CN104508150B - 基于适体的多重测定 - Google Patents

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Abstract

本公开描述了用于检测测试样品中可能存在的一种或多种靶分子的方法、装置、试剂和试剂盒。所描述的方法、装置、试剂盒和试剂有助于通过对核酸(即，适体)进行检测和定量来对测试样品中的非核酸靶标(例如，蛋白质靶标)进行检测和定量，其中显著减少或消除适体‑适体相互作用，同时维持适体‑靶标相互作用。

Description

基于适体的多重测定
相关申请
本申请要求于2012年6月7日提交的美国临时申请序列号61/656,956的权益，所述临时申请通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明一般涉及经设计以改良基于适体的多重测定的性能的方法、装置、试剂和试剂盒。此类方法在诊断应用以及生物标记物探索和研究工具的设计与开发及基于适体的治疗剂的开发中具有广泛效用。具体地说，提供了用于减少或消除背景信号的材料和方法。
背景
以下描述提供了与本公开相关的信息的汇总，而不是承认本文中所提供的任何信息或所参考的任何出版物是在要求保护的本发明之前的技术。
针对生物样品和其它样品中的生理学上重要的分子的检测和定量的诸多测定在科学研究和卫生保健领域是重要的工具。一类所述测定涉及使用包括一个或多个被固定在固体支持物上的适体的微阵列。所述适体各自能够以高特异性方式且以极高亲和力结合靶分子。参见例如标题为“Nucleic Acid Ligands”的美国专利号5,475,096，还参见例如美国专利号6,242,246、美国专利号6,458,543和美国专利号6,503,715，各专利的标题为“Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip”。一旦微阵列与样品接触，适体就结合样品中所存在的其各自的靶分子，且从而能够测定靶分子在样品中不存在、存在、量和/或浓度。
还描述了多重适体测定，所述测定提供了经设计以去除测定混合物的特定组分的基于溶液的靶相互作用和分离步骤，参见美国专利号7,855,054和7,964,356及美国公布号US/2011/0136099和US/2012/0115752。所描述的适体测定方法使用一个或多个特异性捕获步骤从欲检测的靶标分离测试样品的组分，同时分离适体-靶标亲和复合物。
许多测定形式的敏感性和特异性因检测方法在测定期间从由于非特异性缔合产生的信号中解析真信号且产生可检测信号的能力而受到限制。这对基于适体的多重测定尤其如此。已经观察到，此类型测定中的非特异性结合的主要来源之一是非预期适体-适体相互作用的功能。由于靶标/适体相互作用取决于维持靶特异性适体的结构特征，所以减少适体-适体相互作用的任何方法都需要受到制衡，以便不减少特异性/靶适体相互作用。本公开描述了消除单一或多重适体测定中的背景同时维持靶标/适体特异性相互作用的方法。
发明概要
本公开提供了经设计以改良单一分析物和基于适体的多重测定的性能的方法、装置、试剂和试剂盒。具体地说，提供了用于减少或消除背景信号的材料和方法。
在一个实施方案中，提供了对靶分子和第一可释放标签具有高亲和力和特异性的适体。在一些实施方案中，适体是光适体。在一些实施方案中，这种第一可释放标签是可光裂解生物素。描述了其它标签和可裂解部分及含有所述标签和可裂解部分的适体。
在与测试样品进行平衡结合之前，在溶液中将包含对靶分子具有特异性亲和力的第一可释放第一标签的适体固定在固体支持物上。适体与固体支持物的连接是通过使第一固体支持物与适体接触并且允许适体上所包括的可释放第一标签直接或间接地与连接到第一固体支持物或为第一固体支持物一部分的适当第一捕获剂缔合来实现。在连接之后，利用被缓冲到pH 11的溶液进行洗涤，以去除适体/适体聚集物，从而减少测定背景(下文定义的“Catch-0”固定)
然后制备测试样品并且与对其各自靶分子具有特异性亲和力的固定的适体接触。如果测试样品含有靶分子，则适体-靶标亲和复合物将在与测试样品的混合物中形成。注意，除适体-靶标复合物以外，未复合的适体也将连接到第一固体支持物上。然后将适体-靶标亲和复合物和已经与固体支持物上的探针缔合的未复合适体与混合物的其余部分分隔开，从而去除测试样品(样品基质)中的游离靶标和所有其它未复合物质，即，混合物中未与第一固体支持物缔合的组分。这个分隔步骤在本文中称为Catch-1分隔(参见以下定义)。在分隔之后，使用适用于所采用的特定可释放第一标签的方法从第一固体支持物释放适体-靶标亲和复合物以及任何未复合适体。
在一个实施方案中，用将第二标签引入到适体-靶标亲和复合物的靶分子组分的试剂来处理与固体支持物结合的适体-靶标亲和复合物。在一个实施方案中，靶标是蛋白质或肽，并且通过用NHS-PEO4-生物素处理靶标而将其生物素化。引入到靶分子中的第二标签可以与适体捕获标签相同或不同。如果第二标签与第一标签或适体捕获标签相同，则可能在这个标记步骤起始之前，第一固体支持物上的游离捕获位点被封闭。在该示例性实施方案中，在靶标标记起始之前用游离生物素洗涤第一固体支持物。标记方法，且确切地说，诸如肽和蛋白质的靶标的标记描述于美国专利号7,855,054中。
分隔是通过从第一固体支持物释放未复合的适体和适体-靶标亲和复合物来完成的。在一个实施方案中，第一可释放标签为通过在可裂解≥90％第一可释放标签的条件下用紫外灯辐照而裂解的可光裂解部分。在其它实施方案中，释放是通过适用于第一可释放标签中的选定可释放部分的方法来完成的。适体-靶标亲和复合物可以经过洗脱和收集以进一步用于测定，或可与另一种固体支持物接触以进行测定的其余步骤。
在一个实施方案中，进行第二分隔(在本文中称为Catch-2分隔，参见以下定义)以去除游离适体。如上文所描述，在一个实施方案中，可以将用于Catch-2分隔的第二标签加入到靶标，同时适体-靶标亲和复合物仍与用于Catch-0捕获的固体支持物接触。在其它实施方案中，可以在Catch-2分隔起始之前，在测定中的另一个点将第二标签加入到靶标。使混合物与固体支持物接触，该固体支持物具有粘附于其表面的捕获元件(第二)，该捕获元件能够优选地以高亲和力和特异性结合靶标捕获标签(第二标签)。在一个实施方案中，固体支持物为微量滴定板的孔内所含有的磁性珠(诸如DynaBeads MyOne StreptavidinC1)，且捕获元件(第二捕获元件)为链霉亲和素。磁性珠为分离经过分隔的混合物组分提供了便利的方法。混合物中所含有的适体-靶标亲和复合物从而通过靶标(第二)捕获标签与第二固体支持物上的第二捕获元件的结合相互作用而结合到固体支持物。然后将适体-靶标亲和复合物与混合物的其余部分分隔开，例如通过用缓冲溶液洗涤支持物，所述缓冲溶液包括包含有机溶剂的缓冲液，所述有机溶剂包括但不限于甘油。
然后用包含离液盐的缓冲液从适体-靶标复合物选择性地洗脱适体，所述离液盐包括但不限于高氯酸钠、氯化锂、氯化钠和氯化镁。此处理不洗脱凭借适体/适体相互作用保留在Catch-2珠上的适体。
在另一个实施方案中，通过任何合适的核酸检测方法，诸如例如DNA微阵列杂交、Q-PCR、质谱法、侵入测定、下一代测序等，对由Catch-2分隔释放的适体进行检测并且任选地定量。以下更详细地描述了这些检测方法。
本文中所描述的任何方法都可以用于对测试样品进行单分析物测试或多重分析。例如，任何多重分析都可以包括使用两种、数十种、数百种或数千种适体同时测定诸如生物样品的测试样品中的相等数目的靶分子。在这些实施方案中，将多种适体引入到测试样品中，并且可以进行任何上述测定。在释放适体之后，可以采用任何合适的多重核酸检测方法来独立地测量所释放的不同的适体。在一个实施方案中，这可以通过与单独地排列在固体表面上的互补探针进行杂交来实现。在另一个实施方案中，可以使用质谱法基于分子量来检测不同的适体中的每一种。在另一个实施方案中，可以基于诸如，例如毛细管电泳中凝胶中的电泳迁移率或通过液相色谱法来检测不同的适体中的每一种。在另一个实施方案中，使用Q-PCR，可使用独特PCR探针来检测并且任选地定量不同的适体中的每一种。在另一个实施方案中，可以使用下一代测序法来检测并且任选地定量不同的适体中的每一种。
在本文中所公开的各测定中，可以使用动力学挑战来增加测定的特异性和减少非特异性结合。在可以任选地用于本文中所描述的各测定中的一个实施方案中，可以通过将竞争物与测试样品一起预孵育或通过在平衡结合期间向混合物中加入竞争物来实现非特异性结合的额外减少。在其它实施方案中，通过稀释进行动力学挑战。
另一个实施方案描述了一种用于检测测试样品中可能存在的靶分子的方法，该方法包括：将对靶分子具有特异性亲和力且携带对第一捕获元件具有特异性亲和力的第一标签的适体暴露于包含第一捕获元件的第一固体支持物，并且允许第一标签与第一捕获元件缔合；用一种或多种解离聚集的适体的缓冲溶液来洗涤所述固体支持物；和用一种或多种包含破坏适体/分析物相互作用但支持适体/适体相互作用和DNA杂交的离液盐的缓冲溶液从所述固体支持物洗脱适体。在一个实施方案中，所述离液盐选自高氯酸钠、氯化锂、氯化钠和氯化镁，并且所述解离聚集的适体的缓冲溶液包含有机溶剂。在一个实施方案中，所述有机溶剂是甘油。
附图简述
图1以图表描绘了适体依赖性滞留和随后从Catch-2珠洗脱适体。将不携带生物素的经过放射标记的适体与携带增加量的未经放射标记的生物素化的适体的磁性链霉亲和素珠一起孵育并且洗涤。然后用含1M氯化钠的CAPS缓冲液(pH 10)洗脱留存的材料。所洗脱的经放射标记的适体的量与Catch-2珠所吸附的冷适体的量成比例。
图2A-2F说明了当在用测试样品平衡之前未对适体进行预固定时血浆浓度对测定的影响。参考图2，从0％v/v至25％v/v对血浆进行滴定。如可见，大部分分析物的信号在10％与20％之间进入平台期。
图3A-3F以图表描绘了当在用测试样品平衡之前未对适体进行预固定时光裂解洗脱物中的适体回收率作为血浆浓度的函数。Catch-1光裂解(回收洗脱物并且通过杂交进行定量(Y轴，相对荧光单位)。如可见，随着血浆浓度增加，适体回收率显著下降，其中即使在5％血浆时也可见显著效果。分析物结合是否影响适体结合珠是未知的，然而，应注意，优先损失复合的适体将产生甚至更大的血浆依赖性效果。
图4A-4D以图表描绘了标准(黑色曲线)与预固定(虚线曲线)测定中的血浆滴定的比较。
图5A-5D以图表描绘了使用本文中所描述的预固定测定形式的1M NaCl/CAPSO洗脱与1.8M NaClO4/PIPES洗脱的比较。以预固定测定形式运作在缓冲液中的标准曲线(下面的曲线)和在40％血浆中的加标(spike)(上面的曲线)。
图6描绘了使用高氯酸盐洗脱和预固定适体对仅存在缓冲液的孔进行8次重复实验的CV(变异系数)。
图7说明了针对300种分析物测量的加标和回收率。加标回收率被定义为(分析物信号加标至血浆中的10pM分析物信号血浆)/分析物信号10pM缓冲液 加标)。
图8说明了针对蛋白ERBB2的固定形式的左移缓冲液剂量-响应。所测量的内源水平低十倍以上且非常接近所报告的内源水平。
图9说明了对于蛋白质激活素A来说，在缓冲液中的蛋白质滴定有所改良、加标和回收特性更好、血浆滴定特性更具线性和血浆中的预测内源蛋白水平更稳定。
详述
现在将详细参考本发明的代表性实施方案。尽管将结合所列举的实施方案来描述本发明，但应理解本发明并不旨在局限于那些实施方案。相反，本发明旨在涵盖所有的替代方案、修改和等效物，它们可以被包括在如由权利要求书界定的本发明范围内。
除非另外指示，否则采用本领域技术人员水平内的化学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法来实施本发明。文献中充分说明了此类技术。参见例如，Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(现行版本)；DNA Cloning:A PracticalApproach,第I卷和第II卷(D.Glover编辑)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait编辑,现行版本)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames和S.Higgins编辑,现行版本)；Transcription and Translation(B.Hames和S.Higgins编辑,现行版本)。
除非另外限定，否则本文所使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文中所描述的那些方法、装置和材料相似或相等的任何方法、装置和材料，但现在描述优选的方法、装置和材料。
本说明书中所引用的所有出版物、公开专利文件和专利申请指示本发明所属领域的技术水平。本文中所引用的所有出版物、公开专利文件和专利申请在此以引用的方式并入，其程度如同每个单独出版物、公开专利文件或专利申请被具体地和单独地指出是以引用的方式并入那样。
所引用的出版物中的实施例和与其相关的限制意在为说明性的而非排他性的。在阅读本说明书和研究附图后，对所引用的出版物的其它限制对本领域技术人员将显而易见。
本公开包括经设计以改良基于适体的多重测定的性能的方法、装置、试剂和试剂盒。所公开的方法、装置、试剂和试剂盒通过减少或消除背景信号而提供了用于对测试样品中的靶分子进行检测和/或定量的高敏感度测定。
值得注意的是，除非特定实施方案中另外规定，否则本文中所描述的用于对靶分子进行检测和/或定量的方法不依赖于描述步骤的具体顺序。出于说明的目的，将方法描述为步骤的具体顺序；然而，应理解，所说明的步骤顺序的任何排列编号都是可能的，只要能实现所描述的特定测定的目的即可。换句话说，可以按照任何可行的顺序来进行所公开的任何方法中所叙述的步骤，且本发明的方法不限于所描述的任何实施方案、实施例或所附权利要求书中所提供的任何特定顺序。此外，为便于和易于呈现，参考单一靶分子和单一适体描述了各种方法。然而，应理解，所描述的任何方法都能以可使用多种适体同时检测和/或定量多种靶标的多重形式进行，从而，举例来说，可以通过使测试样品与多种适体接触来检测和/或定量测试样品中的多种靶分子，其中各适体对特定的靶分子具有特异性亲和力(即，呈多重形式)。
如包括所附权利要求书的本公开中所使用，除非内容另外明确指示，否则单数形式“一个/种(a,an)”和“所述/该”包括多个指示物，并且可与“至少一个/种”和“一个/种或多个/种”互换使用。因而，提到“一个适体”包括适体的混合物等。
如本文中所使用，术语“约”表示使得与数值相关的项目的基本功能不变的数值的不重要修改或变化。
术语“各”当在本文中用于指多个项目时意在指所述项目中的至少两个。无需要求形成复数的所有项目都满足相关额外限制。
如本文中所使用，术语“包含(comprises,comprising)”、“包括(includes,including)”、“含有(contains,containing)”及其任何变型意在涵盖非排他性包括，从而包含、包括或含有要素或要素列表的工艺、方法、工艺衍生产品或物质组合物不仅包括那些要素，而且可以包括未明确列出的或所述工艺、方法、工艺衍生产品或物质组合物所固有的其它要素。
如本文中所使用，“缔合(associate,associates)”及其任何变型是指标签与探针之间的相互作用或复合，所述相互作用或复合在给定复合或反应条件下产生充分稳定的复合物，以便允许从标签-探针复合物中分离“未缔合”或未结合材料(诸如，例如测试样品的未结合组分)。标签和探针可以通过彼此特异性地相互作用和结合而彼此直接缔合。标签和探针还可以彼此间接缔合，诸如当其复合是由接头分子介导时。
如本文中所使用，术语“核苷酸”是指核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，或其经修饰形式以及其类似物。核苷酸所包括的物质包括嘌呤(例如，腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤及其衍生物和类似物)以及嘧啶(例如，胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶及其衍生物和类似物)。
如本文中所使用，“核酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换用于指核苷酸的聚合物，并且包括DNA、RNA、DNA/RNA杂交物及这些核酸种类的修饰物、寡核苷酸和多核苷酸，其中包括不同的实体或部分在任何位置处连接于核苷酸单元。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”包括双链或单链分子以及多链(即，三螺旋)分子。核酸、寡核苷酸和多核苷酸是比术语适体更广泛的术语，并且因而，术语核酸、寡核苷酸和多核苷酸包括作为适体的核苷酸的聚合物，但术语核酸、寡核苷酸和多核苷酸不限于适体。
如本文中所使用，“核酸配体”、“适体”、“SOMAmer”和“克隆”可互换用于指对靶分子具有所需要的作用的非天然存在的核酸。所需要的作用包括但不限于结合靶标、催化地改变靶标、以修改或改变靶标或靶标功能活性的方式与靶标反应、共价连接于靶标(如在自杀性抑制剂中)和促进靶标与另一个分子之间的反应。在一个实施方案中，该作用是针对靶分子的特异性结合亲和力，所述靶分子是通过与沃森/克里克(Watson/Crick)碱基配对或三螺旋形成无关的机制结合核酸配体的除多核苷酸以外的三维化学结构，其中适体不是被靶分子正在结合的具有已知生理功能的核酸。针对给定靶标的适体包括通过以下方法从候选核酸混合物中鉴别的核酸，其中适体是靶标的配体，该方法包括：(a)使候选混合物与靶标接触，其中可从候选混合物中的其余物质分隔出相对于候选混合物中的其它核酸来说对靶标具有较高亲和力的核酸；(b)从候选混合物的其余物质分隔出较高亲和力核酸；和(c)对较高亲和力核酸进行扩增以产生配体富集的核酸混合物，借此鉴别靶分子的适体。已经认识到，亲和力相互作用是一个程度问题；然而，在本文中，适体对其靶标的“特异性结合亲和力”意指适体以比其结合混合物或样品中的其它非靶标组分高得多的亲和力程度结合其靶标。适体可以包括任何合适数目的核苷酸。“适体”是指一个以上这样的分子集合。不同的适体可以具有相同或不同数目的核苷酸。适体可以是DNA或RNA，并且可以是单链、双链或者含有双链或三链区域。适体可用所需要的碱基经修饰核苷酸的任何组合来设计。
如本文中所使用，“SOMAmer”或低解离速率经修饰的适体是指解离速率(t1/2)≥30分钟的适体(包括包含至少一个具有疏水性修饰的核苷酸的适体)。在一些实施方案中，使用标题为“Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates”的美国专利7,947,447中所描述的改良的SELEX方法来产生SOMAmer。
可以使用任何已知的方法，包括SELEX方法来鉴别适体。参见例如，标题为“Nucleic Acid Ligands”的美国专利号5,475,096。在鉴别后，可以根据任何已知的方法，包括化学合成方法和酶促合成方法，来制备或合成适体。
如本文中所使用，术语“适体-靶标亲和复合物”、“适体亲和复合物”或“适体复合物”是指通过适体与其靶分子的相互作用形成的非共价复合物。“适体-靶标亲和复合物”、“适体亲和复合物”或“适体复合物”是指一个以上这样的复合物集。适体-靶标亲和复合物、适体亲和复合物或适体复合物一般可以通过环境条件变化，例如温度增加、盐浓度增加或加入变性剂来逆转或解离。
在一些实施方案中，提供了适体与其靶标的非共价复合物，其中适体对靶标的Kd为约100nM或更低，其中适体从靶标解离的速率(以复合物半衰期给出；t1/2)大于或等于约30分钟；和/或其中适体的核酸序列中的一个、若干个或所有嘧啶在碱基的5-位上被修饰。
如本文中所使用，“非特异性复合物”是指两个或更多个除适体以外的分子与其靶分子的非共价缔合。因为非特异性复合物不是基于其组成分子之间的亲和力相互作用加以选择，而是代表几类分子之间的相互作用，所以非特异性复合物中所缔合的分子将对彼此展现平均起来低得多的亲和力，并且所具有的解离速率将对应地高于适体与其靶分子。非特异性复合物包括适体与非靶分子、适体与另一个适体、竞争物与非靶分子、竞争物与靶分子、适体与竞争物、和靶分子与非靶分子之间形成的复合物，以及适体、靶分子、非靶分子、表面与竞争物的高级聚集物。
如本文中所使用，“靶分子”、“分析物”和“靶标”可互换用于指适体能以高亲和力和特异性与其结合并且可以存在于测试样品中的任何目标分子。“目标分子”包括特定分子的任何细微变化，诸如在蛋白质的情况下，例如氨基酸序列中的细微变化、二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化，或任何其它操作或修饰(诸如与基本上不改变分子特性的标记组分缀合)。示例性靶分子包括蛋白质、多肽、核酸、碳水化合物、脂质、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、亲和体、抗体模拟物、病毒、病原体、毒性物质、底物、代谢物、过渡态类似物、辅因子、抑制剂、药物、染料、营养物、生长因子、细胞、组织和任何上述物质的任何片段或部分。可对于任何尺寸的几乎任何化学或生物学分子鉴别适体，并且因而，任何尺寸的几乎任何化学或生物学分子都可以是合适的靶标。靶标还可以经过修饰以提高靶标与适体之间的相互作用的可能性或强度。靶标还可以经过修饰以包括如上文所定义的标签。在示例性实施方案中，靶分子是蛋白质。关于其中SELEX靶标为肽的方法，参见标题为“ModifiedSELEX Processes Without Purified Protein”的美国专利号6,376,190。
“多肽”、“肽”和“蛋白质”可在本文中互换用于指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直链或支链，其可以包含经过修饰的氨基酸，并且其可以间杂非氨基酸。这些术语还涵盖已被天然修饰或通过介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰(诸如与标记组分缀合)。该定义中还包括，例如，含有氨基酸(包括例如，非天然氨基酸等)的一种或多种类似物以及本领域中已知的其它修饰的多肽。多肽可以是单链或缔合链。
术语“测试样品”在本文中是指含有多种分子且可能包括至少一种靶分子的任何材料、溶液或混合物。术语测试样品包括如下文所定义的生物样品和可用于环境或毒理学测试的样品，举例来说，诸如被污染或可能被污染的水和工业流出物。测试样品还可以是制备工艺(例如制造工艺)的最终产物、中间产物或副产物。测试样品可以包括已添加到获自生物体或一些其它来源(例如，环境或工业来源)的材料、溶液或混合物的任何合适的测定介质、缓冲液或稀释剂。
术语“生物样品”是指获自生物体的任何材料、溶液或混合物。这包括血液(包括全血、白细胞、外周血单核细胞、血浆和血清)、痰液、呼气、尿液、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸液、支气管抽吸液、滑液、关节抽吸液、细胞、细胞提取物和脑脊髓液。这还包括所有前述物质的用实验分离的部分。术语“生物样品”还包括例如含有均质化固体材料(诸如来自于粪便样品、组织样品或组织活检)的材料、溶液或混合物。术语“生物样品”还包括来源于细胞系、组织培养物、细胞培养物、细菌培养物、病毒培养物或无细胞生物系统(例如，IVTT)的材料、溶液或混合物。
在本文中所公开的任何实施方案中，可以对测试样品与参考样品进行比较。术语“参考样品”在本文中是指含有多种分子且已知包括至少一种靶分子的任何材料、溶液或混合物。参考样品中存在的任何靶分子的确切量或浓度也可能是已知的。术语参考样品包括如本文中所定义的生物样品和可用于环境或毒理学测试的样品，举例来说，诸如被污染或可能被污染的水和工业流出物。参考样品还可以是制备工艺(例如制造工艺)的最终产物、中间产物或副产物。参考样品可以包括已添加到获自生物体或一些其它来源(例如，环境或工业来源)的材料、溶液或混合物的任何合适的测定介质、缓冲液或稀释剂。
如本文中所使用，“非靶分子”和“非靶标”可互换用于指测试样品中所含有的能与适体形成非特异性复合物的分子。应了解，作为第一适体的非靶标的分子可能是第二适体的靶标。同样，作为第一适体的靶标的分子可能是第二适体的非靶标。
如本文中所使用，术语“分隔”是指分离、浓缩或去除测试样品中的一种或多种分子物质或测试样品中的其它分子。分隔可用于增加敏感度和/或减少背景。分隔在适体复合物形成之后或当适体-靶标亲和复合物由于交联期间引入的共价键而变得不可逆转时最有效。可以在对适体-靶标亲和复合物进行固定的任何步骤或每一步骤之后引入分隔步骤。分隔还可能依赖于尺寸差异性或适体-靶标亲和复合物与测试样品的其它组分之间差异性地存在的其它特有性质。还可以通过与适体或靶标的特异性相互作用来实现分隔。分隔还可以基于适体、靶标、适体-靶标亲和复合物或适体-靶标共价复合物的物理或生物化学性质来实现。
在单分析物和多重适体测定中，已经设计了许多步骤以从可能导致混淆性背景信号的样品中的材料或测定试剂中分离特异性适体/亲和复合物。尽管实施了这些步骤，但在这些类型的测定中，背景仍然是一个问题。分析方法中的背景可以凭经验解决，或较好的方法是鉴别背景来源并且消除导致背景的相互作用。已经发现，适体-适体相互作用是多重适体方法中的一个背景来源。能减少DNA-DNA和RNA-RNA相互作用的试剂，包括基于序列的那些试剂，是已知的。由于适体的内部相互作用决定了适体的二级和三级结构，所以将不会期望这些类型的试剂能在不影响适体折叠及因此不影响与其相应靶标的结合的情况下大幅减少多重测定中的背景信号。描述了能在减少背景的需要与维持适体结构之间取得平衡的材料和方法。
本公开描述了进行基于适体和光适体的多重测定以便对测试样品中可能存在的一种或多种靶分子进行定量的改良型方法，其中可以使用任何合适的核酸检测方法来分离适体(或光适体)与适体-靶标亲和复合物(或光适体-靶标共价复合物)以便进行最终检测，因为本文中所描述的材料和方法可以用于改良整体测定性能。光适体是包含使适体能够共价结合或“光交联”其靶分子的光反应性官能团的适体。
两个意料之外的限制出现在先前描述的用于进行基于适体的单一和多重测定(包括多重蛋白质组适体亲和力测定)的详细检查中。首先，适体/适体相互作用被鉴别为测定背景的主要来源且可能限制多路复用能力(multiplex capacity)。其次，发现样品基质(主要是血清和血浆)抑制生物素化的适体在经链霉亲和素取代的基质上的固定。本文中描述了能减少和/或消除该方法中的这些限制的三项主要创新。两项是本文中所描述的改良型方法所独有的(在本文中称为多重测定的“版本3”)；一项按照如Gold等,(2010年12月)“Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery”,PLoSOne5(12):e15005)中所描述的稍早期版本实施。版本3是本文中所描述的发明的一个实施方案。
对如Gold等,(PLoS One(2010)5(12):e15005)中所描述的测定的第一个改良包括在Catch-2步骤的一些洗涤缓冲液中使用有机溶剂来减小介质的介电常数。加入这些洗涤缓冲液有效地强化了适体的相邻磷酸二酯骨架的同种电荷排斥力，因而促进引起背景的相互作用适体的解离。
如本文所描述的方法中的第二个改良提供了双重优势。首先，如在向测定的Catch-2步骤中所使用的一些洗涤缓冲液中加入有机溶剂情况下，还能抵消适体相互作用的倾向，并且因而减少背景且增加多路复用能力。然而，其主要优势在于抵消生物素化的适体对链霉亲和素基质吸附的基质依赖性抑制。此类抑制即使在5％v/v血浆或血清下也能容易地检测，并且将可行的测定浓度限制为5-10％血浆或血清浓度。这个限制继而限制了测定敏感性。
如本文中所描述，对多重测定的第二个改良包括在用测试溶液平衡之前对固体支持物基质上的经标记适体进行预固定(称为“Catch-0”)。然后与结合的适体一起在它们自身的处理容器中进行用测试溶液的平衡。如本文中仅出于说明目的所描述，将生物素化的适体预固定在链霉亲和素珠基质上，并且与珠结合的适体一起进行用测试溶液的平衡。这个预固定步骤使得能够在适体相互作用趋势被减小的条件下进行固定，并且还使得能够在平衡之前进行非常严格的洗涤(用碱和用离液盐)，从而破坏相互作用适体并且通过非常强的生物素-链霉亲和素相互作用去除所有未结合的适体。这就减少了横贯所述测定的适体“簇”–即在一定的可检测频率下保留生物素部分或在测定中被生物素化的簇的数目。值得注意的是，辐照裂解适体的大部分但并非所有的可光裂解生物素部分，同时，一些适体经由意在“标记”蛋白质的NHS-生物素处理变得生物素化。在Catch-2步骤捕获的生物素化的适体通过与本体光裂解适体相互作用产生背景，然后在洗脱后被释放(图1)。还应注意，预固定形式将有可能支持非常高的多路复用能力，因为适体小组可以被单独地固定，然后以珠结合形式组合，因而避免了适体可能相互作用并且成簇的条件。
因而，预固定避免了在存在分析物溶液的情况下对适体吸附的需要，因而即使在测定分析物溶液的抑制浓度时也能确保定量固定。这使得能够使用高得多的浓度，高达且包括至少40％v/v血浆或血清，而不是如先前所述方法的10％最高浓度(Gold等,(2010年12月)PLoS One 5(12):e15005)或该方法的最近版本中所使用的5％最高浓度，从而使敏感性增加大约4到8倍，以及增加测定的总体稳健性。
如本文中所描述对整个方法的第三个改良包括在如下文详细描述的Catch-2步骤期间在中性pH值下使用离液盐进行洗脱。现有方法包括在高pH值(10)下使用氯化钠，这会破坏DNA杂交和适体/适体相互作用以及蛋白质/适体相互作用。如上文所指出，DNA杂交和适体/适体相互作用有助于测定背景。离液盐，包括但不限于高氯酸钠、氯化锂、氯化钠和氯化镁，在中性pH值下支持DNA杂交和适体/适体相互作用，同时破坏适体/蛋白质相互作用。净结果是显著减少(约10倍)的背景，伴随测定敏感性升高。
先前描述的多重适体测定的概述
用测试样品(例如，血浆)在溶液中平衡适体。在此期间，分析物与适体(特别是低解离速率适体)之间形成了长久有效(中值半衰期约30分钟)的复合物。然后将包含样品基质、适体、蛋白质分析物和适体/分析物复合物的平衡混合物暴露于固定在琼脂糖珠上的链霉亲和素(SA-琼脂糖)(在用生物素部分标记适体的情况下)。经由附加的生物素部分将混合物中的适体捕获在SA-琼脂糖上。注意，该测定依赖于此步骤的定量适体捕获。然后在温和条件下洗涤经过固定的适体，从而去除游离的和松散结合的蛋白质，但留下适体和适体/分析物复合物。这个步骤称为“Catch-1”，可以被认为是蛋白质纯化步骤。(参见例如，美国专利号7,947,447和7,855,054)。
然后用NHS-生物素处理携带适体和分析物/适体复合物的琼脂糖珠，将生物素“标签”留在适体结合的蛋白质分析物上。在进一步洗涤之后，经由裂解适体与生物素部分之间的不稳定接头(如以下实施例中仅出于说明目的所描述，使用在暴露于紫外光后裂解的光不稳定接头)，从琼脂糖珠释放适体(包括适体/生物素化的分析物复合物)。然后将所谓的光裂解洗脱物转移到携带磁性链霉亲和素珠的孔。优先吸附适体/生物素化的分析物复合物。这个捕获步骤称为“Catch-2”。(参见例如，美国专利号7,947,447和7,855)。在洗涤之后，用高pH值的氯化钠溶液洗脱现在通过分析物与珠结合的适体。然后通过与市售微阵列杂交对所回收的适体进行定量。所回收的适体量充当蛋白质浓度的替代物，正常情况下是借助于标准曲线来确定。
如上文所指出，已经观察到即使在不存在来自于测试样品的添加蛋白质的情况下也有大量适体横贯测定(即，穿过分隔步骤)且产生背景。这种与蛋白质无关的背景的来源可追溯到适体/适体相互作用，如图1中所说明。已经开发了若干种缓解策略来解决这个问题，这些策略描述于Gold等,(PLoS One(2010)5(12):e15005)中。最后，选择温甘油洗涤作为缓解这个问题的有效而又合适的策略。然而，降低水的介电常数的其它溶剂和试剂能够以类似方式减少测定背景。实例包括但不限于甘油、丙二醇、海藻糖、乙醇等。
通过适体的预吸附减轻捕获抑制
如上文所指出，确定了血清和血浆降低适体的捕获效率，从而限制浓度，这可以如图2和3中所说明地那样加以测量。
如图4中所说明，如本文中所描述的适体预固定和随后的平衡缓解了捕获抑制问题，且使得能够使用高得多的血浆浓度。具体地说，可以使用高达且包括至少40％v/v血浆或血清的浓度，而不是如Gold等,(PLoS One(2010年12月)5(12):e15005)中先前所描述的方法的10％最高浓度或最近版本中的5％最高浓度，从而使敏感性增加大约4至8倍，以及增加测定的总体稳健性。
参考图4可见，可以观察到信号线性增加一直到高达40％v/v血浆(比较用(□)标记的线(预固定形式)与用(○)标记的线(标准形式))。注意，针对Spuriomer观察的信号(蛋白质依赖性的背景的替代物，下面两个图)在标准形式中相当高，表明预固定可以减少蛋白质依赖性背景。
使用离液盐进行洗脱以减少测定背景和提高测定敏感性
如图5中所说明，使用离液盐进行洗脱既减少了测定背景又提高了测定敏感性。参考图5可见，在高氯酸盐洗脱的情况下，缓冲液中的测定背景显著减少(比较图5A中下面的曲线与图5B中下面的曲线)。测定背景已经下降到20-40RFU。对于IL-11，在高氯酸盐洗脱的情况下，表观内源水平也在一定程度上明显降低，表明蛋白质依赖性背景有所减少(大约0.2pM对1pM)。
下表总结了CAPSO/NaCl洗脱与高氯酸盐洗脱的比较结果(RFU)。在第1-6行中显示了各稀释组(第2列)中的所有SOMAmer在血浆存在下(对于5％SOMAmer，5％v/v血浆；对于0.316％SOMAmer，0.316％v/v血浆；和对于0.01％SOMAmer，0.01％血浆)的中值和平均信号；在第8行和第9行中显示了被称为Spuriomer(不具有同类分析物的电脑设计的SOMAmer)的所有SOMAmer在5％血浆存在下的中值和平均信号；及第10行显示了所有SOMAmer在所有稀释度下在仅存在缓冲液的情况下的中值和平均信号。
表1
Figure BDA0000662973340000171
表中所示的结果反映了图5中所描绘的结果。高氯酸盐洗脱产生了相当低的缓冲液信号，在血浆中产生了显著降低的Spuriomer信号，且在0.01％与0.316％混合物中产生了稍微降低的信号，其中信号明确来源于同类分析物。
经过8次重复实验测量在用高氯酸盐洗脱的情况下缓冲液信号的变异系数(CV’s)，从而可推断出将接近机器背景的信号指定为噪声，且因而可排除由这些极低背景表明实现了极低定量下限(LLOQ)。在本实验中，中值信号仅为32RFU，原始中值CV为6.2％(图6)。这些极低信号的稳定性不可能是限制LLOQ的因素。
测定性能的比较
对Gold等,(PLoS One(2010年12月)5(12):e15005)中所公开的方法的最近版本(在表2中称为“先前测定”)和本公开(表2中的版本3)进行比较。方案之间的高度相似性允许其中可以在单次机器运行中，实际上在相同滤板上，在最少人工干预的情况下运行两种测定方案的测试。测试包括用于测定变异性的8个重复血浆样品、8个缓冲液剂量响应孔和8个血浆加标孔。注意，版本3所使用的血浆浓度远远大于先前测定版本进行先前测定的血浆浓度(40％、1.3％和0.044％相对于5％、0.167％和0.0056％)。RFU空白和归一化为血浆浓度的RFU的结果汇总示于以下(表2)中。
表2
Figure BDA0000662973340000181
参考表2可见，如通过得自于Spuriomer和针对非人靶标的适体的信号所测定在版本3中原始背景信号减少约4倍，而如由得自于中等丰度和高丰度分析物的信号所测量原始分析物信号大约相同。注意，这些值是用40％血浆在版本3中获得，而早期测定版本使用5％血浆。如果将信号归一化为100％血浆(括号中的值)，则背景显著下降(约30倍)，而分析物信号下降约7倍。仅缓冲液的信号下降接近对数形式。注意，背景下降是有代价的—先前测定需要约15μL血浆，而版本3需要约60μL。这种升高的样品消耗对于大型动物样品(例如人)可能无关紧要，但在分析诸如小鼠的小型动物的纵向样品时就变成了一个因素。版本3中显示的本发明实施方案的总体加标回收率比早期测定版本高得多，如图7中所说明，本发明的中值运作为约80％，而先前测定仅为25％。这一改良大部分可归功于在平衡之前对适体进行固定。
图8和9描绘了先前测定(上面的图)和本文中所描述的方法(下面的图)的缓冲液的蛋白质滴定曲线(左图，下面的曲线)、血浆中的蛋白质加标(左图，上面的曲线)、血浆滴定(中图)和计算的内源水平(将血浆滴定定位到蛋白质标准曲线图，右图)的直接比较的两个实例。注意，将蛋白质在5％血浆(对于先前测定)和40％血浆中(对于本文中所描述的方法)中进行加标。图8中可见显示缓冲液剂量响应、血浆加标和测量的内源水平的典型比较曲线。经过改良的加标回收率的一个明确实例可见于图9中。
经过改良的多重适体测定
在一个实施方案中，提供了对靶分子和第一可释放标签具有高亲和力和特异性的适体。在一些实施方案中，适体是光适体。在另一个实施方案中，在测定中在Catch-1(如下文于段落[0082]中所定义)分隔之前的任何时间加入第一可释放标签。在一个实施方案中，这种第一可释放标签是可光裂解生物素。描述了其它标签和可裂解部分及含有所述标签和可裂解部分的适体。
在用测试样品平衡之前，在溶液中将包含对靶分子具有特异性亲和力的可释放第一标签的适体固定在固体支持物上。适体与固体支持物的连接是通过使第一固体支持物与适体接触并且允许适体上所包括的可释放第一标签直接或间接地与连接到第一固体支持物的适当第一捕获剂缔合来实现。用被缓冲到pH 11的溶液进行洗涤，以去除适体/适体聚集物，从而减少测定背景。这些步骤包括“Catch-0”。
然后制备测试样品(如实施例中所描述)并且与对其各自靶分子具有特异性亲和力的经过固定的适体接触。如果测试样品含有靶分子，则适体-靶标亲和复合物将与测试样品在混合物中形成。注意，除适体-靶标复合物以外，未复合的适体也将连接到第一固体支持物上。然后从混合物的其余部分分隔适体-靶标亲和复合物和已经与固体支持物缔合的未复合适体，从而去除测试样品(样品基质)中的游离靶标和所有其它未复合物质，即混合物中未与第一固体支持物缔合的组分。在分隔之后，使用适用于所采用的特定可释放第一标签的方法从第一固体支持物释放适体-靶标亲和复合物以及任何未复合适体。
在一个实施方案中，然后用可将第二标签引入到适体-靶标亲和复合物的靶分子组分的试剂来处理与固体支持物结合的适体-靶标亲和复合物。在一个实施方案中，靶标是蛋白质或肽，并且通过用NHS-PEO4-生物素处理靶标而将其生物素化。引入到靶分子中的第二标签可以与适体捕获标签相同或不同。如果第二标签与第一标签或适体捕获标签相同，则可能在这个标记步骤起始之前封闭第一固体支持物上的游离捕获位点。在该示例性实施方案中，在靶标标记起始之前用游离生物素洗涤第一固体支持物。标记方法，且确切地说，诸如肽和蛋白质的靶标的标记描述于美国专利号7,855,054中。在其它实施方案中，可以在Catch-2分隔起始之前，在测定中的任何其它点处对靶标进行标记。
Catch-1分隔是通过从第一固体支持物释放适体和适体-靶标亲和复合物来完成。在一个实施方案中，第一可释放标签为通过在可裂解≥90％第一可裂解标签的条件下用紫外灯辐照而裂解的可光裂解部分。在其它实施方案中，释放是通过适用于第一可释放标签中的选定可释放部分的方法来完成的。适体-靶标亲和复合物可以经过洗脱和收集以进一步用于测定，或可与另一种固体支持物接触以进行测定的其余步骤。
在一个实施方案中，可以任选地对混合物进行动力学挑战(kinetic challenge)。动力学挑战有助于减少适体与非靶标分子之间的任何非特异性结合。在一个实施方案中，将10mM硫酸葡聚糖加入到适体-靶标亲和复合物中，且将混合物孵育约15分钟。其它竞争物包括但不限于竞争物核酸。在另一个实施方案中，通过在10mM硫酸葡聚糖存在下进行Catch-1洗脱来引发动力学挑战。在其它实施方案中，在平衡结合步骤之后且在Catch-2分隔之前进行动力学挑战。在其它实施方案中，通过稀释进行动力学挑战。
在一个实施方案中，进行Catch-2分隔以去除游离适体。如上文所描述，在一个实施方案中，可以将用于Catch-2分隔的第二标签加入到靶标，同时适体-靶标亲和复合物仍与用于Catch-1分隔所用的固体支持物接触。在其它实施方案中，可以在Catch-2分隔起始之前，在测定中的另一个点将第二标签加入到靶标。使混合物与固体支持物接触，该固体支持物具有粘附于其表面的捕获元件(第二)，该捕获元件能够优选地以高亲和力和特异性结合靶标捕获标签(第二标签)，。在一个实施方案中，固体支持物为微量滴定板的孔内所含有的磁性珠(诸如DynaBeads MyOne Streptavidin C1)，且捕获元件(第二捕获元件)为链霉亲和素。磁性珠为分离经过分隔的混合物组分提供了便利的方法。混合物中所含有的适体-靶标亲和复合物从而通过靶标(第二)捕获标签与第二固体支持物上的第二捕获元件的结合相互作用而结合到固体支持物。然后将适体-靶标亲和复合物与混合物的其余部分分隔开，例如通过用缓冲溶液洗涤支持物，所述缓冲溶液包括包含有机溶剂的缓冲液，所述有机溶剂包括但不限于甘油。
然后用包含离液盐的缓冲液从适体-靶标复合物选择性地洗脱适体，所述离液盐包括但不限于高氯酸钠和氯化锂。此处理不洗脱凭借适体/适体相互作用保留在Catch-2珠上的适体。
在另一个实施方案中，通过任何合适的核酸检测方法，诸如例如DNA微阵列杂交、Q-PCR、质谱法、侵入测定(Invader assay)、下一代测序等，对由Catch-2分隔释放的适体进行检测并且任选地定量。以下更详细地描述了这些检测方法。
在一个实施方案中，参考样品可以是代表对照组的汇集生物样品。在另一个实施方案中，参考样品可以是获自个体的、在第一时间收集的生物样品，而测试样品可以获自同一个体但在第二时间收集，从而有助于通过测量和评估由该个体随时间推移提供的多个生物样品中的一种或多种靶分子的量或浓度的任何变化来对个体进行纵向研究。
本文中所描述的任何方法都可以用于对测试样品进行单分析物测试或多重分析。例如，任何多重分析都可以包括使用两种、数十种、数百种或数千种适体同时测定诸如生物样品的测试样品中的相等数目的靶分子。在这些实施方案中，向测试样品中引入多种适体，各适体识别并任选地交联于不同的分析物上，并且可以进行上述测定中的任一种。在释放适体之后，可以采用任何合适的多重核酸检测方法来测量已释放的不同的适体。在一个实施方案中，这可以通过与单独地排列在固体表面上的互补探针进行杂交来实现。在另一个实施方案中，可以使用质谱法基于分子量来检测不同的适体中的每一种。在另一个实施方案中，可以基于诸如，例如毛细管电泳中凝胶中的电泳迁移率或通过液相色谱法来检测不同的适体中的每一种。在另一个实施方案中，可以通过使用Q-PCR，使用独特PCR探针来定量不同的适体中的每一种。
在本文中所公开的各测定中，可以使用动力学挑战来增加测定的特异性和减少非特异性结合。在可以任选地用于本文中所描述的各测定中的一个实施方案中，可以通过将竞争物与测试样品一起预孵育或通过在平衡结合期间向混合物中加入竞争物来实现非特异性结合的额外减少。在一个实施方案中，将4μM Z-阻断竞争物寡核苷酸(5'-(ACZZ)7AC-3'，其中Z＝5-苄基-dUTP)与测试混合物一起预孵育约5分钟。
试剂盒
本公开的另一个方面涉及可用于方便地进行本文中所公开的任何方法以分析测试样品的试剂盒。为了增强所公开方法的多用性，试剂可以呈处于同一或单独容器中的包装组合的形式提供，使得试剂的比率能显著优化该方法和测定。试剂可以各自处于单独的容器中，或可将各种试剂组合在一个或多个容器中，这取决于试剂的交叉反应性和稳定性。
试剂盒包含呈包装组合形式的至少一种标记适体和一种或多种固体支持物，所述固体支持物各自包括至少一种捕获剂。试剂盒还可以包含洗涤溶液(诸如用于样品稀释以及阵列洗涤的缓冲水性介质)、样品制备试剂等等。试剂盒还可以含有可用于引入第二标签(一般通过对靶标进行修饰或衍生)的试剂。另外，试剂盒可以含有适合于在分析方法期间进行所需要的动力学挑战的试剂。试剂盒中的各种试剂的相对量可以广泛变化以提供能显著优化测定期间需要发生的反应的试剂浓度和进一步显著优化测定的敏感性。在适当的情形下，试剂盒中的一种或多种试剂可以呈包括赋形剂的干粉(通常冻干)形式提供，其在溶解后将提供具有适于进行根据本公开的方法或测定的浓度的试剂溶液。试剂盒还可以包括根据如本文中所描述的任何方法的书面方法说明。
在一个实施方案中，用于检测和/或定量测试样品中可能存在的一种或多种靶分子的试剂盒包括至少一种对靶分子具有特异性亲和力且包含标签的适体；和固体支持物，其中固体支持物包括至少一种置于其上的捕获剂，且其中捕获元件能够与适体上的标签缔合。
在另一个实施方案中，用于检测和/或定量测试样品中可能存在的一种或多种靶分子的试剂盒包括至少一种对靶分子具有特异性亲和力且包含标签和标记物的适体；和固体支持物，其中固体支持物包括至少一种置于其上的捕获剂，且其中捕获元件能够与适体上的标签缔合。
在另一个实施方案中，用于检测和/或定量测试样品中可能存在的一种或多种靶分子的试剂盒包括至少一种对靶分子具有特异性亲和力且包含可释放标签和标记物的适体；和固体支持物，其中固体支持物包括至少一种置于其上的捕获剂，且其中捕获元件能够与适体上的标签缔合。
另外，任何上述试剂盒都可以含有用于在试剂盒的检测方法期间进行动力学挑战的试剂和材料。
如本文中所使用，“Catch-1”是指对适体-靶标亲和复合物或适体-靶标共价复合物进行分隔。Catch-1的目的在于基本上去除所有未与适体缔合的测试样品组分。去除大多数所述组分将通过从用于Catch-2捕获的靶标标记步骤去除非靶标分子而通常提高靶标标记效率，并且可以导致测定背景降低。在一个实施方案中，在测定之前、在测定准备期间或在测定期间通过将标签附加于适体而将标签连接于适体。在一个实施方案中，标签是可释放标签。在一个实施方案中，可释放标签包含可裂解接头和标签。如上文所描述，经过标记的适体可以被捕获在固体支持物上，其中固体支持物包括适用于标签的捕获元件。然后可以在用测试样品平衡之前如本文中所描述洗涤固体支持物以去除任何不想要的材料(Catch-0)。
如本文中所使用，“Catch-2”是指基于靶分子的捕获对适体-靶标亲和复合物或适体-靶标共价复合物进行分隔。Catch-2步骤的目的在于在检测和任选定量之前从测试样品中去除游离的或未复合的适体。从样品中去除游离的适体允许通过任何合适的核酸检测技术来检测适体-靶标亲和力或适体-靶标共价复合物。当使用Q-PCR进行检测和任选的定量时，需要去除游离的适体以便对靶分子进行精确检测和定量。
在一个实施方案中，靶分子是蛋白质或肽，且使用可掺入蛋白质(和肽)和包括蛋白质(或肽)的复合物(举例来说，诸如适体-靶标亲和力(或共价)复合物)中的试剂将适体-靶标亲和力(或共价)复合物(和测试样品的其余物质)与游离的适体分隔开。经过标记的蛋白质(或肽)和适体-靶标亲和力(或共价)复合物可以固定在固体支持物上，从而使得能够将游离适体与蛋白质(或肽)和适体-靶标亲和力(或共价)复合物分隔开。所述标记可以包括例如能掺入蛋白质或肽中的生物素部分。
在一个实施方案中，在测定之前、在测定准备期间或在测定期间通过将标签化学连接于靶标而将Catch-2标签连接于蛋白质(或肽)。在一个实施方案中，Catch-2标签是可释放标签。在一个实施方案中，可释放标签包含可裂解接头和标签。然而，通常不必要从Catch-2固体支持物释放蛋白质(或肽)。如上文所描述，经过标记的靶标可以被捕获在第二固体支持物上，其中固体支持物包括适用于靶标标签的捕获元件。然后用各种缓冲溶液洗涤固体支持物，所述缓冲溶液包括包含有机溶剂的缓冲溶液、及包含盐和/或含盐清洁剂和/或清洁剂的缓冲溶液。
在洗涤第二固体支持物之后，然后对适体-靶标亲和复合物进行解离步骤，其中破坏复合物以产生游离适体，同时靶分子通过捕获元件与靶标捕获标签的结合相互作用而一般保持与固体支持物结合。可以通过破坏适体或靶标的结构的任何方法从适体-靶标亲和复合物释放适体。这可以通过在解离非共价结合的适体-靶标复合物的高盐缓冲液中洗涤支持物结合的适体-靶标亲和复合物来实现。收集并检测所洗脱的游离适体。在另一个实施方案中，使用高或低pH来破坏适体-靶标亲和复合物。在另一个实施方案中，使用高温来解离适体-靶标亲和复合物。在另一个实施方案中，可以使用任何上述方法的组合。在另一个实施方案中，使用对适体-靶标亲和复合物的蛋白质部分的蛋白水解消化来释放适体组分。
在适体-靶标共价复合物的情况下，使用适体构建体中的可裂解接头来实现释放适体以用于随后定量。在另一个实施方案中，靶标中的可裂解接头将引起适体-靶标共价复合物的释放。
如本文中所使用，“竞争物分子”和“竞争物”可互换用于指能与非靶分子形成非特异性复合物，例如以防止非靶标分子非特异性地再结合适体的任何分子。“竞争物分子”或“竞争物”是指一个以上这样的分子集合。竞争物分子包括寡核苷酸、聚阴离子(例如，肝素、鲱鱼精DNA、单链鲑鱼精DNA和葡聚糖(例如，硫酸葡聚糖))、非碱性磷酸二酯聚合物、dNTP和焦磷酸酯。在使用竞争物进行动力学挑战的情况下，竞争物也可以是能与游离的适体或蛋白质形成非特异性复合物，例如以防止适体或蛋白质非特异性地再结合非靶分子的任何分子。所述竞争物分子包括聚阴离子(例如，精胺、亚精胺、聚赖氨酸和聚精氨酸)和氨基酸(例如，精氨酸和赖氨酸)。当使用竞争物作为动力学挑战时，利用相对于样品中存在的总蛋白质或总适体的预期浓度来说相当高的浓度。在一个实施方案中，使用约10mM硫酸葡聚糖作为动力学挑战中的竞争物。在一个实施方案中，动力学挑战包括向含有适体-靶标亲和复合物的混合物中加入竞争物，和孵育含有适体-靶标亲和复合物的混合物持续大于或等于约30秒、约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约10分钟、约30分钟和约60分钟的时间。在另一个实施方案中，动力学挑战包括向含有适体-靶标亲和复合物的混合物中加入竞争物，和孵育含有适体-靶标亲和复合物的混合物持续一段时间，使得适体-靶标亲和复合物的测量水平与非特异性复合物的测量水平的比率有所增加。
在一些实施方案中，通过用结合缓冲液或不显著增加适体-靶标亲和复合物的自然解离速率的任何其它溶液稀释测试样品来进行动力学挑战。稀释度可以是约2倍、约3倍、约4倍、约5倍或任何合适的更大稀释度。更大的稀释度通过降低稀释后的总蛋白质和适体浓度且因此降低其再缔合率来提供更有效的动力学挑战。如果使用稀释来引入动力学挑战，则可以在进一步处理之前浓缩含有适体-靶标亲和复合物的后续测试样品混合物。如果适用，则该浓缩可以使用本文中关于任选地从测试样品分隔任何游离适体和/或任选地去除测试样品中可与标记剂反应的其它组分所描述的方法来实现。当使用稀释作为动力学挑战时，鉴于初始测试样品体积和在不发生复合物显著损失的情况下从最终(经过稀释的)体积中回收适体-靶标亲和复合物的合意性，选择稀释的量与实际一样高。在一个实施方案中，稀释适体-靶标亲和复合物，并且孵育混合物持续≥约30秒、≥约1分钟、≥约2分钟、≥约3分钟、≥约4分钟、≥约5分钟、≥约10分钟、≥约30分钟和≥约60分钟的时间。在另一个实施方案中，稀释适体-靶标亲和复合物，并且孵育含有适体-靶标亲和复合物的混合物持续一段时间，使得适体-靶标亲和复合物的测量水平与非特异性复合物的测量水平的比率有所增加。
在一些实施方案中，以同时实现样品稀释的作用和引入竞争物的作用的方式进行动力学挑战。举例来说，可以用较大体积的竞争物来稀释测试样品。组合这两种动力学挑战策略可以获得比使用一种策略可以实现的更有效的动力学挑战。在一个实施方案中，稀释度可以是约2倍、约3倍、约4倍、约5倍或任何合适的更大稀释度，且竞争物是约10mM硫酸葡聚糖。在一个实施方案中，动力学挑战包括稀释含有适体-靶标亲和复合物的混合物，向含有适体-靶标亲和复合物的混合物中加入竞争物，和孵育含有适体-靶标亲和复合物的混合物持续大于或等于约30秒、约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约10分钟、约30分钟和约60分钟的时间。在另一个实施方案中，动力学挑战包括稀释含有适体-靶标亲和复合物的混合物，向含有适体-靶标亲和复合物的混合物中加入竞争物，和孵育含有适体-靶标亲和复合物的混合物持续一段时间，使得适体-靶标亲和复合物的测量水平与非特异性复合物的测量水平的比率有所增加。
如本文中所公开，适体还可以包括“标签”，标签是指能提供用于将适体(和与其结合的任何靶分子)连接或固定于固体支持物的手段的组分。“标签”是能够与“捕获元件”缔合的部分。“标签”或“捕获元件”是指一个以上这样的组分集合。标签可以通过任何合适的方法连接于适体或包括在适体中。通常，标签允许适体直接或间接地与连接于固体支持物的捕获元件或受体缔合。捕获元件通常被选择(或设计)为在其与标签相互作用方面具有高特异性并且在后续处理步骤或程序期间保持该缔合。标签可以使得能够将适体-靶标亲和复合物(或共价适体-靶标亲和复合物)定位于固体支持物上的在空间上被限定的位置。因此，不同的标签可以使得能够将不同的适体-靶标共价复合物定位于固体支持物上的不同的在空间上被限定的位置。标签可以是多核苷酸、多肽、肽核酸、锁核酸、寡糖、多糖、抗体、亲和体、抗体模拟物、细胞受体、配体、脂质、生物素、聚组氨酸或这些结构的任何片段或衍生物、前述各项的任何组合，或捕获元件(或接头分子，如下文所述)可以经过设计或配置以便特异性结合或缔合的任何其它结构。总体上，标签经配置以使其不与自身或其所连接或作为一部分的适体发生分子内相互作用。如果使用SELEX来鉴别适体，则可以在SELEX前或SELEX后将标签加入到适体。在一个实施方案中，标签在SELEX后被包括在适体的5'端上。在另一个实施方案中，标签在SELEX后被包括在适体的3'端上。在另一个实施方案中，标签可以在SELEX后修饰过程中被包括在适体的3'和5'端上。在另一个实施方案中，标签可以是适体的内部片段。
在一个实施方案中，标签是生物素基团且捕获元件是生物素结合蛋白，诸如亲和素、链霉亲和素、中性亲和素(neutravidin)、外亲和素(Extravidin)或Traptavidin。这种组合可以方便地用于各种实施方案中，因为生物素容易在合成期间掺入适体中且链霉亲和素珠容易获得。
在一个实施方案中，标签是聚组氨酸且捕获元件是与诸如镍、钴、铁的金属离子或当与NTA螯合时能够与聚组氨酸形成配位化合物的任何其它金属离子螯合的次氮基三乙酸(NTA)。
在一个实施方案中，标签是经设计以直接与含有互补多核苷酸序列的捕获元件杂交的多核苷酸。在这种情况下，标签有时被称为“序列标签”且捕获元件一般被称为“探针”。在该实施方案中，一般在使得标签不与除该标签为其完全补体的探针以外的探针杂交的条件下配置标签和进行杂交反应。这就允许设计多重测定形式，因为各标签/探针组合可以具有独特序列。
在一些实施方案中，标签所包含是适体自身的一部分的核苷酸。举例来说，如果使用SELEX来鉴别适体，则适体一般包括通过根据适体而变化的核苷酸序列(即，可变区)与3'固定端隔开的5'固定端。在一个实施方案中，标签可以包含任何合适数目的核苷酸，所述核苷酸被包括在适体的固定端中，诸如例如整个固定端或固定端的任何部分，包括固定端内部的核苷酸。在另一个实施方案中，标签可以包含任何合适数目的核苷酸，所述核苷酸被包括在适体的可变区内，诸如例如整个可变区或可变区的任何部分。在另一个实施方案中，标签可以包含任何合适数目的核苷酸，所述核苷酸与可变区和固定端之一重叠，即标签可以包含有包括可变区的任何部分(包括全部)和固定端的任何部分(包括全部)的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，标签可以直接与探针缔合或与探针共价结合，从而将适体共价连接于固体支持物的表面。在本实施方案中，标签和探针可以包含合适的反应性基团，所述基团在标签与探针缔合后彼此足够邻近从而经历产生共价键的化学反应。该反应可以自发地发生，或可能需要激活，诸如光激活或化学激活。在一个实施方案中，标签包括二烯部分且探针包括二烯亲和物，且二烯与二烯亲和物的自发性狄尔斯阿尔德尔缀合反应(Diels-Alder conjugation reaction)导致共价键形成。可以使用任何适当的互补化学反应，诸如例如N-曼尼希反应(N-Mannich reaction)、二硫键形成、库尔提斯反应(Curtiusreaction)、醛醇缩合、希夫碱形成(Schiff base formation)和迈克尔加成(Michaeladdition)。
在另一个实施方案中，如下文进一步描述，标签诸如例如通过接头分子间接地与探针缔合。在本实施方案中，标签可以包括与接头分子的特定区域或组分互补的多核苷酸序列。一般配置标签并且进行杂交反应以使得标签不与除连接分子中所包括的多核苷酸序列以外的多核苷酸序列杂交。
如果标签包括多核苷酸，则多核苷酸可以包括任何合适数目的核苷酸。在一个实施方案中，标签包括至少约10个核苷酸。在另一个实施方案中，标签包括约10至约45个核苷酸。在另一个实施方案中，标签包括至少约30个核苷酸。不同的包括多核苷酸的标签可以包括相同数目的核苷酸或不同数目的核苷酸。
在一些实施方案中，标签组分是双官能的，因为它包括用于与固体支持物上的捕获元件或下文所定义的“探针”发生特异性相互作用的官能度(探针缔合组分)和用于从标签的探针缔合组分解离其所连接的分子的官能度。用于解离标签的探针缔合组分的手段包括化学手段、光化学手段或其它手段，取决于所采用的特定标签。
如本文中所使用，“捕获元件”、“探针”或“受体”是指经配置以直接或间接地与标签缔合的分子。“捕获元件”、“探针”或“受体”是能够通过直接或间接地与标签缔合将标签所连接的部分固定到固体支持物的数份一种分子类型或一种多分子结构类型的集合。“捕获元件”、“探针”或“受体”是指一个以上这样的分子集合。捕获元件、探针或受体可以是多核苷酸、多肽、肽核酸、锁核酸、寡糖、多糖、抗体、亲和体、抗体模拟物、细胞受体、配体、脂质、生物素、聚组氨酸或这些结构的任何片段或衍生物、前述各项的任何组合，或标签(或连接分子)可以经过设计或配置以便特异性结合或缔合的任何其它结构。捕获元件、探针或受体可以通过任何合适的方法共价或非共价地连接于固体支持物。
尽管术语“捕获元件”、“探针”或“受体”可互换使用，但探针一般是指多核苷酸序列。在一个实施方案中，探针包括具有与多核苷酸标签序列互补的序列的多核苷酸。在该实施方案中，一般在使得探针不与除该探针包括其互补序列的标签以外的核苷酸序列杂交的条件下配置探针序列和进行杂交反应(即，一般在使得探针不与不同的标签或适体杂交的条件下配置探针和进行杂交反应)。
在另一个实施方案中，探针例如通过接头分子间接地与标签缔合。在该实施方案中，探针可以包括与接头分子的特定区域或组分互补的多核苷酸序列。一般配置探针并且进行杂交反应以使得探针不与除接头分子中所包括的多核苷酸序列以外的多核苷酸序列杂交。
如果探针包括多核苷酸，则多核苷酸可以包括任何合适数目的核苷酸。在一个实施方案中，探针包括至少约10个核苷酸。在另一个实施方案中，探针包括约10至约45个核苷酸。在另一个实施方案中，探针包括至少约30个核苷酸。不同的包括多核苷酸的探针可以包括相同数目的核苷酸或不同数目的核苷酸。
在一些实施方案中，捕获探针是双官能的，因为它包括用于与多核苷酸标签发生特异性相互作用的官能度和用于从固体支持物解离探针的官能度，从而同时释放探针和适体。用于从固体支持物解离探针的手段包括化学手段、光化学手段或其它手段，取决于所采用的特定捕获探针。
由于特定标签和捕获元件配对之间的相互作用的相互性，可以使用一个实施方案中的标签作为另一个实施方案中的捕获元件，并且可以使用一个实施方案中的捕获元件作为另一个实施方案中的标签。举例来说，在一个实施方案中，可以用连接于固体支持物的链霉亲和素捕获具有生物素标签的适体，而在另一个实施方案中，可以用连接于固体支持物的生物素捕获具有链霉亲和素标签的适体。
如本文中所使用，接头是用于连接两个官能团或分子结构的分子结构。如本文中所使用，“间隔接头”或更简单地说，“间隔物”是指分隔或间隔适体内的两个不同的官能团的良性原子团。如本文中所使用，“可释放”或“可裂解”元件、部分或接头是指可以断裂以产生两个单独组分的分子结构。可释放(或可裂解)元件可以包含化学键能断裂的单一分子(在本文中称为“链内可裂解接头”)，或其可以包含非共价相互作用能被断裂或破坏的两个或更多个分子(在本文中称为“杂交接头”)。
在一些实施方案中，有必要在空间上分隔某些官能团与其它官能团以防止干扰个别官能度。举例来说，在可光裂解基团附近存在吸收某些波长的光的标记物可能干扰光裂解效率。因此，需要用例如能提供足以恢复全部光裂解活性的空间分隔的非干扰性部分来分隔所述基团。在一些实施方案中，已经用标记物和光裂解官能度将“间隔接头”引入到适体中。
在一个实施方案中，间隔接头是在合成期间被引入到适体中且因此可以包含一定数目的亚磷酰胺间隔物，包括但不限于长度为3、6、9、12和18个碳原子的脂肪族碳链、长度为1、3和9个乙二醇单元的聚乙二醇链，或四氢呋喃部分(称为dSpacer(Glenn Research))或前述各项的任何组合或可经设计或配置以增加沿磷酸二酯骨架方向上的长度的任何其它结构或化学组分。在另一个实施方案中，间隔接头包括多核苷酸，诸如聚dT、聚dA、聚dG或聚dC，或聚U、聚A、聚G或聚C，或前述各项的任何组合。在另一个实施方案中，间隔物包括一个或多个非碱性核糖或脱氧核糖部分。注意，设计所述序列以使得它们不干扰适体的结构或功能。
如本文中所使用，“杂交接头”是指包含两个或更多个分子的接头，其中可以通过化学或物理方法打断或破坏非共价相互作用。在一些实施方案中，使用杂交接头来接合适体与标签，从而形成可释放标签。举例来说，杂交接头可以用于所描述的任何测定中以便建立适体与生物素之间的可释放连接(例如，在亲和力测定和交联测定中)或适体与光交联基团之间的可释放连接(例如，在交联测定中)。
在一个实施方案中，杂交接头包含可杂交以形成非共价键的两个核酸。在一个实施方案中，形成杂连接的核酸之一可以是适体自身的一个区域，且另一个核酸可以是与此区域互补的核酸。释放可以通过用于破坏核酸双链体(同时仍维持与测定的相容性)的任何合适的机制来实现。在一个实施方案中，使用20mM NaOH来破坏双捕获光交联测定中的杂交接头。杂交接头分子可以具有任何合适的构型，并且可以包括任何合适的组分，包括以下各项中的一项或多项：多核苷酸、多肽、肽核酸、锁核酸、寡糖、多糖、抗体、亲和体、抗体模拟物或片段、受体、配体、脂质、这些结构的任何片段或衍生物、前述各项的任何组合，或可以经过设计或配置以形成可释放结构的任何其它结构或化学组分。
在一个实施方案中，可释放标签由至少一种由合适数目的核苷酸组成的多核苷酸组成。在一个实施方案中，接头分子的多核苷酸组分包括至少约10个核苷酸。在另一个实施方案中，接头分子的多核苷酸组分包括约10至约45个核苷酸。在另一个实施方案中，接头分子的多核苷酸组分包括至少约30个核苷酸。用于本文中所公开的任何方法的接头分子可以包括具有相同数目的核苷酸或不同数目的核苷酸的多核苷酸组分。
“固体支持物”是指具有分子可通过共价键或非共价键直接或间接地连接的表面的任何物质。固体支持物可以包括能够为连接于表面的捕获元件或探针提供物理支持的任何物质材料。该材料通常能够耐受进行测定期间所遇到的与捕获元件或探针连接到表面和任何后续处理、处置或加工相关的条件。该材料可以是天然存在的、合成的或天然存在的材料的修饰。合适的固体支持物材料可以包括独自或联合其它材料一起使用的硅、硅晶片芯片(silicon wafer chip)、石墨、镜面、层压物、膜、陶瓷、塑料(包括聚合物，诸如，例如聚(氯乙烯)、环烯烃共聚物、琼脂糖凝胶或珠、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(对苯二甲酸乙二酯)、聚四氟乙烯(PTFE或
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)、尼龙、聚(丁酸乙烯酯))、锗、砷化镓、金、银、朗缪尔-布劳杰特膜(LangmuirBlodgett films)、流过式芯片等。可以考虑其它刚性材料，诸如包括二氧化硅的玻璃，并且还包括例如可作为生物玻璃的玻璃。可以采用的其它材料包括多孔材料，诸如，例如受控孔隙玻璃珠、珠状交联
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或琼脂糖树脂，或交联双丙烯酰胺与氮杂内酯的共聚物。其它珠包括纳米颗粒、聚合物珠、固体核心珠、顺磁性珠或微珠。还涵盖本领域中已知的能够具有一个或多个例如掺入在其表面上的官能团(诸如氨基、羧基、硫醇或羟基官能团中的任一个)的任何其它材料。
用于固体支持物的材料可以呈从简单到复杂范围内的多种构型中的任一种。固体支持物可以具有许多形状中的任一种，包括条、板、盘、杆、颗粒、珠、管、孔(微量滴定法)等。固体支持物可以是多孔或非多孔的、磁性的、顺磁性或非磁性的、多分散或单分散的、亲水性或疏水性的。固体支持物还可以呈紧密包装的凝胶或浆液(如呈列矩阵形式)或松散包装颗粒的形式。
在一个实施方案中，将连接有捕获元件的固体支持物用于从测试混合物中捕获经过标记的适体-靶标亲和复合物或适体-靶标共价复合物。在一个特定实施例中，当标签为生物素部分时，固体支持物可以是经过链霉亲和素涂覆的珠或树脂，诸如Dynabeads M-280链霉亲和素、Dynabeads MyOne链霉亲和素、Dynabeads M-270链霉亲和素(Invitrogen)、链霉亲和素琼脂糖树脂(Pierce)、链霉亲和素超联树脂、MagnaBind链霉亲和素珠(ThermoFisher Scientific)、BioMag链霉亲和素、ProMag链霉亲和素、二氧化硅链霉亲和素(Bangs Laboratories)、高效链霉亲和素琼脂糖(Streptavidin Sepharose HighPerformance)(GE Healthcare)、链霉亲和素聚苯乙烯微球体(Microspheres-Nanospheres)、经过链霉亲和素涂覆的聚苯乙烯颗粒(Spherotech)或本领域技术人员常用于捕获生物素标记的分子的任何其它经过链霉亲和素涂覆的珠或树脂。
如上文所描述，本发明的一个目标为将蛋白质信号转换成适体信号。因此，所收集/检测的适体的量指示所结合的靶分子的量和样品中靶分子的量，且可能与所结合的靶分子的量和样品中靶分子的量成正比。可以在Catch-2分隔之后采用许多检测方案，而不从第二固体支持物上洗脱适体-靶标亲和力或适体-靶标共价复合物。除以下检测方法实施方案以外，本领域技术人员应已知其它检测方法。
许多检测方法需要在检测前将明确标签掺入适体中。在这些实施方案中，可以在合成期间或合成后使用核酸合成标准技术将诸如例如荧光或化学发光染料的标记物掺入适体中。可以在合成期间或合成后使用标准酶反应与适当的试剂一起掺入放射性标记物。标记还可以在Catch-2分隔和通过使用合适的酶促技术进行洗脱之后发生。举例来说，使用具有上述标记物的引物，PCR将标记物掺入到所洗脱的适体的扩增产物中。当使用凝胶技术进行定量时，也可以使用PCR掺入不同尺寸的质量标记物。这些质量标记物还可以掺入不同的荧光或化学发光染料以获得额外的多路复用能力。可以通过使用在合成期间或合成后掺入适体中的特异性标签和之后加入能与标签缔合且携带标记物的探针而将标记物间接地加入到适体。标记物包括上文描述的那些标记物以及标准测定中用于例如比色读数的酶。这些酶与酶底物组合起作用，且包括诸如例如辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)的酶。标记物还可以包括为用于电化学检测的电化学官能团的材料或化合物。
举例来说，可以在接触测试样品之前用诸如32P的放射性同位素如上文所描述来标记适体。采用如上文所讨论的四种基本测定及其变型中的任一种，可以通过在测定结束时对第二固体支持物进行放射性定量而简单地实现适体检测。放射性计数将与原始测试样品中靶标的量成正比。类似地，在接触测试样品之前如上文所描述用荧光染料标记适体允许对第二固体支持物直接进行简单的荧光读数。化学发光标记物或量子点可以类似地用于从第二固体支持物直接读数，而不需要进行适体洗脱。
通过从第二固体支持物洗脱适体或释放光适体-靶标共价复合物，除上述那些方案以外，还可以采用其它检测方案。举例来说，所释放的适体、光适体或光适体-靶标共价复合物可以在PAGE胶上跑胶，并且用诸如SYBR Gold的核酸染色剂进行检测且任选地定量。或者，所释放的适体、光适体或光适体共价复合物可以使用毛细管凝胶电泳(CGE)，使用如上文所述的掺入适体中的荧光标记物来进行检测和定量。另一个检测方案采用定量PCR，使用例如SYBR Green来检测和定量所洗脱的适体。或者，可以采用
Figure BDA0000662973340000341
DNA测定来检测和定量所洗脱的适体。另一种替代检测方案采用下一代测序。
在另一个实施方案中，在复制过程中使用“分子信标”来测定适体-靶标亲和复合物(或适体-靶标共价复合物)的量或浓度(参见例如Tyagi等,Nat.Biotech.16:4953,1998；美国专利号5,925,517)。分子信标是折叠成发夹环并且在发夹结构的一端上含有荧光团且在发夹结构的另一端上含有淬灭基团，使得当形成发夹时荧光团几乎不产生或不产生信号的特异性核酸探针。环序列对靶多核苷酸序列具有特异性，且在与适体序列杂交后，发夹展开并且从而产生荧光信号。
关于仍与第二固体支持物结合的少量适体的多重检测，可采用具有不同的激发/发射光谱的荧光染料来检测并定量两个或三个或五个或多达十个单独适体。类似地，可以采用不同尺寸的量子点用于多重读出。可以在从第二固体支持物分隔游离适体之后引入量子点。通过使用连接于独特量子点的适体特异性杂交序列，可以对2、3、5和多达10个适体进行多重读数。用诸如32P、125I、3H、13C和35S的可以单独检测的不同的放射性同位素标记不同的抗体也可以用于进行受限多重读出。
为了对从Catch-2第二固体支持物释放的适体进行多重检测，可以将如上文所描述掺入各适体中的单一荧光染料用于允许鉴别适体序列以及定量适体水平的定量方法。方法包括但不限于DNA芯片杂交、微珠杂交、下一代测序和CGE分析。
在一个实施方案中，使用标准DNA杂交阵列或芯片来使各适体或光适体与固定在载片或芯片上的独特或一系列独特探针杂交，诸如Agilent阵列、Illumina BeadChip阵列、NimbleGen阵列或定制印刷阵列。各独特探针与适体上的序列互补。互补序列可以是掺入适体中的独特杂交标签，或适体序列的一部分，或整个适体序列。将从Catch-2固体支持物释放的适体加入到适当的杂交缓冲液中，且使用标准杂交方法进行处理。举例来说，在约60℃下将适体溶液与DNA杂交阵列一起孵育12小时，以确保杂交严格度。洗涤阵列，然后在荧光载片扫描仪中进行扫描，从而产生就阵列各特征的适体杂交强度的图像。图像分段和定量是使用诸如ArrayVision的图像处理软件来实现的。在一个实施方案中，多重适体测定可以使用多达25种适体、多达50种适体、多达100种适体、多达200种适体、多达500种适体、多达1000种适体和多达10,000种适体进行检测。
在一个实施方案中，将如上文所描述的具有与适体互补的独特DNA探针的可寻址微珠用于杂交。微珠可以用独特荧光染料(诸如Luminex珠技术)或使用条形码标记(如在Illumina VeraCode技术中)或激光驱动应答器来寻址。在一个实施方案中，将从Catch-2固体支持物释放的适体加入到适当的杂交缓冲液中，且使用标准微珠杂交方法进行处理。举例来说，在约60℃下将适体溶液与一组微珠一起孵育两小时，以确保杂交严格度。然后在Luminex仪器上处理溶液，该仪器对个别珠类型进行计数且对适体荧光信号进行定量。在另一个实施方案中，使VeraCode珠与适体溶液接触且在约60℃下杂交两小时，然后沉积在栅格化表面上并且使用用于鉴定和荧光定量的载片扫描仪进行扫描。在另一个实施方案中，将应答器微珠与适体样品一起在约60℃下孵育，然后使用适用于应答器微珠的装置进行定量。在一个实施方案中，多重适体测定可以通过与微珠杂交，使用多达25种适体、多达50种适体、多达100种适体、多达200种适体和多达500种适体对多重适体测定进行检测。
可以处理含有所洗脱的适体的样品以掺入如上文所述的独特质量标签以及荧光标记物。然后将经过质量标记的适体注入CGE仪器(实质上为DNA测序器)中，且通过其独特质量鉴别适体并且使用来自于标记反应期间所掺入的染料的荧光进行定量。AltheaTechnologies已经开发出了该技术的一个示例性实例。
在上文所描述的许多种方法中，可以在定量之前扩增适体溶液并且任选地标记。标准PCR扩增可以用于从Catch-2固体支持物洗脱的适体溶液。所述扩增可以在DNA阵列杂交、微珠杂交和CGE读出之前使用。
在另一个实施方案中，使用Q-PCR对适体-靶标亲和复合物(或适体-靶标共价复合物)进行检测和/或定量。如本文中所使用，“Q-PCR”是指以测定结果是定量结果(即，测定能够对测试样品中所存在的适体的量或浓度进行定量)的方式且在这样的控制条件下进行的PCR反应。
在一个实施方案中，使用
Figure BDA0000662973340000361
PCR来测定测试样品中的适体-靶标亲和复合物(或适体-靶标共价复合物)的量或浓度。该技术一般依赖于从靶序列产生信号的寡核苷酸复制酶的5'-3'核酸外切酶活性。TaqMan探针是基于欲定量的适体的序列加以选择的，且通常包括5'端荧光团(诸如6-羧基荧光素)和3'端淬灭基团(诸如，例如6-羧基四甲基荧光素)以便在使用聚合酶链式反应(PCR)扩增适体序列时产生信号。因为聚合酶拷贝适体序列，所以核酸外切酶活性能从探针释放荧光团，所述探针在PCR引物下游退火，从而产生信号。该信号在产生复制产物时增加。PCR产物的量取决于所进行的复制循环数以及适体的起始浓度。
在另一个实施方案中，在复制过程期间使用插入的荧光染料来测定适体-靶标亲和复合物(或适体-靶标共价复合物)的量或浓度。与在单链DNA存在下产生的荧光信号相比，插入的染料(诸如例如
Figure BDA0000662973340000362
green)在双链DNA存在下产生了较大荧光信号。由于在PCR期间形成了双链DNA产物，所以由染料产生的信号增加。所产生的信号的强度取决于PCR循环数和适体的起始浓度。
在另一个实施方案中，使用质谱法对适体-靶标亲和复合物(或适体-靶标共价复合物)进行检测和/或定量。可以使用上文所描述的酶促技术来引入独特质量标签。对于质谱法读出来说，不需要检测标记物，而是基于质谱法分析期间产生的位置和质量峰下面积，使用质量本身来进行鉴别和使用本领域技术人员常用的技术进行定量。使用质谱法的一个实例是由Sequenom开发的
Figure BDA0000662973340000363
系统。
可以使用计算机程序来进行本文中所公开的任何方法的一个或多个步骤。本公开的另一个方面是一种包括上面存储有计算机程序的计算机可读取存储介质的计算机程序产品，其在加载到计算机中时执行或辅助执行本文中所公开的任何方法。
本公开的一个方面是本文中所公开的任何方法的产物，即测定结果，其可以在测试场所加以评估，或可以将它运到另一个场所以便评估和在需要时传递给远程位置的相关方。如本文中所使用，“远程位置”是指物理上不同于获得结果的位置的位置。因此，可以将结果发送到不同的房间、不同的建筑、城市的不同部分、不同的城市等。可以通过任何手段传输数据，诸如，例如传真、邮件、隔夜送达、电子邮件、ftp、语音邮件等。
“传递”信息是指代表该信息的数据作为电子信号经过合适传递渠道(例如，私人网络或公共网络)的传输。“转发”物品是指不论是通过物理输送物品还是其它方式(在可能的情况下)使该物品从一个位置到下一个位置的任何手段，并且包括，至少在数据的情况下，物理输送携带数据的介质或传递数据。
实施例
提供以下实施例只是为了说明的目的而非意欲限制如所附权利要求书中所限定的本公开的范围。
上文参考各种实施方案和实施例描述了本公开。特定实施方案、实施例或者特定实施方案或实施例的要素不应被视为任一项权利要求的重要、需要或必需的要素或特征。
应了解，可以在不背离如以下权利要求书中所阐述的本公开的范围的情况下对所公开的实施方案进行各种修改或替代。包括附图和实施例的本说明书应被视为说明性的而不是限制性的，并且希望所有所述修改和替代都包括在本公开的范围内。因此，本公开的范围可以由所附权利要求书及其法律等效物来确定而不是由实施例来确定。举例来说，任何方法或工艺权利要求中所述的步骤可以按任何可行的顺序执行，并且不限于实施方案、实施例或权利要求书中的任一者中所提供的顺序。
蛋白质组亲和力测定
Catch-0
将133μL含7.5％链霉亲和素-琼脂糖浆液的1×SB17,Tw(40mM HEPES、102mMNaCl、1mM EDTA、5mM MgCl2、5mM KCl、0.05％Tween-20)加入到过滤板(0.45μm MilliporeHV板(Durapore，目录号MAHVN4550))的诸多孔中。将适当的1.1×适体混合物(所有适体都在5'端上含有Cy3荧光团和可光裂解生物素部分)解冻，随后涡旋。然后使1.1×适体混合物沸腾10分钟，涡旋30秒，并且在水浴中冷却到20℃维持20分钟。然后通过离心(1000×g，1分钟)去除含有链霉亲和素琼脂糖浆液的过滤板中的液体。将100μL适体混合物加入到过滤板的诸多孔中(通过机器)。在25℃下，在设定在850rpm的振荡器上将混合物避光孵育20分钟。
Catch-0洗涤
继20分钟孵育之后，经由真空过滤去除溶液。加入190μL1×CAPS适体预洗缓冲液(50mM CAPS、1mM EDTA、0.05％Tw-20，pH 11.0)并且在振荡的同时将混合物孵育1分钟。然后经由真空过滤去除CAPS洗涤溶液。然后将CAPS洗涤重复一次。加入190μL1×SX17,Tw并且在在振荡的同时将混合物孵育1分钟。然后经由真空过滤去除1×SB17,Tw。再加入190μL 1×SX17,Tw，并且在振荡的同时将混合物孵育1分钟。然后通过离心(1分钟，1000×g)去除1×SB17,Tw。在去除1×SB17,Tw之后，加入150μL Catch-0贮存缓冲液(150mM NaCl、40mMHEPES、1mM EDTA、0.02％叠氮化钠、0.05％Tween-20)，并且仅在板周边小心地密封过滤板，且在4℃下在暗处贮存直到使用。
样品制备
将75μL 40％样品稀释液在40％样品板中(最终40％样品含有：20μM Z-block、1mM苯甲脒、1mM EGTA、40mM HEPES、5mM MgCl2、5mM KCl、1％Tween-20)常规板出(platedout)。将195μL1×SB17,Tw在1％样品板中常规板出。将90μL 1×SB17,Tw在1：10稀释板中常规板出。将133μL 1×SB17,Tw在0.005％样品板中常规板出。在机架式解冻站(RackThawing Station)上在25℃孵育箱中将样品解冻10分钟，然后涡旋，并且在1000×g下自旋1分钟。取掉管子的盖子。混合样品(5次，50μL)，并且将50μL 100％样品转移到含有样品稀释液的40％样品板。然后在样品板上通过上下吸移对40％样品进行混合(110μL，10次)。然后将5μL 40％样品转移到含有1×SB17,Tw的1％样品板。再次通过上下吸移对该样品进行混合(120μL，10次)。在混合之后，将10μL 1％样品转移到含有1×SB17,Tw的1：10稀释板，通过上下吸移对所述样品进行混合(75μL，10次)。从1：10稀释板将7μL 0.1％样品转移到含有1×SB17,Tw的0.005％样品板中，并且通过上下吸移进行混合(110μL，10次)。
平衡之前的板准备
经由真空过滤从过滤板中去除Catch-0贮存溶液。然后加入190μL 1×SB17,Tw，随后经由真空过滤将其从过滤板中去除。然后再向过滤板中加入190μL 1×SB17,Tw。
平衡
通过离心(1分钟，1000×g)从过滤板中去除1×SB17,Tw缓冲液。将100μL适当的样品稀释物加入到过滤板(三个过滤板，各自针对40％、1％或0.005％的各样品稀释度)。仅在板周边小心地密封过滤板，从而避免对孔加压。压力将会在平衡期间造成泄露。然后在28℃下，在设定在850rpm的恒温振荡器上将板避光孵育3.5小时。
过滤板处理
在平衡之后，将过滤板放到真空歧管上并且通过真空过滤去除样品。加入190μL生物素洗涤液(含100μM生物素的1×SB17,Tw)，并且通过真空过滤去除液体。然后用190μL 1×SB17,Tw将样品洗涤5次(真空过滤)。加入100μL含1mM NHS-生物素的1×SB17,Tw(新制)且在吸附垫上将过滤板吸干，并且在振荡下将混合物孵育5分钟。通过真空过滤去除液体。加入125μL含20mM甘氨酸的1×SB17,Tw，并且通过真空过滤去除液体。再次加入125μL含20mM甘氨酸的1×SB17,Tw，并且通过真空过滤去除液体。随后用190μL 1×SB17,Tw将样品洗涤6次，通过真空过滤去除液体。然后向各过滤板中加入85μL光裂解缓冲液(含2μM Z-block的1×SB17,Tw)。
光裂解
在吸附垫上将过滤板吸干，并且在振荡(800rpm，25℃)下用BlackRay紫外灯辐照6分钟。将板旋转180度，并且在BlackRay光源下再辐照6分钟。将40％过滤板放到空的96孔板上。将1％过滤板堆叠在40％过滤板顶部，并且将0.005％过滤板堆叠在1％过滤板顶部。使板组合件以1000×g自旋1分钟。将含有所洗脱的样品的96孔板放到机器平台上。将含60％甘油的1×SB17,Tw从37℃孵育箱中放到机器平台上。
Catch-2
在测定设定期间，将50μL 10mg/mL MyOne SA珠(500μg)加入到ABgene Omni-tube96孔板以便进行Catch-2，并且放在Cytomat下。使Catch-296孔珠板悬浮90秒，放在磁铁块上60秒，并且去除上清液。将所有Catch-1洗脱液转移到Catch-2珠板，并且在Peltier恒温振荡器上孵育(1350rpm，5分钟，25℃)。将板转移到25℃磁铁上维持2分钟，并且去除上清液。接下来，加入75μL 1×SB17,Tw，并且在Peltier振荡器上在37℃下以1350rpm孵育样品1分钟。然后加入75μL含60％甘油的1×SB17,Tw(加热到37℃)，并且再次在Peltier振荡器上在37℃下以1350rpm孵育样品1分钟。将板转移到已经加热到37℃的磁铁，并且孵育2分钟，随后去除上清液。将这个37℃1×SB17,Tw和甘油洗涤循环重复两次。然后在Peltier振荡器上(1350rpm，1分钟，25℃)用150μL 1×SB17,Tw洗涤样品以去除残余甘油，随后在25℃磁铁块上洗涤1分钟。去除上清液且加入150μL经0.5M NaCl取代的1×SB17,Tw，并且在1350rpm下孵育1分钟(25℃)，随后在25℃磁铁块上孵育1分钟。去除上清液且加入75μL高氯酸盐洗脱缓冲液(1.8M NaClO4、40mM PIPES、1mM EDTA、0.05％Triton X-100，1×杂交对照，pH＝6.8)，随后在Peltier振荡器上孵育10分钟(25℃，1350rpm)。之后，将板转移到磁性分离器且孵育90秒，并且回收上清液。
杂交
通过机器向空的96孔板中加入20μL洗脱的样品。通过机器向洗脱的样品中加入5μL含有第二组杂交对照的10×Agilent阻断缓冲液。然后将25μL 2×Agilent HiRPM杂交缓冲液手动加入到各孔。将40μL杂交混合物装载到Agilent垫片式载片上。将Agilent 8×15k阵列加入到垫片式载片上，并且用夹钳拧紧夹层结构。然后在55℃下边旋转(20rpm)边孵育夹层结构，持续19小时。
杂交后洗涤
在Little Dipper Processor(SciGene，目录号1080-40-1)上进行杂交后载片处理。将大约750mL洗涤缓冲液1(Oligo aCGH/ChIP-on-chip洗涤缓冲液1，AgilentTechnologies)放到一个玻璃染色皿中。将大约750mL洗涤缓冲液1(Oligo aCGH/ChIP-on-chip洗涤缓冲液1，Agilent Technologies)放到Little Dipper Processor的1号浴液中。将加热至37℃的大约750mL洗涤缓冲液2(Oligo aCGH/ChIP-on-chip洗涤缓冲液1，AgilentTechnologies)放到Little Dipper Processor的2号浴液中。将浴液的磁性搅拌速度设定为5。针对1号浴液的温度控制器并未开启，而针对2号浴液的温度控制器被设定为37℃。按顺序将多达12个载片/垫片组合件拆分到含有洗涤缓冲液1的第一染色皿中，并且将载片放到载片架上，同时仍浸在洗涤缓冲液1中。在所有载片/垫片组合件都被拆分后，将载片架快速转移到Little Dipper Processor的1号浴液，并且开始自动洗涤方案。Little DipperProcessor在1号浴液中以250的速度将载片孵育300秒，随后转移到含有Agilent Wash 2(Oligo aCGH/ChIP-on-chip洗涤缓冲液2，Agilent Technologies)的37℃2号浴液，并且在100的速度下孵育300秒。之后，Little Dipper Processor将载片架转移到内设离心机，在此使载片以速度690自旋300秒。
微阵列成像
用微阵列扫描仪(Agilent G2565CA微阵列扫描仪系统，Agilent Technologies)在Cy3通道中在100％PMT设定下以5μm分辨率对微阵列载片进行成像，且在0.05下激活XRD选项。使用Agilent特征提取软件10.7.3.1版，利用GE1_107_Sep09方案处理所得tiff格式图像。

Claims (44)

1.一种方法，其包括：
将适体暴露于第一固体支持物，其中所述适体包含第一标签且所述第一固体支持物包含第一捕获元件，且其中所述第一标签对所述第一捕获元件具有亲和力，
允许所述第一标签与所述第一捕获元件缔合；
用一种或多种解离聚集的适体的溶液来洗涤所述第一固体支持物；
使所述适体与测试样品接触，其中如果所述测试样品中存在靶分子，则形成适体-靶标亲和复合物；
去除未与所述第一固体支持物缔合的一种或多种组分；
将第二标签连接到所述适体-靶标亲和复合物中的所述靶分子，其中所述第二标签对第二捕获元件具有亲和力；
从所述第一固体支持物释放所述适体-靶标亲和复合物；
将所述释放的适体-靶标亲和复合物暴露于包含所述第二捕获元件的第二固体支持物，并且允许所述第二标签与所述第二捕获元件缔合；
去除未与所述第二固体支持物缔合的一种或多种组分；和
用一种或多种包含离液盐的缓冲溶液从所述第二固体支持物洗脱所述适体。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种缓冲溶液的pH是中性的。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述缓冲溶液中的一种或多种包含有机溶剂。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述有机溶剂是甘油。
5.一种方法，其包括：
使被固定于第一固体支持物上并且经一种或多种溶液洗涤的适体与测试样品接触，所述一种或多种溶液解离聚集的适体，其中如果所述测试样品中存在靶分子，则形成适体-靶标亲和复合物，且其中所述第一固体支持物包含第一捕获元件且其中所述适体包含对所述第一捕获元件具有亲和力的第一标签；
去除未与所述第一固体支持物缔合的一种或多种组分；
将第二标签连接到所述适体-靶标亲和复合物中的所述靶分子，其中所述第二标签对第二捕获元件具有亲和力；
从所述第一固体支持物释放所述适体-靶标亲和复合物；
将所述释放的适体-靶标亲和复合物暴露于包含所述第二捕获元件的第二固体支持物，并且允许所述第二标签与所述第二捕获元件缔合；
去除未与所述第二固体支持物缔合的一种或多种组分；和
用一种或多种包含离液盐的溶液从所述第二固体支持物洗脱所述适体。
6.如权利要求1或5所述的方法，其还包括检测所述适体-靶标亲和复合物的所述适体部分的步骤。
7.如权利要求1或5所述的方法，其还包括定量所述适体。
8.如权利要求1或5所述的方法，其还包括通过使所述适体与第三固体支持物杂交来检测所述适体，其中所述第三固体支持物包括多个可寻址特征且其中至少一个所述特征包括至少置于其上的与所述适体内所含有的任何序列互补的捕获元件。
9.如权利要求8所述的方法，其中使用选自Q-PCR、MS、下一代测序和杂交的方法检测并且任选地定量所述适体。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述Q-PCR是在PCR方法期间使用插入荧光染料或在PCR方法期间使用分子信标来进行。
11.如权利要求1或5所述的方法，其中所述一种或多种溶液的pH为约11。
12.如权利要求1或5所述的方法，其中所述离液盐破坏适体-靶标相互作用。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述离液盐选自高氯酸钠、氯化锂、氯化镁和氯化钠。
14.如权利要求1或5所述的方法，其中所述适体是单链核酸或双链核酸。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述适体包含DNA、RNA或DNA与RNA两者。
16.如权利要求1或5所述的方法，其中所述适体-靶标亲和复合物具有慢解离速率。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述适体-靶标亲和复合物的解离速率t1/2是≥30分钟。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述适体-靶标亲和复合物的解离速率t1/2是≥60分钟。
19.如权利要求16所述的方法，其中所述适体-靶标亲和复合物的解离速率t1/2是≥90分钟。
20.如权利要求16所述的方法，其中所述适体-靶标亲和复合物的解离速率t1/2是≥120分钟。
21.如权利要求16所述的方法，其中所述适体-靶标亲和复合物的解离速率t1/2是≥150分钟。
22.如权利要求16所述的方法，其中所述适体-靶标亲和复合物的解离速率t1/2是≥180分钟。
23.如权利要求16所述的方法，其中所述适体-靶标亲和复合物的解离速率t1/2是≥210分钟。
24.如权利要求16所述的方法，其中所述适体-靶标亲和复合物的解离速率t1/2是≥240分钟。
25.如权利要求1或5所述的方法，其中所述适体包含可检测部分，所述可检测部分选自染料、量子点、放射性标记物、电化学官能团和酶加可检测酶底物。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述染料是荧光染料。
27.如权利要求1或5所述的方法，其中所述适体包含至少一种C-5经修饰的核苷酸。
28.如权利要求1或5所述的方法，其中所述适体包含至少一种化学修饰，所述化学修饰包括在一个或多个独立地选自核糖位置、脱氧核糖位置、磷酸位置和碱基位置的位置上的化学取代。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述化学修饰独立地选自2'-位糖修饰、2'-氨基(2'-NH2)、2'-氟(2'-F)、2'-O-甲基(2'-OMe)、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、胞嘧啶环外胺上的修饰、5-溴尿嘧啶的取代、5-溴脱氧尿苷的取代、5-溴脱氧胞苷的取代、主链修饰、甲基化、3'帽和5'帽。
30.如权利要求1或5所述的方法，其中所述靶分子选自蛋白质、肽、碳水化合物、激素、病毒、过渡态类似物、和受控物质。
31.如权利要求1或5所述的方法，其中所述靶分子选自底物、代谢物、受体、辅因子、抑制剂、染料、营养物、药物和生长因子。
32.如权利要求1或5所述的方法，其中所述靶分子选自抗原和抗体。
33.如权利要求1或5所述的方法，其中所述靶分子选自多糖和糖蛋白。
34.如权利要求1或5所述的方法，其中所述测试样品选自全血、白细胞、外周血单核细胞、血浆、血清、痰液、呼气、尿液、精液、唾液、脑膜液、羊水、淋巴液、乳头抽吸液、支气管抽吸液、滑液、关节抽吸液、细胞提取物、粪便、组织提取物和脑脊髓液。
35.如权利要求1或5所述的方法，其中所述测试样品选自血液、腺液、细胞和组织。
36.如权利要求1或5所述的方法，其中所述测试样品是组织活检。
37.如权利要求1或5所述的方法，其中所述第一标签和所述第二标签各自包含至少一种独立地选自以下的组分：多核苷酸、多肽、肽核酸、锁核酸、寡糖、多糖、抗体、亲和体、抗体模拟物、细胞受体、配体、脂质、生物素、亲和素、金属和组氨酸。
38.如权利要求1或5所述的方法，其中所述第一标签和所述第二标签各自包含至少一种独立地选自以下的组分：链霉亲和素和Traptavidin。
39.如权利要求1或5所述的方法，其中所述第一捕获元件和所述第二捕获元件各自包含至少一种独立地选自以下的组分：多核苷酸、多肽、肽核酸、锁核酸、寡糖、多糖、抗体、亲和体、抗体模拟物、细胞受体、配体、脂质、生物素、亲和素、金属和组氨酸。
40.如权利要求1或5所述的方法，其中所述第一捕获元件和所述第二捕获元件各自包含至少一种独立地选自以下的组分：链霉亲和素和Traptavidin。
41.如权利要求1或5所述的方法，其中所述第一标签包含可释放部分。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述可释放部分包含可光裂解部分。
43.如权利要求1或5所述的方法，其中所述第一固体支持物和第二固体支持物各自独立地选自聚合物珠、固体核心珠、多孔珠、顺磁性珠、受控孔隙珠、微量滴定孔、环烯烃共聚物基板、膜、塑料基板、尼龙、玻璃、锗基板、硅基板、硅晶片芯片、流过式芯片、微珠、纳米颗粒、聚四氟乙烯基板、聚苯乙烯基板、砷化镓基板、金基板和银基板。
44.如权利要求1或5所述的方法，其中所述第一固体支持物和第二固体支持物各自独立地选自琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、丙烯酰胺珠、玻璃珠和朗缪尔-布劳杰特膜。
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