JP2013005765A

JP2013005765A - 液体中のａｔｐ測定方法

Info

Publication number: JP2013005765A
Application number: JP2011141142A
Authority: JP
Inventors: Yuta Nakatsuka; 裕太中塚; Noe Miyashita; 野恵宮下; Shuichi Mori; 修一森
Original assignee: Hitachi Plant Technologies Ltd
Current assignee: Hitachi Plant Technologies Ltd
Priority date: 2011-06-24
Filing date: 2011-06-24
Publication date: 2013-01-10

Abstract

【課題】本発明は、液体成分が持つ透過性や色やｐＨといった固有値を補正して、ＡＴＰを測定するＡＴＰ測定方法を提供することを課題とする。
【解決手段】本発明のＡＴＰ測定方法は、液体である試料中のＡＴＰ量を測定する方法であって、前記試料中に含まれる微生物の細胞外に存在するＡＴＰを消去（Ｓ１０２）した後、前記試料中に含まれる微生物の細胞内に存在するＡＴＰを抽出する（Ｓ１０３）工程と、既知量のＡＴＰを含むＡＴＰ標準液を所定の比率で添加した後、発光試薬を添加し、第一の発光量を測定する（Ｓ１０４）工程と、前記ＡＴＰ標準液よりもＡＴＰ量が少ないブランク液を所定の比率で添加した後、発光試薬を添加し、第二の発光量を測定する（Ｓ１０５）工程と、前記第一の発光量および前記第二の発光量に基づいて、前記試料中のＡＴＰ量を算出する（Ｓ１０６）工程と、を含むことを特徴とする。
【選択図】図１

Description

本発明は、液体中のＡＴＰ測定方法に関する。

従来、サンプル中の微生物の計数方法としては、微生物から抽出したＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を定量することで微生物を間接的に計数する、いわゆるＡＴＰ測定法が知られている。このＡＰＴ測定法は、サンプルに含まれる微生物にＡＴＰ抽出試薬を接触させることで微生物に内在するＡＴＰを抽出し、このＡＴＰに発光試薬を反応させた際の発光量に応じて微生物を計数する方法である。

このＡＴＰ測定法は、水の衛生管理にも利用され（例えば、特許文献１参照）、茶系飲料中の微生物の測定にも利用されている（例えば、特許文献２参照）。しかし、液体中の微生物を計数する場合、液体成分が持つ（原料由来の）透過性や色やｐＨ（potential Hydrogen、power of Hydrogen）が、ＡＴＰの測定に影響を与える（阻害する）ため、正確に測定できないという問題点があった。
そこで、特許文献２には、茶系飲料と特定の緩衝液を混合し処理することで、微生物を破壊することなく茶系飲料中の原料由来ＡＴＰを抽出、遊離させ、後のＡＴＰ消去剤との反応によるＡＴＰ消去工程の効率を高めるだけでなく、化学発光を低減し、茶系飲料中の微生物由来ＡＴＰを測定する方法が開示されている。

特開２００５−１３８０１８号公報特開２０１０−１１７５９号公報

特許文献２おいて開示される測定方法は、アルカリ性の緩衝液であるＡＴＰ消去前処理試薬によって、茶系飲料中成分に含まれる没食子酸やポリフェノール化学発光を生じさせることにより、後の工程で化学発光を生じにくくさせている（段落００２０）。しかしながら、このＡＴＰ消去前処理試薬と反応しない成分が含まれていた場合、バックグランド発光を十分に低減することはできない。

そこで、本発明は、液体成分が持つ透過性や色やｐＨといった固有値を補正して、ＡＴＰを測定するＡＴＰ測定方法を提供することを課題とする。

本発明のＡＴＰ測定方法は、液体である試料中のＡＴＰ量を測定する方法であって、前記試料に、ＡＴＰ消去試薬を添加して前記試料中に含まれる微生物の細胞外に存在するＡＴＰを消去した後、ＡＴＰ抽出試薬を添加して前記試料中に含まれる微生物の細胞内に存在するＡＴＰを抽出する工程と、前記ＡＴＰ消去試薬および前記ＡＴＰ抽出試薬を添加した試料へ、既知量のＡＴＰを含むＡＴＰ標準液を所定の比率で添加した後、発光試薬を添加し、第一の発光量を測定する工程と、前記ＡＴＰ消去試薬および前記ＡＴＰ抽出試薬を添加した試料へ、前記ＡＴＰ標準液よりもＡＴＰ量が少ないブランク液を前記所定の比率で添加した後、発光試薬を添加し、第二の発光量を測定する工程と、前記第一の発光量および前記第二の発光量に基づいて、前記試料中のＡＴＰ量を算出する工程と、を含むことを特徴とする。

本発明によれば、液体成分が持つ透過性や色やｐＨといった固有値を補正して、ＡＴＰを測定するＡＴＰ測定方法を提供することが可能になる。

本実施形態に係るＡＴＰ測定方法を説明するフローチャートである。発光量とＡＴＰ量との相関関係を説明する図である。換算係数Ｂを算出する手順を説明する図である。測定の妥当性評価について説明する図である。

以降、本発明を実施するための形態（「本実施形態」と呼ぶ）を、図等を参照しながら詳細に説明する。また、本実施形態を説明するための全図において、同一部には原則として同一の符号を付し、その繰り返しの説明は省略する。

図１および図２を参照して、ＡＴＰ測定方法を説明する。ここでは、サンプル液（試料）として、例えば、飲料（緑茶や烏龍茶や紅茶等の茶系飲料、清涼飲料等）や医薬品（点滴液、注射液等）を想定して説明する。

（ＡＴＰ標準液の発光量測定）
まず、既知量のＡＴＰを含む溶液（以下、ＡＴＰ標準液という）を調製する。そして、調製したＡＴＰ標準液に発光試薬を添加し、発光量を測定する（図１のＳ１０１）。発光試薬としては、例えば、ルシフェラーゼ・ルシフェリン試薬が挙げられる。なお、ＡＴＰ標準液は、測定を阻害する物質等が含まれていないものとする。

この発光量は、ＡＴＰ量と相関関係があることは公知である。発光量とＡＴＰ量との相関関係を、図２に示す。図２（ａ）は、ＡＴＰ標準液のＡＴＰ量をｓとし、発光量をＳとすることを示す。図２（ｂ）の縦軸は発光量を、横軸はＡＴＰ量を示す。前記のように、ＡＴＰ標準液に含まれるＡＴＰ量は既知であるため、横軸の位置（ｓ）が特定できる。そして、図１のＳ１０１において測定したＡＴＰ標準液の発光量（Ｓ）を縦軸にとると、図２（ｂ）に示す「●」の位置が特定できる。この「●」から、検量線（１）を特定することができる。なお、この検量線（１）の傾きＡを、換算係数Ａと呼ぶ。この換算係数Ａは、発光量からＡＴＰ量を求めるための係数である。

（サンプル液中の阻害物質消去）
次に、サンプルとなる液体にＡＴＰ消去試薬を添加し、溶液１を調整する。ＡＴＰ消去試薬としては、例えば、アピラーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ、及び、アデノシントリホスファターゼ、アデノシンリン酸デアミナーゼからなる群より選ばれる少なくとも一種が用いられる。このように、サンプル液にＡＴＰ消去試薬を添加することで、サンプル液中に含まれる微生物の細胞外に存在するＡＴＰ（阻害物質）が消去される（Ｓ１０２）。そして、阻害物質を消去することで、微生物の細胞内に存在するＡＴＰの測定が可能となる。

（サンプル液中のＡＴＰ抽出）
次に、溶液１にＡＴＰ抽出試薬を添加し、溶液２を調整する。ＡＴＰ抽出試薬としては、例えば、界面活性剤、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、トリス緩衝液、エタノール、プロテアーゼ活性を有する溶菌酵素等を含むものが使用される。このように、溶液１にＡＴＰ抽出試薬を添加することで、溶液１（サンプル液）中に含まれる微生物の細胞膜が溶解され、内在するＡＴＰが抽出される（Ｓ１０３）。そして、抽出されたＡＴＰと発光試薬とを反応させることが可能となる。

（サンプル液＋ＡＴＰ標準液の発光量測定）
次に、溶液２にＡＴＰ標準液を添加し、溶液３を調整する。そして、調製した溶液３に発光試薬を添加し、発光量を測定する（Ｓ１０４）。このように、溶液２（サンプル液）にＡＴＰ標準液を添加することで、溶液３全体のＡＴＰ量が増加し、発光試薬を添加した際の発光量も増加することになる。これにより、サンプル液中の微生物が微量であっても、測定装置の感度を上回る発光量が得られ、発光量の測定が可能となる。なお、ＡＴＰ標準液の添加量は、発光量を測定する機器が測定可能な範囲で、添加する。ここでは、サンプル液の量をａとし、ＡＴＰ標準液の添加量をｂとする。

（サンプル液＋ブランク液の発光量測定）
次に、溶液２にブランク液を添加し、溶液４を調整する。また、ブランク液の添加量は、溶液４が溶液３と同じ希釈率になるように、添加する。ここでは、サンプル液の量をａとし、ブランク液の添加量をｂとする。なお、ブランク液とは、ＡＴＰ標準液よりもＡＴＰを含まない溶液（ＡＴＰの含有量既知）のことをいい、好ましくはＡＴＰがゼロの溶液がよい。ブランク液は、市販の、ＡＴＰフリーの水、ＤＮＡ（Deoxyribonucleic acid）フリーの水、タンパク質フリーの水を用いることができる。
そして、調製した溶液４に発光試薬を添加し、発光量を測定する（Ｓ１０５）。このように、溶液２（サンプル液）に、Ｓ１０４で添加したＡＴＰ標準液と同量のブランク液を添加することで、溶液３と同じ条件（液量比が同一等）で発光量を測定することが可能となる。

（換算係数Ｂの算出、サンプル液中のＡＴＰ量の算出）
次に、溶液３および溶液４の、発光量およびＡＴＰ量の差異に基づいて、換算係数Ｂを算出する。この換算係数Ｂは、発光量からＡＴＰ量を求めるための係数である。換算係数Ｂを算出する手順について、図３を参照して説明する。

図３（ａ）は、図３（ｂ）に示すプロット各点のＡＴＰ量、発光量、液量比を示す。図３（ｂ）の縦軸は発光量を、横軸はＡＴＰ量を示す。図１のＳ１０４において測定した溶液３（サンプル液＋ＡＴＰ標準液）の発光量をＹとし、溶液３に含まれるＡＴＰ量をｘ＋ｓとする。また、図１のＳ１０５において測定した溶液４（サンプル液＋ブランク液）の発光量をＸとし、溶液４に含まれるＡＴＰ量をｘとする。溶液３および溶液４の、発光量の差異とＡＴＰ量の差異とに基づいて、検量線の傾きを算出し、検量線（２）を特定することができる。なお、この検量線（２）の傾きＢを、換算係数Ｂと呼ぶ。

また、前記のようにサンプル液は、飲料や医薬品であるため、原料由来の透過性や色やｐＨが、発光量に影響を与える。そのため、換算係数Ｂを溶液３および溶液４の発光量に基づいて算出することで、原料由来の透過性や色やｐＨによる影響を考慮（補正）した換算係数を求めることが可能となる。そして、この換算係数Ｂに基づいて、サンプル液中のＡＴＰ量を求めることが可能となる（Ｓ１０６）。

（測定の妥当性評価）
次に、測定の妥当性を評価する（Ｓ１０７）。前記のように、ＡＴＰ測定法は従来から利用されており、このＡＴＰ測定法によって微生物を計数する微生物計数装置も知られている。そこで、本実施形態のＡＴＰ測定方法を、微生物計数装置において実施する場合、算出した換算係数Ｂやサンプル液中のＡＴＰ量が、微生物計数装置が測定可能な範囲内であるか否か、すなわち、測定の妥当性があるか否かを検討することが好ましい。
ここで、微生物計数装置が測定可能な範囲とは、微生物計数装置の性能等を考慮し、測定値（測定結果）の信頼性が担保されている範囲をいう。

図４には、図２（ｂ）で示した検量線（１）と、図３（ｂ）で示した検量線（２）が示されている。原料由来の透過性や色やｐＨによる影響は、図４に示す検量線（３）（傾き：Ｂ_１）のように、発光量を増加させる場合も考えられる。また、原料由来の透過性や色やｐＨによる影響は、図４に示す検量線（４）（傾き：Ｂ_２）のように、発光量を大幅に減少させる場合も考えられる。さらに、原料由来の透過性や色やｐＨによる影響は、発光量を大幅に増大させる場合も考えられる（検量線の図示は省略）。

前記のように、ＡＴＰ標準液には、測定を阻害する物質等が含まれていない。そのため、ＡＴＰ標準液の測定では、高い精度でＡＴＰ量を測定することができる。換言すれば、ＡＴＰ標準液の測定では、ＡＴＰ量が少なくても、測定可能である。ここで、微生物計数装置がＡＴＰ標準液を測定可能な範囲の下限を、γ_ａ（図４）とする。

一方、サンプル液の測定では、原料由来の透過性や色やｐＨによる影響がある。そのため、サンプル液の測定では、ＡＴＰ標準液の測定よりも、精度が低くなる。換言すれば、サンプル液の測定では、ＡＴＰ量が少ないと、測定不可能である。ここで、微生物計数装置がサンプル液を測定可能な範囲の下限を、γ_ｂ（図４）とする。
なお、サンプル液の測定において、原料由来の透過性や色やｐＨによる影響が少ない場合または影響がない場合は、ＡＴＰ標準液の測定と同様に、ＡＴＰ量が少なくても測定可能である。

測定の妥当性評価は、このような、微生物計数装置が測定可能な範囲に基づいて、ステップＳ１０６（図１）において算出した値が、サンプル液のＡＴＰ量として妥当であるか否かを評価することにより行われる。図４に示すｘ_２は、微生物計数装置がＡＴＰ標準液を測定可能な範囲の下限（γ_ａ）よりも大きい。仮に、検量線（４）を特定する基となったサンプル液に、測定を阻害する物質等が極めて少ないまたは含まれていない場合は、原料由来の透過性や色やｐＨによる影響がほとんどないため、ｘ_２がサンプル液のＡＴＰ量として妥当であると評価される。

しかし、当該サンプル液の測定において、原料由来の透過性や色やｐＨによる影響がある場合は、ｘ_２が、微生物計数装置がＡＴＰ標準液を測定可能な範囲の下限（γ_ａ）より大きくても、サンプル液のＡＴＰ量とするには妥当性に欠けると考えられる。そこで、微生物計数装置がサンプル液を測定可能な範囲の下限（γ_ｂ）に基づいて、ｘ_２をサンプル液のＡＴＰ量とした場合に妥当性があるか否かを評価する。図４においてｘ_２は、サンプル液を測定可能な範囲の下限（γ_ｂ）よりも小さいため、ｘ_２は、サンプル液のＡＴＰ量として妥当でないと評価される。

また、測定の妥当性評価は、図４に示す各検量線に基づいて行うこともできる。検量線に基づく妥当性評価は、検量線の傾きにより行うことができる。例えば、ＡＴＰ標準液から特定した検量線（１）の場合、使用した発光試薬や溶媒等によって、傾きが変化することがある。そこで、微生物計数装置に適した条件において検量線を求め、その傾きを基準値として予め設定しておく。そして、この基準値と検量線（１）の傾きとを比較し、その差異に基づいて評価を行う。差異が大きい場合は、このＡＴＰ標準液および／または発光試薬を使用した測定は妥当でないと評価される。一方、差異が小さい場合は、このＡＴＰ標準液および／または発光試薬を使用した測定は妥当であると評価される。なお、この差異の大小を判断する閾値は、予め設定しておく。

そして、妥当であると評価された場合、この検量線（１）に基づいて、サンプル液から特定した検量線（２）〜（４）の妥当性を評価する。前記のように、原料由来の透過性や色やｐＨの影響によって、サンプル液から特定した検量線は、傾きが変化することがある。そこで、妥当であると評価された検量線（１）の傾きを基準値として、この基準値と検量線（２）〜（４）の傾きとを比較し、その差異に基づいて評価を行う。差異が大きい場合は、このサンプル液は原料由来の透過性や色やｐＨによる影響が大きいため、その影響を補正できる範囲を超え、測定は妥当でないと評価される。一方、差異が小さい場合は、このサンプル液は原料由来の透過性や色やｐＨによる影響が補正できる範囲内であり、測定は妥当であると評価される。なお、この差異の大小を判断する閾値は、予め設定しておく。

（まとめ）
本実施形態によれば、液体成分が持つ透過性や色やｐＨといった固有値を補正して、ＡＴＰ量を測定することが可能となる。また、測定の妥当性を評価することにより、正しいＡＴＰ量を求めることができるようになるため、測定結果の信頼性が担保される。

なお、前記した実施形態は、本発明を実施するための好適なものであるが、その実施形式はこれらに限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において、種々変更することが可能である。例えば、発光量を測定する順番は、図１に示す順番に限らない。

Ｓ１０１ＡＴＰ標準液の発光量測定（第三の発光量を測定）
Ｓ１０２サンプル液中の阻害物質消去（微生物の細胞外に存在するＡＴＰを消去）
Ｓ１０３サンプル液中の阻害物質消去（微生物の細胞内に存在するＡＴＰを抽出）
Ｓ１０４サンプル液＋ＡＴＰ標準液の発光量測定（第一の発光量を測定）
Ｓ１０５サンプル液＋ブランク液の発光量測定（第二の発光量を測定）
Ｓ１０６換算係数Ｂの算出、サンプル液中のＡＴＰ量の算出（第一の発光量および第二の発光量に基づいて試料中のＡＴＰ量を算出）
Ｓ１０７測定の妥当性評価（発光試薬および／またはＡＴＰ標準液の妥当性評価、試料中のＡＴＰ量の妥当性評価）

Claims

液体である試料中のＡＴＰ量を測定する方法であって、
前記試料に、ＡＴＰ消去試薬を添加して前記試料中に含まれる微生物の細胞外に存在するＡＴＰを消去した後、ＡＴＰ抽出試薬を添加して前記試料中に含まれる微生物の細胞内に存在するＡＴＰを抽出する工程と、
前記ＡＴＰ消去試薬および前記ＡＴＰ抽出試薬を添加した試料へ、既知量のＡＴＰを含むＡＴＰ標準液を所定の比率で添加した後、発光試薬を添加し、第一の発光量を測定する工程と、
前記ＡＴＰ消去試薬および前記ＡＴＰ抽出試薬を添加した試料へ、前記ＡＴＰ標準液よりもＡＴＰ量が少ないブランク液を前記所定の比率で添加した後、発光試薬を添加し、第二の発光量を測定する工程と、
前記第一の発光量および前記第二の発光量に基づいて、前記試料中のＡＴＰ量を算出する工程と、
を含むことを特徴とするＡＴＰ測定方法。
前記算出した前記試料中のＡＴＰ量と、測定結果の信頼性が担保される範囲を示す所定の値とを比較し、それらの大小関係に基づいて、前記算出した前記試料中のＡＴＰ量の妥当性を評価する工程と、
を含むことを特徴とする請求項１に記載のＡＴＰ測定方法。
前記ＡＴＰ標準液に、発光試薬を添加して第三の発光量を測定する工程と、
前記第三の発光量とＡＴＰ量との相関関係を示す第一のグラフを特定する工程と、
前記第一のグラフの傾きと、測定に適した条件で特定されたグラフの傾きとを比較し、その差異に基づいて、前記発光試薬および／または前記ＡＴＰ標準液の妥当性を評価する工程と、
を含むことを特徴とする請求項１または請求項２に記載のＡＴＰ測定方法。
前記第一の発光量および前記第二の発光量と前記試料へ添加した前記ＡＴＰ標準液に含まれるＡＴＰ量との相関関係を示す第二のグラフを特定する工程と、
前記第一のグラフの傾きと、前記第二のグラフの傾きとを比較し、その差異に基づいて、前記算出した前記試料中のＡＴＰ量の妥当性を評価する工程と、
を含むことを特徴とする請求項３に記載のＡＴＰ測定方法。