수 분리 정제하기 위해서는 glutathione agarose을 이용하였다. 전체 pGEX 4T-1 세포 활성형 단백질과 GST 순수 분리 정제 단백질은 SDS-PAGE (12%) 분석을 통하여 확인하였다. SDS-PAGE 분석을 통하여 전체 pGEX 4T-1 세포 활성형 단백질 중 GST 단백질은 20%의 활성형 단백질로 존재하며, 약 26 kDa의 크기를 가짐을 확인할 수 있었다 (도 7a의 (a) 참고). 이렇게 획득된 자연 상태의 GST 정제 단백질과 GST 결합 DNA 앱타머와의 결합을 확인하기 위하여 EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) 수행하였다 (도 7a의 (b) 참고). 먼저 자연 상태의 GST 정제 단백질 38.46 pmol과 dig 변형 GST 결합 DNA 앱타머-2 30.8 pmol을 섞고 4℃에서 12시간 동안 반응 시킨 후, 5% pour acrylamide gel에 loading 한 후, Bio rad (USA)의 Mini Trans Blot Cell을 이용하여 methanol로 활성화된 PVDF membrane으로 옮겨졌다. 이렇게 획득한 membrane은 1X PBS (pH 7.2) buffer를 이용하여 2번에 걸쳐 washing한 후, 샘플이 고정된 membrane은 blocking buffer (5% nonfat dry milk, 1X PBS (pH 7.2), tween 20 (0.1% v/v)를 이용하여 비특이적인 단백질과의 반응을 차단하였다. 이후 blocking buffer에 1:5,000로 희석한 anti-Dig-Alkaline phosphatae conjugated (Roche, Germany) 용액과 4℃에서 1시간 동안 반응 시켰으며, 모두 반응과 반응 사이는 washing buffer (PBS (pH 7.2), 0.5% tween 20)를 이용하여 15 분씩 2회에 걸쳐 washing을 실시하였다. Dig 으로 변형된 GST 결합 DNA 앱타머-2와 자연 상태의 GST 정제 단백질과 결합한 dig으로 변형된 GST 결합 DNA 앱타머-2의 시각화에는 NBT/BCIP 시스템을 활용하였다. EMSA를 통하여 GST 결합 DNA 앱타머가 자연 상태의 GST 정제 단백질과 특이적으로 결합하는 것을 확인 할 수 있었다 (도 7a 의 (b) 참고).

이후, GST 단백질 결합 DNA 앱타머 및 anti-GST 항체를 이용한 GST 단백질 탐지능 비교를 위하여, 기 확보한 전체 pGEX 4T-1 세포 활성형 단백질과 GST 순수 분리 정제 단백질을 활용하였다. 전체 pGEX 4T-1 세포 활성형 단백질과 GST 순수 분리 정제 단백질은 SDS-PAGE (12%)를 통하여 확인하였으며, SDS-PAGE를 통하여 확인 된 단백질은 Bio rad (USA)의 Mini Trans Blot Cell을 이용하여 methanol로 활성화된 PVDF membrane으로 옮겼다. 이때 2장의 membrane을 제작하여 하나의 membrane은 HRP로 변형된 anti-GST 항체를 이용한 WB (Western blotting) 기법을 활용하여 GST 단백질을 탐지하였으며, 다른 한 장은 HRP로 변형된 GST 단백질 결합 DNA 앱타머-2를 이용한 aptamer blotting을 이용하여 GST 단백질을 탐지하였다.

이와 같은 실험을 위하여 먼저 전체 pGEX 4T-1 세포 활성형 단백질과 GST 순수 분리 정제 단백질이 고정된 두 장의 membrane을 확보하고 이들 membrane 모두를 1X PBS (pH 7.2) buffer를 이용하여 2번에 걸쳐 washing한 후, 샘플이 고정된 membrane은 blocking buffer (5% nonfat dry milk, 1X PBS (pH 7.2), tween 20 (0.1% v/v)를 이용하여 비특이적인 단백질과의 반응을 차단하였다. WB의 경우 blocking buffer에 1 : 1,000로 희석한 HRP로 변형된 anti-GST 항체 (Sigma, USA) 용액과 4℃에서 1시간 동안 반응 시켰으며, aptamer blotting의 경우 blocking buffer에 HRP로 변형된 1ug/ml 농도의 GST-2 앱타머 희석 용액과 4℃에서 1시간 동안 반응 시켰다. GST-항체 및 GST-2 앱타머와 반응을 마친 membrane은 시각화를 위하여 ECL kit (GE Healthcare, Sweden)을 사용하였다.

이를 통하여 anti-GST 항체를 기반으로 한 WB 방법 및 GST 결합 앱타머를 기반으로 한 AB(aptamer blotting) 방법을 활용하여 약 26 kDa에서 GST 단백질 signal을 확인 할 수 있었다 (도 7b의 (c), (d) 참고). 하지만 이 실험을 통하여 GST 탐지 시 동일한 실험 시간을 투자할 때, anti-GST 항체를 기반으로하는 WB보다 GST 결합 DNA 앱타머를 기반으로 하는 aptamer blotting 시스템 하에서 GST 단백질을 탐지할 때, 비특이적인 반응 없이 더욱 깨끗한 signal을 확인할 수 있었다 (도 7b의 (c), (d) 참고).

실시예 9: SELEX 기법을 이용한 digoxigenin ( Dig )과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별

9.1 SELEX 에 이용될 ssDNA 앱타머 제작

Dig과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위하여 기 제작 확보한 ssDNA 95㎕에 증류수 55㎕을 첨가하고, 2X PBS 용액 150㎕을 첨가한 후 95℃에서 5분간 끓여 변성(Denaturation) 시켰다가 상온에서 서서히 식혀 ssDNA 앱타머의 안정한 3차원 구조를 형성시켰다.

9.2 Dig 과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별을 위한 Dig 결합 컬럼 제작 및 Dig 과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별을 위한 SELEX 방법을 이용한 Dig 특이적 앱타머의 선별

Dig 결합 컬럼(Affinity column)을 제작하기 위하여 먼저 5′은 Biotin으로 변형되어 있으며, 3′쪽은 Dig으로 변형된 ATT TTT GGT TGG TTG CTT CG (서열번호 31) 서열을 Bioneer에서 주문 제작하였다. Dig 결합 컬럼 제작을 위하여 주문 제작 확보한 Biotin-Dig 변형 주형은 10 pmol/ul 농도 희석하여 사용하였다. Biotin-Dig 변형 주형 200 ul에 100 ul의 streptavidin bead를 첨가한 후, 4℃에서 1시간 동안 반응 시킨 후, PBS buffer와 원심분리기를 이용하여 streptavidin bead에 결합하지 않은 주형들은 제거하였다. 이렇게 제작된 Dig 결합 컬럼에 기 제작 확보한 ssDNA aptamer pool 100 ul을 첨가한 후, 4℃에서 1시간 동안 Dig과 ssDNA 앱타머가 결합할 수 있도록 반응을 진행하였다. 반응 종료 후 PBS buffer와 원심분리기를 이용하여 결합하지 못하고 남아있는 비특이적인 ssDNA 앱타머를 분리 제거하였다. 이후, Dig 결합 컬럼에 PBS 100 ul을 첨가한 후, 85℃에서 5분 동안 반응시킴으로써 Dig과 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머만을 분리 회수하였다. 회수된 Dig 결합 ssDNA 앱타머 용액에 PCI 100 ul를 첨가한 후 원심분리를 하여 상층액을 회수하였으며, 이후 회수용액은 1/10 부피의 3M NaOAc (pH4.5)과 2~3 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 1시간 동안 방치한다. 반응 후에는 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 Dig과 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머만을 회수하였다.

9.3 Negative SELEX 을 통한 비특이적 ssDNA 앱타머 제거

Dig이 아닌 streptavidin bead 또는 Biotin과 ATT TTT GGT TGG TTG CTT CG 주형 서열에 비특이적으로 흡착하는 ssDNA 앱타머를 제거하기 위하여 Dig과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별을 위한 SELEX 7회와 8회 사이에는 Biotin으로만 변형된 ATT TTT GGT TGG TTG CTT CG (서열번호 31) 주형 서열로 제작된 컬럼을 이용하여 negative SELEX 과정을 진행하였다. Streptavidin bead에 Biotin으로 변형된 ATT TTT GGT TGG TTG CTT CG (서열번호 31) 주형을 결합 시킨 후, 상온에서 식힌 ssDNA 앱타머를 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, negative 컬럼과 결합되지 않고 분리, 회수된 ssDNA 앱타머를 8회 SELEX에 활용하였다. 이후, SELEX는 10회까지 계속 진행되었으며, SELEX의 결합 조건은 횟수가 증가할수록 ssDNA 앱타머 양과 반응 시간을 줄였으며, 횟수가 거듭될수록 반응 조건을 거칠게 하여 목표 물질인 Dig과 더욱 특이적으로 결합하는 앱타머를 얻고자 하였다.

실시예 10: 실시간( Real time ) PCR 방법 및 전기영동 기법을 이용한 각 라운드에서 회수된 앱타머 pool과 Dig 과의 친화성 테스트

SELEX를 10회까지 마친 후 SELEX의 계속적인 진행 여부 및 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 실시간 PCR을 수행하였다. 먼저 초기 ssDNA 라이브러리와 8 라운드, 9 라운드, 10 라운드에서 용리된 각각의 ssDNA 앱타머를 PCR을 통하여 증폭하고, 비대칭 PCR을 토하여 ssDNA 앱타머를 확보하였다. 만들어진 ssDNA 앱타머 농도를 1㎍로 고정한 후 Dig 결합 컬럼과 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, Dig과 결합 후 용리 회수된 ssDNA 앱타머를 이용하여 실시간 PCR을 진행하였다. 실시간 PCR은 Biorad사의 iQ SYBR Green Supermix (Bio-rad, USA)를 이용하였으며, 실시간 PCR 반응 조건은 우선 94℃에서 5분간 변성시키고, 94℃에서 20초, 52℃에서 20초, 그리고 72℃에서 20초간 반응을 40주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 연장시키는 반응 조건으로 반응을 진행하였다. 초기 라운드, 8, 9, 10 라운드에서 용리 회수된 ssDNA를 주형으로 사용하여 실시간 PCR을 실시한 결과 각 라운드의 실시간 PCR 효율은 각각 84.08%, 65.92%, 82.15%, 62.88%로 나타났으며, 9 라운드의 앱타머가 Dig과의 결합 효율이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다. 8 라운드와 비교하였을 때, 9 라운드에서 회수된 ssDNA 앱타머 pool이 Dig과의 결합력이 더 높음을 확인 할 수 있었으며, 10 라운드에서 회수된 ssDNA 앱타머 pool은 9 라운드에서 회수된 ssDNA 앱타머 pool과 비교하였을 때, Dig과의 결합력이 떨어졌음을 확인 할 수 있었다. 이와 같은 결과 확인을 통하여 더 이상의 SELEX 과정이 무의미함을 알 수 있었다. 뿐만 아니라, 실시간　PCR 결과를 토대로 9 라운드에서 획득한 ssDNA 앱타머가 Dig과의 결합 효율이 가장 높다는 것을 확인할 수 있었다. 표 3은 Dig 결합 컬럼을 이용하여 총 10 라운드의 SELEX를 진행하여 획득한 ssDNA 앱타머 중, 초기 ssDNA 라이브러리와 8 라운드, 9 라운드, 10 라운드에서 용리된 ssDNA에 대해 각 라운드의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 실시간 PCR을 수행한 결과를 나타낸 표이다.

	0R(1X10^-3)	8R(1X10^-3)	9R(1X10^-3)	10R(1X10^-3)
Efficiency(%)	84.08	65.92	82.15	62.88
C(t)	4.95	6.06	3.01	5.07

실시예 11: Dig 과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군의 클로닝

실시간 PCR을 통하여 Dig과 결합 효율이 가장 높은 것으로 판단된 9 라운드의 ssDNA 앱타머에 대해 정방향 프라이머: 5'-GGTAATACGACTCAC TATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-3'(서열번호 29)와 역방향 프라이머: AGATTGCACTTACTATCT-3'(서열번호 30)를 이용한 PCR을 수행하였으며, 이를 통하여 T-vector 클로닝에 사용할 수 있는 dsDNA를 획득할 수 있었다. 획득된 dsDNA 산물은 RBC의 T&A 클로닝 키트를 이용하여 TA 클로닝을 수행하였으며, 실제 TA 클로닝은 T-벡터 (25ng/㎕) 2㎕와 PCR 산물 (20ng/㎕) 5㎕, 리가아제(3unit) 1㎕, 10X 라이게이션 버퍼 A 1㎕, 10X 라이게이션 버퍼 B 1㎕을 섞어서 4℃에서 16시간 동안 반응시키는 조건을 활용하였다. TA 클로닝한 ligate 10㎕는 열충격(heat shock) 방법을 이용하여 DH5α에 형질전환하였다. 형질전환체는 앰피실린(ampicillin, 50ng/ml), X-gal(50㎍/ml), IPTG (5㎍/ml)이 포함되어 있는 LB 배양 플레이트(LB plate)에 스프레딩한 후, 37℃에서 12시간이상 배양한 후 흰색 콜로니만을 선별하여 솔젠트(solgent, Korea)에 의뢰하여 앱타머의 염기서열을 결정하였다. 표 4는 Dig 결합 컬럼을 활용한 SELEX 과정 중 획득한 Dig 결합 DNA 앱타머 후보군 12개에 대한 DNA 서열을 나타낸 것이다. 상기 클로닝 및 시퀀싱을 통하여 획득된 Dig 결합 DNA 앱타머 후보군들의 구조는 Rensselear polytechnic institute에서 제공하는 DNA mfold 프로그램을 활용하여 이미지화 할 수 있었다 (도 8a 내지 도 8f).

Clone	Selected sequences	Sequence size ( bp )	Identical sequences	Kd ( uM )
Dig-1	AGATTGCACTTACTATCTCGGTTGCTCCTGGTAGGTTACGACACGCGGGGCTGGCGGAAATTGAATAAGCTGGTATCTCCCTATAGTGAGTCGTATTACC (서열번호16)	100	8	0.007 ± 0.001
Dig-2	AGATTGCACTTACTATCTACCGTAACAGATAAAAGATTCTGTGATTGACTGCTTCTGGAATTGAATAAGCTGGTATCTCCCTATAGTGAGTCGTATTACC (서열번호17)	100	2	0.742 ± 0.024
Dig-3	AGATTGCACTTACTATCTCGCCGGCTAGGAAACAATTGGTTGGTGTGTTCGGCCCCTTAATTGAATAAGCTGGTATCTCCCTATAGTGAGTCGTATTACC (서열번호18)	100	3	0.030 ± 0.001
Dig-4	AGATTGCACTTACTATCTCAGTGAAACTTTGGTTGGCCGCCTGTAGGGTCACTTTGTGAATTGAATAAGCTGGTATCTCCCTATAGTGAGTCGTATTACC (서열번호19)	100	1	9.513 ± 0.413
Dig-5	AGATTGCACTTACTATCTCCCCGCCAAGGTTTTTGCAGTTGGTCCCTCCGGTGATTCGAATTGAATAAGCTGGTATCTCCCTATAGTGAGTCGTATTACC (서열번호20)	100	2	2.492 ± 0.439
Dig-6	AGATTGCACTTACTATCTCGCATTCGACATAGCCGGTAGTAAAAGCATGGTCGCTTCAAATTGAATAAGCTGGTATCTCCCTATAGTGAGTCGTATTACC (서열번호21)	100	2	1.751 ± 0.112
Dig-7	AGATTGCACTTACTATCTCCAAAGTGGGATTTTTTAGTGGTTGCATCGCGAGACAGCTAATTGAATAAGCTGGTATCTCCCTATAGTGAGTCGTATTACC (서열번호22)	100	2	1.035 ± 0.457
Dig-8	AGATTGCACTTACTATCTCGAGGTAGCAGGTTGCTTGCGGCTAAAGCATTTTCATGCTAATTGAATAAGCTGGTATCTCCCTATAGTGAGTCGTATTACC (서열번호23)	100	2	1.442 ± 0.318
Dig-9	AGATTGCACTTACTATCTCACAAAGGAATGAACGATGCGATCTGGTAGCTTCTTTGGCAATTGAATAAGCTGGTATCTCCCTATAGTGAGTCGTATTACC (서열번호24)	100	3	0.011 ± 0.017
Dig-10	AGATTGCACTTACTATCTCGTGGAATGTTGTTGCTTCTGCTACGATACGTCAACCCTCAATTGAATAAGCTGGTATCTCCCTATAGTGAGTCGTATTACC (서열번호25)	100	1	1.775 ± 0.571
Dig-11	AGATTGCACTTACTATCTAGGTGTAGATACCCAGGCGTATGGTTGCGCTGTTTCGTGGAATTGAATAAGCTGGTATCTCCCTATAGTGAGTCGTATTACC (서열번호26)	100	2	4.001 ± 0.672
Dig-12	AGATTGCACTTACTATCTCAAGGTGTCGCACTTTTTGACGTTGGACTGCTTCGAACAGAATTGAATAAGCTGGTATCTCCCTATAGTGAGTCGTATTACC (서열번호27)	100	2	2.184 ± 0.753

실시예 12: SPR 을 이용한 Dig 과 결합하는 DNA 　 앱타머 후보군의 친화도 테스트

12.1 Dig 과 결합하는 각 DNA 앱타머 후보군들의 친화도 테스트를 위한 Dig 코팅 SA 센서 칩 제작 실험

Dig과 실시예 11에서 획득한 Dig 결합 DNA 앱타머 후보군과의 친화도를 정량적으로 측정하기 위하여, 본 발명자들은 SPR 검출 시스템 기기인 BIAcore 2000(BIACORE)을 이용하여 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 실험을 실시하였다.

Dig과 Dig 결합 DNA 앱타머 후보군과의 친화도를 확인하기 위하여, 표면이 Streptavidin으로 코팅된 SA 센서 칩(GE Healthcare)을 이용하였다. SA 센서 칩은 사용하기 전 1M MaCl과 50mM NaOH 혼합액을 50 ㎕/min의 속도로 2분 동안 칩에 흘려주는 작업을 세 번 반복함으로서 unconjugated streptavidin을 제거하였다. 이후 10 pmol/ul 농도 희석된 5′은 Biotin으로 변형되어 있으며, 3′쪽은 Dig으로 변형된 ATT TTT GGT TGG TTG CTT CG (서열번호 31) 주형을 5 ㎕/min의 속도로 5분 동안 처리하여 칩 표면에 Biotin으로 변형된 Dig 주형을 고정시킨다. 이후, Biotin으로 변형되지 않은 고정되지 못한 주형들을 제거하기 위하여 10 mM NaOH를 5 ㎕/min의 속도로 30분 동안 처리하였다. 각 실험 후 센서 칩은 10 mM EGTA로 재생시켰으며, 속도 변수는 BIA 평가프로그램 (BIACORE)으로 수득하였다.

12.2 Dig 결합 DNA 앱타머 후보군의 친화력 측정

Dig과 가장 높은 친화력을 가지는 앱타머를 선별하기 위하여 각 Dig 결합 DNA 앱타머 후보군을 HBS2P 버퍼(GE Healthcare)에 희석하여 다양한 농도(3uM, 2uM, 1uM)로 준비하였다. 확보된 Dig 결합 DNA 앱타머는 Dig이 결합되지 않은 SA 센서 칩(채널 1)과 Dig을 고정시킨 SA 칩(채널 2)에 순차적으로 주입함으로써, 본 발명자들은 Dig 결합 DNA　앱타머 후보군과 Dig 간의 해리상수 (Kd, dissociation), 즉 친화도를 수득할 수 있었다 (표 4). Biacore를 활용한 Dig 결합 DNA 앱타머 후보군과 Dig간의 친화도를 정량적으로 분석한 결과 Dig-1에 해당하는 Dig 결합 DNA 앱타머 후보의 해리상수가 7 ± 0.003 nM로 Dig과의 결합력이 가장 높은 것을 확인 할 수 있었다. 이와 같은 SPR 분석 결과는 작은 크기의 Dig과 같은 화학물질과 결합하는 DNA 앱타머의 해리상수로는 매우 높은 값이다. 상기 SPR 분석을 통하여 획득한 Dig 결합 DNA 앱타머 후보군의 구조는 Rensselear polytechnic institute에서 제공하는 DNA mfold 프로그램을 활용하여 이미지화 및 구조를 만드는데 필요한 에너지 값을 확인 할 수 있었다 (도 8a 내지 도 8f).

실시예 13: Dot blotting 기법을 이용한 Dig 결합 DNA 　 앱타머 후보군의 탐지능 확인

Dig 결합 DNA 앱타머의 Dig을 탐지할 수 있는 탐지능을 확인하기 위하여 다양한 농도로 dot blotting을 실시하였다. 이를 위하여 먼저 5′은 Biotin으로 변형되어 있으며, 3′쪽은 Dig으로 변형된 ATT TTT GGT TGG TTG CTT CG (서열번호 31) 주형을 methanol에 의하여 활성화된 PVDF membrane에 100pmol, 80pmol, 60pmol, 40pmol, 20pmol, 10pmol, 5pmol, 1pmol의 농도로 희석하여 샘플을 spotting 하였다. 이렇게 샘플이 고정된 membrane은 1X PBS (pH 7.2) buffer를 이용하여 2번에 걸쳐 washing한 후, 샘플이 고정된 membrane은 blocking buffer (5% nonfat dry milk, 1X PBS (pH 7.2), tween 20 (0.1% v/v)를 이용하여 비특이적인 단백질과의 반응을 차단하였다. 이후 blocking buffer에 1μg/ml의 농도로 희석한 Dig 결합 Dig-1 앱타머 용액과 4℃에서 1시간 동안 반응 시켰다. Dig 결합 Dig-1 앱타머와 반응을 마친 membrane은 시각화를 위하여 blocking buffer에 1:5,000로 희석한 anti-mouse digoxigenin HPR conjugated (Abcam, UK) 항체 용액과 4℃에서 1시간 동안 반응 시킨다. 모든 반응과 반응 사이는 washing buffer (PBS (pH 7.2), 0.5% tween 20)를 이용하여 15 분 동안 washing을 실시한다. 이후 이를 시각화하기 위하여 enhanced chmiluminescence (ECL) kit (GE Healthcare, Sweden)을 사용하였으며, Dot blotting 결과 Dig-1 앱타머는 농도별루 희석된 Dig을 5 pmol까지 탐지할 수 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 9 참고).

실시예 14: Dig 결합 Dig -1 앱타머의 HRP 변형 실험

Dig 결합 Dig-1 앱타머의 HRP 변형을 위하여 본 발명자들은 Dig 결합 Dig-1 앱타머를 아민기로 변형하고자 하였다. 이를 위하여 Dig-1 앱타머에 대해 아민으로 변형된 정방향 프라이머: 5'-GGTAATACGACTCAC TATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-3'(서열번호 29)와 Biotin으로 변형된 역방향 프라이머: AGATTGCACTTACTATCT-3'(서열번호 30)를 이용하여 PCR 및 비대칭 PCR을 수행하였다. Dig 결합 Dig-1 앱타머의 HRP 변형은 Alpha diagnostic (USA)에서 판매하고 있는 Horseradish peroxidase (HRP) conjugation kit (Micro)를 이용하여 진행하였다. 아민으로 변형된 Dig-1 앱타머는 1X conjugation buffer (0.1M NaHCO₃, pH 9.5)를 이용하여 앱타머를 HRP로 변형하기 위한 환경을 조성하였으며, 이후 preactivate된 HRP solution을 첨가한 후 4℃에서 12시간 이상 반응하였다. 이후 반응이 끝난 샘플에는 blocking buffer를 샘플 1ml당 200 ul를 참가한 후, 실온에서 1시간 이상 반응 시켜, HRP 변형 과정을 마무리 하였다. 이후 4도에서 PBS로 투석하고, stabilizing buffer를 샘플 500 ul 당 1ml를 첨가하여 샘플 안정성을 확보하였다.

실시예 15: HRP 로 변형된 Dig 결합 DNA 앱타머를 이용한 Dig 변형 DNA 앱타머의 Dig 탐지능 확인 실험

HRP로 변형된 Dig 결합 Dig-1 앱타머의 Dig 탐지 탐지능을 확인하기 위하여 다양한 농도로 dot blotting을 실시하였다. 이를 위하여 5′은 Biotin으로 변형되어 있으며, 3′쪽은 Dig으로 변형된 ATT TTT GGT TGG TTG CTT CG 주형을 methanol에 의하여 활성화된 PVDF membrane에 100pmol, 80pmol, 60pmol, 40pmol, 20pmol, 10pmol, 5pmol, 1pmol의 농도로 희석하여 샘플을 고정하였으며, 이렇게 샘플이 고정된 membrane은 1X PBS (pH 7.2) buffer를 이용하여 2번에 걸쳐 washing한 후, 샘플이 고정된 membrane은 blocking buffer (5% nonfat dry milk, 1X PBS (pH 7.2), tween 20 (0.1% v/v)를 이용하여 비특이적인 샘플과의 반응을 차단하였다. 이후 blocking buffer에 1μg/ml의 농도로 희석한 HRP로 변형된 Dig 결합 Dig-1 앱타머 용액과 4℃에서 1시간 동안 반응 시킨 후, washing buffer (PBS (pH 7.2), 0.5% tween 20)를 이용하여 15 분 동안 washing하는 단계를 3번 반복한 후, enhanced chmiluminescence (ECL) kit (GE Healthcare, Sweden)을 사용하여, 시그널을 시각화하였다. HRP로 변형된 Dig 결합 Dig-1 앱타머의 Dig 탐지능을 확인한 결과 Dig-1 앱타머는 HRP 변형 이전과 마찬가지로 5 pmol까지 희석된 Dig을 탐지할 수 있는 것으로 확인할 수 있었다 (도 10 참고).

실시예 16: HRP 로 변형된 Dig 결합 DNA 앱타머의 2차 항체로의 활용 가능성 확인 실험 및 기존 단백질 형태의 2차 항체와의 비교 실험

HRP로 변형된 Dig 결합 DNA 앱타머의 2차 항체로의 활용 가능성을 확인하기 위하여 GST와 특이적으로 결합하는 GST 결합하는 GST-2 앱타머와 Dig 결합 Dig-1 앱타머를 순차적으로 활용하였다. 뿐만 아니라, 이와 같은 과정이 기존에 GST 단백질을 탐지하기 위하여 활용되었던 1차 GST-항체 및 2차 항체를 활용 탐지와 어떻게 차이를 보이는지 확인하였다. 기 확보된 GST 활성형 단백질과 정제된 GST 단백질은 SDS-PAGE (12%)에 3개의 경우로 나뉘어 loading 한 후, Bio rad (USA)의 Mini Trans Blot Cell을 이용하여 methanol로 활성화된 PVDF membrane으로 옮겼다. 2장의 membrane 중 하나의 membrane은 anti-GST 항체 (1차 항체)와 anti-mouse IgG peroxidase conjugated 항체 (2차 항체)를 이용한 기존 WB (Western blotting) 기법을 활용하여 GST 단백질을 탐지하였으며, 다른 한 장은 앱타머와 기존 항체 기법을 결합한 SWB (southwestern blotting) 기법을 이용하여 GST 단백질을 탐지하였다. 이는 dig으로 변형 된 GST 단백질 결합 GST-2 앱타머와 anti-Dig-Alkaline phosphatae conjugated (2차 항체)를 이용하여 탐지하였다. 마지막으로 Dig으로 변형된 GST 단백질 결합 GST-2 앱타머와 Dig 결합 Dig-1 앱타머를 이용한 새로운 형태의 AB (aptamer blotting)기법을 이용하여 GST 단백질을 탐지하였다. 이를 위하여 먼저 단백질이 완전히 고정된 세 장의 membrane을 1X PBS (pH 7.2) buffer를 이용하여 2번에 걸쳐 washing하였으며, 샘플이 고정된 membrane은 blocking buffer (5% nonfat dry milk, 1X PBS (pH 7.2), tween 20 (0.1% v/v)를 이용하여 비특이적인 단백질과의 반응을 차단하였다. 이후, WB의 경우 blocking buffer에 1 : 1,000로 희석한 anti-GST 항체 (Sigma, USA) 용액과 4℃에서 1시간 동안 반응 시켰으며, SWB과 aptamer blotting의 경우 blocking buffer에 1μg/ml로 dig으로 변형된 GST-2 앱타머를 희석 용액과 4℃에서 1시간 동안 반응 시켰다. 1차 GST-항체 및 GST-2 앱타머 반응을 마친 membrane들은 시각화를 위하여 WB의 경우 blocking buffer에 1:10,000로 희석한 anti-mouse IgG peroxidase conjugated (Sigma, USA) 항체 용액과 4℃에서 1시간 동안 반응 시켰며, SWB의 경우 blocking buffer에 1:5,000로 희석한 anti-Dig-Alkaline phosphatae conjugated (Roche, Germany) 용액과 4℃에서 1시간 동안 반응 시켰다. Aptamer blotting의 경우 blocking buffer에 1μg/ml로 희석한 HRP 변형 Dig 결합 Dig-1 앱타머와 4℃에서 1시간 동안 반응 시켰다. WB, SWB, aptamer blotting 기법 모두 반응과 반응 사이는 washing buffer (PBS (pH 7.2), 0.5% tween 20)를 이용하여 15 분씩 3회 반복 washing을 실시하였으며, 이후 각 반응에 대한 시그널을 확인하기 위하여 WB과 aptamer blotting 기법은 enhanced chemiluminescence (ECL) kit (GE Healthcare, Sweden)을 사용하였으며, SWB은 NBT/BCIP과 ECL kit (GE Healthcare, Sweden)을 시스템을 활용하였다. 이와 같은 실험을 통하여 anti-GST 항체 및 2차 항체를 이용한 WB 기법, dig으로 변형된 GST 단백질 결합 앱타머와 Dig을 탐지할 수 있는 2차 항체를 이용하는 SWB 기법, GST 단백질 결합 DNA 앱타머 및 Dig과 특이적으로 결합하는 Dig 결합 DNA 앱타머를 이용한 aptamer blotting 기법을 활용하였을 때 모두 GST 활성형 단백질과 정제된 GST 단백질 샘플 모두에서 약 26 kDa에서 GST 단백질에 특이적인 signal을 확인할 수 있었다 (도 11 a, b, c 참고). 하지만 이 실험을 통하여 GST 탐지시 동일한 실험 시간을 투자할 때, anti-GST 항체를 기반으로 하는 WB보다 앱타머를 기반으로 하는 AB 시스템 하에서 표적하는 단백질을 더 깨끗한 signal을 확인 할 수 있었다 (도 11 a, c 참고). 뿐만 아니라, GST 탐지시 GST 앱타머 와 Dig 결합 2차 항체를 활용하는 기법인 SWB 기법의 이용이 가능함을 확인 할 수 있었으며, WB 기법 보다는 앱타머와 2차 항체를 동시에 이용하는 SWB 기법을 이용하였으때 보다 깨끗한 signal을 확인 할 수 있었다 (도 11a의 (a), (b) 참고). SWB 기법을 활용한 확인을 통하여 ECL을 이용한 탐지 뿐만 아니라, NBT/BCIP 탐지 기법을 이용하여 signal을 확보할 수 있음을 확인 할 수 있었다 (도 11a 및 도 11b 의 (a), (b), (c) 참고).

실시예 17: 재조합 PNBE 균주 제작

실제 GST 재조합 단백질 탐지에 있어서도 GST 단백질 결합 DNA 앱타머와 Dig 결합 DNA 앱타머를 이용할 수 있는지를 확인하기 위하여 바실러스 써브틸리스 (Bacillus subtilis) 유래의 지질분해효소인 PNBE 유전자를 pGEX4T-1 벡터에 클로닝 하였다. 이를 위하여 일차적으로 B. subtilis 유래의 지질분해효소 PNBE 유전자를 포함하는 DNA 프라이머 (primer) 한쌍을 주문 제작하였다 (Bioneer, Korea). (표 5 참고). 제한 효소 자리를 참가하여 제작한 프라이머 (primer)를 이용한 PCR 방법을 이용하여 B. subtilis 유래의 PNBE 유전자를 증폭하였다. 이때, PCR 조건은 변성 (Denaturation): 94℃, 60초, 아닐링 (annealing): 66℃, 60초, 신장 (extention): 72℃, 1분 30 초 동안 실시하고 이 과정을 30회 반복하였다. 증폭된 유전자와 벡터를 동일한 제한 효소 (pGEX 4T-1: BamH I/Not I)로 자른 후 (도 12 참고), 라이게이션하여 발현 벡터를 제조하고, 이를 BL21(DE3) (Studier, F.A., and Moffatt, B.A., 1986, 189, 113-130)에 전기천공방법 (electro phoration)을 이용하여 형질전환 시킨 후, 앰피실린 (amphicillin)에 저항성이 있는 콜로니를 선별하였다. 이렇게 선발된 pGEX4T-1 발현 벡터에 B. subtilis 유래의 PNBE 유전자이 클로닝된 재조합 균주는 plasmid mini-prep kit (Geneall, korea)를 이용하여 plasmid DNA를 추출하였으며, 획득한 재조합 plasmid DNA는 BamH I/Not I 제한 효소를 이용하여 재조합 plasmid를 잘라 약 1.5 kb의 PNBE 유전자가 클로닝 되어 있음을 확인하였으며 (도 12, 레인 3번 참고), 서열 분석을 통하여 정확한 B. subtilis 유래의 PNBE 유전자가 클로닝 되어 있음을 확인하였다.

Primer name	Sequence	Enzyme site
PNBE F	AGT GGA TCC ATG ACT CAT CAA ATA GTA A (서열번호 32)	BamH I
PNBE R	GAT GCG GCC GC T TCT CCT TTT GAA GGG AAT (서열번호 33)	Not I

실시예 18: GST 단백질 결합 DNA 앱타머 및 Dig 결합 앱타머를 GST 융합 PNBE 단백질 탐지 실험

GST 단백질 결합 DNA 앱타머 및 HRP 변형 Dig 결합 앱타머를 이용한 GST 융합 PNBE 단백질 탐지 확인 실험을 진행하기 위하여 먼저, PNBE 유전자를 pGEX4T-1 발현 백터에 클로닝하여 재조합 균주를 확보하였으며, IPTG를 이용한 재조합 단백질 유도 기법을 이용하여 재조합 균주의 전체 활성형 단백질을 확보할 수 있었다. 뿐만 아니라, glutathione agarose를 이용하여 순수 분리 정제한 GST 단백질 융합 PNBE 단백질을 확보할 수 있었다 (도 13의 (a), 레인 3, 4번 참고). GST 단백질 결합 앱타머와 HRP로 변형된 GST 단백질 결합 DNA 앱타머를 기반으로 GST 단백질 및 GST 융합 PNBE 단백질 탐지를 확인하기 위하여 aptamer blotting을 수행하였다. GST 단백질 및 GST 융합 PNBE 단백질 탐지능을 확인 실험을 위하여 전체 pGEX 4T-1 세포 활성형 단백질, GST 순수 분리 정제 단백질, GST 융합 PNBE 단백질, 순수 분지 정제된 GST 융합 PNBE 단백질을 활용하였다. 각 단백질은 SDS-PAGE (12%)를 통하여 확인하였으며, SDS-PAGE를 통하여 확인 된 단백질은 Bio rad (USA)의 Mini Trans Blot Cell을 이용하여 methanol로 활성화된 PVDF membrane으로 옮겼다. 단백질이 고정된 membrane은 1X PBS (pH 7.2) buffer를 이용하여 3번에 걸쳐 washing한 후, 샘플이 고정된 membrane은 blocking buffer (5% nonfat dry milk, 1X PBS (pH 7.2), tween 20 (0.1% v/v)을 이용하여 비특이적인 단백질과의 반응을 차단하였다. 이후 GST 단백질 및 GST 융합 PNBE 단백질을 탐지하기 위하여 dig으로 변형된 GST-2 앱타머를 1 ug/ml로 blocking buffer에 희석하여 4℃에서 1시간 동안 반응 시켰으며, 이를 시각화하기 위하여 2차로 HRP로 변형된 Dig 결합 DNA 앱타머 1 ug/ml를 blocking buffer에 희석하여 4℃에서 1시간 동안 반응 시켰다. 모두 반응과 반응 사이는 washing buffer (PBS (pH 7.2), 0.5% tween 20)를 이용하여 15 분씩 3회 반복 washing을 실시하였다. 이후 enhanced chemiluminescence (ECL) kit (GE Healthcare, Sweden)을 사용하여 시각화하였다. 앱타머를 기반으로 하는 aptamer blotting 기법을 이용하여 약 26 kDa에서 GST 단백질 signal 및 약 75 kDa에서 GST 융합 PNBE 단백질 signal을 확인 할 수 있었다 (도 13의 (b) 참고). 이와 같은 실험을 통하여, 기존 WB 기법을 aptamer blotting 기법이 완벽하게 대처할 수 있음을 최종 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Development of new protein detection system using DNA aptamer and uses thereof <160> 33 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-1 <400> 1 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttaccgctgc aatcgtgtgc 60 catacacaga tgatccgcac aagatagtaa gtgcaatct 99 <210> 2 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-2 <400> 2 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttcagggttg gagaggtttg 60 gtggttatca taagcggtac acagatagta agtgcaatct 100 <210> 3 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-3 <400> 3 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa tttaggtttg ggtaggttgg 60 aatggtgaat aatatgggac ggagatagta agtgcaatct 100 <210> 4 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-4 <400> 4 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttcggacgtt gcactggaaa 60 aggaggtttg gttcggttgg tcagatagta agtgcaatct 100 <210> 5 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-5 <400> 5 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttagacagca tagcactgta 60 acgattggtt tggtgtggtt ggagatagta agtgcaatct 100 <210> 6 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-6 <400> 6 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttagatatca ggagcggggt 60 ttggggtggt tggcggtgga cgagatagta agtgcaatct 100 <210> 7 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-7 <400> 7 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttgctctaag tataccggta 60 gggttggctg cggtttggct cgagatagta agtgcaatct 100 <210> 8 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-8 <400> 8 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttactatcgg atttctgggt 60 ttggatcggt tggcagcgag tgagatagta agtgcaatct 100 <210> 9 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-9 <400> 9 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttgctctaag tattccggta 60 gggttggctg cggtttggct caagatagta agtgcaatct 100 <210> 10 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-10 <400> 10 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttgggcatgt ggacttgcga 60 tttcggtttg gtgtggttgg ggagatagta agtgcaatct 100 <210> 11 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-11 <400> 11 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttcagcgctc cccacgggga 60 cattgtctca gttctacggc ccagatagta agtgcaatct 100 <210> 12 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-12 <400> 12 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttagatagcg tagcactgta 60 acgattggtt tggtgtggtt ggagatagta agtgcaatct 100 <210> 13 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-13 <400> 13 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttccacgttt ccacgtatcc 60 tcggagcttg cttaaccgta cgagatagta agtgcaatct 100 <210> 14 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-14 <400> 14 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttcgcgcggc acttaatgct 60 gctgcatcaa cccccctggg cgagatagta agtgcaatct 100 <210> 15 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-15 <400> 15 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttagatagca tagcactgta 60 acgattggtt tggtttgtta cgagatagta agtgcaatct 100 <210> 16 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dig-1 <400> 16 agattgcact tactatctcg gttgctcctg gtaggttacg acacgcgggg ctggcggaaa 60 ttgaataagc tggtatctcc ctatagtgag tcgtattacc 100 <210> 17 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dig-2 <400> 17 agattgcact tactatctac cgtaacagat aaaagattct gtgattgact gcttctggaa 60 ttgaataagc tggtatctcc ctatagtgag tcgtattacc 100 <210> 18 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dig-3 <400> 18 agattgcact tactatctcg ccggctagga aacaattggt tggtgtgttc ggccccttaa 60 ttgaataagc tggtatctcc ctatagtgag tcgtattacc 100 <210> 19 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dig-4 <400> 19 agattgcact tactatctca gtgaaacttt ggttggccgc ctgtagggtc actttgtgaa 60 ttgaataagc tggtatctcc ctatagtgag tcgtattacc 100 <210> 20 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dig-5 <400> 20 agattgcact tactatctcc ccgccaaggt ttttgcagtt ggtccctccg gtgattcgaa 60 ttgaataagc tggtatctcc ctatagtgag tcgtattacc 100 <210> 21 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dig-6 <400> 21 agattgcact tactatctcg cattcgacat agccggtagt aaaagcatgg tcgcttcaaa 60 ttgaataagc tggtatctcc ctatagtgag tcgtattacc 100 <210> 22 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dig-7 <400> 22 agattgcact tactatctcc aaagtgggat tttttagtgg ttgcatcgcg agacagctaa 60 ttgaataagc tggtatctcc ctatagtgag tcgtattacc 100 <210> 23 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dig-8 <400> 23 agattgcact tactatctcg aggtagcagg ttgcttgcgg ctaaagcatt ttcatgctaa 60 ttgaataagc tggtatctcc ctatagtgag tcgtattacc 100 <210> 24 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dig-9 <400> 24 agattgcact tactatctca caaaggaatg aacgatgcga tctggtagct tctttggcaa 60 ttgaataagc tggtatctcc ctatagtgag tcgtattacc 100 <210> 25 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dig-10 <400> 25 agattgcact tactatctcg tggaatgttg ttgcttctgc tacgatacgt caaccctcaa 60 ttgaataagc tggtatctcc ctatagtgag tcgtattacc 100 <210> 26 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dig-11 <400> 26 agattgcact tactatctag gtgtagatac ccaggcgtat ggttgcgctg tttcgtggaa 60 ttgaataagc tggtatctcc ctatagtgag tcgtattacc 100 <210> 27 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dig-12 <400> 27 agattgcact tactatctca aggtgtcgca ctttttgacg ttggactgct tcgaacagaa 60 ttgaataagc tggtatctcc ctatagtgag tcgtattacc 100 <210> 28 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template DNA, wherein n is any one selected from consiting of A, G, C and T <400> 28 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnagattgca cttactatct 100 <210> 29 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer <400> 29 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa tt 42 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer <400> 30 agattgcact tactatct 18 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 atttttggtt ggttgcttcg 20 <210> 32 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNBE F primer <400> 32 agtggatcca tgactcatca aatagtaa 28 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNBE R primer <400> 33 gatgcggccg cttctccttt tgaagggaat 30

Claims

GST(Glutathione-S-transferase) 단백질에 특이적으로 결합하는, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계;
상기 반응 후에 디곡시게닌(digoxigenin)에 특이적으로 결합하는, 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 DNA 앱타머를 시료에 처리하는 단계; 및
표지물질에 의한 시그널의 크기를 분석하는 단계를 포함하며,
상기 GST 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 디곡시게닌이 결합되어 있고, 상기 디곡시게닌에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 표지물질이 결합된 것을 특징으로 하는, DNA 앱타머를 이용하여 시료 내 GST 단백질을 검출하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 표지물질은 발색 효소, 형광물질, 발광물질, 리간드, 미소입자, 레독스 분자 또는 방사선 동위원소인, DNA 앱타머를 이용하여 시료 내 GST 단백질을 검출하는 방법.
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