KR101069589B1

KR101069589B1 - Ｃｅａ에 특이적으로 결합하는 단일 가닥 ｄｎａ 압타머

Info

Publication number: KR101069589B1
Application number: KR1020090041157A
Authority: KR
Inventors: 이정오; 장현주; 김용환; 박혜정; 나주리
Original assignee: 광운대학교 산학협력단; 한국화학연구원
Priority date: 2009-05-12
Filing date: 2009-05-12
Publication date: 2011-10-05
Also published as: KR20100122223A

Abstract

본 발명은 CEA에 특이적으로 결합하는 단일 가닥 DNA를 포함하는 압타머에 관한 것이다. 본 발명에서 CEA에 특이적으로 결합하는 단일 가닥 DNA는 서열 번호 1 내지 서열 번호 3의 단일 가닥 DNA 가 이루는 3차원 구조가 CEA와의 특이적인 결합을 달성하게 하는 것으로 생각된다.

본 발명의 DNA 압타머를 이용하는 바이오센서는 DNA 서열로 이루어져 단백질 서열로 이루어진 종래의 진단 시약에 비해 활성을 장기간 유지할 수 있고, 열 등의 환경 조건에도 변하지 않아 안정적으로 장기간 보관할 수 있다.

CEA

Description

ＣＥＡ에 특이적으로 결합하는 단일 가닥 ＤＮＡ 압타머{Single-stranded DNA aptamers specifically binding to CEA}

본 발명은 바이오 센서에 사용되는 DNA 압타머, 구체적으로는 종양 표지자로 널리 알려진 CEA(Carcinoembryonic antigen)에 특이적으로 결합하여 CEA를 감지하는 바이오 센서에 사용될 수 있도록 CEA에 높은 친화력을 가지는 DNA 압타머에 관한 것이다.

통상적으로, 질병의 진단을 위해, 특정 단백질 등의 타겟 바이오 분자를 검출하는 것이 필요하며, 이러한 타겟 바이오 분자의 검출을 위한 바이오 센서가 이용됨이 알려져 있다.

종래의 바이오센서에서는 타겟 바이오 분자를 검출하기 위해 압타머를 사용하고 있다. 이러한 압타머는 특정 타겟 바이오 분자와 결합할 수 있는 물질로서 바람직하게는 핵산, 아미노산, 펩티드, 단백질, 효소기질, 리간드, 코펙터, 안티센스, 유기 저분자 및 탄수화물로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 이때, 타겟 바이오 분자로는 CEA, AFP, PSA 등의 종양표지자, 또는 단백질, 유기 저분자가 바람직하게 사용된다.

그런데, 타겟 바이오 분자의 검출을 위해, 타겟 바이오 분자와 항체 항원 반응을 이용하는 경우가 시도되고 있으며, 이를 위해 타겟 바이오 분자와 특이적으로 결합하는 항체가 이용되었다.

일반적으로, 항체는 포유류의 면역 시스템에서 외부의 자극에 대항하기 위해 만들어 내는 물질로 단백질로 구성된다. 따라서, 특정 타겟 바이오 분자에 대한 항체를 수득하기 위해서는 인공적으로 동물 세포에 자극을 가하여 항체를 생산하고, 이렇게 생산된 항체를 별도의 분리 과정을 통해 분리해 내야 한다.

그런데, 항체는 단백질이기 때문에, 균일한 특성(활성)을 유지하기 어렵고, 열이나 기타 환경조건에 취약한 단점을 갖고 있다. 그리고, 단백질 구조에 영향 없이, 리포터를 직접 고정화하거나 작용기를 추가하는 것이 쉽지 않았다.

따라서, 이러한 단백질인 항체 대신에 타겟 바이오 분자와 친화성이 높고, 장기간 안정하게 보존될 수 있는 핵산을 압타머로 사용하고자 하는 시도가 있다.

또한, 이러한 핵산은 형광 물질 등의 리포터, 및 다양한 작용기 등을 추가하는 것이 용이하여 압타머로서 유용성이 확인되고 있다.

한편, CEA(Carcinoembryonic antigen)는 널리 알려진 종양 표지자로서 주로 소화기계에 분포하며 소화기, 폐, 갑상선, 유방암, 전립선암, 자궁암 등의 상피내막 암의 경우에 과 발현된다. 따라서, CEA 농도의 측정은 상기 암 질환들을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.

현재로는 단일클론 (monoclonal) 항체를 이용하여 혈액 중의 CEA 농도를 측정하고 있으나, CEA와 친화적으로 결합하는 핵산 서열은 아직 발견되지 않아, 핵산 을 이용하는 바이오센서는 아직 개발되지 못하고 있다.

상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 종양 표지자인 CEA에 높은 친화력을 가지는 핵산 서열을 이용하는 DNA압타머를 제공하는 것이다.

위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 한 특징에 따른 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 DNA 서열로 구성된다.

또한, 본 발명의 또 다른 특징에 따른 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 DNA 서열로 구성된다.

또한, 본 발명의 또 다른 특징에 따른 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 DNA 서열로 구성된다.

또한, 본 발명의 또 다른 특징에 따른 CEA용 압타머는 서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

또한, 본 발명의 또 다른 특징에 따른 CEA용 압타머는 서열번호 2의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

또한, 본 발명의 또 다른 특징에 따른 CEA용 압타머는 서열번호 3의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 DNA는 종양 표지자인 CEA와 우수한 친화력을 가지고 있으므로, CEA에 특이적으로 결합하여 CEA를 검출하기 위한 바이 오센서에 압타머로 이용될 수 있다.

그에 따라, 본 발명의 DNA 압타머를 이용한 바이오 센서는 항체를 사용하는 종래의 진단 시약을 보다 저렴한 비용으로 대체할 수 있다. 또한, 본 발명의 DNA 압타머를 이용하는 바이오센서는 DNA 서열로 이루어져 단백질 서열로 이루어진 종래의 진단 시약에 비해 활성을 장기간 유지할 수 있고, 열 등의 환경 조건에도 변하지 않아 안정적으로 장기간 보관할 수 있다. 따라서 본 발명의 DNA 압타머를 이용한 바이오센서는 그 상품성과 경제성이 우수하다.

본 발명에서는, CEA에 특이적으로 결합하는 DNA 서열의 폴리뉴클레오티드를 선별하기 위해 SELEX 방법을 이용하였다.

이러한 방법에 의해, 본 발명자들은 종양 표지자인 CEA와 높은 친화력을 가지며 압타머로 사용될 수 있는 서열번호 1 내지 3에 기재된 DNA 서열의 폴리뉴클레오티드를 확인하였다.

이하, 본 발명을 바람직한 실시예와 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

단계 1: 무작위 DNA 라이브러리 및 프라이머의 제작

5’-GAATTCGGGAGACAAGAATAAACGCTC-3’의 정방향 프라이머와 5’- GCCTGTTGTGAGCCTCCTGTCGAAGCTT-3’의 역방향 프라이머를 각각 사용하여 PCR 을 실시하였다. 여기서, 밑줄 친 부분 중 GAATTC는 EcoR I 제한효소가, 그리고 AAGCTT는 Hind Ⅲ 제한효소가 결합할 위치를 나타낸다.

이러한 PCR 및 비대칭PCR을 통해 5’-GAATTCGGGAGACAAGAATAAACGCTC-N60-CGACAGGAGGCTCACAACAGGCAAGCTT-3’와 같이 뉴클레오티드가115개로 이루어진 단일 가닥 DNA(이하, 간단히 ssDNA라고도 한다) 라이브러리를 준비하였다. 여기서 5' 말단의 GAATTC 는 EcoR I 제한효소가, 그리고 3' 말단의 AAGCTT는 Hind III 제한효소가 인식하는 부분으로 차후 서열분석을 위해 포함되며, 중앙부의 N60은 압타머의 후보에 해당하는 무작위 서열이다. 여기서, 5' 말단 쪽의 27개의 뉴클레오티드와 3' 말단 쪽의 28개의 뉴클레오티드는 각각 PCR에서 프라이머가 위치되는 서열로 사용된다.

그리고, 비대칭 PCR을 위해 5' 말단에 fluorescein으로 표지하여 역 프라이머를 준비하였다.

단계 2: CEA 가 코팅된 자성 비드 준비

자성 비드(Dynabeads M-270 Epoxy (Dynal Biotech 사, 노르웨이) 를 0.1 M 소듐 포스페이트 버퍼에 약 1×10⁹ 비드/ml 의 농도로 분산시켰다. 이 비드를 CEA 와 24시간 동안 반응시켜 비드 표면에 CEA를 고정시켰다. 여기서 사용되는 CEA 의 농도는 최종 농도가 20 mg 단백질/mg 비드 농도가 되도록 약 100 mg/ml 의 CEA 용액을 사용하였다.

그 후, 자석을 이용하여 CEA가 결합된 자성비드를 분리하였다. 분리된 CEA-자성비드는 다시 pH 7.4의 0.1% BSA (Bovine Serum Albumin) 단백질과 0.02% 소듐 아지드가 들어있는 4℃ PBS (Phosphate Buffer Saline)에 보관하였다.

단계 3: SELEX 공정 수행

단계 1에서 준비된 단일 가닥 DNA 라이브러리의 DNA 단편(100 pmol/ml) 10 μl 를 바인딩 버퍼 (100 mM NaCl와 20 mM Tris-HCl의 혼합 용액, pH 7.6) 에 분산된 CEA 자성비드 10 μl 와 반응시켰다. 이 때 DNA 단편이 3차원 구조를 잘 형성하여 CEA 와 결합할 수 있도록 37℃에서 최하 30분간 반응시켰다.

그 후, 자석을 이용하여 상등액으로부터 ssDNA-CEA 자성비드 복합체를 분리하였다. 그 후, 분리된 ssDNA-CEA 자성비드 복합체를 PBS 버퍼로 5회 이상 세척하여 비드에 결합되어 있지 않은 ssDNA를 제거하였다.

다음으로, CEA 비드에 결합한 아래와 같이 ssDNA를 CEA 비드에서 분리시킨 후, 이를 증폭시켰다.

우선 앞서 단계 1의 두 종류의 프라이머를 사용하여 94℃ 에서 10분간 처리한 후, 94℃ 에서 30초, 60℃에서 30초씩 15회의 PCR 주기를 반복하여 이중 나선 DNA를 수득하였다.

그 후, 다음에 5' 말단에 fluorescein로 표지 된 역 프라이머와 EX Taq 폴리머라아제를 사용하여 비대칭 PCR을 수행하였다. 이 때는 94℃ 에서 4분간 처리한 후, 94℃ 에서 30초, 60℃에서 30초씩 30 회의 주기로 증폭하였다.

단계 4: 단일 가닥 DNA의 클로닝 및 서열 확인

상기 단계 3을 6 주기 수행한 후, 증폭된 단일 가닥 DNA들 중 N60의 무작위 부분의 서열을 확인하기 위해 T 이지 벡터(T easy vector)로 클로닝하였다.

그 후, N60의 무작위 부분의 서열은 소프트웨어ClusterW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2)를 이용하여 확인하였다.

그리고, 단일 가닥 DNA의 3차원 구조 또한 최소 자유에너지 알고리즘인 소프트웨어 mfold (www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/)를 이용하여 분석하였다.

하기 표 1은 분리된 단일 가닥 DNA 서열을 나타낸다.

명칭	DNA 서열
1(A)	GGTGTAGGTGTCGATGCGTGTCGGTGGTCTTTAGTA
1(B)	GTCGATGCGTGTCGGTGGTCTTTAGTACGTAGTGGGTACACGCTTGTTCT
56	GACTTGGAAGGAAGCGAGTCACTGGCTTTAGTA
3	ATTGATGAGATCTGGAGGCCCTTGGTAGATGAGGTG
59(A)	ACTGTTGAGATGTCGGGGATTCTTGTGATAATGTG
59(B)	ACTGTTGAGATGTCGGGGATTCTTGTGATAATGTGTGTGGAATCTCTCGG
5	GATAATGAGACGCCTGGCGGGTTACTTTGCGGACGGATCGTGTTCCTCG

상기 표 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 분리된 ssDNA의 염기 서열에 높은 유사성이 확인된다(굵은 글씨로 표시된 부분).

단계 5: 압타머용 DNA 서열 확인

상기 표 1에 개시된 ssDNA의 CEA 친화성을 확인하였다.

우선 형광 분광계를 이용하여 CEA가 코팅된 자성 비드와 상기 표 1의 ssDNA의 결합을 525 nm 에서 측정하였다.

여기서 CEA가 코팅된 자성비드와 결합되지 않고, 상등액에 떠 있는 fluorescein 이 표지된 단일 가닥 DNA 를 형광신호로 검출할 수 있으므로 형광신호의 세기로 각 압타머 후보서열의 결합력을 확인할 수 있다.

이러한 형광 분광계를 통한 CEA 친화성 확인 결과는 도 1에 도시된다.

도 1에서 확인되는 바와 같이, ssDNA 중 01(A)(이하, 서열 번호 1이라 합니다) 가 가장 높은 친화력을 나타내었으며, 01(B)(이하, 서열 번호 2라 합니다) 와 56(이하, 서열 번호 3이라 합니다)은 01(A) 에 비해 약 50%의 친화력을 나타냄이 확인되었다. 이에 비해 다른 네 서열 (3, 5, 59(A), 59(B)) 은 CEA 와 거의 결합하지 않음을 볼 수 있다.

도 2는 각 단일 가닥 압타머의 3차원의 예상 구조를 비교하였다. 도 2로부터 서열 번호 1 내지 서열번호 3의 ssDNA의 2 차원 예상 구조가 유사함을 알 수 있으며, 이러한 유사한 3차원 구조가 CEA에 특이적으로 결합할 수 있게 하는 것으로 추정된다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것이 아니고 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고 이 또한 첨부된 특허 청구 범위에 속하는 것은 당연하다.

도 1은 표 1의 ssDNA의 결합 친화도를 보여준다.

도 2는 표 1의 ssDNA의 3차원 예상 구조를 보여준다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY Kwangwoon University Industry-Academic Collaboration Foundation <120> SINGLE-STRANDED DNA APTAMERS SPECIFICALLY BINDING TO CEA <130> pa090312-c02 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA specifically binding to CEA <400> 1 ggtgtaggtg tcgatgcgtg tcggtggtct ttagta 36 <210> 2 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA specifically binding to CEA <400> 2 gtcgatgcgt gtcggtggtc tttagtacgt agtgggtaca cgcttgttct 50 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA specifically binding to CEA <400> 3 gacttggaag gaagcgagtc actggcttta gta 33

Claims

서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드.
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서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 CEA(Carcinoembryonic antigen)에 특이적으로 결합하는 압타머.
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