PT1639122E - Sistema de teste aperfeiçoado para determinar a presença de um antibiótico num fluido - Google Patents

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PT1639122E
PT1639122E PT04740628T PT04740628T PT1639122E PT 1639122 E PT1639122 E PT 1639122E PT 04740628 T PT04740628 T PT 04740628T PT 04740628 T PT04740628 T PT 04740628T PT 1639122 E PT1639122 E PT 1639122E
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test
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PT04740628T
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Jacobus Stark
Pieter Cornelis Langeveld
Angelina Dekker
Cornelis Jacobus Bouwknecht
Johannes Theodorus Arie V Pelt
De Angelique Rijk
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Dsm Ip Assets Bv
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material

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Description

1
DESCRIÇÃO "SISTEMA DE TESTE APERFEIÇOADO PARA DETERMINAR A PRESENÇA DE UM ANTIBIÓTICO NUM FLUIDO"
Area da invenção A presente invenção refere-se a um novo e aperfeiçoado sistema de teste microbiológico e a um novo método para determinar rapidamente a presença de compostos antibacterianos em fluidos, como leite, suco de carne, soro e urina, utilizando o referido sistema de teste.
Contexto da invenção
Conhecem-se desde há muito tempo métodos de teste microbiológico para determinar a presença de compostos antibacterianos, particularmente residuos de antibióticos, como cefalosporina, penicilina, tetraciclina e respectivos derivados, e agentes quimioterapêuticos, como os de sulfa, em fluidos como leite, suco de carne, soro e urina.
Exemplos desses testes foram descritos em CA 2056581, DE 3613794, EP 0005891, EP 0285792, EP 0611001, GB A 1467439 e US 4,946,777. Todas estas descrições lidam com testes prontos a usar que empregam um microrganismo e darão um resultado pela alteração indicada por uma molécula indicadora adicionada ao sistema de teste. O principio é o seguinte: quando está presente no fluido um composto antibacteriano numa concentração suficiente para inibir o crescimento do microrganismo, a cor do indicador não se alterará, ao passo que, quando não ocorre inibição, o crescimento do microrganismo é acompanhado da formação de metabolitos ácidos ou reduzidos, ou outros fenómenos, que induzirão um sinal indicador. 2
Os sistemas de teste mencionados acima incluem um meio de teste, como um meio de agar, inoculado com um microrganismo, preferivelmente uma estirpe de Bacillus, Escherichia coli ou Streptococcus, e um indicador do pH e/ou ou indicador redox. 0 microrganismo e o indicador são introduzidos numa solução de agar opcionalmente tamponada, opcionalmente adicionam-se nutrientes à solução e opcionalmente adicionam-se à solução substâncias para alterar a sensibilidade a certos compostos antimicrobianos. Por fim, deixa-se a solução de agar solidificar para formar o meio de teste, de modo que os microrganismos permaneçam vivos mas não possam multiplicar-se devido a ausência de nutrientes e/ou baixa temperatura. Um teste adequado deverá ter a sensibilidade desejada no que se refere aos compostos a serem testados. 0 problema dos sistemas de teste presentemente comercializados e/ou descritos na literatura é o facto de terem uma sensibilidade limitada para certos antibióticos. Uma das consequências deste problema é que, para certas aplicações, por exemplo, quando são alterados requisitos de valores-limite, a presente tecnologia não consegue disponibilizar um sistema de teste adequado. Assim, é necessário um método de teste aperfeiçoado que não tenha este problema.
Resumo da invenção
Um objectivo da presente invenção é proporcionar um método aperfeiçoado para determinar a presença de antibióticos em fluidos. Surpreendentemente, descobrimos que se pode obter um efeito positivo quando se aplica o indicador de acordo com a invenção. 3
Por aplicação do indicador da presente invenção em sistemas de teste microbiológico pode obter-se uma vantagem quanto à sensibilidade para antibióticos, tais como, por exemplo, β-lactamas e aminoglicósidos. Por aplicação do referido indicador num método para determinar a presença de antibióticos em fluidos podem obter-se aumentos da sensibilidade. Esses aumentos podem perfazer até 25% e mesmo até 100%, dependendo do antibiótico em questão. Adicionalmente, foi descoberto que a utilização desse indicador também origina um sistema de teste que exibe um contraste visual melhorado quando se comparam amostras positivas e negativas. Este último fenómeno facilita muito uma avaliação visual rigorosa dos resultados do teste. A presente invenção proporciona um sistema de teste para determinar a presença de um antibiótico num fluido, que compreende um meio de teste compreendendo um microrganismo, uma substância que proporciona um estado sólido e um indicador adequado para detectar penicilina G, caracterizado por o referido indicador ser Azul de Bromotimol.
Suplementarmente, é proporcionado um método para determinar a presença de um antibiótico num fluido, que compreende os passos seguintes: (a) contactar uma amostra do referido fluido com um meio de teste que compreende um microrganismo, pelo menos uma substância que proporciona um estado sólido e um indicador; (b) incubar o microrganismo durante um período de tempo para que o microrganismo cresça no caso de não estar presente nenhum antibiótico na amostra de fluido; e (c) detectar o crescimento ou a inibição do crescimento do microrganismo com o indicador, 4 caracterizado por o referido indicador ser Azul de Bromotimol.
Além disso, é proporcionado um estojo adequado para determinar a presença de um antibiótico num fluido, que compreende um recipiente parcialmente cheio com um meio de teste compreendendo um microrganismo, um agente gelificador e um indicador, caracterizado por o referido indicador ser Azul de Bromotimol.
Por fim, é proporcionada a utilização de Azul de Bromotimol como indicador num sistema de teste para um antibiótico.
Descrição pormenorizada da invenção
Os termos e abreviaturas apresentados abaixo são utilizados ao longo desta revelação e são definidos do modo seguinte. 0 termo "CFU" é uma abreviatura de Unidades Formadoras de Colónias e refere-se ao número de microrganismos, esporos de microrganismos, esporos parcialmente germinados de microrganismos ou células vegetativas capazes de produzirem colónias de microrganismos. 0 termo "fluido" refere-se a uma substância (como um liquido) que tende a fluir ou a adquirir a forma da fronteira do seu contentor. 0 termo "agente gelificador" refere-se a um composto que ajuda uma mistura a transformar-se ou a tomar a forma de um gel. 0 termo "indicador" refere-se a uma substância utilizada para medir (por exemplo, por alteração da cor ou fluorescência) o estado de um meio de teste relativamente à presença de um material particular (por exemplo, um ácido, uma base, agentes oxidantes ou redutores) . Por exemplo, o 5 termo "indicador" pode referir-se a um ou mais compostos conhecidos como indicadores do pH, mas também a um ou mais compostos conhecidos como indicadores redox. 0 termo "indicador" também pode referir-se a misturas de dois ou mais tipos diferentes de indicadores, como uma combinação de um indicador de pH e um redox. Em geral, quando se utilizam dois ou mais indicadores, estes indicadores cooperam para aumentar o efeito indicador de cada um dos indicadores quando empregues isoladamente. 0 termo "nutriente" refere-se a uma ou mais substâncias ou ingredientes nutritivos que promovem e/ou são necessários para o crescimento de microrganismos, como utilizados no método da presente invenção. 0 termo "dispositivo de amostragem" refere-se a um dispositivo com o auxilio do qual uma amostra de um fluido pode ser adicionada a um meio de teste. Esse dispositivo pode ser um recipiente, opcionalmente com marcações de volume. Esse recipiente pode ser um capilar, uma seringa, uma pipeta ou um sistema de pipetagem automático. Essa seringa ou pipeta pode ser concebida de modo tal que, apenas com um modo de operação, um volume predeterminado pode ser recolhido do fluido a ser analisado. 0 termo "sensibilidade" refere-se ao grau de recept ividade de um dado sistema para detectar um certo estado. Mais particularmente, no presente caso, "sensibilidade" refere-se ao grau em que concentrações de antibióticos numa amostra podem ser determinadas. 0 termo "esporo" refere-se a um corpo inactivo ou reprodutor primitivo, habitualmente unicelular e muitas vezes ambientalmente resistente produzido por microrganismos e capaz de se desenvolver num novo microrganismo individual. 6 0 termo "meio de teste" refere-se a uma composição, como uma solução, um sólido ou, preferivelmente, na forma de um sol ou gel, por exemplo, compreendendo um agente gelificador. Exemplos adeguados de agentes gelificadores são agar, ácido alginico e respectivos sais, carragenano, gelatina, hidroxipropilguar e respectivos derivados, goma de sementes de alfarroba (goma de alfarroba) , alga Euchema transformada e afins. No entanto, o experimentado na área entenderá que outros tipos de meios de teste sólidos se podem basear em materiais de suporte, como cerâmicas, algodão, vidro, partículas metálicas, papel, polímeros de qualquer configuração ou formato, silicatos, esponjas, lã e afins. Habitualmente, um meio de teste contém um ou mais indicadores, todavia, estes compostos também podem ser adicionados posteriormente quando o teste está a ser realizado. 0 meio de teste compreende um ou mais tipos de microrganismos como agentes detectores. Opcionalmente, o meio de teste também pode conter um ou mais tampões, nutrientes, estabilizadores, substâncias que alteram a sensibilidade a certos compostos antimicrobianos de um modo positivo ou negativo e/ou agentes que aumentam a viscosidade. Quando um tampão está presente no meio, pode ser adicionado durante a mistura dos componentes do meio ou os componentes podem ser dissolvidos e/ou suspensos no tampão. Opcionalmente, o meio de teste é esterilizado, e habitualmente o pH é ajustado para o valor requerido. Exemplos de substâncias que alteram a sensibilidade a certos compostos antimicrobianos são antifolatos, como ormetoprim, tetroxoprim e trimetoprim, que aumentam a sensibilidade do microrganismo a compostos sulfa ou sais do ácido oxálico ou ácido fluorídrico, que melhoram a sensibilidade à tetraciclina. Exemplos de agentes que aumentam a viscosidade são pectinato de 7 ascorbilmetil-silanol, carbómero, carboximetilcelulose, álcool cetearílico, álcool cetílico, ésteres de cetilo, DEA de cocoamida, cera emulsionante, glucose, hidroxietilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, DEA de lauramida, DEA de linoleamida, silicato de alumínio e magnésio, maltodextrinas, diestearato de PEG-8, poliacrilamida, álcool polivinílico, copolímero de PVP/hexadeceno, cloreto de sódio, sulfato de sódio, sojamidopropilbetaína, goma de xantano e afins. Alternativamente, os ingredientes opcionais do meio de teste mencionados acima também podem ser adicionados de modo exógeno. 0 meio de teste pode estar contido em qualquer tipo de recipiente; recipientes frequentemente utilizados são tubos, placas de microtítulo e placas de Petri. 0 termo "valor limite" refere-se ao valor de concentração acima do qual um dado analito deve ser considerado como estando presente e abaixo do qual o referido analito deve ser considerado como estando ausente. Em geral, um valor limite é fixado para analitos particulares em amostras particulares por autoridades locais, regionais ou inter-regionais, mas também pode ser pré-fixado para certos fins de investigação.
Num primeiro aspecto da invenção é proporcionado um sistema de teste que compreende um meio de teste. 0 meio de teste compreende um microrganismo, uma substância que proporciona um estado sólido e um indicador, caracterizado por o indicador ser Azul de Bromotimol.
Preferivelmente, a substância que proporciona um estado sólido é um agente gelificador e/ou um material de suporte. A quantidade de agente gelificador no meio de teste situa-se entre 2 e 100 g.L-1, preferivelmente entre 5 e 50 g.L-1, mais preferivelmente entre 10 e 20 g.L-1, muito preferivelmente entre 12 e 15 g.L-1. Preferivelmente, o agente gelificador é agar.
Numa especificação do primeiro aspecto da invenção, o microrganismo é um microrganismo estável termicamente, como uma espécie de Bacillus, preferivelmente Bacillus stearothermophilus, uma espécie de Escherichia coli ou uma espécie de Streptococcus, preferivelmente Streptococcus thermophilus. Estas espécies podem ser introduzidas no teste como unidades capazes de produzir colónias, ou Unidades Formadoras de Colónias (CFU's). Essas CFU's podem ser esporos, células vegetativas ou uma mistura de ambas. A concentração das referidas CFU's é expressa como Unidades Formadoras de Colónias por mL do meio de teste (CFU.mL-1) e habitualmente situa-se na gama de 1 x 105 até 1 x 1012 CFU.mL-1, preferivelmente 1 x 106 até 1 x IO10 CFU.mL-1, mais preferivelmente 2 x 106 até 1 x 109 CFU.mL-1, muito preferivelmente 5 x 106 até 1 x 108 CFU.mL-1, ou ainda mais preferivelmente 5 x 106 até 2 x 107 CFU.mL-1.
Num segundo aspecto da invenção é proporcionado um método para determinar a presença de um antibiótico num fluido, que compreende os passos de contactar uma amostra do referido fluido com um meio de teste, de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção, na presença de nutrientes. Vantajosamente, o método proporciona condições para que não ocorra crescimento do microrganismo antes da adição da amostra de fluido ao manter o meio de teste em condições que previnem o crescimento, como temperatura relativamente baixa e/ou ausência de nutrientes essenciais para o crescimento. Após a adição da amostra de fluido deixa-se o microrganismo crescer durante um período de tempo suficientemente longo para que os microrganismos 9 cresçam no caso de não estarem presentes antibióticos, por adição de nutrientes, opcionalmente antes do contacto da referida amostra de fluido, e/ou aumentando a temperatura, e/ou proporcionando um valor de pH ao qual o microrganismo é capaz de crescer, e detectando o crescimento do microrganismo observando a presença ou ausência de uma alteração de um indicador. 0 método da presente invenção também inclui misturar amostras (por exemplo, com outras amostras, mas também com sais, compostos de tamponamento, nutrientes, estabilizadores, compostos etiquetados com isótopos, compostos etiquetados de modo fluorescente e afins), concentrar e/ou diluir amostras (por exemplo, com líquidos diluentes, como água, leite ou líquidos derivados do leite, sangue ou líquidos derivados do sangue, urina e/ou solventes) antes da adição ao meio de teste.
Numa especificação do segundo aspecto da presente invenção, o antibiótico é um antibiótico β-lactama, como um derivado de cefalosporina ou de penicilina. Exemplos desses derivados são amoxicilina, ampicilina, cefadroxil, cefradina, ceftiofur, cefalexina, penicilina G, penicilina V e ticarcilina, mas obviamente muitos outros derivados β-lactama semelhantes são conhecidos e aplicáveis no método da presente invenção. Noutra especificação, o antibiótico é um aminoglicósido, tal como, por exemplo, neomicina.
Vantajosamente, foi determinado que o método da presente invenção exibe selectividade no que se refere a antibióticos, em particular no que se refere a antibióticos β-lactama e aminoglicósidos.
Noutra especificação do segundo aspecto da invenção, o crescimento do microrganismo deve ocorrer durante um período de tempo predeterminado, preferivelmente num período de tempo de 0,5 até 4 horas, mais preferivelmente 10 entre 1 e 3,5 horas, muito preferivelmente entre 2,0 e 3,25 horas. Preferivelmente, o crescimento do microrganismo é conduzido a uma temperatura predeterminada, preferivelmente a temperatura óptima de crescimento do microrganismo. Quando se empregam, por exemplo, microrganismos estáveis termicamente, essa temperatura situa-se preferivelmente entre 40 e 70°C, mais preferivelmente entre 50 e 65°C, muito preferivelmente entre 60 e 64°C. Opcionalmente, essa reacção pode ser conduzida com o auxilio de um dispositivo termostático. Alternativamente, o tempo necessário para o crescimento do microrganismo é igual ao tempo necessário para que uma amostra de calibração sem nenhum analito induza uma alteração do indicador.
Ainda noutra especificação do segundo aspecto da invenção, adicionam-se nutrientes como fonte separada, por exemplo, na forma de uma pastilha, disco ou papel de filtro. Também outros compostos, como o(s) indicador(es), microrganismo, estabilizadores e/ou antifolatos, podem ser adicionados como fonte separada, opcionalmente incorporados no meio de nutrientes.
Ainda noutra especificação do segundo aspecto da invenção, é proporcionado um método para determinar a presença ou ausência de um antibiótico numa amostra de fluido em que a razão entre a amostra de fluido e o meio de teste excede 2:3 (0,68:1) (v/v). Preferivelmente, essa razão é pelo menos 20:27 (0,74:1) (v/v), mais preferivelmente a referida razão é pelo menos 25:27 (0,93:1) (v/v); muito preferivelmente, a referida razão é pelo menos 2:1 (v/v). Verificou-se que não há nenhum motivo técnico para se estabelecer um limite superior para a quantidade da amostra de fluido. Na prática, este volume não deve exceder a capacidade máxima do recipiente que contém o meio de teste. Por exemplo, num recipiente de 2 mL 11 com 0,2 mL de meio de teste, não devem adicionar-se mais do que 1,8 mL da amostra de fluido. Na prática, os recipientes para implementar o método da presente invenção têm um volume que raramente excede 50 mL; assim, a quantidade de amostra de fluido a ser adicionada não excederá 50 mL, preferivelmente 10 mL, mais preferivelmente 5 mL, ainda mais preferivelmente 2 mL, muito preferivelmente 1 mL. Assim, em geral, o limite superior da razão entre o volume da amostra de fluido e o volume do meio de teste é 250:1 (v/v), preferivelmente 50:1 (v/v), mais preferivelmente 25:1 (v/v), ainda mais preferivelmente 10:1 (v/v), muito preferivelmente 5:1 (v/v). Preferivelmente, o volume da amostra de fluido é superior ao volume do meio de teste. O resultado do método da presente invenção é determinado pela observação da presença ou ausência de uma alteração do indicador ou indicadores utilizados. Por exemplo, quando essa alteração é uma alteração de cor, essa alteração de cor pode ser observada visualmente. No entanto, numa especificação da invenção, essa alteração de cor é determinada utilizando um dispositivo que gera dados de imagens digitais ou um dispositivo que gera dados de imagens analógicos e converte esses dados de imagens analógicos em dados de imagens digitais, seguido de interpretação dos referidos dados de imagens digitais por um processador computacional. Esse dispositivo, que pode ser, por exemplo, um dispositivo de leitura de amostras, como um "scanner" acoplado a um computador pessoal, está descrito na Candidatura de Patente Internacional WO 03/033728, incorporado por referência e brevemente resumido abaixo. O dispositivo pode ser adequadamente utilizado, por exemplo, para detectar resíduos de antibióticos no leite. Com este dispositivo é possível submeter a varrimento o 12 lado inferior de cada uma das amostras numa placa de teste. A cor e o brilho da luz reflectida são registados em três variáveis, cada uma descrevendo um componente de cor, por exemplo, o denominado modelo L*a*b*. No modelo L*a*b*, o espectro de cores é dividido numa matriz bidimensional. A posição de uma cor nesta matriz é registada através das duas variáveis "a" e "b". A variável L indica a intensidade (por exemplo, de azul-claro para azul-escuro). É possível construir um critério compreendendo o valor a, valor b e o valor L para criar uma função compósita do modo seguinte: Z = wL . L + wa. a + wb. b em que wL, wa w wb são factores de ponderação para o valor L, valor a e valor b, respectivamente. Os valores destes factores de ponderação podem ser calculados por "análise discriminante", de modo que as médias do grupo exibem uma distância máxima relativamente ao espalhamento. Combinando dois ou mais dos componentes de cor no modelo L*a*b* de um modo predeterminado, que depende do tipo de resíduo e da amostra, é possível obter-se uma detecção rigorosa. Na prática, determina-se experimentalmente um certo valor de Z ao qual um teste deve mudar entre um resultado positivo e um negativo.
Num terceiro aspecto da invenção é proporcionado um estojo para implementar o método do segundo aspecto da presente invenção. Esse estojo compreende um ou mais recipientes cheios com meio de teste, como descrito no primeiro aspecto da invenção, e opcionalmente um dispositivo de amostragem. Os recipientes podem ser tubos de teste de qualquer formato e dimensão e feitos de qualquer material disponível, desde que seja possível 13 observar alterações do indicador. Os recipientes também podem ser cavidades, como as incorporadas em placas de microtítulo.
Esse dispositivo de amostragem é um dispositivo com o auxilio do qual um fluido pode ser adicionado ao referido meio de teste. Preferivelmente, esse dispositivo é um recipiente, opcionalmente com marcações de volume. Mais preferivelmente, esse dispositivo é uma seringa, uma pipeta ou um sistema de pipetagem automático. Essa seringa ou pipeta pode ser concebida de modo tal que, apenas com um modo de operação, um volume predeterminado pode ser recolhido do fluido a ser analisado. Opcionalmente, podem aplicar-se sistemas conhecidos na área com os quais mais do que uma seringa ou pipeta podem ser operadas com uma única manipulação. 0 objectivo do segundo aspecto da presente invenção é proporcionar um estojo que permita a simples adição das quantidades do fluido a ser adicionado de acordo com o primeiro aspecto da invenção. Opcionalmente, esse estojo compreende meios para selar os referidos recipientes cheios com meio de teste durante a incubação e/ou um folheto com instruções de utilização e/ou um meio para fixar o tempo necessário para a incubação.
Numa especificação do terceiro aspecto da invenção, esse estojo compreende nutrientes. Preferivelmente, esses nutrientes estão contidos num meio, como uma pastilha, disco ou papel de filtro. As vantagens de proporcionar nutrientes contidos num meio consistem no utilizador poder facilmente adicioná-los ao meio de teste e nas quantidades poderem ser predeterminadas, de modo a evitar erros na dosagem das quantidades requeridas. Também outros compostos, como o(s) indicador(es), estabilizadores e/ou antifolatos, podem ser adicionados como fonte separada, opcionalmente incorporados no meio de nutrientes. 14
Noutra especificação do terceiro aspecto da presente invenção, esse estojo compreende um dispositivo termostático, com o auxilio do qual amostras de teste podem ser mantidas a uma temperatura pré-fixada, como a temperatura à qual os microrganismos exibem crescimento suficiente. Preferivelmente, esse dispositivo termostático é concebido de modo tal que pode conter os referidos recipientes cheios com meio de teste. Opcionalmente, o dispositivo termostático é acoplado a um meio para fixar o tempo necessário para a incubação, de modo que o aquecimento e/ou arrefecimento são terminados depois de decorrer um período de tempo pré-fixado.
Ainda noutra especificação do terceiro aspecto da invenção, esse estojo compreende um suporte de dados com um programa computacional adequado para instruir um computador para analisar dados digitais obtidos de um dispositivo de leitura de amostras. Esse suporte de dados pode ser qualquer suporte adequado para armazenar informação digital, como um CD-ROM, uma disquete, um DVD, um cartão de memória, uma fita magnética ou afins. Vantajosamente, esse suporte de dados com um programa computacional proporciona acesso fácil aos últimos programas computacionais disponíveis adequados para serem utilizados no método da presente invenção.
Num quarto aspecto da presente invenção é proporcionada a utilização de Azul de Bromotimol para melhorar a sensibilidade a um antibiótico num teste de inibição microbiana. 15 EXEMPLOS Exemplo 1
Comparação entre Azul de Bromotimol e Púrpura de Bromocresol na determinação de penicilina G
Adaptou-se o Delvotest® MCS comercialmente disponível, preparado de acordo com os métodos descritos em EP 0005891, substituindo o indicador Púrpura de Bromocresol por Azul de Bromotimol (160 mg.IT1). Determinou-se a sensibilidade à penicilina G investigando amostras com diferentes concentrações de penicilina G em diferentes sistemas de teste. Os resultados estão resumidos na Tabela abaixo (valores de sensibilidade em partes por milhar de milhão). Púrpura de Bromocresol Azul de Bromotimol Penicilina G1 4 2 Penicilina Gz 3 2 1. Investigaram-se concentrações de penicilina G de 0, 2, 4 e 6 partes por milhar de milhão 2. Investigaram-se concentrações de penicilina G de 0, 1, 2, 3 e 4 partes por milhar de milhão
Exemplo 2
Comparação entre Azul de Bromotimol e Púrpura de Bromocresol na determinação de vários antibióticos
Adaptou-se o Delvotest® MCS comercialmente disponível, preparado de acordo com os métodos descritos em EP 0005891, substituindo o indicador Púrpura de Bromocresol por Azul de Bromotimol (160 mg.IT1). Determinou-se a sensibilidade a diferentes antibióticos investigando dois conjuntos de seis experiências utilizando um sistema de teste em placa ou de 16 teste em tubo. Determinou-se a sensibilidade lendo o teste no momento em que um controlo sem antibiótico mudou de cor. Dos resultados, que estão resumidos na Tabela abaixo (valores de sensibilidade em partes por milhar de milhão), pode observar-se que o Azul de Bromotimol exibe sensibilidades superiores em comparação com Púrpura de bromocresol (PB) para todos os antibióticos investigados exceptuando sulfadiazina, em cujo caso os resultados para os dois indicadores são idênticos. PB1 Azul de Bromotimol Tipo de teste Teste em placa Teste em tubo Experiência # 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Penicilina G 3 1 2 1 1 1-2 1 2 2 2 2 2 2 Ampicilina 8 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Amoxicilina 8 4 2 2 2 2-4 2 4 4 4 4 4 4 Cefapirina 8 2 2 4 6 2 4-6 4 4 4 4 4 4 Cloxacilina 40 10 10 10 10 10 10 20 20 20 20 20 20 Neomicina 600 100 100 100 100 100 100 200 200 200 200 200 200 Sulfadiazina 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 1. PB: Púrpura de Bromocresol
Exemplo 3
Efeito da concentração na comparação entre Azul de Bromotimol e Púrpura de Bromocresol
Prepararam-se dois sistemas de teste. 0 primeiro sistema difere de um Delvotest® MCS comercialmente disponível apenas no facto da concentração de Púrpura de Bromocresol ser 160 mg.Lh1, e a segunda série é igual à primeira substituindo Púrpura de Bromocresol por Azul de Bromotimol (160 mg.Lh1). Determinou-se a sensibilidade à penicilina G lendo o teste no momento em que um controlo sem antibiótico mudou de cor. Dos resultados apresentados 17 na Tabela abaixo (valores de sensibilidade em partes por milhar de milhão) pode observar-se que a sensibilidade do Azul de Bromotimol é melhor do que a do Púrpura de Bromocresol às mesmas concentrações do indicador. Púrpura de Bromocresol (160 mg.L"1) Azul de Bromotimol (160 mg.L-1) Penicilina G 3 2
Exemplo 4
Comparação entre Azul de Bromotimol e Púrpura de Bromocresol no teste de inibição microbiológica à escala de produção
Prepararam-se duas séries de sistemas de teste à escala de produção. A primeira série consiste num Delvotest® MCS comercialmente disponível e a segunda série é igual à primeira substituindo Púrpura de Bromocresol por Azul de Bromotimol (160 mg.L-1). Determinou-se a sensibilidade a diferentes antibióticos lendo o teste no momento em que um controlo sem antibiótico mudou de cor. Os resultados estão apresentados na Tabela abaixo (valores de sensibilidade em partes por milhar de milhão). Púrpura de Bromocresol Azul de Bromotimol Penicilina G1 3 2 Penicilina Gz 3 2 Ampicilina2 6 2 Amoxicilina^ 8 4 Cefapirina^ 8 4 Cloxacilina^ 40 20 Neomicina2 400 200 18 1. Lote #1, imediatamente após a produção 2. Lote #1, três semanas após a produção
Lisboa, 31 de Março de 2009

Claims (13)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para determinar a presença de um antibiótico num fluido, que compreende os passos seguintes: (a) contactar uma amostra do fluido com um meio de teste que compreende um microrganismo, pelo menos uma substância que proporciona um estado sólido e um indicador, (b) incubar o microrganismo durante um período de tempo para que o microrganismo cresça no caso de não estar presente nenhum antibiótico na amostra de fluido, e (c) detectar o crescimento ou a inibição do crescimento do microrganismo com o indicador, caracterizado por o indicador ser Azul de Bromotimol.
2. Método de acordo com a Reivindicação 1, em que o antibiótico a ser determinado é seleccionado do grupo que consiste num antibiótico β-lactama e um aminoglicósido.
3. Método de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, em que o fluido onde se pretende determinar a presença de antibióticos é um fluido que pode ser obtido do corpo de um animal ou de um humano.
4. Método de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-3, em que a razão entre o volume da amostra de fluido e o volume do meio de teste excede 0,68:1 (v/v).
5. Método de acordo com a Reivindicação 4, em que a razão entre o volume da amostra de fluido e o volume do meio de teste excede 2:1 (v/v). 2
6. Método de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-5, em que o volume da amostra de fluido é superior ao volume do meio de teste.
7. Sistema de teste para determinar a presença de um antibiótico num fluido, que compreende um meio de teste compreendendo um microrganismo, pelo menos uma substância que proporciona um estado sólido e um indicador, caracterizado por o referido indicador ser Azul de Bromotimol.
8. Estojo adequado para determinar a presença de um antibiótico num fluido, que compreende um recipiente parcialmente cheio com um meio de teste compreendendo um microrganismo, um agente gelificador e um indicador, caracterizado por o referido indicador ser Azul de Bromotimol.
9. Estojo de acordo com a Reivindicação 8 que também compreende nutrientes adequados para permitir o crescimento do microrganismo.
10. Estojo de acordo com a Reivindicação 8 ou 9 que também compreende um dispositivo termostático, com o auxílio do qual amostras de teste podem ser mantidas a uma temperatura pré-fixada.
11. Estojo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 8-10 que também compreende um suporte de dados com um programa computacional adequado para instruir um computador para analisar dados digitais obtidos de um dispositivo de leitura de amostras. 3
12. Utilização de Azul de Bromotimol para sensibilidade a um antibiótico num teste microbiana.
13. Utilização de acordo com a Reivindicação antibiótico é seleccionado do grupo que antibiótico β-lactama e um aminoglicósido. Lisboa, 31 de Março de 2009 melhorar a de inibição 12, em que o consiste num
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