EA014533B1 - Способы обнаружения вирусов гриппа - Google Patents

Способы обнаружения вирусов гриппа Download PDF

Info

Publication number
EA014533B1
EA014533B1 EA200870542A EA200870542A EA014533B1 EA 014533 B1 EA014533 B1 EA 014533B1 EA 200870542 A EA200870542 A EA 200870542A EA 200870542 A EA200870542 A EA 200870542A EA 014533 B1 EA014533 B1 EA 014533B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
viruses
substrate
influenza
viral particles
virus
Prior art date
Application number
EA200870542A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200870542A1 (ru
Inventor
Николай Владимирович БОВИН
Ирина Александровна Любавина
Роберт-Маттиас Ляйзер
Original Assignee
Ветеринермедицинише Универзитет Вин
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ветеринермедицинише Универзитет Вин filed Critical Ветеринермедицинише Универзитет Вин
Publication of EA200870542A1 publication Critical patent/EA200870542A1/ru
Publication of EA014533B1 publication Critical patent/EA014533B1/ru

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Способ быстрого обнаружения вирусов и/или вирусных частиц гриппа, содержащих гемагглютинин и нейраминидазный компонент, включающий в себя следующие стадии: а) связывание вирусов и/или вирусных частиц с подложкой, содержащей по меньшей мере один тип углеводного рецептора, выбранного из группы, состоящей из природных или синтетических олигосахаридов, которые соединены или находятся в композиции с гликопротеинами, такими как гликофорин, a1-кислый гликопротеин, а2-макроглобулин, овомукоид и их сочетаниями, углеводный рецептор подложки связывается с гемагглютининовым компонентом вирусов и/или вирусных частиц; b) взаимодействие нейраминидазного компонента связанных вирусов и/или вирусных частиц с меченым ферментным субстратом, что генерируют детектируемый сигнал; и с) детекция сигнала, порожденного на этапе b).

Description

Настоящее изобретение относится к способам быстрого обнаружения вирусов и/или вирусных частиц гриппа, содержащих гемагглютининовый и нейраминидазный компонент, при этом указанный способ включает связывание вирусов и/или вирусных частиц с подложкой при помощи специфической связывающей молекулы, которая связывается с гемагглютининовым компонентом вирусов и/или вирусных частиц, и обнаружение связанных вирусов и/или вирусных частиц реакцией нейраминидазного компонента с ферментным субстратом, приводящей к обнаруживаемому сигналу. Настоящее изобретение также относится к системе быстрого обнаружения вирусов гриппа и/или вирусных частиц, в которой используется способ по изобретению, и к применению системы обнаружения по изобретению.
Все вирусы птичьего гриппа (ΑΙ) представляют собой вирус гриппа типа А семейства вирусов ОйРотухоуитбае, и все известные штаммы вируса гриппа А инфицируют птиц. Вирус гриппа типа А подразделяют на подтипы в зависимости от белков гемагглютинина (Н) и нейраминидазы (Ν), выступающих из центральной части вируса. Существует 16 типов Н и до 9 подтипов Ν, что дает возможность для 144 различных комбинаций Н и N.
Птичий грипп (также известный как вирус гриппа А, грипп типа А или грипп вида А) является гриппом, вызываемым типом вируса гриппа, который переносится птицами, но также может инфицировать некоторые виды млекопитающих.
Пандемия гриппа - это крупномасштабная эпидемия вируса гриппа, например эпидемия испанки в 1918 г. Всемирная Организация здравоохранения (\УНО) обеспокоена большой вероятностью возникновения пандемии гриппа в течение следующих нескольких лет. Одним из наиболее вероятных кандидатов является подтип Α (Η5Ν1) птичьего гриппа.
Η5Ν1 является типом вируса птичьего гриппа, который за счет дрейфа генов мутировал в большое число высокопатогенных вариантов, но все они в настоящее время принадлежат генотипу Ζ вируса птичьего гриппа Η5Ν1. Генотип Ζ появился в 2002 г. путем рекомбинации ранее известных высокопатогенных генотипов Η5Ν1, которые впервые были выявлены у птиц в Китае в 1996 г. и у людей в Гонконге в 1997 г. Вирусы Η5Ν1, выделенные из организма человека и близко родственные вирусы птичьего гриппа, выделенные в 2004 и 2005 гг., принадлежат одному и тому же генотипу, часто называемому генотипом Ζ.
Подтипами птичьего гриппа, подтвержденными у людей, которые, как известно, привели к высокой смертности у людей, являются: Η1Ν1, вызвавший Испанку, Η2Ν2, вызвавший Азиатский грипп, Η3Ν2, вызвавший Гонконгский грипп, Η5Ν1, Η7Ν7, Η9Ν2, Η7Ν2, Η7Ν3, Η10Ν7.
Для быстрой реакции в случае возникновения мутировавшего и вирулентного штамма гриппа, способного передаваться от человека к человеку, требуется быстрый и надежный метод анализа для того, чтобы определить инфицирован индивид или животное вирусом. Существующие в настоящее время лабораторные методы обнаружения вирусов в образцах окружающей среды, взятых у животных и больных, являются трудозатратными и длительными по времени.
В И8-В-6503745 приведено описание соединений циклопентана и циклопентена, а также их применение в способе обнаружения вируса гриппа. Вирус захватывается покрытой фетуином поверхностью и его обнаружение осуществляют с помощью меченой композиции, которая связывается с нейраминидазой.
Ό.Ε. №уо1а е1 а1. описали в 1оигиа1 οί СРшса1 М1сгоЬю1о§у, 2000, р. 1161-1165 гранулы, покрытые фетуином. Фетуин также выступает в роли субстрата нейраминидазы, и обнаружение проводят с помощью агглютинации.
В ϋδ-Α-2003/0129618 описаны способы и композиции для обнаружения аналитов с помощью флуоресценции, которая возникает в полимерном материале в ответ на селективное связывание аналитов с полимерными материалами. В частности, настоящее изобретение позволяет определить с помощью флуоресценции модифицирующие мембрану реакции и аналиты, ответственные за такие модификации, и провести анализ скрининга действующих ингибиторов.
Все известные и доступные быстрые методики в этой области основаны либо на использовании антител против вирусных эпитопов, либо на простых тестах на нейраминидазу (ΝΑ).
Главным недостатком методов, в которых используются антитела, основанных на технике растекания капли жидкости, или других типов анализа является нестабильность антител, использующихся в качестве реагентов.
Кроме того, большое число иммунологических анализов, доступных в настоящее время, специфичны для гриппа А, а не для Η5Ν1. К тому же, использование антител неизбежно ведет к повышению стоимости анализа.
Главным недостатком тестов на ΝΑ, специфичных для вирусов гриппа, является необходимость использования дорогого, субстратного реагента, используемого в данной области, который должен быть частично метилирован.
Настоящее изобретение решает вышеперечисленные проблемы благодаря способу быстрого обнаружения вирусов и/или вирусных частиц гриппа, благодаря системе обнаружения, в которой используется указанный способ, а также благодаря применению указанного способа обнаружения, как заявлено в формуле изобретения.
- 1 014533
В описании изобретения используются следующие аббревиатуры:
3'8ЬЫ = Ыеи5Аса2-3Са1в1-4С1сЫАс;
НА = гемагглютинин;
НАВ = реакция гемагглютинации;
ЙОЭ = предел обнаружения;
ΝΑ = нейраминидаза;
ТСГО = доза инфекции в культуре тканей;
буфер ΤΝ = 0,02 М ТИ8-НС1 (рН 7,2) с 0,1 М ЫаС1.
Изобретение относится к способу быстрого обнаружения вирусов и/или вирусных частиц гриппа, который включает следующие стадии:
a) связывание вирусов или вирусных частиц с подложкой, содержащей по меньшей мере один тип углеводных рецепторов, выбранных из группы, состоящей из природных или синтетических олигосахаридов, которые конъюгированы или находятся в композиции с гликопротеинами, такими как гликофорин, а1-кислый гликопротеин, а2-макроглобулин, овомукоид и их композиций, причем углеводный рецептор связывается с гемагглютининовым компонентом вируса и/или вирусной частицы;
b) реакцию нейраминидазного компонента связанных вирусов и/или вирусных частиц с их меченым ферментным субстратом, что вызывает генерирование обнаруживаемого сигнала; и
c) обнаружение сигнала, генерированного на этапе Ь).
В частности, могут быть обнаружены вирусы и/или вирусные частицы гриппа, содержащие все известные подтипы птичьего гриппа (ΑΙ).
В другом варианте осуществления изобретения вирусы и/или вирусные частицы гриппа содержат конкретный подтип или группу подтипов. Способ подходит для обнаружения вирусов и/или вирусных частиц гриппа, содержащих высокопатогенный вариант.
Изобретение может, в частности, осуществляться с подложкой, которая представляет собой хроматографическую бумагу или мембрану. Такие материалы хорошо известны специалистам в данной области. Согласно изобретению можно обеспечить ковалентное связывание или физическое адсорбирование углеводного рецептора, как указано выше, с подложкой.
В изобретении, в частности, используют углеводный рецептор, содержащий повтор а2-3Са1. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения (дот-блот-подход) связывание вирусов и/или вирусных частиц достигается путем нанесения образца, содержащего вирус и/или вирусные частицы, на подложку в виде пятна. Согласно изобретению связывание вирусов и/или вирусных частиц достигается пропитыванием образцом, содержащим вирус и/или вирусные частицы, всей подложки так называемой техникой растекания капли жидкости. В другом варианте осуществления изобретения меченый ферментный субстрат нейраминидазного компонента осаждается на месте связывания вируса и/или вирусных частиц.
Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения ферментный субстрат метят хромогенной группой, и реакция с нейраминидазой вызывает изменение цвета указанного ферментного субстрата. В качестве ферментного субстрата могут быть использованы, кроме прочих, следующие хромогенные производные Ν-ацетилнейраминовой кислоты, в частности 5-бромо-4-хлор-3-индолил-а-Ыацетилнейраминовая кислота. Альтернативно, реакция с нейраминидазой вызывает специфический флуоресцентный сигнал, если в качестве метки используются подходящие флуоресцентные молекулы.
Способ по изобретению может осуществляться с помощью системы быстрого обнаружения вирусов и/или вирусных частиц гриппа по изобретению. Система содержит систему для быстрого обнаружения вирусов и/или вирусных частиц гриппа способом по изобретению, причем система содержит:
a) подложку, содержащую по меньшей мере один тип углеводного рецептора, выбранного из группы, состоящей из природных или синтетических олигосахаридов, которые конъюгированы или находятся в композиции с гликопротеинами, такими как гликофорин, а1-кислый гликопротеин, а2-макроглобулин, овомукоид и их комбинацией, причем углеводный рецептор подложки связывается с гемагглютининовым компонентом вирусов и/или вирусных частиц;
b) меченый ферментный субстрат, который взаимодействует с нейраминидазным компонентом, генерируя, таким образом, обнаруживаемый сигнал.
В частности, подложка помещается в пластиковый контейнер с окном для считывания результата вместе с образцом и положительным контролем. Подложка содержит, в частности, по меньшей мере два разных количества указанных специфических связывающих веществ для полуколичественной оценки содержания вируса в образце. В другом варианте осуществления подложка содержит по меньшей мере два специфических рецептора разных подтипов специфичности для одновременного обнаружения вирусов, принадлежащих разным подтипам. Система обнаружения по изобретению служит в качестве контейнера для образцов и переносной установки для подтверждающих тестов, таких как полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией, после обнаружения вирусов и/или вирусных частиц.
- 2 014533
Также в соответствии с изобретением система для обнаружения может использоваться для обнаружения вирусов и/или вирусных частиц гриппа в образцах, взятых у животных и/или человека, таких как мазки, фекалии и кровь, в образцах окружающей среды и/или в качестве системы раннего предупреждения появления высокопатогенных подтипов вирусов.
Гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (ΝΑ) находятся на поверхности вирусов гриппа. НА вызывает связывание вирусов с сиалилсодержащими клеточными рецепторами, а ΝΑ стимулирует доступ вируса к клеткам-мишеням и ускоряет высвобождение вируса из инфицированных клеток и от природных ингибиторов [Ма1го5ОУ1сй, Μ.Ν., Ма1го5ОУ1сй, Τ.Υ., Сгау, Т., ВоЬейя, Ν.Α., К1епк, Η.Ό. 2004: 1. Упо1.. 78(22) 12665-7], т.е. НА связывает рецепторы, а ΝΑ разрушает рецепторы. Важным условием эффективной репликации вирусов является согласованное действие НА и ΝΑ, и у разных видов соотношение двух этих активных веществ различается. Вирусы гриппа, выделенные у птиц, имеют некоторые характерные особенности. Все вирусы птичьего гриппа обладают НА, который имеет наибольшее сродство к №и5Лс</.2-3Са1в-концевым углеводным цепям. Кроме того, активность их ΝΑ выше, чем у вирусов другого вида.
В способе обнаружения и системе детекции по настоящему изобретению используются свойства обоих этих компонентов, НА и ΝΑ, вируса птичьего гриппа. Вирус гриппа связывается со специфичной связывающей молекулой, предпочтительно с субстанцией, которая содержит сиалилированные углеводы и соединена с мембраной, после чего следует реакция, предпочтительно расщепления нейраминидазного субстрата, вызывая окрашивание содержащей вирус зоны на мембране. Способ обнаружения вирусов гриппа и система по настоящему изобретению имеют ряд преимуществ по сравнению с тестовыми системами, известными из уровня техники, использование двух компонентов, НА и ΝΑ, повышает специфичность анализа и позволяет конструировать системы обнаружения с выбранными специфичностями. В то же время и в противоположность системам обнаружения, основанным на иммунологических методах, нет необходимости в дополнительных маркерных ферментах для выявления положительной детекции, так как для этих целей служит сама нейраминидаза вируса.
Различные варианты тщательно отобранных типов молекул углеводных рецепторов собирают вирусы гриппа независимо от типа и подтипа и одновременно способны к специфическому распознаванию высокопатогенных форм, таких как Η5Ν1.
Результат способа обнаружения по изобретению может быть получен без использования какоголибо сложного оборудования.
Способ по изобретению позволяет обнаруживать вирусы гриппа в течение 0,1-2 ч.
Изобретение далее подробно описано с помощью примеров, не ограничивающих объем изобретения.
Примеры
Пример 1. Синтез полиакриламидного конъюгата 3'§Ь№трисахарида для получения специфической молекулы углеводного рецептора.
Раствор 1,7 мг (10 мкмоль) полиакриловой кислоты, полностью активированной Ν-гидроксисукцинимидом, молекулярная масса ~1000 кДа, в 200 мкл ΌΜ8Θ и 4 мкл диизопропилэтиламина, добавляли в раствор 1,46 мг (2 мкмоль) 3ΎΝ-Ο(ί.Ή2)3ΝΗ2 в 200 мкл ΌΜ8Θ, смесь поддерживали при 37°С в течение 48 ч, 40 мкл 25% водного раствора аммиака или 40 мкл этаноламина были добавлены и раствор поддерживали 18 ч при комнатной температуре, после чего проводили гель-проникающую хроматографию на сефарозе ЬН, выход ~90%.
Пример 2. Обнаружение вирусов гриппа в жидкости аллантоиса способом и тест-системой по изобретению.
Набор.
1. Тест-полоска.
2. Буфер для образца. Буфер № 1.
3. Контрастный буфер. Буфер № 2.
4. Буфер для промывки А. Буфер № 3.
5. Буфер для промывки В. Буфер № 4.
6. Окрашивающий буфер. Буфер № 5.
7. Двойная полоска (2 ряда с 8 лунками) или плашка с 96 лунками.
8. Ножницы или скальпель.
9. Щипцы.
10. Чашка для промывания полоски.
11. Емкость для протекания реакции.
12. Термостат (или его заменитель).
13. Камера для процедуры хроматографирования (или крышка, которой закрывают 96-луночную плашку с полосками).
- 3 014533
Материалы.
Полоски: нитроцеллюлоза, абсорбент, прокладка для образца, полученная от \УНа1тап. ИЗА.
1. Специфический реагент (фетуин, 31дта) выделяли из сырых куриных яиц.
2. Буфер № 1: 0,2 М ТП8-НС1 (рН 7,2) с 3 М ЫаС1 и 0,5% Т\\ееп-20.
3. Буфер № 2: 0,02 М Ттй-НС1 (рН 7,2) с 0,3 М ЫаС1 и 0,05% Т\\ееп-20.
4. Буфер № 3: 0,02 М Ттй-НС1 (рН 7,2) с 0,1 М ЫаС1 и 0,05% Т\\ееп-20.
5. Буфер № 4: 0,02 М Ттй-НС1 (рН 7,2) с 0, 1 М ЫаС1 (ТЫ- буфер).
6. Буфер № 5: 4 мМ раствора Ыеи-Х в ТЫ-буфере с 0,01 М СаС12.
ТЫ-буфер может быть заменен другим подходящим буфером, например забуференным фосфатом, солевым раствором или солевым раствором.
Полоску (фигуру) разделяли на три зоны: зону пропитывания, обнаружения и абсорбции. Линия молекулы углеводного рецептора (тестовая линия) так же, как и контрольная линия располагаются в зоне обнаружения. Полоски сделаны из мембраны, адсорбента и прокладки для образца. Молекулу углеводного рецептора (1 мкл на 1 мг/мл раствора) помещают в зону обнаружения, после чего полоску сушат и промывают. Полоску хранят в герметично закрытом сосуде при 18-25°С.
Обнаружение.
1. Получение образца. 1/10 часть (об./об.) буфера № 1 добавляют в образец непосредственно перед анализом и тщательно встряхивают. Это образец № 1 (Р № 1).
2. Процедура обнаружения включает несколько стадий (табл. 1).
На первой стадии прокладки для образца на полоске помещают в 80-100 мкл Р № 1. Под действием капиллярных сил жидкость из образца поднимается вверх и достигает зоны абсорбции через зону обнаружения, где частицы вируса связываются с молекулой углеводного рецептора. Длительность этого процесса зависит от вязкости пробы, но не должна превышать 15 мин. Буфер № 2 добавляют в ту же лунку плашки (альтернативно можно перенести полоску в другую лунку, заполненную буфером № 2). Через 10 мин полоску вынимают из лунки.
На второй стадии пропитанную часть полоски отрезают (ножницами). После того как (например, с помощью пинцета) абсорбирующую зону полоски осторожно вынимают, тестовую зону промывают буфером № 3, а затем буфером № 4. Затем зону абсорбции тоже отрезают.
На третьей стадии оставшуюся часть тестовой зоны помещают в сосуд с буфером № 5. Сосуд плотно закрывают и оставляют в темноте при 37-40°С. Наличие вируса гриппа в образце обнаруживают по темно-синему окрашиванию зоны молекулы углеводного рецептора. Длительность этой стадии зависит от концентрации I вируса в образце, и она может занять от 20 до 60 мин до обнаружения вируса с помощью реакции гемагглютинации (НАК титр около 2). Как правило, эти образцы имеют значение ТСШ/мл около 105. Для образцов с 10- и 100-кратно меньшим содержанием вируса (104-103 ТСШ/мл) окрашивание может появиться через несколько часов. После этой процедуры полоску вынимают из раствора, после чего визуально оценивают результат реакции.
Контрольная линия нейраминидазы в зоне обнаружения используется для оценки функциональности анализа. Контрольная зона должна окрашиваться в темно-синий цвет.
Результаты интерпретируют следующим образом:
1) если наблюдается равномерно окрашенная линия, то результат считается положительным, т.е. образец содержит вирус; интенсивность цвета должна быть сравнима с интенсивностью контрольной линии;
2) если наблюдается слабо окрашенная линия, то образец содержит вирус в концентрации, недостаточной для точного обнаружения, и выдерживание полоски в буфере № 5 должно быть продолжено на всю ночь или тест может быть повторен еще раз;
3) отсутствие окрашенной линии означает, что в образце нет вируса или его концентрация меньше, чем минимальный порог обнаружения;
4) отсутствие окрашенной линии в зоне положительного контроля означает либо то, что эксперимент проведен неправильно, либо то, что ΝΑ в контрольной линии была разрушена; в этом случае рекомендуется повторное тестирование образца с использованием нового тест-набора.
Данные по чувствительности теста приведены в табл. 2.
- 4 014533
Таблица 1
Схема способа обнаружения по изобретению
После удаления
Адсорбирующая прокладки с полоски мин - 2 ч в нейраминидазы оценивают
Синяя контрольная линия положительного
Положительный содержит вирус в концентрации чем поре
Отрицательным наблюдаться две линии.
Интенсивность должна быть сравнима с интенсивностью отрицательного
Необходимо цвета контрольной линии. В случае помешают в промывочный буфер повторить тест если контрольном линии не окрашивания тестовой линии наблюдается.
- 5 014533
Пример 3. Обнаружение вирусов гриппа в куриных фекалиях при помощи системы обнаружения по изобретению.
В этом примере используются те же материалы и способы, что и в примере 2.
1. Было выполнено многократное разведение содержащих вирус образцов в суспензии фекалий здоровых куриц (2 г сухой субстанции на 10 мл буфера). Было показано, что тест не чувствителен и не специфичен к обнаружению вируса гриппа в фекалиях.
2. К свежим куриным фекалиям добавляли 1/10 часть (об./об.) вируса А/утка/Альберта/76 (ΗΑΚ-титр 1:10) и смесь гомогенизировали. После добавления буфера № 2 к гомогенату (1:1 об./об.) из получившейся суспензии отбирали аликвоту и использовали ее в анализе. Темно-синее окрашивание в тестовой зоне появлялось через 2 ч. Если куриные фекалии добавляли к образцам из табл. 1 перед началом процедуры, то это не оказывало никакого заметного влияния на результаты теста.
Пример 4. Обнаружение вирусов гриппа в ткани легких мертвых куриц при помощи системы обнаружения по изобретению.
В этом примере используют те же материалы и способы, что и в примере 2.
Ткань легких курицы, умершей от вируса гриппа Η5Ν1, была извлечена силиновым буфером для исследования (собран: Крым/январь 2006 г.). Может быть показано, что вирусы гриппа могут быть достоверно обнаружены в легких тела курицы для исследования.
Таблица 2
Предел обнаружения (БОБ) вирусов птичьего гриппа в образцах, содержащих вирус, как было обнаружено с помощью тестовой системы по изобретению
№ Вирус ЬОЭ для 2 ч
ΤΟΙϋ/мл НАР- титр/ образец
1 А/утки/Альберта/35/76 (Η1Ν1) 105 4
2 А/утки/Франция/146/82 (Η1Ν1) 2x10’ 10~3
3 А/шилохвости/Приморье/695/76 (Η2Ν3) 2х107 10
4 А/чайки/Астрахань/165/8б (Η6Ν5) 10’ пг1
5 А/ГРУ/Росток/34 (Η7Ν1) 10’ 1
6 А/дикой утки/КТ/12/02 (Η7Ν3) 5х104 5x10 1
7 А/дикой утки/Приморье/3/82 (Η9Ν2) 10 1
8 А/Гонконг/1073/99 (Η9Ν2) Ϊ05 1
9 А/дикой утки/Гурьев/244/82 (Η14Ν6) 5x10® 10'1
10 А/дикой утки/РА/10218 (Η5Ν2) Не определено 10~2
11 А/ утки/Постдам/1402/6/86 (Η5Ν2) 5х102 5x10 1
12 Α/ΝΙΒΚΟ-14 (Η5Ν1)® 5х103 5
13 А/курицы/Курган/5/2005 (Η5Ν1) 2 пассажа в МОСК 10’ <1
14 А/у^ки/Курган/8/2005 (Η5Ν1) 2 пассажа в МОСК 10® 1СГ1
а Штамм вакцины, имеющий гены НА и ΝΑ из А/Вьетнам/1194/04 патогенного вируса и все внутренние гены белка из А/Пуэрто-Рико/2/34.
Вирусы были получены из Института полиомиелита и вирусных энцефалитов (Московская область) и Института гриппа (Санкт-Петербург).

Claims (19)

1. Способ быстрого обнаружения вирусов и/или вирусных частиц гриппа, содержащих гемагглютинин и нейраминидазный компонент, включающий стадии:
a) связывания вирусов и/или вирусных частиц с подложкой, содержащей по меньшей мере один тип углеводного рецептора, выбранного из группы, состоящей из природных или синтетических олигосахаридов, которые конъюгированы или находятся в композиции с гликопротеинами, такими как гликофорин, а1-кислый гликопротеин, а2-макроглобулин, овомукоид, и их сочетаниями, причем углеводный рецептор подложки связывается с гемагглютининовым компонентом вирусов и/или вирусных частиц;
b) взаимодействия нейраминидазного компонента связанных вирусов и/или вирусных частиц с меченым ферментным субстратом, генерируя таким образом обнаруживаемый сигнал; и
c) детекции сигнала, генерированного на этапе Ь).
2. Способ по п.1, в котором указанные вирусы и/или вирусные частицы гриппа содержат все известные подтипы гриппа (ΑΙ).
3. Способ по п.2, в котором указанные вирусы и/или вирусные частицы гриппа содержат конкретный подтип или группу подтипов.
4. Способ по п.2, в котором указанные вирусы и/или вирусные частицы гриппа содержат высокопатогенную форму.
5. Способ по любому из пп.1-4, в котором подложкой является хроматографическая бумага или мембрана.
6. Способ по любому из пп.1-5, в котором углеводный рецептор ковалентно связан или физически адсорбирован на подложку.
7. Способ по п.6, в котором углеводный рецептор содержит а2-30а1 повтор.
8. Способ по любому из пп.1-7, в котором указанное связывание указанных вирусов и/или вирусных частиц достигается за счет нанесения образца, содержащего вирусы и/или вирусные частицы, на указанную подложку в виде пятна (дот-блот подход).
9. Способ по любому из пп.1-7, в котором указанное связывание вирусов и/или вирусных частиц достигается путем пропитывания указанной подложки образцом, содержащим вирусы и/или вирусные частицы (метода растекания капли жидкости).
10. Способ по любому из пп.1-9, в котором указанный меченый ферментный субстрат указанного нейраминидазного компонента осаждается на месте связывания вирусов и/или вирусных частиц.
11. Способ по любому из пп.1-10, в котором указанный ферментный субстрат помечен хромогенной группой, и реакция с нейраминидазой вызывает изменение цвета указанного ферментного субстрата.
12. Способ по любому из пп.1-11, в котором указанный ферментный субстрат является хромогенным производным Ν-ацетилнейраминовой кислоты, в частности 5-бромо-4-хлор-3-индолил-а-Ыацетилнейраминовой кислоты.
13. Способ по любому из пп.1-12, в котором реакция с нейраминидазой вызывает специфический флуоресцентный сигнал.
14. Система быстрого обнаружения вирусов и/или вирусных частиц гриппа, в которой используется способ по любому из пп.1-13, содержащая:
a) подложку, содержащую по меньшей мере один тип углеводного рецептора, выбранный из группы, состоящей из природных или синтетических олигосахаридов, которые конъюгированы или находятся в композиции с гликопротеинами, такими как гликофорин, а1-кислый гликопротеин, а2-макроглобулин, овомукоид, и их сочетаниями, причем углеводный рецептор подложки связывается с гемагглютининовым компонентом вирусов и/или вирусных частиц;
b) меченый ферментный субстрат, который взаимодействует с нейраминидазным компонентом, генерируя таким образом детектируемый сигнал.
15. Система обнаружения по п.14, в которой указанная подложка помещена в пластиковый контейнер с окном для считывания результатов теста с образцом и положительным контролем.
16. Система обнаружения по п.14 и/или 15, в которой указанная подложка содержит по меньшей мере два различных количества указанных специфических связывающих веществ для полуколичественной оценки содержания вируса в образце.
17. Система обнаружения по п.14 и/или 16, в которой указанная подложка содержит по меньшей мере два специфических рецептора разных подтипов специфичности для одновременного обнаружения вирусов, принадлежащих к разным подтипам.
18. Система обнаружения по любому из пп.16, 17, причем система после обнаружения присутствия вирусов и/или вирусных частиц служит контейнером для проб и переносной установкой для подтверждающих тестов, таких как полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией.
19. Применение системы обнаружения по любому из пп.16-18 для обнаружения вирусов и/или вирусных частиц гриппа в пробах у животных и/или человека, таких как мазки, фекалии и кровь, в пробах окружающей среды и/или как системы раннего предупреждения появления высокопатогенных подтипов
EA200870542A 2006-05-18 2007-05-18 Способы обнаружения вирусов гриппа EA014533B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06114170 2006-05-18
US83941506P 2006-08-23 2006-08-23
EP06119398 2006-08-23
PCT/EP2007/054835 WO2007135099A1 (en) 2006-05-18 2007-05-18 Detection method for influenza viruses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200870542A1 EA200870542A1 (ru) 2009-04-28
EA014533B1 true EA014533B1 (ru) 2010-12-30

Family

ID=38331692

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200870542A EA014533B1 (ru) 2006-05-18 2007-05-18 Способы обнаружения вирусов гриппа

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20100009339A1 (ru)
EP (1) EP2018564B1 (ru)
JP (1) JP2009537128A (ru)
KR (1) KR20090031362A (ru)
AT (1) ATE467836T1 (ru)
AU (1) AU2007253354A1 (ru)
CA (1) CA2652404A1 (ru)
DE (1) DE602007006471D1 (ru)
EA (1) EA014533B1 (ru)
IL (1) IL195097A (ru)
MX (1) MX2008014529A (ru)
PL (1) PL2018564T3 (ru)
WO (1) WO2007135099A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10317404B2 (en) 2013-04-01 2019-06-11 Becton, Dickinson And Company Method and kits for the diagnosis of influenza

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0702183D0 (en) * 2007-02-05 2007-03-14 Iti Scotland Ltd Pathogen binding
US7960139B2 (en) 2007-03-23 2011-06-14 Academia Sinica Alkynyl sugar analogs for the labeling and visualization of glycoconjugates in cells
ES2442024T3 (es) 2008-07-15 2014-02-07 Academia Sinica Matrices de glucano sobre portaobjetos de vidrio revestidos con aluminio de tipo PTFE y métodos relacionados
CN101701958A (zh) * 2009-03-05 2010-05-05 中国检验检疫科学研究院 同时检测新城疫和禽流感病毒的荧光试纸条及应用
US11377485B2 (en) 2009-12-02 2022-07-05 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
US10087236B2 (en) 2009-12-02 2018-10-02 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
JP5706088B2 (ja) * 2010-01-06 2015-04-22 大阪瓦斯株式会社 インフルエンザウイルスの検知方法およびインフルエンザウイルスの検知装置
WO2011130332A1 (en) 2010-04-12 2011-10-20 Academia Sinica Glycan arrays for high throughput screening of viruses
US8841104B2 (en) 2010-04-21 2014-09-23 Nanomr, Inc. Methods for isolating a target analyte from a heterogeneous sample
US20110262989A1 (en) 2010-04-21 2011-10-27 Nanomr, Inc. Isolating a target analyte from a body fluid
US9476812B2 (en) * 2010-04-21 2016-10-25 Dna Electronics, Inc. Methods for isolating a target analyte from a heterogeneous sample
US9428547B2 (en) * 2010-04-21 2016-08-30 Dna Electronics, Inc. Compositions for isolating a target analyte from a heterogeneous sample
KR101745386B1 (ko) 2010-05-10 2017-06-09 아카데미아 시니카 항-인플루엔자 활성을 가진 자나미비르 포스포네이트 동족체 및 인플루엔자 바이러스의 오셀타미비르 감수성을 확인하는 방법
EP2748606A1 (en) * 2011-10-05 2014-07-02 The Provost, Fellows, Foundation Scholars, and The Other Members of Board, of The College of The Holy and Undivided Trinity of Queen Elizabeth Carbohydrate functionalised surfaces
US10130714B2 (en) 2012-04-14 2018-11-20 Academia Sinica Enhanced anti-influenza agents conjugated with anti-inflammatory activity
AU2013306098A1 (en) 2012-08-18 2015-02-12 Academia Sinica Cell-permeable probes for identification and imaging of sialidases
US9599610B2 (en) 2012-12-19 2017-03-21 Dnae Group Holdings Limited Target capture system
US9804069B2 (en) 2012-12-19 2017-10-31 Dnae Group Holdings Limited Methods for degrading nucleic acid
US10000557B2 (en) 2012-12-19 2018-06-19 Dnae Group Holdings Limited Methods for raising antibodies
US9551704B2 (en) 2012-12-19 2017-01-24 Dna Electronics, Inc. Target detection
US9995742B2 (en) 2012-12-19 2018-06-12 Dnae Group Holdings Limited Sample entry
US9434940B2 (en) 2012-12-19 2016-09-06 Dna Electronics, Inc. Methods for universal target capture
US10086054B2 (en) 2013-06-26 2018-10-02 Academia Sinica RM2 antigens and use thereof
WO2014210564A1 (en) 2013-06-27 2014-12-31 Academia Sinica Glycan conjugates and use thereof
JP6486368B2 (ja) 2013-09-06 2019-03-20 アカデミア シニカＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ 改変されたグリコシル基を含む糖脂質を用いたヒトｉＮＫＴ細胞の活性化
US10150818B2 (en) 2014-01-16 2018-12-11 Academia Sinica Compositions and methods for treatment and detection of cancers
US9982041B2 (en) 2014-01-16 2018-05-29 Academia Sinica Compositions and methods for treatment and detection of cancers
CN105567644A (zh) * 2014-03-13 2016-05-11 华中农业大学 一种抗新城疫病毒单克隆抗体
EP3129767B1 (en) 2014-03-27 2021-09-01 Academia Sinica Reactive labelling compounds and uses thereof
US10118969B2 (en) 2014-05-27 2018-11-06 Academia Sinica Compositions and methods relating to universal glycoforms for enhanced antibody efficacy
CN106661099A (zh) 2014-05-27 2017-05-10 中央研究院 抗her2醣抗体及其用途
CA2950423A1 (en) 2014-05-27 2015-12-03 Academia Sinica Compositions and methods relating to universal glycoforms for enhanced antibody efficacy
KR20240096599A (ko) 2014-05-27 2024-06-26 아카데미아 시니카 항-ｃｄ20 글리코항체 및 이의 용도
WO2015184001A1 (en) 2014-05-28 2015-12-03 Academia Sinica Anti-tnf-alpha glycoantibodies and uses thereof
KR102422375B1 (ko) 2014-09-08 2022-07-18 아카데미아 시니카 당지질을 사용한 인간 iNKT 세포 활성화
US9975965B2 (en) 2015-01-16 2018-05-22 Academia Sinica Compositions and methods for treatment and detection of cancers
US10495645B2 (en) 2015-01-16 2019-12-03 Academia Sinica Cancer markers and methods of use thereof
AU2015378564A1 (en) 2015-01-24 2017-07-13 Academia Sinica Novel glycan conjugates and methods of use thereof
JP2019515876A (ja) 2016-03-08 2019-06-13 アカデミア シニカＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ Ｎ−グリカンおよびそのアレイのモジュール合成のための方法
CA3034057A1 (en) 2016-08-22 2018-03-01 CHO Pharma Inc. Antibodies, binding fragments, and methods of use

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4355102A (en) * 1979-03-06 1982-10-19 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale, Inserm Agglutination tests for detecting influenza viruses, and reagents for carrying out these tests
US6503745B1 (en) * 1998-11-05 2003-01-07 Biocryst Pharmaceuticals, Inc. Cyclopentane and cyclopentene compounds and use for detecting influenza virus
US20030129618A1 (en) * 2001-08-10 2003-07-10 Regents Of The University Of California Sensitive and rapid detection of pathogenic organisms and toxins using fluorescent polymeric lipids

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6168956B1 (en) * 1991-05-29 2001-01-02 Beckman Coulter, Inc. Multiple component chromatographic assay device
US5719020A (en) * 1996-09-25 1998-02-17 Oklahoma Medical Research Foundation 4,7-dialkoxy N-acetylneuraminic acid derivatives and methods for detection of influenza type A and B viruses in clinical specimens
US7591978B2 (en) * 2006-08-10 2009-09-22 Inverness Medical Switzerland Gmbh Solid phase test device for sialidase assay

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4355102A (en) * 1979-03-06 1982-10-19 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale, Inserm Agglutination tests for detecting influenza viruses, and reagents for carrying out these tests
US6503745B1 (en) * 1998-11-05 2003-01-07 Biocryst Pharmaceuticals, Inc. Cyclopentane and cyclopentene compounds and use for detecting influenza virus
US20030129618A1 (en) * 2001-08-10 2003-07-10 Regents Of The University Of California Sensitive and rapid detection of pathogenic organisms and toxins using fluorescent polymeric lipids

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NOYOLA DANIEL E. ET AL.: "Comparison of a new neuraminidase detection assay with an enzyme immunoassay, immunofluorescence, and culture for rapid detection of influenza A and V viruses in nasal wash specimens". JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, vol. 38, no. 3, March 2000 (2000-03), pages 1161-1165, KHR002416855, page 1161, column 2, lines 19-30 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10317404B2 (en) 2013-04-01 2019-06-11 Becton, Dickinson And Company Method and kits for the diagnosis of influenza
RU2713112C2 (ru) * 2013-04-01 2020-02-03 Бектон, Дикинсон Энд Компани Способы и средства для диагностики гриппа
US11209433B2 (en) 2013-04-01 2021-12-28 Becton, Dickinson And Company Methods and kits for the diagnosis of influenza

Also Published As

Publication number Publication date
IL195097A (en) 2011-11-30
ATE467836T1 (de) 2010-05-15
IL195097A0 (en) 2009-08-03
MX2008014529A (es) 2009-01-28
WO2007135099A1 (en) 2007-11-29
PL2018564T3 (pl) 2010-12-31
JP2009537128A (ja) 2009-10-29
EP2018564A1 (en) 2009-01-28
US20100009339A1 (en) 2010-01-14
EA200870542A1 (ru) 2009-04-28
EP2018564B1 (en) 2010-05-12
KR20090031362A (ko) 2009-03-25
CA2652404A1 (en) 2007-11-29
AU2007253354A1 (en) 2007-11-29
DE602007006471D1 (de) 2010-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA014533B1 (ru) Способы обнаружения вирусов гриппа
Pedersen Hemagglutination-inhibition assay for influenza virus subtype identification and the detection and quantitation of serum antibodies to influenza virus
Pedersen Hemagglutination-inhibition test for avian influenza virus subtype identification and the detection and quantitation of serum antibodies to the avian influenza virus
ES2477588T3 (es) Ensayo de activación de monocitos perfeccionado capaz de detectar contaminantes pirogénicos no endotoxínicos en productos médicos
US20060246429A1 (en) Dot-elisa for the detection of animal viruses
KR101211593B1 (ko) 신속 면역크로마토그라피법에 의한 ｈ9형 조류인플루엔자 바이러스 진단 키트 및 이를 이용하여 ｈ9형 조류인플루엔자를 진단하는 방법
Chua et al. Performance evaluation of five detection tests for avian influenza antigen with various avian samples
CN112964873A (zh) 基于夹心法的SARS-CoV-2检测试剂盒
WO2019147891A1 (en) Compositions and methods for determining avian influenza virus susceptabilty
KR100762825B1 (ko) 신속 면역크로마토그라피법에 의한 ｈ5형 고병원성 및 일반조류인플루엔자 바이러스 항원 진단 스트립 및 그 제조방법
CN110320364A (zh) 一种双抗夹心胶体金检测试剂盒、及其制备方法与应用
KR20080075285A (ko) 돼지혈청으로부터 일본뇌염바이러스 항체 검출을 위한면역크로마토그래피 진단 키트
KR100968063B1 (ko) 면역형광항체법에 사용할 항원슬라이드의 제조방법 및 이 방법을 사용하여 제조된 일본뇌염바이러스, 웨스트나일바이러스, 황열바이러스 및 진드기매개뇌염바이러스에 대한 항체를 동시에 검출할 수 있는 다가 항원슬라이드
ES2345790T3 (es) Procedimiento de deteccion de virus de gripe.
Maduike CO et al. Modification of the passive heamagglutination test for detection of infectious bursal disease virus
CN101449164A (zh) 流感病毒的检测方法
AU2008333953B2 (en) Kit and method for detecting bovine viral diarrhea virus in tissue samples
Groves et al. Rapid active assay for the detection of antibodies to West Nile virus in chickens
RU2684417C1 (ru) Способ определения специфических антител к вирусу гепатита утят типа i
RU2305842C1 (ru) Гемагглютинационный тест на основе рекомбинантного антигена для серодиагностики сифилиса
Vázquez Rodríguez Novel procedures of viral quantification: development, optimization and validation of ex vivo and in vivo techniques
Pershin et al. Techniques of blood sampling for detection of African swine fever virus in wild boar and domestic pigs in the field conditions
RU2199126C2 (ru) Набор для определения антител к вирусу энцефаломиелита птиц
Tarigan et al. Endemicity of avian influenza in ducks living around commercial layer farms.
KR101046004B1 (ko) 돼지 인플루엔자 혈청 진단 방법

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU