KR101341994B1 - 간접면역형광항체법에 의한 레지오넬라증 진단용 항원슬라이드의 제조방법 및 이를 이용한 마이크로 다가 항원슬라이드 - Google Patents
간접면역형광항체법에 의한 레지오넬라증 진단용 항원슬라이드의 제조방법 및 이를 이용한 마이크로 다가 항원슬라이드 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 급성 폐렴을 일으키는 세균성 호흡기 질환인 레지오넬라증의 면역혈청학적 진단방법에 사용하는 항원슬라이드의 제조방법에 대한 것이다. 본 발명은, 간접면역형광항체법에 의해 레지오넬라증을 진단하는 항원슬라이드의 제조방법에 있어서, i) 2 ~ 5 ㎕의 용액을 수용할 수 있는 마이크로 웰 (micro well)이 다수 개 형성된 슬라이드를 준비하는 단계; ii) 항원으로 사용할 다수의 레지오넬라균을 불활화하는 단계; 및 iii) 상기 각 웰에 각기 다른 레지오넬라균을 고정하는 단계를 포함하는 간접면역형광항체법에 의한 레지오넬라증 진단용 마이크로 다가 항원슬라이드의 제조방법 및 이를 이용한 마이크로 다가 항원슬라이드로 구성된다. 상기 본 발명에 의하면, 레지오넬라증이 의심되는 환자의 혈청으로부터 여러 종류의 레지오넬라균에 대한 면역항체의 유무를 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 한 개의 슬라이드를 이용하여 여러 종류의 레지오넬라균에 대한 면역 항체 역가의 측정이 가능한 이점이 있다.
Description
본 발명은 간접면역형광항체법 (Indirect Immunofluorescent Antibody Assay, IFA)에 의한 레지오넬라증 진단용 항원슬라이드의 제조방법 및 이를 이용한 마이크로 다가 항원슬라이드에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 동시에 여러 종류의 레지오넬라균에 대한 면역항체의 유무를 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 하나의 슬라이드로 여러 종류의 레지오넬라 균종에 대한 항체의 역가를 측정할 수 있도록 하여 간접면역형광항체법 (IFA)에 이용할 수 있는 레지오넬라증 진단용 항원슬라이드의 제조방법 및 이를 이용한 마이크로 다가 항원슬라이드에 관한 것이다.
레지오넬라균 (Legionella )은 토양, 호수 등의 자연수계와 냉각탑수, 장식용 분수 등의 인공수계에 널리 분포하는 세균으로 Legionellaceae속에 포함되는 포자와 협막이 없는 그람음성 간균이다. 레지오넬라균은 현재까지 50여종 (species)의 70여개 이상의 혈청군 (serogroup)이 있으며, 이중 20개 균종 이상이 사람에게 감염을 일으키는 것으로 알려져 있다. 레지오넬라균종의 전 세계의 분포 현황을 살펴보면, 냉각탑수에서는 L. pneumophila sg 1, 냉·온수 시스템에는 L. pneumophila sg 1, 2, 4, 6, 12, L. micdadei, L. bozemanii, L. feeleii 등, 온천 등에는 L. pneumophila sg 1, L. micdadei, L. gormanii, L. anisa 등, 원예용 토양에는 L. longbeachae 이 주로 분리되는 것으로 알려져 있다.
레지오넬라증은 레지오넬균에 의해 급성폐렴을 일으키는 세균성 호흡기질환으로, 1976년 미국에서 보고된 이후로 현재까지 전세계적으로 발생하고 있으며, 미국의 경우에도 연간 8천 명에서 1만 8천 명 정도의 환자가 발생하며, 실제로는 더 많을 것으로 추정한다. 레지오넬라증은 대형건물의 냉방시스템에 사용되는 냉각탑수와 와류욕, 온천수, 장식용 분수, 식료품 매장의 분무기 등 다중이용시설의 수계시스템이 레지오넬라균에 오염되었을 때 비말 (에어로졸)을 통하여 호흡기계로 전파됨으로써 감염된다. 특히, 골수 또는 장기이식 등으로 면역체계가 약해진 환자, 당뇨 및 고령의 만성폐질환자 등 기저질환자가 많은 병원에서 냉각탑수 및 샤워기, 수도 등 병원내 수계시설과 호흡기 치료장치나 오염된 음용수를 사용한 아스프레이션 (aspiration) 등이 오염되어 발생하는 병원 내 획득성 레지오넬라증은 적절한 치료를 받아도 사망률이 50%이상인 것으로 보고되고 있다. 또한 지역사회 폐렴환자의 0.5~5%정도가 매년 레지오넬라증으로 보고되고 있으며, 주로 40대 이후의 장년층에서 자주 발생한다.
미국의 경우 레지오넬라증의 90% 이상이 L. pneumophila sg 1에 의한 것이나, 유럽은 L. pneumophila sg 1에 의한 것이 70%, 다른 혈청군에 의한 것이 20~30%, 5~10%가 다른 균종 (L. micdadei 60%, L. bozemanii 15%, L. dumoffii 10%, L. longbeachae 5%, other species 10%)에 의한 것으로 알려져 있다. 특히 호주와 일본에서는 L. longbeachae에 의한 감염 사례가 많다.
수계 시스템에서 분리되는 레지오넬라균의 우세종은 L. pneumophila이지만, 이외에 L. micdadeii , L. bozemanii , L. dumoffii , L. anisa , L. feeleii 등의 균종도 자주 분리되고 있다. 최근에는 면역억제제 치료를 받고 있는 환자, 장기이식환자, 심장질환 환자들에게 L. micdadei, L. bozemanii, L. dumoffii 등의 non-L. pneumophila에 의한 감염이 더 자주 발생하며, 미국 오하이오주의 원인불명 지역사회획득성폐렴환자들 중 14%가 L. bozemanii (8%), L. anisa (4%) 등과 같이 다른 레지오넬라균종에 의한 항체가 양전률을 보였다.
한국의 경우에는 레지오넬라증이 법정감염병 3군으로 관리되고 있으며, 1984년 레지오넬라증 발생이 처음으로 보고된 이후로 연간 30명 정도의 환자발생이 보고되고 있으나, 환자발생보고 시스템에 보고되지 않은 환자도 많을 것으로 추정하고 있다. 우리나라에서도 냉각탑수 등의 인공 수계에서 분리·동정되는 레지오넬라균은 주로 L. pneumophila sg 1인 것으로 알려져 왔으나, 국내에서 분리된 L. busanenesis를 신종 (new species)으로 보고한 이후로 (International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2003. 53:77-80), 최근에는 L. pneumophila sg 6, 12, L. micdadei , L. erythra , L. londiniensis , L. anisa , L. taurinensis 등 다양한 균종이 분리되고 있다 (Applied Environmental Microbiology. 2010. 76:6547-6554).
레지오넬라증에 대한 진단은 다른 유사 병원체에 의한 폐렴증상과 구별하기 어렵기 때문에 임상증상과 함께 실험실진단에 의한 확진이 매우 중요하다. 레지오넬라증에 대한 실험실 진단은 임상검체에서의 레지오넬라균 분리배양, 급성기 및 회복기 혈청에서 채취한 항체 검사, 소변 항원 검사, 객담 등 호흡기 검체에서 균 항원 검출, 레지오넬라균 특이 유전자 검사 등이 사용되고 있다.
임상검체에서 레지오넬라균을 배양하는 방법은 특이도가 100%로 가장 우수한 방법이지만, 적절한 검체를 사용하지 않으면 균 배양이 매우 까다롭고 2주 이상의 기간이 필요하다.
소변검사는 발병 후 1일이 지난 후부터 수 주간 지속적으로 배출되어 널리 사용되고 있으며, 특이도 (99~100%)와 민감도 (75~99%)가 높지만, 레지오넬라균의 여러 균종 중 L. pneumophila sg 1만 검출할 수 있어, 다른 균종 및 다른 혈청군에 의하여 감염되었을 경우에는 진단에서 제외될 수 있다는 단점이 있다.
유전자 검사는 소요시간이 짧고 특이도가 높으나 (94~99%), 민감도가 낮아 (33~70%), 현재 추정환자의 진단에만 주로 사용하고 있다.
발병 초기의 급성기 혈청과 회복기 혈청을 이용한 혈청학적 검사는 특이도 (95~99%)와 민감도 (70~90%)가 비교적 높아 실험실에서 널리 사용되고 있는 방법으로, 사람이 레지오넬라균에 감염되었을 때 인체 내에서 일어나는 면역반응에 의하여 혈청 내에 생기는 레지오넬라균에 대한 면역글로블린을 측정하는 것이며, 간접형광항체법 (IFA)과 효소면역측정법 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay; ELISA)이 주로 이용된다. 특히, IFA는 숙련자가 필요하고 결과판독을 형광현미경 검경으로 하기 때문에 주관적이기는 하지만, ELISA 기법보다 간편하고 소요시간이 짧아 아직까지도 많이 사용되고 있다. 즉, 레지오넬라균 항원 부유액을 슬라이드 위에 점적하였을 때, 번지지 않도록 제작된 슬라이드를 사용하여 균항원 부유액을 일정량 고정하고 환자의 혈청을 1차적으로 반응시켜 레지오넬라균 항원과 결합한 [항원-항체] 복합체를 형성시킨다. 이때 복합체로 형성되지 않은 항체 또는 비특이적 결합을 제거하기 위하여 세척과정을 실시하고, 사람 혈청과 반응할 수 있는 형광물질이 부착된 면역글로블린 (Fluorescein Isothiocyanate-conjugated anti-human IgG/IgM antibody)를 반응시켜 [항원-항체-2차 항체] 복합체를 형성시킨다. 이를 다시 세척과정을 실시하여 비특이적인 반응물을 제거한 후, 형광현미경에서 관찰한다. 이때 [항원-항체-2차 항체] 복합체는 형광색 (연두색) 계역의 발광체로 관찰되고, 복합체가 형성되지 않는 웰은 시야가 검정색으로 관찰된다.
상용화되고 있는 레지오넬라균에 대한 혈청학적 검사키트에는 대부분 6개의 균항원 (L. pneumophila sg 1, sg 2, sg 3, sg 4, sg 5, sg 6)이 혼합되거나 각각의 균항원이 고정되어 있거나, 다른 균종의 경우에는 대부분 혼합되어 고정되어 있다. 따라서 여러 개의 균 항원이 혼합되었을 때에는 비특이 반응이 생길 수 있고 환자의 항체역가를 측정하기 위해서는 여러 개의 항원슬라이드를 사용하여야 하는 번거로움이 있다. 특히, L. pneumophila 균종이 아닌 다른 균종에 의한 환자 발생률이 증가하고 있고, 감염원인 수계시설에서도 다른 균종의 레지오넬라균의 분리율이 점점 증가하고 있는 상황에서, 기존 키트에 사용되지 않은 다른 균종에 의하여 레지오넬라증 환자가 발생하였을 때에는 실험실 진단에서 환자가 아닌 것으로 진단될 가능성이 크기 때문에 다른 균종을 균 항원으로 추가한 키트의 개발이 필요하다. 또한, 현재 시판되고 있는 키트는 10개 또는 30개의 웰이 있는 슬라이드를 사용하고 있어, 실험시 사용되는 균 항원이나 사람혈청 등 시료의 양이 많이 필요하며 (웰 당 10~100 ㎕), 동일한 슬라이드 위에서 각각의 균 항원별로 항체 역가를 측정하기가 어려운 문제점이 있다.
레지오넬라균 검출 방법과 관련된 본 발명의 배경이 되는 기술로서 대한민국 등록특허 제10-0968063호(2006.07.19)에는 레지오넬라 균종의 공통 지질단백항원 및 이를 이용한 레지오넬라 검출용 진단시약이 공개되어 있고, 대한민국 공개특허 제10-2010-0083133호(2010.07.21)에는 레지오넬라속균 rRNA 증폭용 프라이머, 검출방법 및 검출키트 등이 알려져 있다. 그러나 여러 종류의 레지오넬라균에 대한 면역항체의 유무를 진단할 수 있을 뿐만 아니라 하나의 슬라이드로 여러 종류의 레지오넬라 균종에 대한 항체의 역가를 측정할 수 있는 기술에 대해 공개된 바는 없다.
Wilkinson, H. W. 1987. Hospital-laboratory diaganosis of Legionella infections. pp.23-25. U.S. Department of Health and Human service, Public Health service, Centers for Disease Control.
따라서 본 발명의 목적은 시료의 양을 줄이고, 여러 종류의 레지오넬라균에 대한 면역항체의 유무를 진단할 수 있을 뿐만 아니라 하나의 슬라이드로 여러 종류의 레지오넬라 균종에 대한 항체의 역가를 측정할 수 있는 마이크로 다가 항원슬라이드 (micro-multivalent antigen slide)를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제작된 마이크로 다가 항원슬라이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 간접면역형광항체법에 의해 레지오넬라증을 진단하는 항원슬라이드의 제조방법에 있어서, i) 2 ~ 5 ㎕의 용액을 수용할 수 있는 마이크로 웰 (micro well)이 다수 개 형성된 슬라이드를 준비하는 단계; ii) 항원으로 사용할 다수의 레지오넬라균을 불활화하는 단계; 및 iii) 상기 각 웰에 각기 다른 레지오넬라균을 고정하는 단계를 포함하는 간접면역형광항체법에 의한 레지오넬라증 진단용 마이크로 다가 항원슬라이드의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 2 ~ 5 ㎕의 용액을 수용할 수 있는 마이크로 웰 (micro well)이 다수 개 형성된 슬라이드; 및 상기 각 웰에 고정된 각기 다른 불활화된 레지오넬라균 항원을 포함하는 간접면역형광항체법에 의한 레지오넬라증 진단용 마이크로 다가 항원슬라이드를 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명은 간접면역형광항체법에 의해 레지오넬라증을 진단하는 항원슬라이드의 제조방법에 관한 것이다. 통상 간접면역형광항체법에 의해 레지오넬라증을 진단하는 항원슬라이드의 제조방법은 슬라이드에 부착하여 고정할 레지오넬라균의 배양 단계, 배양한 레지오넬라균의 불활화처리 단계, 고정할 레지오넬라균 항원의 농도 조절단계, 및 조절한 레지오넬라균 항원의 고정 단계를 포함한다.
본 발명의 일 양태에 의하면, 본 발명에 의한 마이크로 다가 항원슬라이드의 제조방법은 i) 2 ~ 5 ㎕의 용액을 수용할 수 있는 마이크로 웰 (micro well)이 다수 개 형성된 슬라이드를 준비하는 단계; ii) 항원으로 사용할 다수의 레지오넬라균을 불활화하는 단계; 및 iii) 상기 각 웰에 각기 다른 레지오넬라균을 고정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기와 같은 구성에 의해, 마이크로 웰을 이용하면 균 항원의 양을 줄일 수 있고 간접면역형광항체법을 실시하였을 경우, 사람 혈청 등 사용되는 시료의 양 및 기타 시험에 사용되는 시약의 양을 줄일 수 있는 이점이 있다. 2 ㎕ 미만의 마이크로 웰인 경우, 면역 반응 결과가 불명확할 수 있고, 5 ㎕ 초과의 마이크로 웰인 경우는, 상기 이점을 활용하기 어려운 점이 있다. 2 ㎕의 용액을 수용할 수 있는 마이크로 웰이 가장 바람직하다. 상기 웰의 개수에는 특별한 제한이 없으나, 고정되는 항원의 수를 고려하여 60개 이상의 웰을 가진 슬라이드를 이용하는 것이 바람직하며, 여러 종류의 균항원에 대한 실험과 대조실험을 하기 위해서는 80 개 이상의 웰을 가진 슬라이드를 이용하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 상기와 같이 다수개의 웰에 각기 다른 레지오넬라균을 고정하는 구성에 의해, 시료에 대해 일회의 간접형광항체법을 실시함으로써, 다수의 레지오넬라균에 대한 면역항체의 유무를 동시에 진단할 수 있을 뿐만 아니라 동시에 여러 균 종별 항체 역가를 측정할 수 있는 이점이 있다.
상기 단계 ii)에서 상기 불활화된 레지오넬라균을 0.1 ~ 0.5 %의 유정난황막 부유액에 부유하여 상기 레지오넬라균 항원의 농도를 조절하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다. 균 항원의 부유에 배양한 레지오넬라균을 열처리하여 불활화한 후, 슬라이드 위에 고정할 레지오넬라균 항원 부유액 제조시, 비특이적인 반응을 줄이고 슬라이드 위에 항원의 부착능력을 높이기 위하여 유정난황막 부유액을 사용한다. 이때, 0.1 ~ 0.5 %의 유정난황막 부유액에 부유하여 고가의 유정난황막을 적게 사용하면서 상기 항원의 부착능력을 유지할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 0.2%의 유정난황막 부유액을 이용하는 것이 더욱 바람직하다.
이에 한정되는 것은 아니나, 상기 불활화된 레지오넬라균은 유정난황막 부유액에 부유하여 1 x 106/ml ~ 1 x 107/ml의 농도로 조절된 후 각 웰에 고정되는 것이 바람직하다. 상기 농도의 레지오넬라균 항원을 이용하면 최적의 검출 효과를 도출할 수 있는 이점이 있다.
이에 한정되는 것은 아니나, 상기 레지오넬라균 부유액은 2 ~ 5 ㎕ 떨어뜨려 고정하는 것이 바람직하다. 상기 부유액을 2 ㎕ 미만으로 사용하면, 레지오넬라균의 농도를 적정한 농도로 유지할 수 없어 정확한 진단 결과를 얻을 수 없고, 5 ㎕ 초과의 경우 옆의 웰을 침범하여 항원이 혼합될 수 있고 부유액의 건조시간이 연장되는 문제점이 있다. 추후 진단 시료의 양도 2 ~ 5 ㎕로 하는 것이 바람직하다. 2 ㎕ 미만의 경우 실험 중간에 각 웰의 시료가 말라 버릴 수 있고, 2 ㎕ 초과하여 사용하면 옆의 웰의 시료와 접촉하여 혼합됨에 따라 오염문제가 발생하기 때문이다.
이에 한정되는 것은 아니나, 상기 레지오넬라균은 레지오넬라 뉴모필라 sg 1, sg 2, sg 3, sg 4, sg 5, sg 6(L. pneumophila sg 1, sg 2, sg 3, sg 4, sg 5, sg 6), 레지오넬라 보제마니(L. bozemanii), 레지오넬라 듀모피(L. dumoffii), 레지오넬라 고마니(L. gormanii), 레지오넬라 믹다데이(L. micdadei), 레지오넬라 롱비취채(L. longbeachae), 레지오넬라 아니사(L. anisa), 및 레지오넬라 부산넨시스(L. busanensis)를 항원으로 포함하는 것이 바람직하다. 또한 14개의 항원 수에 국한되지 않고 20개의 항원 수까지 고정이 가능하다. 상기와 같이, 다양한 레지오넬라균을 하나의 슬라이드에 포함하여 종래의 기술에 비해 오진의 가능성을 낮출 수 있다.
이에 한정되는 것은 아니나, 상기 레지오넬라균은 간접면역형광항체법의 2차 항체 반응시 IgG 또는 IgM으로 처리되는 것이 바람직하다. 상기한 구성에 의하면, IgG과 IgM 각각에 대한 항체 역가를 구분하여 측정할 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 2 ~ 5 ㎕의 용액을 수용할 수 있는 마이크로 웰 (micro well)이 다수 개 형성된 슬라이드; 및 상기 각 웰에 고정된 각기 다른 불활화된 레지오넬라균 항원을 포함하는 간접면역형광항체법에 의한 레지오넬라증 진단용 마이크로 다가 항원슬라이드를 제공한다.
이에 한정되는 것은 아니나, 상기 불활화된 레지오넬라균은 0.1 ~ 0.5 %의 유정난황막 부유액에 부유하여 1 x 106/ml ~ 1 x 107/ml의 농도로 조절된 후 각 웰에 고정되는 것이 바람직하다. 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 마이크로 다가 항원슬라이드는 상술한 바와 같은 이점이 있다. 또한, 상기 농도의 레지오넬라균 항원을 이용하면 최적의 검출 효과를 도출할 수 있는 이점이 있다.
이에 한정되는 것은 아니나, 상기 레지오넬라균은 레지오넬라 뉴모필라 sg 1, sg 2, sg 3, sg 4, sg 5, sg 6(L. pneumophila sg 1, sg 2, sg 3, sg 4, sg 5, sg 6), 레지오넬라 보제마니(L. bozemanii), 레지오넬라 듀모피(L. dumoffii), 레지오넬라 고마니(L. gormanii), 레지오넬라 믹다데이(L. micdadei), 레지오넬라 롱비채(L. longbeachae), 레지오넬라 아니사(L. anisa), 및 레지오넬라 부산넨시스(L. busanensis)를 항원으로 포함하는 것이 바람직하다. 상기와 같이, 다양한 레지오넬라균을 하나의 슬라이드에 포함하여 종래의 기술에 비해 오진의 가능성을 낮출 수 있다.
또한, 상기 슬라이드는 양성대조군으로 사용되는 레지오넬라 항원이 고정되어 있는 웰을 더 포함하는 것이 바람직하다. 상기와 같은 구성에 의하면, 일회의 간접면역형광항체 반응으로 시료의 양성 여부를 정확하게 확진할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 간접면역형광항체법에 사용할 항원슬라이드의 새로운 제조방법을 제공하는 것에 관한 것이다. 상기 방법은 80개의 웰이 있는 슬라이드를 사용하여, 균 항원 부유액과 실험시 사용하는 시료의 양을 줄이고자 하였으며, 현재까지 알려진 레지오넬라균종 가운데, 사람에게 질환을 일으키는 것으로 알려진 레지오넬라균 항원 (L. pneumophila sg 1, sg 2, sg 3, sg 4, sg 5, sg 6, L. bozemanii , L. dumoffii , L. gormanii , L. micdadei , L. longbeachae)에 수계시스템에서 우세하게 분리되고 있는 균종 (L. anisa)과 국내 분리균종 (L. busanensis)을 2개 더 추가한 14개의 균항원을 사용하였고, 동일한 슬라이드 위에서 환자의 항체 역가를 측정할 수 있도록 고안한 것이 특징이다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 의한 방법으로 제작된 항원슬라이드를 이용하여 간접면역형광항체법을 실시할 경우, L. pneumophila 균종이 아닌 다른 균종을 포함한 여러 가지 레지오넬라균 항원에 대한 항체 보유 여부와 항체역가 측정을 동시에 실시할 수 있어, 항체 보유를 확인한 후, 다시 역가측정에 대한 실험을 하여야 하는 번거로움을 줄임으로써, 시간을 단축할 수 있고, 많은 웰이 있는 슬라이드를 사용함으로써 사용하는 균 항원, 사람혈청 등의 시료의 양을 줄일 수 있어, 기존의 방법보다 편리하고 경제적이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 14종의 마이크로-다가 항원슬라이드의 실물을 나타낸다. 각 번호에 해당되는 웰에 레지오넬라균 항원을 고정하였다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 14종의 마이크로-다가 항원슬라이드를 이용한 레지오넬라균에 대한 항체 검사법의 개략적 절차도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 14종의 마이크로-다가 항원슬라이드에 다가 토끼 항혈청을 반응시켜 적합성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 도 3의 결과의 판독기준을 나타내며, 1:128 이상에서 엔드 포인트(end point) 2+ 이상일 경우를 양성으로 판독한다.
4+ = 아주 밝은 노랑-초록으로 균이 염색됨 (균체수가 100% 보일 때)
3+ = 밝은 노랑-초록으로 균이 염색됨 (균체수가 75% 보일 때)
2+ = 전체적으로 일정하나 희미하게 균이 염색됨 (균체수가 50% 보일 때)
1+ = 거의 보일 정도로 균이 염색됨
- = 염색이 안 됨. 균이 훤하게 자가 형광으로 보이기도 하나, 노랑-초록색은 아님.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 14종의 마이크로-다가 항원슬라이드를 이용한 레지오넬라균에 대한 항체 검사법의 개략적 절차도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 14종의 마이크로-다가 항원슬라이드에 다가 토끼 항혈청을 반응시켜 적합성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 도 3의 결과의 판독기준을 나타내며, 1:128 이상에서 엔드 포인트(end point) 2+ 이상일 경우를 양성으로 판독한다.
4+ = 아주 밝은 노랑-초록으로 균이 염색됨 (균체수가 100% 보일 때)
3+ = 밝은 노랑-초록으로 균이 염색됨 (균체수가 75% 보일 때)
2+ = 전체적으로 일정하나 희미하게 균이 염색됨 (균체수가 50% 보일 때)
1+ = 거의 보일 정도로 균이 염색됨
- = 염색이 안 됨. 균이 훤하게 자가 형광으로 보이기도 하나, 노랑-초록색은 아님.
본 발명은 이하의 실시 예를 통하여 더욱 상세하게 설명될 것이다, 그러나, 본 발명을 예시하기 위하여 이하의 실시 예들이 제공된 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시의 예로 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 다가 항원 슬라이드 제작
간접면역형광항체법에 따라 레지오넬라균종에 대한 면역혈청학적인 실험실 진단을 위하여 본 발명의 방법을 사용하여 항원슬라이드를 제작하였다.
항원슬라이드의 제조를 위하여 14개의 레지오넬라균을 사용하였고 그 방법은 다음과 같다.
레지오넬라균은 BCYE (Buffered Charcol Yeast extract) 한천배지에서 접종하여 2.5% 이산화탄소가 주입되는 37℃ 배양기에서 3일간 배양한 후, 0.05% Sodium azide가 포함된 부유액으로 2회 세척하였고 100℃에서 15분간 열처리하였다. 열처리한 균을 0.2% 유정난황막 부유액(Yolk sac diluent-PBS-0.05% sodium azide 부유액; 0.2% YPBS-S, pH 7.6)으로 각각의 균항원의 수 (표 1)가 되도록 희석하여 레지오넬라균 항원을 제조하였다. 균 항원의 부유에 사용한 0.2% YPBS-S 부유액은 PBS (pH 7.6)에 0.05%가 되도록 sodium azide (NaN3)을 첨가하고 3% Yolk sac diluent가 0.2%가 되도록 희석한 후, 0.2 ㎛ pore size의 일회용 멸균 필터를 사용하여 무균적으로 필터링하여 제조하였다.
이때 각 균의 희석은 수차례의 예비실험에 근거하여 최종적으로 조정하였다. 80 웰 슬라이드에 기 제조된 각각의 균항원을 표 2와 같은 구성으로 웰 당 2 ㎕씩 떨어뜨린 후, 37℃ 항원슬라이드 건조배양기에서 건조하고 -20℃에 보관한 차가운 아세톤으로 상온에서 15분간 고정하였다. 이후 항원이 고정된 항원슬라이드는 사용하기 전까지 -70 ~ -80℃ 정도의 초저온 냉동고에 보관하였다. 표 2는 14개의 레지오넬라균 항원의 슬라이드 고정을 나타낸다. 표 2에 나타난 바와 같이, 슬라이드에는 14개의 다른 레지오넬라균 항원이 고정되어 있다. 즉, 슬라이드의 line 1~4까지는 동일한 항원이 고정되어 있고, 각 line에는 14개의 항원이 각각 웰에 고정되어 있으며(표 1 및 표 2), 슬라이드 오른쪽의 well No. 16~20의 열과 행에는 14개 항원이 각각 웰에 고정되어 있다 (양성대조용 항원으로 사용함).
실시예
2: 양성대조용 참조 다가 항혈청 제작
ㄱ) 면역용 항원 준비 및 면역
항원슬라이드 제작용으로 준비한 14개의 레지오넬라균 항원 부유액을 참조 다가 항혈청 제작을 위한 면역용 항원으로 사용하였다. 즉, 면역용 토끼는 2.5~3.0㎏ 정도의 건강한 뉴질랜드산 화이트 토끼를 사용하였고 토끼의 귀정맥 (耳靜脈) 투여방법으로 3~4일 간격으로 6~7회 접종하였으며, 이때 지속적인 면역세포의 자극으로 토끼의 면역세포의 세포 증식과 이에 따른 항체 분비의 증가를 유도하기 위하여 매회 항원부유액의 접종량을 2배씩 증가시켰다.
ㄴ) 면역여부 확인
최종 면역 후 5~7일이 경과하였을 때, 귀정맥에서 소량의 혈액을 채취하여 혈청을 분리하였고 이를 saline을 이용하여 단계희석 한 후, 항혈청의 역가를 측정하여 면역여부를 확인하였다.
ㄷ) 전채혈을 통한 항혈청 제작
면역이 확인된 토끼는 대한실험동물학회에서 권고하는 주사마취제를 이용하여 전신마취 한 후, 심장채혈을 통하여 혈액을 채취하였고 채취한 혈액은 4℃에서 24~48시간 정치하여 혈장이 응고되도록 한 후, 8,000rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액 (맑은 혈청)만을 분리하였다. 분리한 혈청은 56℃의 water bath에서 30분간 불활화하여 보체의 활성을 파괴한 후, 적량의 sodium azide 용액을 첨가하고 사용할 때까지 초저온 냉동고(-70℃ 이하)에 보관하였다.
ㄹ) 항혈청의 적정희석배수 결정 및 다가 항혈청 제작
제조한 혈청은 0.01M PBS (pH 7.6)를 이용하여 단계희석 하였고 각 항원 부유액과의 응집반응을 통하여 2+의 엔드 포인트를 기준으로 각 항혈청의 희석배수를 결정하였다. 결정한 희석배수로 각각의 항혈청을 희석하여 혼합하였고 희석된 혈청 내 항체의 보존성과 안정성을 위하여 10 % glycerol, 및 thimerosal(방부제)을 첨가한 후, 0.2 μm pore size의 filter를 이용하여 무균적으로 여과하여 양성대조로 사용할 다가 항혈청을 제작하였다.
실시예
3: 마이크로-다가 항원슬라이드의 적합성 시험
본 발명에 따라 제작된 마이크로-다가항원 슬라이드의 각 웰에 고정한 레지오넬라균 수의 적합성을 알아보기 위하여 14개의 레지오넬라균 항원과 반응할 수 있는 다가 토끼 항혈청을 사용하여 간접면역형광항체법을 실시하였다.
도 2는 본 발명에 의한 마이크로-다가 항원슬라이드를 이용한 레지오넬라균에 대한 항체 검사법의 절차도이다. 항원이 고정된 슬라이드는 사용 전에 -20℃ 또는 -70℃에서 꺼내어 상온에서 5~10분간 방치 한 후, 사용하였다. 14개의 항원에 모두 반응하며, 2+ 역가를 가진 토끼 항혈청을 항원이 고정된 슬라이드의 각 웰에 2㎕ 씩 떨어뜨린 후, moist chamber에 넣고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이후 PBS (pH 7.6)로 3회 세척하여 항원과 반응하지 않은 잔여혈청(비특이적 반응물)을 제거하고 공기 중에서 살짝 건조시켰다. 다음의 2차 항체반응으로 멸균 PBS (pH 7.6)을 이용하여 400배로 희석된 FITC-conjugate anti-rabbit IgG (Cappel, #55646)를 각 웰 당 2㎕ 씩 떨어뜨린 후, 슬라이드를 moist chamber에 넣고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 다시 PBS (pH 7.6)로 반응시킨 슬라이드를 2회 세척하고 멸균 증류수로 1회 세척하여 항원-항체반응을 하지 않은 잔여 컨쥬게이트(conjugate)를 제거한 후, 공기 중에서 살짝 건조시켰다. Mounting fluid (pH 9.0)를 웰에 떨어뜨리고 커버글래스(cover glass, 22x60 ㎜)를 덮은 후, 형광현미경으로 400배에서 검경하였다. 그 결과, 도 3과 같이 항원슬라이드의 각 웰에 고정된 레지오넬라균수의 적합성을 확인하였다.
실시예
4: 마이크로-다가 항원슬라이드를 이용한
레지오넬라증의
면역학적 진단의 민감도 및 특이도 시험
민감도 및 특이도 측정을 위하여 10개의 혈청을 사용하였다 (레지오넬라균 분리배양법을 확진되었거나, 뇨항원 양성 또는 레지오넬라균 특이 유전자 검출로 레지오넬라증 환자로 확진된 혈청, 또는 급성기와 회복기 혈청 역가비교에서 4배 이상 역가 상승을 보인 혈청).
환자 혈청은 멸균된 PBS (pH 7.6)로 1:32 희석 (혈청 5 ㎕ + PBS 155 ㎕)하고 이를 1:64, 1:128, 1:256로 2배 단계 희석하였다. 항원이 고정된 슬라이드의 각 웰 에 2㎕ 씩 희석한 혈청을 떨어뜨린 후, moist chamber에 넣고 37℃에서 30분간 반응시켰다 (이때 양성 대조는 다가 참조 토끼 항혈청을 사용하였으며, 필요시 음성 대조는 PBS (pH 7.6)를 이용하였다). 이후 PBS (pH 7.6)로 3회 세척하여 항원과 반응하지 않은 잔여혈청 (비특이적 반응물)을 제거하였고 공기 중에서 살짝 건조시켰다. 다음의 2차 항체반응으로 멸균된 PBS (pH 7.6)를 이용하여 400배로 희석된 FITC-conjugate anti-human IgGMA (Cappel, #55156) 또는 Goat FITC conjugate anti-humant IgG (Cappel, #55144), Goat FITC conjugate anti-humant IgM (Cappel, #55153)를 각 웰당 2㎕ 씩 떨어뜨린 후, 슬라이드를 moist chamber에 넣고 37℃에서 30분간 반응시켰다 (양성대조인 토끼 항혈청은 400배로 희석된 FITC-conjugate anti-rabbit IgG-Cappel, #55646을 사용하였다). 다시 PBS (pH 7.6)로 반응시킨 슬라이드를 2회 세척하고 멸균 증류수로 1회 세척하여 항원-항체반응을 하지 않은 잔여 컨쥬게이트(conjugate)를 제거한 후, 공기 중에서 살짝 건조시켰다. Mounting fluid (pH 9.0)를 웰에 떨어뜨리고 커버글래스(cover glass, 22x60 ㎜)를 덮은 후, 형광현미경으로 400배에서 검경하였다. 그 결과, 도 3과 같이 항원슬라이드의 각 웰에 고정된 레지오넬라균수의 적합성을 확인하였다.
비교실험 예 1: 상용화
ELISA
제품과의 비교
ELISA 기법을 적용한 Legionella pneumophila sg 1-7 ELISA Kit (Euroimmun, USA, EI2150-9601M, EI2150-9601G)와 비교하였다. 이때 판독기준은 IFA의 경우, 항체가 1:128배 이상인 혈청을 항체 양성으로 판정하였고, ELISA의 경우에는 사용설명서에 표시된 것과 같이 대조용 혈청 또는 시료의 extinction 값을 calibrator 값으로 나눈 값이 1.1 이상일 경우를 항체 양성으로 판정하였다.
실험에 사용한 대조용 혈청과 시약들은 키트에서 제공된 것을 사용하였다. 혈청은 샘플 버퍼(sample buffer)를 이용하여 1:101 비율로 희석한 후, duplicate로 수행하였다. 희석된 시료를 각 웰에 넣고 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 세척버퍼(washing buffer)로 300 ㎕ 씩 넣고 3회 세척하였다. 이후 100 ㎕의 엔자임 컨쥬게이트(enzyme conjugate)를 넣고 37℃에서 30분 동안 반응시키고 위와 동일한 방법으로 세척하였으며, 100 ㎕의 기질(substrate)을 넣고 15분간 반응시킨 후에 100 ㎕의 정지액(stop solution)을 넣어 450nm의 파장에서 흡광도(optical density)를 측정하였다.
IFA와 ELISA에서 동일한 결과를 보인 혈청은 IgM에서 70% (7/10), IgG에서 70% (7/10)이었다 (표 3). 그러나 본 발명에 따라 제작된 마이크로-다가항원 슬라이드를 사용할 경우에는 고정된 14종류의 균항원 각각에 대하여 항체 역가를 측정할 수 있었으나, ELISA 키트에 고정된 항원은 7개의 균항원이 혼합되어 고정된 것으로 각각의 항원에 대한 항체역가를 측정하는 것은 불가능하였다. 표 3은 마이크로-다가 항원슬라이드와 ELISA 키트와의 비교 결과를 나타낸다.
비교실험예
2: 상용화
IFA
제품과의 비교
환자 검체에서 레지오넬라균이 분리, 배양되었고 급성기 및 회복기 혈청에서 항체가 상승으로 확인 진단된 레지오넬라증 환자 혈청 (n=2)을 이용하여, 본 발명에 따라 제작된 마이크로-다가항원 슬라이드와 상용화되고 있는 IFA 제품과의 비교실험을 실시하였다. 타사 제품으로 Euroimmun Legionella pneumophila serotypes 1-14 IFA test (Euroimmun, USA, FI2150-1001P)를 사용하였다. 실험에 사용한 대조구와 시약들은 키트에서 제공된 것을 사용하였다. 혈청은 키트에서 제공되는 PBS/tween20을 사용하여 1:128배로 희석한 후, 항원이 고정된 슬라이드 위에 떨어뜨리고 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 그 후 PBS/tween20로 5분 동안 세척한 후, 키트에서 제공되는 2차 항체를 떨어뜨리고 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 5분 동안 세척한 후, mounting fluid (pH 9.0)를 떨어뜨리고 cover glass를 덮고 형광현미경으로 400배에서 관찰하였다. 이때 결과 판정기준은 1:128배 이상을 양성으로 하였다. 그 결과, 마이크로-다가항원 슬라이드와 타사 제품과 동일한 결과를 나타내었으나, 회복기 혈청에서 타사 제품은 4개 이상의 혈청군과 교차반응을 보였으며, 키트 안에 있는 2차 항체가 IgM과 IgG 혼합시약으로 되어 있어, IgM과 IgG 각각에 대한 항체역가를 구분하여 측정할 수 없었다 (표 4). 또한, 타사제품은 본 발명에 따라 제작된 마이크로-다가항원 슬라이드를 사용할 때보다 많은 양의 혈청이나 시료가 필요하였으며 (100 ㎕), 비특이 반응도 많았다. 표 4는 마이크로-다가 항원슬라이드와 타사 면역형광항체법 키트와의 비교 결과를 나타낸다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현의 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (8)
- 간접면역형광항체법에 의해 레지오넬라증을 진단하는 항원슬라이드의 제조방법에 있어서,
i) 2 ~ 5 ㎕의 용액을 수용할 수 있는 마이크로 웰 (micro well)이 다수 개 형성된 슬라이드를 준비하는 단계;
ii) 항원으로 사용할 다수의 레지오넬라균을 불활화하고, 상기 불활화된 레지오넬라균을 0.1 ~ 0.5 %의 유정난황막 부유액에 부유하여 상기 레지오넬라균 항원의 농도를 조절하는 단계; 및
iii) 상기 각 웰에 각기 다른 레지오넬라균을 고정하는 단계를 포함하고,
상기 레지오넬라균은 레지오넬라 뉴모필라 sg 1, sg 2, sg 3, sg 4, sg 5, sg 6(L. pneumophila sg 1, sg 2, sg 3, sg 4, sg 5, sg 6), 레지오넬라 보제마니(L. bozemanii), 레지오넬라 듀모피(L. dumoffii), 레지오넬라 고마니(L. gormanii), 레지오넬라 믹다데이(L. micdadei), 레지오넬라 롱비채(L. longbeachae), 레지오넬라 아니사(L. anisa), 및 레지오넬라 부산넨시스(L. busanensis)를 항원으로 포함하는 것을 특징으로 하는 간접면역형광항체법에 의한 레지오넬라증 진단용 마이크로 다가 항원슬라이드의 제조방법. - 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 레지오넬라균은 간접면역형광항체법의 2차 항체 반응시 IgG 또는 IgM으로 처리되는 것을 특징으로 하는 간접면역형광항체법에 의한 레지오넬라증 진단용 마이크로 다가 항원슬라이드의 제조방법.
- 2 ~ 5 ㎕의 용액을 수용할 수 있는 마이크로 웰 (micro well)이 다수 개 형성된 슬라이드; 및
상기 각 웰에 고정된 각기 다른 불활화된 레지오넬라균 항원을 포함하고,
상기 불활화된 레지오넬라균은 0.1 ~ 0.5 %의 유정난황막 부유액에 부유하여 1 x 106/ml ~ 1 x 107/ml의 농도로 조절된 후 각 웰에 고정되고,
상기 레지오넬라균은 레지오넬라 뉴모필라 sg 1, sg 2, sg 3, sg 4, sg 5, sg 6(L. pneumophila sg 1, sg 2, sg 3, sg 4, sg 5, sg 6), 레지오넬라 보제마니(L. bozemanii), 레지오넬라 듀모피(L. dumoffii), 레지오넬라 고마니(L. gormanii), 레지오넬라 믹다데이(L. micdadei), 레지오넬라 롱비채(L. longbeachae), 레지오넬라 아니사(L. anisa), 및 레지오넬라 부산넨시스(L. busanensis)를 항원으로 포함하는 것을 특징으로 하는 간접면역형광항체법에 의한 레지오넬라증 진단용 마이크로 다가 항원슬라이드. - 삭제
- 삭제
- 제5항에 있어서, 상기 슬라이드는 양성대조로 사용되는 레지오넬라 항원이 고정되어 있는 웰을 더 포함하는 간접면역형광항체법에 의한 레지오넬라증 진단용 마이크로 다가 항원슬라이드.
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