KR20220167781A - 압타머를 이용하여 시료의 표적 단백질 분자 집단에 대한 프로파일을 얻는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 압타머를 이용하여 시료의 표적 단백질 분자 집단에 대한 프로파일을 얻는 방법을 개시한다. 본 발명의 방법은 시료 중의 표적 단백질 분자 집단이 미지의 표적 단백질 분자를 포함하여 압타머 프로파일로 제공될 수 있으며, 이러한 압타머 프로파일은 약물 처방의 적합성 여부 판단(예컨대 항암제 동반진단 등), 질병 진단 정보 제공, 약물 치료의 모니터링, 약물 순응도 판단, 약물 처리에 대한 In vitro 상에서의 세포 반응 여부나 정도, 생물종의 분류나 동정 등 인간에게 유용한 정보를 제공하는데 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 압타머를 이용하여 시료의 표적 단백질 분자 집단에 대한 프로파일을 얻는 방법에 관한 것이다.
시료를 구성하는 단백질 등 생체분자 양적인 상태를 종합화한 전체적인 정보인 프로파일(profile)을 생산하는 기술은 물리학, 생화학, 생물정보학 등의 발달로 다양하게 개발되어 왔으나, 비용, 정확도, 민감도, 프로파일의 크기 등에 있어 여전히 새로운 기술의 필요성이 요구된다.
핵산 칩에 대응하는 기존 단백질 칩은 좁은 면적의 마이크로어레이에 항체를 고정한 것으로 그 집적도에 한계에 있어, 25,000개 이상의 유전자의 상대적 발현 수준을 프로파일링할 수 있는 핵산 칩과 달리, 기지의(이미 동정된) 단백질에 대해 수백 가지 분자의 프로파일링을 가능하게 할 뿐이다.
특히 생체시료는 수 백만개의 단백질을 포함하고 있지만, 현재 기지의(동정된) 단백질의 수는 수 만개에 불과하기 때문에 미지의 단백질을 포함한 시료의 생체 분자 집단에 대한 프로파일링 기술은 그 필요성이 매우 높다고 할 수 있다.
생체분자의 프로파일은 각종 질환의 진단, 약물 치료 모니터링 등에 유용하게 사용될 수 있는데, 그 프로파일이 포함하고 있는 단백질 정보가 다양하고 클수록 그 프로파일의 유용성은 높아진다.
본 발명은 압타머를 이용하여 미지의 표적 단백질 분자를 포함한 시료의 표적 단백질 분자 집단에 대한 프로파일링 기술을 개시한다.
본 발명의 목적은 압타머를 이용하여 미지의 표적 단백질 분자를 포함한 시료의 표적 단백질 분자 집단에 대한 프로파일을 얻는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.
본 발명은 일 측면에 있어서, 압타머를 이용하여 시료의 표적 단백질 분자 집단에 대한 프로파일을 생성하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 (a) 시료의 표적 단백질 집단에 특이적인 압타머 라이브러리를 준비하는 단계, (b) 상기 시료와 동류(同類)의 분석 대상 시료에 단백질 친화성 자성입자들을 혼합하여 그 분석 대상 시료 중의 표적 단백질 집단의 표적 단백질들을 그 자성입자들에 결합시키는 단계, (c) 시료 중의 미결합 성분들을 제거하여 표적 단백질들이 결합된 자성입자들을 얻는 단계, (d) 상기 표적 단백질들이 결합된 자성입자들에 상기 압타머 라이브러리를 처리하여 그 압타머 라이브러리의 각 압타머를, 상기 자성입자들에 결합된 표적 단백질들의 각 표적 단백질에 결합시켜 압타머-표적 단백질-자성입자 복합체 집단을 형성시키는 단계, (e) 미결합 압타머를 제거하여, 압타머-표적 단백질-자성입자 복합체 집단을 얻는 단계, (f) 상기 복합체 집단에서 압타머 집단을 분리하는 단계, 및 (g) 상기 분리된 압타머 집단으로부터 그 압타머 집단의 각 압타머를 정량하여 압타머 프로파일을 생성하는 단계를 포함한다.
이렇게 얻어지는 압타머 프로파일은 시료의 표적 단백질 집단으로부터 분리된 압타머 집단의 각 압타머의 양(즉 압타머 검출값으로 압타머의 정량 결과)의 전체적인(즉 집단적인) 분포가 되는데, 여기서 각 압타머의 양은 그 압타머가 결합하는 시료 중의 표적 단백질의 양에 비례하고 따라서 그 표적 단백질의 양을 나타내므로, 압타머 프로파일은 시료 중 각 표적 단백질 양의 전체적인(집단적인) 분포인 표적 단백질 집단에 대한 프로파일이 된다.
따라서 본 발명의 시료의 표적 단백질 집단에 대한 프로파일을 생성하는 방법은 실질적으로는 시료의 표적 단백질 집단에 대한 압타머 프로파일을 얻는 방법으로 이해될 수도 있다. 이 압타머 프로파일은 전술한 바와 같이 결국은 시료의 표적 단백질 집단에 대한 프로파일이 된다.
본 발명의 방법은 어떤 특정 시료의 표적 단백질 집단 예컨대 사람 혈장의 표적 단백질 집단에 대해 특이적인 압타머 라이브러리를 그 시료와 동류(同類)의 분석 대상 시료 예컨대 사람의 혈장 시료에 처리하여 그 분석 대상 시료 중의 표적 단백질 집단에 대한 압타머 프로파일을 생성함에 의한, 그 시료의 표적 단백질 집단에 대한 프로파일을 생성하기 위한 위한 방법으로, 이러한 압타머 프로파일이나 그 표적 단백질 집단에 대한 프로파일은 약물 처방의 적합성 여부 판단(예컨대 항암제 동반진단 등), 질병 진단 정보 제공, 약물 치료의 모니터링, 약물 순응도 판단, 약물 처리에 대한 In vitro 상에서의 세포 반응 여부나 정도, 생물종의 분류나 동정 등 인간에게 유용한 정보를 제공하는데 사용될 수 있다.
본 발명에서, 표적 단백질은 시료에 존재하는 검출하고자 하는 임의의 단백질 분자를 의미한다. 이러한 표적 단백질은 비수식(nonmodified) 단백질, 당단백질, 지질단백질, 짧은 길이의 단백질인 펩타이드 등일 수 있다.
본 발명에서 이러한 표적 단백질은 동정된 기지의 단백질 분자이거나 동정되지 아니한 미지의 단백질 분자일 수 있지만, 본 발명은 표적 단백질 집단에 대한 프로파일을 압타머 프로파일로 얻는다는 점에서 시료 중 포함된, 검출하고자 하는 표적 단백질이 동정된 기지의 단백질 분자인지 동정되지 아니한 미지의 단백질 분자인지는 중요하지 않게 된다. 본 발명에서는 어떤 표적 단백질의 검출 결과(정량 결과)는 그 표적 단백질이 동정된 기지의 단백빌 분자이거나 동정되지 아니한 미지의 단백질 분자인지 상관없이 모두 압타머 검출 결과(즉 정량 결과)로 나타나기 때문이다. 이러한 압타머 정량 결과는 전체적으로 압타머 프로파일을 형성한다.
또 본 발명에서, 표적 단백질 집단은 2종 이상의 서로 다른 단백질 분자의 집합체를 의미하는데, 후술한 바와 같이 시료 중의 표적 단백질 집단에 특이적 압타머 라이브러리는 무작위 서열을 가져 다양한 표적 단백질들에 대한 잠재적 결합 능력을 가진 단일가닥 핵산 라이브러리를 처리하고 표적 단백질과의 복합체 전체를 분리하고 그 복합체의 단일가닥 핵산을 증폭하여 얻은 것이므로 상당수의 표적 단백질이 집단적으로 검출될 수 있다. 따라서 표적 단백질 집단은 적어도 500 종 이상의 표적 단백질 분자로 구성된 표적 단백질 분자 집단의 의미로 이해될 수 있으며, 바람직하게는 1000종 이상, 더 바람직하게는 1500 종 이상, 더욱 바람직하게는 2000종 이상 표적 단백질로 구성된 표적 단백질 분자 집단으로 이해될 수 있다.
또 본 발명에서, 시료 중의 표적 단백질 집단에 특이적인 압타머 라이브러리는, 그 표적 단백질 집단에 특이적으로 결합함으로써 표적 단백질을 집단적으로 검출할 수 있는 압타머의 집합체를 의미한다. 따라서 표적 단백질 집단의 크기가 예컨대 1000종의 표적 단백질로 구성되어 있다면, 압타머 라이브러리도 적어도 1000종 이상의 압타머로 구성되게 될 것이다. 여기서 '적어도 1000종 이상의 압타머로 구성될 것'이라고 한 것은, 어떠한 특정 표적 단백질에 압타머 라이브러리를 반응시키면 어느 1 종의 특정 압타머만이 상기 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 것이 아니라 에피토프를 달리하여 2종 이상의 특정 압타머가 상기 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 경우도 있기 때문이다. 일반적으로는 압타머 라이브러리는 이를 구성하는 압타머의 종류가 표적 단백질 집단을 구성하는 표적 단백질의 종류보다 많을 것이다. 상기 압타머 라이브러리의 각 압타머는 필요에 따라서는 차세대서열분석 기술(Next Generation Sequencing, NGS)이나 기존 공지의 BAC library 구축을 통한 클로닝에 의한 서열 결정 방법(Genome Res 2001 Mar; 11(3):483-496) 등을 적용하여 그 서열이 미리 결정되어 있는 압타머일 수도 있으며, 그렇게 서열이 이미 결정된 압타머 라이브러리를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 (a) 단계의 시료의 표적 단백질 집단에 특이적 압타머 라이브러리의 준비는 아래에서 개념적으로 서술되고 아래 실시예에서 실험적으로 개시된 압타머 라이브러리 제조 방법에 따라 얻어지거나, 기존 공지된 방법에 따라 얻어질 수도 있다.
기존 공지된 방법으로서는 명칭이 "차세대서열결정법을 이용한 표적 단백질의 집단적 정량 방법과 그 용도"인 한국 공개특허 제10-2019-0135456호나 그것의 국제출원인 국제공개 WO 2018/084594에 개시된 방법, 또 명칭이 "미지의 생체분자와 단일가닥핵산의 결합 프로파일을 생성하기 위한 핵산칩, 핵산칩의 제조방법, 및 핵산칩을 이용한 미지의 생체분자 분석방법"인 한국 등록특허 제10-0923048호에 개시된 방법을 들 수 있다.
상기 한국 공개특허 제10-2019-0135456호 등의 문헌에 개시된 방법은 (i) 서로 다른 다양한 서열(즉 무작위 서열)을 가져 다양한 표적 단백질 분자들에 대한 잠재적 결합 능력을 가진 단일가닥 핵산 라이브러리를 제작하고, (ii) 이 단일가닥 핵산 라이브러리를 시료의 표적 단백질 분자 집단과 반응시켜 각 단일가닥 핵산과 각 표적 단백질 분자 사이에 특이적 결합을 유도하여 복합체의 집단을 형성시키고, (iii) 비결합한 단일가닥 핵산을 제외시켜 그 복합체 집단을 분리하고, (iv)그 복합체 집단의 단일가닥 핵산을 증폭하여 얻어질 수 있다.
시료의 표적 단백질 집단에 특이적 압타머 라이브러리의 제조에 전술한 바의 방법을 이용할 경우, 단백질을 고정시킬 수 있는 나이트로셀룰로스 막 디스크(nitrocellulose membrane disc)에 시료를 처리하여 표적 단백질을 집단적으로 고정시키고 여기에 단일가닥 핵산 라이브러리를 처리하여 수행될 수도 있다.
상기 압타머 라이브러리의 제작 과정에 있어서, 상기 (i) 단계의 서로 다른 다양한 서열을 가진 단일가닥 핵산 라이브러리는, 일반적으로 단일가닥의 RNA 또는 DAN 올리고뉴클레오티드 핵산 풀을 의미하는데, 이 올리고뉴클레오티는 일반적으로 기지의 서열로 이루어진 5' 말단 보존영역과 3' 말단 보존영역, 그리고 그 사이에 무작위 서열로 이루어진 가변영역을 포함하여 구성된다. 이 기지의 서열로 이루어진 보존영역에는 정방향/역방향 프라이머가 결합하는 서열, RNA 폴리머나아제의 프로모터 서열, 클로닝 등의 조작을 위한 제한효소 인식 서열 등이 포함될 수 있다. 상기 무작위 서열로 이루어진 가변영역은 통상 40~60개의 뉴클레오티드로 이루어지기 때문에 5' 말단 영역과 3' 말단 영역을 포함한 올리고뉴클레오티드 전체의 길이는 통상 60~150개의 뉴클레오티드의 길이가 된다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 합성은 당업계에 주지되어 있으며, 그러한 방법으로서 고체상 올리고뉴클레오티드 합성 기술, 트리에스테르 합성 방법 등의 용액상 합성 기술 등을 들 수 있다. 구체적인 것은 문헌[Nucl. Acid Res. 14:5399-5467, 1986] 문헌[Tet. Lett. 27:5575-5578, 1986], 문헌[Nucl. Acid Res. 4:2557, 1977], 문헌[Lett., 28:2449, 1978] 등을 참조할 수 있다. 또한 시중에 나와있는 자동화된 핵산 합성 장치를 이용할 수도 있으며, 이러한 장치를 이용할 경우 1014-1016개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 충분한 분자수를 가진 단일가닥 핵산 라이브러리를 얻을 수 있다. 또한 단일가닥핵산 라이브러리로서 단일가닥 RNA 라이브러리를 사용할 경우 이러한 RNA 라이브러리는 DNA 라이브러리를 T3, T4, T7 등의 RNA 폴리머라제로 전사시켜 얻을 수 있다.
또 상기 압타머 라이브러리의 제작에서, 상기 (iii) 단계의 복합체 집단의 분리를 위하여 상기 비결합한 단일가닥 핵산의 제거는 당업계에 공지된 적절한 방법을 적용함으로써, 예컨대 적절한 세척 버퍼로 세척 단계를 1회 이상 수행함으로써 가능하다. 이렇게 비결합 단일가닥 핵산을 제거하고 복합체 집단을 '선택'적으로 분리한 후에는 그 복합체 집단의 단일가닥 핵산만을 '증폭'시킴으로써 시료의 표적 단백질 분자 집단에 특이적인 압타머 라이브러리를 제작할 수 있게 된다. 이러한 선택과 증폭을 1회만 수행하여 얻어진 압타머 라이브러리를, 본 발명의 방법의 상기 (a) 단계에 그대로 사용할 수 있으나, 상기 선택과 증폭 과정을 2회 이상 반복함으로써, 즉 상기 복합체 집단의 단일가닥 핵산만을 증폭시켜 얻어진 압타머 라이브러리를, 다시 시료의 표적 단백질 분자 집단과 반응시켜 다시 복합체 집단을 형성시키고 복합체 집단을 분리하고, 그 복합체 집단의 압타머만을 다시 증폭시키는 과정을 2회 이상 반복함으로써, 분석 대상 시료의 표적 단백질 분자 집단에 대한 특이적 결합 능력을 높인 압타머 라이브러리를 사용할 수도 있다. 그러나 압타머 라이브러리는 분석 대상 시료의 표적 단백질 분자들을 다양하게 반영함으로써 보다 다양한 표적 단백질 분자들을 집단적으로 검출, 분석할 수 있는 것이 표적 단백질 분자 집단에 대해 얻어지는 압타머 라이브러리의 유용성 측면에서 바람직하므로, 상기 선택과 증폭 과정을 반복하는 대신, 1회의 선택과 증폭 과정으로 압타머 라이브러리를 제작하되, 다양한 세척 버퍼를 사용하여 세척 단계를 2회 이상 수행하여 압타머 라이브러리를 제작하는 것이 바람직할 수 있다. 세척 버퍼는 당업계에 널리 이용되는 것을 구입하여 이용하거나 적절히 조제하여 사용할 수 있는데, 이러한 세척용액에는 일반적으로 계면활성제 및/또는 염(카오트로픽 염, chaotropic salt)이 포함된다. 계면활성제로서는 SDS, Tween 20, Tween 30, Tween 40, Tween 60, Tween 80, Triton X-405, Triton X-100, Tetronic 908, Cholesterol PEG 900, Polyoxyethylene Ether W-1, Span 20, Span 40, Span 85, 이들의 혼합물이 사용될 수 있으며, 염은 리튬, 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 암모늄의 아세트산염, 젖산염, 구연산염, 인산염, 질산염, 황산염, 과염소산염, 염화물염, 이의 혼합물(SSC, SSPE 등)이 사용될 수 있다. 특히 세척용액은 TBST 용액(10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20), PBST 용액(PBS, pH 7.0, 0.05% Tween 20), Tween 20, Tween 30 등이 포함된 SSPE 용액(0.2M phosphate buffer, 2.98M NaCl, 20mM EDTA, pH7.4), SB18 용액(40 mM HEPES, pH 7.5, 101 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl2 및 0.05 % (v/v) Tween 20), SB17 용액(1mM trisodium EDTA가 첨가된 SB18 용액), SB17T 용액(40mM HEPES, pH 7.5, 102mM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl2, 1mM EDTA 및 0.05 % Tween 20) 등을 사용할 수 있으며, 1~600 mM EDTA 용액 등도 사용할 수 있다.
상기 비결합한 단일가닥 핵산을 제외시키기 위한 세척 단계를 수행하기 전에, 상기 단일가닥 핵산이 비표적 단백질 분자와 비특이적으로 결합하는 것을 방지하여 그것의 표적 단백질 분자와의 특이적 결합을 향상시키기 위하여, 상기 (ii) 단계의 단일가닥 핵산 라이브러리를 시료의 표적 단백질 분자 집단과 반응시켜 복합체의 형성 시에 또는 복합체 집단을 형성시킨 후에, 시료 중의 임의의 분자와 비특이적 복합체를 형성할 수 있는 임의의 경쟁 분자(competitor molecule)를 첨가할 수 있다. 이러한 경쟁분자가 첨가될 경우 상기 단일가닥 핵산이 비표적 단백질 분자와 비특이적으로 결합하는 것이 방지되어 결과적으로 상기 단일가닥 핵산의 표적 단백질 분자와의 특이적 결합(또는 특이적 결합력)이 향상될 수 있다. 이러한 경쟁분자는 올리고뉴클레오티드, 헤파린, 청어의 정자 DNA, 단일가닥의 연어 정자 DNA 등의 다중 음이온 분자, 덱스트란 설페이트 등의 폴리덱스트란, 비염기성 포스포디에스테르 폴리머(abasic phosphodiester polymers), dNTPs, 파이로포스페이트(pyrophosphate) 등일 수 있으며, 스페르민(spermine), 스페르미딘(spermidine), 폴리라이신(polylysine), 폴리아르기닌(polyarginine) 등의 다중 양이온 분자, 아르기닌, 라이신 등의 아미노산 등일 수 있다. 이러한 경쟁분자는 표적 단백질 분자의 예상 농도 또는 사용되는 단일가닥 핵산의 농도를 고려하여 이보다 높은 농도로 사용되는 것이 단일가닥 핵산의 표적 단백질 분자와의 특이적 결합을 향상시키는 데 유리할 수 있다. 또 이러한 경쟁 분자는 상기 세척 단계 시에 세척 버퍼에 첨가되어 사용될 수도 있다.
본 명세서에서, 달리 정의하지 않는 한, 압타머는 특정 표적 단백질 분자에 특이적인 결합력(specific affinity)을 가진 핵산 리간드를 의미하는 것으로 사용되는데, 이러한 압타머는 특정 표적 단백질 분자에 잠재적인 결합 능력을 가진 후보 핵산들에서 앞서 설명한 바와 같이 선택과 증폭 과정을 거쳐 얻어지게 된다. 여기서 압타머가 표적 단백질 분자에 특이적인 결합력을 가진다고 할 때 그 특이적 결합력의 의미는 표적 단백질 분자와만 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하고 다른 단백질 분자에 대해서는 실질적으로 그러한 복합체를 형성하지 않는 경우를 의미한다. 실질적으로 복합체를 형성하지 않으면 되므로 세척 등에 의하여 제거될 수 있는 비특이적 결합에 의해 복합체가 형성되는 것을 배제하는 의미는 아니다.
또 본 발명에서, 표적 단백질 분자와 특이적인 결합력을 가진 압타머는 인위적으로 제작되고 선택, 증폭됨으로써 얻어지는 비자연 발생적 핵산 리간드이다. 이러한 압타머는 일반적으로 단일가닥 DNA이거나 단일가닥 RNA이며, 표적 단백질 분자와 결합 능력을 가지는 한 자연적 뉴클레오티드(natural nucleotide) 뿐만 아니라 변형된 뉴클레오티드(modified nucleotide)를 포함할 수 있다. 이러한 변형된 뉴클레오티드는 그 당인 리보스이나 디옥시 리보스, 그 포스페이트 및/또는 그 염기에서 변형된 것일 수 있다. 이러한 당, 포스페이트 및/또는 염기에서 변형된 뉴클레오티드는 당업계에 그 제조방법을 포함하여 구체적으로 공지되어 있다. 예컨대 당에서 변형된 뉴클레오티드는, 그 당의 2' 위치가 할로겐 기(특히 불소(F)), 지방족 기, 에테르 기, 아민 기로 수식되거나 특히 OMe, O-알킬, O-알릴, S-알킬, S-알릴 또는 할로겐 등으로 수식된 것, 당인 리보스 또는 디옥시 리보오스 자체가 이를 대신할 수 있는 당 유사체 α-아노머 당(α-anomeric sugars), 아라비노스(arabinose), 자일로스(xyloses) 또는 릭소오스(lyxoses)와 같은 에피머 당(epimeric sugars), 피라노오스 당(pyranose sugars), 퓨라노오스 당(furanose sugars) 등으로 치환된 것을 들수 있다. 또한 예컨대 포스페이트에서의 변형은 포스페이트가 P(O)S(thioate), P(S)S(dithioate), P(O)NR2(amidate), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2(formacetal)로의 변형된 것 등을 들수 있다. 여기서 상기 R 또는 R'는 H 또는 치환되거나 치환되지 않은 알킬 등이며, 포스페이트에서 변형될 경우 그 연결기는 -O-, -N-, -S- 또는 -C-가 되어, 이러한 연결기를 통해 인접 뉴클레오티드가 서로 결합하게 된다. 변형된 뉴클레오티드, 그러한 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 단일가닥 핵산 등과 관련해서는 문헌[Sproat, et al, Nucl Acid Res 19:733-738(1991)], 문헌[Cotten, et al, Nucl Acid Res 19:2629-2635(1991)], 문헌[Hobbs, et al, Biochemistry 12:5138-5145(1973)] 등 당업계에 상당한 문헌이 공지되어 있으며, 보다 구체적인 것은 이들 문헌들을 참조할 수 있다. 이들 문헌을 포함하여 본 명세서에서 인용되는 문헌은 모두 본 명세서의 일부로서 간주된다.
또 본 발명에서, 시료는 검출하고자 하는 하나 이상 또는 상당수의 표적 단백질 분자를 포함하거나 포함하고 있을 것으로 의심되어 검출의 필요성을 가지는 임의의 혼합물 또는 용액일 수 있다. 시료는 인체 또는 동물로부터 얻어진 생체시료뿐만 아니라 그러한 생체시료를 가공하여 검출하고자 하는 표적 단백질 분자의 농도를 높인 가공시료일 수 있고, 나아가 표적분가 포함되어 있거나 있을 것으로 여겨지는 물, 식품, 산업폐수 등, 환경오염인자, 독성인자 등의 검사가 필요한 시료일 수도 있다. 이러한 시료는 적정 희석제, 완충용액을 포함할 수 있으며, 세균이나 바이러스 존재 여부를 검출하고자 할 때에는 배지나 배지 성분이 포함되어 있는 세균 배양물, 세균 용해물, 바이러스 배양물일 수도 있다.
또 본 발명의 방법에서, 시료는 바람직하게는 인체 또는 동물로부터 얻어진 생체시료 또는 그 가공시료일 수 있다. 생체시료는 혈액, 소변, 침, 정액, 양수, 림프액, 객담, 조직 등 검출하고자 하는 표적 단백질 분자를 포함하거나 포함하고 있을 것으로 의심되어 검출의 필요성을 가지는 인체 또는 동물로부터 얻어진 것일 수 있다. 가공시료는 예컨대 혈장, 혈청, 생체시료에 단백질 추출 키트를 적용하여 단백질 농도를 높인 시료, 조직 추출물, 조직에서 얻어진 세포, 세포 용해물, 세포 배양물 등일 수 있다. 또 가공시료는 생체시료에서 그 생체시료 중에 많은 양으로 존재하고 표적 단백질로서의 유용성(예컨대 특정 질병에 대한 바이오마커로 사용될 가능성 등)이 떨어지는 단백질을 제거한 가공시료일 수 있다. 예컨대 혈액 시료에는 매우 적은 수의 특정 몇몇 단백질들이 그 시료 중 단백질 양의 99.9%를 차지하고 있으며, 이렇게 많은 양으로 존재하는 단백질들은 통상 표적 단백질로서의 유용성이 낮다(Mol Cell Prot (2006) 5(10):1727-1744). 생체시료 중에 많은 양으로 존재하는 단백질을 제거한 가공시료를 사용할 경우, 유용성이 높은 표적 단백질의 검출 민감성을 향상시킬 수 있다. 이렇게 많은 양으로 존재하는 단백질들로서는, 예컨대 인간을 포함한 포유동물의 혈액 시료의 경우 알부민, IgG, IgA, 트랜스페린(Transferrin), 피브리노겐 등을 들 수 있다. 이들 많은 양으로 존재하는 단백질들은 당업계 공지된 적절한 방법(예컨대 면역-친화성 제거 방법(immuno-affinity depletion))을 사용하거나 시판되고 있는 적절한 키트(Agilent Technologies 사의 Multiple Affinity Removal System 등)를 사용하여 제거될 수 있다.
본 발명에서, 상기 (b) 단계의 분석 대상 시료가 상기 (a) 단계의 시료와 "동류(同類)"라 함은 상기 (b) 단계의 분석 대상 시료가 임의의 특정 사람으로부터 유래한 시료 예컨대 혈청일 때, 상기 (a) 단계의 시료는 동일 기원(상기 사람와 동일 개체) 또는 다른 기원(상기 사람과 다른 개체)으로부터 유래한 시료 예컨대 혈청을 의미한다. 또 예컨대 동류의 시료라 함은 상기 (a) 단계의 어떤 시료가 특정 균주에 속하는 대장균 용해물일 때, 상기 (b) 단계의 분석 대상 시료는 그와 같은 균주에 속하는 대장균 용해물이거나 다른 균주에 속하는 대장균 용해물일 수 있다.
통상적으로는 본 발명의 방법에서는 상기 (a) 단계의 시료의 표적 단백질 분자 집단에 특이적인 압타머 라이브러리는 이미 준비된(즉 제작되고 필요에 따라서 그 서열이 밝혀진) 상태로 본 발명의 방법에 사용되게 것이다.
본 발명의 방법에서, 상기 (b) 단계는 분석 대상 시료와 단백질 친화성 자성입자들을 혼합하여 그 분석 대상 시료 중의 표적 단백질 집단의 표적 단백질들을 그 자성입자들에 결합시키는 단계인데, 이때 사용될 수 있는 자성입자들은 임의의 단백질들에 친화성을 가진 자성입자들이거나 특정 성질을 가진 그룹의 단백질들(예컨대 친수성 단백질들)에 친화성을 가진 자성입자들의 혼합물일 수 있다. 여기서 임의의 단백질은 바람직하게는(또는 이론적으로는) 프로파일을 얻고자 하는 시료 중에 존재하는 단백질 전체 또는 그 대부분이나 가공 시료(예컨대 시료 중 과량으로 존재하는 단백질들을 제거하여 생물학적으로 의미가 높은 단백질의 함량을 높인 시료) 중에 존재하는 단백질 전체 또는 그 대부분을 말한다. 이러한 임의의 단백질은 동정되지 아니한 미지의 단백질들과 이미 동정된 기지의 단백질들의 혼합물일 수 있다(그런데 본 발명에서는 단백질들에 대한 정량 정보나 그 프로파일이 압타머들 정량 정보나 압타머 프로파일로 얻어진다는 점에서 그 단백질들이 미지의 단백질들인지, 기지의 단백질들인지는 기술적 의미를 가지지 않을 수 있다). 또 이러한 단백질들은 친수성(또는 극성) 단백질, 소수성(즉 비극성) 단백질, 양쪽성 단백질(막 단백질 등), 양이온성 단백질, 음이온성 단백질, 양쪽이온성(zwitterion) 단백질이거나 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
본 발명의 방법에서, 자성입자는 그 표면의 성질에 따라 그것이 친화적인 단백질들과 수소결합, 반데르발스 결합(Van der Waals interaction), 정전기적 결합, 킬레이트 결합(예컨대 니켈 이온 등 금속이온으로 코팅된 자성입자를 이용하여 히스 태그 재조합 단백질을 분리할 때) 또는 이들이 혼합된 방식의 결합일 수 있다.
본 발명의 방법에서, 자성입자는 그것이 친수성 단백질들을 결합시키기 위한 것이라면, 그 자성입자에는 친수성 단백질에 친화성을 가지는 물질이 결합되어 있거나(일반적으로 자성입자 표면에 코팅됨), 그 자성입자가 소수성 단백질을 결합시키기 위한 것이라면 그 자성입자에는 소수성 단백질에 친화성을 가지는 물질이 결합되어 있거나, 또 이온성 단백질들(양이온성, 음이온성 또는 양쪽이온성 단백질들)을 결합시키기 위한 것이라면, 그 자성입자에는 그 반대의 이온성 물질이나 양쪽 이온성 물질이 결합되어 있을 수 있다. 이러한 이온성 물질이 결합된 자성입자는 양이온성 물질이 결합된 자성입자, 음이온성 물질이 결합된 자성입자, 양이온성 물질과 음이온성 물질이 결합된 자성입자 또는 양쪽이온성 물질이 결합된 자성입자일 수 있다. 또 본 발명의 방법에서 자성입자가 친수성 단백질들, 소수성 단백질들 및 이온성 단백질들의 혼합물을 결합시키기 위하여 사용되는 것이라면, 친수성 단백질에 친화성을 가지는 물질이 결합되어 있는 자성입자와 소수성 단백질에 친화성을 가지는 물질이 결합되어 있는 자성입자와 이온성 단백질에 친화성을 가지는 물질이 결합되어 있는 자성입자의 혼합물을 사용할 수 있다.
친수성 단백질에 친화성을 가지는 물질은 예컨대 실리카(SiO2), 소수성 단백질에 친화성을 가지는 물질은 예컨대 탄소수 1~18 알킬기(예컨대 n-프로필기(C3), n-옥틸기(C8), n-도데실기(C12), and n-옥타데실기(C18)) 등을 들 수 있으며, 또 이온성 단백질들에 친화성을 가지는 물질로서는 양이온성 단백질에 친화성을 가지는 카르복시기(-COOH)나, 음이온성 단백질에 친화성을 가지는 아민기(-NH2) 또는 디에틸아민기(-N(CH2CH3)2) 등을 들 수 있다. 또한 당업계에는 양이온성 폴리머( polyethyleneimine, PEI)와 음이온성 폴리머(poly(acrylic acid),PAA)가 모두 코어(Fe3O4)-쉘(silica) 구조 표면에 결합된 자성입자도 알려져 있다(Biomaterials, 35, 6389 (2014)). 이러한 자성입자는 양이온성 단백질들이나 음이온성 단백질들 모두에 친화성을 나타낼 것이다.
전술한 바의 작용기 이외에도 자성입자에는 표적 단백질들과 결합이 가능하도록 에폭시기, 토실기, 아미노기, 실록산기 등의 작용기가 도입될 수도 있다.
자성입자에 이러한 작용기들의 도입 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예컨대 미국 특허 제6,027,945호, 미국 특허 제6,673,631호, 미국 특허 제7,183,002호, 일본 특허 제3,253,638호, 일본 공개특허 제2001-136970호, 한국 공개특허 제2009-0088299호 등을 참조할 수 있다.
자성입자는 공침법(Co-precipitation), 열분해법(Thermal decomposition), 마이크로에멀젼법(Microemulsion), 졸겔 합성법(Sol-gel synthesis), 산화법(Oxidation method), 전기화학법(Electrochemical method), 음향합성법(Sonochemical method) 등의 화학적 방법이나, 기상 증착법(Gas phase deposition), 볼밀(Ball milling) 등의 기계적 분쇄법(Mechanical grinding) 등의 물리적 방법이나, 바이오미네랄화법(Biomineralization) 등의 생물학적 방법으로 제조될 수 있다(Korean J. Chem. Eng., 34(3), 589-599 (2017); Nanomaterials 2018, 8, 810).
자성입자는 자성물질과 기능성 물질(일반적으로 유·무기 고분자)이 일반적으로 코어(자성물질)-쉘(기능성 물질) 구조(Core-shell structure)를 이루나 그 역의 구조인 코어(기능성 물질)-쉘(자성물질) 구조를 이룰 수도 있다. 자성입자는 기능성 물질이 매트릭스가 되고 그 안에 자성물질이 분산된 형태(Martix-dispersed structure)나 자성물질과 기능성 물질이 분할되어 서로 결합된 재너스 입자 구조(Janus particle structure)일 수도 있다(Nanomaterials 2018, 8, 810).
자성물질은 금속 입자, 금속산화물 입자, 금속 합금 입자(Metal Alloys Magnetic Nanostructure) 등일 수 있다.
금속 입자로는 Pd, Pt, Cu, Ni, Co, Fe, Mn, Ru, Rh, Os, Ir 등의 입자일 수 있으며, 금속 산화물 입자는 화학식 MxOy(단, M은 금속으로 Fe, Pt, Ni 또는 Mn이며, O는 산소, x와 y는 정수를 나타낸다)의 입자일 수 있으며, 또 금속 합급 입자는 FePt(Iron-Platinum), FePd(Iron-Palladium) 등일 수 있다. 바람직하게는 산화철로서 마그네타이트(magnetite; Fe3O4), 마그헤마이트(maghemite; Fe2O3), 헤마타이트(hematite; Fe2O3) 등일 수 있다.
자성입자에는 자성입자의 분산성, 안전성 등을 높이고, 표적 단백질들에 대해 친화성을 가진 작용기 도입을 통해 표적 단백질들에 대한 분리 효율을 높이기 위하여 유·무기 고분자 물질이 자성물질과 결합할 수도 있다. 그러한 고분자로서 예컨대 키토산, 폴리에틸렌이민, PAA(poly(acrylic acid)), 카로복시메틸 셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤, 알콕실레이트, 알칸올아미드, 에스테르, 아민 옥사이드, 알킬 폴리길리코사이드, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌아민, 폴리비닐아민, 베타인, 글리시네이트, 이미다졸린 등을 들 수 있다.
이러한 자성입자는 아래의 실시예에서와 같이 시판되는 것을 구입하고, 그 표면의 성질을 고려하여 적절한 비율로 혼합하여 사용할 수도 있다. 시판되는 자성입자로서는 알킬 그룹이 표면에 부착된 탄소 시리즈인 탄소수 3의 C3 자성입자, 탄소수 8의 C8 자성입자, WCX(weak cation exchange) 자성입자, IMAC-Metal(immobilized metal-affinity chromatography) 자성입자 등을 들 수 있다. 이러한 자성입자들을 시판하는 회사로서는 CD Bioparticles 사(미국), EPRUI Biotech 사(중국), Bioclone 사(미국), Invitrogen Dynal 사(미국) 등을 들 수 있다.
자성입자에 고분자 물질의 결합이나 친수성이나 소수성 또는 이온성 물질의 결합은 공유결합이나 비공유결합을 통하여 이루어질 수 있다. 비공유결합은 반데르발스 결합(Van der Waals interaction)에 의한 물리적 흡착이나 정전기적 상호작용에 의한 화학적 흡착을 포함한다.
본 발명에서 자성물질은 코발트, 니켈, 철 등의 강자성(Ferromagnetic) 물질과 알루미늄, 마그네슘, 텅스텐 등의 상자성(paramagnetic) 물질을 포함하는 의미이다.
기타 자성입자의 제조, 사용될 수 있는 작용기나 유·무기 물질, 그러한 작용기나 유·무기 물질 도입 등과 관련해서는 미국 특허 제5,665,554호, 미국 특허 제6,027,945호, 미국 특허 제6,673,631호, 미국 특허 제7,078,224호, 미국 특허 제7,183,002호, 일본 특허 제3,253,638호, 일본 공개특허 제2001-136970호, 한국공개특허 제2006-0061494호, 한국등록특허 제0541282호, 한국 공개특허 제2009-0088299호 등을 당업계에 매우 많고 다양한 문헌이 공지되어 있으며, 더 구체적인 것은 이들 문헌들을 참조할 수 있다.
또 본 발명에서, 상기 (b) 단계는 표적 단백질들이 자성입자들에 대한 친화성을 높여 그 자성입자들에의 결합을 촉진하기 위하여 염산, 아세트산, 수산화나트륨 등의 pH 조정제를 첨가하여 pH를 조정하는 것이 바람직할 수도 있다. 일반적으로 단백질은 염기성 조건에서는 등전점보다 pH가 높으므로 음이온성을 띠고, 산성 조건에서는 등전점보다 pH가 낮으므로 양이온성을 띠는 것으로 알려져 있다. 이렇게 pH를 조정함으로써 표적단백질들의 자성입자에의 결합을 촉진할 수도 있다.
또 본 발명에서, 상기 (c) 단계의 미결합 성분들을 제거하여 표적 단백질들이 결합된 자성입자들을 얻는 단계는, 자석을 이용하여 손쉽게 이루어질 수 있다. 구체적으로 미결합 성분들과 표적 단백질들이 결합된 자성입자들이 혼합된 반응용액이 들어있는 튜브 등의 반응용기에 자석을 적용하여 표적 단백질들이 결합된 자성입자들을 고정시키고, 나머지 미결합 성분들이 포함된 반응용액을 피펫으로 제거하거나 튜브를 기울려 제거함으로써 이루어질 수 있다. 여기서 미결합 성분들에는 자성입자에 결합하지 아니한 단백질 이외에 시료 중에 존재하는 핵산, 탄수화물, 지질 분자들이 포함될 것이다.
본 발명에서, 상기 (d) 단계의 자성입자에 결합된 표적 단백질 분자와 압타머의 복합체를 형성시킬 때, 전술한 바의 경쟁 분자가 표적 단백질 분자와 압타머 사이의 특이적 결합을 향상시키기 위하여 상기 압타머 라이브러리와 함께 상기 표적 단백질들이 결합된 자성입자들에 처리될 수 있다. 이러한 경쟁분자의 처리는 압타머와 비표적 단백질 분자의 비특이적 결합을 방지하고 압타머와 표적 단백질 분자의 특이적 결합을 높이는 효과를 가져올 수 있다.
본 발명에서, 상기 (e) 단계인 미결합 압타머를 제거하여, 압타머-표적 단백질-자성입자 복합체 집단을 얻는 단계도 자석을 이용하여 즉 자석에 압타머-표적 단백질-자성입자 복합체 집단을 고정시키고 미결합 압타머 등 나머지를 제거함으로써 이루어질 수 있다.
본 발명에서, 상기 (f) 단계의 압타머-표적 단백질-자성입자 복합체 집단으로부터 압타머 집단을 분리하는 단계는, 표적 단백질 분자와 압타머 사이의 비공유결합을 파괴하여 압타머를 표적 단백질-자성입자 복합체로부터 분리하는 단계인데, 이러한 단계는 표적 단백질 분자와 압타머 사이의 비공유결합을 파괴할 수 있는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 이루어질 수 있다. 그러한 방법으로 대표적으로 아래의 실시예에서 사용한 가열(heating)을 들 수 있다. 이러한 가열은 표적 단백질 분자와 압타머 사이의 비공유결합을 파괴할 수 있는 적절한 온도에서 적절한 시간 동안 이루어질 수 있으며, 이러한 적절한 온도와 적절한 시간의 결정은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 이루어질 수 있다. 예컨대 90~95℃의 가열 온도를 적용할 경우라면 5분 내지 20분 정도 가열 처리할 수 있다.
이러한 비공유결합의 파괴는 가열 이외에도 카오트로픽 염(chaotropic salt)의 처리, pH의 강산성 또는 강염기성으로의 변화 유도, 상기 세척과 관련하여 전술한 바의 계면활성제의 처리, 이들의 복합 처리 등을 들 수 있다.
본 발명에서, 압타머 집단을 분리한 후에는 상기 (g) 단계에서 그 압타머 집단으로부터 압타머 프로파일을 생성하게 되는데, 이는 압타머 집단의 각 압타머를 정량하고 종합함으로써 가능하다.
이러한 압타머의 정량 방법도 당업계에 공지되어 있는데 그러한 방법으로서 예컨대 차세대서열분석 기술(Next generation sequencing, NGS)을 이용한 방법, 마이크로어레이를 이용한 방법, 다중 실시간 PCR 방법(multiplex real time PCR) 등을 들 수 있다.
NGS 방법을 적용하여 압타머를 정량할 경우, 로슈(Roche)사의 454 플랫폼, 일루미나(Illumina)사의 HiSeq 플랫폼, 라이프테크놀로지(Life Technology)사의 Ion PGM 플랫폼, 퍼시픽바이오사이언스(Pacific BioSciences)사의 PacBio 플랫폼 등을 이용할 수 있으며, 해당 기기의 프로토콜에 따라 압타머의 정량 결과를 얻을 수 있다. 이 NGS 기술은 게놈 DNA를 단편화하여 얻은 DNA 라이브러리를 기판 또는 에멀전(비드) 상에서 각각의 단편들로 공간적으로 분리하고 PCR로 증폭하여 각 단편들의 클론들을 형성시킨 다음 수십만개 내지 수십억개의 클론들에 대해서 대량병렬 방식으로 동시에 서열결정 반응을 수행하여 각 클론들의 서열들을 동시에 읽어내는 방식이다. 이 서열결정 반응은 각 클론의 단일 DNA 단편을 주형으로 하여 PCR(polymerase chain reaction)로 모노뉴클레오티드를 하나씩 붙이면서 그때 나오는 시그널을 물리화학적으로 검출하게 된다. 각 단편들에 대해 얻어진 서열 정보인 리드(Read)들은 이미 분석되어 얻어진 참조서열(Reference sequece)과 비교되고 생물정보학적 기법으로 계수되어 정량화될 수 있다.
마이크로어레이를 이용한 방법은 압타머에 상보적인 프로브를 지지체 상에 하나 이상의 스폿(spot)에 고정되고 여기에 압타머를 처리하여 혼성화를 유도하여 그 혼성화 정도를 신호 발생 물질로 검출하는 방법이다.
사용될 수 있는 지지체는 유리, 실리콘, 합성수지 등의 재질로 이루어질 수 있고, 형태는 슬라이드, 멤브레인 등의 평면 기판의 형태이거나 섬유 다발체의 단면 형태, 비드나 입자 형태일 수 있다.
신호 발생 물질은 방사성 동위원소, 형광물질, 화학 발광물질, 효소 등일 수 있는데, 예컨대, 시아닌 형광 염료(Cy2, Cy3, Cy5), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor 350, 430 등), 플루오레세인(fluorescein), bodipy, 텍사스 레드(Texas red), FITC(Fluorescein Isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 호스래디시퍼옥시데이즈(horseradish peroxidase), 바이오틴(biotin), SYTO(SYTO-11 등), 에티듐 브로마이드, 에티듐 호모다이머-1, 에티듐 호모다이머-2, 에티듐 유도체, 아크리딘, 아크리딘 오렌지, 아크리딘 유도체, 에티듐-아크리딘 헤테로다이머, 에티듐 모노아지드, 프로피듐 요오다이드, 7-아미노악티노마이신 D, POPO-1, TOTO-3 등일 수 있다. 이들 신호 발생 물질은 압타머의 제조 시에 표지화되어 사용되거나 인터칼레이터의 경우 혼성화 후에 첨가되어 사용될 수 있다. 압타머 제조시에 표지화 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Nucleic Acid Microarray and the Latest PCR Method](published by Shujunsha, Japan)에 기재된 방법 등을 참조할 수 있다.
혼성화 정도의 검출은 형광 이미지 스캐너 등 바이오 칩의 화상 이미지 스캐너로 검출하고 화상 이미지의 시그널을 통계적·수치적으로 처리할 수 있는 소프트웨어를 통하여 혼성화 정도를 정량적으로 산출할 수 있다.
다중 실시간 PCR 방법은 DNA 합성 효소의 5'-3' 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 이용하여 증폭하고자 하는 여러 주형 서열(여기서는 압타머)을 합성하면서 각 주형 서열에 상보적으로 결합되어 있는 프로브(예컨대 TaqMan 프로브)를 분해할 때 각 주형에 따라 발생하는 서로 다른 신호를 동시에 검출하거나, 복제 과정 동안 서로 다른 신호를 내는 삽입성 형광물질을 사용하여 각 주형에 따라 발생하는 서로 다른 신호를 동시에 검출하는 방법이다. 복제 정도에 따라 시그널이 증가하며 PCR 산물인 복제물의 양은 압타머의 시작 농도뿐만 아니라 수행된 복제 주기의 수에 좌우된다.
상기 다중 실시간 PCR 방법에는 DNA를 주형으로 사용하는 다중 실시간 PCR 방법 이외에 최초 주형으로 RNA를 사용하는 다중 실시간 역전사 PCR 방법(real time multiplex RT-PCR)도 포함된다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 2가지 이상의 분석 대상 시료의 구분 방법에 대한 것이다.
본 발명의 방법은 (a) 시료의 표적 단백질 집단에 특이적인 압타머 라이브러리를 준비하는 단계, (b) 상기 시료와 동류(同類)의 분석 대상 시료에 단백질 친화성 자성입자들을 혼합하여 그 분석 대상 시료 중의 표적 단백질 집단의 표적 단백질들을 그 자성입자들에 결합시키는 단계, (c) 시료 중의 미결합 성분들을 제거하여 표적 단백질들이 결합된 자성입자들을 얻는 단계, (d) 상기 표적 단백질들이 결합된 자성입자들에 상기 압타머 라이브러리를 처리하여 그 압타머 라이브러리의 각 압타머를, 상기 자성입자들에 결합된 표적 단백질들의 각 표적 단백질에 결합시켜 압타머-표적 단백질-자성입자 복합체 집단을 형성시키는 단계, (e) 미결합 압타머를 제거하여, 압타머-표적 단백질-자성입자 복합체 집단을 얻는 단계, (f) 상기 복합체 집단에서 압타머 집단을 분리하는 단계, (g) 상기 분리된 압타머 집단으로부터 그 압타머 집단의 각 압타머를 정량하여 압타머 프로파일을 생성하는 단계, (h) 상기 (a) 내지 (g) 단계를, 상기 분석 대상 시료와 다른 한 가지 이상의 분석 대상 시료에 대해 동일하게 수행하여 그 한 가지 이상의 다른 분석 대상 시료의 표적 단백질 분자 집단에 대한 압타머 프로파일을 생성하는 단계, (i) 상기 (g) 단계를 통해 생성한 압타머 프로파일과 상기 (h) 단계를 통하여 생성한 압타머 프로파일을 비교하여 압타머 정량 결과에 있어 차이가 있는 하나 이상의 압타머를 결정함으로써 상기 2가지 이상의 분석 대상 시료를 구분하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은, 상기 (h) 단계에서 한 가지의 다른 분석 대상 시료에 대해서 압타머 프로파일을 생성하고, 그 압타머 프로파일을 상기 (g) 단계를 통해 얻어진 압타머 프로파일과 비교하여 2가지 시료 구분에 사용되거나, 상기 (h) 단계에서 2가지의 다른 분석 대상 시료에 대해서 압타머 프로파일을 생성하고, 그 2가지 압타머 프로파일을 상기 (g) 단계를 통해 얻어진 압타머 프로파일과 비교하여 총 3가지 시료 구분에 사용될 수 있다. 이러한 방식으로 본 발명의 방법은 2가지 이상의 시료 구분에 사용될 수 있다.
특히 본 발명의 방법은, 상기 (h) 단계에서 2가지 이상의 다른 분석 대상 시료에 대해서 각 압타머 프로파일을 생성한 후, 그 생성된 각 압타머 프로파일을 평균화시킨, 평균화된 압타머 프로파일을 생성하는 단계가 추가될 수 있고, 이 경우 상기 (i) 단계는 이 평균화된 압타머 프로파일과 상기 (g) 단계를 통해 얻어진 압타머 프로파일을 비교하여 시료 구분에 이용될 수 있다.
평균화된 압타머 프로파일(trained aptamer profile)은 상기 2가지 이상의 압타머 프로파일에서 각 동일 압타머(예컨대 A 시료의 압타머 프로파일에서의 a' 압타머와 B 시료의 압타머 프로파일에서의 동일한 a' 압타머)의 정량 결과를 평균값으로 산출하고 그 각 동일 압타머 평균값의 전체적인 분포로 도출함으로써 얻어질 수 있다.
평균화된 압타머 프로파일은 2가지일 수 있는데, 예컨대 질환자의 2가지 이상의 압타머 프로파일에서 얻어진 한 가지와, 정상인의 2가지 이상의 압타머 프로파일에서 얻어진 다른 한 가지일 수 있다.
만일 한 가지의 평균화된 압타머 프로파일이 질환자의 수백가지 시료, 수천가지 시료에 대해서 얻어진 것이고, 다른 한 가지의 평균화된 압타머 프로파일이 정상인의 수백가지 시료, 수천가지 시료에 대해서 얻어진 것일 경우, 피검자의 분석 대상 시료에 대한 압타머 프로파일을 상기 2가지의 평균화된 압타머 프로파일과 비교하여 그 피검자를 질환자 또는 정상인으로 분류할 때 그 정확성이 높아질 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 (a) 단계의 압타머 라이브러리는 2 가지 이상의 분석 대상 시료에 대해서 동일한 압타머 라이브러리가 사용되는 것이 바람직하다. 여기서 동일한 압타머 라이브러리는 동일한 압타머의 조성을 갖는 압타머 라이브러리를 말한다. 동일한 압타머 라이브러리가 사용될 때, 각 표적 단백질에 대한 압타머가 동일하기 때문에(즉 동일한 서열을 가진 압타머이기 때문에) 표적 단백질과 그에 대한 압타머 사이에 결합력이 동일하여 결합력에 따른 정량 결과의 차이가 발생하지 않으므로 결국 이렇게 얻어진 정량 결과는 2가지 이상의 시료 구분에 있어 보다 유용하게 사용될 수 있다.
또 본 발명의 방법에서, 본 발명은 상기 (i) 단계에서 얻어진 정량 결과에 있어서 차이가 있는 것으로 결정된 하나 이상의 압타머를 이용하여 그 압타머가 특이적으로 결합하는 표적 단백질 분자를 분리하고 당업계에 공지된 방법(예컨대 표적 단백질 분자 동정에 사용되는 MALDI-TOF 등의 방법)을 이용하여 그 표적 단백질 분자를 동정하는 단계가 상기 (i) 단계 후에 추가로 포함될 수 있다. 이러한 표적 단백질 분자의 동정은 유용한 질병 특이적 바이오마커의 후보 등을 제공할 수 있는 효과를 가진다.
또 본 발명에서, 상기 (i) 단계에서 얻어진 정량 결과에 있어서 차이가 있는 것으로 '이미' 결정된 한 가지 이상의 압타머를, 상기 (a) 단계의 압타머 라이브러리 대신 사용하여, 상기 (a) 단계 내지 (i) 단계를 추가로 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 이 경우 상기 한 가지 이상의 압타머는 상기 2 가지 이상의 분석 대상 시료 사이에서 이미 정량 결과에 있어 차이가 있는 것으로 확인된 압타머이기 때문에 2가지 이상의 분석 대상 시료의 구분을 보다 용이하게 할 수 있는 효과를 가진다. 상기 한 가지 이상의 압타머는, 이를 이용하여 상기 (a) 단계 내지 (i) 단계를 수행하기 전에 이미 그 서열이 결정되고 제조되어 준비된 상태일 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 표적 단백질 분자는 단백질, 당단백질, 지질단백질 또는 짧은 길이의 단백질인 펩타이드 등 일 수 있다.
또 본 발명의 방법에서, 상기 표적 단백질 분자 집단은 미지의 표적 단백질 분자를 포함할 수 있다.
또 본 발명의 방법에서, 상기 시료 중의 표적 단백질 분자 집단에 특이적인 압타머 라이브러리는, 바람직하게는 (i) 서로 다른 다양한 무작위 서열을 가져 다양한 표적 단백질 분자들에 대한 잠재적 결합 능력을 가진 단일가닥 핵산 라이브러리를 제작하고, (ii) 이 단일가닥 핵산 라이브러리를 시료의 표적 단백질 분자 집단과 반응시켜 각 단일가닥 핵산과 각 표적 단백질 분자 사이에 특이적 결합을 유도하여 복합체의 집단을 형성시키고, (iii) 비결합한 단일가닥 핵산을 제외시켜 그 복합체 집단을 분리하고, (iv)그 복합체 집단의 단일가닥 핵산을 증폭하여 얻어진 것일 수 있다.
이 경우 상기 (i) 단계 내지 (iv) 단계는 1회 수행되고, 상기 비결합한 단일가닥 핵산을 제외시키는 것은 세척 단계를 통해 수행되며, 또 상기 세척 단계는 2회 이상 반복하여 수행되며, 상기 세척 단계는 계면활성제, 염, 경쟁 분자 또는 이들의 혼합물을 포함하는 세척버퍼를 처리하여 수행되는 것이 바람직할 수 있다.
또 본 발명의 방법에서, 상기 압타머는 단일가닥 RNA 또는 단일가닥 DNA일 수 있으며, 이 단일가닥 RNA 또는 단일가닥 DNA는, 당, 포스페이트 또는 염기에서 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.
또 본 발명의 방법에서, 상기 시료는 혈액 등의 생체시료 또는 그 가공시료인 혈장, 혈청 등인 것이 바람직할 수 있다.
또 본 발명의 방법에서, 표적 단백질들이 결합된 자성입자들의 분리나 압타머-표적 단백질-자성입자 복합체 집단의 분리는 자석을 이용하여 이루어질 수 있다.
또 본 발명의 방법에서, 상기 (d) 단계의 자성입자에 결합된 표적 단백질 분자와 압타머의 복합체 형성시킬 때, 경쟁 분자가 표적 단백질 분자와 압타머의 특이적 결합을 향상시키기 위하여 상기 압타머 처리시 함께 처리되는 것이 바람직할 수 있다.
또 본 발명의 방법에서, 상기 (f) 단계의 압타머-표적 단백질-자성입자 복합체 집단에서 압타머 집단을 분리하는 단계는, 가열, 카오트로픽 염(chaotropic salt)의 처리, pH의 강산성이나 강염기성으로의 변화 유도, 계면활성제의 처리 또는 이들의 복합 처리에 의해서 이루어지는 것이 바람직할 수 있다.
또 본 발명의 방법에서, 상기 (g) 단계의 압타머의 정량은 차세대서열분석 기술, 마이크로어레이 방법 또는 다중 실시간 PCR 방법에 의해 수행되는 것이 바람직할 수 있다.
기타 본 발명의 시료 구분 방법에 대해 구체적으로 설명되지 않은 기술적 사항들에 대해서는 상기 본 발명의 시료의 표적 단백질 분자 집단에 대한 프로파일을 생성하는 방법과 관련하여 설명한 바가 그대로 유효하며 그 해당 부분을 참조할 수 있다.
또 다른 측면에 있어서, 시료 중의 표적 단백질 분자 집단에 특이적인 압타머 라이브러리의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 압타머 라이브러리의 제조 방법은 (a) 무작위 서열을 가져 다양한 단백질들에 대한 잠재적 결합 능력을 가진 단일가닥 핵산 라이브러리를 제조하는 단계, (b) 시료에 단백질 친화성 자성입자들을 혼합하여 그 시료 중의 표적 단백질 집단의 표적 단백질들을 그 자성입자들에 결합시키는 단계, (c) 시료 중의 미결합 성분들을 제거하여 표적 단백질들이 결합된 자성입자들을 얻는 단계, (d) 상기 표적 단백질들이 결합된 자성입자들에 상기 단일가닥 핵산 라이브러리를 처리하여 그 라이브러리의 각 단일가닥 핵산을, 상기 자성입자들에 결합된 표적 단백질들의 각 표적 단백질에 결합시켜 단일가닥 핵산-표적 단백질-자성입자 복합체 집단을 형성시키는 단계, (e) 미결합 단일가닥 핵산을 제거하여, 단일가닥 핵산-표적 단백질-자성입자 복합체 집단을 얻는 단계, (f) 상기 복합체 집단에서 단일가닥 핵산 집단을 분리하는 단계, 및 (g) 상기 분리된 단일가닥 핵산 집단으로부터 시료 중 표적 단백질 분자 집단에 특이적인 단일가닥 핵산 집단인 압타머 라이브러리를 제조하는 단계를
본 발명의 시료 중의 표적 단백질 분자 집단에 특이적인 압타머 압타머 라이브러리 제조 방법에 있어서, 그 라이브러리를 구성하는 각 압타머 서열 결정은 BAC library 구축을 통한 클로닝에 의한 서열 결정 방법(Genome Res 2001 Mar; 11(3):483-496)을 적용하거나 차세대서열분석 기술(Next generation sequencing) 등 당업계에 공지된 방법에 따라 이루어질 수 있다.
또 본 발명의 방법에서, 상기 (g) 단계 후에 상가 압타머 라이브러리의 각 압타머의 서열을 결정하는 단계가 추가로 포함되는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 표적 단백질 분자는 단백질, 당단백질, 지질단백질 또는 짧은 길이의 단백질인 펩타이드일 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 표적 단백질 분자 집단은 미지의 표적 단백질 분자를 포함하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 (a) 단계의 단일가닥 핵산 라이브러리는 5' 보존영역과 3' 보존 영역을 가지고 그 사이에 무작위 서열을 가지는 것이 바람직할 수 있다.
또 본 발명의 방법에서, 상기 (c) 단계의 표적 단백질들이 결합된 자성입자들을 얻는 단계와 상기 (e) 단계의 단일가닥 핵산-표적 단백질-자성입자 복합체 집단을 얻는 단계는 자석을 이용하여 이루어지는 것이 바람직하다.
또 본 발명의 방법에서, 상기 (a) 단계 내지 (g) 단계는 1회 이상 수행되고, 상기 (e) 단계의 미결합 단일가닥 핵산을 제거하는 단계는 자석을 이용하여 단일가닥 핵산-표적 단백질-자성입자 복합체 집단을 고정시킨 후 2회 이상의 세척 단계에 의하여 수행되며, 이 세척 단계는 계면활성제, 염, 경쟁 분자 또는 이들의 혼합물을 포함하는 세척버퍼를 처리하여 수행될 수 있다. 상기 (a) 단계 내지 (g) 단계는 1회 이상 수행하되, 이렇게 2회 이상 세척 단계를 수행하는 것은 상기 압타머 라이브러리의 제작 방법과 관련하여 설명한 바와 같이, 최종 제조되는 압타머 라이브러리가 분석 대상 시료의 표적 단백질 분자들을 최대한 다양하게 반영하도록 하기 위함이다.
또 본 발명의 방법에서, 상기 (f) 단계의 단일가닥 핵산 집단의 분리는 가열, 카오트로픽 염(chaotropic salt)의 처리, pH의 강산성이나 강염기성으로의 변화 유도, 계면활성제의 처리 또는 이들의 복합 처리에 의해서 이루어지는 것이 바람직할 수 있다.
또 본 발명의 방법에서, 상기 단일가닥 핵산은 단일가닥 RNA 또는 단일가닥 DNA인 것이 바람직할 수 있다.
또 본 발명의 방법에서, 상기 단일가닥 RNA 또는 단일가닥 DNA는, 당, 포스페이트 또는 염기에서 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직할 수 있다.
또 본 발명의 방법에서, 상기 시료는 생체시료 또는 그 가공시료인 것이 바람직할 수 있다.
또 본 발명의 방법에서, 상기 (d) 단계의 자성입자에 결합된 표적 단백질 분자와 단일가닥 핵산의 복합체 얻을 때, 경쟁 분자가 표적 단백질 분자와 단일가닥 핵산의 특이적 결합을 향상시키기 위하여 상기 단일가닥 핵산과 함께 처리되는 것이 바람직할 수 있다.
기타 본 발명의 시료 중의 표적 단백질 분자 집단에 특이적인 압타머 라이브러리의 제조 방법에 대해 구체적으로 설명되지 않은 기술적 사항들에 대해서는 상기 본 발명의 시료의 표적 단백질 분자 집단에 대한 프로파일을 생성하는 방법 또는 상기 본 발명의 2가지 이상의 시료의 구분 방법과 관련하여 설명한 바가 그대로 유효하며 그 해당 부분을 참조할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 압타머를 이용하여 표적 단백질 분자 집단에 대한 프로파일을 얻는 방법을 제공할 수 있다. 본 발명의 방법은 시료 중의 표적 단백질 분자 집단에 대한 프로파일이 미지의 표적 단백질 분자를 포함하여 압타머 프로파일로 제공될 수 있으며, 이러한 압타머 프로파일은 약물 처방의 적합성 여부 판단(예컨대 항암제 동반진단 등), 질병 진단 정보 제공, 약물 치료의 모니터링, 약물 순응도 판단, 약물 처리에 대한 In vitro 상에서의 세포 반응 여부나 정도, 생물종의 분류나 동정 등 인간에게 유용한 정보를 제공하는데 사용될 수 있다.
도 1 내지 5는 정상인 혈청의 단백질 분자 집단에 특이적인 RNA 압타머를 사용하여, 폐암 환자의 혈청 시료와 정상인의 혈청 시료 중의 단백질 분자 집단에 대해 획득한 압타머 라이브러리와 이 압타머 라이브러리를 통하여 상기 2가지 시료가 구분됨을 보여주는 결과이다.
도 6 내지 10은 혈청의 단백질 분자 집단에 특이적인 DNA 압타머를 사용하여, 폐암 환자의 혈청 시료와 정상인의 혈청 시료 중의 단백질 분자 집단에 대해 획득한 압타머 라이브러리와 이 압타머 라이브러리를 통하여 상기 2가지 시료가 구분됨을 보여주는 결과이다.
도 6 내지 10은 혈청의 단백질 분자 집단에 특이적인 DNA 압타머를 사용하여, 폐암 환자의 혈청 시료와 정상인의 혈청 시료 중의 단백질 분자 집단에 대해 획득한 압타머 라이브러리와 이 압타머 라이브러리를 통하여 상기 2가지 시료가 구분됨을 보여주는 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 무작위 이중가닥 핵산 라이브러리의 제조
시료 중의 표적 단백질 분자 집단에 특이적으로 결합하는 RNA 압타머 라이브러리 제조를 위하여, 먼저 아래 <일반식 I> 구조의 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오티드들(무작위 단일가닥핵산들)을 주문 제조하였다(한국, 바이오니아).
<일반식 I>
5'-GGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGGCCN50 CATAACCCAGAGGTCGATGGATCCCCCC-3'
상기 <일반식 I> 구조의 올리고뉴클레오티드는 5'보존영역-가변영역-3'보존영역으로 구성되어 있다.
상기에서 밑줄 친 염기서열은 기지의 서열로 이루어진 고정된 부위인 보존영역이며, 가변영역인 50개 뉴클레오티드로 구성된 N50은 각 위치에 A, G, T, C 등의 염기들이 같은 빈도로 존재한다.
상기 <일반식 I>의 올리고뉴클레오타이드를 주형으로 하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 수행하여 이중가닥 DNA 라이브러리를 제조하였다. 이때 사용되는 프라이머는, T7 프로모터 서열이 포함된 하기의 DS 정방향 프라이머(서열번호 2)와 DS 역방향 프라이머(서열번호 3)이다.
<DS 정방향 프라이머>
5'-GGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGGCC- 3' (서열번호 1)
<T7 프로모터 서열이 포함된 DS 정방향 프라이머>
5'-TAATACGACTCACTATAGGGGGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGGCC-3' (서열번호 2)
<DS 역방향 프라이머>
5'-GGGGGGATCCATCGACCTCTGGGTTATG-3' (서열번호 3)
상기 T7 프로모터 서열이 포함된 DS 정방향 프라이머(서열번호 2)는 상기 <일반식 I> 구조의 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오티드의 5' 보존영역(밑줄친 부분의 서열)에 대한 프라이머 서열 이외에 박테리오파지 T7의 RNA 폴리머라아제를 위한 T7 프로모터 서열(서열번호 2에서 밑줄로 표시된 부분)을 포함하고 있다. 상기 DS 역방향 프라이머(서열번호 3)는 상기 <일반식 I> 구조의 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오티드의 3' 보존영역(밑줄친 부분의 서열)에 대한 프라이머 서열이다.
PCR 수행은 상기 <일반식 I> 구조의 단일가닥핵산 올리고뉴클레오티드를 주형으로 상기 정방향 프라이머(서열번호 2) 및 상기 역방향 프라이머(서열번호 3)를 사용하여 이루어졌다.
구체적으로, 1,000 pmole의 단일가닥핵산 올리고뉴클레오티드, 2,500 pmole 프라이머 쌍(T7 프로모터 서열이 포함된 DS 정방향 프라이머, DS 역방향 프라이머)을 50mM KCl, 10mM Tris-Cl (pH 8.3), 3mM MgCl2, 0.5mM dNTP(dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP) 및 0.1U Taq DNA Polymerase (Perkin-Elmer, Foster City Calif.)를 혼합하여 PCR을 수행한 후, QIAquick-spin PCR 정제 칼럼(QIAGEN Inc., Chatsworth Calif.)으로 정제하였다. 이렇게 하여 T7 프로모터가 있는 이중가닥핵산 DNA를 제조하였다．이 PCR 산물은 T7 프로모터(밑줄친 부분의 서열)를 포함하는 이중가닥 DNA이며, 그것의 일반 구조식은 아래의 <일반식 Ⅱ>와 같이 표현될 수 있다.
<일반식 Ⅱ>
5´-TAATACGACTCACTATAGGGGGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGGCCN50CATAACCCAGAGGTCGATGGATCCCCCC-3'
<실시예 2> 단일가닥핵산 RNA 라이브러리 제조
본 실시예에서는 시료 중의 단백질 분자 집단과 반응시킬 RNA 단일가닥핵산 라이브러리를 제조하였다. 이 RNA 단일가닥 핵산 라이브러리는 변형된 뉴클레오티드인 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 단일가닥 RNA 라이브러리(single-stranded nucleic acid library, SSN library)이며, <실시예 1>에서 제조된 ＜일반식 Ⅱ> 구조의 PCR 산물을 이용하여 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 RNA 단일가닥핵산을 DuraScribe® T7 Transcription Kit (Lucigen, USA)로 생체외 전사를 수행하여 합성하고 정제하여 제조하였다.
구체적으로 200 pmoles의 상기 제조된 ＜일반식 Ⅱ>의 이중가닥 DNA, 40mM Tris-Cl (pH 8.0), 12mM MgCl2, 5mM DTT, 1mM spermidine, 0.002% Triton X-100, 4% PEG 8000, 5U T7 RNA Polymerase 그리고 1mM (ATP, GTP) 및 3mM (2'F-CTP, 2'F-UTP)를 혼합하여 37℃에서 6 ~ 12시간 동안 반응시킨 후, Bio-Spin 6 크로마토그래피 칼럼(Bio-Rad Laboratories, Hercules Calif.)으로 정제한 후, UV 스펙트로미터를 이용하여 정제된 핵산의 양 및 그 순도를 분석하였다.
<실시예 3> 시료의 단백질 분자 집단에 특이적으로 결합하는 RNA 압타머 라이브러리의 제조와 시료 구분에의 적용
<실시예 3-1> 시료의 단백질 분자와 자성입자 복합체 집단의 제조
(1) 시료의 준비
시료는 서울아산병원(IRB 승인번호: 2015-0607)에서 제공받은 정상인의 혈청 시료를 사용하였다.
유용한 표적 단백질 검출의 민감성을 높이기 위하여 제조사에서 제공하는 방법에 따라 MARC(Multiple Affinity Removal Column) 칼럼(Agilent Technologies Inc. USA)을 이용하여 환자의 혈청에 과량으로 존재하는 단백질(high abundant protein)을 제거한 것을 실제 실험에 단백질 시료로 사용하였다. MARC 컬럼을 통과한 혈청 시료는 미량으로 존재하는 단백질(low abundant protein)과 과량으로 존재하는 단백질(high abundant protein)로 분획된다.
단백질 시료는 단백질 분해 방지를 위하여, 0.6 mM MgCl2, 1 mM Trisodium EDTA, 0.8 mM AEBSF, 단일가닥핵산 RNA 농도의 5배의 효모 tRNA가 포함된 0.94x SB17에 희석하여 10% 시료 용액을 제조하여 사용하였다.
(2) 자성입자의 준비
자성입자는 2종류의 탄소 시리즈(carbon series) C3 비드와 C8 비드 그리고 WCX(weak cation exchange) 비드 총 3종을 구입하고(Dynal Biotech Ltd, 미국), 같은 용량으로 혼합하여 준비하였다.
(3) 자성입자와 단백질 시료 반응
1.5㎖ 튜브에서 시료 용액 10㎕를 반응용액(50mM HEPES, pH 7.5, 125mM NaCl, 5mM KCl, 5mM NgCl2, 1mM EDTA, 0.05% TWEEN-30) 90㎕에 혼합하고 가볍게 흔들어 준 다음, 여기에 상기에서 준비한 자성입자 5㎕를 첨가하고, 비특이적 반응을 차단하기 위하여 1mM 덱스트란 황산(Dextran sulfate)을 포함하는 완충용액 PB1(10 mM HEPES, pH 7.5, 101 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM trisodium EDTA 및 0.05 % (v/v) Tween-20) 5㎕을 첨가하여 100rpm에서 40분간 교반기를 이용하여 교반시켜 자성입자와 시료의 단백질 분자 집단 사이의 복합체 형성을 유도하였다.
이렇게 복합체 형성을 유도한 후, 상기 반응 혼합액이 있는 튜브를 자석이 있는 스탠드에 놓고, 용액 층을 피펫으로 조심스럽게 제거하였다. 그 후 미결합 단백질을 제거하기 위하여 상기 튜브에 상기 반응용액 500㎕를 넣고 100 rpm으로 10분간 교반기로 교반하고 자석이 있는 스탠드에 놓고 용액을 피펫으로 제거하는 것을 3회 반복하여 3회 세척을 수행하였다. 이렇게 하여 단백질 분자와 자성입자 사이의 복합체 집단을 제조하였다.
<실시예 3-2> 시료의 단백질 집단에 특이적인 RNA 압타머 집단의 제조
먼저 상기 <실시예 2>에서 제조된 단일가닥핵산 RNA 라이브러리를, 300 pM의 농도가 되도록, 반응용액(50mM HEPES, pH 7.5, 125mM NaCl, 5mM KCl, 5mM NgCl2, 1mM EDTA, 0.05% TWEEN-30)에 첨가하고 80℃에서 10분간 가열한 후, 얼음에 10분간 방치하였다. 이후 비특이 반응을 차단할 수 있도록, 단일가닥핵산 RNA 5배 농도 효모 tRNA(yeast tRNA, Life Technologies사)와 0.2% BSA(bovine serum albumin, Merck사)을 상기 반응용액에 첨가하였다.
다음 상기 <실시예 3-1>에서 준비한, 단백질 분자와 자성입자 사이의 복합체 집단이 들어 있는 튜브에 PB1 완충용액 195㎕을 첨가하고, 여기에 상기 단일가닥핵산 RNA 라이브러리 반응용액 5㎕를 첨가하였다. 첨가 후 300 rpm에서 40분간 교반기를 이용하여 교반시켜 자성입자와 단백질 분자 그리고 단일가닥핵산 RNA 사이의 복합체 집단의 형성을 유도하였다.
이렇게 복합체 집단의 형성을 유도한 후, 상기 <실시예 3-1>과 마찬가지로 반응 튜브를 자석이 있는 스탠드에 놓고 용액을 제거한 후 반응용액으로 3회 세척을 수행하여 미결합 또는 비특이적 단일가닥핵산 RNA을 제거하여, 자성입자와 단백질 분자 그리고 단일가닥핵산 RNA 사이의 복합체 집단을 제조하였다.
다음 복합체 집단을 새로운 1.5㎖ 튜브에 넣고, DEPC 멸균 정제수 50㎕를 첨가하였다. 그 후 95℃ 히트 블럭(heat block)에서 10분간 두어 RNA 용리를 유도하였다. 다음 탭핑(tapping)하여 막에 붙은 RNA까지 용리되도록 한 후 QIAquick-spin PCR 정제 칼럼(QIAGEN Inc., Chatsworth Calif.)으로 정제하고 얼음에 두었다. 정제된 단일가닥핵산 RNA를 PCR를 위한 새로운 튜브에 옮겨 시료의 단백질 분자 집단과 특이적으로 결합하는 RNA 압타머 집단을 확보하였다.
<실시예 3-3> 시료의 단백질 집단과 특이적으로 결합하는 RNA 압타머 라이브러리의 제조
상기 확보된 RNA 압타머 집단에 대해서 먼저 T7 프로모터가 있는 DS 정방향 프라이머(서열번호 2)와 DS 역방향 프라이머(서열번호 3)로 RT-PCR(Reverse transcription PCR)를 수행하였다.
RT-PCR은 SuperScript IV Reverse Transcriptase 키트(Thermofisher 사, 미국)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 구체적으로 먼저 DS 역방향 프라이머(서열번호 3)를 사용하여 cDNA를 제조하고, T7 프로모터가 있는 DS 정방향 프라이머(서열번호 2), 역방향 프라이머(서열번호 3) 및 HotStarTaq DNA Polymerase키트(Qiagen 사, 독일)를 사용하여 PCR를 수행하였다.
얻어진 RT-PCR 산물에 대해서 상기 <실시예 2>와 동일하게 생체외 전사를 수행하여 최종적으로 시료의 단백질 분자 집단과 특이적으로 결합하는 RNA 압타머 라이브러리를 제조하였다.
상기 제조한 RNA 라이브러리에 대해서 상기 <실시예 3-1> 및 <실시예 3-2>의 과정을 1회 이상 추가로 반복하여 보다 특이도과 친화도가 높은 RNA 압타머 라이브러리를 제조할 수도 있다. 그러나 시료의 단백질 분자 집단에 특이적인 RNA 라이브러리는 그 시료에 포함된 단백질 분자의 다양성을 있는 그대로 반영하여야 하는 것이 이상적이므로, 상기 <실시예 3-1> 및 <실시예 3-2>의 과정을 1회만 수행하되, 세척 과정을 반복하여 시료에 포함된 단백질 분자의 다양성을 잘 반영하는 RNA 압타머 라이브러리를 제조하였다.
<실시예 3-4> 분석 시료와 비교 시료 구분에의 적용
상기 <실시예 3-3>에서 얻어진 정상인 혈청 시료의 단백질 분자 집단(미량으로 존재하는 단백질 분자 집단)에 대한 RNA 압타머 라이브러리를 이용하여 폐암 환자의 6가지 혈청 시료(분석 시료, L5, L7, L8, L10, L13 및 L14)와 정상인의 6가지 혈청 시료(비교 시료, N1 내지 N6)의 구분에 적용하였다.
시료는 서울아산병원(IRB 승인번호: 2015-0607)에서 제공받은 폐암 환자의 혈청 시료와 정상인의 혈청 시료를 사용하였고, 분석은 각 시료에 대해서 상기 <실시예 3-1>과 <실시예 3-2>에서와 동일한 과정을 수행하여 시험 시료와 대조 시료의 단백질 분자 집단에 특이적으로 결합한 RNA 압타머 집단을 분리하였다.
구체적으로 시료와 자성입자를
반응시켜 단백질 분자와 자성입자 복합체 집단을 제조한 후, 여기에 상기 <실시예 3-3>에서 얻어진 RNA 압타머 라이브러리를 반응시켜 단백질 분자와 자성입자 그리고 RNA 압타머 사이의 복합체 집단을 형성시켰다. 다음 자석이 있는 스탠드 위에서 세척을 통해 미결합 또는 비특이적 RNA 압타머를 3회 세척하여 제거한 후, 95℃ 히트 블럭(heat block)에서 10분간 두어 RNA 압타머 집단을 용리시켰다. 용리된 RNA 압타머 집단을 QIAquick-spin PCR 정제 칼럼(QIAGEN Inc., Chatsworth Calif.)으로 정제하였다. 정제된 RNA 압타머 집단을 PCR를 위한 새로운 튜브에 옮겨 그 RNA 압타머에 대해서 상기 DS 프라이머를 사용하여 cDNA를 제조하고 이 cDNA에 대해서 일방향 PCR(One-way PCR)를 1회 수행하여, 용리된 RNA 압타머 집단에 대응하는 집단적 이중가닥 DNA 단편을 얻었다.
일방향 PCR은 T7 프로모터를 포함하는 DS 정방향 프라이머(서열번호 2)와 DS 역방향 프라이머(서열번호 3) 10:1로 하여 conventional PCR과 동일한 방식을 사용하여 수행하였다. 구체적으로, 1,000 pmole의 상기 제조된 cDNA, 2,500 pmole 프라이머 쌍(T7 프로모터 서열이 포함된 DS 정방향 프라이머, DS 역방향 프라이머의 비율은 10:1)을 50mM KCl, 10mM Tris-Cl (pH 8.3), 3mM MgCl2, 0.5mM dNTP(dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP) 및 0.1U Taq DNA Polymerase (Perkin-Elmer, 미국.)를 혼합하여 PCR을 수행한 후, QIAquick-spin PCR 정제 칼럼(QIAGEN Inc., 독일.)으로 정제하였다.
이후 Ion AmpliSeq Library Kit 20(Ion Torrent, Thermofisher Scientific 사)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 NGS(Next Generation Sequencing) 라이브러리를 제작한 후, Ion Torrent (104, ThermoFisher 사)를 사용하여 각 DNA 단편의 염기서열을 분석하고 각 DNA 단편의 출현 빈도(각 DNA 단편의 개수 또는 양)와 각 DNA 단편의 출현 빈도의 전체적인 종합인 압타머 프로파일을 획득하였다.
결과를 도 1 내지 도 5에 나타내었다. 도 1 및 도 2는 각각 분석 시료인 폐암 시료와 비교 시료인 비폐암 시료에서 결합 압타머 가지 수, 총 출현빈도(결합 압타머 총 갯수), 평균 빈도 및 최대 빈도를 나타낸 것이고, 도 3 및 도 4는 각각 6가지 폐암 시료에 대한 일부 압타머들(BioSign_일련번호)의 압타머 프로파일과 정상 시료에 대한 일부 압타머들의 압타머 프로파일을 나타낸 것이며, 도 5는 폐암 시료와 정상 시료에서 출현 빈도에 있어서 차이가 있는 일부 압타머들의 압타머 프로파일을 비교하여 나타낸 것이다.
도 1 내지 5를 참조하여 보면, 분석 시료와 반응한 RNA 압타머 라이브러리와 비교시료와 반응한 RNA 압타머 라이브러리의 프로파일(각 RNA 압타머의 종합적 출현 빈도로서 RNA 압타머 출현빈도는 DNA의 출현빈도로 나타남)이 뚜렷하게 구분됨을 알 수 있다.
<실시예 4> 시료의 단백질 분자 집단에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 라이브러리의 제조와 시료 구분에의 적용
<실시예 4-1> 시료의 단백질 분자 집단에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 라이브러리의 제조
상기 <실시예 1>의 <일반식 I>의 올리고뉴클레오티드를 주형으로 사용하고 DS 정방향 프라이머(서열번호 1)와 DS 역방향 프라이머(서열번호 3)을 사용하여 상기 <실시예 1>에서와 같은 조건으로 PCR를 30회 수행하여다. 이 PCR 산물에 대해, DNA 압타머 준비에 사용할 단일가닥핵산 DNA를 제조하기 위하여 DS 역방향 프라이머(서열번호 3)을 사용하여 일방향 PCR(One-way PCR)를 프라이머 비율만 조절된 DNA를 HotStarTaq DNA Polymerase 키트(Qiagen 사, 독일)를 사용하여 3회 수행하여 센스 단일가닥을 증폭하고 이 센스 단일가닥은 HotStarTaq DNA Polymerase 키트(Qiagen 사, 독일)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 분리하여, 단일가닥핵산 DNA 라이브러리를 준비하였다.
다음 상기 <실시예 3-1>에서와 동일하게 단백질 분자와 자성입자 사이의 복합체 집단을 준비하고, 이 복합체 집단과 상기 단일가닥핵산 DNA 라이브러리를 반응시켜 상기 <실시예 3-2>에서와 동일하게 DNA 압타머 집단을 확보하였다.
확보한 DNA 압타머 집단에 대해서 DS 정방향 프라이머(서열번호 1)와 DS 역방향 프라이머(서열번호 3)을 사용하여 상기 <실시예 1>에서와 같은 조건으로 PCR를 30회 수행하고, DNA를 HotStarTaq DNA Polymerase 키트(Qiagen 사, 독일) 키트를 이용하여 제조사의 방법에 따라 이중가닥 DNA를 단일가닥 DNA를 전환시켜, 최종적으로 시료의 단백질 분자 집단과 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 라이브러리를 제조하였다.
여기서도 DNA 라이브러리에 대해서 상기 <실시예 3-1> 및 <실시예 3-2>의 과정을 1회 이상 추가로 반복하여 보다 특이도과 친화도가 높은 DNA 압타머 라이브러리를 제조할 수도 있다. 그러나 시료의 단백질 분자 집단에 특이적인 DNA 라이브러리는 그 시료에 포함된 단백질 분자의 다양성을 있는 그대로 반영하여야 하는 것이 이상적이므로, 상기 <실시예 3-1> 및 <실시예 3-2>의 과정을 1회만 수행하되, 세척 과정을 반복하여 시료에 포함된 단백질 분자의 다양성을 잘 반영하는 DNA 압타머 라이브러리를 제조하였다.
<실시예 4-2> 시료의 구분에의 적용
상기 <실시예 4-1>에서 얻어진 정상인 혈청 시료의 단백질 분자 집단(미량으로 존재하는 단백질 분자 집단)에 대한 DNA 압타머 라이브러리를 이용하여 폐암 환자의 6가지 혈청 시료(분석 시료, L5, L7, L8, L10, L13 및 L14)와 정상인의 6가지 혈청 시료(비교 시료, N1 내지 N6)의 구분에 적용하였다.
시료는 서울아산병원(IRB 승인번호: 2015-0607)에서 제공받은 폐암 환자의 혈청 시료와 정상인의 혈청 시료를 사용하였고, 분석은 각 시료에 대해서 상기 <실시예 4-1>에서와 동일한 과정을 수행하여 시험 시료와 대조 시료의 단백질 분자 집단에 특이적으로 결합한 DNA 압타머 집단을 분리하였다.
구체적으로 시료와 자성입자를
반응시켜 단백질 분자와 자성입자 복합체 집단을 제조한 후, 여기에 상기 <실시예 4-1>에서 얻어진 DNA 압타머 라이브러리를 반응시켜 단백질 분자와 자성입자 그리고 DNA 압타머 사이의 복합체 집단을 형성시켰다. 다음 자석이 있는 스탠드 위에서 세척을 통해 미결합 또는 비특이적 DNA 압타머를 3회 세척하여 제거한 후, 95℃ 히트 블럭(heat block)에서 10분간 두어 DNA 압타머 집단을 용리시켰다. 용리된 DNA 압타머 집단을 QIAquick-spin PCR 정제 칼럼(QIAGEN Inc., Chatsworth Calif.)으로 정제하였다. 정제된 DNA 압타머 집단을 PCR를 위한 새로운 튜브에 옮겨 그 DNA 압타머에 대해서 DS 프라이머를 사용하여 일방향 PCR(One-way PCR)를 1회 수행하여, 용리된 DNA 압타머 집단에 대응하는 집단적 이중가닥 DNA 단편을 얻었다. 이후 Ion AmpliSeq Library Kit 20(Ion Torrent, Thermofisher Scientific 사)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 NGS(Next Generation Sequencing) 라이브러리를 제작한 후, Ion Torrent (104, ThermoFisher 사)를 사용하여 각 DNA 단편의 염기서열을 분석하고 각 DNA 단편의 출현 빈도(각 DNA 단편의 개수 또는 양)와 각 DNA 단편의 출현 빈도의 전체적인 종합인 압타머 프로파일을 획득하였다.
결과를 도 6 내지 도 10에 나타내었다. 도 6 및 도 7은 각각 분석 시료인 폐암 시료와 비교 시료인 비폐암 시료에서 결합 압타머 가지 수, 총 출현빈도(결합 압타머 총 갯수), 평균 빈도 및 최대 빈도를 나타낸 것이고, 도 8 및 도 9는 각각 6가지 폐암 시료에 대한 일부 압타머들(BioSign_일련번호)의 압타머 프로파일과 정상 시료에 대한 일부 압타머들의 압타머 프로파일을 나타낸 것이며, 도 10은 폐암 시료와 정상 시료에서 출현 빈도에 있어서 차이가 있는 일부 압타머들의 압타머 프로파일을 비교하여 나타낸 것이다.
도 6 내지 10을 참조하여 보면, 분석 시료와 반응한 DNA 압타머 라이브러리와 비교시료와 반응한 DNA 압타머 라이브러리의 프로파일(각 DNA 압타머의 종합적 출현 빈도임)이 뚜렷하게 구분됨을 알 수 있다.
Claims (44)
- (a) 시료의 표적 단백질 집단에 특이적인 압타머 라이브러리를 준비하는 단계, (b) 상기 시료와 동류(同類)의 분석 대상 시료에 단백질 친화성 자성입자들을 혼합하여 그 분석 대상 시료 중의 표적 단백질 집단의 표적 단백질들을 그 자성입자들에 결합시키는 단계, (c) 시료 중의 미결합 성분들을 제거하여 표적 단백질들이 결합된 자성입자들을 얻는 단계, (d) 상기 표적 단백질들이 결합된 자성입자들에 상기 압타머 라이브러리를 처리하여 그 압타머 라이브러리의 각 압타머를, 상기 자성입자들에 결합된 표적 단백질들의 각 표적 단백질에 결합시켜 압타머-표적 단백질-자성입자 복합체 집단을 형성시키는 단계, (e) 미결합 압타머를 제거하여, 압타머-표적 단백질-자성입자 복합체 집단을 얻는 단계, (f) 상기 복합체 집단에서 압타머 집단을 분리하는 단계, 및 (g) 상기 분리된 압타머 집단으로부터 그 압타머 집단의 각 압타머를 정량하여 압타머 프로파일을 생성하는 단계를 포함하는,
압타머를 이용하여 시료의 표적 단백질 분자 집단에 대한 프로파일을 생성하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 시료의 표적 단백질 분자 집단에 대한 프로파일은 압타머 프로파일인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 압타머 프로파일은 약물 처방의 적합성 여부 판단, 질병 진단 정보 제공, 약물 치료의 모니터링, 약물 순응도 판단, 약물 처리에 대한 인 비트로 상에서의 세포 반응 여부, 약물 처리에 대한 인 비트로 상에서의 세포 반응 정도, 생물종의 분류 또는 생물종의 동정에 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 표적 단백질 분자는 단백질, 당단백질, 지질단백질 또는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 표적 단백질 분자 집단은 미지의 표적 단백질 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 시료 중의 표적 단백질 분자 집단에 특이적인 압타머 라이브러리는, (i) 서로 다른 다양한 무작위 서열을 가져 다양한 표적 단백질 분자들에 대한 잠재적 결합 능력을 가진 단일가닥 핵산 라이브러리를 제작하고, (ii) 이 단일가닥 핵산 라이브러리를 시료의 표적 단백질 분자 집단과 반응시켜 각 단일가닥 핵산과 각 표적 단백질 분자 사이에 특이적 결합을 유도하여 복합체의 집단을 형성시키고, (iii) 비결합한 단일가닥 핵산을 제외시켜 그 복합체 집단을 분리하고, (iv) 그 복합체 집단의 단일가닥 핵산을 증폭하여 얻어진 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (i) 단계 내지 (iv) 단계는 1회 수행되고,
상기 비결합한 단일가닥 핵산을 제외시키는 것은 세척 단계를 통해 수행되고, 상기 세척 단계는 2회 이상 반복하여 수행되며, 상기 세척 단계는 계면활성제, 염, 경쟁 분자 또는 이들의 혼합물을 포함하는 세척버퍼를 처리하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 압타머는 단일가닥 RNA 또는 단일가닥 DNA인 것을 특징으로 하는 방법,
- 제8항에 있어서,
상기 단일가닥 RNA 또는 단일가닥 DNA는, 당, 포스페이트 또는 염기에서 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 시료는 생체시료 또는 그 가공시료인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (c) 단계의 미결합 성분들을 제거하여 표적 단백질들이 결합된 자성입자들을 얻는 단계와 상기 (e) 단계인 미결합 압타머를 제거하여, 압타머-표적 단백질-자성입자 복합체 집단을 얻는 단계는 자석을 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (b) 단계의 단백질 친화성 자성입자들은 (i) 친수성 단백질에 친화성을 가지는 물질이 결합되어 있는 자성입자, (ii) 소수성 단백질에 친화성을 가지는 물질이 결합되어 있는 자성입자, (iii) 이온성 단백질에 친화성을 가지는 물질이 결합되어 있는 자성입자 또는 이들의 2 이상의 자성입자의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (d) 단계의 표적 단백질 분자와 압타머의 복합체 형성시킬 때, 경쟁 분자가 표적 단백질 분자와 압타머의 특이적 결합을 향상시키기 위하여 상기 압타머 라이브러리와 함께 상기 표적 단백질들이 결합된 자성입자들에 처리되는 것을 특징으로 하는 방법
- 제1항에 있어서,
상기 (f) 단계의 복합체 집단에서 압타머 집단을 분리하는 단계는, 가열, 카오트로픽 염(chaotropic salt)의 처리, pH의 강산성이나 강염기성으로의 변화 유도, 계면활성제의 처리 또는 이들의 복합 처리에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서
상기 (g) 단계의 압타머의 정량은 차세대서열분석 기술, 마이크로어레이 방법 또는 다중 실시간 PCR 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- (a) 시료의 표적 단백질 집단에 특이적인 압타머 라이브러리를 준비하는 단계, (b) 상기 시료와 동류(同類)의 분석 대상 시료에 단백질 친화성 자성입자들을 혼합하여 그 분석 대상 시료 중의 표적 단백질 집단의 표적 단백질들을 그 자성입자들에 결합시키는 단계, (c) 시료 중의 미결합 성분들을 제거하여 표적 단백질들이 결합된 자성입자들을 얻는 단계, (d) 상기 표적 단백질들이 결합된 자성입자들에 상기 압타머 라이브러리를 처리하여 그 압타머 라이브러리의 각 압타머를, 상기 자성입자들에 결합된 표적 단백질들의 각 표적 단백질에 결합시켜 압타머-표적 단백질-자성입자 복합체 집단을 형성시키는 단계, (e) 미결합 압타머를 제거하여, 압타머-표적 단백질-자성입자 복합체 집단을 얻는 단계, (f) 상기 복합체 집단에서 압타머 집단을 분리하는 단계, (g) 상기 분리된 압타머 집단으로부터 그 압타머 집단의 각 압타머를 정량하여 압타머 프로파일을 생성하는 단계, (h) 상기 (a) 내지 (g) 단계를, 상기 분석 대상 시료와 다른 한 가지 이상의 분석 대상 시료에 대해 동일하게 수행하여 그 한 가지 이상의 다른 분석 대상 시료의 표적 단백질 분자 집단에 대한 압타머 프로파일을 생성하는 단계, (i) 상기 (g) 단계를 통해 생성한 압타머 프로파일과 상기 (h) 단계를 통하여 생성한 압타머 프로파일을 비교하여 압타머 정량 결과에 있어 차이가 있는 하나 이상의 압타머를 결정함으로써 상기 2가지 이상의 분석 대상 시료를 구분하는 단계를 포함하는
2가지 이상의 분석 대상 시료의 구분 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 (a) 단계의 압타머 라이브러리는 상기 2 가지 이상의 분석 대상 시료에 대해서 동일한 압타머 라이브러리가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 (h) 단계의 분석 대상 시료는 2가지 이상이고, 또 상기 압타머 프로파일도 상기 2가지 이상의 분석 대상 시료에 대해서 각각 얻어지며,
상기 2가지 이상의 압타머 프로파일을 평균화시킨, 평균화된 압타머 프로파일을 생성하는 단계가 상기 (h) 단계 후에 추가되며,
상기 (i) 단계는 상기 평균화된 압타머 프로파일과 상기 (g) 단계를 통해 얻어진 압타머 프로파일을 비교하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 (i) 단계에서 얻어진 정량 결과에 있어서 차이가 있는 것으로 결정된 하나 이상의 압타머를 이용하여 그 압타머가 특이적으로 결합하는 표적 단백질 분자를 분리하고 그 표적 단백질 분자를 동정하는 단계가 상기 (i) 단계 후에 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 (i) 단계에서 얻어진 정량 결과에 있어서 차이가 있는 것으로 이미 결정된 한 가지 이상의 압타머를, 상기 (a) 단계의 압타머 라이브러리 대신 사용하여, 상기 (a) 단계 내지 (i) 단계를 추가로 수행하는 단계를 추가로 수행하고,
상기 (i) 단계는 상기 정량 결과에 있어서 차이가 있는 것으로 이미 결정된 한 가지 이상의 압타머에 대해서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 표적 단백질 분자는 단백질, 당단백질, 지질단백질 또는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 표적 단백질 분자 집단은 미지의 표적 단백질 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 시료 중의 표적 단백질 분자 집단에 특이적인 압타머 라이브러리는, (i) 서로 다른 다양한 무작위 서열을 가져 다양한 표적 단백질 분자들에 대한 잠재적 결합 능력을 가진 단일가닥 핵산 라이브러리를 제작하고, (ii) 이 단일가닥 핵산 라이브러리를 시료의 표적 단백질 분자 집단과 반응시켜 각 단일가닥 핵산과 각 표적 단백질 분자 사이에 특이적 결합을 유도하여 복합체의 집단을 형성시키고, (iii) 비결합한 단일가닥 핵산을 제외시켜 그 복합체 집단을 분리하고, (iv)그 복합체 집단의 단일가닥 핵산을 증폭하여 얻어진 것을 특징으로 하는 방법.
- 제23항에 있어서,
상기 (i) 단계 내지 (iv) 단계는 1회 수행되고,
상기 비결합한 단일가닥 핵산을 제외시키는 것은 세척 단계를 통해 수행되며, 상기 세척 단계는 2회 이상 반복하여 수행되며, 상기 세척 단계는 계면활성제, 염, 경쟁 분자 또는 이들의 혼합물을 포함하는 세척버퍼를 처리하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 압타머는 단일가닥 RNA 또는 단일가닥 DNA인 것을 특징으로 하는 방법,
- 제25항에 있어서,
상기 단일가닥 RNA 또는 단일가닥 DNA는, 당, 포스페이트 또는 염기에서 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 시료는 생체시료 또는 그 가공시료인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 (c) 단계의 미결합 성분들을 제거하여 표적 단백질들이 결합된 자성입자들을 얻는 단계와 상기 (e) 단계인 미결합 압타머를 제거하여, 압타머-표적 단백질-자성입자 복합체 집단을 얻는 단계는 자석을 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 (b) 단계의 단백질 친화성 자성입자들은 (i) 친수성 단백질에 친화성을 가지는 물질이 결합되어 있는 자성입자, (ii) 소수성 단백질에 친화성을 가지는 물질이 결합되어 있는 자성입자, (iii) 이온성 단백질에 친화성을 가지는 물질이 결합되어 있는 자성입자 또는 이들의 2 이상의 자성입자의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 (d) 단계의 표적 단백질 분자와 압타머의 복합체 형성시킬 때, 경쟁 분자가 표적 단백질 분자와 압타머의 특이적 결합을 향상시키기 위하여 상기 압타머 라이브러리와 함께 상기 표적 단백질들이 결합된 자성입자들에 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 (f) 단계의 복합체 집단에서 압타머 집단을 분리하는 단계는, 가열, 카오트로픽 염(chaotropic salt)의 처리, pH의 강산성이나 강염기성으로의 변화 유도, 계면활성제의 처리 또는 이들의 복합 처리에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서
상기 (g) 단계의 압타머의 정량은 차세대서열분석 기술, 마이크로어레이 방법 또는 다중 실시간 PCR 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- (a) 무작위 서열을 가져 다양한 단백질들에 대한 잠재적 결합 능력을 가진 단일가닥 핵산 라이브러리를 제조하는 단계, (b) 시료에 단백질 친화성 자성입자들을 혼합하여 그 시료 중의 표적 단백질 집단의 표적 단백질들을 그 자성입자들에 결합시키는 단계, (c) 시료 중의 미결합 성분들을 제거하여 표적 단백질들이 결합된 자성입자들을 얻는 단계, (d) 상기 표적 단백질들이 결합된 자성입자들에 상기 단일가닥 핵산 라이브러리를 처리하여 그 라이브러리의 각 단일가닥 핵산을, 상기 자성입자들에 결합된 표적 단백질들의 각 표적 단백질에 결합시켜 단일가닥 핵산-표적 단백질-자성입자 복합체 집단을 형성시키는 단계, (e) 미결합 단일가닥 핵산을 제거하여, 단일가닥 핵산-표적 단백질-자성입자 복합체 집단을 얻는 단계, (f) 상기 복합체 집단에서 단일가닥 핵산 집단을 분리하는 단계, 및 (g) 상기 분리된 단일가닥 핵산 집단으로부터 시료 중 표적 단백질 분자 집단에 특이적인 단일가닥 핵산 집단인 압타머 라이브러리를 제조하는 단계를 포함하는 시료 중의 표적 단백질 분자 집단에 특이적인 압타머 라이브러리의 제조 방법.
- 제33항에 있어서,
상기 (g) 단계 후에 상가 압타머 라이브러리의 각 압타머의 서열을 결정하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제33항에 있어서,
상기 표적 단백질 분자는 단백질, 당단백질, 지질단백질 또는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제33항에 있어서,
상기 표적 단백질 분자 집단은 미지의 표적 단백질 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제33항에 있어서,
상기 (a) 단계의 단일가닥 핵산 라이브러리는 5' 보존영역과 3' 보존 영역을 가지고 그 사이에 무작위 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제33항에 있어서,
상기 (c) 단계의 표적 단백질들이 결합된 자성입자들을 얻는 단계와 상기 (e) 단계의 단일가닥 핵산-표적 단백질-자성입자 복합체 집단을 얻는 단계는 자석을 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제33항에 있어서,
상기 (a) 단계 내지 (g) 단계는 1회 이상 수행되고, 상기 (e) 단계의 미결합 단일가닥 핵산을 제거하는 단계는 자석을 이용하여 단일가닥 핵산-표적 단백질-자성입자 복합체 집단을 고정시킨 후 2회 이상의 세척 단계에 의하여 수행되며, 이 세척 단계는 계면활성제, 염, 경쟁 분자 또는 이들의 혼합물을 포함하는 세척버퍼를 처리하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제33항에 있어서,
상기 압타머는 단일가닥 RNA 또는 단일가닥 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제40항에 있어서,
상기 단일가닥 RNA 또는 단일가닥 DNA는, 당, 포스페이트 또는 염기에서 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제33항에 있어서,
상기 시료는 생체시료 또는 그 가공시료인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제33항에 있어서,
상기 (d) 단계의 표적 단백질 분자와 단일가닥핵산의 복합체 얻을 때, 경쟁 분자가 표적 단백질 분자와 단일가닥핵산의 특이적 결합을 향상시키기 위하여 상기 단일가닥 핵산과 함께 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제33항에 있어서,
상기 (f) 단계의 단일가닥 핵산 집단의 분리는 가열, 카오트로픽 염(chaotropic salt)의 처리, pH의 강산성이나 강염기성으로의 변화 유도, 계면활성제의 처리 또는 이들의 복합 처리에 의해서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
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