KR20220163640A - 단백체의 집단적 정량을 위한 자성 수집을 이용한 단백체 결합 압타머 풀의 제조 및 이의 자동화 장비 - Google Patents

단백체의 집단적 정량을 위한 자성 수집을 이용한 단백체 결합 압타머 풀의 제조 및 이의 자동화 장비 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백체의 집단적 정량을 위한 자기 수집을 이용한 단백체 결합 압타머 풀의 제조 및 이를 위한 자동화 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 단백체의 집단적 정량을 위한 자기 수집을 이용하여 단백체 결합 압타머 풀의 제조는 자동화 방식으로 자동화 액체 처리 장치상에서 실시될 수 있도록 하여 높은 수준의 자동성 그리고 단백체의 잡단적 정량에서 재현성 및 반복성의 이점을 갖는다.

Description

단백체의 집단적 정량을 위한 자성 수집을 이용한 단백체 결합 압타머 풀의 제조 및 이의 자동화 장비{Preparation of Proteome Binding Aptamer Pool using Magnetic Collection for Quantitatively Analyzing Proteome and Automated Equipment thereof}
본 발명은 단백체의 집단적 정량을 위한 자성 수집을 이용한 단백체 결합 압타머 풀의 제조 및 이를 위한 자동화 장비에 관한 것이다.
시료를 구성하는 단백체를 분석하는 기술, 단백체에 포함된 단백질들의 정량 및 양적인 상태를 종합화한 정보, 즉 단백체의 프로파일(profile)을 생산하는 기술과 표적분자를 동정하는 기술은 물리학, 생화학 및 생물정보학의 발달로 널리 개발되었으나, 기존 방법이나 기기의 사용 및 유지비, 용이성, 정확도, 민감도, 검사시간 및 과정의 자동화 등에 대한 문제로 효율적인 새로운 방법 및 기기에 대한 필요성이 매우 높다.
최근에, 2-D 겔 전기영동 및 질량 분석 검정이 개발되었으며 소량 포함된 혈장 성분들의 측정을 가능하게 하였다. 그러나 고농도로 존재하는 단백질의 혈장/혈청을 제거하는 노동집약적 예비분류 프로토콜의 수행이 요구된다(Anderson, Proteomics (3005); Anderson and Anderson, Electrophoresis (1991); Gygi and Aebersold, Curr Opin Chem Biol (3000); Liotta, et al., JAMA (3001); Yates, Trends Genet (3000); and Adkin, et al., Mol Cell Proteomics (3002) 참조). 또한, 이런 검정들은 시간 소비적이고, 이들 방법을 수행하기 위해 필수 장비들을 구입하고 유지하는데 비용이 많이 든다.
생체시료의 단백체, 예를 들어 혈장 단백체가 질병 진단 및 치료적 모니터링을 위해 편리한 표본으로서 매우 유망하지만, 기존 검정 및 기술이 감도 제한, 시간 및 효율 제한, 및 관련된 과도할 수 있는 비용을 포함하는 여러 결점을 갖는다. 또한, 기존 검정 및 기술은 바이오마커를 위해 원료로서 생체시료을 충분히 이용하지 못한다. 예를 들어, 전기영동 및 질량분석 모두는 단백질 크기 및 전하에 기초하여 혈장 단백질을 분리하지만, 단백질의 기타 물성에 기초한 검정 및 기술이 결여되어 있다. 시료의 단백체 프로파일을 수득하고 이용하는 방법에 대한 요구가 당업계에 있고, 상기-언급된 기존 기술의 단점들을 극복하기 위해 노력하고 있다.
압타머(aptamer)는 표적 단백질들에 대해 높은 특이적 결합성을 가지는, 표적 화합물 또는 단백질에　대한 특이적 단일가닥핵산인 리간드이다. 압타머의 제조방법으로는, "SELEX"(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)" 방법이 널리 사용되고 있다. SELEX(셀렉스) 방법은 표적분자에 높은 특이적 결합성을 가진 핵산 단백질의 생체외 전개에 관한 방법으로, 1990. 6. 11 출원의 미국특허 출원 제07/536,428호(현재 포기), 미국특허 제5,475,096호(발명의 명칭: "Nucleic Acid Ligands") 및 미국특허 제5,270,163호(발명의 명칭: "Nucleic Acid Ligands") 등에 기재되어 있다.
SELEX 방법은, 핵산이 다양한 2 차원 및 3 차원 구조를 형성하기에 충분한 능력과, 실질적으로 임의의 화학적 화합물(단량체 또는 중합체 상관없이)에　대해 리간드로서 작용(즉, 특이적 결합 쌍을 형성)하기에 충분한, 단량체 내에서 이용 가능한 화학적 다기능성(chemical versatility)을 보유한다는 것을 바탕으로 한다. 임의의 크기 또는 조성을 갖는 단백질이 표적분자로 이용될 수 있다. 압타머는 매우 유용한 리간드로 많이 연구되고 있으나, 압타머의 일반적인 선별방법은 기지 단백질 혹은 물질을 대상으로 실시되는 한계가 있다.
본 발명자는 미지단백질 또는 기지단백질을 포함하는 복합시료를 대상으로 단백질에 결합하는 단일가닥핵산(압타머)을 선발하고 압타머에 결합하는 표적분자를 정량하는 방법 등을 제안하였다. 즉, 단백체에 대한 프로파일을 생산하는 Reverse-SELEX(대한민국 특허등록 제10-0670799호 참조), 압타머기반 바이오칩(대한민국 특허등록 제10-0464225 참조), 압타머기반 바이오칩을 이용한 생물학적 의미 분석 기술(대한민국 특허등록 제10-0924048호 참조)을 수행함에 있어서, 단일가닥핵산을 이용하여 단백체 프로파일을 생산하는 방법 및 생체시료를　구성하는 다중의 단백질에 결합한 압타머의 선정하는　방법 등을 제시하였다.
기존 집단정량 기술은 시료 처리 단계의 수동 공정에 따른 집단적 정량 기술의 재현성 및 반복성이 이슈가 있어 본 발명에서 시료 처리 단계를 자성비드를 이용하여 자동화하여 재현성 및 반복성 이슈를 해결하여 특허출원하였다.
본 발명은 단백체를 집단적 정량하기 위한 자성비드를 이용한 단백체 결합 압타머 풀의 제조 방법 및 자동화 장비 등을 개시한다.
본 발명의 목적은 분석 대상 시료 중의 표적 단백질의 재현성 및 반복성이 높은 집단적 정량 방법을 제공하기 위한 자성비드를 이용하여 단백체 결합 압타머 풀의 제조하는 방법 및 이를 위한 자동화 장비를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 분석 대상 시료 중의 표적 단백질과 표적 핵산의 동시 분석 방법 및 이를 위한 자동화 장비를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.
일 측면에 있어서, 본 발명은, 분석 대상 시료에, 그 시료에 존재하는 단백체의 집단적 정량을 하기 위해서,
(a) 분석 대상 시료에, 그 시료에 존재하는 단백체와 Magnetic Beads(자성비드)를 접촉시켜 제조된 단백체-자성비드 복합체를 미결합 단백체를 포함한 상기 분석대상 시료를 구성하는 혼합물로부터 세척 및 분리를 자기력으로 실시하는 단백체-자성비드 복합체의 1차 자기 수집 단계;
(b) 상기 1차 수집된 복합체와 압타머 풀을 접촉시킴으로써, 제조된 압타머 풀-단백체-자성비드 복합체를 미결합하거나 비특이적으로 결합한 압타머들로부터 세척 및 분리를 자기력으로 실시하는 압타머 풀-단백체-자성비드 복합체의 2차 자기 수집 단계; 및
(c) 상기 2차 수집된 복합체에 포함된 결합 압타머 풀을 용출하는 단계를 포함하는 단백체 결합 압타머 풀의 제조 및 이의 자동화 장비를 제공한다.
본 발명의 방법에서, 분석 대상 시료는 바람직하게는 인체 또는 동물로부터 얻어진 생체시료 또는 환경시료일 수 있다. 생체시료는 혈액, 소변, 침, 정액, 양수, 림프액, 객담, 조직, 활액, 세포, 세포 추출물 등 검출하고자 하는 표적 단백질을 포함하거나 포함하고 있을 것으로 의심되어 검출의 필요성을 가지는 인체 또는 동물로부터 얻어진 것일 수 있다. 예컨대 혈장, 혈청, 생체시료에 단백질 추출 키트를 적용하여 단백질 농도를 높인 시료, 조직 추출물, 조직에서 얻어진 세포, 세포 용해물, 세포 배양물 등일 수 있다. 또 생체시료에서 그 생체시료 중에 많은 양으로 존재하고 표적 단백질로서의 유용성(예컨대 특정 질병에 대한 바이오마커로 사용될 가능성 등)이 떨어지는 단백질을 제거한 시료일 수도 있다.
본 발명자는 미지단백질 또는 기지단백질을 포함하는 복합시료를 대상으로 단백질에 결합하는 단일가닥핵산(압타머)을 선발하고 압타머에 결합하는 표적분자를 정량하는 방법 등을 제안하였다. 즉, 단백체에 대한 프로파일을 생산하는 Reverse-SELEX(대한민국 특허등록 제10-0670799호 참조), 압타머기반 바이오칩(대한민국 특허등록 제10-0464225 참조), 압타머기반 바이오칩을 이용한 생물학적 의미 분석 기술(대한민국 특허등록 제10-0924048호 참조)을 수행함에 있어서, 단일가닥핵산을 이용하여 단백체 프로파일을 생산하는 방법 및 생체시료를　구성하는 다중의 단백질에 결합한 압타머의 선정하는　방법 등을 제시하였다.
기존 발명에서, 예컨대 분석 대상 시료를, 단백질에 대한 높은 결합 친화성을 가지는 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)이 있는 반응용액(이러한 반응용액은 예컨대 60 mM TrisCl (pH 7.4), 5 mM KCl, 100mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0.1% NaN3의 조성으로 이루어질 수 있다)에 처리하여 반응시켜 분석 대상 시료의 표적 단백체를 니트로셀룰로오스 막에 부착시키고, 여기에 특이적인 압타머 라이브러리를 처리하여 복합체의 형성을 유도한 후에 적절한 세척버퍼로 세척하여 미결합하거나 비특이적으로 결합한 압타머를 제거하여 복합체만이 결합되어 있는 니트로셀룰로오스 막을 회수함으로써 복합체 집단만의 분리가 가능하다. 또한 예컨대 적절한 세척버퍼로 세척하여 미결합하거나　비특이적으로　결합한 단백체를 제거하여 복합체 집단을 수집할　수 있다. 여기서 세척 버퍼와 이를 이용한 세척 단계와 관련해서는 기존 발명의 방법과 관련하여 설명한 바를 참조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 단백체의 수집을 자기 수집으로 수행하여 단백체 진단 정량의 재현성 및 반복성을 구현하고자 하였다. 단백체의 자기 수집은 (a) 분석 대상 시료에, 그 시료에 존재하는 단백체와 Magnetic Beads(자성 비드)를 접촉시켜 제조된 단백체-자성 비드 복합체를 미결합 단백체를 포함한 상기 분석대상 시료를 구성하는 혼합물로부터 세척 및 분리를 자기력으로 하는 자기 수집 단계로 매우 간단하게 할 수 있다.
본 발명의 상기 (a) 단계에서 제안하는 단백체의 자기 수집 기술은 이전 단백체 수집 절차에 비해 몇 가지 장점이 있다. 이 프로세스는 일반적으로 몇 가지 처리 단계만으로 매우 간단한다. 수집 절차의 모든 단계는 단일 테스트 튜브 또는 다른 용기에서 수행할 수 있다. 기타 장비가 필요하지 않다. 수집 공정은 부유 고체 물질을 포함하는 원유 시료에서 직접 수행할 수 있다. 일부 경우 (예 : 세포 내 단백질 분리) 분해 및 분리 단계를 통합하여 총 분리 시간을 단축할 수도 있다. 자기 흡착제의 자기 특성 (및 처리된 시료에 존재하는 대부분의 오염 분자 및 입자의 반자성 특성)으로 인해 시료에서 비교적 쉽고 선택적으로 수집할 수 있다.
본 발명의 자성비드 즉, 친화성 또는 소수성 리간드 또는 이온 교환기가 고정된 자성 담체(Magnetic carriers bearing an immobilized affinity or hydrophobic ligand or ion-exchange groups)를 표적 단백체를 포함하는 분석 대상 시료와 혼합한다. 본 발명의 자성비드는 MB-C3, C8 및 C18, MB-WCX, WAX, MB-IMAC Fe Cu, MB-IAC Prot G 등과 같은 다양한 종류의 키트를 사용할 수도 있다. MB-HIC 키트는 소수성 코팅 (C3, C8, C18)으로 기능화된 고 다공성 표면을 가진 초상 자성 마이크로 입자를 기반으로 한다.
MB-WCX 키트는 양이온 교환 크로마토 그래피를 가능하게 하는 표면에 음으로 하전된 작용기가 있는 초상 자성 마이크로 입자를 기반으로 한다. 물질의 결합은 용액에서 하전된 분자가 반대 전하의 고정된 이온 교환기에 가역적으로 흡착되기 때문에 발생한다. MB-IMAC Fe 키트는 초상 자성 마이크로 입자의 표면에서 포스포펩티드 (예 : 단백질 분해물)의 선택적 분리 및 사전 농축을 위해 설계되었다. 펩티드의 인산화된 아미노산 잔기와 자기 비드 사이의 특정 상호 작용은 고정된 다가 금속 이온 (예 : Fe3 +)으로 기능화된 입자 표면을 통해 실현된다. MB-IMAC Cu Kit를 사용하여 킬레이트화에 의해 고정된 Cu 이온에 대한 친화성에 따라 단백질과 펩타이드를 분리한다. 고정화된 복합체는 단백질 표면에서 아미노산 측쇄 (예 : -COO-)와 상호 작용할 수 있는 하나의 배위 부위를 가지고 있다. MB-IAC Prot G Kit는 해당 항체에 대한 친화성을 기반으로 생물학적 유체에서 항원 (예 : 펩타이드, 단백질)을 특정 캡처하기 위해 개발되었다. 그리고 AnchorChip 타겟은 강철 타겟의 결정화보다 MS 스펙트럼의 더 나은 재현성으로 더 균일한 매트릭스 결정화를 생성하기 때문에 강철 타겟 대신 AnchorChip 타겟을 사용한다.
사실, 자기 수집은 생물학적 파편 및 유사한 크기의 기타 오염 물질이 있는 경우 작은 자성 입자 (직경 약 0.1 - 1 μm)를 회수할 수 있는 유일한 방법이다. 더욱이 자기 수집 절차의 힘과 효율성은 대규모 작업에서 특히 유용한다. 자기 수집 기술은 또한 다양한 자동화 절차, 특히 단백질과 펩티드 중에서 다양한 분석물을 측정하기 위한 자기 입자 기반 면역 분석 시스템의 기초이다. 단백질 또는 핵산 분리를 위한 여러 자동화 시스템이 최근에 출시되었다.
자성 수집을 위한 기본 장비는 매우 간단하다. 고정된 친화성 또는 소수성 리간드를 갖는 자성 비드, 표적 화합물 (들)에 대한 친화성을 나타내는 바이오 폴리머로부터 제조된 자성 입자 또는 자기 이온 교환기가 일반적으로 수집 절차를 수행하는 데 사용된다. 다양한 유형의 자기 분리기를 자기 분리에 사용할 수 있지만, 저렴한 강력한 영구 자석은 특히 예비 실험에서 똑같이 효율적이다.
자성 비드는 실험실에서 준비하거나 시판되는 것을 사용할 수 있다. 이러한 비드는 일반적으로 다양한 합성 고분자, 바이오 폴리머 또는 다공성 유리로 제조된 자성 입자의 형태로 이용 가능하거나 표면 개질된 마그네타이트와 같은 무기 자성 재료를 기반으로 한 자성 입자가 사용될 수 있다. 대부분의 입자는 외부 자기장에 반응하는 초상 자성 입자처럼 행동하지만 자기장이 없으면 상호 작용하지 않는다. 이것은 자성 입자가 쉽게 재현탁되고 오랜 시간 동안 부유 상태로 남아있을 수 있기 때문에 중요하다. 대부분의 경우 입자의 직경은 약 50nm에서 약 10 μm까지 다양하다. 그러나 직경이 최대 밀리미터 범위인 더 큰 자기 친화성 입자도 성공적으로 사용할 수 있다. 직경이 약 1μm 이상인 자성 입자는 간단한 자기 분리기를 사용하여 쉽게 분리할 수 있는 반면, 작은 입자 (입자 크기가 수십 ~ 수백 나노 미터 범위인 자기 콜로이드)를 분리하려면 고 구배 자기 분리기를 사용해야 할 수 있다.
시판되는 자성 입자는 다양한 회사에서 얻을 수 있다. 대부분의 경우 폴리스티렌이 폴리머 매트릭스로 사용되지만 셀룰로오스, 아가 로스, 실리카, 다공성 유리 또는 실란화된 자성 입자를 기반으로 하는 캐리어도 사용할 수 있다. 단백질과 펩타이드 분리에 사용되는 (또는 사용 가능한) 자성 입자의 예는 다른 곳에서 찾을 수 있다.
또한 친화성 리간드 (예 : 니트릴 로트리 아세트산, 글루타티온, 트립신, 트립신 억제제, 젤라틴 등)는 이미 상업적으로 이용 가능한 담체에 고정되어 있다. 관심있는 다른 리간드를 상용 및 실험실 제작된 자성 입자 모두에 고정하기 위해 친화성 크로마토그래피에 사용되는 표준 절차를 사용할 수 있다. 일반적으로 -COOH, -OH 또는 -NH2와 같은 자성 입자의 표면에서 사용할 수 있는 작용기는 고정화에 사용되며, 경우에 따라 자성 입자는 이미 활성화된 형태 (예 : 토실 활성화, 에폭시 활성화 등)로 제공된다.
실험실에서 마그네타이트 (또는 마그마이트 또는 페라이트와 같은 유사한 자성 물질) 입자는 실란화에 의해 표면 개질될 수 있다. 이 과정은 무기 입자의 표면을 수정하여 적절한 작용기가 이용 가능하게 하여 친화성 리간드를 쉽게 고정시킬 수 있다. 예외적으로 산화철이 노출된 자성 입자를 사용하면 효소 활성이 감소할 수 있다. 이 경우 순수한 폴리머의 외부 층을 가진 캡슐화 된 마이크로 스피어가 더 안전한다.
agarose, chitosan, kappa carrageenan 및 alginate와 같은 생체 고분자는 자성 형태로 쉽게 제조할 수 있다. 가장 간단한 방법으로 바이오 폴리머 용액은 자성 입자와 혼합되고 벌크 겔 형성 후 형성된 자성 겔은 기계적으로 미세 입자로 분해한다. 또는 분산된 마그네타이트를 포함하는 바이오 폴리머 용액을 혼합 경화 용액에 떨어 뜨리거나 유중수 현탁액 기술을 사용하여 구형 입자를 제조한다.
기본적으로 동일한 절차를 사용하여 폴리아크릴아미드, 폴리 (비닐 알코올) 및 기타 여러 합성 고분자로부터 자성 입자를 제조할 수 있다.
최근에는 자기 나노 막대와 같은 비 구형 자기 구조가 표적 단백질의 특정 분리를 위한 가능한 흡착 물질로 테스트되었다.
시스템에서 자성 입자를 분리하려면 자기 분리기가 필요하다. 가장 간단한 방법으로는 작은 영구 자석을 사용할 수 있지만 강력한 희토류 자석을 사용하는 다양한 자기 분리기를 합리적인 가격으로 얻을 수 있다. 상업용 실험실 규모의 배치 자기 분리기는 일반적으로 소독제 방지 재료에 내장된 자석으로 만들어집니다. 랙은 Eppendorf 마이크로 튜브, 표준 테스트 튜브 또는 원심 분리 큐벳에서 분리할 수 있도록 구성되어 있으며, 일부에는 분리된 자성 입자를 쉽게 세척할 수 있도록 분리 가능한 자기 플레이트가 있다. 다른 유형의 분리기는 미세 적정 플레이트의 웰에서 분리할 수 있으며 편평한 자기 분리기는 많은 양의 현탁액 (최대 약 500 - 1000 ml)에서 분리하는 데 유용한다.
유동식 자기 분리기는 일반적으로 더 비싸며 고 구배 자기 분리기 (HGMS)가 전형적인 예이다. 실험실 규모의 HGMS는 적절한 자석의 극 사이에 배치된 미세 자성 등급의 스테인리스 스틸 울 또는 작은 강철 볼로 포장된 컬럼으로 구성된다. 현탁액은 컬럼을 통해 펌핑되고 자성 입자는 매트릭스 내에 유지된다. 자기장에서 컬럼을 제거한 후 입자는 흐름과 일반적으로 컬럼의 부드러운 진동에 의해 회수된다.
조밀한 서스펜션 작업의 경우 개방형 그래디언트 자기 분리기가 유용할 수 있다. 리터 부피의 현탁액에서 자기 친화성 흡착제를 분리하기위한 매우 간단한 실험 설정이 설명되었다.
많은 수의 개별 단백체 분석이 필요하다. 따라서 다른 단백체의 다중 병렬 처리를 허용하는 방법이 필요하다. 단백체의 자기 수집은 일반적으로 편리하고 빠르다. 자유 형태의 단백체는 다른 시료에서 직접 분리할 수 있다. 막 결합 단백체는 보통 적절한 세제를 사용하여 용해되어야 한다. 시료 준비 중에 핵이 끊어지면 용해물로 방출된 DNA가 시료를 매우 점성으로 만든다. 이 DNA는 표적 단백질을 분리하기 전에 21 게이지 피하 주사기 바늘을 통해 위아래로 반복된 통과에 의해 전단될 수 있다. 또는 DNase를 추가하여 DNA를 효소적으로 소화할 수 있다.
많은 경우에 자기 비드는 다른 시료에 존재하는 비표적 분자의 낮은 비특이적 결합을 나타낸다. 특정 시료는 높은 비특이적 결합 활성을 갖는 분자를 제거하기 위해 여전히 사전 세척이 필요할 수도 있다. 사전 세척이 필요한 경우 시료를 친화성 리간드로 코팅되지 않은 자기 비드와 혼합할 수 있다.
일반적으로 자기 친화성 수집은 적절한 친화성 리간드가 자성 입자는 시료에 추가되고 표적 단백체는 결합한다. 생성된 복합체는 적절한 자성 입자에 의해 포착된다. 분리된 표적 화합물이 있는 자성 입자를 자기적으로 분리한 다음 일련의 세척 단계를 수행하여 대부분의 오염 화합물 및 입자를 제거한다. 친화성 리간드가 표적 화합물에 대해 낮은 친화성을 갖는 경우 간접 절차가 더 잘 수행될 수 있다.
그러나 추가 단백체학 프로파일링 분석을 위해 가능한 한 많은 단백질과 펩티드를 얻을 수 있도록 올바른 유형의 자기 비드를 선택하는 것이 주요 관심사이다. 질량 분석법 (MS)을 사용하여 단백체 프로파일을 생성함으로써 단백질 또는 펩티드의 복잡한 혼합물을 포함하는 생물학적 시료를 분석할 수 있는 광범위한 가능성을 제공한다. 대부분의 프로파일링 실험의 목적은 특정 질병이나 임상 변화와 관련된 단백체 패턴의 변화를 확인하는 것이다. 따라서 이러한 패턴은 조기 진단을 수행하고, 정확한 예후를 제공하고, 질병 진행 또는 치료에 대한 반응을 모니터링하고, 특정 치료를 통해 혜택을 받을 가능성이 가장 높은 환자를 식별하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 (a) 단계의 분석 대상 시료에, 그 시료에 존재하는 단백체와 Magnetic Beads(자성비드)를 접촉시켜 제조된 단백체-자성비드 복합체를 미결합 단백체를 포함한 상기 분석대상 시료를 구성하는 혼합물로부터 세척 및 분리를 자기력으로 실시하여 단백체-자성비드 복합체의 1차 자기 수집 단계 다음에는, 본 발명의 방법 (b) 단계에 해당하는 상기 1차 수집된 복합체와 압타머 풀을 접촉시킴으로써, 제조된 압타머 풀-단백체-자성비드 복합체를 미결합하거나 비특이적으로 결합한 압타머들로부터 세척 및 분리를 자기력으로 실시하여 압타머 풀-단백체-자성비드 복합체의 2차 자기 수집 단계를 할 필요가 있다.
이러한 상기 (a) 단계의 단백체-자성비드 복합체 집단의 세척 및 분리는 1차 자기 수집을 통하여 이루어질 수 있다. 예컨대 분석 대상 시료를, 단백체에 대한 높은 결합 친화성을 가지는 자성비드가 있는 반응용액[이러한 반응용액은 예컨대 60 mM TrisCl (pH 7.4), 5 mM KCl, 100mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0.1% NaN3의 조성으로 이루어질 수 있다]에 처리하여 반응시켜 분석 대상 시료의 표적 단백체를 자성비드에 부착시키고, 적절한 세척버퍼로 세척하여 미결합한 단백체 및 시료를 분석하는 혼합물을 제거하여 복합체만이 결합되어 있는 자성비드를 회수함으로써 단백체-자성비드 복합체 집단만의 세척 및 분리하는 1차 자기 수집이 가능하다.
여기서 세척 버퍼와 이를 이용한 세척 단계와 관련해서는 통상적인 방법와 관련하여 설명한 바를 참조할 수 있다.
상기 (b) 단계에서 상기 분리된 단백체-자성비드 복합체에 압타머 풀을 처리하여 복합체의 형성을 유도한 후에 적절한 세척버퍼로 세척하여 미결합하거나 비특이적으로 결합한 압타머를 제거하여 복합체만이 결합되어 있는 자성비드를 회수함으로써 압타머 풀-단백체-자성비드 복합체 집단만을 세척 및 분리하는 2차 자기 수집이 가능하다. 이러한 압타머 풀-단백체- 자성비드 복합체 집단만의 분리에 자기 수집을 할 수 있다.
여기서 세척 버퍼와 이를 이용한 세척 단계와 관련해서는 통상적인 방법와 관련하여 설명한 바를 참조할 수 있다.
상기 압타머 풀은 (a) 무작위 서열을 가져 다양한 단백질들에 대한 잠재적 결합 능력을 가진 압타머 풀; (b) (i) 무작위 서열을 가져 다양한 단백질들에 대한 잠재적 결합 능력을 가진 압타머 풀을 제작하고, (ii) 이 압타머 풀을 상기 (a) 단계에서와 동일한 분석 대상 시료의 표적 단백질 집단과 반응시켜 각 압타머와 각 표적 단백질 사이에 특이적 결합을 유도하여 복합체 집단을 형성시키고, (iii) 비결합한 압타머를 제외시켜 그 복합체 집단을 분리하고, (iv) 그 복합체 집단의 압타머를 증폭하여 얻어진 압타머 풀; 및 (c) 하나 이상의 단백질들에 대한 결합 능력을 가진 압타머 풀을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 압타머는 PCR의 프라이머 세트가 상보적으로 결합할 수 있는 부위 또는 상기 상보적인 결합을 연결될 수 있다.
상기 압타머 풀의 제작 과정에서, 상기 (b) 단계의 서로 다른 다양한 서열을 가진 압타머 풀은, 일반적으로 단일가닥의 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드 핵산 풀을 의미하는데, 이 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 전술한 바와 같이, 기지의 서열로 이루어진 5' 말단 보존영역과 3' 말단 보존영역, 그리고 그 사이에 무작위 서열로 이루어진 가변영역을 포함하여 구성된다. 이 기지의 서열로 이루어진 보존영역에는 정방향/역방향 프라이머가 결합하는 서열, RNA 폴리머나아제의 프로모터 서열, 클로닝 등의 조작을 위한 제한효소 인식 서열 등이 포함될 수 있다. 상기 무작위 서열로 이루어진 가변영역은 통상 20~60개의 뉴클레오티드로 이루어지기 때문에 5'말단 영역과 3' 말단 영역을 포함한 올리고뉴클레오티드 전체의 길이는 통상 60~120개의 뉴클레오티드의 길이가 된다.
이러한 올리고뉴클레오티드의 합성은 당업계에 주지되어 있으며, 그러한 방법으로서 고체상 올리고뉴클레오티드 합성 기술, 트리에스테르 합성 방법 등의 용액상 합성 기술 등을 들 수 있다. 구체적인 것은 문헌[Nucl. Acid Res. 14:5399-5467, 1986] 문헌[Tet. Lett. 27:5575-5578, 1986], 문헌[Nucl. Acid Res. 4:2557, 1977],문헌[Lett., 28:2449, 1978] 등을 참조할 수 있다. 또한 시중에 나와 있는 자동화된 DNA 합성 장치를 이용할 수도 있으며, 이러한 장치를 이용할 경우 1014-1016개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 충분히 다양한 압타머를 포함하는 압타머 풀을 얻을 수 있다. 또한 압타머 풀로서 RNA 풀을 사용할 경우 DNA 풀을 T3, T4, T7 등의 RNA 폴리머라제로 전사시켜 RNA 풀을 얻어 사용할 수 있다.
상기 (b) 단계의 압타머 풀-단백체-자성비드 복합체 집단의 세척 및 분리를 위하여 상기 비결합한 압타머를 제거는 2차 자기 수집을 적용함으로써, 예컨대 적절한 세척 버퍼로 세척 단계를 1회 이상 수행함으로써 가능하다.
다양한 세척 버퍼를 사용하여 세척 단계를 1회 이상 수행하여 압타머 라이브러리를 제작하는 것이 바람직하다. 세척용액은 당업계에 널리 이용되는 것을 구입하여 이용하거나 적절히 조제하여 사용할 수 있는데, 이러한 세척용액으로서는 일반적으로 계면활성제 및/또는 염이 포함된다. 계면활성제로서는 SDS, Tween 20, Tween 30, Tween 40, Tween 60, Tween 80, Triton X-405, Triton X-100, Tetronic 908, Cholesterol PEG 900, Polyoxyethylene Ether W-1, Span 20, Span 40, Span 85, 이들의 혼합물이 사용될 수 있으며, 염은 리튬, 나트륨, 칼륨 및 암모늄의 아세트산염, 젖산염, 구연산염, 인산염, 질산염, 황산염, 염화물염, 이의 혼합물(SSC, SSPE 등)이 사용될 수 있다. 특히 세척용액은 TBST 용액(10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20), PBST 용액(PBS, pH 7.0, 0.05% Tween 20), Tween 20, Tween 30 등이 포함된 SSPE 용액(0.2M phosphate buffer, 2.98M NaCl, 20mM EDTA, pH7.4) 등을 사용할 수 있으며, 1~600 mM EDTA 용액 등도 사용할 수 있다.
본 발명 (c) 단계에서 압타머 풀-단백체-자성비드 복합체에서 압타머 풀의 용출은 염, pH 또는 온도에서 적절한 요소를 선택하여 실시할 수 있으며 통상적인 방법을 참조할 수 있다. 바람직하게, 95℃에서 5분간 가열 처리, pH의 변화, 카오트로픽 염(chaotropic salt)을 함유한 CAPSO 용출 버퍼에 의한 용출이다. 가열, pH의 변화이나 카오트로픽 염은 비공유결합을 파괴하여 단백질이나 핵산의 해리, 용출, 변성에 사용되는 것이 당업계에 매우 오래전부터 주지되어 있던, 상호호환적인 관용기술입니다.
여기서 본 발명의 압타머 풀을 이용한 단백체의 집단적 정량은 상기 자기 수집을 이용한 용출된 단백체 결합 압타머 풀에 통상적인 방법을 적용하여 실시할 수 있으며 이에 관한 설명를 참조할 수 있다.
<단백체 결합 압타머 풀과 핵산의 자기 수집>
분석 대상 시료 중의 표적 단백체와 유전체를 자기 수집하기 위해서,
(a) (i) 분석 대상 시료에, 그 시료에 존재하는 단백체와 Magnetic Beads(자성 비드)를 접촉시켜 제조된 단백체-자성 비드 복합체를 미결합 단백체를 포함한 상기 분석대상 시료를 구성하는 혼합물로부터 세척 및 분리를 자기력으로 1차 자기 수집하고, 상기 자기 수집된 복합체에 압타머 풀을 처리하여, 형성된 압타머 풀-단백체-자성비드 복합체를 미결합하거나 비특이적 결합한 압타머들로부터 세척 및 분리를 자기력으로 2차 자기 수집한 복합체에서 결합 압타머 풀을 용출하는 단계; 및 (ii) 상기 분석 대상 시료와 동일한 분석 대상 시료에서 자성비드를 접촉시켜 제조된 표적 핵산이 포함된 핵산-자성비드 복합체에서 표적핵산을 포함된 핵산을 용출하는 단계; 및
(b) 상기 용출된 압타머 풀과 상기 용출되고 표적 핵산이 포함된 핵산을 혼합하는 단계; 를 포함하여 구성된다.
본 발명의 단백체 결합 압타머 풀과 핵산의 동시 자기 수집은, 핵산의 서열 분석과 동일 서열을 가진 핵산에 대한 정량을 가능하게 하는 NGS 기술을 적용하여, 시료 중의 표적 단백질과 표적 핵산을 동시분석하기 위한 것으로, 이를 위하여 시료 중의 표적 단백질에 대한 압타머를 NGS 기술이 적용될 수 있는 이중가닥 DNA로 전환시키고 또 시료 중의 핵산을 이중가닥 핵산 단편으로 전환시켜, 이들을 혼합하고, NGS 기술을 적용, 시료 중의 단백질과 핵산을 동시분석하는 방법이다.
NGS를 적용하여 동시분석을 수행하면, 특정 분석 대상 시료 중의 표적 단백질과 표적 핵산에 대한 정량 정보가 동시에 얻어지며, 이와 함께 표적 단백질에 특이적인 압타머에 대한 서열과 표적 핵산에 대한 서열이 얻어질 수 있다.
본 발명의 동시분석 방법에서, 분석 대상 시료는 검출하고자 하는 표적 단백질과 표적 핵산을 포함하거나 포함하고 있을 것으로 의심되어 검출의 필요성을 가지는 임의의 혼합물 또는 용액일 수 있다. 바람직하게는 생체 시료이다. 기타 분석 대상 시료와 관련해서는 상기 본 발명의 표적 단백질의 집단적 정량 방법과 관련하여 설명한 바가 그대로 유효하며, 그 관련 내용을 참조할 수 있다.
또 본 발명의 동시분석 방법에서 상기 (a)의 (i) 단계의 그 복합체 집단만을 비결합 압타머로부터 분리하기까지의 과정에 대해서는 상기 본 발명의 표적 단백질의 집단적 정량 방법과 관련하여 설명한 바가 그대로 유효하며, 마찬가지로 그 관련 내용을 참조할 수 있다.
또 본 발명의 동시분석 방법에서, 상기 (a)의 (i) 단계의 복합체 집단의 압타머를 용출시키는 단계로 획득한 복합체 집단의 압타머에 대해서, 그 압타머가 RNA 단일가닥핵산 압타머일 경우 역전사하여 단일가닥 cDNA를 얻고 이에 대해서 일방향(one-way) PCR를 1회 수행하여 이루어질 수 있다. 압타머가 DNA 단일가닥 핵산일 경우 바로 일방향(one-way) PCR를 1회 수행하여 이루어질 수 있다. 또한 NGS 기술의 적용을 통한 서열분석을 위해서 시료의 양을 적절한 양으로 늘릴 필요가 있을 때 등에는 cDNA 등을 대상으로 PCR를 수회 또는 수십회 반복 수행하여 시료의 양을 늘릴 수도 있다. 이러한 역전사 및/또는 PCR의 수행은 복합체 집단으로부터 압타머 집단을 해리시켜 그 압타머 집단에 대해서 이루어질 수 있으나, 역전사와 PCR 과정에서 가웰 과정이 있어 복합체 집단으로부터 압타머 집단이 해리되므로 상기와 같이 별도의 해리 과정을 거치지 않더라도 무방하다. 이때 PCR 수행은, 상기 본 발명의 표적 단백질의 집단적 정량방법과 관련하여 설명한 바와 같이, 정방향 및 역방향 프라이머 결합 부위가 기지 서열의 보존영역으로 구성되어 있을 경우 1 세트의 프라이머를 가지고 이루어질 수 있다. 압타머로부터 유래한 이중가닥 DNA는 이미 NGS 기술의 적용에 적합한 크기의 단편이므로 이를 단편화시킬 단계가 특별히 요구되지는 않는다.
본 발명의 동시분석 방법에서, 표적 핵산은 gDNA 및/또는 RNA를 포함한다. gDNA라면 결실, 삽입, 단일염기다형성(SNP), 메틸화 등의 후성유전학적 변화를 갖는 gDNA를 포함한다. 만일 메틸화 gDNA를 분석하고자 할 경우 당 업계에 공지된 방법(예컨대 비설파이트(bisulfite) 처리)에 따라 적절히 전처리되어 NGS 분석에 사용될 수 있다. NGS 기술을 적용한 DNA 메틸화 분석에 대해서 더 구체적인 것은 문헌[Cancer Res. 67 (2007) 8511-8518], 문헌[Cancer Metastasis Rev (2011) 30:199-210], 문헌[Biology (Basel). 2016 Mar; 5(1):3], 문헌[J Vis Exp. 2015; (96): 52488] 등을 참조할 수 있으며, 삽입, 결실, SNP 등에 대한 NGS 분석에 대해서는 문헌[Cancer Genet. 2013 Dec; 206(12): 432-440], 문헌[Front Bioeng Biotechnol. 2015; 3: 92], 문헌[PLoS One, 2014 9: e104652], 문헌[Nature Reviews Genetics, 2011, 12:443-451] 등을 참조할 수 있다. gDNA는 페놀-클로로포름 추출 방법(phenol-chloroform extraction method) 등 당업계에 공지된 방법(Molecular Ecology Notes (2003) 3, 317-320; J Forensic Sci, May 2009, 54(3):599-607)이나 시판되는 키트(예컨대 DNAzol™ Reagent, PureLink™ Genomic DNA Mini Kit 등)를 사용하여 분리한 후, 초음파 분해(sonication) 등을 통하여 랜덤(random)하게 일정 범위의 길이(통상 1kb 이하)로 단편화시켜 NGS 기술을 적용, 그 서열을 분석할 수 있다.
표적 핵산이 RNA이라면, 단백질을 암호화하는 mRNA, 스플라이싱 이전의 pre-mRNA, 스플라이싱(splicing)에 관여하는 snRNA(small nuclear RNA), rRNA의 수식(modification)에 관여하는 snoRNA(small nucleolar RNA), 전사 후 단계에서의 유전자 발현 조절에 관여하는 miRNA(micro RNA)나 piRNA(piwi-interesting) 등을 포함한다. 이들 RNA도 당업계에 공지된 방법(J Mol Diagn. 2008 May; 10(3): 203-211; PREPARATIVE BIOCHEMISTRY & BIOTECHNOLOGY Vol. 34, No. 3, pp. 209-214, 2004)이나 시판되는 키트(TRIZOL™ Reagent, RNeasy™ FFPE Kit, PureLink™ FFPE RNA Isolation Kit, RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit 등)를 사용하여 총 RNA나 분석하고자 RNA(예컨대 mRNA)를 분리하고 그 RNA를 이중가닥 cDNA로 전환시켜 NGS 기술을 적용, 그 서열을 분석, 정량할 수 있다. 바람직하게는 생체시료의 총 RNA을 분리하고 그 총 RNA를 NGS 기술 적용을 위한 시료로 사용하고자 할 때, rRNA가 총 RNA의 대부분(통상 95%)을 차지하므로, 이를 당업계에 공지된 방법이나 적절한 시판 키트(RiboMinus™, RiboZero™ 등) 등을 사용하여 제거함으로써 총 RNA에서 나머지 상대적으로 소량 존재하는 RNA, 예컨대 mRNA, pre-mRNA, snRNA나 miRNA 등의 ncRNA(noncoding RNA)에 대해 NGS 기술을 적용하여 보다 용이하게 그 서열의 분석과 정량을 수행할 수 있다. 만일 표적 핵산으로 mRNA만을 분석하고자 할 경우 mRNA가 polyA를 가지므로 자성비드 등 지지체에 고정된 polyT 올리고를 사용하여 mRNA만을 분리하여 NGS 분석을 수행할 수 있으며, 표적 핵산으로 miRNA 등의 small RNA만을 분석하고자 할 경우 겔 전기영동(Gel electrophoresis)을 이용한 크기 선별법(Size selection)을 적용하여 miRNA만을 분리하여 NGS 기술로 분석을 수행할 수 있다. mRNA나 pre-mRNA 등 길이가 큰 RNA의 경우 cDNA 합성 전후에 NGS 기술의 적용을 위해 적절한 크기로 단편화시키는 것이 바람직할 수 있으며, 상대적으로 소량 존재하는 RNA의 경우 그 cDNA를 증폭하여 그 증폭물을 NGS 기술로 분석하는 것이 바람직할 수도 있다.
또 표적 핵산은 미지의 서열을 갖는 gDNA 상의 임의의 유전자이거나 미지의 서열을 갖는 mRNA 등의 임의의 RNA일 수 있으며, 또 기지의 서열을 갖는 특정 유전자나 RAN 또는 그 유전자나 RNA로부터 얻어진 증폭물일 수도 있다. 이처럼 표적 핵산은 그 서열분석 및/또는 정량이 요구되는 시료 중의 임의의 핵산일 수 있다.
또 본 발명의 동시분석 방법에서, 상기 (a) 단계의 압타머의 이중가닥 DNA나 핵산의 이중가닥 DNA 단편에 대해, 아탑터의 부가 등을 통해 각각 시퀀싱 라이브러리(Sequencing library)를 제조한 후 그 시퀀싱 라이브러리를 혼합하고 그 시퀀싱 라이브러리 혼합물에 대해, NGS 기기를 적용하여 분석을 수행할 수도 있다. 이와 관련하여 일루미나(Ilumina)사의 NGS 기기에 대해 예로 들어 설명하면, 시퀀싱 라이브러리는 DNA 단편은 말단 수선(End Repair)과 아데노신 접합(dA-Tailing) 그리고 아답터(adapter)의 부가 등에 의해 제조된다. 이러한 시퀀싱 라이브러리는 DNA 단편 라이브러리를 NGS 기기로 서열분석을 수행할 수 있는 상태로 전환시키기 위한 것으로, 상기에서 일루미나(Ilumina)사의 NGS 기기를 예로 들어 설명하였지만, 각 NGS 기기에 따라 해당 제조사의 프로토콜에 따라 이중가닥 DNA 단편을 시퀀싱 라이브러리로 전환, 제조할 수 있다.
또 본 발명의 동시분석 방법에서, 상기 (a) 단계의 각 시료 즉 압타머의 이중가닥 DNA와 핵산의 이중가닥 DNA 단편에 대해 그 혼합 전에 이들이 유래한 시료를 구분할 수 있는 바코드(barcode)를 상기 이중가닥 DNA에 아탑터의 부가와 함께 부가할 수 있다. 이러한 바코드는 gDAN와 RAN를 표적 단백질과 동시분석할 경우에는 이들 핵산 시료를 구분하기 위해서도 각 시료로부터 얻어진 이중가닥 DNA 단편에 도입될 수 있으며, RNA를 분석할 경우에는 각 RNA 시료(예컨대 miRNA 등의 small RNA 시료 와 mRNA 시료)를 구분하기 위해서 각 시료로부터 얻어진 이중가닥 DNA 단편에 도입될 수도 있다. 이러한 바코드는 짧은 길이(통상 6-bp)의 DNA로 시료를 구분할 수 있도록 각 시료마다 특유의 서열을 가지도록 제작된다. NGS 기술을 통한 다중 시료의 서열분석에 이러한 바코드를 이용한 시료의 구분은 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Mol. Ecol. 19, 2455-473 (2010)], 문헌], 문헌[Biology 2012, 1(3), 895-905] 등을 참조할 수 있다.
또 본 발명의 동시분석 방법에서, 상기 본 발명의 표적 단백질의 집단적 정량 방법에서처럼, 상기 (a) 단계의 단백질 시료와 핵산 시료로 나눠지기 전의 상기 분석 대상 시료에 그 시료 중에는 그 유사체(analog)도 존재하지 않는 2종 이상 외부 표준단백질을 서로 다른 정량값으로 첨가하고 그 외부 표준단백질에 특이적 압타머를 상기 압타머 라이브러리에 포함시켜 그 외부 표준단백질에 대한 검출 결과를 표적 단백질의 정량에 이용할 수 있다. 이와 관련하여 더 구체적인 것은 상기 본 발명의 표적 단백질의 집단적 정량 방법에서 설명한 바를 그대로 참조할 수 있다.
또 본 발명의 동시분석 방법에서, 표적 단백질의 정량을 위하여 상기 2종 이상의 외부 표준단백질을 사용하는 것과 마찬가지로, 핵산 정량을 위하여, 상기 (a) 단계의 분석 대상 시료에 그 시료에는 시료에는 존재하지 않는 2종 이상의 외부 표준핵산을 서로 정량값으로 첨가할 수도 있다. 이 경우도 외부 표준핵산의 정량값은 표적 핵산의 정량에 유용하게 이용될 수 있다. 이러한 외부 표준핵산은 정량하고자 하는 표적 핵산을 고려하여 그 표적 핵산에 상응하게 적절한 크기로 제작될 수 있는데, 예컨대 표적 핵산이 mRNA이고 그 크기가 lkb일 경우, 800b 내지 1200b로 제작될 수 있다, 또한 외부 표준핵산은 동류의 핵산 즉 표적 핵산이 mRNA이면 poly A가 3' 말단에 접합된 RNA로 제작될 수 있다. 이러한 외부 표준핵산의 적절한 선택도 상기 외부 표준 단백질에서와 같이 현재 유전체 서열 분석이 완료된 생물종에 대한 유전정보와 분석 대상 시료가 얻어진 생물종에 대한 유전정보를 비교함으로써 이루어질 수 있다. 이러한 외부 표준핵산도 외부 표준단백질과 마찬가지로 시료 준비 등에서의 차이(variation) 등에 대한 정도관리(quality control)를 위하여 사용될 수 있다. 이러한 외부 표준핵산도 2종 이상이라면 특별한 제한없이 수종 내지 수백종까지 서로 다른 정량값으로 사용될 수 있다.
또 본 발명의 동시분석 방법에서도, 상기 본 발명의 표적 단백질의 집단적 정량방법에서처럼 각 표적 단백질의 압타머 및 각 표적 핵산에 대응하는 이미 서열이 결정된 참조서열을 상기 (c) 단계의 정량과 서열 결정 등에 이용할 수 있으며, 또 표적 단백질이 미지의 단백질일 경우는 그에 대한 압타머를 이용하여 분리, 동정하는 단계가 추가로 포함될 수 있다.
기타 본 발명의 동시분석 방법에 대해 구체적으로 설명되지 않은 기술적 사항들에 대해서는 상기 본 발명의 표적 단백질의 집단적 정량 방법과 관련하여 설명한 바가 그대로 유효하며 그 해당 부분을 참조할 수 있다.
<자동화 장비>
전통적으로 생체분자를 추출하는 작업은 실험자의 수작업으로 수행되어 왔다. 하지만, 한번에 생체분자를 추출하여야 하는 시료 수가 늘어나고 추출 과정에 대한 정도 관리의 필요성이 높아지면서, 근래에는 생체분자 추출 및 정제 작업을 자동으로 수행하는 자동화 장치들이 많이 개발되고 있다.
일반적으로, 핵산에 결합하고 결합된 핵산을 용출할 수 있는 자성 비드(magnetic bead)들이 자동화 핵산 추출 방법에 보통 사용되고 있다. 자성 비드를 사용하는 자동화 핵산 추출 방법은 자성 비드에 결합된 핵산을 용출시키는 공정의 타입에 따라 액체 이송(Liquid Transfer) 방식과 비드 이송(Bead Transfer) 방식으로 나눌 수 있다. 액체 이송-타입 방법은 반응액들을 용기에 첨가하고 반응이 완료된 후, 외부 자력에 의하여 상기 용기의 내부 벽면에 자성 비드가 고정된 상태에서 용액들을 상기 용기로부터 제거하는 방식으로 실시된다. 특히, 시료, 세포-용해 시약 및 자성 비드가 용기에 첨가되고, 세포 용해 및 자성 비드에 핵산 결합이 완료된 후, 상기 자성 비드가 외부 자석의 자력에 의하여 상기 용기에 부착된 상태에서, 상기 용기 내의 상기 반응 용액은 제거한다. 그후, 세정 용액이 상기 용기에 첨가되고, 상기 세정 용액은 세정 반응이 완료된 이후, 자성 비드가 용기에 고정된 상태에서 제거된다. 마지막으로, 용출 용액이 상기 용기에 첨가되고, 용출 반응의 완료 후 용출 용액이 수득된다.
요컨대, 액체 이송-타입 방법의 핵산 추출 과정에서 용기로부터 반응 용액들 제거하는 동안, 자성 비드는 외부 자력에 의하여 반응 용기의 내부 면에 고정된다. 자동화 방식으로 액체 이송-타입 방법을 수행하기 위해서, 복수의 용기 내로 또는 복수의 용기로부터 반응 용액을 분주하거나 또는 제거할 수 있는 자동화 액체 처리 시스템이 필수적으로 요구된다. 이러한 액체 이송-타입 방법은 높은 수준의 자동성 달성, 시료 수에 의존적으로 사용되는 시약의 함량을 용이하게 조절, 및 동일한 장치에서 계속적으로 그리고 자동적으로 효율적인 PCR(Polymerase Chain Reaction) 조제물의 제조 가능성의 이점을 갖는다. 하지만, 이러한 타입의 방법은 용기내로 또는 용기로부터 반응액을 분주하고 제거하는 과정으로 인하여, 오랜 반응 시간과 같은 단점도 갖는다.
시료로부터 핵산을 추출하기 위한 비드 이송-타입 방법은 보통 용해 용액, 세정 용액 및 용출 용액으로 각각 미리 채워진 반응 용기들의 카트리지를 보통 활용하며, 또한 자성 막대 어셈블리를 사용하여 하나의 용기로부터 다른 반응 용액을 포함하는 용기로 순차적으로 자성 비드를 이송하는 것에 의하여 실시된다. 이러한 비드 이송-타입 방법은 이러한 방법에만 사용되기 위하여 특별히 디자인된 소형 장치에서 일반적으로 실시된다. 비드 이송-타입 방법을 위한 통상적인 장치에는 반응 용액을 포함하는 용기들, 구동 디바이스에 결합된 지지부에 기계적으로 고정된 자성 막대, 상기 자성 막대를 커버하고 구동 디바이스에 또한 결합된 지지부로부터 부착 및 탈착되도록 디자인된 튜브 스트립을 위한 공간이 마련되어 있다. 이러한 비드 이송-타입 방법은 자성 비드를 이송하는 과정 및 시약으로 미리 충전된 용기의 사용으로 반응 용액을 분주하고 제거하는 과정을 필요하지 않아서 반응 시간이 단축되는 장점을 갖는다. 하지만, 시약의 낭비로 인한 고 비용의 단점을 갖는다. 예를 들어, 이러한 타입의 방법에서, 시약으로 채워진 이미 결정된 수의 용기를 갖는 카트리지가 실제적으로 추출하려는 시료의 수와 상관없이 사용된다. 더욱이, 비드 이송-타입 방법은 자동적으로 추출된 핵산을 처리하고 순차적으로 차후 분석 단계(e.g., PCR)를 위한 반응 혼합물을 제조하기 위하여 추가적인 액체 처리 장치를 필요로 한다.
일본 등록특허 제3,794,734은 비-자성 물질로 제작된 튜브 및 상기 튜브의 안과 밖으로 이동가능한 자성 막대를 포함하는 캐리어 흡착 수단을 사용하여 액체 시료를 분석하는 방법을 기술한다. 상기 방법에서, 비드 이송-타입 방법이 사용되며, 상기 캐리어 흡착 수단은 액체 시료를 포함하는 복수의 용기들로부터 상기 캐리어를 수집할 수 있다. 상기 자성 막대 및 상기 튜브는 구동 수단에 결합되어 있고, 상기 이동 수단에 의하여 수직 및 수평 방향으로 이동가능하도록 구성된다.
미국 등록특허 제7,329,488는 또한 비드 이송-타입 방법의 예를 기술한다. 상기 문헌은 생물학적 시료로부터 핵산이나 생물학적 물질을 분리하기 위한 키트를 개시하며, 상기 키트는 버퍼 및 고상 물질을 포함하는 복수의 챔버를 갖는 용기 및 캐리지를 포함하며, 상기 캐리지는 구멍이 형성된 평판부 및 내부 통로를 갖는 돌출부를 포함하고, 상기 돌출부의 내부 통로의 하나의 말단은 막혀있고 다른 말단은 웰려있으며, 상기 돌출부는 상기 챔버내의 버퍼에 담길 수 있는 미리 결정된 길이를 갖는다. 상기 방법에서 다음과 같은 3개의 이송 유닛이 제공된다; 캐리지 및 캐리지 부착 프레임 어셈블리를 수직 방향으로 이동시키기 위한 캐리지 부착 프레임 이송 유닛; 자성 바 어셈블리를 수직 방향으로 이동시키기 위한 자성 바 어셈블리 이송 유닛; 및 수평 방향으로 베이스 플레이트를 이동시키기 위한 베이스 플레이트 이송 유닛.
일본 등록특허 제3,794,734 및 미국 등록특허 제7,329,488에 개시된 핵산 추출 방법은 비드-이송 타입 방법만을 위해 특별히 디자인된 장치에서 실시되므로, 상술한 비드-이송 타입 방법의 단점을 여전히 가지고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 다수의 특허들 및 문헌들이 참조되고 그 인용이 괄호로 표시되어 있다. 본 발명 및 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준을 보다 명확하게 설명하기 위하여 이러한 특허들 및 문헌들의 공개는 그 전체로서 본 명세서에 참조로 포함되어 있다.
본 발명은 <도 1>에 제시한 바처럼, 자성 모듈(210) 및 커버 모듈(220)을 포함하는 자성부(200); 1차 결합용 웰(301), 1차 세척용 웰 (302), 2차 결합용 웰(303), 2차 세척용 웰(304) 및 용출용 웰(305) 등의 딥-웰을 포함하는 딥-웰 플레이트(300); 및 제1 이동 모듈(410) 및 제2 이동 모듈(420)을 포함하는 이동부(400)를 포함하는 자동화 장비 100일 수 있다.
상기 자성 모듈 210의 구현예는 자성 비드를 수집하기 위한 자력-발생 물질을 포함하는 로드, 상기 로드에 연결된 로드-지지부 및 상기 로드-지지부를 이동 모듈과 체결하도록 구성된 상기 로드-지지부 상의 제1 체결부를 포함한다.
로드는 자성 비드를 수집하기 위한 자력-발생 물질을 포함한다. 자력-발생 물질은 자기장을 생산할 수 있는 물질을 의미하며 예를 들어 자석일 수 있다. 자석은 영구 자석 또는 전자석일 수 있다.
로드는 금속, 합금 또는 비금속 물질일 수 있다. 금속 물질은 알루미늄(aluminum), 철(steel), 스테인레스 스틸(stainless steel), 및 이들의 합금을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 비금속 물질은 플라스틱 물질 및 플라스틱과 다른 물질과의 혼합물질을 포함할 수 있다. 플라스틱 물질은 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리염화비닐, 폴리카보네이트, 멜라민 수지, 페놀 수지 및 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
커버 모듈 220의 일구현예는 튜브, 튜브-지지부 및 제2 체결부를 포함한다. 상기 커버 모듈 220은 상기 로드 211을 가이드하기 위한 튜브 221을 포함하며, 상기 로드 211은 상기 튜브 221에 삽입되고 삽입된 로드 211이 튜브 221에서 상하 방향으로 이동하며, 상기 튜브 221에 튜브-지지부가 연결되어 있고, 및 제2 체결부는 상기 튜브-지지부를 제2 이동 모듈 420와 체결하도록 구성된다.
상기 튜브 221은 상기 로드 211이 상기 튜브 221에 삽입될 수 있는 방식으로 상기 튜브-지지부에 연결될 수 있다.
상기 커버 모듈 220은 자성 비드를 이송하기 위한 상기 자성 모듈 210과 조합하여 사용될 수 있고, 상기 자성 모듈 210의 상기 로드 211은 상기 커버 모듈 220의 상기 튜브 221에 삽입되며 상기 삽입된 로드 211은 자성 비드를 사용하는 핵산 추출 과정 동안 상기 튜브 221에서 상하 방향으로 이동한다. 상기 자성 모듈 210이 복수의 로드 211을 포함하는 경우, 상기 커버 모듈 220은 복수의 튜브 221을 포함할 수 있다. 다른 구현예에 따르면, 두 개의 커버 모듈 220은 하나의 자성 모듈 210과 조합으로 함께 사용될 수 있다.
상기 로드 211가 상기 튜브 221에 삽입되고, 상기 삽입된 로드 211은 상기 튜브 221에서 상하 방향으로 이동하며, 상기 커버 모듈 220의 상기 튜브 221은 상기 자성 모듈 210의 상기 로드 211을 가이드하도록 구성된다.
상기 자성 모듈 210의 상기 로드 211은 상기 커버 모듈 220의 상기 튜브 221에 삽입될 수 있다.
상기 튜브 221은 그의 상부 말단 부위, 특히 그의 상부 말단을 통하여 상기 튜브-지지부에 연결될 수 있다.
상기 튜브 221의 상기 상부 말단 부위가 연결에 관여하는 경우, 상기 튜브 221의 상기 상부 말단은 상기 튜브-지지부로부터 위쪽으로 돌출될 수 있다.
상기 튜브 221의 상위 말단 부위는 길이로 상기 튜브 221의 상부 말단으로부터 튜브 221 길이의 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하 또는 10% 이하에 해당하는 지점까지의 범위이다.
상기 튜브 221의 하나의 말단, 특히 상기 튜브 210의 상부 말단은 상기 로드 211이 삽입되도록 개방되어 있을 수 있으며, 상기 튜브 221의 반대편 말단, 특히 상기 튜브 221의 하부 말단은 닫혀 있을 수 있다. 상기 튜브 221의 개방된 상기 하나의 말단은 상기 튜브-지지부에 연결될 수 있다. 상기 튜브 221의 상기 하나의 말단에 연결된 튜브-지지부의 상기 부위는 로드 삽입을 위하여 홀을 가질 수 있다.
상기 커버 모듈 220의 상기 튜브 221는 상기 자성 모듈 210의 삽입된 로드 211이 용기에 담긴 시약과 직접 접촉하는 것을 방지할 수 있다. 또한, 상기 커버 모듈 220의 상기 튜브 221은 용기 내에서 그의 상-하 운동으로 인하여 용기 내의 시약들이 잘 혼합되도록 할 수 있다. 상기 커버 모듈 220의 상기 튜브 221은 용기 내에서 상-하 방향으로 이동하여, 특히 상기 로드 211이 용기 밖으로 이동한 후, 시약을 혼합할 수 있다.
상기 커버 모듈 220의 상기 튜브 221은 돌출을 가질 수 있다.
돌출은 상기 튜브 221의 외주면 상에 형성될 수 있다.
돌출은 상기 튜브 221 상에 상기 로드 211 삽입을 위한 개구가 형성된 상부 말단 부위에 반대편 하부 말단 부위에서 형성될 수 있다.
상기 튜브 221 상에 형성된 돌출은 상기 튜브 210가 용기 내에서 상하로 이동하는 경우, 난류(turbulence)를 생성하여 용기 내에 담긴 시약을 혼합하는 효과를 증가시킬 수 있다.
보다 구체적으로, 용기 내에서 돌출에 의하여 생산되는 난류는 자성 비드에 타겟 분자들(단백질 분자들 또는 압타머)의 결합, 자성 비드에 결합된 타겟 분자의 세정, 및 자성 비드로부터 타겟 분자의 용출과 같은 과정들이 잘 수행되도록 한다.
돌출의 형상은 구체적인 형상으로 제한되지 않으며, 예를 들어, 나선 형상, 원형 형상, 삼각형 형상, 다각형 형상, 단절된 돌기 형상(interrupted swelling shape), 또는 화살 형상을 포함한다.
상기 로드 211가 시약을 포함하는 용기에 위치하는 상기 튜브 221에 삽입되는 경우, 용기에서 시약들과 혼합된 자성 비드는 상기 로드 211의 상기 자기력-발생 물질에 의하여 제공되는 자기력에 의하여 상기 튜브 221의 표면에 선택적으로 부착된다.
상기 커버 모듈 220의 상기 튜브 221은 상기 로드 211로부터의 자기력을 차단하지 않고 용기에서 시약과 화학적 반응을 하지 않는 어떠한 물질로도 제작될 수 있다.
상기 튜브 221은 플라스틱 물질 및 플라스틱과 다른 물질과의 혼합물질로 제작될 수 있다. 플라스틱 물질은 예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리염화비닐, 폴리카보네이트, 멜라민 수지, 페놀 수지 및 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 커버 모듈 220은 하나의 튜브, 두 개의 튜브, 또는 세 개 이상의 튜브 221을 포함할 수 있다. 튜브 221의 수는 필요에 따라 조절될 수 있으며, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 2-8, 2-10, 2-13, 2-16, 2-18, 2-20, 2-30. 2-40, 2-50, 2-60, 2-80, 2-90, or 2-100 개 일수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 커버 모듈 200이 복수의 튜브 221을 포함하는 것처럼 설명할 수 있으나, 상기 튜브 221의 수는 이에 한정되지 않는다.
상기 튜브 221는 원통형 형상, 스틱(stick) 형상, 바(bar) 형상, 보다 특히, 원통형 스틱 형상일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 튜브 221의 길이는 12 - 220 mm, 상기 튜브 210의 내경은2 - 12 mm 및 상기 튜브 221의 외경은 2 - 15 mm일 수 있으나, 이들 범위로 한정되지 않는다. 특히, 튜브 221의 길이는 예를 들어, 12 - 170 mm, 12 - 140 mm, 12 - 110 mm, 12 - 100 mm, 12 - 90 mm, 12 - 80 mm, 12 - 70 mm, 12 - 60 mm, 12 - 50 mm, 15 - 50 mm, 20 - 50 mm, 또는 30 - 50 mm일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 상기 튜브 210의 내경은 예를 들어, 2 - 12 mm, 2 - 10 mm, 2 - 8 mm, 2 - 6 mm, 2 - 4 mm, 또는 3 - 7 mm일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 상기 튜브 210의 외경은 예를 들어, 2 - 15 mm, 2 - 14 mm, 2 - 12 mm, 2 - 10 mm, 2 - 8 mm, 2 - 6 mm, 3 - 8 mm, 또는 3 - 7 mm이나 이에 한정되지 않는다.
단백체 결합 압타머의 자기 수집을 위한 자동화 시스템
자성 비드를 사용하여 분석대상 시료, 그 시료에 포함된 단백체에 결합하는 압타머(단백체 결합 압타머)를 자기 수집하기 위한 자동화 시스템은 자성 모듈 210; 커버 모듈 220; 상기 자성 모듈 210과 체결되고 상기 자성 모듈 210을 하나의 위치로부터 다른 위치까지 이동시키는 제1 이동 모듈 410; 및 상기 커버 모듈 220과 체결되고 상기 커버 모듈 220을 하나의 위치로부터 다른 위치까지 이동시키는 제 2 이동 모듈 420을 포함할 수 있다.
상기 자성 모듈 210의 상기 로드 211은 상기 커버 모듈 220의 상기 튜브 221에 삽입될 수 있다.
상기 제1 이동 모듈 410 및 상기 제2 이동 모듈 420의 최소한 하나는 상-하, 좌-우 및 전-후 방향으로 이동할 수 있다.
상기 제1 이동 모듈 410 및 상기 제2 이동 모듈 420 중 최소한 하나는 X Y Z 좌표계에서 X-축 및 Z-축 방향; Y-축 및 Z-축 방향; 또는 X-축, Y-축 및 Z-축 방향으로 이동할 수 있다.
상기 제1 이동 모듈 410 및 상기 제2 이동 모듈 420 중 최소한 하나는 상기 자성 모듈 210 및 상기 커버 모듈 220의 최소한 하나에 자동적으로 체결될 수 있다.
상기 제1 이동 모듈 410이 상기 자성 모듈 210에 체결되는 경우, 상기 제1 이동 모듈 410은 상기 자성 모듈 210을 상-하, 좌-우 및 전-후 방향으로 이동시킬 수 있다.
상기 제2 이동 모듈 420이 상기 커버 모듈 220에 체결된 경우, 상기 제2 이동 모듈 420은 상기 커버 모듈 220을 상-하, 좌-우 및 전-후 방향으로 이동시킬 수 있다.
상기 자동화 시스템은 자동화 액체 처리 장치이다.
상기 제1 이동 모듈 410 및 상기 제2 이동 모듈 420 중 최소한 하나는 수송 메커니즘 및 다중-기능 프로브를 포함할 수 있다.
상기 제1 이동 모듈 410 및 상기 제2 이동 모듈 420 중 최소한 하나는 파이펫터 모듈 또는 그립퍼 모듈이다.
자성 모듈 및 커버 모듈을 사용한 단백체 결합 압타머의 자기 수집
상기 분석 대상 시료에 포함된 단백체에 결합하는 압타머(단백체 결합 압타머)의 자기 수집 방법은 상기 제1 이동 모듈 410 및 상기 제2 이동 모듈 420을 상기 자성 모듈 210 및 상기 커버 모듈 220과 각각 체결하는 단계; 상기 자성 모듈 210 및 상기 커버 모듈 220을 용기의 상부 공간에 이동시키는 단계; 상기 커버 모듈 220을 하강시켜서 상기 튜브 221을 용기의 내부 공간으로 위치시키는 단계; 상기 커버 모듈 220을 상하로 이동시키는 단계; 상기 자성 모듈 210을 하강시켜서 상기 로드 211을 상기 튜브 221로 삽입하는 단계; 및 상기 자성 모듈 210 및 상기 커버 모듈 220을 상승시켜서 상기 로드 211 및 상기 튜브 221 을 용기 밖으로 이동시키는 단계를 포함한다.
단백체 결합 압타머의 자기 수집은 자성 비드 하나의 용기로부터 다른 용기로 이송하기 위한 상기 자성 모듈 210 및 커버 모듈 220을 사용하여 제1 이동 모듈 410 및 제2 이동 모듈 420를 갖는 장치에서 실시될 수 있다.
본원에서 용어 “분석 대상 시료”는 본 발명에 따라 생물학적 시료, 환경 시료 또는 임의의 다른 매체로부터의 임의의 세포, 조직, 또는 유체를 의미하며, 이는 바이러스, 세균, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 우유, 소변, 분변, 안구액, 타액, 정액, 뇌 추출물, 척수액(SCF), 충수, 비장 및 편도 조직 추출물, 양수, 복수 및 비-생물학적 시료(예컨대, 식품, 및 물)을 포함한다. 또한, 시료는 생물학적 공급원으로부터 단리된 자연 단백체 및 합성 단백질 분자를 포함한다.
상기 자성 모듈 210 및 상기 커버 모듈 220은 상기한 바와 같이 각각의 구성 요소들을 포함할 수 있다.
상기 용기는 시료, 자성 비드, 용해 및 결합 과정을 위한 시약을 포함할 수 있다.
상기 용기는 세척 과정 또는 용출 과정을 위한 세척 시약 또는 용출 시약도 포함할 수 있다.
상기 용기는 딥-웰(deep well)이다.
복수의 웰로 배웰된 복수의 딥-웰을 갖는 딥-웰 플레이트가 용기로 사용될 수 있다.
상기 방법은 딥-웰 플레이트 300상에서 실시되는 것으로 기재되지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 시약, 시료 및 자성 비드를 담을 수 있는 다른 다양한 용기들, 웰, 튜브, 딥 웰, 웰-플레이트, 튜브-플레이트, 딥-웰 플레이트, 및 받침대 내의 튜브들 같은 것들도 상기 방법에 사용될 수 있다.
상기 장치는 상기 제1 이동 모듈 410 및 상기 제2 이동 모듈 420을 갖는 자동화 액체 처리 장치이다.
상기 제1 이동 모듈 410 및 상기 제2 이동 모듈 420과 상기 자성 모듈 210 및 상기 커버 모듈 220의 체결 중 최소한 하나는 상기 자성 모듈 210 및 상기 커버 모듈 220 중 최소한 하나가 놓여진 위치에서 실시될 수 있다.
“상기 제1 이동 모듈 410 및 상기 제2 이동 모듈 420과 상기 자성 모듈 210 및 상기 커버 모듈 220 각각의 체결”단계는 “상기 제1 이동 모듈 410 및 상기 제2 이동 모듈 420 중 최소한 하나를 상기 자성 모듈 210 및 상기 커버 모듈 220 중 최소한 하나가 놓여진 위치로 이동”단계 및 “상기 제1 이동 모듈 410 및 상기 제2 이동 모듈 420 중 최소한 하나를 상기 자성 모듈 210 및 상기 커버 모듈 220 중 최소한 하나와 상기 위치에서 체결” 단계를 포함할 수 있다.
상기 자성 모듈 210 및 상기 커버 모듈 220 중 최소한 하나는 상기 제1 이동 모듈 410 및 상기 제2 이동 모듈 420 중 최소한 하나가 상기 자성 모듈 210 또는 상기 커버 모듈 220에 도달할 수 있는 것을 전제로 장치 내에 어떠한 위치에도 놓일 수 있다.
상기 제1 이동 모듈 410 및 상기 제2 이동 모듈 420 중 최소한 하나는 상-하 및 좌-우 방향; 상-하 및 전-후 방향; 또는 상-하, 좌-우 및 전-후 방향으로 이동할 수 있다.
상기 자성 모듈 210 및 상기 커버 모듈 220 중 최소한 하나는 상기 장치 내에 위치한 용기에 놓일 수 있다.
상기 자성 모듈 210 또는 상기 커버 모듈 220이 놓인 용기는 상기 자성 모듈 210 및 상기 커버 모듈 220을 하우징 할 수 있고 상기 모듈 210, 220이 상기 이동 모듈 410, 420과 체결되는 경우, 그들의 위치 또는 자세를 안정적으로 유지할 수 있는 어떠한 것도 될 수 있다. 예를 들어, 상기 용기는 웰, 튜브, 딥 웰, 웰-플레이트, 튜브-플레이트, 딥-웰 플레이트, 및 받침대 내의 튜브들을 포함할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 자성 모듈 210 및 상기 커버 모듈 220은 상기 체결된 제1 이동 모듈 410 및 상기 제2 이동 모듈 420에 의하여 독립적으로 또는 서로 동기적으로 이동될 수 있다.
상기 장치는 자동화 액체 처리 장치이다.
상기 자동화 액체 처리 장치의 상기 제1 이동 모듈 410 및 상기 제2 이동 모듈 420 중 최소한 하나는 수송 메커니즘 및 다중-기능 프로브를 포함할 수 있다.
상기 제1 이동 모듈 410 및 상기 제2 이동 모듈 420 중 최소한 하나는 파이펫터 모듈 또는 그립퍼 모듈이다.
상기 파이펫터 모듈은 파이펫팅 헤드를 포함할 수 있고 상기 그립퍼 모듈은 그립 핑거를 포함할 수 있다.
상기 자성 모듈 210 또는 상기 커버 모듈 220이 자동화 액체 처리 장치 이외의 장치와 연관되어 사용되는 경우, 상기 제1 이동 모듈 410 또는 상기 제2 이동 모듈 420은 다른 장치에 의하여 제공되는 것 일 수 있다. 다시 말하여, 상기 제1 이동 모듈 410 또는 상기 제2 이동 모듈 420은 자동화 액체 처리 장치이외에 다른 용도에 대한 다른 장치에 포함된 어떠 것일 수 있다.
상기 제1 이동 모듈 410 및 상기 제2 이동 모듈 420 중 최소한 하나는 상기 이동 모듈 410, 420의 이동을 사용하여 자동화 방식으로 상기 자성 모듈 210 또는 상기 커버 모듈 220로부터 체결 해제될 수 있고, 다른 자성 모듈 210 또는 다른 커버 모듈 220과 재체결될 수 있다.
이하, 자성 비드 이송을 위한 자성 모듈 210 및 커버 모듈 220을 사용하여 자동화 액체 처리 장치에서 단백체 결합 압타머를 자기 수집하는 일 구현예를 기재한다.
도 2은 자동화 액체 처리 장치의 모듈을 사용하여 단백체 결합 압타머의 자기 수집을 수행하는 S610-S620 각각 단계를 예시하는 흐름도이다.
단백체와 자성 비드의 결합 및 자기 수집
복수의 웰로 배웰된 복수의 딥-웰을 갖는 딥-웰 플레이트 410가 자동화 액체 처리 장치 상에 놓인다.
복수의 웰의 딥 웰 300은 (i) 혈청과 자성 비드의 접촉으로 단백체-자성비드 복합체의 1차 결합, (ii) 단백체-자성 비드 복합체의 1차 세척,(iii) 압타머 풀과 단백체-자성 비드 복합체의 접촉으로 압타머 풀-단백체-자성비드 복합체의 2차 결합, (iv) 압타머 풀-단백체-자성 비드 복합체의 2차 세척, 및 (v) 압타머 풀-단백체-자성비드 복합체로부터 압타머 풀의 용출을 위한 그들의 용도에 따라 별개의 웰로 구분될 수 있다. 1, 2차 세척에서 복합체를 자기수집할 수 있다.
구체적으로, 딥-웰 플레이트 300에서 복수의 웰의 딥 웰은 단백체가 용해되고 단백체가 자성 비드에 결합되는 1차 결합용 웰(binding row) 302, 단백체가 결합된 자성 비드가 세척되는 1차 세척용 웰(washing row) 303, 압타머 풀과 단백체-자성비드 복합체가 결합하는 2차 결합용 웰 304, 압타머 풀-단백체-자성 비드 복합체가 세척되는 2차 세척용 웰(washing row) 305 및 결합된 압타머 풀이 자성 비드 복합체로부터 해리되는 용출용 웰(elution row) 306로 구분될 수 있다.
혈청, 결합, 세척, 또는 용출용 시약들은 상기 1차 결합용 웰 302, 상기 1차 세척용 웰 303, 2차 결합용 웰 304, 2차 세척용 305 또는 상기 용출용 웰 307로 상기 파이펫터 모듈의 파이펫팅 헤드에 체결된 팁으로 상기 자동화 액체 처리 장치에서 자동적으로 분주될 수 있다.
상기된 바와 같이, 상기 자성 모듈 210은 상기 자동화 액체 처리 장치에서 상기 제1 이동 모듈 410과 체결되거나 상기 커버 모듈 220은 상기 자동화 액체 처리 장치의 상기 제2 이동 모듈 420과 체결된다 (S610).
상기 자성 모듈 210 및 상기 커버 모듈 220 중 최소한 하나는 특히 상기 로드 211가 상기 튜브 221로 삽입되는 위치와 동일한 위치에서 상기 제1 이동 모듈 410 및 상기 제2 이동 모듈 420 중 최소한 하나와 각각 체결될 수 있다.
상기 자성 모듈 210은 상기 커버 모듈 220의 장소와 다른 장소에 위치하고 상기 자성 모듈 210 또는 상기 커버 모듈 220은 상기 제1 이동 모듈 410 또는 상기 제2 이동 모듈 420과 각각 다른 위치에서 체결될 수 있다.
상기 자성 모듈 210 및 상기 커버 모듈 220 중 최소한 하나는 상기 제1 이동 모듈 410 및 상기 제2 이동 모듈 420 중 최소한 하나와 자동화 액체 처리 장치에서 미리-결정된 장소 예를 들어, 핵산 추출용 시약을 포함한 용기 근처의 장소 상에서 체결될 수 있다.
상기 자성 모듈 210 및 상기 커버 모듈 220은 상기 제1 이동 모듈 410 및 상기 제2 이동 모듈 420과 각각 딥-웰 플레이트 300의 시작 웰 301, 308에서 체결될 수 있다. 상기 시작 웰 301, 308의 상기 딥 웰은 어떠한 시약도 포함하지 않는다.
상기 제1 이동 모듈 410 및 상기 제2 이동 모듈 420 중 최소한 하나는 상기 자성 모듈 210의 상기 제1 체결부 및 상기 커버 모듈 220의 상기 제2 체결부 중 최소한 하나와 상기 자동화 액체 처리 장치에서 자동적으로 연결될 수 있다.
본명세서에서 사용된 표현 “자동적으로 체결”은 모듈의 체결을 위하여 요구되는 움직임은 반복적인 입력 명령없이 구체적인 움직임을 정의하는 상기 장치에 탑재된 소프트웨어 프로그램에 의하여 순차적으로 실시될 수 있다는 것을 의미한다.
상기 제1 이동 모듈 410 또는 상기 제2 이동 모듈 420에 체결된 상기 자성 모듈 210 또는 상기 커버 모듈 220, 제1 결합용 웰 302의 딥 웰 300의 상부 공간에 이동된다 (S612).
상기 결합용 웰 302에서 복수의 딥 웰 300은 시료, 단백체 결합를 위한 결합 시약 및 자성비드를 포함할 수 있다.
상기 커버 모듈 220의 상기 튜브 221는 상기 커버 모듈 220을 하강시키는 것에 의하여 상기 제1 결합용 웰 302의 딥웰 300의 내부 공간에 위치한다(S614).
“상기 커버 모듈 220의 상기 튜브 221는 상기 커버 모듈 220을 하강시키는 것에 의하여 상기 용기 (e.g., 딥 웰)의 내부 공간에 위치” 단계는 “상기 자성 모듈 210의 상기 로드 211이 상기 자성 모듈 210을 하강시키는 것에 의하여 상기 용기 (e.g., 딥 웰)의 내부 공간에 삽입” 단계와 병행하여 실시된다.
특히, “상기 커버 모듈 220의 상기 튜브 221이 상기 커버 모듈의 하강에 의하여 상기 용기의 내부 공간으로 위치” 단계는“상기 자성 모듈 210의 상기 로드 211이 상기 튜브 221의 내부 공간으로 삽입되고, 상기 자성 모듈 210의 하강에 의하여 상기 용기의 내부 공간에 위치” 단계와 병행하여 실시된다.
상기 커버 모듈 220은 상하 방향으로 특히 상기 체결된 제2 이동 모듈 420에 의하여 이동한다. (S616).
상기 커버 모듈 220은 상기 1차 결합용 웰 302의 딥 웰 300의 내부 공간에 위치하는 상기 튜브 221와 상하 방향으로 이동한다.
상기 커버 모듈 220의 상기 튜브 221의 상하 방향 이동은 시료의 세포 용해 및 자성 비드와 용해된 세포 성분의 혼합을 가속시킬 수 있다.
“상기 커버 모듈 220이 상하 방향으로 이동”단계는 “상기 자성 모듈 210의 상기 로드 211이 상기 용기(e.g., 딥 웰) 외부로 이동”단계 이후에 실시될 수 있다.
상기 자성 모듈 210의 상기 로드 211이 상기 자성 모듈 210의 하강에 의하여 상기 커버 모듈 220의 상기 튜브 221로 삽입된다 (S618).
자기력-발생 물질을 갖는 상기 로드 211이 상기 튜브 221에 위치하는 경우, 핵산이 결합된 자성 비드가 상기 로드 211의 자기력에 의하여 상기 튜브 221의 외부 표면에 부착된다.
상기 자성 모듈 210의 상기 로드 211 및 상기 커버 모듈 220의 상기 튜브 221이 상기 자성 모듈 210 및 상기 커버 모듈 220을 상승시키는 것에 의하여 상기 딥 웰 300의 밖으로 이동된다 (S620).
상기 자성 모듈 210 및 상기 커버 모듈 220은 상기 튜브 221에 위치하는 상기 로드 211와 상승될 수 있다.
상기 1차 결합용 웰 302에서 상기된 단계를 완료한 후, 단백체-자성 비드 복합체의 세척, 압타머 풀과 단백질-자성비드 복합체의 결합, 압타머 풀-단백체-자성비드 복합체의 세척 및 단백체 결합 압타머의 용출을 상기 2차 세척용 웰 305 및 상기 용출용 웰 306에서 실시한다.
단백체-자성 비드 복합체의 세척
단백체-자성비드 복합체 또는 압타머 풀-단백체-자성비드 복합체의 세척은 세척을 위한 세제를 포함하는 용기에 대하여 “상기 제1 이동 모듈 410 및 상기 제2 이동 모듈 420과 상기 자성 모듈 210 및 상기 커버 모듈 220 각각의 체결”단계를 제외한 상기 단계를 실시하는 것에 의하여 수행될 수 있다.
상기 로드 211 및 상기 튜브 221는 상기 자성 모듈 210 및 상기 커버 모듈 220를 상승시키는 것에 의하여 상기 1차 결합용 웰 302의 딥 웰 300의 밖으로 이동된 후, 상기 자성 모듈 2100 및 상기 커버 모듈 220은 1차 세척용 웰 302의 딥 웰의 상부 공간으로 이동된다(S612).
상기 자성 모듈 210 및 상기 커버 모듈 220은 상기 튜브 221의 외부 표면에 자성 비드의 부착을 확실히 하기 위하여 상기 튜브 221에 삽입된 상기 로드 211과 상기 1차 세척용 웰 303의 딥 웰로 이동될 수 있다.
상기 1차 세척용 웰 303에서 상기 딥 웰 300은 세척을 위한 시약은 포함할 수 있다.
상기 1차 세척용 웰 303의 상기 딥 웰 300의 상기 상부 공간에서, 상기 커버 모듈 220의 하강에 의하여 상기 튜브 221이 상기 1차 세척용 웰 303의 상기 딥 웰 300의 내부 공간에 위치한다 (S614).
상기 커버 모듈 220은 상기 튜브 221에 삽입된 상기 로드 211과 하강될 수 있으며, 상기 튜브 221의 외부 표면에 자성 비드의 확실한 부착을 위해서이다. 상기 로드 211 및 상기 튜브 221를 상기 딥 웰 300로 위치시킨 후에, 상기 자성 모듈 210의 상승에 의하여 상기 로드 211가 상기 튜브 221의 밖으로 이동되고 상기 딥 웰 300의 밖으로도 이동된다.
상기 커버 모듈 220은 상하 방향으로 특히 체결된 제2 이동 모듈 420에 의하여 이동된다 (S616).
상기 커버 모듈 220는 상기 1차 세척용 웰 303의 딥 웰 300의 내부 공간에 위치한 상기 튜브 221와 상하 방향으로 이동될 수 있다. 상기 튜브 221의 상하 방향 이동은 핵산과 결합된 자성 비드의 세척을 가속시킬 수 있다.
상기 튜브 221의 상하 방향 이동을 완료한 후에, 상기 로드 211이 상기 자성 모듈 210을 하강시키는 것에 의하여 상기 튜브 221에 삽입된다(S618).
자기력-발생 물질을 갖는 상기 로드 210이 상기 튜브 221에 위치한 경우, 상기 로드 211의 자기력에 의하여 핵산이 결합된 자성 비드는 상기 튜브 221의 외부 표면에 부착된다.
상기 로드 211 및 상기 튜브 221이 상기 자성 모듈 210 및 상기 커버 모듈 220을 상승시키는 것에 의하여 상기 1차 세척용 웰 303의 상기 딥 웰 300의 밖으로 이동된다(S620).
상기 상술한 세척 과정은 두 개의 1차 세척용 웰 303 이상에 대하여 두 번이상 반복될 수 있다.
압타머 풀-단백체-자성 비드 복합체로부터 압타머의 용출
상기 2차 세척용 웰 311에서 압타머 풀-단백체-자성비드 복합체의 세척을 완료한 후, 자성 비드로부터 압타머 풀을 용출하는 과정이 용출용 웰 312에서 실시된다.
압타머 풀-단백체-자성비드 복합체로부터 압타머 풀의 용출은 세척 대신 용출을 위한 시약을 포함하는 용기에서 수행하는 것을 제외하고는 상기 세척 과정에서 기재된 동일한 단계로 실시될 수 있다.
상기한 것처럼 상기 자동화 액체 처리 장치에서 상기 딥-웰 플레이트 300의 상기 시작 웰 301, 1차 결합용 웰 302, 1차 세척용 웰 303, 2차 결합용 웰 304, 2차 세척용 웰 305 및 용출용 웰 306을 통하여 압타머 풀 용출을 위한 제1 라운드가 완료된 이후, 다른 시료로부터 자기 수집하는 제2 라운드는 상기 시작 웰 307, 1차 결합용 웰 308, 1차 세척용 웰 309, 2차 결합용 웰 310, 2차 세척용 웰 311 및 용출용 웰 312의 제2 웰에서 실시될 수 있다. 다시 말하여, 1라운드의 상기 용출용 웰 307의 상기 딥 웰 300에 포함된 압타머 풀-단백체-자성비드 복합체에 특이적으로 결합하는 압타머 풀 용출이 완료된 후, 2 라운드의 상기 용출용 웰 312의 상기 딥 웰에 포함된 다른 시료에 대한 단백체 결합 압타머 용출이 실시될 수 있다.
1차 결합용 웰 302에서 단백체 결합 압타머 자기 수집 제2 라운드를 시작하기 전에, 상기 제1 라운드의 자기 수집에서 사용된 상기 커버 모듈 220이 상기 제2 이동 모듈 420로부터 체결 해제되고 새로운 커버 모듈 220이 상기 제2 이동 모듈 420에 체결될 수 있다.
상기 제2 이동 모듈 420으로부터 상기 커버 모듈 220의 체결 해제는 상기 제2 이동 모듈 420의 움직임을 이용하여 자동적으로 실시될 수 있다.
이동 모듈로부터 자성 모듈 또는 커버 모듈의 체결 해제
용출 과정 완료 후에, 상기 제1 이동 모듈 410 및 상기 제2 이동 모듈 420 중 최소한 하나는 상기 자성 모듈 210의 상기 제1 체결부 및 상기 커버 모듈 220의 상기 제2 체결부로부터 각각 체결 해제될 수 있다.
상기 제1 체결부 및 상기 제2 체결부로부터 상기 제1 이동 모듈 410 및 상기 제2 이동 모듈 420의 체결 해제 중 최소한 하나는 상기 자동화 액체 처리 장치에서 자동적으로 실시될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 “자동적으로 실시”는 모듈의 체결 해체를 위하여 요구되는 움직임이 반복적인 입력 명령없이 구체적인 움직임을 정의하는 소프트 프로그램에 의하여 순차적으로 실시될 수 있다는 것을 의미한다.
상기 제1 체결부 및 상기 제2 체결부로부터 상기 제1 이동 모듈 410 및 상기 제2 이동 모듈 420의 체결 해제 중 최소한 하나는 수동으로 실시될 수 있다.
이동 모듈로부터 자성 모듈 또는 커버 모듈의 체결 해제, 특히 상기 제2 이동 모듈 410로부터 커버 모듈의 체결 해제 이후, 새로운 라운드의 정제 과정이 자성 모듈 또는 커버 모듈과 이동 모듈의 체결, 특히 커버 모듈과 상기 제2 이동 모듈 420의 체결의 실시에 의하여 진행된다.
서로 인접하여 두 웰로 배웰된 복수의 로드 211 및 튜브 221를 각각 갖는 상기 자성 모듈 210 및 상기 커버 모듈 220을 사용하여, 두 개의 인접한 결합용 웰 302, 308에 배웰된 상기 딥 웰에 포함된 시료에 대한 자기 수집이 동시에 실시될 수 있다. 이러한 타입의 자성 모듈 및 커버 모듈은 하나의 웰로 배웰된 복수의 로드 및 튜브를 각각 갖는 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈에 비하여 자기 수집 시간을 단축시킬 수 있다.
서로 이격된 두 개의 웰로 배웰된 복수의 로드 211 및 튜브 221을 각각 갖는 상기 자성 모듈 210 및 상기 커버 모듈 220를 사용하여, 두 개의 분리된 결합용 웰 302, 308의 딥 웰에 포함된 시료에 대한 자기 수집을 동시에 실시할 수 있다. 이러한 타입의 자성 모듈 및 커버 모듈은 하나의 웰로 배웰된 복수의 로드 및 튜브를 각각 갖는 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈에 비하여 자기 수집 시간을 단축시킬 수 있다.
서로 인접한 또는 서로 이격된 두 웰로 배웰된 복수의 로드 및 튜브를 각각 갖는 자성 모듈 및 커버 모듈을 사용하여 자기 수집을 실시하는 경우, 상기 커버 모듈의 이동 동안, 튜브의 외부 표면에 붙은 시약이 다른 딥 웰로 떨어지는 것을 방지하기 위한 수단, 예를 들어, 드롭 방지 플레이트(anti-dropping plate)가 추가적으로 상기 자동화 액체 처리 장치에 포함될 수 있다.
본 발명의 상기 자동화 액체 처리 장치는 시료를 구성하는 단백체에 결합하는 압타머의 자기 수집 수행을 지시하는 컴퓨터 시스템에 연결될 수 있다. 상기 컴퓨터 시스템은 자기 수집 과정을 실시하는 지시자를 포함하는 소프트웨어 프로그램에 의하여 자기 수집 수행을 지시할 수 있다. 이런 소프트웨어 프로그램은 컴퓨터-해독가능한 저장 매체에 저장될 수 있고 다른 컴퓨터 시스템으로 복사될 수 있다. 상기 컴퓨터-해독가능한 기록 매체는 ROM, RAM, CD-ROM, 마그네틱 테이프, 플로피 디스크, 광학 저장 매체, 플래쉬 메모리, 하드 디스크 드라이브, 비휘발성 메모리 카드, EEPROM, 및 웹 서버를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 자동화 액체 처리 장치 400은 컴퓨터 시스템에 의한 지시에 따라 시료를 구성하는 단백체에 결합하는 압타머 풀의 자기 수집하는 방법을 자동적으로 수행한다.
한 실시례로, 다음의 단계를 포함하는 제1 이동 모듈 및 제2 이동 모듈을 갖는 장치에서 자성 비드를 이송하기 위한 자성 모듈 및 반응용액 혼합을 위한 커버 모듈을 사용하여 분석 대상 시료, 그 시료에 있는 단백체에 특이적으로 결합하는 압타머 풀의 제조 자동화 장비로,
(a) 상기 제1 이동 모듈 및 상기 제2 이동 모듈을 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈과 각각 체결하는 단계;
(b) 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈을 1차 결합용 웰의 상부 공간으로 이동시키는 단계;
(c) 상기 커버 모듈을 하강시켜서 상기 1차 결합용 웰의 내부 공간으로 상기 튜브를 위치시키는 단계;
(d) 상기 커버 모듈은 1차 결합용 웰 내 분석대상 시료에 있는 단백체 및 자성비드 반응용액을 혼합하여 자성비드 복합체를 제조 하는 단계;
(e) 상기 자성 모듈을 하강시켜 상기 로드를 튜브에 삽입시켜 1차 결합용 웰 내 자성비드 복합체와 접촉하는 단계;
(f) 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈을 상승시켜서 세척용액이 있는 1차 세척용 웰로 이동시켜 상기 자성비드 복합체를 자기 수집하고 세척하는 단계;
(g) 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈을 상승시켜서 자성비드 복합체를 압타머 풀 반응용액이 있는 2차 결합용 웰로 이동시켜 압타머 풀-단백체-자석비드 복합체를 제조하는 단계;
(h) 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈을 상승시켜서 세척용액이 있는 1차 세척용 웰로 이동시켜 상기 자성비드 복합체를 2차 자기 수집하고 세척하는 단계; 및
(i) 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈을 상승시켜서 용출용액이 있는 용출용 웰로 압타머 풀의 용출을 하는 단계.
또 다른 실시례로, 다음의 단계를 포함하는 제1 이동 모듈 및 제2 이동 모듈을 갖는 장치에서 자성 비드를 이송하기 위한 자성 모듈 및 반응용액 혼합을 위한 커버 모듈을 사용하여 분석 대상 시료, 그 시료에 있는 단백체에 특이적으로 결합하는 압타머 풀 및 유전체의 제조 자동화 장비로,
단백체 결합 압타머 풀의 제조는
(a) 상기 제1 이동 모듈 및 상기 제2 이동 모듈을 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈과 각각 체결하는 단계;
(b) 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈을 1차 결합용 웰의 상부 공간으로 이동시키는 단계;
(c) 상기 커버 모듈을 하강시켜서 상기 1차 결합용 웰의 내부 공간으로 상기 튜브를 위치시키는 단계;
(d) 상기 커버 모듈은 1차 결합용 웰 내 분석대상 시료에 있는 단백체 및 자성비드 반응용액을 혼합하여 자성비드 복합체를 제조 하는 단계;
(e) 상기 자성 모듈을 하강시켜 상기 로드를 튜브에 삽입시켜 1차 결합용 웰 내 자성비드 복합체와 접촉하는 단계;
(f) 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈을 상승시켜서 세척용액이 있는 1차 세척용 웰로 이동시켜 상기 자성비드 복합체를 자기 수집하고 세척하는 단계;
(g) 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈을 상승시켜서 자성비드 복합체를 압타머 풀 반응용액이 있는 2차 결합용 웰로 이동시켜 압타머 풀-단백체-자석비드 복합체를 제조하는 단계;
(h) 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈을 상승시켜서 세척용액이 있는 1차 세척용 웰로 이동시켜 상기 자성비드 복합체를 2차 자기 수집하고 세척하는 단계; 및
(i) 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈을 상승시켜서 용출용액이 있는 용출용 웰로 압타머 풀의 용출을 하는 단계.
또는/및
유전체의 제조는
(a) 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈을 핵산 1차 결합용 웰의 상부 공간으로 이동시키는 단계;
(b) 상기 커버 모듈을 하강시켜서 상기 핵산 1차 결합용 웰의 내부 공간으로 상기 튜브를 위치시키는 단계;
(c) 상기 커버 모듈은 핵산 1차 결합용 웰 내 분석대상 시료에 있는 핵산 및 자성비드 반응용액을 혼합하여 자성비드 복합체를 제조 하는 단계;
(d) 상기 자성 모듈을 하강시켜 상기 로드를 튜브에 삽입시켜 핵산 1차 결합용 웰 내 자성비드 복합체와 접촉하는 단계;
(e) 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈을 상승시켜서 세척용액이 있는 핵산 1차 세척용 웰로 이동시켜 상기 자성비드 복합체를 자기 수집하고 세척하는 단계; 및
(f) 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈을 상승시켜서 용출용액이 있는 핵산 용출용 웰로 압타머 풀의 용출을 하는 단계.
여기서, 상기 (i) 단계와 상기 (f)의 용출단계에서 얻은 용액을 단백체 및 유전체 분석에 사용한다.
또한, 상기 자성 모듈은 자성 비드를 수집하기 위한 자기력-발생 물질을 포함하는 로드; 상기 로드가 연결된 로드-지지부; 및 상기 로드-지지부 상의 제1 체결부로서, 상기 로드-지지부를 상기 제1 이동 모듈과 체결하도록 구성되는 제1 체결부를 포함하고; 및
상기 커버 모듈은 튜브로서, 상기 튜브가 단백체와 자성비드 혼합용액을 혼합하고 상기 로드가 상기 튜브에 삽입되고 상기 삽입된 로드가 상하 방향으로 상기 튜브에서 이동할 때, 상기 로드를 가이드하는 튜브; 상기 튜브에 연결된 튜브-지지부; 및
상기 튜브-지지부 상의 제2 체결부로서, 상기 튜브-지지부를 상기 제2 이동 모듈과 체결하도록 구성되는 제2 체결부를 포함하고; 상기 자성 모듈의 상기 로드는 상기 커버 모듈의 상기 튜브에 삽입가능하며, 상기 제1 이동 모듈 및 상기 제2 이동 모듈 중 최소한 하나는 상-하, 좌-우 및 전-후 방향으로 이동 가능한 것을 특징으로 한다.
이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 분석대상 시료, 그 시료에 있는 단백체의 집단적 정량을 위해서, 자성 수집을 이용하여 단백체 결합 압타머 풀을 제조하고 이를 자동화하여 전 공정의 재현성 및 반복성을 구현한 방법 등을 제공할 수 있다.
도 1은 자성수집을 이용한 단백체 결합 압타머 풀의 자동화 장치의 모식도이고,
도 2는 자동화 액체 처리 장치의 모듈을 사용하여 단백체 결합 압타머의 자기 수집을 수행하는 S610-S620 각각 단계를 예시하는 흐름도이고,
도 3은 분석시료 폐암환자의 혈청에서 준비된 압타머 일차 라이브러리와 비교시료 비폐암환자 혈청에서 준비된 압타머 일차 라이브러리 각각을 구성하는 5,395개의 압타머에 대한 염기서열과 출현빈도의 비율을 비교하여 서로 상이함을 확인한 결과이고,
도 4는 상기 분석시료(10례)와 대조구(21례) 각각에 대해 분석한 결과를 이용하여 분석시료와 비교시료에 대한 db를 구축하였으며 두 그룹을 잘 구분할 수 있는 압타머들을 One-way ANOVA 기법으로 결정한 후, 결정된 압타머의 출현빈도를 4*[(출현빈도-최소)/(최대-최소)]-2로 전환하여 표현한 결과이고,
도 5는 선정된 압타머의 출현빈도로 계층 클러스터링한 결과로 폐암 환자의 혈청과 비폐암 환자의 혈청은 각각 독립된 클러스터를 형성하고 있어, 인간 혈청단백질에 결합하는 압타머 출현빈도로 환자들의 구분할 수 있음을 알 수 있으며,
도 6은 상기 결과와 같이, 생체시료를 구성하는 다중의 단백질, 결합하는 압타머 및 NGS 기술을 이용하여 특정한 생체시료에서 단백질의 프로파일을 탐색 및 분석하여 분석시료인 폐암 환자 혈청단백질에 특이적으로 결합하고 생물학적 의미를 지닌 압타머들을 선정할 수 있다. 이 중에 일련번호 768(압타머에 대해 자체 부여한 번호임) 압타머에 대한, 분석시료인 폐암 환자의 혈청과 비교시료인 비폐암 환자의 혈청에 대한 결합정도를 평가한 결과, 폐암 환자의 혈청에만 특이적으로 반응함을 알 수 있었다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이하의 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하는 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
<실시예 1> 단일가닥핵산 라이브러리 제조
<실시예 1-1> 단일가닥핵산 라이브러리의 올리고뉴클레오티드 및 프라이머
표적 단백체 집단을 포함하는 생체시료(분석시료 및 비교시료)와 반응시킬 단일가닥핵산　라이브러리　제조를 위하여, 아래 <일반식 I> 구조의 올리고뉴클레오티드들(무작위 단일가닥핵산들)을 제조하였다(한국,　바이오니아).
먼저 상기 <일반식 I> 구조의 단일가닥핵산 라이브러리를 구성하는 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드를 5'보존영역-가변영역-3'보존영역으로 구성되어 있다.
<일반식 I> 올리고뉴클레오티드 구조:
5'-GGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGGCCN50CATAACCCAGAGGTCGATGGATCCCCCC-3'
상기에서 밑줄 친 염기서열은 단일가닥핵산 라이브러리의 기지의 서열로 이루어진 고정된 부위인 보존영역이며, 가변영역인 50개 염기의 N50은 각 위치에 A, G, T, C 등의 염기들이 같은 농도로 존재한다.
상기 <일반식 I>의 올리고뉴클레오타이드를 주형으로 하여 PCR 방법을 수행하여 이중가닥 DNA 라이브러리를 제조하였다. 이때 사용되는 프라이머는 하기의 DS 정방향 프라이머(서열번호 1) 및 DS 역방향 프라이머(서열번호 2) 이다.
DS 정방향 프라이머:
5'-GGGGC TAATACGACTCACTATAGGG AGAGCGGAAGCGTGCTGGG- 3' (서열번호 1)
DS 역방향 프라이머:
5'-GGGGCATCGACCTCTGGGTTATG-3' (서열번호 2)
상기 DS 정방향 프라이머(서열번호 1)는 상기 <일반식 I> 구조의 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 밑줄친 서열과 상보결합을 할 수 있다. 또한, 서열번호 1의 밑줄로 표시된 부분은 박테리오파지 T7의 RNA 폴리머라아제를 위한 T7 프로모터 서열이다.
PCR에 이용되는 상기 DS 역방향 프라이머(서열번호 2)는 상기 <일반식 I> 구조의 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 밑줄 친 부분의 서열과 상보결합을 할 수 있다.
PCR (Polymerase Chain Reaction)을 수행은 상기 <일반식 I> 구조의 단일가닥핵산 라이브러리를 주형으로 상기 DS 정방향 프라이머(서열번호 1) 및 상기 DS 역방향프라이머(서열번호 2)를 사용하여 이루어졌다.
구체적으로, 1,000 pmole의 단일가닥핵산 라이브러리, 2,600 pmole DS 프라이머 쌍(DS 정방향 프라이머, DS 역방향 프라이머)을 60mM KCl, 10mM Tris-Cl (pH 8.3), 3mM MgCl2, 0.5mM dNTP(dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP) 및 0.1U Taq DNA Polymerase (Perkin-Elmer, Foster City Calif.)를 혼합하여 PCR을 수행한 후, QIAquick-spin PCR 정제 칼럼(QIAGEN Inc., Chatsworth Calif.)으로 정제하였다. 이렇게 하여　T7 프로모터가　있는　이중가닥 핵산　DNA를　제조하였다．
해당 PCR 산물은 T7 프로모터를 포함하는 이중가닥 DNA이며, 그것의 일반 구조식은 아래의 <일반식 Ⅱ>와 같다.
<일반식 Ⅱ> PCR산물:
5'-GGGGGCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGGCCN50CATAACCCAGAGGTCGATCCCC-3'
아래에서 기술되는 RT-PCR를 위한 프라이머는 "RS 정방향 프라이머(서열번호 3)" 및 "RS 역방향 프라이머(서열번호 4)"이며 이들의 염기서열은 아래와 같다.
RS 정방향 프라이머:
5'-CGGAAGCGTGCTGGGCC-3' (서열번호 3)
RS 역방향 프라이머:
5'-TCGACCTCTGGGTTATG-3' (서열번호 4)
<실시예 1-2> 단일가닥핵산 RNA 라이브러리의 제조
본　실시예에서는　생체시료(분석시료 및 비교시료)와 반응할 RNA 단일가닥핵산　라이브러리를 제조하였다. 이 RNA 단일가닥 핵산 라이브러리는　변형된　뉴클레오티드인 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 RNA 라이브러리이며, <실시예 1-1>에서 제조된 ＜일반식　Ⅱ> 구조의　PCR 산물을 이용하여　2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 RNA 단일가닥핵산들을, DuraScribe T7 Transcription Kit (EPICENTRE, USA)로 생체외 전사를 수행하여 합성하고 정제하여 제조하였다.
구체적으로 300 pmoles 상기 제조된 이중가닥 DNA, 50mM Tris-Cl (pH 8.0), 12mM MgCl2, 5mM DTT, 1mM spermidine, 0.002% Triton X-100, 4% PEG 8000, 5U T7 RNA Polymerase 그리고 1mM (ATP, GTP) 및 3mM (2'FCTP, 2'F-UTP)를 혼합하여 37℃에서 6 ~ 12시간 동안 반응시킨 후, Bio-Spin 6 크로마토그래피 칼럼(Bio-Rad Laboratories, Hercules Calif.)으로 정제한 후, UV 스펙트로미터를 이용하여 정제된 핵산의 양 및 그 순도를 분석하였다.
<실시예 1-3> 정도관리 및 측정용 외부 표준물질의 제조
외부 표준단백질은 아래 [표 1]에서 같이 미시간주립대학교의 플랜트지놈믹스(Plant Genomics of Michigan State University, http://genomics.msu.edu/plant_specific/)에서 확보한 인간에서는 그 유사체(analog)도 존재하지 않는 A, B, C, D 및 E 등 5개 종류의 식물(애기장대) 특이 단백질을 대장균 발현시스템을 사용하여 제조하여 사용하였다.
식물특이단백질
종류 Locus 내 용 Accession number
A At1g65390.1 defense/immunity protein GO:0003793
B At5g39310.1 cell elongation GO:0009826
C At4g15910.1 Drought-Induced Protein (Di21) GO:0009414
D At1g12860.1 Bhlh Protein GO:0003677
E At4g02530.1 Chloroplast Thylakoid Lumen Protein GO:0009543
선정된 5개 식물특이단백질은 대장균 발현시스템을 사용하여 상응하는 단백질을 발현시킨 후, 발현된 단백질을 분리하여 표준 SELEX 방법(Ellington, A.D. and J.W. Szostak. 1990. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature 346: 818-822; Gold, L., P.Allen, J. Binkley, D. Brown, D. Schneider, S.R. Eddy, C. Tuerk, L. Green, S. Macdougal, and D. Tasset. 1993. RNA: the shape of things to come, pp. 497-510. In: R.F. Gestelend and J.F. Atkins (eds.). The RNA World, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)으로 기준물질에 결합하는 단일가닥핵산을 확보하였다. 이를 정도관리용 단일가닥핵산이라고 명명하였으며 이들의 염기서열로 정도관리 단일가닥핵산에 상응하는 포착프로브를 디자인하였다.
<실시예 2> 압타머 일차 라이브러리 제조
<실시예 2-1> 압타머 일차 라이브러리 제조
압타머　일차 라이브러리를　제조하기 위하여,　단백질 집단을 포함하는 생체시료인 혈청을 시료로　사용하였고, 심근경색 환자의 혈청을 분석시료, 불안정성 협심증 환자의 혈청을 비교시료로 사용하였다.
유용한 표적 단백질의 검출 민감성을 높이기 위하여 제조사에서 제공하는 방법에 따라 MARC 칼럼(Agilent Technologies Inc. USA)을 이용하여 환자의 혈청에 과량으로 존재하는 단백질을 제거한 것을 실제 실험에 시료로 사용하였다.
압타머 일차 라이브러리의 제조를 위해서, 먼저 상기 분석시료(폐암 환자의 혈청에서 과량 존재하는 단백질을 제거한 시료임)의 단백질 집단에 특이적인 RNA 단일가닥핵산 풀을 제조하고, 다음 이 특이적인 RNA 단일가닥핵산 풀을, 과량 존재하는 단백질이 제거된 분석시료와 대조시료에 반응시켜 각 시료에 대한 압타머 일차 라이브러리를 제조하였고, 이 일차 라이브러리를 이용하여 NGS 적용을 위한 시퀀싱 라이브러리를 제조하였다.
시료에 특이적인 단일가닥핵산 풀의 제조는, 먼저 상기 <실시예 1>에서 합성된 RNA 단일가닥핵산 라이브러리를 심근경색 환자의 혈청에서 과량 존재하는 단백질을 제거한 분석시료와 반응시켜 단백질과 RNA 단일가닥핵산의 복합체를 형성시키고 동일한 세척버퍼로 세척 과정을 반복함으로써 미결합 또는 비특이적 RNA 단일가닥핵산을 제거하였다. 다음 복합체 풀을 분리하고, 복합체에서 RNA 단일가닥핵산을 해리시켜 얻어진 RNA 단일가닥핵산 풀을 상기 <실시예 1>의 RS 정방향 프라이머와 RS 역방향 프라이머를 이용하여 RT-PCR(Reverse transcription－PCR)로　증폭하고, 그 증폭물에 대해 상기 <실시예 1>과 같은 방법으로 생체외 전사를 수행하여 RNA 단일가닥핵산 풀을 얻었다.
이 RNA 단일가닥핵산 풀의 제조 과정을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
먼저 상기 <실시예 1-2>에서 제조된 300pmol RNA　라이브러리의 1014 염기서열/㎖의 농도 용액 300㎕을 첨가한 반응용액(50mM HEPES, pH 7.5, 125mM NaCl, 5mM KCl, 5mM NgCl2, 1mM EDTA, 0.05% TWEEN-30)을 80℃에서 10분간 가웰한 후, 얼음에 10분간 방치하였다.
상기 사용한 단일가닥핵산의 5배의 효모 tRNA(yeast tRNA, Life Technologies사)와 0.2% BSA(bovine serum albumin, Merck사)을 상기 반응용액에 첨가하여 비특이 반응 차단완충용액을 제조하였다.
혈청단백질을 선택된 5 μL 자성비드에 고정시키기 전에, 상기 RNA　라이브러리가 첨가된 반응용액에 100mM DTT 60㎕를 첨가하였으며, 상기 비특이 반응 차단완충용액에 100mM DTT, 10% BSA 400㎕를 첨가하였다.
본 실시례에서 사용한 자성비드는 탄소 시리즈 (C3, C8) 및 약한 양이온 교환(WCX)에서 선택하여 사용하였으며 Dynabeads® WCX(Dynal Biotech, 미국)를 사용하였다.
1.5㎖ 결합 반응 튜브에서 제조된 혈청단백질 600㎍를 반응용액 (50mM HEPES, pH 7.5, 125mM NaCl, 5mM KCl, 5mM NgCl2, 1mM EDTA, 0.05% TWEEN-30) 95㎕에 혼합하여 준비하였다.. 탭핑(tapping)하여 선택된 5 μL 자성비드이 완전히 반응용액에 분산되도록 해주었다. 100rpm에서 40분간 교반기를 이용하여 혼합하였다. 상기 자성비드를 자기력으로 1차 자기 수집하였다. 상기 비특이반응 차단완충용액 300㎕ 첨가하고 100rpm에서 40분간 교반기를 이용하여 혼합하여 준 후 자성비드를 다시 1차 자기 수집하였다.
이후 비결합 혈청단백질를 포함한 분석대상 시료의 혼합물을 제거하기 위한 세척 단계는 반응용액을 이용하여 수행하였다. 500㎕의 반응용액을 첨가하고 100rpm에서 10분간 교반기를 이용하여 혼합하여 준 후 단백체-자성비드 복합체를 세척 및 분리하는 1차 자기 수집을 자기력으로 하였다.
여기에 상기 RNA 단일가닥핵산 풀이 첨가된 반응용액(100ng/㎕) 5㎕와 결합완충용액 195㎕를 첨가하여 300 rpm에서 40분간 교반기를 이용하여 혼합한 후 단일가닥핵산 풀-단백체-자성비드 복합체를 세척 및 분리하는 2차 자기수집를 자기력으로 하였다. 이후 미결합 단일가닥핵산 및 비특이적인 결합 단일가닥핵산을 제거하기 위한 세척단계는 반응용액을 이용하여 수행하였다. 반응용액 500㎕를 첨가하여 100rpm에서 10분간 교반기를 이용하여 혼합하여 준 후 자성비드를 세척하여 자기력으로 추가적인 2차 자기 수집하였다.
수집된 자성비드를 새로운 1.5㎖ 튜브에 넣고, DEPC 멸균 정제수 50㎕를 첨가하였다. 95℃ heat block에서 10분간 두어 RNA를 용리하였다. 탭핑(tapping)하여 막에 붙은 RNA를 용리하고 quick-spin한 후, 얼음에 두었다. 다음 PCR 튜브에 옮기고, 36℃에서 다음 과정인 상기 <실시예 1>의 RS 정방향 프라이머와 RS 정방향 프라이머를 사용하여 역전사 반응과 PCR 반응을 수행하고 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 생체외 전사를 수행하여 RNA 단일가닥핵산 풀을 제조하였다. 상기에서 인간혈청시료 단백질과 결합하는 압타머 일차 라이브러리의 준비는 인간혈청시료의 단백질과 RNA 라이브러리를 반응시키고 다양한 세척버퍼(0 내지 1×의 반응용액, 0 내지 5% Tween-30 또는 0 내지 600mM의 EDTA 용액)로 세척하는 과정을 반복한 일회만의 선택과정을 통하여 수행하였다.
압타머 일차 단일가닥핵산 라이브러리의 제조는, 상기와 같이 얻어진 RNA 단일가닥핵산 풀을, 상기 방법과 같이 상기 각 분석시료와 비교시료에 각각 반응시켜 미결합 또는 비특이 RNA 단일가닥핵산을 제거하여 단백질과의 복합체 풀을 분리하고 그 복합체 풀에서 RNA 단일가닥핵산을 해리시켜 이루어졌다. 이때 세척 과정은 1회만을 수행하였다.
다음 상기 압타머 RNA 단일가닥핵산에 대해 역전사를 수행하여 cDNA를 제조하고 이 cDNA에 대해서 일방향 PCR(One-way PCR)를 1회 수행하여 이중가닥 DNA 단편을 얻고, 이에 대해서 후술하는 바와 같이 NGS 분석을 수행하였다.
<실시예 2-2> 외부 표준단백질을 포함한 시료에 대한 압타머 일차 라이브러리 제조
상기 <실시예 1>의 외부 표준단백질을 분석시료 또는 대조시료의 표적 단백질의 정량에 이용하기 위해서, 먼저 <실시예 1>에서 합성된 RNA 단일가닥핵산 라이브러리를 사용하여, 표준 SELEX 방법(Ellington, A.D. and J.W. Szostak. 1990. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature 346: 818-822; Gold, L., P.Allen, J. Binkley, D. Brown, D. Schneider, S.R. Eddy, C. Tuerk, L. Green, S. Macdougal, and D. Tasset. 1993. RNA: the shape of things to come, pp. 497-510. In: R.F. Gestelend and J.F. Atkins(eds.). The RNA World, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)을 이용하여 각 외부 표준단백질에 대해 특이적으로 결합하는 RNA 단일가닥핵산을 확보하였고, 기존 공지의 BAC library 구축을 통한 클로닝에 의한 서열 결정 방법(Genome Res. 2001 Mar; 11(3):483-496)을 적용하여 그 서열을 미리 결정하였다.
상기 <실시예 1>에서 제조된 외부 표준단백질 5종에 대해서, A는 0.01pg/ml, B는 1.0pg/ml, C는 100.0pg/ml, D는 10.0ng/ml, E는 1.0ug/ml의 농도로 분석시료와 비교시료에 각각 첨가하여 본 실시예의 분석 대상 시료로 사용하였다. 또 이 시료와 반응시킬 RNA 단일가닥핵산 풀에도 각 외부 표준단백질에 대해 특이적으로 결합하는 RNA 단일가닥핵산을 첨가하여, 시료와 반응할 RNA 단일가닥핵산 풀을 제조였다. 다음은 상기 5종의 외부 표준단백질이 각기 다른 농도로 첨가된 각 시료와 상기 외부 표준단백질에 대한 RNA 단일가닥핵산이 첨가된 RNA 단일가닥핵산 풀을 반응시켜 상기 <실시예 2-1>과 동일한 방법으로 압타머 일차 라이브러리를 제조하고, 이에 대해서 역전사와 일방향 PCR를 1회 수행하여, 그 결과물에 후술하는 바와 같이 NGS 분석을 수행하였다.
<실시예 3> 압타머 라이브러리의 염기서열 결정 및 출현빈도 결정
상기 <실시예 2>에서　제조된　압타머 일차　라이브러리의 RT-PCR 산물인 이중가닥 DNA 풀과 압타머　이차　라이브러리의 RT-PCR 산물인 이중가닥 DNA 풀에 대해 NGS(Next Generation Sequencing) 기술을 적용하여 그 압타머들의 염기서열과 그　출현 빈도를 결정하였다.
NGS 분석은 상기 DNA　풀을 대상으로　HiSeq 3000(Illumina 사)를　사용하여　실시하였다.
상기 실시예에서 제조된　DNA 풀과 TruSeq DNA sample preparation kit v. 2 (Illumina 사)를 사용하여 시퀀싱 라이브러리를 제조하였다. 구체적으로 제조사의 프로토콜에 따라 136ng의　DNA의 말단 부위 수리(end repair), 아데노신의　추가, 어댑터 부가를 수행하고 PCR을 수행 하였다. 아데노신 염기 추가 단계를 제외하고 각 단계마다 TruSeq 키트에　포함된　Agencourt AMPure XP beads(Beckman-Coulter사, 미국)로 세척하였다. 다음 제조사의 프로토콜에 따라 키트에 포함된 PCR 프라이머를사용하여　15　cycles의　PCR을　수행하여　시퀀싱　라이브러리를　제조하였다.
상기 PCR 산물인　시퀀싱　라이브러리는 Qubit　fluorometer(Invitrogen 사)로 정량하였다. HiSeq 3000의 cBOT cluster station에 한 시료당　3ng PCR 산물을　5pM의 농도로 flowcell에서　혼성화하였다. cBOT에서 브리지 증폭(bridge amplification)을 압타머 라이브러리 단일 DNA 당 28번 증폭하여 클러스터를　형성시켰다.
각 클러스터는 선형화시킨 후 시퀀싱 프라이머와 혼성화하였다. 본　flowcell을　HiSeq 3000에　로딩하였으며　73 single read bases과　더불어 7 multiplexed bases를　염기서열 분석할　수　있는　HiSeq 3000의　Single Read 80 Base Pair Recipe를 사용하여 분석을 수행하였다. Illumina Real Time Analysis (RTA)로　이미지 생성 및 분석을　실시하여 실시간으로 base-call files과　품질 점수를 확인하였다.
순방향 및 역방향 가닥의 시퀸싱이 종료된 후, 제조사(Illumina 사) Casava 소프트웨어를 이용하여 품질분석을 수행하였으며 추가적으로 자체 개발한 소프트웨어(AptaCDSS, 바이오이즈),　분석시스템를 사용하여 다운 스트림 분석을 수행하였다.
품질분석의 매칭(Matching) 단계는, 단일가닥핵산 라이브러리를 구성하는 올리고뉴클레오타이드의 <일반식 I> 구조에서 5' 보존영역(17 bp), 가변영역(50 bp) 및 3' 보존영역(17 bp)를 포함하는 서열의 74 염기쌍(bp)의 패턴을 기준으로 비교 분석하였다. 필터링(Filtering) 단계는 상기 패턴과 일치하지 않는 임의의 서열을 제외하는 단계이다. 패턴 매칭 동안 각 보존영역에서 하나의 불일치는 허용하였다. 보존영역 서열은 다운 스트림 분석을 위해 50 bp의 가변영역 서열만 남기고, 필터링 후에 제외하였다. 역방향 보충 태그는 순방향 서열 태그와 결합하였다. 압타머 카운트 라운드 리드를 계수하는 과정은 round enrichment analysis로 수행하였다. 이러한 품질분석 및 카운트 라운드 결과를 이용하여 상기 라이브러리를 구성하는 특정한 압타머의 염기서열을 결정하고 출현빈도를 결정하였다.
서열 분석은 각 압타머의 DNA 풀 당 15,000,000 내지 18,000,000개의 단일 DNA에 대해서 이루어졌다.
분석시료(S)에서 준비된 압타머 일차 라이브러리와 비교시료(C)에서 준비된 압타머 일차 라이브러리 각각을 구성하는 5,395개의 압타머에 대한 염기서열과 출현빈도의 비율을 비교하여 서로 상이함을 확인하였다[도 3].
SSH 공정으로 제작된 압타머 이차 라이브러리를 구성하는 압타머 염기서열 분석은 상기 압타머 일차 라이브러리에서 결정된 압타머 염기서열로 구축된 참조 염기서열(reference sequences)과 EBI 웹 사이트 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)의 Omega Cluster로 클러스터링 분석하였다.
이러한 분석시료 및 비교시료를 비교 분석을 통하여, 분석시료를 대표할 수 있는 압타머으로 총 1,149개를 결정하였다.
<실시예 4> 재현성 및 반복성 평가
상기 <실시례 3>에서 얻은 1,149개의 압타머 풀을 사용하여 <실시례 3>에 따라 혈청 시료를 동일한 연구자가 수동으로 분석한 집단적 정량과 Tialong(중국)의 Libex를 이용하여 분석한 집단적 정량하고 그 결과에 대해 하기와 같이 재현성 및 반복성을 평가하였다.
1ul, 5uL 및 10ul 혈청을 자성 비드와 압타머 풀을 포함하는 반응용액과 혼합하여 준비된 100ul 혼합용액을 집단적 정량을 1일 2회(run), 5일 동안 3회 반복 측정하여 반복성(repeatability, within laboratory precision)을 평가하였다.
시약을 따로 3번 제조한 시약 로트를 이용하여 5uL 혈청을 상기 반응용액과 혼합하여 준비된 100ul 혼합용액 검체를 제조하여 로트간 정밀도(lot-to-lot precision)를 평가한다.
3곳의 검사실에서 1ul, 5uL 및 10ul 혈청을 상기 반응용액과 혼합하여 준비된 100ul 혼합용액 검체를 제조하여 1일 2회, 5일 동안, 3회 반복 측정하여 재현성(reproducibility) 평가하였다.
평균, 표준편차, 변동계수(Coefficient of variation, CV%) 등으로 결과를 제시하였다.
상기 실시례 3 항목에서에 얻은 1,149개의 압타머 풀을 사용하여 혈청 시료를 수동으로 실시하는 집단적 정량보다 Tialong(중국)의 Libex를 이용하여 분석한 집단적 정량이 재현성 및 반복성이 우수함을 확인하였다.
<실시예 5>　압타머의　생물학적　의미　결정
폐암 환자의 혈청(10례)을 분석시료로, 비폐암 환자의 혈청(21례)을 비교시료로 분석하였다[표 2].
폐암과련 시료의 임상정보

시료 임상정보
폐암 대조구
시료 수 10 21
평균 나이 64.3 56.6
중앙값 평균 나이 65 56
성 남자 8 16
여자 2 5
Histopathology of NSCLC
Squamous cell carcinoma 2
Adenocarcinoma 8
NSCLC Stage I 6
Stage II 4
Stage III
Stage IV
Pneumonia 21
Tuberculosis 10
Benign mass 2
Etc 17
상기 실시예에서 결정된 1,149개의　압타머의　염기서열로　참조서열을　구축하였다. 시료를 1,149개의 압타머 라이브러리에 반응시킨 후 형성된 단백질-압타머 복합체 풀에서 분리된 압타머 풀의 RT-PCR 산물인 이중가닥 DNA를　핵산시료로 하여　시퀀싱　라이브러리를　제조하였다. 그 후 NGS로 리드를　생산하고　상기 참조서열과 비교하여 압타머의 출현빈도를 분석하였다. 생물학적　의미결정　시스템을 이용한,　1,149개의 압타머 출현빈도로 페암 환자와 비폐암 환자를 통계적인 방법으로 구분할 수 있는 압타머의 분포는 [도 4]과 같다.
상기 분석시료(10례)와 대조구(21례) 각각에 대해 분석한 결과를 이용하여 분석시료와 비교시료에 대한 db를 구축하였으며 두 그룹을 잘 구분할 수 있는 압타머들을 One-way ANOVA 기법으로 결정한 후, 결정된 압타머의 출현빈도를 4*[(출현빈도-최소)/(최대-최소)]-2로 전환하여 표현한 결과는 [도 4]과 같다.
상기 결과와 같이, 생체시료를 구성하는 다중의 단백질, 결합하는 압타머 및 NGS 기술을 이용하여 특정한 생체시료에서 단백질의 프로파일을 탐색 및 분석하여 분석시료인 폐암 환자 혈청단백질에 특이적으로 결합하고 생물학적 의미를 지닌 압타머들을 선정할 수 있다. 이 중에 일련번호 768(압타머에 대해 자체 부여한 번호임) 압타머에 대한, 분석시료인 폐암 환자의 혈청과 비교시료인 비폐암 환자의 혈청에 대한 결합정도를 평가한 결과, 폐암 환자의 혈청에만 특이적으로 반응함을 알 수 있었다[도 6].
<실시예 6> 생체시료의　분석-핵산과 단백질의 동시분석
NGS(next generation sequencing)는 칩(Chip)기반 그리고 PCR 기반 페어드엔드(paired end) 방법으로, 전장 유전체를 조각내고 상기 조각을 혼성화(hybridization)하여 초고속으로 시퀀싱하는 기술이다. NGS를 이용하여 유전체에 대한 많은 정보를 생산할 수 있다.
NGS 기술을 이용하여, 인구집단의 2~5%에서 나타나는 대립유전자 유전형질 정보인 염기다형성(SNP: single nucleotide polymorphism)과 염기다형성의 결과로 Wild type 아미노산이 변형된 형태인 돌연변이(amino acid mutation)를 신속하게 분석할 수 있다. WGS(whole genome sequencing)는 차세대염기서열결정법(NGS)에 의한 전장 유전체 시퀀싱을 10×, 30×, 50× 등 여러 배수로 인간게놈을 읽는 방법이고 WES(whole exome sequencing)는 위의 WGS 중에서 단백질 생성에 관여하는 유전자 부위만 염기서열 결정을 하는 방법이며, TS(Target sequencing)는 위의 WGS중에서 표적분자 생성에 관여하는 유전자부위만 시퀸싱을 하는 기술이다. 따라서, WGS > WES > TS의 순으로 데이터 크기가 생성된다. 그러나 작은 부위를 분석대상으로 하는 경우 다수의 시료를 시퀀싱할 수 있다는 장점이 있다. METseq은 유전자의 DNA methylation 측정을 위한 시퀀싱 기술이고, RNAseq은 유전자의 발현, 즉 DNA transcriptome을 위한 시퀀싱 기술이다. SV(structural variation)는 변이중에서 insertion, inversion, translocation 등에 의하여 생기는 염색체의　큰 단위(DNA segment)에서 생기는 변이로 이에 대한 정보도 NGS로 생산할 수 있다.
NGS 기술을 이용하여 단백질 및 핵산 정보를 동시에 생산하는 과정은 다음과 같다.
참조서열 구축
먼저, 분석하고자하는　핵산들의　염기서열과　분석하고자하는　단백질들의 압타머를　포함하는　압타머의　염기서열로　참조서열을　구축해야 한다. 본 실시예에서는 1,149개의 압타머의 염기서열과 분석하고자하는 하기 핵산의 염기서열로 참조서열을 구축하였다.
<실시예 6-1> 단백질　분석
생체시료를 나누어 단백질 분석을 위한 시료를 준비하였다. 준비된 단백질 시료와　Dynabeads® WCX(Dynal Biotech, 미국)을　접촉시키고　형성된　단백체－자성 비드　복합체　풀을　1차 자기 수집하였다.　구체적으로 단백질 시료를　자성비드에　부착하고　압타머를　포함하는　압타머 풀과　반응 용액 내에서 접촉시켰으며　형성된　압타머 풀-단백체-자성비드 복합체　풀을　세척용액으로　세척하였다. 상기 과정을 통하여　미결합하거나　비특이적　결합　압타머을 제거하고　자성비드를 분리하였다. 자성비드에 부착된 다중 단백질과 결합하는 압타머 풀에서　확보한 RNA인　압타머을　대상으로　역전사 및　PCR를　수행하여　DNA　풀을　얻었다. 확보된　DNA 풀 136ng 이용하여 TruSeq DNA sample preparation kit v. 2(Illumina 사)로 end repair, 아데노신의　추가, 어댑터 부가 및 PCR을 수행하였다. 아데노신 염기 추가를 제외하고　각 단계마다 TruSeq 키트에　포함된　Agencourt AMPure XP beads(Beckman-Coulter)로 세척하였다. 제조사의 프로코톨에 따라 키트에 포함된 PCR 프라이머를　사용하여　15 회의 PCR을　하여 시퀀싱 라이브러리를 제작하였다.
<실시예 6-2> DNA 분석
핵산 정보를 분석하기 위하여, 표적유전자를 증폭하는 과정에서 올리고뉴클레오타이드의 특별한 디자인이 요구된다. 상기 올리고뉴클레오티드는 많은 표적들을 동시에 증폭하기 위한 목적을 지니며, 타겟-특이적 서열(타겟 혼성화 뉴클레오타이드 서열) 및 5'-플랭킹 어셈블리 스페이서　서열(오버래핑 서열)이 사용될 수 있다.
특정 온도에서 어닐링할 수 있는 최적의 길이를 가진 mTAS(multiple target loci assembly sequencing) 올리고뉴클레오타이드를 제작하기 위해, 본 발명자들은 컴퓨터 프로그램인 PrimerPlex2.75 software (PREMIER Biosoft, 미국)를 이용하였다. 올리고뉴클레오타이드 프로브는 타겟-특이적 서열(타겟 혼성화 뉴클레오타이드 서열) 및 5'-플랭킹 어셈블리 스페이서　서열(오버래핑 서열)로부터 제작되었다. 프로브들은 약 25 bp의 길이이며 Tm 60℃에서 어닐링될 수 있다.
각 타겟 게놈 유전자 위치(genomic locus)를 위해, SNP 위치를 포함하는 7 bp의 갭(gap)이 존재하도록(즉,　SNP 위치의 좌측, 3 bp; SNP 위치, 1 bp; 및 SNP 위치의 우측, 3 bp) 디자인하였다. 디자인의 용이성을 더하기 위하여 갭의 간격은 0-3bp로 조절되었다. 비록 어셈블리 스페이서 서열은 임의적으로 제조되었으나, 어셈블리 서열상에 존재하는 어닐링 부위는 올리고뉴클레오타이드 간의 중첩 부위(overlapping regions)에　대한 온도값(temperature value)을 계산하기 위해 가장 가까운 인접 방법(nearest neighbor methods; BMC Genomics. 2016; 17: 486. )에　기반하여 결정되었다.
생체시료에서 공지된 방법을 이용하여 핵산시료를 분리·준비하였다. 인간 혈청시료로부터 QIAamp DNA 추출 키트(Qiagen, 독일)를 이용하여 DNA(gDNA)를 추출하였다.
구체적으로, gDNA의 분리를 위해 혈청시료를 1.5㎖ 마이크로 원심분리튜브에 넣어 프로테아제(protease) K 30㎕ 및 완충용액 180㎕와 혼합하였고, 1시간 동안 56℃에서 반응시켰다. 이와 같이 얻어진 반응액을 QIAamp 스핀 컬럼(spin column)을 이용하여 정제한 후, 완충 용액으로 2회 세척하였다. 그 다음, 70℃에서 예웰한 완충용액 60㎕로 용해하여 gDNA를 추출하였으며 -30℃에 보관하였다. 추출한 각 gDNA는 Qubit　dsDNA HS Assay Kit와 Qubit 2.0(Life Technologies 사, 미국)를 사용하여 정량하였다.
-30℃에 보관되어 있는 gDNA 10 ng을 사용하여 17개의 표적유전자의 패널 프라이머를 이용하여 NGS 수행을 위한 라이브러리를 제작하였다. 해당 패널 프라이머를 아래의 [표 3]에 개시하였다.
NGS를 위한 라이브러리는 Ion AmpliSeq Library Kit 2.0(Life technologies사)를 사용하여 제작하였다.
구체적으로, 시료에서 추출한 DNA에서 표적유전자의 돌연변이 발생부위만을 얻어내기 위하여 상기 패널 프라이머풀을 이용하여 증폭하였다. 5X HiFi 마스터믹스 4㎕와 패널 프라이머풀 10㎕, DNA 10ng을 혼합하고,　총 반응액이 30㎕가 되도록 멸균 증류수로 보정하여 혼합 반응액을 준비하였다. 준비된 혼합 반응액을 PCR 기기에서 99℃에서 2분, 99℃에서 15초, 60℃에서 4분의 과정을 21회 반복하여 증폭하였다. 얻어진 증폭산물에 2㎕의 Fupa 시약(Thermo Fisher Scientific 사, 미국; 부분적인 절단 및 인산화를 위하여 사용됨)을 첨가하여 60℃에서 10분, 55℃에서 10분, 60℃에서 30분간 반응시켜서 증폭산물 양 말단을　부분적으로 절단하였다. 부분적으로 절단된 증폭산물에 Ion P1 adapter 2㎕, Ion Xpress Barcode 2㎕를 첨가하여 22℃에서 40분, 72℃에서 10분간 반응시켰으며 시퀀싱 어댑터와 시료를 구분할 수 있는 바코드를 증폭산물에　결합시켰다. 시퀀싱 어댑터와 바코드가 결합된 증폭산물에 45㎕의 AMPure XP 용액을 첨가하여 세척하고　Agilent DNA 1000 chip을 이용하여 정량화하여 시퀀싱 라이브러리를 제작하였다.
<실시예 6-3> RNA 분석
혈청시료를 1.5ml씩 시료링하여 상온에서 10,000g로 5분간 원심분리하여 세포를 회수하였다. 그 후 RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen사)를 이용하여 회수된 세포의 전체 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA의 농도와 질(quality)은 NanoDropTM　1000 spectrophotometer(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)를 이용하여 260nm와 280nm에서 측정하였다.
시료의 RNA　핵산시료로부터 제조된 cDNA 라이브러리의 서열을 대량 동시 기술을 이용하여 분석하였다. 예를 들어 mRNA-Seq Sample preparation Kit(Illumina사)와 같은 제품을 이용하였으며 제조사의 프로토콜에 따라 또는 약간 변형 사용하여 cDNA 라이브러리를 합성하였다. 혈장 cDNA의 말단-보수 단계에서는 5배 희석된 클레노브(Klenow) DNA 중합효소를 사용하였다. 말단 보수되고 아데닐화된 생성을 정제하기 위하여 PCR 정제 키트 QIAquick MinElute Kit(Qiagen사, 미국)를 사용하였다. 10배 희석된 쌍 지은 말단 어댑터(adapter)를 혈장 cDNA 시료와 결합시켰으며, 어댑터가　결합된 생성물을 정제하기 위하여 AMPure XP 비드(Agencourt사, 미국)를 사용하여 2회 정제과정을 수행하였다. 이후　Agilent DNA 1000 chip을 이용하여 정량화하였으며　시퀀싱 라이브러리를 제작하였다.
<실시예 6-4> miRNA 분석
인간혈청시료에서　소형 리보핵산(small RNA) 서열분석(sequencing)으로 전체 유전체 마이크로RNA(genome-wide
miRNA)를 분석, 비교하였다. mirVAna miRNA isolation kit(Ambion　사, Austin, TX)를 사용하여 혈청시료로부터 소형 리보핵산이 풍부한　총　RNA를 추출하였으며, Illumina library preparation protocol(Illumina 사, San Diego,　CA, USA)를 이용하여 miRNA 라이브러리를 준비하였다. 각각의 라이브러리는 Illumina 어댑터(adaptor; 6-염기 바코드(base barcode)로　색인화하였다. 소형 리보핵산(small RNA) 라이브러리는 6% TBE 유레아 폴리아크릴아마이드 겔(TBE urea　polyacrylamide gel)을 이용하여 크기별로 나누었으며(size fractionation), 150 내지 160 염기 쌍(base pair) 부분(fraction)은 겔로부터 절개하여 얻고 정제하였다. 정제된 miRNA 라이브러리는 Agilent DNA 1000 chip을 이용하여 정량하였으며 시퀀싱 라이브러리를 제작하였다.
상기　분획된　생체시료에서　분리한　핵산　시료와　상기　분리한　단백질－압타머　복합체　풀을 혼합하여 시퀀싱　라이브러리를　제작할 수도 있으나, 본 실시예에서는 각기 따로 제작한 시퀀싱 라이브러리를 혼합하여 염기서열을 결정하였다. 상기　제작된　시퀀싱　라이브러리를　구성하는　핵산의　염기서열을　상기　참조서열과　비교분석하여　출현빈도를　결정하였다.
NGS용 시퀀싱 라이브러리가 시퀀싱에 사용될 수 있는가를 확인하기 위하여 Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent 사,　미국) 기기와 High Sensitivity chip을 이용하여 제작된 라이브러리의 길이와 양을 측정하였고, 길이는 100 내지 400bp, 양은 100 pmol/ul 이상인 조건에 만족하는 라이브러리를 시퀀싱에 사용하였다. 또한 High Sensitivity chip을 이용하여 라이브러리 정도관리를　하였다.
상기에서 나타낸 바와 같이, 각 시료별로 혼합되고 해당 시료의 바코드 서열이 부착된 PCR 산물을 Qubit fluorometer(Invitrogen 사)로 정량하였다. HiSeq 3000의 cBOT cluster station에 한 시료당 3ng PCR 산물을 5pM의 농도로 flowcell에서　혼성화하였다. cBOT를 이용한 브리지 증폭(bridge amplification)으로 단일 DNA 단백질당 28회 증폭하여 클러스터를　형성하였다. 각 클러스터를 선형화하였으며 시퀀싱 프라이머와 혼성화하였다. 해당　flowcell를　 HiSeq 3000에　로딩하였다.　본　flowcell은　73 single read bases와　더불어 7　multiplexed bases를　염기서열 분석할　수　있는　HiSeq 3000의　Single Read 80 Base Pair Recipe로　분석하였다. Illumina Real Time Analysis (RTA）를 이용하여 이미지 생성 및 분석을 수행하였으며 실시간으로 basecall file과　품질 점수를 확인하였다.
순방향 및 역방향 가닥의 시퀸싱이 종료된 후 Illumina사의 Casava 소프트웨어를 이용하여 품질 분석을 하였으며, 추가적으로 내부에서 개발한 소프트웨어　분석시스템과　참조서열를 사용하여 다운 스트림 분석을 수행하였다.
상기　결정된　시퀀싱　라이브러리를　구성하는　핵산의　출현빈도는 표적분자인 핵산 및 단백질의 정보를 반영하고 있어 생물학적　의미결정　시스템으로　상기　분석결과를 이용하여　생체시료의　생물학적　의미를　결정할 수 있다. 상기 생물학적 의미결정 시스템의 생물학적 의미는 상기 시료 또는 시료를 채취한 사람의 생리적인 변화를 의미하고, 상기　임상검사　값에　상응하여　예방, 진단, 치료, 완화와 처치 등의　건강관리를 목적으로 의사 결정(Decision Making)을 하는 과정에　필요한　정보를　말한다.
상기 [표 3]의 프라이머는 정방향, 역방향 각각 187개로 서열번호는 상기 표 3에 기재된 순서대로 서열번호 9 내지 서열번호 서열번호 383으로 지정되어 있다.
표적유전자 및 프라이머
정방향primer 역방향Primer 표적유전자
TCCTCATGTACTGGTCCCTCAT GGTGCACTGTAATAATCCAGACTGT KRAS
CATACGCAGCCTGTACCCA GTGGATGCAGAAGGCAGACAG RET
TGTCCTCTTCTCCTTCATCGTCT AGGAGTAGCTGACCGGGAA RET
CCATCTCCTCAGCTGAGATGAC GGACCCTCACCAGGATCTTG RET
CCTATTATGACTTGTCACAATGTCACCA TAGACGGGACTCGAGTGATGATT BRAF
CACAGCAGGGTCTTCTCTGTTT CCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTCC EGFR
TGTCAAGATCACAGATTTTGGGCT ATGTGTTAAACAATACAGCTAGTGGGAA EGFR
GGTGACCCTTGTCTCTGTGTTC AGGGACCTTACCTTATACACCGT EGFR
GGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCT GGAAATATACAGCTTGCAAGGACTCT EGFR
cttACCAGCTTGTTCATGTCTGGA AGAGGACTTCGCTGAATTGACC MET
GCAGCGCGTTGACTTATTCATG CACAGCTACTCTCAGAAAGCACT MET
AACTGAGCTTGTTGGAATAAGGATGTTAT CCATTTTGGTTTAATGTATGCTCCACAATC MET
CCCATCCAGTGTCTCCAGAAGT CAAGTGACACTGGTTGTAAATATGCATTT MET
GTTATGACAGGATTTGCACACATAGTT CCCAAGCCATTCAATGGGATCT MET
CCCTTCTCTTCACAGATCACGA CAGACAGATCTGTTGAGTCCATGT MET
GCTTGGGCTGCAGACATTTC GCCAGCTGTTAGAGATTCCTACC MET
TGGTCCTGCACCAGTAATATGC ATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGA KRAS
CCATCCACAAAATGGATCCAGACA GCTCTGATAGGAAAATGAGATCTACTGTTT BRAF
AGGAAATTCCCACTTAGGAACCATTG AGCAAACTCAGTTGAAATGGTTTGG MET
GTTCAGTGTGTCAAACAGTATTCTTGAATG GTTGGATGAATTTCATAGACAATGGGATC MET
ACAAGCATCTTCAGTTACCGTGAA AAAACTGCAATTCCTCTTGACTATTCTACA MET
GCTATGGATGTTGCCAAGCTGT TAACATGAAAAAGGCTTTGGTTTTCAGG MET
GCAACAGCTGAATCTGCAACTC ATTTTCATTGCCCATTGAGATCATCAC MET
CTGTGTTTAAGCCTTTTGAAAAGCCA CCAAGTACAACAATTGTATTCACATAGCT MET
CATAATTAAATGTTACGCAGTGCTAACCA GCAAACCACAAAAGTATACTCCATGGT MET
CAGTCAAACCCTCAGGACAAGA CCCTCGGTCAGAAATTGGGAAA MET
TCTCAGGAATCACTGACATAGGAGAAG CGAATGAAATTTCGAAGATCTCCATGTTT MET
GCTGGTGGTCCTACCATACATG TTTTTAAAGACTCAGAGCAGGCCTATT MET
GAGGCCAGATGAAATACTTCCTTCA AAAATCAGCAACCTTGACTGTGAATTTT MET
TGTCCTTTCTGTAGGCTGGATGA GGTGGTAAACTTTTGAGTTTGCAGA MET
GTGAAGTGGATGGCTTTGGAAAG AAACTGGAATTGGTGGTGTTGAATTTTT MET
CGTCTCCTGGAGATGGATACTCT CTGTGGAGGAACTTTTCAAGCTG FGFR1
GCAGTTACTGGGCTTGTCCAT GAGGCGGAGAAGCTCTAACAC FGFR1
GCATGGACAGGTCCAGGTAC GGAAGACCTGGACCGCATC FGFR1
CCTTACCTGGTTGGAGGTCAA GGAGACGTCCCTGACCTTACA FGFR1
GAGTTCTTTGCTCCACTTGGGA CCACACTCTGCACCGCTAG FGFR1
GCACCTTACCTTGTTCAGGCAA TGGAGTATCCATGGAGATGTGGA FGFR1
AGGAATGCCTTCAAAAAGTTGGGA TCCAGTGCATCCATGAACTCTG FGFR1
GTGATGGCCGAACCAGAAGAAC CATGTGCCTCTGCCATTGTTG FGFR1
GAGAGAGGCCTTGGGACTGATA TCAGAAATGGAGATGATGAAGATGATCG FGFR1
AGCAGGTTGATGATATTCTTATGCTTCC CCACTCCCTTAGCCTTTATCCTG FGFR1
TTAAACCCAATGCCCAGACCCAAA CCCTTCTTCTTCCCATAGATGCTCT FGFR1
TCTCCTCTGAAGAGGAGtcatcatc GGTGTCCGTGTTCATCTGGAAC FGFR1
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TGTAGATCCGGTCAAATAATGCCTC GGTTTCATCTGAGAAGCAAGGAGT FGFR1
GCATTAGAGGCCCAGAGAGAGA TCATCGTCTACAAGATGAAGAGTGGTA FGFR1
GCTGTGGAAGTCACTCTTCTTGG CTAACACCCTGTTCGCACTGA FGFR1
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AAATGAAAAGCATGTAATCAGGACTTCCTA ACACTGCGCTGGTTGAAAAATG FGFR1
TGTGGTCAGGTTTGAATTCTTTGC GCCGTAGCTCCATATTGGACATC FGFR1
CATGCAATTTCTTTTCCATCTTTTCTGG CTCACAGGTGTTGGGCAGAT FGFR1
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TTCTAGTAATTTGGGAATGCCTGGTT cgcctcTGAATATTTCTTTAATGTTGTCTT ROS1
GCCTAGGTGCTCCATAATGATGG AGTCTGGCATAGAAGATTAAAGAATCAAAA ROS1
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TCACCGAATGAGGGTGATGTTTT GCAGAGCCCTGAGTACAAGC ALK
GGTTGTAGTCGGTCATGATGGT TGGCCTGTGTAGTGCTTCAAG ALK
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GTTCTAGTTCAGTCTTCTTCATTGTACCTT CGGAAGAAGGTAAACATTAGCTCTACAG EML4
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AGAGAACTCAGCGACACTACCT TCTGAGCTTTCCACAAGAAATCACTT EML4
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TCTTGCCACACATCCCTTCAAA GCCAGTGTGAGGAGTTTCTGTG EML4
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GAGCATATGCTTACTGTATGGGACT GCTTTTGCGACTTACGAATAGATAGTTCTA EML4
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AGCCATGTCACCAATGTCAGTTTTA GGCTTTGGTTAGAGTAGTATCCGCTA EML4
AGTTATCTTTGCCTCAGAATGAGACTG GTGGGAGAACTGCTTATTCTACTTTCC EML4
GCCCTTAAATGAGACAGCTGAAGA GCTTATCTCGTTGCATGGCTCTT EML4
GAGACCTTGGTGAGCCTCTTTATG ACATGCAGCTGAAGGAAAAGAGTT EML4
CAGCTATAAATGCAGGCTTCGAGTA GTTCCTCGTAAAATAAAGTTTCGTGATGT EML4
GGAAAGGCAGATCAATTTTTAGTAGGC ACCCTGAAAATGAAAGACACTCATTGTTAT EML4
GCTAATTTTTCTGCATCCCTGTGTT GGGATACTGAAACAGATGGACTTTACAAA EML4
GTGATAGCTGTTGCCGATGACT GAGTATCATGGAGAGGAATCAGTAACCTAT EML4
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ATCCGCAAATGACTTGCTATTATTGATG CCCAGGATTCTTACAGAAAACAAGTG NRAS
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CCTCACCTCTATGGTGGGATCA GCTCGCCAATTAACCCTGATTACT NRAS
CAGGTCTCTCCGGAGCAAA GCCAAGTCCCTGTGTACGA HER2
AGAACCTCTCAACATTGTCAGTTTTCT GCTCTGAGTAGAACCATTGCTCA MET
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GTCTCTCGGAGGAAGGACTTGA CAGACTCAGCTCAGTTAATTTTGGTTAC ALK
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TATGCAGATTGCCAAGGTATGCA AATGGGAAGCACCCATGTAGAC HER2
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GGATGAGCTACCTGGAGGATGT CCATCTGCATGGTACTCTGTCT HER2
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TCTCCCATACCCTCTCAGCGTA CAGCCATAGGGCATAAGCTGTG HER2
100: 자동화 장비 200: 자성부
210: 자성 모듈 220: 커버 모듈
300: 딥-웰 플레이트 301: 1차 결합용 웰
302: 1차 세척용 웰 303: 2차 결합용 웰
304: 2차 세척용 웰 305: 용출용 웰
400: 이동부 410: 제1 이동 모듈
420: 제2 이동 모듈

Claims (18)

  1. 분석 대상 시료에, 그 시료에 존재하는 단백체의 집단적 정량을 하기 위해서,
    (a) 분석 대상 시료에, 그 시료에 존재하는 단백체와 Magnetic Beads(자성비드)를 접촉시켜 제조된 단백체-자성비드 복합체를 미결합 단백체를 포함한 상기 분석대상 시료를 구성하는 혼합물로부터 세척 및 분리를 자기력으로 실시하는 단백체-자성비드 복합체의 1차 자기 수집 단계;
    (b) 상기 1차 수집된 복합체와 압타머 풀을 접촉시킴으로써, 제조된 압타머 풀-단백체-자성비드 복합체를 미결합하거나 비특이적으로 결합한 압타머들로부터 세척 및 분리를 자기력으로 실시하는 압타머 풀-단백체-자성비드 복합체의 2차 자기 수집 단계; 및
    (c) 상기 2차 수집된 복합체에 포함된 결합 압타머 풀을 용출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백체 결합 압타머 풀의 제조 및 이의 자동화 장비
  2. 제1항에 있어서, 상기 Magnetic Beads는
    (a) 친화성 리간드(affinity ligand);
    (b) 친수성 리간드(hydrophilic ligand);
    (c) 소수성 리간드(hydrophobic ligand); 및
    (d) 이온 교환기(ion-exchange groups)를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나가 고정된 것을 특징으로 하는 단백체 결합 압타머 풀의 제조 및 이의 자동화 장비
    청구항 2
    제1항 내지 제2항에 있어서, 상기 Magnetic Beads는 MB-C3, C8 및 C18, MB-WCX, WAX, MB-IMAC Fe Cu ?? MB-IAC Prot G를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 단백체 결합 압타머 풀의 제조 및 이의 자동화 장비
  3. 제1항에 있어서, 상기 압타머 풀은
    (a) 무작위 서열을 가져 다양한 단백질들에 대한 잠재적 결합 능력을 가진 압타머 풀;
    (b) (i) 무작위 서열을 가져 다양한 단백질들에 대한 잠재적 결합 능력을 가진 압타머 풀을 제작하고, (ii) 이 압타머 풀을 상기 (a) 단계에서와 동일한 분석 대상 시료의 표적 단백질 집단과 반응시켜 각 압타머와 각 표적 단백질 사이에 특이적 결합을 유도하여 복합체 집단을 형성시키고, (iii) 비결합한 압타머를 제외시켜 그 복합체 집단을 분리하고, (iv) 그 복합체 집단의 압타머를 증폭하여 얻어진 압타머 풀; 및
    (c) 하나 이상의 단백질들에 대한 결합 능력을 가진 압타머 풀을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 단백체 결합 압타머 풀의 제조 및 이의 자동화 장비
  4. 제1항 및 제3항에 있어서, 상기 압타머는 PCR의 프라이머 세트가 상보적으로 결합할 수 있는 부위 또는 상기 상보적인 결합을 연결될 수 있는 것을 특징으로 하는 단백체 결합 압타머 풀의 제조 및 이의 자동화 장비
  5. 제1항에 있어서, 상기 제조한 압타머-단백체-비드 복합체로부터 결합 압타머를 용출하는 단계는 온도, pH 및 염으로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 사용하는 것을 특징으로 하는 단백체 결합 압타머 풀의 제조 및 이의 자동화 장비
  6. 제1항에 있어서, 상기 집단적 정량은 PCR, 혼성화 및 염기서열 결정을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 사용하는 것을 특징으로 하는 단백체 결합 압타머 풀의 제조 및 이의 자동화 장비
  7. 분석 대상 시료 중의 표적 단백체와 표적 유전체를 동시분석하기 위해서,
    (a) (i) 분석 대상 시료에, 그 시료에 존재하는 단백체와 Magnetic Beads(자성 비드)를 접촉시켜 제조된 단백체-자성 비드 복합체를 미결합 단백체를 포함한 상기 분석대상 시료를 구성하는 혼합물로부터 세척 및 분리를 자기력으로 1차 자기 수집하고, 상기 자기 수집된 복합체에 압타머 풀을 처리하여, 형성된 압타머 풀-단백체-자성비드 복합체를 미결합하거나 비특이적 결합한 압타머들로부터 세척 및 분리를 자기력으로 2차 자기 수집한 복합체에서 결합 압타머 풀을 용출하는 단계; 및 (ii) 상기 분석 대상 시료와 동일한 분석 대상 시료에서 자성비드를 접촉시켜 제조된 표적 핵산이 포함된 핵산-자성비드 복합체에서 표적핵산을 포함된 핵산을 용출하는 단계; 및
    (b) 상기 용출된 압타머 풀과 상기 용출되고 표적 핵산이 포함된 핵산을 혼합하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 표적 핵산은 gDNA, RNA 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 gDNA는 서열 결실, 서열 삽입, 단일염기다형성(SNP) 및 메틸화 시토신 중 하나 이상을 가진 gDNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 RNA는 mRNA, pre-mRNA, ncRNA(noncoding RNA) 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 자성모듈(210) 및 커버모듈(220)을 포함하는 자성부(200);
    1차 결합용 웰(301), 1차 세척용 웰 (302), 2차 결합용 웰(303), 2차 세척용 웰(304) 및 용출용 웰(305) 등의 딥-웰을 포함하는 딥-웰 프레이트(300); 및
    제1이동 모듈(410) 및 제2 이동 모듈(420)을 포함하는 이동부(400);를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백체 결합 압타머 풀의 제조 자동화 장비(100)
  12. 제11항에 있어서, 다음의 단계를 포함하는 제1 이동 모듈 및 제2 이동 모듈을 갖는 장치에서 자성 비드를 이송하기 위한 자성 모듈 및 반응용액 혼합을 위한 커버 모듈을 사용하여 분석 대상 시료, 그 시료에 있는 단백체에 특이적으로 결합하는 압타머 풀의 제조 자동화 장비로,
    (a) 상기 제1 이동 모듈 및 상기 제2 이동 모듈을 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈과 각각 체결하는 단계;
    (b) 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈을 1차 결합용 웰의 상부 공간으로 이동시키는 단계;
    (c) 상기 커버 모듈을 하강시켜서 상기 1차 결합용 웰의 내부 공간으로 상기 튜브를 위치시키는 단계;
    (d) 상기 커버 모듈은 1차 결합용 웰 내 분석대상 시료에 있는 단백체 및 자성비드 반응용액을 혼합하여 자성비드 복합체를 제조 하는 단계;
    (e) 상기 자성 모듈을 하강시켜 상기 로드를 튜브에 삽입시켜 1차 결합용 웰 내 자성비드 복합체와 접촉하는 단계;
    (f) 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈을 상승시켜서 세척용액이 있는 1차 세척용 웰로 이동시켜 상기 자성비드 복합체를 자기 수집하고 세척하는 단계;
    (g) 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈을 상승시켜서 자성비드 복합체를 압타머 풀 반응용액이 있는 2차 결합용 웰로 이동시켜 압타머 풀-단백체-자석비드 복합체를 제조하는 단계;
    (h) 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈을 상승시켜서 세척용액이 있는 1차 세척용 웰로 이동시켜 상기 자성비드 복합체를 2차 자기 수집하고 세척하는 단계; 및
    (i) 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈을 상승시켜서 용출용액이 있는 용출용 웰로 압타머 풀의 용출을 하는 단계.
    여기서, 상기 자성 모듈은 자성 비드를 수집하기 위한 자기력-발생 물질을 포함하는 로드; 상기 로드가 연결된 로드-지지부; 및 상기 로드-지지부 상의 제1 체결부로서, 상기 로드-지지부를 상기 제1 이동 모듈과 체결하도록 구성되는 제1 체결부를 포함하고; 및
    상기 커버 모듈은 튜브로서, 상기 튜브가 단백체와 자성비드 혼합용액을 혼합하고 상기 로드가 상기 튜브에 삽입되고 상기 삽입된 로드가 상하 방향으로 상기 튜브에서 이동할 때, 상기 로드를 가이드하는 튜브; 상기 튜브에 연결된 튜브-지지부; 및
    상기 튜브-지지부 상의 제2 체결부로서, 상기 튜브-지지부를 상기 제2 이동 모듈과 체결하도록 구성되는 제2 체결부를 포함하고; 상기 자성 모듈의 상기 로드는 상기 커버 모듈의 상기 튜브에 삽입가능하며, 상기 제1 이동 모듈 및 상기 제2 이동 모듈 중 최소한 하나는 상-하, 좌-우 및 전-후 방향으로 이동 가능한 것을 특징으로 한다.
  13. 제11항 내지 제12항에 있어서, 상기 웰은 샘플, 용해 시약, 및 자성 비드를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백체 결합 압타머 풀의 제조 자동화 장비.
  14. 제11항 내지 제12항에 있어서, 상기 장치는 자동화 액체 처리 장치인 것을 특징으로 하는 단백체 결합 압타머 풀의 제조 자동화 장비.
  15. 제11항 내지 제12항에 있어서, 상기 제1 이동 모듈 및 상기 제2 이동 모듈을 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈과 각각 체결하는 단계를 제외한 단계들은 세척 과정 또는 용출 과정에 대하여 추가적으로 실시되는 것을 특징으로 하는 단백체 결합 압타머 풀의 제조 자동화 장비.
  16. 제15항에 있어서, 상기 제1 이동 모듈 및 상기 제2 이동 모듈 중 최소한 하나는 수송 메커니즘 및 다중-기능 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백체 결합 압타머 풀의 제조 자동화 장비.
  17. 제15항에 있어서, 상기 제1 이동 모듈 및 상기 제2 이동 모듈 중 최소한 하나는 파이펫터 모듈 또는 그립퍼 모듈인 것을 특징으로 하는 단백체 결합 압타머 풀의 제조 자동화 장비.
  18. 제11항에 있어서, 다음의 단계를 포함하는 제1 이동 모듈 및 제2 이동 모듈을 갖는 장치에서 자성 비드를 이송하기 위한 자성 모듈 및 반응용액 혼합을 위한 커버 모듈을 사용하여 분석 대상 시료, 그 시료에 있는 단백체에 특이적으로 결합하는 압타머 풀 및 유전체의 제조 자동화 장비로,
    단백체 결합 압타머 풀의 제조는
    (a) 상기 제1 이동 모듈 및 상기 제2 이동 모듈을 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈과 각각 체결하는 단계;
    (b) 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈을 1차 결합용 웰의 상부 공간으로 이동시키는 단계;
    (c) 상기 커버 모듈을 하강시켜서 상기 1차 결합용 웰의 내부 공간으로 상기 튜브를 위치시키는 단계;
    (d) 상기 커버 모듈은 1차 결합용 웰 내 분석대상 시료에 있는 단백체 및 자성비드 반응용액을 혼합하여 자성비드 복합체를 제조 하는 단계;
    (e) 상기 자성 모듈을 하강시켜 상기 로드를 튜브에 삽입시켜 1차 결합용 웰 내 자성비드 복합체와 접촉하는 단계;
    (f) 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈을 상승시켜서 세척용액이 있는 1차 세척용 웰로 이동시켜 상기 자성비드 복합체를 자기 수집하고 세척하는 단계;
    (g) 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈을 상승시켜서 자성비드 복합체를 압타머 풀 반응용액이 있는 2차 결합용 웰로 이동시켜 압타머 풀-단백체-자석비드 복합체를 제조하는 단계;
    (h) 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈을 상승시켜서 세척용액이 있는 1차 세척용 웰로 이동시켜 상기 자성비드 복합체를 2차 자기 수집하고 세척하는 단계; 및
    (i) 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈을 상승시켜서 용출용액이 있는 용출용 웰로 압타머 풀의 용출을 하는 단계; 및
    유전체의 제조는
    (a) 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈을 핵산 1차 결합용 웰의 상부 공간으로 이동시키는 단계;
    (b) 상기 커버 모듈을 하강시켜서 상기 핵산 1차 결합용 웰의 내부 공간으로 상기 튜브를 위치시키는 단계;
    (c) 상기 커버 모듈은 핵산 1차 결합용 웰 내 분석대상 시료에 있는 핵산 및 자성비드 반응용액을 혼합하여 자성비드 복합체를 제조 하는 단계;
    (d) 상기 자성 모듈을 하강시켜 상기 로드를 튜브에 삽입시켜 핵산 1차 결합용 웰 내 자성비드 복합체와 접촉하는 단계;
    (e) 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈을 상승시켜서 세척용액이 있는 핵산 1차 세척용 웰로 이동시켜 상기 자성비드 복합체를 자기 수집하고 세척하는 단계; 및
    (f) 상기 자성 모듈 및 상기 커버 모듈을 상승시켜서 용출용액이 있는 핵산 용출용 웰로 압타머 풀의 용출을 하는 단계.
    여기서, 상기 (i) 단계와 상기 (f)의 용출단계에서 얻은 용액을 단백체 및 유전체 분석에 사용한다.
    또한, 상기 자성 모듈은 자성 비드를 수집하기 위한 자기력-발생 물질을 포함하는 로드; 상기 로드가 연결된 로드-지지부; 및 상기 로드-지지부 상의 제1 체결부로서, 상기 로드-지지부를 상기 제1 이동 모듈과 체결하도록 구성되는 제1 체결부를 포함하고; 및
    상기 커버 모듈은 튜브로서, 상기 튜브가 단백체와 자성비드 혼합용액을 혼합하고 상기 로드가 상기 튜브에 삽입되고 상기 삽입된 로드가 상하 방향으로 상기 튜브에서 이동할 때, 상기 로드를 가이드하는 튜브; 상기 튜브에 연결된 튜브-지지부; 및
    상기 튜브-지지부 상의 제2 체결부로서, 상기 튜브-지지부를 상기 제2 이동 모듈과 체결하도록 구성되는 제2 체결부를 포함하고; 상기 자성 모듈의 상기 로드는 상기 커버 모듈의 상기 튜브에 삽입가능하며, 상기 제1 이동 모듈 및 상기 제2 이동 모듈 중 최소한 하나는 상-하, 좌-우 및 전-후 방향으로 이동 가능한 것을 특징으로 한다.
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