KR100968063B1 - 면역형광항체법에 사용할 항원슬라이드의 제조방법 및 이 방법을 사용하여 제조된 일본뇌염바이러스, 웨스트나일바이러스, 황열바이러스 및 진드기매개뇌염바이러스에 대한 항체를 동시에 검출할 수 있는 다가 항원슬라이드 - Google Patents

면역형광항체법에 사용할 항원슬라이드의 제조방법 및 이 방법을 사용하여 제조된 일본뇌염바이러스, 웨스트나일바이러스, 황열바이러스 및 진드기매개뇌염바이러스에 대한 항체를 동시에 검출할 수 있는 다가 항원슬라이드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역형광항체법의 실시 후에 형광현미경을 이용한 양성대조군에서의 특이 형광을 판정하는 것이 용이하도록 하기 위한 면역형광항체법에 사용할 항원슬라이드의 새로운 제조방법에 대한 것으로서, 구체적으로는, 2시간 이내에 강제적으로 고착시키는 기존의 항원슬라이드 제조방법과는 다르게, 검출할 바이러스를 세포에 접종하는 단계; 바이러스를 접종한 세포를 항원슬라이드 상에 분주하여 다시 배양하는 단계; 및 항원슬라이드에서 배양액이 마르기 전에 이를 제거하여 배양된 세포를 항원슬라이드 상에 고착시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역형광항체법에 사용할 항원슬라이드의 제조방법에 대한 것이다.
상기 제조방법을 사용하여 제조된 항원슬라이드에서는 세포가 고유의 모양을 그대로 유지한 채로 고착되어 있기 때문에, 상기 항원슬라이드를 사용하여 면역형광항체법을 실시하는 경우에 양성대조군에서 특이 형광을 판정하기가 용이해지는 장점이 있다.
또한 본 발명은 상기 항원슬라이드의 제조방법을 사용하면서, 사람의 혈청 또는 뇌척수액에서 일본뇌염바이러스, 황열바이러스, 웨스트나일바이러스 및 진드기매개뇌염바이러스에 대한 항체를 동시에 검출할 수 있는 다가항원슬라이드를 제조하는 방법 및 상기 다가항원슬라이드를 포함하는 진단키트를 제공한다.
일본뇌염바이러스, 황열바이러스, 웨스트나일바이러스, 진드기매개뇌염바이러스

Description

면역형광항체법에 사용할 항원슬라이드의 제조방법 및 이 방법을 사용하여 제조된 일본뇌염바이러스, 웨스트나일바이러스, 황열바이러스 및 진드기매개뇌염바이러스에 대한 항체를 동시에 검출할 수 있는 다가 항원슬라이드 {A method of manufacturing antigen slide for immunofluorescence antibody assay and a multivalent antigen slide for simultaneous detection of antibodies against Japanese encephalitis virus, West Nile virus, Yellow fever virus and Tick-borne encephalitis virus manufactured by using the same}
본 발명은 면역형광항체법 (Immunofluorescence Antibody Assay, IFA)을 이용한 각종 질병의 실험실 진단에 있어서 사용되는 항원슬라이드의 제조방법 및 상기 제조방법에 따라 제조된 항원슬라이드를 이용하여 여러 가지 질병을 동시에 진단할 수 있는 항원슬라이드의 제조에 관한 것이다.
플라비바이러스 (Flavivirus)는 분류학상 플라비비리대 (Flaviviridae) 과의 플라비바이러스 (Flavivirus) 속에 속하는 40~50nm 크기의 양성 단일 가닥 RNA 바 이러스이다. 현재까지 약 70여 종이 확인되었으며 모기나 진드기가 주요 매개체이다. 감염시 동물이나 사람에게 열성 또는 뇌염질환을 일으킨다. 일본뇌염 (Japanese encephalitis), 웨스트나일뇌염 (West Nile encephalitis), 세인트루이스뇌염 (St.Louis encephalitis), 황열 (Yellow fever), 뎅기열 (Dengue fever), 진드기매개뇌염 (Tick-borne encephalitis)등이 주요한 질환이다. 일본뇌염은 일본뇌염바이러스를 매개하는 모기에 의한 흡혈을 통해 돼지나 사람에게 감염되는데 주로 아시아지역에서 유행하는 인수공통전염병이다. 백신개발이 이루어져 과거에 비해 환자발생이 급감하였으나 아직까지도 매년 30,000~50,000명의 환자가 보고되고 있다. 우리나라에서는 1946년에 최초로 보고된 이래 1970년대 후반까지 매년 수십에서 천 여명에 이르는 환자가 발생했으나 1970년대 후반 도입된 백신접종 등의 영향으로 1982년 1,197명과 1983년 139명이 발생한 것을 끝으로 이후 매년 수명 미만의 환자가 보고되고있다. 뎅기열은 아직까지 백신개발이 이루어지지 않은 상황이며 100여 개 이상 국가에서 유행하여 매년 5,000만 명 정도의 환자가 발생하고 있다. 진드기매개뇌염은 러시아, 북유럽, 일본 홋가이도 지역에 국한되어 매년 12,000 명 정도의 환자가 보고되고 있다.
플라비바이러스 감염증의 실험실 진단은 크게 (1) 역전사중합효소 연쇄반응법 (Reverse transcriptase Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)에 의한 바이러스 유전자 검출, (2) 세포배양이나 동물실험을 통한 바이러스 분리, (3) 플라크감소 중화시험법 (Plaque Reduction Neutralization Test, PRNT)이나 혈구응집억제시험법 (Hemagglutination Inhibition test, HI), 면역형광항체법 (Immunofluorescence Antibody assay, IFA) 또는 효소면역측정법 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)에 의한 혈청학적 진단으로 나눌 수 있다. 한편, 면역형광항체법은 크게 직접면역형광항체법과 간접면역형광항체법 (Indirect Immunofluorescence Antibody assay)으로 구분할 수 있다. 실험실 진단의 확진 기준은 (1) 해당바이러스에 대한 IgM 항체가 검출되었거나, (2) 급성기, 회복기 혈청 사이의 항체 역가가 4배 이상 차이를 보인 경우, (3) 바이러스가 분리되었거나 유전자가 검출된 경우이다.
이 중 유전자 검사법에 의한 진단은 뎅기열이나 황열을 제외하고는 사실상 큰 의미가 없는데 이는 뎅기바이러스와 황열바이러스 정도를 제외하고는 바이러스의 혈중 잔존기간이 너무 짧아 환자가 병원에 내원하여 실험실 진단을 위해 시료를 취했을 시점에는 이미 바이러스가 사멸되었기 때문이다.
최근의 진단방법으로는 1980년대에 개발된 효소면역측정법과 면역형광항체법, 특히 IgG 항체보다는 IgM 항체 검출법이 주로 활용되고 있다. 1950년대에 개발되어 현재까지 사용되고 있는 혈구응집억제시험법은 사용 시약이 10여 종에 이르며 실험조건이 까다롭고 신선한 거위 혈액을 지속적으로 필요로 하는 어려움이 있으며 검체의 전처리를 포함하여 1개 시료를 검사하는데 4시간 정도가 소요된다. 1950년대에 개발되어 혈청학적 진단법의 표준검사법 (gold standard)으로 인정되고 있는 플라크감소중화시험법은 플라비바이러스간의 혈청학적 교차반응이 생긴 경우 최종 확진의 방법으로 활용되지만 실험소요시간이 4일~6일 정도라는 단점이 있다. 간접면역형광항체법에 의한 진단은 2시간 정도에 시험결과를 확인할 수 있고 감염 초기에 생성되는 IgM 항체 검출시 민감도가 효소면역측정법과 비슷하여 조기진단에 활 용되고 있다. 기존연구에 의하면 간접면역형광항체법에 의한 진드기매개뇌염의 진단시 민감도, 특이도가 94% 이상을 보였으며 (International J. Medical Microbiology 293(37):148-151, 2004), 황열 진단에서는 민감도 94%, 특이도 97%를 (Clinical & Vaccine Immunology 15(2):177-181, 2008), 웨스트나일뇌염 진단에서는 민감도 96%, 특이도 100%를 보였다(American J. Clinical Pathology 119:508-515, 2003).
앞서 설명한 바와 같이, 면역형광항체법에는 직접법과 간접법이 있으나, 양 방법 모두에 사용되는 항원슬라이드는 동일한 것이다. 이하 면역형광항체법에 사용되는 항원슬라이드의 일반적인 제조방법과 상기 항원슬라이드를 사용한 간접면역형광항체법의 원리를 요약하자면 다음과 같다.
항원슬라이드의 제조를 위해 먼저 Vero (African green monkey kidney cell) 또는 BHK-21 (Baby hamster kidney cell) 세포주를 T75 플라스크 (바닥면적이 75cm2)나 T150 플라스크 (바닥면적이 150cm2)에서 배양한다. 이들 배양세포에 바이러스를 접종시킨 후, 이산화탄소배양기에서 계속 배양하면서 거의 모든 세포가 바이러스에 감염되도록 한다. 실제 세포가 바이러스에 감염되는 시간은 바이러스역가나 접종량에 따라 차이가 있으나 본 발명자의 경험에 의하면 상기 바이러스의 경우는 대체로 2~3일 정도 소요된다. 세포의 감염 여부는 세포의 모양이 둥글둥글하게 변하면서 플라스크 바닥에서 탈착되는 현상을 관찰하거나 더욱 정확하게는 세포배 양액을 회수하여 유전자증폭법으로 해당바이러스의 감염 여부를 확인함으로써 수시간 이내에 확인할 수 있다. 이들 감염된 세포를 원심분리하고 적당한 양의 완충용액으로 다시 풀어준 다음 이를 항원슬라이드의 각 구획에 분주한다. 항원슬라이드는 일반적으로 25mm x 75mm 규격에 여러가지 크기의 원형 웰 (well)로 구획된 것을 구매할 수 있는데 구획된 수에 따라 10웰, 12웰, 및 24웰 슬라이드 등으로 명명된다. 실험실진단에서는 주로 5mm~7mm 지름의 10웰 또는 12웰 슬라이드가 활용된다. 항원슬라이드에 따라 차이는 있지만 5mm 웰에 보통 5㎕이하의 감염세포액을 분주하여 생물안전캐비넷이나 방습함 (상대습도 30%미만)에 넣고 1~2시간 이내에 세포를 건조시킨다. 이어 아세톤이나 에탄올 등의 유기용매에 완전히 건조된 항원슬라이드를 담궈 고정시키는 것으로 항원슬라이드의 제작이 완료된다.
전술한 바와 같이, 면역형광항체법은 크게 직접면역형광항체법과 간접면역형광항체법으로 나눌 수 있다.
직접법에서는 항원슬라이드의 웰에 특정 바이러스에 대한 항체 (다클론 또는 단클론)를 반응시킨다. 이때 상기 항체에는 FITC, Cyanine 또는 Rhodamine 등의 형광물질이 결합되어 있다. 상기 항원슬라이드의 웰에 특정 바이러스에 감염된 세포가 고착되어있다면 형광물질로 표지된 항체는 항원슬라이드에 고착되어 있는 세포내의 바이러스 항원과 결합하여 [항원-항체] 복합체가 형성되게 된다. 이후 항원슬라이드를 세척하여 형광현미경으로 관찰하게 되면, [항원-항체] 복합체에 의한 특이 형광을 관찰할 수 있게 된다. 이를 직접법이라 한다.
이에 반해 혈청이나 뇌척수액 등의 생물시료를 이용하는 경우에는 이들 시료 에 직접 형광물질을 결합시킬 수 없어서 대신 이들에 반응하는 2차 항체에 형광을 표지하게 된다. 항원슬라이드 상에 특정 바이러스에 감염되어 항체가 생성된 환자의 혈청 또는 뇌척수액을 떨어뜨려 반응시키면, 시료 내에 있는 바이러스 특이적인 항체는 일차적으로 항원슬라이드에 고착된 세포 내의 바이러스 항원에 결합하여 [항원-항체] 복합체를 형성한다. 세척과정을 통해 비특이적인 결합을 제거한 다음 형광물질로 표지된 2차 항체 (예를 들면, Fluorescein isothiocyanate-conjugated anti-human IgM antibody가 있으며,이는 사람 IgM 항체에 특이적으로 반응하는 항체임)를 처리하면 [항원-항체-2차 항체] 복합체가 형성된다. 이를 다시 세척과정을 통해 비특이적인 반응물을 제거한 후 형광현미경에서 관찰한다. 형광물질로 Fluorescein isothiocyanate (FITC)를 사용하는 경우에는 형광현미경 하에서 [항원-항체-2차 항체] 복합체는 세포의 외벽을 따라 연두색 (yellow green) 계열의 발광체로 보인다. 이렇게 하여 환자 검체 내의 바이러스 특이적인 항체를 검출할 수 있다. 음성 검체의 경우에는 어떠한 항원-항체 반응도 일어나지 않기 때문에 형광현미경 하에서 까맣게 관찰된다.
이와 같이 면역형광항체법은 실험법이 간소하고 효능성, 즉 민감도와 특이도가 뛰어난 강점이 있지만 고가의 형광현미경을 필요로 하며 현미경 결과 판독시 상당한 수준의 숙련도가 요구된다는 문제점이 있다. 1980년대 개발된 이래 이러한 단점을 보완하기 위한 방안들이 고안되었다. 첫째 양성과 음성결과의 판독을 용이하게 하기 위해 Evans blue나 trypan blue 등의 대조염색 시약을 도입한 것이다. 즉, FITC로 표지된 2차 항체를 PBS (phosphate buffered saline) 용액이 아닌 상기 대 조염색약에 희석하여 사용함으로써 형광현미경하에서 세포가 전체적으로 붉게 보이도록 한 것이다. 이로 인해 항원-항체반응이 일어나지 않은 세포의 경우에는 형광현미경하에서 세포 전체가 붉게 관찰되는 반면, 양성반응을 보인 세포는 전체적으로 붉은색을 띄는 가운데 세포 외벽을 따라 연두색 계열의 형광색이 대비되어 더욱 명확하게 구분되는 효과가 있다. 둘째, 비정상적인 혈청에 의한 위양성결과를 막기 위한 방법으로써 감염세포와 비감염세포를 적정비율로 섞은 후에 항원슬라이드에 분주하는 방식을 고안한 것이다. 명확한 이유가 밝혀지지 않았으나 비정상적인 혈청에서는 비특이적인 항원-항체반응에 의해 모든 세포에서 형광이 관찰되는 경우가 발생한다. 이때 항원슬라이드의 각 웰에 고착된 세포가 100% 바이러스에 감염되어 있다면, 양성대조군과 상기 비정상적인 혈청을 적용한 웰에서는 모든 세포에서 형광의 발광체가 관찰되어 아무런 의심없이 양성으로 판정할 것이다. 그러나 이는 실제 양성이 아닌 비정상적인 반응에 의한 위양성으로 판정해야하지만 과거에는 이를 확인할 방법이 없었다. 이를 해결하기 위해 항원슬라이드의 각 웰에 감염세포와 비감염세포가 일정비율로 함께 고착되어 있다면, 실제 양성대조군에서 전체 세포가 아닌 일정부분의 세포에서만 특이 형광이 관찰될 것이다. 이러한 노력에도 불구하고 면역형광항체법에 따른 현미경 판독을 위해 숙련된 진단요원을 필요로 하고 있는 실정이다.
효소면역측정법에 의한 IgM 항체 검출법은 다량의 시료를 적용하기 용이하며 3시간 정도에 시험결과를 얻을 수 있어 현재 가장 선호되는 방법이지만, 플라비바이러스간 혈청학적 교차반응률이 상대적으로 간접면역형광항체법에 비해 높은 것으 로 보고되었다. 현재 일본뇌염, 뎅기열, 웨스트나일뇌염, 진드기매개뇌염 진단용 시약이 시판되고 있다. 또한 몇몇 국가의 진단센터에서는 자국에서 유행하는 바이러스주에 맞춰 자체 생산한 진단시약을 활용하고 있다.
플라비바이러스 감염증은 뎅기열이나 황열처럼 열성질환, 일본뇌염이나 진드기매개뇌염처럼 뇌염질환으로 구분되어 명명되는 것이 보통이지만, 최근 뎅기바이러스에 의한 뇌수막염이 보고되는가 하면, 이들 질환이 임상적으로 명백히 구분되지 않는 것이 사실이다. 따라서 한 지역 내에 여러 종류의 플라바이러스가 활동하고 있는 경우, 정확한 병원체의 확인을 위해서는 해당지역에 활동하고 있을 가능성이 있는 플라비바이러스 모두에 대해 검사를 수행해야 할 필요가 있다. 이로 인해 진단결과의 환류시간이 늦어질 우려가 있다. 게다가 플라비바이러스 감염증의 실험실 진단에서는 이들 바이러스간의 혈청학적 교차반응으로 인해 정확한 병원체를 확인하기 어려운 경우가 빈번하게 발생한다. 이는 플라비바이러스들이 항원학적으로 상당히 유사한 단백질을 보유하고 있기 때문이다. 플라비바이러스의 유전자는 Capsid, Membrane, Envelope의 3개 구조 (structural) 단백질과 7개의 비구조(non-sturctural) 단백질로 구성되어 있는데, 이 중 Envelope (피막) 단백질은 감염시 숙주세포의 면역반응을 야기하는 기능을 담당한다.플라크감소중화시험법을 제외한 대부분의 항체검출법은 이 피막단백질에 대한 항체를 검출하는 것이다. 플라비바이러스들 사이에서 이 피막단백질 내 특정 항원결정기 (epitopes)를 공유하고 있기 때문에 교차반응이 일어나게 되는 것이다. 이로 인해 플라비바이러스 감염증의 실험실 진단에서는 플라크감소중화시험법을 제외한 모든 실험법에서 일정 정도의 혈 청학적 교차반응이 일어날 가능성이 있다. 즉, 일본뇌염바이러스에 감염된 환자의 시료를 시험한 결과 일본뇌염바이러스뿐만 아니라 웨스트나일바이러스나 진드기매개뇌염바이러스에 대해서도 항체반응을 보일 수 있다는 것이다. 이러한 교차반응은 IgM 항체보다 IgG 항체 검출에서 더 심한 편이고, 면역형광항체법보다는 효소면역측정법 검사에서 더 높게 나타난다. 일본뇌염, 웨스트나일뇌염, 황열, 뎅기열 사이의 혈청학적 교차반응에 대한 연구결과에 살펴보면, IgM 검출을 위한 효소면역측정법 시험에서는 30~44%, 간접면역형광항체법 시험에서는 4~10%의 교차반응이 일어났고 IgG 검출에서는 효소면역측정법 시험이 62~84%, 간접면역형광항체법 시험이 16~71%의 교차반응을 보였다 (Microbes & Infection, 4:1209-1215, 2002). 혈청학적 교차반응이 확인된 경우에는 해당 바이러스에 대한 플라크감소중화시험법을 진행하여 급성기와 회복기 혈청 간 항체역가 차이에 근거하여 최종판정을 하게 된다. 플라크중화감소법 시험에 의한 감별 진단은 정확한 병원체 확인을 위해서 반드시 수행해야 하지만 이를 위해서 복수의 혈청, 즉 페어 혈청 (paired serum)이 필요하고 보통 4~6일 정도가 소요되어 결과 환류가 지연되는 문제점이 있다.
이러한 문제를 해결하기 위해 플라크감소중화시험법을 수행하지 않고서도 플라비바이러스 간 감별진단 (differential diagnosis)이 가능한 시약 개발을 위한 연구가 진행되고 있다. 효소면역측정법 시스템으로는 일본뇌염과 뎅기열 감별을 위해 활용되고 있는 Japanese encephalitis-Dengue IgM Combo ELISA Test (Panbio, Australia)가 판매되고 있고, 간접면역형광항체법 시스템으로는 Panbio(사)에서 개발한 Arbovirus screen slide가 있는데 이는 웨스트나일바이러스 및 기타 절지동물 매개 바이러스인 EEEV (Eastern equine encephalitis virus), WEEV (Western equine encephalitis virus), SLEV (St.Louis encephalitis virus), La Crosse virus 등의 바이러스에 대한 스크리닝 검사를 한 장의 슬라이드에서 수행할 수 있도록 고안되었다. 이러한 간접면역형광항체법 시스템은 한 장의 항원슬라이드를 10~12개의 원형 웰로 구획을 나누고 각 웰에 각기 서로 다른 바이러스에 감염된 세포를 고착시키는 방식을 활용하고 있다.
플라비바이러스 진단용 항원슬라이드 제작에 사용하는 세포는 대부분 Vero (African green monkey kidney cell) 세포 또는 BHK-21 (baby hamster kidney) 세포인데 이들의 원래 모양은 방사형이다. 그러나 세포는 바이러스에 감염이 진행됨에 따라 서서히 사멸하게 되고 이들은 배양플라스크바닥에서 탈착되어 배양액 위로 떠오르고 모양 또한 원형으로 수축된다. 설령 바이러스의 감염 정도가 세포를 사멸시킬 정도가 아니더라도 세포를 슬라이드 위에 분주하고 건조시키는 과정 자체에서 세포는 스트레스로 인해 본래의 모양을 잃고 원형으로 수축된다. 그 결과 형광현미경을 통해서 세포의 외벽에서 특이 형광을 관찰하여 양성 여부를 판단하는 것은 비숙련된 진단요원에게는 상당히 어려운 일이다. 본 발명은 면역형광항체법의 실시 후, 형광현미경을 통해 양성 여부를 판단하는데 있어서의 어려움을 해결하고자 하였다. 즉, 본 발명에서는 바이러스에 감염된 세포를 유리기판에 고착함에 있어서 세포 본래의 모양을 보존할 수 있는 방법을 찾아내어 실험결과의 현미경 판독을 용이하게 하고자 하였다.
본 발명은 나아가서 양성과 위양성의 판별을 용이하게 할 수 있는 기존의 방식을 개량하고자 한다.
또한, 본 발명은 일본뇌염, 웨스트나일뇌염, 진드기매개뇌염 및 황열의 진단을 짧은 시간 내에 수행할 수 있는 항원슬라이드를 제공하고자 한다. 우리나라에는 이미 일본뇌염이 토착화되어 있고 진드기매개뇌염바이러스가 분리되어 언제든지 환 자가 발생할 수 있으며, 뎅기바이러스 및 웨스트나일바이러스를 매개하는 모기가 서식하고 있어 두 질환의 국내발생 가능성이 높고, 해외 여행에 따라서 황열바이러스에 감염된 환자들이 발생하고 있는 것이 현실이다. 한편, 이들 병원체의 진단을 위해 뎅기열, 일본뇌염, 웨스트나일뇌염, 진드기매개뇌염은 상용화된 효소면역측정법 시약 및 간접면역형광항체법을 활용하고 황열은 자체 제작한 항원슬라이드를 활용하고 있다. 그러나 플라비바이러스간 혈청학적 교차반응을 고려하여 상기 병원체에 대한 실험을 모두 수행해야 하기 때문에 하나의 시료를 검사하는데 최대 10시간이 넘게 걸리고 시약의 낭비요인도 심한 것이 사실이다. 따라서 본 발명에서는 일본뇌염, 웨스트나일뇌염, 황열, 진드기매개뇌염의 혈청학적 검사를 2시간 정도에 수행할 수 있는 다가항원슬라이드 (multivalent antigen slide)를 제작함으로써 진단결과의 환류시간을 단축시키고자 하였다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해서 면역형광항체법에 사용할 항원슬라이드의 새로운 제조방법을 제공하고자 한다.
상기 방법은 바이러스에 감염된 세포를 슬라이드 상에 분주하여 방습상자 (상대습도 30% 미만)등에 넣어 1~2시간 이내에 강제적으로 고착시키는 기존의 항원슬라이드 제조방법과는 다르게, 검출할 바이러스를 세포에 접종하는 단계; 바이러스를 접종한 세포를 항원슬라이드 상에 분주하여 다시 배양하는 단계 및; 항원슬라이드에서 배양액이 마르기 전에 이를 제거하여 배양된 세포를 항원슬라이드 상에 고착시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
한편, 면역형광항체법시 형광현미경 관찰과정에서 일어날 수 있는 위양성 여부를 판별하고자 기존방식에서는 감염세포에 비감염세포를 일정비율로 섞은 후 이를 항원슬라이드 상에 고착시키는 방법을 사용하였으나, 본 발병에서는 세포에 접종할 바이러스의 역가와 접종 후 배양시간을 최적화하여 본 발명에서 제공하는 방식에 따라 실험을 진행하였을 때 전체 세포 중 50~90%의 세포만이 감염되어 있도록 하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법을 사용한 항원 슬라이드 제조방법을 사용하여 일본뇌염바이러스, 웨스트나일바이러스, 황열바이러스 및 진드기매개뇌염바이러스를 동시에 진단할 수 있는 항원슬라이드를 제공하고자 한다. 즉, 본 발명에 따른 항원슬라이드는 플라비바이러스, 예를 들면 일본뇌염바이러스, 웨스트나일바이러스, 황열바이러스 및 진드기매개뇌염바이러스 검출용 진단키트에 사용될 수 있다.
본 발명에서 제안된 방법으로 제작된 항원슬라이드를 이용하여 면역형광항체법을 실시한 후 형광현미경으로 관찰하는 경우, 세포의 모양이 원형 그대로 유지되어 있고 크기 또한 기존 항원슬라이드에서 보이는 것의 2배 이상이기 때문에 세포질 내에 특이형광의 위치를 파악하는 것이 용이하게 되었다. 또한, 기존의 항원슬라이드에서는 세포가 원래 크기의 절반 이하로 수축되었던 것에 비해 본 발명의 항원슬라이드에는 본래의 모양과 크기가 유지된 세포가 고착되어 있기 때문에 형광현 미경에서 동일한 시야를 확보하기 위해 필요한 세포의 양이 기존에 비해 줄어들게 되었다. 따라서, 동일한 양의 세포를 사용하면서도 기존 방식에 비해 2배 이상의 항원슬라이드를 생산해낼 수 있게 되어 이에 따르는 경비를 절감할 수 있다. 또한, 본 발명은 항원슬라이드 상에 고착된 세포의 바이러스 감염 정도를 50~90%로 조절함으로써, 면역형광항체법 실시 후 위양성을 판정하기가 용이해지는 장점이 있다. 나아가서, 본 발명에 따라 항원슬라이드를 제작하면 기존방식에 비해 하루 이상의 시간이 절약될 수 있다.
본 발명은 이하의 실시예를 통해 보다 구체적으로 설명될 것이다. 그러나 이하의 실시예들은 본 발명을 예시하기 위해 제공된 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 자연고착방식을 이용한 다가항원슬라이드 제작
면역형광항체법에 따라 일본뇌염바이러스, 웨스트나일바이러스, 황열바이러스 및 진드기매개뇌염바이러스에 대한 실험실 진단을 위해서 본 발명의 고착방법을 사용하여 항원슬라이드를 제조하였다.
항원슬라이드의 제조를 위한 세포주는 BHK-21 세포를 사용하였다. T75 조직배양 플라스크 (Tissue culture flask) 5개에 신선한 BHK-21 세포를 접종하고 이를 이산화탄소배양기에서 배양하였다. 세포가 flask 면적의 80~90% 정도 차지할 때까 지 자라면 생물안전캐비넷 (Biosafety cabinet)에서 각 플라스크의 세포를 PBS (phosphate buffered saline) 용액으로 2회 세척하였다. 여기에 표 1과 같이 일본뇌염바이러스, 웨스트나일바이러스, 진드기매개뇌염바이러스 및 황열바이러스 균주를 정해진 양의 영양배지 (Minimum Essential Medium, 10% fetal bovine serum과 항생제가 포함된 것, 이하 'MEM-10')에 희석하였다. 각 바이러스의 희석방법은 수차례의 예비실험에 근거하여 최종적으로 조정된 것이다. 이렇게 희석된 바이러스는 서로 간 교차오염이 일어나지 않도록 주의하여 각 1개 플라스크에 접종하여 이산화탄소배양기에 넣고 1시간 30분 동안 정치하였다.
표 1. 항원슬라이드 제작에 사용된 바이러스 균주
바이러스 분리지역 분리주명 바이러스 역가 희석방법
일본뇌염바이러스 대한민국 K05GS 2.2 x 106 pfu/㎖ 바이러스 1㎖ + MEM-10 2㎖
웨스트나일바이러스 우간다 B956 3.0 x 106 pfu/㎖ 바이러스 0.8㎖ + MEM-10 2.2㎖
황열바이러스 - 17D 2.3 x 106 pfu/㎖ 바이러스 1.5㎖ + MEM-10 1.5㎖
진드기매개뇌염바이러스 대한민국 KrM93 3.0 x 106 pfu/㎖ 바이러스 1.2㎖ + MEM-10 1.8㎖
이어 생물안전캐비넷으로 플라스크를 옮기고 세포층을 PBS 용액으로 2회 세척한 후, 각 플라스크 당 1.5㎖의 trypsin-EDTA를 첨가하여 플라스크 면에서 세포를 탈착시킨 후 20~25㎖의 배지 (MEM-10)를 넣고 파이펫팅하여 뭉쳐있는 세포들을 풀어주었다. 혈구측정기 (Hamacytometer)를 이용하여 세포수를 측정하고 1x105~1.2x105cells/㎖이 되도록 영양배지의 양을 조정하였다. 정사각형의 투명 플 라스틱상자 (24 x 24 x 2cm)에 항원슬라이드 (75 x 25 x 1mm)를 20개씩 정렬시키고 뚜껑을 닫아 놓았다. 상기 준비된 세포액을 잘 섞어서 항원슬라이드의 정해진 웰에 30㎕ 씩 분주하여 결과적으로 웰 당 약 3,000~3,500개의 세포가 분주되도록 하였다. 도 1과 같이 고안된 유리 재질의 항원슬라이드 하나에는 5mm 지름의 10개 웰이 테프론 재질로 코팅되어 구획되어있고 맨 왼쪽으로부터 C, JEV, WNV, YFV, TBEV로 인쇄되어 있다. 여기에 각각 정상세포 (C), 일본뇌염바이러스를 접종한 세포 (JEV), 웨스트나일바이러스를 접종한 세포 (WNV), 황열바이러스를 접종한 세포 (YFV), 진드기매개뇌염바이러스를 접종한 세포 (TBEV)를 분주하였다. 모든 항원슬라이드에 각 바이러스별 분주가 끝나면 이를 다시 이산화탄소배양기에 넣고 15~17시간 (하룻밤)동안 배양하였다. 배양이 끝나면 항원슬라이드를 생물안전캐비넷으로 옮기고 자동흡입기를 이용하여 항원슬라이드의 각 웰에서 배양액을 빨아내고 -20℃에서 보관해둔 80% 아세톤 용액이 담긴 염색통 (staining jar)에 항원슬라이드를 10분 동안 침지시킨 후, 상온에서 10분 정도 건조하였다. 건조가 끝난 항원슬라이드는 사용 전까지 -70~ -80℃ 정도의 초저온 냉동고에 보관하였다.
실시예 2: 항원슬라이드 적합성 실험
본 발명에서 따라 제작된 항원슬라이드는 웰 당 전체 세포의 50~90% 정도가 감염되어 있도록 조정되어 있어 양성시료를 적용하였을 때 일정 정도의 세포는 특이 형광이 발하지 않고 붉은색으로 관찰되도록 하였다. 모든 세포가 100% 감염되어 있는 경우에는 모든 세포가 특이 형광을 발하게 되고 이것이 실제 양성에 의한 것 인지 아니면 비정상적인 혈청에 의한 위양성인지를 판정하기 어렵기 때문이다. 실시예 1을 통해 제작한 다가항원슬라이드 (multivalent antigen slide)의 각 웰에 고착한 세포가 각기 지정된 바이러스에 감염되었는지와 웰간 바이러스 교차오염 여부를 확인하기 위해 표 2와 같은 시약을 사용하여 실험하였다.
표 2. 항원 적합성 실험을 위한 주요시약
시약명 제조사 제조사
공급번호		 제조형태
Phosphate buffered saline powder Sigma P3813 분말
Evans Blue Science-Lab SLE1912 분말
FITC-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgM (Fc5μ) Jackson ImmunoResearch 109-095-043 분말
Ultra Pure water JBI 019-02 액체
Mounting fluids Chemicon 5013 액체
Mouse anti-Japanese encephalitis virus monoclonal antibody Chemicon MAB8743 액체
Mouse anti-West Nile virus monoclonal antibody Chemicon MAB8150 액체
Mouse anti-yellow fever virus monoclonal antibody Chemicon MAB984 액체
Polyclonal antibody against tick-borne encephalitis virus Jeno - 액체
FITC-conjugated Goat Anti-Mouse IgG antibodies Jackson ImmunoResearch 115-095-003 분말
FITC-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG antibodies Jackson ImmunoResearch 111-095-003 분말
각 바이러스에 반응하는 항체 (anti-JEV, anti-WNV, anti-YFV, anti-TBEV)를 PBS 용액으로 50배 희석해서 300㎕씩 준비하였다. 초저온 냉동고에 보관중인 항원슬라이드 4개를 꺼내서 PBS 용액이 담긴 염색통에 5분 정도 담궈 상온과 온도평형이 되도록 하였다. 서로 다른 항체 용액들이 뒤섞이지 않도록 흡습지를 이용하여 항원슬라이드의 웰과 웰 사이의 물기를 제거하였다. 첫번째 항원슬라이드의 각 웰 에 항 일본뇌염바이러스 항체를 25㎕씩 분주하였다. 두번째 항원슬라이드의 각 웰에는 항 웨스트나일바이러스 항체, 세번째 슬라이드에는 항 황열바이러스 항체, 네번째 슬라이드에는 항 진드기매개뇌염바이러스 항체를 적용하였다. 상용시약 중 항 일본뇌염바이러스항체는 웨스트나일바이러스에도 약하게 반응하는 것으로 제품지시서에 명시되어있다. 항원슬라이드를 빛이 통과하지 않는 함습상자 (humid chamber, 20 x 14 x 4cm. 100㎖ 정도의 증류수를 채운다)에 넣고 37℃ 배양기에서 30분 동안 반응시켰다. 이어 항원슬라이드 위의 항체 용액을 떨어버리고 PBS 용액이 담긴 염색통에 넣고 교반기에서 150 rpm으로 5분 동안 2회 세척하였다. 흡습지를 이용하여 항원슬라이드의 웰과 웰 사이의 물기를 제거하고 평평한 곳에 항원슬라이드를 놓았다. 이어 0.0025% evans blue 분말이 녹여진 PBS 용액에 FITC-conjugated Goat Anti-Mouse IgG antibodies (첫번째부터 세번째 항원슬라이드에 적용할 것임)와 FITC-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG antibodies (네번째 항원슬라이드에 적용할 것임)를 300배 희석하여 각기 1㎖, 0.3㎖씩 준비하였다. 상기 희석된 2차 항체 용액을 해당 웰에 25㎕씩 첨가하고 다시 이를 함습상자 (humid chamber, 20 x 14 x 4cm)에 넣고 37℃ 배양기에서 30분 동안 반응시켰다. 30분이 경과한 후 항원슬라이드를 배양기에서 꺼내어 2차 항체 용액을 떨어버리고 PBS 용액이 담긴 염색통에 넣고 교반기에서 150rpm으로 5분 동안 2회 세척하였다. 이어 항원슬라이드를 평평한 곳에 놓아두고 덮개 유리 (cover glass)에 mounting fluid를 3~4 방울 떨어뜨리고 그 위에 항원슬라이드를 뒤집어 얹었다. 빛이 들지 않는 암상자에 항원슬라이드를 넣고 형광현미경실로 이동하여 관찰하였다. 도 3과 같이 항원슬라이드의 각 웰에는 정해진 바이러스에 대해 50~90% 정도의 세포들이 감염되어 있는 것을 확인하였다. 또한 웰과 웰사이의 바이러스간 교차오염도 없는 것으로 확인하였다.
실시예 3: 다가항원슬라이드를 이용한 일본뇌염 진단
간접면역형광항체법을 이용한 일본뇌염진단의 효능평가에 대한 문헌을 구할 수 없어 상기 실시예 1, 2를 통해 적합성이 확인된 항원슬라이드에 일본뇌염으로 판명된 환자에서 채취한 IgM 양성 혈청 19건을 적용하여 민감도를 산출하였다. IgM 항체검사법은 Panbio(Australia)의 Japanese encephalitis-Dengue IgM Combo ELISA Test를 표준방법으로 하였다. IgM 항체검사를 위해서는 먼저 혈청 내의 IgG 항체를 제거해야 한다. IgG 제거 시약 (Chemicon, USA) 105㎕에 혈청 15㎕와 PBS 용액 30㎕를 넣고 잘 섞은 후 상온에서 10분 정도 방치하면 혈청 내 IgG 항체가 모두 활성을 잃게되어 IgM항체만을 검출할 수 있게 된다. 이렇게 준비된 혈청을 항원슬라이드의 각 웰에 25㎕ 씩 첨가하였다. 1개 슬라이드에 두 건의 혈청을 적용하였는데 항원슬라이드의 윗줄과 아랫줄에 각각 다른 혈청을 적용한 것이다. 혈청을 적용한 항원슬라이드는 37℃ 배양기에서 1시간 동안 반응시킨 후, 세척과정을 거쳐 0.025% evans blue 용액에 200배 희석된 FITC-conjugated Goat Anti-human IgM antibodies를 각 웰에 적하하였다. 다시 37℃ 배양기에서 30분 동안 반응시킨 후 세척과정을 거치고 형광현미경하에서 관찰하였다. 표 3과 같이 다가 항원슬라이드를 이용하여 일본뇌염환자 혈청을 적용해본 결과 88.9% (16/18)의 민감도를 보였고 다른 플라비 바이러스와 교차반응은 없었다. 특이도 시험을 위해서는 상기 ELISA법으로 시험한 결과, IgM 음성으로 확인된 혈청 36건을 사용하였고 실험결과 100%의 특이도를 보였다.
표 3. 다가 항원슬라이드에 일본뇌염 환자혈청을 적용한 민감도 결과
혈청번호 07-153 07-155 07-165 07-168 07-170 07-176 07-188 07-192 07-201
실험결과 IgM양성 IgM양성 IgM양성 IgM양성 IgM양성 IgM양성 IgM양성 IgM양성 IgM양성
교차반응 없음 없음 없음 없음 없음 없음 없음 없음 없음
혈청번호 07-218 07-220 07-229 07-234 08-538 08-650 08-668 08-683 08-692
실험결과 IgM음성 IgM양성 IgM양성 IgM양성 IgM양성 IgM양성 IgM음성 IgM양성 IgM양성
교차반응 없음 없음 없음 없음 없음 없음 없음 없음 없음
비교 실험예 1: 기존 항원슬라이드와의 판독성 비교
Panbio (Australia)에서 판매하는 Arbovirus screen slide라는 상용 키트와 상기 실시예 1을 통해 제작된 본원의 항원슬라이드를 이용하여 웨스트나일바이러스에 대한 실험을 수행하였다. 각 항원슬라이드의 웨스트나일바이러스에 해당하는 웰에 상기 상용 키트에서 제공하는 대조혈청을 사용하여 실험을 수행하고 형광현미경으로 관찰하였다. 도 4의 상단 사진과 같이 현재 시판되는 항원슬라이드에서는 세포들이 원래의 모양을 잃고 본래 크기의 두 배 이하로 수축되어 있어 숙련된 진단요원조차도 양성대조군에서 특이 형광을 판정하기가 어려웠다. 이러한 문제점은 도 4의 하단 사진과 같이 국외 연구진의 실험결과를 통해서도 확인할 수 있었다 (American J. Clinical Pathology 119:508-515, 2003). 단 이 사진은 본래 크기보다 2배 이상 확대한 것으로 추정되는바 실제 현미경관찰시에는 특이 형광의 판정이 어려웠을 것으로 사료된다. 이에 반해 본 발명을 통해 제작된 항원슬라이드에 대조혈청을 적용한 경우에는 도 5를 통해 볼 수 있듯이 슬라이드 표면에 세포들이 원래 모양과 크기를 유지한 채 고착되어 있기 때문에 비숙련자라도 세포질 내 특이 형광 유무를 쉽게 판정할 수 있었다.
도 1은 실시예 1에 따라 제조된 4 종 플라비바이러스 진단용 다가 항원슬라이드의 실물이다. C는 control (비감염 정상세포), JEV는 일본뇌염바이러스 (Japanese encephalitis virus), WNV는 웨스트나일바이러스 (West Nile virus), YFV는 황열바이러스 (yellow fever virus), TBEV는 진드기매개뇌염바이러스 (Tick-borne encephalitis virus)를 가리키는 약자임.
도 2는 실시예 1에 따라 제조된 항원슬라이드를 이용한 플라비바이러스 항체검사법의 절차도이다.
도 3은 실시예 1에 따라 제조된 다가항원슬라이드 4개를 이용하여 각 슬라이드에 4종 바이러스에 대한 항체를 각각 반응시켜 적합성을 확인한 것이다. 각 항원슬라이드에 일본뇌염바이러스, 웨스트나일바이러스, 황열바이러스, 진드기매개뇌염바이러스에 대응하는 항체를 각각 반응시켜서 세포가 각 바이러스에 50~90% 정도로 감염되었는지와 웰간 바이러스 교차오염 여부를 확인하였다.
도 4는 상용 진단키트로서 Panbio(Australia)에서 시판하고 있는 Arbovirus screen slide 키트를 이용하여 간접면역형광항체법을 실시한 결과사진이며, N은 음성대조군, P는 양성대조군이며 현미경배율은 각 사진의 우편 하단에 기재하였다. 위의 사진은 상용 진단키트의 사용설명서에 따라 본 발명자가 웨스트나일바이러스 검사를 수행한 것이며 아래 그림은 외국연구진의 실험결과를 수정 없이 발췌한 것이다 (Am J Clin Pathol 119:508-515,2003). 바이러스에 특이적인 형광의 일부를 화살표로 표시하였다.
도 5는 본 발명에 따라 고안된 항원슬라이드에 Panbio(사)의 대조혈청을 적용하여 실험한 결과이다.

Claims (11)

  1. 면역형광항체법에 사용할 항원슬라이드의 제조방법에 있어서,
    검출할 바이러스를 세포에 접종하는 단계; 바이러스를 접종한 세포를 항원슬라이드 상에 분주하여 전체 세포의 50~90%가 바이러스에 감염되도록 바이러스의 역가과 배양시간을 조절하여 배양하는 단계 및; 항원슬라이드에서 배양액이 마르기 전에 배양액을 제거하여 배양된 세포를 항원슬라이드 상에 고착시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역형광항체법에 사용할 항원슬라이드의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    배양된 세포를 항원슬라이드 상에 고착시키는 단계에서 세포는 세포 고유 모양과 크기를 유지한 채로 고착되는 것을 특징으로 하는 면역형광항체법에 사용할 항원슬라이드의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항원슬라이드는 유리 재질인 것을 특징으로 하는 면역형광항체법에 사용할 항원슬라이드의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 세포는 Vero 세포 또는 BHK-21 세포인 것을 특징으로 하는 면역형광항체법에 사용할 항원슬라이드의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 배양하는 단계에 있어서, 전체 세포의 50~90%가 바이러스에 감염되도록 바이러스의 역가과 배양시간을 조절하여 배양함으로써 간접면역형광항체법 실시시 위양성 여부를 판정할 수 있도록 하는 것을 특징으로 하는 면역형광항체법에 사용할 항원슬라이드의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 배양시간은 15~17시간인 것을 특징으로 면역형광항체법에 사용할 항원슬라이드의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 배양하는 단계에 있어서, 상기 항원슬라이드는 복수의 웰을 구비하여 각 웰에 각기 다른 바이러스를 접종한 세포를 배양시킴으로써, 복수의 바이러스를 일 회의 간접면역형광항체법을 실시함으로써 진단할 수 있는 것을 특징으로 하는 면역형광항체법에 사용할 항원슬라이드의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 복수의 바이러스는 일본뇌염바이러스, 웨스트나일바이러스, 황열바이러스 및 진드기매개뇌염바이러스인 것을 특징으로 하는 면역형광항체법에 사용할 항원슬라이드의 제조방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항의 제조방법에 따라 제조된 면역형광항체법에 사용할 항원슬라이드.
  10. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항의 제조방법에 따라 제조된 면역형광항체법에 사용할 항원슬라이드를 포함하는 플라비바이러스 검출용 진단키트.
  11. 제8항의 제조방법에 따라 제조된 면역형광항체법에 사용할 항원슬라이드를 포함하는 일본뇌염바이러스, 웨스트나일바이러스, 황열바이러스 및 진드기매개뇌염바이러스 검출용 진단키트.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101341994B1 (ko) 2012-02-20 2013-12-16 대한민국 간접면역형광항체법에 의한 레지오넬라증 진단용 항원슬라이드의 제조방법 및 이를 이용한 마이크로 다가 항원슬라이드
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