JP2018046856A - 細胞中の複数のエピトープを同定するためのダイナミックレンジを高めること - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、標的分子を検出するための方法、組成物、キットおよびデバイスを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、多重化された標的分子検出を可能にする。複数の標的が複数の細胞に存在するか否かを同定するための方法であって、該方法は、該標的に複数のタグを結合する工程を包含し、タグは、a)該標的の同一性、およびb)タグが結合している該細胞の同一性を表すコードを含み、ここで、該複数のうちの少なくとも第1の標的対は、100倍よりも多くその相対存在量が変化する、方法。
【選択図】なし
Description
ヒトの身体のすべての細胞は、同じ遺伝物質を含んでいるが、それらの細胞のすべてにおいて同じ遺伝子が活性であるわけではない。遺伝子発現パターンの変化は、生物学的機能に重大な影響を及ぼし得る。さらに、遺伝子産物(タンパク質)、そのバリアントおよび相互作用パートナーの動態および制御を理解することは、例えば、遺伝的障害/および環境的に誘導される障害の背後にあるメカニズムまたは薬物媒介性治療の影響を理解する際に不可欠である。この理解は、さらなる臨床上および診断上の分析にとって基本的根拠になる可能性がある。ゆえに、細胞内での遺伝子および/またはそれらの産物の発現および制御の同定および定量は、治療上および診断上の新しい標的の発見を助け得る。
本発明は、概して、サンプル中の標的分子の検出、同定および定量の分野に関する。本発明は、複雑な細胞集団の単一細胞内の個々の標的分子に関する細胞特異的な情報を保持しながらの、その標的分子の検出、同定および定量に部分的に関する。
態において、その反応体積は、1000μl、900μl、800μl、700μl、600μl、500μl、400μl、300μl、200μl、100μl、50μl、40μl、30μl、20μl、10μl、5μl、4μl、3μl、2μl、1μl、900nl、800nl、700nl、600nl、500nl、400nl、300nl、200nl、100nl、50nl、40nl、30nl、20nl、10nl、9nl、8nl、7nl、6nl、5nl、4nl、3nl、2nl、1nlである。いくつかの実施形態において、その反応体積は、1nl未満である。いくつかの実施形態において、その反応体積は、1pl未満である。いくつかの実施形態において、その集団中の細胞の総数は、1、5、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000、20000、50000、100000、200000、500000、100万、200万、500万、1000万または1000万より多くである。いくつかの実施形態において、各個々の反応体積は、0または1個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、異なるESBの数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20である。いくつかの実施形態において、そのCOBは、誤り訂正配列(error correcting
sequence)を有する。いくつかの実施形態において、そのCOBは、誤り訂正配列を有さない。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
複数の標的が複数の細胞に存在するか否かを同定するための方法であって、該方法は、該標的に複数のタグを結合する工程を包含し、タグは、
a)該標的の同一性、および
b)タグが結合している該細胞の同一性
を表すコードを含み、ここで、該複数のうちの少なくとも第1の標的対は、100倍よりも多くその相対存在量が変化する、方法。
(項目2)
前記複数のうちの少なくとも第1の標的対は、1000倍よりも多くその相対存在量が変化する、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記複数のうちの少なくとも第1の標的対は、10000倍よりも多くその相対存在量が変化する、項目1に記載の方法。
(項目4)
少なくとも第3の標的が、前記第1の標的対における両方の標的よりも10倍よりも多くその相対存在量が変化する、項目1〜3のうちの一項に記載の方法。
(項目5)
少なくとも第3の標的が、前記第1の標的対における両方の標的よりも100倍よりも多くその相対存在量が変化する、項目1〜3のうちの一項に記載の方法。
(項目6)
少なくとも第3の標的が、前記第1の標的対における両方の標的よりも1000倍よりも多くその相対存在量が変化する、項目1〜3のうちの一項に記載の方法。
(項目7)
前記複数の標的は、少なくとも5の標的を含む、項目1に記載の方法。
(項目8)
前記複数の標的は、少なくとも10の標的を含む、項目1に記載の方法。
(項目9)
前記複数の標的は、少なくとも25の標的を含む、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記複数の標的は、少なくとも50の標的を含む、項目1に記載の方法。
(項目11)
前記複数の標的は、少なくとも100の標的を含む、項目1に記載の方法。
(項目12)
同じ標的の同一性および細胞の同一性を有する少なくとも2個の異なるタグをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目13)
前記少なくとも2個の異なるタグが、同じプライマーのセットを用いて様々な速度で増幅する、項目12に記載の方法。
(項目14)
個々の細胞または標的の分離または単離は、前記検出する工程に不必要である、項目1に記載の方法。
(項目15)
前記コードを検出する工程をさらに包含し、個々の細胞の分離または単離は、該検出する工程に不必要である、項目1に記載の方法。
(項目16)
前記検出する工程が配列決定することを含む、項目15に記載の方法。
(項目17)
各標的が、タンパク質または核酸である、項目1に記載の方法。
(項目18)
各標的がmRNAである、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記タグが、核酸である、項目1に記載の方法。
(項目20)
前記タグが、UBAを含む、項目1に記載の方法。
(項目21)
前記UBAが、前記標的のうちの1つに特異的である、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記UBAが、標識されたUBAと非標識のUBAとの混合物を含む、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記UBAが、抗体を含む、項目21に記載の方法。
(項目24)
前記タグが、ESBを含む、項目1に記載の方法。
(項目25)
前記ESBが、共通リンカー(CL)を含む、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記ESBが、該標的の同一性をコードする、項目24に記載の方法。
(項目27)
前記ESBが、標識ESBと未標識ESBとの混合物を含む、項目26に記載の方法。(項目28)
前記ESBが、核酸を含む、項目24に記載の方法。
(項目29)
前記タグが、APSを含む、項目1に記載の方法。
(項目30)
前記APSが、検出可能に異なるコードユニットを含む、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記結合する工程中に、複数個のAPSが、分割プール合成の連続したラウンドにおいて順序づけられた様式で該タグに付加される、項目29に記載の方法。
(項目32)
前記タグが、少なくとも2個のAPSを含む、項目1に記載の方法。
(項目33)
前記APSが、核酸を含む、項目29に記載の方法。
(項目34)
前記タグが、ライゲーションによって連結された、複数個のAPS、ESBおよびUBAを含む、項目1に記載の方法。
(項目35)
前記複数個のAPS、前記ESBまたは前記UBAが、クリックケミストリーで連結されることが可能である、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記APSまたは前記ESBが、増幅プライマー結合領域を含む、項目34に記載の方法。
(項目37)
前記UBA、ESBまたはAPSが、鋳型になり得る、項目34に記載の方法。
(項目38)
a)第1の標的分子、
b)該第1の標的分子に特異的な第1のユニーク結合物質(UBA)、
c)少なくとも2個の異なる連結可能なUBA依存性のエピトープ特異的バーコード(
ESB)、および
d)複数の順序づけられたアッセイ可能ポリマーサブユニット(APS)
を含み、該APSの順序は、検出可能である、組成物。
(項目39)
前記少なくとも2個の異なるUBAが、同じプライマーのセットを用いる増幅に様々な割合で影響する少なくとも2個の異なるプライマー結合領域を含む、項目38に記載の組成物。
(項目40)
前記少なくとも2個の異なるUBAが、同じプライマーのセットを用いる増幅に様々な割合で影響する少なくとも2個の異なるプライマー結合領域に連結されている、項目38に記載の組成物。
(項目41)
前記少なくとも2個の異なるUBAが、ESBまたはCOBを様々な効率で補充する1つ以上の結合領域を含む、項目38に記載の組成物。
(項目42)
前記少なくとも2個の異なるUBAが、様々な効率で結合パートナーと会合する1つ以上の捕捉領域を含む、項目38に記載の組成物。
(項目43)
組成物であって、該組成物は、
a)第1の標的分子、
b)該第1の標的分子に特異的な第1のユニーク結合物質(UBA)、
第1の連結可能なUBA依存性のエピトープ特異的バーコード(ESB)、および
c)少なくとも2つの連結可能なUBA依存性のエピトープ特異的バーコード(ESB)、および
d)複数の順序づけられたアッセイ可能ポリマーサブユニット(APS)
を含み、
ここで、APSの順序が検出可能である、組成物。
(項目44)
前記少なくとも2個の異なるESBが、同じプライマーのセットを用いる増幅に様々な割合で影響する少なくとも2個の異なるプライマー結合領域を含む、項目43に記載の組成物。
(項目45)
前記少なくとも2個の異なるESBが、同じプライマーのセットを用いる増幅に様々な割合で影響する少なくとも2個の異なるプライマー結合領域に連結されている、項目43に記載の組成物。
(項目46)
前記少なくとも2個の異なるESBが、UBAまたはCOBを様々な効率で補充する1つ以上の結合領域を含む、項目43に記載の組成物。
(項目47)
前記少なくとも2個の異なるESBが、様々な効率で結合パートナーと会合する1つ以上の捕捉領域を含む、項目43に記載の組成物。
(項目48)
前記標的分子が、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、リンタンパク質、抗体、核酸、ペプチド核酸、合成小分子、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、脂質、ステロイドおよびリン脂質からなる群より選択される、項目38または43に記載の組成物。
(項目49)
前記複数の順序づけられたAPSは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のAPSを含む、項目38または43に記載の組成物。
(項目50)
前記UBA、ESBまたはAPSが、鋳型になり得る、項目38または43に記載の組成物。
(項目51)
個々のAPS、ESBまたは連結オリゴヌクレオチド分子が、ユニークなカウンタータグを含む、項目38または43に記載の組成物。
(項目52)
前記ユニークなカウンタータグが、検出可能である、項目51に記載の組成物。
(項目53)
細胞の集団中の細胞の標的分子を細胞起源バーコードで標識するためのキットであって、
(a)m個のアッセイ可能ポリマーサブユニット(APS)のn個のセットであって、各々は、異なる情報パッケージを含み;ここで、該情報パッケージは、順序づけられた形式で連結されることが可能である、セット;および
(b)同じ標的に特異的な少なくとも2個のユニーク結合物質(UBA)
を備える、キット。
(項目54)
細胞の集団中の細胞の標的分子を細胞起源バーコードで標識するためのキットであって、
(a)m個のアッセイ可能ポリマーサブユニット(APS)のn個のセットであって、各々は、異なる情報パッケージを含み;ここで、該情報パッケージは、順序づけられた形式で連結されることが可能である、セット;および
(b)標的分子特異的な複数のユニーク結合物質(UBA)であって、各々は、UBA特異的なエピトープ特異的バーコード(ESB)と連結されており、少なくとも1個のU
BAの2個のサブタイプをさらに含み、ここで、該2個のサブタイプが異なるESBに連
結されている、標的分子特異的な複数のユニーク結合物質(UBA)
を備える、キット。
(項目55)
細胞の集団中の細胞の標的分子を細胞起源バーコードで標識するためのキットであって、
(a)m個のアッセイ可能ポリマーサブユニット(APS)のn個のセットであって、各々は、異なる情報パッケージを含み;ここで、該情報パッケージは、順序づけられた形式で連結されることが可能である、セット;
(b)標的分子特異的な複数のユニーク結合物質(UBA);および
(c)UBA特異的な複数のエピトープ特異的バーコード(ESB)であって、各ESBは、指定のUBAと連結することが可能であり、同じUBAに特異的である少なくとも1このESBの少なくとも2個のサブタイプをさらに含む、UBA特異的な複数のエピトープ特異的バーコード(ESB)
を備える、キット。
(項目56)
nが、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10である、項目53〜55のうちの一項に記載のキット。
(項目57)
mが、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20である、項目53〜55のうちの一項に記載のキット。
(項目58)
nが、10より大きい、項目53〜55のうちの一項に記載のキット。
(項目59)
mが、20より大きい、項目53〜55のうちの一項に記載のキット。
(項目60)
個々のAPS、ESBまたは連結オリゴヌクレオチド分子が、ユニークなカウンタータグを含む、項目53〜55のうちの一項に記載のキット。
(項目61)
前記ユニークなカウンタータグが、検出可能である、項目60に記載のキット。
(項目62)
APSまたはESBが、増幅プライマー結合領域を含む、項目53〜55のうちの一項に記載のキット。
(項目63)
プローブをさらに含む、項目53〜55のうちの一項に記載のキット。
(項目64)
サンプル中の標的分子を検出するための方法であって、該方法は、
(a)
(i)該標的分子を含む細胞の集団、
(ii)複数の標的特異的UBA混合物であって、少なくとも1つのUBA混合物は、標識UBAおよび未標識UBAを所定の比で含む、複数の標的特異的UBA混合物、
(iii)該UBAと会合することができる複数のESB、および
(iv)複数のラウンド特異的なAPSセットであって、各セットは、互いに検出可能に異なる複数のAPSを含む、複数のラウンド特異的なAPSセット
を得る工程;
(b)該UBAの混合物を該細胞の集団と接触させる工程であって、該標識UBAおよび該未標識UBAは、該標的分子に結合する、工程;
(c)該複数のESBを該細胞の集団と接触させる工程;および
(d)ラウンド特異的な該複数のAPSを使用して分割プール合成を行う工程
を包含する、方法。
(項目65)
第1の標識UBAが、同じ標的に対する第1の未標識UBAよりも少なくとも10倍、ESBと優先的に会合する、項目64に記載の方法。
(項目66)
第2の標識UBAが、同じ標的に対する第2の未標識UBAよりも少なくとも10倍、ESBと優先的に会合する、項目65に記載の方法。
(項目67)
第1の標識UBAが、同じ標的に対する第1の未標識UBAよりも少なくとも10倍、COBと優先的に会合する、項目64に記載の方法。
(項目68)
第2の標識UBAが、第2の未標識UBAよりも少なくとも10倍、COBと優先的に会合する、項目67に記載の方法。
(項目69)
第1の標識UBAが、同じ標的に対する第1の未標識UBAよりも少なくとも10倍、優先的に検出される、項目64に記載の方法。
(項目70)
第2の標識UBAが、同じ標的に対する第2の未標識UBAよりも少なくとも10倍、優先的に検出される、項目69に記載の方法。
(項目71)
第1の標識UBAが、同じ標的に対する第1の未標識UBAよりも少なくとも10倍、優先的に増幅される、項目64に記載の方法。
(項目72)
第2の標識UBAが、同じ標的に対する第2の未標識UBAよりも少なくとも10倍、優先的に増幅される、項目71に記載の方法。
(項目73)
第1の標識UBAが、同じ標的に対する第1の未標識UBAよりも少なくとも10倍、優先的に枯渇される、項目64に記載の方法。
(項目74)
第2の標識UBAが、同じ標的に対する第2の未標識UBAよりも少なくとも10倍、優先的に枯渇される、項目73に記載の方法。
(項目75)
サンプル中の標的分子を検出するための方法であって、該方法は、
(a)
(i)該標的分子を含む細胞の集団、
(ii)複数の標的特異的UBA、
(iii)複数のESB混合物であって、各々は、該UBA混合物のうちの1つと会合することができ、少なくとも1つのESB混合物は、標識ESBおよび未標識ESBを所定の比で含む、複数のESB混合物、および
(iv)複数のラウンド特異的なAPSセットであって、各セットは、互いに検出可能に異なる複数のAPSを含む、複数のラウンド特異的なAPSセット
を得る工程;
(b)該UBAを該細胞の集団と接触させる工程;
(c)該複数のESBを該細胞の集団と接触させる工程であって、該標識ESBおよび該未標識ESBは、該UBAに結合する、工程;および
(d)該複数のラウンド特異的なAPSを使用して分割プール合成を行う工程
を包含する、方法。
(項目76)
第1の標識ESBが、同じ標的に対する第1の未標識ESBよりも少なくとも10倍、UBAと優先的に会合する、項目75に記載の方法。
(項目77)
第2の標識ESBが、同じ標的に対する第2の未標識ESBよりも少なくとも10倍、UBAと優先的に会合する、項目76に記載の方法。
(項目78)
第1の標識ESBが、同じ標的に対する第1の未標識ESBよりも少なくとも10倍、COBと優先的に会合する、項目75に記載の方法。
(項目79)
第2の標識ESBが、同じ標的に対する第2の未標識ESBよりも少なくとも10倍、COBと優先的に会合する、項目78に記載の方法。
(項目80)
第1の標識ESBが、同じ標的に対する第1の未標識ESBよりも、少なくとも10倍、優先的に検出される、項目75に記載の方法。
(項目81)
第2の標識ESBが、同じ標的に対する第2の未標識ESBよりも少なくとも10倍、優先的に検出される、項目80に記載の方法。
(項目82)
第1の標識ESBが、同じ標的に対する第1の未標識ESBよりも、少なくとも10倍、優先的に増幅される、項目75に記載の方法。
(項目83)
第2の標識ESBが、同じ標的に対する第2の未標識ESBよりも少なくとも10倍、優先的に増幅される、項目82に記載の方法。
(項目84)
第1の標識ESBが、同じ標的に対する第1の未標識ESBよりも、少なくとも10倍、優先的に枯渇される、項目75に記載の方法。
(項目85)
第2の標識ESBが、同じ標的に対する第2の未標識ESBよりも少なくとも10倍、優先的に枯渇される、項目84に記載の方法。
(項目86)
前記UBA−ESB−APS複合体の少なくとも一部を検出することによって、少なくとも1つの標的特異的シグナルを得る工程をさらに包含する、項目64または75のうちの一項に記載の方法。
(項目87)
前記標的特異的シグナルを乗数で正規化することによって、該標的特異的シグナルと関連している標的分子を定量する工程をさらに包含し、ここで、該乗数は、前記所定の比に基づく、項目86に記載の方法。
(項目88)
前記検出工程が、配列決定することを含む、項目86に記載の方法。
(項目89)
前記乗数が、前記所定の比の逆数である、項目87に記載の方法。
(項目90)
a)細胞を含むサンプルを、標識UBAおよび未標識UBAを所定の比で含む混合物と接触させる工程、および
b)細胞に関連する標的に結合した標識UBAの量を検出し、該検出値を該所定の比に基づく係数で正規化することによって、該標的の量の近似値を生成する工程
を包含する方法であって、ここで、該細胞は、分割プール合成に供される、方法。
(項目91)
第1の標識UBAが、同じ標的に対する第1の未標識UBAよりも少なくとも10倍、ESBと優先的に会合する、項目90に記載の方法。
(項目92)
第2の標識UBAが、同じ標的に対する第2の未標識UBAよりも少なくとも10倍、ESBと優先的に会合する、項目91に記載の方法。
(項目93)
第1の標識UBAが、同じ標的に対する第1の未標識UBAよりも少なくとも10倍、COBと優先的に会合する、項目90に記載の方法。
(項目94)
第2の標識UBAが、第2の未標識UBAよりも少なくとも10倍、COBと優先的に会合する、項目93に記載の方法。
(項目95)
第1の標識UBAが、同じ標的に対する第1の未標識UBAよりも少なくとも10倍、優先的に検出される、項目90に記載の方法。
(項目96)
第2の標識UBAが、同じ標的に対する第2の未標識UBAよりも少なくとも10倍、優先的に検出される、項目95に記載の方法。
(項目97)
第1の標識UBAが、同じ標的に対する第1の未標識UBAよりも少なくとも10倍、優先的に増幅される、項目90に記載の方法。
(項目98)
第2の標識UBAが、同じ標的に対する第2の未標識UBAよりも少なくとも10倍、優先的に増幅される、項目97に記載の方法。
(項目99)
第1の標識UBAが、同じ標的に対する第1の未標識UBAよりも少なくとも10倍、優先的に枯渇される、項目90に記載の方法。
(項目100)
第2の標識UBAが、同じ標的に対する第2の未標識UBAよりも少なくとも10倍、優先的に枯渇される、項目99に記載の方法。
(項目101)
a)細胞を含むサンプルを、UBAならびに標識ESBおよび未標識ESBを所定の比で含む混合物と接触させる工程、および
b)細胞に関連する標的に結合した標識ESBの量を検出し、該検出値を該所定の比に基づく係数で正規化することによって、該標的の量の近似値を生成する工程
を包含する方法であって、ここで、該細胞は、分割プール合成に供される、方法。
(項目102)
第1の標識ESBが、同じ標的に対する第1の未標識ESBよりも、少なくとも10倍、UBAと優先的に会合する、項目101に記載の方法。
(項目103)
第2の標識ESBが、同じ標的に対する第2の未標識ESBよりも少なくとも10倍、UBAと優先的に会合する、項目102に記載の方法。
(項目104)
第1の標識ESBが、同じ標的に対する第1の未標識ESBよりも少なくとも10倍、COBと優先的に会合する、項目101に記載の方法。
(項目105)
第2の標識ESBが、同じ標的に対する第2の未標識ESBよりも少なくとも10倍、COBと優先的に会合する、項目104に記載の方法。
(項目106)
第1の標識ESBが、同じ標的に対する第1の未標識ESBよりも、少なくとも10倍、優先的に検出される、項目101に記載の方法。
(項目107)
第2の標識ESBが、同じ標的に対する第2の未標識ESBよりも少なくとも10倍、優先的に検出される、項目106に記載の方法。
(項目108)
第1の標識ESBが、同じ標的に対する第1の未標識ESBよりも、少なくとも10倍、優先的に増幅される、項目101に記載の方法。
(項目109)
第2の標識ESBが、同じ標的に対する第2の未標識ESBよりも少なくとも10倍、優先的に増幅される、項目108に記載の方法。
(項目110)
第1の標識ESBが、同じ標的に対する第1の未標識ESBよりも、少なくとも10倍、優先的に枯渇される、項目101に記載の方法。
(項目111)
第2の標識ESBが、同じ標的に対する第2の未標識ESBよりも少なくとも10倍、優先的に枯渇される、項目110に記載の方法。
本明細書中で述べられるすべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願の各々が、参照により援用されると明確かつ個々に示されたのと同程度に、参照により本明細書中に援用される。
用語「核酸」は、ヌクレオチドポリマーのことを指し、別段限定されない限り、天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で機能し得る(例えば、ハイブリダイズし得る)天然ヌクレオチドの公知のアナログを含む。
UBAは、少なくとも1つの標的分子、少なくとも1つの標的分子代用物またはその両方と結合するようにデザインされた分子または構築部品(assemblies)であり;適切な条件下において、UBAおよび標的分子を含む分子複合体を形成し得る。標的分子の例としては、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、イオン、小分子、有機モノマーおよび薬物が挙げられるが、これらに限定されない。単に便宜のため、本明細書中に記載される実施形態のほとんどが、標的タンパク質または標的mRNAに結合するUBAに照らして説明される。しかしながら、これらの実施形態は、他の標的分子にも適用され得る。用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「アミノ酸配列」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーのことを指すために本明細書中で交換可能に使用される。そのポリマーは、直鎖状であっても分枝状であってもよく、改変されたアミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸または合成アミノ酸によって中断されてもよい。上記の用語は、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識構成要素による結合体化などの他の任意の操作によって改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書中で使用されるとき、用語「アミノ酸」は、天然および/もしくは非天然または合成のアミノ酸(グリシンおよびDまたはL光学異性体の両方、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物を含むがこれらに限定されない)のことを指す。
2,Oxford University Press(1997);C.Borrebaeck,Antibody Engineering,2d ed.,Oxford
university Press(1995);A.Johnstone and R.Thorpe,Immunochemistry in Practice,Blackwell Science,Ltd.(1996);H.Zola,Monoclonal Antibodies:Preparation and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives(Basics:From Background to Bench),Springer Verlag(2000);およびS.Hockfieldら、Selected Methods for Antibody and
Nucleic Acid Probes,Cold Spring Harbor Lab Press(1993)に見られる。さらに、莫大な数の商業的に入手可能な抗体(標識されたかまたは標識されていない;ポリクローナル、モノクローナルおよび単一特異的抗体、ならびにそれらの免疫反応性の構成要素を含む);カスタム抗体供給業者などは、とりわけ、ワールドワイドウェブ上のbiocompare.comにおけるAntibody Searchページ、antibodyresource.comにおけるAntibody Resource Pageおよびsigmaaldrich.comにおけるAntibody Explorerページに見られる。
いくつかの実施形態において、本発明は、エピトープ特異的バーコード(ESB)を提供する。各ESBは、特定の標的分子と会合し得るユニークなコードを含む。ESBは、少なくとも1つのUBAまたはUBAの一部と結合するようにデザインされた分子または構築部品であり;適切な条件下において、ESB、UBAおよび標的分子を含む分子複合体を形成し得る。
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞起源バーコード(COB)を提供する。各COBは、特定の細胞の起源に会合し得るユニークなコードを提供する。いくつかの実施形態において、ESBに会合する共通リンカー部分(例えば、共通リンカーオリゴ)にCOBを結合する際、COBコードは、UBA/ESB複合体が結合する標的分子の細胞起源を同定する。したがって、いくつかの実施形態において、本発明のCOBは、2つの主要な部分:(i)UBA/ESBプローブに会合する共通リンカー部分(例えば、共通リンカーオリゴ)に特異的な配列;および(ii)特定の細胞起源に会合し得るユニークなコードを含む。
Plateデバイスなどの454 Lifesciences,Inc.(Branford,Connecticut)が利用可能な技術の使用が必要である。この光ファイバーの使用によって、4.5時間で最低2000万塩基対の検出が可能である。
high−density pricolitre reactors”,Nature,doi:10.1038/nature03959;ならびに米国公開出願番号20020012930;20030058629;20030100102;20030148344;20040248161;20050079510、20050124022;および20060078909に記載されている。
March 2000;およびM.J,Leveneら、Science 299:682−686,January 2003;ならびに米国公開出願番号20030044781および2006/0078937に開示されているものが挙げられる。そのようなシステムの全部が、核酸分子上で測定される重合反応を介した塩基の経時的付加による複数の塩基を有する標的核酸分子の配列決定を必要とし、すなわち、配列決定される鋳型核酸分子上での核酸重合酵素の活性が、リアルタイムで追跡される。次いで、一連の塩基付加の各工程における核酸重合酵素の触媒活性によって、どの塩基が標的核酸の成長相補鎖に組み込まれているかを同定することによって配列が推定され得る。標的核酸分子複合体上のポリメラーゼは、標的核酸分子に沿って移動して活性部位においてオリゴヌクレオチドプライマーを伸長するのに適した位置に提供される。複数の標識タイプのヌクレオチドアナログが、活性部位に近接して提供され、ヌクレオチドアナログの識別可能な各タイプは、標的核酸配列内の異なるヌクレオチドに相補的である。成長核酸鎖は、ヌクレオチドアナログを活性部位の核酸鎖に付加するポリメラーゼを使用することによって伸長され、ここで、付加されるヌクレオチドアナログは、その活性部位において標的核酸のヌクレオチドに相補的である。重合工程の結果としてオリゴヌクレオチドプライマーに付加されたヌクレオチドアナログが同定される。標識されたヌクレオチドアナログを提供する工程、成長核酸鎖を重合する工程、および付加されたヌクレオチドアナログを同定する工程が、繰り返されて、その核酸鎖がさらに伸長され、標的核酸の配列が決定される。
1;75(5):1155およびKlammerら、Bioinformatics 2008,24:348−356を参照のこと)。その配列依存性のフラグメンテーション効率は、所望のフラグメンテーションパターンを有する代表的なペプチド配列をデザインするために使用され得る。
本発明のCOBは、任意の種々の標識モノマー(例えば、放射性同位体、蛍光色素、色素、酵素、ナノ粒子、化学発光マーカー、ビオチン、または直接(例えば、発光によって)もしくは間接的に(例えば、蛍光標識された抗体の結合によって)検出され得る当該分野で公知の他のモノマー)で標識され得る。通常、COB内の標識されたAPSの1つ以上が、1つ以上の標識モノマーで標識され、COBのAPSに付着させられた標識モノマーによって提供されるシグナルが、UBACOBが結合する標的を同定する検出可能なコードを構成する。ある特定の実施形態において、APSからの所与のシグナルの欠損(例えば、暗点)もまた、COBのコードの一部を構成し得る。
標的分子またはエピトープは、それとUBAとの結合によって検出または測定される分子(UBAの標的特異的領域が認識する)である。標的分子の例としては、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、小分子、有機モノマーまたは薬物が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中の方法によって分析され得る核酸としては:二本鎖DNA、一本鎖DNA、一本鎖DNAヘアピン、DNA/RNAハイブリッド、RNA(例えば、mRNAまたはmiRNA)およびRNAヘアピンが挙げられる。単に便宜のため、本明細書中に記載される方法は、タンパク質またはmRNAの分析に照らして主に説明される。しかしながら、本明細書中に記載される実施形態は、非タンパク質または非mRNA標的を検出するためにも使用され得る。いくつかの実施形態において、標的分子は、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、リンタンパク質、抗体、核酸、ペプチド核酸、合成小分子、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、脂質、ステロイドおよびリン脂質からなる群より選択される。
本発明は、生体分子サンプル中の標的分子を検出および定量するための方法を提供する。特に、本発明は、個々の標的分子に結合することができるUBAを提供する。本発明は、ESBおよびCOBの使用も提供する(図2を参照のこと)。ESBおよびCOBのコードによって、UBAと標的分子との結合が、単一細胞内での標的分子の同定をもたらす。いくつかの実施形態において、ESB/COB複合体は、標的分子および細胞の起源を表す情報の量を表す(図1を参照のこと)。そのようなUBAおよび/またはESBならびにCOBを作製および使用する方法も提供される。
必要とされるタグの数=
cDNA libraries expressed sequence tags\normalization and subtraction of cDNA libraries,Methods Mol Biol.2009;533:109−22.)、DNAサブトラクションおよび他のハイブリダイゼーション法が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明のUBAおよびESB/COBシステムは、任意の生体分子サンプル中の標的分子を検出するために使用され得る。当業者によって認識されるように、そのサンプルは、生物学的サンプル(例えば、実質的に任意の生物の細胞(初代細胞と培養細胞株の両方を含む)、細胞溶解産物または抽出物、組織および組織抽出物);体液(血液、尿、血清、リンパ液、胆汁、脳脊髄液、間質液、眼房水または硝子体液、初乳、痰、羊水、唾液、肛門および膣の分泌物、汗および精液、漏出液、滲出液(例えば、膿瘍または感染もしくは炎症の他の任意の部位から得られる流体)または関節(例えば、正常関節または疾患(例えば、関節リウマチ、変形性関節症、痛風または化膿性関節炎)に罹患した関節)から得られる流体を含むがこれらに限定されず、哺乳動物のサンプルが好ましく、ヒトサンプルが特に好ましい);環境サンプル(大気、農業、水および土壌のサンプルを含むがこれらに限定されない);生物学的兵器剤サンプル;研究サンプル(細胞外液、細胞培養物の細胞外の上清、細菌における封入体、細胞内コンパートメント、細胞周辺質、ミトコンドリアコンパートメントなどを含む)を含むがこれらに限定されない任意の数のものを含み得る。
Proteome Extraction Kits(C−PEK)であるがこれらに限定されない)も使用され得る。当業者は、本発明の組成物、方法およびキットとともに使用するための非核酸被検体が、そのような精製法および市販のキットを用いて過度の実験を行うことなく容易に入手できることを認識するだろう。
COB/ESB複合体は、所与のCOB/ESB複合体上の特定の配列またはシグナルを検出することができる当該分野において利用可能な任意の手段によって検出される。
high−density pricolitre reactors”,Nature,doi:10.1038/nature03959;ならびに米国公開出願番号20020012930;20030068629;20030100102;20030148344;20040248161;20050079510、20050124022;および20060078909に記載されている。
and Meller A.(2007)Clin Chem 53:1996−2001を参照のこと)である。ナノポアは、直径がおおよそ約1ナノメートルの小さな穴であり得る。ナノポアを導電性流体に浸漬し、それに対して電位を印加すると、ナノポアを通過するイオンの伝導に起因して、わずかな電流が生じ得る。流れる電流の量は、ナノポアのサイズに感受性であり得る。DNA分子が、ナノポアを通過するとき、そのDNA分子上の各ヌクレオチドは、異なる程度にナノポアを塞ぎ得る。したがって、DNA分子がナノポアを通過するときにそのナノポアを通過する電流の変化が、DNA配列の読みに相当し得る。ナノポア配列決定技術は、Oxford Nanopore Technologiesによるもの;例えば、GridlONシステムであり得る。単一のナノポアが、マイクロエウェルの上部を通ってポリマー膜に挿入し得る。各マイクロウェルは、個々の感知のための電極を有し得る。マイクロウェルは、1チップあたり100,000個以上のマイクロウェル(例えば、200,000個超、300,000個超、400,000個超、500,000個超、600,000個超、700,000個超、800,000個超、900,000個超または1,000,000個超)を有するアレイチップに製作され得る。機器(またはノード)が、チップを分析するために使用され得る。データは、リアルタイムで分析され得る。1つ以上の機器が、一度に稼働され得る。ナノポアは、タンパク質ナノポア、例えば、タンパク質アルファ−溶血素、七量体タンパク質ポアであり得る。ナノポアは、合成膜(例えば、SiNxまたはSi02)において、作製された固体状態のナノポア、例えば、その膜に形成されたナノメートルサイズの穴であり得る。ナノポアは、ハイブリッドポア(例えば、固体状態の膜へのタンパク質ポアの組み込み)であり得る。ナノポアは、組み込まれたセンサー(例えば、トンネル電極検出器、容量検出器またはグラフェンベースのナノギャップもしくはエッジ状態検出器(例えば、Garajら(2010)Nature vol.67,doi:10.1038/nature09379を参照のこと))を有するナノポアであり得る。ナノポアは、特定のタイプの分子(例えば、DNA、RNAまたはタンパク質)を分析するための官能性を有し得る。ナノポア配列決定法は、DNAがそのポアを移動するとき、リアルタイムで配列決定しながら、インタクトなDNAポリマーがタンパク質ナノポアを通過し得る、「鎖配列決定」を含み得る。ある酵素が、二本鎖DNAの鎖を分離して、ナノポアを通る鎖を供給し得る。そのDNAは、一方の端にヘアピンを有し得、このシステムは、両方の端を読むことができる。場合によっては、ナノポア配列決定法は、個々のヌクレオチドが、前進型エキソヌクレアーゼ(processive exonuclease)によってDNA鎖から切断され得、それらのヌクレオチドが、タンパク質ナノポアを通過し得る、「エキソヌクレアーゼ配列決定法」である。それらのヌクレオチドは、ポア内の分子(例えば、シクロデキストラン)に一過性に結合し得る。電流の特徴的な妨害が、塩基を同定するために使用され得る。
March 2000;およびM.J,Leveneら、Science 299:682−686,January 2003;ならびに米国公開出願番号20030044781および2006/0078937に開示されているものが挙げられる。そのようなシステムの全部が、核酸分子上で測定される重合反応を介した塩基の経時的付加による複数の塩基を有する標的核酸分子の配列決定を必要とし、すなわち、配列決定される鋳型核酸分子上での核酸重合酵素の活性が、リアルタイムで追跡される。次いで、一連の塩基付加の各工程における核酸重合酵素の触媒活性によって、どの塩基が標的核酸の成長相補鎖に組み込まれているかを同定することによって配列が推定され得る。標的核酸分子複合体上のポリメラーゼは、標的核酸分子に沿って移動して活性部位においてオリゴヌクレオチドプライマーを伸長するのに適した位置に提供される。複数の標識タイプのヌクレオチドアナログが、活性部位に近接して提供され、ヌクレオチドアナログの識別可能な各タイプは、標的核酸配列内の異なるヌクレオチドに相補的である。成長核酸鎖は、ヌクレオチドアナログを活性部位の核酸鎖に付加するポリメラーゼを使用することによって伸長され、ここで、付加されるヌクレオチドアナログは、その活性部位において標的核酸のヌクレオチドに相補的である。重合工程の結果としてオリゴヌクレオチドプライマーに付加されるヌクレオチドアナログが同定される。標識されたヌクレオチドアナログを提供する工程、成長核酸鎖を重合する工程、および付加されたヌクレオチドアナログを同定する工程が、繰り返されて、その核酸鎖がさらに伸長され、標的核酸の配列が決定される。
Photochemistry,Menlo Park:Benjamin/Cummings Publishing Col,Inc.(1978),pp.296−361。COB/ESB複合体が、蛍光標識される場合、適切な励起源の適切な考慮が検討され得る。可能性のある励起源としては、アークランプ、キセノンランプ、レーザー、発光ダイオードまたはそれらのいくつかの組み合わせが挙げられ得るがこれらに限定されない。適切な励起源は、適切な光学的検出システム、例えば、倒立蛍光顕微鏡、落射蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡と組み合わせて使用される。好ましくは、COB/ESB複合体上のスポットの配列を決定するのに十分な空間分解能での検出を可能にし得る顕微鏡が使用される。例えば、COB/ESB複合体が、3つの異なる色、Alexa488、Cy3およびAlexa647で標識される場合(それぞれ1、2および3と表示される)、色1、2および3は各々、異なるチャネルにおいて取得され、第1および第2のレジスター(それらは、スポットの列として見ることができる)は、数画素ずつ移動することにより、各レジスターを個別に示すことができる。本発明の方法において使用され得る複数個の色を検出するための方法の例は、米国特許第7,473,767号、米国特許公開番号2007/0166708、米国出願番号11/645,270およびPCT出願番号US06/049274(その全体が本明細書中で参照により援用される)に記載されている。
charge)を与えることによって、それらの細胞は、他の細胞から分離され得る。次いで、ポジティブ選択された細胞は、滅菌された回収容器に収集され得る。これらの細胞選別手順は、例えば、FACSVantageTM.Training Manualに詳細に記載されており、特に、3−11から3−28および10−1から10−17の項を参照のこと(それらは、上記装置についてその全体が本明細書によって参照により援用される)。
Acta Part B:Atomic Spectroscopy,(2007),62(3):188−195)。
本発明の組成物および方法は、診断、予後診断、治療、患者の層別化、薬物の開発、処置の選択およびスクリーニングの目的のために、使用され得る。本発明は、多くの異なる標的分子が、本発明の方法を用いて単一の生体分子サンプルから一度に分析され得るという利点を提供する。このおかげで、例えば、いくつかの診断テストを1つのサンプルにおいて行うことが可能になる。単一のサンプル内で分析される異なる標的分子の量は、少なくとも、10、100、1000、10000、100000、1000000、10000000、100000000、1000000000またはそれより多くの範囲に及び得る。
coli、Wuchereria bancrofti、Toxoplasma spp.、Enterobius vermicularis、Ascaris lumbricoides、Trichuris trichiura、Dracunculus medinesis、trematodes、Diphyllobothrium latum、Taenia spp.、Pneumocystis cariniiおよびNecator americanisが挙げられる。
本発明は、本発明の1つ以上の構成要素を備えるキットをさらに提供する。そのキットは、例えば、1つ以上のUBA、1つ以上のESBおよび/または1つ以上のAPSを備え得る。そのキットは、上に記載された目的を含む当業者に明らかな任意の目的のために使用され得る。
当該分野で公知の標準的な手法に従って、オリゴヌクレオチドが合成され得る。例えば、394A DNA Synthesizer(Applied Biosystems
Division of Perkin−Elmer Corp.,Foster City,Calif.)においてオリゴヌクレオチドが合成され得る。
NaClおよび5mM EDTAを含む100mM Tris/HCl pH8.0)中で64℃において一晩溶出し、Sep Pakカートリッジ(Millipore Corp,Milford,Mass.)を製造者の指示書に従って使用して溶出物から回収する。
El−Sagheerら(PNAS,108:28,11338−11343,2011)に記載されているようにオリゴヌクレオチドを合成する。簡潔には、標準的なDNAホスホラミダイト、固体支持体およびさらなる試薬をLink TechnologiesおよびApplied Biosystemsから購入する。酸触媒脱トリチル化、カップリング、キャッピングおよびヨウ素酸化の標準的な0.2または1.0μモルのホスホラミダイトサイクルを用いて、Applied Biosystems 394 自動DNA/RNA合成装置においてオリゴヌクレオチドを合成する。すべてのβ−シアノエチルホスホラミダイトモノマーを、使用の直前に無水アセトニトリルに0.1Mの濃度に溶解する。通常のA、G、CおよびTモノマーに対するカップリング時間は、35秒であるのに対し、逆アミダイト(reverse amidite)に対するカップリング時間は、180秒である。アルキンホスホラミダイトモノマー(図2の2c、El−Sagheerら、PNAS,108:28,11338−11343,2011)および他の非標準的モノマーは、360秒間カップリングされる。固体支持体からのオリゴヌクレオチドの切断および脱保護は、濃アンモニア水性溶液に室温で60分間曝露した後、密閉チューブ内において55℃で5時間加熱することによって達成される。そのオリゴヌクレオチドを、酢酸アンモニウム中のアセトニトリルの勾配(30分間にわたる0%〜50%緩衝液B、流速4mL/分)、緩衝液A:0.1M酢酸アンモニウム,pH7.0、緩衝液B:50%アセトニトリルを含む0.1M酢酸アンモニウム,pH7.0でXBridgeTM BEH300 Prep C18 10μM 10×250mmカラム(Waters)を使用するGilsonシステムにおける逆相HPLCで精製する。305または295nmにおけるUV吸収によって溶出をモニターする。HPLC精製後、オリゴヌクレオチドを、NAP−10カラムを使用して脱塩し、ゲル電気泳動によって分析する。
3’−アルキンオリゴヌクレオチドの合成を、El−Sagheerら(PNAS,108:28,11338−11343,2011)に記載されているように行う。簡潔には、El−Sagheerら(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107(35):15329−15334)に従って、3’−プロパルギルチミジンホスホラミダイトモノマー2cを用いて、ならびにA、G、CおよびTの3’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)デオキシリボヌクレオシド−5’−ホスホラミダイト(逆ホスホラミダイト,Link Technologies)を用いるか、または5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−3’−O−プロパルギル−5−メチル−デオキシシチジンを固体支持体(33μmol/gのローディング,AMポリスチレン,Applied
Biosystems)に付着することによって、必要とされる配列を5’から3’の方向で組み立てて、3’−アルキンオリゴヌクレオチドを合成する。レジンをツイストカラム(Glen Research)に詰め、次いでそれを用いて、必要とされる配列を標準的なホスホラミダイトオリゴヌクレオチド合成によって3’から5’の方向で組み立てる。次いで、それらのオリゴヌクレオチドを、上に記載されたように切断し、脱保護し、精製する。
5’−アジドオリゴヌクレオチドの合成を、El−Sagheerら(PNAS,108:28,11338−11343,2011)に記載されているように行う。簡潔には、通常の5’−HO−dC、5’−HO−dTを用いて(またはGlen Research製の商業的に入手可能な5’−ヨードdTモノマーを使用する5’−ヨード−dTを用いて)、一般的方法(上記)に記載されたような0.2または1.0μmolスケールでオリゴヌクレオチドを組み立てる(トリチルオフ)。5’−ヒドロキシル基を5’−ヨードに変換するために、合成カラムに付着させられた保護されたオリゴマーを、DMF中のヨウ化メチルトリフェノキシホスホニウムの0.5M溶液(1.0mL)で処理し、それは、室温において15分間にわたって2本の1mL注射器によって一定間隔をあけて上記カラムに通す。次いで、そのカラムを乾燥DMFで数回洗浄する。その5’−ヨード(dTまたはdC)を5’−アジド(dTまたはdC)に変換するために、アジ化ナトリウム(50mg)を乾燥DMF(1mL)に懸濁し、70℃で10分間加熱し、次いで、冷却し、上清を1mL注射器に吸い上げ、カラムに往復させて通し、次いで、室温で一晩(または55℃で5時間)放置する。次いで、そのカラムをDMFおよびアセトニトリルで洗浄し、アルゴンガス流を通すことによって乾燥する。得られる5’−アジドオリゴヌクレオチドを、上に記載されたように固体支持体から切断し、脱保護し、精製する。
3’−アルキン−5’アジドオリゴヌクレオチドの合成を、El−Sagheerら(PNAS,108:28,11338−11343,2011)に記載されているように行う。簡潔には、ポリスチレン固体支持体上の5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−3’−O−プロパルギル−5−メチルデオキシシチジンをツイストカラム(Glen Research)に詰め、それを用いて、5’末端に5’−ヨードdT、5’−HO−dTまたは5’−HO−dCを有する必要とされる配列を3’から5’の方向で組み立てる(標準的なホスホラミダイトオリゴヌクレオチド合成)。次いで、その5’−ヒドロキシルまたはヨード基を、5’−アジドオリゴヌクレオチドの合成のための上に記載した条件を用いてアジドに変換する。
オリゴヌクレオチドAPSを、鋳型にアニールさせ、4℃で一晩維持する。CuIクリック触媒の溶液を、Chanらに記載されているようなtris−ヒドロキシプロピルトリアゾールリガンド(Chan TR,Hilgraf R,Sharpless KB,& Fokin VV(2004)Polytriazoles as copper(I)−stabilizing ligands in catalysis.Org.Lett.6(17):2853−2855;0.2M NaCl中の2.8μmol,38.0μL)、アスコルビン酸ナトリウム(0.2M NaCl中の4.0μmol,8.0μL)およびCuSO4.5H2O(0.2M NaCl中の0.4μmol,4.0μL)から調製する。この溶液を、アニールされたオリゴヌクレオチドに加え、その反応混合物を0℃で1時間維持し、次いで、室温でさらに1時間維持する。NAP−25ゲル濾過カラムを用いて、試薬を除去する。
この実施例では、COBをビーズに付着させられた状態で合成する。APSをCOBに組み立てるために4つの異なる方法が使用される。
アミノメチルマクロ多孔性ポリスチレン(MPPS)ビーズを、10個の異なるCLオリゴヌクレオチド(各々が、自由選択の第1の増幅プライマー相補的領域、10個の異なるESB配列のうちの1つおよび共通のアニーリング領域を有する)で標識する。6ラウンドの分割プール合成を行う。各ラウンドにおいて、ビーズを20個の異なる容器に分割する。異なるオリゴヌクレオチドAPSを各容器に加える(合計20個の異なるAPS)。所与のラウンドにおける各APSは、そのラウンドにおける残りのAPSと異なるユニークサブコード配列をさらに含む。
アミノメチルマクロ多孔性ポリスチレン(MPPS)ビーズを、10個の異なるCLオリゴヌクレオチド(各々が、自由選択の第1の増幅プライマー相補的領域、10個の異なるESB配列のうちの1つおよび共通のアニーリング領域を有する)で標識する。6ラウンドの分割プール合成を行う。各ラウンドにおいて、ビーズを20個の異なる容器に分割する。異なるオリゴヌクレオチドAPSを各容器に加える(合計20個の異なるAPS)。所与のラウンドにおける各APSは、そのラウンドにおける残りのAPSと異なるユニークサブコード配列をさらに含む。
アミノメチルマクロ多孔性ポリスチレン(MPPS)ビーズを、10個の異なるCLオリゴヌクレオチド(各々が、自由選択の第1の増幅プライマー相補的領域、10個の異なるESB配列のうちの1つおよび共通のアニーリング領域を有する)で標識する。6ラウンドの分割プール合成を行う。各ラウンドにおいて、ビーズを20個の異なる容器に分割する。異なるオリゴヌクレオチドAPSを各容器に加える(合計20個の異なるAPS)。所与のラウンドにおける各APSは、そのラウンドにおける残りのAPSと異なるユニークサブコード配列をさらに含む。
アミノメチルマクロ多孔性ポリスチレン(MPPS)ビーズを、10個の異なるCLオリゴヌクレオチド(各々が、自由選択の第1の増幅プライマー相補的領域、10個の異なるESB配列のうちの1つ、6対のAPS特異的ループアニーリング領域および自由選択の第2の増幅プライマー相補的領域を有する)で標識する。6ラウンドの分割プール合成を行う。各ラウンドにおいて、ビーズを20個の異なる容器に分割する。異なるオリゴヌクレオチドAPSを各容器に加える(合計20個の異なるAPS)。所与のラウンドにおける各APSは、そのラウンドにおける残りのAPSと異なるユニークサブコード配列をさらに含む。
アミノメチルマクロ多孔性ポリスチレン(MPPS)ビーズを、10個の異なるCLオリゴヌクレオチド(各々が、10個の異なるループESB配列のうちの1つに特異的な1対のループアニーリング領域および6対のAPS特異的ループアニーリング領域を有する)で標識する。10個のループESB配列のすべてを加えることにより、ループ形状でCLのループESB特異的部分にアニールさせる。ループESB配列は、CLのループESB特異的領域の残りの部分に対する非特異的なアニーリングを最小にするようにデザインされている。ループESB配列は、自由選択の第1の増幅プライマー相補的領域、ESB配列、およびCL中のループESB特異的ループアニーリング領域に十分に相補的な1対のアニーリング領域を含む。6ラウンドの分割プール合成を行う。各ラウンドにおいて、ビーズを20個の異なる容器に分割する。異なるオリゴヌクレオチドAPSを各容器に加える(合計20個の異なるAPS)。所与のラウンドにおける各APSは、そのラウンドにおける残りのAPSと異なるユニークサブコード配列をさらに含む。最後のラウンドのAPSは、必要に応じて、第2の増幅プライマー相補的領域をさらに含む。
実施例3における方法のいずれかに由来する、組み立てられた、ESBに連結したCOBを、IlluminaのHiSeq2000装置によって配列決定する。得られた配列は、10個の異なるESB配列のうちの少なくとも1つ、ランダムなタグ領域、および6ラウンドの分割プール合成中にその特定のビーズに付加されたAPSを起源とする6個のサブコードの組み合わせを含む。
実施例3における方法のいずれかを用いて、ESBに連結したCOBを合成する。得られた配列は、T7プロモーター、SP6開始部位、開始コドン、ESB、COB、および必要に応じて、His(6)タグをコードする領域を含む(図11)。T7プロモーターおよびSP6開始部位は、ESBを組み込むために使用されたのと同じ方法を用いて、ESBに連結される配列に組み込まれ得る。あるいは、これらの配列は、最後のAPS内に組み込まれ得る。必要に応じて、His(6)タグをコードする領域は、最後のAPSまたはESBに組み込まれて連結され得る。
白血球細胞株(HL60、JYおよびU937)上の細胞表面レセプターは、細胞表面上でのCOBの分割プール合成を用いて検出および定量される。Antibody−Oligonucleotide All−in−One Conjugation Kit(Solulink)を使用して、CD1、CD3、CD8およびCD4に対する抗体が、実施例3に記載されたアミン修飾CLオリゴヌクレオチドと結合体化される。個々に標識された抗体が、CLオリゴヌクレオチド中の配列を標的とする相補的なオリゴヌクレオチドを使用するアフィニティークロマトグラフィーを用いて単離され、各抗体上の標識の数が、質量分析を用いて検証される。107個の細胞の細胞懸濁液を、好適な条件下で上記抗体の組み合わせとインキュベートした後、6ラウンドの分割プール合成を行う。得られたESBに連結したCOBは、実施例3または実施例4に記載されているように検出される。COBに連結したESBに関連する検出されたシグナルが、各COB組み合わせについて定量される。それらの細胞上でのCD1、CD3、CD8およびCD4抗原の各々の同時発現が、ペアワイズでプロットされる。主成分分析を用いることにより、発現プロファイルにおける最も強い相関を特定する。
メタノールを−20℃に冷却する。107個のHeLa細胞を含む細胞培養物を、当該分野で公知の好適な組織培養条件を用いて増殖させる。その増殖培地を吸引によって除去する。細胞を直ちに固定し、50mLの冷メタノールを加えることによって透過処理する。それらの細胞を、外界温度で10分間、静かに振盪しながらインキュベートする。メタノールを吸引によって慎重に除去する。それらの細胞を100mLの1×PBSで3回すすぐ。
読まれる所与の細胞の標的数は、検出機器がその最大容量に達する場合、制限され得る。この実施例では、配列分析装置によって読まれる配列の最大数は、1000である。読まれる標的の総数は、1400である:800コピーの標的A、200コピーの標的Bおよび400コピーの標的C。標的A、BおよびCに特異的なUBAが作製され得るので、各UBA集団は、いずれかのESBで標識されたUBAおよび未標識UBAを例えば1:3の比で含む。したがって、例えば、標的AのUBA集団は、標的AのUBA−ESBおよびESBを有しない標的AのUBAを含み得る。(いくつかの実施形態において、未標識UBAは、リンカー部位を有しないヌクレオチドに結合したUBAを含む。いくつかの実施形態において、未標識UBAは、増幅結合物質部位を有しないヌクレオチドに結合したUBAを含む。いくつかの実施形態において、未標識ESBは、UBAを含むが、その配列は、下流の工程において容易に増幅可能でなく、例えば、1つ以上のプライマー部位(cites)が欠損しているか、またはリンカー領域が欠損しているか、またはCOBが形成できないように改変されている)。
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