JP2009136205A - 細胞内ａｔｐ測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞内のＡＴＰを測定する時に、細胞外ＡＴＰを取り除くためのＡＴＰ分解酵素を効果的に取り除き、細胞内ＡＴＰの測定感度を低下させる事のない細胞内ＡＴＰ測定方法を提供する。
【解決手段】測定すべき細胞の周囲にＡＴＰ分解酵素を含む消去剤を塗布し、前記消去剤を疎水性化合物がオクタデシル基であり且つシリカゲル担体に結合した構造を持つ消去剤で不活化した後に前記測定すべき細胞の細胞内ＡＴＰを測定する細胞内ＡＴＰ測定方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、細胞内ＡＴＰを測定する方法に関し、より詳細には、細胞内ＡＴＰを測定する為に細胞外ＡＴＰを消去する目的で使用するＡＴＰ消去剤の活性を低減して、細胞内ＡＴＰを高感度に検出する技術に関する。

アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）は、多くの生物体のエネルギー代謝に関与している。生体内で起こる種々の化学反応には、ＡＴＰが加水分解されてアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）またはアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）となる際に放出されるエネルギーを利用して行われるものが多い。また、ＡＴＰは、生体内においてリボ核酸（ＲＮＡ）の前駆体、生体内リン酸化反応におけるリン酸供与体などとしても利用される。このように、ＡＴＰは、生体において極めて重要な役割を果たす化合物であることから、ＡＴＰの測定は、様々な分野において、重要な役割を担っている。

食品衛生、バイオ、臨床検査等の現場では、衛生度、あるいは検体中の微生物の存在や量の迅速な把握が望まれている。しかし、従来の培養法では、現場での拭き取りから検査結果が出るまでに、数日かかり、その場で検査結果が得られない。そのため、迅速にＡＴＰの測定が出来る生物発光法を使用したＡＴＰ検査装置が注目されている。
ＡＴＰ量を測定する方法として、蛍の発光原理でもあるルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を利用した生物発光法が一般的であり、ＡＴＰ検査装置にも広く用いられている。この方法は、試料から抽出したＡＴＰにルシフェリンおよびルシフェラーゼを作用させることで発光させる。この発光は、１分子あたり１個のフォトンが放出されるので、発光時間に対する値を積分することによってＡＴＰを定量的に検出できる。

この原理を利用したＡＴＰ検査装置は、検体を拭き取ってからＡＴＰ量を測定するまで数分しかかからない為、現場で衛生度を迅速に判定できる。これは、不適合の判定だったとしても、即座に再洗浄等の対策を実施することが出来るので、後の工程や流通あるいは消費者への汚染や食中毒の発生を防止できる利点がある。また、迅速にＡＴＰ量を測定できるメリットを生かし、食品中の微生物検査への応用も出来る。これは、生きた微生物の生物細胞の中には必ずＡＴＰが存在する事を利用し、食品中の微生物量を判定する。

微生物の細胞内ＡＴＰ量を測定する場合に問題になるのが、微生物の外に存在する細胞外ＡＴＰである。ＡＴＰはすべての生命体に含まれる物質なので、あらゆる所にＡＴＰが浮遊している。従って、測定すべき生物細胞の細胞内ＡＴＰを検出する際に、この細胞外ＡＴＰがバックグラウンドノイズとして同時に測定され、精度良く細胞内ＡＴＰ量が測定出来ない。

このため、まず細胞外ＡＴＰを除去した後、細胞を界面活性剤で構成した抽出剤で細胞を破壊して、抽出した細胞内ＡＴＰ量を生物発光法で測定する方法が用いられる。細胞外ＡＴＰの除去には、ＡＴＰ分解酵素を利用したＡＴＰ消去剤が使用されている。ＡＴＰ分解酵素には、アピラーゼ、アデノシントリホスファターゼ、ヘキソキナーゼ、ＡＴＰピロフォスファターゼ等が知られており、特にアデノシンリン酸デアミナーゼを主として、１つあるいは複数のＡＴＰ分解酵素を組み合わせて使用したＡＴＰ消去剤が製品化されている（例えば、特許文献１参照。）。

この方法は、検体に含まれる細胞外ＡＴＰ量すなわちバックグラウンドノイズを極力低い量まで削減した後に、細胞内ＡＴＰを抽出剤により抽出し、生物発光法で細胞内ＡＴＰ量を測定する。ところが、ＡＴＰ抽出後の細胞内ＡＴＰ測定時にも、ＡＴＰ消去剤のＡＴＰ消去活性が残っている為、ＡＴＰが分解されて発光量も低く抑えられ、感度が低下する。そこで、消去剤としてアデノシンリン酸デアミナーゼを使用し、その阻害剤であるコホルマイシンを投入して不活化する提案がされている。この提案によれば、コホルマイシンがアデノシンリン酸デアミナーゼの阻害剤として有効に働き、ＡＴＰ発光検出酵素であるルシフェラーゼへの影響を低く抑えて、ＡＴＰを検出できる（例えば、特許文献２参照。）。
特開平９−１８２６００号公報 特開平１１−５６３９３号公報

しかしながら、前記従来の構成では、消去剤であるコホルマイシンは劇薬であるので、食品衛生検査などの現場では、安全に使用することが出来ないという課題を有していた。

本発明は、前記従来の課題を解決するもので、細胞内のＡＴＰを測定する時に、細胞外ＡＴＰを取り除くためのＡＴＰ分解酵素を効果的に取り除き、細胞内ＡＴＰの測定感度を低下させる事のない細胞内ＡＴＰ測定方法を提供することを目的とする。

前記従来の課題を解決するために、本発明の細胞内ＡＴＰ測定方法は、測定すべき細胞の周囲にＡＴＰ分解酵素を含む消去剤を塗布し、前記消去剤を疎水性化合物で不活化した後に前記測定すべき細胞の細胞内ＡＴＰを測定することを特徴としたものである。

本発明の細胞内ＡＴＰの測定方法によれば、細胞外ＡＴＰを安全な消去剤によって除去した後に、消去剤のＡＴＰ分解能力を抑制して消去剤の影響を受ける事無く、高感度に細胞内ＡＴＰ量を測定することができる。

以下に、本発明の細胞内ＡＴＰの測定方法の実施の形態を詳細に説明する。
（実施の形態１）
細胞内ＡＴＰを抽出する際には、ＡＴＰを測定すべき細胞を形成している生体膜を除去しなければならない。この除去剤として界面活性剤が使用される。生体膜はタンパク質と脂質とが結合しているが、界面活性剤がこのタンパク質と疎水基結合をして界面活性剤の親水基の部分がタンパク質の表面をおおい、タンパク質を溶かす。これによって、細胞の生体膜が破壊され、ＡＴＰを含む細胞内物質が抽出できる。

また、ＡＴＰ分解酵素も疎水基部分を有しているため、ＡＴＰ分解の際には、この疎水基部分とＡＴＰとが結合してＡＴＰ分解酵素内に埋もれてしまう。そのため、ＡＴＰ分解酵素は、その表面の疎水性が減少すると共に形状も変化するが、分解時のリン酸放出の際に元の状態に戻る。そのため、界面活性剤を使用する際には、ＡＴＰ分解酵素の疎水基部分に界面活性剤が結合して、ＡＴＰ分解酵素の力を弱める。従来法では、この界面活性剤を利用して、細胞外ＡＴＰを除去した後のＡＴＰ分解酵素の力を弱めていた。

本発明では、この細胞外ＡＴＰを除去するためのＡＴＰ分解酵素のＡＴＰ分解能力をさらに抑制する為、疎水性化合物を固定した担体を用いる。この疎水性化合物を固定した担体に、オクタデシル基を球状の粒子であるシリカゲルに固定したオクタデシルシリカゲル担体（ＯＤＳ）を使用した。オクタデシルシリカゲル担体は、粒子状のシリカゲル表面に露出しているシラノール基に、シリル化剤を使用して疎水性の高いオクタデシル基をシラノール基に化学結合させ、シリカの表面を覆う事で作製できる。

大腸菌の細胞内ＡＴＰを測定する際に、このオクタデシルシリカゲル担体を使用することで、本発明によるＡＴＰ分解酵素の不活化の有効性を確認した。

対象となる大腸菌には、ＬＢ寒天培地上にて１日３７℃で培養した大腸菌を用い、１０６ＣＦＵ／ｍＬのコロニーを２箇所採取し、１０ｍＭリン酸バッファ１ｍＬ溶液に溶解させて、２本作製した（試料Ｎｏ．１及び試料Ｎｏ．２。）。ＡＴＰ消去剤は、アデノシンリン酸デアミナーゼとアピラーゼの２種類のＡＴＰ分解酵素から成るキッコーマン製ルシフェールＡＴＰ消去剤を使用した。疎水性化合物とその支持担体には、オクタデシル基を導入したシリカゲル（ＯＤＳ）であるＨＡＲＶＡＲＤ製 ＭａｃｒｏＳｐｉｎＣｏｌｕｍｓ ＯＤＳを使用した。また、ＡＴＰを測定する装置はルミノメーター（ルミテスターＣ−１０００、キッコーマン社製）を使用した。発光試薬とＡＴＰ抽出剤は、ルシフェール２５０プラス（キッコーマン社製）のキット試薬を使用した。このシステムでは、ＡＴＰの濃度をＡＴＰ発光量で表現しており、事前に検量線を作製し評価した結果、ＡＴＰ濃度１桁の変化が、おおよそＡＴＰ発光量１桁の変化に相当し、ＡＴＰ濃度で１０−９Ｍ(1ｎＭ)が、ＡＴＰ発光量１００，０００に相当している事を確認した。

＜比較例１及びその評価手順＞
試料Ｎｏ．１及び試料Ｎｏ．２の大腸菌を用い、比較例１として、細胞外ＡＴＰの消去を確認する為に、細胞外ＡＴＰを消去剤で消去し、細胞内ＡＴＰを抽出しないサンプルを作製した。以下の手順で、サンプルのＡＴＰ発光量を測定した。
（１） 検体である大腸菌溶解液１５０μＬをエッペンチューブに抽出した。
（２） 消去剤を１５μＬ滴下し、３０秒撹拌した。
（３） （１）と（２）の混合溶液から１００μＬ抽出し、更に蒸留水を１００μＬ滴下（抽出剤を投入しない代わり）し、３０秒撹拌した。
（４） ＡＴＰ発光試薬をＡＴＰ測定用チューブに１００μＬ滴下し、ＡＴＰ発光量をルミノメーターで測定した。

＜比較例２及びその評価手順＞
試料Ｎｏ．１及び試料Ｎｏ．２の大腸菌を用い、比較例２として従来法を用いた。これは、消去剤で細胞外ＡＴＰを消去した後、抽出液で細胞内ＡＴＰを抽出したものである。以下の手順で、このＡＴＰ発光量を測定した。
（１） 検体である大腸菌溶解液１５０μＬをエッペンチューブに抽出する。
（２） 検体に消去剤を１５μＬ滴下し、３０秒撹拌する。
（３） （１）と（２）の混合溶液から１００μＬを抽出してＡＴＰ測定用チューブにとり、更にＡＴＰ抽出剤を１００μＬ滴下して、３０秒撹拌する。
（４） ＡＴＰ発光試薬をＡＴＰ測定用チューブに１００μＬ滴下し、ＡＴＰ発光量をルミノメーターで測定する。

＜実施例とその評価手順＞
試料Ｎｏ．１及び試料Ｎｏ．２の大腸菌を用い、実施例として、本発明の消去剤で細胞外ＡＴＰを消去した後、疎水性化合物を使用して消去剤を不活化し、その後抽出液で細胞内ＡＴＰを抽出したサンプルを作製した。以下の手順で、このサンプルのＡＴＰ発光量を測定した。
（１） 検体である大腸菌溶解液１５０μＬをエッペンチューブに抽出する。
（２） 検体に消去剤を１５μＬ滴下し、３０秒撹拌する。
（３） （１）と（２）の混合溶液をＯＤＳスピンカラムに添加し、２０００ｒｐｍ、２分間遠心分離する。
（４） 混合溶液から１００μＬを抽出してＡＴＰ測定用チューブにとり、更にＡＴＰ抽出剤を１００μＬ滴下して、３０秒撹拌する。
（５） ＡＴＰ発光試薬をＡＴＰ測定用チューブに１００μＬ滴下し、ＡＴＰ発光量をルミノメーターで測定する。

表１に、比較例１及び２と実施例でのＡＴＰ発光量の測定結果を示す。

比較例１が示すＡＴＰ発光量は、細胞外ＡＴＰの量を表す。すなわち、２つの大腸菌からなる試料Ｎｏ．１及び試料Ｎｏ．２のバックグランドノイズを表す。比較例１と２とのＡＴＰ発光量を比べると、従来法である比較例２では、このバックグランドノイズの２〜３倍の発光量があった。しかし、消去剤を追加した本発明の実施例の発光量は、このバックグランドノイズよりも２８倍〜４１倍と一桁大きい値を示した。これは、本発明で用いたる疎水性化合物を使用して消去剤の効果によるものである。このような消去剤を使用する事で、従来法よりも発光量の低下をはるかに抑制することが出来、細胞内ＡＴＰ測定の感度の向上が出来る。

（実施の形態２）
図１は、本発明の第２の実施の形態における、細胞内ＡＴＰの測定方法を発光方式で実現する検体検査キットの構造図を示す。細胞外ＡＴＰを除去する為の消去剤には、本実施の形態１で説明した消去剤を使用する。検体検査キット１は、検体の拭き取りを実施する拭き取り器具２と、筒状で拭き取り器具２の先端部が差し込まれるキット本体３から構成されている。拭き取り器具２の先端には、拭き取る材料である綿棒９が装備されている。また、綿棒９の材料は、綿以外にもガーゼやスポンジ等の吸収材や多孔質材料を選択可能である。

キット本体３には、使用前の拭き取り器具２を格納する拭き取り器具格納部４と、細胞外ＡＴＰを除去する為の消去剤が格納されている細胞外ＡＴＰ消去部５、消去剤のＡＴＰ分解能力を抑制する疎水性化合物を支持した担体を含んだ溶液が格納されている消去剤除去部６、拭き取り器具２に付着した拭き取り検体より検出対象物を抽出する液状の試薬が格納されている抽出試薬部７、検出対象物を発光で検出する検出部１１で構成されている。

これら各格納部は独立して混ざらないように複数の仕切り８で区切っており、検体を検査する際には、格納部毎に順次反応を進める様、拭き取り器具で各仕切りを突き破れる素材でできている。例えば、アルミ箔やビニル、プラスチックで構成した膜等の仕切りで構成可能である。抽出試薬部７に充填されている抽出試薬とは、例えば、塩化ベンザルコニウム等の界面活性剤や、トリクロロ酢酸、メタノール等が選択可能である。

抽出試薬部７の下には、疎水性化合物を支持した担体をろ過するフィルター１０を配置する。フィルターの径は、疎水性化合物を支持した担体を捕捉できるサイズ、数μｍを選択する。担体をフィルターで補足する目的は、検出部１１で、光を透過しない疎水性化合物を支持した担体の妨害を防ぐ為である。細胞内ＡＴＰを含んだ混合溶液は、フィルター１０を通過し、検出部のルシフェリン−ルシフェラーゼを含む発光試薬と反応する。反応後、即時に検体検査用キット１をＡＴＰ測定装置に装填してＡＴＰ量の測定を行う。発光式のＡＴＰ測定装置は、ＡＴＰ量に基づいた発光量を定量測定し、表示するよう構成されている。

（実施の形態３）
図２は、本発明の第３の実施の形態における、細胞内ＡＴＰの測定方法を電気化学式で実現する検体検査キットの構造図を示す。細胞外ＡＴＰを除去する為の消去剤には、本実施の形態１で説明した消去剤を使用する。

検体検査キット１は、検体の拭き取りを実施する拭き取り器具２と、筒状で拭き取り器具２の先端部が差し込まれるキット本体３から構成されている。拭き取り器具２の先端には、拭き取る材料である綿棒９が装備されている。綿棒９の材料は、綿以外にもガーゼやスポンジ等の吸収材や多孔質材料を選択可能である。

キット本体３には、使用前の拭き取り器具２を格納する拭き取り器具格納部４と、細胞外ＡＴＰを除去する為の消去剤が格納されている細胞外ＡＴＰ消去部５、消去剤のＡＴＰ分解能力を抑制する疎水性化合物を支持した担体を含んだ溶液が格納されている消去剤除去部６、拭き取り器具２に付着した拭き取り検体より検出対象物を抽出する液状の試薬が格納されている抽出試薬部７、電気化学検出を行うセンサチップ１２が格納されている検出部１１で構成されている。これら各格納部は独立して混ざらないように仕切り８で区切っており、検体を検査する際には、格納部毎に順次反応を進める様、拭き取り器具で各仕切りを突き破れる素材でできている。例えば、アルミ箔やビニル、プラスチックで構成した膜等の仕切りで構成可能である。抽出試薬部７に充填されている抽出試薬とは、例えば、塩化ベンザルコニウム等の界面活性剤や、トリクロロ酢酸、メタノール等が選択可能である。

センサチップ１２は、キット本体内で鉛直に配置されており、全ての仕切りを突き破って出てきた綿棒９が、検体取り込み口１４に直接接触して停止する様な構成にしている。つまり、拭き取り器具２をキット本体３の限界まで挿入した際の綿棒の位置に、センサチップ１２の検体取り込み口１４を配置する。また、仕切りを突き破って出てきた綿棒が、できるかぎり本体キットの円周の中心に位置する様、導入路規制部材２１が設けられている。

更に導入路規制部材２１の入口より出口の径を小さくし、なおかつ出口の径を綿の径とほぼ同等にしておくことで、過剰な液が検出部に滴下しないようにする事も可能である。キット本体３の最下部には、センサチップ固定用蓋２２が配置されている。これは、センサチップ１２をキット本体３内に固定し、かつセンサチップ１２のコネクタ部１９を検体検査キット１の外側に出して装置との接続を可能にする機能に加えて、万が一抽出部７から過剰の抽出液が滴下しても、検体検査キット１外に液が流出しない液漏れ防止の機能を持っている。またセンサチップ１２は、センサチップ固定用蓋を二分する様にして固定される。

図３は、本発明の第３の実施の形態における、センサチップの構造図を示す。センサチップ１２は、絶縁基板部１３に、測定対象物を取り込む検体取り込み口１４、検体を毛細管現象で取り込むための空気口１５、取り込み口から空気口までの検体流路１６、また検体流路中に配置されている検出電極１７と、検出電極上に試薬を固定化している反応層１８、及び反応層を覆う膜２０、および分析装置（ＡＴＰ測定装置、図示せず）との電気的接続部であるコネクタ部１９とで構成されている。膜２０の径は、疎水性化合物を支持した担体を捕捉して、測定対象物を含む混合溶液が通過するサイズ、数μｍ以下を選択する。膜２０は、電極上の反応において疎水性化合物を支持した担体が妨害しないよう、除去する事が目的である。尚、図３のセンサチップ１２は三電極、すなわち作用極、参照極、対極による構成を記載している。これは、食品衛生分野では、検査対象が様々でｐＨ等にばらつきがあり、より安定した測定を実施する為に有効である。もちろん血糖値センサの様な二電極構成、すなわち作用極と対極のみでの構成も可能である。

反応層にはＡＴＰを電気化学的に検出する為の試薬（酵素も含む）を、以下で構成している。
（イ） 塩化マグネシウム六水和物
（ロ） 塩化チアミンピロリン酸
（ハ） フラビンアデニンジヌクレオチドニナトリウムＮ水和物
（ニ） アデノシン一リン酸
（ホ） ホスホエノールピルビン酸
（ヘ） ミオキナーゼ
（ト） ピルビン酸キナーゼ
（チ） ピルビン酸デヒドロゲナーゼ
（リ） １−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェイト
（ヌ） リン酸（緩衝用）
上記はＡＴＰ検査用試薬構成の一例であり、本発明の実施には、公知のＡＴＰ検査用試薬を用いれば良い。

電極上の反応層１８と検体が接触した後、検体検査用キットをコネクタ部１９を通してＡＴＰ測定装置に接続し、ＡＴＰ量の測定を行う。電気化学式のＡＴＰ測定装置は、コネクタ部１９を通してセンサチップ１２の電極間に電位電圧をかけた際に、ＡＴＰの濃度に応じて発生する電流値を測定し表示するよう構成されている。

尚、本実施例ではセンサチップを検体検査キット内に取り込む事で、検体の拭き取りから測定対象物の抽出及び電気化学的検出までの一連の工程をキット内に封入し、外部からの異物や測定対象物そのものの混入を防止できる構造にしているが、電気化学的検出であるセンサチップと、拭き取りから細胞内ＡＴＰを抽出するまでのキットを別提供してもよい。

本発明にかかる細胞内ＡＴＰの測定方法は、細胞内ＡＴＰを測定する場合において、細胞外ＡＴＰを消去剤で消去後、消去剤に含まれているＡＴＰ分解酵素を疎水性化合物と結合させる事で、抽出した細胞内ＡＴＰが消去剤の影響を受ける事無く、高感度にＡＴＰ量を測定することができ、特にＡＴＰ検査の様な食品等衛生状態や微生物を検査するに適している。

本発明の第２の実施の形態における、細胞内ＡＴＰの測定方法を発光方式で実現する検体検査キットの構造図 本発明の第３の実施の形態における、細胞内ＡＴＰの測定方法を電気化学式で実現する検体検査キットの構造図 本発明の第３の実施の形態における、センサチップの構造図

符号の説明

１ 検体検査キット
２ 拭き取り器具
３ キット本体
４ 拭き取り器具格納部
５ 消去部
６ 消去剤除去部
７ 抽出部
８ 仕切り
９ 綿棒
１０ フィルター
１１ 検出部
１２ センサチップ
１３ 絶縁基板部
１４ 検体取り込み口
１５ 空気口
１６ 検体流路
１７ 検出電極
１８ 反応層
１９ コネクタ部
２０ 膜
２１ 導入路規制部材
２２ センサチップ固定用蓋

Claims (5)

1. 測定すべき細胞の周囲にＡＴＰ分解酵素を含む消去剤を塗布し、前記消去剤を疎水性化合物で不活化した後に前記測定すべき細胞の細胞内ＡＴＰを測定する細胞内ＡＴＰ測定方法。
2. 前記疎水性化合物は、担体に結合した構造を持つ請求項１記載の細胞内ＡＴＰ測定方法。
3. 前記疎水性化合物がオクタデシル基であり、及び前記担体がシリカゲル担体である請求項２記載の細胞内ＡＴＰ測定方法。
4. 前記細胞内ＡＴＰの測定は、発光検出である請求項１から請求項３記載の細胞内ＡＴＰ測定方法。
5. 前記細胞内ＡＴＰの測定は、電気化学検出である請求項１から請求項３記載の細胞内ＡＴＰ測定方法。

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