WO2014061787A1 - 生体物質定量方法及び生体物質定量装置 - Google Patents

生体物質定量方法及び生体物質定量装置 Download PDF

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裕太 中塚
修一 森
野恵 宮下
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株式会社日立製作所
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    • G01N2201/0636—Reflectors

Definitions

  • the present invention relates to a biological material quantification method and a biological material quantification apparatus for quantifying a cellular biological material contained in a specimen.
  • ATP adenosine triphosphate
  • This ATP measurement method is also used for water hygiene management (see, for example, Patent Document 1) and is also used for measuring microorganisms in soft drinks (for example, see Patent Document 2).
  • the quantification method of Patent Document 2 is configured to remove a quantitative inhibitory substance in the sample by adding a predetermined processing reagent to the sample in advance.
  • the conventional ATP quantification method when the conventional ATP quantification method is applied to the measurement of the amount of ATP contained in the microorganism, the amount of ATP contained in the microorganism is very small [amol (10 ⁇ 18 mol) range], so ATP is accurately and highly sensitive. There was a problem that could not be quantified. In addition, since a very small amount of ATP is contained in the processing reagent used for the pretreatment of the specimen, there is a problem that the conventional ATP quantification method cannot quantitate ATP with high accuracy and high sensitivity. Further, since the quantification range of the ATP amount is the amol range as described above, it is extremely difficult to control the concentration of the processing reagent so as to correspond to this, so the conventional ATP quantification method is extremely difficult. There was a problem that ATP could not be quantified with high sensitivity.
  • an object of the present invention is to provide a biological material quantification method and a biological material quantification apparatus capable of quantifying a biological material of cells contained in a specimen with higher accuracy and sensitivity than before.
  • the biological material quantification method that solves the above-described problem is a biological material quantification method that quantifies the biological material of cells contained in a specimen, wherein the biological body is separated and extracted from the cells by bringing a predetermined processing reagent into contact with the specimen.
  • a first luminescence measuring step for measuring the amount of luminescence when a biological substance luminescent reagent is reacted with a substance, and the first luminescence measuring step are performed in combination with the predetermined processing reagent.
  • a second luminescence measuring step for measuring the luminescence when the biological substance luminescence reagent is reacted, the luminescence measured in the first luminescence measuring step, and the second luminescence measurement.
  • a biological material quantification step of quantifying the biological material of the cells contained in the specimen based on the difference luminescence amount from the luminescence amount measured in the step.
  • the biological material quantification apparatus that solves the above-described problem is a biological material quantification apparatus that quantifies the biological material of cells contained in a specimen, and is separated and extracted from the cells by bringing a predetermined processing reagent into contact with the specimen. Based on a difference luminescence amount between a luminescence amount when the biological material luminescence reagent is reacted with the biological material and a luminescence amount when the biological material luminescence reagent is reacted with the predetermined treatment reagent. And a control unit for calculating the amount of the biological material of the cells contained in the specimen.
  • the present invention it is possible to provide a biological material quantification method and a biological material quantification apparatus capable of quantifying the biological material of cells contained in a specimen with higher accuracy and sensitivity than before.
  • FIG. 1 is a configuration explanatory diagram of a biological material quantification apparatus in an embodiment of the present invention. It is a flowchart which shows the outline of the biological material determination method in embodiment of this invention.
  • (A) And (b) is process explanatory drawing explaining the procedure of the biological material quantification method in embodiment of this invention according to a biological material quantification apparatus.
  • (A), (b) and (c) is process explanatory drawing explaining the procedure of the biological material quantification method in other embodiment of this invention according to a biological material quantification apparatus.
  • the biological material quantification method and the biological material quantification apparatus of the present embodiment include a light emission amount of a biological material contained in a cell such as a microorganism in a specimen, and a trace amount of biological substance contained in a treatment reagent used for pretreatment of the specimen.
  • the main feature is that a biological substance contained in a cell such as a microorganism in a sample is quantified based on a difference light emission amount from the light emission amount.
  • the biological material quantification apparatus 1 includes a plurality of elements described later, and includes a mechanism 4 for separating / recovering ATP contained in microorganisms in the liquid sample 8a (specimen) and a plurality of elements described later. And an ATP quantitative mechanism 3.
  • the separation / recovery mechanism 4 separates / recovers ATP (biological material) from microorganisms in the liquid sample 8a.
  • the separation / recovery mechanism 4 includes a recovery container 21 having a filter 26 therein, a filtration device 2 that evacuates the contents of the recovery container 21 through the filter 26, and a liquid for dispensing a predetermined amount of a reagent or the like.
  • the collection container 21 separates microorganisms contained in the liquid sample 8a put into the container, and extracts and collects ATP of the separated microorganisms. The separation of the microorganism from the liquid sample 8a and the extraction process of ATP from the microorganism will be described in detail later.
  • the collection container 21 is configured by providing a filter 26 at the bottom of a main body 25 formed in a funnel shape.
  • the filter 26 in the present embodiment is a two-layer stack of a hydrophilic filter and a hydrophobic filter.
  • a hydrophilic filter is disposed on the upper side of the double stack, and a hydrophobic filter is disposed on the lower side of the double stack.
  • the filter 26 configured as described above is configured to hold the liquid sample 8a charged in the main body 25 on the filter 26 unless suction is performed via the suction head 23 of the filtration device 2 described below. . Further, when suctioned by the suction head 23, the filter 26 leaves the microorganisms (not shown) in the liquid sample 8a on the filter 26 so that the liquid component can be discharged to the suction head 23 side through the filter 26. It has become.
  • the collection container 21 is detachably attached to a predetermined position of the processing stage 5 provided in the biological material quantification apparatus 1.
  • the filtration device 2 includes a collection container 21 that also constitutes the separation / recovery mechanism 4, a suction head 23, a lifting mechanism 22 that moves the suction head 23 up and down, and the contents of the collection container 21 through the suction head 23. And a suction pump 24 for evacuating the vacuum.
  • the suction head 23 can be moved up and down by the lifting mechanism 22, and when the contents of the collection container 21 are filtered by the filter 26, the lifting mechanism 22 raises the suction head 23 and sucks it.
  • the head 23 and the collection container 21 are connected.
  • the elevating mechanism 22 lowers the suction head 23 to disconnect the suction head 23 from the collection container 21.
  • the said suction pump 24 provided in the middle of the piping P1 extended from such a suction head 23 starts, as above-mentioned, the liquid component in the collection container 21 is the filter 26, the suction head 23. And, it is discharged through a suction pump 24 into a waste liquid storage tank (not shown) of the biological material determination apparatus 1.
  • the driving and stopping of the suction pump 24 and the driving and stopping of the lifting mechanism 22 are controlled by the suction pump control unit 34d and the lifting mechanism control unit 34e of the control unit 34.
  • the liquid dispensing device 31 includes a liquid dispensing nozzle 31 a, a dispensing pump 31 b that causes the liquid dispensing nozzle 31 a to suck or discharge a predetermined amount of liquid, and a liquid in the housing 7 of the biological material quantification device 1.
  • An actuator 31c for moving the dispensing nozzle 31a three-dimensionally, and an actuator control unit 34a and a flow rate control unit 34b of the control unit 34 are provided.
  • the liquid dispensing nozzle 31a of the liquid dispensing apparatus 31 applies a predetermined amount of the ATP extract 8d (see FIG. 3A) obtained in the collection container 21 in the step of measuring the ATP emission intensity described later.
  • the liquid dispensing nozzle 31a dispenses the ATP luminescent reagent 8b of the reagent holder 6 into the luminescent tube 32b.
  • the ATP luminescent reagent 8b corresponds to a “biological substance luminescent reagent” in the claims.
  • the liquid dispensing nozzle 31a dispenses the ATP extraction reagent 8c of the reagent holder 6 into the light emission tube 32b when measuring the amount of ATP contained in the ATP extraction reagent 8c described later as a processing reagent.
  • the liquid dispensing nozzle 31a dispenses the ATP luminescent reagent 8b of the reagent holder 6 into the luminescent tube 32b.
  • the three-dimensional movement of the liquid dispensing nozzle 31a is realized by predetermined control of the actuator 31c by the actuator control unit 34a. Further, the adjustment of the dispensing amount of the ATP luminescent reagent 8b, the ATP extraction reagent 8c, the ATP extract 8d (see FIG. 3A) described later, and the like is realized by predetermined control of the dispensing pump 31b by the flow rate control unit 34b. Is done.
  • the ATP quantification mechanism 3 includes a luminescence intensity measurement unit 32, a calculation unit 34f of a control unit 34 that quantifies ATP contained in microorganisms based on a detection signal of ATP luminescence intensity output from the luminescence intensity measurement unit 32, It is mainly prepared.
  • the luminescence intensity measurement unit 32 accepts the dispensed ATP extract 8d (see FIG. 3A) or the ATP extraction reagent 8c and the ATP luminescence reagent 8b to cause a luminescence reaction.
  • a tube 32b and a light detection unit main body 32a having a photomultiplier tube or the like for detecting the ATP emission intensity during these luminescence reactions are provided. Then, as described above, the light detection unit main body 32a outputs the detection signal of the ATP emission intensity in the light emission tube 32b to the calculation unit 34f of the control unit 34.
  • the light detection unit main body 32a generates a detection signal of “ATP emission intensity due to ATP in the ATP extract 8d” and a detection signal of “ATP emission intensity due to ATP in the ATP extraction reagent 8c (treatment reagent)”. Output each.
  • the “ATP emission intensity due to ATP in the ATP extract 8d” corresponds to the “amount of luminescence when the biological substance luminescent reagent is reacted with the biological substance separated and extracted from the cells” in the claims.
  • the “ATP emission intensity by ATP in the treatment reagent” corresponds to the “amount of luminescence when the biological substance luminescence reagent is reacted with the predetermined treatment reagent” in the claims.
  • the calculation unit 34f calculates and determines the amount of ATP contained in the microorganism in the liquid sample 8a based on the differential emission intensity. Note that the calculation procedure of the ATP amount of the calculation unit 34f will be described in detail later.
  • FIG. 2 is a flowchart showing an outline of the biological material quantification method in the embodiment of the present invention.
  • a collection container 21 is arranged on the processing stage 5, and then a liquid sample 8 a to be inspected is injected into the collection container 21, and then an activation switch (not shown) is turned on.
  • the control unit 34 executes the following procedure.
  • the elevating mechanism control unit 34 e of the control unit 34 outputs a command to the elevating mechanism 22 so as to raise the suction head 23 and connect it to the collection container 21.
  • the suction pump control unit 34d of the control unit 34 activates the suction pump 24
  • the suction head 23 starts filtering the contents (liquid sample 8a) of the collection container 21 (step S1 in FIG. 2).
  • step S1 microorganisms are collected on the filter 26, and the liquid component in the liquid sample 8a is discharged to the suction head 23 side.
  • most of the ATP present outside the cells of the microorganisms contained in the liquid component of the liquid sample 8a and substances that inhibit the subsequent ATP luminescence reaction are also discharged together with this liquid component.
  • a buffer solution is injected into the collection container 21 (step S2 in FIG. 2).
  • ATP-free sterilized warm water or the like is preferably used.
  • the suction pump control unit 34d of the control unit 34 starts the suction pump 24
  • the suction head 23 starts filtering the contents of the collection container 21 again (step S3 in FIG. 2).
  • the ATP elimination reagent is dispensed into the collection container 21 (step S4 in FIG. 2).
  • the ATP erasing reagent is arranged in the reagent holder 6 and is dispensed from the reagent holder 6 to the collection container 21 by the liquid dispensing nozzle 31a of the liquid dispensing apparatus 31 described above.
  • the ATP elimination reagent include ATP degrading enzyme.
  • the liquid dispensing nozzle 31a of the liquid dispensing apparatus 31 dispenses the ATP extraction reagent 8c into the collection container 21 under the control of the actuator control unit 34a and the flow rate control unit 34b (step S5 in FIG. 2). ).
  • the ATP extraction reagent 8c corresponds to a “treatment reagent” in the claims.
  • ATP extraction reagent 8c By dispensing the ATP extraction reagent 8c, ATP contained in the microorganism is extracted, and an ATP extract 8d (see FIG. 3A) is generated in the collection container 21. Further, the ATP elimination reagent dispensed into the collection container 21 in step S4 is deactivated by coming into contact with the ATP extraction reagent 8c.
  • a surfactant for example, a mixed solution of ethanol and ammonia, methanol, ethanol, trichloroacetic acid, perchloric acid, Tris buffer, and the like can be preferably used.
  • surfactants are desirable. Examples of such surfactants include sodium dodecyl sulfate, potassium lauryl sulfate, sodium monolauroyl phosphate, sodium alkylbenzenesulfonate, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, cetylpyridinium chloride, and cetyl bromide. Examples include trimethylammonium and myristyldimethylbenzylammonium chloride.
  • the liquid dispensing nozzle 31a of the liquid dispensing apparatus 31 is configured to control the ATP extract 8d in the collection container 21 to emit light from the light emission intensity measuring unit 32 under the control of the actuator controller 34a and the flow controller 34b. 32b (step S6 in FIG. 2).
  • the luminescence tube 32b luminescence is generated by a luminescence reaction between ATP in the ATP extract 8d and the ATP luminescence reagent 8b.
  • the liquid dispensing nozzle 31a dispenses the ATP luminescent reagent 8b disposed in the reagent holder 6 into the luminescent tube 32b under the control of the actuator control unit 34a and the flow rate control unit 34b (step of FIG. 2). S7).
  • the ATP luminescent reagent 8b include a luciferase / luciferin reagent.
  • the calculation unit 34f of the control unit 34 digitally processes the detection signal output by detecting the ATP emission intensity by the light detection unit main body 32a (see FIG. 1), and the emission intensity based on the single photon counting method. Is measured (step S8 in FIG. 2). This emission intensity corresponds to the “emission amount” in the claims as described above. The step S8 corresponds to a “first light emission amount measuring step” in the claims. Then, the control unit 34 temporarily stores the value (data) of the light emission intensity (the light emission amount measured in the first light emission amount measurement step) measured by the calculation unit 34f in a predetermined storage unit (not shown).
  • the light emission tube 32b of the light emission intensity measuring unit 32 is replaced with a new one.
  • the liquid dispensing nozzle 31a dispenses the ATP extraction reagent 8c (treatment reagent) arranged in the reagent holder 6 into the light emission tube 32b under the control of the actuator control unit 34a and the flow rate control unit 34b (FIG. 2). Step S9).
  • the liquid dispensing nozzle 31a dispenses the ATP luminescent reagent 8b disposed in the reagent holder 6 into the luminescent tube 32b under the control of the actuator control unit 34a and the flow rate control unit 34b (step S10 in FIG. 2). .
  • the light emission tube 32b light emission is caused by a light emission reaction between ATP in the ATP extraction reagent 8c (treatment reagent) and the ATP light emission reagent 8b.
  • the calculation unit 34f of the control unit 34 digitally processes the detection signal output by detecting the ATP emission intensity by the light detection unit main body 32a (see FIG. 1), and the emission intensity based on the single photon counting method. Is measured (step S11 in FIG. 2).
  • the step S11 corresponds to a “second light emission amount measuring step” in the claims.
  • the control unit 34 temporarily stores the value (data) of the light emission intensity (the light emission amount measured in the second light emission amount measurement step) measured by the calculation unit 34f in the storage unit.
  • the process “first light emission amount measurement process” in step S8 and the process “second light emission amount measurement process” in step S11 are always performed in pairs in the present embodiment.
  • the calculation unit 34f of the control unit 34 refers to the storage unit (not shown), the light emission intensity measured in step S8 (the light emission amount measured in the first light emission amount measurement step), and the step A differential light emission intensity of the light emission intensity measured in S11 (the light emission quantity measured in the second light emission quantity measurement step) is calculated (step S12 in FIG. 2).
  • control unit 34 calculates the ATP amount (amol) corresponding to the differential light emission intensity based on a calibration curve indicating the relationship between the ATP amount (amol) stored in advance and the light emission intensity (CPS). To do. That is, ATP in the liquid sample 8a (specimen) is quantified based on the differential emission intensity (step S13 in FIG. 2). By performing step S13, the predetermined steps of the series of biological material quantification methods according to the present embodiment are completed.
  • FIG. 3 to be referred to is a process explanatory diagram for explaining the procedure of the biological material quantification method in the present embodiment in accordance with the biological material quantification apparatus, and (a) shows the procedure from step S5 to step S7 in FIG.
  • FIG. 4B is a process diagram showing the procedure of steps S9 and S10 in FIG.
  • the ATP extraction reagent 8c is dispensed into the recovery container 21 (step S5 in FIG. 2), and an ATP extract 8d is generated in the recovery container 21.
  • ATP extract 8d ATP extracted from microorganisms in the liquid sample 8a (see FIG. 1) and ATP contained in the dispensed ATP extraction reagent 8c are mixed.
  • the ATP extract 8d in the collection container 21 is dispensed into the light emission tube 32b.
  • the luminescence tube 32b emits light with a luminescence intensity corresponding to the amount of ATP present. That is, the light detection unit main body 32a outputs a detection signal of ATP emission intensity corresponding to the total amount of ATP derived from the microorganism of the liquid sample 8a and ATP contained in the dispensed ATP extraction reagent 8c ( In FIG. 3A, (I) ATP emission intensity is indicated).
  • step S10 when the ATP extraction reagent 8c is dispensed into the luminescence tube 32b (step S9 in FIG. 2), and the ATP luminescence reagent 8b is dispensed into the luminescence tube 32b (FIG. 2).
  • step S10 the light emission tube 32b emits light with a light emission intensity corresponding to the amount of ATP contained in the dispensed ATP extraction reagent 8c. That is, a detection signal of ATP emission intensity corresponding to the amount of ATP contained in the dispensed ATP extraction reagent 8c is output from the light detection unit main body 32a ((II) ATP emission intensity in FIG. 3B). ).
  • step S12 shown in FIG. 2 the difference luminescence intensity, that is, the amount of ATP contained in the ATP extraction reagent 8c is subtracted to perform calibration measurement, and only the ATP derived from microorganisms in the liquid sample 8a Based on the ATP emission intensity is calculated.
  • step S13 shown in FIG. 2 ATP is quantified based on such differential emission intensity. Therefore, according to the biological material quantification apparatus 1 and the biological material quantification method of the present embodiment, the amount of ATP derived from microorganisms in the liquid sample 8a can be quantified with high accuracy and high sensitivity.
  • the ATP extraction reagent 8c dispensed into the collection container 21 in step S5, and the ATP extraction reagent 8c dispensed into the luminescence tube 32b in step S9. Since the same one is used, not only the concentration of the ATP extraction reagent 8c itself, but also the amount of ATP contained in the ATP extraction reagent 8c and the concentration of other unknown inclusions are the same. The same ATP luminescence reagent 8b is used.
  • the biological material quantification apparatus 1 and the biological material quantification method of the present embodiment do not cause a difference in the concentration of the processing reagent such as the ATP extraction reagent 8c and the ATP luminescence reagent 8b. Therefore, according to the biological material quantification apparatus 1 and the biological material quantification method of the present embodiment, the amount of ATP derived from microorganisms in the liquid sample 8a can be quantified with high accuracy and high sensitivity.
  • the control unit 34 determines the difference emission intensity based on the calibration curve indicating the relationship between the ATP amount (amol) stored in advance and the emission intensity (CPS).
  • the present invention is not limited to this, and every time ATP of one liquid sample 8a is quantified, the ATP amount (amol) and the luminescence are calculated. It can be set as the structure which calculates
  • 4 (a), 4 (b) and 4 (c) are process explanatory diagrams for explaining the procedure of the biological material quantification method according to another embodiment (modified example) of the present invention in accordance with the biological material quantification apparatus.
  • reference numeral 6 is a reagent holder
  • reference numeral 8d is an ATP extract
  • reference numeral 8e is an ATP standard reagent
  • reference numeral 21 is a collection container
  • reference numeral 32a is a light detection unit body
  • reference numeral 32b is for light emission. It is a tube.
  • an ATP standard reagent 8e having a known ATP content is separately prepared as shown in FIGS.
  • the ATP standard reagent 8e can be placed at a suitable position in the housing 7 (see FIG. 1) that can be accessed by the liquid dispensing nozzle 31a (see FIG. 1) of the liquid dispensing device 31 (see FIG. 1).
  • it can also be arranged in the reagent holder 6.
  • the procedure of the biological material quantification method shown in FIGS. 4 (a) and 4 (b) is the same as the procedure of the biological material quantification method shown in FIGS. 3 (a) and 3 (b). That is, from the light detection unit main body 32a shown in FIG. 4A, detection of ATP emission intensity corresponding to the total amount of ATP derived from microorganisms of the liquid sample 8a and ATP contained in the dispensed ATP extraction reagent 8c. A signal is output (referred to as (I) ATP emission intensity in FIG. 4A).
  • the detection signal of ATP emitted light intensity corresponding to the amount of ATP contained in the dispensed ATP extraction reagent 8c is output (in FIG.4 (b), (II) ATP emission intensity).
  • step S13 (see FIG. 2) of the embodiment, based on the calibration curve indicating the relationship between the ATP amount (amol) stored in advance by the control unit 34 and the emission intensity (CPS).
  • the ATP amount (amol) corresponding to the difference emission intensity is calculated.
  • an ATP prepared separately as shown in FIG.
  • the standard reagent 8e is dispensed into the luminescence tube 32b (step S ⁇ ), and the same ATP luminescence reagent 8b used in steps S7 and S10 is dispensed into the luminescence tube 32b (step S ⁇ ).
  • the dispensing process of these ATP luminescent reagent 8b and ATP standard reagent 8e is performed under the control of the actuator control unit 34a and the flow rate control unit 34b shown in FIG.
  • the luminescence tube 32b luminescence is generated by the luminescence reaction of the ATP luminescence reagent 8b according to the ATP amount of the dispensed ATP standard reagent 8e. That is, the ATP emission intensity corresponding to the known amount of ATP contained in the ATP standard reagent 8e is obtained from the light detection unit main body 32a by the ATP emission reagent 8b used in the procedure shown in FIGS. 4 (a) and 4 (b). A detection signal is output (referred to as (III) ATP emission intensity in FIG. 4C).
  • step S12 in the above embodiment, “(I) ATP emission intensity” and “(II) ATP emission intensity shown in FIGS. 4A and 4B, respectively. ”To calculate the difference light emission intensity. Then, ATP corresponding to the differential luminescence intensity is quantified based on “ATP luminescence intensity of a known ATP amount” actually measured by “use of the ATP luminescence reagent 8b”.
  • the ATP emission intensity by ATP in the processing reagent is measured after the ATP emission intensity by ATP in the ATP extract 8d is measured.
  • the present invention can be configured to measure the ATP emission intensity by ATP in the ATP extract 8d after measuring the ATP emission intensity by ATP in the processing reagent.
  • the biological material quantification apparatus 1 can be configured so that the measurement of the ATP emission intensity by ATP in the ATP extract 8d and the measurement of the ATP emission intensity by ATP in the processing reagent are performed in parallel.
  • the ATP extraction reagent 8c is assumed as the processing reagent in the embodiment, but in the present invention, the ATP elimination reagent can be included in the concept of the processing reagent.
  • the ATP elimination reagent is included in the concept of the processing reagent, the purpose is not to correct the ATP amount of the ATP elimination reagent but to correct the concentration error of the ATP elimination reagent.
  • ATP luminescent reagent 8b is dispensed with respect to the ATP extract 8d or ATP extraction reagent 8c (processing reagent) dispensed to the light emission tube 32b
  • luminescence reaction is performed.
  • the ATP luminescent reagent 8b dispensed in the luminescent tube 32b may be dispensed with the ATP extract 8d or the ATP extract reagent 8c (treatment reagent) to cause a luminescence reaction.
  • the ATP standard reagent 8e can be dispensed with respect to the ATP luminescence reagent 8b dispensed in the luminescence tube 32b.
  • microorganism in the embodiment examples include, for example, Corynebacterium, Micrococcus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, etc., Citrobacter, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Serratia, etc. Examples include, but are not limited to, gram-negative bacteria, Aspergillus, blue mold, Azuki fungus, fungi such as Candida.
  • spore-forming bacteria such as Bacillus subtilis
  • nutrient-type cell conversion reagents such as amino acids and sugars can be included in the aforementioned reagents.
  • Limulus can be used as the biological material luminescence reagent.
  • the liquid sample 8a can also be obtained by adding a buffer solution or the like in the state.
  • the gel-like carrier include those formed of a material that changes in phase from gel to sol when the temperature is raised from room temperature. This material is preferably liquefied at 30 ° C. or higher and lower than 40 ° C.
  • gelatin a mixture of gelatin and glycerol, and N-acryloylglycinamide and N-methacryloyl-N′-biotinylpropylenediamine 10:
  • One copolymer is more desirable.

Abstract

　本発明は、検体としての液状試料（８ａ）に含まれる細胞の生体物質（ＡＴＰ）を定量する生体物質定量装置（１）であって、液状試料（８ａ）に処理試薬としてのＡＴＰ抽出試薬（８ｃ）を接触させて液状試料（８ａ）に含まれる細胞から分離・抽出した生体物質（ＡＴＰ）に対し、生体物質発光試薬としてのＡＴＰ発光試薬（８ｂ）を反応させた際の発光量と、前記ＡＴＰ抽出試薬（８ｃ）に対し、前記ＡＴＰ発光試薬（８ｂ）を反応させた際の発光量と、の差分発光量に基づいて、液状試料（８ａ）に含まれる細胞の生体物質の量を演算する制御部（３４）を備えることを特徴とする。

Description

生体物質定量方法及び生体物質定量装置
　本発明は、検体に含まれる細胞の生体物質を定量する生体物質定量方法及び生体物質定量装置に関する。
　従来、検体中の微生物の定量方法（計数方法）としては、微生物から抽出したＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を定量することで微生物を間接的に計数する、いわゆるＡＴＰ測定法が知られている。このＡＴＰ測定法は、検体に含まれる微生物にＡＴＰ抽出試薬を接触させることで微生物に内在するＡＴＰを抽出し、このＡＴＰに発光試薬を反応させた際の発光量に応じて微生物を計数する方法である。
　このＡＴＰ測定法は、水の衛生管理にも利用され（例えば、特許文献１参照）、清涼飲料中の微生物の測定にも利用されている（例えば、特許文献２参照）。しかし、検体に含まれる微生物を計数する場合、検体の光透過性や色、ｐＨが、ＡＴＰの定量精度に影響を及ぼす問題点がある。その点、特許文献２の定量方法では、予め検体に所定の処理試薬を添加することで、検体中の定量阻害物質を除去するように構成されている。
特開２００５－１３８０１８号公報 特開２０１０－１１７５９号公報
　しかしながら、微生物に含まれるＡＴＰ量の測定に従来のＡＴＰ定量方法を適用すると、微生物に含まれるＡＴＰ量が極微量［ａｍｏｌ（１０－１８ｍｏｌ）レンジ］であることから精度よく高感度にＡＴＰの定量を行うことができない問題があった。また、検体の前処理に使用する処理試薬にも極微量なＡＴＰが含まれているため、従来のＡＴＰ定量方法では精度よく高感度にＡＴＰの定量を行うことができない問題があった。また、前記のようにＡＴＰ量の定量範囲がａｍｏｌレンジであるのに対してこれに対応するように処理試薬の濃度制御を行うことが従来のＡＴＰ定量方法では極めて困難であることから、精度よく高感度にＡＴＰの定量を行うことができない問題があった。
　そこで、本発明は、検体に含まれる細胞の生体物質を従来よりも精度よく高感度に定量することができる生体物質定量方法及び生体物質定量装置を提供することにある。
　前記課題を解決する生体物質定量方法は、検体に含まれる細胞の生体物質を定量する生体物質定量方法であって、前記検体に所定の処理試薬を接触させて前記細胞から分離・抽出した前記生体物質に対し、生体物質発光試薬を反応させた際の発光量を測定する第１の発光量測定工程と、この第１の発光量測定工程と対になって行われ、前記所定の処理試薬に対し、前記生体物質発光試薬を反応させた際の発光量を測定する第２の発光量測定工程と、前記第１の発光量測定工程で測定された発光量と、前記第２の発光量測定工程で測定された発光量との差分発光量に基づいて、前記検体に含まれる細胞の生体物質を定量する生体物質定量工程と、を有することを特徴とする。
　また、前記課題を解決する生体物質定量装置は、検体に含まれる細胞の生体物質を定量する生体物質定量装置であって、前記検体に所定の処理試薬を接触させて前記細胞から分離・抽出した前記生体物質に対し、生体物質発光試薬を反応させた際の発光量と、前記所定の処理試薬に対し、前記生体物質発光試薬を反応させた際の発光量と、の差分発光量に基づいて、前記検体に含まれる細胞の生体物質の量を演算する制御部を備えることを特徴とする。
　本発明によれば、検体に含まれる細胞の生体物質を従来よりも精度よく高感度に定量することができる生体物質定量方法及び生体物質定量装置を提供することができる。
本発明の実施形態における生体物質定量装置の構成説明図である。 本発明の実施形態における生体物質定量方法の概略を示すフローチャートである。 （ａ）及び（ｂ）は、本発明の実施形態における生体物質定量方法の手順を生体物質定量装置に即して説明する工程説明図である。 （ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、本発明の他の実施形態における生体物質定量方法の手順を生体物質定量装置に即して説明する工程説明図である。
　次に、本発明の実施形態について適宜図面を参照しながら詳細に説明する。
　本実施形態の生体物質定量方法及び生体物質定量装置は、検体中の微生物等の細胞に含まれる生体物質の発光量と、この検体の前処理に使用する処理試薬に含まれる微量の生体物質の発光量との差分発光量に基づいて、検体中の微生物等の細胞に含まれる生体物質の定量を行うことを主な特徴とする。
　以下では、検体中の微生物に含まれる生体物質であるＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を定量する生体物質定量装置について説明した後に、この生体物質定量装置の動作及び生体物質の定量原理について説明しながら本発明の生体物質定量方法について説明する。
＜生体物質定量装置＞
　図１に示すように、生体物質定量装置１は、後記する複数の要素からなり、液状試料８ａ（検体）中の微生物に含まれるＡＴＰの分離・回収機構４と、後記する複数の要素からなるＡＴＰの定量機構３と、を備えて構成されている。
（ＡＴＰの分離・回収機構）
　分離・回収機構４は、液状試料８ａ中の微生物からＡＴＰ（生体物質）を分離・回収するものである。
　分離・回収機構４は、フィルタ２６を内部に有する回収容器２１と、この回収容器２１の内容物を、フィルタ２６を介して真空引きする濾過装置２と、試薬等の所定量を分注する液分注装置３１と、を備えている。
　回収容器２１は、これに投入される液状試料８ａに含まれる微生物を分離し、この分離した微生物のＡＴＰを抽出して回収するものである。この液状試料８ａからの微生物の分離及びこの微生物からのＡＴＰの抽出工程については後に詳しく説明する。
　この回収容器２１は、ロート状に形成された本体２５の底部にフィルタ２６が設けられて構成されている。本実施形態でのフィルタ２６は、図示しないが、親水性フィルタと、疎水性フィルタの二枚重ねになっている。二枚重ねの上側には親水性フィルタが配置され、二枚重ねの下側には疎水性フィルタが配置されている。
　このように構成されたフィルタ２６は、次に説明する濾過装置２の吸引ヘッド２３を介して吸引しない限りは、本体２５に投入された液状試料８ａをフィルタ２６上に保持するようになっている。また、吸引ヘッド２３で吸引すると、フィルタ２６は、液状試料８ａのうち微生物（図示省略）をフィルタ２６上に残して、その液状成分を、フィルタ２６を介して吸引ヘッド２３側に排出できるようになっている。
　ちなみに、回収容器２１は、生体物質定量装置１内に設けられる処理ステージ５の所定の位置に着脱自在に取り付けられる。
　濾過装置２は、前記の分離・回収機構４をも構成する回収容器２１と、吸引ヘッド２３と、吸引ヘッド２３を上下移動させる昇降機構２２と、吸引ヘッド２３を介して回収容器２１の内容物を真空引きする吸引ポンプ２４と、を備えている。
　吸引ヘッド２３は、前記したように、昇降機構２２によって上下移動可能になっており、回収容器２１の内容物をフィルタ２６で濾過する場合には、昇降機構２２が吸引ヘッド２３を上昇させて吸引ヘッド２３と回収容器２１とを連結させる。また、回収容器２１を処理ステージ５に取り付け、又は処理ステージ５から取り外す際には、昇降機構２２は、吸引ヘッド２３を下降させて吸引ヘッド２３と回収容器２１との連結を解くこととなる。
　そして、このような吸引ヘッド２３から延出する配管Ｐ１の途中に設けられた前記吸引ポンプ２４が起動することで、前記したように、回収容器２１内の液状成分は、フィルタ２６、吸引ヘッド２３、及び吸引ポンプ２４を介して生体物質定量装置１の図示しない廃液貯留槽内に排出される。
　ちなみに、吸引ポンプ２４の駆動及び停止、並びに昇降機構２２の駆動及び停止は、制御部３４の吸引ポンプ制御部３４ｄ及び昇降機構制御部３４ｅによって制御される。
　液分注装置３１は、液分注ノズル３１ａと、この液分注ノズル３１ａに所定量の液体を吸引させ、又は排出させる分注ポンプ３１ｂと、生体物質定量装置１の筐体７内で液分注ノズル３１ａを三次元的に移動させるアクチュエータ３１ｃと、制御部３４のアクチュエータ制御部３４ａ及び流量制御部３４ｂと、を備えている。
　この液分注装置３１の液分注ノズル３１ａは、後記するＡＴＰ発光強度を測定する工程において、回収容器２１内に得られるＡＴＰ抽出液８ｄ（図３（ａ）参照）の所定量を、次に説明するＡＴＰの定量機構３の構成要素である発光強度測定ユニット３２の発光用チューブ３２ｂに分注する。また、液分注ノズル３１ａは、試薬ホルダ６のＡＴＰ発光試薬８ｂを発光用チューブ３２ｂに分注する。なお、このＡＴＰ発光試薬８ｂは、特許請求の範囲にいう「生体物質発光試薬」に相当する。
　液分注ノズル３１ａは、処理試薬としての後記するＡＴＰ抽出試薬８ｃに含まれるＡＴＰ量を測定する際には、試薬ホルダ６のＡＴＰ抽出試薬８ｃを発光用チューブ３２ｂに分注する。また、液分注ノズル３１ａは、試薬ホルダ６のＡＴＰ発光試薬８ｂを発光用チューブ３２ｂに分注する。
　なお、液分注ノズル３１ａの三次元的な移動は、アクチュエータ制御部３４ａによるアクチュエータ３１ｃの所定の制御によって実現される。また、ＡＴＰ発光試薬８ｂ、ＡＴＰ抽出試薬８ｃ、後記のＡＴＰ抽出液８ｄ（図３（ａ）参照）等の分注量の調節は、流量制御部３４ｂによる分注ポンプ３１ｂの所定の制御によって実現される。
（ＡＴＰの定量機構）
　ＡＴＰの定量機構３は、発光強度測定ユニット３２と、この発光強度測定ユニット３２から出力されるＡＴＰ発光強度の検出信号に基づいて微生物に含まれるＡＴＰを定量する制御部３４の演算部３４ｆと、を主に備えて構成されている。
　発光強度測定ユニット３２は、後に詳しく説明するように、分注されたＡＴＰ抽出液８ｄ（図３（ａ）参照）又はＡＴＰ抽出試薬８ｃと、ＡＴＰ発光試薬８ｂとを受け入れて発光反応させる発光用チューブ３２ｂと、これらの発光反応時のＡＴＰ発光強度を検出する光電子増倍管等を有する光検出部本体３２ａとを備えている。
　そして、光検出部本体３２ａは、前記したように、発光用チューブ３２ｂにおけるＡＴＰ発光強度の検出信号を制御部３４の演算部３４ｆに出力する。つまり、光検出部本体３２ａは、「ＡＴＰ抽出液８ｄ中のＡＴＰによるＡＴＰ発光強度」の検出信号と、「ＡＴＰ抽出試薬８ｃ（処理試薬）中のＡＴＰによるＡＴＰ発光強度」の検出信号と、をそれぞれ出力する。
　なお、「ＡＴＰ抽出液８ｄ中のＡＴＰによるＡＴＰ発光強度」は、特許請求の範囲にいう「細胞から分離・抽出した生体物質に対し、生体物質発光試薬を反応させた際の発光量」に相当する。また、「処理試薬中のＡＴＰによるＡＴＰ発光強度」は、特許請求の範囲にいう「所定の処理試薬に対し、生体物質発光試薬を反応させた際の発光量」に相当する。
　演算部３４ｆは、光検出部本体３２ａから出力される「ＡＴＰ抽出液８ｄ中のＡＴＰによるＡＴＰ発光強度」の検出信号と、「処理試薬中のＡＴＰによるＡＴＰ発光強度」の検出信号とに基づいて、それぞれのＡＴＰ発光強度同士の差分発光強度を演算する。なお、この差分発光強度は、特許請求の範囲にいう「差分発光量」に相当する。
　また、演算部３４ｆは、この差分発光強度に基づいて、液状試料８ａ中の微生物に含まれるＡＴＰの量を演算して求める。なお、この演算部３４ｆのＡＴＰの量の演算手順については、後に詳しく説明する。
＜生体物質定量装置の動作及び生体物質の定量原理＞
　次に、生体物質定量装置１の動作及び生体物質の定量原理について説明しながら本発明の生体物質定量方法について説明する。ここでは図１及び図２を参照しながら説明する。図２は、本発明の実施形態における生体物質定量方法の概略を示すフローチャートである。
　図１に示す生体物質定量装置１では、回収容器２１が処理ステージ５に配置され、次いでこの回収容器２１に検査対象となる液状試料８ａが注入された後、図示しない起動スイッチがオンにされることで制御部３４が次の手順を実行する。
　制御部３４の昇降機構制御部３４ｅは、吸引ヘッド２３を上昇させて回収容器２１と連結させるように昇降機構２２に指令を出力する。
　次に、制御部３４の吸引ポンプ制御部３４ｄが吸引ポンプ２４を起動することで、吸引ヘッド２３は、回収容器２１の内容物（液状試料８ａ）の濾過を開始する（図２のステップＳ１）。このステップＳ１の濾過の工程によって、フィルタ２６上に微生物が回収されると共に、液状試料８ａ中の液体成分は、吸引ヘッド２３側に排出される。この際、液状試料８ａの液体成分に含まれる微生物の細胞外に存在するＡＴＰの大部分、及び後のＡＴＰの発光反応を阻害する物質もこの液体成分と共に排出される。
　次に、回収容器２１の内容物の濾過が完了した後、回収容器２１内にバッファ液が注入される（図２のステップＳ２）。
　このバッファ液としては、ＡＴＰフリーの滅菌温水等が好適に使用される。
　そして、制御部３４の吸引ポンプ制御部３４ｄが吸引ポンプ２４を起動することで、吸引ヘッド２３は、回収容器２１の内容物の濾過を再び開始する（図２のステップＳ３）。
　次のステップＳ４では、回収容器２１内にＡＴＰ消去試薬が分注される（図２のステップＳ４）。
　ちなみに、ＡＴＰ消去試薬は、試薬ホルダ６に配置されており、前記の液分注装置３１の液分注ノズル３１ａによって、試薬ホルダ６から回収容器２１に分注される。
　このＡＴＰ消去試薬の分注によって、微生物の細胞外に存在するＡＴＰは、より確実に消去される。
　このＡＴＰ消去試薬としては、例えば、ＡＴＰ分解酵素が挙げられる。
　また、この液分注装置３１の液分注ノズル３１ａは、前記のアクチュエータ制御部３４ａ及び流量制御部３４ｂによる制御で、回収容器２１内にＡＴＰ抽出試薬８ｃを分注する（図２のステップＳ５）。なお、このＡＴＰ抽出試薬８ｃは、特許請求の範囲にいう「処理試薬」に相当する。
　このＡＴＰ抽出試薬８ｃの分注によって、微生物に含まれるＡＴＰが抽出されて回収容器２１内にＡＴＰ抽出液８ｄ（図３（ａ）参照）が生成する。また、ステップＳ４で回収容器２１内に分注されたＡＴＰ消去試薬は、このＡＴＰ抽出試薬８ｃと接触することによって失活する。
　このＡＴＰ抽出試薬８ｃとしては、例えば、界面活性剤、エタノールとアンモニアの混合液、メタノール、エタノール、トリクロロ酢酸、過塩素酸、トリス緩衝液等を好適に使用することができる。中でも界面活性剤が望ましく、この界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸カリウム、モノラウロイルリン酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ミリスチルジメチルベンジルアンモニウム等が挙げられる。
　また、この液分注装置３１の液分注ノズル３１ａは、前記のアクチュエータ制御部３４ａ及び流量制御部３４ｂによる制御で、回収容器２１内のＡＴＰ抽出液８ｄを発光強度測定ユニット３２の発光用チューブ３２ｂに分注する（図２のステップＳ６）。
　これにより、発光用チューブ３２ｂ内ではＡＴＰ抽出液８ｄ中のＡＴＰと、ＡＴＰ発光試薬８ｂとの発光反応によって発光が生じる。
　また、液分注ノズル３１ａは、前記のアクチュエータ制御部３４ａ及び流量制御部３４ｂによる制御で、試薬ホルダ６に配置されているＡＴＰ発光試薬８ｂを発光用チューブ３２ｂに分注する（図２のステップＳ７）。
　このＡＴＰ発光試薬８ｂとしては、例えば、ルシフェラーゼ・ルシフェリン試薬が挙げられる。
　次に、制御部３４の演算部３４ｆは、光検出部本体３２ａ（図１参照）がＡＴＰの発光強度を検出して出力した検出信号をデジタル処理し、単一光子計数法に基づいて発光強度を測定する（図２のステップＳ８）。なお、この発光強度は、前記のとおり特許請求の範囲にいう「発光量」に相当する。また、このステップＳ８の工程は、特許請求の範囲にいう「第１の発光量測定工程」に相当する。
　そして、制御部３４は、演算部３４ｆで測定したこの発光強度（第１の発光量測定工程で測定された発光量）の値（データ）を、図示しない所定の記憶部に一旦格納する。
　次に、発光強度測定ユニット３２の発光用チューブ３２ｂは新たなものと取り替えられる。そして、液分注ノズル３１ａは、アクチュエータ制御部３４ａ及び流量制御部３４ｂの制御によって、試薬ホルダ６に配置されているＡＴＰ抽出試薬８ｃ（処理試薬）を発光用チューブ３２ｂに分注する（図２のステップＳ９）。
　また、液分注ノズル３１ａは、アクチュエータ制御部３４ａ及び流量制御部３４ｂの制御によって、試薬ホルダ６に配置されているＡＴＰ発光試薬８ｂを発光用チューブ３２ｂに分注する（図２のステップＳ１０）。
　これにより、発光用チューブ３２ｂ内では、ＡＴＰ抽出試薬８ｃ（処理試薬）中のＡＴＰと、ＡＴＰ発光試薬８ｂとの発光反応によって発光が生じる。
　次に、制御部３４の演算部３４ｆは、光検出部本体３２ａ（図１参照）がＡＴＰの発光強度を検出して出力した検出信号をデジタル処理し、単一光子計数法に基づいて発光強度を測定する（図２のステップＳ１１）。なお、このステップＳ１１の工程は、特許請求の範囲にいう「第２の発光量測定工程」に相当する。
　そして、制御部３４は、演算部３４ｆで測定したこの発光強度（第２の発光量測定工程で測定された発光量）の値（データ）を、前記の記憶部に一旦格納する。
　ちなみに、本実施形態におけるこのようなステップＳ８の工程「第１の発光量測定工程」と、ステップＳ１１の工程「第２の発光量測定工程」とは、常に対で行われる。
　次に、制御部３４の演算部３４ｆは、前記の記憶部（図示省略）を参照して、ステップＳ８で測定した発光強度（第１の発光量測定工程で測定された発光量）と、ステップＳ１１で測定した発光強度（第２の発光量測定工程で測定された発光量）の差分発光強度を演算する（図２のステップＳ１２）。
　そして、制御部３４は、予め記憶しているＡＴＰ量（ａｍｏｌ）と、発光強度（ＣＰＳ）との関係を示す検量線に基づいて、前記の差分発光強度に対応するＡＴＰ量（ａｍｏｌ）を演算する。つまり、差分発光強度に基づいて液状試料８ａ（検体）中のＡＴＰが定量される（図２のステップＳ１３）。このステップＳ１３が行われることで、本実施形態に係る一連の生体物質定量方法の所定の工程が終了する。
　以上のような本実施形態に係る生体物質定量装置１及び生体物質定量方法によれば、次のような作用効果を奏することができる。次に参照する図３は、本実施形態における生体物質定量方法の手順を生体物質定量装置に即して説明する工程説明図であり、（ａ）は、図２のステップＳ５からステップＳ７の手順を示す工程図、（ｂ）は、図２のステップＳ９及びステップＳ１０の手順を示す工程図である。
　図３（ａ）に示すように、回収容器２１内にＡＴＰ抽出試薬８ｃが分注され（図２のステップＳ５）、回収容器２１内にはＡＴＰ抽出液８ｄが生成される。このＡＴＰ抽出液８ｄには、液状試料８ａ（図１参照）中の微生物から抽出されたＡＴＰと、分注したＡＴＰ抽出試薬８ｃに含まれているＡＴＰとが混在している。
　次のステップＳ６では、回収容器２１のＡＴＰ抽出液８ｄが、発光用チューブ３２ｂに分注される。
　次いで、ＡＴＰ発光試薬８ｂがこの発光用チューブ３２ｂに分注されると（図２のステップＳ７）、発光用チューブ３２ｂでは、存在するＡＴＰ量に応じた発光強度で発光が生じる。つまり、光検出部本体３２ａからは、液状試料８ａの微生物由来のＡＴＰと、分注されたＡＴＰ抽出試薬８ｃに含まれるＡＴＰとの合計量に対応するＡＴＰ発光強度の検出信号が出力される（図３（ａ）中、（Ｉ）ＡＴＰ発光強度と記す）。
　図３（ｂ）に示すように、ＡＴＰ抽出試薬８ｃが発光用チューブ３２ｂに分注され（図２のステップＳ９）、ＡＴＰ発光試薬８ｂがこの発光用チューブ３２ｂに分注されると（図２のステップＳ１０）、発光用チューブ３２ｂでは、分注されたＡＴＰ抽出試薬８ｃに含まれるＡＴＰ量に応じた発光強度で発光が生じる。つまり、光検出部本体３２ａからは、分注されたＡＴＰ抽出試薬８ｃに含まれるＡＴＰ量に対応するＡＴＰ発光強度の検出信号が出力される（図３（ｂ）中、（II）ＡＴＰ発光強度と記す）。
　そして、前記したように、図２に示すステップＳ１２では差分発光強度、つまりＡＴＰ抽出試薬８ｃに含まれるＡＴＰ量が差し引かれることでキャリブレーション測定が実施され、液状試料８ａの微生物由来のＡＴＰのみに基づいたＡＴＰ発光強度が演算される。また、図２に示すステップＳ１３では、このような差分発光強度に基づいてＡＴＰが定量される。よって、本実施形態の生体物質定量装置１及び生体物質定量方法によれば、液状試料８ａの微生物由来のＡＴＰ量を精度よく高感度に定量することができる。
　また、図３（ａ）及び（ｂ）に示すように、ステップＳ５で回収容器２１に分注されるＡＴＰ抽出試薬８ｃと、ステップＳ９で発光用チューブ３２ｂに分注されるＡＴＰ抽出試薬８ｃとは同じものが使用されるので、ＡＴＰ抽出試薬８ｃ自体の濃度は勿論のこと、ＡＴＰ抽出試薬８ｃに含まれるＡＴＰ量、その他の不知の介在物の濃度についても同じ量となっている。また、ＡＴＰ発光試薬８ｂについても、同じものが使用される。
　したがって、本実施形態の生体物質定量装置１及び生体物質定量方法では、従来の定量方法と異なって、ＡＴＰ抽出試薬８ｃ等の処理試薬や、ＡＴＰ発光試薬８ｂの濃度に差が生じることがない。よって、本実施形態の生体物質定量装置１及び生体物質定量方法によれば、液状試料８ａの微生物由来のＡＴＰ量を精度よく高感度に定量することができる。
　以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は前記実施形態に限定されず、種々の形態で実施することができる。
　前記実施形態では、図２のステップＳ１３において、制御部３４は、予め記憶しているＡＴＰ量（ａｍｏｌ）と、発光強度（ＣＰＳ）との関係を示す検量線に基づいて、前記の差分発光強度に対応するＡＴＰ量（ａｍｏｌ）を演算するように構成されているが、本発明はこれに限定されず、1つの液状試料８ａのＡＴＰの定量を行うたびに、ＡＴＰ量（ａｍｏｌ）と、発光強度（ＣＰＳ）との関係を求める構成とすることができる。
　図４（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、本発明の他の実施形態（変形例）における生体物質定量方法の手順を生体物質定量装置に即して説明する工程説明図である。
　図４（ａ）から（ｃ）中、符号６は試薬ホルダ、符号８ｄはＡＴＰ抽出液、符号８ｅはＡＴＰ標準試薬、符号２１は回収容器、符号３２ａは光検出部本体、符号３２ｂは発光用チューブである。
　この「他の実施形態（変形例）」における生体物質定量方法では、図４（ａ）から（ｃ）に示すように、ＡＴＰの含有量が既知のＡＴＰ標準試薬８ｅが別途用意される。このＡＴＰ標準試薬８ｅは、液分注装置３１（図１参照）の液分注ノズル３１ａ（図１参照）でアクセス可能な、筐体７（図１参照）内の適所に配置することができ、勿論試薬ホルダ６に配置することもできる。
　図４（ａ）及び（ｂ）に示す生体物質定量方法の手順は、図３（ａ）及び（ｂ）に示す生体物質定量方法の手順と同じである。つまり、図４（ａ）に示す光検出部本体３２ａからは、液状試料８ａの微生物由来のＡＴＰと、分注したＡＴＰ抽出試薬８ｃに含まれるＡＴＰとの合計量に対応するＡＴＰ発光強度の検出信号が出力される（図４（ａ）中、（Ｉ）ＡＴＰ発光強度と記す）。また、図４（ｂ）に示す光検出部本体３２ａからは、分注したＡＴＰ抽出試薬８ｃに含まれるＡＴＰ量に対応するＡＴＰ発光強度の検出信号が出力される（図４（ｂ）中、（II）ＡＴＰ発光強度と記す）。
　一方、前記したように、実施形態のステップＳ１３（図２参照）では、制御部３４が予め記憶しているＡＴＰ量（ａｍｏｌ）と、発光強度（ＣＰＳ）との関係を示す検量線に基づいて差分発光強度に対応するＡＴＰ量（ａｍｏｌ）を演算する。
　これに対して、この変形例においては、図４（ａ）及び（ｂ）に示す生体物質定量方法の手順が行われた後、図４（ｃ）に示すように、別途用意された、ＡＴＰ標準試薬８ｅが発光用チューブ３２ｂに分注され（ステップＳα）、ステップＳ７及びステップＳ１０で使用されるものと同じＡＴＰ発光試薬８ｂが発光用チューブ３２ｂに分注される（ステップＳβ）。ちなみに、これらのＡＴＰ発光試薬８ｂ及びＡＴＰ標準試薬８ｅの分注工程は、図１に示すアクチュエータ制御部３４ａ及び流量制御部３４ｂの制御によって行われる。
　これにより、発光用チューブ３２ｂでは、分注したＡＴＰ標準試薬８ｅのＡＴＰ量に応じたＡＴＰ発光試薬８ｂの発光反応によって発光が生じる。つまり、光検出部本体３２ａからは、図４（ａ）及び（ｂ）に示す手順で使用されたＡＴＰ発光試薬８ｂによって、ＡＴＰ標準試薬８ｅに含まれる既知のＡＴＰ量に対応するＡＴＰ発光強度の検出信号が出力される（図４（ｃ）中、（III）ＡＴＰ発光強度と記す）。
　この変形例においては、前記実施形態でのステップＳ１２（図２参照）と同様に、図４（ａ）及び（ｂ）にそれぞれ示す「（Ｉ）ＡＴＰ発光強度」及び「（II）ＡＴＰ発光強度」に基づいて差分発光強度が演算される。そして「前記のＡＴＰ発光試薬８ｂの使用」により実測される「既知のＡＴＰ量のＡＴＰ発光強度」に基づいて、当該差分発光強度に対応するＡＴＰが定量される。
　このような変形例によれば、「微生物中のＡＴＰの定量に使用されたものと同じＡＴＰ発光試薬８ｂの使用」により実測される「既知のＡＴＰ量のＡＴＰ発光強度」に基づいて、当該差分発光強度に対応するＡＴＰが定量されるので、より一層精度よく高感度に液状試料８ａの微生物由来のＡＴＰ量を定量することができる。
　また、前記実施形態及び前記「他の実施形態（変形例）」では、ＡＴＰ抽出液８ｄ中のＡＴＰによるＡＴＰ発光強度を測定した後に、処理試薬中のＡＴＰによるＡＴＰ発光強度を測定するように構成されているが、本発明は処理試薬中のＡＴＰによるＡＴＰ発光強度を測定した後に、ＡＴＰ抽出液８ｄ中のＡＴＰによるＡＴＰ発光強度を測定する構成とすることができる。
　また、ＡＴＰ抽出液８ｄ中のＡＴＰによるＡＴＰ発光強度の測定と、処理試薬中のＡＴＰによるＡＴＰ発光強度の測定とが並行して行われるように生体物質定量装置１を構成することもできる。
　また、前記実施形態での処理試薬は、前記したように、ＡＴＰ抽出試薬８ｃを想定しているが、本発明ではＡＴＰ消去試薬を処理試薬の概念に含めることができる。このＡＴＰ消去試薬を処理試薬の概念に含める場合には、これのＡＴＰ量を補正するものではなく、ＡＴＰ消去試薬の濃度誤差を補正することがその目的とされる。
　また、前記実施形態では、発光用チューブ３２ｂに分注したＡＴＰ抽出液８ｄ又はＡＴＰ抽出試薬８ｃ（処理試薬）に対して、ＡＴＰ発光試薬８ｂを分注して発光反応を行わせているが、本発明は発光用チューブ３２ｂに分注したＡＴＰ発光試薬８ｂに対して、ＡＴＰ抽出液８ｄ又はＡＴＰ抽出試薬８ｃ（処理試薬）を分注して発光反応を行わせる構成とすることもできる。
　また、前記「他の実施形態（変形例）」では、発光用チューブ３２ｂに分注したＡＴＰ発光試薬８ｂに対して、ＡＴＰ標準試薬８ｅを分注する構成とすることもできる。
　前記実施形態での微生物としては、例えば、コリネバクテリウム、ミクロコッカス、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、セレウス菌、枯草菌等のグラム陽性菌、シトロバクター、大腸菌、緑膿菌、セラチア菌等のグラム陰性菌、コウジカビ、アオカビ、アズキイロカビ、カンジタ菌等の真菌等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
　なお、本発明は、枯草菌等の芽胞形成菌に適用する場合には、前記した試薬にアミノ酸、糖等の栄養形細胞変換試薬を含めることができる。
　また、生体物質としてグラム陰性菌の細胞膜に含まれるエンドトキシンを定量する場合には、生体物質発光試薬としては、リムルスを使用することができる。
　また、前記実施形態では、液状試料８ａ中の生体物質の定量を想定しているが、例えば、空気中を浮遊する微生物をゲル状担体で捕集した後、これを回収容器２１内に配置した状態でバッファ液等を加えて液状試料８ａとすることもできる。
　ちなみに、ゲル状担体としては、例えば、常温から昇温することでゲルからゾルに相変化する材料で形成されるものが挙げられる。この材料としては、３０℃以上、４０℃未満で液化するものが望ましく、中でも、ゼラチン、ゼラチンとグリセロールの混合物、及びＮ－アクリロイルグリシンアミドとＮ－メタクリロイル－Ｎ´－ビオチニルプロピレンジアミンとの１０：１のコポリマーがさらに望ましい。
　１　　　生体物質定量装置
　２　　　濾過装置
　４　　　回収機構
　３　　　定量機構
　６　　　試薬ホルダ
　８ａ　　液状試料（検体）
　８ｂ　　ＡＴＰ発光試薬（生体物質発光試薬）
　８ｃ　　ＡＴＰ抽出試薬（処理試薬）
　８ｄ　　ＡＴＰ抽出液
　８ｅ　　ＡＴＰ標準試薬（生体物質標準試薬）
　２１　　回収容器
　２２　　昇降機構
　２３　　吸引ヘッド
　２４　　吸引ポンプ
　２６　　フィルタ
　３１　　液分注装置
　３１ａ　液分注ノズル
　３１ｂ　分注ポンプ
　３１ｃ　アクチュエータ
　３２　　発光強度測定ユニット
　３２ｂ　発光用チューブ
　３４　　制御部
　３４ａ　アクチュエータ制御部
　３４ｂ　流量制御部
　３４ｄ　吸引ポンプ制御部
　３４ｅ　昇降機構制御部
　３４ｆ　演算部

Claims (3)

  1. 　検体に含まれる細胞の生体物質を定量する生体物質定量方法であって、
    　前記検体に所定の処理試薬を接触させて前記細胞から分離・抽出した前記生体物質に対し、生体物質発光試薬を反応させた際の発光量を測定する第１の発光量測定工程と、
    　この第１の発光量測定工程と対になって行われ、前記所定の処理試薬に対し、前記生体物質発光試薬を反応させた際の発光量を測定する第２の発光量測定工程と、
    　前記第１の発光量測定工程で測定された発光量と、前記第２の発光量測定工程で測定された発光量との差分発光量に基づいて、前記検体に含まれる細胞の生体物質を定量する生体物質定量工程と、
    を有することを特徴とする生体物質定量方法。
  2. 　請求項１に記載の生体物質定量方法において、
    　前記第１の発光量測定工程及び前記第２の発光量測定工程で使用される前記生体物質発光試薬は互いに同じロットに属するものであり、
    　前記生体物質定量工程での前記差分発光量に基づく前記生体物質の定量は、前記生体物質の含有量が既知の生体物質標準試薬に対し、前記第１の発光量測定工程及び前記第２の発光量測定工程で使用される前記生体物質発光試薬と、互いに同じロットに属する前記生体物質発光試薬を反応させた際の発光量の実測値を基準に演算されることを特徴とする生体物質定量方法。
  3. 　検体に含まれる細胞の生体物質を定量する生体物質定量装置であって、
    　前記検体に所定の処理試薬を接触させて前記細胞から分離・抽出した前記生体物質に対し、生体物質発光試薬を反応させた際の発光量と、前記所定の処理試薬に対し、前記生体物質発光試薬を反応させた際の発光量と、の差分発光量に基づいて、前記検体に含まれる細胞の生体物質の量を演算する制御部を備えることを特徴とする生体物質定量装置。
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