CN101738472A - 用于同时检测伤寒、副伤寒的生物芯片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于同时检测伤寒、副伤寒的生物芯片，属于生物芯片技术领域，包括芯片片基，所述的片基设置有至少一个检测单元，所述的检测单元设置有检测样待检点阵，所述的检测点阵为双位点设计；所述的检测点阵包括质控检测点，阴性对照检测点，伤寒O、H、VI型检测位点和副伤寒甲、乙、丙型检测位点；所述的质控检测点，阴性对照检测点，伤寒O、H、VI型检测位点和副伤寒甲、乙、丙型检测位点分别包被有相应的抗原。通过本发明所述的生物芯片进行检测，可以实现高效、节省时间、高通量同时诊断检测伤寒沙门氏菌感染，即一次检测可得知伤寒O、H、VI和副伤寒甲、乙、丙型的组合的目的。
Description
技术领域
本发明属于生物芯片技术领域，尤其是涉及一种用于同时检测伤寒、副伤寒的生物芯片及其制备方法，以及包括所述芯片的检测试剂盒。
背景技术
肠道感染是世界排名第3位的疾病病因，其中伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌引起的肠热症占主要部分。这种疾病构成在卫生条件差和饮水未经处理的国家更为明显，是威胁人们健康的主要问题。在亚洲，甲型副伤寒沙门菌已经成为肠热症的主要病因。中国自1998年分离到甲型副伤寒沙门菌，它逐渐成为流行的优势菌型，经常引起地方性流行和暴发。
伤寒副伤寒在全球分布广泛，2000年世界卫生组织(WHO)估计全球伤寒总发病数为2 165万，发病率高达355/10万，死亡数21.6万，其中副伤寒发病数541万。虽然全球的伤寒副伤寒总发病呈下降趋势，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下，常出现水和食物污染引起的暴发和流行。伤寒副伤寒沙门菌耐药日益严重，流行菌型不断变迁，伤寒副伤寒高发病率所造成的疾病负担仍不容忽视。
目前伤寒副伤寒的诊断方法有：细菌的分离培养、血清学方法如肥达氏反应、乳胶凝集试验、ELISA、核酸检测(PCR)。分离培养法是在患者的体液标本中培养出伤寒沙门菌，是最基本也是诊断伤寒病例的金标准。培养所用的标本可有骨髓、血液、粪便和尿液，Gilman等的实验中证明即使在使用抗生素的前提下，骨髓的培养阳性率仍然最高，可达到90％，而血、尿等标本的培养阳性率受到显著影响。但抽取骨髓对患者来说很痛苦，并且增加了伤寒病诊治过程中的风险。由于培养的方法受到抗生素应用的影响，阳性率大大降低，而且培养的方法至少经过3～5天才能得到结果，不能及时为正确合理的治疗方案提供依据。
血清学方法所针对的目的抗原(或其相应的抗体)有以下3种：菌体抗原O、鞭毛抗原H和Vi抗原。其中，肥达反应存在诸多问题，在诊断上含糊不清，不敏感不特异，已表现出显著的局限性，需要改用其他敏感特异的检测方法。相对于肥达反应18～24h的时耗，ELISA显示了快速灵敏和特异的特点人们普遍认为EL ISA方法是一种既灵敏又特异的诊断方法。尤其是EL ISA方法同时检测IgM和IgG比单独检测IgM结果更可靠。
PCR检测标本中的伤寒沙门菌核酸，是目前公认最为敏感和特异的诊断方法。但PCR方法并不是完美的，不仅容易污染，另外，伤寒和甲型副伤寒沙门菌是胞内寄生菌，抗生素的滥用加剧了血液中细菌数量的减少，制备DNA模板过程中样品的损失增加PCR扩增的难度。但PCR方法的灵敏度比血培养和肥达氏反应显著高，并且其高灵敏度和特异性对临床有争议的伤寒病例做出快速、确切的诊断有巨大作用。
上述方法都各有优缺点，但都需要一次实验只能检测一种细菌，或者一个抗体，不能同时检测出伤寒O、H、VI和副伤寒甲、乙、丙型。在检测效率方面费时费力，尤其传统的肥达氏反应更需要12-24小时，分离培养需要3-5天时间。PCR方法固然敏感和特异，但也要几个小时，也需要昂贵仪器，一次实验只能作出一种细菌的诊断，在基层医疗机构无法实施，因为它需要有严格控制的操作空间和结净环境。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种用于同时检测伤寒、副伤寒的生物芯片，解决现有技术存在的缺陷。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于同时检测伤寒、副伤寒的生物芯片包括芯片片基，所述的片基设置有至少一个检测单元，所述的检测单元设置有检测样待检点阵，所述的检测点阵为双位点设计；所述的检测点阵包括质控检测点，阴性对照检测点，伤寒O、H、VI型检测位点和副伤寒甲、乙、丙型检测位点；所述的质控检测点，阴性对照检测点，伤寒O、H、VI型检测位点和副伤寒甲、乙、丙型检测位点分别包被有相应的抗原。
优选的方案是：所述的检测点阵还包括空白对照检测点。
更为优选的方案是：所述的检测单元的检测样待检点阵为4×5双位点设计；所述的质控检测点，阴性对照检测点，伤寒O、H、VI型检测位点和副伤寒甲、乙、丙型检测位点以及空白对照检测点设置有两个重复；所述的阴性对照检测点以及空白对照检测点为伤寒O、H、VI型检测位点和副伤寒甲、乙、丙型检测位点的共同对照检测点。
更为优选的方案是：所述的质控检测点包被的抗原为为用于检测IgM和/或IgG型抗体的抗原。
更为优选的方案是：所述的芯片片基为活化处理后的玻璃片基，或者为膜片基，或者为高分子硅片基，或者为塑料片基。
更为优选的方案是：所述的芯片片基为多聚-L-赖氨酸或者戊二醛活化处理的玻璃片基，或者为膜片基，或者为高分子硅片基，或者为塑料片基。
本发明的目的之二在于提供一种制备用于同时检测伤寒、副伤寒的生物芯片的方法，采用如下技术方案：
一种制备用于同时检测伤寒、副伤寒的生物芯片的方法：包括如下步骤：
(A)准备好已经活化处理的芯片片基，所述的片基设置有至少一个检测单元，所述的检测单元设置有检测样待检点阵，所述的检测点阵为双位点设计；所述的检测点阵包括质控检测点，阴性对照检测点，空白对照检测点，伤寒O、H、VI型检测位点和副伤寒甲、乙、丙型检测位点；
(B)准备待检测的伤寒O、H、VI型抗原和副伤寒甲、乙、丙型抗原；
(C)准备质控蛋白，所述的质控蛋白为经过多次试验后确定，无论待检样品室阳性还是阴性，该蛋白均能在反应结束后显示质控点，在阅读仪或扫描仪下能清晰可见；
(D)对芯片片基的检测位点进行位点图案排布设计，所排布的图案能被人工或者点样机械手点样时识别；
(E)点样，将质控蛋白和伤寒O、H、VI型抗原和副伤寒甲、乙、丙型抗原按步骤D中设计的图案用机械手或人工点样于芯片上，并对其进行封闭反应，制作伤寒副伤寒检测芯片，用于同时检测不同亚型所产生的抗体，包括IgM和/或IgG型抗体。
优选的方案是：所述的检测单元的检测样待检点阵为4×5双位点设计；所述的质控检测点，阴性对照检测点，伤寒O、H、VI型检测位点和副伤寒甲、乙、丙型检测位点以及空白对照检测点设置有两个重复；所述的阴性对照检测点以及空白对照检测点为伤寒O、H、VI型检测位点和副伤寒甲、乙、丙型检测位点的共同对照检测点；所述的质控检测点包被的抗原为用于检测IgM和/或IgG型抗体的抗原；所述的芯片片基为多聚-L-赖氨酸或者戊二醛活化处理的玻璃片基，或者为膜片基，或者为高分子硅片基，或者为塑料片基。
本发明的目的之三在于提供一种包括本发明的发明目的之一所述的生物芯片的检测试剂盒，采用如下技术方案：
一种用于同时检测伤寒、副伤寒的检测试剂盒，包括：如发明目的之一任一技术方案所述的生物芯片；
稀释试剂；
视踪试剂；
洗涤试剂；
和显色反应试剂。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
本发明所述的生物芯片，通过双位点设计点阵的方法来实现高通量同时检测伤寒沙门氏菌感染，即一次检测可得知伤寒O、H、VI和副伤寒甲、乙、丙型的组合，具有鉴别感染类型和鉴别诊断的作用，尤其伤寒与副伤寒感染后临床症状几乎完全相似，只有严格的分型诊断才能区别。通过本发明所述的检测试剂盒，可以实现高效、节省时间、高通量同时诊断检测伤寒沙门氏菌感染，即一次检测可得知伤寒O、H、VI和副伤寒甲、乙、丙型的组合的目的。无论对于基层还是大型医疗机构，均可以使用，配以芯片阅读仪后可以达到定量诊断的目的，对基层人员的要求不高，但产品的灵敏度照样可以达到ELISA的水平。是目前比较理想的技术平台方法，在国内外均未见到类似的方法。
附图说明
图1为本发明所述的生物芯片检测单元的点阵结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例1
用于同时检测伤寒、副伤寒的生物芯片的制备
如图1所示，一种用于同时检测伤寒、副伤寒的生物芯片包括多聚-L-赖氨酸活化的玻璃三维芯片片基，所述的片基设置有至少一个检测单元，检测单元设置有检测样待检点阵，检测样待检点阵为4×5双位点设计；从上至下用A、B、C、D分别代表行，从左至右用数字1、2、3、4、5分别代表列。其中，各位点A1、B1、C1、D1均代表质控点；各位点：A2、B2代表伤寒O位点；A3、B3代表伤寒H位点；A4、B4代表伤寒VI位点；A5、B5代表副伤寒甲位点；C2、D2代表副伤寒乙位点；C3、D3代表副伤寒丙位点；C4、D4代表阴性对照(NC)位点；C5、D5为空白对照位点。质控检测点包被的抗原为IgM和IgG型抗原。依据检测仪器的需要，可以将本实施例所述的多个检测单元设计在一张检测芯片上，在用于临床检测时，可以同时对多个检测标本进行检测。
一种能同时检测伤寒副伤寒感染的生物芯片，其具体制备步骤如下：
1)用TBS缓冲液(PH值8.0)将伤寒O、H和副伤寒甲、乙、丙抗原及对照和质控点稀释到10ug/ml。阴性对照用TBS缓冲液代替；
2)将稀释后的各类抗原和对照，用点样仪机械手按照后面所示的图案喷点于玻璃基片上，在湿度为60％的孵育箱中放置3小时；
3)用封闭液封闭上述芯片，在上述同样的条件下2小时。所述的封闭液主要以含蔗糖、洛蛋白、明胶为主的超纯水制备而成，PH值为6.0-7.2，以7.0为首选；
4)干燥：将上述3)步骤形成的芯片置于干燥环境(温度22度、湿度低于45％)下干燥过夜。
5)将上述4)步骤所形成的芯片，装于铝箔袋中，加干燥剂后封口，保存于4-8度待用，有效期可达一年。
实施例2
检测试剂盒的组装
1.实施例1所述的生物芯片 2TX10/20片
2.标本稀释液 1瓶(2.5/5ml，呈蓝色)
3.示踪物 1瓶(2.5/5ml，呈红色)
4.显色剂 1瓶
5.洗涤液 2/4瓶(18mlX2/4，直接使用)
6.说明书 1张
7.湿盒自备：于饭盒内放湿纱布一层即可。
实施例3
通过检测试剂盒同时检测伤寒沙门氏菌感染
将实施例2所述试剂盒平衡至室温。标本稀释：用标本稀释液以1∶20(15ul～300ul)稀释血清标本于试管中混匀。加样：取出芯片拆封并平放于实验台上，于每方格中加入200ul已稀释的标本，注意使标本布满方格。孵育：将芯片置于湿盒中并放置37℃温育30分钟。甩去方格内液体，于每格内加入4滴洗涤液，立刻甩掉，连续洗涤3次，最后用蒸馏水流洗1秒钟，甩干后在吸水纸上吸干方格周围水滴。加示踪物：每格滴2滴示踪物，勿溢出方格外。湿盒中37℃温育30分钟，同上法洗涤3次，在吸水纸上吸干周围水滴。显色：每格加入2滴显色剂，37℃孵育箱显色10-12分钟。甩去方格内液体，用蒸馏水流洗1秒种。甩干，吸水纸吸干液滴。
检测结果：通过同一反应单元，可同时得知不同类型的伤寒感染组合，如：若O位点出现阳性，则为伤寒近期感染，若H位点出现阳性反应，则为既往伤寒感染，具有流行病学诊断的意义；若O与H位点同时出现阳性反应，则代表是伤寒的近期感染和复发感染；如副伤寒甲位点出现阳性反应，则代表是副伤寒甲型感染，依次类推。NC位点始终不出现反应，是阴性对照；C5、D5位点也始终不出现反应，是空白对照；各位点的反应呈现蓝色或红色斑点(与示踪物有关)，弱反应可能呈现半圆型斑点或淡淡的斑点。本系统设计中阴性标本不显色，即为背景色。本芯片所指背景是芯片基质的颜色、点与点之间的部分为背景。显色即为阳性。一般情况下标本位点的显色深度不超过质控点。当标本显色较弱时，有时可出现“空心”或“半空心”，尤其当甩掉显色液吸干后会出现此现象，仍判为阳性。本系统以双位点设计，若双位点中只有一个显色，另一位点未显色，则实验需重复。实验完毕的芯片若要长期保存可存放于黑暗干燥处，并做为污染物处理。室温过低(低于20℃)会致显色较慢且偏淡，可适当延长时间或置37℃恒温箱中解决。
需要定量分析时，将其结果通过扫描仪扫描后，使用分析软件进行分析。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于发明型的保护范围。
Claims (9)
1.一种用于同时检测伤寒、副伤寒的生物芯片，其特征是：包括芯片片基，所述的片基设置有至少一个检测单元，所述的检测单元设置有检测样待检点阵，所述的检测点阵为双位点设计；所述的检测点阵包括质控检测点，阴性对照检测点，伤寒O、H、VI型检测位点和副伤寒甲、乙、丙型检测位点；所述的质控检测点，阴性对照检测点，伤寒O、H、VI型检测位点和副伤寒甲、乙、丙型检测位点分别包被有相应的抗原。
2.如权利要求1所述的用于同时检测伤寒、副伤寒的生物芯片，其特征是：所述的检测点阵还包括空白对照检测点。
3.如权利要求2所述的用于同时检测伤寒、副伤寒的生物芯片，其特征是：所述的检测单元的检测样待检点阵为4×5双位点设计；所述的质控检测点，阴性对照检测点，伤寒O、H、VI型检测位点和副伤寒甲、乙、丙型检测位点以及空白对照检测点设置有两个重复；所述的阴性对照检测点以及空白对照检测点为伤寒O、H、VI型检测位点和副伤寒甲、乙、丙型检测位点的共同对照检测点。
4.如权利要求3所述的用于同时检测伤寒、副伤寒的生物芯片，其特征是：所述的质控检测点包被的抗原为用于检测IgM和/或IgG型抗体的抗原。
5.如权利要求4任一项所述的用于同时检测伤寒、副伤寒的生物芯片，其特征是：所述的芯片片基为活化处理后的玻璃片基，或者为膜片基，或者为高分子硅片基，或者为塑料片基。
6.如权利要求5所述的用于同时检测伤寒、副伤寒的生物芯片，其特征是：所述的芯片片基为多聚-L-赖氨酸或者戊二醛活化处理的玻璃片基，或者为膜片基，或者为高分子硅片基，或者为塑料片基。
7.一种制备用于同时检测伤寒、副伤寒的生物芯片的方法：包括如下步骤：
(A)准备好已经活化处理的芯片片基，所述的片基设置有至少一个检测单元，所述的检测单元设置有检测样待检点阵，所述的检测点阵为双位点设计；所述的检测点阵包括质控检测点，阴性对照检测点，空白对照检测点，伤寒O、H、VI型检测位点和副伤寒甲、乙、丙型检测位点；
(B)准备待检测的伤寒O、H、VI型抗原和副伤寒甲、乙、丙型抗原；
(C)准备质控蛋白，所述的质控蛋白为经过多次试验后确定，无论待检样品室阳性还是阴性，该蛋白均能在反应结束后显示质控点，在阅读仪或扫描仪下能清晰可见；
(D)对芯片片基的检测位点进行位点图案排布设计，所排布的图案能被人工或者点样机械手点样时识别；
(E)点样，将质控蛋白和伤寒O、H、VI型抗原和副伤寒甲、乙、丙型抗原按步骤D中设计的图案用机械手或人工点样于芯片上，并对其进行封闭反应，制作伤寒副伤寒检测芯片，用于同时检测不同亚型所产生的抗体，包括IgM和/或IgG型抗体。
8.如权利要求7所述的用于同时检测伤寒、副伤寒的生物芯片的方法：其特征是：所述的检测单元的检测样待检点阵为4×5双位点设计；所述的质控检测点，阴性对照检测点，伤寒O、H、VI型检测位点和副伤寒甲、乙、丙型检测位点以及空白对照检测点设置有两个重复；所述的阴性对照检测点以及空白对照检测点为伤寒O、H、VI型检测位点和副伤寒甲、乙、丙型检测位点的共同对照检测点；所述的质控检测点包被的抗原为为用于检测IgM和/或IgG型抗体的抗原；所述的芯片片基为多聚-L-赖氨酸或者戊二醛活化处理的玻璃片基，或者为膜片基，或者为高分子硅片基，或者为塑料片基。
9.一种用于同时检测伤寒、副伤寒的检测试剂盒，其特征是：包括：如权利要求1～6任一项所述的生物芯片；
稀释试剂；
视踪试剂；
洗涤试剂；
和显色反应试剂。
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