BR112015025042B1 - Sistema de diagnóstico e método para detectar vírus influenza, composto inibidor de máscara e kit - Google Patents
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Abstract
SISTEMA DE DIAGNÓSTICO, COMPOSTOS, KIT E MÉTODOS PARA DETECTAR VÍRUS INFLUENZA. Algumas modalidades fornecidas aqui dizem respeito a ensaios combinados. Em algumas modalidades, um ensaio para identificar influenza tipo A ou influenza tipo B é combinado com um ensaio para determinar a sensibilidade de uma neuraminidase de influenza a uma droga antiviral.
Description
[001] Este Pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. No. 61/807,185 depositado em 01 de abril de 2013, intitulado “Point Of Care (POC) Influenza Antiviral Suscetibility Test” que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
[002] Algumas modalidades fornecidas aqui permitem métodos, composições, dispositivos e sistemas para ponto de cuidado de testes de influenza. Algumas modalidades relacionam a ensaios combinados. Em algumas modalidades, um ensaio para identificar influenza tipo A ou influenza tipo B é combinado com um ensaio para determinar a sensibilidade de uma neuraminidase de influenza a uma droga antiviral.
[003] A influenza é uma ameaça série e constante à saúde pública. Cada ano, doenças associadas a influenza levam a aproximadamente 200.000 hospitalizações e 36.000 mortes nos Estados Unidos. De uma perspectiva de impacto nacional, os custos econômicos totais em 2010 para influenza foram estimados em $29 Bilhões. Terapia antiviral para influenza é eficaz, quando dado como um tratamento ou dado para profilaxia em uma maneira temporal. Vários estudos concluíram que drogas de neuraminidase reduzem a duração dos sintomas. Tamiflu e Relenza têm ambos 80% de eficácia na profilaxia contra gripe sazonal. Quando tratando pacientes com influenza, é recomendado que o paciente inicie terapia dentro de 48 horas dos sintomas e retardos menores são melhor. Diagnóstico imediato e iniciação da terapia antiviral leva a melhor resultado do paciente.
[004] Com base na resistência ampla aos bloqueadores de canal M2, não é não razoável para especular que amplitude de uso dos inibidores de neuraminidase pode ultimamente levar a uma emergência em sua resistência no vírus influenza sazonal ou pandêmico. Um número de mutantes resistentes inibidores de neuraminidase pode ser identificado durante estudos clínicos. Em um período de três anos de observação, oito variantes de vírus com uma diminuição > 10 vezes em suscetibilidade a Osetltamivir foram isolados. Estes achados devem causar pausa quando considerando a distribuição de massa de drogas a base de inibidor de neuraminidase para o gerenciamento de gripe sazonal. Em 2010 o WHO manteve a primeira consulação global em resistência antiviral em Hong Kong, seguindo da emergência de vírus influenza resistente a Oseltamivir transmissível durante estação de inverno de 2007-2008 e detecções de resistência à Oseltamivir em HSN1 e influenza pandêmica H1N1 (2009). Uma saída chave para esta consulação foi o requerimento para relatório de estado formal de resistência antiviral a influenza, tanto em ajustes clínicos ou como parte de vigilância nacional. Ainda adicionalmente, alguns antivirais como Oseltamivir causam eventos adversos tornando importante apenas prescrever quando requerido. Cobertura para as várias drogas antivirais pode variar com fornecimento e ter custos diferentes para os pacientes. Os médicos têm a responsabilidade de apenas prescrever o que é necessário. Enquanto custo é secundário para eficácia, se um paciente pode ter com isso uma droga menos cara, o médico tem a obrigação de fazer o paciente atento à opção. Em consequência, existe uma necessidade não encontrada para testes de ponto de cuidado que podem fornecer diagnóstico de uma cepa específica para evitar eventos adversos, reduzir a evolução da resistência à droga, e criar uma economia ao paciente e ao sistema de saúde pública dos Estados Unidos.
[005] Algumas modalidades dos métodos, kits, sistemas, e composições fornecidos aqui incluem um método para detectar um vírus influenza compreendendo: (a) contactar uma amostra com um tampão de imunoensaio adaptado para um imunoensaio para detectar um vírus influenza tipo A ou um vírus influenza tipo B, assim obtendo uma amostra de teste de imunoensaio; (b) contactar uma primeira parte da amostra de teste de imunoensaio a um teste compreendendo um imunoensaio para detectar um tipo influenza tipo A ou tipo B, assim detectando a presença ou ausência de influenza tipo A ou tipo B na amostra; (c) contactar uma segunda parte da amostra teste de imunoensaio com uma matriz compreendendo um tampão de ensaio de neuraminidase, assim obtendo uma amostra teste de neuraminidase e (d) contactar a amostra teste de neuraminidase com um ensaio de neuraminidase, assim detectando a presença de um neuraminidase na amostra. Em alguma modalidade, o tampão de imunoensaio é incompatível com um ensaio para atividade de neuraminidase. Em alguma modalidade, o tampão de imunoensaio inibe atividade de neuraminidade. Em algumas modalidades, etapa (c) e (d) são realizadas no mesmo vaso.
[006] Algumas modalidades fornecidas aqui incluem um método para detectar um vírus influenza compreendendo: (a) contactar uma amostra com um tampão de ensaio de neuraminidase adaptado para um ensaio de neuraminidase, assim obtendo uma amostra de teste de neuraminidase; (b) contactando uma primeira parte de amostra de teste de neuraminidase a um teste compreendendo um imunoensaio para detectar uma influenza tipo A ou tipo B, em que a amostra de teste de neuraminidase contacta uma matriz compreendendo tampão de imunoensaio, assim obtendo uma amostra teste de imunoensaio e detectando a presença ou ausência de influenza tipo A ou tipo B na amostra; e (c) contactar uma segunda parte da amostra de teste de neuraminidase com um ensaio de neuraminidase, assim detectando a presença de uma neuraminidase na amostra. Em alguma modalidade, o tampão de ensaio de neuraminidase é incompatível com um imunoensaio para detectar uma influenza tipo A ou tipo B. Em algumas modalidades, o tampão de ensaio de neuraminidase inibe ligação específica de um anticorpo a um antígeno selecionado do grupo consistindo de influenza tipo A e influenza tipo B. Em alguma modalidade, a matriz compreende tampão de imunoensaio liofilizado ou seco. Em alguma modalidade, etapa (c) é realizada em um vaso compreendendo uma pluralidade de câmaras.
[007] Em algumas modalidades dos métodos para detectar um vírus de influenza o vaso compreende uma pluralidade de câmaras. Em algumas modalidades, o vaso compreende uma câmara compreendendo a matriz, e uma câmara compreendendo reagentes para o ensaio de neuraminidase. Em algumas modalidades, a matriz compreende um polissacarídeo reticulado. Em algumas modalidades, a matriz é selecionada do grupo consistindo de sephadez e sepharose.
[008] Em algumas modalidades, a amostra de teste de imunoensaio e a amostra de teste de neuraminidase são movidas no vaso por uma ou mais forças selecionadas de gravidade, ação por capilaridade, e difusão.
[009] Em algumas modalidades, o vaso compreende um cartucho. Em algumas modalidades, o vaso compreende um cartucho de multipoços adaptado para ser lido usando um fotomultiplicador. Em algumas modalidades, o fotomultiplicador é selecionado do grupo consistindo de um tubo fotomultiplicador e tubo microfotomultiplicador. Em algumas modalidades, o fotomultiplicador é portátil. Em algumas modalidades, o fotomultiplicador está em um leitor portátil adequado para um consultório médico de cuidado primário. Em algumas modalidades, o tubo fotomultiplicador é redondo e tem um diâmetro de cerca de 6 mm a 9 mm, ou o tubo microfotomultiplicador é retangular e tem uma dimensão de cerca de 1 mm a 3 mm.
[0010] Em algumas modalidades, o ensaio de neuraminidase compreende determinar a sensibilidade de uma neuraminidase para um composto de teste. Em algumas modalidades, o ensaio de neuraminidase compreende: (a) obter uma razão de valor de inibição, em que a razão compreende o nível de atividade de neuraminidase na presença de um composto de teste comparado ao nível de atividade de neuraminidase na ausência do composto de teste; e (b) comparar a razão do valor de inibição a um limite de inibição, assim determinando a sensibilidade da atividade de neuraminidase para o composto teste. Em algumas modalidades, o limite de inibição é determinado pela detecção de um vírus tipo A ou um tipo B. Em algumas modalidades, um primeiro limite de inibição é usado se vírus tipo A é detectado, e um segundo limite de inibição é usado se vírus tipo B é detectado. Em algumas modalidades, o primeiro limite é menor que o segundo limite. Em algumas modalidades, o limite de inibição é determinado pelo composto de teste.
[0011] Em algumas modalidades também inclui selecionar o composto de teste para tratar a influenza.
[0012] Em algumas modalidades, o ensaio de neuraminidase compreende um ensaio de enzima dupla compreendendo uma enzima de sinalização. Em algumas modalidades, atividade de neuraminidase produz um substrato para a enzima de sinalização. Em algumas modalidades, o ensaio de neuraminidase compreende um conjugado de um ácido N-acetilneuramínico e luciferina ou um derivado do mesmo. Em algumas modalidades, atividade de neuraminidase produz um inibidor para a enzima de sinalização. Em algumas modalidades, o ensaio de neuraminidase compreende um conjugado de um ácido N-acetilneuramí- nico e uma trifluormetilcetona ou um derivado da mesma. Em algumas modalidades, a enzima de sinalização compreende luciferase. Em algumas modalidades, o tampão de imunoensaio inibe atividade de luciferase. Em algumas modalidades, o nível de atividade de neuramini- dase é medido usando um tubo fotomultiplicador.
[0013] Em algumas modalidades, o composto de teste é uma droga antiviral. Em algumas modalidades, o composto de teste é uma droga antiviral selecionada do grupo consistindo de Oseltamivir, Zanamivir, Lanamivir e Peramivir.
[0014] Em algumas modalidades, o imunoensaio compreende um ensaio sanduíche.
[0015] Em algumas modalidades, a amostra é obtida de um paciente. Em algumas modalidades, a amostra é obtida de um paciente. Em algumas modalidades, o paciente é suspeito de ter influenza. Em algumas modalidades, o paciente é humano.
[0016] Algumas modalidades fornecidas aqui incluem um método para selecionar um tratamento para um vírus influenza compreendendo: (a) contactar uma amostra com um tampão de imunoensaio adaptado para um imunoensaio para detectar um vírus influenza tipo A ou um vírus influenza tipo B, assim obtendo uma amostra de teste de imunoensaio; (b) contactar uma primeira parte da amostra de teste de imunoensaio a um teste compreendendo um imunoensaio para detectar uma influenza tipo A ou tipo B, assim detectando a presença ou ausência de influenza tipo A ou tipo B na amostra; (c) contactar uma segunda parte da amostra de teste de imunoensaio com uma matriz compreendendo um tampão de ensaio de neuraminidase, assim obtendo uma amostra de teste de neuraminidase; (d) contactar a amostra de teste de neuraminidase com um ensaio de neuraminidase, assim determinando a sensibilidade de uma neuraminidase da amostra de teste de neuraminidase a um composto de teste, a determinação compreendendo: (i) obter uma razão de valor de inibição, em que a razão compreende o nível de atividade de neuraminidase na presença de um ou mais compostos teste comparados ao nível de atividade de neuraminidase na ausência de um ou mais compostos teste, e (ii) comparar a razão do valor de inibição a um limite de inibição, assim determinar a sensibilidade da atividade de teste de neuraminidase ao composto de teste; e (e) selecionar um composto de teste dos um ou mais compostos de teste que foram determinados para inibir atividade de neuraminidase. Em algumas modalidades, o tampão de imunoensaio inibe a atividade da neuraminidase. Em algumas modalidades, etapas (c) e (d) são realizadas no mesmo vaso.
[0017] Algumas modalidades fornecidas aqui incluem um método para selecionar um tratamento para um vírus de influenza compreendendo: (a) contactar uma amostra com um tampão de ensaio de neuraminidase adaptado para um ensaio de neuraminidase, assim obtendo uma amostra teste de neuraminidase; (b) contactando uma primeira parte da amostra de teste de neuraminidase a um teste compreendendo um imunoensaio para detectar uma influenza tipo A ou tipo B, em que a amostra de teste de neuraminidase contacta uma matriz compreendendo tampão de imunoensaio, assim obtendo uma amostra de teste de imunoensaio e detectar a presença ou ausência de influenza tipo A ou tipo B na amostra; e (c) contactar uma segunda parte da amostra de teste de neuraminidase com um ensaio de neuraminidase, assim determinando a sensibilidade de uma neuraminidase da amostra de teste de neuraminidase a um composto de teste, compreendendo a determinação: (i) obter uma razão de valor de inibição, em que a razão compreende o nível de atividade de neuraminidase na presença de um ou mais compostos de teste comparados ao nível de atividade de neuraminidase na ausência do um ou mais compostos de teste, e (ii) comparar a razão do valor de inibição a um limite de inibição, assim determinar a sensibilidade da atividade de neuraminidase ao composto de teste; e (e) selecionar um composto de teste de um ou mais compostos de teste que foram determinados para inibir atividade de neuraminidase. Em algumas modalidades, a matriz compreende tampão de imunoensaio liofilizado ou de outra forma seco. Em algumas modalidades, etapa (c) é realizada no mesmo vaso. Em algumas modalidades, etapa (c) é realizada no mesmo vaso. Em algumas modalidades, etapa (c) é realizada em um vaso compreendendo uma pluralidade de câmaras.
[0018] Em algumas modalidades dos métodos para selecionar um tratamento para um vírus influenza, o limite de inibição é determinado pela detecção de vírus tipo A ou tipo B. Em algumas modalidades, um primeiro limite de inibição é usado se vírus tipo A é detectado, e um segundo limite de inibição é usado se vírus tipo B é detectado. Em algumas modalidades, o primeiro limite é menor que o segundo limite.
[0019] Em algumas modalidades, o vaso compreende uma tira de multipoço ou cartucho adaptado a ser lido usando um tubo fotomultiplicador ou tubo microfotomultiplicador. Em algumas modalidades, o tubo fotomultiplicador tubo microfotomultiplicador é portátil. Em algumas modalidades, o tubo fotomultiplicador está em um leitor portátil adequado para um consultório médico de cuidado primário. Em algumas modalidades, a superfície de tubo fotomultiplicador é redondo e tem um diâmetro de cerca de 6 mm a 9 mm, ou o tubo microfotomultiplicador é retangular e tem uma dimensão de cerca de 1 mm a 3 mm.
[0020] Alguns métodos também incluem selecionar o composto de teste para tratar a influenza.
[0021] Em algumas modalidades, o ensaio de neuraminidase compreende um ensaio de enzima dupla compreendendo uma enzima de sinalização. Em algumas modalidades, atividade de neuraminidase produz um substrato para a enzima de sinalização. Em algumas modalidades, o ensaio de neuraminidase compreende um conjugado de um ácido N-acetilneuramínico ou luciferina ou um derivado da mesma. Em algumas modalidades, atividade de neuraminidase produz um inibidor para a enzima de sinalização. Em algumas modalidades, o ensaio de neuraminidase compreende um conjugado de ácido N- acetilneuramínico e uma trifluormetilcetona ou um derivado dos mesmos. Em algumas modalidades, a enzima de sinalização compreende luciferase.
[0022] Em algumas modalidades, o nível de atividade de neuraminidase é medido usando um tubo fotomultiplicador.
[0023] Em algumas modalidades, o composto de teste é uma droga antiviral. Em algumas modalidades, o composto de teste é uma droga antiviral selecionada do grupo consistindo de Oseltamivir, Zanamivir, Lanamivir e Peramivir.
[0024] Em algumas modalidades, o imunoensaio compreende um ensaio sanduíche.
[0025] Em algumas modalidades, a amostra é obtida de um paciente. Em algumas modalidades, o paciente é suspeito de ter influenza. Em algumas modalidades, o paciente é humano. Em algumas modalidades, a amostra de paciente foi obtida de um paciente, e o paciente é instruído a tomar o composto de teste selecionado para tratar influenza. Em algumas modalidades, a amostra de paciente foi obtida de um paciente, e o paciente é fornecido com o composto de teste selecionado para tratar influenza.
[0026] Algumas modalidades incluem um sistema de diagnóstico para detectar vírus influenza compreendendo um cartucho para determinar atividade de neuraminidase em uma amostra, em que o cartucho é configurado para processar uma amostra compreendendo um tampão incompatível para a determinação de uma amostra compreendendo um tampão compatível para determinação; um teste para detectar influenza tipo A ou tipo B na amostra, em que o teste é configurado para processar uma amostra compreendendo um tampão incompatível para detecção de uma amostra compreendendo um tampão compatível para a detecção; um primeiro detector configurado para medir um sinal do teste; e um segundo detector configurado para medir um sinal do cartucho.
[0027] Em algumas modalidades, o cartucho compreende uma câmara de matriz compreendendo uma matriz de cartucho compreendendo o tampão compatível para a determinação, e uma câmara de reagente compreendendo reagentes para a determinação de atividade de neuraminidase. Em algumas modalidades, a matriz de cartucho compreende um polissacarídeo reticulado. Em algumas modalidades, a matriz de cartucho é selecionada do grupo consistindo de sephadez e sepharose.
[0028] Em algumas modalidades, a câmara de matriz e câmara de cartucho estão em comunicação fluida de modo que uma amostra aplicada à câmara de matriz escoa da câmara de matriz para a câmara de reagente. Em algumas modalidades, a amostra escoa no cartucho por uma ou mais forças selecionadas de gravidade, ação por capilaridade, e difusão.
[0029] Em algumas modalidades, o cartucho compreende um cartucho de multipoços adaptado para ser lido usando um tubo fotomultiplicador ou tubo microfotomultiplicador.
[0030] Em algumas modalidades, o teste compreende um imunoensaio. Em algumas modalidades, o imunoensaio é um ensaio sanduíche. Em algumas modalidades, o teste compreende uma matriz compreendendo o tampão compatível para detecção. Em algumas modalidades, a matriz compreende nitrocelulose. Em algumas modalidades, o tampão compatível para a detecção é liofilizado ou seco.
[0031] Em algumas modalidades, o primeiro detector compreende um luminômetro. Em algumas modalidades, o primeiro detector compreende um leitor de refletância. Em algumas modalidades, o segundo detector compreende um tubo fotomultiplicador ou tubo microfotomultiplicador. Em algumas modalidades, um dispositivo compreende o primeiro e segundo detectores. Em algumas modalidades, o primeiro e segundo detectores são os mesmos.
[0032] Em algumas modalidades, o dispositivo é portátil. Em algumas modalidades, o dispositivo é carregável.
[0033] Algumas modalidades incluem um kit para detectar vírus influenza compreendendo: um cartucho para determinar atividade de neuraminidase em uma amostra, em que o cartucho é configurado para processar uma amostra compreendendo um tampão incompatível para a determinação de uma amostra compreendendo um tampão compatível para a determinação; e um teste para detectar influenza tipo A ou tipo B na amostra, em que o teste é configurado para processar uma amostra compreendendo um tampão incompatível para a detecção de uma amostra compreendendo um tampão compatível para a detecção. Algumas modalidades incluem um primeiro detector configurado para medir um sinal de teste; e um segundo detector configurado para medir um sinal do cartucho. Algumas modalidades incluem reagentes para um ensaio de atividade de neuraminidase. Em algumas modalidades, os reagentes de ensaio de atividade de neuraminidase são selecionados do grupo consistindo de luciferas, um conjugado de um ácido N- acetilneuramínico e luciferina ou um derivado do mesmo, um ácido N- acetilneuramínico e uma trifluormetilcetona ou um derivado do mesmo, e uma droga antiviral. Em algumas modalidades, a droga antiviral é selecionada do grupo consistindo de Oseltamivir, Zanamivir, Lanamivir e Peramivir. Algumas modalidades incluem reagentes para um imunoensaio. Em algumas modalidades, os reagentes de imunoensaio são selecionados do grupo consistindo de um anticorpo específico a um antígeno de influenza tipo A, e um anticorpo especifico a um antígeno de influenza tipo B.
[0034] Algumas modalidades incluem um composto inibidor mascarado para uso em um ensaio de sensibilidade de neuraminidase de influenza de enzina dupla tendo a estrutura da fórmula (I): em que R1, R2 e R3 são cada independentemente hidrogênio ou C1-5- alquila; n é 0, 1, 2 ou 3; R4 é -(CH2)mC(=O)CF3; m é 0 ou 1; X é -S(O)z- ou -CH(R5)-; R5 é -S(O)zCH3; e z é 0, 1 ou 2.
[0035] Em algumas modalidades, o composto da Fórmula (I) é selecionado do grupo consistindo de:
[0036] A FIG. 1 mostra uma modalidade de uma tira de teste de imunoensaio e leitor para sistema Veritor (Becton Dickinson).
[0037] A FIG. 2 mostra uma modalidade de um fluxo de trabalho para combinar um imunoensaio de fluxo lateral e um ensaio de suscetibilidade de droga.
[0038] A FIG. 3 mostra uma modalidade para determinar razão de sinal em um ensaio de suscetibilidade de droga.
[0039] A FIG. 4 mostra uma modalidade de uma síntese para um inibidor mascarado.
[0040] A FIG. 5 mostra uma modalidade de um cartucho para um ensaio de neuraminidase de fluxo cinético.
[0041] A FIG. 6 é um gráfico de unidades de luz relativas e concentração de um controle de fluorescência medido usando um leitor portátil.
[0042] A FIG. 7 é um gráfico de unidades de luz relativa para ensaios de neuraminidase, e demonstra a capacidade de um Ensaio de enzima dupla para selecionar o melhor antiviral a base de NA para tratamento. No exemplo, Relenza supera Tamiflu.
[0043] A FIG. 8 é um gráfico de valores de inibição para várias diluições de vários vírus de influenza tipo A, e demonstra que existe um valor de inibição distinto que pode ser usado para discernir resistente a droga de Gripe A de cepas sensíveis a droga de gripe A, que é distinto do valor para cepas de gripe B, e BD tem a capacidade de fazer o julgamento em uma configuração POC, quando o teste AST segue um teste Flu ID convencional que fornece tipagem A/B.
[0044] A FIG. 9 é um gráfico de valores de inibição de várias diluições de vários vírus de influenza tipo B, e demonstra que existe um valor de inibição distinto que pode ser usado para discernir cepas resistentes a droga de gripe B de sensíveis a dobra De gripe B, que é distinto do valor para cepas de gripe A, e BD tem a capacidade de fazer o julgamento em uma configuração POC, quando o teste AST segue um teste Flu ID convencional que fornece tipagem A/B.
[0045] A FIG. 10 é um gráfico de valores de inibição para várias diluições de misturas de vírus, e demonstra a capacidade da tecnologia descrita aqui para sinalizar a presença das cepas resistentes à droga quando elas existem em culturas misturadas. Até mais significativa é a capacidade demonstrada para sinalizar influenza altamente resistente a droga possuindo o NA sensível a pH.
[0046] A FIG. 11 mostra uma estrutura química de um substrato de neuraminidase exemplar, NANA-CF3 (inibidor mascarado) e a trifluorcetona (inibidor livre), usado em uma modalidade de uma cascata de enzima dupla para teste de susceptibilidade viral.
[0047] A FIG. 12 mostra uma modalidade de uma Cascata de Enzima Dupla completa envolvendo inibidor mascarado e livre.
[0048] A FIG. 13 é um gráfico de dois ensaios de enzima dupla diferentes, e demonstra a faixa de sensibilidade que pode ser acompanhada com uma Química de Detecção de Enzima Dupla.
[0049] A FIG. 14 mostra uma modalidade de uma tira de teste de fluxo lateral de imunoensaio incluindo preposicionamento dos reagentes de extração de nucleocapsídeo de imunoensaio na tira.
[0050] Algumas modalidades dos métodos, composições, kits, disposi-tivos e sistemas fornecidos aqui incluem um diagnóstico de combinação de ponto de cuidado (POC) capaz de identificar influenza A ou B e guiar terapia antiviral. Em algumas modalidades, uma plataforma portátil pode ser operável por pessoal médico com habilidades de laboratório limitadas. Algumas modalidades incluem uma tecnologia de fluxo lateral para detecção de influenza com um ensaio para detectar cepas de resistência antiviral, direcionadas para isolados clínicos sem qualquer amplificação de cultura de célula.
[0051] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidos aqui incluem ensaios de combinação nos quais uma amostra é ensaiada para (1) identificação do vírus influenza tipo A ou tipo B na amostra; e (2) sensibilidade da neuraminidase do vírus influenza a uma ou mais drogas antivirais. Tipicamente, uma amostra preparada para uso em um imunoensaio para identificar um vírus de influenza tipo A ou tipo B é incompatível para uso em um ensaio relacionado à atividade de neuraminidase do vírus. Por exemplo, um tempão de lise para uso em um imunoensaio pode inibir um ensaio de atividade de neuraminidase. Modalidades dos métodos e composições fornecidas aqui incluem métodos para usar um imunoensaio e um ensaio de atividade de neuraminidase de uma amostra única em um tampão inicial compatível com um dos ensaios. Algumas tais modalidades fornecem teste rápido para tipo de influenza e fornece guia para selecionar uma droga antiviral para tratamento.
[0052] Em adição, algumas modalidades fornecidas aqui intensificam bastante a sensibilidade de tais ensaios. Em algumas modalidades, um ensaio para identificar o tipo de influenza em uma amostra vantajosamente informa a análise de um ensaio para determinar a sensibilidade ou resistência de uma neuraminidase de influenza para uma droga antiviral. Em algumas modalidades, um valor de inibição limite para um vírus tipo A ou tipo B para uma droga antiviral particular pode ser selecionada e pode ser usada para determinar se uma neuraminidase é sensível ou resistente à droga antiviral.
[0053] Algumas modalidades aqui fornecidas incluem a integração de dois ensaios para um benefício maior ao paciente. Modalidades fornecidas aqui melhoram dramaticamente a sensibilidade de um ensaio de identificação de influenza. Além disso, ambos ensaios podem ser realizados com o mesmo volume de espécime. Em algumas modalidades, um imunoensaio inicial e tampão de extração úteis com um ensaio podem ser não modificados, evitando a necessidade de submeter um ensaio já comercializado a uma nova tentativa clínica. Em algumas modalidades, um espécime em um tampão adequado para um imunoensaio de gripe para determinar tipo de gripe pode ser convertido em um espécime em um tampão adequado para um ensaio de sensibilidade de droga de neuraminidase. Em algumas modalidades, um espécime em um tampão adequado para um ensaio de sensibilidade de droga neuraminidase pode ser convertido a um espécime em um tampão adequado para um imunoensaio de gripe para determinar o tipo de gripe. Em algumas das modalidades acima mencionadas, conversão pode ocorrer em um período de tempo adequado para um teste de diagnóstico em um ponto de cuidado. Em algumas modalidades, período de tempo adequado para um teste de diagnóstico em ponto de cuidado pode incluir menor que cerca de 1 dia, menos que cerca de 12 horas, menos que cerca de 6 horas, menos que cerca de 3 horas, menos que cerca de 1 hora, menos que cerca de 30 minutos, menos que cerca de 10 minutos, menos que cerca de 5 minutos, menos que cerca de 1 minuto, e um período entre qualquer dos tempos acima mencionados.
[0054] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas aqui podem fornecer valores de inibição de droga específicos em ensaios de sensibilidade de droga de neuraminidase que são notavelmente menores que outros ensaios anteriores. Tais valores de inibição de droga permitem uma determinação sobre se uma variante de influenza é resistente à droga ou sensível à droga. Os resultados de sensibilidade melhorada em poucos resultados errôneos, onde gripe é identificada como não sendo resistente à droga quando de fato é.
[0055] Algumas modalidades incluem um componente de identificação de gripe que inclui um imunoensaio de fluxo lateral que utiliza uma nanopartícula para detecção, focada na presença de nucleocapsídeo de influenza e tem um leitor capaz de avançar automaticamente o resultado de tipo de gripe (Gripe A vs. Gripe B) para módulo de leitura e assim aplicando o valor de inibição de droga mais apropriado para usar em um teste subsequente para distinguir sensibilidade de droga da resistência à droga. Em algumas modalidades, o componente de identificação de gripe fornece a informação com respeito ao tipo de gripe para o componente de sensibilidade de droga sem ainda intervenção humana.
[0056] Algumas modalidades incluem um ensaio de duas enzimas para teste de susceptibilidade de droga que alavanca a atividade de neuraminidase de influenza, e assim a primeira enzima (neuraminidase) age em um primeiro substrato que libera um segundo substrato que pode ser agido sob uma segunda enzima envolvida em geração de sinal.
[0057] Versões múltiplas de um ensaio de duas enzimas ou ensaio duplo de enzima são compatíveis com as modalidades divulgadas aqui. Em algumas modalidades, o resultado da primeira reação enzima- substrato pode ser um substrato que é agido sob uma segunda enzima, onde sinal aumenta com mais antígeno de influenza e diminui quando um antiviral de influenza eficaz está presente. Em algumas modalidades, o resultado da primeira reação enzima-substrato pode ser um composto que funciona como um inibidor da segunda reação de enzima. Em algumas modalidades, o primeiro substrato é um inibidor mascarado, isto é, é um precursor a um inibidor. Em algumas modalidades, sinal vai para baixo quanto mais antígeno de influenza está presente e sinal sobre quando um antiviral de influenza eficaz está presente. Em algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas aqui incluem ensaios de enzima dupla que podem entregar boa sensibilidade para a neuraminidase de influenza e a sensibilidade pode variar de 10 picomolar a 100 fentomolar.
[0058] Atualmente, os antivirais mais eficazes para tratamento de influenza alvejam a neuraminidase. As duas drogas inibidoras de neuraminidase principais são zanamivir (RELENZATM) e oseltamivir (TAMIFLUTM). Cepas de gripe resistentes a estas drogas podem não ser detectadas durante a visita inicial ao médico, causando estresse adicional ao paciente que pode ser evitado com um teste de resistência a droga antiviral POC. Nos Estados Unidos e outros países industrializados, teste de suscetibilidade antiviral é primeiramente realizado pelos laboratórios do governo, longe do paciente e muito após sua visita com um médico de cuidado primário, como um componente de vigilância. Até recentemente, não era concebível que tais testes poderiam ser realizados em um laboratório de consultório médico. Além disso, reagentes suscetíveis antivirais faltam em sensibilidade necessária para contemplar teste direto em um espécime de não cultura amplificada. Química de sensibilidade igual ou melhor e direcionada a um antígeno independente foi necessária, e um leitor portátil capaz de ler múltiplas saídas de sinal, tais como refletância, fluorescência, luminescência, foi perdido. Consequentemente, existe uma necessidade para um teste rápido e sensível para resistência à droga de influenza iria promover um uso mais racional dos terapêuticos antivirais.
[0059] Algumas modalidades fornecidas aqui incluem um teste POC para a presença de influenza A+B, que alveja um conjunto de epiotopos de influenza através de imunoensaio e avalia resistência à droga de influenza alvejando um antígeno de influenza separado, a neuramini-dase. Combinando estes antígenos leva a melhor detecção global de gripe, enquanto simultaneamente fornecendo um guia para terapia.
[0060] Algumas modalidades fornecidas aqui incluem um imunoensaio sensível para nucleocapsídeo e um ensaio cinético para medir atividade de neuraminidase. Em algumas modalidades, o ensaio cinético pode incluir um ensaio cinético de enzima dupla. O ensaio cinético de enzima dupla para atividade de neuraminidase com um imunoensaio para nucleocapsídeo pode incluir luciferase como uma segunda enzima e um conjugado a base de luciferina como um substrato. Vírus tipos A e B de influenza possui glicoproteínas na superfície, neuraminidases capazes de hidrolisar substratos contendo ácido N- acetilneurâmico ligado alfa-cetosidicamente, algumas vezes referido como Neu5Ac. Em algumas modalidades, substratos para uso em um teste de suscetibilidade antiviral a base de neuraminidase pode ser moléculas híbridas (conjugados) compreendidos de ácido N- acetilneuramínico e luciferina. Quando luciferina é liberada na presença de luciferase, luz é produzida em uma quantidade diretamente proporcional à atividade de neuraminidase residual no espécime. Em algumas modalidades, conjugados de ácido N-acetilneurâmico-luciferina vaga-lume pode incluir aqueles usados no kit Cellex QFluTM Combo.
[0061] Algumas modalidades aqui proporcionadas incluem um leitor. Em algumas modalidades, o leitor inclui o leitor do Sistema Veritor™ (Beckton Dickinson), que inclui capacidades de luminometria. O luminômetro pode ser usado com vários materiais descartáveis, incluindo um cartucho de teste de fluxo lateral, que é utilizado no sistema Veritor™, e tiras de micropoços. A sensibilidade e flexibilidade adicional descartável pode ser uma opção útil para derivar um segundo resultado do espécime atualmente utilizado apenas para identificar a presença de influenza A ou B.
[0062] Atualmente, quando a gripe entra em uma comunidade, uma amostra é tomada e uma determinação de influenza A ou B é feita pelo médico de cuidado primário. Os espécimes restantes podem ser enviados para um laboratório de vigilância para testes de sensibilidade de drogas e resultados postados em um site do governo para outros médicos na comunidade verem. Embora alguns dos métodos e composições aqui fornecidos visam orientar o médico para o melhor antiviral inibidor de neuraminidase (NAI), tais modalidades também podem proporcionar uma oportunidade para fazer novas melhorias para o teste de influenza em laboratório no consultório médico básico em termos de sensibilidade, já que ambos neuraminidase e nucleocapsídeo podem ser medidos no mesmo espécime. Alguns dos métodos e composições aqui proporciona-dos também proporcionam a oportunidade de recolher dados de resistên-cia antivirais mais precisos para vigilância, como muitas autoridades principais sobre o tema acreditam que o verdadeiro fenótipo de neuraminidase pode mudar, quando o vírus é amplificado por cultura de MDCK, um passo requerido pelo ensaio de sensibilidade a droga IC50 laborioso tradicional.
[0063] Medições da atividade de Neuraminidase com e sem drogas são realizadas rotineiramente em laboratórios ao redor do mundo como um componente de vigilância da gripe. Enquanto o ensaio de atividade de neuraminidase a base de cultura de tecidos pode beneficiar a padronização adicional, o ensaio é um método aceitável e confiável para determinar a resistência à droga de uma amostra clínica após quantidades suficientes de vírus serem geradas por cultura de células. Substratos quimioluminescentes tais como o NA-Star ™ (Applied Biosystems) são rotineiramente utilizados para medir a atividade de neuraminidase da gripe. Em contraste, alguns dos métodos e composições aqui proporcionados incluem uma outra enzima para o coquetel de reagente, que pode atuar sobre um substrato criado pela reação de neuraminidase. Ao fazê-lo, alguns dos métodos e composições aqui proporcionados amplificam o sinal produzido pela enzima nativa do vírus da gripe. A segunda enzima, por sua vez serve para substituir o passo de amplificação de cultura utilizado no processo de vigilância de laboratório mais tradicional. Em algumas modalidades, um sinal a partir do sistema de imunoensaio Veritor ™ pode verificar se antígeno viral suficiente está presente para o ensaio de neuraminidase, tomando o lugar da titulação do vírus laborioso, por vezes, um passo realizado ao ajustar- se ensaios de IC50. Quando uma intensidade de sinal específico é alcançada no imunoensaio, a relação de sinal luminescente (atividade da enzima sem droga: atividade da enzima com droga) é válida.
[0064] Alguns dos métodos e composições aqui proporcionados incluem uma plataforma que pode ser rápida, fácil de usar, e de baixo custo. Algumas modalidades podem segmentar vários cenários de teste, fornecendo uma ferramenta para laboratórios de consultório médico POC e laboratórios que necessitam de maior rendimento. Estas mesmas qualidades são úteis para cenários de recursos limitados e usadas durante as pandemias.
[0065] Alguns dos métodos e composições aqui proporcionados incluem o Sistema de Veritor™, um sistema portátil, de mão, se desejado, com uma melhor sensibilidade, devido em grande parte a uma nova partícula detectora proprietária. Ver a FIG. 1. A leitura instrumentada cria o potencial para ser quantitativa, um atributo do sistema exigido para o teste de sensibilidade antiviral proposto.
[0066] Alguns dos atributos do Sistema Veritor™ que são úteis para a distribuição ampla incluem: 1) Facilidade de uso pelos cuidadores pouco qualificados e de portabilidade suficiente para empurrar para fora para locais remotos de teste (consultórios médicos, farmácias, centros de reabilitação e uso potencialmente móvel). 2) O maior número possível de pacientes, incluindo um foco no primeiro teste de sensibilidade antiviral de influenza no Ponto de Cuidado (POC). 3) Uso em ambientes biológicos. 4) Baixo custo de implantação. 5) Sistema de Combinação usado para determinar Influenza A e B presentes no esfregaço nasal, lavagem ou aspirados nasofaríngeos, tendo também a capacidade de marcar cepas resistentes a drogas da influenza. Como um resultado melhorar o diagnóstico, tratamento e vigilância. 6) A pilhas. 7) Leitor de peso leve com uma pegada pequena - 15 cm (L) x 15 cm (A) x 15 cm (D).
[0067] O desenho de fluxo lateral e membranas representada na fig. 1 são úteis para integrar dois ou mais ensaios que envolvem diferentes substâncias químicas. Substratos de fluxo lateral permitem reações químicas que envolvem duas enzimas distintas a serem colocadas na sequência adequada, em que os tampões podem ser trocados, outros reagentes podem ser preposicionados e diferentes tipos de sinal podem ser lidos em diferentes regiões do substrato de fluxo lateral.
[0068] Em algumas modalidades, suportes sólidos tais como a nitrocelulose utilizada na reação e o bloco detector de partícula são componentes comuns em dispositivos de teste de fluxo lateral. Ver, por exemplo, US 5.998.221 e US 6.194.220 que se referem, cada um, a um fluxo lateral quantitativo e são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, fluxo lateral quantitativo é um passo útil para verificar se antígeno viral adequado está disponível para o ensaio de resistência ao antiviral. Em algumas modalidades, as tiras de fluxo lateral podem usar membranas separadas para o bloco de amostras e para a almofada de conjugado. Em algumas modalidades, uma tira de fluxo lateral pode incluir uma pluralidade de membranas. Em algumas modalidades, uma tira de fluxo lateral pode incluir quatro membranas. Em algumas modalidades, uma tira de fluxo lateral pode incluir quatro membranas em um cassete de fluxo lateral. Em outras modalidades, uma membrana é utilizada tanto para receber e segurar a amostra de conjugado seco para baixo.
[0069] Alguns dos métodos e composições aqui proporcionados incluem um sistema de enzima dupla. Em algumas modalidades, os componentes do sistema de reagente de substrato-enzima Cellex pode ser usado. Podem ser encontrados mais detalhes sobre as enzimas de esterase químicas duplas nas seguintes publicações: Mize et al., Dual Enzyme Cascade, Analytical Chemistry, 179, (1989) p229-235; Patente EUA 4.904.583; e Patente US 4.835.099, as quais são, cada uma, incorporadas por referência na sua totalidade.
[0070] Alguns dos métodos e composições proporcionados aqui incluem enzimas de luciferase modificadas e substratos para tais enzimas, incluindo conjugados de luciferina-ácido neuramínico. Em algumas modalidades, a amplificação pode ser adicionalmente consegui-da por introdução de uma segunda enzima diferente (esterase) e um inibidor bloqueado (mascarado) à base de fluorcetona. FIG. 4 mostra a síntese de uma modalidade de um inibidor de esterase mascarado. FIG. 4 mostra uma modalidade de um substrato que inclui, quer um carbamato ou ligação de carbonato como o substrato de neuraminidase.
[0071] Alguns dos métodos e composições aqui proporcionados incluem uma variedade de configurações de formato possíveis. Em algumas modalidades, a execução completa do imunoensaio e o ensaio de enzima dupla pode incluir um formato de fluxo lateral. Em algumas de tais modalidades, um espécime processado pelo mesmo reagente de extração pode ser carregado sobre uma almofada de amostra de fluxo lateral e momentos mais tarde, a extremidade terminal do cassete de fluxo lateral pode ser lido para a presença de gripe e uma recomendação para a terapia pode ser fornecida também. Em algumas modalidades, uma mudança de cor pode ser medida utilizando um leitor de refletância. Em algumas modalidades, uma medição, tal como uma medição de refletância, pode ser feita diretamente a partir da membrana de fluxo lateral para a detecção da gripe, e outro tipo de medição, tal como a quimioluminescência, a fluorescência ou a medição de cromóforo, podem ser tomadas para a suscetibilidade da droga. Em algumas modalidades, uma medição pode ser feita utilizando um leitor referindo a um instrumento para a detecção e/ou quantificação de dados, tais como em tiras de teste. Tais leitores são revelados e descritos na Pat. N ° s. 6.267.722, 6.394.952 e 6.867.051, que são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, um leitor de refletância refere-se a um instrumento adaptado para ler uma tira de teste usando luz refletida, incluindo fluorescência, ou radiação eletromagnética de qualquer comprimento de onda refletância pode ser detectada utilizando um fotodetector ou outro detector, tais como diodos de carga acoplada (CCD).
[0072] Tanto o sinal de imunoensaio e de suscetibilidade podem ser observados utilizando um detector comum, tal como uma câmara CCD. Em algumas modalidades, o imunoensaio e os ensaios de suscetibilidade podem ser lidos utilizando detectores diferentes, tais como um tubo fotomultiplicador e CCD. Em algumas modalidades, câmaras CCD resfriadas portáteis para medições quimioluminescentes quantitativas “no campo” podem ser usadas. Em algumas modalidades, um ensaio de suscetibilidade antiviral de quimioluminescência também pode ser lido por um diodo PIN com um amplificador de baixo ruído.
[0073] Em algumas modalidades, em que uma primeira reação de enzima no ensaio de enzima dupla não é compatível com os reagentes de imunoensaio, a extremidade dianteira do ensaio de enzima dupla é realizada fora de linha e uma amostra parcialmente transformada com substrato clivado sendo carregada para a lateral de fluxo da almofada de amostra, que pode viajar abaixo da tira de fluxo lateral por ação capilar a um suporte sólido contendo a luciferase e os outros reagentes necessários para gerar um sinal luminescente. Nesta configuração, o sinal de imunoensaio e de suscetibilidade podem ser lidos utilizando um detector comum, tal como uma câmara CCD. Em algumas modalidades, os imunoensaios e ensaios de suscetibilidade podem ser lidos utilizando diferentes detectores, tais como um tubo fotomultiplicador e CCD.
[0074] Em algumas modalidades, os ensaios de enzima dupla de fluxo lateral sobre podem ser conseguidos através da submersão da seção do cassete de fluxo lateral processado contendo luciferina clivada dentro de um poço com luciferase e outros reagentes necessários para produzir um sinal luminescente. Luz produzida a partir do ensaio de enzima dupla é então medida por um TL Pus Luminoskan ou luminômetro de tubo equivalente.
[0075] Em algumas modalidades, o imunoensaio é conduzido e lido de um cassete de fluxo lateral e é realizado um ensaio de enzima dupla e lido em uma tira de poço. Os dois ensaios podem compartilhar um espécime comum extraído, mas são executados em diferentes formatos, em seguida, ler um instrumento comum que pode acomodar refletância de fluxo lateral e quimiluminescência de tira de poço (ou fluorescência ou outro sinal óptico). Ambos os sinal de imunoensaio e de suscetibilidade podem ser observados utilizando um detector comum, tal como uma câmara CCD, ou os imunoensaios enzimáticos e os ensaios de enzima dupla poderiam ser lidos utilizando diferentes detectores, tais como um tubo fotomultiplicador e CCD.
[0076] Como mostrado na FIG. 2, o requerente explorou várias opções para executar o teste de tipagem de gripe e de sensibilidade antiviral em uma única amostra. Em uma modalidade, a amostra foi dividida e tratou-se com dois tampões de extração de diferentes, com cada parte do espécime a ser utilizado em apenas um ensaio. A limitação dessa abordagem é que em algumas situações espécime não foi suficientemente disponível para executar os ensaios Flu ID e AST. Em uma modalidade, um reagente de extração e tampão comum que poderia ser utilizado em ambos os ensaios foi testado. Uma limitação desta abordagem é que as condições de imunoensaio e o ensaio de cinética são diferentes, fazendo uso de um tampão comum menos que ótimo. Em outra modalidade, foi utilizado um tampão de extração único apropriado para tanto o ensaio Flu ID ou AST foi usado, com conversão do tampão para o ensaio de oposição em tempo real. Esta modalidade forneceu volume de amostra suficiente e sensibilidade para ambos os ensaios. FIG. 2, também mostra várias modalidades de formatos de ensaio para ambos testes de suscetibilidade e Flu ID que foram desenvolvidos. Leitores adequados e descartável(is) para os imunoensaios de fluxo lateral combinados e ensaios de enzima dupla são utilizados (por exemplo, se uma tira de poço é usada para a AST, um leitor de tira de poço separado pode ser utilizado, enquanto que, se uma tira de fluxo lateral é usada, um único leitor de escoamento lateral, pode ser utilizado para ambos os testes).
[0077] Em algumas modalidades, um reagente de extração comum tanto para imunoensaio e medições de resistência antivirais é usado.
[0078] Em algumas modalidades, um formato de fluxo lateral é utilizado tanto para imunoensaio e ensaio de enzima dupla em que a medição da resistência antiviral sobre a neuraminidase passa através da almofada de nitrocelulose. Em algumas modalidades, o ensaio pode ser realizado sobre os ~150 μl de espécime que permanecem frequentemente depois do cartucho de fluxo lateral de imunoensaio ser carregado. Em algumas modalidades, um ou ambos os volumes podem ser medidos em uma tira bem como um ensaio homogêneo.
[0079] Em algumas modalidades, um sistema inclui um luminômetro, como o Tropix ou Bethold, um luminômetro portátil, tal como a HG-2 do Shanghi Huguo Science Instrument Company.
[0080] Em algumas modalidades, fontes de vírus pode incluir espécimes clínicas positivas congeladas, de gripe conhecida, para verificar a cinética funcional e imunoensaio na presença de secreções nasais humanas.
[0081] Como mostrado na FIG. 3, algumas modalidades de um ensaio de cinético de enzima dupla para a atividade da neuraminidase podem incluir luciferase como a segunda enzima e um conjugado à base de luciferina como substrato. Yolken informou sobre substratos fluorescentes para neuraminidase em 1980. Buxton informou sobre substratos quimioluminescentes para neuraminidase em 2000 e Hamilton realizou uma comparação lado a lado do Teste FDA Aprovado ZestatFlu-II em 2004, que usa um substrato de neuraminidase quimioluminescente para identificação de influenza. Nenhum sistema de substrato único - enzima única evoluiu para um teste de sensibilidade às drogas robusto adequado para o desempenho em laboratório de um consultório médico. Esta pode ser uma questão de sensibilidade, endereçável por um melhor sistema de amplificação de sinal. Algumas modalidades aqui proporcionadas incluem um sistema de enzima dupla, que envolve um conjugado de luciferina. Uma vez postos em prática pela neuraminidase de influenza, as conjugadas liberam luciferina livre, que por sua vez é influenciado por luciferase. Nas modalidades aqui descritas, tais sistemas quimioluminescentes de enzima dupla podem proporcionar amplificação suficiente para um diagnóstico de suscetibilidade antiviral POC. Um exemplo de reagentes úteis com os métodos e composições aqui proporcionados incluem reagentes utilizados no ensaio QFlu ™ Combo de Cellex.
[0082] Algumas modalidades aqui fornecidas incluem demonstração de quais passos de reação de ensaio/reagentes são compatíveis quando realizada sobre mesmo período de tempo e nas proximidades, se não no mesmo espaço. Em algumas modalidades, o imunoensaio para ensaio de nucleocapsídeo e enzima dupla para a atividade de neuraminidase pode ser monitorado de perto para qualquer perda de sensibilidade, especificidade, intervalo do ensaio, resolução e tempo para resultado. Nem todos os passos dos dois ensaios precisam ser compatíveis para serem bem-sucedidos. Em algumas modalidades, os reagentes de imunoensaio Veritor ™ e os reagentes de enzima dupla atuais utilizado em ensaio Cellex QFlu ™ (atualmente destacados para fins de vigilância) são utilizados nos métodos, composições, kits, sistemas, e dispositivos revelados. Um reagente avaliado foi o reagente de lise utilizado para ambos os ensaios. Em algumas modalidades, o reagente de lise a partir do imunoensaio Veritor ™ é usado para a preparação de uma amostra usada tanto no teste da gripe A/B e a sensibilidade à droga. Em outra modalidade, o reagente de lise do ensaio de Cellex QFlu ™ é usado é usado para a preparação de uma amostra usada tanto no teste da gripe A/B e a sensibilidade à droga.
[0083] Tipos de vírus influenza A e B possuem glicoproteínas de superfície, neuraminidases capazes de hidrolisar substratos contendo ácido N-alfa- acetilneurâmico cetosidicamente ligado, por vezes referido como Neu5Ac. Os substratos avaliados para utilização no teste de suscetibilidade antiviral à base de neuraminidase incluiu moléculas híbridas (conjugados), composto de ácido N-acetilneurâmico e luciferina. Quando é liberada a luciferina na presença de luciferase, a luz é produzida em uma quantidade diretamente proporcional à atividade da neuraminidase residual na amostra. Em uma modalidade, os conjugados de N-luciferina de vaga-lume - ácido N-acetilneurâmico utilizado no kit Cellex QFlu ™ Combo, que é atualmente distribuído para aplicações de vigilância, foi avaliada. Em algumas modalidades, as experiências de avaliação do desempenho são realizadas com um estoque viral cultivado, pelo que duas reações separadas são realizadas para cada condição de teste, uma reação por exemplo contendo o antiviral (Ex: Oseltamivir) e a outra medição da atividade da neuraminidase realizada sem inibidor antiviral. Espécimes de controle podem ser ensaiados pelo método rápido e sob desenvolvimento por um dos métodos WHO IC50 recomendados. Em algumas modalidades, varredura de reagentes de suscetibilidade antiviral pode ser realizada em um micropoço, tubo ou placa ou tina e lido por quimioluminescência ou por fluorescência. A varredura pode ser realizada com cepas resistentes e sensíveis a antivirais de gripe. Quando despachada, neuraminidase pura pode ser cravada no espécime e usada em varredura de interferência. Espécimes clínicas positivas congeladas conhecidas também podem ser testadas em uma base regular, principalmente para garantir que os outros componentes da secreção nasal não estão interferindo no ensaio de enzima dupla.
[0084] Em algumas modalidades, varredura para detecção de reagentes de influenza (imunoensaio) pode ser realizada no formato de fluxo lateral e para ler a refletância, tal como é atualmente realizada na FDA aprovada CLIA Waived Veritor ™ Product. O imunoensaio BD Veritor ™ utiliza dois anticorpos monoclonais dirigidos ao nucleocapsídeo da influenza. Um anticorpo é imobilizado na superfície de uma partícula de ouro proprietária e o outro é imobilizado em nitrocelulose para o cassete de fluxo lateral. A quantidade de sinal foi detectada na tira de nitrocelulose de reação é proporcional à quantidade de vírus da gripe no espécime. Reagentes Teste de enzima dupla para a interferência de potencial para o imunoensaio Veritor ™, pode ser realizado na presença de amostras positivas de Influenza A (gripe A/PR/8/34) e Influenza B (gripe B/Lee/40) preparadas para produzir uma concentração final correspondente a um positivo moderado (~ 5 vezes nível de detecção). Teste de interferência podem ser vistos na forma de um resultado positivo falso negativo com as amostras de influenza A ou influenza B ou um resultado falso negativo com uma amostra positiva de influenza A ou Influenza B. Apenas podem ser avançados os reagentes das enzimas duplas que não apresentam interferência. Quando despachado, nucleocapsídeo puro pode ser cravado na amostra e usado para triagem de desempenho.
[0085] Outros sistemas de reagentes de enzima dupla incluem substratos semelhantes ao sistema Cellex que inclui componentes conjugados de ácido N-acetilneurâmico e luciferina mas utilizam um ligante diferente. Em algumas modalidades, uma enzima luciferase diferente pode ser usada.
[0086] Algumas modalidades dos métodos e composições aqui proporcionados incluem selecionar o formato adequado para ensaios combinados. Em algumas modalidades, em que a química é encontrada sendo compatível, em seguida, a execução completa do imunoensaio e ensaio de enzima dupla pode ser melhor manipulada sobre o formato de fluxo lateral. Quando o formato de fluxo lateral é utilizado para ambos os ensaios, um espécime processado pelo mesmo reagente de extração pode ser carregado em um bloco de amostras de fluxo lateral e momentos depois da extremidade terminal do cassete de fluxo lateral pode ser lido para a presença de influenza, incluindo Tipo A/B, e uma recomendação para a terapia baseada na suscetibilidade às drogas pode ser fornecida também. A medição de refletância pode ser feita diretamente a partir da membrana de fluxo lateral para a detecção de influenza e uma medição quimioluminescente tomada para a suscetibilidade da droga. Em algumas modalidades, uma câmera CCD resfriada portátil para medições quimioluminescentes quantitativa “no campo” pode ser usada.
[0087] Em algumas modalidades, em que uma primeira reação de enzima em um ensaio de enzima dupla não é compatível com outros reagentes de imunoensaio, a extremidade dianteira do ensaio de enzima dupla é realizada fora de linha e uma amostra parcialmente transformada com substrato clivado é carregada para a lateral de fluxo da almofada de amostra, que pode viajar abaixo da tira de fluxo lateral por ação capilar a um suporte sólido contendo a luciferase e os outros reagentes necessários para gerar um sinal luminescente.
[0088] Em algumas modalidades, os ensaios de enzima dupla no fluxo lateral podem ser alcançados através da submersão da seção do cassete de fluxo lateral processado contendo luciferina clivado dentro de um poço com luciferase e outros reagentes necessários para produzir um sinal luminescente. Luz produzida a partir do ensaio de enzima dupla é então medida por um TL Pus Luminoskan ou luminômetro equivalente.
[0089] Em algumas modalidades, o imunoensaio é conduzido e lido em um cassete de fluxo lateral e um ensaio Cellex Qflu ™ Combo em linha de corrente é conduzido e lido em uma tira de poço Os dois ensaios podem compartilhar um espécime comuns extraído, mas são executados em diferentes formatos, em seguida, lendo um instrumento comum que pode acomodar refletância de fluxo lateral e quimiluminescência de tira de poço. Em algumas modalidades, dois instrumentos separados são usados. Em algumas modalidades, os dispositivos únicos ou múltiplos são, dispositivos portáteis alimentados por bateria com uma pegada pequena, adequado para uma colocação em um consultório médico, por exemplo dimensionado para caber em uma bancada ou um suporte médico portátil.
[0090] Um conjunto de teste de 20 cepas de influenza pode ser cultivado e enumerado, permitindo que a plataforma de combinação final (descartável integrado, leitor e reagentes) a serem testados para a sensibilidade para baixo para as concentrações de partículas virais 10E3 (definidas em TCID50/ml ou CEID50/unidades de mL). O conjunto de teste de 20 cepas pode conter um equilíbrio de cepas de influenza A e B. Cepas de influenza A podem ser uma mistura de influenza H1N1 e H3N2. O conjunto de teste pode conter cepas resistentes e suscetíveis a TamifluTM. O conjunto de teste também pode incluir cepas resistentes e suscetíveis a uma segunda droga NAI. Para o progresso de referência e do sistema integrado final, cerca de 100 isolados clínicos positivos congelados conhecidos podem ser usados.
[0091] A Tabela 1 fornece antivirais NAI de exemplo (inibidor de neuraminidase) úteis com os métodos e as composições aqui fornecidos. Uma vez que uma população não pode confiar em novas cepas de influenza circulando estando sempre sensível ao Oseltamivir e Zanamivir, gerando dados no diagnóstico de suscetibilidade antiviral de POC com a droga Biota é desejável.TABELA 1
[0092] A TABELA 2 contém fenótipos específicos de exemplo e genótipos para uso com algumas modalidades dos métodos e composições fornecidos aqui. Cepas de Influenza A e Influenza B (BSL- 2), ambas resistentes e suscetíveis às drogas de neuraminidase podem ser obtidas para desenvolvimento. Em algumas modalidades, métodos e composições fornecidas aqui incluem neuraminidases de gripe subtipo A, bem como neuraminidases de Gripe B.TABELA 2
[0093] Algumas modalidades fornecidas aqui incluem o desempenho de IC50 para o ponto único de QFluTM Combo e Imunoensaios. Os sistemas VeritorTM e QFluTM podem ser usados de acordo com as bulas. Existem muitas opções para IC50 de kits preparados, tais como o kit NA-StarTM de Applied Byosistems/Life Technologies. Tabela 3 fornece exemplos de fontes e parte de números para os fornecimentos que podem ser usados no teste antiviral.TABELA 3
[0094] Algumas modalidades dos métodos e composições aqui proporcionados podem ser comparados com um ensaio quimioluminescente NAI realizado com o Kit disponível comercialmente NA-Star® (Applied Biosystems, Foster City, CA), que inclui tampão NA- Star® (26 mM de MES, 4 mM de CaC12, pH 6,0), substrato de NA-Star®, acelerador NA-Star®, e placas de 96 poços de sólido branco. Catálogo 4374348 e 4374349. Mais detalhes do método de IC50, preparação e a análise podem ser encontrados em Antimicrobial Agents and QUIMIOTERAPIA, setembro 2008, p. 3284-3292 Vol. 52, N ° 9, a qual é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[0095] Algumas modalidades incluem três opções de amostra (teste direto de cotonetes vs. teste de lavagem de nasofaringe ou aspirados). Algumas modalidades incluem testes de amostras e cultura congeladas, e a capacidade de realizar o imunoensaio de nucleocapsídeo e ensaio de atividade de neuraminidase a partir de uma única coleção.
[0096] Algumas modalidades dos métodos e composições aqui proporcionados incluem a utilização de esfregaços para coletar os espécimes. O primeiro imunoensaio Veritor ™ baseia-se uma coleta de esfregaço seco em que todo o espécime é intencionalmente comprometido com um “reagente de processamento” (volume de 400 μl) e as chamadas bula para o espécime a serem aplicados à tira de escoamento lateral, dentro de uma hora. Tipicamente, várias centenas de microlitros permanecem após um volume de -80 μl ser carregado para um cassete de fluxo lateral, deixando uma grande quantidade de antígeno processado não utilizado que pode ser dirigido para o teste de suscetibilidade antiviral. Enquanto este caminho de processamento de espécimes não parte uma amostra para cultura viral, em algumas modalidades, tanto ensaios imuno e cinéticos podem apresentar no ou perto do seu nível de pico de detecção com alguma amostra restante que pode ser suplementada com estabilizador de ácido nucleico para posterior detecção por PCR.
[0097] A plataforma Veritor ™ inclui um método em que um reagente é adicionado mucolítico concentrado para o espécime recolhido em 3 partes para 1 parte antes do carregamento em um cassete de fluxo lateral. Trezentos\microlitros de cada suspensão do organismo é adicionado ao tubo monobloco contendo RV Reagente C ou RV Reagente D tal como é vendido por BD (por exemplo no kit para o Sistema VeritorTM para um rápido diagnóstico da gripe A & B (Produto No. 256045). Mais de 10 meios de preservação de transporte foram testados com estas amostras de lavagem/aspiração com êxito. Exemplos de meios de preservação de transporte incluem: M4RT, M4, M5, UTM, Meio Ames (líquido), Meio Bartel Vira Trans ™, Hanks Solução Salina Equilibrada, solução salina normal, solução salina tamponada com fosfato. Meio M4RT tem pH 7,3 a 25 ° C e contém sais equilibrados de Hank: CaCl2, MgCl2-6H20, MgSO4-7H2O, KCl, KH2P04, NaCl, Na2HPO4-7H2O, glicose. Portanto, em algumas modalidades, uma amostra para a propagação de vírus pode ser recolhida com uma lavagem/aspirado nasofaríngeo antes do agente mucolítico ser adicionado. Um efeito de diluição de antígeno possível pode ser tomado em consideração quando usando espécimes de lavagem/aspirado nasofaringeal. O ensaio Veritor ™ tem uma sensibilidade maior do que qualquer outro ensaio rápido no mercado.
[0098] Métodos de quimiluminescência úteis com os métodos e composições aqui proporcionados incluem os divulgados na Patente US Nos. 8,221,976; 8.163.237; 7.947.820; 7.642.060; 7.291.488; 5.736.365; 5.639.428; 5.561.044; 5.518.884; 5.470.723; 5.457.027; 5.314.801; 5.017.473; e 4.810.631, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, as métricas de um ensaio de enzima dupla é substancialmente semelhante com as métricas, como o nível de detecção para virião da gripe, obtido utilizando o imunoensaio Veritor ™. Em algumas modalidades, a substância química para detectar a presença de neuraminidase pode produzir um sinal suficiente em 103 TCID50 para permitir também para uma robusta relação de 5: 1 a ser observada entre as reações realizadas com droga e drogas w\o. Em algumas modalidades, tanto a sensibilidade e a faixa linear de tempo podem ser avaliadas. Em algumas modalidades, o Cellex pode ser usado.
[0099] A FIG. 12 mostra uma química à base de esterase que pode ser utilizada com as composições e métodos aqui proporcionados para ensaio de atividade de neuraminidase. Métodos úteis com modalidades dos métodos e composições aqui proporcionados incluem os descritos no seguinte: Mize et al, Dual Enzyme Cascade, Analytical Chemistry, 179, (1989) p229-235; Patente U.S. 4.904.583; Patente US 4.835.099, os quais são, cada uma, aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Algumas modalidades incluem enzimas de luciferase modificadas e substratos dos mesmos, tais como conjugados de ácido neuramínico- luciferina modificados. Outros inibidores que podem ser utilizadas incluem o seguinte: R = H Inibidor de Esterase R = NANA Inibidor de Esterase Mascarado Alguns possíveis Inibidores Beta-tio Variantes/Inibidor mascarado
[00100] O composto na FIG. 12 tem a trifluorcetona na posição para. Mais inibidores de esterase incluem 1,1,1-trifluor-4-(4- hidroxifenil)butan-2-ona (para); 1,1,1-trifluor-4- (3-hidroxifenil) butan-2- ona (meta); e 1,1,1 -Trifluro-4- (2-hidroxifenil) butan-2-ona (orto).
[00101] Substratos de inibidores mascarados alternativos para utilização nas modalidades descritas na presente invenção incluem os que têm a trifluorcetona nas posições -meta e -orto como provido abaixo:
[00102] Em outra modalidade, um ácido N-acetilneuramínico 4,7 metilado (NANA)-trifluorcetona poderia ser utilizado no processo de ensaio de inibidor mascarado, com maior especificidade para a neuraminidase da gripe.
[00103] Algumas modalidades incluem um composto inibidor de máscaras para uso em um ensaio de sensibilidade a neuraminidase da gripe de enzima dupla tendo a estrutura da Fórmula (1):em que: R1, R2 e R3 são cada independentemente hidrogênio ou Ci-5 alquila; n é 0, 1, 2 ou 3; R4 é -(CHz)mC(=O)CFa; m é 0 ou 1; X é - S(O)z- ou -CH(R5); R5 é -S(O)zCH3; e z é 0, 1 ou 2.
[00104] Em algumas modalidades, um composto da Fórmula (I) é selecionado do grupo consistindo de:
[00105] Em algumas modalidades, os dados de genótipo são obtidos a partir de um virião da gripe de um espécime. Em algumas modalidades, um isolado de vírus em particular pode produzir um perfil de sensibilidade às drogas com um método de IC50 de cultura de tecidos de referência diferente de um perfil a partir do teste de POC rápido. Os perfis diferentes podem ser devidos de uma mutação nos resíduos dentro do sítio ativo e neuraminidase conhecido por conferir resistência em subtipos de gripe ou substituições em outras partes do quadro NA específico. Métodos para sequenciar ácidos nucleicos a partir de amostras são bem conhecidos na arte.
[00106] Em algumas modalidades, prevê-se que algumas amostras de pacientes com suspeita de ter uma infecção de gripe podem conter outros patógenos que produzem uma neuraminidase. TABELA 4 fornece exemplos de patógenos mais comumente encontrados em espécimes clínicas positivas para gripe.TABELA 4
[00107] A Tabela 5 fornece exemplos de patógenos que podem ser testados em testes de interferência da amostra. Tais patógenos podem ser testados quanto a qualquer efeito sobre os métodos e composições aqui fornecidos. Testes de interferência com os vírus inteiros ou neuraminidase purificada. Estes patógenos podem ser testados a concentrações que se esperam estar presentes em coleções clínicas.TABELA 5
[00108] Em algumas modalidades, as amostras podem incluir lavagens nasofaríngeas, aspirados e esfregaços.
[00109] Algumas das modalidades aqui proporcionadas incluem a detecção da presença de um vírus de influenza tipo A ou de um vírus de influenza tipo B, em uma amostra. Algumas modalidades incluem a utilização de um imunoensaio para identificar antígenos virais que podem distinguir entre tipos de gripe, tais como a A/B. Em algumas modalidades, o antígeno é um nucleocapsídeo. Em algumas modalidades, o imunoensaio compreende um ensaio sanduíche. Em algumas de tais modalidades, um primeiro anticorpo se liga especificamente a um antígeno alvo, e o antígeno ligado e, em seguida, primeiro anticorpo se liga especificamente a um segundo anticorpo que produz um sinal. Em algumas modalidades, o sinal é colorimétrico, fluorescente, quimioluminescente e radioativo. Em algumas modalidades, um imuno- ensaio pode incluir sistema de fluxo lateral. Em algumas modalidades, uma tira de teste compreende o imunoensaio. Os sistemas e composições úteis com os métodos e composições aqui proporcionados incluem o Sistema de Veritor ™ para a detecção rápida de Gripe A + B (Becton Dickinson). Em alguns casos, a saída da tira de teste será refletância. Em algumas modalidades, a saída da tira de teste com uma mudança de cor que pode ser medida utilizando um leitor de refletância. Além de formatos de imunoensaios de fluxo lateral, modalidades para determinar tipo A ou tipo B do vírus da gripe podem compreender a detecção molecular e imuno em fase de solução, em substratos tais como membranas, superfícies e partículas. Em algumas modalidades, micropoços ELISA, ensaios de separação de nanomarcação-magnética, e aglutinações de partículas. Um exemplo de um ensaio de detecção molecular inclui Sistema Xpert® Flu (Cephied, Sunnyvale, CA). As modalidades que incluem nanomarcações, incluem a espectroscopia de Raman de superfície melhorada (SERS) de nanomarcações. Ver, por exemplo, ACS Nano, 2009, 3 (10), pp 2859-2869, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. As modalidades que incluem partículas de aglutinação são bem conhecidas e incluem o contato de um antígeno em um fluido com elementos de ligação de antígenos, tais como anticorpos, que são revestidos em partículas. Ver p.ex.. US 4,590,169, que está aqui incorporada por referência na sua totalidade.
[00110] Algumas das modalidades aqui proporcionadas incluem a detecção da presença de um vírus influenza de tipo A ou de um vírus influenza de tipo B, em uma amostra incluem métodos de não- imunoensaio. Em algumas modalidades, a presença de um vírus influenza tipo A ou influenza tipo B pode ser detectada utilizando métodos baseados em ácidos nucleicos, tais como PCR, hibridação de ácido nucleico e a sequência de ácido nucleico.
[00111] Algumas modalidades aqui proporcionadas incluem detectar e/ou medir a atividade do neuraminidase em uma amostra. Em algumas modalidades, a neuraminidase é uma neuraminidase viral, tal como um vírus influenza tipo A ou tipo B da neuraminidase. Em algumas modalidades, a enzima a ser detectada é um sialidase. Em algumas modalidades, a atividade da neuraminidase pode ser medida utilizando um ensaio de enzima dupla. Os reagentes úteis com algumas modalidades dos métodos e composições aqui proporcionados incluem os ensaios QFlu™ NI (Cellex, Inc., Maryland) e o Ensaio QFluTM Combo.
[00112] Em algumas modalidades, um substrato para neuraminidase é convertido a um substrato para uma segunda enzima, tal como uma esterase, tal como a luciferase. Em algumas modalidades, um substrato para neuraminidase inclui os conjugados de derivados de ácido N-acetilneuramínico (ácido siálico) e derivados de luciferina. Em algumas modalidades, os conjugados entre o ácido N-acetilneuramínico ou seus derivados e luciferina, estão ligados entre si através de uma ligação de glicosídeo através de um grupo -OH no anel de açúcar do ácido N-acetilneuramínico. Em algumas modalidades, a posição no anel de açúcar é a posição 2' uma vez que esta é a ligação de glicosídeo favorecida pela neuraminidase da gripe. Exemplos de derivados de ácido siálico incluem 4-alquila ou 7-alquila ou 4,7 alquila de ácidos N- acetilneuramínicos (por exemplo, aqueles descritos na Pat. No. 6.303.764 e Pat. Nos. 6,420,552, 6.680.054, que são aqui incorporadas por referência na sua totalidade). Um exemplo é conjugado de ácidos N- acetilneuramínico 4,7 metilado - luciferina de vagalume. As modalidades de tais conjugados são fornecidas na Patentes US No. 7.893.272 que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, os conjugados utilizados como substrato de neuraminidase podem ser representados pela seguinte fórmula apresentada para o sal de sódio:
[00113] Em algumas modalidades, R1, R2, R3 são cada, independentemente de um outro, hidrogênio ou alquila tendo de 1-5 átomos de carbono.
[00114] Em algumas modalidades, um substrato para neuraminidase é convertido em um inibidor para uma segunda enzima, tal como uma esterase, tal como a luciferase. Em algumas modalidades, um substrato para neuraminidase inclui os conjugados de derivados de ácido N-acetilneuramínico (ácido siálico) e derivados de uma trifluormetilcetona (CF3). Os derivados de ácido N-acetilneuramínico são descritos acima. Em algumas modalidades, um substrato para neuraminidase é:
[00115] Em algumas modalidades, o inibidor de trifluormetilcetona inclui:
[00116] Em algumas modalidades, em que um substrato para neuraminidase é convertido em um inibidor para uma segunda enzima, tal como uma esterase, o substrato é também conhecido como um inibidor mascarado. Exemplos de inibidores úteis mascarados com alguns dos métodos aqui proporcionados são aqui descritos.
[00117] Um exemplo de síntese é mostrado na FIG. 4. Em algumas modalidades, uma amostra pode conter uma neuraminidase a partir de uma fonte que não seja o vírus influenza. Em algumas modalidades, uma neuraminidase indesejada é inibida utilizando anticorpos e inibidores específicos. A atividade da neuraminidase indesejada é inibida usando anticorpos policlonais ou anticorpos monoclonais específicos. Por exemplo, para a detecção da neuraminidase viral, a atividade de neuraminidase não específica a partir de organismos suscetíveis contaminantes presentes nas amostras tais como as espécies de bactérias Streptococcus pneumoniae e Actinomyces viscosus são inibidas usando anticorpos específicos para as neuraminidases a partir dessas fontes. Esta abordagem é possível porque neuraminidases de diferentes organismos possuem sequências de aminoácidos distintas, que permite a geração de espécie específica, ou subespécies específicas, anticorpos de neuraminidase. Por exemplo, anticorpos específicos são comumente usados para diferenciar subtipos de neuraminidase do vírus da gripe em ensaios de neutralização de neuraminidase.
[00118] Algumas modalidades aqui proporcionadas incluem ensaios de combinação em que uma amostra é ensaiada para (1) a identificação do vírus influenza tipo A ou B na amostra; e (2) a sensibilidade da neuraminidase do vírus influenza a certas drogas antivirais. Em algumas modalidades, o imunoensaio para a identificação do tipo A ou do tipo B do vírus da gripe na amostra é realizada em um tampão que é diferente do ensaio para medir a sensibilidade da neuraminidase do vírus influenza a certas drogas antivirais.
[00119] Em algumas modalidades, um espécime é obtido. Em algumas modalidades, as amostras podem incluir lavagens, aspirados e esfregaços nasofaríngeos. Em algumas modalidades, pode haver quantidades insuficientes de um espécime para preparar várias amostras iniciais em diferentes tampões. Em algumas modalidades, uma amostra é colocada em um primeiro tampão para se obter uma primeira amostra de teste para um primeiro ensaio. Em algumas modalidades, a primeira amostra de teste compreende um tampão que é incompatível com um segundo ensaio. Por exemplo, o primeiro tampão pode inibir a um segundo ensaio. Em algumas de tais modalidades, a primeira amostra de teste é convertida para uma segunda amostra de teste compreendendo um segundo tampão que é compatível com um segundo ensaio. Em algumas modalidades, o primeiro ou segundo ensaio inclui um imunoensaio para a identificação do vírus influenza tipo A ou do tipo B na amostra. Em algumas modalidades, o primeiro ou o segundo ensaio é um ensaio para determinar a sensibilidade da neuraminidase do vírus influenza a uma certa droga antiviral.
[00120] Em algumas modalidades, uma amostra é adicionada a um primeiro tampão compatível com um imunoensaio para a identificação do vírus da influenza tipo A ou tipo B, de modo a preparar uma amostra de teste de imunoensaio. Uma primeira parte da amostra de teste de imunoensaio pode ser aplicada a um imunoensaio para a identificação do vírus influenza tipo A ou B. A segunda parte pode ser convertida a uma amostra de teste com neuraminidase, por contato da amostra de teste de imunoensaio para uma matriz de troca equilibrada com um segundo tampão compatível com um ensaio de atividade da neuraminidase. Exemplos de matrizes incluem polissacáridos reticulados, tais como Sephadex e Sepharose. Em algumas modalidades, a neuraminidase compreende um cartucho que compreende uma câmara que compreende a matriz. A variedade sephadex pode ser um meio de G25, G25 curso, G25 bem. A altura do leito pode ser em qualquer lugar de um centímetro de 15 centímetros. Em algumas modalidades, a resina pode ser fornecida pré-lavada e pré-equilibrada com um tampão que promove a liberação da neuraminidase da influenza e uma medição da atividade da neuraminidase subsequente. Tais reagentes são semelhantes aos encontrados nos kits NA-StarTM e NA-FLUORTM e produto ZstatFluTM. Estes tampões conterão tipicamente um baixo teor de cloreto de sódio, tal como menos de 100 mM e muitas vezes menos de 10 mM. Em algumas modalidades, o teor de cloreto de sódio é de 100 mM e 0,1 mM, 100 mM e 1 mM, 10 mM e 0,1 mM e 10 mM e 1 mM. Estes tampões conterão tipicamente íons de cálcio e/ou magnésio na faixa de 0,1 mM a 50 mM, 1 mM a 20 mM, ou e 4 mM a 10 mM, para se obter a medição da atividade da neuraminidase mais ótima. O pH de tampões usados para equilibrar a resina deve ser entre 5 e 8 para assegurar que o ensaio de atividade de neuraminidase subsequente pode funcionar em cepas raras contendo neuraminidase sensível a pH, como a influenza letal H7N9. O espécime de gripe que passa através do cartucho de resina pode conter uma pequena quantidade de detergente semelhante à do detergente usado para liberar o nucleocapsídeo para o imunoensaio de identidade da gripe. Os detergentes podem incluir NP-40, os sais biliares, Brij-35 e Tritons. Um exemplo de um Triton é Triton-X-100. Um exemplo de um sal biliar é desoxicolato de sódio. Estes agentes de lise de tecidos e vírus podem vir em estoques líquidos e em outros casos, estar disponível como sólidos. Tritons e NP-40 podem estar presentes de 0,01% a 10% v/v, ou 0,5% a 3% v/v na amostra que passa através do cartucho de resina. Os detergentes sólidos podem estar presentes em concentrações que variam de 0,1% a 10% p/v, ou 0,5% a 2% p/v.
[00121] Em algumas modalidades, uma amostra é adicionada a um primeiro tampão compatível com o ensaio de uma atividade de neuraminidase de modo a preparar uma amostra de teste de ensaio de neuraminidase. Uma primeira parte da amostra de teste com neuraminidase pode ser aplicada a um ensaio de atividade da neuramini-dase. A segunda parte pode ser convertida a uma amostra de teste de imunoensaio por contato da amostra de teste com neuraminidase, a uma matriz de troca equilibrada com um segundo tampão compatível com um imunoensaio para a identificação do tipo A ou B do vírus influenza. Exemplos de tais matrizes incluem polissacá-ridos reticulados, tais como Sephadex, Sepharose e nitrocelulose. Em algumas modalidades, o imunoensaio compreende uma tira de teste e a matriz compreende nitrocelulose. Em algumas modalidades, o segundo tampão é liofilizado ou seco de outra forma para baixo para a matriz. O tampão de extração destinado a tornar disponível para a detecção da nucleocápside de imunoensaio é preposicionado na almofada de amostra para a almofada de conjugado, ou ambos. Os exemplos adequados destas almofadas (membranas) incluem a fibra de vidro Millipore G041, Millipore GFDX e celulósico Millipore C083, C048 Millipore, Millipore C068, C083 Millipore, Millipore C248, uma família específica de almofadas Millipore adequada é a linha de produtos SureWick. Outros exemplos adequados são a GE Healthcare CF1, CF3, CF4 linter de algodão, Whatman Fusão 5, Std 14 e Std 15, e almofadas de espécime de poliéster -conjugados são outros exemplos. FIG. 14 ilustra uma modalidade da pré-posicionamento de reagentes de extração do nucleocapsídeo de imunoensaio no imunoensaio de fluxo lateral de tira de teste.
[00122] Algumas modalidades aqui proporcionadas incluem a medição da sensibilidade de uma neuraminidase para um composto de teste. Um composto de teste inclui uma droga antiviral, tal como uma droga anti-viral para a gripe. Em modalidades, a atividade de uma neuraminidase é medida na presença e ausência de um composto de teste. A razão entre a atividade pode ser usada para determinar um valor de inibição, e o valor de inibição pode ser comparado com um limite de inibição selecionado para determinar se a neuraminidase é sensível ou resistente ao composto de teste.
[00123] Em algumas modalidades, um valor de limite de inibição pode ser determinado através da determinação dos valores de inibição para um painel de diferentes vírus com sensibilidade conhecida ou resistência a um composto de teste em particular. Os valores de inibição para cada um dos vírus podem ser representados graficamente e o limite de inibição determinado a situar-se entre os valores de inibição de vírus que são sensíveis ao composto de teste, e os valores de inibição de vírus que são resistentes ao composto de teste. Os requerentes descobriram inespera-damente que os limites de inibição para o vírus influenza tipo A e influenza tipo B são diferentes. Em algumas modalidades, o vírus do tipo A tem um limite de inibição inferior a vírus do tipo B para certos compostos de teste. Em algumas modalidades, se o tipo de vírus da gripe em uma amostra é conhecido (por exemplo, tipo A ou tipo B), o nível de limite de inibição adequado pode ser aplicado para o composto testado, o que pode aumentar a sensibilidade do ensaio significativamente, permitindo a capacidade de resolver cepas de gripe com apenas um baixo nível de resistência aos medicamentos das cepas que não apresentem resistência às drogas de qualquer tipo.
[00124] Algumas modalidades dos métodos e composições aqui proporcionados incluem cartuchos de teste para um ensaio de neuraminidase. Em algumas modalidades, em um ensaio de neuraminidase para determinar a sensibilidade de um composto de teste, tal como uma droga de ensaio e/ou uma droga antiviral, pode ser realizado em um cartucho que compreende uma câmara de matriz e uma câmara de reagente. Em algumas modalidades, o cartucho pode incluir uma ou mais câmaras de ensaio. As câmaras de teste podem incluir mais câmaras de teste para: espécime + reagentes de ensaio sem composto de teste; reagentes de ensaio sem amostra ou composto de teste; espécime + reagentes de ensaio + composto de teste; e reagente de ensaio + composto de ensaio sem amostra. Em algumas modalidades, vários compostos de teste são testados, e câmaras de teste adicionais para o espécime + reagentes de ensaio + composto de teste, e reagente de ensaio + composto de teste sem espécime para cada composto de teste adicional são incluídos (por exemplo, primeiro, segundo, terceiro, quarto, etc. composto de teste). As câmaras de teste de controle para espécimes+ reagentes de ensaio e/ou reagentes de ensaio, podem ser utilizados para todos os compostos de teste testados no cartucho. Em algumas modalidades, a câmara de matriz está em comunicação fluida com uma ou mais outra câmara, tais como câmaras, que são selecionadas para conter espécime. Em algumas modalidades, as câmaras de teste incluem: (1) Ensaio com a droga, que inclui a mistura de reação de amostra, e droga de teste; (2) Teste sem droga, que inclui a mistura de reação e da amostra; (3) Controle de mistura de reação, que inclui mistura de reação; e (4) de controle para a droga de teste, que inclui mistura de reação e de drogas. Em algumas modalidades, os outros controles podem ser incluídos.
[00125] Em algumas modalidades, uma amostra de fluido é adicionada à câmara de matriz. A amostra de fluido flui através da câmara de matriz para uma câmara selecionada para conter amostra por uma ou mais forças selecionadas de difusão, fluxo capilar, e gravidade. Sinal a partir de uma reação que ocorre em uma câmara pode ser medido usando um tubo fotomultiplicador. Um cartucho de exemplo é mostrado na FIG. 5.
[00126] Algumas modalidades aqui proporcionadas incluem a detecção de um vírus da gripe que compreende o contato de uma amostra com um tampão de imunoensaio adaptado para um imunoensaio para a detecção de um vírus influenza tipo A ou um vírus influenza tipo B, obtendo-se assim uma amostra de teste de imunoensaio; o contato de uma primeira parte da amostra de teste de imunoensaio para uma tira de teste que compreende um imunoensaio para a detecção de um vírus influenza tipo A ou tipo B, detectando deste modo a presença ou ausência de influenza do tipo A ou do tipo B na amostra; o contato de uma segunda parte da amostra de teste de imunoensaio com uma matriz compreendendo um tampão de teste com neuraminidase, obtendo-se assim uma amostra de teste com neuraminidase; e o contato da amostra de teste com neuraminidase, com um ensaio de neuraminidase, detectando-se assim a presença de uma neuraminidase na amostra. Em algumas modalidades, o tampão de imunoensaio é incompatível com um ensaio para a atividade da neuraminidase. Em algumas modalidades, o tampão de imunoensaio inibe a atividade da neuraminidase.
[00127] Algumas modalidades dos métodos e composições aqui proporcionados incluem métodos para a detecção de um vírus influenza que compreende: o contato de uma amostra com um tampão de ensaio de neuraminidase adaptado para um ensaio de neuraminidase, obtendo- se assim uma amostra de teste com neuraminidase; o contato de uma primeira parte da amostra de teste com neuraminidase com uma tira de teste que compreende um imunoensaio para a detecção de uma influenza tipo A ou tipo B, em que a amostra de testes de neuraminidase contacta uma matriz compreendendo tampão de imunoensaio, obtendo-se assim uma amostra de teste de imunoensaio e detectando a presença ou ausência de influenza tipo A ou tipo B na amostra; e o contato de uma segunda parte da amostra de teste com neuraminidase, com um ensaio de neuraminidase, detectando-se assim a presença de uma neuraminidase na amostra. Em algumas modalidades, o tampão de ensaio de neuraminidase é incompatível com um imunoensaio para a detecção de um tipo de vírus influenza A ou tipo B. Em algumas modalidades, o tampão de ensaio de neuraminidase inibe a ligação específica de um anticorpo a um antígeno selecionado a partir do grupo que consiste de influenza do tipo A e influenza tipo B. Em algumas modalidades, a matriz compreende tampão de imunoensaio liofilizada.
[00128] Em algumas modalidades, a matriz compreendendo um tampão de teste com neuraminidase, e os reagentes para o ensaio de neuraminidase estão no mesmo recipiente, tal como um cartucho. Em algumas modalidades, o recipiente compreende uma pluralidade de câmaras, por exemplo uma câmara que compreende a matriz, e uma câmara que compreende os reagentes para o ensaio de neuraminidase. Em algumas modalidades, a matriz compreende um polissacárido reticulado, tal como Sephadex e Sepharose. Em algumas modalidades, o recipiente compreende um cartucho com múltiplas cavidades, adaptado para ser lido, utilizando um tubo fotomultiplicador, tal como um tubo fotomultiplicador portátil. A tira de multi-poços, ou cartucho de resina de tira de multi-poços é então transferida através de um posicionamento do trilho de cada poço diretamente sob o detector. O movimento através do trilho é feito por um motor passo a passo, que é programado para parar e permitir a cada cavidade a ser contada.
[00129] Em algumas modalidades, a amostra de teste de imunoensaio e a amostra de teste de neuraminidase são movidas no vaso por uma ou mais forças selecionadas de gravidade, ação de capilaridade, e difusão.
[00130] Algumas modalidades e métodos e composições fornecidas aqui incluem determinar a sensibilidade de uma neuraminidase a um composto de teste compreendendo: (a) obter uma razão de valor de inibição, em que a razão compreende o nível de atividade de neuramini-dase na presença de um composto teste comparado ao nível de atividade de neuraminidase na ausência do composto teste; e (b) comparar a razão do valor de inibição a um limite de inibição, assim determinando a sensibilidade da atividade de neuraminidase ao composto de teste. Uma razão de valor de inibição acima do limite de inibição indica que a atividade de neuraminidase é sensível ao composto teste, e assim a cepa de gripe é sensível ao composto de teste, e uma razão abaixo do limite indica que a atividade de neuraminidase não é sensível ao composto de teste, e assim a cepa de gripe é resistente ao composto de teste. Em algumas modalidades, o limite de inibição é determinado pelo composto de teste. Em algumas modalidades, um composto de teste pode ser selecionado de acordo com a sensibilidade da neuraminidase ao composto de teste de modo a tratar a influenza. Em algumas modalidades, um paciente sofrendo da cepa de gripe testada pode ser recomendado a tomar o composto de teste, ou o composto de teste pode ser fornecido a um paciente, onde a neuraminidase é sensível ao composto de teste.
[00131] Em algumas modalidades, o ensaio de neuraminidase compreende um ensaio de enzima dupla compreendendo uma enzima de sinalização. Em algumas modalidades, atividade de neuraminidase produz um substrato para a enzima de sinalização. Em algumas modalidades, o ensaio de neuraminidase compreende um conjugado de um ácido N-acetilneuramínico e luciferina ou um derivado do mesmo. Em algumas modalidades, atividade de neuraminidase produz um inibidor para a enzima de sinalização. Em algumas modalidades, o ensaio de neuraminidase compreende um conjugado de um ácido N-acetilneura- mínico e uma trifluormetilcetona ou um derivado da mesma. Em algumas modalidades, a enzima de sinalização compreende luciferase. Em algumas modalidades, o tampão de imunoensaio inibe atividade de luciferase. Em algumas modalidades, o nível de atividade de neuramini-dase é medido usando um tubo fotomultiplicador.
[00132] Em algumas modalidades, o composto de teste é uma droga antiviral. Em algumas modalidades, o composto de teste é uma droga antiviral selecionada do grupo consistindo de Oseltamivir, Zanamivir, Peramivir e lanamivir.
[00133] Em algumas modalidades, o imunoensaio compreende um ensaio sanduíche.
[00134] Em algumas modalidades, a amostra é obtida de um paciente, tal como um humano, tal como um paciente suspeito de ter influenza.
[00135] Em algumas modalidades, o ensaio de combinação descrito aqui tem um limite de detecção de vírus influenza em termos de dose infecciosa de pelo menos 2000 TCID50/ml, 1000 TCID50/ml, 500 TCID50/ml, 200 TCID50/ml, 100 TCID50/ml, ou uma faixa definida por quaisquer dois destes valores. Em uma base molar o teste de combinação divulgado tem a capacidade de detectar neuraminidase a pelo menos 1000 fM, 5000 fM, 100 fM, 10 fM, ou uma faixa definida por quaisquer dois destes valores.
[00136] Algumas modalidades dos métodos e composições aqui proporcionados incluem métodos para a seleção de um tratamento para o vírus influenza que compreende (a) contactar uma amostra com um tampão de imunoensaio adaptado para um imunoensaio para a detecção de um vírus influenza tipo A ou vírus influenza tipo B, obtendo-se assim uma amostra de teste de imunoensaio; (b) contactar uma primeira parte da amostra de teste de imunoensaio para uma tira de teste de fluxo lateral compreende um imunoensaio para a detecção de vírus influenza tipo A ou tipo B, detectando deste modo a presença ou ausência de influenza do tipo A ou do tipo B na amostra; (c) contactar uma segunda parte da amostra de teste de imunoensaio com uma matriz compreendendo um tampão de teste com neuraminidase, obtendo-se assim uma amostra de teste com neuraminidase; (d) contactar a amostra de teste com neuraminidase, com um ensaio de neuraminidase, determinando-se assim a sensibilidade de uma neuraminidase da amostra de teste com neuraminidase de um composto de teste (por exemplo, droga antiviral de influenza), o que compreende determinar: (i) a obtenção de uma relação de valor de inibição, em que a relação compreende o nível de atividade de neuraminidase na presença de um composto de teste em comparação com o nível de atividade de neuraminidase na ausência do composto de teste, e (ii) comparar a razão do valor de inibição a um limite de inibição, determinando-se assim a sensibilidade da atividade da neuraminidase ao composto de teste; e (e) selecionar ou identificar o composto de teste determinado para inibir a atividade da neuraminidase. Em algumas modalidades, a inibição limiar é determinada pela detecção do vírus tipo A ou tipo B. Em algumas modalidades, o tampão de imunoensaio é incompatível com um ensaio para a atividade de neuraminidase. Em algumas modalidades, o tampão de imunoensaio inibe a atividade da neuraminidase. Em algumas modalidades, os passos (c) e (d) são realizados no mesmo vaso. Em algumas modalidades, o paciente é suspeito de ter gripe. Em algumas modalidades, o paciente é humano.
[00137] Algumas modalidades dos métodos e composições aqui proporcionados incluem métodos para a seleção de um tratamento para o vírus influenza que compreende: (a) contactar uma amostra com um tampão de ensaio de neuraminidase adaptado para um ensaio de neuraminidase, obtendo-se assim uma amostra de teste com neuraminidase; (b) contactar uma primeira parte da amostra de teste com neuraminidase para uma tira de teste que compreende um imunoensaio para a detecção de um vírus influenza tipo A ou tipo B, em que a amostra de testes de neuraminidase contacta uma matriz compreendendo tampão de imunoensaio, obtendo-se assim uma amostra de teste de imunoensaio e a detecção da presença ou ausência de influenza do tipo A ou do tipo B na amostra; e (c) o contactar uma segunda parte da amostra de teste com neuraminidase, com um ensaio de neuraminidase, determinando-se assim a sensibilidade de uma neuraminidase da amostra de teste com neuraminidase de um composto de teste, o que compreende determinar: (i) a obtenção de uma razão de valor de inibição, em que a razão compreende o nível de atividade de neuraminidase na presença de um composto de teste em comparação com o nível de atividade de neuraminidase na ausência do composto de teste, e (ii) comparar a razão do valor de inibição a um limite de inibição, determinando-se assim a sensibilidade da atividade de neuraminidase ao composto de teste; e (e) seleção do composto de teste determinado para inibir a atividade da neuraminidase. Em algumas modalidades, o limite de inibição é determinado pela detecção do vírus tipo A ou tipo B. Em algumas modalidades, a matriz compreende tampão de imunoensaio liofilizado. Em algumas modalidades, o passo (c) é realizado no mesmo vaso.
[00138] Em algumas modalidades, o limite de inibição é determinado pela detecção de um vírus do tipo A ou do tipo B, em que um primeiro limite de inibição é utilizado, se um vírus da gripe tipo A for detectado, e um segundo limiar de inibição é usado, se o vírus da gripe tipo B é detectado. Em algumas modalidades, o limite de inibição é menor se vírus da gripe tipo A é detectado do que se for detectado vírus da gripe do tipo B.
[00139] Em algumas modalidades, o vaso compreende uma pluralidade de câmaras, por exemplo uma câmara compreendendo a matriz, e uma câmara compreendendo os reagentes para o ensaio de neuraminidase. Em algumas modalidades, a matriz compreende um polissacárido reticulado, tal como Sephadex e Sepharose.
[00140] Em algumas modalidades, o vaso compreende um cartucho, tal como um cartucho com múltiplas cavidades, adaptado para ser lido usando um tubo fotomultiplicador. Em algumas modalidades, o tubo fotomultiplicador é portátil.
[00141] Em algumas modalidades, o ensaio de neuraminidase compreende um ensaio de enzima dupla compreendendo uma enzima de sinalização. Em algumas modalidades, a atividade da neuraminidase produz um substrato para a enzima de sinalização. Em algumas modalidades, o ensaio de neuraminidase compreende um conjugado de um ácido N-acetilneuramínico e luciferina ou de um derivado do mesmo. Em algumas modalidades, a atividade da neuraminidase produz um inibidor para a enzima de sinalização. Em algumas modalidades, o ensaio de neuraminidase compreende um conjugado de um ácido N- acetilneuramínico e uma trifluormetilcetona ou um derivado do mesmo. Em algumas modalidades, a enzima compreende a sinalização de luciferase. Em algumas modalidades, o nível de atividade da neuramini-dase é medido usando um tubo fotomultiplicador.
[00142] Em algumas modalidades, o composto de teste é uma droga anti-viral. Em algumas modalidades, o composto de teste é uma droga antiviral selecionada a partir do grupo que consiste de oseltamivir, zanamivir, Peramivir e Lanamivir.
[00143] Em algumas modalidades, o imunoensaio compreende um ensaio sanduíche.
[00144] Em algumas modalidades, a amostra é obtida de um paciente.
[00145] Algumas modalidades proporcionadas aqui, incluem sistemas de diagnóstico para a detecção do vírus da gripe. Em algumas modalidades, tais sistemas incluem um cartucho para a determinação da atividade da neuraminidase em uma amostra, em que o cartucho é configurado para processar uma amostra compreendendo um tampão incompatível para a determinação de uma amostra compreendendo um tampão compatível para a determinação; e uma tira de teste para a detecção de influenza tipo A ou tipo B na amostra, em que a tira de teste, tal como uma tira de fluxo lateral, está configurada para processar uma amostra compreendendo um tampão incompatível para a detecção de uma amostra que compreende um tampão compatível para a detecção. Em algumas modalidades, esses sistemas também incluem um primeiro detector configurado para medir um sinal a partir do cartucho; e um segundo detector configurado para medir um sinal a partir da tira de teste.
[00146] Em algumas modalidades, o cartucho compreende uma câmara de matriz compreendendo uma matriz de cartucho compreendendo o tampão compatível para a determinação, e uma câmara de reagente compreendendo os reagentes para a determinação da atividade da neuraminidase. Em algumas modalidades, o cartucho compreende uma matriz de polissacárido reticulado. Em algumas modalidades, o cartucho de matriz é selecionado a partir do grupo consistindo de Sephadex e Sepharose. Em algumas modalidades, a câmara de matriz e a câmara de cartucho estão em comunicação fluida de tal modo que uma amostra aplicada aos fluxos de câmara de matriz a partir da câmara de matriz para a câmara de reagente. Em algumas modalidades, a amostra flui para dentro do cartucho por uma ou mais forças selecionadas de gravidade, de ação capilar, e difusão. Em algumas modalidades, o cartucho compreende um cartucho com múltiplas cavidades, adaptado para ser lido usando um tubo fotomultiplicador.
[00147] Em algumas modalidades, a tira de teste compreende um imunoensaio. Em algumas modalidades, o imunoensaio é um ensaio em sanduíche. Em algumas modalidades, a tira de teste compreende uma matriz que compreende o tampão compatível para a detecção. Em algumas modalidades, a matriz compreende nitrocelulose. Em algumas modalidades, o tampão compatível para a detecção é liofilizado.
[00148] Em algumas modalidades, o primeiro detector compreende um luminômetro. Em algumas modalidades, o primeiro detector compreende um leitor de refletância. Em algumas modalidades, o segundo detector compreende um tubo fotomultiplicador. Em algumas modalidades, um dispositivo compreende o primeiro e segundo detectores. Em algumas modalidades, o primeiro e segundo detectores são os mesmos. Em algumas modalidades, o dispositivo é portátil. Em algumas modalidades, o dispositivo é portátil. Em algumas modalidades, a faixa de fluxo lateral e vários poços cartucho de tiras/resina são lidos em uma plataforma comum com duas modalidades de detecção separadas, mas comparti-lhando uma fonte de energia comum e de exibição para analisar os resultados de ambos os ID e AST.
[00149] Algumas modalidades fornecidas aqui incluem kits de diagnóstico para detecção de vírus influenza. Em algumas modalidades, tais kits incluem um cartucho para a determinação da atividade da neuraminidase em uma amostra, em que o cartucho é configurado para processar uma amostra compreendendo um tampão incompatível para a determinação de uma amostra compreendendo um tampão compatível para a determinação; e uma tira de teste para a detecção de influenza tipo A ou tipo B na amostra, em que a tira de teste é configurada para processar uma amostra compreendendo um tampão incompatível para a detecção de uma amostra que compreende um tampão compatível para a detecção.
[00150] Algumas modalidades incluem também um primeiro detector configurado para medir um sinal a partir do cartucho; e um segundo detector configurado para medir um sinal a partir da tira de teste.
[00151] Algumas modalidades também incluem reagentes para um ensaio de atividade da neuraminidase. Em algumas modalidades, os reagentes de ensaio de atividade de neuraminidase são selecionados a partir do grupo consistindo de luciferase, um conjugado de um ácido N- acetilneuramínico e de luciferina ou de um derivado do mesmo, um ácido N-acetilneuramínico e uma trifluormetilcetona ou um derivado do mesmo, e uma droga antiviral. Em algumas modalidades, o antiviral é selecionado dentre o grupo consistindo de oseltamivir, zanamivir, Peramivir e Lanamivir.
[00152] Algumas modalidades também incluem reagentes para um imunoensaio. Em algumas modalidades, os reagentes de imunoensaio são selecionados a partir do grupo que consiste de um anticorpo específico para um antígeno de influenza de tipo A, e um anticorpo específico para um antígeno de influenza do tipo B.
[00153] Este exemplo ilustra um fluxograma de exemplo com um teste de influenza tipo A ou tipo B, e um teste de resistência aos medicamentos neuraminidase. Um kit que compreende: um tubo de aplicador de tampão de extração contendo um imunoensaio e uma tampa com uma abertura; um primeiro dispositivo de teste que compreende um imunoensaio de fluxo lateral para identificar o vírus influenza do tipo A ou do tipo B; e um segundo dispositivo de teste que compreende um ensaio de fluxo cinético para determinar a resistência à droga neuraminidase, é desembrulhada da embalagem e cada componente marcado com uma identificação de um paciente. Uma amostra é recolhida a partir do nariz de um paciente usando um cotonete. O esfregaço é inserido no tampão de extração e rodado contra a parede interior três vezes. O esfregaço é removido a partir do tampão de extração enquanto apertando os lados do tubo, e, em seguida, descartado. A tampa do tubo aplicador é ligada ao tubo.
[00154] O tubo aplicador é invertido e três gotas (~ 85 μl) do tampão de extração são espremidas através da tampa e aplicadas ao primeiro dispositivo de teste. O primeiro dispositivo de teste inclui uma almofada de amostra de não-sobreposição com os reagentes detectores que contém um primeiro tampão de teste para o primeiro teste. A amostra difunde-se através do primeiro tampão de teste para o local de teste do primeiro dispositivo de teste. O primeiro dispositivo de teste é incubado durante 10 minutos, e os resultados do primeiro teste são medidos utilizando um leitor. O leitor fornece uma indicação sobre se do vírus da gripe tipo A ou B está presente na amostra.
[00155] O tubo aplicador é invertido e o tampão de extração remanes-cente é espremido através da tampa e aplicado ao segundo dispositivo de teste. Neste teste, um aumento no resultado de neuraminidase resulta em um aumento do sinal da luciferase. O segundo dispositivo inclui uma câmara de troca de tampão (câmara de matriz aka) e câmaras de reação. A amostra difunde-se através da câmara de troca de tampão para as câmaras de reação para os ensaios de resistência a drogas de neuraminidase. Um valor de inibição é a razão de sinal com o fármaco de teste para um sinal sem fármaco de teste, levando-se em níveis de sinal produzido por mistura de reação e da droga de teste. As câmaras de reação são apresentadas na Tabela 5A.TABELA 5A
[00156] O segundo dispositivo de teste é incubado e os sinais provenien-tes de cada uma das câmaras medidas usando um tubo fotomultipli-cador. Um valor de inibição é determinado usando a fórmula seguinte a partir dos sinais de cada câmara de reação:Valor de inibição = (teste com droga) - (controle para droga) X amplificador (teste sem droga) - (controle para mistura de reação)
[00157] Os limites de sensibilidade às drogas para cada droga antiviral de teste são selecionados de acordo com o tipo de influenza determinados no primeiro teste, e a droga antiviral de teste usada. Se o valor de inibição for inferior ao valor de limite de inibição, a neuraminidase é determinada para ser sensível à droga antiviral de teste.
[00158] Este exemplo demonstra a sensibilidade de um dispositivo de tubo Hamamatsu TO-Can Fotomultiplicador e a capacidade de realizar o baixo nível de ruído escuro lendo em um sistema portátil de mão. Unidades relativas de luz (RLU) foram medidas para diferentes concentrações de um reagente quimioluminescente positivo de produção de sinal de controle (Cell Titer Glo) usando um dispositivo de tubo Hamamatsu TO-Can fotomultiplicador. Os controles incluíram um controle de fundo e um controle de contagem de escuro. Os resultados são mostrados na FIG. 6.
[00159] Este exemplo demonstra um ensaio de enzima dupla para a cepa de teste A/Mississipi/03/2001 (H1N1) H275Y que compreende uma neuraminidase que é sensível ao zanamivir e resistente a oseltamivir. Espécime compreendendo a cepa de teste foi diluído 1/3000 ou 1/9000 e aplicado a um dispositivo de teste de fluxo cinético. Câmaras de ensaio no ensaio de teste de fluxo cinético incluíam aqueles como na TABELA 5 A, que é: (1) mistura de reação + amostra; (2) mistura de reação + amostra + droga de teste antiviral; (3) Controle: mistura de reação; e (4) controle: mistura de reação + droga antiviral de teste. Sinais a partir de cada câmara de teste foram medidos utilizando um dispositivo de tubo fotomultiplicador. Os resultados são mostrados na FIG. 7. O ensaio mostrou que a cepa de ensaio foi mais sensível a zanamivir do que a oseltamivir.
[00160] Este exemplo demonstra a determinação de um nível limite de inibição para um painel de vírus influenza tipo A de sensibilidade conhecida ou resistência a Oseltamivir. Os espécimes foram preparados a partir de várias diluições de várias cepas de influenza A, e aplicados a um dispositivo de teste de fluxo cinético com oseltamivir. Câmaras de ensaio sobre o ensaio de fluxo cinético incluíram aqueles como na Tabela 5A, que é: (1) mistura de reação + amostra; (2) Mistura de reação + espécime + droga antiviral de teste; (3) Controle: mistura de reação; e (4) controle: mistura de reação + droga antiviral de teste. Sinais a partir de cada câmara de teste foram medidos usando um tubo fotomultiplicador. Um valor de inibição para cada uma das cepas foi determinado como no Exemplo 1. Os valores de inibição foram representados em um gráfico para várias diluições de cada cepa, e um valor limite de inibição foi determinado a partir do gráfico. O valor limite de inibição, ou valor de corte, para discernir droga sensível de resistente aos medicamentos foi de cerca de 0,6. O corte foi determinado a ser um valor, onde as barras de erro a partir das cepas sensíveis a drogas não se sobrepõem com as cepas resistentes da gripe. Ver a FIG. 8.
[00161] Este exemplo demonstra a determinação de um nível limite de inibição para um painel de vírus influenza tipo A de sensibilidade conhecida ou resistência a oseltamivir. As amostras foram preparadas e ensaiadas como no Exemplo 4. Um valor de inibição para cada cepa foi determinado. Os valores de inibição foram representados em um gráfico para várias diluições de cada cepa, e um valor limite de inibição foi determinado a partir do gráfico. O valor limite de inibição, ou valor de corte, para discernir droga sensível de resistente aos medicamentos é de cerca de 1,55. Ver a FIG. 9.
[00162] Este exemplo demonstra a sensibilidade do imunoensaio de fluxo lateral para determinar influenza tipo A ou tipo B em um espécime, após a troca de tampão de tampão de ensaio de neuraminidase de fluxo cinético. Amostras de várias diluições do vírus influenza: A/PR/8/34, B/Florida/4/de 2006, e A/Texas/12/2007, foram testadas usando (1) ensaio de fluxo lateral do Veritor™ de acordo com a bula, ou (2) o ensaio de fluxo lateral de Veritor ™ com a troca de tampão de tampão de extração de fluxo cinético do tampão de extração de imunoensaio presente na almofada de fluxo lateral. Os sinais foram medidos e o leitor forneceu uma determinação da presença ou ausência de influenza do tipo A e/ou B em cada amostra. A Tabela 6 resume os resultados. Notavelmente, influenza do tipo A ou do tipo B foram identificados em amostras mais diluídas em ensaios que utilizam um protocolo com Veritor™ com a troca de tampão, do que com o ensaio Veritor ™ de acordo com a bula.TABELA 6
[00163] O imunoensaio Veritor e o ensaio de fluxo cinético de enzima de neuraminidase dupla com oseltamivir foram realizados em várias diluições do vírus da gripe: A/Perth/21 WT 1/2001. A Tabela 7 resume os resultados de duas experiências. Estes resultados demonstram que a aplicação de uma amostra em tampão de extração de imunoensaio para uma resina Sephadex G25M pré-equilibrada com tampão de atividade de neuraminidase não tem um efeito negativo sobre a sensibilidade do Ensaio padrão (Std) DE. O Ensaio Std DE foi capaz de fornecer um resultado de sensibilidade às drogas em concentrações de amostra clinicamente relevantes.TABELA 7
[00164] Várias diluições de amostras foram analisadas utilizando um ensaio de cinética de fluxo com a droga antiviral, oseltamivir. As amostras incluíram A\Bethesda (H3N2 R); A \ Fukui (H3N2 S); e a mistura A \ Bethesda (V) + AFukui (WT). Os sinais foram medidos usando um tubo fotomultiplicador, e os valores de inibição determinados. Os resultados estão resumidos na FIG. 10. Estes resultados demonstram que Detecção Química padrão de enzima dupla AST, quando depois de um ensaio que distingue Gripe A da gripe B (que permite que o valor de inibição mais adequada a ser aplicada), usando um PMT simples com detecção de fótons e a aplicação de subtração do fundo pode identificar uma cepa resistente à droga, quando presentes em uma amostra com uma cepa sensível a drogas.
[00165] Este exemplo compara a sensibilidade de dois tipos de ensaios de enzima dupla. Várias diluições de uma neuraminidase de influenza H3N2 purificada foram testadas com um ensaio de enzima dupla, que incluíam tanto (1) um substrato de neuraminidase que é inibidor precursor para a luciferase (NANA-CF3; ver Fig. 11); e (2) um substrato de neuraminidase que é um precursor de substrato para a luciferase (um conjugado de ácido N-acetilneuramínico e luciferina). Atividade de Neuraminidase cliva NANA-CF3 ao inibidor de esterase, CFC. Em um ensaio em que a esterase compreende luciferase, os resultados da atividade de neuraminidase na presença do inibidor de CFC, inibe a atividade de luciferase, que resulta em uma diminuição na conversão de um substrato de luciferase para um produto luminescente. Ver a FIG. 12. Os resultados dos ensaios são mostrados na FIG. 13. O nível de detecção (LOD) para o ensaio (1, Ensaio Enzimático dupla p/inibidor mascarado) foi de cerca de 10 pM. Em contraste, o nível de detecção para ensaio (2, Ensaio de Enzima Dupla Padrão) era inferior a 0,1 pM.
[00166] Este exemplo demonstra o efeito de subtração dos níveis de fundo, como descrito na fórmula no Exemplo 1 no cálculo dos valores de inibição da atividade de neuraminidase na presença de droga antiviral. Os valores de inibição foram determinados para várias concentrações de uma cepa particular de vírus com uma droga antiviral particular, como no Exemplo 1. Os valores de inibição sem subtrações de fundo foram determina-dos utilizando a seguinte fórmula para o sinal a partir de uma câmara contendo mistura de reação + amostra + droga antiviral de teste (teste com drogas), e a mistura de reação + amostra (teste sem drogas): Valor de Inibição = (teste com droga) X amplificador (teste sem droga)
[00167] Os resultados são mostrados na Tabela 8. Na Tabela 8, as colunas da esquerda para a direita estão os resultados de diminuição da concentração de vírus. Subtraindo-se os níveis de fundo, como indicado no Exemplo 1 no cálculo dos valores de inibição aumenta a sensibilidade do ensaio. TABELA 8
[00168] O termo “compreendendo”, como aqui é usado é sinônimo de “incluindo”, “contendo”, ou “caracterizado por” e é inclusivo ou aberto e não exclui, elementos não citados adicionais ou passos do processo.
[00169] A descrição anterior descreve vários métodos e materiais da presente invenção. Esta invenção é suscetível a modificações nos materiais e métodos, bem como alterações nos métodos e equipamentos de fabricação. Tais modificações podem tornar-se evidentes para os peritos na arte a partir da consideração da presente memória descritiva ou prática da invenção aqui divulgada. Consequentemente, não se pretende que a presente invenção seja limitada às modalidades específicas aqui descritas, mas que abrange todas as modificações e alternativas abrangidas pelo verdadeiro escopo e espírito da invenção.
[00170] Todas as referências aqui citadas, incluindo, mas não limitadas a aplicações publicadas e não publicadas, patentes, e referências da literatura, são aqui incorporadas por referência na sua totalidade e que passam a fazer parte deste Relatório Descritivo. Para as publicações de extensão e patentes ou pedidos de patentes incorporadas por referência contradiz a revelação contida no Relatório Descritivo, esta destina-se a substituir e/ou ter precedência sobre qualquer material contraditório.
Claims (21)
1. Método Para Detectar o Vírus da Influenza, caracterizado por que compreende: (a) contatar uma amostra com um tampão de imunoensaio adaptado para um imunoensaio para detectar um Vírus da Influenza tipo A ou um Vírus da Influenza tipo B, obtendo uma amostra de teste de imunoensaio; (b) contatar uma primeira parte da amostra de teste do imunoensaio a um teste compreendendo um imunoensaio para detectar uma influenza tipo A ou tipo B, detectando a presença ou ausência de influenza tipo A ou tipo B na amostra; (c) contatar uma segunda parte da amostra de teste de imunoensaio com uma matriz compreendendo um tampão de ensaio de neuraminidase, obtendo uma amostra de teste de neuraminidase; e (d) contatar a amostra de teste de neuraminidase com um ensaio de neuraminidase, detectando a presença de uma neuraminidase na amostra.
2. Método Para Detectar o Vírus da Influenza, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o tampão de imunoensaio é incompatível com um ensaio para atividade da neuraminidase.
3. Método Para Detectar o Vírus da Influenza, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 2, caracterizado por que o tampão de imunoensaio inibe a atividade da neuraminidase.
4. Método Para Detectar o Vírus da Influenza, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 3, caracterizado por que etapas (c) e (d) são realizadas no mesmo vaso, em que o recipiente compreende câmaras e em que o recipiente compreende uma câmara compreendendo a matriz e uma câmara compreendendo reagentes para o ensaio de neuraminidase.
5. Método Para Detectar o Vírus da Influenza, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 4, caracterizado por que a matriz compreende um polissacarídeo reticulado.
6. Método Para Detectar o Vírus da Influenza, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 4 a 5, caracterizado por que o vaso compreende um cartucho de multipoços adaptado a ser lido usando um fotomultiplicador, em que o nível de atividade da neuraminidase é medido utilizando um tubo fotomultiplicador.
7. Método Para Detectar o Vírus da Influenza, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 6, caracterizado por que o ensaio de neuraminidase compreende determinar a sensibilidade de uma neuraminidase a um composto de teste e em que o ensaio de neuraminidase compreende: (a) obter uma razão de valor de inibição, em que a razão compreende o nível de atividade da neuraminidase na presença de um composto de teste comparado ao nível de atividade da neuraminidase na ausência do composto de teste; e (b) comparar a razão de valor de inibição a um limite de inibição, determinando a sensibilidade da atividade da neuraminidase ao composto de teste.
8. Método Para Detectar o Vírus da Influenza, de acordo com a Reivindicação 7, caracterizado por que o limite de inibição é determinado pela detecção de um vírus tipo A ou tipo B, em que um primeiro limite de inibição é usado se for detectado o vírus do tipo A e um segundo limite de inibição é usado se for detectado o vírus do tipo B.
9. Método Para Detectar o Vírus da Influenza, de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por que o primeiro limite é menor que o segundo limite.
10. Método Para Detectar o Vírus da Influenza, de acordo com a Reivindicação 7, caracterizado por que o limite de inibição é determinado pelo composto de teste, em que o composto de teste é uma droga antiviral.
11. Método Para Detectar o Vírus da Influenza, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 10, caracterizado por que o ensaio de neuraminidase compreende um ensaio de enzima dupla compreendendo uma enzima de sinalização, em que a atividade da neuraminidase produz um substrato para a enzima de sinalização ou a atividade da neuraminidase produz um inibidor para a enzima de sinalização.
12. Método Para Detectar o Vírus da Influenza, de acordo com a Reivindicação 11, caracterizado por que a enzima de sinalização compreende luciferase e em que o tampão de imunoensaio inibe a atividade da luciferase.
13. Sistema de Diagnóstico para Detectar o Vírus da Influenza, caracterizado por que compreende: um cartucho para determinar atividade da neuraminidase em uma amostra, em que o cartucho é configurado para processar uma amostra compreendendo um tampão incompatível para a determinação a uma amostra compreendendo um tampão compatível para a determinação; um teste para detectar influenza tipo A ou tipo B na amostra, em que o teste é configurado para processar uma amostra compreendendo um tampão incompatível para a detecção a uma amostra compreendendo um tampão compatível para a detecção; um primeiro detector configurado para medir um sinal do cartucho; e um segundo detector configurado para medir um sinal do cartucho.
14. Sistema de Diagnóstico para Detectar o Vírus da Influenza, de acordo com a Reivindicação 13, caracterizado por que o cartucho compreende uma câmara de matriz compreendendo uma matriz de cartucho que compreende o tampão compatível para a determinação e uma câmara de reagente compreendendo reagentes para a determinação da atividade da neuraminidase, em que a matriz de cartucho compreende um polissacárido reticulado e em que a câmara de matriz e a câmara de cartucho estão em comunicação de fluidos de tal modo que uma amostra aplicada à câmara de matriz flui da câmara de matriz para a câmara de reagente.
15. Sistema de Diagnóstico para Detectar o Vírus da Influenza, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 13 a 14, caracterizado por que o cartucho compreende um cartucho de multipoços adaptado para ser lido utilizando um tubo fotomultiplicador ou tubo microfotomultiplicador.
16. Sistema de Diagnóstico para Detectar o Vírus da Influenza, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 13 a 15, caracterizado por que o teste compreende um imunoensaio.
17. Kit, para detectar o vírus da influenza, caracterizado por que compreende: um cartucho para determinar a atividade da neuraminidase numa amostra, em que o cartucho está configurado para processar uma amostra compreendendo um tampão incompatível para a determinação de uma amostra compreendendo um tampão compatível para a determinação, em que o cartucho compreende uma câmara de matriz compreendendo uma matriz de cartucho compreendendo o tampão compatível e uma câmara de reagente compreendendo reagentes para a determinação da atividade da neuraminidase, em que a matriz de cartucho compreende um polissacarídeo reticulado e em que a câmara de matriz e a câmara de cartucho estão em comunicação de fluidos de tal modo que uma amostra aplicada à câmara da matriz flui a partir da câmara da matriz para a câmara de reagentes; e um teste para detectar a influenza do tipo A ou do tipo B na amostra, em que o teste é configurado para processar uma amostra compreendendo um tampão incompatível para a detecção de uma amostra compreendendo um tampão compatível para a detecção.
18. Kit, de acordo com a Reivindicação 17, compreendendo ainda reagentes para um ensaio da atividade da neuraminidase, caracterizado por que os reagentes de ensaio da atividade da neuraminidase são selecionados do grupo que consiste em luciferase, um conjugado de um ácido N-acetilneuramínico e luciferina ou um derivado da mesma, um ácido N-acetilneuramínico e uma trifluormetilcetona ou um derivado da mesma e um fármaco antiviral.
19. Kit, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 17 a 18, caracterizado por que compreende ainda reagentes para um imunoensaio, em que os reagentes de imunoensaio são selecionados do grupo que consiste num anticorpo específico para um antígeno da influenza do tipo A e um anticorpo específico para um antígeno da influenza do tipo B.
20. Composto Inibidor de Máscara, para uso no método, conforme definido na Reivindicação 1, em que a atividade da neuraminidase com o composto inibidor de máscara produz um inibidor para a enzima sinalizadora, caracterizado por que o composto inibidor de máscara tem a estrutura da Fórmula (I): em que R1, R2 e R3 são cada independentemente hidrogênio ou C1-5- alquila; n é 0, 1, 2 ou 3; R4 é -(CH2)mC(=O)CF3; m é 0 ou 1; X é -S(O)z- ou -CH(R5)-; R5 é -S(O)zCH3; e z é 0, 1 ou 2.
21. Composto Inibidor de Máscara, de acordo com a Reivindicação 20, caracterizado por que o composto de Fórmula (I) é selecionado do grupo que consiste em:
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